BRPI0611399B1

BRPI0611399B1 - A process for preparing a low molecular weight gelatine hydrolyzate, the above-mentioned gelatin hydrolisate and compositions comprising the same

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Publication number: BRPI0611399B1
Authority: BR
Publication date: 2017-09-05

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA PREPARAR UM HIDROLISADO DE GELATINA DE BAIXO PESO MOLECULAR, O REFERIDO HIDROLISADO DE GELATINA E COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO O MESMO".

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Este pedido reivindica prioridade de USSN 11/140.863 depositado em 31 de maio de 2005, cujo pedido está por este meio incorporado por referência em sua totalidade.

[002] A presente invenção refere-se a um hidrolisado de gelatina, um processo para preparar o hidrolisado de gelatina, e uma composição que compreende o hidrolisado de gelatina. Mais especificamente, a presente invenção fornece um hidrolisado de gelatina de baixo peso molecular que tem um teor de amina primária alto, a um processo para preparar o hidrolisado de gelatina, e a uma composição de gelatina incluindo o hidrolisado de gelatina. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[003] Gelatina é fabricada pela desnaturação de colágeno contido em materiais tais como pele de porco, pele de gado ou couro, e ossos de animais. Como sua proteína de origem, colágeno, a gelatina é definida por uma estrutura distintiva que compreende uma mistura sem igual de aminoácidos, Colágeno nativo é uma esc!eroproteína baseada em uma cadeia de polipeptídeo que compreende cerca de 1050 aminoácidos. Três destas cadeias de polipeptídeo vêm juntamente formar uma hélice tripla. A superimposição de várias destas hélices triplas produz fibrilas de colágeno que são estabilizadas por reticulação, consequentemente, formando uma estrutura de rede tridimensional. Esta estrutura particular torna o colágeno insolúvel; é em seguida trazido em forma solúvel por hidrólise parcial como gelatina ou hidrolisado de gelatina. O teor de aminoácido de colágeno e consequentemente da gelatina, abrange de um terço de glicina e um adicional de 22% de prolina e 4-hidroxiprolina; os 45% restantes compreendem 17 aminoácidos diferentes. Gelatina tem um teor particularmente alto de aminoácidos ácidos e básicos. Dos aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), quantidades variáveis estão presentes na forma de amido como glutamina e asparagina que dependem das condições de processo empregadas no processo de fabricação de gelatina. Cisteína está completamente ausente; dos aminoácidos contendo enxofre, a metionina é o único presente.

[004] Os dados para colágeno de peixe e avícula são um pouco diferentes, mas a presente invenção é igualmente aplicável à gelatina e/ou hidrolisado de gelatina derivado de colágeno de peixe e avícula.

[005] Gelatina pode ser utilizada em uma ordem ampla de aplicações dependendo de seu material de partida e método de fabricação. Isto é porque o comportamento físico e químico da gelatina é determinado por um lado por uma combinação de seu teor de aminoácido e a estrutura espacial resultante, e por outro lado por uma miríade de condições tais como pH, resistência iônica e reações com outras moléculas. Por exemplo, tipos diferentes de gelatinas são utilizados em aplicações diversas tais como alimentícias, fotográficas, cosméticas, e farmacêuticas.

[006] Na indústria farmacêutica, a gelatina é empregada inter alia na fabricação de cápsulas duras e macias. Cápsulas de gelatina fornecem um método conveniente e eficiente para administrar oralmente um fármaco porque as cápsulas desintegram-se rapidamente na exposição ao teor ácido do estômago, desse modo libertando o fármaco no corpo. Enquanto cápsulas de gelatina fornecem uma maneira farmaceuticamente elegante em que administrar um fármaco, há, porém, um risco que a cápsula de gelatina pode sofrer retardamento da desintegração e dissolução que são o resultado de um processo conhecido como reticulação. Acredita-se que a reticulação ocorre quando grupos carbonila em gelatina, ingredientes suficientes contendo carbonila em cápsulas, ou decomposição de ingredientes suficientes em grupos carbonila, reagem com aminas primárias e outros compostos nitrogenosos presentes na gelatina para formar reticulações.

[007] Reticulação, em particular, pode ter conseqüências medonhas no desempenho de cápsulas de gelatina no armazenamento prolongado e exposição aos extremos de calor e umidade. Reticulação da gelatina extensa em formulações de cápsula pode levar à formação de um película muito fina, dura e insolúvel em água, normalmente referida como uma película. A película age como uma camada borrachenta, insolúvel em água que pode restringir, ou prevenir a liberação dos conteúdos da cápsula.

[008] Alguém relatou amplamente meios para prevenir reticulação em focos de cápsulas de gelatina em produtos que agem como descontaminantes de carbonila, prevenindo a interação de grupos carbonila, por exemplo, grupos aldeído, com a casca da cápsula de gelatina, desse modo prevenindo a reticulação de gelatina. Todos estes métodos geralmente sugerem a adição de produtos à composição farmacêutica contida nas cápsulas de gelatina. Foi mostrado que a adição do aminoácido glicina e ácido cítrico em combinação às formulações encapsuladas em cápsulas duras de gelatina melhorou o perfil de dissolução das cápsulas duras (3). Provou-se que a adição do aminoácido glicina sozinho não produz resultados satisfatórios. Mas a adição de descontaminantes de carbonila tais como glicina, e ácidos carboxílicos tal como citrato, nas quantidades necessárias para reduzir a reticulação em cápsulas de gelatina está significativamente proibitiva de custo. Como tal, a adição destes produtos à gelatina não é uma solução prática para reduzir a reticulação em cápsulas de gelatina, SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] A presente invenção fornece um meio de custo eficaz, prático para reduzir a reticulação na gelatina. Brevemente, a invenção abrange um hidrolisado de gelatina de baixo peso molecular que, quando misturado com gelatina de peso molecular mais alto, reduz a reticulação da gelatina e melhora as propriedades de dissolução aumentando-se as quantidades de glicina livre, outros aminoácidos, e peptideos pequenos no produto de gelatina misturado. Vantajosamente, porque o hidrolisado de gelatina e composição de gelatina misturada da invenção têm propriedades de reticulação reduzidas alcançadas sem a adição de produtos tal como glicina como um composto isolado misturado com ácido cítrico, a gelatina pode ainda ser comercializada como um produto natural.

[0010] Entre os vários aspectos da invenção, portanto, é um processo para produzir um hidrolisado de gelatina que tem um peso molecular médio de cerca de 100 a abrange de 2000 Da, preferivelmente abrange de 1500 Da, e um teor de amina primária médio de cerca de 1,0 x 10'3 a abrange de 1,0 x 10'2 μΜοΙ de amina primária por pg do hidrolisado de gelatina. O processo compreende contatar um material de partida de gelatina com pelo menos uma enzima proteolítica que tem atividade de endopeptidase para formar um produto de gelatina digerido por endopeptidase. O produto de gelatina digerido por endopeptidase é em seguida tipicamente contatado com pelo menos uma enzima proteolítica que tem atividade de exopeptidase. Geral mente, as digestões proteolíticas de endopeptidase e exopeptidase procedem para um comprimento suficiente de tempo e são conduzidas sob condições de reação para formar o hidrolisado de gelatina.

[0011] Outro aspecto da invenção abrange um processo para preparar um hidrolisado de gelatina. O processo compreende contatar uma um material de partida de gelatina com uma série de pelo menos três enzimas proteolíticas que têm atividade de endopeptidase para formar um produto de gelatina digerido por endopeptidase. Tipicamente, as três enzimas proteolíticas consistem em Endopeptidase de Bacillus subtilis (por exemplo, Corolase® 7089), Bromelaína (por exemplo, Concentrado de Bromelaína Enzeco®), e Papaína (por exemplo, Papain 6000L). O produto de gelatina digerido por endopeptidase é em seguida contatado com uma série de pelo menos duas enzimas proteolíticas que têm atividade de exopeptidase. Geralmente, as duas enzimas proteolíticas consistem em Exopeptidase de Aspergillus oryzae (por exemplo, Validase® FPII) e Exopeptidase de Aspergillus sojae (por exemplo, Corolase® LAP).

[0012] Ainda um outro aspecto da invenção fornece um hidrolisado de gelatina. O hidrolisado de gelatina terá tipicamente um peso molecular médio de cerca de 100 a abrange de 2000 Da, preferivelmente abrange de 1500 Da e um teor de amina primária médio de cerca de 1,0 x 10'3 a abrange de 1,0 x 10'2μΜοΙ de amina primária por pg de hidrolisado de gelatina. Em uma modalidade, o hidrolisado de gelatina é feito por um processo compreendendo contatar um material de partida de gelatina com uma série de pelo menos três enzimas proteolíticas que têm atividade de endopeptidase para formar um produto de gelatina digerido por endopeptidase. Tipicamente, as três enzimas proteolíticas são selecionadas de Endopeptidase de Bacillus subtilis (por exemplo, Corolase® 7089), Bromelaína (por exemplo, Concentrado de Bromelaína Enzeco®), e Papaína (por exemplo, Papain 6000L). O produto de gelatina digerido por endopeptidase é, em seguida, contatado com uma série de pelo menos duas enzimas proteolíticas que têm atividade de exopeptidase. Geralmente, as duas enzimas proteolíticas são selecionadas de Exopeptidase de Aspergillus oryzae (por exemplo, Validase® FPII) e Exopeptidase de Aspergillus sojae (por exemplo, Corolase® LAP).

[0013] Um aspecto adicional da invenção é direcionado a uma composição de gelatina. A composição compreende um hidrolisado de gelatina e gelatina. Tipicamente, a composição compreenderá de cerca de 1% a cerca de 20% em peso do hidrolisado de gelatina e de cerca de 80% a abrange de 99% em peso de gelatina.

[0014] Outros objetivos e aspectos da invenção estarão em parte evidentes e em parte mostrados em seguida.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0015] A figura 1 mostra a redução na reticulação induzida por formaldeído de LH-1, uma gelatina de pele com óxido de cálcio, na adição de 2 hidrolisados de gelatina diferentes, Tipo BH-3 e Tipo LHSH, como medido pelo procedimento de Endurecimento de Vórtice. Hidrolisado Type BH-3 é um hidrolisado de pele com óxido de cálcio de baixo peso molecular e Tipo LHSH é um hidrolisado de pele com óxido de cálcio da presente invenção.

DESCRiCÂQ DAS MODALIDADES PREFERIDAS

[0016] A presente invenção fornece um novo hidrolisado de gelatina, um processo para preparar o hidrolisado de gelatina e composições de gelatina que compreendem o hidrolisado de gelatina. Foi descoberto que a mistura de um hidrolisado de gelatina de baixo peso molecular e em particular, o hidrolisado de gelatina da presente invenção, com gelatina, reduz a tendência da gelatina de reticular e melhora as propriedades de dissolução aumentando-se as quantidades de glicina livre, outros aminoácidos, e peptideos pequenos no produto de gelatina misturado. Vantajosamente, a presente invenção fornece um meio de custo eficaz para reduzir a reticulação da gelatina com o benefício de manter a composição de aminoácido original de gelatina e sem a necessidade de adicionar compostos não derivados de gelatina como ácido cítrico. Como tal, as composições de hidrolisado de gelatina da presente invenção ainda podem ser comercializadas como produtos naturais. /. Processo para Preparar o Hidrolisado de Gelatina [0017] Um aspecto da presente invenção abrange um processo para produzir um hidrolisado de gelatina que tem um peso molecular médio de cerca de 100 a cerca de 2000 Da, preferivelmente cerca de 1500 Da e um teor de amina primária médio de cerca de 1,0 x 10'3 a cerca de 1,0 x 10 2 μΜοΙ de amina primária por pg do hidrolisado de gelatina. O processo compreende contatar um material de partida de gelatina com pelo menos uma enzima proteolítica que tem atividade de endopeptidase para formar um produto de gelatina digerido por endopeptidase. O produto de gelatina digerido por endopeptidase é em seguida tipicamente contatado com pelo menos uma enzima proteolítica que tem atividade de exopeptidase. Geralmente, as digestões proteolítícas de endopeptidase e exopeptidase procedem durante um período de tempo suficiente e são administradas sob condições de reação para formar o hidrolisado de gelatina.

[0018] O material de partida de gelatina empregado no processo da invenção é tipicamente derivado de colágeno ou tecido rico em colágeno disponível de várias matérias-primas adequadas. Tecidos ricos em colágeno incluem a pele e ossos de animais, tais como de peixe, avícula, porcos ou gado. Geral mente, há dois tipos principais de gelatina derivada de colágeno, Tipo A e Tipo B que diferem-se em seu método de fabricação, Em uma modalidade, o material de partida de gelatina é gelatina Tipo A, Tipo A, com um ponto isoiônico de 7 a 10,0, é derivado de colágeno com pré-trata mento exclusiva mente ácido por métodos geral mente conhecidos na técnica. Em uma modalidade alternativa, o material de partida de gelatina é gelatina Tipo B. Tipo B, com um ponto de isoiônico de 4,8 a 5,8, é o resultado de um pré- tratamento alcalino de colágeno e é produzido por métodos geralmente conhecidos na técnica.

[0019] Em outra modalidade alternativa, o material de partida de gelatina é uma mistura de Tipo A e Tipo B. As quantidades respectivas de gelatina Tipo A e Tipo B podem ser grandemente variadas sem efeito prejudicial sobre as propriedades do hidrolisado de gelatina produzido.

[0020] Em princípio, qualquer um dentre gelatina Tipo A e Tipo B pode ser trocado completamente ou parcialmente por gelatina enzimaticamente produzida. Porém, o processo enzimático para fabricar gelatina não foi até o momento amplamente empregado.

[0021] Independente da modalidade, o material de partida de gelatina conterá normalmente de cerca de 80% a cerca de 90% em peso da proteína, de cerca de 0,1% a cerca de 2% em peso de sais minerais (correspondendo ao teor de cinza) e de cerca de 10% a 15% em peso de água.

[0022] É da mesma forma considerado que as propriedades físicas do material de partida de gelatina pode e variará, dependendo do uso pretendido do hidrolisado de gelatina. O material de partida de gelatina terá um peso molecular médio tipicamente de cerca de 50.000 Da a cerca de 200.000 Da. Em uma modalidade particularmente preferida, o material de partida de gelatina terá um peso molecular médio menor que cerca de 150.000 Da.

[0023] Em uma modalidade, a resistência da força do material de partida de gelatina será de cerca de 50g a cerca de 300g, o pH será de cerca de 3,8 a cerca de 7,5, o ponto isoelétrico será de cerca de 4,7 a cerca de 9,0, a viscosidade será de cerca de 15 a cerca de 75 mP e a cinza será de cerca de 0,1 a cerca de 2,0%.

[0024] Em uma modalidade alternativa quando o material de partida de gelatina é substancialmente gelatina Tipo A, a resistência da força será de cerca de 50g a cerca de 300g, o pH será de cerca de 3,8 a cerca de 5,5, o ponto isoelétrico será de cerca de 7,0 a cerca de 9,0, a viscosidade será de cerca de 15 a cerca de 75 mP e a cinza será de cerca de 0,1 a cerca de 2,0%.

[0025] Em uma modalidade alternativa quando o material de partida de gelatina é substancialmente gelatina Tipo B, a resistência de força será de cerca de 50g a cerca de 300g, o pH será de cerca de 5,0 a cerca de 7,5, o ponto isoelétrico será de cerca de 4,7 a cerca de 5,4, a viscosidade será de cerca de 20 a cerca de 75 mP e a cinza será de cerca de 0,5 a cerca de 2,0%.

[0026] Em uma modalidade preferida onde o hidrolisado de gelatina é empregado na fabricação de produtos farmacêuticos de cápsula dura, o material de partida de gelatina terá uma resistência de força de cerca de 200g a cerca de 300g, uma viscosidade de cerca de 40 a cerca de 60 mP e um pH de cerca de 4,5 a cerca de 6,5. Em ainda outra modalidade preferida onde o hidrolisado de gelatina é empregado na fabricação de produtos farmacêuticos de cápsula de casca macia, o material de partida de gelatina terá uma resistência de força de cerca de 125g a cerca de 200g, uma viscosidade de cerca de 25 a cerca de 45 mP e um pH de cerca de 4,5 a cerca de 6,5.

[0027] No processo da invenção, o material de partida de gelatina é tipicamente misturado ou dissolvido em água por um processo conhecido como dilatação para formar uma solução que compreende cerca de 10% a cerca de 60% de gelatina em peso. Em uma modalidade preferida, a solução tem de cerca de 10% a cerca de 50% de gelatina em peso.

[0028] Em uma outra modalidade adicional, a solução tem de cerca de 20% a cerca de 50% de gelatina em peso. Em ainda um modalidade mais preferida, a solução tem de cerca de 35% a cerca de 40% de gelatina em peso.

[0029] É considerado que gelatinas que têm tamanhos de partícula variados podem ser utilizadas na invenção como material de partida. Por exemplo, o tamanho de partícula da gelatina pode variar de cerca de 0,1 mm a cerca de 10 mm. O tamanho de partícula de gelatina pode ser superior tendo um tamanho de partícula médio de cerca de 0,1 a cerca de 0,3 mm. Em outra modalidade, o tamanho de partícula da gelatina pode ser médio tendo um tamanho de partícula médio de cerca de 0,3 a cerca de 0,8 mm. Em ainda outra modalidade, o tamanho de partícula de gelatina pode ser grande tendo um tamanho de partícula médio de aproximadamente maior que cerca de 0,8 mm. Em geral, o tamanho de partícula do material de partida de gelatina incidirá a quantidade de tempo necessária para gelatina dissolver na solução. Durante o processo de dilatação, a capacidade da gelatina absorver até dez vezes seu peso em água fria é utilizada. Gelatinas que têm uma tamanho de partícula superior dilatam dentro de alguns minutos, gelatinas que têm um tamanho de partícula médio dilatam dentro de cerca de 8 a cerca de 12 minutos, e gelatinas que têm um tamanho de partícula grande dilatam dentro de cerca de uma hora. Tipicamente, soluções de gelatina concentradas baixas, soluções que têm por exemplo, de cerca de 10% a cerca de 20% em peso de gelatina, podem ser preparadas empregando todos os tamanhos de partícula. Para soluções altamente concentradas, soluções que têm, por exemplo, de cerca de 30% a cerca de 35% de gelatina em peso, partículas grossas são tipicamente empregadas porque elas tendem a não agregar-se e produzir menos bolhas de ar ao ser processadas.

[0030] Depois que a gelatina foi trazida na solução através do processo de dilatação e tipicamente antes da adição das enzimas proteolíticas, o pH, temperatura e Estado de Oxirredução da solução é tipicamente ajustada para tomar cuidado de quantidades menores de peróxido residual presente na gelatina de seu processo de fabricação para otimizar a reação de hidrólise, e em particular, garantir que as enzimas proteolíticas contendo cisteína utilizadas na reação de hidrólise funcionam próximo do seu nível de atividade ideal. O pH da solução de gelatina é ajustado e mantido de cerca de 5 a cerca de 7. Em uma modalidade particularmente preferida, o pH da solução de gelatina é ajustado e mantido de cerca de 6,0 a cerca de 6,5. Neste pH, as enzimas proteolíticas detalhadas abaixo estão próximas do seu nível de atividade ideal. O pH da solução de gelatina pode ser ajustado e monitorado de acordo com métodos geralmente conhecidos na técnica. Por exemplo, para diminuir o pH da solução de gelatina um ácido, tal como ácido clorídrico, é tipicamente adicionado. Alternativamente, para aumentar o pH da solução de gelatina uma base, tal como hidróxido de sódio, é tipicamente adicionada. A temperatura da solução de gelatina é ajustada preferivelmente e mantida de cerca de 40Ό a cerca de 65Ό durante a reação de hidrólise de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade particularmente preferida, a temperatura da solução de gelatina é ajustada e mantida de cerca de 50*0 a cerca de 60Ό durante a reação de hidrólise. Em geral, temperaturas acima desta faixa podem desativar enzimas proteolíticas, enquanto temperaturas abaixo desta faixa tendem a reduzir a atividade das enzimas proteolíticas. Dependendo da enzima proteolítica empregada na reação de hidrólise, o Estado de Oxirredução da solução de gelatina tipicamente deveria ser ajustado e mantido ligeiramente como neutro no lado redutor. Níveis altos de oxidantes tendem a inativar algumas das enzimas proteolíticas contendo cisteína empregada na reação de hidrólise, enquanto baixos níveis de redutores podem servir para manter algumas das enzimas proteolíticas, tal como papaína, ativas até que elas sejam desativadas.

[0031] Em geral, a reação de hidrólise é conduzida adicionando-se enzimas proteolíticas à solução de gelatina. Várias enzimas proteolíticas são adequadas para uso no processo da invenção. Em uma modalidade preferida, as enzimas proteolíticas serão enzimas de grau alimentício que têm atividade de endopeptidase ou exopeptidase em um pH de cerca de 5 a cerca de 7 e em uma temperatura de cerca de 40*0 a cerca de 65Ό. Em uma modalidade particul armente preferida, as enzimas proteolíticas serão enzimas de grau alimentício que têm atividade de exopeptidase ou endopeptidase em um pH de cerca de 6 a cerca de 6,5 e em uma temperatura de cerca de 50Ό a cerca de 60Ό.

[0032] Em uma modalidade, a endopeptidase será uma serina proteinase de grau alimentício que pertence a EC 3.4.21. Em uma alternativa desta modalidade, a serina proteinase é uma quimiotripsina proteinase. Em uma outra alternativa desta modalidade, a serina proteinase é uma subtilisina proteinase. Em outra modalidade, a endopeptidase será uma cisteína proteinase de grau alimentício que pertence a EC 3.4.22. Em ainda outra modalidade, a endopeptidase será um aspártico proteinase de grau alimentício que pertence a EC 3.4.23. Em uma outra modalidade, o endopeptidase será uma metaloproteinase de grau alimentício que pertencem a EC 3.4.24. Exemplos não limitantes exemplares de endopeptidases de grau alimentício que podem ser utilizados no processo da invenção incluem Validase® AFP, Validase® FP 500, Concentrado de Protease Alcalina, Validase® TSP, Concentrado de Bromelaína Enzeco®, Corolase® 7089, Papain 600L e Concentrado de Papaína Livre de Sulfito Validase®.

[0033] Em uma outra modalidade, a exopeptidase será um amino peptidase de grau alimentício que pertence a EC 3.4.11. Em outra modalidade, a exopeptidase será uma dipeptidase de grau alimentício que pertencem a EC 3.4.13. Em ainda outra modalidade, a exopeptidase será uma peptidildi ou tripeptidase de grau alimentício que pertencem a EC 3.4.14. Em ainda outra modalidade, a exopeptidase será uma peptidildipeptidase de grau alimentício que pertencem a EC 3.4.15. Em uma outra modalidade, a exopeptidase será uma carbóxi peptidase tipo se ri na de grau alimentício que pertence a EC 3.4.16. Em ainda outra modalidade, a exopeptidase será uma metalo carbóxi peptidase de grau alimentício que pertence a EC 3.4.17. Em uma outra modalidade, a exopeptidase será uma carbóxi peptidase tipo cisteína de grau alimentício que pertence a EC 3.4.18. Em ainda uma outra modalidade, a exopeptidase será uma omega peptidase de grau alimentício que pertence a EC 3.4.19. Um exemplo exemplar de uma exopeptidase de grau alimentício que pode ser utilizada no processo da invenção inclui Validase® FP II ou Co rol a se LAP®.

[0034] Outro exemplo de uma enzima hidrolítica de grau alimentício que pode ser empregada no processo da invenção é Concentrado de Validase® FP. Exemplos de outras enzimas de grau alimentício proteolíticas adequadas são mostradas na Tabela A.

Tabela A

[0035] Tipicamente, combinações de endopeptidases e exopeptidases serão empregadas para catalisar a reação de hidrólise. As enzimas proteolíticas são selecionadas preferivelmente considerando-se a atividade de protease das enzimas e selecionando-se as enzimas que maximizarão a divagem de ligações de peptídeo no material de partida de gelatina. Em uma modalidade preferida, enzimas com atividade de endopeptidase preferencial são adicionadas à solução de gelatina primeiro para formar um produto de gelatina digerido por endopeptidase. O produto de gelatina digerido por endopeptidase é em seguida contatado com enzimas que têm atividade de exopeptidase preferencial sem desativar a(s) endopeptidase(s). É da mesma forma considerado que em certas modalidades enzimas tendo atividade de exopeptidase podem ser adicionadas antes ou ao mesmo tempo que as enzimas que têm atividade de endopeptidase.

[0036] Em uma modalidade preferida, a endopeptidase é selecionada a partir do grupo que consiste em Corolase® 7089, Validase® AFP, Validase® FP 500, Concentrado de Protease Alcalina, Validase® TSP, Concentrado de Bromelaína Enzeco®, Papain 6000L e Concentrado de Papaína Livre de Sulfito Validase®; e a exopeptidase é Validase® FP II ou Corolase® LAP. Em ainda outra modalidade, a endopeptidase é selecionada a partir do grupo que consiste em Corolase® 7089, Concentrado de Bromelaína Enzeco®, e Papain 6000L; e a exopeptidase é selecionada a partir do grupo que consiste em Validase® FPII e Corolase® PAL. Em uma modalidade preferida, cada enzima proteolítica é consecutivamente adicionada ao material de partida de gelatina na seguinte ordem: Corolase® 7089, Concentrado de Bromelaína Enzeco®, Papain 6000L, Validase® FPII e Corolase® LAP. Em uma alternativa desta modalidade, cada enzima proteolítica digere o material de partida de gelatina durante aproximadamente cerca de 0,5 a cerca de 2 horas antes da adição da enzima proteolítica subseqüente.

[0037] A quantidade de enzima proteolítica adicionada à reação de hidrólise pode e variará, dependendo do grau desejado de hidrólise de gelatina e da duração da reação de hidrólise. Em geral, cerca de 0,025% a cerca de 0,15% (p/p) da enzima proteolítica que tem atividade de endopeptidase é adicionado e de cerca de 0,025% a cerca de 0,15% (p/p) da enzima proteolítica que tem atividade de exopeptidase é adicionado para uma reação de hidrólise permanecendo por uma duração de cerca de 5 horas a cerca de 24 horas. Em uma modalidade preferida, cerca de 0,05% a cerca de 0,15% (p/p) de Corolase® 7089, cerca de 0,025% a cerca de 0,075% (p/p) de Concentrado de Bromelaína Enzeco®, cerca de 0,05% a cerca de 0,15% (p/p) de Papain 6000L, cerca de 0,025% a cerca de 0,075% (p/p) de Validase® FPII, e cerca de 0,05% a cerca de 0,15% (p/p) de Corolase® LAP são adicionados ao material de partida de gelatina.

[0038] A reação de hidrólise procederá tipicamente durante até cerca aproximadamente 24 horas. Tipicamente, depois de cerca de 24 horas a qualidade do hidrolisado de gelatina, em termos de cor e odor, começará a diminuir notoriamente. Em outra modalidade, a reação de hidrólise procederá de cerca de 1 hora a cerca de 24 horas. Em ainda outra modalidade, a reação de hidrólise procederá de cerca de 3 horas a cerca de 15 horas. Em ainda uma modalidade mais preferida, a reação de hidrólise procederá de cerca de 5 horas a cerca de 12 horas. Dentro deste período de tempo, condições de processo altamente econômicas e qualidade constante do hidrolisado de gelatina são facilmente realizáveis. Para terminar a reação de hidrólise, a solução de gelatina hidrolisada pode ser aquecida em aproximadamente 90°C para desativar as enzimas proteolíticas. Uma etapa adicional para desativar a cisteína proteases pode ser requerida. Se desse modo requerido, a adição de peróxido de hidrogênio ou outro agente oxidando pode ser adicionada, geralmente não excede 1000 ppm. O hidrolisado de gelatina pode em seguida ser purificado a partir da solução de hidrólise por qualquer meio geralmente conhecido na técnica, por exemplo, microfiltração.

[0039] Tipicamente, o grau de hidrólise (DH) do material de gelatina de partida no processo da invenção é maior que cerca de 13%. Em certas modalidades, o DH é de cerca de 10% a cerca de 20%. Em outras modalidades, o DH é de cerca de 20% a cerca de 30%. Em outra modalidade, o DH é de cerca de 30% a cerca de 40%. Em ainda outra modalidade, o DH é de cerca de 40% a cerca de 50%. Em ainda outra modalidade, o DH é de cerca de 50% a cerca de 60%. Em uma outra modalidade, o DH é de cerca de 60% a cerca de 70%. Em ainda uma outra modalidade adicional, o DH é de cerca de 70% a cerca de 80%. Em ainda outra modalidade, o DH é de cerca de 80% a cerca de 90%. Em ainda outra modalidade, o DH é maior que cerca de 90%. O DH é a porcentagem do número total de ligações de peptídeo no material de partida de gelatina que foi hidrolisado por enzimas proteolíticas. O DH pode ser calculado por métodos geralmente conhecidos na técnica, tal como de acordo com o método de Adler-Nissen (19).

[0040] Foi observado que hidrolisados de gelatina com um peso molecular médio mais baixo são mais eficazes na prevenção do processo de reticulação. Como uma conseqüência, a quantidade de hidrolisado na formulação de gelatina pode ser reduzida a qual otimiza os custos. II. Hidrolisado de Gelatina [0041] Ainda outro aspecto da invenção abrange um hidrolisado de gelatina feito pelo processo da invenção. Em geral, o hidrolisado de gelatina, comparado ao material de partida de gelatina, compreenderá uma mistura de peptídeo de comprimentos diferentes que têm um aumento nas quantidades de glicina livre, outros aminoácidos, e peptídeos pequenos. O hidrolisado de gelatina da mesma forma terá um peso molecular médio mais baixo e teor de amina primária mais alto comparado ao material de partida de gelatina.

[0042] O hidrolisado de gelatina terá tipicamente um peso molecular médio de pelo menos cerca de 100 Da. Em outras modalidades, o hidrolisado de gelatina terá tipicamente um peso molecular médio que não excede cerca de 2000 Da. Em algumas modalidades, o hidrolisado de gelatina terá um peso molecular médio de cerca de 100 Da a cerca de 2.000 Da. Em outras modalidades, o hidrolisado de gelatina terá um peso molecular médio de cerca de 700 Da a cerca de 1800 Da. Em outra modalidade, o hidrolisado de gelatina terá um peso molecular médio de cerca de 700 Da a cerca de 1500 Da. Em ainda outras modalidades, o hidrolisado de gelatina terá um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 1200 Da.

[0043] O peso molecular médio é o peso de um hidrolisado de gelatina como medido por espectrometria de massa de cromatografia líquida de ionização por eletrovaporização (ESI-LC/MS). Por exemplo, um hidrolisado de gelatina que têm um peso molecular médio de cerca de 1200 Da pode ter uma faixa de peso molecular de cerca de 75 Da a 8000 Da.

[0044] Em geral, o hidrolisado de gelatina terá um teor de amina primária médio não menor que cerca de 1,0 x 10'3 μΜοΙ de amina primária por pg de hidrolisado de gelatina. Em outra modalidade, o hidrolisado de gelatina terá um teor de amina primária médio não menor que cerca de 1,5 x 10'3 μΜοΙ de amina primária por pg de hidrolisado de gelatina. Em ainda outra modalidade, o hidrolisado de gelatina terá um teor de amina primária médio não menor que cerca de 2,0 x 10'3 μΜοΙ de amina primária por pg de hidrolisado de gelatina. Em uma modalidade adicional, o hidrolisado de gelatina terá um teor de amina primária médio de cerca de 1,0 x 10'3 a cerca de 1,0 x 10'2 μΜοΙ de amina primária por pg de hidrolisado de gelatina. O teor de amina primária do hidrolisado de gelatina é medido por derivatização e absorção de UV subseqüente (6-8) como ilustrado nos Exemplos.

[0045] O hidrolisado de gelatina da presente invenção compreende polipeptídeos tipicamente de até cerca de 75 aminoácidos no comprimento, preferivelmente até 50 aminoácidos no comprimento. Em uma modalidade, o polipeptídeo médio que compreende o hidrolisado de gelatina é de cerca de 6 a cerca de 18 aminoácidos no comprimento. Em outra modalidade, o polipeptídeo médio contido no hidrolisado de gelatina da presente invenção é de cerca de 9 a cerca de 20 aminoácidos no comprimento. O comprimento de uma cadeia de polipeptídeo pode ser determinado indiretamente por cromatografia de exclusão de tamanho/ cromatografia líquida de alto desempenho (SEC/HPLC).

[0046] Em uma modalidade, o hidrolisado de gelatina terá um peso molecular médio de cerca de 100 Da a cerca de 2.000 Da, um teor de amina primária médio de cerca de 1,0 x 10'3 a cerca de 1,0 x 10'2 μΜοΙ de amina primária por pg de hidrolisado de gelatina, e um comprimento de polipeptídeo médio de até cerca de 20 aminoácidos. Em ainda outra modalidade, o hidrolisado de gelatina terá um peso molecular médio de cerca de 700 Da a cerca de 1500 Da, um teor de amina primária médio de cerca de 1,0 x 10‘3 a cerca de 2,0 x 10'3 μΜοΙ de amina primária por pg de hidrolisado de gelatina, e um comprimento de polipeptídeo médio de até cerca de 18 aminoácidos. Em outra modalidade, o hidrolisado de gelatina terá um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 1200 Da, um teor de amina primária médio de cerca de 1,0 x 10'3 a cerca de 2,0 x 10'3 μΜοΙ de amina primária por pg de hidrolisado de gelatina, e um comprimento de polipeptídeo médio de cerca de 4 a cerca de 1 aminoácidos. III. Composições de Gelatina [0047] Outro aspecto da invenção abrange uma composição de gelatina que compreende um hidrolisado de gelatina e gelatina de baixo peso molecular Surpreendentemente, foi constatado que quando um hidrolisado de gelatina de baixo peso molecular for misturado com gelatina de peso molecular mais alto, ele reduz a reticulação da gelatina e melhora as propriedades de dissolução aumentando-se as quantidades de glicina livre, outros aminoácidos, e peptídeos pequenos no produto de gelatina misturado, como mostrado nos Exemplos.

[0048] Vários hidrolisados de gelatina diferentes são adequados para uso na composição de gelatina. Em uma modalidade, o hidrolisado de gelatina será um hidrolisado enzimaticamente digerido. Por meio de exemplo não limitante, o hidrolisado de gelatina da presente invenção é produzido por um procedimento de hidrólise enzimática, como detalhado acima. Em outra modalidade, o hidrolisado de gelatina será um hidrolisado digerido por ácido. Por exemplo, hidrólise ácida pode ser administrada digerindo um material de partida de gelatina com cerca de 6 N de ácido clorídrico durante cerca de 24 horas em uma temperatura de reação de cerca de 110*0. Em ainda outra modalidade, o hidrolisado de gelatina será um hidrolisado digerido por base. Por meio de exemplo não limitante, hidrólise de base pode ser administrada digerindo um material de partida de gelatina com uma base forte, tal como hidróxido de sódio. Hidrólise de base e ácido resultará tipicamente em um hidrolisado que tem aminoácidos livre. Em cada modalidade (isto é, hidrólise de base, ácida e enzimática), materiais de partida de gelatina adequados são detalhados na seção I acima, que delineiam propriedades estruturais e funcionais para materiais de partida de gelatina a ser empregados no processo da invenção.

[0049] Tipicamente, hidrolisados de gelatina terão um baixo peso molecular. Em uma modalidade, o peso molecular médio será de cerca de 400 Da a cerca de 2000 Da. Em outra modalidade, o hidrolisado de gelatina terá um peso molecular médio de cerca de 700 Da a cerca de 1500 Da. Além disso, o hidrolisado de gelatina da mesma forma terá um teor de amina primária médio que varia de cerca de 1,0 x 10"3 a cerca de 1,0 x 10'2 μΜοΙ de amina primária por μg de hidrolisado de gelatina.

[0050] Em outra modalidade, o teor de amina primária médio pode variar de cerca de 1,0 x 10"3 a cerca de 2,0 x 10'3 μΜοΙ de amina primária por μg de hidrolisado de gelatina.

[0051] Em ainda outra modalidade, o teor de amina primária médio pode variar de cerca de 2,0 x 10'3 a cerca de 4,0 x 10'3 μΜοΙ de amina primária por μg de hidrolisado de gelatina. Em ainda uma outra modalidade, o teor de amina primária médio pode variar de cerca de 4,0 x 10'3 a cerca de 6,0 x 10'3 μΜοΙ de amina primária por μg de hidrolisado de gelatina. Em ainda uma modalidade adicional, o teor de amina primária médio pode variar de cerca de 6,0 x 10'3 a cerca de 1,0 x 10~2 μΜοΙ de amina primária por μg de hidrolisado de gelatina.

[0052] O hidrolisado de gelatina da mesma forma geralmente terá um comprimento de cadeia de polipeptídeo médio de cerca de 4 a cerca de 50 aminoácidos. Em uma modalidade, o polipeptídeo médio que compreende o hidrolisado de gelatina é até cerca de 30 aminoácidos no comprimento. Em outra modalidade, o polipeptídeo médio que compreende o hidrolisado de gelatina é de cerca de 9 a cerca de 20 aminoácidos no comprimento. O peso molecular médio, teor de amina primária médio e comprimento de cadeia de polipeptídeo médio são determinados como detalhado na seção II.

[0053] Em uma modalidade preferida, o hidrolisado de gelatina empregado na composição será o hidrolisado da presente invenção como detalhado na seção II. Exemplos de outros hidrolisados de gelatina exemplares que podemk ser empregados na composição são delineados na Tabela B. Misturas dos hidrolisados de gelatina anteriormente descritos podem da mesma forma ser empregadas. Tabela B

[0054] O hidrolisado de gelatina pode ser misturado com vários tipos de gelatina que tem uma ampla faixa de propriedades físicas e funcionais. A escolha de uma gelatina particular pode e variará, grandemente dependendo do uso planejado da composição de gelatina. Em geral, independente da modalidade ou uso planejado, a gelatina é derivada tipicamente de colágeno ou tecido rico em colágeno disponível de várias matérias-primas adequadas tal como da pele e ossos de animais. Em uma modalidade, a gelatina é gelatina Tipo A. Em outra modalidade, a gelatina é gelatina Tipo B. Em ainda outra modalidade, a gelatina é uma mistura de gelatina Tipo A e Tipo B. Novamente, a gelatina preparada em um processo enzimático pode ser empregada para substituir gelatina Tipo A e/ou Tipo B.

[0055] A gelatina, independente da modalidade, conterá preferivelmente de cerca de 80% a cerca de 90% em peso de proteína, de cerca de 0,1% a cerca de 2% em peso de sais minerais (teor de cinza) e de cerca de 10% a 15% em peso de água.

[0056] A gelatina tipicamente terá um peso molecular médio alto. Em uma modalidade, a gelatina terá um peso molecular médio maior que cerca de 200.000 Da. Em outra modalidade, a gelatina terá um peso molecular médio maior que cerca de 150.000 Da. Em ainda outra modalidade, a gelatina terá um peso molecular médio de cerca de 100.000 Da a cerca de 200.000 Da.

[0057] Em uma modalidade, a resistência de força da gelatina será de cerca de 50g a cerca de 300g, o pH será de cerca de 3,8 a cerca de 7,5, o ponto isoelétrico será de cerca de 4,7 a cerca de 9,0, a viscosidade será de cerca de 15 a cerca de 75 mP e a cinza será de cerca de 0,1 a cerca de 2,0%.

[0058] Em uma modalidade alternativa quando a gelatina for substancialmente gelatina Tipo A, a resistência de força será de cerca de 50g a cerca de 300g, o pH será de cerca de 3,8 a cerca de 5,5, o ponto isoelétrico será de cerca de 7,0 a cerca de 10,0, a viscosidade será de cerca de 15 a cerca de 75 mP e a cinza será de cerca de 0,1 a cerca de 2,0%.

[0059] Em uma modalidade alternativa quando a gelatina for substancialmente gelatina Tipo B, a resistência de força será de cerca de 50g a cerca de 300g, o pH será de cerca de 5,0 a cerca de 7,5, o ponto isoelétrico será de cerca de 4,8 a cerca de 5,8, a viscosidade será de cerca de 20 a cerca de 75 mP e a cinza será de cerca de 0,5 a cerca de 2,0%.

[0060] Em uma modalidade alternativa quando a composição de gelatina é empregada na fabricação de produtos farmacêuticos de cápsula dura, a gelatina terá uma resistência de força de cerca de 200g a cerca de 300g, uma viscosidade cerca de 40 a cerca de 60 mP e um pH de cerca de 4,5 a cerca de 6,5.

[0061] Em ainda outra modalidade preferida onde a composição de gelatina é empregada na fabricação de produtos farmacêuticos de cápsula de casca macia, a gelatina terá uma resistência de força de cerca de 125g a cerca de 200g, uma viscosidade de cerca de 25 a cerca de 45 mP e um pH de cerca de 4,5 a cerca de 6,5.

[0062] A composição de gelatina da invenção geralmente compreenderá de cerca de 1% a cerca de 20% em peso do hidrolisado de gelatina e de cerca de 80% a cerca de 99% em peso da gelatina. Em outra modalidade, a composição de gelatina compreenderá de cerca de 1% a cerca de 5% em peso do hidrolisado de gelatina e de cerca de 95% a cerca de 99% em peso da gelatina. Em ainda outra modalidade, a composição de gelatina compreenderá de cerca de 5% a cerca de 10% em peso do hidrolisado de gelatina e de cerca de 90% a cerca de 95% em peso da gelatina. Em outra modalidade, a composição de gelatina compreenderá de cerca de 10% a cerca de 15% em peso do hidrolisado de gelatina e de cerca de 85% a cerca de 90% em peso da gelatina. Em uma modalidade adicional, a composição de gelatina compreenderá de cerca de 15% a cerca de 20% em peso do hidrolisado de gelatina e de cerca de 80% a cerca de 85% em peso da gelatina. Em uma modalidade típica, a composição de gelatina compreenderá uma relação de hidrolisado de gelatina a gelatina de cerca de 1:4 a cerca de 1:99 (p/p).

[0063] Em uma modalidade preferida, a composição de gelatina compreenderá o hidrolisado de gelatina da presente invenção e uma gelatina de grau farmacêutico de peso molecular mais alto. Em uma modalidade, a composição de gelatina compreenderá de cerca de 5% a cerca de 10% em peso do hidrolisado de gelatina e de cerca de 90% a cerca de 95% em peso da gelatina de grau farmacêutica. Em outra modalidade, a composição de gelatina compreenderá de cerca de 10% a cerca de 15% em peso do hidrolisado de gelatina e de cerca de 85% a cerca de 90% em peso da gelatina de grau farmacêutica.

[0064] Vantajosamente, composições de gelatina da presente invenção e desta modalidade tipicamente têm reduzido a reticulação quando medida pelo teste de endurecimento do vórtice e teste de viscosidade. Composições de gelatina desta modalidade têm tipicamente um tempo de endurecimento do vórtice de cerca de 200 a cerca de 300 segundos. Em outra modalidade, o tempo de endurecimento do vórtice é maior que cerca de 300 segundos. O procedimento para determinar o tempo de endurecimento do vórtice é descrito nos Exemplos. Composições de gelatina desta modalidade tipicamente da mesma forma têm uma viscosidade inicial média de cerca de 10 a cerca de 15 cP e depois da adição de menos que cerca de 0,5% em peso de [2-(4-dimetil-carbamoil-piridino)-etano-1-sulfonato ((OB1207® de H.W. Sands Corporation) à composição de gelatina durante cerca de duas horas em uma temperatura de reação de cerca de 60°C, a composição de gelatina tem uma viscosidade média de cerca de 15 a cerca de 50 cP. O procedimento para medir a viscosidade é descrito nos exemplos.

[0065] Em uma modalidade, glicina como um composto separado pode ser adicionada à composição de gelatina da invenção. A glicina pode ser adicionada à composição de gelatina em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 5% em peso. Em mais uma modalidade típica, a quantidade de glicina será de cerca de 1,5% a cerca de 2,5% em peso. Em ainda outra modalidade, ácido cítrico pode ser adicionado à composição de gelatina. O ácido cítrico pode ser adicionado em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 5% em peso. Em mais uma modalidade típica, ácido cítrico é adicionado à composição de gelatina em uma quantidade de cerca de 0,5% a cerca de 1,5%.

[0066] A composição de gelatina da invenção pode ser empregada em várias aplicações incluindo como um ingrediente alimentício, como um ingrediente cosmético e como um ingrediente fotográfico. Por causa da tendência reduzida da composição de gelatina reticular para e propriedades de dissolução melhoradas, em uma modalidade preferida, a composição de gelatina é empregada na fabricação de produtos farmacêuticos.

[0067] Em uma modalidade preferida, a composição de gelatina é empregada na fabricação de cápsulas de gelatina dura. Como detalhado acima, quando a composição de gelatina é empregada na fabricação de produtos farmacêuticos de cápsula dura, a gelatina terá uma resistência de força de cerca de 200g a cerca de 300g, uma viscosidade de cerca de 40 a cerca de 60 mP e um pH de cerca de 4,5 a cerca de 6,5. Uma formulação de cápsula dura típica compreenderá aproximadamente 30% em peso da composição de gelatina da invenção, aproximadamente 65% em peso de água, cerca de 5% em peso de uma tintura adequada, e conterá um pigmento quando necessário. As cápsulas de gelatina dura podem ser feitas de acordo com qualquer método geralmente conhecido na técnica.

[0068] Em ainda outra modalidade preferida, a composição de gelatina é empregada na fabricação de gelatina de cápsula macia. Como detalhado acima, quando a composição de gelatina é empregada na fabricação de produtos farmacêuticos de cápsula de casca macia, a gelatina terá uma resistência de força de cerca de 125g a cerca de 200g, uma viscosidade de cerca de 25 a cerca de 45 mP e um pH de cerca de 4,5 a cerca de 6,5. Uma formulação de gelatina de cápsula macia típica compreenderá de cerca de 40% a cerca de 45% em peso da composição de gelatina da invenção, de cerca de 15% a cerca de 35% em peso de plasticizador e de cerca de 20% a cerca de 45% em peso de água. As cápsulas de gelatina macias podem ser feitas de acordo com qualquer método geralmente conhecido na técnica. Exemplos típicos para plasticizadores são glicerol (normalmente empregado na forma de uma solução aquosa com 85 % em peso) e sorbitol (normal mente empregado na forma de uma solução aquosa com 70% em peso) e misturas destes.

[0069] Todas as publicações, patentes, pedidos de patente e outras referências citadas neste pedido estão aqui incorporados por referência em sua totalidade como se cada publicação individual, patente, pedido de patente ou outra referência fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência. DEFINIÇÕES

[0070] "Anfotérica" é uma substância que pode ser tanto catiônica quanto aniônica no caráter, tal como uma proteína.

[0071] "Valor de Força" é o grau de firmeza de um gel medido em gramas. O valor de Força é a força requerida para uma punção de forma definida e dimensão para penetrar 4 mm de profundidade na superfície de uuma solução de gelatina com 6,7% em peso. O valor de Força das gelatinas comercial mente disponíveis está entre 8üg e 280g.

[0072] "Lasca de osso" é osso cortado, desengraxado e secado do qual, subseqüente à desmineralização (vide maceração), a gelatina é produzida.

[0073] "Reticulação" refere-se ao mecanismo pelo qual, por exemplo, uma película é formada sobre uma cápsula macia farmacêutica. Tipicamente, a reticulação diminui as propriedades de dissolução da cápsula.

[0074] "Da" é uma abreviação para dalton.

[0075] "EC" é uma abreviação para Classificação de Enzima. É tipicamente empregada como um prefixo na designação numérica de uma enzima.

[0076] "Endopeptidase" é uma enzima tipicamente pertencente dentro da subclasse EC 3.4, peptídeo hidrolases, que hidrolisa ligações de peptídeo não terminais em oligopeptídeos ou polipeptídeos e que compreende quaisquer subclasses de enzima EC 3.4.21-99.

[0077] "Exopeptidase" é uma enzima de um grupo de peptídeo hidrolases dentro da subclasse EC 3.4 que catalisa a hidrólise de ligações de peptídeo adjacentes ao grupo de carboxila ou amina terminal de um oligopeptídeo ou polipeptídeo. O grupo tipicamente abrange subclasses de enzima 3.4.11-3.4.19.

[0078] "Enzima de Grau Alimentício" é uma enzima que está tipicamente livre de organismos geneticamente modificados e está segura quando consumida por um organismo, tal como um ser humano. Tipicamente, a enzima e o produto do qual a enzima pode ser derivada são produzidos de acordo com as diretrizes de FDA aplicáveis.

[0079] "Cápsulas duras" são cápsulas ocas de vários tamanhos feitas de gelatina pura com ou sem a adição de tintura. Elas compreendem uma parte superior e inferior; estas são unidas juntamente logo que o preenchimento é concluído.

[0080] "Gelatina instantânea" é gelatina em pó capaz de dilatar em água fria.

[0081] "Microgel" é considerado ser gelatina com um peso molecular maior que 300.000 Da.

[0082] "Escleroproteínas" são aquelas proteínas que fornecem uma função de apoio dentro do corpo. Elas são insolúveis em água e possuem uma estrutura fibrosa. Estas proteínas incluem, por exemplo, queratina que ocorre no cabelo e unhas, as elastinas e os colágenos que ocorrem no tecido conjuntivo e de apoio, pele, osso e cartilagem.

[0083] "Cápsulas macias" são cápsulas elásticas feitas de gelatina para preencher com mistura de ingrediente ativo/excipiente. Elas podem ser produzidas com espessura de parede diferente e com ou sem uma costura.

[0084] "Divisão" é uma matéria-prima de gelatina; meia-camada do tecido conjuntivo da pele do gado.

[0085] "Hélice tripla" é uma estrutura básica de colágeno que consiste em 3 cadeias de proteína. Estes possuem freqüentemente seqüências de aminoácido um pouco diferentes.

[0086] "Gelatina tipo A" é gelatina digerida por ácido.

[0087] "Gelatina tipo B" é gelatina digerida por álcali (básico).

[0088] "Tipo LBSH" é um hidrolisado de osso com oxido de cálcio da presente invenção produzido por digestão proteolítica de gelatina.

[0089] "Tipo LHSH" é um hidrolisado de pele com oxido de cálcio da presente invenção produzido por digestão proteolítica de gelatina.

[0090] Visto que várias mudanças podem ser feitas nos compostos anteriores, produtos e métodos sem afastarem-se do escopo extensão da invenção, é pretendido que toda matéria contida na descrição anterior e nos exemplos dados abaixo, seja interpretada como ilustrativa e não em um sentido limitante.

EXEMPLOS

[0091] Os exemplos seguintes ilustram a invenção.

Exemplo 1 [0092] O hidrolisado de gelatina da invenção pode ser feito de acordo com o seguinte processo. Uma solução que contém 34% em peso de gelatina (gelatina de osso com oxido de cálcio Tipo B, Força = 100) foi feita adicionando-se 1,94 kg de água para 1,0 kg de gelatina processada desionizada. A gelatina foi deixada hidratar durante 1 hora e em seguida colocada em um banho de água a 55°C para dissolver. Logo que completamente dissolvida, o pH da solução de gelatina foi ajustado para 6,0-6,5 com hidróxido de sódio aquoso. Cloreto de cálcio foi adicionado à solução de gelatina na quantidade de 0,037% em p/p com a quantidade de gelatina na solução (CDG - Gelatina Seca Comercial (tendo um teor de umidade de cerca de 10% em peso), todas as adições neste procedimento foram baseadas nesta quantidade). Uma alíquota foi tirada e foi diluída em 5% em peso para testar o Estado de Oxirredução da solução. Tiras de teste de peróxido (EM Science) foram empregadas para medir rapidamente a quantidade de peróxido. Se o peróxido estiver presente, Fermcolase® 1000F (Genencor International Inc.) é adicionado em incrementos de 0,5 ml. Depois de cada adição, a solução foi deixada reagir durante 30 minutos antes de repetir a medida de peróxido. Adições de Fermcolase® 1000F foram repetidas até o nível de peróxido aproximar-se de zero.

[0093] Corolase® 7089 (AB Enzymes) foi adicionado à solução na quantidade de 0,1% em p/p. Próximo do final do tempo de reação de 1 hora e antes da adição da próxima enzima, uma amostra pequena foi tirada e o peso molecular foi analisado. Este processo foi repetido para cada dentre as adições de enzima. Depois de um tempo de reação de 1 hora, 0,05% em p/p de Concentrado de Bromelaína Enzeco® (Enzyme Development Corp.) foi adicionado e a solução foi deixada reagir durante mais uma hora. Papain 6000L líquida (Valley Research) foi em seguida adicionado 0,1% em p/p. Depois de 1 hora, 0,05% em p/p de Validase® FPII (Valley Research) foi adicionado à solução e foi reagido durante mais hora. A adição da enzima final foi 0,1% em p/p de Corolase® LAP (AB Enzymes). Depois de 1 hora, a solução foi aquecida a 90°C para desativar as enzimas funcionais restantes. Em alguns exemplos, um adicional de 30-40 ppm de peróxido de hidrogênio foi adicionado para assegurar-se de que a Papai n 6000L foi desativada. Nenhuma prova da atividade enzimática depois da desativação de calor foi vista. Um sumário que alista os detalhes das cinco enzimas empregadas durante a hidrólise é dado na Tabela 1. Tabela 1 [0094] O hidrolisado de gelatina obtido neste exemplo foi empregado como hidrolisado Tipo LHSH nos exemplos seguintes. O peso molecular médio foi determinado para ser cerca de 1500 Da. Exemplo 2 [0095] O seguinte procedimento foi empregado para quantificar o grau de redução na reticulação para várias composições de gelatina.

Nas experiências de controle, 10,0 + 0,1 g de uma gelatina foi adicionado a um béquer de 250 ml, ao qual foi adicionado 90,0 + 0,5 g de água desionizada. Um vidro de relógio foi colocado no béquer e a gelatina foi permitida dilatar durante 30 - 60 minutos. A gelatina dilatada foi colocada em um banho de água a 60 + 0,1 °C durante 15 -30 minutos ou até que toda a gelatina fosse dissolvida. Uma barra de agitação magnética foi colocada na solução de gelatina e o pH foi ajustado em uma placa de agitação com NaOH ou H2S04 diluído em um pH de 7,00 ± 0,05 depois do qual a barra de agitação magnética foi removida. A solução foi colocada em um banho de água a 40 ± 0,1°C durante 15-60 minutos para resfriar. Um motor de agitação digital (Heidolph Brinkman 2102) equipado com um misturador de 4 lâminas foi empregado para criar o vórtice em 750 + 10 RPM. Imediatamente, 20 ± 0,5 ml de uma solução de formalina a 10% tamponada por fostato de pH 7 (Fisher Scientific) foram adicionados. O tempo de endurecimento do vórtice foi registrado (em segundos) no momento quando a solução de gelatina reticulada desmoronou-se no eixo do misturador de 4 lâminas.

[0096] Em experiências que envolvem composições de gelatina que contêm aditivos, uma porcentagem da gelatina foi substituída com o aditivo desejado (por exemplo, uma amostra adicionada ao hidrolisado a 10% continha 9,0 g de gelatina e 1,0 g de hidrolisado). As gelatinas que exibem um tempo de endurecimento de vórtice mais longo são acreditadas ter tendências reduzidas para reticulação induzida por formaldeído.

[0097] Como mostrado na Tabela 2, o teste de endurecimento do vórtice confirma os resultados anteriores que a combinação de glicina e ácido cítrico pode reduzir a quantidade de reticulação da gelatina. Mais importantemente, a adição apenas de glicina tem um efeito dramático sobre o tempo de endurecimento do vórtice desta amostra de gelatina de osso com óxido de cálcio particular. A adição de citrato não reduziu a reticulação.

[0098] Curiosamente, a adição de 1,5% de citrato promoveu a reticulação nesta amostra particular. Estes resultados podem servir para sustentar a posição do papel da glicina como um descontaminante de aldeído neste sistema modelo. Os efeitos prejudiciais sobre a reticulação experimentada por uma das amostras contendo apenas citrato não puderam ser facilmente explicado, [0099] O teste de endurecimento de vórtice é aqui empregado como uma ferramenta analítica para uma rápida avaliação do impacto de aditivos para o comportamento de reticulação de composições de gelatina.

Tabela 2 [uuuiuj a tigura i oetaina os ereitos oa aaiçao ao maronsaao i ipo LHSH, um hidrolisado de gelatina de pele com óxido de cálcio obtido em um processo similar ao Exemplo 1 (PM ~1200 Da), e um hidrolisado de gelatina Tipo BH-3 (PM - 2200 Da) em LH-1, uma gelatina de pele com óxido de cálcio típica com força de 260 g e uma viscosidade de 6,67% 45 mP. O termo viscosidade de 6,67% é empregado como uma abreviação para uma viscosidade observada com uma solução de CDG a 6,67% em água. Os resultados mostram um aumento no tempo de endurecimento de vórtice para ambos os hidrolisados adicionados. Entretanto, o desempenho foi melhor na adição do hidrolisado da presente invenção, Tipo LHSH. Várias gelatinas de pele exibiram esta reticulação muito rápida do que foi previamente visto apenas em gelatinas de osso com oxido de cálcio com uma viscosidade de 6,67% próxima a 60 mP.

[00101] A Tabela 3 mostra o tempo de endurecimento de vórtice de várias gelatinas de pele com óxído de cálcio em relação a propriedades diferentes de peso molecular. Nenhuma tendência conclusiva poderia ser deduzida com as exceções de uma possível correlação de uma porcentagem aumentada de microgel e viscosidade com uma reticulação aumentada e uma redução subseqüente no tempo de endurecimento do vórtice.

Tabela 3 [00102] A Tabela 4 mostra os resultados da adição de 10% de hidrolisado Tipo LBSH do Exemplo 1 (PM médio = 1500), um hidrolisado de gelatina Tipo BB 4, e glicina em uma gelatina de osso com oxido de cálcio de alta viscosidade com uma força de 240 g e 6,67% de viscosidade de 64 mP. Este extrato de alta viscosidade exibe propriedades de reticulação similares como algumas gelatinas de osso com óxido de cálcio com viscosidade muita mais baixa. Esta gelatina mostrou uma redução significante em reticulação na presença de todos os três aditivos. Entretanto, o hidrolisado Tipo LBSH aumentou o tempo de endurecimento do vórtice em quase 30% em comparação ao Tipo BB-4. Glicina mostrou a maior redução na reticulação e aumento subseqüente no tempo de endurecimento do vórtice como mostrado na Tabela 4.

Tabela 4 luinuõsj a laoeia o mostra que os resunaaos ae uma expenencia tentando determinar a quantidade de hidrolisado de baixo peso molecular necessitando igualar o desempenho de glicina quando adicionada a uma gelatina farmacêutica de osso com óxido de cálcio de viscosidade média (Força = 244, 6,67% vis. = 47,0 mP) como medido pelo teste de endurecimento de vórtice. Os resultados indicam que 4 - 5% do Tipo LBSH é necessário para igualar o desempenho de 2,5% de glicina, enquanto 5 - 6% do Tipo BB-4 é necessário. Similarmente, 10% do Tipo LBSH e 11-12% do Tipo BB-4 é necessário para igualar a redução na reticulação obtida por 5,0% de glicina.

Tabela 5 bxempio 3 [00104] O agente de endurecimento de gelatina OB1207® [2-{4-D i m eti I ca rba m oi I - pi rid i no )-eta n o-1 -s ul fo nato] foi adquirido a partir de H.W. Sands Corporation. OB1207® foi observado como uma substituição de formaldeído em emulsões fotográficas. A reação 1 descreve a reticulação de OB1207® com gelatina. A formação de amida e ligações de éster entre cadeias de gelatina através da reação com OB1207® pode rígorosamente imitar o tipo de reticulação visto em amostras de gelatina que foram envelhecidas e/ou realçadas devido à exposição a extremos de calor e umidade.

Reação 1 [00105] Em experiências de controle, 15,0 + 0,1 g de gelatina (gelatina de osso com óxido de cálcio Tipo B, Força = 200} foram adicionados em um frasco de 250 ml. A isto, 95,0 + 0,5 g de água desionizada e uma barra de agitação magnética foram adicionados. A gelatina foi revestida com parapelícula e permitida inchar durante 30 -60 minutos. O frasco foi colocado em um banho de água a 60 + 1,0Ό durante 15-20 minutos ou até que toda a gelatina fosse dissolvida, A viscosidade desta solução foi medida empregando um Brookfield DV-III + Reômetro em 50 RPM e 60,0 + 0,113. Uma solução feita de 0,30 g de OB1207® dissolvida em 10,0 g de água desionizada foi lentamente adicionada à gelatina no frasco enquanto agitando em uma placa de agitação. O frasco foi colocado outra vez no banho de água. A viscosidade da solução foi medida 2 horas depois. Em experiências contendo a adição de hidrolisados, uma porcentagem da gelatina de controle foi substituída com o hidrolisado desejado {Isto é, uma amostra adicionada ao hidrolisado a 10% continha 13,5 g de gelatina e 1,5 g de hidrolisado).

[00106] Os resultados de experiências de viscosidade envolvendo uma força médio e gelatina de viscosidade (LB-1) depois da reticulação com OB1207® são determinados na Tabela 6. 0 controle A LB-1 não teve hidrolisado ou OB1207® adicionado, visto que o controle B LB-1 não teve hidrolisado, porém, foi retículado com OB1207®. Depois de duas horas, o Controle B foi muito viscoso ao ler no reômetro de Brookfield indicando um grau muito alto de reticulação.

As amostras contendo hídrolisados mostraram um grau diminuído de reticulação, com os melhores resultados obtidos com Tipo LBSH, o hidrolisado da presente invenção, especial mente no nível a 10%. Tabela 6 Exemplo 4 [00107] O seguinte procedimento foi empregado para determinar o teor de aminas primárias no hidrolisado de gelatina. O uso de ácido trinitrobenzenossuIfônico (TNBS) para medir a quantidade de aminas primárias foi descrito por Alder-Nissen (6). Uma versão modificada deste procedimento foi empregada para mediras quantidades relativas de aminas primárias em hídrolisados de gelatina. A Reação 2 descreve a derivatização de uma amina primária com TNBS.

Reação 2 [00108] Glicina (Acros) na quantidade de 2,000 ± 0,002 g foi adicionada a um béquer de 250 ml e trazida até um peso de 200,00 + 0,01 g empregando uma solução de dodecil sulfato de sódio a 1% ("SDS", Aldrich) (solução de glicina agora referida como G-1). Hidrolisados de gelatina na quantidade de 4,000 ± 0,002 g foram adicionados ao béquer de 250 ml e trazidos a um peso de 100 + 0,01 g empregando uma solução a 1% de SDS (solução de hidrolisado agora referida como H-1). Os béqueres contendo as soluções de G-1 e H-1 foram colocados em uma chapa elétrica e aquecidos em uma temperatura de 80 - 85Ό para dissolver completamente e dispersar os sólidos. As soluções foram resfriadas em temperatura ambiente e em seguida 1,00 g de G-1 foi adicionado em um béquer de 250 ml e trazido a um peso de 200,00 ±0,01 g empregando a solução de SDS a 1% (G-2). Diluições (padrões de G-3) de G-2 foram feitas em 50 ml de frascos volumétricos adicionando-se 50, 37,5, 25, 12,5, 5, e 0,5 ml de G-2, respectiva mente. Os frascos foram trazidos até a marca empregando-se a solução de SDS a 1%. A solução H-1 foi diluída para criar H-2 adicionando-se 1,00 g de H-1 e trazendo até a um peso de 200,00 ± 0,01 g em um béquer de 250 ml empregando a solução de SDS a 1%. Em um tubo de teste de 15 ml foi adicionado a 2 ml de um tampão de fosfato de 0,2125 M (feito adicionando-se de 0,2125 M de NaH2P04 a 0,2125 M de Na2HP04 até que um pH de 8,20 ± 0,02 seja obtido), e 250 μΙ_ dos padrões G-3. Isto corresponde a um calibre de glicina de padrão seis contendo 0,1667, 0,1250, 0,0833, 0,0417, 0,0167, e 0,0017 hitioIs de aminas primárias por amostra, respectivamente. Similarmente, 250 μΙ de cada solução de H-2 foi adicionado a um tubo de teste de 15 ml (correspondendo a 50 ng de amostra) junto com 2 ml do tampão de fosfato. Uma amostra de controle é feita adicionando-se 250 μΙ da solução SDS a 1% em um tubo de teste de 15 ml com 2 ml de tampão. Uma solução de trinitrobenzeno a 0,1% foi feita adicionando-se 170 ± 2 μΙ de uma solução de TNBS de 1M (Sigma) em um frasco volumétrico de 50 ml e trazida até a marca com água desionizada e imediatamente revestida com folha de alumínio quando TNBS for sensível à luz.

[00109] As seguintes etapas foram todas administradas em um ambiente escuro fotográfico. Aos tubos de teste, 2 ml da solução de TNBS a 1% foram adicionados. Os tubos de teste foram em seguida vortexados (Fisher Scientific Vortex Genie 2) durante 5 segundos. As amostras foram em seguida colocadas em um banho de água a 50,0 + 0,1*0 durante 30 minutos. As amostras foram, em seg uida, vortexadas durante um adicional de 5 segundos e colocadas outra vez no banho de água durante 30 minutos. As amostras foram removidas do banho de água e 4 ml de solução de HCI a0,100 N foram adicionados para terminar a reação de TNBS. As soluções foram vortexadas durante 5 segundos e permitidas resfriar durante 10 minutos (resfriamento mais longo pode levar a turvação por causa de SDS). A absorbância de cada amostra foi lida em 340 nm (Espectrofotômetro Beckman DU-7) contra uma cubeta com água de água. As quantidades de aminas primárias nas amostras foram calculadas empregando-se um cálculo de regressão linear com base em absorvência dos padrões de glicina.

[00110] A derivatização de aminas primárias com o-ftaldialdeído (OPA) para medir a proteólise em proteínas do leite foi descrita por Church e outros (7). Nielsen e outros (8) empregaram OPA para medir o grau de hidrólise em outras proteínas de alimentação, incluindo aquele da gelatina. Uma vantagem do método de Nielsen é a substituição do ditiotreitol mais agradável ao meio ambiente (DTT -Reagente de Cleland) para β-mercaptoetanol como o agente de redução contendo enxofre. Este procedimento é adaptado a partir do funcionamento de Nielson e outros. A reação 3 descreve a reação de aminas primárias com OPA na presença de DTT.

Reação 3 [00111] O reagente de OPA foi preparado adicionando-se 7,620 g de decaidrato de tetraborato de sódio (Fisher Scientific) e 200 mg de SDS em um frasco volumétrico de 200 ml. Água desionizada na quantidade de aproximadamente 150 mi foi adicionada e a solução foi agitada até que completamente dissolvida. OPA (Aldrich) na quantidade de 160 mg foi dissolvido em 4 ml de etanoi {Fisher Scientific) e quantitativamente transferida ao frasco volumétrico empregando água desionizada. DTT (Aldrich) na quantidade de 176 mg foi adicionado e a solução total foi trazida até o volume com água desionizada. Padrões de glicina foram criados adicionando-se 50 mg de glicina em um frasco volumétrico de 500 ml e preenchendo até marca de água de desionizada. Diluições foram feitas adicionando-se 100, 75, 50, 25, e 5 ml da solução de glicina em frascos volumétricos de 100 ml e preenchendo até a marca com água desionizada criando padrões de glicina 5. Amostras de hidrolisado de gelatina foram preparadas adicionando-se 0,500 g de hidrolisado em um frasco volumétrico de 100 ml e adicionando água desioniozada à marca. A outro frasco volumétrico de 100 ml, 10 ml da solução de hidrolisado foram adicionados e preenchidos até a marca de água desionizada. Em um tubo de teste de 15 ml, 3,0 ml da solução de reagente de OPA foram adicionados seguido pelos 400 μΐ de um padrão de glicina (resultando em 40, 30, 20, 10, e 2 Mg de glicina) ou amostra de hidrolisado de gelatina (200 Mg de hidrolisado). Uma amostra de controle empregando 400 μΙ_ de água foi da mesma forma empregada para medir a absorvência apenas de OPA. A amostra foi vortexada durante 5 segundos. A absorvência foi lida exatamente 2 minutos depois da adição da amostra contra um espaço vazio de água. A divergência do requerimento de 2 minutos impacta significativamente a absorvência. Cada amostra ou padrão foi, em seguida, testado em intervalos de dois minutos. As quantidades de aminas primárias nas amostras foram calculadas empregando-se um cálculo de regressão linear com base na absorvência dos padrões de glicina.

[00112] A Tabela 7 e a Tabela 8 mostram os resultados de TNBS e derivatização de OPA de aminas primárias em 6 hidrolisados de gelatina, uma gelatina do primeiro extrato, um trímero de glicina, e um monômero de lisina. O grau de hidrólise é relatado como a quantidade de aminas primárias divididas pelo número de aminas primárias na amostra hidrolisada de HCI (6N de HCI durante 24 horas @ 110Ό). Os pesos moleculares derivados de TNBS e OPA são o inverso da quantidade de aminas primárias por quantidade de amostra. Os pesos moleculares derivados de TNBS e OPA são considerados ser apenas qualitativos, a significação real sendo a quantidade medida de aminas primárias em cada dentre as amostras. Os pesos moleculares derivados de amina primária não levam em conta a derivatização dupla de lisina e hidroxilisina, nem levam em conta o fato que as aminas secundárias não são derivadas por qualquer agente de derivatização. Entretanto, ao assumir que estes fatores são relativamente constantes para todos os hidrolisados de gelatina, o peso molecular derivado de amina primária é um meio útil de comparar os graus relativos de hidrólise dentre tipos diferentes de hidrolisados de gelatina. Hidrolisados de pele com óxido de cálcio e de osso com oxido de cálcio Tipo LBSH e Tipo LHSH, de acordo com a presente invenção, mostraram um aumento médio de quase 30 - 130% nas aminas primárias sobre os hidrolisados enzimati ca mente digeridos. O peso molecular médio quando medido por metodologia de SEC/HPLC é da mesma forma determinado. Nota-se que os pesos moleculares para lisina e o trímero de glicina estão longe dos valores de peso molecular conhecidos. Os pesos moleculares derivados de TNBS e OPA são da mesma forma muito similares aos resultados esperados da amostra de gelatina hídrolisada por HCI, visto que os dados de HPLC/SEC são quase 5 vezes esta quantidade. Isto geralmente demonstra a inexatidão relativa da metodologia de SEC/HPLC de peso molecular baixo geralmente empregada para medir o peso molecular dos hidrolisados de gelatina. Pesos moleculares derivados de TNBS e OPA não são considerados para gelatina. As complexidades da macromolécula de gelatina inibem uma representação precisa do peso molecular empregando este modelo simplificado. Â derivatização de OPA mostra-se ser um meio muito mais seguro para medir o teor de amina primária em comparação à derivatização com TNBS.

Tabela 7 Tabela 8 KbhbKblNUIAS

[00113] Todas as referências citadas no texto anterior do pedido de patente ou à seguinte lista de referência, na medida que elas fornecem procedimentos exemplares, ou outros detalhes suplementares àqueles mencionados aqui, são especifica mente incorporadas por referência na mesma extensão como se cada pedido de patente ou publicação individual fosse especifica mente e individualmente indicado para ser incorporado por referência. 1. Ofner, C.M., Zhang, Y., Jobeck, V., Bowman, B., "Crosslinking Studies in Gelatin Capsules Treated with Formaldeído and in Capsules Exposed to Elevated Temperature and Humidity". J. Pharm. Sei., Jan. de 2001,90(1): 79-88. 2. Singh, S., Rama Rao, K.V., Venugopal, K, Maníkandan, R., "Dissolution Characteristics: A Review of the Problem, Test Methods, and Solutions". Pharmaceutica! Technology- Abril de 2002; 36-58. 3. Adesunloye, T.A., Stach, P.E., "Effect of Glycine/Citric Acid on the Dissolution Stability of Hard Gelatin Capsules". Drug Dev.

Ind. Pharm., 1998, 24(6), 493-500. 4. Rama Rao, K.V., Pakhale, S.P., Singh, S., "A film Approach for the Stabilization of Gelatin Preparations Against Cross-Linking". Pharmaceutical Technology. Abril de 2003: 54-63. 5. Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H., "Reaction of Formaldehyde with Proteins. II. Participation of Guanidyl Groups and Evidence of Crosslinking". J. Am. Chem. Soc., Jan. de 1946, 68(1): 34-37. 6. Adler-Nissen, J., "Determination of the Degree of Hydrolysis of Food Protein Hidrolisados by Trinitrobenzene Sulfonic Acid", J. Agric. Food Chem., Nov.-Dez. de 1979, 27(6): 1256-62. 7. Church, F., et al, "Spectrophotmetric Assay Using o-phthaldialdehyde for Determination of Proteolysis in Milk and Isolated Milk Proteins". J. ofDairy Sei., 1983, 66(6): 1219-1227. 8. Nielsen, P.M., Petersen, D., Dambmann, C., "Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis". J. of Food Sei., 2001, 66(5): 642-646. 9. Fraenkel-Conrat, H., Cooper, M., Olcott, H., "The Reaction of Formaldehyde with Proteins". J. Am. Chem. Soc., Jun. de 1945, 67(6): 950-954. 10. Fraenkel-Conrat, H., Olcott, H., "The Reaction of Formaldehyde with Proteins V. Cross linking between Amino and Primary Amide or Guanidyl Groups". J. Am. Chem. Soc., Agosto de 1948, 70(8): 2673-2684. 11. Ward, A. G., Courts, A., The Science and Technology of Gelatin. Academic Press lnc.1977, pp. 231. 12. Davis, P., Tabor, B., "Kinetic Study of the Crosslinking of Gelatin by Formaldehyde and Glyoxal". J. Polym. Sei. Part A., 1963, 1: 799-815. 13. Albert, K., Peters, B., Bayer, E., Treiber, U., Zwilling, M., "Crosslinking of Gelatin with Formaldehyde; a 13C NMR Study". Z. Naturforsch., 1986, 41b: 351-358 14. Gold, T.B., e outros, "Studies on the Influence of pH and Pancreatin on 13C-Formaldehyde-lnduced Gelatin Cross-Links Using Nuclear Magnetic Resonance". Pharm. Dev. Tech., 1996, 1(1): 21-26. 15. Matsuda, S., Iwata, H., Se, N., Ikada, Y., "Bioadhesion of Gelatin Films Crosslinked with Glutaraldeído". J Biomed Mater. Res. Abril de 1999; 45(1):20-7. 16. Jiskoot, W., e outros, "Indentification of Formaldehyde-induced Modifications in Proteins: Reaction with Model Peptides". J. Bio. Chem., Fev. de 2004, 279(8): 6235-6243. 17. Digenis, G.A., Gold, T.B., Shah, V.P., "Cross-Linking of Gelatin Capsules and its Relevance to Their in Vitro-in Vivo Performance". J. Pharm. Sei., Julho de 1994, 83(7):915-921. 18. Nagaraj, R.H., Shipanova, I.N., Faust, F.M., "Protein Cross-Linking by the Maillard Reaction". J. Biol. Chem., Agosto de 1996, 271(32):19338-19345. 19. "Enzymic Hydrolysis of Food Proteins"; Elsvier Applied Science Publishers Ltd. (1986), pág. 122.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Processo para preparar um hidrolisado de gelatina, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) contatar um material de partida de gelatina com uma série de pelo menos três enzimas proteolíticas tendo atividade de endopeptidase para formar um produto de gelatina digerido por endopeptidase, as três enzimas proteolíticas consistindo em Endopeptidase de Bacillus subtilis, Bromelaína, e Papaína; e (b) contatar o produto de gelatina digerido por endopeptidase com uma série de pelo menos duas enzimas proteolíticas tendo atividade de exopeptidase, as duas enzimas proteolíticas consistindo em Exopeptidase de Aspergillus oryzae e Exopeptidase de Aspergillus sojae.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada enzima proteolítica é sequencialmente adicionada ao material de partida de gelatina na seguinte ordem: Endopeptidase de Bacillus subtilis, Bromelaína, Papaína, Exopeptidase de Aspergillus oryzae e Exopeptidase de Aspergillus sojae; e em que cada enzima proteolítica digere o material de partida de gelatina durante 0,5 a 2 horas antes da adição da enzima proteolítica subseqüente.

3. Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a digestão proteolítica é permitida proceder durante 5 a 12 horas.

4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o material de partida de gelatina tem uma resistência de força menor do que 150g e uma viscosidade menor do que 30 mP a 60Ό e a uma concentração de gelatina de 6,67% em peso.

5. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que uma solução aquosa contendo 10% a 50% (p/p) do material de partida de gelatina é contatado com as enzimas proteolíticas.

6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que material de partida de gelatina é uma gelatina de grau farmacêutico.

7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que as digestões proteolíticas são conduzidas em um pH de 5 a 7 e em uma temperatura de cerca de 40Ό a cerca de 6513.

8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o peso molecular médio do hidrolisado de gelatina está na faixa a partir de cerca de 100 a cerca de 1500 Da.

9. Processo, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o peso molecular médio do hidrolisado de gelatina está na faixa a partir de cerca de 400 a cerca de 1200 Da, mais preferivelmente a partir de cerca de 700 a cerca de 1200 Da.

10. Hidrolisado de gelatina tendo um peso molecular médio a partir de 100 a 2000 Da e um teor de amina primária médio de 1,0 x 10'3 a 1,0 x 10'2 pMol de amina primária por pg de hidrolisado de gelatina, produzido pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Hidrolisado de gelatina, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o hidrolisado de gelatina tem um grau de hidrólise maior do que 13%.

12. Hidrolisado de gelatina, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o peso molecular médio do hidrolisado de gelatina está na faixa a partir de 100 a 1500 Da.

13. Hidrolisado de gelatina, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o peso molecular médio está entre 400 e 1200 Da, mais preferivelmente a partir de 700 a 1200 Da.

14. Hidrolisado de gelatina de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo médio no hidrolisado de gelatina é de 4 a 18 aminoácidos no comprimento.

15. Composição de gelatina, caracterizada pelo fato de que compreende de 1% a 20% em peso de um hidrolisado de gelatina como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 14 e de 80% a 99% em peso da gelatina.

16. Composição de gelatina, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que a composição compreende de 5% a 10% em peso do hidrolisado de gelatina e de 90% a 95% em peso da gelatina.

17. Composição de gelatina de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que a composição compreende uma relação de hidrolisado de gelatina para gelatina de 1 : 4 a 1 : 99 (P/P)·

18. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizada pelo fato de que a gelatina tem um peso molecular médio maior do que 150.000 Da.

19. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizada pelo fato de que a gelatina tem um peso molecular médio a partir de 100.000 a 150.000.

20. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, caracterizada pelo fato de que a gelatina é uma gelatina de grau farmacêutico.

21. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizada pelo fato de que a gelatina é gelatina Tipo B.

22. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizada pelo fato de que a gelatina é gelatina Tipo A.

23. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, caracterizada pelo fato de que o hidrolisado de gelatina tem um peso molecular médio de 100 a 2000 Da, preferivelmente de 100 a 1500 Da, mais preferivelmente dentre 400 a 1200 Da, ainda mais preferivelmente a partir de 700 a 1200 Da.

24. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 23, caracterizada pelo fato de que também compreende glicina.

25. Composição de gelatina, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a quantidade de glicina é de 0,5% a 5% em peso.

26. Composição de gelatina, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizada pelo fato de que também compreende ácido cítrico.

27. Composição de gelatina, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que a quantidade de ácido cítrico é de 0,5% a 5% em peso.

28. Composição de gelatina, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a quantidade de glicina adicionada é de 1,5% a 2,5% em peso e a quantidade de citrato adicionada é de 0,5% a 1,5% em peso.

29. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 28, caracterizada pelo fato de que a composição tem um tempo de endurecimento de vórtice a partir de 200 a 300 segundos.

30. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 28, caracterizada pelo fato de que a composição tem um tempo de endurecimento de vórtice maior do que 300 segundos.

31. Composição de gelatina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 30, caracterizada pelo fato de que a composição tem uma viscosidade média a partir de 10 a 15 cP e em que depois da adição de 0,5% em peso de [2-(4-dimetilcarbamoil-piridino)-etano-1-sulfonato] à composição e reação do mesmo durante cerca de 2 horas em uma temperatura de reação de 60*0, a composição tem uma viscosidade média a partir de 15 a 50 cP.