BRPI0611445A2

BRPI0611445A2 - molécula de ligação a antìgeno glicomanipulada, polinucleotìdeo, polipeptìdeo, vetor, célula hospedeira, método para produção, uso e composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0611445A2
Application number: BRPI0611445-8A
Authority: BR
Inventors: Peter Sondermann; Claudia Ferrara Koller; Peter Bruenker; Fiona Stuart; Pablo Umana
Original assignee: Glycart Biotechnology Ag
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2010-09-08
Also published as: IL187090A0; WO2007039818A2; KR20080032026A; JP2008539753A; EP1888649A2; AU2006298519A1; RU2007145509A; WO2007039818A8; CN101228189A; US20070111281A1; CA2605781A1; NO20075635L; WO2007039818A3; MX2007013924A; ZA200709630B

Abstract

MOLéCULA DE LIGAçãO A ANTIGENO GLICOMANIPULADA, POLINUCLEOTIDEO, POLIPEPTIDEO, VETOR, CéLULAHOSPEDEIRA, MéTODO PARA PRODUçãO, USO E COMPOSIçãO FARMACêUTICA A presente invenção refere-se à moléculas de ligação a antígeno, incluindo anticorpos, compreendendo uma região Fc tendo uma ou mais modificações de aminoácido, em que a molécula de ligação a antígeno exibe ligação alterada e um ou mais receptores Fc como um resultado da(s) modificaçáo(ões). A invenção é ainda dirigida a polinucleotídeos e vetores que codificam tais moléculas de ligação a antígeno, a células hospedeiras com- preendendo os mesmos, a métodos para fabricação das moléculas de ligação a antígeno da invenção e a seu uso no tratamento de várias doenças e distúrbios, por exemplo, cânceres.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULASDE LIGAÇÃO A ANTÍGENO TENDO REGIÕES FC MODIFICADAS E LI-GAÇÃO ALTERADA A RECEPTORES FC".

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a moléculas de ligação a antíge-no, incluindo anticorpos, compreendendo uma região Fc tendo uma ou maismodificações de aminoácido, em que a molécula de ligação a antígeno exibeligação alterada a um ou mais receptores Fc como um resultado da(s) modi-ficação(ões). A invenção é ainda dirigida a polinucleotídeos e vetores quecodificam tais moléculas de ligação a antígeno, à células hospedeiras com-preendendo as mesmas, a métodos para fabricação das moléculas de liga-ção a antígeno da invenção e a seu uso no tratamento de várias doenças edistúrbios, por exemplo, cânceres.

Antecedentes da Invenção

Anticorpos proporcionam um elo entre o sistema imune humorale celular com IgG sendo a imunoglobulina mais abundante no soro. Emboraas regiões Fab do anticorpo reconheçam antígenos, a porção Fc se liga areceptores de Fcy (FcyRs) que são diferencialmente expressos por todas ascélulas imunes competentes. Quando de ligação cruzada ao receptor por umcomplexo de antígeno/anticorpo multivalente, desgranulação, citólise ou fa-gocitose da célula alvo e ativação transcricional de genes de codificação decitocina são disparados (Deo, Y.M. e outros, lmmunol. Today 18(3): 127-135(1997)).

As funções efetoras mediadas pela região Fc do anticorpo po-dem ser divididas em duas categorias: (1) funções efetoras que operam a-pós a ligação do anticorpo a um antígeno (essas funções envolvem, por e-xemplo, a participação da cascata de complemento ou células trazendo re-ceptor Fc (FcR)); e (2) funções efetoras que operam independentemente daligação de antígeno (essas funções conferem, por exemplo, persistência nacirculação e a capacidade de ser transferida através de barreiras celularespor meio de transcitose). Por exemplo, ligação do componente C1 de com-plemento a anticorpos ativa o sistema de complemento. Ativação de com-plemento é importante na opsonização e Iise de patógenos celulares. A ati-vação de complemento também estimula a resposta inflamatória e podetambém estar envolvida em hiper-sensibilidade auto-imune. Ainda, anticor-pos se ligam à células via a região Fc1 com um sítio de ligação de receptorFc sobre a região Fc do anticorpo se ligando a um receptor Fc (FcR) sobreuma célula. Há uma série de receptores Fc os quais são específicos paradiferentes classes de anticorpo, incluindo IgG (receptores gama), IgE (recep-tores epsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). Embora a pre-sente invenção não esteja limitada a qualquer mecanismo em particular, li-gação de anticorpo a receptores Fc sobre superfícies celulares dispara umasérie de respostas biológicas importantes e diversas, incluindo engolfamentoe destruição de partículas revestidas de anticorpo, eliminação de complexosimunes, Iise de células alvo revestidas de anticorpo por células assassinas(conhecida como citotoxicidade célula-mediada anticorpo-dependente ouADCC), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária econtrole de produção de imunoglobulina.

FcRs são definidos por sua especificidade por isotipos de imu-noglobulina; receptores Fc para anticorpos de IgG são referidos como FcyR,para IgE como FceR, para IgA como FcaR e assim por diante. Três subclas-ses de FcyR humano foram identificadas: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) eFcyRIII (CD16).

Em virtude do fato de que cada subclasse de FcyR é codificadapor dois ou três genes e união alternativa de RNA leva a múltiplos transcri-tos, uma ampla diversidade existe nas isoformas de FcyR. Os três genesque codificam a subclasse FcyRI (FcyRIA1 FcyRIB e FcyRIC) estão agrupa-das na região 1q21.1 do braço longo do cromossoma 1; os genes que codifi-cam isoformas FcyRII (FcyRIIA, FcyRIIB e FcyRIIC) e os dois genes que co-dificam FcyRIII (FcyRIIIA e FcyRIIIB) estão todos agrupados na região 1q22.

Esses diferentes subtipos de FcR são expressos sobre diferentes tipos decélulas (veja, por exemplo, Ravetch, J.V. e Kinet, J.P. Annu. Rev. Immunol.9: 457- 492 (1991)). Por exemplo, em seres humanos, FcyRIIIB é encontradoapenas sobre neutrófilos, enquanto que FcyRIIIA é encontrado sobre macró-fagos, monócitos, células assassinas naturais (NK) e uma sub-população decélulas T. Notavelmente, FcyRIIIA é o único FcR presente sobre células NK1um dos tipos de célula implicados em ADCC.

FcyRI1 FcyRII e FcyRIII são receptores da superfamília de imu-noglobulina (IgSF); FcyRI tem três domínios de IgSF em seu domínio extra-celular, enquanto que FcyRII e FcyRIII têm apenas dois domínios de IgSFem seus domínios extracelulares.

Outro tipo de receptor Fc é o receptor Fc neonatal (FcRn). FcRné estruturalmente similar ao principal complexo de histocompatibilidade(MHC) e consiste em uma α-cadeia não covalentemente ligada à β2-microglobulina.

Recentemente, a importância da ativação do receptor FcyRIIIapara a eliminação in vivo de células tumorígenas foi descoberta. Em pacien-tes com Iinfoma não-Hodgkin folicular, uma relação foi reportada entre o ge-nótipo de FcyRIIIa e respostas clínicas e moleculares ao rituximab, um anti-corpo quimérico anti-CD20 usado contra malignidades hematológicas (Car-tron, G. e outros, Blood 99(3): 154-15% (2002)). Os autores demonstraramque a eficácia do rituximab era maior em pacientes homozigóticos para "altaafinidade"-FcyRllla, caracterizado por uma valina na posição 158 (FcyRIIIa[Val-158]) do que em pacientes heterozigóticos ou homozigóticos para "bai-xa afinidade"-FcyRllla, o qual tem um resíduo de fenilalanina nessa posição(FcyRllla[Phe-158]). Essa dissimilaridade parece contar para as afinidadessignificativamente diferentes que o anticorpo mostrou por células imunesFcyRllla-positivas (DallOzzo, S. e outros, Câncer Res. 64(13): 4664-4669(2004)).

As observações acima implicam em um papel crucial paraFcyRIIIa na eliminação de células tumorígenas e sustentam a idéia de queanticorpos monoclonais (mAbs) com afinidade aumentada pelo FcyRIIIa te-rão atividade biológica aperfeiçoada. Uma via para intensificar a afinidadepelo FcyRIIIa e, conseqüentemente, as funções efetoras de anticorpos mo-noclonais é a manipulação de sua porção carboidrato (Umana, P. e outros,Nat. Biotech. 170: 176-180 (1999), Shields1 R.L. e outros, J. Bioi Chem.277(30): 26733-26740 (2002), Ferrara, C. e outros, submetido). A N-glicosilação de Fc em Asn-297 em ambos os domínios Cy2 é crucial para aafinidade a todos os FcyRs (Tao, M.H. & Morrison, S.L., J. Immunol. 143(8):2595-2601 (1989), Mimura, Y. e outros, J. BioL Chem. 276(49): 45539-45547(2001) e para estimular funções efetoras apropriadas (Wright, A. & Morrison,S.L., J. Exp. Med. 180(3): 1087-1096 (1994), Sarmay, G. e outros, Mol Im-munol. 29(5): 633-639 (1992)). Ele é compreendido de uma estrutura princi-pal pentassacarídica conservada com adição variável de fucose e açúcaresde braço externo (Jefferis, R. e outros, Immunol. fíev. 163: 59-16 (1998)). Opadrão de N-glicosilação de mAbs foi manipulado através de manipulaçãoda via de glicosilação de uma linhagem de células de produção usando ativi-dades enzimáticas que levam a carboidratos que ocorrem naturalmente. Osanticorpos glicomanipulados resultantes (GE) se caracterizam por altas pro-porções de oligossacarídeos não-fucosilados bisseccionados, afinidade a-perfeiçoada pelo FcyRIIIa e ADCC intensificada (Umana, P. e outros, Nat.Biotech. 17 (2): 176-180 (1999), Ferrara, C. e outros, submetido). Resultadossimilares são encontrados usando uma linhagem de células de produção aqual é incapaz de adicionar resíduos de fucose a oligossacarídeos N-Iigados(Sarmay, G. e outros, Mol. Immunol. 29(5): 633-639 (1992).

Em contraste à situação com Fc de IgG, pouca informação estádisponível com relação à influência de glicosilação de FcyRIIIa sobre a ativi-dade do receptor. A estrutura principal de cristal de FcyRIII não glicosiladoem complexo com o fragmento Fe de hlgG1 indica que a porção carboidratoputativa do FeyRIII potencialmente presa à Asn-162 apontaria para uma ca-vidade central dentro do fragmento Fc (Shields, R.L. e outros, J. Bioi Chem.277(30): 26733-26740 (2002)), onde as glicanos do núcleo rígido presas àlgG-Asn-297 também estão localizadas (Huber, R. e outros, Nature 264(5585): 415-420 (1976)). Essa disposição sugere uma possível abordagemdas porções carboidrato de ambas as proteínas quando de formação decomplexo.

Para dissecar a interação entre IgGI e FcyRIIIa humano solúvel(sh) em um nível molecular, ligação de variantes de ShFcyRIIIa à glicovarian-tes de anticorpo distintas foi avaliada através de ressonância de plasmônioem superfície (SPR) e em um sistema celular.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Em uma modalidade, a invenção é dirigida a uma molécula deligação a antígeno glicomanipulada compreendendo uma região Fc1 em quea referida região Fc tem uma estrutura principal de oligossacarídeo alteradacomo um resultado da referida glicomanipulação e tem pelo menos uma mo-dificação de aminoácido e em que a referida molécula de ligação a antígenoexibe ligação aumentada a um receptor FcyRIII humano comparado com amolécula de ligação a antígeno que carece da referida modificação. Em umamodalidade preferida, a molécula de ligação a antígeno glicomanipulada nãoexibe ligação aumentada a um receptor FcyRII humano, tal como o receptorFcyRllaouoreceptorFcyRIIb.

De preferência, o receptor FcyRIII é glicosilado de modo que elecompreende oligossacarídeos N-Iigados em Asn162. Em uma modalidade, oreceptor FcyRIII é FcyRIIIa. Em outra modalidade, o receptor FcyRIII éFcyRIIIb. Em determinadas modalidades, o receptor FcyRIIIa tem um resíduode valina na posição 158. Em outras modalidades, o receptor FcyRIIIa temum resíduo de fenilalanina na posição 158.

Em uma modalidade preferida, a molécula de ligação a antígenoglicomanipulada da presente invenção contém uma modificação que nãoaumenta substancialmente a ligação a um receptor FcyRIII não-glicosiladocomparado com a molécula de ligação a antígeno carecendo da referidamodificação. Em uma modalidade, a molécula de ligação a antígeno glico-manipulada da presente invenção compreende uma substituição em um oumais dos aminoácidos 239, 241, 243, 260, 262, 263, 264, 265, 268, 290,292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302 ou 303. Em algumasmodalidades, a molécula de ligação a antígeno glicomanipulada compreendeduas ou mais das substituições listadas nas Tabelas 2 e 4. Em algumas mo-dalidades, a molécula de ligação a antígeno glicomanipulada compreende asduas ou mais substituições listadas na Tabela 5.A presente invenção é ainda dirigida a uma molécula de ligaçãoa antígeno glicomanipulada compreendendo uma ou mais substituições quesubstituem o resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente por um resíduode aminoácido que interage com o carboidrato preso àAsn162 do receptorFcyRIII. De preferência, o resíduo de aminoácido que interage com o carboi-drato preso à Ans162 do receptor FcyRI 11 é selecionado do grupo consistindoem: Trp1 His, Tyr1 Glu, Arg1 Asp1 Phe1 Asn e Gln.

Em uma modalidade preferida, a molécula de ligação a antígenoglicomanipulada compreende uma substituição selecionada do grupo consis-tindo em: Ser239Asp, Ser239Glu, Ser239Trp, Phe243His, Phe243Glu, T-hr260His, His268Asp, His268Glu. Alternativa ou adicionalmente, a moléculade ligação a antígeno glicomanipulada de acordo com a presente invençãopode conter uma ou mais substituições listadas na Tabela 2 ou 4.

Em uma modalidade preferida, a molécula de ligação a antígenoglicomanipulada da presente invenção se liga ao receptor FcyRIII com afini-dade pelo menos 10% aumentada, afinidade pelo menos 20% aumentada,afinidade pelo menos 30% aumentada, afinidade pelo menos 40% aumenta-da, afinidade pelo menos 50% aumentada, afinidade pelo menos 60% au-mentada, afinidade pelo menos 70% aumentada, afinidade pelo menos 80%aumentada, afinidade pelo menos 90% aumentada ou afinidade pelo menos100% aumentada, comparado com a mesma molécula de ligação a antígenocarecendo da referida modificação.

A molécula de ligação a antígeno glicomanipulada da presenteinvenção compreende, de preferência, uma região Fc de IgG humana. Emuma modalidade, a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo ou umfragmento de anticorpo compreendendo uma região Fe. Em uma modalidadepreferida, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é quimérico ou humanizado.

Em determinadas modalidades, a molécula de ligação a antíge-no glicomanipulada de acordo com a invenção exibe função efetora aumen-tada. De preferência, a função efetora aumentada é citotoxicidade celularanticorpo-dependente aumentada ou citotoxicidade complemento-depen-dente aumentada.A estrutura principal de oligossacarídeo alterada nas moléculasde ligação a antígeno glicomanipuladas da presente invenção compreende,de preferência, um número diminuído de resíduos de fucose quando compa-rado com a molécula de ligação a antígeno não-glicomanipulada. Em umamodalidade preferida, pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%,pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% oumais dos oligossacarídeos na região Fc são não-fucosilados.

A estrutura principal de oligossacarídeo alterada nas moléculasde ligação a antígeno glicomanipuladas da presente invenção pode tambémcompreender um número aumentado de oligossacarídeos bisseccionadosquando comparado com a molécula de ligação a antígeno não-glicoma-nipulada. O oligossacarídeo bisseccionado pode ser do tipo híbrido ou dotipo complexo. A presente invenção também abrange uma molécula de liga-ção a antígeno glicomanipulada, em que a referida estrutura principal de oli-gossacarídeo alterada compreende um aumento na proporção de resíduosde GIcNAc para resíduos de fucose quando comparado com a molécula deligação a antígeno não-glicomanipulada.

Em uma modalidade preferida, as moléculas de ligação a antí-geno glicomanipuladas da presente invenção se ligam seletivamente a umantígeno selecionado do grupo consistindo em: o antígeno CD20 humano, oantígeno EGFR humano, o antígeno MCSP humano, o antígeno MUC-1 hu-mano, o antígeno CEA humano, o antígeno HER2 humano e o antígenoTAG-72 humano.

A presente invenção também é dirigida a uma molécula de Iiga-ção a antígeno glicomanipulada compreendendo uma região Fc, em que areferida região Fc tem uma estrutura principal de oligossacarídeo alteradacomo um resultado da referida glicomanipulação e tem pelo menos uma mo-dificação de aminoácido e em que a referida molécula de ligação a antígenoexibe especificidade aumentada por um receptor FcyRIH humano comparadocom a molécula de ligação a antígeno que carece da referida modificação.De preferência, a molécula de ligação a antígeno glicomanipulada da pre-sente invenção não exibe especificidade aumentada por um receptor FcyRIIhumano, tal como o receptor FcyRIIa humano ou o receptor FcyRIIb humano.

O receptor FcyRIII é, de preferência, glicosilado (isto é, ele com-preende oligossacarídeos N-Iigados em Asn162). Em uma modalidade, oreceptor FcyRIII é FcyRIIIa. Em uma modalidade alternativa, o receptorFcyRIII é FcyRIIIb. Em determinadas modalidades, o receptor FcyRIIIa temum resíduo de valina na posição 158. Em outras modalidades, o receptorFcyRIIIa tem um resíduo de fenilalanina na posição 158.

Em uma modalidade preferida, a modificação de aminoácido deuma molécula de ligação a antígeno não aumenta substancialmente a espe-cificidade por um receptor FcyRIII não-glicosilado comparado com a molécu-la de ligação a antígeno carecendo da modificação.

Em uma modalidade particularmente preferida, a modificaçãocompreende uma substituição de aminoácido em uma ou mais das posiçõesde aminoácido 239, 241, 243, 260, 262, 263, 264, 265, 268, 290, 292, 293,294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302 ou 303. Em uma modalidadepreferida, a substituição substitui o resíduo de aminoácido que ocorre natu-ralmente por um resíduo de aminoácido que interage com o carboidrato pre-so à Asn162 do receptor FcyRIII. Em uma modalidade, o resíduo de aminoá-cido que interage com o carboidrato preso à Asn162 do receptor FcyRIII éselecionado do grupo consistindo em: Trp, His, Tyr, Glu, Arg, Asp, Phe, Asne Gln.

Em uma modalidade, a substituição é selecionada do grupo con-sistindo em: Ser239Asp, Ser239Glu, Ser239Trp, Phe243Hís, Phe243Glu,Thr260His, His268Asp, His268Glu. A molécula de ligação a antígeno glico-manipulada de acordo com a presente invenção pode também conter umaou mais das substituições listadas nas Tabelas 2 ou 5.

Em uma modalidade preferida, a invenção abrange uma molécu-la de ligação a antígeno glicomanipulada em que a referida molécula de liga-ção a antígeno se liga a um receptor FcyRIII com especificidade pelo menos10% aumentada, especificidade pelo menos 20% aumentada, especificidadepelo menos 30% aumentada, especificidade pelo menos 40% aumentada,especificidade pelo menos 50% aumentada, especificidade pelo menos 60%aumentada, especificidade pelo menos 70% aumentada, especificidade pelomenos 80% aumentada, especificidade pelo menos 90% aumentada ou es-pecificidade pelo menos 100% aumentada ou mais comparado com a molé-cula de ligação a antígeno carecendo da referida modificação.

De preferência, a molécula de ligação a antígeno glicomanipula-da da invenção exibindo especificidade aumentada contém uma região Fcde IgG humana. Em outra modalidade preferida, a molécula de ligação aantígeno é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo compreendendo umaregião Fe. Em uma modalidade particularmente preferida, o anticorpo oufragmento de anticorpo é quimérico ou humanizado.

A molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a invenção exibe, de preferência, função efetora aumentada, por exem-plo, citotoxicidade celular anticorpo-dependente aumentada ou citotoxicidadecomplemento-dependente aumentada.

A estrutura principal de oligossacarídeo alterada pode compre-ender um número diminuído de resíduos de fucose quando comparado coma molécula de ligação a antígeno não-glicomanípulada. Por exemplo, a in-venção abrange uma molécula de ligação a antígeno glicomanipulada emque pelo menos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%,pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% oumais dos oligossacarídeos na região Fc são não-fucosilados.

Em outra modalidade, a estrutura principal de oligossacarídeoalterada pode compreender um número aumentado de oligossacarídeos bis-seccionados quando comparado com a molécula de ligação a antígeno não- glicomanipulada. Os oligossacarídeos bisseccionados podem ser do tipohíbrido ou do tipo complexo. Em uma modalidade, a estrutura principal deoligossacarídeo alterada compreende um aumento na proporção de resíduosde GIcNAc para resíduos de fucose quando comparado com a molécula deligação a antígeno não-glicomanipulada.

Em uma modalidade preferida, as moléculas de ligação a antí-geno glicomanipuladas de acordo com a invenção se ligam seletivamente aum antígeno selecionado do grupo consistindo em: o antígeno CD20 huma-no, o antígeno EGFR humano, o antígeno MCSP humano, o antígeno MUC-1 humano, o antígeno CEA humano, o antígeno HER2 humano; e o antígenoTAG-72 humano.

A presente invenção é também dirigida a um polinucleotídeo quecodifica um polipeptídeo compreendendo uma região Fc de anticorpo ou umfragmento de uma região Fc de anticorpo, em que a referida região Fc oufragmento da mesma tem pelo menos uma modificação de aminoácido e emque o referido polipeptídeo exibe ligação aumentada a um receptor FcyRIIIhumano comparado com o mesmo polipeptídeo que carece da referida modi-ficação. O polipeptídeo pode ser uma cadeia pesada de anticorpo. O poli-peptídeo pode também ser uma proteína de fusão.

A presente invenção é ainda dirigida a vetores e células hospe-deiras compreendendo os polinucleotídeos da invenção.

A presente invenção é também dirigida a um método para pro-dução de uma molécula de ligação a antígeno glicomanipulada compreen-dendo uma região Fe, em que a referida região Fc tem uma estrutura princi-pal de oligossacarídeo alterada como um resultado da referida glicomanipu-lação e tem pelo menos uma modificação de aminoácido e em que a referidamolécula de ligação a antígeno exibe ligação aumentada a um receptorFcyRIII humano comparado com a molécula de ligação a antígeno que care-ce da referida modificação, o referido método compreendendo:

(i) cultura da célula hospedeira da invenção sob condiçõesque permitem a expressão do referido polinucleotídeo; e

(ii) recuperação da referida molécula de ligação a antígenoglicomanipulada do meio de cultura.

A invenção também é dirigida a um método para produção deuma molécula de ligação a antígeno glicomanipulada compreendendo umaregião Fc1 em que a referida região Fc tem uma estrutura principal de oligos-sacarídeo alterada como um resultado da referida glicomanipulação e tempelo menos uma modificação de aminoácido e em que a referida moléculade ligação a antígeno exibe seletividade aumentada por um receptor FcyRIIIhumano comparado com a molécula de ligação a antígeno que carece dareferida modificação, o referido método compreendendo:

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1(a-c). caracterização de oligossacarídeo de anticorposglicomanipulados (GE) e nativos: (a) Porção de carboidrato associada àAsn297 de IgGI-Fc humana. Os açúcares em negrito definem o núcleo depentassacarídeo; a adição dos outros resíduos de açúcar é variável. A bis-secção do resíduo de GIcNAc β1,4-ligado é introduzida através de GnT-lll.(b) Espectros por MALDI-MS de oligossacarídeos neutros liberados de anti-corpos GEe nativos. O valor de m/z corresponde ao íon de oligossacarídeosódio-associado. Para confirmar o tipo de carboidrato, os anticorpos foramtratados com Endoglicosidase H a qual hidrolisa apenas glicanos híbridos,mas não em complexo, (c) Distribuições de oligossacarídeo das glicovarian-tes de IgG usadas nesse estudo. Glico-1 se refere a uma variante de anti-corpo glicomanipulada gerada a partir de superexpressão de GnT-III apenas.Glico-2 se refere a uma variante de anticorpo glicomanipulada gerada atra-vés de co-expressão de GnT-III e Manll recombinante.

A figura 2(a-b). Ligação de shFc7Rllla[Val-158] ou shFcyRllla[Phe-158] à glicovariantes de IgGI imobilizadas. A fase de associação é re-presentada por uma barra sólida acima das curvas, (a) Sobreposição desensogramas dos eventos de ligação para shFcyllla[Val-158] e shFcyRllla[Phe-158], respectivamente. Para comparar o evento de ligação de anticor-pos GE dentro de uma faixa de resposta similar, os sensogramas obtidos emconcentrações de 800 nM ou 6,4 μΜ para o anticorpo nativo foram sobre-postos. Todos os sensogramas foram normalizados para o nível de imobilí-zação. (b) Análise cinética para ligação de shFcYRIIIa[Val-158] oushFcyRllla[Phe-158] à Glico-2. Curvas adaptadas e erros residuais (abaixo)foram derivados através de adaptação de curva não-linear.

A figura 3(a-c). Ligação de glicovariantes de IgG ao hFcyRllla[Val-158/Gln-162], Todos os sensogramas foram normalizados para o nívelde imobilização. (a) Sobreposição de sensogramas dos eventos de ligaçãopara shFcyRllla[Val-158/Gln-162]. A fase de associação é representada poruma barra sólida acima das curvas, (b) Sobreposição de sensogramas doseventos de ligação para shFcyRllla[Val-158/Gli-l62] ou ligação deshFcyRllla[Val-158] à Glico-2 ou WT. (c) Ligação de células inteiras de IgG àcélulas de Jurkat expressando hFcyRllla[Val-158/Gln-162] e hFcyRllla[Val-158] ou não transfectadas. Ligação de FcyRIIIa é fornecida em unidades ar-bitrárias.

A figura 4(a-b). A interação proposta do FcyRIII glicosilado com ofragmento Fc de IgG. (a) A estrutura principal de cristal do FcyRIII em com-plexo com o fragmento Fc de IgG nativa (código PDB Ie4k) é mostrada noinseto. O retângulo indica a clipagem mostrada acima. As duas cadeias dofragmento Fc e do FcyRIII não-glicosilado são representadas como superfí-cie com Asn 162 e o resíduo de fucose indicado. Os glicanos presos ao Fcsão mostrados como esferas e bastões. O resíduo de fucose ligado ao car-boidrato da cadeia do fragmento Fc é responsável pelo impedimento estéricoda interação proposta com o carboidrato do FcyRIII. (b) Modelo de interaçãoentre um FcyRIII glicosilado e o fragmento Fc (não-fucosilado) de GE-IgG.Uma vez que esse resíduo de fucose não está presente dentro da GE-IgG,os carboidratos presos em Asn162 do receptor podem interagir totalmentecom a GE-IgG. A figura foi criada usando o programa PYMOL(www.delanoscientific.com).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Termos são usados aqui conforme geralmente usado na técnica,a menos que de outro modo definido como segue.

ABREVIAÇÕES: Ig, imunoglobulina; ADCC, citoxicidade celularanticorpo-dependente; CDC, citotoxicidade complemento-dependente;

PBMC, células mononucleares de sangue periférico; GE, glicomanipulada;

GIcNAc: N-acetilglicosamina; Man, manose; Gal, galactose; Fuc, fucose;

NeuAc, ácido N-acetilneuramínico; GnT-lll, N-acetilglicosaminil transferase;

kon, constante de taxa de associação; kof1, constante de taxa de dissociação.Conforme usado aqui, o termo anticorpo se destina a incluir mo-léculas de anticorpo inteiras, incluindo anticorpos monoclonais, policlonais emultiespecíficos (por exemplo, bisseccionados), bem como fragmentos deanticorpo tendo a região Fc e retendo especificidade de ligação e pelo me-nos uma função efetora, por exemplo, ADCC, e proteínas de fusão que in-cluem uma região funcionalmente equivalente à região Fc de uma imunoglo-bulina e que retém especificidade de ligação e pelo menos uma função efe-tora. Também abrangidos são anticorpos quiméricos e humanizados, bemcomo anticorpos camelizados e primatizados.

Conforme usado aqui, o termo região Fc se destina a se referir auma região C-terminal de uma cadeia pesada de IgG humana. Embora oslimites da região Fc de uma cadeia pesada de IgG possam variar ligeiramen-te, a região Fc de cadeia pesada de IgG humana é usualmente definida co-mo se estendendo do resíduo de aminoácido na posição Cys226 ao carboxil-término.

Conforme usado aqui, o termo região equivalente à região Fc deuma imunoglobulina se destina a incluir variantes alélicas que ocorrem natu-ralmente da região Fc de uma imunoglobulina, bem como variantes tendoalterações as quais produzem substituições, adições ou deleções, mas asquais não diminuem substancialmente a capacidade da imunoglobulina demediar funções efetoras (tal como citotoxicidade celular anticorpo-depen-dente). Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser deletados do N-término ou C-término da região Fc de uma imunoglobulina sem perda subs-tancial de função biológica. Tais variantes podem ser selecionadas de acor-do com regras gerais conhecidas na técnica de modo a ter efeito mínimosobre a atividade (veja, por exemplo, Bowie, J. U. e outros, Science 247:1306-10(1990)).

Conforme usado aqui, o termo molécula de ligação a antigenoou ABM se refere, em seu sentido mais amplo, a uma molécula que se ligaespecificamente a um determinante antigênico. De preferência, a ABM é umanticorpo; contudo, anticorpos com cadeia simples, moléculas de Fv comcadeia simples, fragmentos Fab, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e simila-res também são considerados pela presente invenção.

Por se liga especificamente ou se liga com a mesma especifici-dade, quando usado para descrever uma molécula de ligação a antígeno dainvenção, entenda-se que a ligação é seletiva para o antígeno e pode serdiscriminada de interações indesejadas ou não específicas.

Conforme usado aqui, os termos fusão e quimérico, quando u-sados em referência a polipeptídeos, tais como ABMs, se referem a polipep-tídeos compreendendo seqüências de aminoácido derivadas de dois ou maispolipeptídeos heterólogos, tais como porções de anticorpos de diferentesespécies. Para ABMs quiméricas, por exemplo, os componentes de ligaçãoa não-antígeno podem ser derivados de uma ampla variedade de espécies,incluindo primatas, tais como chimpanzés e seres humanos. A região cons-tante da ABM quimérica é, mais preferivelmente, substancialmente idêntica àregião constante de um anticorpo humano natural; a região variável do anti-corpo quimérico é, mais preferivelmente, substancialmente idêntica àquelade um anticorpo recombinante tendo a seqüência de aminoácido da regiãovariável de murino. Anticorpos humanizados são uma forma particularmentepreferida de anticorpo de fusão ou quimérico.

Conforme usado aqui, um polipeptídeo tendo, por exemplo, ati-vidade de GnT-lll, se refere a um polipeptídeo que é capaz de catalisar aadição de um resíduo de N-acetilglicosamina (GIcNAc) em ligação β1,4 aomanosídeo β-ligado do núcleo de trimanosila de oligossacarídeos N-ligados.Isso inclui polipeptídeos de fusão exibindo atividade enzimática similar a,mas não necessariamente idêntica a, uma atividade de β (1,4)-N-acetilgli-cosaminil transferase III, também conhecida como glicoproteína de β-1,4-manosila 4^-N-acetilglicosaminil-transferase (EC 2.4.1.144), de acordo como Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology (NC-IUBMB), conforme medido em um ensaio biológicoparticular, com ou sem dose-dependência. No caso onde a dose-dependência existe, ela não precisa ser idêntica àquela da GnT-lll, mas an-tes substancialmente similar à dose-dependência em uma determinada ativi-dade quando comparado com a GnT-III (isto é, o polipeptídeo candidato exi-birá maior atividade ou não mais do que cerca de 25 vezes menos e, de pre-ferência, não mais do que cerca de dez vezes menos atividade e, ainda maispreferivelmente, não mais do que cerca de três vezes menos atividade comrelação à GnT-lll).

Conforme usado aqui, o termo variante (ou análogo) se refere aum polipeptídeo diferindo de um polipeptídeo especificamente mencionadoda invenção por inserções, deleções e substituições de aminoácido criadasusando, por exemplo, técnicas de DNA recombinante. Variantes das ABMsda presente invenção incluem moléculas de ligação a antígeno quiméricas,primatizadas ou humanizadas, em que um ou vários resíduos de aminoácidosão modificados através de substituição, adição e/ou deleção de uma manei-ra tal que não afeta substancialmente a afinidade de ligação a antígeno oufunção efetora do anticorpo. Orientação sobre a determinação de quais resí-duos de aminoácido podem ser substituídos, adicionados ou deletados semeliminar atividades de interesse pode ser encontrada através de comparaçãoda seqüência do polipeptídeo em particular com aquela de peptídeos homó-logos e minimização do número de alterações de seqüência de aminoácidofeitas em regiões de alta homologia (regiões conservadas) ou através desubstituição de aminoácidos por seqüências de consenso.

Alternativamente, variantes recombinantes que codificam essesmesmos ou polipeptídeos similares podem ser sintetizadas ou selecionadasfazendo uso da "redundância" no código genético. Várias substituições decódon, tais como as alterações silenciosas as quais produzem vários sítiosde restrição, podem ser introduzidas para otimizar a clonagem em um plas-mídeo ou vetor viral ou expressão em um sistema procariota ou eucariotaem particular. Mutações na seqüência do polinucleotídeo podem ser refleti-das no polipeptídeo ou domínios dos outros peptídeos adicionados ao poli-peptídeo para modificar as propriedades de qualquer parte do polipeptídeo,para alterar características tais como afinidades de ligação a ligante, afinida-des intercadeia e/ou taxa de degradação/movimentação.

De preferência, "substituições" de aminoácido são o resultado desubstituição de um aminoácido por outro aminoácido tendo propriedadesestruturais e/ou químicas similares, isto é, substituições conservativas deaminoácido. Substituições "conservativas" de aminoácido podem ser feitascom base na similaridade de polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade,hidrofilicidade e/ou na natureza anfifática dos resíduos envolvidos. Por e-xemplo, aminoácidos não polares (hidrofóbicos) incluem alanina, leucina,isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina; aminoácidosneutros polares incluem glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagi-na e glutamina; aminoácidos positivamente carregados (básicos) incluemarginina Iisina e histidina; e aminoácidos negativamente carregados (ácidos)incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. "Inserções" ou "deleções" estão,de preferência, na faixa de cerca de 1 a cerca de 20 aminoácidos, mais pre-ferivelmente cerca de 1 a cerca de 10 aminoácidos. A variação permitidapode ser experimentalmente determinada fazendo inserções, deleções ousubstituições sistematicamente em uma molécula polipeptídica usando téc-nicas de DNA recombinante e avaliando as variantes recombinantes resul-tantes quanto à atividade.

Conforme usado aqui, o termo humanizado é usado para se re-ferir a uma molécula de ligação a antígeno (ABM) derivada de uma moléculade ligação a antígeno não-humana, por exemplo, um anticorpo de murino,que retém ou retém substancialmente as propriedades de ligação a antígenoda molécula precursora, mas a qual é menos imunogênica em seres huma-nos. Isso pode ser obtido através de vários métodos, incluindo (a) enxerta-gem apenas das regiões de determinação de complementaridade (CDRs)não-humanas sobre a estrutura principal humana e regiões constantes comou sem retenção de resíduos estruturais críticos (por exemplo, aqueles quesão importantes para retenção de boa afinidade de ligação a antígeno oufunções do anticorpo) ou (b) transplante dos domínios variáveis não-humanos inteiros, mas "ocultação" dos mesmos com uma seção semelhanteà humana através de substituição de resíduos na superfície. Tais métodossão descritos em Jones e outros, Nature 321: 6069, 522-525 (1986); Morri-son e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. 57: 6851-6855 (1984); Morrison e Oi,Adv. Immunol. 44: 65-92 (1988); Verhoeyen e outros, Science 259: 1534-1536 (1988); Padlan1 Molec. Immun. 25: 489-498 (1991); Padlan1 Molec.Immun. 31(3): 169-217 (1994), todos os quais são incorporados por referên-cia em sua totalidade aqui.

Geralmente, existem três CDRs (CDR1, CDR2, e CDR3) em ca-da um dos domínios variáveis de cadeia pesada e leve de um anticorpo, asquais são flanqueadas por quatro sub-regiões de rede (isto é, FR1, FR2,FR3, e FR4): FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4. Uma discussão deanticorpos humanizados pode ser encontrada, inter alia, na Patente U.S. Ne6.632.927 e no Pedido de Patente U.S. publicado N5 2003/0175269, ambosos quais são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

Similarmente, conforme usado aqui, o termo primatizado é usa-do para se referir a uma molécula de ligação a antígeno derivada de umamolécula de ligação a antígeno de não-primata, por exemplo, um anticorpode murino, que retém ou retém substancialmente as propriedades de ligaçãoa antígeno da molécula precursora, mas a qual é menos imunogênica emprimatas.

No caso onde existem duas ou mais definições de um termo oqual é usado e/ou aceito dentro da técnica, a definição do tempo conformeusado aqui se destina a incluir todos de tais significados, a menos que expli-citamente estabelecido o contrário. Um exemplo específico é o uso do termo"região de determinação de complementaridade" ("CDR") para descreversítios de combinação de antígeno não-contínuos dentro da região variável depolipeptídeos de cadeias pesada e leve. Essa região particular foi descritapor Kabat e outros, U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequencesof Proteins of Immunological Interest" (1983) e por Chothia e outros, J. MoiBiol. 196: 901-911 (1987), os quais são incorporados aqui por referência,onde as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos deaminoácido quando comparada uma com a outra. Todavia, aplicação dequalquer definição para se referir a uma CDR de um anticorpo ou variantesdo mesmo se destina a estar dentro do escopo do termo conforme definido eusado aqui. Os resíduos de aminoácido apropriados os quais abrangem asCDRs conforme definido por cada uma das referências citadas acima sãoapresentados abaixo na Tabela 1 como uma comparação. Os números exa-tos de resíduo os quais abrangem uma CDR em particular variarão depen-dendo da seqüência e tamanho da CDR. Aqueles versados na técnica po-dem determinar rotineiramente quais resíduos compreendem uma CDR emparticular dada a seqüência de aminoácido da região variável do anticorpo.

TABELA 1

DEFINIÇÕES DE CDR1

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1 Numeração de todas as definições de CDR na Tabela 1 é de acordo com asconvenções de numeração apresentadas por Kabat e outros (veja abaixo).

Kabat e outros também definiram um sistema de numeração pa-ra seqüências de domínio variável que é aplicável a qualquer anticorpo.

Aqueles versados na técnica podem atribuir inequivocamente esse sistemade "numeração de Kabat" a qualquer seqüência de domínio variável, semconfiar em quaisquer dados experimentais além da seqüência em si. Con-forme usado aqui, "numeração de Kabat" se refere ao sistema de numera-ção apresentado em Kabat e outros, U.S. Dept. of Health and Human Servi-ces, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983) (incorporadoaqui por referência em sua totalidade). As seqüências de qualquer listagemde seqüência (isto é, SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2) não são numeradas deacordo com o sistema de numeração de Kabat. Contudo, conforme estabe-lecido acima, está bem dentro da capacidade daqueles versados na técnicadeterminar o esquema de numeração de Kabat de qualquer seqüência deregião variável na Listagem de Seqüência baseado na numeração das se-qüências conforme apresentado no mesmo.

Por um ácido nucléico ou polinucleotídeo tendo uma seqüênciade nucleotídeo pelo menos, por exemplo, 95% idêntica ou tendo 95% de /-dentidade a uma seqüência de nucleotídeo de referência da presente inven-ção, entenda-se que a seqüência de nucleotídeo do polinucleoíídeo é idênti-ca à seqüência de referência, exceto que a seqüência de polinucleotídeopode incluir até cinco mutações de ponto por cada 100 nucleotídeos da se-qüência de nucleotídeo de referência. Em outras palavras, para obter umpolinucleotídeo tendo uma seqüência de nucleotídeo pelo menos 95% idên-tica a uma seqüência de nucleotídeo de referência, até 5% dos nucleotídeosna seqüência de referência podem ser deletados ou substituídos por outronucleotídeo ou uma série de nucleotídeos até 5% dos nucleotídeos totais naseqüência de referência pode ser inserida na seqüência de referência.

Como um assunto prático, se qualquer molécula de ácido nucléi-co ou polipeptídeo em particular é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%,97%, 98% ou 99% idêntico a uma seqüência de nucleotídeo ou seqüênciade polipeptídeo da presente invenção pode ser determinado convencional-mente usando programas de computador conhecidos. Um método preferidopara determinação da melhor combinação global entre uma seqüência query(uma seqüência da presente invenção) e uma seqüência em questão, tam-bém referida como um alinhamento global de seqüência, pode ser determi-nado usando o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo deBrutlag e outros, Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990). Em um alinhamentode seqüência das seqüências query e em questão ambas são seqüências deDNA. Uma seqüência de RNA pode ser comparada convertendo-se U's emT's. O resultado do referido alinhamento global de seqüência está em identi-dade percentual. Parâmetros preferidos usados em um alinhamentoFASTDB de seqüências de DNA para calcular a identidade percentual são:Matriz = Unitária, k tupla = 4, Penalidade por Combinação Errônea = 1, Pe-nalidade por União = 30, Extensão do Grupo de Randomização = 0, Escorede Corte = 1, Penalidade por Gap = 5, Penalidade por Tamanho de Gap =0,05, Tamanho de Janela = 500 ou a extensão da seqüência de nucleotídeoem questão, a que seja mais curta.

Se a seqüência em questão é mais curta do que a seqüênciaquery em virtude de deleções 5' ou 3', não em virtude de deleções internas,uma correção manual deve ser feita nos resultados. Isso é porque o progra-ma FASTDB não leva em conta truncamentos 5' e 3' da seqüência em ques-tão quando de cálculo da identidade percentual. Para seqüências em ques-tão truncadas nas extremidades 5' ou 3' com relação à seqüência query, aidentidade percentual é corrigida calculando-se o número de bases da se-qüência query que estão 5' e 3' da seqüência em questão, as quais não sãocombinadas/alinhadas, como um percentual das bases totais da seqüênciaquery. Se um nucleotídeo é combinado/alinhado é determinado pelos resul-tados do alinhamento de seqüência pelo FASTDB. Esse percentual é, então,subtraído da identidade percentual, calculada através de do programaFASTDB acima usando os parâmetros especificados, para chegar a um es-core de identidade percentual final. Esse escore corrigido é aquele que éusado para fins da presente invenção. Apenas bases fora das bases 5' e 3'da seqüência em questão, conforme mostrado pelo alinhamento FASTDB,as quais não são combinadas/alinhadas com a seqüência query são calcula-das para fins de ajuste manual do escore de identidade percentual.

Por exemplo, uma seqüência em questão de 90 bases é alinha-da a uma seqüência query de 100 bases para determinar a identidade per-centual. As deleções ocorrem na extremidade 5' e, portanto, o alinhamentoFASTDB não mostra uma combinação/alinhamento das 10 primeiras basesna extremidade 5'. As 10 bases não emparelhadas representam 10% da se-qüência (número de bases nas extremidades 5' e 3' não combinadas/númerototal de bases na seqüência query), de modo que 10% são subtraídos doescore de identidade percentual calculado pelo programa FASTDB. Se as 90bases restantes forem perfeitamente combinadas, a identidade percentualfinal seria 90%. Em outro exemplo, uma seqüência em questão de 90 basesé comparada com uma seqüência query de 100 bases. Nesse caso, as dele-ções são deleções internas, de modo que não existem bases sobre a extre-midade 5' ou 3' da seqüência em questão as quais não são combina-das/alinhadas com a query. Nesse caso, a identidade percentual calculadapelo FASTDB não é manualmente corrigida. Mais uma vez, apenas basessobre a extremidade 5' e 3' da seqüência em questão as quais não sãocombinadas/alinhadas com a seqüência query são manualmente corrigidas.Nenhuma outra correção manual é feita para fins da presente invenção.

Por um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido pelomenos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma seqüência de aminoácido queryda presente invenção, se pretende que a seqüência de aminoácido do poli-peptídeo em questão seja idêntica à seqüência query, exceto que a seqüên-cia de polipeptídeo em questão pode incluir até cinco alterações de aminoá-cido por cada 100 aminoácidos da seqüência de aminoácido query. Em ou-tras palavras, para obter um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoá-cido pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido query, até5% dos resíduos de aminoácido na seqüência em questão podem ser inseri-dos, deletados ou substituídos por outro aminoácido. Essas alterações daseqüência de referência podem ocorrer nas posições amino ou carbóxi ter-minais da seqüência de aminoácido de referência ou em qualquer parte en-tre essas posições terminais, interespaçadas individualmente entre resíduosna seqüência de referência ou em um ou mais grupos contínuos dentro daseqüência de referência.

Como um assunto prático, se qualquer polipeptídeo em particu-lar é pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico aum polipeptídeo de referência pode ser determinado convencionalmente u-sando programas de computador conhecidos. Um método preferido paradeterminação da melhor combinação global entre uma seqüência query (u-ma seqüência da presente invenção) e uma seqüência em questão, tambémreferida como um alinhamento global de seqüência, pode ser determinadousando o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Bru-tlag e outros, Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990). Em um alinhamento deseqüência das seqüências query e em questão ambas são seqüências denucleotídeo ou ambas seqüências de aminoácido. O resultado do referidoalinhamento global de seqüência está em identidade percentual. Parâmetrospreferidos usados em um alinhamento FASTDB de seqüências de aminoáci-do são: Matriz = PAM 0, k tupla = 2, Penalidade por Combinação Errônea =1, Penalidade por União = 20, Extensão do Grupo de Randomização = 0,Escore de Corte = 1, Tamanho de Janela = extensão da seqüência, Penali-dade por Gap = 5, Penalidade por Tamanho de Gap = 0,05, Tamanho deJanela = 500 ou a extensão da seqüência de aminoácido em questão, a queseja mais curta.

Se a seqüência em questão é mais curta do que a seqüênciaquery em virtude de deleções N- ou C-terminais, não em virtude de deleçõesinternas, uma correção manual deve ser feita nos resultados. Isso é porqueo programa FASTDB não leva em conta truncamentos N- e C-terminais daseqüência em questão quando de cálculo da identidade percentual. Paraseqüências em questão truncadas nos N- e C-términos com relação à se-qüência query, a identidade percentual é corrigida calculando-se o númerode resíduos da seqüência query que são N- e C-terminais da seqüência emquestão, os quais não são combinados/alinhados com um resíduo em ques-tão correspondente, como um percentual das bases totais da seqüênciaquery. Se um resíduo é combinado/alinhado é determinado pelos resultadosdo alinhamento de seqüência pelo FASTDB. Esse percentual é, então, sub-traído da identidade percentual, calculada através de do programa FASTDBacima usando os parâmetros especificados, para chegar a um escore deidentidade percentual final. Esse escore corrigido é aquele que é usado parafins da presente invenção. Apenas resíduos nos N- e C-términos da seqüên-cia em questão os quais não são combinados/alinhados com a seqüênciaquery são considerados para fins de ajuste manual do escore de identidadepercentual. Isto é, apenas posições de resíduo query fora dos resíduos N- eC-terminais mais distantes dos resíduos da seqüência em questão.

Por exemplo, uma seqüência em questão de 90 resíduos é ali-nhada a uma seqüência query de 100 resíduos para determinar a identidadepercentual. As deleções ocorrem no N-término da seqüência em questão e,portanto, o alinhamento FASTDB não mostra uma combinação/alinhamentodos 10 primeiros resíduos no N-término. Os 10 resíduos não emparelhadosrepresentam 10% da seqüência (número de resíduo nos N- e C-términosnão combinados/número total de resíduos na seqüência query), de modoque 10% são subtraídos do escore de identidade percentual calculado peloprograma FASTDB. Se os 90 resíduos restantes forem perfeitamente combi-nados, a identidade percentual final seria 90%. Em outro exemplo, uma se-qüência em questão de 90 resíduos é comparada com uma seqüência queryde 100 resíduos. Nesse caso, as deleções são deleções internas, de modoque não existem resíduos nos N- ou C-términos da seqüência em questãoos quais não são combinados/alinhados com a query. Nesse caso, a identi-dade percentual calculada pelo FASTDB não é manualmente corrigida. Maisuma vez, apenas posições de resíduos fora das extremidades N- e C-terminais da seqüência em questão os quais não são combinados/alinhadoscom a seqüência query são manualmente corrigidos. Nenhuma outra corre-ção manual é feita para fins da presente invenção.

Conforme usado aqui, um ácido nucléico que se hibridiza sobcondições estringentes a uma seqüência de ácido nucléico da invenção serefere a um polinucleotídeo que se hibridiza em uma incubação durante anoite a 42°C em uma solução compreendendo formamida a 50%, 5 χ SSC(NaCI a 750 mM, citrato de sódio a 75 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH de7,6), 5x solução de Denhardt, sulfato de dextrana a 10% e 20 μg/ml de DNAde esperma de salmão desnaturado, cisalhado, seguido por lavagem dosfiltros em 0,1 χ SSC em torno de 65°C.

Conforme usado aqui, o termo domínio de localização de Golgise refere à seqüência de aminoácido de um polipeptídeo residente no Golgio qual é responsável pela ancoragem do polipeptídeo em um local dentro docomplexo de Golgi. Geralmente, domínios de localização compreendem"caudas" terminais de uma enzima.

Conforme usado aqui, o termo função efetora se refere àquelasatividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de seqüêncianativa ou região Fc de variante de seqüência de aminoácido) de um anticor-po. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem, mas não estão limi-tadas a, afinidade de ligação a receptor Fc1 citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC), fagocitose celular anticorpo-dependente (ADCP), se-creção de citocina, captação de antígeno complexo imune-mediada por célu-las que apresentam antígeno, sub-regulação de receptores na superfíciecelular, etc.Conforme usado aqui, os termos, manipular, manipulada, mani-pulação, glicomanipular, glicomanipulada, glicomanipulação e manipulaçãode glicosilação são considerados como incluindo qualquer manipulação dopadrão de glicosilação de um polipeptídeo recombinante ou que ocorre natu-ralmente, tal como uma molécula de ligação a antígeno (ABM) ou fragmentoda mesma. Manipulação de glicosilação inclui manipulação metabólica damaquinaria de glicosilação de uma célula, incluindo manipulações genéticasdas vias de síntese de oligossacarídeo para obter glicosilação alterada deglicoproteínas expressas em células. Além disso, manipulação de glicosila-ção incluem os efeitos de mutações e do ambiente celular sobre a glicosila-ção. Em uma modalidade, a manipulação de glicosilação é uma alteração naatividade de glicosiltransferase. Em uma modalidade em particular, a mani-pulação resulta em atividade de glicosaminiltransferase e/ou atividade defucosiltransferase alteradas.

Conforme usado aqui, o termo célula hospedeira cobre qualquertipo de sistema celular o qual pode ser manipulado para gerar os polipeptí-deos e moléculas de ligação a antígeno da presente invenção. Em uma mo-dalidade, a célula hospedeira é manipulada para permitir a produção de umamolécula de ligação a antígeno com glicoformas modificadas. Em uma mo-dalidade preferida, a molécula de ligação a antígeno é um anticorpo, frag-mento de anticorpo ou proteína de fusão. Em determinadas modalidades, ascélulas hospedeiras foram manipuladas para expressar níveis aumentadosde um ou mais polipeptídeos tendo atividade de GnT-lll. Em outras modali-dades, as células hospedeiras foram manipuladas para ter atividade deα1,6-fucosiltransferase central eliminada, reduzida ou inibida. O termo ativi-dade de α1,6-fucosiltransferase central abrange expressão do gene de α1,6-fucosiltransferase central, bem como interação da enzima α1,6-fucosil-transferase central com seu substrato. Células hospedeiras incluem célulascultivadas, por exemplo, células cultivadas de mamífero, tais como célulasCHO, células BHK, células NSO, células SP2/0, células de mieloma YO, cé-lulas de mieloma de camundongo P3X63, células PER, células PER.C6 oucélulas de hibridoma, células de levedo, células de inseto e células de plan-ta, para mencionar umas poucas, mas também células compreendidas den-tro de um animal transgênico, planta transgênica ou tecido de animal ouplanta cultivado.

Conforme usado aqui, o termo região Fc de seqüência nativa serefere a uma seqüência de aminoácido que é idêntica à seqüência de ami-noácido de uma região Fc comumente encontrada na natureza, regiões Fchumanas de seqüência nativa exemplificativas incluem uma região Fc deIgGI humana de seqüência nativa (alótipos não-A e A); região Fc de lgG2humana de seqüência nativa; região Fc de lgG3 humana de seqüência nati-va; e região Fc de lgG4 humana de seqüência nativa, bem como variantesque ocorrem naturalmente das mesmas. Outras seqüências são considera-das e são prontamente obtidas de vários web sites (por exemplo, web site doNCBI).

Os termos receptor Fc e FcR são usados para descrever um re-ceptor que se liga a uma região Fc (por exemplo, a região Fc de um anticor-po ou fragmento de anticorpo) do equivalente funcional de uma região Fc.Porções de receptores Fc são especificamente consideradas em algumasmodalidades da presente invenção. Em modalidades preferidas, o FcR é umFcR humano de seqüência nativa. Em outras modalidades preferidas, o FcRé um o qual se liga a um anticorpo de IgG (um receptor gama) e inclui recep-tores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas eformas alternativamente unidas desses receptores. Receptores FctRII inclu-em FcyRIIa (um "receptor de ativação) e FcyRIIb (um "receptor de inibição"),os quais têm seqüências de aminoácido similares que diferem primariamentequanto aos domínios citoplásmicos dos mesmos. O receptor de ativaçãoFcyRIIa contém um motivo de ativação baseado em tirosina de imunorecep-tor (ITAM) em seu domínio citoplásmico. O receptor de inibição FcyRIIb con-tém um motivo de inibição baseado em tirosina de imunoreceptor (ITIM) emseu domínio citoplásmico. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn,o qual é responsável pela transferência de IgGs maternas para o feto. Umexemplo de um receptor Fc abrangido pela presente invenção é o precursorde receptor Ill-A da região Fc de gama imunoglobulina de baixa afinidade(receptor 111-2 de Fc de IgG) (Fc-gama RHI-alfa) (Fc-gama Rllla) (FcRIIIa)(Fc-gama Rlll) (FcRIII) (Antígeno CD16-A) (FcR-10). [gi: 119876], a seqüên-cia do qual é apresentada abaixo:

RTEDLPKAW FLEPQ WYRVL EKDSVTLKCQ GAYSPEDNSTQWFHNESLIS SQASSYFIDA ATVDDSGEYR CQTNLSTLSD PVQLE-VHIGW LLLQAPRWVF KEEDPIHLRC HSWKNTALHK VTYLQNGKGR KY-FHHNSDFY IPKATLKDSG SYFCRGLFGS KNVSSETVNI TITQGLAVSTISSFFPPGYQ VSFCLVMVLL FAVDTGLYFS VKTNIRSSTR DWKDHKFK-WR KDPQDK

Conforme usado aqui, uma variante polipeptídica com afinidadede ligação ao FcR ou função(ões) efetora(s) alterada é uma a qual tem ativi-dade de ligação a FcR e/ou função efetora intensificada (isto é, aumentada)ou diminuída (isto é, reduzida) comparado com um polipeptídeo precursor ouum polipeptídeo compreendendo uma região Fc de seqüência nativa. Umavariante polipeptídica a qual exibe ligação aumentada a um FcR se liga apelo menos um FcR com melhor afinidade do que o polipeptídeo precursor.Uma variante polipeptídica a qual exibe ligação diminuída a um FcR, se ligapelo menos a um FcR com pior afinidade do que um polipeptídeo precursor.Tais variantes as quais mostram ligação diminuída a um FcR podem possuirpouca ou nenhuma ligação apreciável a um FcR, por exemplo, 0-20% deligação ao FcR comparado com um polipeptídeo precursor. Uma variantepolipeptídica a qual se liga a um FcR com afinidade aumentada comparadocom um polipeptídeo precursor é uma a qual se liga a qualquer um ou maisdos FcRs acima identificados com maior afinidade de ligação do que o anti-corpo precursor, quando as quantidades de variante polipeptídica e polipep-tídeo precursor em um ensaio de ligação são essencialmente as mesmas etodas as outras condições são idênticas. Por exemplo, uma variante polipep-tídica com afinidade de ligação ao FcR aperfeiçoada pode mostrar um aper-feiçoamento (isto é, aumento) de cerca de 1,10 vezes a cerca de 100 vezes(mais tipicamente de cerca de 1,2 vezes a cerca de 50 vezes) na afinidadede ligação ao FcR comparado com o polipeptídeo precursor, onde a afinida-de de ligação ao FcR é determinada, por exemplo, em um ensaio baseadoem FACS ou uma análise por SPR (Biacore).

Conforme usado aqui, uma modificação de aminoácido se referea uma alteração na seqüência de aminoácido de uma determinada seqüên-cia de aminoácido. Modificações exemplificativas incluem, mas não estãolimitadas a, substituição, inserção e/ou deleção de aminoácido. Em modali-dades preferidas, a modificação de aminoácido é uma substituição (por e-xemplo, em uma região Fc de um polipeptídeo precursor). Uma modificaçãode aminoácido em uma posição especificada (por exemplo, na região Fc) serefere à substituição ou deleção do resíduo especificado ou à inserção depelo menos um resíduo de aminoácido adjacente ao resíduo especificado. Ainserção pode ser N-terminal ou C-terminal ao resíduo especificado.

O termo afinidade de ligação se refere à constante de dissocia-ção em equilíbrio (expressa em unidades de concentração) associada comcada interação de ligação Fc-receptor Fe. A afinidade de ligação é direta-mente relacionada à proporção da taxa-off cinética (geralmente reportadaem unidades de tempo invertido, por exemplo, segundos-1) dividido pelataxa-on cinética (geralmente reportada em unidades de concentração portempo unitário, por exemplo, molar/segundo). Em geral, não é possível esta-belecer inequivocamente se alterações nas constantes de dissociação emequilíbrio são em virtude de diferenças nas taxas-on, taxas-off ou ambas, amenos que cada um desses parâmetros seja experimentalmente determina-do (por exemplo, através de medições pelo BIACORE (vejawww.biacore.com) ou SAPIDYNE).

Conforme usado aqui, o termo citotoxicidade celular Fc-mediadainclui citotoxicidade celular anticorpo-dependente e citotoxicidade celularmediada por uma proteína de fusão-Fc solúvel contendo uma região Fc hu-mana. Ela é um mecanismo imune que leva à Iise de "células anticorpo-objetivadas" por "células efetoras imunes humanas", em que:

As células efetoras imunes humanas são uma população de Ieu-cócitos que mostra receptores Fc sobre sua superfície através dos quais e-Ias se ligam à região Fc de anticorpos ou proteínas de fusão-Fc e desempe-nham funções efetoras. Tal população pode incluir, mas não está limitada a,células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e/ou células assassinasnaturais (NK).

As células anticorpo-objetivadas são células ligadas através dasABMs (por exemplo, anticorpos ou proteínas de fusão-Fc) da invenção. Emgeral, os anticorpos ou proteínas de fusão-Fc se ligam às células alvo atra-vés da parte de proteína N-terminal à região Fc.

Conforme usado aqui, o termo citotoxicidade celular Fc-mediadaaumentada é definida como um aumento no número de "células anticorpo-objetivadas" que são submetidas à Iise em um determinado tempo e em umadeterminada concentração de anticorpo ou proteína de fusão-Fc no meioque circunda as células alvo pelo mecanismo de citotoxicidade celular Fc-mediada definido acima e/ou uma redução na concentração de anticorpo ouproteína de fusão-Fc no meio que circunda as células alvo requerida paraobter a Iise de um determinado número de "células anticorpo-objetivadas"em um determinado tempo através do mecanismo de citotoxicidade celularFc-mediada. O aumento na citotoxicidade células Fc-mediada é com relaçãoà citotoxicidade celular mediada pelo menos anticorpo ou proteína de fusão-Fc produzida pelo mesmo tipo de células hospedeiras, usando os mesmosmétodos de produção, purificação, formulação e armazenamento padrão osquais são conhecidos por aqueles versados na técnica, mas o qual não tinhasido produzido por células hospedeiras glicomanipuladas para expressar aglicosiltransferase GnT-III através dos métodos descritos aqui.

Por anticorpo tendo citotoxicidade celular anticorpo-dependente(ADCC) aumentada entenda-se um anticorpo, conforme o termo é definidoaqui, tendo ADCC aumentada, conforme determinado através de qualquermétodo adequado conhecido por aqueles versados na técnica. Um ensaiode ADCC in vitro aceito é como segue:

1) o ensaio usa células alvo que são conhecidas por expres-sar o antígeno alvo reconhecido pela região de ligação aantígeno do anticorpo;

2) o ensaio usa células mononucleares de sangue periféricohumanas (PBMCs) isoladas de sangue de um doador sau-dável aleatoriamente escolhido, como células efetoras;o ensaio é realizado de acordo com o seguinte protocolo:as PBMCs são isoladas usando procedimentos padrão decentrifugação em densidade e são suspensas a 5 χ 106 cé-lulas/ml em meio de cultura de células RPMI;as células alvo são crescidas através de métodos de cultu-ra tecidual padrão, coletadas da fase de crescimento expo-nencial com uma viabilidade maior do que 90%, lavadasem meio de cultura de células RPMI, rotuladas com 100micro-Curies de 51Cr, lavadas duas vezes com meio de cul-tura de células e resuspensas em meio de cultura de célu-las em uma densidade de 105 células/ml;100 μΙ da suspensão de células alvo final acima são trans-feridos para cada cavidade de uma lâmina de microtitula-ção com 96 cavidades;

o anticorpo é serialmente diluído de 4000 ng/ml para 0,04ng/ml em meio de cultura de células e 50 μΙ das soluçõesde anticorpo resultantes são adicionados às células alvo nalâmina de microtitulação com 96 cavidades, testando emtriplicada várias concentrações de anticorpo abrangendotoda a faixa de concentração acima;para controles de liberação máxima (MR), 3 cavidades adi-cionais na lâmina contendo as células alvo rotuladas rece-bem 50 μΙ de uma solução aquosa a 2% (PESO/V) de de-tergente não-iônico (Nonidet, Sigma, St. Louis) ao invés dasolução dè anticorpo (ponto iv acima);para controles de liberação espontânea (SR), 3 cavidadesadicionais na lâmina contendo as células alvo rotuladas re-cebem 50 μΙ de meio de cultura de células RPMI ao invésda solução de anticorpo (ponto iv acima);a lâmina de microtitulação com 96 cavidades é, então, cen-trifugada a 50 χ g durante 1 minuto e incubada durante 1hora a 4°C;

viii) 50 μΙ da suspensão de PBMS (ponto I acima) são adicio-nados a cada cavidade para proporcionar uma proporçãode células efetoras:alvo de 25:1 e as lâminas são coloca-das em uma incubadora sob atmosfera com 5% de CO2 a37°C durante 4 horas;

ix) o sobrenadante isento de células de cada cavidade é cole-tado e a radioatividade experimentalmente liberada (ER) équantificada usando um contador gama;

χ) o percentual de Iise específica é calculado para cada con-centração de anticorpo de acordo com a fórmula (ER-MR)/(MR-SR) χ 100, onde ER é a radioatividade médiaquantificada (veja ponto ix acima) para essa concentraçãode anticorpo, MR é a radioatividade média quantificada (ve-ja ponto ix acima) para os controles de MR (veja ponto νacima) e SR é a radioatividade média quantificada (vejaponto ix acima) para os controles SR (veja ponto vi acima);

4) "ADDC aumentada" é definida como um aumento no per-centual máximo de Iise específica observada dentro da fai-xa de concentração de anticorpo testada acima e/ou umaredução na concentração de anticorpo requerida para obtermetade do percentual máximo de Iise específica observadodentro da faixa de concentração de anticorpo testada aci-ma. O aumento na ADCC é com relação à ADCC medidacom o ensaio acima, mediada pelo menos anticorpo, pro-duzida pelo menos tipo de células hospedeiras, usando osmesmos métodos de produção, purificação, formulação earmazenamento padrão os quais são conhecidos por aque-les versados na técnica, mas que não tinha sido produzidopor células hospedeiras manipuladas para superexpressarGnT-lll.

Regiões de Fc VariantesA presente invenção proporciona polipeptídeos, incluindo molé-culas de ligação a antígeno, tendo regiões Fc modificadas, seqüências deácido nucléico (por exemplo, vetores) que codificam tais polipeptídeos, mé-todos para geração de polipeptídeos tendo regiões Fc modificadas e méto-dos para uso dos mesmos no tratamento de várias doenças e distúrbios. Depreferência, as regiões Fc modificadas da presente invenção diferem da re-gião Fc precursora não modificada em pelo menos uma modificação de ami-noácido. O polipeptídeo "precursor", "de partida" ou "não modificado" com-preende, de preferência, pelo menos uma porção de uma região Fe de anti-corpo e pode ser preparado usando métodos disponíveis na técnica parageração de polipeptídeos compreendendo uma região Fc ou porção damesma. Em modalidades preferidas, o polipeptídeo precursor é um anticor-po. O polipeptídeo precursor pode, contudo, ser qualquer outro polipeptídeocompreendendo pelo menos uma porção de uma região Fc (por exemplo,uma molécula de ligação a antígeno). Em determinadas modalidades, umaregião Fc modificada pode ser gerada (por exemplo, de acordo com o méto-dos descritos aqui) e pode ser fundida a um polipeptídeo heterólogo de es-colha, tal como um domínio variável de anticorpo ou domínio de ligação deum receptor ou Iigante. Em modalidades preferidas, os polipeptídeos da in-venção compreendem um anticorpo inteiro compreendendo cadeias leve epesada tendo uma região Fc modificada.

Em modalidades preferidas, o polipeptídeo precursor compreen-de uma região Fc ou porção funcional da mesma. Geralmente, a região Fcdo polipeptídeo precursor compreenderá uma região Fc de seqüência nativae, de preferência, uma região Fc de seqüência nativa humana. Contudo, aregião Fe do polipeptídeo precursor pode ter uma ou mais alterações ou mo-dificações de seqüência de aminoácido preexistentes de uma região Fc deseqüência nativa. Por exemplo, a atividade de ligação ai C1q da região Fcpode ter sido previamente alterada ou a afinidade de ligação ao FcyR da re-gião Fc pode ter sido alterada. Em outras modalidades, a região Fe do poli-peptídeo precursor é conceituai (por exemplo, imagem mental ou uma repre-sentação visual em um computador ou sobre papel) e, embora não existafisicamente, o manipulador de anticorpo pode decidir sobre uma seqüênciade aminoácido de região Fc modificada desejada e gerar um polipeptídeocompreendendo essa seqüência ou um DNA que codifica a seqüência deaminoácido de região Fc modificada desejada. Contudo, em modalidadespreferidas, um ácido nucléico que codifica uma região Fc de um polipeptídeoprecursor está disponível (por exemplo, comercialmente) e essa seqüênciade ácido nucléico é alterada para gerar uma seqüência de ácido nucléicovariante que codifica a região Fc modificada.

Polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo compreendendouma região Fc modificada podem ser preparados através de métodos co-nhecidos na técnica usando a orientação da presente especificação paraseqüências particulares. Esses métodos incluem, mas não estão limitados a,preparo através de mutagênese sítio-dirigida (ou oligonucleotídeo-mediada),mutagênese por PCR e mutagênese em cassete de um ácido nucléico pre-parado anteriormente que codifica o polipeptídeo. Mutagênese sítio-dirigidaé um método preferido para preparo de variantes com substituição. Essemétodo é bem-conhecido na técnica (veja, por exemplo, Carter e outros, Nu-cleíc Acids Res. 13: 4431-4443 (1985) e Kunkel e outros, Proc. Natl. Acad.Sei. USA 82: 488 (1987), ambos os quais são aqui incorporados por referên-cia). Resumidamente, ao realizar mutagênese sítio-dirigida de DNA, o DNAde iniciação é alterado primeiro através de hibridização a um oligonucleotí-deo que codifica a mutação desejada em um filamento simples de tal DNAde iniciação. Após hibridização, uma DNA polimerase é usada para sintetizarum segundo filamento inteiro, usando o oligonucleotídeo hibridizado comoum iniciador e usando o filamento simples do DNA de iniciação como ummolde. Assim, o oligonucleotídeo que codifica a mutação desejada é incor-porado no DNA de filamento duplo resultante.

Mutagênese por PCR também é adequada para fabricação devariantes de seqüência de aminoácido do polipeptídeo de iniciação não mo-dificado (veja, por exemplo, Vallette e outros, Nuc. Acids Res. 17: 723-733(1989), aqui incorporado por referência). Resumidamente, quando pequenasquantidades de molde de DNA são usadas como material de partida em umaPCR, iniciadores que diferem ligeiramente quanto à seqüência da região cor-respondente em um molde de DNA podem ser usados para gerar quantida-des relativamente grandes de um fragmento de DNA específico que difereda seqüência molde apenas nas posições onde os iniciadores diferem domolde.

Outro método para preparo de variantes, mutagênese em casse-te, é baseado na técnica descrita por Wells e outros, Gene 34: 315-323(1985), aqui incorporado por referência. O material de partida é o plasmídeo(ou outro vetor) compreendendo o DNA de polipeptídeo de iniciação a sermodificado. O(s) códon(s) no DNA de iniciação a sofrer(em) mutação é(são)identificado. Se tais sítios de restrição não existem, eles podem ser geradosusando o método de mutagênese oligonucleotídeo-mediado acima descritopara introduzir os mesmos em locais apropriados no DNA do polipeptídeo deiniciação. O DNA de plasmídeo é cortado nesses sítios para linearizá-lo. Umoligonucleotídeo o filamento duplo que codifica a seqüência do DNA entre ossítios de restrição, mas contendo a(s) mutação(ões) desejada(s) é sintetiza-do usando procedimentos padrão, em que os dois filamentos do oligonucleo-tídeo são sintetizados e, então, hibridizados juntos usando técnicas padrão.Esse oligonucleotídeo de filamento duplo é referido como o cassete. Essecassete é projetado para ser diretamente ligado ao plasmídeo. Esse plasmí-deo agora contém a seqüência de DNA com mutação.

Alternativa ou adicionalmente, a seqüência de aminoácido dese-jada que codifica uma variante polipeptídica pode ser determinada e umaseqüência de ácido nucléico que codifica tal variante de seqüência de ami-noácido pode ser gerada sinteticamente.

A seqüência de aminoácido do polipeptídeo precursor pode sermodificada de forma a gerar uma região Fc variante com afinidade ou ativi-dade de ligação ao receptor Fc alterada in vitro e/ou in vivo e/ou uma oumais funções efetoras alteradas, tal como atividade de citotoxicidade célula-mediada anticorpo-dependente (ADCC), in vitro e/ou in vivo. A seqüência deaminoácido do polipeptídeo precursor pode também ser modificada de formaa gerar uma região Fc modificada com propriedades de ligação a comple-mento e/ou meia-vida em circulação alterada.

Modificações substanciais nas propriedades biológicas da regiãoFc podem ser realizadas através de seleção de substituições que diferemsignificativamente quanto a seu efeito sobre manutenção (a) da estruturaprincipal da parte principal do polipeptídeo na área da substituição, por e-xemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal, (b) a carga ou hidro-fobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) o grosso da cadeia lateral. Resí-duos que ocorrem naturalmente são divididos em classes baseado em pro-priedades em comum da cadeia lateral:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: gly, pro; e

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Substituições não conservativas requerem troca de um membrode uma dessas classes por um membro de outra classe. Substituições con-servativas requererão troca de um membro de uma dessas classes por outromembro da mesma classe.

Pode-se manipular uma região Fc para produzir uma variantecom afinidade de ligação alterada por um ou mais FcRs. Por exemplo, pode-se modificar um ou mais resíduos ácidos da região Fc de forma a alterar (porexemplo, aumentar ou diminuir) a ligação a um FcR. Em modalidades prefe-ridas, a modificação compreende um ou mais resíduos da região Fc identifi-cados aqui (veja, por exemplo, Tabela 2). Geralmente, se fará uma substitui-ção de aminoácido em um ou mais dos resíduos da região Fc identificadosaqui como afetando a ligação do FcR de forma a gerar tal variante de regiãoFe. Em modalidades preferidas, não mais do que cerca de dez resíduos daregião Fc serão deletados ou substituídos. As regiões Fc aqui compreen-dendo uma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, substitui-ções) reterão, de preferência, pelo menos cerca de 80% e, de preferência,pelo menos cerca de 90% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%da seqüência da região Fc precursora ou de uma região Fc humana de se-qüência nativa.

Pode-se também fazer regiões Fc modificadas através de inser-ção de aminoácido, variantes as quais têm função efetora alterada. Por e-xemplo, pode-se introduzir pelo menos um resíduo de aminoácido (por e-xemplo, um a dois resíduos de aminoácido e, geralmente, não mais do quedez resíduos) adjacentes a uma ou mais das posições de região Fc identifi-cadas aqui como conferindo ligação ao FcR. Por adjacente entenda-se den-tro de um a dois resíduos de aminoácido de um resíduo de região Fc identifi-cado aqui. Tais variantes de região Fc podem mostrar ligação pelo FcR e/oufunção efetora intensificada ou diminuída. De forma a gerar tais variantescom inserção, pode-se avaliar uma estrutura principal de co-cristal de umpolipeptídeo compreendendo uma região de ligação de um FcR (por exem-plo, o domínio extracelular do FcR de interesse) e a região Fc na qual o(s)resíduo(s) de aminoácido tem(têm) de ser inserido(s) (veja, por exemplo,Sondermann e outros. Nature 406: 261 (2000); Deisenhofer, Biochemistry 20(9): 2361-2370 (1981); e Burmeister e outros, Nature 3442: 379-383, (1994),todos os quais são aqui incorporados por referência) de forma a projetar ra-cionalmente uma região Fe modificada que exibe, por exemplo, capacidadeaperfeiçoada de ligação ao FcR.

Através de introdução das modificações de seqüência de amino-ácido apropriadas em uma região Fc precursora, pode-se gerar uma regiãoFc variante a qual (a) media uma ou mais funções efetoras na presença decélulas efetoras humanas mais ou menos eficazmente e/ou (b) se liga a umreceptor Fc γ (FeyR) ou receptor neonatal Fc (FcRn) com melhor afinidadedo que o polipeptídeo precursor. Tais regiões Fc modificadas geralmentecompreenderão pelo menos uma modificação de aminoácido na região Fe.

Em modalidades preferidas, a região Fc do polipeptídeo precur-sor é uma região Fc humana, por exemplo, uma região Fc de IgGI (alótiposA e não-A), lgG2, lgG3 ou lgG4 humana nativa, incluindo todos os alótiposconhecidos ou descobertos. Tais regiões têm seqüências tais como aquelasmostradas em SEQ ID NOs: 1-2.Em determinadas modalidades, a região Fc de polipeptídeo pre-cursor é uma região Fc não-humana. Regiões Fc não-humanas incluem re-giões Fc derivadas de espécies não-humanas tais como, mas não limitado a,eqüinos, suínos, bovinos, murinos, caninos, felinos, primatas não-humanos eaves, por exemplo, uma região Fc de IgG não-humana nativa, incluindo to-das as subclasses e alótipos conhecidos ou descobertos.

Em determinadas modalidades, de forma a gerar uma região Fcmodificada com função efetora aperfeiçoada (por exemplo, ADCC), o poli-peptídeo precursor tem, de preferência, atividade de ADCC pré-existente(por exemplo, o polipeptídeo precursor compreende uma região Fc de IgGIhumana ou lgG3 humana). Em algumas modalidades, uma região Fc modifi-cada com ADCC aperfeiçoada media ADCC substancialmente mais eficaz-mente do que um anticorpo com uma região Fc de IgGI ou lgG3 de seqüên-cia nativa.

Em modalidades preferidas, uma ou mais modificações de ami-noácido são introduzidas no domínio CH2 da região Fc precursora de formaa gerar uma região Fc de IgG modificada com afinidade ou atividade de liga-ção alterada pelo receptor Fc γ (FcyR).

Em determinadas modalidades, a uma ou mais modificações deaminoácido introduzidas no domínio CH2 da região Fc precursora ocorrenaquelas posições indicadas na Tabela 2.

Tabela 2

<table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table>

Em determinadas modalidades, a üma ou mais modificações deaminoácido introduzidas no domínio CH2 da região Fc precursora compre-ende substituição do resíduo existente por um resíduo selecionado do grupoconsistindo em: Trp, His1 Tyr, Glu1 Arg, Asp1 Phe, Asn e Gln.Em determinadas modalidades, mais de uma modificação deaminoácido é introduzida no domínio CH2 da região Fc precursora de formaa gerar uma região Fc de IgG modificada com afinidade ou atividade de liga-ção alterada pelo FcyR através de combinação de qualquer uma das modifi-cações individuais conforme listado na Tabela 2, de modo que uma modifi-cação em uma posição possa ser combinada com uma ou mais modifica-ções adicionais localizadas em diferentes posições para produzir duas oumais modificações da região Fc precursora.

Em modalidades preferidas, não mais do que cerca de dez resí-duos da região Fc serão modificados. As regiões Fc aqui compreendendouma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, substituições) rete-rão, de preferência, pelo menos cerca de 80% e, de preferência, pelo menoscerca de 90% e, mais preferivelmente, pelo menos cerca de 95% da se-qüência da região Fc precursora ou de uma região Fc humana de seqüêncianativa.

Em determinadas modalidades, uma ou mais modificações deaminoácido introduzidas no domínio CH2 da região Fc precursora resulta emligação significativamente reduzida da região Fc modificada ao FcyRIlIa, porexemplo, aquelas modificações listadas na Tabela 3.

Tabela 3

<table>table see original document page 41</column></row><table><table>table see original document page 42</column></row><table>

Em uma modalidade preferida, a uma ou mais modificações deaminoácido introduzidas no domínio CH2 da região Fc precursora resulta emuma região Fc de IgG modificada com afinidade apenas ligeiramente reduzi-da, inalterada ou aumentada pelo FcyRIIIa, por exemplo, aquelas modifica-ções listadas na Tabela 4.

Tabela 4

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Em determinadas modalidades, mais de uma modificação deaminoácido é introduzida no domínio CH2 da região Fc precursora de formaa gerar uma região Fc de IgG modificada com afinidade ou atividade de Iiga-ção ao FcyR alterada através de combinação de qualquer uma das modifica-ções individuais conforme listado na Tabela 4, de modo que tal modificaçãoem uma posição pode ser combinada com uma ou mais modificações adi-cionais localizadas em diferentes posições para produzir qualquer uma dasduas ou mais, três ou mais ou quatro ou mais modificações da região Fcprecursora listadas na Tabela 5.

Tabela 5

<table>table see original document page 42</column></row><table><table>table see original document page 43</column></row><table>

Em uma modalidade preferida, mais de uma modificação de a-minoácido introduzida no domínio CH2 da região Fc precursora envolvequalquer combinação com Thr260His, conforme listado na Tabela 5.

Os polipeptídeos da invenção tendo regiões Fc modificadas po-dem ser submetidos a uma ou mais de outras modificações, dependendo douso desejado ou pretendido do polipeptídeo. Tais modificações podem en-volver, por exemplo, alteração adicional da seqüência de aminoácido (substi-tuição, inserção e/ou deleção de resíduos de aminoácido), fusão a polipeptí-deo(s) heterólogo(s) e/ou modificações covalentes. Essas outras modifica-ções podem ser feitas antes de, simultaneamente com ou após a(s) modifi-cação(ões) de aminoácido descrita(s) acima, a(s) qual(is) resulta(m) em umaalteração da ligação e/ou função efetora do receptor Fc.

Alternativa ou adicionalmente, pode ser útil combinar modifica-ções de aminoácido com uma ou mais de outras modificações de aminoáci-do que alteração a ligação a C1q e/ou função de citotoxicidade complemen-to-dependente da região Fe. O polipeptídeo de iniciação de interesse particu-lar a esse respeito é um que se liga ao C1q e mostra citotoxicidade comple-mento-dependente (CDC). Substituições de aminoácido descritas aqui po-dem servir para alterar a capacidade do polipeptídeo de iniciação de se ligarao C1q e/ou modificar sua função de citotoxicidade complemento-dependente (por exemplo, para reduzir e, de preferência, eliminar essas fun-ções efetoras). Contudo, polipeptídeos compreendendo substituições emuma ou mais das posições descritas com ligação ao C1q e/ou função de ci-totoxicidade complemento-dependente (CDC) aperfeiçoada são considera-dos aqui. Por exemplo, o polipeptídeo de iniciação pode ser incapaz de seligar ao C1q e/ou mediar CDC e pode ser modificado de acordo com os en-sinamentos aqui, de modo que ele adquire essas outras funções efetoras.Além disso, polipeptídeos com atividade de ligação a C1q pré-existente, op-cionalmente ainda tendo a capacidade de mediar CDC, podem ser modifica-dos de modo que uma ou mais dessas atividades sejam intensificadas. Mo-dificações de aminoácido que alteram C1q e/ou modificam sua função decitotoxicidade complemento-dependente são descritos, por exemplo, noWO00/42072, o qual é aqui incorporado por referência.

Conforme descrito acima, pode-se projetar uma região Fc ouporção da mesma com função efetora alterada, por exemplo, através de mo-dificação da ligação a C1q e/ou ligação a FcR e, desse modo, alterando aatividade de CDC e/ou atividade de ADCC. Por exemplo, pode-se gerar umaregião Fc modificada com ligação aperfeiçoada a C1q e ligação aperfeiçoadaao FcyRI11 (por exemplo, tendo atividade de ADCC aperfeiçoada e atividadede CDC aperfeiçoada). Alternativamente, onde se deseja que a função efeto-ra seja reduzida ou eliminada, pode-se manipular uma região Fc modificadacom atividade de CDC reduzida e/ou atividade de ADCC reduzida. Em ou-tras modalidades, pode-se aumentar apenas uma dessas atividades e, op-cionalmente, também, reduzir a outra atividade, por exemplo, gerar uma re-gião Fc modificada com atividade de ADCC aperfeiçoada, mas atividade deCDC reduzida e vice versa.

Outro tipo de substituição de aminoácido serve para alterar opadrão de glicosilação do polipeptídeo. Isso pode ser obtido, por exemplo,através de deleção de uma ou mais porções de carboidrato encontradas nopolipeptídeo e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estãopresentes no polipeptídeo. Glicosilação de polipeptídeos é, tipicamente, N-Iigada ou O-ligada. N-Iigada se refere à fixação da porção de carboidrato àcadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de peptídeo as-paragina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácidoexceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para fixação enzimáti-ca da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a pre-sença de qualquer um dessas seqüências peptídicas em um polipeptídeocria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-Iigada se refere à fixa-ção de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a umácido hidróxilisina, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidro-xiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser usadas.

Em algumas modalidades, a presente invenção proporcionacomposições compreendendo uma modificação de um polipeptídeo precur-sor tendo uma região Fc, em que a região Fc modificada compreende pelomenos uma modificação de resíduo de aminoácido na superfície (veja, porexemplo, Deisenhofer, Biochemistry 20(9): 2361-70 (1981), e W000/42072,ambos os quais são aqui incorporados por referência). Em outras modalida-des, a presente invenção proporciona composições compreendendo umamodificação de um polipeptídeo precursor tendo uma região Fc1 em que aregião Fc modificada compreende pelo menos uma modificação de resíduode aminoácido não na superfície. Em outras modalidades, a presente inven-ção compreende uma variante de um polipeptídeo precursor tendo uma re-gião Fc, em que a variante compreende pelo menos uma modificação deaminoácido na superfície e pelo menos uma modificação de aminoácido nãona superfície.

Ensaios para Polipeptídeos Tendo Regiões Fc Modificadas

A presente invenção ainda proporciona vários ensaios para se-leção de polipeptídeos da presente invenção tendo regiões Fc modificadas.Ensaios de seleção podem ser usados para descobrir ou confirmar regiõesFc modificadas úteis. Por exemplo, polipeptídeos com regiões Fc modifica-das podem ser selecionados para descobrir variantes com ligação ao FcR oufunção(ões) efetora(s) aumentadas, tais como atividade de ADCC ou CDC(por exemplo, atividade aumentada ou diminuída de ADCC ou CDC). Tam-bém, polipeptídeos modificados com modificações de aminoácido em resí-duos não na superfície também podem ser selecionados (por exemplo, umaregião Fc modificada com pelo menos uma modificação de aminoácido nasuperfície e uma modificação de aminoácido não na superfície pode ser se-lecionada). Também, conforme descrito abaixo, os ensaios da presente in-venção podem ser empregados para descobrir ou confirmar regiões Fc mo-dificadas que têm atividade terapêutica benéfica em um indivíduo (por e-xemplo, tal como um ser humano com sintomas de uma doença responsivaa anticorpo ou imunoadesina). Uma variedade de tipos de ensaios pode serempregada para avaliar qualquer alteração em um polipeptídeo tendo umaregião Fc modificada comparado com o polipeptídeo precursor (veja ensaiosde seleção fornecidos no W000/42072, aqui incorporado por referência).Outros ensaios exemplificativos são descritos abaixo.

Em modalidades preferidas, os polipeptídeos tendo regiões Fcmodificadas da presente invenção são moléculas de ligação a antígeno queretêm essencialmente a capacidade de ligação a antígeno (através de umaregião de ligação a antígeno não modificada ou região de ligação a antígenomodificada) comparado com o polipeptídeo não variante (precursor) (por e-xemplo, a capacidade de ligação é, de preferência, não pior do que cerca de20 vezes ou não pior do que cerca de 5 vezes aquela do polipeptídeo nãovariante). A capacidade de ligação da variante polipeptídica ao antígeno po-de ser determinada usando técnicas tais como análise por seleção de célu-las fluorescência-ativada (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA), por e-xemplo. Para informação mais detalhada a respeito do evento de ligação,uma análise de interação biológica pode ser realizada usando SPR.

Ensaios de ligação ao receptor Fc (FcR) podem ser empregadospara avaliar os polipeptídeos com regiões Fc modificadas da presente inven-ção. Por exemplo, ligação de receptores Fc, tais como FcyRI, FcyRIIa,FcTRIlb, FcyRIII, FcRn, etc., pode ser medida através de titulação do poli-peptídeo modificado e medição da variante polipeptídica modificada ligadausando um anticorpo o qual se liga especificamente à variante polipeptídicaem um formato ELISA padrão. Por exemplo, uma molécula de ligação a an-tígeno compreendendo uma região Fc modificada da presente invenção po-de ser selecionada em um ensaio ELISA padrão para determinar a ligação aum FcR. Uma superfície sólida pode ser revestida com um antígeno. Antíge-no em excesso pode ser lavado e a superfície bloqueada. O polipeptídeomodificado (anticorpo) é específico para esse antígeno e, portanto, se liga àsuperfície antígeno-revestida. Então, um FcR conjugado a um rótulo (porexemplo, biotina) pode ser adicionado e a superfície lavada. Na etapa se-guinte, uma molécula específica para o rótulo sobre o FcR é adicionada (porexemplo, avidina conjugada a uma enzima). Após o que, um substrato podeser adicionado de forma a determinar a quantidade de ligação do FcR aopolipeptídeo com a região Fc modificada. Os resultados desse ensaio podemser comparados com a capacidade do polipeptídeo precursor que carece damodificação de se ligar ao mesmo FcR. Em modalidades preferidas, o FcR éselecionado de FcyRIIA, FcyRIIB e FcyRIIIA para IgG, uma vez que essesreceptores (por exemplo, recombinantemente expressos) podem ser empre-gados com sucesso para selecionar as regiões Fc modificadas da presenteinvenção. Na verdade, tais ensaios de ligação com esses receptores preferi-dos permitem, inesperadamente, a identificação de regiões Fc modificadasúteis. É inesperado que polipeptídeos modificados úteis (por exemplo, commaior ligação ao FcR ou função(ões) efetora(s), tal como ADCC ou CDC)sejam identificados de tal modo. Em outras modalidades, os componentespara realização de um ELISA (por exemplo, com FcyRIIA, FcyRIIB e FcyRIIIApara IgG) para selecionar variantes são embalados em um kit (por exemplo,com instruções para uso).

Células efetoras úteis para tais ensaios incluem, mas não estãolimitadas a, células assassinas naturais (NK), macrófagos e outras célulasmononucleares de sangue periférico (PBMC). Alternativa ou adicionalmente,atividade de ADCC dos polipeptídeos tendo regiões Fc modificadas da pre-sente invenção pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo ani-mal, tal como aquele descrito em Clynes e outros. PNAS (USA) 95: 652-656(1998), aqui incorporado por referência.

A capacidade dos polipeptídeos modificados de se ligar ao C1qe mediar a citotoxicidade complemento-dependente (CDC) pode ser avalia-da. Por exemplo, para determinar a ligação ao C1q, um ELISA de ligação aC1q pode ser realizado. Um ensaio de ligação a C1q exemplificativo é comosegue. Lâminas de ensaio podem ser revestidas durante a noite a 4°C compolipeptídeo modificado da invenção ou polipeptídeo precursor (controle) emtampão de revestimento. As lâminas podem, então, ser lavadas e bloquea-das. Após lavagem, uma alíquota de C1q humano pode ser adicionada acada cavidade e incubada durante 2 horas em temperatura ambiente. Apósuma outra lavagem, 100 μΙ de um anticorpo peroxidase-conjugado anticom-plemento C1q de ovelha pode ser adicionado a cada cavidade e incubadodurante 1 hora em temperatura ambiente. A lâmina pode ser novamente la-vada com tampão de lavagem e 100 μΙ de tampão de substrato contendoOPD (dicloridrato de O-fenilenodiamina (Sigma)) podem ser adicionados acada cavidade. A reação de oxidação, observada pelo aparecimento de umacor amarela, pode ser deixada processar durante um tempo otimizado (2-60minutos) e cessada através da adição de 100 μΙ de H2SO4 a 4,5N. A absor-bância pode, então, ser lida a 405 nm subtraída desse valor.As regiões Fc modificadas da presente invenção também podemser selecionadas com relação à ativação de complemento. Para avaliar aativação de complemento, um ensaio de citotoxicidade complemento-dependente (CDC) pode ser realizado (veja, por exemplo, Gazzano-Santoroe outros, J. Immunol. Methods, 202: 163 (1996), aqui incorporado por refe-rência). Por exemplo, várias concentrações do polipeptídeo modificado dainvenção e complemento humano podem ser diluídas com tampão. Célulasas quais expressam o antígeno ao qual a variante polipeptídica se liga po-dem ser diluídas para uma densidade de 1 χ 106 células/ml. Misturas de va-riante polipeptídica, complemento humano diluído e células expressando oantígeno podem ser adicionadas a uma lâmina com 96 cavidades de culturatecidual de fundo plano e deixadas incubar durante 2 horas a 37°Ce 5% deCO2 para facilitar a Iise de células complemento-mediada. 50 μΙ de azul ala-mar (Accumed International) podem ser, então, adicionados a cada cavidadee incubados durante a noite a 37°C. A absorbância pode ser medida usandoum fluorímetro com 96 cavidades com excitação a 530 nm e emissão a 590nm. Os resultados podem ser expressos em unidades de fluorescência rela-tiva (RFU). As concentrações de amostra podem ser computadas a partir deuma curva padrão e a atividade percentual, quando comparado com o poli-peptídeo não variante, pode ser reportada para a variante polipeptídica deinteresse.

Em modalidades preferidas, o polipeptídeo modificado tem umamaior afinidade de ligação pelo C1q humano do que o polipeptídeo precur-sor. Tal variante pode mostrar, por exemplo, cerca de duas vezes ou mais e,de preferência, cerca de cinco vezes ou mais aperfeiçoamento na ligação aC1q humano comparado com o polipeptídeo precursor (por exemplo, emvalores de IC50 para essas duas moléculas). Por exemplo, a ligação a C1qhumano pode ser cerca de duas vezes a cerca de 500 vezes e, de preferên-cia, de cerca de duas vezes ou de cerca de cinco vezes a cerca de 1000vezes aperfeiçoada comparado com o polipeptídeo precursor.

Em outras modalidades preferidas, descobriu-se que as varian-tes exibem redução de 2 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes ou 1000 ve-zes na ligação a C1q comparado com um anticorpo de controle (precursor)tendo uma região Fc de IgGI não modificada. Em modalidades ainda maispreferidas, o polipeptídeo com região Fc modificada não se liga a C1q (porexemplo, 10 μg/ml do polipeptídeo modificado mostram cerca de 100 vezesou mais redução na ligação a C1q comparado com 10 μg/ml do anticorpo decontrole).

Em determinadas modalidades, os polipeptídeos modificados dapresente invenção não ativam o complemento. Por exemplo, o polipeptídeomodificado mostra atividade de CDC de cerca de 0-10% nesse ensaio com-parado com um anticorpo de controle tendo uma região Fc de IgGI não mo-dificada. De preferência, a variante não parece ter qualquer atividade deCDC (por exemplo, base acima) no ensaio de CDC acima. Em outras moda-lidades, descobriu-se que os polipeptídeos modificados da presente inven-ção têm CDC intensificada comparado com o polipeptídeo precursor [porexemplo, mostrando um aperfeiçoamento de cerca de duas vezes a cerca de100 vezes (ou maior) na atividade de CDC in vitro ou in vivo quando os valo-res de IC50 são comparados].

Os polipeptídeos tendo regiões Fc modificadas da presente in-venção também podem ser selecionados in vivo. Qualquer tipo de ensaio invivo pode ser empregado. Um exemplo particular de um tipo de ensaio éfornecido abaixo. Esse ensaio exemplificativo permite a avaliação pré-clínicade regiões Fc modificadas in vivo. Um polipeptídeo modificado a ser testadopode ser incorporado na região Fc de um anticorpo em particular conhecidopor ter alguma atividade. Por exemplo, uma modificação pode ser incorpora-da na região Fc de uma IgG anti-CD20 através de mutagênese. Isso permiteque uma IgG precursora e IgG variante de Fc sejam comparadas diretamen-te com o RITUXAN (conhecido por promover regressão de tumor). A avalia-ção pré-clínica pode ser feita em 2 fases (uma fase farmacocinética e umafarmacodinâmica). O objetivo dos estudos de farmacocinética de Fase I édeterminar se existem diferenças na taxa de eliminação entre uma IgG vari-ante de Fc e o anticorpo com atividade in vivo conhecida (por exemplo, RI-TUXAN). Diferenças na taxa de eliminação podem causar diferenças no ní-vel em estado uniforme de IgG no soro. Como tal, se diferenças em concen-trações em estado uniforme são detectadas, essas deverão ser normaliza-das para permitir que comparações precisas sejam feitas. O objetivo dosestudos de farmacodinâmica de Fase Il é determinar o efeito das mutaçõesde Fc sobre, nesse caso, o crescimento do tumor. Estudos anteriores comRITUXAN usaram uma única dose a qual inibiu completamente o crescimen-to de tumor. Em virtude do fato de isso não permitir que diferenças quantita-tivas sejam medidas, uma faixa de dose deveria ser empregada.

Comparação farmacocinética de Fase I de um polipeptídeo ten-do uma região Fc modificada da presente invenção, a Fc precursora nãomodificada (por exemplo, do tipo silvestre) e RITUXAN pode ser realizada daseguinte maneira. Primeiro, 40 μ^ por animal podem ser injetados intraveno-samente e o nível no plasma da IgG quantificado a 0, 0,25, 0,5, 1, 24, 48,168 e 336 horas. Os dados podem ser adaptados, por exemplo, usando umprograma de farmacocinética (WinNonLin) usando um modelo farmacociné-tico com dois compartimentos de retardo zero para obter a taxa de elimina-ção. A taxa de eliminação pode ser usada para definir o nível em estado uni-forme no plasma com a seguinte equação: C = Dose/(Taxa de eliminação χΤ), onde T é o intervalo entre as doses e C é o nível no plasma em estadouniforme. Experimentos de farmacocinética podem ser realizados em ca-mundongos que não trazem tumor, por exemplo, com um mínimo de 5 ca-mundongos por ponto de tempo.

Um modelo animal pode ser empregado para a próxima fase daseguinte maneira. O flanco direito de camundongos CB 17-SCID pode serimplantado com células 106 Raji subcutaneamente. Bolus intravenoso dopolipeptídeo com região Fc modificada, o polipeptídeo com a Fc precursora(por exemplo, tipo silvestre) e RITUXAN pode ser iniciado imediatamenteapós implante e continuado até que o tamanho do tumor seja maior do que 2cm de diâmetro. O volume do tumor pode ser determinado a cada Segunda,Quarta e Sexta medindo-se o comprimento, largura e profundidade do tumorusando um calibrador (volume do tumor = WxLxD). Uma plotagem do vo-lume do tumor versus o tempo proporcionará a taxa de crescimento do tumorpara o cálculo farmacodinâmico. Um mínimo de cerca de 10 animais porgrupo deverá ser usado.

Comparação farmacodinâmica de Fase Il do polipeptídeo comregião Fc modificada da invenção, a Fc precursora (por exemplo, tipo silves-tre) e RITUXAN pode ser realizada da seguinte maneira. Baseado em dadospublicados, RITUXAN a 10 μg/g semanalmente inibiu completamente ocrescimento de tumor in vivo (Dynes e outros, Nat. Med. Abril de 2000; 6(4):443-6,-2000,-aqui incorporado por- referência).- Portanto, uma-faixa de dosesemanal de 10 μg/g, 5 μg/g, 1 μg/g, 0,5 μg/g, e 0 μρ^ pode ser testada. Onível no plasma em estado uniforme no qual a taxa de crescimento do tumoré inibida em 50% pode ser graficamente determinado através da relaçãoentre o nível no plasma em estado uniforme e a eficácia. O nível no plasmaem estado uniforme pode ser calculado conforme descrito acima. Se neces-sário, T pode ser ajustado conseqüentemente para cada polipeptídeo comregião Fc modificada e a Fc do tipo silvestre, dependendo de suas proprie-dades farmacocinéticas, para obter um nível no plasma em estado uniformecomparável ao RITUXAN. Valores farmacodinâmicos estatísticos aperfeiço-ados do polipeptídeo modificado em comparação com o polipeptídeo precur-sor (por exemplo, Fc do tipo silvestre) e RITUXAN geralmente indicarão queo polipeptídeo modificado confere atividade aperfeiçoada in vivo.

Em outras modalidades, as regiões Fc modificadas da presenteinvenção são selecionadas de modo que variantes que são úteis para usoterapêutico em pelo menos duas espécies sejam identificadas. Tais varian-tes são referidas aqui como "variantes aperfeiçoadas para duas espécies" esão particularmente úteis para identificação de variantes que são terapêuti-cas em seres humanos e também demonstram (ou é provável que demons-trem) eficácia em um modelo animal. A esse respeito, a presente invençãoproporciona métodos de identificação de variantes que têm uma forte chancede serem aprovadas para testagem clínica humana, uma vez que dados commodelo animal provavelmente sustentarão quaisquer aplicações de testa-gem humana feitas por agências regulatórias governamentais (por exemplo,U.S. Food e Drug Administration).Em determinadas modalidades, polipeptídeos modificados aper-feiçoados para duas espécies são identificados primeiro realizando-se umensaio de ADCC usando células efetoras humanas; para descobrir polipeptí-deos modificados aperfeiçoados e, então, realizando-se um segundo ensaiode ADCC usando células efetoras de camundongo, rato ou primata não-humano para identificar um subconjunto dos polipeptídeos modificados aper-feiçoados que são polipeptídeos modificados aperfeiçoados para duas espé-cies. Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona métodospara identificação de polipeptídeos modificados aperfeiçoados para duasespécies compreendendo: a) fornecimento de: i) células alvo, ii) uma com-posição compreendendo um polipeptídeo modificado candidato de um poli-peptídeo precursor tendo pelo menos uma porção de uma região Fc, em queo polipeptídeo modificado candidato compreende pelo menos uma modifica-ção de aminoácido na região Fc e em que o polipeptídeo modificado candi-dato media citotoxicidade de célula alvo na presença de uma primeira espé-cie (por exemplo, ser humano) de células efetoras mais eficazmente do queo polipeptídeo precursor e iii) uma segunda espécie (por exemplo, camun-dongo, rato ou primata não-humano) e b) incubação da composição com ascélulas alvo sob condições de modo que o polipeptídeo modificado candida-to se liga às células alvo, desse modo, gerando células alvo ligadas ao poli-peptídeo modificado candidato, c) mistura das células efetoras da segundaespécie com as células alvo ligadas ao polipeptídeo candidato modificado ed) medição da citotoxicidade de células alvo mediada pelo polipeptídeo mo-dificado candidato. Em determinadas modalidades, o método ainda compre-ende a etapa de e) determinação se o polipeptídeo modificado candidatomedia a citotoxicidade de células alvo na presença de células efetoras dasegunda espécie mais eficazmente do que o polipeptídeo precursor. Em al-gumas modalidades, o método ainda compreende a etapa de f) identificaçãode um polipeptídeo modificado candidato como um polipeptídeo modificadoaperfeiçoado para duas espécies que media citotoxicidade de célula alvo napresença de células efetoras de uma segunda espécie mais eficazmente doque o polipeptídeo precursor. Em modalidades preferidas, os polipeptídeosmodificados para duas espécies identificados são, então, selecionados invivo em ou mais ensaios com animais.

Em determinadas modalidades, polipeptídeos modificados aper-feiçoados para duas espécies são identificados realizando-se qualquer umdos ensaios acima usando componentes humanos (por exemplo, célulashumanas, receptores Fc humanos, etc.) para identificar polipeptídeos aper-feiçoados tendo regiões Fc modificadas e, então, realizando-se o mesmonsaio-(o.u- um ensaio diferente), com componentes animais não-humanos(por exemplo, células de camundongo, receptores Fc de camundongo, etc.).

A esse respeito, um subconjunto de polipeptídeos modificados que tem umbom desempenho de acordo com critérios fornecidos em ensaios baseadosem seres humanos e ensaios baseados em uma segunda espécie pode seridentificado.

Um processo exemplificativo para identificação de polipeptídeosaperfeiçoados para duas espécies tendo regiões Fc modificadas da invençãoé como segue. Primeiro, uma seqüência de ácido nucléico que codifica pelomenos uma porção de uma região Fc de IgG é modificada de modo que aseqüência de aminoácido expressa tenha pelo menos uma alteração de a-minoácido, desse modo, gerando uma região Fc modificada. Essa variantede IgG expressa é, então, capturada via o antígeno sobre uma lâmina deensaio. Em seguida, a variante capturada é selecionada com relação à liga-ção ao FcyRIII humano solúvel usando ELISA. Se a variante demonstra liga-ção aperfeiçoada ou comparável ao FcyRIII (comparado com uma região Fcprecursora sem mutação), então, a variante é selecionada para ligação aoFcyRI11 humano usando ELISA. A proporção de especificidade relativa paraa variante pode ser, então, calculada. Em seguida, um ensaio de ADCC érealizado com a variante usando PBMCs humanas ou um subconjunto (célu-las NK ou macrófagos, por exemplo). Se atividade intensificada de ADCC éencontrada, então, a variante é selecionada em um segundo ensaio deADCC usando PBMCs de rato ou camundongo. Alternativamente ou alémdisso, um ensaio pode ser realizado com a variante com relação à ligação areceptores ou linhagens de células de roedor clonadas. Finalmente, caso severifique que a variante é aperfeiçoada no segundo ensaio, tornando-a umavariante duplamente aperfeiçoada, então, a variante é selecionada in vivoem camundongos ou ratos.

Polipeptídeos Exemplificativos Compreendendo as Regiões Fc Modificadasda Invenção

As regiões Fc variantes da presente invenção podem ser partede moléculas maiores, de preferência moléculas de ligação a antígeno(ABMs). As moléculas-maiores podem ser, por exemplo, anticorpos mono-clonais, anticorpos policlonais, anticorpos quimérieos, anticorpos humaniza-dos, anticorpos biespecíficos, imunoadesinas, etc. Como tal, é evidente quehá uma ampla faixa de aplicações para as regiões Fc modificadas da pre-sente invenção.

Para todas as posições discutidas na presente invenção, nume-ração de uma cadeia pesada de imunoglobulina é de acordo com o índiceNorte Americano (Kabat e outros, 1991, Sequences of Proteins of Immuno-logical lnterest, b- Ed., United States Public Health Service, National Institu-tes of Health, Bethesda). O "índice Norte Americano conforme em Kabat" serefere à numeração de resíduos do anticorpo EU de IgGI humana.

Moléculas de ligação a antígeno compreendendo as regiões Fcmodificadas da presente invenção podem ser otimizadas com relação a umavariedade de propriedades. Propriedades que podem ser otimizadas inclu-em, mas não estão limitadas a, afinidade intensificada ou reduzida por umFcyR. Em uma modalidade preferida, as regiões Fc modificadas da presenteinvenção são otimizadas para possuir afinidade intensificada por um FcyR deativação humano, de preferência FcRI, FcyRIIa, FcyRIIc, FcyRIIIa e FcyRIIIb,mais preferivelmente FcyRII Ia. Em uma modalidade alternativamente prefe-rida, as regiões Fc modificadas são otimizadas para possuir afinidade redu-zida pelo receptor inibitório humano FcyRIIb. As ABMs da invenção propor-cionam anticorpos e fusões de Fc com propriedades terapêuticas intensifica-das em seres humanos, por exemplo, função efetora intensificada e maiorpotência anti-câncer. Em uma modalidade alternativa, as regiões Fc modifi-cadas da presente invenção são otimizadas para ter afinidade reduzida oueliminada por um FcyR humano incluindo, mas não limitado a, FcyRI1FcyRIIa, FcyRIIb ou FcyRIIc. É previsto que essas ABMs da invenção pro-porcionem anticorpos e fusões de Fc com propriedades terapêuticas intensi-ficadas em seres humanos, por exemplo, função efetora reduzida e toxicida-de reduzida. Modalidades preferidas compreendem otimização da ligação deFe a um FcyR humano; contudo, em modalidades alternativas, as variantesde Fc da presente invenção possuem afinidade intensificada ou reduzida porFcyRs de organismos-não humanos incluindo, mas não limitado a, camun-dongos, ratos, coelhos e macacos. Variantes de Fe que são otimizadas comrelação à ligação a um FcyR não humano podem encontrar uso em experi-mentação. Por exemplo, modelos com camundongo estão disponíveis parauma variedade de doenças que permitem a testagem de propriedades taiscomo eficácia, toxicidade e farmacocinética com relação a um determinadofármaco candidato. Conforme é conhecido na técnica, células cancerígenaspodem ser enxertadas ou injetadas em camundongos para imitar um câncerhumano, um processo referido como xenoenxerto. Testagem de anticorposou fusões de Fc que compreendem regiões Fc modificadas que são otimiza-das para um ou mais FcyRs de camundongo pode proporcionar informaçãovaliosa com relação à eficácia do anticorpo ou fusão de Fc, seu mecanismode ação e similares.

As regiões Fc modificadas da presente invenção podem ser de-rivadas de polipeptídeos de Fc precursores que são, em si, de uma amplafaixa de fontes. O polipeptídeo de Fc precursor pode ser substancialmentecodificado por um ou mais genes de Fc de qualquer organismo incluindo,mas não limitado a, seres humanos, camundongos, ratos, coelhos, camelos,lhamas, dromedários, macacos, de preferência mamíferos e mais preferi-velmente seres humanos e camundongos. Em uma modalidade preferida, opolipeptídeo de Fc precursor compreende um anticorpo, referido como o an-ticorpo precursor. Q anticorpo precursor pode ser totalmente humano obtido,por exemplo, usando camundongos transgênicos (Bruggemann e outros,1997, Curr Opin Biotechnol 8: 455-458) ou bibliotecas de anticorpo humanoacoplados a métodos de seleção (Griffiths e outros, 1998, Curr Opin Biote-chnol 9: 102-108). O anticorpo precursor não precisa ser um que ocorre na-turalmente. Por exemplo, o anticorpo precursor pode ser um anticorpo mani-pulado incluindo, mas não limitado a, anticorpos quiméricos e anticorposhumanizados (Clark, 2000, Immunol Today 27: 397-402). O anticorpo pre-cursor pode ser uma variante manipulada de um anticorpo que é substanci-almente codificado por um ou mais genes de anticorpo natural. Em uma mo-dalidade, o anticorpo precursor foi maturado por afinidade, conforme é co-_ nhecido_na técnica. Alternativamente, o anticorpo. foLmodificado de algumaoutra forma, por exemplo, conforme descrito no U.S. N9 de Série 10/339.788,depositado em 3 de Março de 2003.

As regiões Fc modificadas da presente invenção podem sersubstancialmente codificadas por genes de imunoglobulina pertencendo aqualquer uma das classes de anticorpo. Em uma modalidade preferida, asregiões Fc modificadas da presente invenção encontram uso em anticorposou fusões de Fc que compreendem seqüências pertencendo à classe IgG deanticorpos, incluindo IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4. Em uma modalidade alterna-tiva, as regiões Fc modificadas da presente invenção encontram uso em an-ticorpos ou fusões de Fc que compreendem seqüências pertencendo àsclasses IgA (incluindo as subclasses IgAI e lgA2), IgD, IgE, IgG ou IgM deanticorpos. As regiões Fc modificadas da presente invenção podem compre-ender mais de uma cadeia de proteína. Isto é, a presente invenção pode en-contrar uso em um anticorpo ou fusão de Fc que é um monômero ou um oli-gômero, incluindo um homo- ou hetero-oligômero.

As regiões Fc modificadas da presente invenção podem sercombinadas com outras modificações de Fc incluindo, mas não limitado a,modificações que alteram a função efetora ou interação com um ou maisIigantes de Fe. Tal combinação pode proporcionar propriedades aditivas,sinergísticas ou novas nas ABMs da invenção. Em uma modalidade, as regi-ões Fe modificadas da presente invenção podem ser combinadas com ou-tras modificações de Fc conhecidas (Duncan e outros, 1988, Nature 352:563-564; Lund e outros, 1991, J Immunol 147: 2657-2662; Lund e outros,1992, Mol Immunol 29: 53-59; Alegre e outros, 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins e outros, 1995, Proe Natl Acad Sei USA 02: 11980-11984; Jefferis e outros, 1995, Immunol Left 44: 111-117; Lund e outros,1995, Faseb J9: 115-119; Jefferis e outros, 1996, Immunol Left 54: 101-104;Lund e outros, 1996, J /mmuno/157: 4963-4969; Armour e outros, 1999, EurJ Immunol 29: 2613-2624; Idusogie e outros, 2000, J Immunol 164: 4178-4184; Reddy e outros, 2000, J Immunol 164: 1925-1933; Xu e outros, 2000,Cell Immunol 200: 16-26; Idusogie e outros, 2001, J Immunol 166: 2571-2575; Shields e outros, 2001,. J B/o/ ChewZl 6591-6604; Jefferis e outros,2002, Immunol Left 82: 57-65; Presta e outros, 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; Hinton e outros, 2004, J. Biol. Chem. 279: 6213-6216) (Pats. U.S.Nos. 5.624.821; 5.885.573; 6.194.551; PCT WO 00/42072; PCT WO99/58572; 2004/0002587 A1). Assim, combinações das regiões Fc modifica-das da presente invenção com outras modificações de Fc, bem como modifi-cações de Fc não descobertas, são consideradas como o objetivo de gera-ção de novas ABMs (por exemplo, anticorpos ou fusões de Fe) com proprie-dades otimizadas.

Virtualmente qualquer antígeno pode ser objetivado pelas ABMscompreendendo as regiões Fc modificadas da invenção incluindo, mas nãolimitado a, seguinte lista de proteínas, subunidades, domínios, motivos e epi-topos pertencendo à seguinte lista de proteínas: CD2; CD3, CD3E, CD4,CD11, CD11a, CD14, CD16, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25,CD28, CD29, CD30, CD32, CD33 (proteína p67), CD38, CD40, CD40L,CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3, IL-I1 IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5,IL-6, IL-6R, IL- 8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, interferon a, interferon β, interfe-ron γ, TNF-a, TNFP2, TNFc, TNFay, TNF-RI, TNF-RII1 FasL, CD27L, CD30L,4-1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEGI, OX40L,TRAIL Receptor-1, Receptor de Adenosina A1, Beta Receptor de Linfotoxi-na, TACI, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, EpCAM, integrina a1, In-tegrina β2, integrina α4/β7, integrina a2, integrina a3, integrina oc4, integrinaoc5, integrina a6, integrina αν, integrina ανβ3, FGFR-3, Fator de Crescimentode Queratinócito, VLA-1, VLA-4, L-selectina, anti-ld, E-selectina, HLA, HLA-DR, CTLA-4, receptor de células Τ, B7-1, B7-2, VNRintegrina, ΤΰΡβΙ,TGFp2, eotaxinal, BLyS (Estimulador de linfócitos B), complemento C5, IgE,fator VU, CD64, CBL1 NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4 (ErbB-4), Fator Tecidual, VEGF1 VEGFR, receptor de endote-lina, VLA-4, Hapteno NP-cap ou NlP-cap, α/β,Ε-selectina do receptor de cé-lulas T, digoxina, fosfatase alcalina placentária (PLAP) e fosfatase alcalinatesticular PLAP-semelhante, receptor de transferrina, antígeno carcinoem-briônico (CEA), CEACAM5, HMFG PEM, mucina MUC1, MUC18, Heparana-—se-l, miosina cardíaca-humana, glicoproteína-72 tumor-associada (TAG-72),antígeno CA 125 tumor-associado, antígeno da membrana próstata-específico (PSMA), antígeno melanoma-associado de elevado peso molecu-lar (HMW-MAA), antígeno carcinoma-associado, Glicoproteína llb/llla (GPI-Ib/llla), antígeno tumor- associado expressando carboidrato de Lewis Y-relacionado, proteína do envoltório gH de citomegalovírus humano (HCMV),gp120 de HIV, HCMV, vírus sincicial respiratório RSV F, Fgp de RSVF, VN-Rintegrina, IL-8, antígeno de citoqueratina tumor-associado, gp120 de HepB, CMV, gpllbllla, Ioop V3 de IIIB gp120 de HIV, Fgp de vírus sincicial respi-ratório (RSV), glicoproteína gD de vírus do Herpes simplex (HSV), glicopro-teína gB de HSV, glicoproteína gB do envoltório de HCMV e toxina de Clos-tridium perfringens.

Aqueles versados na técnica apreciarão que a lista antes men-cionada de alvos se refere não apenas à proteínas e biomoléculas específi-cas, mas à via ou vias bioquímicas que compreendem os mesmos. Por e-xemplo,referência à CTLA-4 como um antígeno alvo implica que os Iigantese receptores que compõem a via co-estimulatória de células T, incluindo C-TLA-4, B7-1, B7-2, CD28 e quaisquer outros Iigantes ou receptores não des-cobertos que se ligam a essas proteínas, também são alvos. Assim, alvo,conforme usado aqui, se refere não apenas a uma biomolécula específica,mas ao conjunto de proteínas que interagem com o referido alvo e os mem-bros da via bioquímica à qual o referido alvo pertence. Aqueles versados natécnica ainda apreciarão que qualquer um dos antígenos alvo antes mencio-nados, os Iigantes ou receptores dos mesmos ou outros membros de sua viabioquímica correspondente, podem ser operavelmente ligados às variantesde Fc da presente invenção de forma a gerar uma fusão de Fc. Assim, porexemplo, uma fusão de Fc que objetiva EGFR poderia ser construída atra-vés de ligação, operavelmente, de uma variante de Fe ao EGF1 TGFa ouqualquer outro ligante, descoberto ou não descoberto, que se liga ao EGFRde forma a gerar uma fusão de Fc que se liga ao EGF, TGF α ou qualqueroutro ligante, descoberto ou não descoberto, que se liga ao EGFR. Assim,virtualmente qualquer polipeptídeo, quer um ligante, receptor ou alguma ou-- tra proteína JDU-domínio de .proteína incluindo,-mas não limitado a, os alvosantes mencionados e proteínas que compõem suas vias bioquímicas corres-pondentes, pode ser operavelmente ligado às variantes de Fc da presenteinvenção para desenvolver uma fusão de Fe.

Uma série de anticorpos e fusão de Fc que são aprovados parauso em experimentos clínicos ou em desenvolvimento podem se beneficiardas regiões Fc modificadas da presente invenção. Os referidos anticorpos efusões de Fc são aqui referidos como "produtos e candidatos clínicos". As-sim, em uma modalidade preferida, as variantes de Fc da presente invençãopodem encontrar uso em uma faixa de produtos e candidatos clínicos. Porexemplo, uma série de anticorpos que objetivam a CD20 podem se benefici-ar das regiões Fc modificadas da presente invenção. Por exemplo, as regi-ões Fc modificadas da presente invenção podem encontrar uso em um anti-corpo que é substancialmente similar ao rituxirnab (Rituxan®, IDEC/ Genen-tech/Roche) (veja, por exemplo, Pat. U.S. N5 5.736.137), um anticorpo anti-CD20 quimérico aprovado para tratar Iinfoma Não-Hodgkin; HuMax-CD20,um anti-CD20 atualmente sendo desenvolvido pela Genmab; um anticorpoanti-CD20 descrito na Pat. U.S. N5 5.500.362; AME-I33 (Applied MolecularEvolution); hA20 (Immunomedies, Inc.); e HumaLYM (fritracel). Uma série deanticorpos que objetivam membros da família de receptores do fator decrescimento epidérmico, incluindo EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4 (ErbB-4), podem se beneficiar das variantes de Fc da presen-te invenção. Por exemplo, as variantes de Fc da presente invenção podemencontrar uso em um anticorpo que é substancialmente similar ao trastuzu-mab (Herceptin®, Genentech) (veja, por exemplo, Pat. U.S.. Ne 5.677.171),um anticorpo anti-Her2/neu humanizado aprovado para tratar câncer demama; pertuzumab (rhuMab-2C4, Omnitarg™), atualmente sendo desenvol-vido pela Genentech; um anticorpo anti-Her2 descrito na Pat. U.S. Ne4.753.894; cetuximab (Erbitux®), Imclone) (Pat. U.S. Ng 4.943.533; PCT WO96/40210), um anticorpo anti-EGFR quimérica em experimentos clínicos pa-ra uma variedade de cânceres; ABX-EGF (Pat. U.S. N9 6.235.883), atual-mente sendo desenvolvido pela Abgenix/lmmunex/Amgen; HuMax-EGFr(U.S--N9-Ser. 10/172,31-7), -atualmente sendo desenvolvido pela Genmab;425, EMD55900, EMD62000 e EMD72000 (Merck KGaA) (Pat. U.S. Nq5.558.864; Murthy e outros. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2): 549-60;Rodeck e outros, 1987, J Cell Biochem. 35(4): 315-20; Kettleborough e ou-tros, 1991, Protein Eng. 4(7): 773-83); ICR62 (Institute of Câncer Research)(PCT WO 95/20045; Modjtahedi e outros, 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3): 129-46; Modjtahedi e outros, 1993, Br J Câncer. 1993, 67(2): 247-53;Modjtahedi e outros, 1996, Br J Câncer, 73(2): 228-35; Modjtahedi e outros,2003, Int J Câncer, 105(2): 273-80); TheraCIM hR3 (YM Biosciences, Cana-dá e Centro de Immunologia Molecular, Cuba (Pats. U.S. Nos. 5.891.996;6.506.883; Mateo e outros, 1997, Immunotechnology, 3(1): 71-81); mAb-806(Ludwig Institute for Câncer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluthe outros. 2003, Proc NatIAcad Sci USA. 100(2): 639-44); KSB-102 (KS Bio-medix); MR1-I (IVAX, National Câncer Institute) (PCT WO 0162931A2); eSC100 (ScanceII) (PCT WO 01/88138). Em outra modalidade, as regiões Fcmodificadas da presente invenção podem encontrar uso no alemtuzumab(Campath®, Millenium), um anticorpo monoclonal humanizado atualmenteaprovado para tratamento de leucemia linfocítica crônica de células B. Asregiões Fc modificadas podem encontrar uso em uma variedade de anticor-pos ou fusões de Fc que são substancialmente similares a outros produtos ecandidatos clínicos incluindo, mas não limitado a, muromonab-CD3 (Ortho-clone OKT3®)), um anticorpo anti-CD3 desenvolvido pela Ortho Biote-ch/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), um anticorpo anti-CD20 desenvolvido pela IDEC/Schering AG, gemtuzumab ozogamicina (M-ylotarg®), um anticorpo anti-CD33 (proteína p67) desenvolvido pela Cellte-ch/Wyeth, alefacept (Amevive®), uma fusão de Fc anti-LFA-3 desenvolvidapela Biogen), abciximab (ReoPro®)), desenvolvido pela Centocor/Lilly, basi-Iiximab (Simulect®.)), desenvolvido pela Novartis, palivizumab (Synagis®)),desenvolvido pela Medlmmune, ínfliximab (Remicade®)), um anticorpo anti-TNFaIfa desenvolvido pela Centocor, adalimumab (Humira®), um anticorpoanti-TNFalfa desenvolvido pela Abbott, Humicade®, um anticorpo anti-TNFaIfa desenvolvido pela Celltech1 etanercept (Enbrel®), uma fusão de FcantkTNEalfa^desenvolvida- pelaJmmunex/Amgenr_ABX-CBL, um anticorpoanti-CD 147 sendo desenvolvido pela Abgenix, ABX-IL8, um anticorpo anti-IL8 sendo desenvolvido pela Abgenix, ABX-MA1, um anticorpo anti-MUC18sendo desenvolvido pela Abgenix, Pemtumomab (R1549, sup.90Y-muHMFGI), um anti-MUC1 em desenvolvimento pela Antisoma, Therex(R1550), um anticorpo anti-MUC1 sendo desenvolvido pela Antisoma, Angi-oMab (AS1405), sendo desenvolvido pela Antisoma, HuBC-I, sendo desen-volvido pela Antisoma, Tioplatina (AS 1407) sendo desenvolvida pela Anti-soma, Antegren® (natalizumab), um anticorpo anti-alfa-4-beta-1 (VLA-4) ealfa-4-beta-7 sendo desenvolvido pela Biogen, mAb VLA-I, um anticorpo an-ti-integrina VLA-1 sendo desenvolvido pela Biogen, mAb LTBR, um anticorpoanti- receptor beta de Iinfotoxina (LTBR) sendo desenvolvido pela Biogen,CAT-152, um anticorpo anti-TGF.2 sendo desenvolvido pela Cambridge An-tibody Technology, J695, um anticorpo anti-IL-12 sendo desenvolvido pelaCambridge Antibody Technology e Abbott, CAT-192, um anticorpo anti-TGF.beta.1 sendo desenvolvido pela Cambridge Antibody Technology eGenzyme, CAT-213, um anticorpo anti-Eotaxinal sendo desenvolvido pelaCambridge Antibody Technology, LymphoStat-B®, um anticorpo anti-B1yssendo desenvolvido pela Cambridge Antibody Technology e Human GenomeSciences Inc., TRAIL-RImAb, um anticorpo anti-TRAIL-R1 sendo desenvol-vido pela Cambridge Antibody Technology e Human Genome Sciences, Inc.,Avastin® (bevacizumab, rhuMAb-VEGF), um anticorpo anti-VEGF sendodesenvolvido pela Genentech, um anticorpo antifamília do receptor HERsendo desenvolvido pela Genentech, Fator AntiTeciduaI (ATF), um anticorpoantiFator Tecidual sendo desenvolvido pela Genentech, Xolair® (Omalizu-mab), um anticorpo anti-IgE sendo desenvolvido pela Genentech, Raptiva®(EfaIizumab)1 um anticorpo anti-CDIIa sendo desenvolvido pela Genentech eXoma, Antibody MLN-02 (formalmente LDP-02), sendo desenvolvido pelaGenentech e Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, um anticorpo anti-CD4 sendo desenvolvido pela Genmab, HuMax-IL 15, um anticorpo anti-IL15sendo desenvolvido pela Genmab e Amgen, HuMax-InfIam, sendo desenvol-vido pela Genmab e Medarex, HuMax-Cancer1 um anticorpo anti-Heparanase I sendo-desenvolvido pela Genmab. e Medarex e Oxford GcoS-ciences, HuMax-Lymphoma, sendo desenvolvido pela Genmab e Amgen,HuMax-TAC, sendo desenvolvido pela Genmab, IDEC-131 e anticorpo anti-CD40L sendo desenvolvido pela DDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Cleno-liximab), um anticorpo anti-CD4 sendo desenvolvido pela IDEC Pharmaceu-ticals, IDEC-114, um anticorpo anti-CD80 sendo desenvolvido pela IDECPharmaceuticals, IDEC-152, um anticorpo anti-CD23 sendo desenvolvidopela IDEC Pharmaceuticals, anticorpos antiFator de migração de macrófago(MIF) sendo desenvolvidos pela IDEC Pharmaceuticals, BEC2, um anticorpoanti-idiotípico sendo desenvolvido pela Imclone, IMC-IC11, um anticorpo an-ti-KDR sendo desenvolvido pela Imclone, DC101, um anticorpo anti-flk-1sendo desenvolvido pela Imclone, anticorpos anticaderina VE sendo desen-volvidos pela Imclone, CEA-Cide® (labetuzumab), um anticorpo ao antígenoanti-carcinoembriônico (CEA) sendo desenvolvido pela Immunomedics,LymphoCide® (Epratuzumab)1 um anticorpo anti-CD22 sendo desenvolvidopela Immunomedics, AFP-Cide1 sendo desenvolvido pela Immunomedics,MyeIomaCide, sendo desenvolvido pela Immunomedics, LkoCide1 sendodesenvolvido pela Immunomedics, ProstaCide1 sendo desenvolvido pelaImmunomedics, MDX-010, um anticorpo anti-CTLA4 sendo desenvolvidopela Medarex, MDX-060, um anticorpo anti-CD30 sendo desenvolvido pelaMedarex, MDX-070 sendo desenvolvido pela Medarex, MDX-018 sendo de-senvolvido pela Medarex1 Osidem® (IDM-1) e anticorpo anti-Her2 sendo de-senvolvido pela Medarex e Immuno-Designed Molecules, HuMax® CD4, umanticorpo anti-CD4 sendo desenvolvido pela Medarex e Genmab1 HuMax-IL15, um anticorpo anti-IL15 sendo desenvolvido pela Medarex e Genmab1CNTO 148, um anticorpo anti-TNFa sendo desenvolvido pela Medarex eCentocor/J&J, CNTO 1275, um anticorpo anti-citocina sendo desenvolvidopela Centocor/J&J, MOR101 e MOR102, anticorpos antimolécula-1 de ade-são intercelular (ICAM-1) (CD54) sendo desenvolvidos pela MorphoSys,MOR201, um anticorpo anti-receptor 3 de fator de crescimento de fibroblasto(FGFR-3) sendo desenvolvido pela MorphoSys, Nuvion® (visilizumab), umanticorpo anti-CD3 sendo desenvolvido pela Protein Design Labs1 HuZAF®,um.anticorpo, anti-interferon gama sendo desenvolvido pela Protein DesignLabs, Anti- .quadrature.5. quadrature.1 Integrin, sendo desenvolvido pelaProtein Design Labs, anti-IL-12, sendo desenvolvido pela Protein DesignLabs, ING-I, um anticorpo anti-Ep-CAM sendo desenvolvido pela Xoma eMLN01, um anticorpo antiintegrina Beta2 sendo desenvolvido pela Xoma.

Aplicação das regiões Fc modificadas aos produtos e candidatosclínicos de anticorpo e fusão de Fc antes mencionados não se destina a es-tar limitada à sua composição precisa. As regiões Fc modificadas da presen-te invenção podem ser incorporadas nos candidatos e produtos clínicos an-tes mencionados ou em anticorpos e fusões de Fc que são substancialmentesimilares aos mesmos. As regiões Fc modificadas da presente invenção po-dem ser incorporadas em versões dos candidatos e produtos clínicos antesmencionados que são humanizados, maturados por afinidade, manipuladosou modificados de alguma outra forma. Além disso, o polipeptídeo todo dosprodutos e candidatos clínicos antes mencionados não precisa ser usadopara construir um novo anticorpo ou fusão de Fc que incorpora a região Fcmodificada da presente invenção; por exemplo, apenas a região variável deum anticorpo de produto ou candidato clínico, uma região variável substan-cialmente similar ou uma versão humanizada, maturada por afinidade, mani-pulada ou modificada da região variável pode ser usada. Em outra modali-dade, a região Fc modificada da presente invenção pode encontrar uso emum anticorpo ou fusão de Fc que se liga ao mesmo epitopo, antígeno, Iiganteou receptor que um dos produtos e candidatos clínicos antes mencionados.

As regiões Fc modificadas da presente invenção podem encon-trar em uma ampla faixa de produtos de anticorpo e fusão de Fe. Em umamodalidade, a ABM da presente invenção é um reagente terapêutico, diag-nóstico ou de pesquisa, de preferência um produto terapêutico.

Doenças e distúrbios capazes de serem tratados ou aliviadospela ABM da invenção incluem, mas não estão limitados a, doenças auto-imunes, doenças imunológicas, doenças infecciosas, doenças inflamatórias,doenças neurológicas e doenças oncológicas e neoplásicas, incluindo cân-cer. "Câncer" e "cancerígena" aqui se refere a ou descreve a condição fisio-Jógica_ejTLmamíferosj^ por crescimento celu-lar desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a,carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (incluindo lipossarcoma), tumoresneuroendócrinos, mesotelioma, schwanoma, meningioma, adenocarcinoma,melanoma e leucemia ou malignidades linfóides. Exemplos mais particularesde tais cânceres incluem câncer de células escamosas (por exemplo, câncerde células escamosas epiteliais), câncer de pulmão, incluindo câncer depulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não-pequenas,adenocarcinoma do pulmão e carcinoma escamoso do pulmão, câncer doperitônio, câncer hepatocelular, câncer gástrico ou de estômago, incluindocâncer gastrointestinal, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical,câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, hepatoma, câncer demama, câncer de cólon, câncer retal, câncer cólon-retal, câncer endometrialou carcinoma uterino, carcinoma de glândula salivar, câncer renal ou de rim,câncer de próstata, câncer vulval, câncer da tiróide, carcinoma hepático,carcinoma anal, carcinoma de pênis, câncer testicular, câncer esofageal,tumores do trato biliar, bem como câncer de cabeça e pescoço. Além disso,as variantes de Fc da presente invenção também podem ser usadas paratratar condições incluindo, mas não limitado a, insuficiência cardíaca conges-tiva (CHF), vasculite, rosecea, acne, eczema, miocardite e outras condiçõesdo miocárdio, Iupus eritematoso sistêmico, diabetes, espondilopatias, fibro-blastos sinoviais e estroma da medula óssea; perda óssea; doença de Pa-get, osteoclastoma; mieloma múltiplo; câncer de mama; osteopenia difusa;má nutrição, doença periodontal, doença de Gaucher1 histiocitose de célulasde Langerhans, lesão da coluna espinhal, artrite séptica aguda, osteomala-cia, síndrome de Cushing, displasia fibrosa monoostótica, displasia fibrosapoliostótica, reconstrução periodontal e fraturas ósseas; sarcoidose; miejomamúltiplo; cânceres ósseos osteolíticos, câncer de mama, câncer de pulmão,câncer de rim e câncer retal; metástases ósseas, tratamento de dor óssea ehipercalcemia maligna humoral, espondilite anquilosante e outras espondilo-artropatias; rejeição a transplante, infecções virais, neoplasias hematológi-cas e condições semelhantes à neoplasia, por exemplo, Iinfoma de Hodgkin;linfomas- não-Hodgkin -(linfoma—de Burkitt,- Iinfoma- linfocítico peque-no/leucemia linfocítica crônica, micose fungóide, Iinfoma de células mantle,Iinfoma folicular, Iinfoma de células B grandes difuso, Iinfoma de zona margi-nal, leucemia de células pilosas e leucemia linfoplasmacítica), tumores decélulas precursoras linfóides, incluindo leucemia linfoblástica aguda/linfomade células B e leucemia linfoblástica aguda/linfoma de células T, timoma,tumores de células TeNK maduras, incluindo Ieucemias de células T perifé-ricas, leucemia de células T/linfomas de células T em adultos e leucemialinfocítica granular grande, histocitose de células de Langerhan, neoplasiasmielóides, tais como Ieucemias mielogêneas agudas, incluindo AML commaturação, AML sem diferenciação, leucemia pró-mielocítica aguda, leuce-mia mielomonocítica aguda e Ieucemias monocíticas agudas, síndromes mi-elodisplásicas e distúrbios mieloproliferativos crônicos, incluindo leucemiamielogênea crônica, tumores do sistema nervoso central, por exemplo, tumo-res do cérebro (glioma, neuroblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, epen-dimoma e retinoblastoma), tumores sólidos (câncer nasofaringeal, carcinomade células basais, câncer pancreático, câncer do duto biliar, sarcoma de Ka-posi, câncer testicular, cânceres uterino, vaginal ou cervical, câncer ovaria-no, câncer hepático primário ou câncer endometrial e tumores do sistemavascular (angiosarcoma e hemagiopericitoma), osteoporose, hepatite, HIV,AIDS, espondiloartrite, artrite reumatóide, doenças inflamatórias do intestino(IBD), sepsia e choque séptico, doença de Crohn, psoríase, escleroderma,doença hospedeiro versus enxerto (GVHD), rejeição a enxerto de ilhotasalogênicas, malignidades hematológicas, tais como mieloma múltiplo (MM),síndrome mielodisplásica (MDS) e leucemia mielogênea aguda (AML), infla-mação associada a tumores, lesão do nervo periférico ou doenças desmieli-nizantes.

Em uma modalidade, uma ABM compreendendo uma região Fcmodificada da presente invenção é administrada a um paciente tendo umadoença envolvendo expressão inapropriada de uma proteína. Dentro do es-copo da presente invenção, isso se destina a incluir doenças e distúrbioscaracterizados por proteínas anormais em virtude, por exemplo, de altera-ções na quantidade de uma proteína presente, da presença de uma proteínamutante ou ambos. Uma super-abundância pode ser em virtude de qualquercausa incluindo, mas não limitado a, superexpressão a nível molecular, apa-recimento prolongado ou acumulado no local de ação ou atividade aumenta-da de uma proteína com relação ao normal. Essa redução pode ser em vir-tude de qualquer causa incluindo, mas não limitado a, expressão reduzida anível molecular, aparecimento reduzido ou diminuído no local de ação, for-mas mutantes de uma proteína ou atividade diminuída de uma proteína comrelação ao normal. Tal super-abundância ou redução de uma proteína podeser medida com relação à expressão, aparecimento ou atividade normais deuma proteína e a referida medição pode exercer um papel importante no de-senvolvimento e/ou testagem clínica das ABMs da presente invenção.

Métodos de Manipulação

A presente invenção proporciona métodos de manipulação quepodem ser usados para gerar variantes de Fe. O principal obstáculo que temimpedido tentativas anteriores de manipulação de Fc é que apenas tentati-vas aleatórias na modificação foram possíveis devido, em parte, à ineficáciadas estratégias e métodos de manipulação e da natureza de baixo rendi-mento da produção e seleção de anticorpos. A presente invenção descrevemétodos de manipulação que superam essas deficiências. Uma variedadede estratégias de design, métodos de seleção computacional, métodos degeração de biblioteca e métodos de seleção e produção experimentais sãoconsiderados. Essas estratégias, abordagens, técnicas e métodos podemser aplicados individualmente ou em várias combinações para manipularvariantes de Fc otimizadas.Estratégias de Desiqn

Uma estratégia de design para variantes de Fc manipuladas éproporcionada, na qual interação de Fc com algum Iigante de Fc é alteradaatravés de manipulação de modificações de aminoácido na interface entre aFc e o referido Iigante de Fe. Ligantes de Fc aqui podem incluir, mas nãoestão limitados a, FcyRs, C1q, FcRn, proteína A ou G e similares. Através deexploração de substituições energeticamente favoráveis em posições da FcqueJêm um impacto sobre_a interface de ligação, variantes podem ser mani-puladas que mostram novas conformações de interface, algumas das quaispodem melhorar a ligação ao Iigante de Fc, algumas das quais podem redu-zir a ligação ao Iigante de Fc e algumas das quais podem ter outras proprie-dades favoráveis. Essas novas conformações de interface poderiam ser oresultado, por exemplo, de interação direta com resíduos de Iigante de Fcque formam a interface ou efeitos indiretos causados pelas modificações deaminoácido, tal como perturbação das conformações de cadeia lateral ouparte principal. Posições variáveis podem ser escolhidas como quaisquerposições que acredita-se exercerem um papel importante na determinaçãoda conformação da interface. Por exemplo, posições variáveis podem serescolhidas como o conjunto de resíduos que estão dentro de uma determi-nada distância, por exemplo, 5 Angstroms, de preferência entre 1 e 10 Angs-troms, de qualquer resíduo que faz contato direto como o Iigante de Fc.

Uma estratégia de design adicional para geração de variantes deFc é proporcionada, na qual a conformação do carboidrato de Fc a N297 éotimizada. Otimização, conforme usado no presente contexto, se destina aincluir alterações conformacionais e composicionais no carboidrato N297que resultam em uma propriedade desejada, por exemplo, afinidade aumen-tada ou reduzida por um FcyR. Tal estratégia é sustentada pela observaçãode que a estrutura principal e conformação do carboidrato afetam dramati-camente a ligação Fc/FcyR e Fc/C1q (Umana e outros, 1999, Nat Biotechnol77: 176-180; Davies e outros, 2001, Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Mimurae outros, 2001, J Biol Chem 275: 45539-45547; Radaev e outros, 2001, 276J Biol Chem-. 16478-16483; Shields e outros., 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740; Shinkawa e outros, 2003, J Biol Chem 275: 3466-3473). Através deexploração de substituições energeticamente favoráveis em posições queinteragem com um carboidrato, uma diversidade de qualidade de variantespode ser manipulada, que mostram novas conformações de carboidrato, al-gumas das quais podem melhorar e algumas das quais podem reduzir a li-gação a um ou mais Iigantes de Fc. Embora a maioria das mutações próxi-mo da interface Fc/carboidrato parecem alterar a conformação de carboidra-to, foLmostrado que algumas mutações alterama composição de glicosila-ção (Lund e outros, 1996, J Immunol 757: 4963-4969; Jefferis e outros,2002, ImmunoILett 52: 57-65).

Outra estratégia de design para geração de variantes de Fc éproporcionada, na qual o ângulo entre os domínios Cy2 e Cy3 é otimizado.Otimização, conforme usado nesse contexto, se destina a descrever altera-ções conformacionais no ângulo do domínio Ογ2-Ογ3 que resultam em umapropriedade desejada, por exemplo, afinidade reduzida ou aumentada porum FcyR. Esse ângulo é uma determinante importante da afinidade Fc/FcyR(Radaev e outros, 2001, J Biol Chem 276: 16478- 16483) e uma série demutações distais à interface Fc/FcyR afetam a ligação potencialmente atra-vés de modulação da mesma(Shields e outros, J Biol Chem 276: 6591 -6604(2001)). Através de exploração de substituições favoráveis, posições queparecem exercer um papel chave na determinação do ângulo Cy2-Cy3 e daflexibilidade dos domínios um com relação ao outro, uma diversidade dequalidade de variantes pode ser projetada, que mostram novos ângulos eníveis de flexibilidade, algumas das quais podem ser otimizadas com relaçãoa uma propriedade de Fc desejada.

Outra estratégia de design para geração de variantes de Fc éproporcionada, na qual a Fc é remanipulada para eliminar a dependênciaestrutural e funcional de glicosilação. Essa estratégia de design envolve aotimização da estrutura principal, estabilidade, solubilidade de Fc e/ou fun-ção de Fc (por exemplo, afinidade da Fc por um oü mais Iigantes de Fe) naausência de carboidrato N297. Em uma abordagem, posição que são expos-tas a solvente na ausência de glicosilação são manipuladas, de modo queelas sejam estáveis, estruturalmente consistentes com a estrutura principalda Fc e não tenham tendência a agregar. O Cy2 é o único domínio de Ig nãoemparelhado no anticorpo. Assim, o carboidrato N297 cobre até o trechohidrofóbico exposto, que normalmente estaria na interface para uma intera-ção proteína-proteína com outro domínio de Ig1 mantendo a estabilidade eintegridade estrutural da Fc e mantendo os domínios Cy2 de agregação con-tra o eixo central. Abordagens para otimização de Fc aglicosilada podemenvolver, mas-não. estão limitadas-a,-planejamento, de modificações de ami-noácido que intensificam a estabilidade e/ou solubilidade da Fc aglicosiladaatravés de incorporação de resíduos polares e/ou carregados que faceiaminternamente em direção ao eixo do dímero Cy2-Cy2 e planejando modifica-ções de aminoácido que intensificam diretamente a interface Fc/FcyR aglico-silada ou a interface de Fc aglicosilada com algum outro Iigante de Fc.

Uma estratégia de design adicional para manipulação de varian-tes de Fc é proporcionada, na qual a conformação do domínio Ογ2 é otimi-zada. Otimização, conforme usado nesse contexto, se destina a descreveralterações conformacionais no ângulo do domínio Cy2 que resultam em umapropriedade desejada, por exemplo, afinidade reduzida ou aumentada porum FcyR. Através de exploração de substituições energeticamente favorá-veis em posições do Cy2 que têm um impacto sobre a conformação do Cy2,uma diversidade de qualidade de variantes pode ser manipulada, que mos-tram novas conformações de Cy2, algumas das quais podem obter o objetivodo design. Essas novas conformações de Cy2 poderiam ser o resultado, porexemplo, de conformações alternadas da parte principal que são mostradaspela variante. Posições variáveis podem ser escolhidas como quaisquer po-sições que se acredita exercerem um papel importante na determinação daestrutura principal, estabilidade, solubilidade, flexibilidade, função do Cy2 esimilares. Por exemplo, resíduos de núcleo hidrofóbico de Ογ2, isto é, resí-duos de Cy2 que são parcial ou totalmente capturados a partir do solvente,podem ser re-manípulados. Alternativamente, resíduos não centrais podemser considerados ou resíduos que são considerados importantes para de-terminação da estrutura principal, estabilidade ou flexibilidade da parte prin-cipal.

Uma estratégia de design adicional para otimização de Fc é pro-porcionada, na qual ligação a um FcyR, complemento ou algum outro Iigantede Fc é alterada através de modificações que modulam a interação eletros-tática entre a Fc e o referido Iigante de Fc. Tais modificações podem serconsideradas como otimização do caráter eletrostático global da Fc e inclu-em substituição de aminoácidos neutros por um aminoácido carregado,substituição de um-aminoácido-carregado-por- um- aminoácido neutro ousubstituição de um aminoácido carregado por um aminoácido de carga opos-ta (isto é, carga inversa). Tais modificações podem ser usadas para realizaralterações na afinidade de ligação entre uma Fc e um ou mais Iigantes deFe, por exemplo, FcyRs. Em uma modalidade preferida, posições nas quaissubstituições eletrostáticas poderiam afetar a ligação são selecionadas u-sando uma variedade de métodos bem-conhecidos para cálculo de potenci-ais eletrostáticos. Na modalidade mais simples, a lei de Coulomb é usadapara gerar potenciais eletrostáticos como uma função da posição na proteí-na. Modalidades adicionais incluem o uso de escalonamento de Debye-Huckel levando em conta os efeitos da resistência iônica e modalidadesmais sofisticadas, tais como cálculos de Poisson-Boltzmann. Tais cálculoseletrostáticos podem realçar posições e sugerem modificações de aminoáci-do específicas para obter o objetivo do design. Em algumas modalidades,essas substituições podem ser previstas para afetar variavelmente a ligaçãode diferentes Iigantes de Fc, por exemplo, para intensificar a ligação a FcyRsde ativação, ao mesmo tempo em que diminui a afinidade de ligação aFcyRs inibitórios.

Anticorpos quiméricos de camundongo/ser humana foram des-critos. Veja, por exemplo, Morrison, S. L. e outros, PNAS 77: 6851-6854(1984); Publicação de Patente Européia Ne 173494; Boulianna, G. L, e ou-tros, Nature 312: 642 (1984); Neubeiger, M. S. e outros., Nature 314: 268(1985); Publicação de Patente Européia Nq 125023; Tan e outros, J. Immu-nol. 735: 8564 (1985); Sun, L. K e outros, Hybridoma 5(1): 517 (1986); Sa-hagan e outros, J. Immunol. 737: 1066-1074 (1986). Veja, de modo geral,Muron, Nature 372: 597 (1984); Dickson, Genetic Engineering News 5(3)(1985); Marx, Science 229: 455 (1985); e Morrison, Science 229: 1202-1207 (1985).

Em uma modalidade particularmente preferida, a ABM quiméricada presente invenção é um anticorpo humanizado. Métodos para humaniza-ção de anticorpos não-humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo,ABMs humanizadas da presente invenção podem ser preparadas de acordocom os métodos da Pat. U.S. N9 5.225.539 para Winter; Pat. U.S. N96.180.370 para Queen e outros; Pat. U.S. Ne 6.632.927 para Adair e outros;Pub. Ped. Pat. U.S. N9 2003/0039649 para Foote; Pub. Ped. Pat. U.S. N92004/0044187 para Sato e outros; ou Pub. Ped. Pat. U.S. N9 2005/0033028para Leung e outros, os conteúdos todos de cada um dos quais são aquiincorporados por referência. De preferência, um anticorpo humanizado temum ou mais resíduos de aminoácido introduzidos no mesmo a partir de umafonte a qual é não-humana. Esses resíduos de aminoácido não-humanossão freqüentemente referidos como resíduos "importados" os quais são, tipi-camente, tomados de um domínio variável "importado". Humanização podeser essencialmente realizada seguindo o método de Winter e outros (Jonese outros, Nature, 321: 522- 525 (1986); Riechmann e outros, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen e outros, Science, 239: 1534-1536 (1988)),substituindo-se seqüências de região hipervariável pelas seqüências corres-pondentes de um anticorpo humano. Conseqüentemente, tais anticorpos"humanizados" são anticorpos quiméricos (Pat. U.S. N9 4.816.567), em quesubstancialmente menos do que um domínio variável humano intacto foisubstituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana. Naprática, anticorpos humanizados são, tipicamente, anticorpos humanos nosquais alguns resíduos da região hipervariável e possivelmente alguns resí-duos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos deroedores. Os anticorpos humanizados em questão geralmente compreende-rão regiões constantes de imunoglobulinas humanas, tal como IgGI.

A escolha de domínios variáveis humanos, leves e pesados, aserem usados na fabricação dos anticorpos humanizados é muito importantepara reduzir a antigenicidade. De acordo com o assim denominado métodode "melhor-adaptação", a seqüência do domínio variável de um anticorpo deroedor é selecionada contra a biblioteca toda de seqüências de domínio va-riável humanas conhecidas. A seqüência humana a qual é mais próxima da-quela do roedor é, então, aceita como a região de armação humana (FR)para o anticorpo humanizado (Sims e outros, J. Immunol., 151: 2296 (1993);Chothia e outros, J. MoL Biol, 196: 901 (1987)). Outro método de seleção daseqüência de framework humana é_comparar a seqüência de cada sub-região individual da framework total de roedor (isto é, FR1, FR2, FR3 e FR4)ou alguma combinação das sub-regiões individuais (por exemplo, FR1 eFR2) contra uma biblioteca de seqüências de região variável humana co-nhecidas que correspondem àquela da sub-região de framework (por exem-plo, conforme determinado através da numeração de Kabat) e escolher aseqüência humana para cada sub-região ou combinação que é mais próximadaquela do roedor (Leung, Publicação de Pedido de Patente U.S. Ns2003/0040606 A1, publicada em 27 de Fev. de 2003) (os conteúdos todosda qual são aqui incorporados por referência). Outro método usa uma regiãode framework em particular derivada da seqüência de consenso de todos osanticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leve e pesada. Amesma framework pode ser usada para vários anticorpos humanizados dife-rentes (Carter e outros, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 89: 4285 (1992); Prestae outros, J. Immunol., 151: 2623 (1993)) (os conteúdos todos dos quais sãoaqui incorporados por referência).

É ainda importante que os anticorpos sejam humanizados comretenção de alta afinidade pelo antígeno e outras propriedades favoráveis.Para obter esse objetivo, de acordo com um método preferido, anticorposhumanizados são preparados através de um processo de análise das se-qüências parentais e seqüências humanizadas. Modelos de imunoglobulinatridimensionais podem ser gerados usando programas de computador fami-liares para aqueles versados na técnica (por exemplo, InsightH1 accelrys inc(primeiro MSI) ou em http://swissmodel.expasy.org/ descrito por Schwede eoutros., Nucleíc Acids Fies. 2003 (13): 3381-3385). Inspeção desses mode-los permite análise do provável papel dos resíduos no funcionamento da se-qüência de imunoglobulina candidato, isto é, a análise dos resíduos que in-fluenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar a seu antí-geno. Dessa forma, resíduos de FR podem ser selecionados e combinadosa partir de seqüências do recipiente e importadas, de modo que o anticorpocaracterístico desejado, tal como com afinidade mantida pelo(s) antígeno(s)alvo, seja(m) obtido(s). Em geral, os resíduos da região hipervariável estãodireta-e mais substancialmente envolvidos na influência sobre a ligação aoantígeno.

Em uma modalidade, as ABMs da presente invenção compreen-dem uma região Fc humana modificada. Em uma modalidade específica, aregião constante humana é IgGI, conforme apresentado em SEQ ID NOs: 1e 2 e apresentado abaixo:

Seqüência de nucleotídeo de região constante de IgGI humana(SEQ ID NO: 1)

ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCT ACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTG AACTCCTG GGG G G ACCGTC AGTCTTCCTCTTCCCCCC AAAACCC AAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA

Seqüência de aminoácido de região constante de IgGI humana

(SEQ ID NO: 2)

TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDLTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Contudo, variantes e isoformas da região Fc humana nativatambém são abrangidas pela presente invenção. Por exemplo, regiões Fcvariantes adequadas para uso na presente invenção podem ser produzidasde acordo com o método ensinado na Pat. U.S. N5 6,737,056 to Presta (vari-antes de região Fc com função efetora alterada em virtude de uma ou maismodificações de aminoácido); ou nos Pedidos de Pat. U.S. Nos. 60/439,498;60/456,041; 60/514,549; ou WO 2004/063351 (regiões Fc variantes com afi-nidade de ligação aumentada em virtude de modificação de aminoácido); ouna Pat. U.S. Ne 10/672,280 ou WO 2004/099249 (variantes de Fc com liga-ção alterada ao FcyR em virtude de modificação de aminoácido), os conteú-dos de cada um dos quais são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

Em outra modalidade, as moléculas de ligação a antígeno dapresente invenção são manipuladas para ter afinidade de ligação intensifica-da de acordo com, por exemplo, os métodos descritos na Pub. de Pedido dePat. U.S. Nq 2004/0132066 para Balint e outros, os conteúdos todo da qualsão aqui incorporados por referência.

Em uma modalidade, a molécula de ligação a antígeno da pre-sente invenção é conjugada a uma porção adicional, tal como um radiorrótu-lo ou uma toxina. Tais ABMs conjugadas podem ser produzidas através denumerosos métodos que são bem-conhecidos na técnica.

Uma variedade de radionuclídeos são aplicáveis à presente in-venção e aqueles versados na técnica são creditados com a capacidade dedeterminar prontamente qual radionuclídeo é mais apropriado sob uma vari-edade de circunstâncias. Por exemplo, 131 iodo é um radionuclídeo bem-conhecido para imunoterapia objetivada. Contudo, a utilidade clínica do131iodo pode serJimitada por vários fatores, incluindo: meia-vida física de oitodias; dealogenação do anticorpo iodinado no sangue e locais de tumor; eemissões características (por exemplo, grande componente gama), os quaispode ser subótimos para depósito dose-localizado no tumor. Com o adventode agentes de quelação superiores, a oportunidade para fixação de gruposde quelação de metal à proteínas tem aumentado as oportunidades de utili-zar outros radionuclídeos, tais como 111índio e 90Itrio. 90Itrio proporciona vá-rios benefícios para utilização em aplicações radioimunoterapêuticas: ameia-vida de 64 horas do 90Itrio é longa o bastante para permitir acúmulo deanticorpo pelo tumor e, diferente, por exemplo, do 131iodo, o 90Itrio é um betaemissor puro de alta energia, sem nenhuma irradiação gama associada emseu declínio, com uma faixa no tecido de 100 a 1000 diâmetros de células.

Além disso, a quantidade mínima de radiação penetrante permite a adminis-tração ambulatorial de anticorpos 90ítrio-rotulados. Adicionalmente, internali-zação de anticorpo rotulado não é requerida para morte celular e a emissãolocal de radiação ionizante será letal para células tumorígenas adjacentesque carecem do antígeno alvo.

Com relação a anticorpos radiorrotulados, terapia com os mes-mos pode também ocorrer usando um único tratamento de terapia ou usan-do múltiplos tratamentos. Em virtude do componente de radionuclídeo, é pre-ferido que, antes de tratamento, células tronco periféricas ("PSC") ou medulaóssea ("BM") sejam "coletadas" para pacientes que experimentam toxicidadepotencialmente fatal para a medula óssea resultante da radiação. BM e/ouPSC são coletadas usando técnicas padrão e, então, purgadas e congeladaspara possível reinfusão. Adicionalmente, é mais preferido que, antes de tra-tamento, um estudo de dosimetria diagnóstico usando um anticorpo diagnós-tico rotulado (por exemplo, usando 111Indio) seja conduzido sobre o paciente,a finalidade do qual é assegurar que o agente terapeuticamente rotulado(por exemplo, usando 90Itrio) não se tornou desnecessariamente "concentra-do" em qualquer órgão ou tecido normal.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção é dirigida aum polinucleotídeo isolado compreendendo uma seqüência que codifica umpoüpeptídeo .da invenção, A invenção é. ainda dirigida_a um ácido nucléicoisolado compreendendo uma seqüência pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%,96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma seqüência de nucleotídeo da inven-ção. Em outra modalidade, a invenção é dirigida a um ácido nucléico isoladocompreendendo uma seqüência que codifica um poüpeptídeo tendo umaseqüência de aminoácido pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%,98% ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácido da invenção. A inven-ção também abrange um ácido nucléico isolado compreendendo uma se-qüência que codifica um poüpeptídeo da invenção tendo uma ou mais substi-tuições conservativas de aminoácido.

Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida a um vetorde expressão e/ou uma célula hospedeira a qual compreende um ou maispolinucleotídeos isolados da presente invenção.

Geralmente, qualquer tipo de linhagem de célula cultivada podeser usada para expressar a ABM da presente invenção. Em uma modalidadepreferida, células HEK293-EBNA, células CHO, células BHK, células NSO,células SP2/0, células de mieloma YO, células de mieloma de camundongoP3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, outras célulasde mamífero, células de levedo, células de inseto ou células de planta sãousadas como a linhagem de célula de base para gerar as células hospedei-ras manipuladas da invenção.

A eficácia terapêutica das ABMs da presente invenção pode serintensificada-se as mesmas em uma célula hospedeira que ainda expressaum polinucleotídeo que codifica um poüpeptídeo tendo atividade de glicosiltransferase. Em uma modalidade preferida, o poüpeptídeo é selecionado dogrupo consistindo em: um polipeptídeo tendo atividade de β(1,4)-IV- acetilgli-cosaminil transferase III; um polipeptídeo tendo atividade de α-manosidase Ile um polipeptídeo tendo atividade de p-(1,4)-galactosil transferase. Em umamodalidade, a célula hospedeira expressa um polipeptídeo tendo atividadede β (1,4)-IV- acetilglicosaminil transferase III. Em outra modalidade, a célulahospedeira expressa um polipeptídeo tendo atividade de β (1,4)-IV- acetilgli-cosaminil transferase III, bem como um polipeptídeo tendo atividade de a-manosidaseJJ. Em ainda outra modalidade, a célula hospedeira expressa umpolipeptídeo tendo atividade de β (1,4)-IV- acetilglicosaminil transferase III,um polipeptídeo tendo atividade de α-manosidase Il e um polipeptídeo tendoatividade de p-(1,4)-galactosil transferase. O polipeptídeo será expresso emuma quantidade suficiente para modificar os oligossacarídeos na região Fcda ABM. Alternativamente, a célula hospedeira pode ser manipulada para terexpressão reduzida de uma glicosil transferase, tal como α (1,6)- fucosiltransferase. Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo tendo atividade deGnT-III é um polipeptídeo de fusão compreendendo o domínio de localizaçãode Golgi de um polipeptídeo residente no Golgi. Em outra modalidade prefe-rida, a expressão das ABMs da presente invenção em uma célula hospedei-ra que expressa um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo ativi-dade de GnT-III resulta em ABMs com afinidade de ligação aumentada aoreceptor de Fc e função efetora aumentada. Conseqüentemente, em umamodalidade, a presente invenção é dirigida a uma célula hospedeira com-preendendo (a) um ácido nucléico isolado compreendendo uma seqüênciaque codifica um polipeptídeo tendo atividade de GnT-lll; e (b) um polinucleo-tídeo isolado que codifica uma ABM da presente invenção, tal como um anti-corpo quimérico, primatizado ou humanizado. Em uma modalidade preferida,o polipeptídeo tendo atividade de GnT-III é um polipeptídeo de fusão com-preendendo o domínio catalítico de GnT-III e o domínio de localização noGolgi é o domínio de localização de manosidase II. Métodos para geraçãode tais polipeptídeos de fusão e uso dos mesmos para produzir anticorposcom funções efetoras aumentadas são descritos no Pedido de Pat. Provisó-rio U.S. Ne 60/495.142 e Pub. de Pedido U.S. N9 2004/0241817 A1, os con-teúdos todos de cada um dos quais são expressamente incorporados aquipor referência. Em uma modalidade particularmente preferida, o anticorpoquimérico compreende uma Fc humana. Em outra modalidade preferida, oanticorpo é primatizado ou humanizado.

Em uma modalidade alternativa, as ABMs da presente invençãopodem ser intensificadas através de produção das mesmas em uma célulahospedeira que tenha sido manipulada para ter atividade reduzida, inibida oueliminada de pelo menos uma fucosil transferase, tal como fucosil transfera-se com oc1,6-núcleo.

Em uma modalidade, um ou vários polinucleotídeos que codifi-cam uma ABM da presente invenção podem ser expressos sob o controle deum promotor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressãoregulada. Sistemas de expressão regulada adequados incluem, mas nãoestão limitados a, um sistema de expressão tetraciclina-regulado, um siste-ma de expressão induzível por ecdysona, um sistema de expressão Iac-acionado, um sistema de expressão glicocorticóide-induzível, um sistemapromotor temperatura-induzível e um sistema de expressão metalotioneínade metal-induzível. Se vários ácidos nucléicos diferentes que codificam umaABM da presente invenção estão compreendidos dentro do sistema de célu-la hospedeira, alguns deles podem ser expressos sob o controle de um pro-motor constitutivo, enquanto que outros são expressos sob o controle de umpromotor regulado. O nível máximo de expressão é considerado como sendoo maior nível possível de expressão de polipeptídeo estável que não tem umefeito adverso significativo sobre a taxa de crescimento celular e será deter-minado usando experimentação de rotina. Níveis de expressão são determi-nados através de métodos geralmente conhecidos na técnica, incluindo aná-lise de Western blot usando um anticorpo específico para a ABM ou um anti-corpo específico para uma tag peptídica fundida à ABM; e análise de Nor-thern blot. Em uma outra alternativa, o polinucleotídeo pode ser operativa-mente ligada a um gene repórter; os níveis de expressão de uma ABM dainvenção são determinados através de medição de um sinal correlacionadoao nível de expressão do gene repórter. O gene repórter pode ser transcritojunto com o(s) ácido(s) nucléico(s) que codifica(m) o referido polipeptídeo defusão como uma única molécula de mRNA; suas respectivas seqüências decodificação podem ser ligadas através de um sítio de entrada ribossômicainterno (IRES) ou através de um intensificador de tradução cap-inde-pendente (CITE). O gene repórter pode ser traduzido junto com pelo menosum ácido nucléico que codifica uma ABM quimérica, de modo que uma únicacadeia polipeptídica seja formada. Os ácidos nucléicos que codificam asABMs da presente invenção podem ser operativamente ligados a um generepórter sob o controle de um único promotor, de modo que o ácido nucléicoque codifica o polipeptídeo de fusão e o gene repórter sejam transcritos emuma molécula de RNA a qual é, alternativamente, dividida em duas molécu-las de RNA mensageiro (mRNA) separadas; um dos mRNAs resultantes étraduzido na referida proteína repórter e o outro é traduzido no referido poli-peptídeo de fusão.

Métodos os quais são bem-conhecidos por aqueles versados natécnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo aseqüência de codificação de uma ABM da invenção junto com sinais de con-trole de transcrição/tradução apropriados. Esses métodos incluem técnicasde DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genéti-ca/recombinação in vivo. Veja, por exemplo, as técnicas descritas em Mania-tis e outros, MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, ColdSpring Harbor Laboratory1 Ν. Y. (1989) e Ausubel e outros, CURRENT PRO-TOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates andWiley Interscience, N.Y (1989).

Uma variedade de sistemas de vetor de expressão-hospedeiropodem ser utilizados para expressar a seqüência das ABMs da presente in-venção. De preferência, células de mamífero são usadas como sistemas decélulas hospedeiras transfectadas com vetores de expressão de DNA decosmídeo ou DNA de plasmídeo recombinantes contendo a seqüência decodificação da proteína de interesse e a seqüência de codificação do poli-peptídeo de fusão. Mais preferivelmente, células CHO, células BHK, célulasNSO, células SP2/0, células de mieloma YO1 células de mieloma de camun-dongo Ρ3Χ63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, outrascélulas de mamífero, células de levedo, células de inseto ou células de plan-ta são usadas como o sistema de célula hospedeira. Alguns exemplos desistemas de expressão e métodos de seleção são descritos nas referênciasa seguir e referências nas mesmas: Borth e outros, Biotechnol Bioen. 71(4):266-73 (2000-2001), em Werner e outros, Arzneimittelforschung/Drug Res.48(8): 870-80 (1998), em Andersen e Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 73:117-123 (2002), em Chadd e_Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12: 188-194(2001) e em Giddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001). Em modali-dades alternativas, outros sistemas de célula hospedeira eucariota podemser usados, incluindo células de levedo transformadas com vetores de ex-pressão de levedo recombinantes contendo a seqüência de codificação deuma ABM da presente invenção, tal como os sistemas de expressão ensina-dos no Pedido de Pat. U.S. Ne 60/344.169 e WO 03/056914 (métodos paraprodução de glicoproteína semelhante a humana em uma célula hospedeiraeucariota não-humana) (os conteúdos de cada um dos quais são incorpora-dos por referência em sua totalidade); sistemas de células de inseto infecta-das com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, bacu-lovírus) contendo a seqüência de codificação de uma ABM quimérica da in-venção; sistemas de célula de planta infectada com vetores de expressão devírus recombinantes (por exemplo, vírus mosaico da couve-flor, CaMV; vírusmosaico de tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão deplasmídeo recombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti) contendo a seqüênciade codificação da ABM da invenção incluindo, mas não limitado a, sistemasde expressão ensinados na Pat. U.S. N2 6.815.184 (métodos para expressãoe secreção de polipeptídeos biologicamente ativos a partir de lentilha d'á-gua); WO 2004/057002 (produção de proteínas glicosiladas em células deplanta briófita através de introdução de um gene de glicosil transferase) eWO 2004/024927 (métodos de geração de proteína não-vegetal extracelularheteróloga em protoplasta de musgo); e Pedidos de Pat. U.S. Nos.60/365.769, 60/368.047 e WO 2003/078614 (processamento de glicoproteí-na em plantas transgênicas compreendendo uma enzima GnTIII de mamífe-ro funcional) (os conteúdos de cada um dos quais são aqui incorporados porreferência em sua totalidade); ou sistemas de células de animal infectadoscom vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, adenoví-rus, vírus da varíola), incluindo linhagens de células manipuladas para contermúltiplas cópias do DNA que codifica uma ABM quimérica da invenção, querestavelmente amplificadas (CHO/dhfr) ou instavelmente amplificadas emcromossomas double-minute (por exemplo, linhagens de células de murino).Em-uma modalidade, o vetor compreendendo o(s) polinucleotídeo(s) quecodifica(m) a ABM da invenção é policistrônico. Também, em uma modali-dade, a ABM discutida acima é um anticorpo ou um fragmento do mesmo.Em uma modalidade preferida, a ABM é um anticorpo humanizado.

Para os métodos da presente invenção, expressão estável é ge-ralmente preferida à expressão transitória porque ela obtém, tipicamente,resultados mais reproduzíveis e também é mais passível de produção emlarga escala, embora expressão transitória também seja abrangida pela in-venção. Ao invés de usar vetores de expressão os quais contêm origens vi-rais de replicação, células hospedeiras podem ser transformadas com osrespectivos ácidos nucléicos de codificação controlados por elementos decontrole de expressão apropriados (por exemplo, promotor, intensificador,seqüências, terminadores de transcrição, sítios de poliadenilação, etc.) e ummarcador selecionável. Após a introdução do DNA estranho, células manipu-ladas podem ser deixadas crescer durante 1-2 dias em um meio enriquecidoe, então, são trocadas para meio seletivo. O marcador selecionável no plas-mídeo recombinante confere resistência à seleção e permite seleção de cé-lulas as quais foram estavelmente integradas no plasmídeo em seus cro-mossomas e crescer para formar focos os quais, por sua vez, podem serclonados e expandidos em linhagens de células.

Uma série de sistemas de seleção podem ser usados incluindo,mas não limitado a, os genes de quínase de timidina do vírus do herpessímplex (Wigler e outros, Cell 11: 223 (1977)), fosforibosil transferase de hi-poxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:2026 (1962)) e fosforibosil transferase de adenina (Lowy e outros, Cell 22:817 (1980)), os quais podem ser empregados em células tk-, hgprt- ou aprt-,respectivamente. Também, resistência anti-metabólito pode ser usada comoa base de seleção para os genes de dhfr, o qual confere resistência ao me-totrexato (Wigler e outros, Nati Acad. Sei. USA 77: 3567 (1989); O1Hare eoutros, Proc. Nati Acad. Sei. USA 78: 1527 (1981)); gpt, o qual confere re-sistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA78: 2072 (1981)); neo, o qual confere resistência ao aminoglicosídeo G-418(Colberre-Garapin e outros, J. Moi Bioi 150: 1 (1981)); e hygro, o qual confe-re resistência à higromicina (Santerre e outros, Gene 30: 147 (1984). Genesselecionáveis adicionais foram descritos, isto é, trpB, o qual permite que ascélulas utilizem indola em lugar de triptofano; hisD, o qual permite que ascélulas utilizem histinol em lugar de histidina (Hartman & Mulligan, Proc. Na-tl. Acad. Sei. USA 55: 8047 (1988)); o sistema de sintase de glutamina; eODC (decarboxilase de ornitina), o qual confere resistência ao inibidor dedecarboxilase de ornitina, 2-(difluorometil)-DL- ornitina, DFMO (McConlogue,em: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Labo-ratory ed. (1987)).

A presente invenção é ainda dirigida a um método para modifi-cação do perfil de glicosilação das ABMs da presente invenção que são pro-duzidas por uma célula hospedeira compreendendo expressão, na referidacélula hospedeira, de um ácido nucléico que codifica uma ABM da invençãoe um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo com atividade de glicosil-transferase ou um vetor compreendendo tais ácidos nucléicos. Em uma mo-dalidade preferida, o polipeptídeo é selecionado do grupo consistindo em:um polipeptídeo tendo atividade de β(1,4)-N-acetilglicosaminil transferase III;um polipeptídeo tendo atividade de α-manosidase Il e um polipeptídeo tendoatividade de p-(1,4)-galactosil transferase. Em uma modalidade, a célulahospedeira expressa um polipeptídeo tendo atividade de β(1,4)-N-acetil-glicosaminil transferase III. Em outra modalidade, a célula hospedeira ex-pressa um polipeptídeo tendo atividade de p(1,4)-N-acetilglicosaminil trans-ferase III, bem como um polipeptídeo tendo atividade de α-manosidase II.Em ainda outra modalidade, a célula hospedeira expressa expresses umpolipeptídeo tendo atividade de p(1,4)-N-acetilglicosaminil transferase III, umpolipeptídeo tendo atividade de α-manosidase Il e um polipeptídeo tendoatividade de p-(1,4)-galactosil transferase. De preferência, o polipeptídeomodificado é IgG ou um fragmento da mesma compreendendo a região Fc.

Em uma modalidade particularmente preferida, a ABM é um anticorpo hu-manizado ou um fragmento do mesmo. Alternativamente ou além disso, taiscélulas hospedeiras podem ser manipuladas para ter atividade reduzida, ini-bida ou^eliminada de pelojTienos_uma fucosil transferase. Em outra modali-dade, a célula hospedeira é manipulada para co-expressar uma ABM da in-venção, GnT-III e manosidase Il (Manll).

As ABMs modificadas produzidas pelas células hospedeiras dainvenção exibem afinidade de ligação ao receptor de Fc aumentada e/oufunção efetora aumentada como um resultado da modificação. Em uma mo-dalidade particularmente preferida, a ABM é um anticorpo humanizado ouum fragmento do mesmo contendo a região Fe. De preferência, a afinidadede ligação pelo receptor de Fc aumentada é ligação aumentada a um recep-tor de ativação de Fcy, tal como o receptor FcyRII Ia. A função efetora au-mentada é, de preferência, um aumento em um ou mais dos seguintes: cito-toxicidade celular anticorpo-dependente aumentada, fagocitose celular anti-corpo-dependente (ADCP) aumentada, secreção de citocina aumentada,captação de antígeno complexo imune-mediada aumentada por células queapresentam antígeno, citotoxicidade celular Fc-mediada aumentada, ligaçãoaumentada à células NK, ligação aumentada a macrófagos, ligação aumen-tada à células polimorfonucleares (PMNs), ligação aumentada a monócitos,ligação reticulada aumentada a anticorpos alvo-ligados, sinalização diretaaumentada de indução à apoptose, maturação aumentada de células dendrí-ticas ou produção aumentada de células T.

A presente invenção também é dirigida a um método para pro-dução de uma ABM da presente invenção tendo oligossacarídeos modifica-dos em uma célula hospedeira compreendendo (a) cultura de uma célulahospedeira manipulada para expressar pelo menos um ácido nucléico quecodifica um polipeptídeo tendo atividade de glicosil transferase sob condi-ções as quais permitem a produção de uma ABM de acordo com a presenteinvenção, em que o referido polipeptídeo tendo atividade de glicosil transfe-rase é expresso em uma quantidade suficiente para modificar os oligossaca-rídeos na região Fc da referida ABM produzida pela referida célula hospedei-ra; e (b) isolamento da referida ABM. Em uma modalidade preferida, o poli-peptídeo é selecionado do grupo consistindo em: um polipeptídeo tendo ati-vidade de β (1,4)-N-acetilglicosaminil transferase III; um polipeptídeo tendoatividade de α-manosidase Il e um polipeptídeo tendo atividade de β-(1,4)-galactosil transferase. Em uma modalidade, a célula hospedeira expressaum polipeptídeo tendo atividade de P(1,4)-N-acetilglicosaminil transferase III.Em outra modalidade, a célula hospedeira expressa um polipeptídeo tendoatividade de P(1,4)-N-acetilglicosaminil transferase III, bem como um poli-peptídeo tendo atividade de α-manosidase II. Em ainda outra modalidade, acélula hospedeira expressa expresses um polipeptídeo tendo atividade deβ(1,4)-Ν-3θβ%Ιΐοο53ΐηϊηΗ transferase III, um polipeptídeo tendo atividade deα-manosidase Il e um polipeptídeo tendo atividade de p-(1,4)-galactosiltransferase. Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo tendo atividade deGnT-III é um polipeptídeo de fusão compreendendo o domínio catalítico deGnT-lll. Em uma modalidade particularmente preferida, o polipeptídeo defusão ainda compreende o domínio de localização no Golgi de um polipeptí-deo residente no Golgi.

De preferência, o domínio de localização no Golgi é o domíniode localização de manosidase Il or GnT-I. Alternativamente, o domínio delocalização no Golgi é selecionado do grupo consistindo em: o domínio delocalização de manosidase I, o domínio de localização de GnT-II e o domíniode localização de uma fucosil transferase com oc1,6-núcleo. As ABMs produ-zidas através dos métodos da presente invenção têm afinidade de ligaçãoaumentada pelo receptor de Fc e/ou função efetora aumentada. De prefe-rência, a função efetora aumentada é uma ou mais das seguintes: citotoxici-dade celular Fc-mediada aumentada (incluindo citotoxicidade celular anticor-po-dependente aumentada), fagocitose celular anticorpo-dependente au-mentada (ADCP), secreção de citocina aumentada, captação de antígenocomplexo imune-mediada aumentada por células que apresentam antígeno,ligação aumentada à células NK1 ligação aumentada a macrófagos, ligaçãoaumentada a monócitos, ligação aumentada à células polimorfonucleares,sinalização direta aumentada que induz à apoptose, ligação reticulada au-mentada a anticorpos alvo-ligados, maturação aumentada de células dendrí-ticas ou produção aumentada de células Τ. A afinidade de ligação aumenta-da pelo receptor de Fc é, de preferência, ligação aumentada a receptores deativação de Fc1 tal como FcTRIlIa. Em uma modalidade particularmente pre-ferida, a ABM é um anticorpo humanizado ou um fragmento do mesmo.

Em outra modalidade, a presente invenção é dirigida a uma ABMquimérica tendo uma região Fc modificada e a qual tem uma proporção au-mentada de oligossacarídeos bissecionados na região Fc do referido poli-peptídeo. Considera-se que tal ABM abrange anticorpos e fragmentos dosmesmos compreendendo a região Fe. Em uma modalidade preferida, a ABMé um anticorpo humanizado. Em uma modalidade, o percentual de oligossa-carídeos bissecionados na região Fc da ABM é pelo menos 50%, mais prefe-rivelmente pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo me-nos 90% e, ainda mais preferivelmente, pelo menos 90-95% dos oligossaca-rídeos totais. Em ainda outra modalidade, a ABM produzida pelos métodosda invenção tem uma proporção aumentada de oligossacarídeos não fucosi-Iados na região Fc como um resultado da modificação de seus oligossacarí-deos através dos métodos da presente invenção. Em uma modalidade, opercentual de oligossacarídeos não fucosilados é pelo menos 50%, de prefe-rência pelo menos 60% a 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%. Osoligossacarídeos não fucosilados podem ser do tipo híbrido ou complexo.Em uma modalidade particularmente preferida, a ABM produzida pelas célu-las hospedeiras e métodos da invenção tem uma proporção aumentada deoligossacarídeos bissecionados não fucosilados na região Fe. Os oligossa-carídeos não fucosilados bissecionados podem ser híbridos ou em comple-xo. Especificamente, os métodos da presente invenção podem ser usadospara produzir ABMs nas quais pelo menos 15%, mais preferivelmente pelomenos 20%, mais preferivelmente pelo menos 25%, molécula pelo menos30%, mais preferivelmente pelo menos 35% dos oligossacarídeos na regiãoFc da ABM são bissecionados, não fucosilados. Os métodos da presenteinvenção também podem ser usados para produzir polipeptídeos nos quaispelo menos 15%, mais preferivelmente pelo menos 20%, mais preferivel-mente pelo menos 25%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais prefe-rivelmente pelo menos 35% dos oligossacarídeos na região Fc da ABM sãobissecionados, não fucosilados. Os métodos da presente invenção tambémpodem ser usados para produzir poJipeptídeos nos quais pelo menos 15%,mais preferivelmente pelo menos 20%, mais preferivelmente pelo menos25%, mais preferivelmente pelo menos 30%, mais preferivelmente pelo me-nos 35% dos oligossacarídeos na região Fc do polipeptídeo são bisseciona-dos híbridos não fucosilados.

Em outra modalidade a presente invenção é dirigida a uma ABMtora aumentada e/ou afinidade aumentada de ligação a um receptor de Fcproduzida por meio dos métodos da invenção. De preferência, a função efe-tora aumentada é uma ou mais das seguintes: citotoxicidade celular Fc-mediada aumentada (incluindo citotoxicidade celular anticorpo-dependenteaumentada), fagocitose celular anticorpo-dependente aumentada (ADCP),secreção de citocina aumentada, captação de antígeno complexo imune-mediada aumentada por células que apresentam antígeno, ligação aumen-tada à células NK1 ligação aumentada a macrófagos, ligação aumentada amonócitos, ligação aumentada à células polimorfonucleares, sinalização di-reta aumentada que induz à apoptose, ligação reticulada aumentada a anti-corpos alvo-ligados, maturação aumentada de células dendríticas ou produ-ção aumentada de células T. Em uma modalidade preferida, a afinidade deligação aumentada pelo receptor de Fc é ligação aumentada a um receptorde ativação de Fc, mais preferivelmente FcyRIIIa. Em uma modalidade, aABM é um anticorpo, um fragmento de anticorpo contendo a região Fc ouuma proteína de fusão que inclui uma região equivalente à região Fc de umaimunoglobulina. Em uma modalidade particularmente preferida, a ABM é umanticorpo humanizado.A presente invenção é ainda dirigida a composições farmacêuti-cas compreendendo as ABMs da presente invenção e um veículo farmaceu-ticamente aceitável.

A presente invenção é ainda dirigida ao uso de tais composiçõesfarmacêuticas no método de tratamento de câncer. Especificamente, a pre-sente invenção é dirigida a um método para o tratamento ou profilaxia decâncer compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamenteeficaz da composição farmacêutica da invenção.

A presente invenção é ainda dirigida ao uso de tais composiçõesfarmacêuticas no método de tratamento de uma condição ou lesão pré-cancerígena. Especificamente, a presente invenção é dirigida a um métodopara o tratamento ou profilaxia de uma condição ou lesão pré-cancerígenacompreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficazda composição farmacêutica da invenção.

A presente invenção ainda proporciona métodos para a geraçãoe uso de sistemas de célula hospedeira para a produção de glicoformas dasABMs da presente invenção tendo afinidade de ligação aumentada pelo re-ceptor de Fc1 de preferência ligação aumentada a receptores de ativação deFc e/ou tendo funções efetoras aumentadas, incluindo citotoxicidade celularanticorpo-dependente. A metodologia de glicomanipulação que pode ser u-sada com as ABMs da presente invenção foi descrita em maiores detalhesna Pat. U.S. Ns 6.602.684, Pub. de Pedido de Pat. U.S. N9 2004/0241817A1, Pub. de Pedido de Pat. U.S. N2 2003/0175884 A1, Pedido de PatenteProvisório U.S. Ne 60/441.307 e WO 2004/065540, os conteúdos inteiros decada um dos quais são incorporados aqui por referência em sua totalidade.

As ABMs da presente invenção podem, alternativamente, ser glicomanipula-das para ter resíduos de fucose reduzidos na região Fc de acordo com astécnicas descritas na Publ. De Pedido de Pat. U.S. N9 2003/0157108 (Ge-nentech) ou no EP 1 176 195 A1, WO 03/084570, WO 03/085119 e Pub. dePedido de Pat. U.S. Nos. 2003/0115614, 2004/093621, 2004/110282,2004/110704, 2004/132140 (todos para a Kyowa Hakko Kogyo Ltda.). Osconteúdos de cada um desses documentos são aqui incorporados por refe-rência em sua totalidade. ABMs glicomanipuladas da invenção também po-dem ser produzidos em sistemas de expressão que produzem glicoproteínasmodificadas, tal como ensinado na Pub. de Pedido de Pat. U.S. Ns60/344.169 e WO 03/056914 (GlycoFi, Inc.) ou no WO 2004/057002 e WO2004/024927 (Greenovation), os conteúdos de cada um dos quais são aquiincorporados por referência em sua totalidade.

Geração de linhagens de célula para a produção de proteínas com padrãode glicosilação alterado

A presente invenção proporciona sistemas de expressão de cé-lula hospedeira para geração das ABMs da presente invenção tendo regiõesFc modificadas e padrões de glicosilação de Fc modificados. Em particular, apresente invenção proporciona sistemas de célula hospedeira para a gera-ção de glicoformas das ABMs da presente invenção tendo um valor terapêu-tico aperfeiçoado. Portanto, a invenção proporciona sistemas de expressãode célula hospedeira selecionados ou manipulados para expressar um poli-peptídeo tendo atividade de GnT-lll. Em uma modalidade, o polipeptídeotendo atividade de GnT-III é um polipeptídeo de fusão compreendendo odomínio de localização no Golgi de um polipeptídeo residente no Golgi hete-rólogo. Especificamente, tais sistemas de expressão de célula hospedeirapodem ser manipulados para compreender uma molécula de ácido nucléicorecombinante que codifica um polipeptídeo tendo atividade de GnT-III opera-tivamente ligado a um sistema promotor regulado ou constitutivo.

Em uma modalidade específica, a presente invenção proporcio-na uma célula hospedeira que tenha sido manipulada para expressar pelomenos um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de fusão tendo ativi-dade de GnT-III e compreendendo o domínio de localização no Golgi de umpolipeptídeo residente no Golgi heterólogo. Em um aspecto, a célula hospe-deira é manipulada com uma molécula de ácido nucléico compreendendopelo menos um gene que codifica um polipeptídeo de fusão tendo atividadede GnT-III e compreendendo o domínio de localização no Golgi de um poli-peptídeo residente no Golgi heterólogo.

Geralmente, qualquer tipo de linhagem de célula cultivada, inclu-indo as linhagens de célula discutidas acima, pode ser usado como uma ba-se para manipular as linhagens de célula hospedeira da presente invenção.Em uma modalidade preferida, células CHO1 célula BHK1 células NSO1 célu-las SP2/0, células de mieloma YO1 células de mieloma de camundongoP3X63, células PER, células PER.C6 ou células de hibridoma, outras célulasde mamífero, células de levedo, células de inseto ou células de planta sãousadas como a linhagem de célula de base para gerar as células hospedei-ras-manipuladas da invenção.

Considera-se que a invenção abranja quaisquer células hospe-deiras manipuladas expressando um polipeptídeo tendo atividade de GnT-lll,incluindo um polipeptídeo de fusão que compreende o domínio de localiza-ção no Golgi de um polipeptídeo residente no Golgi heterólogo conformedefinido aqui.

Um ou vários ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeotendo atividade de GnT-III podem ser expressos sob o controle de um pro-motor constitutivo ou, alternativamente, um sistema de expressão regulado.

Tais sistemas são bem-conhecidos na técnica e incluem os sistemas discuti-dos acima. Se vários ácidos nucléicos diferentes que codificam polipeptídeosde fusão tendo atividade de GnT-III e compreendendo o domínio de Iocaliza-ção no Golgi de um polipeptídeo residente no Golgi heterólogo estão com-preendidos dentro do sistema da célula hospedeira, alguns deles podem serexpressos sob o controle de um promotor constitutivo, enquanto que outrossão expressos sob o controle de um promotor regulado. Níveis de expressãodos polipeptídeos de fusão tendo atividade de GnT-III são determinados a-través de métodos geralmente conhecidos na técnica, incluindo análise deWestern blot, análise de Northern blot, análise de expressão de gene repór-ter ou medição de atividade de GnT-lll. Alternativamente, uma Iecitina podeser empregada, a qual se liga a produtos biossintéticos da GnT-lll, por e-xemplo, Iecitina E4-PHA. Alternativamente, um ensaio funcional o qual medea ligação aumentada ao receptor de Fc ou função efetora mediada por anti-corpos produzidos pelas células manipuladas com o ácido nuciéico que codi-fica um polipeptídeo com atividade de GnT-III pode ser usado.Identificação de transfectantes ou transformantes que expressam a proteínatendo um padrão de qlicosilacão modificado

As células hospedeiras as quais contêm a seqüência de codifi-cação de uma ABM quimérica e as quais expressam os produtos genéticosbiologicamente ativos podem ser identificadas através de pelo menos quatroabordagens gerais: (a) hibridização de DNA-DNA ou DNA-RNA; (b) a pre-sença ou ausência de funções de gene "marcador"; (c) avaliação do nível detranscrição, conforme medido pela expressão dos respectivos transcritos demRNA na célula hospedeira; e (d) detecção do produto genético, conformemedido através de imunoensaio ou por sua atividade biológica.

Na primeira abordagem, a presença da seqüência de codificaçãode uma ABM quimérica da invenção e da seqüência de codificação do poli-peptídeo tendo atividade de GnT-III pode ser detectada através de hibridiza-ção de DNA-DNA ou DNA-RNA usando sondas compreendendo seqüênciasde nucleotídeo que são homólogas às respectivas seqüências de codifica-ção, respectivamente, ou porções ou derivados das mesmas.

Na segunda abordagem, o vetor de expressão/sistema hospe-deiro recombinante pode ser identificado e selecionado baseado na presen-ça ou ausência de determinadas funções de gene "marcador" (por exemplo,atividade de quínase de timidina, resistência a antibióticos, resistência aometotrexato, fenotipo de transformação, formação de corpo de oclusão embaculovírus, etc.). Por exemplo se a seqüência de codificação da ABM dainvenção ou um fragmento da mesma e a seqüência de codificação do poli-peptídeo tendo atividade de GnT-III são inseridas dentro de uma seqüênciade gene marcador do vetor, recombinantes contendo as respectivas seqüên-cias de codificação podem ser identificados pela ausência da função do ge-ne marcador. Alternativamente, um gene marcador pode ser colocado alea-toriamente com as seqüências de codificação sob o controle do mesmo oude um promotor diferente usado para controlar a expressão das seqüênciasde codificação. Expressão do marcador em resposta à indução ou seleçãoindica expressão da seqüência de codificação da ABM da invenção e da se-qüência do polipeptídeo tendo atividade de GnT-lll.Na terceira abordagem, a atividade transcricional para a regiãode codificação da GnT-III da invenção ou um fragmento da mesma e a se-qüência de codificação do polipeptídeo tendo atividade de GnT-III pode seravaliada através de ensaios de hibridização. Por exemplo, RNA pode serisolado e analisado através de Northern blot usando uma sonda homólogaàs seqüências de codificação da ABM da invenção ou um fragmento damesma e à seqüência de codificação do polipeptídeo tendo atividade deGnTdlLau-porções particulares da mesma. Alternativamente, ácidos nucléi-cos totais da célula hospedeira podem ser extraídos e ensaiados para hibri-dização de tais sondas.

Na quarta abordagem, a expressão dos produtos de proteínapode ser avaliada imunologicamente, por exemplo, através de Western blots,imunoensaios tais como radioimuno-precipitação, imunoensaios enzima-Iigados e similares. O teste final do sucesso do sistema de expressão, con-tudo, envolve a detecção dos produtos genéticos biologicamente ativos.

Geração e uso de ABMs tendo função efetora aumentada, incluindo citotoxi-cidade celular anticorpo-dependente

Em modalidades preferidas, a presente invenção proporcionaglicoformas de ABMs quiméricas tendo regiões Fc modificadas e tendo fun-ção efetora aumentada, incluindo citotoxicidade celular anticorpo-depen-dente. Manipulação de glicosilação de anticorpos foi anteriormente descrita.Veja, por exemplo, Patente U.S. Nq 6.602.684, incorporada aqui por referên-cia em sua totalidade.

Experimentos clínicos de anticorpos monoclonais conjugados(mAbs) para o tratamento de alguns tipos de câncer têm proporcionado re-centemente resultados encorajadores. Dillman, Câncer Biother. & Radio-pharm. 12: 223-25 (1997); Deo e outros, Immunology Today 18: 121 (1997).Uma IgGI não conjugada quimérica foi aprovada para Iinfoma não-Hodgkinde células B de baixo grau ou folicular. Dillman, Câncer Biother. & Radio-pharm. 12: 223-25 (1997), enquanto que outro mAb não conjugado, umaIgGI humanizada que objetiva tumores de mama sólidos, também tem mos-trado resultados promissores em experimentos clínicos de fase III. Deo eoutros, Immunology Today 18: 121 (1997). Os antígenos desses dois mAbssão altamente expressos em suas respectivas células tumorígenas e os an-ticorpos mediam destruição potente de tumor por células efetoras in vitro e invivo. Em contraste, muitos outros mAbs não conjugados com especificidadesde tumor finas não podem disparar funções efetoras de potência suficientepara serem clinicamente úteis. Frost e outros, Câncer 80: 311-33 (1997);Surfus e outros, J. Immunother. 79: 184-91 (1996). Para alguns dessesmAbs mais fracos, terapia adjunta com citocina está sendo atualmente tes-tada. A adição de citocinas pode estimular citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC) através de aumento da atividade e do número de linfó-citos em circulação. Frost e outros, Câncer 80: 311-33 (1997); Surfus e ou-tros, J. Immunother. 19: 184-91 (1996). ADCC, um ataque lítico sobre célu-las anticorpo-objetivadas, é disparada quando de ligação de receptores deleucócitos à região constante (Fc) de anticorpos. Deo e outros, ImmunologyToday 18: 121 (1997).

Uma abordagem diferente, mas complementar, para aumentar aatividade de ADCC de IgGIs não conjugadas é manipular a região Fc doanticorpo. Estudos de manipulação de proteína têm mostrado que FctRsinteragem principalmente com a região de dobradiça da molécula de IgG.Lund e outros, J. Immunol. 157: 4963-69 (1996). Contudo, ligação ao FcyRtambém requer a presença de oligossacarídeos covalentemente presos àAsn 297 conservada na região CH2. Lund e outros, J. Immunol. 157: 4963-69 (1996); Wright e Morrison, Trends Biotech. 15: 26-31 (1997), sugerindoque oligossacarídeo e polipeptídeo contribuem ambos diretamente para osítio de interação ou que o oligossacarídeo é requerido para manter umaconformação polipeptídica de CH2 ativa. Modificação da estrutura principaldo oligossacarídeo pode, portanto, ser explorada como um meio para au-mentar a afinidade da interação.

Uma molécula de IgG traz dois oligossacarídeos N-Iigados emsua região Fc, um sobre cada cadeia pesada. Como qualquer glicoproteína,um anticorpo é produzido como uma população de glicoformas as quaiscompartilham a mesma parte principal polipeptídica, mas têm diferentes oli-gossacarídeos presos aos sítios de glicosilação. Os oligossacarídeos nor-malmente encontrados na região Fc de IgG no soro são do tipo biantenáriocomplexo (Wormald e outros, Biochemistry 36: 130-38 (1997), com um baixonível de ácido siálico terminal e N-acetilglicosamina de bissecção (GIcNAc) eum grau variável de galactosilação terminal e fucosilação de núcleo. Algunsestudos sugerem que a estrutura principal de carboidrato mínima requeridapara ligação ao FcyR repousa dentro do núcleo de oligossacarídeo. Lund eoutros, J. Immunol. 157: 4963-69 (1996).

As linhagens de células derivadas de camundongo ou hâmsterusadas na indústria e academia para a produção de mAbs terapêuticos nãoconjugados normalmente atacam os determinantes de oligossacarídeo re-queridos aos sítios de Fe. IgGs expressas nessas linhagens de células, con-tudo, carecem da GIcNAc de bissecção encontrada em baixas quantidadesnas IgGs no soro. Lifely e outros, Glycobiology 318: 813-22 (1995). Em con-traste, foi observado que uma IgGI humanizada mieloma de rato-produzida(CAMPATH-1H) trazia uma GIcNAc de bissecção em algumas de suas glico-formas. Lifely e outros, Glycobiology 318: 813-22 (1995). O anticorpo deriva-do de célula de rato atingiu uma atividade de ADCC máxima in vitro similaraos anticorpos CAMPATH-1 H produzidos em linhagens de célula padrão,mas em concentrações significativamente menores de anticorpo.

O antígeno ao CAMPATH-1 H normalmente está presente emaltos níveis sobre células de Iinfoma e esse mAb quimérico tem alta ativida-de de ADCC na ausência de uma GIcNAc de bissecção. Lifely e outros, Gly-cobiology 318: 813-22 (1995). Na via de glicosilação N-ligada, uma GIcNAcde bissecção é adicionada pela GnT-lll. Schachter, Biochem. Cell Bioi 64:163-81 (1986).

Estudos anteriores usavam uma única linhagem de célula CHOque produz anticorpo, que foi previamente manipulada para expressar, deum modo externamente-regulado, diferentes níveis de uma enzima do genede GnT-III clonada (Umana, P. e outros, Nature Biotechnol. 77: 176-180(1999)). Essa abordagem estabeleceu, pela primeira vez, uma correlaçãoentre expressão de GnT-III e a atividade de ADCC do anticorpo modificado.Assim, a invenção considera um ABM recombinante, quimérica ou humani-zada (por exemplo, anticorpo) ou um fragmento do mesmo tendo uma regiãoFc modificada de uma ou mais modificações de aminoácido e tendo glicosi-lação alterada resultante de atividade de GnT-III aumentada. A atividade deGnT-III aumentada resulta em um aumento no percentual de oligossacarí-deos bissecionados, bem como uma diminuição no percentual de resíduosde fucose na região Fc da ABM. Esse anticorpo ou fragmento dà mesma temafinidade de ligação aumentada pelo receptor de Fc e função efetora aumen-tada. Além disso, a invenção é dirigida a fragmentos de anticorpo e proteí-nas de fusão compreendendo uma região que é equivalente à região Fc deimunoglobulinas.

Aplicações terapêuticas de ABMs produzidas de acordo com os métodos dainvenção

No sentido mais amplo, as ABMs da presente invenção podemser usadas para objetivar células in vivo ou in vitro que expressam um antí-geno desejado. As células expressando o antígeno desejado podem ser ob-jetivadas para fins diagnósticos ou terapêuticos. Em um aspecto, as ABMsda presente invenção podem ser usadas para detectar a presença do antí-geno em uma amostra. Em outro aspecto, as ABMs da presente invençãopodem ser usadas para se ligar à células expressando antígeno in vitro ou invivo, por exemplo, para identificação ou objetivação. Mais particularmente,as ABMs da presente invenção podem ser usadas para bloquear ou inibir aligação a antígeno de um Iigante antigênico ou, alternativamente, objetivaruma célula que expressa antígeno para destruição.

As ABMs da presente invenção podem ser usadas sozinhas pa-ra objetivar e matar células tumorígenas in vivo. As ABMs também podemser usadas em conjunto com um agente terapêutico apropriado para tratarcarcinoma humano. Por exemplo, as ABMs podem ser usadas em combina-ção com métodos de tratamento convencionais ou padrão, tais como quimio-terapia, terapia de radiação ou podem ser conjugadas ou ligadas a um fár-maco terapêutico ou toxina, bem como a uma Iinfocina ou um fator de cres-cimento inibitório de tumor para distribuição do agente terapêutico ao localdo carcinoma. Os conjugados das ABMs da presente invenção que são deimportância principal são (1) imunotoxinas (conjugados da ABM e uma por-ção citotóxica) e (2) ABMs rotuladas (por exemplo, radiorrotuladas, enzima-rotuladas ou fluorocromo-rotuladas) nas quais o rótulo proporciona um meiopara identificação de complexos imunes que incluem a ABM rotulada. AABMs podem também ser usadas para induzir à Iise através do processo decomplemento natural e interagir com células citotóxicas anticorpo-depen-dente normalmente presentes.

A porção citotóxica da imunotoxina pode ser um fármaco citotó-xico ou uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana ou vegetalou um fragmento enzimaticamente ativo ("cadeia A") de tal toxina. Toxinasenzimaticamente ativas e fragmentos das mesmas usadas são cadeia A dedifteria, fragmentos ativos de não ligação de toxina de difteria, cadeia A deexotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A deabrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, pro-teínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, croitina, inibidor de Sapaonariaofficinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina e enomicina. Emoutra modalidade, as ABMs são conjugadas a fármacos anticâncer de pe-quena molécula. Conjugados da ABM e tais porções citotóxicas são feitosusando uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais.Exemplos de tais reagentes são SPDP1 IT, derivados bifuncionais de imido-ésteres, tal como HCI de adipimidato de dimetila, ésteres ativos, tal comosuberato de dissuccinimidila, aldeídos, tal como glutaraldeído, compostos debis-azido, tal como (p-azidobenzoil) hexanodiamina, derivados de bis-diazô-nio, tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina, diisocianatos, tal como2,6-diisocianato de tolileno e compostos de flúor bis-ativos, tal como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno. A porção de Iise de uma toxina pode ser unida aofragmento Fab das ABMs. Toxinas apropriadas adicionais são conhecidasna técnica, conforme evidenciado, por exemplo, no Pedido de Patente U.S.publicado Nq 2002/0128448, incorporado aqui por referência em sua totali-dade.Em uma modalidade, uma ABM glicomanipulada quimérica dainvenção é conjugada à cadeia A de ricina. Mais vantajosamente, a cadeia Ade ricina é desglicosilada e produzida através de meios recombinantes. Ummétodo vantajoso de fabricação da imunotoxina de ricina é descrito em Vitet-5ta e outros, Science 235: 1098 (1987), aqui incorporado por referência.

Quando usadas para matar células cancerígenas humanas invitro para fins diagnósticos, os conjugados serão, tipicamente, adicionadosao meio de cultura de célula em uma concentração de pelo menos cerca de10 nM. A formulação e modo de administração para uso in vitro não são crí-ticos. Formulações aquosas que são compatíveis com o meio de cultura ouperfusão normalmente serão usadas. Citotoxicidade pode ser lida através detécnicas convencionais para determinar a presença ou grau de câncer.

Conforme discutido acima, um produto radiofarmacêutico citotó-xico para tratamento de câncer pode ser feito através de conjugação de umisótopo radioativo (por exemplo, I, Y1 Pr) a uma ABM glicomanipulada quimé-rica. O termo "porção citotóxica", conforme usado aqui, se destina a incluirtais isótopos.

Em outra modalidade, Iipossomas são enchidos com um fárma-co citotóxico e os Iipossomas são revestidos com as ABMs da presente in-venção.

Técnicas para conjugação de tais agentes terapêuticos a anti-corpos são bem-conhecidos (veja, por exemplo, Arnon e outros, "MonoclonalAntibodies for Immunotargeting of Drugs in Câncer Therapy", em MonoclonalAntibodies-and Câncer Therapy, Reisfeld e outros (eds.), páginas 243 56(Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom e outros, "Antibodies For Drug Delivery",em Controlled Drug Delivery (2- Ed.), Robinson e outros (eds.), páginas 62353 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic A-gents in Câncer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biologi-cal and Clinicai Applications, Pinchera e outros, (eds.), páginas 475-506(1985); e Thorpe e outros, "The Preparation and Cytotoxic Properties Of An-tibody Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62: 119 58 (1982)).

Ainda outras aplicações terapêuticas para as ABMs da invençãoincluem conjugação ou ligação, por exemplo, através de técnicas de DNArecombinante, a uma enzima capaz de conversão de um pró-fármaco em umfármaco citotóxico e o uso desse conjugado de enzima-anticorpo em combi-nação com o pró-fármaco para converter o pró-fármaco em um agente cito-tóxico no local do tumor (veja, por exemplo, Senter e outros, Proc. Natl. A-cad. Sei. USA 55: 4842-46 (1988); Senter e outros, Câncer Research 49:5789-5792 (1989); e Senter, FASEB J. 4: 188 193 (1990)).

Ainda outro uso terapêutico para as ABMs da invenção envolveuso, quer não conjugadas na presença de complemento ou como parte deum fármaco de anticorpo ou um conjugado de anticorpo-toxina, para remo-ver células tumorígenas da medula óssea de pacientes com câncer. De a-cordo com essa abordagem, medula óssea autóloga pode ser purgada exvivo através de tratamento com o anticorpo e a medula infundida de volta nopaciente (veja, por exemplo, Ramsay e outros, J. CHn. Immunol, 5(2): 81-88(1988)).

Similarmente, uma proteína de fusão compreendendo pelo me-nos a região de ligação a antígeno de uma ABM da invenção unida a pelomenos uma porção funcionalmente ativa de uma segunda proteína tendoatividade antitumor, por exemplo, uma Iinfocina ou oncostatina, pode ser u-sada para tratar carcinona humano in vivo.

A presente invenção proporciona um método para matar seleti-vamente células tumorígenas expressando um antígeno alvo. Esse métodocompreende reação do imunoconjugado (por exemplo, a imunotoxina) dainvenção com as referidas células tumorígenas. Essas células tumorígenaspodem ser de um carcinoma humano.

Adicionalmente, a presente invenção proporciona um método detratamento de carcinomas (por exemplo, carcinomas humanos) in vivo. Essemétodo compreende administração, a um indivíduo, de uma quantidade far-maceuticamente eficaz de uma composição contendo pelo menos um dosimunoconjugados (por exemplo, a imunotoxina) da invenção.

Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um mé-todo de tratamento de distúrbios de proliferação celular em que um antígenoassociado a tumor é expresso, particularmente em que o referido antígenoassociado a tumor é anormalmente expresso (por exemplo, superexpresso)compreendendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficazde uma ABM da presente invenção a um ser humano que precisa da mesma.

Similarmente, outros distúrbios de proliferação celular tambémpodem ser tratados pelas ABMs da presente invenção. Exemplos de taisdistúrbios de proliferação celular incluem, mas não estão limitados a: hiper-gamaglobulinemia, distúrbios linfoproliferativos, paraproteinemias, púrpura,sarcoidose, síndrome de Sezary, Macroglobulinemia de Waldenstron, doen-ça de Gaucher, histiocitose e qualquer outra doença de proliferação celular,além de neoplasia, localizada em um sistema de órgão listado acima.

De acordo com a prática da presente invenção, o indivíduo podeser um ser humano, eqüino, suíno, bovino, murino, canino, felino e ave. Ou-tros animais de sangue quente também são incluídos na presente invenção.

A invenção em questão ainda proporciona métodos para inibiçãodo crescimento de células tumorígenas humanas, tratamento de um tumorem um indivíduo e tratamento de uma doença do tipo proliferativa em umindivíduo. Esses métodos compreendem administração, ao indivíduo, deuma quantidade eficaz de uma composição de ABM da invenção.

É evidente, portanto, que a presente invenção abrange composi-ções farmacêuticas, combinações e métodos para o tratamento ou profilaxiade câncer ou para uso no tratamento ou profilaxia de uma condição ou lesãopré-cancerosa. A invenção inclui composições farmacêuticas para uso notratamento ou profilaxia de malignidades humanas, tais como melanomas ecânceres da bexiga, cérebro, cabeça e pescoço, pâncreas, pulmão, mama,ovário, cólon, próstata e rim. Por exemplo, a invenção inclui composiçõesfarmacêuticas para uso no tratamento ou profilaxia de cânceres, tais comomalignidades humanas, ou para uso no tratamento ou profilaxia de umacondição ou lesão pré-cancerosa compreendendo uma quantidade farma-ceuticamente eficaz de uma molécula de ligação a antígeno da presente in-venção e um veículo farmaceuticamente aceitável. O câncer pode ser, porexemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célula não pequena (NS-CL), câncer de pulmão de célula bronquioalveolar, câncer ósseo, câncerpancreático, câncer de pele, câncer de cabeça ou pescoço, melanoma cutâ-neo ou intraocular, câncer uterino, câncer ovariano, câncer retal, câncer daregião anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de cólon, câncerde mama, câncer uterino, carcinoma das trompas falopianas, carcinoma doendométrio, carcinoma do cérvix, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva,doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncerdo sistema endócrino, câncer da glândula tiróide, câncer da glândula parati-róide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra,câncer do pênis, câncer de próstata, câncer da bexiga, câncer do rim ou ure-ter, carcinoma de célula renal, carcinoma da pélvis renal, mesotelioma, cân-cer hepatocelular, câncer biliar, leucemia crônica ou aguda, Iinfomas linfocí-ticos, neoplasmas do sistema nervoso central (CNS), tumores do eixo espi-nhal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multiforme, astrocitomas, sch-wanomas, ependimomas, meduloblastomas, meningiomas, carcinomas decélulas escamosas, adenomas da pituitária, incluindo as versões resistentesde qualquer um dos cânceres acima ou uma combinação de um ou mais doscânceres acima. A condição ou lesão pré-cancerosa inclui, por exemplo, ogrupo consistindo em Ieucoplasia oral, queratose actínica (queratose solar),pólipos pré-cancerosos do cólon ou reto, displasia epitelial gástrica, displasiaadenomatosa, síndrome de câncer de cólon com não-polipose hereditária(HNPCC), esôfago de Barrett, displasia da bexiga e condições cervicais pré-cancerosas.

De preferência, o referido câncer é selecionado do grupo consis-tindo em câncer de mama, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço,câncer de pele, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano,câncer de cólon, câncer de próstata, câncer de rim e câncer de cérebro.

A frase "farmaceuticamente aceitável" é empregada aqui para sereferir àqueles compostos, material, composições e/ou formas de dosagemos quais são, dentro do escopo do julgamento médico, adequados para usoem contato com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade ex-cessiva, irritação, resposta alérgica ou outro problema ou complicação, co-mensurável com uma proporção benefício/risco razoável. Qualquer materialveículo convencional pode ser utilizado. O material veículo pode ser um or-gânico ou inorgânico adequado para administração enteral, percutânea ouparenteral. Veículos adequados incluem água, gelatina, goma arábica, Iacto-se, amido, estearato de magnésio, talco, óleos vegetais, polialquileno-glicóis,geléia de petróleo e similares. Além disso, os preparados farmacêuticos po-dem conter outros agentes farmaceuticamente ativos. Aditivos adicionais,tais como agentes de flavorização, estabilizantes, agentes de emulsificação,tampões e similares podem ser adicionados de acordo com práticas aceitasde composição farmacêutica.

Em ainda outra modalidade, a invenção se refere a uma ABM deacordo com a presente invenção para uso como um medicamento, em parti-cular para uso no tratamento ou profilaxia de câncer ou para uso no trata-mento ou profilaxia de uma condição ou lesão pré-cancerosa. O câncer podeser, por exemplo, câncer de pulmão, câncer de pulmão de célula não pe-quena (NSCL), câncer de pulmão de célula bronquioalveolar, câncer ósseo,câncer pancreático, câncer de pele, câncer dâ cabeça ou pescoço, melano-ma cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer ovariano, câncer retal,câncer da região anal, câncer de estômago, câncer gástrico, câncer de có-lon, câncer de mama, câncer uterino, carcinoma das trompas faiopianas,carcinoma do endométrio, carcinoma do cérvix, carcinoma da vagina, carci-noma da vulva, doença de Hodgkin, câncer do esôfago, câncer do intestinodelgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tiróide, câncer daglândula paratiróide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole,câncer da uretra, câncer do pênis, câncer de próstata, câncer da bexiga,câncer do rim ou ureter, carcinoma de célula renal, carcinoma da pélvis re-nal, mesotelioma, câncer hepatocelular, câncer biliar, leucemia crônica ouaguda, Iinfomas linfocíticos, neoplasmas do sistema nervoso central (CNS),tumores do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, glioblastoma multifor-me, astrocitomas, schwanomas, ependimomas, meduloblastomas, meningi-omas, carcinomas de células escamosas, adenomas da pituitária, incluindoas versões resistentes de qualquer um dos cânceres acima ou uma combi-nação de um ou mais dos cânceres acima. A condição ou lesão pré-cancerosa inclui, por exemplo, o grupo consistindo em Ieucoplasia oral, que-ratose actínica (queratose solar), pólipos pré-cancerosos do cólon ou reto,displasia epitelial gástrica, displasia adenomatosa, síndrome de câncer decólon com não-polipose hereditária (HNPCC), esôfago de Barrett, displasiada bexiga e condições cervicais pré-cancerosas.

Ainda outra modalidade é o uso da ABM de acordo com a pre-sente invenção para a fabricação de um medicamento para o tratamento ouprofilaxia de câncer. Câncer é conforme definido acima.

Também, de preferência, a referida molécula de ligação a an-tígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de1,0 mg/kg a cerca de 15 mg/kg.

Também, mais preferivelmente, a referida molécula de ligação aantígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de1,5 mg/kg a cerca de 12 mg/kg.

Também, mais preferivelmente, a referida molécula de ligação aantígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de1,5 mg/kg a cerca de 4,5 mg/kg.

Também, mais preferivelmente, a referida molécula de ligação aantígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de4,5 mg/kg a cerca de 12 mg/kg.

Mais preferivelmente, a referida molécula de ligação a antígenoé usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de 1,5 mg/kg.Também mais preferivelmente, a referida molécula de ligação aantígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de4,5 mg/kg.

Também mais preferivelmente, a referida molécula de ligação aantígeno é usada em uma quantidade terapeuticamente eficaz de cerca de12 mg/kg.

As composições de ABM da invenção podem ser administradasusando modos de administração convencionais incluindo, mas não limitadoa, intravenoso, intraperitoneal, oral, intra-linfático ou administração direta-mente no tumor. Administração intravenosa é preferida.

Em um aspecto da invenção, formulações terapêuticas contendoas ABMs da invenção são preparadas para armazenamento através de mis-tura de um anticorpo tendo o grau desejado de pureza com veículos, excipi-entes ou estabilizantes farmaceuticamente aceitáveis opcionais (Reming-toris Pharmaceutical Sciences 16ã edição, Osol, A. Ed. (1980)), na forma deformulações Iiofilizadas ou soluções aquosas. Veículos, excipientes ou esta-bilizantes aceitáveis são não tóxicos para os recipientes nas dosagens econcentrações empregadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato eoutros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metioni-na; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloretode hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol; álcoolbutílico ou benzílico; alquil parabenos, tais como metil ou propil parabeno;catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos debaixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais comoalbumina do soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, talcomo polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, aspara-gina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outroscarboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes de quelação,tal como EDTA; açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol;contra-íons de formação de sal, tal como sódio; complexos de metal (porexemplo, complexos de Zn-proteína); e/ou tensoativos não-iônicos, tais co-mo TWEEN®, PLURONICS® ou polietileno glicol (PEG).As ABMs da presente invenção podem ser administradas a umindivíduo para tratar uma doença ou distúrbio caracterizado por atividadeanormal do antígeno alvo, tal como um tumor, quer sozinho ou em terapiacombinada, por exemplo, com um agente quimioterapêutico e/ou terapia deradiação. Agentes quimioterapêuticos adequados incluem cisplatina, doxor-rubicina, topotecan, paclitaxel, vinblastina, carboplatina e etoposídeo.

Além disso, as ABMs da presente invenção podem ser usadascomo um substituto para terapia com IVIG. Embora primeiro introduzido parao tratamento de hipogamaglobulinemia, foi mostrado, desde então, que oIVIG tem amplas aplicações terapêuticas no tratamento de doenças infeccio-sas e inflamatórias. Dwyer, J. Μ. , New England J. Med. 326: 107 (1992). Foidemonstrado que as especificidades policlonais encontradas nesses prepa-rados são responsáveis por alguns dos efeitos biológicos do IVIG. Por e-xemplo, o IVIG tem sido usado como uma profilaxia contra agentes infeccio-sos e no tratamento de dermatite necrozante. Viard11. e outros, Science 282:490 (1998). Independente desses efeitos antígeno-específicos, o IVIG tematividades antiinflamatórias bem-reconhecidas, geralmente atribuídas aosdomínios Fc de imunoglobulina G (IgG). Essas atividades, primeiro aplicadaspara o tratamento de trombocitopenia imune (ITP) (lmbach, P. e outros, Lan-cet 1228 (1981); Blanchette, V. e outros, Lancet 344: 103 (1994)) foram es-tendidas ao tratamento de uma variedade de distúrbios inflamatórios imune-mediados, incluindo citopenias auto-imunes, síndrome de Guillain-Barre, mi-astenia gravis, doença auto-imune antiFator VIII, dermatomiosite, vasculite euveíte (van der Meche, F.G. e outros, New Engi J. Med. 326: 1123 (1992);Gajdos, P. e outros, Lancet 406 (1984); Sultan, Y. e outros, Lancet 765(1984); Dalakas, M.C. e outros, New Engl J. Med. 329: 1993 (1993); Jayne,R. e outros, Lancet 337: 1131 (1991); LeHoang, P. e outros, Oeul Immunol.Inflamm. 5: 49 (2000)). Uma variedade de explicações foram feitas levando-se em conta essas atividades, incluindo bloqueio do receptor Fc, atenuaçãode dano tecidual complemento-mediado, neutralização de auto-anticorpospor anticorpo ao idiotipo, neutralização de superantígenos, modulação daprodução de citocina e sub-regulação de respostas de células B (Ballow, M.,J. Allergy Clin. Immunol. 100: 151 (1997); Debre, M. e outros, Lancet 342:945 (1993); Soubrane1 C. e outros, Blood 81: 15 (1993); Clarkson, S.B. eoutros., N. EngL J. Med. 314: 1236 (1986).

Formulações Iiofilizadas adaptadas para administração subcutâ-nea são descritas no W097/04801. Tais formulações Iiofilizadas podem serreconstituídas com um diluente adequado para uma alta concentração deproteína e a formulação reconstituída pode ser administrada subcutanea-mente ao mamífero a ser tratado aqui.

A formulação aqui também pode conter mais de um compostoativo, conforme necessário, para a indicação que está sendo tratada em par-ticular, de preferência aqueles com atividades complementares que não afe-tam adversamente uns aos outros. Por exemplo, pode ser desejável aindaproporcionar um agente citotóxico, agente quimioterapêutico, citocina ou a-gente imunossupressor (por exemplo, um o qual atua sobre células T, talcomo ciclosporina ou um anticorpo que se liga à células T, por exemplo, umo qual se liga ao LFA-I). A quantidade eficaz desses outros agentes dependeda quantidade de antagonista presente na formulação, do tipo de doença oudistúrbio ou tratamento e outros fatores discutidos acima. Esses são geral-mente usados nas mesmas dosagens e com vias de administração conformeusado aqui antes ou de cerca de 1 a 99% das dosagens empregadas atéagora.

Os ingredientes ativos podem também estar encerrados em mi-crocápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervaçãoou através-de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetil celulose oumicrocápsulas de gelatina e microcápsulas de (poli)metilmetacrilato, respec-tivamente, em sistema de distribuição de fármaco coloidais (por exemplo,lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas enanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são descritas em Re-mington's Pharmaceutical Sciences 16ã edição, Osol, A. Ed. (1980).

Preparados com liberação sustentada podem ser preparados.

Exemplos adequados de preparados com liberação sustentada incluem ma-trizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antago-nista, matrizes as quais estão na forma de artigos formatados, por exemplo,filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes com liberação sustentadaincluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, (poli)2-hidroxietil-metacrilato ouálcool (poli)vinílico, polilactídeos (Pat. U.S. N2 3.773.919), copolímeros deácido L-glutâmico e yetil-L-glutamato, acetato de etileno-vinila não degradá-vel, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradáveis, tal como o LU-PRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácidoláctico-ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido (poli)-D-(-)-3-hidro-xibutírico.

As formulações a serem usadas para administração in vivo de-vem ser estéreis. Isso é prontamente obtido por meio de filtração através demembranas de filtração estéreis.

As composições da invenção podem estar em uma variedade deformas de dosagem as quais incluem, mas não estão limitadas a, soluçõeslíquidas ou suspensão, comprimidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsu-las poliméricas ou microvesículas, Iipossomas e soluções injetáveis ou infu-síveis. A forma preferida depende do modo de administração e da aplicaçãoterapêutica.

As composições da invenção também incluem, de preferência,veículos e adjuvantes convencionais farmaceuticamente aceitáveis conheci-dos na técnica, tais como albumina de soro humano, permutadores de íons,alumina, lecitina, substâncias tampão, tais como fosfatos, glicina, ácido sór-bico, sorbato de potássio e sais ou eletrólitos, tal como sulfato de protamina.

O modo mais eficaz de administração e o regime de dosagempara as composições farmacêuticas da presente invenção dependem dagravidade e, naturalmente, da doença, da saúde do paciente e da respostaao tratamento e do julgamento do médico que trata. Todavia, uma dose efi-caz das composições da presente invenção geralmente estará na faixa decerca de 0,01 a cerca de 2000 mg/kg.

As moléculas de ligação a antígeno descritas aqui podem estarem uma variedade de formas de dosagem as quais incluem, mas não estãolimitadas a, soluções ou suspensões líquidas, comprimidos, pílulas, pós, su-positórios, microcápsulas ou microvesículas poliméricas, Iipossomas e solu-ções injetáveis ou infusíveis. A forma preferida depende do modo de admi-nistração e da aplicação terapêutica.

A composição compreendendo uma ABM da presente invençãoserá formulada, dosada e administrada de um modo consistente com a boaprática médica. Fatores para consideração nesse contexto incluem a doençaou distúrbio que está sendo tratado em particular, o mamífero que está sen-do tratado em particular, a condição clínica do paciente individual, a causada doença ou distúrbio, o local de distribuição do agente, o método de admi-nistração, o esquema de administração e outros fatores conhecidos pelospraticantes médicos. A quantidade terapeuticamente eficaz do antagonista aser administrada será orientada por tais considerações.

Como uma proposição geral, a quantidade terapeuticamente efi-caz do anticorpo administrada parenteralmente por dose estará na faixa decerca de 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal do paciente por dia, com a faixainicial típica de antagonista usada estando na faixa de cerca de 2 a 10mg/kg.

Em uma modalidade preferida, a ABM é um anticorpo, de prefe-rência um anticorpo humanizado. Dosagens adequadas para tal anticorponão conjugado estão, por exemplo, na faixa de cerca de 20 mg/m2 a cercade 1000 mg/m2. Por exemplo, pode-se administrar ao paciente uma ou maisdoses substancialmente menores do que 375 mg/m2 do anticorpo, por exemplo,onde a dose está na faixa de cerca de 20 mg/m2 a cerca de 250 mg/m2, porexemplo, de cerca de 50 mg/m2 a cerca de 200 mg/m2.

Além disso, pode-se administrar uma ou mais doses iniciais doanticorpo, seguido por uma ou mais doses subseqüentes, em que a dose,em mg/m2, do anticorpo na(s) dose(s) subseqüente(s) excede a dose emmg/m2 do anticorpo na dose(s) inicial. Por exemplo, a dose inicial pode estarna faixa de cerca de 20 mg/m2 a cerca de 250 mg/m2 (por exemplo, de cercade 50 mg/m2 a cerca de 200mg/m2) e a dose subseqüente pode estar nafaixa de cerca de 250 mg/m2 a cerca de 1000 mg/m2.

Conforme observado acima, contudo, essas quantidades sugeri-das de ABM estão sujeitas a uma grande cota de discernimento terapêutico.O fator chave na seleção de uma dose e esquema apropriados é o resultadoobtido, conforme indicado acima. Por exemplo, doses relativamente maiorespodem ser necessárias inicialmente para o tratamento de doenças em an-damento e agudas. Para obter os resultados mais eficazes, dependendo dadoença ou distúrbio, o antagonista é administrado tão cedo quanto possíveldo primeiro sinal, diagnóstico, aparecimento ou ocorrência da doença oudistúrbio ou durante remissões da doença ou distúrbio.

No caso de ABMs da invenção usadas para tratar tumores, re-sultados terapêuticos ótimos são geralmente obtidos com uma dose que ésuficiente para saturar completamente o antígeno de interesse sobre as cé-lulas alvo. A dose necessária para obter saturação dependerá do número demoléculas de antígeno expressas por célula tumorígena (a qual pode variarsignificativamente entre diferentes tipos de tumor). Concentrações no sorotão baixas quanto 30 nM podem ser eficazes no tratamento de alguns tumo-res, enquanto que concentrações acima de 100 nM podem ser necessáriaspara obter um efeito terapêutico ótimo com outros tumores. A dose necessá-ria para obter saturação para um determinado tumor pode ser prontamentedeterminada in vivo através de radioimunoensaio ou imunoprecipitação.

Em geral, para terapia combinada com radiação, um regime te-rapêutico adequado envolve infusões de oito semanas de uma ABM da in-venção em uma dose de carga de 100-500 mg/m2, seguido por doses demanutenção a 100-250 mg/m2 e radiação na quantidade de 70,0 Gy em umadose de 2,0 Gy diariamente. Para terapia combinada com quimioterapia, umregime terapêutico adequado envolve administração de uma ABM da inven-ção como doses de carga/manutenção semanalmente de 100/100 mg/m2,400/250 mg/m2 ou 500/250 mg/m2 em combinação com cisplatina em umadose de 100 mg/m2 a cada três semanas. Alternativamente, gencitabina ouirinotecan pode ser usado em lugar de cisplatina.

A ABM da presente invenção é administrada através de qualquermeio adequado, incluindo parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapul-monar e intranasal e, se desejado, para tratamento imunossupressor local,administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração in-tramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. Alémdisso, o antagonista pode, adequadamente, ser administrado através de in-fusão pulsada, por exemplo, com doses decrescentes do antagonista. Depreferência, a dosagem é fornecida através de injeções, mais preferivelmen-te injeções intravenosas ou subcutâneas dependendo, em parte, se a admi-nistração é breve ou crônica.

Pode-se administrar outros compostos, tais como agentes cito-tóxicos, agentes quimioterapêuticos, agentes imunossupressores e/ou cito-cinas com os antagonistas aqui. A administração combinada inclui co-administração, usando formulações separadas ou uma única formulaçãofarmacêutica, e administração consecutiva em qualquer ordem em que, depreferência, há um período de tempo enquanto ambos (ou todos) ou agentesativos exercem simultaneamente suas atividades biológicas.

Estará claro que a dose da composição da invenção requeridapara obter curas pode ainda ser reduzida com otimização do esquema.

De acordo com a prática da invenção, o veículo farmacêuticopode ser um veículo lipídico. O veículo lipídico pode ser um fosfolipídio. Ain-da, o veículo lipídico pode ser um ácido graxo. Também, o veículo lipídicopode ser um detergente. Conforme usado aqui, um detergente é qualquersubstância que altera a tensão de superfície de um líquido, geralmente dimi-nuindo-a.

Em um exemplo da invenção, o detergente pode ser um deter-gente não-iônico. Exemplos de detergentes não-iônicos incluem, mas nãoestão limitados a, polissorbato 80 (também conhecido como Tween 80 oumonooleato de (poli)oxietileno sorbitan, Brij e Triton (por exemplo, Triton WR1339 e Triton A 20).

Alternativamente, o detergente pode ser um detergente iônico.Um exemplo de um detergente iônico inclui, mas não está limitado a, brome-to de alquiltrimetilamônio.

Adicionalmente, de acordo com a invenção, o veículo lipídicopode ser um lipossoma. Conforme usado no presente pedido de patente, um"lipossoma" é qualquer vesícula membrana-ligada a qual contém quaisquermoléculas da invenção ou combinações das mesmas.

Artigos de Fabricação

Em outra modalidade da invenção, um artigo de fabricação con-tendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima é pro-porcionado. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo oubula na embalagem sobre ou associado ao recipiente. Recipientes adequa-dos incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientespodem ser formados de uma variedade de materiais, tais como vidro ouplástico. O recipiente contém uma composição a qual é eficaz para o trata-mento da condição e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, orecipiente pode ser um saco com solução intravenosa ou um frasco tendouma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menosum agente ativo na composição é usado para o tratamento da condição deescolha, tal como uma doença ou distúrbio não-maligno, por exemplo, umadoença ou distúrbio hiperproliferativo benigno. Além disso, o artigo de fabri-cação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composiçãocontida no mesmo, em que a composição compreende uma primeira ABM aqual se liga a um antígeno alvo e inibe o crescimento de células as quaissuperexpressam o antígeno; e (b) um segundo recipiente com uma compo-sição contida no mesmo, em que a composição compreende um segundoanticorpo o qual se liga ao antígeno e bloqueia a ativação de Iigante de umreceptor antigênico. O artigo de fabricação dessa modalidade da invençãopode ainda compreender uma bula na embalagem indicando que as primeirae segunda composições podem ser usadas para tratar uma doença ou dis-túrbio não maligno da lista de tais doenças ou distúrbios na seção definiçãoacima. Além disso, a bula na embalagem pode instruir o usuário da compo-sição (compreendendo um anticorpo o qual se liga a um antígeno alvo e blo-queia ativação de ligante de um receptor antigênico alvo) para combinar te-rapia com o anticorpo e qualquer uma das terapias adjuntas descritas naseção precedente (por exemplo, um agente quimioterapêutico, um fármacoantígeno-objetivado, um composto anti-hormonal, um cardioprotetor e/ouuma citocina). Alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação podeainda compreender um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo umtampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para in-jeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer esolução de dextrose. Ele pode ainda incluir outros materiais desejáveis deum ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluen-tes, filtros, agulhas e seringas.

Os exemplos abaixo explicam a invenção em maiores detalhes.

Os preparados e exemplos a seguir são fornecidos para permitir que aquelesversados na técnica compreendam mais claramente e pratiquem a presenteinvenção. A presente invenção, contudo, não está limitada, quanto ao esco-po, pelas modalidades exemplificadas, as quais se destinam a ser ilustra-ções dos aspectos únicos da invenção apenas e métodos os quais são fun-cionalmente equivalentes estão dentro do escopo da invenção, na verdade,várias modificações da invenção, além daquelas descritas aqui, se tornarãoevidentes para aqueles versados na técnica a partir da descrição precedentee dos desenhos em anexo. Se pretende que tais modificações caiam dentrodo escopo das reivindicações em anexo.

Todas as patentes, pedidos de patente e publicações citadas nopresente pedido de patente são aqui incorporados por referência em suatotalidade.

EXEMPLOS

A menos que de outro modo especificado, referências à nume-ração de posições de resíduo de aminoácido específicos nos Exemplos aseguir são de acordo com o sistema de numeração de Kabat. Exceto ondede outro modo observado, os materiais e métodos usados para fazer as mo-léculas de ligação a antígeno nesses exemplos de trabalho estão de acordocom aqueles apresentados nos exemplos do Pedido de Patente U.S. Ns10/981.738, o qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

Exemplo 1

Materiais e Métodos

Linhagens de célula, vetores de expressão e anticorpoCélulas HEK293-EBNA foram um tipo de cortesia de Rene Fis-cher (ΕΤΗ Zurich). Linhagens de célula adicionais usadas nesse estudo e-ram células Jurkat (células T linfoblásticas humanas, número ATCC TIB-152)ou linhagens de células de Jurkat expressando FcYRIIIa[Val-158]-, bem co-mo Fc7Rllla[Val-158/Gln-162], criadas conforme anteriormente descrito (Fer-rara, C. e outros, BiotechnoL Bioeng. 93 (5): 851 -861 (2006)). As célulasforam cultivadas de acordo com as instruções do fornecedor. Os DNAs quecodificam a shFcyRllla[Val-158] e shFcTRIIIa[Phe-158] foram gerados atra-vés de PCR (Ferrara, C. e outros, J. Bioi Chem. 281(8): 5032-5036 (2006))e fundidos a uma tag de hexahistidina, resultando na proteína madura quetermina após o resíduo 191 (NH2-MRTEDl... GYQG(H6)-COOH, numeraçãoé baseada na proteína madura), conforme descrito (Shields, RX. e outros, J.BioL Chem. 276(9): 6591-6604 (2001)). A Asn-162 de shFcyRllla[Val-158] foitrocada por Gln através de PCR. Todos os vetores de expressão contidos naorigem de replicação OriP do vírus de Epstein Barr para expressão em célu-las HEK293-EBNA. GE nativa e anticorpos anti-CD20 foram produzidos emcélulas HEK293-EBNA e caracterizados através de métodos padrões. Perfisde oligossacarídeo neutro para os anticorpos foram analisados através deespectrometria de massa (Autoflex, Bruker Daltonics GmbH, Faellan-den/Suíça) no modo de íons positivo (Papac, D.l. e outros, Glycobiol 8(5):AA5-A5A (1998)).

Produção e purificação de receptores shFcYRIIIa recombinantes

As variantes de ShFcyRIIIa foram produzidas através de expres-são transitória em células HEK-293-EBNA (Jordan, M. e outros, Nucl Acids.Res. 24: 596-601 (1996)) e purificadas tomando vantagem da tag de hexa-histidina usando uma HiTrap Chelating HP (Amersham Biosciences, Otelfin-gen/Suíça) e uma etapa de cromatografia por exclusão de tamanho comtampão HSP-EB (HEPES a 0,01 M, pH de 7,4, NaCI a 0,15 M, EDTA a 3mM, Tween 80 a 0,005%). SFcyRIIb humano e de camundongo (m) sFcTRIlbforam produzidos e purificados conforme descrito (Sondermann, P. & Jacob.,U., Biol. Chem. 380(6): 717-721 (1999)). A concentração de todas as proteí-nas foi determinada conforme descrito (Gill, S.C. & von Hippel, P.H., Anal.Biochem. 182(2): 319-326 (1989)).Ressonância em Superfície de Plasmônio (SPR)

Experimentos de SPR foram realizados sobre um Biacore3000com HBS-EP como tampão de operação (Biacore, Freiburg/Alemanha). A-coplamento direto de em torno de 1.000 unidades de ressonância (RU) deglicovariantes de IgG humana foi realizado sobre uma lasca CM5 usando okit de acoplamento padrão de amina (Biacore, Freiburg/Alemanha). Diferen-tes concentrações de FcyRs solúveis foram passadas com uma taxa de fluxode 10 μΙ/min através de células de fluxo. Diferenças no índice refrativo globalforam correlacionadas através de subtração da resposta obtida quando defluxo sobre a superfície BSA-acoplada. A resposta em estado uniforme foiusada para derivar a constante de dissociação, Kd, através de adaptação decurva não linear do isoterma de ligação de Langmuir. Constantes cinéticasforam derivadas usando a unidade de adaptação de curva do programa BIA-evaluation (v3.0, Biacore, Freiburg/Alemanha), para adaptar equações dataxa para ligação de Langmuir a 1:1 através de integração numérica.

Ligação de IgG à células que expressam FcyRIIIa

Experimentos foram conduzidos conforme anteriormente descri-to (Ferrara, C. e outros, Biotechnoi Bioeng. 93(5): 851-861 (2006)). Resumi-damente, células de Jurkat expressando hFcyRllla foram incubadas comvariantes de IgG em PBS, BSA a 0,1%. Após uma ou duas lavagens comPBS, BSA a 0,1%, a ligação de anticorpo foi detectada através de incubaçãocom IgG F(ab')2 específica, anti-humana de cabra FITC-conjugada a 1:200(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA/USA) (Shields, RX. e outros, J.Biol. Chem. 276(9): 6591-6604 (2001)). A intensidade de fluorescência refe-rente às variantes de anticorpo ligadas foi determinada sobre um FACS Ca-Iibur (BD Biosciences, Allschwil/Suíça).

Modelamento

Modelamento foi realizado com base na estrutura principal decristal do FcyRIII em complexo com o fragmento Fc derivado de IgG nativa(PDB código Ie4k). Para essa finalidade, as coordenadas da porção carboi-drato presas à Ans-297 da Fc foram duplicadas e uma das glicanos ajustadamanualmente como um corpo rígido à Asn-162 do FcyRIII com o núcleo depentassacarídeo em direção à posição onde o resíduo FUC do oligossacarí-deo Asn-297 da Fc está presente. O modelo não foi energia-minimizado e foicriado apenas para visualizar o modo de ligação proposto.

Resultados

Caracterização bioquímica de receptores FcyRllla solúveis e qlicovariantesde anticorpo

ShFcyRllla[Val-158], shFcyRllla[Phe-158J e shFcyRllla[Val-158/Gln-162] foram expressos em células HEK293-EBNA e purificados até ho-mogeneidade. O shFcyRllla-[Val-158] e -[Phe-158] migra como uma amplabanda quando submetido a SDS-PAGE de redução com um peso molecularevidente de 40-50 kDa, o que é ligeiramente menor para o shFcyRlllatVal-158/Gln-162] mutante (dados não mostrados). Isso pode ser explicado atra-vés da eliminação dos carboidratos ligados à Asn-162. Quando de N-desglicosilação enzimática, todas as três variantes de receptor migram iden-ticamente na faixa de peso molecular evidente de 25 a 30 kDa e se caracte-rizam por três bandas, conforme previamente observado para membrana-Iigado hFcyRIII (Edberg, J.C. & Kimberly, R.P., J. Immunol. 158(8): 3849-3857 (1997), Ravetch, LV. & Perussia, B., J. Exp. Med. 170(2): 481-497(1989)). Esse padrão heterogêneo pode resultar da presença de carboidra-tos O-ligados.

O padrão de glicosilação do anticorpo nativo é caracterizado poroligossacarídeos em complexo biantenários, fucosilados (Fig. 1b, c), hetero-gêneos com relação ao teor de galactose terminal. Anticorpos GE foramproduzidos em uma linhagem de célula superexpressando N- acetilglicosa-minil transferase Ill (GnT-III)1 uma enzima que catalisa a adição de umaGIcNAc de bissecção (Fig. 1a) à β-manose do núcleo. Duas variantes deanticorpo GE diferentes foram geradas, Glico-1 foi produzida através de su-perexpressão de GnT-III apenas e Glico-2 através de co-expressão de GnT-III e Man-Il recombinante (Ferrara, C. e outros, Biotechnol. Bioeng. 93(5):851-861 (2006), figura 1b). Glico-1 e Glico-2 são caracterizadas por altasproporções de oligossacarídeos não fucosilados bissecionados (88% do tipohíbrido e 90% do tipo complexo, respectivamente, figura 1c). Nós mostramosanteriormente que ambas as formas proporcionam aumentos similares naafinidade pelo FcyRIIIa e ADCC aumentada com relação aos anticorpos na-tivos, mas diferem quanto à sua reatividade em ensaios de CDC (Ferrara, C.e outros, Biotechnol. Bioeng. 93(5): 851-861 (2006)). Modificações de IgG-oligossacarídeo levam a anticorpos com afinidade aumentada peloshFcyRllla.

As interações de glicovariantes de anticorpo com variantes deshFcyRllla ([Val-158], [Phe-158] e [Val-158/Gln-162]), shFcyRllb e smFcyRllbforam analisadas através de SPR. Ligação de shFcyRllla[Val-158] a anticor-pos GE era até 50 vezes mais forte do que aquela ao anticorpo nativo(Kd(gnco-2) 0,015 μΜ v's 0,75 μΜ , Tabela 6). De modo importante, a formapolimérica de "baixa afinidade" do receptor, shFcyRllla[Phe-158], também seligou a anticorpos GE com afinidade significativamente maior do que o anti-corpo nativo (Kd(giíco-i) 0,27 μΜ (18 vezes), Kd(giíco-2) 0,18 μΜ (27 vezes),KD(nativo) 5 μΜ (Tabela 6)). Dissociação de ambas as variantes de receptor daIgG nativa era muito rápida para permitir uma determinação direta de cons-tantes cinéticas para essas interações. Embora não seja possível obter pa-râmetros cinéticos para ligação dos receptores ao Ab nativo, sobreposiçãodos dados experimentais mostra claramente que um grande efeito de glico-manipulação dos anticorpos é dissociação diminuída dos receptores (Fig.2a). Para estimar as taxas de dissociação da IgG nativa, os dados experi-mentais foram sobrepostos com curvas simulando diferentes constantes dataxa de dissociação (não mostrado). Isso indicou que o aumento todo naafinidade quando de glicomanipulação poderia ser computado para a koff di-minuída. As constantes da taxa de associação (kon) das duas formas poli-mórfícas de shFcyRllla para anticorpos GE eram similares, mas a taxa dedissociação de sFcyRTfla[Phe-158] era significativamente mais rápida e con-tava grandemente para a menor afinidade desse receptor (Tabela 6).

A afinidade dos anticorpos pelo FcyRIIb humano e de murinotambém foi medida. GE e IgGs nativas se ligaram ao receptor inibitório hu-mano ShFcyRIIb com afinidades similares na faixa de K0 = 1,55 - 2,40 μΜ(Tabela 6). Para a versão de murino desse receptor, a afinidade com relaçãoà IgGI também não foi alterada pela glicomanipulação mas, surpreendente-mente, era 3,4- a 5,5-vezes aquela do receptor FcyRIIb humano (Tabela 6).

A constante de dissociação (KD) para a interação do anticorpo nativo comsh/mFcyRllb pôde ser determinada apenas através de análise em estadouniforme (Tabela 6) porque o equilíbrio foi atingido muito rápido para umaavaliação cinética (Fig. 2a).<table>table see original document page 117</column></row><table>Glicosilacão de FcyRIIIa regula a ligação a qlicovariantes de anticorpo

Uma forma mutante de hFcyRIHa que não é glicosilada emAsn162 (shFcTRIIIa[Val-158/Gln-162]) foi usada para analisar a influência deuma interação carboidrato-mediada potencial entre oligossacarídeo nessaposição no receptor e IgG. De modo interessante, quando de remoção deAsn162, a IgG nativa mostrou um aumento no limiar (KD = 0,24 μΜ c.f. 0,75μΜ) na afinidade pelo receptor, enquanto que anticorpos GE mostraram umadiminuição de mais de 13 vezes na afinidade (Tabela 6). Para ligação a anti-corpos GE, remoção do sítio de glicosilação do receptor resultou em um au-mento de quase duas vezes na kon, nrias um aumento de mais de 14 vezesna koff (Tabela 6). KpS em estado uniforme cineticamente determinadas dife-riam em 1,6 a 2,2 vezes para a ligação de shFcYRIIIa[Val-158/Gln-162]. Essadiscrepância resulta, mais provavelmente, de um alto erro na adaptação dadissociação muito rápida observada.

Os resultados SPR-baseados foram corrobados em um sistemacelular usando células Jurkat expressando FcyRIIIa. Células Jurkat (linha-gem de células T humanas) representam um ambiente natural para expres-são de FctRIIIa (Edberg, J.C. & Kimberly, R.P., J. Immunol. 158(8): 3849-3857 (1997)). O mAb anti-FcyRIII 3G8, o qual não discrimina entreFcyRIMa[Val-158] e FcTRIIIa[Val-158/Gln-162] (Drescher, B. e outros, Immu-nology 110(3): 335-340 (2003)), foi usado para monitorar expressão deFcyRIII nessas linhagens de célula. Nesse experimento, anticorpos GE seligaram ao FcyRllla[Val-158] melhor do que ao anticorpo nativo (Fig. 3c). Li-gação ao FcYRIIIa[Val-158/Gln-162], contudo, era quase indetectável paratodas as variantes de IgG, incluindo IgG nativa (Fig. 3c). As constantes detaxa de dissociação muito rápidas encontradas no experimento de SPR paraligação de FcYRIIIa[Val-158/Gln-162] a todas as três variantes de IgG pode-ria explicar essa ligação negligenciável no ensaio celular.

Discussão

Análise cinética da interação FcvRIMa/loG

Em geral, a K0S medida concordava com aquelas previamentepublicadas por Okazaki e outros. (Okazaki, A. e outros, J. Mol. BioL 336(5):1239-1249 (2004)). Esses autores concluíram que o aumento na afinidadedo anticorpo não fucosilado (GE) é predominantemente causado por umaumento na kon. Em contraste, embora nós pudéssemos quantificar a kon ekoft para ligação à IgG nativa em virtude da alta velocidade de reação, umaanálise qualitativa desses eventos de ligação comparado com aqueles en-volvendo anticorpos GE mostra claramente dissociação significativamentemais rápida das variantes de receptor da IgG nativa (Fig. 2a). Portanto, podeser concluído que novas interações entre os parceiros de ligação são forma-das ou aquelas presentes são aperfeiçoadas.

A glicosilacão de FcyRIIla em Asn162 modula a ligação a anticorposFcyRIIIa originário de mamífero é uma proteína altamente glico-silada com cinco sítios de glicosilação N-ligados. Conforme suspeitado apartir da estrutura principal de cristal do complexo de FcyRIII/lgG1 -Fc (Son-dermann, P. e outros, Nature 406:267-273 (2000) (aqui incorporado por refe-rência em sua totalidade), eliminação de glicosilação em Asn162 resulta emuma afinidade intensificada pela IgGI nativa (Drescher, B. e outros, Immuno-Iogy 110(3): 335-340 (2003)), provavelmente através da eliminação de umconfronto estérico da porção carboidrato do hFcyRllla[Asn162] com a Fc.Remoção do carboidrato dos outros quatro sítios de N-glicosilação não afetaa afinidade pela IgG nativa (Drescher, B. e outros, Immunology 110(3): 335-340(2003)).

Uma versão mutante do receptor de alta afinidade a qual é nãoglicosilada na posição 162 (shFcyRllla[Val-158/Gm-162]) foi construída parainvestigar adicionalmente a importância da glicosilação de IgG e FcyRIIIa asua interação. Conforme esperado, descobriu-se um aumento na afinidadepela interação entre o anticorpo nativo e o FcyRllla[Val-158/Gln-162]Asn162-glicosilação deficiente (3 vezes, Tabela 6). Contudo, anticorpos GEse ligam mais de dez vezes mais fracamente ao receptor mutante do que aoreceptor glicosilado nativo, shFcyRllla[Val-158] (Tabela 6), indicando que ooligossacarídeo preso à Asn 162 do FcyRIIIa favorece a interação entre IgGIe esse receptor de Fc. Esses dados são corrobados em urn sistema de en-saio celular, onde anticorpos GE se ligam significativamente melhor à célulasexpressando FcyRllla[Val-158] do que à células expressando FcyRllla[Val-158/Gln-162] (Fig. 3c). Em outro conjunto de experimentos, os presentesinventores demonstraram que o comportamento de ligação de anticorposcom um teor de fucose consideravelmente reduzido e carecendo da GIcNAcde bissecção (Fuc-) gerados através da expressão em células de mielomaYO (Lifely, M.R. e outros, Glycobiol. 5(8): 8: 813-822 (1995)) é muito similaràquele dos anticorpos GE (isto é, afinidade pelo receptor desglicosilado émenor do que pelo receptor nativo). A ausência do resíduo de fucose nosanticorpos GE e Fuc-, portanto, parece ser principalmente responsável pelaafinidade intensificada da forma glicosilada do receptor para esses anticor-pos (veja, por exemplo, Shinkawa, T. e outros, J. Biol. Chem. 278(5): 3466-13 (2003); Shields, R.L. e outros, J. Biol. Chem. 277(30): 26733- 26740(2002)).

Em resumo, a interação aperfeiçoada de anticorpos GE comFcyRIIIa é modulada pelas porções carboidrato de ambos os parceiros deligação. A partir das estruturas principais de cristal de fragmentos de IgG-Fc,sabe-se que a interação de carboidratos com a proteína é principalmenteestabilizada por resíduos hidrofóbicos, de preferência aromáticos (Huber, R.e outros, Nature 264(5585): 4I5-420 (1976)). Particularmente relevante paraos resultados é o intenso contato entre a Tur296 da Fc e a fucose da Fc.Anticorpos GE não contêm essa fucose e supõe-se que, quando formaçãode complexo com FcyRIIIa, o carboidrato do receptor preso em Asn162 for-ma contatos fechados favoráveis com a Fc do GE, desse modo, contribuindopara a alta afinidade dessa interação.

Um modelo da interação proposta demonstra que três resíduosde manose do núcleo de pentassacarídeo do oligossacarídeo ligado àAsn 162 do FcyRIIIa poderia atingir a Tyr296 da Fc da IgG (Fig. 4). Tal modode ligação favorece a interação do carboidrato do FcyRIIIa com a Tur296 daFe, o que também é acompanhado por um contato muito mais íntimo do car-boidrato com a porção proteína da IgG. Esse modelo pode ser usado paraidentificar substituições de aminoácido sobre a superfície da Fc1 a qual aindafortalece o contato com o carboidrato do FcyRIII. Em um estudo recente,Okazaki e outros sugerem que anticorpos não fucosilados se ligam aoFcyRIIIa com afinidade aumentada como um resultado de uma ligação re-centemente formada entre Tyr296 da Fc e Lys-128 do FcyRIIIa (Huber, R. eoutros, Nature 264(5585): 415-420 (1976)). Contudo, descobriu-se agoraque a afinidade aumentada de anticorpos não fucosilados depende da glico-silação do receptor. Tal efeito da glicosilação do receptor indica que umaligação Fc-Tyr296/Lys128-FcyRllla é insignificante para a afinidade entreanticorpos GEeo FcyRIIIa.

As formas de FcyRIIIa e b são as únicas formas do FeyR huma-no que possuem sítios de N-glicosilação dentro da região de ligação à IgG.Portanto, conclui-se que a afinidade pela IgG será influenciada pela glicosi-lação do receptor apenas para esses dois FcyRs. Comparação das seqüên-cias de aminoácido do FcyRIII de outras espécies indica que o sítio de N-glicosilação Asn162 é compartilhado pelo FcyRIII de maçado, gato, vaca eporco, enquanto que ele está faltando no FcyRIII de rato e camundongo co-nhecido. Recentemente, os genes de camundongo e rato foram identificados(CD 16-2 e número no banco de dados de proteína NP_997486, respectiva-mente) com alta homologia ao FcyRIII humano e os quais codificam proteí-nas contendo o sítio de glicosilação Asn162 foram identificados (Huber, R. eoutros, Nature 264(5585):415-420 (1976)), mas expressão funcional das pro-teínas ainda tem de ser demonstrada.

A presença de um sítio de glicosilação Asn162-FcyRllla prova-velmente permite que o sistema imune sintonize a afinidade com relação aoFcyRIII, quer através de glicosilação diferencial de FcyRIII (Edberg, J.C. &Kimberly, R.P., J. Immunol. 158(8): 3849-3857 (1997)) ou através de modu-lação do teor de fucose da IgG.

O equilíbrio imunolóqico entre FctRs de ativação e inibitórios

Foi proposto que um aperfeiçoamento na proporção entre sinaisde ativação e inibitórios intensificará a eficácia de anticorpos terapêuticos(Clynes, R:A. e outros, Nat. Med. 6(4): 443-446 (2000); Stefanescu, R.N. eoutros, J. Clin. Immunol. 24(4): 315-326 (Julho de 2004)). No estudo atual,descobriu-se que o receptor shFcyRllb inibitório tem uma afinidade similarpelos anticorpos nativo e GE, enquanto que variantes do receptor de ativa-ção se ligam com maior afinidade aos anticorpos GE do que ao anticorponativo (Tabela 6). Isso indica que as modificações de oligossacarídeo deanticorpos GE aumenta exclusivamente a afinidade pelos receptores de ati-vação e indica que esses anticorpos GE mostrarão eficácia terapêutica in-tensificada.

Os receptores FcyRIIbs inibitórios de camundongo e ser humanonão são glicosilados em Asn 162. A falta de discriminação por anticorpos GEmostrada por esses receptores é consistente com glicosilação de FcyRs emAsn162, sendo essencial para ligação aumentada à IgGs não fucosiladas.

A descoberta de que FcyRII de murino tem afinidade significati-vamente maior do que FcyRIIb humano pelos anticorpos pode ser importantepara a interpretação correta de experimentos in vivo usando modelos decamundongo. Ligação intensificada ao receptor inibitório em um modelo comcamundongo pode resultar em um limiar diferente da resposta imune do queaquele em seres humanos.

Conclusão

Esses estudos demonstram a importância das porções carboi-drato de FcyRIIIa e IgG para sua interação. Os dados proporcionam outroinsight na formação de complexo e identificam a importante interação distintaentre as glicanos do FcyRIIIa e a Fc de glicoformas de IgG não fucosiladas anível molecular. Essa descoberta oferece a base para o design de novasvariantes de anticorpo que fazem outras interações produtivas com o carboi-drato do FcyRIIIa1 o qual tem implicações importantes para terapias com an-ticorpos monoclonais.

Exemplo 2

Geração de mutantes de anticorpo

Mutantes de anticorpo foram geradas usando métodos padrõesde biologia molecular (por exemplo, PCR mutagênica, veja Dulau L, e outros.Nucleíc Acids Res. 11; 17(7): 2873 (1989)), usando uma IgGI humanizadacomo template com uma especificidade pela CD20 ou EGFR. O DNA quecodifica o mutante de anticorpo resultante foi subseqüentemente clonado emuma OriP contendo plasmídeo e usado para a transfecção transitória de cé-lulas HEK293-EBNA (Invitrogen, Suíça), conforme previamente descrito(Jordan, M., e outros, Nucleíc Acids Res. 24, 596-601 (1996)). Anticorposglico-manipulados foram produzidos através de co-transfecção das célulascom dois plasmídeos que codificam anticorpo e GnT-III quimérica, em umaproporção de 4:1, respectivamente enquanto que, para o anticorpo não mo-dificado, os plasmídeos que codificam as enzimas de modificação de carboi-drato foram omitidos. O sobrenadante foi coletado cinco dias após transfec-ção. Para alguns experimentos, o anticorpo foi purificado do sobrenadanteusando duas etapas cromatográficas seqüenciais, conforme descrito (Uma-na, P., e outros, Nat. Biotechnol 17, 176-180 (1999)), seguido por cromato-grafia de exclusão de tamanho. As frações de pico contendo o anticorpomonomélico foram empoçadas e concentradas.

Quantificação do anticorpo no sobrenadante de cultura

Quantificação direta do anticorpo presente no sobrenadante dascélulas EBNA transfectadas foi realizada usando cromatografia de ProteínaA. Para essa finalidade, 100 μ! do sobrenadante foram aplicados a uma co-luna cheia de Proteína A imobilizada a uma resina. O anticorpo ligado foieluído usando um tampão com pH de 3 após a remoção de proteínas nãoligadas com uma etapa de lavagem. A absorbância em um comprimento deonda de 280 nm causada pela eluição de anticorpo foi integrada e usadapara sua quantificação em combinação com padrões de anticorpo de con-centração conhecida.

Análise de -carboidrato

O tampão das frações de HPLC contendo o anticorpo ou anti-corpos purificados foi trocado para TRIS a 2 mM, pH de 7,0 e concentradopara 20 μΙ. Oligossacarídeos foram enzimaticamente liberada dos anticorposatravés de digestão com N-glicosidase (PNGaseF, EC 3.5.1.52, QA-Bio, SanMateo, CA, EUA) a 0,05 mll^g de proteína em Tris a 2 mM, pH de 7 durante3 horas a 37°C. Uma fração da amostra PNGaseF-tratada foi subseqüente-mente digerida com Endoglicosidase H (EndoH, EC 3.2.1.96, Roche, Ba-sel/Suíça) a 0,8 mll^g de proteína para distinguir entre carboidratos híbri-dos e complexos e incubada durante 3 horas a 37°C. Os oligossacarídeosliberados foram ajustados com ácido acético a 150 mM antes de purificaçãoatravés de uma resina de troca de cátions (resina AG50W-X8, forma de hi-drogênio, 100-200 mesh, BioRad1 Reinach/Suíça) acondicionada em umacoluna de cromatografia Bio-spin (BioRad, Reinach/Suíça), conforme descri-to (Papac, D.I., Briggs1 J.B., Chin, E.T. e Jones, AJ. (1998) Glycobiology 8,445-454).

1 μΙ de amostra foi misturado com um tubo de Eppendorf com 1μΙ da matriz recentemente preparada, a qual é preparada através de dissolu-ção de 4 mg de ácido 2,5-dihidroxibenzóico e 0,2 mg de ácido 5-metóxi-salicílico em 1 ml de etanol/cloreto de sódio aquoso a 10 mM a 1:1 (v/v). En-tão, 1 μΙ dessa mistura foi transferido para a lâmina alvo. As amostras foramdeixadas secar antes de medição usando um Autofiex MALDI/TOF (BrukerDaltonics1 Faellanden/Suíça) operando no modo de íons positivo.

Ensaio de ligação de FcyRIIIa

Células Jurkat (DSMZ-número ACC-282) ou CHO (ECACC-número 94060607) foram transfectadas com um plasmídeo que codificahFcyRllla em combinação com a γ-cadeia e incubadas com concentraçõesconhecidas de mutantes de IgG em PBS e BSA a 0,1% durante 30 min a4°C. Após várias lavagens, ligação do anticorpo foi detectada através de in-cubação durante 30 min a 4°C com IgG específica para F(ab')2 anti-humanade cabra FITC-conjugado a 1:200 (Jackson ImmunoResearch, West Grove,PA, EUA). A intensidade de fluorescência de 10000 células correspondendoàs variantes de anticorpo ligadas foi determinada sobre um FACS Calibur(BD Biosciences, Allschwil, Suíça).

De uma maneira similar, uma linhagem de células foi gerada ex-pressando hFcyRllla, a qual é não glicosilada na posição Asn162 através detroca desse resíduo por uma glutamina (FcyRHIa-Q162). O ensaio de liga-ção foi realizado conforme descrito acima usando essa linhagem de célula.

Usando esses métodos, mutantes de IgG podem ser identifica-dos, os quais mostram uma ligação aumentada ao hFcyRllla quando nãofucosilado comparado com o anticorpo mutante não modificado (fucosilado).Além disso, tais mutantes de IgG identificadas têm, de preferência, uma afi-nidade aumentada pelo FcyRIlIa, mas não pelo FcyRIIIa-QI62 não glicosilado.

Ensaio de ligação de FcyRIIb

Células CHO (ECACC-número 94060607) foram transfectadascom um plasmídeo que codifica hFcyRllb, levando à sua expressão na su-perfície. No caso dos mutantes de anticorpo serem dirigidos contra EGFR,células Raji podem ser usadas também para esse ensaio. As células foramincubadas com concentrações conhecidas de mutantes de IgG em PBS eBSA a 0,1% durante 30 min a 4°C. Após várias lavagens, a ligação do anti-corpo foi detectada através de incubação durante 30 min a 4°C com IgG es-pecífica para F(ab')2 anti-humana de cabra FITC-conjugado a 1:200 (Jack-son ImmunoResearch, West Grove, PA, EUA). A intensidade de fluorescên-cia de 10000 células correspondendo às variantes de anticorpo ligadas foideterminada sobre um FACS Calibur (BD Biosciences, Allschwil, Suíça).

Usando os métodos descritos acima, mutantes de IgG podemser identificadas, as quais mostram, de preferência, uma ligação inalteradaao hFcyRllb comparado ao anticorpo não modificado. Em outra modalidadepreferida da presente invenção, moléculas que se ligam, de preferência, aoFcyRIII comparado com o receptor inibitório FcyRIIb são reivindicadas. Isso,conseqüentemente, também inclui mutantes que mostram uma ligação in-termediária ao FcyRIII (isto é, entre o anticorpo do tipo silvestre e o anticorpoglicomanipulado), mas quase nenhuma ligação ao FcyRIIb. Tais mutantes deanticorpo reivindicadas têm uma "proporção de especificidade" acima de 1.Por "proporção de especificidade" entenda-se especificidade pelo receptorFcyRIII humano para a proporção de afinidade de ligação a outro receptorFcy humano.

Ensaio de ADCC

Células A431 EGFR-positivas (ATCC-número CRL-1555) ou cé-lulas de Raji CD20-positivas (ATCC-número CCL-86) foram incubadas commutantes de anticorpo purificadas ou sobrenadantes de cultura contendo osmesmos (Invitrogen AG, Basel, Suíça) durante 10 min serialmente diluídoscom meio AIM-V (Invitrogen, Suíça). Células mononucleares de sangue peri-férico recentemente preparadas (PBMC) de um doador heterozigótico paraFcyRllla-Val/Phe158 e carecendo de expressão de FcyRllc foram adiciona-das às cavidades em uma proporção de efetuador para alvo de 25:1. Alter-nativamente, células NK-92 (DSMZ-número ACC-488) transfectadas comhFcyRllla e a γ-cadeia foram usadas ao invés de PBMCs. Após quatro horasde incubação a 37°C, 100 μΙ do sobrenadante isento de célula foram transfe-ridos para uma nova lâmina para a detecção de LDH liberado pelas célulassubmetidas à Iise usando o Cytotoxicity Detection Kit (Roche, Basel, Suíça)de acordo com o protocolo do fabricante.

Modelamento

Modelamento foi realizado com base na estrutura principal decristal do FcyRIII em complexo com o fragmento de Fc derivado de IgG nati-va (PDB código Ie4k). Para essa finalidade, as coordenadas da porção car-boidrato presas em Asn-297 da Fc foram duplicadas e um dos glicanos ajus-tado manualmente como corpo rígido à Asn-162 do FcyRIII com o núcleo depentassacarídeo em direção à posição onde o resíduo FUC está presente. Omodelo não foi otimizado e foi criado apenas para visualizar o modo de liga-ção proposto.

Exemplo 3

Materiais e Métodos

Expressão de mutantes de anticorpo em células Hek293 EBNA

Os mutantes de anticorpo foram gerados através de mutagênesesítio-dirigida e o DNA resultante foi clonado em uma OriP contendo plasmí-deo e usado para a transfecção transitória de células HEK293-EBNA (Invi-trogen, Suíça), conforme previamente descrito (Jordan, M. e outros, NucleícAcids Res. 24: 596-601 (1996)). Várias glicoformas desses anticorpos forampreparadas através de co-transfecção do plasmídeo que codifica anticorpocom GnT-III quimérica (G1, caracterizado por carboidratos bissecionadosnão fucosilados principalmente híbridos) ou com GnT-III quimérica e Manll(G2, caracterizado por altas proporções de carboidratos bissecionados nãofucosilados em complexo). Para o anticorpo não modificado, os plasmídeosque codificam as enzimas de modificação de carboidrato foram omitidas. Ossobrenadantes foram coletados cinco dias após transfecção.Quantificação e purificação do anticorpo em sobrenadante de cultura paraanálise de carboidrato e ressonância de plasmônio em superfície

Quantificação direta do anticorpo presente no sobrenadante dascélulas EBNA transfectadas foi realizada usando cromatografia em ProteínaA. Para essa finalidade, 100 μΙ do sobrenadante foram aplicados a uma co-luna cheia de Proteína A imobilizada sobre uma resina. O anticorpo ligado foieluído usando um tampão com pH de 3 após a remoção de proteínas nãoligadas com uma etapa de lavagem. A absorbância em um comprimento deonda de 280 nm causada pela eluição de anticorpo foi integrada e usadapara sua quantificação em combinação com padrões de anticorpo de con-centração conhecida. A amostra eluída foi usada para análise de carboidrato.

Para aplicação em ressonância de plasmônio de superfície, 5 mlde sobrenadante foram incubados extremidade-sobre-extremidade com 20μl de contas de Proteína A Sepharose (rmp Protein A Sepharose Fast Flow,Amersham Biosciences, Otelfingen, Suíça) durante a noite em temperaturaambiente. A amostra foi transferida para uma coluna Microspin (BioRad, Rei-nach, Suíça) e centrifugada a 1000 χ g durante 1 min. Os contas retidos fo-ram lavados uma vez com Tris a 10 mM, glicina a 50 mM, cloreto de sódio a100 mM, pH de 8,0. Eluição foi realizada através de incubação com 120 μΙde Tris a 10 mM, glicina a 50 mM, cloreto de sódio a 100 mM, pH de 3,0 du-rante 5 min, seguido por centrifugação a 1000 χ g durante 2 min em um tubode Eppendorf contendo 6 μΙ de Tris a 2 M, pH de 8,0, para neutralização.Análise de carboidrato

O tampão dos anticorpos purificados foi trocado para TRIS a 2mM, pH de 7,0 e concentrado para 20 μΙ. Oligossacarídeos foram enzimati-camente liberados dos anticorpos através de digestão com N-glicosidase(PNGaseF, EC 3.5.1.52, QA-Bio, San Mateo, CA, EUA) a 0,05 mU^g deproteína em Tris a 2 mM, pH de 7 durante 3 horas a 37°C. Os oligossacarí-deos liberados foram ajustados com ácido acético a 150 mM antes de purifi-cação através de uma resina de troca de cátions (resina AG50W-X8, formade hidrogênio, 100-200 mesh, BioRad1 Reinach, Suíça) acondicionada emuma coluna de cromatografia Micro-bio-spin (BioRad, Reinach, Suíça) con-forme descrito (Papac, D.l. e outros, Glycobiology 8, 445-454 (1998)).

1 μΙ de amostra foi misturado em um tubo de Eppendorf com 1 μΙda matriz recentemente preparada, a qual é preparada através de dissoluçãode 4 mg de ácido 2,5-dihidróxibenzóico e 0,2 mg de ácido 5-metóxi-salicílicoem 1 ml de etanol/cloreto de sódio aquoso a 10 mM a 1:1 (v/v). Então, 1 mldessa mistura foi transferido para a placa alvo. As amostras foram deixadassecar antes de medição usando um Autoflex MALDFTOF (Bruker Daltonics,Faellanden, Suíça) operando no modo de íons positivo.

Cromatografia por exclusão de tamanho

Para estudos de SPR, a amostra enriquecida de proteína A (100μΙ) foi purificada através de cromatografia por exclusão de tamanho com umsistema Agilent 1100 com auto-amostrador e unidade MAD usando uma co-luna Tricorn Superdex 200 10/300 GL (Amersham Biosciences, Otelfmgen,Suíça) e tampão HSP-EB (HEPES a 0,01 M, pH de 7,4, NaCI a 0,15 M, ED-TA a 3 mM, Tween 20 â 0,005%) como tampão de operação. A absorbânciaem um comprimento de onda de 280 causada pela eluição do anticorpo foiintegrada e usada para sua quantificação em combinação com padrões deanticorpo de concentração conhecida.

Expressão de shFcTRHIa-HiSg e shFcyRllb-HiSgSolúveisShFCYRIIIa-HiS6 e ShFcyRIIb-HiS6 foram produzidos através deexpressão transitória em células HEK293-EBNA (Jordan, M. e outros, NuciAcids. Res. 24: 596-601 (1996)) e purificados até homogeneidade tomandovantagem da tag de hexahistidina usando HiTrap Chelating HP (AmershamBiosciences, Otelfmgen, Suíça) e uma etapa de cromatografia por exclusãode tamanho com tampão HSP-EB (HEPES a 0,01 M, pH de 7,4, NaCI a 0,15M, EDTA a 3 mM, Tween 20 a 0,005%). A concentração das proteínas foideterminada conforme descrito (Gill, S.C. & von Hippel, P.H., Anal. Biochem.7520:319-326(1989)).

Ressonância de plasmôio em superfícieExperimentos de SPR foram realizados sobre um Biacore 1000com HBS-EB como tampão de operação (Biacore, Freiburg1 Alemanha). A-coplamento direto de em torno de 200-500 unidades de ressonância (RU) dereceptores Fcy humanos foi realizado sobre uma lasca CM5 usando o kit deacoplamento de amina padrão (Biacore, Freiburg, Alemanha). Um conjuntode mutantes de IgG foi passado com uma taxa de fluxo de 30 μΙ/min atravésdas células de fluxo. Diferenças no índice refrativo global foram corrigidasatravés de subtração da resposta obtida quando de fluxo sobre uma superfí-cie de referência sem proteína imobilizada. A resposta em estado uniformefoi usada para derivar a constante de dissociação, Kq1 através de adaptaçãode curva não linear do isoterma de ligação de Langmuir. Constantes cinéti-cas foram derivadas usando a unidade de adaptação de curva do programaBIAevaIuation, para adaptar equações da taxa para ligação de Langmuir a1:1 através de integração numérica.

Resultados

Os anticorpos foram diluídos em HBS-EB e passados sobre su-perfícies com receptores imobilizados. Usando o método descrito, é agorapossível identificar mutantes de aminoácido que não podem ser identificadosquando usando uma versão não glicosilada. Por exemplo, os mutantes deanticorpo S239W e F243E mostram uma afinidade diminuída pelo FcyRIIIaquando não glicomanipulados (não-GE), mas têm uma K0 quase idênticacomparado com aquela do anticorpo de controle quando também glicomani-pulados (GE).

- De acordo com os princípios descritos, mutantes com sucessose caracterizam por uma das seguintes características:

A. O mutante de IgG GE tem uma afinidade aumentada peloFcyRIIIa comparado com a IgG GE carecendo da modificação de aminoácido.

Β. O mutante de IgG GE tem uma afinidade aumentada peloFcyRIIIa, mediada pela porção de carboidrato do FcyRIIIa. Esses mutantespodem ser identificados através de ligação ao FcyRIIIa carecendo de glicosi-lação na posição 162 (FcyRllla-Q162).C. Os mutantes têm uma kon aumentada ou uma koff reduzidacomparado com o anticorpo de controle GE.

De acordo com as características descritas acima, os seguintestrês grupos foram definidos

Tabela 7

<table>table see original document page 130</column></row><table>

Os três grupos foram divididos de acordo com as afinidades(aumentada (>), diminuída (<) ou inalterada (=) KD) para osmutantes de IgG(como glicoformas não-GE ou GE) ao shFcTRWa e shFcyRllla-Q162 compa-rado com o anticorpo de controle na respectiva glicoforma.

OsseguintesmutantesdelgGforamseIecionados:

<table>table see original document page 130</column></row><table>

Tabela 8 - Substituições de aminoácido dos mutantes selecionados<table>table see original document page 131</column></row><table>Constantes de dissociação das interações entre mutantes de IgG eShFcyRIIIa ou shFcyRllla-Q162. Interações entre shFcTRIIIa-H6 e mutantesde IgG imobilizados foram determinadas através de análise cinética, enquan-to que interações entre shFcyRllla-Q162-H6 e mutantes de IgG imobilizadasforam determinadas através de análise em estado uniforme. Não-GE = nãoglicomanipulado; G1 = glicoforma preparada com GnT-lll; G2 = glicoformapreparada com GnT-III e Manll.

Tabela 10

<table>table see original document page 132</column></row><table>

Comparação com anticorpo de controle das interações obtidascom mutantes de IgG selecionadas. Glicoformas mutantes de IgG foramcomparadas com sua respectiva glicoforma do anticorpo original e foramrotuladas como ligação aumentada (I), inalterada (=) ou reduzida (-), Kd oukoff-

* taxas de dissociação muito rápida para determinação; KD foi determinadaatravés de experimentos em estado uniforme.<table>table see original document page 133</column></row><table>Discussão

Os mutantes de IgG selecionados foram divididos nos três gru-pos conforme descrito na Tabela 7.

Grupo 1 - S239W. F243E. F243H

Esses mutantes de anticorpo têm, em sua forma glicomanipula-da, valores de KD muito similares para sua interação com snFcyRllla-H6quando comparado com o anticorpo glicomanipulado de controle, mas secaracterizam por uma constante de taxa de dissociação diminuída (koff 4 ve-zes diminuída). A afinidade ao shFcyRllla carecendo de glicosilação na posi-ção Q162 é diminuída para esses mutantes em glicoformas glicomanipula-das e não glicomanipuladas quando comparado com as afinidades mostra-das pelas respectivas glicoformas para o anticorpo de controle. Isso indicaque a koff aperfeiçoada resulta da porção carboidrato e não da mutação deaminoácido.

Grupo 2 - H268D. H268E, S239D, S239E

Esses mutantes de anticorpo têm uma Kd diminuída nas glico-formas glicomanipuladas e não glicomanipuladas para o shFcyRllla-H6comparado com o anticorpo de controle nas respectivas glicoformas. Para aforma glicomanipulada, isso é o resultado de uma constante de taxa de dis-sociação diminuída (koff 4 a 2 vezes diminuída). Contrário aos mutantes dogrupo 1, esses anticorpos também têm, nas glicoformas glicomanipuladas enão glicomanipuladas, afinidades aumentadas pelo shFcyRllla carecendo deglicosilação na posição Q162, quando comparado com afinidades mostradaspelas respectivas glicoformas do anticorpo de controle, indicando a influên-cia da mutação de aminoácido na afinidade aperfeiçoada.

Grupo 3 - T260H

A forma glicomanipulada desse mutante tem K0 diminuída pelosFcyRllla quando comparado com o anticorpo de controle glicomanipulado,a qual é o resultado de uma kon 3 vezes aumentada para o mutante glicoma-nipulado. A glicoforma não glicomanipulada desse mutante tem uma afinida-de similar pelo sFcyRllla quando comparado com o anticorpo de controlenão glicomanipulado. Ligação ao shFcyRllla carecendo desse mutante,quando comparado com o anticorpo de controle não glicomanipulado, en-quanto que a ligação pelo mutante glicomanipulado é similar àquele do anti-corpo de controle glicomanipulado.

Os perfis de carboidrato da maioria dos mutantes selecionadosforam analisados e indicam padrões de oligossacarídeo muito similarescomparado com o anticorpo de controle.

Conclusão

Mutantes de IgG foram identificados que mostram uma ligaçãoaumentada ao hFcyRllla quando não fucosilado comparado com o anticorponão modificado (fucosilado). Além disso, alguns mutantes de IgG identifica-dos podem ser identificados os quais têm, de preferência, uma afinidadeaumentada pelo FcyRIIIa, mas não pelo FcyRIIIa-QI62 (o qual carece deglicosilação na posição 162). Além disso, o método descrito permite a sele-ção de mutantes de IgG com características distintas, tal como koff diminuídaou kon aumentada.LISTAGEM DE SEQUENCIA

<110> Glycart Biotechnology AGKoller, ClaudiaStuart, FionaSondermann, PeterBrunker, PeterUmana, Pablo

<120> MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO A ANTÍGENO TENDO REGIÕES FC MODIFICADAS E LI-GAÇÃO ALTERADA A RECEPTORES FC

<130> 1975 . 044PC01

<140> para ser assinado

<141> com isto

<150> US 60/678.776

<151> 09/05/2005

<160> 2

<170> PatentIn Versão 3.3

<210> 1

<211> 987

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 60gcggccctgg gctgcctggt ca.agga.ctac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 120tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 180tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 240tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagcaga gcccaaatct 300tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 360gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 420acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 480gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 540taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 600aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 660aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 720aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 780gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 840tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 900gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 960agcctctccc tgtctccggg taaatga 987

<210> 2<211> 328<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Thr Lvs Giy Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr1 5 10 15

Ser Giy QIy Thr Als. Ala Leu Gly Cys Lsu Vsl Lyis Asp iyr Phe Ρ:20 25 30

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Xhr Ser Gly Val35 40 45

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser50 55 60

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile65 70 "7S 80

Cys Asn Val Asr. His Lvs Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Ala85 90 SS

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala100 105 110

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Lsu Phe Fro Pro Lys Pro115 ' 120 .125

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val130 13S 140

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val145 150 155 160

Asp Giy Val Glu Val His Asn AIa Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln165 170 175

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln180 135 190

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asr. Iiys Ala1S5 200 205Leu Pro Ala I:ro Ile GTj Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Giy C-Ir. ;~r;210 215 220

Arg Glu Pro Gln Vs.1 Tyr Thr Leu Prc Pro Ser 7iry Asp Glu Leu Thr22b 230 235 24C

Lys Asη Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phs Tyr Pro Ser245 250 255

Asjz Iie Ala Val Giu Trp Glu Ser Asn Sly Glr. Pro ·31-_ Asn Asr Xyr26C 265 270

Iys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr275 280 285

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe230 295 300

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys30Ξ 310 315 320

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Sly Lys325

Claims

1. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada compreen-dendo uma região Fc, em que a referida região Fc tem uma estrutura princi-pal de oligossacarídeo alterada como um resultado da referida glicomanipu-lação e tem pelo menos uma modificação de aminoácido e em que a referidamolécula de ligação a antígeno exibe ligação aumentada a um receptorFcyR 111 humano comparado com a molécula de ligação a antígeno que care-ce da referida modificação.

2. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 1, em que a referida molécula de ligação a antígeno nãoexibe ligação aumentada a um receptor FcyRII humano.

3. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 2, em que o referido receptor FcyRI I humano é o recep-tor FcyRIIa humano.

4. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 2, em que o referido receptor FcyRII humano é o recep-tor FcyRIIb humano.

5. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 1, em que o referido receptor FcyRIII é glicosilado.

6. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 5, em que o referido receptor glicosilado compreendeoligossacarídeos N-Iigados em Asn162.

7. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 1, em que o referido receptor FcyRIII é FcyRIIIa.

8. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 1, em que o referido receptor FcyRIII é FcyRIIIb.

9. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 7, em que o referido receptor FcyRIIIa tem um resíduode valina na posição 158.

10. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 7, em que o referido receptor FcyRIIIa tem um resíduode fenilalanina na posição 158.

11. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 5, em que a referida modificação não aumenta substan-cialmente a ligação a um receptor FcyRIII não-glicosilado comparado com amolécula de ligação a antígeno carecendo da referida modificação.

12. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 1, em que a referida região Fc compreende uma substi-tuição em um ou mais dos aminoácidos 239, 241, 243, 260, 262, 263, 264, - 265, 268, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302 ou 303.

13. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 12, em que a referida região Fc compreende uma outrasubstituição em um ou mais dos aminoácidos 239, 241, 243, 260, 262, 263,-264, 265, 268, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302 ou 303.

14. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 1, em que a referida região Fc compreende uma substi-tuição em um ou mais dos aminoácidos 239, 243, 260 ou 268.

15. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 11 a 14, em que as referidas substitui-ções substituem o resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente por umresíduo de aminoácido que interage com o carboidrato preso à Asn162 doreceptor FcyRIII.

16. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 15, em que o referido resíduo de aminoácido que inte-rage com o carboidrato preso à Ans162 do receptor FcyRIII é selecionado dogrupo consistindo em: Trp, His, Tyr, Glu, Arg, Asp, Phe, Asn, e Gln.

17. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 14, em que a referida substituição em um ou mais ami-noácidos é selecionada do grupo consistindo em: Ser239Asp, Ser239Glu,Ser239Trp, Phe243His, Phe243Glu, Thr260His, His268Asp ou His268Glu.

18. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 17, em que a referida substituição em mais de um ami-noácido é selecionada das substituições listadas na Tabela 5.

19. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 12, em que a referida substituição é selecionada de umasubstituição listada na Tabela 2.

20. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 5, em que a referida molécula de ligação a antígeno seliga ao referido receptor FcyRIII com afinidade pelo menos 10% aumentadacomparado com a mesma molécula de ligação a antígeno carecendo da re-ferida modificação.

21. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 1, em que a referida região Fc é uma região Fc de IgGhumana.

22. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 21, em que a referida molécula deligação a antígeno é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo compreen-dendo uma região Fe.

23. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 22, em que o referido anticorpo ou fragmento de anti-corpo é quimérico.

24. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 22, em que o referido anticorpo ou fragmento de anti-corpo é humanizado.

25. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 1, em que a referida molécula de ligação a antígeno e-xibe função efetora aumentada.

26. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 25, em que a referida função efetora aumentada é cito-toxicidade celular anticorpo-dependente aumentada ou citotoxicidade com-plemento-dependente aumentada.

27. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 26, em que a referida estruturaprincipal de oligossacarídeo alterada compreende um número diminuído deresíduos de fucose quando comparado com a molécula de ligação a antíge-no não-glicomanipulada.

28. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 27, em que pelo menos 20% dos oligossacarídeos naregião Fc são não-fucosilados.

29. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 27, em que pelo menos 50% dos oligossacarídeos naregião Fc são não-fucosilados.

30. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 27, em que pelo menos 70% dos oligossacarídeos naregião Fc são não-fucosilados.

31. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 27, em que pelo menos 80% dos oligossacarídeos naregião Fc são não-fucosilados.

32. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 26, em que a referida estruturaprincipal de oligossacarídeo alterada compreende um número aumentado deoligossacarídeo bisseccionados quando comparado com a molécula de liga-ção a antígeno não-glicòmanipulada.

33. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 32, em que uma maioria dos referidos oligossacarídeosbisseccionados são do tipo híbrido.

34. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 32, em que uma maioria dos referidos oligossacarídeosbisseccionados são do tipo complexo.

35. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 26, em que a referida estruturaprincipal de oligossacarídeo alterada compreende um número aumentado deoligossacarídeos híbridos comparado com a molécula de ligação a antígenonão-glicomanipulada.

36. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 26, em que a referida estruturaprincipal de oligossacarídeo alterada compreende um número aumentado deoligossacarídeos complexos comparado com a molécula de ligação a antí-geno não-glicomanipulada.

37. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 1 a 26, em que a referida estruturaprincipal de oligossacarídeo alterada compreende um aumento na proporçãode resíduos de GIcNAc para resíduos de fucose quando comparado com amolécula de ligação a antígeno não-glicomanipulada.

38. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 1, em que a referida molécula de ligação a antígeno seliga seletivamente a um antígeno selecionado do grupo consistindo em: oantígeno CD20 humano, o antígeno EGFR humano, o antígeno MCSP hu-mano, o antígeno MUC-1 humano, o antígeno CEA humano, o antígenoHER2 humano e o antígeno TAG-72 humano.

39. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada compreen-dendo uma região Fc em que a referida região Fc tem uma estrutura princi-pal de oligossacarídeo alterada como um resultado da referida glicomanipu-lação e tem pelo menos uma modificação de aminoácido e em que a referidamolécula de ligação a antígeno exibe especificidade aumentada por um re-ceptor FctRIII humano comparado com a molécula de ligação a antígenoque carece da referida modificação.

40. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 39, em que a referida molécula de ligação a antígenonão exibe ligação aumentada a um receptor FcyRII humano.

41. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 40, em que o referido receptor FctRII humano é o re-ceptor FcyRMa humano.

42. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 40, em que o referido receptor FctRH humano é o re-ceptor FcyRIIb humano.

43. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 39, em que o referido receptor FcyRIII é glicosilado.

44. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 43, em que o referido receptor glicosilado compreendeoligossacarídeos N-Iigados em Asn162.

45. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 39, em que o referido receptor FcyRIII é FcyRIIIa.

46. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 39, em que o referido receptor FcyRIII é FcyRIIIb.

47. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 45, em que o referido receptor FcyRlIIa tem um resíduode valina na posição 158.

48. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 45, em que o referido receptor FcyRIIIa tem um resíduode fenilalanina na posição 158.

49. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 43, em que a referida modificação não aumenta subs-tancialmente a ligação a um receptor FcyRIII não-glicosilado comparado coma molécula de ligação a antígeno carecendo da referida modificação.

50. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 39, em que a referida região Fc compreende uma subs-tituição em um ou mais dos aminoácidos 239, 241, 243, 260, 262, 263, 264,- 265, 268, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302 ou 303.

51. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 50, em que a referida região Fc compreende uma outrasubstituição em um ou mais dos aminoácidos 239, 241, 243, 260, 262, 263,- 264, 265, 268, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302 ou 303.

52. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 39, em que a referida região Fc compreende uma subs-tituição em um ou mais dos aminoácidos 239, 243, 260 ou 268.

53. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 50 a 52, em que as referidas substitui-ções substituem o resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente por umresíduo de aminoácido que interage com o carboidrato preso à Asn162 doreceptor FcyRIII.

54. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 53, em que o referido resíduo de aminoácido que inte-rage com o carboidrato preso à Ans162 do receptor FcyRIII é selecionado dogrupo consistindo em: Trp1 His, Tyr, Glu1 Arg1 Asp1 Phe1 Asn, e Gln.

55. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 52, em que a referida substituição em um ou mais ami-noácidos é selecionada do grupo consistindo em: Ser239Asp, Ser239Glu,Ser239Trp, Phe243His, Phe243Glu, Thr260His, His268Asp ou His268Glu.

56. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 55, em que a referida substituição em mais de um ami-noácido é selecionada das substituições listadas na Tabela 5.

57. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 50, em que a referida substituição é selecionada de umasubstituição listada na Tabela 2.

58. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 39, em que a referida molécula de ligação a antígeno seliga ao referido receptor FcyRIII com afinidade pelo menos 10% aumentadacomparado com a mesma molécula de ligação a antígeno carecendo da re-ferida modificação.

59. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 39, em que a referida região Fc é uma região Fc de IgGhumana.

60. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 39 a 59, em que a referida moléculade ligação a antígeno é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo compre-endendo uma região Fc.

61. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 60, em que o referido anticorpo ou fragmento de anti-corpo é quimérico.

62. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 60, em que o referido anticorpo ou fragmento de anti-corpo é humanizado.

63. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 39, em que a referida molécula de ligação a antígenoexibe função efetora aumentada.

64. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 63, em que a referida função efetora aumentada é cito-toxicidade celular anticorpo-dependente aumentada ou citotoxicidade com-plemento-dependente aumentada.

65. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 39 a 64, em que a referida estruturaprincipal de oligossacarídeo alterada compreende um número diminuído deresíduos de fucose quando comparado com a molécula de ligação a antíge-no não-glicomanipulada.

66. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 65, em que pelo menos 20% dos oligossacarídeos naregião Fc são não-fucosilados.

67. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 65, em que pelo menos 50% dos oligossacarídeos naregião Fc são não-fucosilados.

68. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 65, em que pelo menos 70% dos oligossacarídeos naregião Fc são não-fucosilados.

69. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 65, em que pelo menos 80% dos oligossacarídeos naregião Fc são não-fucosilados.

70. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 39 a 64, em que a referida estruturaprincipal de oligossacarídeo alterada compreende um número aumentado deoligossacarídeo bisseccionados quando comparado com a molécula de liga-ção a antígeno não-glicomanipulada.

71. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 70, em que uma maioria dos referidos oligossacarídeosbisseccionados são do tipo híbrido.

72. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 70, em que uma maioria dos referidos oligossacarídeosbisseccionados são do tipo complexo.

73. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 39 a 64, em que a referida estruturaprincipal de oligossacarídeo alterada compreende um número aumentado deoligossacarídeos híbridos comparado com a molécula de ligação a antígenonão-glicomanipulada.

74. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 39 a 64, em que a referida estruturaprincipal de oligossacarídeo alterada compreende um número aumentado deoligossacarídeos complexos comparado com a molécula de ligação a antí-geno não-glicomanipulada.

75. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom qualquer uma das reivindicações 39 a 64, em que a referida estruturaprincipal de oligossacarídeo alterada compreende um aumento na proporçãode resíduos de GIcNAc para resíduos de fucose quando comparado com amolécula de ligação a antígeno não-glicomanipulada.

76. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 39, em que a referida molécula de ligação a antígeno seliga seletivamente a um antígeno selecionado do grupo consistindo em: oantígeno CD20 humano, o antígeno EGFR humano, o antígeno MCSP hu-mano, o antígeno MUC-1 humano, o antígeno CEA humano, o antígenoHER2 humano e o antígeno TAG-72 humano.

77. Polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreenden-do uma região Fc de anticorpo ou um fragmento de uma região Fc de anti-corpo em que a referida região Fc ou fragmento da mesma tem pelo menosuma modificação de aminoácido e em que o referido polipeptídeo exibe Iiga-ção aumentada a um receptor FcyRIII humano comparado com o mesmopolipeptídeo que carece da referida modificação.

78. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 77, em que oreferido polipeptídeo é uma cadeia pesada de anticorpo.

79. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 77, em que oreferido polipeptídeo é uma proteína de fusão.

80. Polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de acordo com areivindicação 77.

81. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 80, em que oreferido polipeptídeo é uma cadeia pesada de anticorpo.

82. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 80, em que oreferido polipeptídeo é uma proteína de fusão.

83. Molécula de ligação a antígeno compreendendo um polipep-tídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 80 a 82.

84. Vetor compreendendo o polinucleotídeo como definido emqualquer uma das reivindicações 77 a 79.

85. Célula hospedeira compreendendo o vetor como definido areivindicação 84.

86. Método para produção de uma molécula de ligação a antíge-no glicomanipulada compreendendo uma região Fc1 em que a referida regiãoFc tem uma estrutura principal de oligossacarídeo alterada como um resul-tado da referida glicomanipulação e tem pelo menos uma modificação deaminoácido e em que a referida molécula de ligação a antígeno exibe liga-ção aumentada a um receptor FcyRI11 humano comparado com a moléculade ligação a antígeno que carece da referida modificação, o referido métodocompreendendo:(a) cultura da célula hospedeira como definido na reivindica-ção 85, sob condições que permitem a expressão do refe-rido polinucleotídeo; e(b) recuperação da referida molécula de ligação a antígenoglicomanipulada do-meio de cultura.

87. Método para produção de uma molécula de ligação a antíge-no glicomanipulada compreendendo uma região Fc, em que a referida regiãoFc tem uma estrutura principal de oligossacarídeo alterada como um resul-tado da referida glicomanipulação e tem pelo menos uma modificação deaminoácido e em que a referida molécula de ligação a antígeno exibe espe-cificidade aumentada por um receptor FcyRIII humano comparado com amolécula de ligação a antígeno que carece da referida modificação, o referi-do método compreendendo:(a) cultura da célula hospedeira como definido na reivindica-ção 85, sob condições que permitem a expressão do refe-rido polinucleotídeo; e(b) recuperação da referida molécula de ligação a antígenoglicomanipulada do meio de cultura.

88. Molécula de ligação a antígeno glicomanipulada de acordocom a reivindicação 22 ou a reivindicação 60, em que o referido anticorpo oufragmento de anticorpo é totalmente humano.

89. Polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreenden-do uma região Fc de anticorpo ou um fragmento de uma região Fc de anti-corpo em que a referida região Fc ou fragmento da mesma tem pelo menosuma modificação de aminoácido e em que o referido polipeptídeo é a molé-cula de ligação a antígeno como definido em qualquer uma das reivindica-ções 1 a 76.

90. Uso da molécula de ligação a antígeno como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 76, 83 ou 88, para a fabricação de ummedicamento para o tratamento ou profilaxia de câncer.

91. Uso de acordo com a reivindicação 90, em que o referidocâncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de mama, câncer debexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer pancreático,câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer de próstata,câncer de rim e câncer de cérebro.

92. Uso da molécula de ligação a antígeno como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 76, 83 ou 88, para a fabricação de ummedicamento para o tratamento ou profilaxia de uma condição ou lesão pré-cancerígena.

93. Uso de acordo com a reivindicação 92, em que a referidacondição ou lesão pré-cancerígena é selecionada do grupo consistindo emIeucoplasia oral, queratose actínica (queratose solar), pólipos pré-can-cerígenos do cólon ou reto, displasia epitelial gástrica, displasia adenomato-sa, síndrome de câncer de cólon com não-polipose hereditária (HNPCC),esôfago de Barrett, displasia da bexiga e condições cervicais pré-cancerígenas.

94. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a-93, em que a referida molécula de ligação a antígeno é usada em uma quan-tidade terapeuticamente eficaz de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 15 mg/kg.

95. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a-94, em que a referida quantidade terapeuticamente eficaz é de cerca de 1,5mg/kg a cerca de 12 mg/kg.

96. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a-95, em que a referida quantidade terapeuticamente eficaz é de cerca de 1,5mg/kg a cerca de 4,5 mg/kg.

97. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a-96, em que a referida quantidade terapeuticamente eficaz é de cerca de 4,5mg/kg a cerca de 12 mg/kg.

98. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a-97, em que a referida quantidade terapeuticamente eficaz é cerca de 1,5mg/kg.

99. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a-98, em que a referida quantidade terapeuticamente eficaz é cerca de 4,5mg/kg.

100. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 90 a-99, em que a referida quantidade terapeuticamente eficaz é cerca de 12mg/kg.

101. Compostos, processos, composições farmacêuticas, méto-dos e usos conforme descrito aqui.

102. Composição farmacêutica compreendendo a molécula deligação a antígeno como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a-76, 83 ou 88, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

103. Método para o tratamento ou profilaxia de câncer compre-endendo administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz da com-posição de acordo com a reivindicação 102, a um paciente que precisa damesma.

104. Método de acordo com a reivindicação 103, em que o refe-rido câncer é selecionado do grupo consistindo em câncer de mama, câncerde bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pele, câncer pancreático,câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de cólon, câncer de próstata,câncer de rim e câncer de cérebro.

105. Método para o tratamento ou profilaxia de uma condição oulesão pré-cancerígena compreendendo administração de uma quantidadeterapeuticamente eficaz da composição farmacêutica como definido na rei-vindicação 102, a um paciente que precisa da mesma.

106. Método de acordo com a reivindicação 105, em que a refe-rida condição ou lesão pré-cancerígena é selecionada do grupo consistindoem Ieucoplasia oral, queratose actínica (queratose solar), pólipos pré-cancerígenos do cólon ou reto, displasia epitelial gástrica, displasia adeno-matosa, síndrome de câncer de cólon com não-polipose hereditária(HNPCC), esôfago de Barrett, displasia da bexiga e condições cervicais pré-cancerígenas.

107. Molécula de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 76, 83 ou 88, para uso no tratamento ou profila-xia de câncer.

108. Molécula de ligação a antígeno de acordo com a reivindica-ção 107, em que o referido câncer é selecionado do grupo consistindo emcâncer de mama, câncer de bexiga, câncer de cabeça e pescoço, câncer depele, câncer pancreático, câncer de pulmão, câncer ovariano, câncer de có-lon, câncer de próstata, câncer de rim e câncer de cérebro.

109. Molécula de ligação a antígeno de acordo com qualqueruma das reivindicações 1 a 76, 83 ou 88, para uso no tratamento ou profila-xia de uma condição ou lesão pré-cancerígena.

110. Molécula de ligação a antígeno de acordo com a reivindica-ção 109, em que a referida condição ou lesão pré-cancerígena é seleciona-da do grupo consistindo em Ieucoplasia oral, queratose actínica (queratosesolar), pólipos pré-cancerígenos do cólon ou reto, displasia epitelial gástrica,displasia adenomatosa, síndrome de câncer de cólon com não-polipose he-reditária (HNPCC), esôfago de Barrett, displasia da bexiga e condições cer-vicais pré-cancerígenas.

111. Molécula de ligação a antígeno de acordo com as reivindi-cações 1 a 76, 83 ou 88, para uso em terapia.