BRPI0611405A2 - método recombinante para a produção de uma proteìna estimuladora da eritropoese - Google Patents
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Abstract
MéTODO RECOMBINANTE PARA A PRODUçãO DE UMA PROTEìNA ESTIMULADORA DA ERITROPOESE. A presente invenção refere-se ao método recombinante usado para a produção de uma forma altamente glicosilada (no total cinco glicosilações ligadas ao N em vez de três glicosilações ligadas ao N na EPO natural) da eritropoetina. Os sítios acrescentados de glicosilação resultarão em um maior número de cadeias de carboidrato, em um conteúdo mais elevado de ácido siálico do que na EPO humana, o que por sua vez comunicaria à molécula recombinante uma meia-vida mais longa. A invenção também refere-se à construção de cassetes de expressão compreendendo a codificação de seqüências de ácidos nucléicos para uma forma altamente glicosilada da eritropoetina e sua expressão estável nas células hospedeiras. A invenção também se relaciona a um método otimizado de purificação da proteína estimuladora da eritropoese. A EPO recombinante de acordo com a presente invenção, e os sais e os derivados funcionais da mesma, podem compreender o componente ativo das composições farmacêuticas para um aumento na taxa de hematócrito para o tratamento da anemia e para a restauração do bem-estar e da qualidade de vida do paciente.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODORECOMBINANTE PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA ESTIMULADO RA DA ERITROPOESE".
CAMPO DE INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao método recombinante usadopara a produção de uma forma altamente glicosilada (em total de cinco gli-cosilações ligadas ao N em vez de três glicosilações ligadas ao N, na EPOnatural) de eritropoetina. Os sítios acrescentados de glicosilação resultarãoem um maior número de cadeias de carboidrato, e em um mais elevado con-teúdo de ácido siálico do que na EPO humana, o que por sua vez comunica-ria à molécula recombinante uma meia-vida mais longa.
A invenção também refere-se à construção de cassetes de ex-pressão compreendendo a codificação de seqüências de ácidos nucléicospara as formas altamente glicosiladas da eritropoetina e para uma expressãoestável nas células do hospedeiro.
A presente invenção também refere-se ao método otimizado pa-ra purificação da proteína estimuladora da eritropoese.
A EPO recombinante de acordo com a prsssnte invenção, e ossais e os derivados funcionais da mesma, podem compreender o componen-te ativo de composições farmacêuticas visando um aumento na taxa de he-matócrito para o tratamento da anemia e para restauração do bem-estar eda qualidade de vida do paciente.
ANTECEDENTES DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO.
A eritropoetina (EPO) é um hormônio glicoproteína que é o regu-Iador primário de eritropoese ou da manutenção da massa de células verme-lhas do sangue no corpo em um nível ótimo. Em resposta a uma redução naoxigenação dos tecidos, a síntese de EPO aumenta nos rins. O hormôniosecretado se liga a receptores específicos na superfície dos precursores dascélulas vermelhas do sangue existentes na medula óssea, levando à suasobrevivência, proliferação, diferenciação e enfim a um aumento na taxa dehematócrito (proporção entre o volume ocupado pelas células vermelhas dosangue depositadas e o volume ocupado integralmente pelo sangue).Desde a sua introdução há mais de uma década, a EPO recom-binante humana (rHuEPO) se tornou o padrão para os cuidados no trata-mento da anemia associada com a falência renal crônica (CRF). Ela é alta-mente eficaz na correção da anemia, na restauração dos níveis de energia,e na elevação do bem-estar e da qualidade de vida do paciente. Também foiaprovada para o tratamento da anemia associada com câncer, infecção daaids, e nos preparos cirúrgicos para reduzir a necessidade de transfusõessangüíneas alógenas.
A terapia recomendada e habitual com rHuEPO é feita duas paratrês vezes por semana por injeção subcutânea ou intravenosa. Para pacien-tes com CRF, a duração da terapia é por toda a vida do paciente, ou até queum transplante de rim bem-sucedido restaure a função renal, incluindo aprodução de hormônio. Para pacientes de câncer, a terapia rHuEPO é indi-cada contanto que a anemia persista, geralmente por toda a duração daquimioterapia. Entretanto, a biodisponibilidade dos tratamentos terapêuticosusando proteínas comercialmente disponíveis, tal como a EPO, é bastantelimitada pela sua curta meia-vida plasmática e suscetibilidade para a degra-dação por protease.
Assim, é um objetivo da presente invenção fornecer o métodorecombinante usado para a produção de isoformas da eritropoetina separa-das e isoladas possuindo um conteúdo definido de ácido siálico, uma meia-vida mais longa e conseqüentemente, uma atividade biológica aumentada.
SUMÁRIO DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO.
A presente invenção refere-se ao método recombinante usadopara a produção de uma forma altamente glicosilada (no total cinco Glicosi-lações ligadas ao N ao em vez de 3 glicosilações ligadas ao N na EPO natu-ral) de eritropoetina. Os sítios acrescentados de glicosilação resultarão emum maior número de cadeias de carboidrato, em um conteúdo mais elevadode ácido siálico do que na EPO humana, o que por sua vez poderia comuni-car à molécula recombinante uma meia-vida mais longa.
Também fornecido pela presente invenção são novos biologica-mente funcionais vetores de DNA de plasmídio circulares e vitais que incor-poram as seqüências de DNA de acordo com a presente invenção e hospe-dam organismos transformados ou transfectados de maneira estável comditos vetores.
Analogamente são fornecidos pela presente invenção novos mé-todos para a produção de polipeptídios úteis compreendendo o crescimentocultivado de tais hospedeiros transformados e transfectados sob condiçõesfacultativas da expressão em larga escala das seqüências de DNA exógenocarregadas por vetor e o isolamento dos polipeptídios desejados do meio decrescimento, dos Iisados celulares ou das frações de membranas celulares.
Um aspecto de acordo com a presente invenção pertence àconstrução de cassetes de expressão que compreendam a seqüências deácidos nucléicos codificando a forma de eritropoetina altamente glicosilada.
Em comparação com a EPO não modificada e os conjugadosconvencionais de EPO-PEG, a proteína da presente invenção tem umameia-vida circulante e um tempo de residência no plasma aumentados, eli-minação reduzida e atividade clínica aumentada in vivo. A EPO recombinan-te de acordo com a presente invenção, e os sais e os derivados funcionaisda mesma, pode compreender o componente ativo ds composições farma-cêuticas destinadas ao aumento no valor do hematócrito para o tratamentoda anemia e para a restauração do bem-estar e da qualidade de vida do paciente.
Diversos aspectos e vantagens de acordo com a presente in-venção serão evidentes para aqueles versados na técnica em consideraçãoa seguinte descrição detalhada, que fornece ilustrações da prática de acordocom a presente invenção em relação as suas modalidades atualmente preferidas.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS E SEQÜÊNCIAS:
SEQ ID N-. 1: Seqüência de nucleotídeos que codifica a novaproteína estimuladora da eritropoese.
SEQ ID Ne. 2: Versão otimizada do códon da seqüência nucleo-tídeo que codifica a nova proteína estimuladora da eritropoese.
SEQ ID NQ. 3: Seqüências de aminoácidos da NESP ou darbe-poietina alfa.
Figura 1: Alinhamento de seqüências pareadas das versões nãootimizadas e otimizadas do códon das seqüências de DNA do nucleotídeoque codifica a nova proteína estimuladora da eritropoese.
Figura 2: Alinhamento de seqüência da seqüência novamentesintetizada do cDNA da proteína estimuladora da eritropoese (AVCIP-NESP-Opt) com a seqüência estabelecida e também otimizada da proteína estimu-ladora da eritropoese (sintética-NESP-Opt).
Figura 3: Alinhamento de seqüência da seqüência novamentesintetizada do cDNA da proteína estimuladora da eritropoese (AVCIP-NESP)com a seqüência estabelecida da proteína estimuladora da eritropoese (sin-tética-NESP).
Figura 4: Digestão de restrição do vetor e da inserção.
Figura 5: Fragmentos digeridos por restrição purificados em gelda AVCIP-NESP, AVCIP-NESP-Opt e da pcDNA3.1 D/V5-His.
Figura 6: Análise da digestão por restrição dos supostos clonesda AVCIPpcDNA3.1 D/V5-His/NESP e da AVCIPpcDNA3.ID/V5-His/NESP-Opt.
Figura 7: Análise da digestão por restrição da AVCIPpcD-NA3.1 D/V5-His/NESP e dos clones da AVCIPpcDNA3.ID/V5-His/NESP-Optutilizando enzimas que clivam interiormente os cDNAs das AVCIP-NESP e aAVCIPNesp-Opt.
Figura 8: Alinhamento de seqüência do clone ns 4 do cDNA daAVCIP-NESP-Opt (sintético-NESP-Opt) com a seqüência estabelecida dogene NESP-Opt.
Figura 9: Alinhamento de seqüência do clone n9 9 do cDNA daAVCIP-NESP (sintético-NESP) com a seqüência estabelecida do gene NESP.
Figura 10: Mapa construtor da AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/NESP.
Figura 11: Mapa construtor da AVCIPpcDNA3.ID/V5-His/NESP-Opt.
Figura 12: pcDNA3.1/NESP (natural).Figura 13: pcDNA3.1/NESP (seqüência otimizada).
Figura 14: análise Western blot dos Iisados celulares totais dalinhagem das células CHO K1 transfectadas com pcDNA3.1/NESP (natural)ou com pcDNA3.1/NESP (seqüência otimizada) e Aranesp® utilizando anti-corpo de coelho anti hematopoietina humana (2 ug/ml).
Figura 15: Diagrama de Fluxo para o Desenvolvimento de Li-nhagem Celular Estável.
Figura 16: Fotos instantâneas das colônias que foram escolhidaspara o desenvolvimento das linhagens celulares CHO K1 estáveis que ex-pressam a darbepoietina alfa.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO.
A presente invenção refere-se a um novo método recombinantealternativo para produção de isoformas da eritropoetina. As isoformas espe-cíficas da eritropoetina obtidas de acordo com a presente invenção, e as su-as propriedades, podem variar dependendo da fonte do material de partida.
Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um novo método re-combinante alternativo para produção de isoformas da eritropoetina, que sediferenciam da eritropoetina recombinante humana (rHuEPO) e Da EPO na-tural humana em cinco posições (Ala 30 Asn; His 32 Thr; Pro 87 Vai; Trp 88Asn e Pro 90 Thr).
O termo "isoformas da eritropoetina" tal como aqui utilizado refe-re-se a preparações de eritropoetina possuindo um único ponto isoelétrico(pl), e possuindo a mesma seqüência de aminoácidos. O termo "eritropoeti-na", tal como aqui utilizado, inclui a ocorrência natural da eritropoetina, eri-tropoetina humana originária do trato urinário bem como os polipeptídios deocorrência não natural possuindo uma seqüência de aminoácidos e uma gli-cosilação suficientemente duplicável daquela eritropoetina de ocorrência na-tural para permitir a posse de propriedades biológicas in vivo para fazer comque as células da medula óssea aumentem a produção de reticulócitos ecélulas vermelhas do sangue.
De acordo com a presente invenção, as seqüências de DNA quecodificam a forma altamente glicosilada da eritropoetina humana foram sinte-tizadas por uma nova abordagem. Essa abordagem permitiria uma melhorotimização do códon em relação à determinada célula de mamífero a serutilizada. Adicionalmente, o DNA sintético foi tornado o objeto da expressãoeucariótica/procariótica fornecendo quantidades isoladas dos polipeptídiosexibindo propriedades biológicas da eritropoetina (EPO) de ocorrência natu-ral bem como tanto atividades biológicas in vivo como in vitro da EPO.
Os exemplos seguintes são apresentados como uma forma deilustração de acordo com a presente invenção e são especificamente dire-cionados a procedimentos realizados antes da identificação dos clones decDNA de macaco e dos clones genômicos humanos codificando a EPO, pa-ra os procedimentos que resultam de tal identificação, para o seqüenciamen-to, o desenvolvimento de sistemas de expressão e verificação imunológicada expressão da EPO em tais sistemas.
EXEMPLO 1:
Síntese da proteína recombinante estimuladora da eritropoese (NESP).
As seqüências de DNA que codificam a forma altamente glicosi-Iada da eritropoetina humana foram sintetizadas por uma nova abordagem.
Essa abordagem permitiu uma melhor otimização do códon em relação àdeterminada célula de mamífero a ser utilizada. Adicionalmente, o DNA sin-tético foi tornado o objeto da expressão eucariótica/procariótica fornecendoquantidades isoladas dos polipeptídios exibindo propriedades biológicas daeritropoetina (EPO) de ocorrência natural bem como tanto atividades biológi-cas in vivo como in vitro da EPO.
A seqüência de nucleotídeos que codifica a proteína estimulado-ra da eritropoese foi representada na SEQ ID NQ. 1. Os resíduos de nucleo-tídeo que foram alterados para incorporar sítios de glicosilação adicionais nadita proteína estimuladora da eritropoese em comparação com a transcriçãoque ocorre naturalmente do gene humano que codifica a eritropoetina foramdestacados em letras maiúsculas.
Os códons na região de codificação da proteína estimuladora daeritropoese foram alterados como parte do processo de otimização de códonpara assegurar a ótima expressão da proteína recombinante nas linhagensde células de mamíferos tais como CHO K1 e HEK 293. A SEQ ID N9. 2 re-presenta a seqüência nucleotídeo otimizada do códon que codifica a proteí-na estimuladora da eritropoese.
O alinhamento das seqüências pareadas não otimizadas de oti-mizadas da seqüência de nucleotídeos do códon que codifica a proteína es-timuladora da eritropoese foi representada na figura n° 1.
A SEQ ID Ne. 3 representa a seqüência primária completa dosaminoácidos da proteína estimuladora da eritropoese de acordo com a pre-sente invenção. Foram destacados os resíduos de aminoácidos da NESPque foram alterados em comparação com a EPO humana que ocorre naturalmente.
EXEMPLO 2:
Verificação da autenticidade da seqüência original novamente sintetizada docDNA codificando a proteína estimuladora da eritropoese.
A verificação da autenticidade da seqüência original (AVCIP-NESP) novamente sintetizada do cDNA e a seqüência cDNA otimizada docódon (AVCIP-NESP-Opt) foi feita pelo seqüenciamento automatizado deDNA e os resultados obtidos estão representados nas figuras Nos. 2 e 3.
EXEMPLO 3:
Subclonaqem dos cDNAs da AVCIP-NESP e da AVCIP-NESP-Opt no vetorde expressão específico da célula pcDNA3.1D/V5-His de mamíferos.
A seqüência original novamente sintetizada do cDNA (AVCIP-NESP) e a seqüência do cDNA otimizada do códon (AVCIP-NESP-Opt) fo-ram individualmente subclonadas no vetor de expressão específico de célu-Ias de mamífero pcDNA3.1D/V5-His para gerar o construtor pronto paratransfecção. Os detalhes dos procedimentos utilizados são dados em baixo:
A. Reaqentes e enzimas:
1. Kit de extração em gel e kit de purificação de PCR marca Ql-AGEN.
2. Vetor de DNA pcDNA3.1 D/V5-His (Invitrogen).<table>table see original document page 9</column></row><table>
Todas as reações foram realizadas tal como recomendado pelofabricante. Para cada reação o tampão de reação 10x fornecido foi diluído auma concentração final de 1x.
B. Digestão de restrição do vetor e da inserção:
• Procedimento
As seguintes amostras de DNA e as enzimas de restrição foram usadas:
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Reação de digestão da enzima de restrição:
<table>table see original document page 9</column></row><table>
A reação foi agitada, centrifugada e incubada por 2 horas a379C. Digestão da restrição foi analisada por eletroforese em gel de agarose.
O modelo de digestão esperado foi observado apresentando um fragmentode gene caindo em aproximadamente 600 bp (para Rxn ns 3 e 4) e um frag-mento de cadeia principal do vetor de aproximadamente 5,5 kb para o Vetor(Rxn n531 e 2). (figura n9 4).
Os fragmentos de DNA de aproximadamente 600 bp que repre-sentam os cDNAs AVCIP-NESP e AVCIP-NESP-Opt foram purificados sepa-radamente pelo método de extração em gel usando o kit de extração em gelQIAGEN. Os fragmentos de aproximadamente 5,5 kb da cadeia principal dovetor digerida do vetor de expressão pcDNA3.1D/V5-His de mamífero tam-bém foram purificados usando o mesmo kit.
Posteriormente à digestão de restrição e a extração de gel docDNA e fragmentos de DNA vetoriais requeridos, uma alíquota (1 a 2 microli-tros) de cada amostra de DNA purificada foi analisada usando eletroforeseem gel de agarose para verificar a pureza e a integridade tal como mostradona figura nQ 5.
C. Ligação da cadeia principal da pcDNA3.1D/V5-His com os cDNAs da AV-CIP-NESP e da AVCIP-Ovt-NESP:
A concentração de DNA digerido e purificado do vetor e dosfragmentos de inserção foi prevista e a ligação foi ajustada da seguinte maneira:
<table>table see original document page 10</column></row><table>
As reações foram suavemente agitadas, centrifugadas e incuba-das na temperatura ambiente, por 2 a 3 horas. As células competentesJM109 foram transformadas com os conteúdos de misturas da reação deligação.
D. Análise da digestão da restrição dos clones presumidos da AVCIPpcD-NA3.1 D/V5-His/NESP e da AVCIPpcDNA3.1 D/V5-His/NESP-Qpt.
O DNA do plasmídio foi individualmente purificado a partir dascolônias obtidas em placas de ágar LB contendo ampicilina e a presença dainserção do cDNA desejado foi confirmada pela análise da digestão da res-trição do DNA do plasmídio isolado tal como mostrado na figura n° 6.
De acordo com os resultados obtidos depois da digestão da res-trição de vários clones presumidos contendo a AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/NESP e AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/NESP-Opt, alguns dos clones quemostraram o modelo de restrição desejado foram selecionados para umaanálise da digestão da restrição adicional usando enzimas de restrição queclivam os cDNAs da AVCIP-NESP e da AVCIPNesp-Opt interiormente paragerar fragmentos de tamanho variável tal como mostrado abaixo na figura n9. 7.
E. Verificação do seqüenciamento do DNA dos clones selecionados da AV-CIPpcDNA3.1 D/V5-His/NESP e da AVCIPpcDNA3.1 D/V5-His/NESP-Qpt.
Os clones selecionados de DNA AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/NESP e AVCIPpcDNA3.1 D/V5-His/NESP-Opt como resultado da análisede mapeamento foram também verificados através de seqüenciamento au-tomatizado de DNA.
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Os clones AVCIPpcDNA3.1D/V5-His/NESP e AVCIPpcD-NA3.1 D/V5-His/NESP-Opt mostraram uma identidade de 100% com a se-quência do padrão, tal como mostrado nas figuras n° 8 e n9. 9.
Os mapas dos construtores da expressão recombinante produ-zidos utilizando os cDNAs das AVCIP-NESP e AVCIP-NESP-Opt novamentesintetizado são figurativamente representados nas figuras n9.10 e n9. 11.
EXEMPLO 4:
Manutenção e propagação dos construtores de fusão do cDNA.
A manutenção e a propagação dos construtores do cDNA codifi-cando a nova proteína estimuladora da eritropoese foi realizada em uma li-nhagem celular bacteriana padrão classificada como Top 10 (Invitrogen).
EXEMPLO 5:
Expressão transiente/estável da proteína recombinante em células CHO-K1.(a) Expressão transiente da proteína estimuladora da eritropoese em células CHO K1:
O protocolo otimizado para a transfecção do DNA do plasmídiofoi usado para transfectar as células CHO com:
1. pcDNA3.1/NESP (natural).
2. pcDNA3.1/NESP (seqüência otimizada).
Protocolo 1:
Transfecção transiente das células aderentes CHO K1.
1. No dia anterior à transfecção, semear 1 χ 105 células por ca-vidade em uma placa de 24 cavidades em 1 ml de meio de crescimento (D-
MEM/F 1:1). O número de células semeadas deve produzir uma confluênciade 80% no dia da transfecção.
2. Incubar as células sob suas condições normais de crescimen-to (geralmente 37°C e 5% de CO2).
3. No dia da transfecção, no Tubo A diluir 2 pg de DNA dissolvi-dos em tampão TE de pH 7,0 a pH 8,0 (concentração mínima de DNA: 0,1Mg/μΙ) com Opti-MEM® a um volume total de 100 μΙ. Agitar e centrifugar asolução durante alguns segundos para retirar as gotas do topo do tubo.
4. No Tubo B, adicione 6 μΙ do reagente de transfecção Lipofec-tamina® 2000 em 100 μΙ de Opti-MEM® e deixar na temperatura ambientedurante 5 minutos.
5. Misturar os conteúdos do tubo A e do tubo B por pipetagemde cima para baixo por 5 vezes.
6. Incubar as amostras durante 15 minutos na temperatura am-biente (15eC a 259C) para permitir a formação do complexo de transfecção.
7. Enquanto ocorre a formação do complexo, aspire suavementeo meio de crescimento da placa, e lave as células uma vez com 2 ml de PBS.
8. Acrescentar 0,1 ml de células Opti-MEM® ao tubo de reaçãocontendo os complexos de transfecção. Misturar por pipetagem de cima parabaixo duas vezes, e imediatamente transferir o volume total para as célulasde um cavidade da placa de 24 cavidades.9. Incubar as células com os complexos transfecção durante 6horas nas suas condições normais de crescimento.
10. Retirar o meio contendo os complexos restantes das célulaspor aspiração suave, e lavar as células uma vez com 4 ml de PBS (salinatamponada por fosfato).
11. Acrescentar o meio de crescimento de células frescas (con-tendo soro e antibióticos). Realizar o ensaio para expressão do gene trans-fectado após um tempo adequado de incubação.
Essas células transfectadas foram coradas com anticorpo antie-ritropoietina para avaliar a expressão da proteína. Tal como representadonas figuras nos. 12 e 13, a expressão específica da proteína acima citada foidetectada em ambos os conjuntos de experimentos de transfecção transien-tes representando as linhagens das células CHO K1 independentementetransfectadas com a pcDNA3.1/NESP (natural) e a pcDNA3.1/NESP (se-quência otimizada).
(b) Detecção da expressão transiente da proteína estimuladora da eritropoe-se na linhagem das células CHO K1 transfectadas por Western blot.
Os Iisados celulares totais foram preparados das linhagens celu-lares CHO K1 que foram independentemente transfectadas com o pcD-NA3.1/NESP (natural) ou com pcDNA3.1/NESP (seqüência otimizada). Osditos Iisados celulares foram preparados 48 horas depois do evento de trans-fecção e duas quantidades diferentes da preparação de proteína total (10 ge 20 g) dos Iisados celulares foram submetidos a eletroforese em SDS-PAGE a 12% antes da coloração em uma membrana PVDF. A membranaPVDF então foi testada com 2 g/ml do anticorpo de coelho antieritropoietinahumana e o resultado obtido é mostrado na figura n° 14.
Tal como fica evidente da figura 8, a presença da proteína esti-muladora da eritropoese foi especificamente descoberta nos Iisados celula-res totais da linhagem das células CHO K1 transfectadas com o pcD-NA3.1/NESP (natural) ou com pcDNA3.1/NESP (seqüência otimizada) nasmais altas concentrações usadas (-20 g) das preparações de proteína. Amobilidade electroforética da dita proteína estimuladora da eritropoese pre-sente nos Iisados celulares das células CHO K1 foi avaliada como combi-nando com a observada no caso da formulação terapêutica, Aranesp®, indi-cando assim a natureza hiperglicosilada esperada da proteína recombinanteexpressada.
(c) Desenvolvimento de linhagens celulares CHO K1 estáveis expressando aproteína estimuladora da eritropoese
Conhece-se que a integração do DNA no cromossomo, ou ma-nutenção do epissoma estável, de genes repórteres e outros genes ocorrecom uma freqüência relativamente baixa. A capacidade de selecionar paraessas células somente pode ocorrer pela utilização de genes que codifiquemresistência a umo fármaco letal. Um exemplo de tal combinação é o genemarcador para a neomicina fosfotransferase com o fármaco Geneticina®. Ascélulas individuais que sobrevivem ao tratamento do fármaco expandem-seem grupos clônicos que podem ser individualmente selecionados, propaga-dos e analisados. Um diagrama de fluxo que representa as etapas implica-dos no desenvolvimento da linhagem estável é mostrado na figura n° 15.
Protocolo 2:
Transfeccão estável de células CHO K1 aderentes.
1. No dia anterior à transfecção, semear 1 χ 105 células por ca-vidade em uma placa de 24 cavidades em 1 ml de meio de crescimento (D-MEM/F 1:1). O número de células semeadas deve produzir uma confluênciade 80% no dia da transfecção.
2. Incubar as células sob suas condições normais de crescimen-(geralmente 37°C e 5% de CO2).
3. No dia da transfecção, no Tubo A diluir 2 pg de DNA dissolvi-dos em tampão TE de pH 7,0 a pH 8,0 (concentração mínima de DNA: 0,1pg/μΙ) com Opti-MEM® a um volume total de 100 μΙ. Agitar e centrifugar asolução durante alguns segundos para retirar as gotas do topo do tubo.
4. No Tubo B, adicione 6 μΙ do reagente de transfecção Lipofec-tamina® 2000 em 100 μΙ de Opti-MEM® e deixar na temperatura ambientedurante 5 minutos.
5. Misturar os conteúdos do tubo A e do tubo B por pipetagemde cima para baixo por 5 vezes.
6. Incubar as amostras durante 15 minutos na temperatura am-biente (159C a 259C) para permitir a formação do complexo de transfecção.
7. Enquanto ocorre a formação do complexo, aspire suavementeo meio de crescimento da placa, e lave as células uma vez com 2 ml de PBS.
8. Acrescentar 0,1 ml de células Opti-MEM® ao tubo de reaçãocontendo os complexos de transfecção. Misturar por pipetagem de cima parabaixo duas vezes, e imediatamente transferir o volume total para as célulasde um cavidade da placa de 24 cavidades.
9. Incubar as células com os complexos transfecção durante 6horas nas suas condições normais de crescimento.
10. Retirar o meio contendo os complexos restantes das célulaspor aspiração suave, e lavar as células uma vez com 4 ml de PBS.
11. Acrescentar o meio de crescimento de células frescas (con-tendo soro e antibióticos). Realizar o ensaio para expressão do gene trans-fectado após um tempo adequado de incubação.
12. Passagem das células no meio seletivo apropriado de 1:10a1:15. Manter as células no meio seletivo nas suas condições normais decrescimento até que as colônias apareçam.
EXEMPLO 6:
Seleção de linhagem de células CHO K1 estáveis expressando a proteínaestimuladora da eritropoese.
Células CHO transientemente expressando transfectadas oucom pcDNA3.1/NESP (natural) ou com pcDNA3.1/NESP (seqüência otimi-zada) foram tripsinizadas e diluídas em um meio de seleção contendo 1mg/ml de Geneticina®. As células foram incubadas durante 14 dias no meiode seleção até que as colônias pudessem ser isoladas (figuras 2A e 2B a-baixo). No total, 89 colônias de pcDNA3.INesp (natural) e 91 colônias pcD-NA3.INesp (Seqüência otimizada) foram pescadas em condições estéreis esemeadas em placa em um único cavidade por colônia de uma placa de 96cavidades.O Avesthagen selecionou 89 colônias de CHOK1/pcDNA3.1/NESP (natural) e 91 colônias de CHO/pcDNA3.1/os-NESP(Seqüência otimizada) para desenvolver linhagens de células de produtorasque sobreexpressem a proteína estimuladora da eritropoese. Todas as colô-nias de células CHO K1 selecionadas até aqui serão analisadas por imuno-fluorescência, Western blot, ELISA e ensaios funcionais de base celular demodo a gerar uma única linhagem celular CHO K1 produtora, derivada decélulas, que expressem de maneira estável a Proteína estimuladora da eri-tropoese de acordo com a presente invenção.
EXEMPLO 7:
Purificação de nova proteína estimuladora da eritropoese.
A qualidade e a biossegurança de um composto biofarmacêuticosão dependentes, em grande escala, dos procedimentos de extração usadospara produzir o produto purificado. De um lado, o processamento a jusantetem que assegurar um isolamento eficaz e econômico do produto desejadodo caldo de cultura ou do material celular obtido durante o processo de culti-vo da célula. Entretanto, por outro lado, os componentes que contaminariamo produto final devem ser separados de modo confiável. Os diferentes tiposde componentes que não devem estar presentes na formulação do produtofinal têm de ser retirados durante essas etapas.
O primeiro grupo compreende as impurezas derivadas do meioou derivadas do processo que podem ser de natureza protéica ou não pro-téica (por exemplo, lipídios, agentes antiespumantes, antibióticos). Este gru-po também inclui as impurezas derivadas da célula hospedeira tais comoproteínas, que poderiam induzir respostas imunes indesejáveis, ou ácidosnucléicos, que são a principal preocupação porque eles poderiam abrigaruma informação genética potencialmente perigosa quando incorporadosdentro de células humanas saudáveis. O segundo grupo compõe-se de a-gentes e contaminantes ocasionais e compreendem vírus, partículas seme-Ihantes a um vírus (VLPs), bactérias, fungos, micoplasmas e assim por diante.
A remoção de componentes do meio e de impurezas protéicas éuma parte integrante do isolamento do produto. Os procedimentos aponta-dos para a remoção de suplementos do meio, tais como antibióticos ousubstâncias citotóxicas (por exemplo, geniticina ou metotrexato) serão incor-porados na estratégia de purificação e os testes adequados serão estabele-cidos de modo a validar suas eficiências. Algumas impurezas tais como oDNA, podem ser reduzidas através de uma escolha cuidadosa das condi-ções de colheita e de cultivo. Como por razões práticas, não é possível fa-bricar um produto 100% puro, foram definidos níveis de concentração acei-táveis da presença de impurezas na formulação do produto final. Por exem-plo, a Organização Mundial de Saúde (OMS) definiu a quantidade máximaaceitável de DNA como sendo de 100 pg por dose única de um fármaco pro-téica biotecnologicamente derivada. O potencial de desativação de agentesocasionais durante a etapa de purificação pode ser explorado ou podem serincluídas etapas adicionais de desativação, dentro da estratégia de purifica-ção. Os vírus e as VLPs1 por exemplo, podem ser tornados inativos pela a-plicação de produtos químicos desativantes (por exemplo, N-acetiletilenoimina, Tri-N-butilfosfato)10, solventes orgânicos, sais caotrópicos,valores de pH extremos, irradiação, e assim por diante. O tratamento detemperatura realizado pela aplicação da tecnologia de microondas tambémfoi mostrado como desativador de vírus. Apesar de tudo o que foi acimamencionado, o potencial da tecnologia escolhida para inativação permanecedependendo de validação, e essa validação também tem que comprovar queo método de inativação não prejudica a integridade do produto.
A proteína EPO humana madura é compreendida por uma se-qüência invariável de 165 aminoácidos, que é derivada de um precursor com193 aminoácidos em duas etapas. O N terminal do aminoácido 27 líder daseqüência é clivado antes da secreção do hormônio e o C terminal-Arg éproteoliticamente retirado por uma carboxipeptidase endógena. Posterior-mente ao estabelecimento de um sistema de cultivo de célula sem contami-nantes de acordo com as linhas guias das agências reguladoras, que sobreexpressa a proteína recombinante desejada, a purificação da nova proteínaestimuladora da eritropoese da proteína pode ser feita usando uma série deetapas que implicam em filtração por diálise e procedimentos com colunasde cromatografia que implicam em matrizes de resinas troca-íon aniônicas eresinas de fase reversa. As frações contendo os glicanos mais altamenteramificados e as mais elevadas concentrações de ácido siálico serão recu-peradas para maximizar a atividade in vivo.
EXEMPLO 8:
Otimização dos procedimentos de purificação.
Posteriormente ao estabelecimento da bioatividade reprodutívelde acordo com os ensaios recomendados de funcionalidade/ligação acimamencionados, serão realizados esforços para otimizar os procedimentos depurificação e maximizar o rendimento da NESP recombinante da linhagemcelular estável, de alta expressão. As estratégias de purificação apontarãopara a economia do processo, velocidade de comercialização, escalabilida-de, reprodutibilidade, e máxima pureza do produto com estabilidade funcio-nal e integridade estrutural sendo os objetivos principais. Para esse efeito,uma abordagem combinatória pelo uso tanto da filtração (filtração de fluxonormal e de fluxo tangencial) como da cromatografia seria explorada. As e-xigências de qualificação do processo e os estudos dos critérios de aceita-ção serão conduzidos em 3 bateladas.
A purificação da proteína utilizando o componente glicano daglicoproteína como um alvo de captura é comumente realizada utilizandocromatografia de afinidade. As matrizes mais comuns são o ácido m-aminofenilborônico em agarose e as Iecitinas imobilizadas, do tipo Concana-vailn A em Sepharose (Com A Sepharose) e a aglutinina do germe de trigoem Sepharose (WGA - Sepharose). Dos tipos acima citados, as matrizes deácido m-aminofenilborônico em agarose são capazes de formar ligaçõestemporárias com qualquer molécula contendo um grupo 1,2-cis-diol enquan-to que as matrizes Com A se ligam especificamente a resíduos manosil eresíduos glicosil contendo grupos hidroxila não modificados nas posiçõesC3, C4 e C6. As matrizes de WGA Sepharose são altamente específicaspara os resíduos N-acetil glicosamina (NAG) ou ácido N-acetil neuramínico(NANA ou ácido siálico) da glicoproteína.
Conseqüentemente, o processo de purificação compreende oseguinte fluxo a jusante:
a. clarificação e concentração inicial utilizando procedimentos defiltração de fluxos normais e tangenciais.
b. ultra filtração/filtração de Diálise (baseado em filtração de flu-xo tangencial).
c. etapa de cromatografia -1: cromatografia de afinidade usandomatrizes a base de lectina/m-amino fenil. O meio de afinidade baseado noIigante m-amino fenil seria mais preferido.
d. etapa de cromatografia - II: cromatografia de troca iônica (IEX)usando a Q-Sepharose para troca aniônica.
e. etapa de cromatografia - III: cromatografia de interação hidro-fóbica (HIC) usando butil - Sepharose.
f. remoção de vírus e filtração estéril.
g. remoção de endotoxina.
h. formulação.
Observação: a seqüência de operações unitárias durante as e-tapas de cromatografia pode ser alterada para uma mais alta pureza e recu-peração máxima de produto. O resultado do processo de purificação em ca-da etapa será avaliado quanto à integridade estrutural e funcional da proteí-na pela utilização de métodos físico-químicos e imunológicos.
Em outra modalidade preferida, o processo de purificação apon-taria para a captura direta da proteína alvo a partir do caldo de cultura brutopelo uso de resina de troca aniônica pela metodologia de adsorção em leitoexpandido em contraste com a metodologia convencional de leito empacota-do e compreenderia as seguintes etapas:
a. cromatografia de troca aniônica usando Q-Sepharose XL atra-vés de uma etapa de eluição em sal como etapa de captura.
b. cromatografia e Interação Hidrofóbica (HIC) usando butil-Sepharose.
c. uma segunda cromatografia de troca aniônica utilizando a re-sina Resource-Q como uma etapa de polimento.
d. remoção de vírus e filtração estéril.e. remoção de endotoxinas.
f. formulação.
Mais preferivelmente, um processo de purificação em duas eta-pas usando a cromatografia de troca aniônica e a HIC seria empregado co-mo as etapas principais de cromatografia dependendo da porcentagem deproduto recuperado e da pureza. As etapas posteriores então seguiriam co-mo esboçado nas estratégias acima mencionadas.
Observação: uma etapa adicional de lavagem ácida pode serincorporada depois da etapa de captura aniônica nas estratégias esboçadasacima, dependendo da eficiência de captura para um enriquecimento seleti-vo das isoformas do ácido pl com altas concentrações de glicosil e sialil epara a remoção de proteínas básicas contaminantes não relacionadas. Adi-cionalmente, o fluxo através de resinas a base de troca aniônica tal comosulfato de celufina será usado para a ligação seletiva dos contaminantes doprocesso, dos endógenos ou dos vírus ocasionais e dos extraíveis por coluna.
EXEMPLO 9:
Estabelecimento da identidade da proteína alvo usando métodos bioquími-cos, imunolóqicos e físico-químicos.
O percentual de recuperação da proteína total em cada etapaserá quantificada usando o procedimento do método de ligação do ácidobicincronínico (BCA)/corante de Bradford. A concentração da proteína alvoem cada etapa da purificação será tentada usando imunoensaios baseadosem enzimas altamente específicas e confiáveis ou através da reação ELISAna forma de sanduíche direto ou indireto. Mais preferivelmente, uma reaçãoELISA de sanduíche de duplo anticorpo seria adaptada para avaliar as con-centrações da proteína alvo. Como a NESP é uma glicoproteína, uma avali-ação qualitativa do grau de glicosilação será examinada usando procedimen-tos corantes específicos para a detecção de glicoproteína por eletroforeseem gel SDS sob condições redutoras. Análises Western blot qualitativas es-pecíficas serão realizadas a cada etapa. A cromatografia de fase reversa, defocagem isoelétrica e eletroforese bidimensional em gel será empregadapara avaliar o produto purificado. A análise estrutural secundária seria exa-minada usando o dicroísmo circular do UV distante. A massa molecular e asituação oligomérica serão investigadas usando os sistemas de exclusão detamanho e MALDI-TOF. As investigações também se concentrarão na esta-bilidade da proteína em relação ao pH e a temperatura. Como a NESP éuma proteína hiperglicosilada, os padrões de glicosilação da proteína purifi-cada seriam documentados usando a análise de cromatografia a gás (CG).
EXEMPLO 10:
Ensaios para avaliação in vitro e in vivo da atividade da nova proteína esti-muladora da eritropoese.
Os bioensaios para detectarem a ligação do receptor da EPO invitro para a nova proteína estimuladora da eritropoese serão realizdos usando:
(a) a ligação competitiva usando a nova proteína estimuladorada eritropoese marcada com I125.
(b) a absorção da timidina-3[H] usando uma linhagem celularhumana recomendada tal como a Ut7/EP0.
A bioatividade pré-clínica in vivo (capacidade de restauração aohematócrito normal) da nova proteína estimuladora da eritropoese será tes-tada em linhagens recomendadas de rato tal como a BDF1.Listagem de Seqüência
<11D> Avestha Gengraine Technologies Pvt LtdMorawala ΡβΐβΠ, ViHoo
<120> MÉTODO RECOMBINANTE PARA A PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA ESTIMULADORA DA ERITROPOESE
<130> 1 <lSCfc- <151> Ç27/CHE/2005 2005-05-24 <160> B <3,70> versão 3.3 da patente <210> <2X1> <212» <213> 1 582 DNA humano <400t> 1 atgggggtgc açgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120aggtacc-tct Iggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtaa tgaaacgtgc 180agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggec tggccctgct gtcggaagct 300gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagg tgaatgagac cctgcagctg 360catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctggga 420gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582<210> <210> <212> <213> 2 S82 humano <400> 2
atgçgcgtgc acçagtgccc cgcttggctc tggctgctgc tgtccctcct gtccctaccc 60
ctcgggctcc cggtgctggg cgcgccccca cgcctgatct gtgactcccg agtgctcgag 120
cgctacctgc tggaggcgaa ggaggccgag aacatcacca çgggctgtaa cgagacctgt IBO
tctctgaacg agaacatcac cgtgcccgac accaaggtga acttctacgc ctggaagaga 240
atggaggtag gccagcaggc cgtcgaggtg tggcagggte tggcgttgct gtccgaagcc 300
gtgctccgeg gccaggccct gctggtgaac tccagtcagg tgaacgaaac actccagctc 360
catgtggaca aggcggtgtc cggcttgcgg tcgctgacaa ccctcctgcg cgccctggga 420gcgeagaagg aggccattag tcccccggac gccgccttgg ctgcccccct gcgaaccatc 480accgcggaca ccttccggaa pctgttccgc gtctaetcga actttctccg cgggaagctg 540aaattataca cgçjgggaggc ctgccgcacc ggcgatcgct 9a 562
<210» 3
<213> 193
<212> PRT
<213> humano
<400> 3
Met Gly vai Hls Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu ser Leu1 5 10 15
teu $er teu Pro Leu Gly Leu Pro vai Leu Gly Ala Pro Pro Arg Lcu20 2$ 30
lie cys Asp Ser Arg vai Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 · 40 45
Ala Glii Asn lie Thr Ttjr Gly Cys Asn Glu Thr Cys Ser Leu Asn Glu50 SS 60
ASfi Xle Thr vai Pro Asp Thr Lys Val Asn Wie Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80
Met Glu vai Gly Gln Gln Ala vai Glu vai Trp Gln Gly Leu Ala LeuSS 90 95
Leu ser Glu Ala vai Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn ser ser100 105 110
Gln Val Asn Glu Thr teu Gln Leu Hls Val Asp Lys Ala Val ser Gly115 120 125
130 135 140
Ala Ile ser Pro Pro Asp Ala Ala ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie145 150 155 IfiO
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe ato Val Tyr Ser Asn Phe Leu165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arn Thr Gly Asp1&0 185 ISO
Arg
Claims (10)
1. Processo para preparação de uma proteína estimuladora daeritropoese biologicamente ativa in vivo, compreendendo as etapas de:(a) crescimento, em condições nutritivas adequadas, das célulashospedeiras transformadas ou transfectadas com uma seqüência de DNAisolada selecionada do grupo consistindo em (i) as seqüências de DNA es-tabelecidas nas SEQ ID NQ.1 e SEQ ID N9 2, (ii) a proteína codificando aseqüência representada na SEQ ID N9. 3, e (iii) as seqüências de DNA quehibridizam sob condições estringentes com as seqüências de DNA definidasem (i) e (ii) ou com as suas fitas complementares; e(b) isolamento da dita eritropoetina produzida a partir das mesmas.
2. Processo para a preparação de um produto biologicamenteativo in vivo da eritropoetina compreendendo as etapas de transformar umacélula hospedeira com uma seqüência sintetizada de DNA codificando a se-qüência de aminoácidos da eritropoetina de acordo com a SEQ ID N9. 3 e oisolamento da dita eritropoetina produzida a partir da dita célula hospedeiraou do seu meio de crescimento.
3. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2 em que asditas células hospedeiras são células de mamíferos.
4. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2 em que asditas células hospedeiras são preferivelmente células CHO K1.
5. Processo para produção de um polipeptídio glicosilado da eri-tropoetina possuindo propriedades biológicas in vivo de fazer as células demedula óssea aumentarem a produção de reticulócitos e células vermelhasdo sangue compreendendo as etapas de:a) crescimento, sob condições nutritivas adequadas, das célulasde mamíferos compreendendo o DNA promotor, outro DNA promotor da eri-tropoetina diferente do ser humano, operacionalmente ligado ao DNA codifi-cando a seqüência de aminoácidos da eritropoetina madura da SEQ ID N9. 3; eb) isolamento do dito polipeptídio glicosilado da eritropoetina ex-pressado pelas ditas células.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que o ditoDNA promotor é um DNA promotor viral.
7. Processo para a preparação de um produto biologicamenteativo in vivo da eritropoetina compreendendo as etapas de transformar umacélula hospedeira com um vetor de construção das figuras n° 10 ou n°. 11 eo isolamento da dita eritropoetina produzida a partir da dita célula hospedeiraou do seu meio de crescimento.
8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que o dito ve-tor é um vetor de expressão específico de células de mamíferos e mais pre-ferivelmente um vetor tal como representado nas figuras nQ. 10 e nQ. 11.
9. Composição farmacêutica compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz da eritropoetina humana e um diluente, adjuvanteou veículo, farmaceuticamente aceitáveis em que a dita eritropoetina é puri-ficada de células de mamíferos cultivadas em meio de cultura.
10. Método de elevação e manutenção do nível de hematócritoem um mamífero compreendendo a administração de uma quantidade tera-peuticamente eficaz de um análogo hiperglicosilado de eritropoetina em umacomposição farmacêutica como definida na reivindicação 9, em que o análo-go é administrado menos freqüentemente do que uma quantidade equivalen-te molar da eritropoetina humana recombinante para obter um nível objetiva-do comparável de hematócrito.
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