BRPI0611570A2 - métodos para fixar covalentemente peg a um polipeptìdeo e para modificar propriedades farmacológicas de hormÈnio de crescimento, composto e sais, pró-drogas ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, hormÈnio de crescimento humano, composição farmacêutica, método para tratamento de doença e, uso de um composto - Google Patents

métodos para fixar covalentemente peg a um polipeptìdeo e para modificar propriedades farmacológicas de hormÈnio de crescimento, composto e sais, pró-drogas ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, hormÈnio de crescimento humano, composição farmacêutica, método para tratamento de doença e, uso de um composto Download PDF

Info

Publication number
BRPI0611570A2
BRPI0611570A2 BRPI0611570-5A BRPI0611570A BRPI0611570A2 BR PI0611570 A2 BRPI0611570 A2 BR PI0611570A2 BR PI0611570 A BRPI0611570 A BR PI0611570A BR PI0611570 A2 BRPI0611570 A2 BR PI0611570A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
mpeg
yloxy
hgh
formula
bis
Prior art date
Application number
BRPI0611570-5A
Other languages
English (en)
Inventor
Florencio Zaragoza Doerwald
Niels Langeland Johansen
Lars Fogh Iversen
Original Assignee
Novo Nordisk Healthcare Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novo Nordisk Healthcare Ag filed Critical Novo Nordisk Healthcare Ag
Publication of BRPI0611570A2 publication Critical patent/BRPI0611570A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/10—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for impotence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/02—Drugs for disorders of the endocrine system of the hypothalamic hormones, e.g. TRH, GnRH, CRH, GRH, somatostatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/10—Drugs for disorders of the endocrine system of the posterior pituitary hormones, e.g. oxytocin, ADH
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/02—Aminoacyltransferases (2.3.2)
    • C12Y203/02013—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

MéTODOS PARA FIXAR COVALENTEMENTE PEG A UM POLIPEPTìDEO E PARA MODIFICAR PROPRIEDADES FARMACOLóGICAS DE HORMÈNIO DE CRESCIMENTO, COMPOSTO E SAIS, PRó-DROGAS OU SOLVATOS FARMACEUTICAMENTE ACEITáVEIS DO MESMO, HORMÈNIO DE CRESCIMENTO HUMANO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, MéTODO PARA TRATAMENTO DE DOENçA, E, USO DE UM COMPOSTO. Método para PEGuilar hormónio de crescimento, referido método compreendendo reagir hormónio de crescimento com uma amina compreendendo nucleófilo que ainda compreende um primeiro grupo funcional na presença de TGase para formar um hormónio de crescimento transaminado, seguido por uma reação de referido hormónio de crescimento transaminado com um PEG que foi funcionalizado com um segundo grupo funcional, em que referido primeiro e segundo grupos funcionais são selecionados de modo que eles reagem para formar uma ligação covalente.

Description

"METODOS PARA FIXAR COVALENTEMENTE PEG A UMPOLIPEPTÍDEO E PARA MODIFICAR PROPRIEDADESFARMACOLÓGICAS DE HORMÔNIO DE CRESCIMENTO,COMPOSTO E SAIS, PRÓ-DROGAS OU SOLVATOSFARMACEUTICAMENTE ACEITÁVEIS DO MESMO, HORMÔNIO DECRESCIMENTO HUMANO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA,MÉTODO PARA TRATAMENTO DE DOENÇA, E, USO DE UMCOMPOSTO"
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a um novo método para aconjugação pós-translacional de hormônio de crescimento em que atransglutaminase é usada para incorporar um ponto de fixação em posiçõesespecíficas no peptídeo em que PEG pode ser seletivamente fixado. Osreferidos hormônios de crescimento conjugados tem características alteradas epodem ser assim usados em aplicações terapêuticas.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Conhece-se bem modificar as propriedades e características depeptídeos por conjugação de grupos no peptídeo que devidamente muda aspropriedades dos peptídeo. Esta conjugação geralmente requer algum grupofuncional no peptídeo para reagir com outro grupo funcional em um grupoconjugante. Tipicamente, grupos amino, tal como o grupo amino N-terminalou o grupo ε-amino em lisinas, tem sido usados em combinação com umreagente acilante apropriado. Com freqüência é desejado ou mesmo requeridoser capaz de controlar a reação de conjugação, isto é controlar onde oscompostos conjugantes compostos fixados e controlar como muitos gruposconjugantes são fixados. Isto é com freqüência referido como especificidade.
Conjugação de peptídeos em general tem sido conhecido pormuito tempo, e US 4,179,337 descreve há mais de 20 anos atrás peptídeos, eem particular hormônio de crescimento conjugado em polietileno oupolipropileno glicóis.
Diferentes tipos de químicas tem sido descritos, os quais sãoefetivos na formação de uma ligação entre o peptídeo e a porção a serconjugada no peptídeo. EP 605 963 descreve um enxerto de polímerosaquosos que forma uma ligação oxima com um grupo aldeído em umaproteína. Nenhum dos aminoácidos naturais compreende um aldeído, assimum grupo hidroxila precisa ser oxidado em uma primeira etapa no processo deconjugação. WO 96/41813 descreve polímeros que são funcionalizados comum grupo formador de amino-óxi oxima, utilizável em reações de conjugação.WO 98/05363 descreve um composto compreendendo um peptídeo e umpolímero solúvel em água, em que os dois são covalentemente ligados atravésde uma ligação oxima em um resíduo aminoácido N-terminal.
Além disso, o uso de enzimas para permitir uma conjugaçãomais específica de peptídeos é conhecido. EP 243 929 descreve o uso deenzimas proteolíticas, tal como carboxipeptidase para incorporar umcomposto com um grupo funcional no C-termino de um peptídeo, ondereferido grupo funcional pode subseqüentemente ser usado para fixar gruposcitotóxicos, outros peptídeos ou grupos repórter usados para facilitar a análisedos peptídeos, tal como por exemplo grupos fluorescentes. Esta técnica, noentanto, limita o ponto de fixação do resíduo de aminoácido C-terminal, o queconstitui uma severa limitação se o resíduo C-terminal for essencial para aatividade do peptídeo.
Transglutaminase tem sido usada anteriormente para alterar aspropriedades de peptídeos. Na indústria alimentícia e particularmente naindústria de laticínios, muitas técnicas estão disponíveis para, por exemplo,reticular peptídeos usando transglutaminases. Outros documentos descrevemo uso de transglutaminase para alterar as propriedades de peptídeosfisiologicamente ativos. EP 950665, EP 785276 e Sato, Adv. Drug DeliveryRev. 54, 487-504 (2002) descreve a reação direta entre peptídeoscompreendendo pelo menos um Gln e PEG funcionalizado por amina ouligandos similares na presença de transglutaminase, e Wada, Biotech. Lett.23, 1367-1372 (2001) descreve a conjugação direta de β-lactoglobulina comácidos graxos por meio de transglutaminase. O pedido de patenteinternacional publicado como W02005/070468 descreve o uso detransglutaminase para incorporar um cabo à mesma onde os gruposconjugantes podem ser fixados.
É um objeto da presente invenção prover um método pelo qualhormônio de crescimento pode ser conjugado com PEG em posiçõesespecífica com um alto grau de especificidade. Os conjugados obtidos poreste método tem características melhoradas ou alternativas, por exemplocaracterísticas farmacológicas, que os tornam apropriados, particularmenteem terapia.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em uma forma de realização, a invenção refere-se a ummétodo de fixar covalentemente uma porção PEG a um hormônio decrescimento, o método compreende reagir, em uma ou mais etapas, umresíduo de glutamina compreendendo hormônio de crescimento representadopor fórmula [Ia]
<formula>formula see original document page 4</formula>
em que GH representa um radical de hormônio de crescimentoobtido por remoção de -C(^O)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo deglutamina presente em hormônio de crescimento, com um nucleófilocontendo nitrogênio de fórmula [II]
<formula>formula see original document page 4</formula>
em que D representa -O- ou uma ligação única;r representa C1^alquileno, -(CH2)4-CH(NH2)-Co-NH-CH2-, -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-, ou C5-i5heteroalquileno;
X representa -O-NH2, um aldeído, uma cetona, ou um grupolatente que, quando de outra reação, pode ser transformado em -O-NH2, umaldeído ou uma cetona;
na presença de transglutaminase para formar um hormônio decrescimento transaminado de fórmula [Illa]
<formula>formula see original document page 5</formula>
opcionalmente, se X é um grupo latente, transformar referidogrupo latente em -O-NH2, um aldeído ou uma cetona,
referido hormônio de crescimento transaminado sendo aindareagido com um segundo composto de fórmula [IV]
<formula>formula see original document page 5</formula>
em que Y,
se X representa um aldeído, uma cetona, ou um grupo latenteque, quando de outra reação, pode ser transformado em um aldeído ou umacetona, representa -O-NH2; ou,
se X representa -O-NH2, ou um grupo latente que, quando deoutra reação, pode ser transformado em -O-NH2, representa um aldeído ouuma cetona; e
Z representa uma porção selecionada dentre
<formula>formula see original document page 5</formula><formula>formula see original document page 6</formula><formula>formula see original document page 7</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;<formula>formula see original document page 8</formula>
desde que se Z é 2 2 5 , então PEG é 10 kDa PEGpara formar um hormônio de crescimento PEGuilado defórmula [Va]
<formula>formula see original document page 8</formula>
em que A representa uma ligação oxima.
Em uma forma de realização, a invenção provê compostos defórmula [V] ou [Va] e qualquer sal, pró-droga ou solvato farmaceuticamenteaceitável do mesmo.
Em uma forma de realização, a invenção provê hGH, que foiPEGuilado na posição correspondendo à posição 40 e/ou 141 em SEQ ID No. 1.
Em uma outra forma de realização, a invenção provêcomposições compreendendo compostos de fórmula [V] ou [Va], e emparticular composições farmacêuticas compreendendo compostos de fórmula[Va],
Em uma forma de realização, a invenção provê o uso decompostos de fórmula [Va] em terapia.
Em uma forma de realização, a invenção provê um método detratamento de doenças que se beneficiam de um aumento no nível do nível dehormônio de crescimento no plasma, o método compreendendo aadministração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto defórmula [Va].
Em uma forma de realização, a invenção provê o uso de umcomposto de fórmula [Va] na fabricação de um medicamento para otratamento de doenças se beneficiando de um aumento no nível no plasma dehormônio de crescimento.
Em uma forma de realização, a invenção provê um métodopara melhorar ou modificar as propriedades farmacológicas de hormônio decrescimento, o método compreendendo PEGuilar referido hormônio decrescimento de acordo com os métodos da presente invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DA LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
SEQ ID No. 1 é a seqüência de aminoácidos de hormônio decrescimento humano, também conhecido como 22K-hGH.h
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção é baseada na observação de que aPEGuilação no N-término e em particular no C-término de hGH dá lugar auma diminuição bem maior na atividade do que a PEGuilação em algunsaminoácidos entre os dois términos, isto é PEGuilação em cadeia. Emparticular, a PEGuilação nas posições correspondendo às posições 40 e/ou141 em um hGH tendo uma seqüência de SEQ ID No.l dá lugar a hGHPEGuilado em que uma grande proporção de uma atividade foi retida.Posições 40 e 141 são ambas glutamina, e, de fato, um hGH tendo umaseqüência de SEQ ID No. 1 compreende ainda 11 resíduos de glutaminase, ouseja em posições 22, 29, 46, 49, 68, 69, 84, 91, 122, 137, e 181.No entanto,verificou-se surpreendentemente que o uso de transglutaminase (TGase), e emparticular TGase de Streptoverticillium mobaraenae ou Streptomyces lydieuspermite uma PEGuilação seletiva em posições 40 e/ou 141, e que os restantes11 resíduos de glutaminase são deixados inalterados apesar do fato de que aglutamina ser um substrato para transglutaminase.
O método da presente invenção também pode ser utilizávelpara a PEGuilação em cadeia de qualquer polipeptídeo compreendendo um oumais resíduos de glutaminas, por exemplo os polipeptídeos terapeuticamenteinteressantes. Isto é particularmente utilizável para a peguilação depolipeptídeos, que compreende mais de um resíduo de glutamina, e em queuma PEGuilação específica para sítio é desejada, mas o método pode serusado para transglutaminar qualquer resíduo de glutamina compreendendopolipeptídeo.
A presente invenção assim provê um método para fixarcovalentemente PEG a um polipeptídeo compreendendo pelo menos umresíduo de glutamina, referido método compreende reagir, em uma ou maisetapas, este resíduo de glutamina compreendendo polipeptídeo representadopor fórmula [I]
<formula>formula see original document page 10</formula>
em que PP representa um radical de polipeptídeo obtido porremoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo de glutaminapresente no polipeptídeo, com um nucleófilo contendo nitrogênio de fórmula
<formula>formula see original document page 10</formula>
em que d representa -o- ou uma ligação única;r representa C1^alquileno, -(CH2)4-CH(NH2)-Co-NH-CH2-, -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-, ou C5.i5heteroalquileno;
X representa -O-NH2, um aldeído, uma cetona, ou um grupolatente que, quando de outra reação, pode ser transformado em -O-NH2, umaldeído ou uma cetona;
na presença de transglutaminase para formar um polipeptídeotransaminado de fórmula [III]
<formula>formula see original document page 10</formula>opcionalmente, se X é um grupo latente, transformar referidogrupo latente em -O-NH2, um aldeído ou uma cetona,
referido polipeptídeo transaminado sendo ainda reagido comum segundo composto de fórmula [IV]
<formula>formula see original document page 11</formula>
em que Y,
se X representa um aldeído, uma cetona, ou um grupo latenteque, quando de outra reação, pode ser transformado em um aldeído ou umacetona, representa -O-NH2; ou,
se X representa -O-NH2, ou um grupo latente que, quando deoutra reação, pode ser transformado em -O-NH2, representa um aldeído ouuma cetona; e
Z representa uma porção selecionada dentre
<formula>formula see original document page 11</formula><formula>formula see original document page 12</formula><formula>formula see original document page 13</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;
<formula>formula see original document page 13</formula>
desde que se Z é 2 2 5 , então PEG é 10 kDa PEGpara formar um PEGuilado polipeptídeo de fórmula [V]
<formula>formula see original document page 13</formula><formula>formula see original document page 14</formula>
em que A representa uma ligação oxima;
ou qualquer sal, pró-droga ou solvato farmaceuticamenteaceitável do mesmo.
O termo polipeptídeo como usado aqui inclui qualquerapropriado polipeptídeo e pode ser usado como sinônimo com os termospeptídeo e proteína, salvo indicado em contrário ou contradito por contexto. Otermo polipeptídeo aqui deve ser geralmente entendido como se referindo aqualquer apropriado polipeptídeo de qualquer apropriado tamanho ecomposição (com relação ao número de aminoácidos e número de cadeiasassociadas na molécula da proteína). Além disso, polipeptídeos no contextodos métodos inventivos e composições descritos aqui podem compreendemresíduos de ocorrência natural ou não L- aminoácido L, salvo indicado emcontrário ou contradito por contexto. Os polipeptídeos também podem serderivatizados. Um polipeptídeo derivatizado deve geralmente ser entendidocomo se referindo a um polipeptídeo em que um ou mais dos resíduos deaminoácidos dos polipeptídeo foram quimicamente modificados (por exemplopor alquilação, acilação, formação de éster, ou formação amida) ou associadocom um ou mais substituintes moleculares não aminoácidos atômicos,orgânicos e/ou inorgânicos e também podem ou alternativamentecompreender resíduos não essenciais, não de ocorrência natural, e/ou não Laminoácidos, salvo indicado em contrário ou contradito por contexto.Exemplos não limitativos destes resíduos de aminoácido incluem por exemploácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, β-alanina, ácido β-aminopropiônico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diaminobutírico,desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiônico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alohidroxilisina, 3-hidroxiprolina,4-hidroxiprolina, isodesmosina, aloisoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, 6-N-metillisina, N-metilvalina, norvalina, norleucina,ornitina, e aminoácidos estatina halogenados. Polipeptídeos, que sãoterapeuticamente utilizáveis e onde a terapia usando os polipeptídeos deve sebeneficiar de, por exemplo, um tempo de retenção aumentado, sãoparticularmente apropriados para uso em um método da presente invenção.
Em uma forma de realização, o polipeptídeo é um resíduo deglutamina compreendendo hormônio de crescimento e PP representa umradical de hormônio de crescimento obtido por remoção de -C(=0)-NH2 dacadeia lateral de um resíduo de glutamina presente em hormônio decrescimento.
A presente invenção assim provê um método para fixarcovalentemente PEG a um hormônio de crescimento, o método compreendereagir, em uma ou mais etapas, um resíduo de glutamina compreendendohormônio de crescimento representado por fórmula [Ia]
<formula>formula see original document page 15</formula>
em que GH representa um radical de hormônio de crescimentoobtido por remoção de -C(^O)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo deglutamina presente em hormônio de crescimento, com um nucleófilocontendo nitrogênio de fórmula [II]
<formula>formula see original document page 15</formula>
em que D representa -O- ou uma ligação única;
r representa Ci_6alquileno, -(CH2)4-CH(NH2)-Co-NH-CH2-, -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-, ou C5.i5heteroalquileno;
X representa -O-NH2, um aldeído, uma cetona, ou um grupolatente que, quando de outra reação, pode ser transformado em -O-NH2, umaldeído ou uma cetona;na presença de transglutaminase para formar um hormônio decrescimento transaminado de fórmula [Illa]
<formula>formula see original document page 16</formula>
opcionalmente, se X é um grupo latente, transformar referidogrupo latente em -O-NH2, um aldeído ou uma cetona,
referido hormônio de crescimento transaminado sendo aindareagido com um segundo composto de fórmula [IV]
<formula>formula see original document page 16</formula>
em que Y representa -O-NH2, aldeído, cetona; e
Z representa uma porção selecionada dentre
<formula>formula see original document page 16</formula><formula>formula see original document page 17</formula><formula>formula see original document page 18</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;
<formula>formula see original document page 18</formula>
desde que se Z é então PEG é 10 kDa PEGpara formar um hormônio de crescimento PEGuilado defórmula [Va]<formula>formula see original document page 19</formula>
em que A representa uma ligação oxima;
ou qualquer sal, pró-droga ou solvato farmaceuticamenteaceitável do mesmo.
No presente contexto, "hormônio de crescimento" (GH)destina-se a indicar uma proteína que demonstra atividade de hormônio decrescimento como determinado em teste I aqui. A proteína que demonstrauma atividade acima de 20%, tal como acima de 40%, tal como acima de60%, tal como acima de 80% deste hGH no referido teste é definido como umhormônio de crescimento.
No presente contexto, o termo "transaminação" e termosrelacionados destinam-se a indicar a reação onde nitrogênio na cadeia lateralde glutamina é trocado com nitrogênio de outro composto, em particularnitrogênio de outro nitrogênio contendo nucleófilo.
O termo "radical" ou "biradical" destina-se a indicar umfragmento molecular com um ou dois elétrons sem par, respectivamente. Estefragmento pode ser formalmente gerado por remoção de um (por exemplo, ahidrogênio) ou dois átomos ou grupos de átomos (por exemplo, um grupohidroxila) por clivagem de ligação homolítica, isto é uma clivagem deligação, em que cada dos dois fragmentos resultantes contém um dos doiselétrons que formaram a ligação original. Como usado aqui, "hGH(141)"significa um radical formado por remoção formal dos grupos CONH2- deglutamina(141) em hGH, "hGH(40)" significa um radical formado porremoção formal dos grupos CONH2- de glutamina(40) em hGH, e"hGH(40,141)" significa um radical formado por remoção formal dos gruposCONH2- de glutamina(40) e glutamina(141) em hGH. hGH(40/141) significaum radical formado por remoção formal dos grupos CONH2- deglutamina(40) e/ou glutamina(141) em hGH, englobando misturas de dois oumais de hGH(40), hGH(141), e (hGH(40,141).
O termo "alquileno" destina-se a indicar um bi-radical de umhidrocarboneto saturado, linear, ramificado e/ou cíclico. Salvo especificadocom outro número de átomos de carbono, o termo destina-se a indicarhidrocarbonetos com de 2 a 6 (ambos incluídos) átomos de carbono, tal como2 a 5 (ambos incluídos), tal como de 2 a 4 (ambos incluídos), por exemplo de2 a 3 (ambos incluídos). Particulares exemplos incluem etileno, propileno,butileno, pentileno e hexileno.
O termo heteroalquileno destina-se a indicar um alquilenocomo indicado acima de em que um ou mais grupos metileno foramsubstituídos com -O-. Particulares exemplos incluem diradicais de polietilenoglicol.
O termo "PEG" ou "Peg" significa um diradical polidispersoou monodisperso da estrutura
<formula>formula see original document page 20</formula>
em que η é um inteiro maior do que 1, e seu peso molecularestá entre aproximadamente 100 e aproximadamente 1,000,000 Da.
O termo "mPEG" ou "mPeg" significa um radical polidispersoou monodisperso da estrutura
<formula>formula see original document page 20</formula>
em que m é um inteiro maior do que 1. Assim, um mPEG emque m é 90 tem um peso molecular de 3991 Da, isto é aproximadamente4kDa. Do mesmo modo, um mPEG com um peso molecular médio de 20 kDatem um m médio de 454. Devido ao processo para produzir mPEG estasmoléculas com freqüência tem uma distribuição de pesos moleculares. Estadistribuição é descrita pelo índice de polidispersidade.
O termo "índice de polidispersidade" como usado aquisignifica a relação entre peso molecular médio ponderai e o peso molecularmédio numérico, como conhecido na técnica de química de polímeros (verpor exemplo "Polymer Síntese and Characterization", J.A. Nairn, Universityde Utah, 2003). O índice de polidispersidade é um número que é maior do queou igual a um, e pode ser estimado a partir dos dados de cromatografia depermeação de gel. Quando o índice de polidispersidade é 1, o produto émonodisperso e é assim feito de compostos com um peso molecular único.
Quando o índice de polidispersidade é maior do que 1, ele é uma medida dapolidispersidade deste polímero, isto é como é ampla a distribuição depolímeros com diferentes pesos moleculares.
O uso de, por exemplo, "mPEG20000" ou "mPEG(20k)" emfórmulas, nomes compostos ou em estruturas moleculares indica um resíduomPEG em que mPEG é polidisperso e tem um peso molecular deaproximadamente 20 kDa.
O índice de polidispersidade tipicamente aumenta com o pesomolecular do PEG ou mPEG. Quando referência é feita a 20 kDa PEG e emparticular 20 kDa mPEG, destina-se a indicar um composto (ou de fato amistura de compostos) com um índice de polidispersidade abaixo de 1,06, talcomo abaixo de 1,05, tal como abaixo de 1,04, tal como abaixo de 1,03, talcomo entre 1,02 e 1,03. Quando referência é feita a 30 kDa PEG e emparticular 30 kDa mPEG, destina-se a indicar um composto (ou de fato amistura de compostos) com um índice de polidispersidade abaixo de 1,06, talcomo abaixo de 1,05, tal como abaixo de 1,04, tal como abaixo de 1,03, talcomo entre 1,02 e 1,03. Quando referência é feita a 40 kDa PEG e emparticular 40 kDa mPEG, destina-se a indicar um composto (ou de fato amistura de compostos) com um índice de polidispersidade abaixo de 1,06, talcomo abaixo de 1,05, tal como abaixo de 1,04, tal como abaixo de 1,03, talcomo entre 1,02 e 1,03.
O termo "GH PEGuilado" ou " hGH PEGuilado" destina-se aindicar GH ou hGH que foi covalentemente fixado a PEG5 isto é, ele indicaum conjugado compreendendo GH ou hGH e PEG, em que referido GH ouhGH e referido PEG são covalentemente ligados um no outro. A referidafixação pode ser via um ligador.
O termo "conjugado" como um nome, destina-se a indicar umpeptídeo modificado, isto é um peptídeo com uma porção ligada ao mesmopara modificar as propriedades de referido peptídeo. Como um verbo, o termodestina-se a indicar o processo de ligação de uma porção a um peptídeo paramodificar as propriedades de referido peptídeo.
O termo "ligação oxima" destina-se a indicar uma subestruturaquímica da estrutura -O-N=. Na fórmula estrutural, como usado aqui, aligação de oxima representada por A na fórmula pode ser posicionada emqualquer direção, isto é ou -O-N= ou =N-O-. Em uma forma de realização, adireção da ligação oxima na fórmula estrutural dada é -O-N=. Em outra formade realização, a direção da ligação oxima na fórmula estrutural dada é =N-O-.
No presente contexto, o termo "sal farmaceuticamenteaceitável" destina-se a indicar sais que não são prejudiciais para o paciente.
Estes sais incluem sais de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveis, saisde metal farmaceuticamente aceitáveis, sais de amônio e amônio alquilado.
Os sais de adição de ácido incluem sais de ácidos inorgânicos assim comoácidos orgânicos. Representativos exemplos de ácidos inorgânicosapropriados incluem ácidos clorídrico, bromídrico, iodídrico, fosfórico,sulfurico, nítrico e outros. Exemplos representativos de ácidos orgânicosapropriados incluem ácidos fórmico, acético, tricloroacetico, trifluoroacetico,propiônico, benzóico, cinâmico, cítrico, fumárico, glicólico, láctico, maleico,málico, malônico, mandélico, oxálico, picrico, pirúvico, salicílico, succínico,metanossulfônico, etanosssulfônico, tartárico, ascórbico, pamóico,bismetileno salicílico, etanodissulfônico, glucônico, citracônico, aspártico,esteárico, palmítico, EDTA, glicólico, p-aminobenzóico, glutâmico,benzenossulfônico, p-toluenossulfônico e outros. Outros exemplos de saisinorgânicos ou orgânicos de adição de ácido farmaceuticamente aceitáveisincluem os sais farmaceuticamente aceitáveis listados em J. Pharm. Sei. 1977,66, 2, que é incorporado aqui por referência. Exemplos de sais de metalincluem sais de lítio, sódio, potássio, magnésio e outros. Exemplos de sais deamônio e amônio alquilado incluem sais amônio, metilamônio,dimetilamônio, trimetilamônio, etilamônio, hidroxietilamônio, dietilamônio,butilamônio, tetrametilamônio e outros.
O termo "pró-droga" como usado aqui destina-se a indicar umcomposto que não tem ou não tem necessariamente uma atividade terapêuticamas que, quando da administração, é transformado em um compostoterapeuticamente ativo por uma reação ocorrendo no corpo. Tipicamente,estas reações são hidrólise, por exemplo por esterases ou oxidações.
Exemplos de pró-drogas incluem amidas bio-hidrolisáveis e ésteres bio-hidrolisáveis e também engloba a) compostos em que a funcionalidade bio-hidrolisável no pró-droga é englobada no composto de acordo com a presenteinvenção, e b) compostos que podem ser oxidados ou reduzidosbiologicamente em um dado grupo funcional para dar as substâncias defármaco de acordo com a presente invenção. Exemplos destes gruposfuncionais incluem 1,4-dihidropiridina, N-alquilcarbonil-l,4-dihidropiridina,1,4-ciclohexadieno, terc-butila, e outros.
Como usado aqui, o termo "amida bio-hidrolisável" é umaamida de uma substância de fármaco (no caso, um composto de acordo com apresente invenção) que ou a) não interfere com a atividade biológica dasubstância parental mas confere sobre esta substância propriedades vantajosasem vivo, tal como duração de ação, início de ação, e outros, ou b) ébiologicamente inativo mas é prontamente convertido em vivo pelo indivíduoem um princípio biologicamente ativo. A vantagem é que, por exemplo, umasolubilidade aumentada em que a amida bio-hidrolisável é oralmenteabsorvida do intestino e é transformada em um composto de acordo com apresente invenção em plasma. Muitos exemplos destes são conhecidos natécnica e incluem, por título de exemplo, amidas de alquila inferior, a-aminoácido amidas, alcoxiacila amidas, e alquilaminoalquilcarbonila amidas.
Como usado aqui, o termo "éster bio-hidrolisável" é um ésterde uma substância de fármaco (no caso, um composto de acordo com ainvenção) que ou a) não interfere com a atividade biológica da substânciaparental mas confere nesta substância propriedades vantajosas em vivo talcomo duração de ação, início de ação, e outros, ou b) é biologicamente inativomas é prontamente convertido em vivo pelo indivíduo em um princípiobiologicamente ativo. A vantagem é, por exemplo solubilidade aumentada ouque o éster bio-hidrolisável é oralmente absorvido do intestino e étransformado em um composto de acordo com a presente invenção emplasma. Muitos exemplos destes são conhecidos na técnica e incluem pormeio de exemplo ésteres de Ci-C4alquila, ésteres de Ci-C4aciloxialquila,ésteres de Ci-C4alcoxiaciloxialquila, ésteres de alcoxiacilóxi, ésteres alquilacilamino alquila, e ésteres de colina.
Transglutaminase (E.C.2.3.2.13) é também conhecida comoproteína-glutamina-y-glutamiltransferase e catalisa a reação geral
<formula>formula see original document page 24</formula>
Q-C(O)-NF^ (receptor de amina) pode representar um resíduode glutamina contendo peptídeo e Q'-NH2 (doador de amina) representa umnucleófilo contendo amina. Alternativamente, Q-C(O)-NH2 e Q'-NH2 podemrepresentar um receptor de amina e um peptídeo contendo lisina,respectivamente. Na presente invenção, no entanto, Q-C(O)-NH2 representaum resíduo de glutamina contendo hormônio de crescimento e Q'-NH2representa um nucleófilo contendo amina, como indicado acima.
Um doador de amina comum in vivo é uma lisina ligada apeptídeo, e a reação acima então dá uma ligação cruzada de peptídeos. O fatorde coagulação Fator XIII é uma transglutaminase que efetua a coagulação desangue quando de ferimentos. Diferentes transglutaminases diferem entre si,por exemplo em que os resíduos de aminoácidos em torno do resíduo deglutamina (ou Gln) são requeridos para a proteína ser um substrato, isto é,diferentes transglutaminases irão ter diferentes peptídeos contendo Gln comosubstratos dependendo de quais resíduos de aminoácidos são vizinhos aoresíduo de Gln. Este aspecto pode ser explorado se um hormônio decrescimento a ser modificado contém mais do que um resíduo de Gln. Se fordesejado conjugar seletivamente o hormônio de crescimento somente emalguns dos resíduos de Gln presentes, esta seletividade pode ser obtida porseleção de uma transglutaminase que somente aceita o resíduo de Gln (s)relevante(s) como substrato. Alternativamente, um ou mais resíduos deaminoácidos próximos de um Gln podem ser alterados, por exemplo, pormeio de engenharia genética para modificar a atividade de uma dadatransglutaminase para o referido resíduo de Gln. Os resíduos de glutaminapodem, como evidente, também ser deletados do hormônio de crescimento ousubstituídos com outro aminoácido para obter um hormônio de crescimentocom menos ou somente um resíduo de glutamina para conjugar a.
ReconheceO-se que se ou não um composto é substrato parauma dada enzima depende, em princípio, das condições de reação, porexemplo o quadro de tempo, a temperatura, etc. Dado tempo suficiente,muitos compostos são normalmente considerados como substratos são, defato, substratos. Quando é afirmado acima que para uma dadatransglutaminase alguns resíduos de Gln podem ser substratos enquantooutros não são, pretende-se indicar que "outros não são" em uma extensãoonde a seletividade desejada pode ser ainda obtida. Se um ou mais dosresíduos de Gln, que se desejada deixar não conjugado, são, de fato, umsubstrato para transglutaminase quando em contato com transglutaminasedurante um período de tempo prolongado, a seletividade pode ser obtida porremoção ou inativação de transglutaminase após um tempo apropriado.
Os exemplos de transglutaminases utilizáveis incluemtransglutaminases microbianas, tal como por exemplo os de Streptomycesmobaraense, Streptomyees einnamoneum e Streptomyces griseocarneum(todos descritos em US 5,156,956, que é incorporado aqui por referência), ede Streptomyees lavendulae (descrito em US 5,252,469, que é incorporadoaqui por referência) e Streptomyees ladakanum (JP2003199569, que éincorporado aqui por referência). Deve-se notar que membros do gêneroanterior Streptoverticillium são agora incluídos no gênero Streptomyees(Kaempfer, J. Gen. Microbiol. 137, 1831-1892 (1991)). Outrastransglutaminases microbianas utilizáveis foram isoladas de Bacillus subtilis(descrito em US 5,731,183, que é incorporado aqui por referência) e de váriosMyxomycetes. Outros exemplos de transglutaminases microbianas utilizáveissão as descritas em WO 96/06931 (por exemplo transglutaminase de Baciluslydicus) e WO 96/22366, ambas sendo incorporadas aqui por referência. Astransglutaminases não microbianas utilizáveis incluem transglutaminase defígado de porquinho-da-índia, e transglutaminases de várias fontes marinhascomo o peixe Pagrus major (descrito em EP-0555649, que é incorporado aquipor referência), e a ostra japonesa Crassostrea gigas (descrito em US5,736,356, que é incorporado aqui por referência).
Em uma forma de realização, o resíduo de glutaminacompreendendo hormônio de crescimento a ser PEGuilado é hormônio decrescimento humano (hGH), que é também conhecido como somatotropinahumana. Variantes diferentes de hGH existem, como descrito por exemplo nabase de dados pública SwissProt. Ele compreende a peptídeo de sinal de 26aminoácidos e um peptídeo maduro de 191 aminoácidos.
Em uma forma de realização, hGH tem uma seqüência deaminoácidos como mostrada em SEQ ID No. 1 aqui (também conhecida como22K-hGH).
Em uma forma de realização, o hGH é 20 kDa hGH (ou 20K-hGH) como descrito em J.Clin.Endocrin.Metabol. 89, 1562-1571 (2004) eEndocrine J., 47, S49-S52 (2000). 20 kDa hGH é um hGH com um pesomolecular de 20 kDa (20K-hGH), que é secretado pela glândula pituitáriaanterior como uma variante de emenda (emenda alternativa de exon 3) eregistrado como perfazendo aproximadamente 5-10% de hGH no plasma dacirculação (Baumann, Endocr. Rev. 12, 424-449 (1991)). 20K-hGH falta 15aminoácidos como comparado com 22K-hGH (resíduos 32-46). 22K-hGH éatualmente aprovado e usado em terapias de substituição hGH e farmacologia,no entanto 20K-hGH nunca foi usado nestas terapias. 20K-hGH é um agonistacompleto para a promoção do crescimento em ratos hipofisectomizados eratos anões, assim tão potente como 22K-hGH (Wada et al., Mol. Cellu.Endocr. 113, 99-107 (1997), Ishikawa et al., Growth Horm. IGF Res. 10, 199-206 (2000)). Além disso, o efeito osteoanabólico de 20K-hGH em células deosteoblastos humanos é também equipotente para o de 22K-hGH. Em umestudo de infusão de 24 horas, de três ramificações, (em ratos) usando 20K-hGH recombinante, 22K-hGH e um grupo de controle, 20K-hGH não teveefeito significante sobre a taxa de infusão de glucose (GIR) em passoseuglicêmicos, como comparado com o controle. Em contraste, 22K-hGHsignificativamente abaixou o GIR comparado com ambos 20K-hGH e o grupode controle (Takahashi et al., Growth Horm. IGF Res. ü, 110-116 (2001)).
Assim, um pico menor (uniforme) de 20K-hGH de perfil no plasma parece serde menor diabetogenicidade e com uma ação antagonizante de insulinareduzida do que 22K-hGH. Além disso, em rato normal, 20K-hGH mostrouuma menor potência em causar retenção de urina (formação de edema ) doque 22K-hGH (Satozawa et al., Growth Horm. IGF Res. 10, 187-192 (2000)).
Um produto de hormônio de crescimento de longa duração tem um perfil noplasma próximo do obtido usando uma infusão. Assim, usando um derivadode 20K-hGH pode oferecer uma farmacologia similar desejada, como umderivado de 22K-hGH, no entanto com um perfil de efeitos adversosmelhorado. Além disso, 20K-hGH pode ter uma possibilidade melhorar de darum produto de hormônio de crescimento de longa duração como ele tem umameia-vida no plasma mais longa em 30% herdada em humanos comparadocom um 22K-hGH. A depuração reduzida é devido, como se acredita, a umadepuração mediada por receptor (Leung et al., Am. J. Fisiol Endocr. Metab.283, 836-843 (2002)). Além disso, em baixa concentração (0,1 nM) 20K-hGHdemonstrou ser aproximadamente três vezes mais eficiente do que 22K-hGHpara induzir a expressão de IGF-I (Yoshizato et al., Endocr. J. 47, 37-40(2000)) - novamente indicando um melhor perfil para um produto dehormônio de crescimento de longa ação.
Em uma forma de realização, o hormônio de crescimento a serPEGuilado é uma variante de hGH, em que uma variante é entendida comosendo o composto obtido por substituição de um ou mais resíduos deaminoácidos na seqüência do hGH com outro aminoácido natural ou nãonatural; e/ou por adição de um ou mais aminoácidos naturais ou não naturaispara uma seqüência de hGH; e/ou por deleção de um ou mais resíduos deaminoácido da seqüência do hGH, em que qualquer uma das destas etapaspode opcionalmente se seguida por outra derivatização de um ou maisresíduos de aminoácidos, por exemplo por peguilação resultantes em umavariante de hormônio de crescimento di- ou multi-peguilado. Em particular,estas substituições são conservativas no sentido em que um resíduo deaminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido do mesmo grupo,isto é por outro resíduo de aminoácido com propriedades similares.
Aminoácidos podem ser convenientemente divididos nos seguintes gruposcom base em suas propriedades: aminoácidos básicos (tal como arginina elisina), aminoácidos ácidos (tal como ácido glutâmico e ácido aspártico),aminoácidos polares (tal como glutamina, histidina, cisteína e asparagina),aminoácidos hidrofóbicos (tal como leucina, isoleucina, prolina, metionina evalina), aminoácidos aromáticos (tal como fenilalanina, triptofano, tirosina) eaminoácidos pequenos (tal como glicina, alanina, serina e treonina).
Em uma forma de realização, o hGH é um hGH em que oresíduo de glutamina na posição correspondendo à posição 40 em SEQ IDNo. 1 foi deletado ou substituído com outro aminoácido. Em uma forma derealização, o hGH é um hGH em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido. Em uma forma de realização, o hGH é um hGH, emque o resíduo de glutamina na posição correspondendo à posição 40 em SEQID No. 1, e o resíduo de glutamina na posição correspondendo à posição 141em SEQ ID No. 1 foram, cada, deletados ou substituídos com outroaminoácido, e onde um resíduo de glutamina está presente em outro posiçãono hormônio de crescimento. Em uma outra forma de realização, referidooutro aminoácido é asparagina.
Em uma forma de realização, o resíduo de glutaminacompreendendo hormônio de crescimento a ser PEGuilado tem pelo menos80%, tal como pelo menos 85%, tal como pelo menos 90%, tal como pelomenos 95% tal como pelo menos 98% identidade com hGH. Em uma formade realização, referidas identidades para hGH são copuladas a pelo menos20%, tal como pelo menos 40%, tal como pelo menos 60%, tal como pelomenos 80% dos hormônio de crescimento atividade de hGH comodeterminado em teste I aqui.
O termo "identidade " como conhecido na técnica, refere-se auma relação entre as seqüências de duas ou mais proteínas, como determinadopor comparação das seqüências. Na técnica, "identidade " também significa ograu de parentesco de seqüência entre proteínas, como determinado pelonúmero de correspondências entre os cordões de dois ou mais resíduos deaminoácidos. "Identidade " mede a percentagem de correspondênciasidênticas entre a menor de duas ou mais seqüências com alinhamentos deespaços (se presentes) dirigidos a um modelo matemático particular modeloou programa de computador (isto é, "algoritmos"). Identidade de proteínasrelacionadas pode ser prontamente calculada por métodos conhecidos. Estesmétodos incluem, mas não são limitados aos descritos em ComputationalMolecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York,1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed.,Academic Press, New York, 1993; Computador Analysis of Sequence Data,Parte 1, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey,1994; Sequence Analysis of Molecular Biology, von Heinje, G., AcademicPress, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M.Stockton Press, New York, 1991; e Carillo et al., SIAM J. Aplicada Math.,48:1073 (1988).
Métodos preferidos para determinar a identidade sãoprojetados para dar a maior correspondência entre as seqüências testadas. Osmétodos para determinar a identidade são descritos em programas decomputador disponíveis. Os métodos de programas de computador preferidospara determinar a identidade entre duas seqüências incluem o pacote deprograma GCG, incluindo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387(1984); Genetics Computador Group, University de Wisconsin, Madison,Wis.), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). O programa BLASTX é publicamente disponível do NationalCenter for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLASTManual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al.,supra). O algoritmo Smith Waterman bem conhecido também pode ser usadopara determinar a identidade.
Por exemplo, usando o algoritmo de computador GAP(Genetics Computador Grupo, University de Wisconsin, Madison, Wis.), duasproteínas para as quais a identidade de seqüência percentual deve serdeterminada são alinhadas para uma correspondência ótima dos aminoácidosrespectivos (o intervalo de correspondência", como determinado peloalgoritmo). Uma penalidade de abertura de espaço (que é calculada como 3vezes, a diagonal média/ a "diagonal média" é a média da diagonal da matrizde comparação sendo usada; a "diagonal" é o escore ou número designadopara cada correspondência de aminoácido perfeita pela matriz de comparaçãoparticular) e uma penalidade de extensão de tamanho (que é geralmente{fração (1/10)} vezes a penalidade de abertura de espaço), assim como umamatriz de comparação como PAM 250 ou BLOSUM 62 são usados emconjunção com o algoritmo. Uma matriz de comparação padrão (ver Dayhoffet ai., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978) para amatriz de comparação PAM 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA,89:10915-10919 (1992) para a matriz de comparação BLOSUM 62) étambém usada pelo algoritmo.
Os parâmetros preferidos para uma comparação de seqüênciade proteína incluem os seguintes: Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol,48:443-453 (1970); Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoffet al.,Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:10915-10919 (1992); Penalidade de espaço:12, penalidade de comprimento de espaço: 4, Limiar de similaridade: 0.
O programa GAP é utilizável com os parâmetros acima. Osparâmetros acima mencionados são os parâmetros de default paracomparações de proteínas (junto com sem penalidade para os espaços deextremidade) usando o algoritmo GAP.
Deve ser entendido que os hormônios de crescimento acimadiscutidos a serem PEGuilados devem compreender pelo menos um resíduode glutamina. O termo "resíduo de glutamina" como usado aqui tambéminclui um análogo de resíduo de glutamina apropriado para transaminação. Osanálogos de resíduo de glutamina apropriados incluem, mas não são limitadosa, análogos de resíduo de glutamina parcialmente fluorados, alquilados, oudeuterados, ou um homólogo de um resíduo de glutamina, isto é um compostoresultante de inserção formal de um, dois ou mais grupos metileno (-CH2-) emuma ligação C-C5 C-H, ou C-N- de glutamina.
O hormônio de crescimento pode ser obtido por métodossintéticos de proteína padrão, ou hormônio de crescimento pode ser obtido portransfecção de uma célula hospedeira apropriada com um DNA codificando ohormônio de crescimento de interesse. Isto está dentro dos conhecimentos doversado. O hormônio de crescimento peguilado obtenível pelo uso de ummétodo de acordo com a invenção usado também pode ser derivatizado poroutros meios do que a peguilação, se assim desejado. Esta derivatizaçãoadicional pode ser realizada antes, durante ou após uso das etapas do métododa invenção. O versado na técnica saberá determinar o tempo destaderivatização adicional. O hormônio de crescimento usado também pode játer sido peguilado em uma ou mais de outras posições além do sítio ou sítios aserem peguilados usando um método de acordo com a presente invenção.
Em uma forma de realização, D representa -O-. Em outraforma de realização, D representa uma ligação única.
O ligador R provê um espaçamento apropriado da amina donucleófilo e grupo funcional ou o grupo funcional latente a ser incorporadoem hormônio de crescimento. Em uma forma de realização, R representa -(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-CH2- ou -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-.
Em uma forma de realização, R representa Ci.6alquileno. Em uma forma derealização, R representa Ci_3alquileno. Em uma forma de realização, Rrepresenta metileno, etileno ou propileno. Em uma forma de realização, Rmetileno ou propileno.
Em uma forma de realização, Z representa<formula>formula see original document page 33</formula><formula>formula see original document page 34</formula><formula>formula see original document page 35</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa.
Deve ser entendido que o funcional grupo compreendido em Xpode ser latente no sentido de que ele precisa ser ativado antes da reação comY-Z. Por meio de exemplo, X pode compreender uma porção que quando dareação com um reagente apropriado é transformada em um aldeído ou umacetona. Exemplos de destas porções incluem
<formula>formula see original document page 35</formula>
em que R9 representa H, C].6alquila, arila ou heteroarila.Exemplos particulares incluem metila, etila e propila. Referidas porçõespodem ser transformadas em um aldeído ou cetona por oxidação com umagente apropriado, tal como por exemplo periodato, ou por hidrólise comácido aquoso, opcionalmente na presença de um catalisador, tal como sais decobre, prata ou mercúrio.
No presente contexto, o termo "arila" destina-se a indicar umradical de anel aromático homocíclico ou um sistema de anel fundidohomocíclico em que pelo menos um dos anéis são aromáticos. Grupos arilatípicos incluem fenila, bifenilila, naftila, tetralinila e outros.
O termo "heteroarila", como usado aqui, sozinho ou emcombinação, refere-se a um radical de anel aromático com por exemplo 5 a 7átomos no anel, ou sistema de radical de anel aromático fundido com porexemplo de 7 a 18 átomos no anel, em que pelo menos um anel é aromático econtém um ou mais heteroátomos como átomos no anel selecionado dentreheteroátomos nitrogênio, oxigênio, ou de enxofre, em que N-óxidos emonóxidos de enxofre e dióxidos de enxofre são substituições deheteroaromáticos permissíveis. Exemplos incluem furanila, tienila, tiofenila,pirrolila, imidazolila, pirazolila, triazolila, tetrazolila, tiazolila, oxazolila,isoxazolila, oxadiazolila, tiadiazolila, isotiazolila, piridinila, piridazinila,pirazinila, pirimidinila, quinolinila, isoquinolinila, benzofuranila,benzotiofenila, indolila, e indazolila, e outros.
Deve ser também entendido que XeY devem sercomplementares no sentido que eles devem ser capazes de reagir um com ooutro para formar uma ligação oxima. Isto significa que se X é um (ou podeser ativado para ser um) aldeído ou cetona, então Y deve ser um aminóxi. SeX for um aminóxi, então Y deve ser um aldeído ou uma cetona. Se Y é umaldeído ou uma cetona, então X deve ser um aminóxi. Se Y é um aminóxi,então X deve ser (ou deve ser ativado para ) um aldeído ou uma cetona.
Exemplos particulares do composto de fórmula [II] incluem1,3-diaminoóxi propano e l,3-diamino-2-propanol. Se se usar o últimocomposto, o grupo aldeído latente tem de ser oxidado, por exemplo por meiode periodato, a ser convertido em um aldeído.
Em uma forma de realização, Y representa -O-NH2 e Xrepresenta um aldeído ou um grupo latente, que pode ser ainda reagido paraformar um aldeído. Em uma forma de realização, Y representa -O-NH2 e Xrepresenta uma cetona ou um grupo latente que pode ser ainda reagido paraformar uma cetona. Em uma forma de realização, o composto de fórmula [II]
<formula>formula see original document page 36</formula>
representa l,3-diamino-2-propanol, e Y representa-O-NH2.
Em uma outra forma de realização, o composto de fórmula [IV]<formula>formula see original document page 37</formula>
representa um composto selecionado dentre
<formula>formula see original document page 37</formula><formula>formula see original document page 38</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG significa mPEGcom um peso molecular de 10 kDa, 20 kDa ou 30 kDa e PEG significa PEGcom um peso molecular entre 2 kDa e 5 kDa.
Em uma forma de realização, Y representa um aldeído e Xrepresenta -O-NH2 ou um grupo latente que, quando de outra reação, pode sertransformado em -O-NH2. Em uma outra forma de realização, o composto defórmula [II]
<formula>formula see original document page 38</formula>
representa 1,3-diaminoóxi propano, e Y representa um aldeído.
Em uma outra forma de realização, o composto de fórmula
<formula>formula see original document page 38</formula>
representa um composto selecionado dentre<formula>formula see original document page 39</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG significa mPEGcom um peso molecular de 10 kDa, 20 kDa ou 30 kDa e PEG significa PEGcom um peso molecular entre 2 kDa e 5 kDa.
Em uma forma de realização, Y representa uma cetona e Xrepresenta -O-NH2 ou um grupo latente que, quando de outra reação, pode sertransformado em -O-NH2. Em uma outra forma de realização, o composto defórmula [II]
<formula>formula see original document page 39</formula>
representa 1,3-diaminoóxi propano, e Y representa umacetona.
Em uma outra forma de realização, o composto de fórmulaN [IV]
<formula>formula see original document page 36</formula>
representa um composto selecionado dentre
<formula>formula see original document page 36</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG significa mPEGcom um peso molecular de 10 kDa, 20 kDa ou 30 kDa e PEG significa PEGcom um peso molecular entre 2 kDa e 5 kDa.
Os compostos de fórmula [IV] são comercialmentedisponíveis, por exemplo das empresas ShearWater ou NOF, ou eles podemser prontamente obtidos de compostos comercialmente disponíveis quando deuma simples modificação química.
Os compostos de fórmula V podem propriedadesfarmacológicas melhoradas ou comparadas com um hormônio de crescimentonão conjugado correspondente, também referido como o hormônio decrescimento parental. Assim, em uma forma de realização, a presenteinvenção refere-se a um método de modificar as propriedades farmacológicasde hormônio de crescimento, o método compreendendo fixar PEG ao referidohormônio de crescimento de acordo com métodos da presente invenção.Exemplos destas propriedades farmacológicas incluem meia-vida funcional invivo, imunogenicidade, filtração renal, proteção de protease e ligação dealbumina.
O termo "meia vida funcional in vivo" é usado em seusignificado normal, isto é, o tempo em que 50% da atividade biológica dohormônio de crescimento ou hormônio de crescimento conjugado ainda estápresente no órgão do corpo/ marcação, ou o tempo em que a atividade dohormônio de crescimento ou conjugado de hormônio de crescimento é 50%de seu valor inicial. Como uma alternativa para determinar a meia vidafuncional in vivo, "meia-vida no plasma in vivo" pode ser determinada, isto é,o tempo em que 50% dos hormônio de crescimento ou conjugado dehormônio de crescimento circulam no plasma ou corrente sangüínea antes deserem depurados. Determinação de meia-vida no plasma é com freqüênciamais simples do que a determinação da meia vida funcional e a magnitude demeia-vida no plasma é geralmente uma boa indicação da magnitude de meiavida funcional in vivo. Termos alternativos para meia-vida no plasma incluemmeia-vida no soro, meia-vida circulante, meia-vida circulatória, depuração nosoro, depuração no plasma, e meia-vida de depuração.
O termo "aumentado" como usado em conexão com a meiavida funcional in vivo ou meia-vida no plasma é usado para indicar que umameia-vida relevante do conjugado de hormônio de crescimento éestatisticamente significantemente aumentado com relação à do hormônio decrescimento parental, como determinado sob condições comparáveis. Porexemplo, a meia-vida relevante pode ser aumentada por pelo menos cerca de25%, tal como por pelo menos cerca de 50%, por exemplo, por pelo menoscerca de 100%, 150%, 200%, 250%, ou 500%. Em uma forma de realização,os compostos da presente invenção demonstram um aumento em meia-vida depelo menos cerca de 5 h, preferivelmente pelo menos cerca de 24 h, maispreferivelmente pelo menos cerca de 72 h, e o mais preferivelmente pelomenos cerca de 7 dias, relativo à meia-vida do GH parental.
A medida de meia vida in vivo no plasma pode ser realizadaem vários modos como descrito na literatura. Um aumento em meia-vida invivo no plasma pode ser quantificado como uma diminuição em depuração(CL) ou como um aumento em tempo de residência médio (MRT). Hormôniode crescimento conjugado da presente invenção para o qual o CL é diminuídoa menos do que 70%, tal como menos do que 50%, então menos do que 20%,tal como menos do que 10% dos CL do hormônio de crescimento parental,como determinado em um teste apropriado é referido como tendo uma meiavida in vivo no plasma aumentada. Hormônio de crescimento conjugado dapresente invenção para o qual MRT é aumentado em mais do que 130%, talcomo mais do que 150%, tal como mais do que 200%, tal como mais do que500% do MRT do hormônio de crescimento parental em um teste apropriadoé referido como tendo uma meia vida in vivo no plasma aumentada.Depuração e tempo de residência médio podem ser avaliados em estudosfarmacocinéticos padrões usando animais de teste apropriados. O versado natécnica saberá escolher um animal de teste apropriado para uma dadaproteína. Os testes em humanos, como evidente, representam o teste final. Osanimais de teste apropriados incluem ratos machos Sprague-Dawley,camundongos e macacos cinomólogo. Tipicamente, os camundongos e ratossão injetados em um bolo subcutâneo único, enquanto os macacos podem serinjetados em um bolo subcutâneo único ou uma dose iv única. A quantidadeinjetada depende do animal de teste. Subseqüentemente, as amostras desangue são tomadas durante um período de um a cinco dias, como apropriadopara a avaliação de CL e MRT. As amostras de sangue são convenientementeanalisadas por técnicas ELISA.
O termo "Imunogenicidade" de um composto refere-se àcapacidade do composto, quando administrado a um humano, elicitar umaresposta imune deletéria, seja humoral, celular, ou ambas. Em qualquer sub-população humana, podem existir indivíduo que demonstram sensibilidadepara as proteínas particulares administradas. Imunogenicidade pode sermedida por quantificação da presença de anticorpos de hormônio decrescimento e/ou células T respondentes a hormônio de crescimento em umindivíduo sensível, usando métodos convencionais conhecidos na técnica. Emuma forma de realização, o GH conjugado da presente invenção demonstrauma diminuição em imunogenicidade em um indivíduo sensível de pelomenos cerca de 10%, preferivelmente pelo menos cerca de 25%, maispreferivelmente pelo menos cerca de 40% e o mais preferivelmente pelomenos cerca de 50%, relativo à imunogenicidade para este indivíduo do GHparental. Em outro aspecto, imunogenicidade pode fazer referência a umaresposta típica em uma população de indivíduos similares, como uma respostatípica em uma população de pacientes em uma experiência clínica.
O termo "proteção de protease" ou "protease protegida" comousado aqui destina-se a indicar que o conjugado do hormônio de crescimentoda presente invenção é mais resistente a uma peptidase ou proteases noplasma do que é o hormônio de crescimento parental. As enzimas protease epeptidase presentes no plasma são conhecidas como estando envolvidas nadegradação de proteínas circulantes, tal como por exemplo hormôniospeptídeo circulantes, tal como hormônio de crescimento.
Resistência de uma proteína à degradação por, por exemplo,dipeptidil aminopeptidase IV (DPPIV) é determinada pelo seguinte teste dedegradação: Alíquotas da proteína (5 nmol) são incubadas a 37°C com 1 μΙ,de dipeptidil aminopeptidase IV purificada correspondendo à uma atividadeenzimática de 5 mU durante 10-180 minutos em 100 μΐ, de tampão 0,1 Mtrietilamina-HCl, pH 7,4. As reações enzimáticas são terminadas pela adiçãode 5 μl. de ácido trifluoroacetico a 10%, e os produtos de degradação deproteína são separados e quantificados usando análise HPLC. Um métodopara realizar esta análise é: as misturas são aplicadas sobre uma coluna dporos largos Vydac Cl8 (poros de 30 nm, partículas de 5 μπι) 250 χ 4,6 mm eeluídas a uma vazão de 1 ml/min com gradientes escalonados lineares deacetonitrila em 0,1 % ácido trifluoroacetico (0% acetonitrila durante 3 min, 0-24% acetonitrila durante 17 min, 24-48% acetonitrila durante 1 min) deacordo com Siegel et al., Regul. Pept. 79, 93-102 (1999) e Mentlein et al. Eur.J. Biochem. 214, 829-35 (1993). Proteínas e seus produtos de degradaçãopodem ser monitorados por sua absorbância a 220 nm (ligações peptídeo ) ou280 nm (aminoácidos aromáticos), e são quantificados por integração de suasáreas de pico relacionadas com os padrões. A taxa de hidrólise de umaproteína por dipeptidil aminopeptidase IV é estimada em tempos de incubaçãoque resultam em menos do que 10% dos peptídeos sendo hidrolisados. Aresistência a outras proteases ou peptidases no plasma pode ser determinadaem modos similares. Em uma forma de realização, a taxa de hidrólise doconjugado de hormônio de crescimento é menor do que 70%, tal como menordo que 40%, tal como menor do que 10% da do hormônio de crescimentoparental.
O componente de proteína mais abundante em sanguecirculante de espécies de mamíferos é albumina no soro, que estánormalmente presente em uma concentração de aproximadamente 3 a 4,5gramas por 100 mL de sangue total. Albumina no soro é uma proteína nosangue de aproximadamente 70,000 daltons que tem várias funçõesimportantes no sistema circulatório. Ela funciona como um transportador devárias moléculas orgânicas no sangue, como o transportador principal devários metabólitos, como ácidos graxos e bilirubina através do sangue, edevido à abundância, um regulador osmótico do sangue circulante. Albuminano soro tem a meia-vida de mais do que uma semana, e uma abordagem paraaumentar a meia-vida no plasma de proteínas tem sido conjugar a proteína aogrupo que liga a albumina no soro. A propriedade de ligação de albuminapode ser determinada, como descrito em J. Med. Chem, 43, 1986-1992 (2000), que é incorporado aqui por referência.
Em uma forma de realização, a presente invenção refere-se aum composto de acordo com a fórmula [V]
<formula>formula see original document page 45</formula>
remoção de -C(^O)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo de glutaminapresente no polipeptídeo;
D representa -O- ou uma ligação;
r representa Ci_6alquileno, -(CH2)4-CH(MH2)-Co-NH-CH2-, -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2- ou C5.15heteroalquileno;
A representa uma ligação oxima;
Z representa uma porção selecionada dentre
<formula>formula see original document page 45</formula><formula>formula see original document page 46</formula><formula>formula see original document page 47</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG com umpeso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;e sais, pró-drogas ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis domesmo.
Em uma forma de realização, o polipeptídeo é um resíduo deglutamina compreendendo hormônio de crescimento e PP representa umradical de hormônio de crescimento obtido por remoção de -C(=0)-NH2 dacadeia lateral de um resíduo de glutamina presente em hormônio decrescimento.
Em uma forma de realização, a invenção refere-se a umhormônio de crescimento, tal como hGH, que é covalentemente fixado a umaou mais porções compreendendo PEG, e em particular mPEG, em quereferido porção compreendendo PEG é fixada à cadeia lateral de um resíduode glutamina presente no hormônio de crescimento. Em uma forma derealização, a invenção refere-se a hGHs em que são covalentemente fixados auma porção compreendendo PEG, e em particular mPEG, em que referidaporção compreendendo PEG- é fixada à cadeia lateral do resíduo deglutamina na posição correspondendo à posição 40, posição 141 ou posição40 e 141 em SEQ ID No. 1, desde que não seja
N£l41-[2-(4-(4-(mPEG(20k)ilbutanoil)-amino-butiloxiimino)-etil] hGH,
NEl41-[2-(l-(hexadecanoil)piperidin-4-il)etiloxiimino)-etil]hGH,
N£l41(2-(4-(4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)butiloxiimino)etil) hGH,
N£l41(2-(4-(2,6-bis(mPEG(20k)iloxicarbonilamino)hexanoilamino)butiloxiimino)etil) hGH,
Νε141(2-(4-(4-(mPEG(3 Ok)iloxi)butirilamino)butiloxiimino)etil) hGH,
Νε141(2-(4-(4-(mPEG(20k)iloxi)butirilamino)butiloxiimino)etil) hGH, ouΝε141(2-(4-(3-
(mPEG(3 Ok)iloxi)propanoilamino)butiloxiimino)etil) hGH.
Em uma forma de realização, a invenção refere-se a umcomposto de fórmula [Va]
<formula>formula see original document page 49</formula>
em que GH representa um radical de hormônio de crescimentoobtido por remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo deglutamina presente em hormônio de crescimento;
D representa -O- ou uma ligação;
r representa Ci.6alquileno, -(CH2)4-CH(NH2)-Co-NH-CH2-, -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2- ou C5.i5heteroalquileno;
A representa uma ligação oxima;
Z representa uma porção selecionada dentre
<formula>formula see original document page 49</formula><formula>formula see original document page 50</formula><formula>formula see original document page 51</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG com umpeso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;
e sais, pró-drogas ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis domesmo;
<formula>formula see original document page 51</formula>
desde que se Z é 2 2 5 , então mPEG é 10 kDa mPEG.
Em uma forma de realização, D representa -O-.
Em uma forma de realização, D representa uma ligação única.Em uma forma de realização, R representa -(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-CH2- ou -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-.
Em uma forma de realização, R representa C^alquileno. Emuma outra forma de realização, R representa Ci^alquileno. Em uma outraforma de realização, R representa metileno, etileno ou propileno. Em umaoutra forma de realização, R representa metileno ou propileno.
Em uma forma de realização, Z representa
<formula>formula see original document page 52</formula><formula>formula see original document page 53</formula><formula>formula see original document page 54</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa.
Em uma forma de realização, GH representa o radical obtidopor remoção de -C(^O)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo de glutaminapresente em um hGH compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ IDNo.l.
Em uma forma de realização, GH representa o radical obtidopor remoção de -C(^O)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo de glutaminapresente em 20 kDa hGH.
Em uma forma de realização, GH representa o radical obtidopor remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de glutamina 40 de hGH. Emparticular, referido hGH pode ter sido ainda modificado por deleção deglutamina 141 ou substituição de glutamina 141 com outro aminoácido, e emparticular asparagina.
Em uma forma de realização, GH representa o radical obtidopor remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de glutamina 141 de hGH. Emparticular, referido hGH pode ter sido ainda modificado por deleção deglutamina 40 ou substituição de glutamina 40 com outro aminoácido, e emparticular asparagina.
Em uma forma de realização, GH representa o radical obtidopor remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo de glutaminapresente em uma posição diferente da posição correspondendo à posição 40em SEQ ID No. 1 e diferente da posição correspondendo à posição 141 emSEQ ID No. 1, em que o resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 40 em SEQ ID No. 1, e o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1 foram, cada, deletados ousubstituídos com outro aminoácido, e em particular asparagina.
Particulares exemplos de compostos de fórmula [Va] incluem
7V5141/4°-2-(0-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} aminobutil)-oximino)etil hGH;
7Vôl41/40-2-(0-(4-{4-(mPEG(10k)iloxi)butiril}aminobutil)oximino)etil hGH;
jVôl41/4°-2-(0-(4-{3-(mPEG(10k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
Λ^141/40-2-(Ο-(4- {4-(2,3-bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
7Vsl41/40-2-(O-(4-{ 5-(mPEG( 10k)iloxi-5-oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;
A^141/40-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
7V5141/40-3-({4-(l,3-bis(mPEG(10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno} -aminoxi)propilóxi hGH;
7Vsl4,/40-3-({4-(mPEG(10k)iloxi)butilideno}aminoxi)propilóxihGH;
7V5141/40_3-({4-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
7V6141/40-3-({3-(mPEG(10k)iloxi)propilideno}aminoxi)propilóxihGH;
jy6141/40_2-(O-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
^141/403 _((4_(2,3 -bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
iV8141/40-2-(0-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril}aminobutil)-oximino)etil hGH;
7V8141/40_2-(0-(4-{3-(mPEG(20k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
A^14i/40_2-(O-(4-{4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
7V6141/40-2-(0-(4-{5-(mPEG(20k)iloxi-5-oxopentanoil} aminobutil)oximino)etil hGH;
iVsl41/40-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno} aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
^141/40-3-({4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno} -aminoxi)propilóxi hGH;
A^141/40-3-({4-(mPEG(20k)iloxi)butilideno}aminoxi)propilóxihGH;
7V5141/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
7Vsl41/40-3-({3-(mPEG(20k)iloxi)propilideno}aminoxi)propilóxihGH;
iV5141/40-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
7V5141/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
7V8141/40_2-(O-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} aminobutil)-oximino)etil hGH;
TV5141 /40-2-(O-(4- { 3-(mPEG(3 Ok)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
7V6141/40-2-(0-(4-{4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
7V8141/40-2-(0-(4-{5-(mPEG(30k)iloxi-5-oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;
7V6141/40-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
7Vsl41/40-3-({4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;
TV6141/40-3 -({4-(mPEG(3 Ok)iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxihGH;
7V6141/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
TV6141/40-3 -({3 -(mPEG(3 Ok)iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxihGH;
7Vôl41/40-2-(O-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
7Vôl41/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
7Vôl41/40-3-({4-{(2,3-bis(mPEG(20k)il)prop-l-iloxi)PEGuiloxi} butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
7Vsl4l/40-2-((4-(4-((2,3-bis(mPEG(20k)il)propil)PEGuiloxi)butirilamino)butil)oximino)etil hGH;
JVsi41 -2-(0-(4- { 4-( 1,3 -bis(mPEG( 1 Ok)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;
7V5141-2-(0-(4-{4-(mPEG(10k)iloxi)butiril}aminobutil)oximino)etil hGH;
7Vôl41-2-(0-(4-{3-(mPEG(10k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
Λ^141-2-(0-(4- {4-(2,3-bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
TVs 141 -2-(0-(4- {5 -(mPEG( 1 Ok)iloxi-5 -oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;
7V5141-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
j/Vsl41-3-({4-(l,3-bis(mPEG(10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno} -aminoxi)propilóxi hGH;
N8m-3-( { 4-(mPEG( 1 Ok)iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxi
hGH;
iV5141-3-({4-(2,3-bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butilideno}aminoxi)propilóxi hGH;
TV5141-S -({3 -(mPEG( 1 Ok)iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;
7Vôl41-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
TV5141 -3 -( {4-(2,3 -bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
7Vsl41-2-(0-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -minobutil)oximino)etil hGH;
TV0141 -2-(0-(4- { 3 -(mPEG(20k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
A^141-2-(0-(4- {4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
TV5141 -2-(0-(4- { 5 -(mPEG(20k)iloxi-5 -oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;
iV5141 -3 -( {4-(2-(2-(2-(2-(4-( 1,3 -bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno} aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
TV5141 -3 -( { 4-( 1,3 -bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;
iV5141 -3 -( { 4-(mPEG(20k)iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxihGH;
7Vsl41-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
-( { 3 -(mPEG(20k)iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;
7V5141-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
7Vsl41-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
7Vsl41-2-(0-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;
iV6141-2-(0-(4-{3-(mPEG(30k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
iV5141 -2-(0-(4- { 4-(2,3 -bis(mPEG(3 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
A/6141 -2-(0-(4- { 5 -(mPEG(3 0k)iloxi-5 -oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;
7Vôl41-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
j/Vôl41-3-({4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;
J/Vsl41-3-({4-(mPEG(30k)iloxi)butilideno}aminoxi)propilóxihGH;
TVsi41 -3 -({4-(2,3 -bis(mPEG(3 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
-({3 -(mPEG(3 Ok)iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;
vV5141-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
TVs 141 -3 -({4-(2,3 -bis(mPEG(3 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
Λ/δ141-3 -( {4- { (2,3 -bis(mPEG(20k)iloxi)prop-1 -il)PEGuiloxi} butilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
7V6141-2-((4-(4-((2,3-bis(mPEG(20k)il)propil)PEGuiloxi)butirilamino)butil)oximino)etil hGH;
7VS40-2-(O-(4-{4-( 1,3-bis(mPEG(10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;
7V640-2-(O-(4-{4-(mPEG( 1 Ok)iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
7V640-2-(O-(4-{3-(mPEG( 1 Ok)iloxi)propionil} aminobutil)oximino)etil hGH;
7Vô40-2-(O-(4-{4-(2,3 -bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
7Vô40-2-(O-(4- { 5-(mPEG( 10k)iloxi-5-oxopentanoil} aminobutil)oximino)etil hGH;
7V540-3 -( { 4-(2-(2-(2-(2-(4-( 1,3 -bis(mPEG( 1 Ok)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno} aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
{4-( 1,3-bis(mPEG( 10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;
J/V640-3-({4-(mPEG(10k)iloxi)butilideno}aminoxi)propilóxihGH;
A^40-3-( {4-(2,3-bis(mPEG( 10k)iloxi)prop-1 -iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
TV640-S -( {3-(mPEG( 1 Ok)iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;
A^40-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
iVS40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno}aminoxi)propilóxi hGH;
A^40-2-(O-(4-{4-(l ,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;
7V540-2-(0-(4-{3-(mPEG(20k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
A^40-2-(0-(4-{4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butiril}aminobutil)oximino)etil hGH;
7VS40-2-(0-(4-{5-(mPEG(20k)iloxi-5-oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;
7V640-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno} aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
TVs40-S -( { 4-( 1,3 -bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;
TV640-S -( { 4-(mPEG(20k)iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxihGH;7VS40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno}aminoxi)propilóxi hGH;
7V840-3-({3-(mPEG(20k)iloxi)propilideno}aminoxi)propilóxihGH;
7VS40-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
j/VS40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-1 -iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
A^40-2-(O-(4- { 4-( 1,3 -bis(mPEG(3 Ok)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;
iV540-2-(0-(4-{3-(mPEG(30k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
Λ^40-2-(Ο-(4- { 4-(2,3 -bis(mPEG(3 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
Λ^40-2-(Ο-(4-{ 5-(mPEG(3 0k)iloxi-5 -oxopentanoil} aminobutil)oximino)etil hGH;
7VS40-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
iV540-3 -( {4-( 1,3 -bis(mPEG(3 0k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno} -aminoxi)propilóxi hGH;
iV640_3 _( { 4-(mPEG(3 Ok)iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxihGH;
iV540_3_({4_(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
iV540-3 -( { 3 -(mPEG(3 Ok)iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;
7V840-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;7V840-3-({4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
Λ^40-3 -( { 4- {(2,3 -bis(mPEG(20k)iloxi)prop-1 -il)PEGuiloxi }butilideno}aminoxi)propilóxi hGH;
7V840_2-((4-(4-((2,3-bis(mPEG(20k)il)propil)PEGuiloxi)butirilamino)butil)oximino)etil hGH;
JVe 141 - [2-0-(4-(4-( 1,3 -bis(mPEG(20K)aminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH;
Ne 141 -[2-(0-(4-(4-(mPEG(3 OK)oxi)butirilamino)-butil)oxiimino)-etil] hGH;
TVe 141 -(3 -((4-(2-(2-(2-(2-(4-( 1,3 -bis(mPEG(20K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno)aminoxi)propiloxi) hGH;
A^141-[2-(2-(2,3-(niPEG(20K)iloxi)propiloxicarbonilamino)etiloximino)etil] hGH;
A^141-[2-(0-(2-(2-(mPEG(40K)iloxi)etilamino)-2-oxoetil)oximino)etil] hGH;
iVe141-[2-(3-(4-((l,3-bis(mPEG(30K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butilideno)aminoxi)propiloxiimino)etil] hGH;
A^ 141 /40- [2-0-(4-(4-( 1,3 -bis(mPEG(20K)aminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH;
TVe 141 /40- [2-(0-(4-(4-(mPEG(3 0K)oxi)butirilamino)-butil)oxiimino)-etil] hGH;
7Ve141/40-(3-((4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno)aminoxi)propiloxi) hGH;
TV8141 /40-[2-(2-(2,3 -(mPEG(20K)iloxi)propiloxicarbonilamino)etiloximino)etil] hGH;
iV8141 /40-[2-(0-(2-(2-(mPEG(40K)iloxi)etilamino)-2-oxoetil)oximino)etil] hGH;
TV8141 /40- [2-(3 -(4-(( 1,3 -bis(mPEG(3 OK)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butilideno)aminoxi)propiloxiimino)etil] hGH;
A^40- [2-0-(4-(4-( 1,3 -bis(mPEG(20K)aminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH;
7Ve40-[2-(0-(4-(4-(mPEG(30K)oxi)butirilamino)-butil)oxiimino)-etil] hGH;
7Ve40-(3-((4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno)aminoxi)propiloxi) hGH;
7Ve40-[2-(2-(2,3-(mPEG(20K)iloxi)propiloxicarbonilamino)etiloximino)etil] hGH;
iV640-[2-(0-(2-(2-(mPEG(40K)iloxi)etilamino)-2-oxoetil)oximino)etil] hGH;
7Ve40-[2-(3-(4-((l,3-bis(mPEG(30K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butilideno)aminoxi)propiloxiimino)etil] hGH;mPeg(10k)-(X
<formula>formula see original document page 64</formula><formula>formula see original document page 65</formula><formula>formula see original document page 66</formula><table>table see original document page 67</column></row><table><formula>formula see original document page 68</formula><table>table see original document page 69</column></row><table><formula>formula see original document page 70</formula>
Algumas das representações gráficas acima também podem seralternativamente representadas como
iV5141-(2-(0-(2-(2,3-Bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)propiloxicarbonilamino)etil)oximino)etil) hGH,
iV5141-(2-(0-(3-(2,3-Bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)propiloxicarbonilamino)propil)oximino)etil) hGH,
iV640-(2-(O-(2-(2,3-Bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)propiloxicarbonilamino)etil)oximino)etil) hGH,
7V640-(2-(O-(3-(2,3-Bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)propiloxicarbonilamino)propil)oximino)etil) hGH,
7V6141-(2-0-(2-oxo-2-(3-(2,3-Bis(mPEG(l Ok)iloxi)propiloxi)propilamino)etil)oximinoetil) hGH,
7VS40-(2-O-(2-oxo-2-(3 -(2,3 -Bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)propiloxi)propilamino)etil)oximinoetil) hGH,
iVsul-(2-0-(4-(5-(3-(omega-(3-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)propiloxi)propiloxi)polioxietileniloxi)propilamino)-l,5-dioxopentilamino)butil)oximinoetil) hGH,
7V5141-(2-(0-(2-(2,3-Bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxicarbonilamino)etil)oximino)etil) hGH
7VÔ141-(2-(0-(3-(2,3-Bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxicarbonilamino)propil)oximino)etil) hGHTV540-C 2-(0-(2-(2,3-Bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxicarbonilamino)etil)oximino)etil) hGH
Τνδ40-(2-(Ο-(3-(2,3-
Bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxicarbonilamino)propil)oximino)etil) hGH
iVôl41-(2-0-(2-oxo-2-(3-(2,3-Bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxi)propilamino)etil)oximinoetil) hGH
7VS40-(2-O-(2-oxo-2-(3 -(2,3 -Bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxi)propilamino)etil)oximinoetil) hGH,
7V6141-(2-0-(4-(5-(3-(omega-(3-(2,3-bis(rrLPEG(20k)iloxi)propiloxi)propiloxi)polioxietileniloxi)propilamino)-l,5-dioxopentilamino)butil)oximinoetil) hGH,
iV5141-(2-(0-(2-(2,3-Bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxicarbonilamino)etil)oximino)etil) hGH,
iV6141-(2-(0-(3-(2,3-Bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxicarbonilamino)propil)oximino)etil) hGH,
Λ^40-(2-(Ο-(2-(2,3-Bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxicarbonilamino)etil)oximino)etil) hGH,
JV640-(2-(O-(3 -(2,3-Bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxicarbonilamino)propil)oximino)etil) hGH,
7Vô141-(2-0-(2-oxo-2-(3-(2,3-Bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxi)propilamino)etil)oximinoetil) hGH,
A^40-(2-O-(2-oxo-2-(3-(2,3-Bis(mPEG(3 Ok)iloxi)propiloxi)propilamino)etil)oximinoetil) hGH, and
7V6141-(2-0-(4-(5-(3-(omega-(3-(2,3-bis(mPEG(3 Ok)iloxi)propiloxi)propiloxi)polioxietileniloxi)propilamino)-1,5-dioxopentilamino)butil)oximinoetil) hGH.
Em uma forma de realização, a presente invenção refere-se acomposto de acordo com a fórmula [VI]<formula>formula see original document page 72</formula>
em que PP representa um radical de polipeptídeo obtido porremoção de -C(^O)-NH2 da cadeia lateral de dois resíduos de glutaminapresentes em referido polipeptídeo;
D representa -O- ou uma ligação;
r representa Ci_6alquileno, -(CH2)4-CH(NH2)-Co-NH-CH2-, -
(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-, ou C5.15heteroalquileno;
A representa uma ligação oxima;
Z representa uma porção selecionada dentre
<formula>formula see original document page 72</formula><formula>formula see original document page 73</formula><formula>formula see original document page 74</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG com umpeso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;
e sais, pró-drogas ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis domesmo
Em uma forma de realização, o polipeptídeo é um resíduo deglutamina compreendendo hormônio de crescimento e PP representa umradical de hormônio de crescimento obtido por remoção de -C(=0)-NH2 dacadeia lateral de dois resíduos de glutamina presentes no hormônio decrescimento.
Em uma forma de realização, a presente invenção provê umcomposto de acordo com a fórmula [Via]<formula>formula see original document page 75</formula>
em que GH representa um radical de hormônio de crescimentoobtido por remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de dois resíduos deglutamina presentes em referido hormônio de crescimento;
D representa -O- ou uma ligação;
r representa C^alquileno, -(CH2)4-CH(NH2)-Co-NH-CH2-, -
(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-, ou C5.i5heteroalquileno;
A representa uma ligação oxima;
Z representa uma porção selecionada dentre
<formula>formula see original document page 75</formula><formula>formula see original document page 76</formula><formula>formula see original document page 77</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG com umpeso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;
e sais, pró-drogas ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis domesmo.
Em uma forma de realização, D representa -O-.
Em uma forma de realização, D representa uma ligação única.
Em uma forma de realização, R representa -(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-CH2- ou -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-.
Em uma forma de realização, R representa C^alquileno. Emuma outra forma de realização, R representa Ci_3alquileno. Em uma outraforma de realização, R representa metileno, etileno ou propileno. Em umaoutra forma de realização, R representa metileno ou propileno.Em uma forma de realização, Z representa
<formula>formula see original document page 78</formula><formula>formula see original document page 79</formula><formula>formula see original document page 80</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa.
Em uma forma de realização, GH na fórmula [Via] representao radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de doisresíduos de glutamina presentes em um hGH compreendendo a seqüência deaminoácidos de SEQ ID No.l.
Em uma forma de realização, GH em fórmula [Via] representao radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de doisresíduos de glutamina presentes em 20 kDa hGH.
Em uma forma de realização, GH em fórmula [Via] representao radical obtido por remoção de -C(^O)-NH2 da cadeia lateral de um resíduode glutamina na posição correspondendo à posição 40 em SEQ ID No. 1, e dacadeia lateral do resíduo de glutamina na posição correspondendo à posição141 em SEQ ID No. 1;
ou
representa o radical obtido por remoção de -C(^O)-NH2 dacadeia lateral de um resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 40 em SEQ ID No. 1, em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido, e por remoção de -C(^O)-NH2 da cadeia lateral de umoutro resíduo de glutamina presente na posição diferente das posiçõescorrespondendo às posições 40 e 141 em SEQ ID No. 1;
ou
representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2 dacadeia lateral de um resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 141 em SEQ ED No. 1, em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 40 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido, e por remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de umoutro resíduo de glutamina presente em uma posição diferente das posiçõescorrespondendo às posições 40 e 141 em SEQ ID No. 1;
ou
representa o radical obtido por remoção de -C(^O)-NH2 dacadeia lateral de duas glutaminas presentes em um hGH em posiçõesdiferentes das posições correspondendo às posições 40 e 141 em SEQ ID No.1, em que quaisquer resíduos de glutamina presentes nas posições correspondendo às posições 40 e 141 em SEQ ID No. 1 foi deletado ousubstituído com outros aminoácidos.
Em uma forma de realização adicional ou alternativa, ainvenção provê métodos e compostos descritos aqui, em que cada caso de"mPEG" é substituído por um alcóxi-PEG ou composto "aPEG" da fórmula
<formula>formula see original document page 81</formula>
em que m é um inteiro maior do que 1. Cada Rl pode serqualquer grupo alquila Cm0 apropriado, ramificado ou (for C3_i0) nãoramificado, incluindo, mas limitados a, metila, etila, propila, e butila.
A presente invenção também provê um composto obtido poruso de um método de acordo com a invenção.
A presente invenção também provê um compostocaracterizado pelo fato de ser obtenível pelo uso de um método de acordocom a invenção.
Compostos da presente invenção exercem atividade dehormônio de crescimento e pode como tal ser usado no tratamento de doençasou estados que irão se beneficiar de um aumento na quantidade de hormôniode crescimento circulante. Em particular, a invenção provê um método para otratamento de deficiência de hormônio de crescimento (GHD); Síndrome deTurner; Síndrome de Prader-Willi (PWS); Síndrome de Noonan; Síndrome deDown; doença renal crônica, artrite reumatóide juvenil; fibrose cística,infecção por HIV em crianças recebendo tratamento HAART (criançasHIV/HALS); crianças baixas que cresceram baixas na idade gestacional(SGA); estatura baixa em crianças que nasceram com peso muito baixo(VLBW) mas SGA; displasia esqueletal; hipocondroplasia; acondroplasia;estatura baixa idiopática (ISS); GHD em adultos; fraturas em ou de ossoslongos, tal como tíbia, fíbula, fêmur, úmero, rádio, ulna, clavícula,matacarpea, matatarsea, e dígito; fraturas em ou de ossos espongiosos, talcomo o remo, base de mão, e base do pé; pacientes após cirurgia dos tendõesou ligamentos em por exemplo mão, joelho, ou ombro; pacientes tendo oupassando através de oteogenese de distração; pacientes após substituição debacia ou disco, reparo do menisco, fusões da espinha ou fixação de prótese,tal como no joelho, quadril, ombro, ombro, pulso ou maxilar; pacientes emque o material de osteosíntese, tal como pregos, parafusos e placas, foramfixados; pacientes com falta de união ou má união de fraturas; pacientes apósosteatomia, por exemplo da tíbia ou do primeiro dedo; pacientes apósimplante de enxertos; degeneração de cartilagem articular em joelho causadopor trauma ou artrite; osteoporose em pacientes com síndrome de Turner;osteoporose em homens; pacientes adultos em diálise crônica (APCD);doença cardiovascular associada com má nutrição APCD; reversão decaquexia em APCD; câncer em APCD; doença pulmonar abstrativa crônicaem APCD; HIV em APCD; idosos com APCD; doença crônica do fígadoAPCD, síndrome de fadiga em APCD; doença de Crohn; função de fígadoprejudicada; males com infecções por HIV; síndrome de intestino curto;obesidade central; síndrome de lipodistrofia associada com HIV (HALS);infertilidade masculina; pacientes após cirurgia eletiva principal,destoxificação de álcool/drogas ou trauma neurológico; envelhecimento;idosos frágeis; osteo-artrite; cartilagem traumaticamente danificada; disfiinçãoerétil; fibromialgia; distúrbios de memória; depressão; dano traumático aocérebro; dano traumático da medula espinhal; hemorragia subaracnóide; pesomuito baixo no nascimento; síndrome metabólica; miopatia glucocorticóide;ou estatura baixa devido a tratamento com glucocorticóide em crianças, ométodo compreendendo administrar a um paciente em necessidade do mesmouma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com apresente invenção. Em particular, referido composto é um composto defórmula [Va] ou fórmula [Via].
O termos "tratamento" e "tratando" como usado aqui significao controle e cuidado de um paciente com o fim de combater uma condição, talcomo uma doença ou a distúrbio. O termo se destina a incluir o espectrocompleto de tratamentos para uma dada condição da qual o paciente estásofrendo, tal como administração do composto ativo para aliviar os sintomasou complicações, para retardar a progressão da doença, distúrbio ou condição,para diminuir ou aliviar os sintomas ou complicações, e/ou para curar oueliminar a doença, distúrbio ou condição assim como para evitar a condição,em que prevenção deve ser entendida como o controle e o cuidado de umpaciente para o fim de combater a doença, condição, ou distúrbio e inclui aadministração dos compostos ativos para evitar o início dos sintomas oucomplicações. O paciente a ser tratado é preferivelmente um mamífero,particularmente um ser humano, mas também pode incluir animais comocachorros, gatos, vacas, ovelhas e suínos. Mesmo assim, deve-se reconhecerque regimes terapêuticos e regimes profiláticos (preventivos) representamaspectos separados da invenção.
A "quantidade terapeuticamente eficaz" de um composto comousado aqui significa uma quantidade suficiente para curar, aliviar ouparcialmente parar as manifestações clínicas de uma dada doença e suascomplicações. Uma quantidade adequada para obter isto é definida como"quantidade terapeuticamente eficaz". As quantidades eficazes para cada fimirão depender de, por exemplo, a severidade da doença ou dano assim como opeso, sexo, idade e estado geral do indivíduo. Será entendido que adeterminação de uma dosagem apropriada pode ser obtida usandoexperimentação de rotina, por construção de uma matriz de valores e teste dediferentes pontos na matriz, que está bem de acordo com os conhecidos de ummédico ou veterinário especializado.
A presente invenção assim provê um composto de acordo coma invenção para uso em terapia.
Em um aspecto, a invenção provê um método para aaceleração da cicatrização de tecido muscular, tecido nervoso ou feridas;aceleração ou melhora do fluxo sangüíneo para tecido danificado; ou adiminuição de taxa de infecção em tecido danificado, o métodocompreendendo a administração a um paciente em necessidade da mesma deuma quantidade eficaz de uma quantidade terapeuticamente eficaz de umcomposto da presente invenção. Em particular, referido composto é umcomposto de fórmula [Va] ou fórmula [Via].
Em uma forma de realização, a invenção refere-se ao uso decompostos de acordo com a presente invenção na fabricação de doenças sebeneficiando de um aumento no nível no plasma de hormônio de crescimento,tal como a doença mencionada acima. Em particular, referido composto é umcomposto de fórmula [Va] ou fórmula [Via].
Uma dose parenteral típica está na faixa de 10"9 mg/kg a cercade 100 mg/kg de peso corporal por administração. As doses de administraçãotípicas são de cerca de 0,0000001 a cerca de 10 mg/kg de peso corporal poradministração. A dose exata irá depender de, por exemplo indicação,medicamento, freqüência e modo de administração, o sexo, idade e condiçãogeral do indivíduo a ser tratado, a natureza e a severidade da doença oucondição a ser tratada, o efeito desejado do tratamento e outros fatoresevidentes para os versados na técnica.
As freqüências de dosagem típicas são de duas vezesdiariamente, uma vez diariamente, duas vezes semanalmente, um vezsemanalmente ou com intervalos de dosagem ainda maiores. Devido às meia-vidas prolongadas dos compostos da presente invenção comparadas com umhormônio de crescimento não conjugado correspondente, um regime dedosagem com intervalos de longa duração, como duas vezes semanalmente ouuma vez por semana, ou com mesmo intervalos de dosagem mais longos, éuma forma de realização particular da invenção.
Muitas doenças são tratadas usando mais do que ummedicamento no tratamento, ou concomitantemente administrado ouseqüencialmente administrado. Assim, está dentro do escopo da presenteinvenção usar compostos da presente invenção em métodos terapêuticos parao tratamento de uma das acima mencionadas doenças em combinação comum ou mais de outros compostos terapeuticamente ativos normalmente usadosno tratamento das referidas doenças. Por analogia, também está dentro doescopo da presente invenção usar compostos da presente invenção emcombinação com outros compostos terapeuticamente ativos normalmenteusados no tratamento de uma das acima mencionadas doenças na fabricaçãode um medicamento para a referida doença.
COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS
Outro fim consiste em prover composições farmacêuticascompreendendo um composto da presente invenção que está presente em umaconcentração de IO"15 mg/ml a 200 mg/ml, tal como por exemplo IO"10 mg/mla 5 mg/ml e em que referido composição tem um pH de 2,0 a 10,0. Acomposição pode ainda compreender um sistema tampão, conservante(s),agente(s) de tonicidade, agente(s) quelante(s), estabilizadores e tensoativos.Em uma forma de realização da invenção, a composição farmacêutica é umacomposição aquosa, isto é composição compreendendo água. Estacomposição é tipicamente uma solução ou uma suspensão. Em ainda umaoutra forma de realização da invenção, a composição farmacêutica é umasolução aquosa. O termo "composição aquosa" é definido como umacomposição compreendendo pelo menos 50 % p/p de água. Do mesmo modo,o termo " solução aquosa" é definido como uma solução compreendendo pelomenos 50 %p/p água, e o termo "suspensão aquosa" é definido como umasuspensão compreendendo pelo menos 50 % p/p água.
Em outra forma de realização, a composição farmacêutica éuma composição seca pro pulverização, à qual o médico ou paciente adicionasolventes e/ou diluentes antes do uso.
Em outra forma de realização, a composição farmacêutica éuma composição seca (por exemplo seca por congelamento ou seca porpulverização) pronta para uso sem qualquer dissolução anterior.
Em um outro aspecto a invenção refere-se a uma composiçãofarmacêutica compreendendo uma solução aquosa de um composto dapresente invenção, e um tampão, em que referido composto está presente emuma concentração de 0,1 -100 mg/ml ou acima, e em que referida composiçãotem um pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0.
Em outra forma de realização da invenção, o pH dacomposição é selecionada dentre a lista consistindo de 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4,2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2,4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0,6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8,7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9, 9,0, 9,1, 9,2, 9,3, 9,4, 9,5, 9,6,9,7, 9,8, 9,9, e 10,0.
Em uma outra forma de realização da invenção, o tampão éselecionado dentre o grupo consistindo de acetato de sódio, carbonato desódio, citrato de sódio, glicilglicina, histidina, glicina, lisina, arginina, di-hidrogeno fosfato de sódio, hidrogeno fosfato de dissódio, fosfato de sódio etris(hidroximetil)-aminometano, bicina, tricina, ácido malico, succinato, ácidomaleico, ácido fiimárico, ácido tartárico, ácido aspártico ou suas misturas.Cada um destes tampões específicos constitui uma forma de realizaçãoalternativa da invenção.
Em uma outra forma de realização da invenção, a composiçãoainda compreende um conservante farmaceuticamente aceitável. Em umaoutra forma de realização da invenção, o conservante é selecionado dentre ogrupo consistindo de fenol, o-cresol, m-cresol, p-cresol, metil p-hidroxibenzoato, propil p-hidroxibenzoato, 2-fenoxietanol, p-hidroxibenzoatode butila, 2-feniletanol, álcool benzílico, clorobutanol, e tiomerosal, bronopol,ácido benzóico, imiduréia, clorohexidina, dehidroacetato de sódio,clorocresol, p-hidroxibenzoato de etila, cloreto de benzetônio, clorfenesina(3p-chlorfenoxipropano-l,2-diol) ou suas misturas. Em uma outra forma derealização da invenção, o conservante está presente em uma concentração de0,1 mg/ml a 20 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção, oconservante está presente em uma concentração de 0,1 mg/ml a 5 mg/ml. Emuma outra forma de realização da invenção, o conservante está presente emuma concentração de 5 mg/ml a 10 mg/ml. Em uma outra forma de realizaçãoda invenção, o conservante está presente em uma concentração de 10 mg/ml a20 mg/ml. Cada um destes conservantes específicos constitui uma forma derealização alternativa da invenção. O uso de um conservante em composiçõesfarmacêuticas é bem conhecido do versado. Por conveniência referência éfeita a Remington: Science and Practice of Pharmacy, 20a' edição, 2000.
Em uma outra forma de realização da invenção, a composiçãoainda compreende um agente isotônico. Em uma outra forma de realização dainvenção, o agente isotônico é selecionado dentre o grupo consistindo de umsal (por exemplo cloreto de sódio), um açúcar ou álcool de açúcar, umaminoácido (por exemplo L-glicina, L-histidina, arginina, lisina, isoleucina,ácido aspártico, triptofano, treonina), um alditol (por exemplo glicerol(glicerina), 1,2-propanodiol (propilenoglicol), 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol) polietilenoglicol (por exemplo PEG400), ou suas misturas.Qualquer açúcar, como mono-, di-, ou polissacarídeos, ou glucanos solúveisem água, incluindo por exemplo fructose, glucose, mannose, sorbose, xilose,maltose, lactose, sacarose, trehalose, dextrano, pululano, dextrina,ciclodextrina, amido solúvel, amido hidroxietila e carboximetilcelulose-Napode ser usado. Em uma forma de realização, aditivo de açúcar e sacarose. Oálcool de açúcar é definido como um hidrocarboneto C4-C8, tendo pelomenos um grupo -OH e inclui, por exemplo, manitol, sorbitol, inositol,galactitol, dulcitol, xilitol, e arabitol. Em uma forma de realização, o aditivode álcool de açúcar é manitol. Os açúcares ou álcoois de açúcar, mencionadosacima, podem ser usados individualmente ou em combinação. Não se tem umlimite fixo para a quantidade usada, desde que o açúcar ou álcool de açúcarseja solúvel na preparação líquida e não afete adversamente os efeitosestabilizantes obtidos usando os métodos da invenção. Em uma forma derealização, a concentração do açúcar ou álcool de açúcar está entre cerca de 1mg/ml e cerca de 150 mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção,o agente isotônico está presente em uma concentração de 1 mg/ml a 50mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção, o agente isotônicoestá presente em uma concentração de 1 mg/ml a 7 mg/ml. Em uma outraforma de realização da invenção, o agente isotônico está presente em umaconcentração de 8 mg/ml a 24 mg/ml. Em uma outra forma de realização dainvenção, o agente isotônico está presente em uma concentração de 25 mg/mla 50 mg/ml. Cada um destes agentes isotônicos específicos constitui umaforma de realização alternativa da invenção. O uso de um agente isotônico emcomposições farmacêuticas é bem conhecido do versado. Por conveniênciareferência é feita a Remington: The Science and Practice of Pharmaey, 20aedição, 2000.
Em uma outra forma de realização da invenção, a composiçãoainda compreende um agente quelante. Em uma outra forma de realização dainvenção, o agente quelante é selecionado dentre sais de ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA), ácido cítrico, e ácido aspártico, e suas misturas. Em umaoutra forma de realização da invenção, o agente quelante está presente emuma concentração de 0,1 mg/ml a 5mg/ml. Em uma outra forma de realizaçãoda invenção, o agente quelante está presente em uma concentração de 0,1mg/ml a 2mg/ml. Em uma outra forma de realização da invenção, o agentequelante está presente em uma concentração de 2mg/ml a 5mg/ml. Cada umdestes agentes quelantes específicos constitui uma forma de realizaçãoalternativa da invenção. O uso de um agente quelante em composiçõesfarmacêuticas é bem conhecido do versado. Por conveniência referência éfeita a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição, 2000.
Em uma outra forma de realização da invenção, a composiçãoainda compreende um estabilizador. O uso de um estabilizador emcomposições farmacêuticas é bem conhecido do versado. Por conveniênciareferência é feita a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20aedição, 2000.
Mais particularmente, composições da invenção sãocomposições farmacêuticas líquidas estabilizadas, cujos componenteterapeuticamente ativos incluem uma proteína que possivelmente demonstraformação de agregado durante armazenamento em composiçõesfarmacêuticas líquidas. Por "formação de agregado" pretende-se umainteração física entre as moléculas da proteína que resulta na formação deoligômeros, que podem permanecer solúveis ou agregados visíveis grandesque precipitam da solução. Por "durante armazenamento" pretende-secomposições farmacêuticas ou líquidas ou composição que uma vezpreparada, não é imediatamente administrada a um indivíduo. Ao contrário,após a preparação, ela é embalada para armazenamento, ou em uma formalíquida ou em um estado congelado, ou em uma forma seca para posteriorreconstituição em uma forma líquida ou outra forma apropriada paraadministração a um indivíduo. Por "forma seca", pretende-se uma composiçãofarmacêutica líquida ou composição que é seca por ou secagem porcongelamento(isto é, liofilização, ver, por exemplo, Williams e Polli (1984) J.Parenteral Sei. Technol. 38:48-59), secagem por pulverização (ver Masters(1991) em Spray-Secagem Handbook (5a. ed; Longman Scientific andTechnical, Essez, U.K.), pp. 491-676; Broadhead et al. (1992) Drug Devei.Ind. Pharm. 18:1169-1206; e Mumenthaler et al. (1994) Pharm. Res. 11:12-20), ou secagem ao ar (Carpenter e Crowe (1988) Cryobiology 25:459-470; eRoser (1991) Biopharm. 4:47-53). A formação de agregados por uma proteínadurante o armazenamento de uma composição farmacêutica líquida podeafetar adversamente a atividade biológica desta proteína, resultando em perdade eficácia terapêutica da composição farmacêutica. Além disso, a formaçãode agregados pode causar outros problemas como bloqueio das tubulações,membranas, ou bombas, quando a composição farmacêutica contendoproteína é administrada usando um sistema de infusão.
As composições farmacêuticas da invenção podem aindacompreender um quantidade de uma base de aminoácido suficiente paradiminuir a formação de agregados pela proteína durante armazenamento dacomposição. Por "base de aminoácido" pretende-se um aminoácido ou umacombinação de aminoácidos, onde qualquer dado aminoácido está presente ouem sua forma de base livre ou em sua forma de sal. Onde se usa umacombinação de aminoácidos, todos os aminoácidos podem estar presentes emsuas formas de base livre, todos podem estar presentes em suas formas de sal,ou alguns podem estar presentes em sua forma de base livre enquanto outrosestão presentes em suas formas de sal. Em uma forma de realização,aminoácidos usados na preparação das composições da invenção são ostransportando uma cadeia lateral carregada, tal como arginina, lisina, ácidoaspártico, e ácido glutâmico. Qualquer estereoisômero (isto é, isômero L ouD, ou suas misturas) de um aminoácido particular (metionina, histidina,arginina, lisina, isoleucina, ácido aspártico, triptofano, treonina e suasmisturas) ou combinações destes estereoisômeros ou glicina ou uma baseorgânica, tal como mas limitada a imidazol, pode estar presente nascomposições farmacêuticas da invenção desde que nenhum aminoácidoparticular ou base orgânica esteja presente ou em sua forma de base livre ousua forma de sal. Em uma forma de realização, o L-estereoisômero de umaminoácido é usado. Em uma forma de realização o L-estereoisômero éusado. Composições da invenção também podem ser formuladas comanálogos destes aminoácidos. Por "análogo de aminoácido " pretende-se umderivado do aminoácido de ocorrência natural que ocasiona o efeito desejadode formação decrescente de agregados pela proteína durante armazenamentodas composições farmacêuticas líquidas da invenção. Os análogos de argininaapropriados incluem, por exemplo, aminoguanidina, ornitina e N-monoetil L-arginina, análogos de metionina apropriados incluem etionina e butionina eanálogos de cisteína apropriados incluem S-metil-L cisteína. Como os outrosaminoácidos, os análogos de aminoácidos são incorporado nas composiçõesem ou sua forma de base livre ou sua forma de sal. Em uma outra forma derealização da invenção, os aminoácidos ou análogos de aminoácido sãousados em uma concentração, que é suficiente para evitar o retardar aagregação das proteínas.
Em uma outra forma de realização da invenção, metionina (ououtros aminoácidos sulfüricos ou análogos de aminoácido) pode seradicionada para inibir a oxidação de resíduos de metionina em sulfóxido demetionina quando a proteína atuando como o agente terapêutico é umaproteína compreendendo pelo menos um resíduo de metionina susceptível àtal oxidação. Por "inibição, pretende-se um acúmulo mínimo de espéciesoxidadas de metionina com o passar do tempo. A inibição da oxidação demetionina resulta e uma retenção maior da proteína em sua forma molecularapropriada. Qualquer estereoisômero de metionina (isômero L ou D) ouquaisquer combinações podem ser usados. A quantidade a ser adicionadadeve ser um quantidade suficiente para inibir a oxidação dos tais resíduos demetionina, de modo que a quantidade de sulfóxido de metionina seja aceitávelpara as agências reguladoras. Tipicamente, isto significa que a composiçãonão contém mais do que cerca de 10% a cerca de 30% sulfóxido demetionina. Geralmente, isto pode ser obtido por tal adição de metionina, demodo que a relação de metionina adicionada a resíduos metionina está nafaixa de cerca de 1:1 a cerca de 1000:1, tal como 10:1 a cerca de 100:1.
Em uma outra forma de realização da invenção, a composiçãoainda compreende um estabilizador selecionado dentre o grupo de polímerosde peso molecular elevado ou composto de peso molecular baixo. Em umaoutra forma de realização da invenção, o estabilizador é selecionado dentrepolietileno glicol (por exemplo PEG 3350), álcool polivinílico (PVA),polivinilpirrolidona, carboxi-/hidroxicelulose ou seus derivados (por exemploHPC, HPC-SL, HPC-L e HPMC), ciclodextrinas, substâncias contendoenxofre, como monotioglicerol, ácido tioglicólico e 2-metiltioetanol, e saisdiferentes (por exemplo cloreto de sódio). Cada um destes estabilizadoresespecíficos constitui uma forma de realização alternativa da invenção.
As composições farmacêuticas podem também compreenderagentes estabilizantes que ainda melhoram a estabilidade de uma proteínaterapeuticamente ativa aqui. Os agentes estabilizantes de interesse particularpara a presente invenção incluem, mas não são limitados a, metionina eEDTA, que protegem a proteína contra oxidação de metionina, e umtensoativo não iônico, que protege a proteína contra a agregação associadacom congelamento / descongelamento ou cisalhamento mecânico.
Em uma outra forma de realização da invenção, a composiçãoainda compreende um tensoativo. Em uma outra forma de realização dainvenção, o tensoativo é selecionado dentre um detergente, óleo de rícinoetoxilado, glicerídeos poliglicolizados, monoglicerídeos acetilados, ésteres deácido graxo de sorbitano, polímeros em bloco polioxipropileno-polioxietileno(por exemplo, poloxâmeros, tal como Pluronic® F68, poloxâmero 188 e 407,Triton X-IOO ), ésteres de ácido graxo de sorbitano polioxietileno, derivadosde polioxietileno e polietileno tal como derivados alquilados e alcoxilados(tweens, por exemplo Tween-20, Tween-40, Tween-80 e Brij-35), seusderivados monoglicerídeos ou etoxilados, seus derivados diglicerídeos oupolioxietileno, álcoois, glicerol, lectinas e fosfolipídeos (por exemplo,fosfatidil serina, fosfatidil colina, fosfatidil etanolamina, fosfatidil inositol,difosfatidil glicerol e esfingomielina), derivados de fosfolipídeos (porexemplo, ácido dipalmitoil fosfatidico) e lisofosfolipídeos (por exemplo,palmitoil lisofosfatidil-L-serina e l-acil-sn-glicero-3-fosfato ésteres deetanolamina, colina, serina ou treonina) e alquila, derivados de alcoxila (ésterde alquila), alcóxi (éter de alquila) de lisofosfatidil e fosfatidilcolinas, porexemplo derivados de lauroila e miristoila de lisofosfatidilcolina,dipalmitoilfosfatidilcolina, e modificações do grupo de cabeça polar, isto écolinas, etanolaminas, ácido fosfatidico, serinas, treoninas, glicerol, inositol, eDODAC, DOTMA, DCP, BISHOP positivamente carregados,lisofosfatidilserina e lisofosfatidiltreonina, e glicerofosfolipídeos (porexemplo, cefalinas), gliceroglicolipídeos (por exemplo, galactopiranosídeo),esfingoglicolipídeos (por exemplo, ceramidas, gangliosídeos),dodecilfosfocolina, lisolecitina de gema de ovo, derivados de ácido fusidico(por exemplo tauro-dihidrofusidatode sódio etc.), ácidos graxos de cadeialonga e seus sais Cfl-Cn (por exemplo, ácido oléico e ácido caprilico),acilcarnitinas e derivados, derivados Nc^acilados de lisina, arginina ouhistidina, ou derivados acilados de cadeia lateral de lisina ou arginina,derivados N^-acilados de dipeptídeos compreendendo qualquer combinaçãode lisina, arginina ou histidina e um aminoácido neutro ou ácido, derivadosNa-acilados de um tripeptídeo compreendendo qualquer combinação de umaminoácido neutro e dois aminoácidos carregados, DSS (docusato de sódio,CAS número de registro [577-11-7]), docusato de cálcio, CAS número deregistro [128-49-4]), docusato de potássio, CAS número de registro [7491-09-0]), SDS (dodecil sulfato de sódio ou lauril sulfato de sódio), caprilato desódio, ácido eólico ou seus derivados, ácidos de bile e seus sais e conjugadosde glicina ou taurina, ácido ursodeoxicólico, colato de sódio, deoxicolato desódio, taurocolato de sódio, glicocolato de sódio, N-Hexadecil-N,N-dimetil-3-amônio-l-propanossulfonato, (sulfonatos de alquil-arila) tensoativosaniônicos monovalentes, tensoativos zwitteriônicos (por exemplo N-alquil-Ν,Ν-dimetilamônio-1 -propanossulfonatos, 3-colamido-1 -propildimetilamônio-l-propanossulfonato, tensoativos catiônicos (bases deamônio quaternário ) (por exemplo brometo de cetil-trimetilamônio, cloretode cetilpiridínio), tensoativos não iônicos (por exemplo, Dodecil β-D-glucopiranosídeo), poloxaminas (por exemplo, Tetronic's), que sãocopolímeros em bloco tetrafuncionais derivados de adição seqüencial deóxido de propileno e óxido de etileno para etilenodiamina, ou o tensoativopode ser selecionado dentre o grupo de derivados de imidazolina, ou suasmisturas. Cada um destes tensoativos específicos constitui uma forma derealização alternativa da invenção.
O uso de um tensoativo em composições farmacêuticas é bemconhecido do versado. Por conveniência referência é feita a Remington: TheScience and Practice of Pharmacy, 20a edição, 2000.
E possível que outros ingredientes possam estar presentes nascomposições farmacêuticas da presente invenção. Estes ingredientesadicionais podem incluir agentes umectantes, emulsificadores, antioxidantes,agentes de volume, modificadores de tonicidade, agentes quelantes, ions demetal, veículos oleaginosos, proteínas (por exemplo, albumina de sorohumano, gelatina ou proteínas) e um zwitteríon (por exemplo, um aminoácidotal como betaina, taurina, arginina, glicina, lisina e histidina). Estesingredientes adicionais, como evidente, não devem afetar adversamente aestabilidade global das composições farmacêuticas da presente invenção.As composições farmacêuticas contendo um composto dapresente invenção podem ser administradas a um paciente em necessidade detal tratamento em vários sítios, por exemplo, em sítios tópicos, por exemplosítios da pele e mucosas, em sítios que ultrapassam a absorção, por exemploadministração em uma artéria, em uma veia, no coração, e em sítios queenvolvem a absorção, por exemplo, administração na pele, sob a pele, em ummúsculo ou no abdômen.
Administração de composições farmacêuticas de acordo com ainvenção pode ser através de várias vias de administração, por exemplo,lingual, sublingual, bucal, na boca, oral, no estômago e intestino, nasal,pulmonar, por exemplo, através dos bronquíolos e alvéolos ou umacombinação dos mesmos, epidérmica, dérmica, transdérmica, vaginal, retal,ocular, por exemplos através de conjuntiva, uretal, e parenteral aos pacientesem necessidade de tal tratamento.
Composições da presente invenção podem ser administradasem várias formas de dosagem, por exemplo, como soluções, suspensões,emulsões, microemulsões, emulsão múltipla, espumas, pomadas, pastas,gessos, ungüentos, comprimidos, comprimidos revestidos, enxágües,cápsulas, por exemplo cápsulas de gelatina dura e cápsulas de gelatina mole,supositórios, cápsulas retais, gotas, géis, pulverização, pó, aerossol, inalantes,colírios, ungüentos oftálmicos, enxágües oftálmicos, pessários vaginais, anéisvaginais, ungüentos vaginais, solução de injeção, em soluções detransformação in situ, por exemplo em geleificação in situ, precipitação insitu, em cristalização in situ, solução de infusão e implantes.
Composições da invenção podem ainda ser compostas em, oufixadas em, por exemplo, através de interações covalentes, hidrofóbicas eeletrostáticas, um veículo de fármaco, sistema de distribuição de fármacos, esistema de distribuição de fármacos avançado, a fim de ainda melhorar aestabilidade do conjugado de GH, aumentar a biodisponibilidade, aumentar asolubilidade, diminuir os efeitos adversos, obter cronoterapia bem conhecidado versado na técnica, e aumentar a adesão dos pacientes ou sua combinação.Exemplos de veículos, sistemas de distribuição de fármacos e sistemas dedistribuição de fármacos avançados incluem, mas não são limitados a,polímeros, por exemplo celulose e derivados, polissacarídeos, por exemplodextrano e derivados, amido e derivados, poli(álcool vinílico), copolímeros deacrilato e metacrilato, ácido polilactico e poliglicolico e seus co-polímeros embloco, polietileno glicóis, proteínas de veículo, por exemplo albumina, géis,por exemplo, sistemas de termo-geleificação, por exemplo sistemas co-poliméricos em bloco bem conhecidos do versado na técnica, micelas,lipossomas, microesferas, nanoparticulados, cristais líquidos e suasdispersões, fase L2 e dispersões da mesma bem conhecidas do versado natécnica de comportamento de fases em sistemas lipídeo-água, micelaspoliméricas, emulsões múltiplas, auto-emulsificantes, auto-microemulsificantes, ciclodextrinas e seus derivados e dendrímeros.
Composições da presente invenção são utilizáveis nacomposição de sólidos, semi-sólidos, pós e soluções para administraçãopulmonar de um composto de fórmula [Va] ou fórmula [Via] usando, porexemplo um inalador de dose medida, inalador de pó seco e um nebulizador,todos sendo dispositivos bem conhecidos do versado na técnica.
Composições da presente invenção são especificamenteutilizáveis na composição de sistemas de liberação de drogas de liberaçãocontrolada, prolongada, retardada, e de liberação lenta. Mais especificamente,mas não limitado a, as composições são utilizáveis em composição deliberação controlada parenteral e sistemas de liberação prolongada (ambossistemas levando a uma redução de muitas vezes no número deadministrações), bem conhecidos do versado na técnica. Ainda maispreferivelmente, são sistemas de liberação controlada e liberação retardadaadministrados de modo subcutâneo. Sem limitar o escopo da invenção,exemplos de sistema de liberação controlada utilizável e composiçõesincluem hidrogéis, géis oleaginosos, cristais líquidos, micelas poliméricas,microesferas, nanopartículas.
Os métodos para produzir sistemas de liberação controladautilizáveis para composições da presente invenção incluem, mas não sãolimitados a, cristalização, condensação, co-cristalização, precipitação, co-precipitação, emulsificação, dispersão, homogeneização em pressão elevada,encapsulação, secagem por pulverização, microencapsulação, coacervação,separação de fase, evaporação de solvente para produzir microesferas,extrusão e processos de fluido supercrítico. A referência geral e feita aHandbook of Pharmaceutical Controlled Release (Wise, D.L., ed. MareeiDekker, New York, 2000) e Drug and the Pharmaceutical Sciences vol. 99:Protein Composition and Delivery (MacNally, EJ., ed. Mareei Dekker, NewYork, 2000).
A administração parenteral pode ser realizada por injeçãosubeutânea, intramuscular, intraperitoneal ou intravenosa por meio de umaseringa, opcionalmente uma seringa de tipo de caneta. A administraçãoparenteral pode ser realizada por meio de uma bomba de infusão. Uma outraopção é a composição que pode ser uma solução ou suspensão para aadministração do composto da presente invenção na forma de umapulverização nasal ou pulmonar. Como ainda outra opção, as composiçõesfarmacêuticas contendo o composto da invenção podem também seradaptadas a administração transdérmica, por exemplo injeção sem agulha oude um curativo adesivo, opcionalmente um adesivo iontoforético, ouadministração transmucosal, por exemplo bucal,.
O termo "composição estabilizada" refere-se a composiçãocom aumentada estabilidade física, aumentada estabilidade química ouaumentada estabilidade física e química.
O termo "estabilidade física" da composição de proteína comousado aqui refere-se à tendência da proteína de formar agregadosbiologicamente inativos e/ou insolúveis da proteína como um resultado daexposição da proteína a estresses termo-mecânicos e/ou interação cominterfaces e superfícies que são desestabilizantes, como superfícieshidrofóbicas e interfaces. A estabilidade física das composições de proteínaaquosa é avaliada por meio de inspeção visual e/ou medidas de turvação apósexposição da composição colocada em recipientes apropriados (por exemplocartuchos ou frasquinhos) para estresse mecânico/ físico (por exemploagitação) em temperaturas diferentes durante vários períodos de tempo. Ainspeção visual das composições é realizada em uma luz de foco agudo comum fundo preto. A turvação da composição é caracterizada por um escorevisual na faixa de grau de turvação, por exemplo em uma escala de 0 a 3 (umacomposição não mostrando turvação corresponde a um escore visual 0, e umacomposição mostrando turvação visual em luz do dia corresponde a umescore visual 3). Uma composição é classificada instável física com relação àagregação de proteína, quando mostra uma turvação visual na luz do dia.Alternativamente, a turvação da composição pode ser avaliada por simplesmedida de turvação bem conhecida do versado. A estabilidade física dascomposições de proteína aquosas também pode ser avaliada por uso de umagente espectroscópico ou sonda do estado conformacional da proteína. Asonda é preferivelmente uma molécula pequena que preferivelmente liga a umconfôrmero não nativo da proteína. Um exemplo de uma sondaespectroscópica molecular pequena de estrutura de proteína é Tioflavina T.Tioflavina T é um corante fluorescente que tem sido amplamente usado para adetecção de fibrilas amilóides. Na presença de fibrilas, e talvez outrasconfigurações de proteína também, Tioflavina T dá lugar a um novo máximode excitação em cerca de 450 nm e uma emissão melhorada abertura 482 nmquando ligada a uma forma de proteína fibrila. A Tioflavina T não ligada éessencialmente não fluorescente nos comprimentos de onda.Outras moléculas pequenas podem ser usadas como sondas dasmudanças em estrutura de proteína de estados nativos para não nativos. Porexemplo, as sondas de "porção hidrofóbica" que ligam preferivelmente aporções hidrofóbicas expostas de uma proteína. As porções hidrofóbicas sãogeralmente enterradas dentro da estrutura terciária de uma proteína em seuestado nativo, mas se torna exposta como uma proteína que começa adesdobrar ou desnaturar. Os exemplos destas sondas espectroscópicasmoleculares pequenas são corantes aromáticos, hidrofóbicos, como antraceno,acridina, fenantrolina ou outros. Outras sondas espectroscópicas sãocomplexos de metal- aminoácido, como complexos de metal cobalto deaminoácidos hidrofóbicos, como fenilalanina, leucina, isoleucina, metionina evalina, ou outros.
O termo "estabilidade química" da composição de proteínacomo usado aqui refere-se a mudanças covalentes químicas na estrutura daproteína levando a formação de produtos de degradação química compotência biológica menos potencial e/ou propriedades imunogênicasaumentadas potenciais comparadas com a estrutura de proteína nativa. Váriosprodutos de degradação química podem ser formados dependendo do tipo enatureza da proteína nativa e o meio em que a proteína é exposta. Aeliminação de degradação química pode mais provavelmente não sercompletamente evitada e quantidades crescentes de produtos de degradaçãoquímica são vistas com freqüência durante o armazenamento e uso dacomposição de proteína, como bem conhecido do versado na técnica. A maiorparte das proteínas são passíveis de desamidação, um processo em que ogrupo amida de cadeia lateral em resíduos de glutaminila ou asparaginila éhidrolisado para formar um ácido carboxílico livre. Outras vias de degradaçãoenvolvem a formação de produtos de transformação de peso molecularelevado, onde duas ou mais moléculas de proteína são covalentemente ligadasuma na outra através de transamidação e/ou interações dissulfeto levando aformação de dímero covalentemente ligado, produtos de degradação depolímero e oligômero (Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. &Manning M.C., Plenum Press, New York 1992). Oxidação (de por exemploresíduos de metionina) pode ser mencionada como outra variante dedegradação química. A estabilidade química da composição de proteína podeser avaliada por medida da quantidade dos produtos de degradação químicaem vários pontos do tempo após exposição a diferentes condições ambientais(a formação de produtos de degradação pode com freqüência ser aceleradapor exemplo aumento da temperatura). A quantidade de cada produto dedegradação individual é com freqüência determinada por separação dosprodutos de degradação dependendo do tamanho de molécula e/ou cargausando várias técnicas de cromatografia (por exemplo SEC-HPLC e/ou RP-HPLC).
Assim, como descrito acima, a "composição estabilizada"refere-se a composição com aumentada estabilidade física, aumentadaestabilidade química ou aumentada estabilidade física e química. Em general,a composição deve ser estável durante uso e armazenamento (de acordo comcondições recomendadas de uso e armazenamento) até o prazo de validade seralcançado.
Em uma forma de realização da invenção, as composiçõesfarmacêuticas compreendendo um composto da presente invenção sãoestáveis por mais do que 6 semanas de uso e por mais do que 3 anos dearmazenamento.
Em outra forma de realização da invenção, as composiçõesfarmacêuticas compreendendo o composto da presente invenção é estável pormais do que 4 semanas de uso e por mais do que 3 anos de armazenamento.
Em uma outra forma de realização da invenção, ascomposições farmacêuticas compreendendo o composto da presente invençãosão estáveis por mais do que 4 semanas de uso e por mais do que dois anos dearmazenamento.
Em ainda uma outra forma de realização da invenção, ascomposições farmacêuticas compreendendo o composto da presente invençãosão estáveis por mais do que 2 semanas de uso e por mais do que dois anos dearmazenamento.
O seguinte é uma lista numerada das formas de realização enão deve ser construída como limitando a invenção:
Forma de realização 1. Um método para fixar covalentementePEG a um polipeptídeo compreendendo pelo menos um resíduo de glutamina,referido método compreende reagir, em uma ou mais etapas, este resíduo deglutamina compreendendo polipeptídeo representado por fórmula [I]
<formula>formula see original document page 101</formula>
em que PP representa um radical de polipeptídeo obtido porremoção de -C(^O)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo de glutaminapresente no polipeptídeo, com um nucleófilo contendo nitrogênio de fórmula
<formula>formula see original document page 101</formula>
em que D representa -O- ou uma ligação única;r representa Ci_6alquileno, -(CH2)4-CH(NH2)-Co-NH-CH2-, -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-, ou C5.15heteroalquileno;
X representa -O-NH2, um aldeído, uma cetona, ou um grupolatente que, quando de outra reação, pode ser transformado em -O-NH2, umaldeído ou uma cetona;
na presença de transglutaminase para formar um polipeptídeotransaminado de fórmula [III]<formula>formula see original document page 102</formula>
opcionalmente, se X é um grupo latente, transformar referidogrupo latente em -O-NH2, um aldeído ou uma cetona,
referido polipeptídeo transaminado sendo ainda reagido comum segundo composto de fórmula [IV]
<formula>formula see original document page 102</formula>
em que Y,
se X representa um aldeído, uma cetona, ou um grupo latenteque, quando de outra reação, pode ser transformado em um aldeído ou umacetona, representa -O-NH2; ou,
se X representa -O-NH2, ou um grupo latente que, quando deoutra reação, pode ser transformado em -O-NH2, representa um aldeído ouuma cetona; e
Z representa uma porção selecionada dentre
<formula>formula see original document page 102</formula><formula>formula see original document page 103</formula><formula>formula see original document page 104</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 4OMkDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e mP kDa;
desde que se Z é 2 2 5 , então PEG é 10kDa PEG
para formar um PEGuilado polipeptídeo de fórmula [V]
<formula>formula see original document page 104</formula>em que A representa uma ligação oxima;ou qualquer sal, pró-droga ou solvato farmaceuticamenteaceitável do mesmo.
Forma de realização 2. Método de acordo com a forma derealização 1, em que D representa -O-.
Forma de realização 3. Método de acordo com a forma derealização 1, em que D representa uma ligação única.
Forma de realização 4. Método de acordo com qualquer umadas formas de realização 1 a 3, em que R representa -(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-CH2- ou -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-.
Forma de realização 5. Método de acordo com qualquer umadas formas de realização 1 a 3, em que R representa C].6alquileno.
Forma de realização 6. Método de acordo com a forma derealização 5, em que R representa Ci.3alquileno.
Forma de realização 7. Método de acordo com a forma derealização 6, em que R representa metileno ou propileno.
Forma de realização 8. Método de acordo com qualquer umadas formas de realização 1 a 7, em que Z representa
<formula>formula see original document page 105</formula><formula>formula see original document page 106</formula><formula>formula see original document page 107</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;
<formula>formula see original document page 107</formula>
então PEG é 10 kDa PEG.Forma de realização 9. Método de acordo com qualquer umadas formas de realização 1 a 8, em que Y representa -O-NH2 e X representaum aldeído ou um grupo latente, que pode ser ainda reagido para formar umaldeído.
Forma de realização 10. Método de acordo com qualquer umadas formas de realização 1 a 8, em que Y representa -O-NH2 e X representauma cetona ou um grupo latente que pode ser ainda reagido para formar umacetona.
Forma de realização 11. Método de acordo com a forma derealização 9 ou forma de realização 10, em que o composto de fórmula [IV]
<formula>formula see original document page 108</formula>
representa um composto selecionado dentre<formula>formula see original document page 109</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG significa mPEGcom um peso molecular de 10 kDa, 20 kDa ou 30 kDa e PEG significa PEGcom um peso molecular entre 2 kDa e 5 kDa.Forma de realização 12. Método de acordo com qualquer umadas formas de realização 1 a 8, em que Y representa um aldeído e Xrepresenta -O-NH2 ou um grupo latente que, quando de outra reação, pode sertransformado em -O-NH2.
Forma de realização 13. Método de acordo com a forma derealização 12, em que o composto de fórmula [IV]
<formula>formula see original document page 110</formula>
representa um composto selecionado dentre
<formula>formula see original document page 110</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG significa mPEGcom um peso molecular de 10 kDa, 20 kDa ou 30 kDa e PEG significa PEGcom um peso molecular entre 2 kDa e 5 kDa.
Forma de realização 14. Método de acordo com qualquer umadas formas de realização 1 a 8, em que Y representa uma cetona e Xrepresenta -O-NH2 ou um grupo latente que, quando de outra reação, pode sertransformado em -O-NH2.
Forma de realização 15. Método de acordo com a forma derealização 14, em que o composto de fórmula [IV]
<formula>formula see original document page 111</formula>
representa um composto selecionado dentre
<formula>formula see original document page 111</formula><formula>formula see original document page 112</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG significa mPEGcom um peso molecular de 10 kDa, 20 kDa ou 30 kDa e PEG significa PEGcom um peso molecular entre 2 kDa e 5 kDa.
Forma de realização 16. Método de acordo com qualquer umadas formas de realização 1 a 8, em que
o composto de fórmula [II]
<formula>formula see original document page 112</formula>
representa l,3-diamino-2-propanol, e
Y representa -O-NH2.
Forma de realização 17. Método de acordo com qualquer umadas formas de realização 1 a 8, em que
o composto de fórmula [II]
<formula>formula see original document page 112</formula>
representa 1,3-diaminoóxi propano, e
Y representa um aldeído.
Forma de realização 18. Um método de modificar aspropriedades farmacológicas de hormônio de crescimento, o métodocompreendendo covalentemente fixar PEG em referido hormônio decrescimento de acordo com um método de qualquer uma das formas derealização 1 a 17.
Forma de realização 19. Método de acordo com qualquer umadas formas de realização 1 a 18, em que o polipeptídeo é um resíduo deglutamina compreendendo hormônio de crescimento e PP representa umradical de hormônio de crescimento obtido por remoção de -C(^O)-NH2 dacadeia lateral de um resíduo de glutamina presente em hormônio decrescimento.
Forma de realização 20. Método de acordo com a forma derealização 19, em que referido resíduo de glutamina compreendendohormônio de crescimento representa um hormônio de crescimento humano.
Forma de realização 21. Método de acordo com a forma derealização 20, em que referido resíduo de glutamina compreendendohormônio de crescimento representa
a) um hGH compreendendo a seqüência de aminoácidos deSEQ ID No.l,
b) 20 kDa hGH,
c) um hGH em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 40 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido,
d) um hGH em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido, ou
e) um hGH em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 40 em SEQ ID No. 1, e o resíduo de glutamina naposição correspondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1 foram, cada,deletados ou substituídos com outro aminoácido, e onde um resíduo deglutamina está presente em outra posição no hormônio de crescimento.
Forma de realização 22. Método de acordo com a forma derealização 21, em que referido hormônio de crescimento representa hGH.
Forma de realização 23. Composto de acordo com a fórmula
<formula>formula see original document page 113</formula>
em que PP representa um radical de polipeptídeo obtido porremoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo de glutaminapresente no polipeptídeo;
D representa -O- ou uma ligação;
r representa Ci^alquileno, -(CH2)4-CH(NH2)-Co-NH-CH2-, -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2- ou C5_i5heteroalquileno;
A representa uma ligação oxima;
Z representa uma porção selecionada dentre
<formula>formula see original document page 114</formula><formula>formula see original document page 115</formula><formula>formula see original document page 116</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG com umpeso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;
e sais, pró-drogas ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis domesmo;
<formula>formula see original document page 116</formula>
desde que se Z é 2 2 5 , então mPEG é 10 kDa mPEG.
Forma de realização 24. Composto de acordo com a forma derealização 23, em que D representa -O-.
Forma de realização 25. Composto de acordo com a forma derealização 23, em que D representa uma ligação única.
Forma de realização 26. Composto de acordo com qualqueruma das formas de realização 23 a 25, em que R representa -(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-CH2- ou -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-.
Forma de realização 27. Composto de acordo com qualqueruma das formas de realização 23 a 25, em que R representa Ci.6alquileno.
Forma de realização 28. Composto de acordo com a forma derealização 27, em que R representa Ci_3alqmleno.
Forma de realização 29. Composto de acordo com a forma derealização 28, em que R representa metileno ou propileno.
Forma de realização 30. Composto de acordo com qualqueruma das formas de realização 23 a 29, em que Z representa
<formula>formula see original document page 117</formula><formula>formula see original document page 118</formula><formula>formula see original document page 119</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;
<formula>formula see original document page 119</formula>
desde que se Z é 2 2 5 , então PEG é 10 kDa PEG.
Forma de realização 31. Composto de acordo com qualqueruma das formas de realização 23 a 30, em que o polipeptídeo é um resíduo deglutamina compreendendo hormônio de crescimento e PP representa umradical de hormônio de crescimento obtido por remoção de -C(=0)-NH2 dacadeia lateral de um resíduo de glutamina presente em hormônio decrescimento.
Forma de realização 32. Composto de acordo com a forma derealização 31, em que GH representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo de glutamina presente em umhGH compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No. 1.Forma de realização 33. Composto de acordo com a forma derealização 31, em que GH representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo de glutamina presente em 20 kDahGH.
Forma de realização 34. Composto de acordo com a forma derealização 31, em que GH representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de
a) o resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 40 em SEQ ID No. 1; ou
b) o resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 141 em SEQ ID No. 1;
ou
GH representa o radical obtido por remoção de -C(^O)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 40 em SEQ ID No. 1, em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido;
ou
GH representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 141 em SEQ ID No. 1, em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 40 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido;
ou
GH representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina presente em uma posiçãodiferente da posição correspondendo à posição 40 em SEQ ID No. 1 ediferente da posição correspondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1, em queo resíduo de glutamina na posição correspondendo à posição 40 em SEQ IDNo. 1, e o resíduo de glutamina na posição correspondendo à posição 141 emSEQ ID No. 1 foram, cada, deletados ou substituídos com outro aminoácido..
Forma de realização 35. Composto de acordo com a forma derealização 23 selecionado dentre
iVôl41/40-2-(O-(4- {4-( 1,3-bis(mPEG( 1 Ok)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} aminobutil)-oximino)etil hGH;
7V6141/40-2-(0-(4-{4-(mPEG(10k)iloxi)butiril}aminobutil)oximino)etil hGH;
7Vôl41/40-2-(0-(4-{3-(mPEG(10k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
7Vôl41/40-2-(O-(4-{4-(2,3-bis(mPEG( 10k)iloxi)prop-1-iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
iVôi4i/40_2_(o_(4_{5_(mPEG(1()k)iloxi_5_oxopentanoil} aminobutil)oximino)etil hGH;
7Vsl41/40-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno} aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
iVôl41/40-3-({4-(l,3-bis(mPEG(10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;
TV5141/40-3-({4-(mPEG( 1 Ok)iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxihGH;
7V6141/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
TV5141x40-B -( { 3 -(mPEG( 1 Ok)iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;
iVôl41/40-2-(O-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
7V5,41/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxi hGH;7Vsl41/40-2-(0-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} aminobutil)-oximino)etil hGH;
7V6141/40-2-(0-(4-{3-(mPEG(20k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
7V5141/40-2-(0-(4-{4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
7Vsl41/40-2-(0-(4-{5-(mPEG(20k)iloxi-5-oxopentanoil} aminobutil)oximino)etil hGH;
7V6141/40-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
7Vôl41/40-3-({4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;
A^141/40-3 -( { 4-(mPEG(20k)iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxihGH;
7V5141/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
A'5141/40-3 -({3 -(mPEG(20k)i loxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;
7V5141/40-2-(0-(2-(3-(2J3-bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
7V5141/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
jV6141/40_2-(O-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} aminobutil)-oximino)etil hGH;
7V5141/40-2-(0-(4-{3-(mPEG(30k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
7V5141/40-2-(0-(4-{4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;7V8141/40-2-(0-(4-{5-(mPEG(30k)iloxi-5-oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;
7V6141/40-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno} aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
A^141/40-3-({4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;
A^141/40-3-({4-(mPEG(30k)iloxi)butilideno}aminoxi)propilóxihGH;
7Vsl41/40_3_({4_(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
7V8141/40-3-({3-(mPEG(30k)iloxi)propilideno}aminoxi)propilóxihGH;
iV5141/40-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
iV5141/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
iVsl41/40-3-({4-{(2,3-bis(mPEG(20k)il)prop-l-iloxi)PEGuiloxi} butilideno }aminoxi)propilóxi hGH;
7Vôl41/40-2-((4-(4-((2,3-bis(mPEG(20k)il)propil)PEGuiloxi)butirilamino)butil)oximino)etil hGH;
A^ul-2-(0-(4- {4-( 1,3-bis(mPEG( 1 Ok)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;
iV6141 -2-(0-(4- { 4-(mPEG( 1 Ok)iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
TV8141 -2-(0-(4- {3-(mPEG( 1 Ok)iloxi)propionil} aminobutil)oximino)etil hGH;
7V6141_2-(0-(4- {4-(2,3-bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;N0ui -2-(0-(4- { 5 -(mPEG( 1 Ok)iloxi-5 -oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;
7Vsl41-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
7V6141-3-({4-(l,3-bis(mPEG(10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno} -aminoxi)propilóxi hGH;
TVsi41 -3 -( {4-(mPEG( 1 Ok)iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxihGH;
iV5141-3-({4-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
-({3 -(mPEG( 1 Ok)iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;
J/V6141-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG( 10k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
TVsi 41 -3 -( { 4-(2,3 -bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
7Vsl41-2-(0-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -minobutil)oximino)etil hGH;
TVsi41 -2-(0-(4- {3 -(mPEG(20k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
A^141-2-(0-(4- {4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
Ndui -2-(0-(4- { 5-(mPEG(20k)iloxi-5-oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;
7Vsl41-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
iVôl41-3-({4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno} -aminoxi)propilóxi hGH;
N^141-3 -( { 4-(mPEG(20k)iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxihGH;
N^141-3 -( { 4-(2,3 -bis(mPEG(20k)iloxi)prop-1 -iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
N^141-( { 3 -(mPEG(20k)iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;
N^141-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
N^141-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
N^141-2-(0-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;
N^141-2-(0-(4- { 3-(mPEG(3 Ok)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
N^141-2-(0-(4- {4-(2,3-bis(mPEG(3 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
N^141-2-(0-(4-{5-(mPEG(30k)iloxi-5-oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;
N^141-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
N^141-3 -( { 4-( 1 ,3 -bis(mPEG(3 0k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;
N^141-3 -({4-(mPEG(3 Ok)iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxihGH;
N^141-3-({4-(2,3 -bis(mPEG(3 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
N^141 -3 -( { 3 -(mPEG(3 Ok)iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxihGH;
N^141-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
N^141-3 -({4-(2,3 -bis(mPEG(3 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
N^141-3 -( { 4- { (2,3 -bis(mPEG(20k)iloxi)prop-1 -il)PEGuiloxi}butilideno}aminoxi)propilóxi hGH;
N^141-2-((4-(4-((2,3-bis(mPEG(20k)il)propil)PEGuiloxi)butirilamino)butil)oximino)etil hGH;
N^141-2-(0-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;
N^40-2-(O-(4- {4-(mPEG( 1 Ok)iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
N^40-2-(O-(4- {3-(mPEG( 1 Ok)iloxi)propionil} aminobutil)oximino)etil hGH;
N^40-2-(0-(4-{4-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)prop-l-iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
N^40-2-(O-(4- {5-(mPEG( 10k)iloxi-5-oxopentanoil} aminobutil)oximino)etil hGH;
N^40-2-( { 4-(2-(2-(2-(2-(4-( 1,3 -bis(mPEG( 1 Ok)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
N^40-3-( {4-( 1,3-bis(mPEG( 10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno} -aminoxi)propilóxi hGH;
N^40-3 -({4-(mPEG(10k)iloxi)butilideno}aminoxi)propilóxihGH;
N^40-3 -( { 4-(2,3 -bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
N^40-3 -( { 3 -(mPEG( 1 Ok)iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxihGH;
iV84°-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
7V540-3-({4-(2,3-bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
7V54°-2-(0-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;
7V840-2-(O-(4- {3-(mPEG(20k)iloxi)propionil} aminobutil)oximino)etil hGH;
7VS40-2-(0-(4-{4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
7VS4°-2-(0-(4-{5-(mPEG(20k)iloxi-5-oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;
iV540-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
7Vô40-3-({4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;
A^40-3 -( { 4-(mPEG(20k)iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxihGH;
7V640-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno }aminoxi)propilóxi hGH;
Τνδ40-3 -({3 -(mPEG(20k)iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxihGH;
7VS40-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
7VS40_3-({4_(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-1 -iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
Λ/δ40-2-(Ο-(4- {4-( 1,3 -bis(mPEG(3 Ok)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;
N^40-2-(0-(4-{3-(mPEG(30k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;
N^40-2-(0-(4-{4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;
N^40-2-(0-(4- { 5-(mPEG(3 0k)iloxi-5-oxopentanoil} aminobutil)oximino)etil hGH;
N^40-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno} aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;
N^40-3-({4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno} -aminoxi)propilóxi hGH;
N^40-2-( { 4-(mPEG(3 Ok)iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxihGH;
N^40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;
N^40-2-( { 3 -(mPEG(3 Ok)iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;
N^40-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;
N^40-( { 4-(2,3 -bis(mPEG(3 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)propilideno}aminoxi)propilóxi hGH;
N^40-({4- {(2,3 -bis(mPEG(20k)iloxi)prop-1 -il)PEGuiloxi} butilideno} aminoxi)propilóxi hGH;
N^40-2-((4-(4-((2,3-bis(mPEG(20k)il)propil)PEGuiloxi)butirilamino)butil)oximino)etil hGH;
N^141 - [2-0-(4-(4-( 1,3 -bis(mPEG(20K)aminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH;
N^141 - [2-(0-(4-(4-(mPEG(3 OK)oxi)butirilamino)-butil)oxiimino)-etil] hGH;
N^141 -(3-((4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno)aminoxi)propiloxi) hGH;
N^141 - [2-(2-(2,3 -(mPEG(20K)iloxi)propiloxicarbonilamino)etiloximino)etil] hGH;
N^141 -[2-(0-(2-(2-(mPEG(40K)iloxi)etilamino)-2-oxoetil)oximino)etil] hGH;
N^141 -[2-(3-(4-(( 1,3-bis(mPEG(30K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butilideno)aminoxi)propiloxiimino)etil] hGH;
N^141/40-[2-0-(4-(4-(l,3-bis(mPEG(20K)aminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH;
N^141/40-[2-(0-(4-(4-(mPEG(30K)oxi)butirilamino)-butil)oxiimino)-etil] hGH;
N^141/40-(3-((4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno)aminoxi)propiloxi) hGH;
N^141/40- [2-(2-(2,3 -(mPEG(20K)iloxi)propiloxicarbonilamino)etiloximino)etil] hGH;
N^141/40-[2-(0-(2-(2-(mPEG(40K)iloxi)etilamino)-2-oxoetil)oximino)etil] hGH;
N^141/40- [2-(3-(4-(( 1,3 -bis(mPEG(3 0K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butilideno)aminoxi)propiloxiimino)etil] hGH;
N^40-[2-0-(4-(4-(l,3-bis(mPEG(20K)aminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH;
N^40-[2-(0-(4-(4-(mPEG(30K)oxi)butirilamino)-butil)oxiimino)-etil] hGH;
N^40-(3-((4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno)aminoxi)propiloxi) hGH;
N^40-[2-(2-(2,3-(mPEG(20K)iloxi)propiloxicarbonilamino)etiloximino)etil] hGH;
N^40-[2-(0-(2-(2-(mPEG(40K)iloxi)etilamino)-2-oxoetil)oximino)etil] hGH;
N^40-[2-(3-(4-((l,3-bis(mPEG(30K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butilideno)aminoxi)propiloxiimino)etil] hGH;
<formula>formula see original document page 130</formula><formula>formula see original document page 131</formula><formula>formula see original document page 132</formula><formula>formula see original document page 133</formula><formula>formula see original document page 134</formula><formula>formula see original document page 135</formula>Forma de realização 36. Composto de acordo com a fórmula
<formula>formula see original document page 136</formula>
em que PP representa um radical de polipeptídeo obtido porremoção de -C(KD)-NH2 da cadeia lateral de dois resíduos de glutaminapresentes em referido polipeptídeo;
D representa -O- ou uma ligação;
r representa C1^alquileno5 -(CH2)4-CH(NH2)-Co-NH-CH2-, -
(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-, ou C5_i5heteroalquileno;
A representa uma ligação oxima;
Z representa uma porção selecionada dentre
<formula>formula see original document page 136</formula><formula>formula see original document page 137</formula><formula>formula see original document page 138</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG com umpeso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;
e sais, pró-drogas ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis domesmo;
<formula>formula see original document page 138</formula>
desde que se Z é 2 2 5 , então mPEG é 10 kDa mPEG.
Forma de realização 37. Composto de acordo com a forma derealização 36, em que D representa -O-.Forma de realização 38. Composto de acordo com a forma derealização 36, em que D representa uma ligação única.
Forma de realização 39. Composto de acordo com qualqueruma das formas de realização 36 a 38, em que R representa -(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-CH2- ou -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-.
Forma de realização 40. Composto de acordo com qualqueruma das formas de realização 36 a 38, em que R representa Ci_6alquileno.
Forma de realização 41. Composto de acordo com a forma derealização 40, em que R representa Ci.3alquileno.
Forma de realização 42. Composto de acordo com a forma derealização 41, em que R representa metileno ou propileno.
Forma de realização 43. Composto de acordo com qualqueruma das formas de realização 36 a 42, em que Z representa
<formula>formula see original document page 139</formula><formula>formula see original document page 140</formula><formula>formula see original document page 141</formula>
em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;
<formula>formula see original document page 141</formula>
desde que se Z é 2 2 5 , então PEG é 10 kDa PEG.
Forma de realização 44. Composto de acordo com qualqueruma das formas de realização 36 a 43, em que o polipeptídeo é um resíduo deglutamina compreendendo hormônio de crescimento e PP representa umradical de hormônio de crescimento obtido por remoção de -C(=0)-NH2 dacadeia lateral de dois resíduos de glutamina presentes no hormônio decrescimento.
Forma de realização 45. Composto de acordo com a forma derealização 44, em que GH representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de dois resíduos de glutamina presentes em umhGH compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No.l.
Forma de realização 46. Composto de acordo com a forma derealização 44, em que GH representa o radical obtido por remoção de -C(^O)-NH2 da cadeia lateral de dois resíduos de glutamina presentes em 20kDa hGH.
Forma de realização 47. Composto de acordo com a forma derealização 44, em que
GH representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 40 em SEQ ID No. 1, e da cadeia lateral do resíduo de glutamina naposição correspondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1;
ou
GH representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 40 em SEQ ID No. 1, em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido, e por remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de umoutro resíduo de glutamina presente em uma posição diferente das posiçõescorrespondendo às posições 40 e 141 em SEQ ID No. 1;
ou
GH representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 141 em SEQ ID No. 1, em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 40 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido, e por remoção de -C(^O)-NH2 da cadeia lateral de umoutro resíduo de glutamina presente em uma posição diferente das posiçõescorrespondendo às posições 40 e 141 em SEQ ID No. 1;ou
GH representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2da cadeia lateral de duas glutaminas presentes em um hGH em posiçõesdiferente das posições correspondendo às posições 40 e 141 em SEQ ID No.1, em que qualquer resíduo de glutaminas presentes nas posiçõescorrespondendo às posições 40 e 141 em SEQ ID No. 1 foi deletado ousubstituído com outros aminoácidos.
Forma de realização 48. Hormônio de crescimento humano,que é covalentemente fixado a uma porção compreendendo PEG5 e emparticular mPEG, em que referido porção compreendendo PEG é fixada nacadeia lateral de resíduo de glutamina 40, na cadeia lateral de glutamina 141ou nas cadeias laterais de glutamina 40 e glutamina 141 de hormônio decrescimento humano, desde que não seja
N^141-[2-(4-(4-(mPEG(20k)ilbutanoil)-amino-butiloxiimino)-etil] hGH,
N^141- [2-( 1 -(hexadecanoil)piperidin-4-il)etiloxiimino)-etil]hGH,
N^141(2-(4-(4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)butiloxiimino)etil) hGH,
N^141(2-(4-(2,6-bis(mPEG(20k)iloxicarbonilamino)hexanoilamino)butiloxiimino)etil) hGH,
N^141(2-(4-(4-(mPEG(30k)iloxi)butirilamino)butiloxiimino)etil) hGH,
N^141(2-(4-(4-(mPEG(20k)iloxi)butirilamino)butiloxiimino)etil) hGH, ou
N^141(2-(4-(3 -(mPEG(3 Ok)iloxi)propanoilamino)butiloxiimino)etil) hGH.
Forma de realização 49. Composto obtido por uso de ummétodo de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 22.Forma de realização 50. Composto caracterizado pelo fato deser obtenível pelo uso de um método de acordo com qualquer uma das formasde realização 1 a 22.
Forma de realização 51. Composto obtido por uso de ummétodo de acordo com qualquer uma das formas de realização 19 a 22.
Forma de realização 52. Composto caracterizado pelo fato deser obtenível pelo uso de um método de acordo com qualquer uma das formasde realização 19 a 22.
Forma de realização 53. Composto de acordo com qualqueruma das formas de realização 31 a 35, qualquer uma das formas de realização44 a 52, forma de realização 51, ou forma de realização 52 para uso emterapia.
Forma de realização 54. Composições farmacêuticascompreendendo um composto de acordo com qualquer uma das formas derealização 31 a 35, qualquer uma das formas de realização 44 a 52, forma derealização 51, ou forma de realização 52.
Forma de realização 55. Um método para tratamento dedeficiência de hormônio de crescimento (GHD); Síndrome de Turner;Síndrome de Prader-Willi (PWS); Síndrome de Noonan; Síndrome de Down;doença renal crônica, artrite reumatóide juvenil; fibrose cística, infecção porHIV em crianças recebendo tratamento HAART (crianças HIV/HALS);crianças baixas que cresceram baixas na idade gestacional (SGA); estaturabaixa em crianças que nasceram com peso muito baixo (VLBW) mas SGA;displasia esqueletal; hipocondroplasia; acondroplasia; estatura baixaidiopática (ISS); GHD em adultos; fraturas em ou de ossos longos, tal comotíbia, fíbula, fêmur, úmero, rádio, ulna, clavícula, matacarpea, matatarsea, edígito; fraturas em ou de ossos espongiosos, tal como o remo, base de mão, ebase do pé; pacientes após cirurgia dos tendões ou ligamentos em porexemplo mão, joelho, ou ombro; pacientes tendo ou passando através deoteogenese de distração; pacientes após substituição de bacia ou disco, reparodo menisco, fusões da espinha ou fixação de prótese, tal como no joelho,quadril, ombro, ombro, pulso ou maxilar; pacientes em que o material deosteosíntese, tal como pregos, parafusos e placas, foram fixados; pacientescom falta de união ou má união de fraturas; pacientes após osteatomia, porexemplo da tíbia ou do primeiro dedo; pacientes após implante de enxertos;degeneração de cartilagem articular em joelho causado por trauma ou artrite;osteoporose em pacientes com síndrome de Turner; osteoporose em homens;pacientes adultos em diálise crônica (APCD); doença cardiovascularassociada com má nutrição APCD; reversão de caquexia em APCD; câncerem APCD; doença pulmonar abstrativa crônica em APCD; HIV em APCD;idosos com APCD; doença crônica do fígado APCD, síndrome de fadiga emAPCD; doença de Crohn; função de fígado prejudicada; males com infecçõespor HIV; síndrome de intestino curto; obesidade central; síndrome delipodistrofia associada com HIV (HALS); infertilidade masculina; pacientesapós cirurgia eletiva principal, destoxificação de álcool/drogas ou traumaneurológico; envelhecimento; idosos frágeis; osteo-artrite; cartilagemtraumaticamente danificada; disfunção erétil; fibromialgia; distúrbios dememória; depressão; dano traumático ao cérebro; hemorragia subaracnóide;peso muito baixo no nascimento; síndrome metabólica; miopatiaglucocorticóide; estatura baixa devido a tratamento com glucocorticóide emcrianças; para aceleração da cicatrização de tecido muscular, tecido nervosoou feridas; aceleração ou melhora do fluxo sangüíneo para tecido danificado;ou a diminuição de taxa de infecção em tecido danificado, o métodocompreendendo administração a um paciente em necessidade da mesma deuma quantidade eficaz de uma quantidade terapeuticamente eficaz de umcomposto de acordo com qualquer uma das formas de realização 31 a 35,qualquer uma das formas de realização 44 a 52, forma de realização 51, ouforma de realização 52 ou as composições farmacêuticas de acordo com aforma de realização 54.
Forma de realização 56. O uso de um composto de acordo comqualquer uma das formas de realização 31 a 35, qualquer uma das formas derealização 44 a 52, forma de realização 51, ou forma de realização 52 nafabricação de um medicamento a ser usado no tratamento de deficiência dehormônio de crescimento (GHD); Síndrome de Turner; Síndrome de Prader-Willi (PWS); Síndrome de Noonan; Síndrome de Down; doença renalcrônica, artrite reumatóide juvenil; fibrose cística, infecção por HIV emcrianças recebendo tratamento HAART (crianças HIV/HALS); criançasbaixas que cresceram baixas na idade gestacional (SGA); estatura baixa emcrianças que nasceram com peso muito baixo (VLBW) mas SGA; displasiaesqueletal; hipocondroplasia; acondroplasia; estatura baixa idiopática (ISS);GHD em adultos; fraturas em ou de ossos longos, tal como tíbia, fíbula,fêmur, úmero, rádio, ulna, clavícula, matacarpea, matatarsea, e dígito; fraturasem ou de ossos espongiosos, tal como o remo, base de mão, e base do pé;pacientes após cirurgia dos tendões ou ligamentos em por exemplo mão,joelho, ou ombro; pacientes tendo ou passando através de oteogenese dedistração; pacientes após substituição de bacia ou disco, reparo do menisco,fusões da espinha ou fixação de prótese, tal como no joelho, quadril, ombro,ombro, pulso ou maxilar; pacientes em que o material de osteosíntese, talcomo pregos, parafusos e placas, foram fixados; pacientes com falta de uniãoou má união de fraturas; pacientes após osteatomia, por exemplo da tíbia oudo primeiro dedo; pacientes após implante de enxertos; degeneração decartilagem articular em joelho causado por trauma ou artrite; osteoporose empacientes com síndrome de Turner; osteoporose em homens; pacientes adultosem diálise crônica (APCD); doença cardiovascular associada com má nutriçãoAPCD; reversão de caquexia em APCD; câncer em APCD; doença pulmonarabstrativa crônica em APCD; HTV em APCD; idosos com APCD; doençacrônica do fígado APCD, síndrome de fadiga em APCD; doença de Crohn;função de fígado prejudicada; males com infecções por HIV; síndrome deintestino curto; obesidade central; síndrome de lipodistrofia associada comHIV (HALS); infertilidade masculina; pacientes após cirurgia eletivaprincipal, destoxificação de álcool/drogas ou trauma neurológico;envelhecimento; idosos frágeis; osteo-artrite; cartilagem traumaticamentedanificada; disfunção erétil; fibromialgia; distúrbios de memória; depressão;dano traumático ao cérebro; hemorragia subaracnóide; peso muito baixo nonascimento; síndrome metabólica; miopatia glucocorticóide; estatura baixadevido a tratamento com glucocorticóide em crianças; aceleração dacicatrização de tecido muscular, tecido nervoso ou feridas; aceleração oumelhora do fluxo sangüíneo para tecido danificado; ou a diminuição de taxade infecção em tecido danificado.
Todas as referências, incluindo publicações, pedidos depatente e patentes incorporadas por referência em sua totalidade e na mesmaextensão como se cada referência fosse individualmente e especificamenteindicada para ser incorporada por referência e como especificados em suatotalidade aqui (na extensão máxima permitida pela lei), apesar de qualquerincorporação provida separadamente dos documentos particulares feitas emoutras partes aqui.
Todos os cabeçalhos e sub-cabeçalhos são usados aqui porconveniência apenas e não devem ser construídos como limitando a invençãode alguma forma.
Qualquer combinação dos elementos acima-descritos em todasas suas variações possíveis é englobada pela invenção salvo indicado emcontrário aqui ou de outra foram claramente contradito pelo contexto.
O uso dos termos "um" e "uma" e "o" e referentes similares nocontexto de descrição da invenção deve ser construído para cobrir tanto osingular como o plural, salvo indicado em contrário aqui ou claramentecontradito por contexto. Por exemplo, a expressão "o composto" deve serentendida como se referindo a vários "compostos " da invenção ou aspectoparticular descrito, salvo indicado em contrário.
As descrições de faixas de valores são aqui apenas pretendidaspara servir como um método abreviado de referência individualmente a cadavalor separado caindo dentro da faixa, salvo indicado em contrário aqui, ecada valor separado é incorporado no relatório como se fosse individualmentedescrito aqui.
Salvo indicado em contrário, todos os valores exatos providosaqui são representativos de valores aproximados correspondentes (porexemplo todos os valores exemplares exatos providos com relação a um fatorparticular ou medida pode ser considerado para também prover uma medidaaproximada correspondente, modificada por "cerca de" onde apropriado).
Todos os métodos descritos aqui podem ser realizados emqualquer ordem apropriada, salvo indicado em contrário aqui ou de outraforma claramente contradito por contexto.
O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou expressõesexemplares (por exemplo, "como") provido aqui, se destina a penas a melhoresclarecer a invenção e não colocada uma limitação no escopo da invençãosalvo indicado em contrário. Nenhum expressão no relatório deve serconstruída como indicando que qualquer elemento é essencial para a práticada invenção salvo se for explicitamente afirmado.
A citação e incorporação de documentos de patente aqui é feitapor conveniência apenas e não reflete qualquer aspecto de validade,patentabilidade e/ou vigor destes documentos de patente
A descrição aqui de qualquer aspecto ou aspecto da invençãousando termos tal como "compreendendo", "tendo", "incluindo," ou"contendo" com referência a um elemento ou elementos se destina a proversuporte para um aspecto similar ou aspecto da invenção que "consiste de","consiste essencialmente de", ou "substancialmente compreende" que esteelemento ou elementos particulares, salvo indicado em contrário ouclaramente contradito por contexto (por exemplo, a composição descrita aquicomo compreendendo um elemento particular deve ser entendida comotambém descrevendo uma composição consistindo deste elemento, salvoindicado em contrário ou claramente contradito por contexto). Aspropriedades básicas e novas com relação a estes aspectos da invenção sãoprovidas aqui.
Esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes dosassuntos citados nos aspectos e reivindicações apresentados aqui na extensãomáxima permitida pela lei aplicável.
EXEMPLOS
O TGase usado nos exemplos é transglutaminase microbianade Streptoverticillium mobaraenae de acordo com US5156956 ou deStreptomyces Lydicus de acordo com WO 9606931-Al.
Métodos Analíticos
Espectrometria de massa Maldi-Tof.
Os pesos moleculares foram determinados usando oinstrumento Autoflex Maldi-Tof (Bruker). Amostras foram preparadas deacordo com o método sandwich. Matriz 1 foi uma solução de 10 mg ácidoalfa-ciano-4-hidroxi-cinâmico em 1 ml acetona. Matriz 2 foi uma solução de10 mg alfa-ciano-4-hidroxi-cinâmico em 1 ml de acetonitrila a 50%em água.Amostras foram preparadas no reservatório por aplicação seqüencial de 1 μΐde matriz 1, secagem em ar, aplicação de 1 μΐ 3% ácido trifluoroacetico,aplicação de amostra de Ιμΐ, aplicação de 1 μΐ de matriz 2, secagem em ar,lavagem da placa de alvo com água e finalmente secagem em ar. Os espectrosforam adquiridos usando 20% força de laser e o método padrão para a faixade 3- 20 kDa que foi fornecida com o instrumento.
Quantificação de proteína
As concentrações de proteína foram estimadas por medida daabsorbância a 280 nm usando espectrofotômetro de V-. Um coeficiente deextinção molar de 16170 JVT1 cm"1 foi usado. Quantidades foram calculadasdos volumes e concentrações.
"SDS page"
A eletroforese de gel SDS poli-acrilamida foi realizada usandogéis NuPAGE 4% - 12 % Bis-Tris (Invitrogen NP0321BOX). Os géis foramcoloridos com prata (Invitrogen LC6100) ou coloridos com Coomassie(Invitrogen LC6065) e onde relevante também coloridos for PEG com iodetode bário, como descrito em Μ. M. Kurfurst, Anal.Biochem. 200(2), 244-248(1992).
Análise RP-HPLC.
Sistema A.: sistema Merck-Hitachi consistindo de: L-7400detector de UV, L-7200 autoamostrador e bomba L-7100. Uma coluna desílica Zorbax SB-300 4,6mm χ 50mm 5μηι C-18 (Agilent Technologies) foiusada e detecção foi por UV a 214 nm. A coluna foi equilibrada com 0,1 %ácido trifluoroacetico / H2O e eluída por um gradiente de 0 a 90% acetonitrilacontra 0,1 % ácido trifluoroacetico /H2O durante 10 min a temperaturaambiente, com um fluxo de 1 ml/min.
Análise CE (eletroforese capilar) analvsis:
A eletroforese capilar foi realizada usando um sistema AgilentTechnologies 3DCE (Agilent Technologies). A aquisição de dados eprocessamento do sinal foram realizados usando Agilent Technologies 3DCEChemStation. O capilar foi a 64,5cm (56,0 cm comprimento eficiente) 50μπιi.d. "Extended Light Path Capillary" de Agilent. A detecção por UV foirealizada a 200 nm (16 nm Bw,Referência 380 nm e 50 nm Bw). O eletrólitode ciclagem foi tampão fosfato 5 OmM pH7 (método A) ou tampão fosfato50mM pH2,5 (método B).0 capilar foi condicionado com 0,1 M NaOHdurante 3min, então com água Milli-Q durante 2min e com o eletrólitodurante 3min. Após cada ciclo, o capilar foi varrido com água milli-Q durante2 min, então com ácido fosfórico durante 2 min, e com água milli-Q durante 2min. A injeção hidrodinâmica foi feita a 50 mbar durante 4,0 s. A voltagemfoi +25 kV. A temperatura do capilar foi 30 C e o tempo de ciclo foi 10,5min(método A) ou 20 min (método B).
Exemplos 1 e 2 são destinados a prover um exemploilustrativo de PEGuilação de hGH usando transaminação com um aldeídolatente - ver também W02005070468.
<formula>formula see original document page 151</formula>
I. hGH, hormônio de crescimento humano
II. Ne40/N£l41-(2-hidróxi-3-amino-propil) hGH
III. Ns40/N£l41-(2-oxoetil) hGH
IV. Νε40/Νε141-[2-(Ο-(4-(4-(mPEGuiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH
Exemplo 1
Preparação de Νε141-[2-0-(4-(4-(1,3-bis(mPEG(20000)aminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH
(a) Trans-aminação de hGH (I.) para dar N£l41-(2-hidróxi-3-aminopropil)hGH (II.)
hGH (I.) (200 mg) foi dissolvido em tampão fosfato (50 mM,pH 8,0, 14 ml).
Esta solução foi misturada com uma solução de 1,3-Diaminopropan-2-ol (4 mmol, 378 mg) dissolvido em tampão fosfato (50mM, 1 ml, pH 8,0, pH ajustado a 8,0 com ácido clorídrico diluído apósdissolução de l,3-Diamino-propan-2-ol).
Finalmente, uma solução de TGase (18 mg ~ 40 U) dissolvidaem tampão fosfato (50 mM, pH 8,0, 1 ml) foi adicionada e o volume foiajustado a 20 ml por adição de tampão fosfato (50 mM, pH 8,0) dando umaconcentração de l,3-Diaminopropan-2-ol a 0,2 Μ. A mistura combinada foiincubada durante 4 horas a 37 0C.
A temperatura foi abaixada a temperatura ambiente e N-etilmaleimida foi adicionado a uma concentração final de 1 mM.
Após outra hora, a mistura foi diluída com 10 volumes detampão tris (50 mM, pH 8,5).
A análise CE da mistura resultante mostra dois picos principaiscorrespondendo à hGH e Νε 141 -(2-hidróxi-3-aminopropil) hGH (II.) e doispicos menores, correspondendo à N£40-(2-hidróxi-3-aminopropil) hGH (II.) eNe405Ne141 -bis(2-hidróxi-3-aminopropil) hGH. Os dois últimos componentessão removidos durante a seguinte purificação, mas eles podem ter sidorecuperados.
(b) cromatografia de troca iônica de N£l41-(2-hidróxi-3-aminopropil) hGH (II.)
A solução resultante de (a) foi aplicada a uma coluna MonoQ10/100 GL (Amersham Biosciences cat. No. 17- 5167-01) pré-equilibradocom tampão A (50 mM tris, pH 8,5). Ela foi então eluída a um fluxo de 2,5ml/min com um gradiente de 0% a 100% de tampão B (50 mM tris, 0,2 MNaCl, pH 8,5) em tampão A over 63 min. Frações foram coletadas com baseem Absorção de UV a 280 nm e análise Maldi-Tof foi realizada em fraçõesselecionadas. As frações correspondendo ao pico maior dando o mw esperadode acordo com a espectrometria de massa Maldi-Tof foram reunidas. Estapoça contém hGH (I.) e Nel41-(2-hidróxi-3-amino-propil) hGH (II.) em umarelação 60:40 encontrada por CE (método A). Os experimentos demapeamento de peptídeos descritos em pedido internacionalW02005DK000028 demonstraram previamente que os procedimentoscombinados de (a) e (b) resultam em derivatização seletiva de Gln-141.
(c) Síntese de N-(4-(terc-Butiloxicarbonilaminoxi)butil)ftalimida
<formula>formula see original document page 153</formula>
A uma mistura agitada de 7V-(4-bromobutil)ftalimida (18,9 g,67,0 mmol), MeCN (14 ml), e iV-Boc-hidroxilamina (12,7 g, 95,4 mmol) foiadicionado DBU (15,0 ml, 101 mmol) em porções. A mistura resultante foiagitada a 50 0C durante 2 4 h. Água (300 ml) e 12 M HCl (10 ml) foramadicionados, e o produto foi extraído três vezes com AcOEt. Os extratoscombinados foram lavados com salmoura, secados (MgS04), e concentradossob pressão reduzida. O óleo resultante (28 g) foi purificado porcromatografia (140 g SiO2, gradiente de eluição com heptano/AcOEt). 17,9 g(80%) do composto titular foram obtidos como um óleo. 1H NMR (DMSO-J6)δ 1,36 (s, 9H), 1,50 (m, 2H), 1,67 (m, 2H), 3,58 (t, J = 7 Hz, 2H), 3,68 (t, J =7 Hz, 2H), 7,85 (m, 4H), 9,90 (s, 1H).
(d) Síntese de 4-(terc-Butiloxicarbonilaminoxi)butilamina.
<formula>formula see original document page 153</formula>
A uma solução de Af-(4-(férc-butiloxicarbonilaminoxi)butil)ftalimida obtida de (a) (8,35 g, 25,0 mmol) em EtOH (10 ml) foi adicionadohidrato de hidrazina (20 ml), e a mistura foi agitada a 80 0C durante 3 8 h. Amistura foi concentrada e o resíduo co-evaporado com EtOH e PhMe. Aoresíduo foi adicionado EtOH (50 ml), e a ftal-hidrazida precipitada foi filtradae lavada com EtOH (50 ml). Concentração dos filtrados combinados deu 5,08g de um óleo. Este óleo foi misturado com uma solução de K2CO3 (10 g) emágua (20 ml), e o produto foi extraído com CH2Cl2. A secagem de (MgSO4) econcentração deram 2,28 g (45%) do composto titular como um óleo, que foiusado sem outra purificação. 1H NMR (DMSO-^6) δ 1,38 (m, 2H), 1,39 (s,9H), 1,51 (m, 2H), 2,51 (t, J= 7 Hz, 2H), 3,66 (t, J= 7 Hz, 2H).(e) Síntese de N-Boc-0-(4-(4-(l,3-bis(mPEG(20000)aminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)-butil)hidroxil-amina.
<formula>formula see original document page 154</formula>
(mPeg(20000)-NH-CO-O-CH2)2CH-O-(CH2)3-CO-OSu(Nektar, 2Z3Y0T01, 2,0 g, 50 μπιοί) foi misturado com uma solução de 4-(Boc-aminoxi)butilamina (187 mg, 915 μπιοί) em DCM (12 ml). Após agitarem temperatura ambiente durante 43 h, a mistura foi adicionada em gotas aEt2O agitado (200 ml). Filtração, lavagem com Et2O. O produto foiredissolvido em DCM (10 ml), e precipitado uma vez mais de Et2O (200 ml).Esta precipitação foi repetida três vezes. O produto foi então dissolvido emDCM (100 ml) e tratado com Amberlyst 15 (11 g; lavado com DCM) durante5 min. Após filtração e concentração, o produto foi precipitado de Et2O comoacima. Filtração e secagem sob pressão reduzida deram 1,98 g do compostotitular como um sólido.
(f) Síntese de 0-(4-(4-(l,3-bis(mPEG(20000) aminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)-hidroxilamina<formula>formula see original document page 155</formula>
O produto de uma reação anterior (1,0 g) foi dissolvido emDCM, e Amberlyst 15 (8,0 g; lavado com DCM) foi adicionado. Após agitardurante 10 min, a mistura foi filtrada e o filtrado concentrado. Ao resíduoforam adicionados DCM (25 ml) e TFA (25 ml). Após permanecer emtemperatura ambiente durante 0,5 h, a mistura foi concentrada, o resíduocoevaporado duas vezes com uma mistura de DCM e tolueno, e secado sobpressão reduzida durante a noite. O resíduo foi dissolvido em água (15 ml) elavado duas vezes com água usando um dispositivo de ultrafiltração amiconUltra-15 (Millipore). A solução foi então neutralizada por adição de 2-metilpiridina a pH 6. Esta solução foi usada diretamente para a oximação.
(g) Oxidação de Nel41-(2-hidróxi-3-aminopropil) hGH (II.) para dar Νε141-(2-oxoetil) hGH (III.)
O tampão das frações reunidas de (b) 2 contendo 53,8 mg de(I.) e (II.) foi trocado quatro vezes a tampão 15 mM trietanolamina/ 137mM3-(Metiltio)-1-propanol pH 8,5 (ajustado com ácido clorídrico 1 N) usando umdispositivo de ultrafiltração amicon Ultra-15 (Millipore). Então, a solução foiconcentrada a 5,4 ml. A esta foi adicionado 0,54 ml de um periodato de sódioa 25 mM em solução de água, e a mistura foi incubada durante 3 0 min atemperatura ambiente no escuro.
A solução foi então lavada três vezes com tampãotrietanolamina 15 mM pH 8,5 usando um dispositivo de ultrafiltração amiconUltra-15 (Millipore). Ela foi então resfriada em gelo 1,62 ml e N,N-dimetilformamida resfriada em gelo foi adicionada.(h) Oximação de Nel41-(2-oxoetil) hGH (III.) com 0-(4-(4-(l,3-bis(mPEG(20000)oxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)hidroxilamina para darNel41-[2-(0-(4-(4-(l,3-bis(mPEG(20000)oxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH
solução de PEG de (f) sob misturação suave e a reação foi deixada prosseguirem temperatura ambiente durante 72 h.
(i) Cromatografia de troca iônica de Νε141-[2-(0-(4-(4-(1,3-bis(mPEG(20000)oxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH.
A solução resultante de (h) foi aplicada a uma coluna MonoQ10/100 GL (Amersham Biosciences cat. No. 17- 5167-01) pré-equilibradacom tampão A (10 mM tris, pH 8,0).
Ela foi então eluída a um fluxo de 2,0 ml/min com umgradiente de 0% a 100% de tampão B (10 mM tris, 0,2 M NaCl, pH 8,0) emtampão A durante 79 min. Frações foram coletadas com base em absorção deUV a 280 nm. As frações foram reunidas correspondendo ao pico desejado econcentradas a 10 ml em um dispositivo de ultrafiltração amicon Ultra-15(Millipore).
G) Cromatografia de exclusão de tamanho de Νε141-[2-(0-(4-(4-(1,3-bis(mPEG(20000)oxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH
A solução concentrada resultante de (i) foi aplicada a umacoluna HiLoad 26/60 Superdex 200 (Amersham Biosciences cat. No. Π-Ι 071-01) pré-equilibrada com tampão C (5 OmM hidrogeno-carbonato deamônio, pH 8,0). Ela foi então eluída a um fluxo de 0,5 ml/min tampão Cdurante 956 min. Frações foram coletadas com base em absorção de UV a 280nm, e reunidas de acordo com os testes anteriores.
SDS page mostrou uma banda única com um peso molecularaparente maior do que 120 kDa.
Exemplo 2Preparação de N£l41-[2-(0-(4-(4-(mPEG(30000)oxi)butirilamino)-butil)oxiimino)-etil] hGH
<formula>formula see original document page 157</formula>
Esta solução foi misturada com uma solução de 1,3-Diaminopropan-2-ol (378 mg) dissolvido em tampão fosfato (50 mM, 0,5 ml,pH 8,0, pH ajustado a 8,0 com ácido clorídrico diluído após dissolução de1,3-Diamino-propan-2-ol).
Finalmente, uma solução de TGase (18 mg ~ 40 U) dissolvidoem tampão fosfato (50 mM, pH 8,0, 0,5 ml) foi adicionado e o volume foiajustado a 20 ml por adição de tampão fosfato (50 mM, pH 8,0) dando umaconcentração de l,3-Diamino-propan-2-ol a 0,2 Μ. o combinada mistura foiincubada durante 4 horas a 37 0C.
A temperatura foi abaixada a temperatura ambiente e N-etil-maleimida foi adicionada a uma concentração final de 1 mM.
Após outra hora, a mistura foi diluída com 10 volumes detampão tris (50 mM, pH 8,5). Análise CE da mistura resultante mostra doispicos principais correspondendo à hGH e N£l41-(2-hidróxi-3-aminopropil)hGH (II.) e dois picos menores correspondendo à Ne40-(2-hidróxi-3-aminopropil) hGH (II.) e Νε40,Νε141 -bis(2-hidróxi-3-aminopropil) hGH. Osdois últimos componentes são removidos durante a purificação seguinte, maseles podem ter sido recuperados.(b) Cromatografia de troca iônica de N -(2-hidróxi-3 -amino-propil) hGH
10/100 GL (Amersham Biosciences cat. No. 17- 5167-01) pré-equilibradacom tampão A (50 mM tris, pH 8,5). Ela foi então eluída a um fluxo de 2ml/min com um gradiente de etapas:
Etapa 1: 0% a 60% tampão B (50 mM tris, 0,2 M NaCl, pH8,5) em tampão A durante 12 min.
Etapa 2: 60% a 64% tampão B em tampão A durante 8 min.
Etapa 3: 64% tampão B em tampão A durante 16 min.
Etapa 4: 64% a 67% tampão B em tampão A durante 16 min.
Etapa 5: 67% tampão B em tampão A durante 16 min.
Etapa 6: 67% a 100% tampão B em tampão A durante 12 min.
Frações foram coletadas com base em absorção de UV a 280nm e frações correspondendo ao pico maior foram reunidas. Esta poça contémhGH (I.) e NE,41-(2-hidróxi-3 -amino-propil) hGH (II.) em uma relação de58:42 encontrada por CE (método A). As experiências de mapeamento depeptídeos descritas no pedido internacional W02005DK000028demonstraram previamente que os procedimentos combinados de (a) e (b)resultam em derivatização seletiva de um Gln-141.
(c) Síntese de 0-(4-(4-(mPEG(30000)oxi)butirilamino)butil)hidroxilamina
<formula>formula see original document page 158</formula>
A uma solução de 4-(N-Boc-aminoxi)butilamina (0,43 g, 2,10mmol) em DCM (40 ml) foi adicionado mPeg(30000)-O-(CH2)3-CO-OSu(Nektar, 2M450R01, MW 30 kDa, 5,0 g, 0,1 7 mmol). A mistura resultantefoi agitada a temperatura ambiente durante 5 d, concentrada sob pressãoreduzida, e o resíduo foi secado em vácuo. A recristalização de iPrOH (4 χ 80ml) seguida por coevaporação com DCM e secagem sob pressão reduzidaderam 4,14 g da alcoxilamina Boc-protegida.
O produto da reação anterior (0,65 g) foi dissolvido em 20mlDCM, e Amberlyst 15 (6,0 g; lavado com DCM) foi adicionado. Após agitardurante 10 min, a mistura foi filtrada e o filtrado concentrado. Ao resíduoforam adicionados DCM (20 ml) e TFA (20 ml). Após permanecer atemperatura ambiente durante 0,5 h, a mistura foi concentrada, o resíduocoevaporado duas vezes com uma mistura de DCM e tolueno, e secado sobpressão reduzida durante a noite, o resíduo foi dissolvido em água (15 ml) elavado duas vezes com água usando um dispositivo de ultrafiltração amiconUltra-15 (Millipore). A solução foi então neutralizada por adição de 2-metilpiridina a pH 6. Esta solução foi usada diretamente para a oximação.
(d) Oxidação de Nel41-(2-hidróxi-3-aminopropil) hGH (II.) para dar Nel41-(2-oxoetil) hGH (III.)
O tampão das frações reunidas de (b) contendo 78,14 mg de(I.) e (II.) foi trocado quatro vezes com um tampão 15 mM trietanolamina/137mM 3-(Metiltio)-1-propanol pH 8,5 (ajustado com 1 N ácido clorídrico)usando um dispositivo de ultrafiltração amicon Ultra-15 (Millipore).
Finalmente, a solução foi concentrada a 3,3 ml. A isto foi adicionado 0,33 mlde um periodato de sódio 25 mM em água foram adicionados, e a mistura foiincubada durante 3 0 min a temperatura ambiente no escuro.
A solução foi então lavada três vezes com tampão 15 mMtrietanolamina pH 8,5 usando um dispositivo de ultrafiltração amicon Ultra-15 (Millipore). Então ela foi resfriada em gelo e 1,0 ml N,N-dimetilformamida resfriada em gelo foi adicionado.
(e) Oximação de Νε'4'-(2-oxoetil) hGH (III.) com 0-(4-(4-(mPEG(30000)oxi)butirilamino)butil)-hidroxilamina para dar Νε141-[2-(0-(4-(4-(mPEG(30000)oxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH.A mistura resultante de (d) foi lentamente adicionada à soluçãoPEG de (c) sob misturação suave e a reação foi deixada prosseguir atemperatura ambiente durante 144 h.
(f) Cromatografia de troca iônica de N^141-[2-(0-(4-(4-(mPEG(30000)oxi)-butirilamino)butil)oxiimino)-etil] hGH.
A solução resultante de (e) foi aplicada a uma coluna MonoQ10/100 GL (Amersham Biosciences cat. No. 17- 5167-01) pré-equilibradacom tampão A (10 mM tris, pH 8,0). Ela foi então eluída a um fluxo de 1,5ml/min com um gradiente de 0% a 100% de tampão B (10 mM tris, 0,2 MNaCl, pH 8,0) em tampão A durante 107 min. Frações foram coletadas combase em absorção de UV a 280 nm. As frações foram reunidascorrespondendo ao pico desejado e concentradas a 10 ml em um dispositivode ultrafiltração amicon Ultra-15 (Millipore).
(g) Cromatografia de exclusão de tamanho de Νε141-[2-(0-(4-(4-(mPEG(30000)oxi)butirilamino)-butil)oxiimino)-etil] hGH.
A solução concentrada resultante de (f) foi aplicada a umacoluna HiLoad 26/60 Superdex 200 (Amersham Biosciences cat. No. Π-1071-01) pré-equilibrada com tampão C (50 mM hidrogeno-carbonato deamônio, pH 8,0). Ela foi então eluída a um fluxo de 0,5 ml/min tampão Cdurante 956 min. Frações foram coletadas com base em absorção de UV a 280nm, e reunidas de acordo com os testes anteriores.
SDS page mostrou uma banda única com um peso molecularde app. 117 kDa.
Exemplo 3
Preparação de N£l41-(3-((4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPeg(20000)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno)aminoxi)propiloxi) hGH (VII.)<formula>formula see original document page 161</formula>
Esquema para a conjugação de hGH com mPEG usandotransaminação com um composto di-aminóxi em exemplo 3.
<formula>formula see original document page 161</formula>
(a) Trans-aminação de hGH (I.) para dar Ne 141 -(3-(aminoxi)propoxi)hGH (V.)
As seguintes soluções foram preparadas:
1) 100 mg hGH (I.) foram dissolvidos em tampão Na- fosfato(50 mM, pH 6,0) cerca de 9 ml. Subseqüentemente, pH foi ajustado a 6 e ovolume foi ajustado a 10 ml usando tampão Na- fosfato (50 mM, pH 6,0).
2) 2,00 g l,3-bisaminoxipropano.2HCl (A. Shirayev, Ρ. K.Thoo lin, e I. K. Moiseev, Síntese, 38-40 (1997) foi dissolvido em tampão Na-fosfato (50 mM, pH 6,0) cerca de 5 ml, seguido por ajuste de pH e volumecomo para 1.3) 30 mg Transglutaminase ativa WM (Ajinomoto, enzima 0,3mg) foi dissolvida em tampão Na- fosfato (50 mM, pH 6,0) cerca de 9 ml,seguido por ajuste de pH e volume como para 1.
Soluções 1+2 + 3 foram misturadas, filtradas através de filtrode 0,45 μιη e deixadas reagir a 22 0C durante um período de 2,5 h. Nesteponto, CE (método B) e espectroscopia de Maldi-tof mostraramaproximadamente 50% conversão de hGH, com aproximadamente 70 % dosprodutos sendo o derivado de hGH desejado. (V). À mistura de reação foramadicionados 30 ml de 2 mM N-etilmaleimida aquosa (NEM). pH foi ajustadoa 8,0 e o solução foi mudada com tampão 6 vezes por filtros de corte deultrafiltração (Amicon Ultra 15 (Millipore) de 10000 Da, 3600 RCF,temperatura ambiente, reduzindo o volume a 1/10) usando uma mistura de 1:1mistura de NEM aquoso 2 mM e tampão fosfato 50 mM, pH 8,0.
(b) Oximação de N8l41-(3-(aminoxi)propoxi)hGH (V.) com 4-(2-(2-(2-(2-(4-(1,3-bis(mPeg(20000)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi) butirilamino)etoxi)-etoxi)etoxi)etoxi)butanal (VI.) para dar Νε141-(3-((4-(2-(2-(2-(2-(4-(1,3-bis(mPeg(20000)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno)aminoxi)propiloxi) hGH (VII.)
Após a última lavagem em (a), pH foi ajustado a 6,0. 180 mgmPEG2-ButyrALD-40K (VI., Nektar 083Y0T01) em 10 ml de tampão foramadicionados. Reação foi completa em 3 h. RP-HPLC (sistema A) e SDS-pagemostraram aproximadamente 100% de conversão do derivado de hGH- V aohGH PEGuilado (VII.). O tampão de reação mudou 3 vezes com 10 mMtampão TRIS pH 8,5 por ultrafiltração como descrito acima.
(c) Cromatografia de troca iônica de Νε141-(3-((4-(2-(2-(2-(2-(4-(1,3-bis(mPeg(20000)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno)aminoxi)propiloxi) hGH (VII.)
O produto bruto foi purificado em uma coluna de trocaaniônica MonoQ 10/100 (Amersham Biosciences) usando 10 mM TRIS pH8,5 (tampão A) e 10 mM TRIS pH 8,5 + 200 mM NaCl (tampão B) tampõesde partida e de eluição, respectivamente. Eluição foi realizada a 2,0 ml/mincom um gradiente de 0 a 100 % B durante um período de 80 min. O produto(VII.) eluiu em aproximadamente 24 % de tampão B. Frações contendo oproduto desejado (VII.) foram coletadas, reunidas e mudadas em tampão 6vezes com tampão 50 mM NH4HCO3 pH 8,0, e finalmente secadas porpulverização.
O produto puro (VII.) foi obtido junto com dois sub-produtos:aproximadamente 20 % de um isômero, hGH PEGuilado em posição Gln-40,e aproximadamente 10 % de um dímero, hGH PEGuilado em ambas asposições Gln-40 e Gln-141. Estes produtos foram separáveis porcromatografia de troca aniônica. A identidade dos produtos foi estabelecidapor experiências de mapeamento de peptídeos e SDS-page.
Exemplo 4
Preparação de N^l41-[2-(2-(2,3-bis(mPeg(20000)iloxi)propiloxicarbonilamino)etiloximino)etil] hGH
<formula>formula see original document page 163</formula>
(a), (b) N8l41-(2-oxoetil) hGH
N^141-(2-oxoetil) hGH (252 mg) foi preparado como descritoem Exemplo 1.
(c) Oximação de NEl41-(2-oxoetil) hGH (III.) com 0-(2-(2,3-(mPeg(20000)iloxi)propiloxicarbonilamino)etil)hidroxilamina (SunbrightGL2-400 CA, NOF Corp.,Tokyo, Japan) para dar Νε141-[2-(2-(2,3-(mPeg(20000)iloxi)propiloxicarbonilamino)etiloximino)etil] hGH.
O derivado aminoxi-PEG (452 mg Sunbright GL2-400 CA,NOF Corp.) foi dissolvido em 5,5 ml de tampão de ácido (2-(N-morfolino)etanossulfônico (MES), 0,3 M, pH 6,5). Então a poça concentradada oxidação foi diluída com 1,25 ml de NMP resinado com gelo e lentamenteadicionada à solução do reagente PEG. A mistura foi agitada lentamentedurante 2 dias.
(d) Cromatografia de troca iônica de Νε141-[2-(2-(2,3-(mPeg(20000)iloxi)propiloxicarbonilamino)etiloximino)etil] hGH.
A mistura de reação de (c) foi trocada em tampão em tampão20 mM trietanolamina pH 8,5 usando uma coluna de dessalinização (HiPrep26/10 Amersham Biosciences cat. No. 17-5087-01) e a proteína aplicada auma coluna de troca iônica (HiLoad 26/10 Q Sepharose HP, AmmershamBiosciences) pré-equilibrada com tampão A (20 mM tretanolamina, pH 8,5).
Ela foi então eluída a um fluxo de 5 ml/min com um gradiente de 0% a 100%de tampão B (20 mM trietanolamina, 0,2 M NaCl, pH 8,5) em tampão Asobre volumes de 10 colunas. Frações foram coletadas com base em absorçãode UV a 280 nm. As frações correspondendo ao pico desejado foramreunidas.
(e) Cromatografia de exclusão de tamanho de Νε141-[2-(2-(2,3-(mPeg(20000)iloxi)propiloxicarbonilamino)etiloximino)etil] hGH.
A poça de (d) foi concentrada a 15 ml por ultrafiltração eproteína trocada em tampão a 50 mM hidrogeno-carbonato de amônio, pH 8,0usando uma coluna de dessalinização (HiPrep 26/10 Amersham Biosciencescat. No. 17-5087-01). A proteína foi então aplicada a uma coluna de exclusãode tamanho (HiLoad 26/10 Superdex 200, Amersham Biosciences cat. No.17-1071-01) pré-equilibrada com 5 OmM hidrogeno-carbonato de amônio, pH8,0). Ela foi então eluída a um fluxo de 1,0 ml/min. Frações foram coletadascom base em absorção de UV a 280 nm.Exemplo 5
Preparação de N£l41-[2-(0-(2-(2-(mPEG(40000)iloxi)etilamino)-2-oxoetil)oximino)etil] hGH
<formula>formula see original document page 165</formula>
(a) Transaminação.
hGH (I) (IOOmg) foi transaminado com l,3-diaminopropan-2-ol e o produto foi purificado usando procedimentos similares aos do exemplo1 (a) e (b). De acordo com a espectrofotometria de UV e análise CE, a poçaresultante de purificação continha 30 mg de proteína, onde 20 mg deramN£l41-(2-hidróxi-3-aminopropil) hGH (II)
(b) Síntese de 0-(2-(2-(mPEG(40000k)iloxi)etilamino)-2-oxoetil)hidroxilamina
<formula>formula see original document page 165</formula>
A uma solução de ácido Bis-Boc-aminoxiacético (0,30 mg, 0,10 mmol) em DMF (1 ml) foram adicionadas diisopropiletilamina (0,034 ml,0,2 mmol), N-hidroxisuccinimida (10 mg, 0,1 mmol) ediisopropilcarbodiimida (0,016 ml, 0,1 mmol). A mistura foi agitada durante15 min e mPeg(40000)-0-(CH2)2-NH2 (Produto 008-028, Chirotech Ltd.Cambridge UK, MW 40 kDa, 1,0 g, 0,025 mmol) dissolvido em umaquantidade mínima de DCM foi adicionado. A mistura resultante foi agitada atemperatura ambiente durante 6 h e o produto foi precipitado e lavado cométer dietílico. O precipitado foi redissolvido em uma mistura de 0,5 ml DMF e1 ml DCM e precipitado e lavado com éter dietílico. Isto foi repetido uma vezmais e após secagem 770 mg de precipitado foram isolados.
200 mg do precipitado seco foram dissolvidos em 5 ml DCM e5 ml TFA foram adicionado. Após 30 min, a mistura foi concentrada em umevaporador giratório e extraída com 10 ml etanol duas vezes. O óleo residualfoi redissolvido em uma mistura de 0,5 ml DMF e 2 ml DCM e precipitado elavado com éter dietílico. Isto foi repetido uma vez mais e o derivado PEGprecipitado foi secado e dissolvido em tampão 1 ml (0,3 M MES, pH 6,5)
O produto transaminado obtido em (a) foi dissolvido emtampão (20 mM trietanolamina, pH 8,5) e 3-(metiltio)-l-propanol (1 ml deuma solução 683 mM) foi adicionado. Então, periodato de sódio (5 mg, 10eq.) foi adicionado e a mistura foi deixada reagir 30 min antes de ser lavadatrês vezes com solução de metionina aquosa (168 mM) e concentrada a 4,5 mlusando um dispositivo de ultrafiltração (Amicon Ultra-15, Millipore). Então0,5 ml N-metil-pirrolidona resfriada com gelo foi adicionado e é lentamenteadicionado a solução do derivado PEG e a mistura é deixada reagir durante anoite.
O tampão da mistura de reação f oi trocado em uma coluna dedessalinização (HiPrep 26/10 Amersham Biosciences cat. No. 17-5087-01)que foi pré-equilibrada e eluída com tampão (tris 10 mM, pH 8,5) e a poça foiaplicada a uma coluna de troca iônica (HiLoad 26/10 QSepharose, AmershamBiosciences cat. No. 17-1066-01) pré-equilibrada em 10 mM Tris pH 8,5 eeluída com um gradiente de 0,2M NaCl em 10 mM Tris pH 8,5 a um fluxo de4 ml/ min para 10 volumes de coluna. As frações contendo hGH PEGuiladode acordo com RP-HPLC foram reunidas e o tampão trocado em uma colunade dessalinização (HiPrep 26/10 Amersham Biosciences cat. No. 17-5087-01)que foi pré-equilibrada e eluída com tampão (bicarbonato de amônio 50 mM,pH 8,5). A poça foi liofilizada. O rendimento do composto alvo foi de 3,25mg.Exemplo 6
Preparação de Νε141-[2-(3-(4-((1,3-bis(mPeg(30000)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butilideno)aminoxi)propiloxiimino)etil] hGH (VII.)
<formula>formula see original document page 167</formula>
hGH (100 mg) foi dissolvido em tampão (7 ml, fosfato demono-sódio 125 mM, pH 6,0). 1,3- bis-aminoxipropano,2HCl (2,0 g em 5,0ml 125 mM fosfato de mono-sódio, ajustado a pH 6,0) foi adicionado efinalmente TGase (Activa WM, Ajinomoto, 30 mg em 2 ml fosfato de mono-sódio 125 mM, pH 6,0) foi adicionado e o volume ajustado a 30 ml comtampão fosfato de mono-sódio (125 mM, pH 6,0).
Após 4 h a 37°C, a reação foi parada por adição de NEM (100ul, IOOmM NEM). Após mais lha 37°C, o bis-aminoxipropano em excessofoi removido e o tampão trocado em uma coluna de dessalinização (HiPrep26/10 Amersham Biosciences cat. No. 17-5087-01) que foi pré-equilibrada eeluída com tampão (Tris 10 mM, pH 8,5).
A uma poça contendo proteína (32 ml contendo 82 mg deproteína) foi adicionada em gotas uma solução de um aldeído 60 kDa 2-armPEG (Nektar, 083YOVOl MPEG2-BUTYRALD-60K, 800mg em 10 mlágua). Após incubação a temperatura ambiente durante a noite, o tampão foitrocado em quatro porções em uma coluna de dessalinização (HiPrep 26/10Amersham Biosciences cat. No. 17-5087-01) a 10 mM Tris pH 8,5. A poçacontendo proteína combinada foi aplicada em três porções a uma colunaMonoQ 10/100 GL equilibrada em 10 mM Tris pH 8,5 e eluída com umgradiente de 0,2M NaCl em 10 mM Tris pH 8,5 a um fluxo de 4 ml/ min para20 volumes de coluna. As frações contendo o composto alvo foram coletadas,trocadas em tampão e re-cromatografadas como acima. Finalmente, as fraçõescontendo o composto alvo foram reunidas e a poça foi aplicada a uma colunade filtração de gel HiLoad 26/60 Superdex 200 PG. (Amersham Biosciencescat. No. 171071-01) que foi pré-equilibrada e eluída com 50 mM bicarbonatode amônio. As frações contendo o composto alvo foram reunidas eliofilizadas. O rendimento foi de 35,74 mg do produto desejado.
MÉTODOS FARMACOLÓGICOS
Teste (I) Teste BAF hGH-R para determinar a atividade de hormônio decrescimento in vivo
O teste BAF-hGH-R é um teste de proliferação in vitro, ondeas células BAF-3 foram modificadas para serem dependentes de hormônio decrescimento (GH) para crescimento e sobrevivência. BAF-3 é uma linhagemde células pro-B derivadas de medula óssea de murinos imortalizada.Originalmente, as células BAF-3 são dependentes de IL-3 para crescimento esobrevivência. A sinalização de IL-3 é iniciada quando uma molécula de IL-3liga e dimeriza dois receptores de IL-3. Isto leva à ativação de via desinalização JAK-2/STAT e, assim, regulação de transcrição de genesimportante para o crescimento e sobrevivência. O receptor de GH (GH-R)pertence à mesma superfamília de receptor como o IL-3R (A superfamília dereceptor de citocina/ hematopoietina) e compartilha a mesma via desinalização intracelular JAK/ STAT. Assim, após transfecção do GH-Rhumano na linhagem de células BAF-3, a linhagem de células se tornou umalinhagem de células dependente de GH. A linhagem de células mostra umaestimulação relacionada com a dose de crescimento por adição deconcentrações crescentes de GH humano ou composto de teste.
O teste BAF hGH-R é iniciada deixando em privação ascélulas para hGH (meio de cultura sem hGH) durante 24 h a 37 0C e 5% CO2.AS células são centrifugadas, o meio é removido e as células são re-colocadasem suspensão em meio de privação. 20,000 células /cavidade são semeadasem placas de micro-titulação (96 poços NUNC TC micropoço 96F SI w/lidNUNCLON D cat. No. 167008). GH humano (em concentrações diferentes)ou composto de teste (em concentrações diferentes) é adicionado ás células, eas placas são incubadas durante 68 horas a 37°C e 5% CO2.
A atividade metabólica das células é medida por AlamarBlue®(BioSource cat no Dal 1025). AlamarBlue é um indicador redox, que éreduzido por reações inatas ao metabolismo celular e, assim, provê umamedida indireta do número de células viáveis. AlamarBlue® é adicionado acada cavidade e as células são incubadas durante mais 4 horas. A absorbânciaé medida em uma leitora de placa de fluorescência usando um filtro deexcitação de 544 nM e um filtro de emissão de 590 nM.
A absorbância das amostras é traçada em gráfico como umafunção da concentração de GH/ composto de teste. A partir das curvas deresposta a dose expressadas pelo valor de EC5O (a quantidade de GH/compostode teste que elícita metade da resposta máxima) pode ser calculada. Alémdisso, a atividade relativa in vitro atividade de um composto de teste pode serdescrita pelo valor de relação como definido comoEC5o(composto)/EC5o(hGH). Um valor de relação acima de 1 indica que ocomposto de teste é menos potente comparado a GH humano.
Tabela 1 mostra os resultados para os compostos comodescrito nos exemplos.
Tabela 1
Potência relativa in vitro de compostos diferentes de hGH descritos noexemplos no teste BAF hGH-R. Valores são Média ± desvio padrão (SD)
<table>table see original document page 169</column></row><table>Farmacocinética
A Farmacocinética dos compostos dos exemplos foiinvestigada em ratos Spraque Dawley machos após administração únicaintravenosa (i.v.) e subcutânea (s.c.).
Os compostos de teste foram diluídos a uma concentração finalde 1 mg/ml em um tampão de diluição consistindo de: glicina 20 mg/ml,manitol 2 mg/ml, NaHCO3 2,5 mg/ml, pH ajustado a 8,2.
Os compostos de teste foram estudados em ratos SpraqueDawley machos pesando 250 g. Os compostos de teste foram administradoscomo uma injeção única ou i.v. na veia do rabo ou s.c. no pescoço com umaagulha 25 G a uma dose de 1 mg/kg de peso corporal.
Para cada composto de teste, a amostragem do sangue foiconduzida de acordo com seguinte esquema apresentado na Tabela 2.
Tabela 2
Esquema de amostragem de sangue para cada composto de testeAnimal
<table>table see original document page 170</column></row><table>
Em cada tempo de amostragem, 0,25 ml de sangue foiretirados da veia da cauda usando uma agulha 25 G. O sangue foi amostradoem um tubo de teste revestido com EDTA e armazenado em gelo até acentrifugação a 1200 χ G durante 10 min a 4°C. Plasma foi transferido paraum tubo Micronic e armazenado a -20°C até análise.
As concentrações de composto de teste foram determinadaspor ELISA sandwich usando um anticorpo policlonal anti-hGH de porquinho-da-índia como o captador, e proteína de ligação de hGH biotinilado (partesolúvel de receptor de GH humano) como detector. O limite de detecção doteste foi 0,2 nM.
Uma análise farmacocinética não compartimentar foi realizadaem perfis de concentração tempo médios de cada composto de teste usandoWinNonlin Professional (Pharsight Inc., Mountain View, CA, USA). Oparâmetro farmacocinético estima a meia-vida terminal (t./2) e tempo deresidência médio (MRT) são apresentados na Tabela 3.
Tabela 3
Meia-vida (t/2) e tempo de residência médio (MRT) de compostos hGH dosexemplos em ratos Spraque Dawley após administração de dose única i.v. es.c..
<formula>formula see original document page 171</formula>LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Novo Nordisk
<120> Conjugação mediada por Tgase de hormônio de crescimento<130> 7217.204 WO<160> 1
<170> PatentIn Versão 3.3
<210> 1<211> 191<212> PRT
<213> Hormônio de crescimento humano<400> 1
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe180 185 190

Claims (56)

1. Método para fixar covalentemente PEG a um polipeptídeocompreendendo pelo menos um resíduo de glutamina, caracterizado pelo fatode que compreende reagir, em uma ou mais etapas, este resíduo de glutaminacompreendendo polipeptídeo representado por fórmula [I]<formula>formula see original document page 173</formula>remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo de glutaminapresente no polipeptídeo, com um nucleófilo contendo nitrogênio de fórmulaR representa Ci^alquileno, -(CH2)4-CH(NH2)-Co-NH-CH2-, -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-, ou C5.15heteroalquileno;X representa -O-NH2, um aldeído, uma cetona, ou um grupolatente que, quando de outra reação, pode ser transformado em -O-NH2, umaldeído ou uma cetona;na presença de transglutaminase para formar um polipeptídeotransaminado de fórmula [III]<formula>formula see original document page 173</formula>em que PP representa um radical de polipeptídeo obtido por<formula>formula see original document page 173</formula>em que D representa -O- ou uma ligação única;<formula>formula see original document page 173</formula>opcionalmente, se X é um grupo latente, transformar referidogrupo latente em -O-NH2, um aldeído ou uma cetona,referido polipeptídeo transaminado sendo ainda reagido comum segundo composto de fórmula [IV] <table>table see original document page 174</column></row><table>em que Y,se X representa um aldeído, uma cetona, ou um grupo latenteque, quando de outra reação, pode ser transformado em um aldeído ou umacetona, representa -O-NH2; ou,se X representa -O-NH2, ou um grupo latente que, quando deoutra reação, pode ser transformado em -O-NH2, representa um aldeído ouuma cetona; eZ representa uma porção selecionada dentre <table>table see original document page 174</column></row><table><formula>formula see original document page 175</formula>mPEG-CXmPEG-O'HN<formula>formula see original document page 176</formula>em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;<formula>formula see original document page 176</formula>desde que se Z épara formar um PEGuilado polipeptídeo de fórmula [V]<formula>formula see original document page 176</formula>em que A representa uma ligação oxima;ou qualquer sal, pró-droga ou solvato farmaceuticamenteaceitável do mesmo.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que D representa -O-.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que D representa uma ligação única.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que R representa -(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-CH2- ou -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que R representa Ci.6alquileno.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelofato de que R representa Ci_3alquileno.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de que R representa metileno ou propileno.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que Z representa<formula>formula see original document page 177</formula><table>table see original document page 178</column></row><table><formula>formula see original document page 179</formula> em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa; <formula>formula see original document page 179</formula> desde que se Z é 2 2 5 , então PEG é 10 kDa PEG.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-8, caracterizado pelo fato de que Y representa -O-NH2 e X representa umaldeído ou um grupo latente, que pode ser ainda reagido para formar umaldeído.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 8, caracterizado pelo fato de que Y representa -O-NH2 e X representa umacetona ou um grupo latente que pode ser ainda reagido para formar umacetona.
11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula [IV]<formula>formula see original document page 180</formula>representa um composto selecionado dentre<formula>formula see original document page 180</formula><formula>formula see original document page 181</formula>em que, salvo indicado em contrário, mPEG significa mPEGcom um peso molecular de 10 kDa, 20 kDa ou 30 kDa e PEG significa PEGcom um peso molecular entre 2 kDa e 5 kDa.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 8, caracterizado pelo fato de que Y representa um aldeído e X representa-O-NH2 ou um grupo latente que, quando de outra reação, pode sertransformado em -O-NH2-
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o composto de fórmula [IV]<formula>formula see original document page 181</formula>[IV]representa um composto selecionado dentre <formula>formula see original document page 182</formula> em que, salvo indicado em contrário, mPEG significa mPEGcom um peso molecular de 10 kDa, 20 kDa ou 30 kDa e PEG significa PEGcom um peso molecular entre 2 kDa e 5 kDa.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 8, caracterizado pelo fato de que Y representa uma cetona e X representa O-NH2 ou um grupo latente que, quando de outra reação, pode ser transformadoem -O-NH2.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que o composto de fórmula [IV]<formula>formula see original document page 183</formula>representa um composto selecionado dentre<formula>formula see original document page 183</formula>em que, salvo indicado em contrário, mPEG significa mPEGcom um peso molecular de 10 kDa, 20 kDa ou 30 kDa e PEG significa PEGcom um peso molecular entre 2 kDa e 5 kDa.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 8, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula [II]H2N-D-R-X[Π]representa l,3-diamino-2-propanol, eY representa -O-NH2.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 8, caracterizado pelo fato de que o composto de fórmula [II]H2N-D-R-X[II]representa 1,3-diaminoóxi propano, eY representa um aldeído.
18. Método para modificar propriedades farmacológicas dehormônio de crescimento, caracterizado pelo fato de compreendercovalentemente fixar PEG ao referido hormônio de crescimento de acordocom um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 17.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 18, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um resíduo de glutaminacompreendendo hormônio de crescimento e PP representa um radical dehormônio de crescimento obtido por remoção de -C(=0)-NH2 da cadeialateral de um resíduo de glutamina presente em hormônio de crescimento.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizadopelo fato de que referido resíduo de glutamina compreendendo hormônio decrescimento representa um hormônio de crescimento humano.
21. Método de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que referido resíduo de glutamina compreendendo hormônio decrescimento representaa) um hGH compreendendo a seqüência de aminoácidos deSEQ ID No. 1,b) 20 kDa hGH,c) um hGH em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 40 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido,d) um hGH em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido, oue) um hGH em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 40 em SEQ ID No. 1, e o resíduo de glutamina naposição correspondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1 foram, cada,deletados ou substituídos com outro aminoácido, e onde um resíduo deglutamina está presente em outro posição no hormônio de crescimento.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que referido hormônio de crescimento representa hGH.
23. Composto e sais, pró-drogas ou solvatosfarmaceuticamente aceitáveis do mesmo, caracterizado pelo fato de ser deacordo com a fórmula [V]<formula>formula see original document page 185</formula>em que PP representa um radical de polipeptídeo obtido porremoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de um resíduo de glutaminapresente no polipeptídeo;D representa -O- ou uma ligação;r representa C1^alquileno, -(CH2)4-CH(NH2)-Co-NH-CH2-,-(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2- ou C5.i5heteroalquileno;A representa uma ligação oxima;Z representa uma porção selecionada dentre<formula>formula see original document page 186</formula><formula>formula see original document page 187</formula><formula>formula see original document page 188</formula>em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG com umpeso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;desde que se ^^^^^ , então mPEG é 10 kDa mPEG.
24. Composto de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que D representa -O-.
25. Composto de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de que D representa uma ligação única.
26. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que R representa -(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-CH2- ou -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-.
27. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 25, caracterizado pelo fato de que R representa C^alquileno.
28. Composto de acordo com a reivindicação 27, caracterizadopelo fato de que R representa Ci_3alquileno.
29. Composto de acordo com a reivindicação 28, caracterizadopelo fato de que R representa metileno ou propileno.
30. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 29, caracterizado pelo fato de que Z representa<formula>formula see original document page 188</formula><formula>formula see original document page 189</formula><formula>formula see original document page 190</formula> em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;<formula>formula see original document page 191</formula> desde que se Z é entao PEG é 10 kDa PEG.
31. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-23 a 30, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um resíduo deglutamina compreendendo hormônio de crescimento e PP representa umradical de hormônio de crescimento obtido por remoção de -C(=0)-NH2 dacadeia lateral de um resíduo de glutamina presente em hormônio decrescimento.
32. Composto de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que GH representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina presente em um hGHcompreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No.l.
33. Composto de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que GH representa o radical obtido por remoção de -C(^O)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina presente em 20 kDa hGH.
34. Composto de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que GH representa o radical obtido por remoção de -C(zizO)-NH2da cadeia lateral dea) o resíduo de glutamina na posição correspondendo à posição 40em SEQ ID No. l;oub) o resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 141 em SEQ ID No. 1;ouGH representa o radical obtido por remoção de -C(^O)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 40 em SEQ ED No. 1, em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido;ouGH representa o radical obtido por remoção de -C(^O)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 141 em SEQ ID No. 1, em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 40 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido;ouGH representa o radical obtido por remoção de -Q=(D)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina presente em uma posiçãodiferente da posição correspondendo à posição 40 em SEQ ID No. 1 ediferente da posição correspondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1, em queo resíduo de glutamina na posição correspondendo à posição 40 em SEQ IDNo. 1, e o resíduo de glutamina na posição correspondendo à posição 141 emSEQ ID No. 1 foram, cada, deletados ou substituídos com outro aminoácido..
35. Composto de acordo com a reivindicação 23, caracterizadopelo fato de ser selecionado dentre7Vsl41/40-2-(O-(4- {4-( 1,3 -bis(mPEG( 1 Ok)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} aminobutil)-oximino)etil hGH;Α^141/40-2-(Ο-(4- {4-(mPEG( 1 Ok)iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;7Vs,4l/40-2-(0-(4-{3-(mPEG(10k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;iV6141/40-2-(O-(4- {4-(2,3-bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;J/Vsl41/40-2-(0-(4-{5-(mPEG(10k)iloxi-5-oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;iV6141/40-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;7Vsl41/40-3-({4-( 1,3-bis(mPEG( 10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;TV5141/40-3 -({4-(mPEG( 1 Ok)iloxi)butilideno} aminoxi )propi lóxihGH;iV8141/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;7Vôl41/40-3-({3-(mPEG(10k)iloxi)propilideno}aminoxi)propilóxihGH;jV5141/4°-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;A^4l/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxi hGH;-7V5141/40-2-(0-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril}aminobutil)-oximino)etil hGH;-7V5141/40-2-(0-(4-{3-(mPEG(20k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;-7V8141/40-2-(O-(4- {4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;-7V6141/40_2-(0-(4-{5-(mPEG(20k)iloxi-5-oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;-7V8141/40-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;iV5141/40-3-({4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno}-aminoxi)propilóxi hGH;7V5141/40-3-({4-(mPEG(20k)iloxi)butilideno}aminoxi)propilóxihGH;7Vsl41/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;7V6141/40-3-({3-(mPEG(20k)iloxi)propilideno}aminoxi)propilóxihGH;7V6141/40-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;7V5141/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;7V6141/40-2-(0-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} aminobutil)-oximino)etil hGH;^y514 i/40_2_(O-(4- { 3-(mPEG(3 Ok)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;7Vsl41/40-2-(0-(4-{4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;iVôl41/40-2-(0-(4-{5-(mPEG(30k)iloxi-5-oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;7V6141/40-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno} aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;jVôl41/40-3-({4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;N8141/40-3 -({4-(mPEG(3 Ok)iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxihGH;7Vôl41/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno }aminoxi)propilóxi hGH;^141/40-3-({3-(mPEG(3 Ok)iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;7V6141/40-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;A^141/40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;7Vsl41/40-3-({4-{(2,3-bis(mPEG(20k)il)prop-l-iloxi)PEGuiloxi}butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;7V5141/40-2-((4-(4-((2,3-bis(mPEG(20k)il)propil)PEGuiloxi)butirilamino)butil)oximino)etil hGH;iV5141-2-(0-(4- {4-( 1,3-bis(mPEG( 1 Ok)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;TVs 141 -2-(0-(4- {4-(mPEG( 1 Ok)iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;7V5141-2-(0-(4-{3-(mPEG(10k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;7νδ141-2-(0-(4- {4-(2,3-bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;7Vsl41-2-(0-(4-{5-(mPEG(10k)iloxi-5-oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;7Vsl41-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;A^141 -3 -({4-( 1,3 -bis(mPEG( 10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno} -aminoxi)propilóxi hGH;iV6141 -3 -({4-(mPEG( 1 Ok)iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxihGH;iV5141-3-({4-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno}aminoxi)propilóxi hGH;TV5141-S -({3 -(mPEG( 1 Ok)iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;j/Vsl41-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;7Vsl41-3-({4-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;TV6141 -2-(0-(4- {4-( 1,3 -bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -minobutil)oximino)etil hGH;TV5141 -2-(0-(4- { 3 -(mPEG(20k)iloxi)propionil} aminobutil)oximino)etil hGH;iV5141-2-(0-(4-{4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;TV6141 -2-(0-(4- { 5 -(mPEG(20k)iloxi-5 -oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;7V5141-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno} aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;iV6141-3-({4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno} -aminoxi)propilóxi hGH;iV5141 -3 -({4-(mPEG(20k)iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxihGH;7V5141-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;TV514L3 -( { 3 -(mPEG(20k)iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;7V6141-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;iV6141-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxi hGH;TV5141 -2-(0-(4- { 4-( 1,3 -bis(mPEG(3 Ok)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;7V5141-2-(0-(4-{3-(mPEG(30k)iloxi)propionil}aminobutil)oximino)etil hGH;7V5141-2-(0-(4-{4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;TV5141 -2-(0-(4- { 5 -(mPEG(3 0k)iloxi-5 -oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;TV6141 -3 -( { 4-(2-(2-(2-(2-(4-( 1,3 -bis(mPEG(3 Ok)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno } aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;TV5141 -3 -( { 4-( 1,3 -bis(mPEG(3 0k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;TV5141 -3 -( { 4-(mPEG(3 Ok)iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxihGH;iVôl41-3-({4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;Nsui-S -( { 3 -(mPEG(3 Ok)iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxihGH;7Vôl41-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;7V5141-3-({4-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxi hGH;iV5141-3-({4-{(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-il)PEGuiloxi} butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;7V5I41-2-((4-(4-((2,3-bis(mPEG(20k)il)propil)PEGuiloxi)butirilamino)butil)oximino)etil hGH;iV540-2-(O-(4- {4-( 1,3 -bis(mPEG( 1 Ok)ilaminocarboniloxi)prop--2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;A^40-2-(O-(4- { 4-(mPEG( 1 Ok)iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;J/V540-2-(O-(4- { 3-(mPEG( 1 Ok)iloxi)propionil} aminobutil)oximino)etil hGH;-/V640-2-(O-(4- {4-(2,3 -bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil) oximino)etil hGH;Α/δ40-2-(Ο-(4- {5-(mPEG( 1 Ok)iloxi-5-oxopentanoil} aminobutil)oximino)etil hGH;iVS40-3-( {4-(2-(2-(2-(2-(4-( 1,3 -bis(mPEG( 1 Ok)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno} aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;A^40-3 -( { 4-( 1,3 -bis(mPEG( 10k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno}-aminoxi)propilóxi hGH;7VS40-3-({4-(mPEG( 1 Ok)iloxi)butilideno} aminoxi)propilóxihGH;iV540-3 -( { 4-(2,3 -bis(mPEG( 1 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butilideno}aminoxi)propilóxi hGH;-( { 3 -(mPEG( 1 Ok)iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxihGH;7VS40-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;7VS40-3-({4-(2,3-bis(mPEG(10k)iloxi)prop-l-iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;7νδ40-2-(Ο-(4-{4-( 1,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop--2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;7V840-2-(O-(4- {3 -(mPEG(20k)iloxi)propionil} aminobutil)oximino)etil hGH;7V640-2-(0-(4-{4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;7Vô40-2-(O-(4- {5-(mPEG(20k)iloxi-5-oxopentanoil} aminobutil)oximino)etil hGH;7VMO-3-({4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno} aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;Λ/δ40-3 -({4-(l,3 -bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;N840-S -( { 4-(mPEG(20k)iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxihGH;7V540-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-l-iloxi)butilideno}aminoxi)propilóxi hGH;N840-S -( { 3-(mPEG(20k)iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxihGH;A^40-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;7V540-3-({4-(2,3-bis(mPEG(20k)iloxi)prop-1 -iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxi hGH;7Vô40-2-(0-(4-{4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop--2-iloxi)butiril} -aminobutil)oximino)etil hGH;A^40-2-(O-(4- { 3 -(mPEG(3 Ok)iloxi)propionil} aminobutil)oximino)etil hGH;iV540-2-(O-(4- { 4-(2,3 -bis(mPEG(3 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butiril} aminobutil)oximino)etil hGH;7VS40-2-(O-(4-{5-(mPEG(3 0k)iloxi-5-oxopentanoil}aminobutil)oximino)etil hGH;N840S -({4-(2-(2-(2-(2-(4-( 1,3 -bis(mPEG(3 Ok)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno} aminoxi)prop-1 -ilóxi hGH;iV640-3-({4-(l,3-bis(mPEG(30k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butilideno } -aminoxi)propilóxi hGH;A^40-3 -( { 4-(mPEG(3 Ok)iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxihGH;N840S -( { 4-(2,3 -bis(mPEG(3 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;A^40-3 -( { 3 -(mPEG(3 Ok)iloxi)propilideno} aminoxi)propilóxihGH;7V54°-2-(0-(2-(3-(2,3-bis(mPEG(30k)iloxi)propiloxi)propilamino)-2-oxoetil)oximino)etil hGH;N040-S -( { 4-(2,3 -bis(mPEG(3 Ok)iloxi)prop-1 -iloxi)propilideno } aminoxi)propilóxi hGH;7VS40-3 -( { 4- { (2,3 -bis(mPEG(20k)iloxi)prop-1 -il)PEGuiloxi} butilideno } aminoxi)propilóxi hGH;7VS40-2-((4-(4-((2,3-bis(mPEG(20k)il)propil)PEGuiloxi)butirilamino)butil)oximino)etil hGH;7Ve141-[2-0-(4-(4-(l,3-bis(mPEG(20K)aminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH;TVeI 41 -[2-(0-(4-(4-(mPEG(30K)oxi)butirilamino)-butil)oxiimino)-etil] hGH;iVe141-(3-((4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno)aminoxi)propiloxi) hGH;Ne 141 - [2-(2-(2,3 -(mPEG(20K)iloxi)propiloxicarbonilamino)etiloximino)etil] hGH;TVe 141 - [2-(0-(2-(2-(mPEG(40K)iloxi)etilamino)-2-oxoetil)oximino)etil] hGH;TVe 141 - [2-(3 -(4-(( 1,3 -bis(mPEG(3 0K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butilideno)aminoxi)propiloxiimino)etil] hGH;Ne 141 /40- [2-0-(4-(4-( 1,3 -bis(mPEG(20K)aminocarboniloxi)--2-propiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH;A^ 141 /40- [2-(0-(4-(4-(mPEG(3 OK)oxi)butirilamino)-butil)oxiimino)-etil] hGH;7Ve141/40-(3-((4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno)aminoxi)propiloxi) hGH;TVe 141 /40- [2-(2-(2,3 -(mPEG(20K)iloxi)propiloxicarbonilamino)etiloximino)etil] hGH;NeI 4 l/40-[2-(0-(2-(2-(mPEG(40K)iloxi)etilamino)-2-oxoetil)oximino)etil] hGH;TVe 141 /40- [2-(3 -(4-(( 1,3 -bis(mPEG(3 OK)ilaminocarboniloxi)--2-propiloxi)butilideno)aminoxi)propiloxiimino)etil] hGH;-7Ve40-[2-0-(4-(4-(l,3-bis(mPEG(20K)aminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)butil)oxiimino)etil] hGH;iVe40-[2-(0-(4-(4-(mPEG(30K)oxi)butirilamino)-butil)oxiimino)-etil] hGH;TVe40-(3-((4-(2-(2-(2-(2-(4-(l,3-bis(mPEG(20K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butirilamino)etoxi)etoxi)etoxi)etoxi)butilideno)aminoxi)propiloxi) hGH;iV£40-[2-(2-(2,3-(mPEG(20K)iloxi)propiloxicarbonilamino)etiloximino)etil] hGH;7Ve40-[2-(0-(2-(2-(mPEG(40K)iloxi)etilamino)-2-oxoetil)oximino)etil] hGH;7Ve40-[2-(3-(4-((l,3-bis(mPEG(30K)ilaminocarboniloxi)-2-propiloxi)butilideno)aminoxi)propiloxiimino)etil] hGH;mPeg(10k)-(X <formula>formula see original document page 201</formula><formula>formula see original document page 202</formula><formula>formula see original document page 203</formula><formula>formula see original document page 204</formula><formula>formula see original document page 205</formula><formula>formula see original document page 206</formula><formula>formula see original document page 207</formula>
36. Composto e sais, pró-drogas ou solvatosfarmaceuticamente aceitáveis do mesmo, caracterizado pelo fato de ser deacordo com a fórmula [VI] <formula>formula see original document page 207</formula> em que PP representa um radical de polipeptídeo obtido porremoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de dois resíduos de glutaminapresentes em referido polipeptídeo;D representa -O- ou uma ligação;R representa C1^alquileno, -(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-CH2-, -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-, ou C5.i5heteroalquileno;A representa uma ligação oxima;Z representa uma porção selecionada dentre<formula>formula see original document page 208</formula><formula>formula see original document page 209</formula><formula>formula see original document page 210</formula> em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG com umpeso molecular entre 1 kDa e 10 kDa; <formula>formula see original document page 210</formula> desde que se Z é entao, então mPEG é 10 kDa mPEG.
37. Composto de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que D representa -O-.
38. Composto de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que D representa uma ligação única.
39. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-36 a 38, caracterizado pelo fato de que R representa -(CH2)4-CH(NH2)-CO-NH-CH2- ou -(CH2)4-CH(NHCOCH3)-CO-NH-CH2-.
40. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-36 a 38, caracterizado pelo fato de que R representa Ci.6 alquileno.
41. Composto de acordo com a reivindicação 40, caracterizadopelo fato de que R representa Ci_3alquileno.
42. Composto de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que R representa metileno ou propileno.
43. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-36 a 42, caracterizado pelo fato de que Z representa <formula>formula see original document page 210</formula><formula>formula see original document page 211</formula><formula>formula see original document page 212</formula> em que, salvo indicado em contrário, mPEG indica um mPEGcom um peso molecular de entre 5 kDa e 40 kDa e PEG indica um PEG comum peso molecular entre 1 kDa e 10 kDa;<formula>formula see original document page 213</formula> desde que se Z éentão PEG é 10 kDa PEG.
44. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-36 a 43, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é um resíduo deglutamina compreendendo hormônio de crescimento e PP representa umradical de hormônio de crescimento obtido por remoção de -C(=0)-NH2 dacadeia lateral de dois resíduos de glutamina presentes no hormônio decrescimento.
45. Composto de acordo com a reivindicação 44, caracterizadopelo fato de que GH representa o radical obtido por remoção de -C(^O)-NH2da cadeia lateral de dois resíduos de glutamina presentes em um hGHcompreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No.l.
46. Composto de acordo com a reivindicação 44, caracterizadopelo fato de que GH representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2da cadeia lateral de dois resíduos de glutamina presentes em 20 kDa hGH.
47. Composto de acordo com a reivindicação 44, caracterizadopelo fato de que GH representa o radical obtido por remoção de -C(^O)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 40 em SEQ ID No. 1, e da cadeia lateral do resíduo de glutamina naposição correspondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1;ouGH representa o radical obtido por remoção de -C(^O)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 40 em SEQ ID No. 1, em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 141 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido, e por remoção de -C(=0)-NH2 da cadeia lateral de umoutro resíduo de glutamina presente em uma posição diferente das posiçõescorrespondendo às posições 40 e 141 em SEQ ID No. 1;ouGH representa o radical obtido por remoção de -C(=0)-NH2da cadeia lateral de um resíduo de glutamina na posição correspondendo àposição 141 em SEQ ID No. 1, em que o resíduo de glutamina na posiçãocorrespondendo à posição 40 em SEQ ID No. 1 foi deletado ou substituídocom outro aminoácido, e por remoção de -C(^O)-NH2 da cadeia lateral de umoutro resíduo de glutamina presente em uma posição diferente das posiçõescorrespondendo às posições 40 e 141 em SEQ ID No. 1;ouGH representa o radical obtido por remoção de -C(^O)-NH2da cadeia lateral de dois glutaminas presente em um hGH em posiçõesdiferente das posições correspondendo às posições 40 e 141 em SEQ ID No.-1, em que qualquer resíduo de glutaminas presente nas posiçõescorrespondendo às posições 40 e 141 em SEQ ID No. 1 foi deletado ousubstituído com outros aminoácidos.
48. Hormônio de crescimento humano, caracterizado pelo fatode ser covalentemente fixado a uma porção compreendendo PEG, e emparticular mPEG, em que referido porção compreendendo PEG é fixada nacadeia lateral de resíduo de glutamina 40, na cadeia lateral de glutamina 141ou nas cadeias laterais de glutamina 40 e glutamina 141 de hormônio decrescimento humano, desde que não sejaNel41-[2-(4-(4-(mPEG(20k)ilbutanoil)-amino-butiloxiimino)-etil] hGH,Nel41-[2-(l-(hexadecanoil)piperidin-4-il)etiloxiimino)-etil]hGH,N£l41(2-(4-(4-(l,3-bis(mPEG(20k)ilaminocarboniloxi)prop-2-iloxi)butirilamino)butiloxiimino)etil) hGH,Ne 141 (2-(4-(2,6-bis(mPEG(20k)iloxicarbonilamino)hexanoilamino)butiloxiimino)etil) hGH,Nel41(2-(4-(4-(mPEG(30k)iloxi)butirilamino)butiloxiimino)etil) hGH,NE,4,(2-(4-(4-(mPEG(20k)iloxi)butirilamino)butiloxiimino)etil) hGH, ouN8l41(2-(4-(3-(mPEG(30k)iloxi)propanoilamino)butiloxiimino)etil) hGH.
49. Composto caracterizado pelo fato de ser obtido por uso deum método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.
50. Composto caracterizado pelo fato de ser obtenível pelo usode um método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 22.
51. Composto caracterizado pelo fato obtido por uso de ummétodo como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 22.
52. Composto caracterizado pelo fato de ser obtenível pelo usode um método como definido em qualquer uma das reivindicações 19 a 22.
53. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações-31 a 35, qualquer uma das reivindicações 44 a 52, reivindicação 51, oureivindicação 52 caracterizado pelo fato de ser para uso em terapia.
54. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 31 a 35, qualquer uma das reivindicações 44 a 52,reivindicação 51, ou reivindicação 52.
55. Método para tratamento de doença, a dita doença sendodeficiência de hormônio de crescimento (GHD); Síndrome de Turner;Síndrome de Prader-Willi (PWS); síndrome de Noonan; síndrome de Down;doença renal crônica, artrite reumatóide juvenil; fibrose cística, infecção porHTV em crianças recebendo tratamento HAART (crianças HIV/HALS);crianças baixas que cresceram baixas na idade gestacional (SGA); estaturabaixa em crianças que nasceram com peso muito baixo (VLBW) mas SGA;displasia esqueletal; hipocondroplasia; acondroplasia; estatura baixaidiopática (ISS); GHD em adultos; fraturas em ou de ossos longos, tal comotíbia, fíbula, fêmur, úmero, rádio, ulna, clavícula, matacarpea, matatarsea, edígito; fraturas em ou de ossos espongiosos, tal como o remo, base de mão, ebase do pé; pacientes após cirurgia dos tendões ou ligamentos em porexemplo mão, joelho, ou ombro; pacientes tendo ou passando através deoteogenese de distração; pacientes após substituição de bacia ou disco, reparodo menisco, fusões da espinha ou fixação de prótese, tal como no joelho,quadril, ombro, ombro, pulso ou maxilar; pacientes em que o material deosteosíntese, tal como pregos, parafusos e placas, foram fixados; pacientescom falta de união ou má união de fraturas; pacientes após osteatomia, porexemplo da tíbia ou do primeiro dedo; pacientes após implante de enxertos;degeneração de cartilagem articular em joelho causado por trauma ou artrite;osteoporose em pacientes com síndrome de Turner; osteoporose em homens;pacientes adultos em diálise crônica (APCD); doença cardiovascularassociada com má nutrição APCD; reversão de caquexia em APCD; câncerem APCD; doença pulmonar abstrativa crônica em APCD; HIV em APCD;idosos com APCD; doença crônica do fígado APCD, síndrome de fadiga emAPCD; doença de Crohn; função de fígado prejudicada; males com infecçõespor HIV; síndrome de intestino curto; obesidade central; síndrome delipodistrofia associada com HIV (HALS); infertilidade masculina; pacientesapós cirurgia eletiva principal, destoxificação de álcool/drogas ou traumaneurológico; envelhecimento; idosos frágeis; osteo-artrite; cartilagemtraumaticamente danificada; disfunção erétil; fibromialgia; distúrbios depeso muito baixo no nascimento; síndrome metabólica; miopatiaglucocorticóide; estatura baixa devido a tratamento com glucocorticóide emcrianças; para aceleração da cicatrização de tecido muscular, tecido nervosoou feridas; aceleração ou melhora do fluxo sangüíneo para tecido danificado;ou a diminuição de taxa de infecção em tecido danificado, o métodocaracterizado pelo fato de compreender a administração, a um paciente emnecessidade de uma quantidade eficaz, uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 31a 35, qualquer uma das reivindicações 44 a 52, reivindicação 51, oureivindicação 52 ou uma composição farmacêutica como definida nareivindicação 54.
56. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 31 a 35, qualquer uma das reivindicações 44 a 52,reivindicação 51, ou reivindicação 52, caracterizado pelo fato de ser nafabricação de um medicamento a ser usado no tratamento de deficiência dehormônio de crescimento (GHD); Síndrome de Turner; Síndrome de Prader-Willi (PWS); Síndrome de Noonan; Síndrome de Down; doença renalcrônica, artrite reumatóide juvenil; fibrose cística, infecção por HIV emcrianças recebendo tratamento HAART (crianças HIV/HALS); criançasbaixas que cresceram baixas na idade gestacional (SGA); estatura baixa emcrianças que nasceram com peso muito baixo (VLBW) mas SGA; displasiaesqueletal; hipocondroplasia; acondroplasia; estatura baixa idiopática (ISS);GHD em adultos; fraturas em ou de ossos longos, tal como tíbia, fíbula,fêmur, úmero, rádio, ulna, clavícula, matacarpea, matatarsea, e dígito; fraturasem ou de ossos espongiosos, tal como o remo, base de mão, e base do pé;pacientes após cirurgia dos tendões ou ligamentos em por exemplo mão,joelho, ou ombro; pacientes tendo ou passando através de oteogenese dedistração; pacientes após substituição de bacia ou disco, reparo do menisco,fusões da espinha ou fixação de prótese, tal como no joelho, quadril, ombro,ombro, pulso ou maxilar; pacientes em que o material de osteosíntese, talcomo pregos, parafusos e placas, foram fixados; pacientes com falta de uniãoou má união de fraturas; pacientes após osteatomia, por exemplo da tíbia oudo primeiro dedo; pacientes após implante de enxertos; degeneração decartilagem articular em joelho causado por trauma ou artrite; osteoporose empacientes com síndrome de Turner; osteoporose em homens; pacientes adultosem diálise crônica (APCD); doença cardiovascular associada com má nutriçãoAPCD; reversão de caquexia em APCD; câncer em APCD; doença pulmonarabstrativa crônica em APCD; HIV em APCD; idosos com APCD; doençacrônica do fígado APCD, síndrome de fadiga em APCD; doença de Crohn;função de fígado prejudicada; males com infecções por HIV; síndrome deintestino curto; obesidade central; síndrome de lipodistrofia associada comHIV (HALS); infertilidade masculina; pacientes após cirurgia eletivaprincipal, destoxificação de álcool/drogas ou trauma neurológico;envelhecimento; idosos frágeis; osteo-artrite; cartilagem traumaticamentedanificada; disfunção erétil; fibromialgia; distúrbios de memória; depressão;dano traumático ao cérebro; hemorragia subaracnóide; peso muito baixo nonascimento; síndrome metabólica; miopatia glucocorticóide; estatura baixadevido a tratamento com glucocorticóide em crianças; aceleração dacicatrização de tecido muscular, tecido nervoso ou feridas; aceleração oumelhora do fluxo sangüíneo para tecido danificado; ou a diminuição de taxade infecção em tecido danificado.
BRPI0611570-5A 2005-06-15 2006-06-15 métodos para fixar covalentemente peg a um polipeptìdeo e para modificar propriedades farmacológicas de hormÈnio de crescimento, composto e sais, pró-drogas ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, hormÈnio de crescimento humano, composição farmacêutica, método para tratamento de doença e, uso de um composto BRPI0611570A2 (pt)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP05105256 2005-06-15
EP05105256.1 2005-06-15
EP05109667 2005-10-18
EP05109667.5 2005-10-18
PCT/EP2006/063246 WO2006134148A2 (en) 2005-06-15 2006-06-15 Transglutaminase mediated conjugation of growth hormone

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0611570A2 true BRPI0611570A2 (pt) 2011-02-22

Family

ID=37031113

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0611570-5A BRPI0611570A2 (pt) 2005-06-15 2006-06-15 métodos para fixar covalentemente peg a um polipeptìdeo e para modificar propriedades farmacológicas de hormÈnio de crescimento, composto e sais, pró-drogas ou solvatos farmaceuticamente aceitáveis do mesmo, hormÈnio de crescimento humano, composição farmacêutica, método para tratamento de doença e, uso de um composto

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20100197573A1 (pt)
EP (1) EP1893239A2 (pt)
JP (1) JP2008543297A (pt)
KR (1) KR20080016674A (pt)
AU (1) AU2006259080A1 (pt)
BR (1) BRPI0611570A2 (pt)
CA (1) CA2612794A1 (pt)
IL (1) IL187630A0 (pt)
MX (1) MX2007015676A (pt)
NO (1) NO20080249L (pt)
RU (1) RU2007145085A (pt)
TW (1) TW200716179A (pt)
WO (1) WO2006134148A2 (pt)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8293708B2 (en) 2005-08-30 2012-10-23 Novo Nordisk Health Care A/G Liquid formulations N-terminal serine of pegylated growth hormone
WO2008003750A2 (en) 2006-07-07 2008-01-10 Novo Nordisk Health Care Ag New protein conjugates and methods for their preparation
CN101854960B (zh) 2006-12-15 2014-06-25 生命连结有限公司 明胶-转谷氨酰胺酶止血敷料和密封材料
WO2008102007A1 (en) * 2007-02-22 2008-08-28 Novo Nordisk Health Care Ag Transglutaminase variants with improved specificity
CA3004716C (en) * 2008-04-29 2022-04-12 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Pegylated recombinant human growth hormone compounds
AU2009261559B2 (en) 2008-06-18 2014-01-16 Lifebond Ltd Improved cross-linked compositions
WO2010029107A1 (en) * 2008-09-09 2010-03-18 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormone conjugate with increased stability
EP2427215A1 (en) * 2009-05-07 2012-03-14 Novo Nordisk Health Care AG Stable pharmaceutical compositions of peptide derivatized using an oxime linker
WO2011015649A1 (en) * 2009-08-06 2011-02-10 Novo Nordisk Health Care Ag Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
EP2512450B1 (en) 2009-12-15 2018-02-07 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Dry growth hormone composition transiently linked to a polymer carrier
EP2963111A1 (en) 2009-12-22 2016-01-06 Lifebond Ltd Modification of enzymatic crosslinkers for controlling properties of crosslinked matrices
PL2525834T3 (pl) 2010-01-22 2020-10-19 Novo Nordisk Health Care Ag Hormony wzrostu o przedłużonej skuteczności in-vivo
EP2536753B1 (en) 2010-02-16 2017-12-20 Novo Nordisk A/S Factor viii molecules with reduced vwf binding
ITPD20100155A1 (it) 2010-05-19 2011-11-20 Univ Padova Metodo per la preparazione di coniugati mediante transglutaminasi
DK2600910T3 (en) 2010-08-05 2016-04-04 Lifebond Ltd Wound dressings and adhesives COMPREHENSIVE DRYING FORMATIONS
AU2012222366A1 (en) 2011-03-02 2013-08-01 Novo Nordisk A/S Coagulation factor-targeting to TLT-1 on activated platelets
MX354705B (es) 2011-09-23 2018-03-16 Novo Nordisk As Analogos de glucagon novedosos.
US9650331B2 (en) 2012-06-18 2017-05-16 Polytherics Limited Conjugation reagents
US9896513B2 (en) 2013-03-15 2018-02-20 Novo Nordisk A/S Antibodies capable of specifically binding two epitopes on tissue factor pathway inhibitor
ES2841123T3 (es) 2013-04-05 2021-07-07 Formulacion Del Compuesto De La Hormona De Crecimiento Formulación del compuesto de la hormona de crecimiento
BR112015025464A2 (pt) 2013-04-18 2017-10-10 Novo Nordisk As coagonistas do receptor de glp-1/glucagon estáveis, prolongados para uso médico
KR20160040556A (ko) * 2013-07-11 2016-04-14 노파르티스 아게 미생물 트랜스글루타미나제를 사용한 리신-특이적 화학효소적 단백질 변형
JP2017525656A (ja) 2014-06-04 2017-09-07 ノヴォ ノルディスク アー／エス 医療用のｇｌｐ−１／グルカゴン受容体コアゴニスト
KR102608645B1 (ko) 2014-11-18 2023-12-01 아센디스 파마 엔도크리놀로지 디비전 에이/에스 신규한 중합체성 hGH 프로드러그
EP4732848A3 (en) 2014-11-21 2026-07-29 Ascendis Pharma Endocrinology Division A/S Long-acting growth hormone dosage forms
WO2018017923A1 (en) * 2016-07-22 2018-01-25 Nektar Therapeutics Conjugates of a factor viii moiety having an oxime-containing linkage
SG11202003094PA (en) 2017-11-07 2020-05-28 Codexis Inc Transglutaminase variants
US11998654B2 (en) 2018-07-12 2024-06-04 Bard Shannon Limited Securing implants and medical devices
JP7524206B2 (ja) 2019-03-04 2024-07-29 アセンディス ファーマ エンドクライノロジー ディヴィジョン エー／エス １日ごとのソマトロピンよりも優れた効力を有する長時間作用性成長ホルモン剤形

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
EP0785276A4 (en) 1994-09-29 2002-01-09 Ajinomoto Kk MODIFICATION OF A PEPTIDE AND A PROTEIN
US6620916B1 (en) 1996-09-26 2003-09-16 Ajinomoto Co., Inc. Modified physiologically active proteins and medicinal compositions containing the same
JP2004524020A (ja) * 2001-01-11 2004-08-12 マキシゲン・エイピーエス 改良された成長ホルモン分子
WO2004108667A2 (en) * 2003-05-30 2004-12-16 Centocor, Inc. Formation of novel erythropoietin conjugates using transglutaminase
CN1243022C (zh) * 2003-10-17 2006-02-22 华东师范大学 生物修饰重组人生长激素复合物及其制备方法
EP2033662B1 (en) 2004-01-21 2012-10-17 Novo Nordisk Health Care AG Transglutaminase mediated conjugation of peptides
CA2594557C (en) * 2004-12-22 2016-04-26 Ambrx, Inc. Modified human growth hormone
US8293708B2 (en) * 2005-08-30 2012-10-23 Novo Nordisk Health Care A/G Liquid formulations N-terminal serine of pegylated growth hormone

Also Published As

Publication number Publication date
MX2007015676A (es) 2008-02-20
AU2006259080A1 (en) 2006-12-21
NO20080249L (no) 2008-03-17
RU2007145085A (ru) 2009-07-20
TW200716179A (en) 2007-05-01
IL187630A0 (en) 2008-03-20
US20100197573A1 (en) 2010-08-05
JP2008543297A (ja) 2008-12-04
WO2006134148A2 (en) 2006-12-21
WO2006134148A3 (en) 2007-12-21
KR20080016674A (ko) 2008-02-21
EP1893239A2 (en) 2008-03-05
CA2612794A1 (en) 2006-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20100197573A1 (en) Transglutaminase Mediated Conjugation of Growth Hormone
EP2461831B1 (en) Growth hormones with prolonged in-vivo efficacy
TWI508737B (zh) 具有延長的活體內功效的生長激素
JP5252458B2 (ja) 新規タンパク質コンジュゲート及びその製造方法
US20090105134A1 (en) C-Terminally Pegylated Growth Hormones
ES2745484T3 (es) Hormonas de crecimiento con eficacia prolongada in vivo
US20080274075A1 (en) Poly(Ethylene Glycol) Derivatives and Process For Their Coupling to Proteins
ES2703388T3 (es) Hormonas de crecimiento con eficacia prolongada in vivo
WO2010128141A1 (en) Stable pharmaceutical compositions of peptide derivatized using an oxime linker
CN101365492A (zh) 转谷氨酰胺酶介导的生长激素的结合

Legal Events

Date Code Title Description
B06G Technical and formal requirements: other requirements [chapter 6.7 patent gazette]

Free format text: SOLICITA-SE A REGULARIZACAO DA PROCURACAO, UMA VEZ QUE BASEADO NO ARTIGO 216 1O DA LPI, O DOCUMENTO DE PROCURACAO DEVE SER APRESENTADO NO ORIGINAL, TRASLADO OU FOTOCOPIA AUTENTICADA.

B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE 6A. E 7A, ANUIDADE(S).

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: REFERENTE AO DESPACHO 8.6 PUBLICADO NA RPI 2212 DE 28/05/2013.

B15K Others concerning applications: alteration of classification

Ipc: C12N 9/96 (2006.01), A61K 47/60 (2017.01), C12N 9/