BRPI0611586A2 - métodos de proteção contra apoptose mediante uso de lipopeptìdeos - Google Patents

Abstract

MéTODOS DE PROTEçãO CONTRA APOPTOSE MEDIANTE USO DE LIPOPEPTìDEOS. A presente invenção refere-se ao uso de lipopeptídeos como indutores de NF-<sym>B para a proteção de mamíferos dos efeitos de apoptose.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSDE PROTEÇÃO CONTRA APOPTOSE MEDIANTE USO DE LIPOPEPTÍDEOS".

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se ao uso de indutores de NF-κΒ para pro-teger mamíferos dos efeitos de apoptose. Mais especificamente, esta inven-ção refere-se ao uso de indutores de NF-κΒ para proteger mamíferos de ex-posição a tensão (stress), tais como tratamentos com radiação e tratamentosde câncer.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A progressão de células normais para células tumorais envolveuma perda de mecanismos negativos de regulação de crescimento que in-cluem resistência a estímulos inibidores de crescimento e uma falta de de-pendência a fatores de crescimento e hormônios. Tratamentos tradicionaisde câncer que se baseiam em radiação ou fármacos citotóxicos dependemdas diferenças no controle de crescimento de células normais e malignas.

Tratamentos tradicionais de câncer submetem as células a severa tensãogenotóxica. Sob essas condições, a maioria das células normais torna-sedetida e, portanto, preservadas, enquanto células tumorais continuam a divi-dir-se e morrer.

Entretanto, a natureza de estratégias de tratamentos convencio-nais de câncer é tal que tecidos normais que se dividem rapidamente ou quesão propensos a apoptose ficam em risco. Dano a essas células normaisque se dividem rapidamente causa os efeitos colaterais bem conhecidos detratamento de câncer (tecidos sensíveis: hematopoiese, intestino delgado,folículos pilosos). A sensibilidade natural de tais tecidos é complicada pelofato de que células cancerosas freqüentemente adquirem defeitos na maqui-naria suicida (apoptótica) e procedimentos terapêuticos que causam morteem tecidos normais sensíveis poderão não ser eficazes sobre células cance-rosas. Tentativas convencionais para minimizar os efeitos colaterais de tera-pias de câncer baseiam-se em (a) tornar células tumorais mais suscetíveis atratamento, (b) tornar terapias de câncer mais específicas a células tumoraisou (c) promover regeneração de tecido normal após tratamento (por exem-plo, eritropoietina, GM-CSF e KGF). Cada um desses procedimentos, noentanto, tem eficácia limitada. Como resultado, continua a haver uma neces-sidade de agentes terapêuticos para mitigar os efeitos colaterais associadosa quimioterapia e terapia com radiação no tratamento de câncer. Esta inven-ção preenche essa necessidade e proporciona outras vantagens afins.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Proporciona-se aqui um método de proteção de um mamífero deuma ou mais condições ou tratamentos que disparam apoptose. Um mamífe-ro poderá receber administração de uma composição que compreende umaquantidade farmaceuticamente aceitável de um composto de fórmula:

<formula>formula see original document page 3</formula>

em que

R1 representa H ou -CO-R4,

R2, R3 e R4 independentemente são H ou Ce-Cie alifático opcio-nalmente substituído;

X é um peptídeo; e

Z é S ou CH2.

O peptídeo poderá compreender uma seqüência apresentadaem SEQS IDS NOs: 1-52. Os cinco primeiros aminoácidos do peptídeo po-derão ser escolhidos dos aminoácidos nas posições referidas na Tabela 2. Ocomposto poderá ser um estereoisômero RR ou RS ou mistura destes. Ocomposto poderá também ser de fórmula:<formula>formula see original document page 4</formula>

A condição que dispara apoptose poderá ser radiação, ferimen-to, envenenamento, infecção ou choque de temperatura. O tratamento quedispara apoptose poderá ser um tratamento de câncer. O tratamento decâncer poderá ser quimioterapia ou terapia com radiação. O tecido em queapoptose é disparada poderá ser o baço, timo, trato Gl, pulmões, rins, fíga-do, sistema cardiovascular, endotélio dos vasos sangüíneos, sistema nervo-so (central ou periférico), células hematopoiéticas progenitoras (medula ós-sea), sistema imune, folículos pilosos ou o sistema reprodutor.

O composto poderá ser administrado em combinação com umradioprotetor. O radioprotetor poderá ser um antioxidante, tal como amifosti-na ou vitamina Ε. O radioprotetor poderá também ser uma citocina, tal comofator de células-tronco. O radioprotetor poderá também ser flagelina, TGFplatente ou um ativador de um TLR.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 ilustra que deficiência de p53 acelera o desenvolvi-mento de síndrome gastrointestinal induzida por radiação em camundongos.

O painel A apresenta gráficos da sobrevivência percentual de camundongosexpostos a 9; 12,5; 25 ou 5 χ 2,5 Gy de radiação-gama de corpo inteiro apóspré-tratamento com um inibidor de p53, pifitrina-alfa (PFT) ou DMSO (contro-le). Camundongos p53 nulo foram também expostos à dose de radiação cu-mulativa fracionada de 12,5 Gy (5 χ 2,5 Gy). O painel B apresenta gráficosda sobrevivência percentual de camundongos do tipo selvagem e p53 nuloapós exposição a doses baixas (10 Gy) ou altas (15 Gy) de radiação-gamade corpo inteiro. O painel C apresenta um gráfico que ilustra a sobrevivênciapercentual de camundongos expostos a 15 Gy de radiação-gama de corpointeiro após reconstituição com medula óssea (BM) do tipo selvagem ou ca-mundongos p53 nulo. O painel D apresenta seções intestinais parafinadascoradas com hematoxilina-eosina de camundongos do tipo selvagem e p53nulo nos pontos de tempo indicados após 15 Gy de radiação-gama. Insetosem 24 h mostram coração TUNEL de regiões crípticas.

A Figura 2 ilustra a dinâmica de proliferação e sobrevivência ce-lulares no intestino delgado de camundongos do tipo selvagem e p53 nulo. Opainel A (esquerda) mostra auto-radiografias de seções de corpo inteiro decamundongos do tipo selvagem e p53 nulo injetado com 14C-timidina queforam tratados com 15 Gy de radiação-gama ou não tratados. Setas apon-tam para os intestinos. O painel A (direita) mostra fotomicrografias de incor-poração de Brdll no intestino delgado camundongos do tipo selvagem e p53nulo em diferentes pontos de tempo após 15 Gy de radiação-gama. Regiõesdas imagens de 96 h são mostradas sob ampliação maior. O painel B apre-senta um gráfico do número de células positivas a BrdU/criptas no intestinodelgado de camundongos do tipo selvagem e p53 nulo em diferentes pontosde tempo após 15 Gy de radiação-gama. O painel C apresenta fotomicrogra-fias de células marcadas com BrdU no intestino delgado de camundongosdo tipo selvagem e p53 nulo em diferentes pontos de tempo após 15 Gy deradiação-gama. BrdU foi injetado 30 min antes de irradiação e os camun-dongos foram sacrificados nos pontos de tempo indicados.

A Figura 3 ilustra o efeito radioprotetor do composto, CBLB601.São mostrados gráficos da porcentagem de sobrevivência de camundongosexpostos a 9; 12,5; 25 ou 5 χ 2,5 Gy de radiação-gama de corpo inteiro apóspré-tratamento com CBLB601 ou PBS.

A Figura 4 ilustra alterações no tamanho do baço após exposi-ção a 13 Gy de radiação-gama de corpo inteiro após pré-tratamento comCBLB601 ou PBS. À esquerda está um gráfico de pesos de baços de ca-mundongos tratados com PBS e CBLB601 e à direita estão imagens de ba-ços dos camundongos de controle ou tratados.

Figura 5 ilustra a determinação do tempo ótimo para injeção in-traperitoneal de CBLB601. O painel A mostra um gráfico da sobrevivênciapercentual de camundongos expostos a 10 Gy de irradiação de corpo inteiro(TBI) após administração intraperitoneal de PBS ou CBLB601 24, 6, 1 ou 0,5h antes de irradiação. O painel B mostra um gráfico da sobrevivência per-centual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração intra-peritoneal de PBS ou CBLB601 96, 72, 48, 24 ou 1 h antes de irradiação.

Figura 6 ilustra a determinação da dose ótima de CBLB601. Opainel A mostra um gráfico da sobrevivência percentual de camundongosexpostos a 10 Gy de TBI após administração intraperitoneal de PBS ou 1, 3,10, 20, 30 pg de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação. O painel Bmostra um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a10 Gy de TBI após administração intraperitoneal de PBS ou 0,1; 0,3; 1; 3; 10ou 15 pg de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação.

A Figura 7 ilustra a determinação da dose de radiação protegidapor CBLB601. O painel A mostra um gráfico da sobrevivência percentual decamundongos expostos a 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 Gy de TBI após adminis-tração intraperitoneal de PBS 24 h antes de irradiação. O painel B mostraum gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10, 11,12, 13, 14 ou 15 Gy de TBI após administração intraperitoneal de 3 pg deCBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação.

A Figura 8 ilustra o efeito radioprotetor de administração intra-muscular de CBLB601. É mostrado um gráfico da sobrevivência percentualde camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração intraperito-TieaT de PBS ou ãdmrnistração intTamuscular de l, 3 ou 10 pg de C-BLB601/camundongo 24 h antes de irradiação.

A Figura 9 representa sobrevivência após diferentes doses deradiação e diferentes doses de CBLB601. É mostrado um gráfico da sobrevi-vência percentual de camundongos expostos a 10, 11 ou 12 Gy de TBI apósadministração intramuscular de PBS ou 0,3; 1; 3; 10 ou 30 pg de C-BLB601/camundongo 24 h antes de irradiação.

A Figura 10 compara sobrevivência após diferentes doses deCBLB601 serem administradas via diferentes rotas. É mostrado um gráficode barras da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gyde TBI após administração intraperitoneal ou intramuscular de diferentesdoses de CBLB601 24 h antes de irradiação.

A Figura 11 compara sobrevivência após diferentes doses deCBLB601, expressas como Mg/kg, serem administradas via diferentes rotas.É mostrado um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expos-tos a 10 Gy de TBI após administração intraperitoneal ou intramuscular dediferentes doses de CBLB601 24 h antes de irradiação.

A Figura 12 ilustra a determinação do tempo ótimo para injeçãointramuscular de CBLB601. O painel A mostra um gráfico da sobrevivênciapercentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após administraçãointramuscular de PBS ou 3 pg de CBLB601/camundongo 24, 6, 3 ou 1 h an-tes de irradiação ou 1 ou 3 h após irradiação. O painel B mostra um gráficoda sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI apósadministração intramuscular de PBS ou 3 pg de CBLB601/camundongo 48,36, 24, 12 ou 6 h antes de irradiação. O painel C mostra um gráfico da so-brevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gy de TBI após ad-ministração intramuscular de PBS ou 1, 3, 10 ou 30 pg de C-BLB601/camundongo 1 h após irradiação.

A Figura 13 compara sobrevivência como função do tempo deadministração e via de administração de CBLB601. É mostrado um gráficode barras da sobrevivência percentual de camundongos expostos a 10 Gyde TBI após administração intraperitoneal ou intramuscular de 3 pg de C-BLB6017cãmündongo em vários tempos antes de irradiação.

A Figura 14 ilustra a determinação do Fatot de Modificação deDoses no 30s dia (DMF3o) para CBLB601 sob as condições radioprotetorasótimas. É mostrado um gráfico da sobrevivência percentual de camundongosexpostos a várias doses de radiação após administração intramuscular dePBS ou 3 pg de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação.

A Figura 15 apresenta um gráfico dos pesos médios de baços decamundongos de controle irradiados e camundongos tratados com C-BLB601. É traçada a razão de peso do baço por peso corporal de camun-dongos expostos a 0, 6 ou 10 Gy de TBI após administração intramuscularde PBS ou 3 pg de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação.

A Figura 16 representa as respostas imunes de camundongostratados com CNLB601 que foram imunizados com flagelina 8, 18 ou 20 se-manas após irradiação. O painel A mostra a resposta imune dos diferentesgrupos um mês após a primeira imunização. O painel B mostra a respostaimune dos diferentes grupos um mês após a primeira sangria. O painel Cmostra a resposta imune secundária a flagelina dos diferentes grupos 10dias após a terceira imunização.

A Figura 17 é um gráfico da ativação de um repórter NF-κΒ porvárias doses de CBLB613 e CBLB601 em 293 células que expressam o he-terodímero TLR2/TLR6.

A Figura 18 apresenta a ativação de um repórter NF-κΒ por vá-rios compostos de CBLB em 293 células que expressam o heterodímeroTLR2/TLR6. O painel A apresenta ativação de NF-κΒ por várias doses deCBLB601, CBLB612, CBLB614 ou CBLB615. O painel B apresenta ativaçãode NF-κΒ por várias doses de CBLB601, CBLB612, CBLB614 ou CBLB615e nenhuma ativação pelos peptídeos livres correspondentes.

A Figura 19 é um gráfico da ativação de um repórter NF-κΒ porvárias doses de CBLB617 e CBLB601 em 293 células que expressam o he-terodímero TLR2/TLR6.

A Figura 20 ilustra a atividade radioprotetora de CBLB613. Émostrado um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos expostosa 10 Gy dêTBI após administração intramuscular de PBS ou 0,3; 1; 3; 10; 30ou 82,5 pg de CBLB613/camundongo 24 h antes de irradiação.

A Figura 21 ilustra a atividade radioprotetora de CBLB612, C-BLB6Í4 e CBLB615. É mostrado um gráfico da sobrevivência percentual decamundongos expostos a 10 Gy de TBI após administração intramuscular dePBS ou várias doses de CBLB612, CBLB614 ou CBLB615 24 h antes deirradiação.

A Figura 22 ilustra a atividade mitigadora de CBLB612. É mos-trado um gráfico da sobrevivência percentual de camundongos tratados com50 μg de CBLB612/camundongo ou PBS 1 h após exposição a 8,5; 9 ou 10Gy de TBI.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Proporciona-se aqui um método de proteção de células e tecidosnormais de apoptose causada por um vários tipos de tensões. Apoptosenormalmente funciona de modo a "limpar" tecidos de células feridas ou ge-neticamente danificadas, enquanto citocinas mobilizam o sistema de defesado organismo contra a tensão. Entretanto, sob condições de dano grave,ambos os mecanismos de resposta a tensão podem eles mesmos atuaremcomo causa de morte. Por exemplo, Ietalidade em conseqüência de radiaçãopoderá resultar de apoptose maciça que ocorre em sistemas hematopoiéti-cos, imunes e digestivos.

Há dois importantes mecanismos de controle de apoptose nacélula: o caminho p53 (pró-apoptótico) e o caminho NF-κΒ (anti-apoptotico).Ambos os caminhos são freqüentemente desregulados em tumores: p53poderá se perder, enquanto NF-κΒ poderá tornar-se constitutivamente ativo.Portanto, inibição de p53 e/ou ativação de NF-κΒ em células normais pode-rão protegê-las de morte causada por tensões. Tal abordagem no tratamentode cânceres não tornaria células tumorais mais resistentes a tratamento por-que elas poderão já apresentar esses mecanismos de controle desregula-dos. Isso contradiz a visão convencional sobre p53 e NF-κΒ, que são consi-derados como alvos para ativação e repressão, respectivamente.

Como descrito neste relatório, atividade de NF-κΒ poderá serInduzida para proteger células normais de apoptose. Mediante indução deatividade de NF-κΒ em um mamífero, células normais poderão ser protegi-das de apoptose atribuível a tensão celular. Uma vez que as células normaistenham se recuperado da tensão, atividade de NF-κΒ poderá ser restauradaa níveis normais. Induzindo temporariamente atividade de NF-κΒ, as célulaspoderão ser protegidas de vários tipos de tensões. Isso poderá proporcionarcontrole tanto de respostas inflamatórias quanto das decisões vida-morte decélulas de tecidos e órgãos danificados.

O papel protetor de NF-κΒ poderá ser mediado por ativaçãotranscricional de genes múltiplos que codificam: a) proteínas anti-apoptóticasque bloqueiam ambos os importantes caminhos apoptóticos, b) citocinas efatores de crescimento que induzem proliferação e sobrevivência de célulashematopoiéticas e outras células-tronco, e c) potentes proteínas antioxidan-tes que seqüestram ROS, tal como MnSOD (SOD-2). Assim, por exemplo,por meio de ativação transiente de NF-κΒ para radioproteção, poderá serpossível obter não só supressão de apoptose em pacientes de câncer, comotambém a capacidade de reduzir a taxa de incidência secundária de câncerdevido a seus efeitos imunoestimuladores simultâneos, o que poderá serobtido se a ativação de NF-κΒ é mediada por receptores semelhantes a Toll.

Uma outra propriedade atraente do caminho NF-κΒ como alvo ésua ativação por numerosos fatores naturais. Entre estes estão múltiplospadrões moleculares associados a patógenos (PAMPs). PAMPs estão pre-sentes somente em microorganismos e não são encontrados no organismohospedeiro, são característicos de grandes grupos de patógenos e não po-dem ser facilmente submetidos a mutação. Eles são reconhecidos por recep-tores semelhantes a Toll (TLRs), os elementos-chave sensores de imunida-de inata. TLRs atuam como um primeiro mecanismo de advertência do sis-tema imune mediante indução de migração e ativação de células imunesdiretamente ou através de liberação de citocina. TLRs são proteínas demembranas tipo I, como o funcionamento conhecido como homo e hetero-dímeros. Após ligação com ligante, TLRs recrutam proteína MyD88, um in-dispensável adaptador de sinalização para a maioria dos TLRs. A cascata desinalizãçãõque sé segue conduz a~efeitos que incluem (i) ativação de cami-nho NF-κΒ e (ii) ativação de MAPKs, incluindo Jun quinase com término N(JNK). Diferentemente de citocinas, muitos PAMPs apresentam pequenoefeito além de ativação de TLRs e, assim, improvavelmente produzem efei-tos colaterais. Além disso, numerosos TLTs (TLR1-TLR10) estão presentesem seres humanos. Consistentes com sua função de ativação de imunóci-tos, todos os TLRs são expressos no baço e leucócitos de sangue periférico,com padrões dé expressão mais específicos a TLR em outros órgãos linfói-des e subconjuntos de leucócitos. Todos os TLRs são também expressosnas células endoteliais e epiteliais mucosas da pele e dos tratos respirató-rios, intestinais e genitourinários.

1. Definições

Deve-se entender que a terminologia usada aqui tem a finalida-de de descrever modalidades particulares apenas e não pretende ser Iimita-tiva. Deve-se observar que, como usadas no relatório descritivo e nas reivin-dicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o(a)" incluem referen-tes plurais, a não ser que o contexto dite claramente o contrário.

O termo "administrar", quando usado para descrever a dosagemde um agente que induz atividade de NF-κΒ, significa uma única dose oudoses múltiplas do agente.

O termo "alifático", como usado neste relatório, refere-se a umgrupo hidrocarboneto não-ramificado, ramificado ou cíclico, que poderá sersubstituído ou não-substituído e que poderá ser saturado ou insaturado, masque não é aromático. O termo alifático adicionalmente inclui grupos alifáti-cos, que compreendem átomos de oxigênio, nitrogênio, enxofre ou fósforoque substituem um ou mais carbonos da cadeia principal do hidrocarboneto.

O termo "alquila", como usado neste relatório, isoladamente ouem combinação refere-se a um grupo alifático ramificado ou não-ramificadosaturado. Exemplos representativos de grupos alquila incluem, mas sem selimitar aos mesmos, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, sec-butila, terc-butila, octila, decila, tetradecila, hexadecila, eicosila, tetracosila esimilares.

Ό termo "alquenila", como usado neste relatório, isoladamenteou em combinação refere-se a um grupo alifático ramificado ou não-ramificado insaturado que contém pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono que poderá ocorrer em qualquer ponto estável ao longo da cadeia.Exemplos representativos de grupos alquenila incluem, mas sem se limitaraos mesmos, etenila, E- e Z-pentenila, decenila e similares.

O termo "alquinila", como usado neste relatório, isoladamente ouem combinação refere-se a um grupo alifático ramificado ou não-ramificadoinsaturado que contém pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono quepoderá ocorrer em qualquer ponto estável ao longo da cadeia. Exemplosrepresentativos de grupos alquinila incluem, mas sem se limitar aos mes-mos, etinila, propinila, propargila, butinila, hexinila, decinila e similares.

O termo "análogo", quando usado no contexto de um peptídeoou polipeptídeo, significa um peptídeo ou polipeptídeo que compreende umou mais aminoácidos não-padrões ou outras variações estruturais do conjun-to convencional de aminoácidos.

O termo "anticorpo", como usado neste relatório, significa umanticorpo de classes IgG, IgM, IgA, IgD ou IgE, ou fragmentos ou derivadosdestas, incluindo Fab, F(ab')2, Fd e anticorpos, diacorpos, anticorpos biespe-cíficos, anticorpos bifuncionais e derivados destes de cadeia única. O anti-corpo poderá ser um anticorpo monoclonal, anticorpo policlonal, anticorpopurificado por afinidade ou misturas dos mesmos que exibem suficiente es-pecificidade de ligação com um epítopo desejado ou uma seqüência deriva-da deste. O anticorpo poderá também ser um anticorpo quimera. O anticorpopoderá ser derivatizado pela ligação de uma ou mais porções químicas, pep-tídicas ou polipeptídicas conhecidas no estado da técnica. O anticorpo pode-rá ser conjugado com uma porção química.

O termo "apoptose", como usado neste relatório, refere-se auma forma de morte celular que inclui contração progressiva de volume celu-lar com a preservação da integridade de organelas citoplasmáticas; conden-sação de cromatina (isto é, condensação nuclear), como observado por meiode microscópio óptico ou eletrônico; e/ou clivagem de DNA em fragmentosdimensionados como nucleossomos, conforme determinado por ensaios desedimentação centrifugada. Morte celular ocorre quando a integridade damembrana da célula é perdida (por exemplo, formação de vesículas namembrana) com engolfamento de fragmentos celulares intactos ("corposapoptóticos") por células fagocíticas.

O termo "câncer", como usado neste relatório, significa qualquercondição caracterizada por resistência a estímulos apoptóticos.

O termo "tratamento de câncer", como usado neste relatório,significa qualquer tratamento para câncer conhecido no estado da técnica,incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, quimioterapia e terapia com radi-ação.

O termo "combinação com", quando usado para descrever ad-ministração de um agente que induz atividade de NF-κΒ e um tratamentoadicional, significa que o agente poderá ser administrado antes de, junta-mente com ou após o tratamento adicional, ou uma combinação destes.

O termo "derivado", quando usado no contexto de um peptídeoou polipeptídeo, significa um peptídeo ou polipeptídeo diferente de outro naestrutura primária (aminoácidos e análogos de aminoácidos). À guisa de ilus-tração, derivados poderão diferir ao serem glicosilados, uma forma de modi-ficação pós-tradução. Por exemplo, peptídeos ou polipeptídeos poderão exi-bir padrões de glicosilação devido a expressão em sistemas heterólogos. Sepelo menos uma atividade biológica é retida, por conseguinte esses peptí-deos ou polipeptídeos são derivados de acordo com a invenção. Outros de-rivados incluem, mas sem se limitar aos mesmos, peptídeos de fusão oupolipeptídeos de fusão que apresentam um término N ou C covalentementemodificado, peptídeos ou polipeptídeos PEGilados, peptídeos ou polipeptí-deos associados a porções lipídicas, peptídeos ou polipeptídeos alquilados,peptídeos ou polipeptídeos ligados via um grupo funcional com cadeia lateralaminoácido a outros peptídeos, polipeptídeos ou compostos químicos, emodificações adicionais como seria entendido no estado da técnica.

O termo "fragmento", quando usado no contexto de um peptídeoou polipeptídeo, poderá significar um peptídeo de cerca de 6 a cerca de 10aminoácidos de comprimento. O fragmento poderá ser de 6, 7, 8, 9 ou 10aminoácidos de comprimento.

O termo "homólogo", quando usado no contexto de um peptídeoou polipeptídeo, significa um peptídeo ou polipeptídeo que compartilha umancestral evolucionário comum.

O termo "saturado", como usado neste relatório, refere-se a umgrupo em que todas as ligações com valências disponíveis dos átomos dacadeia principal ligam-se a outros átomos.

O termo "substituído", como usado neste relatório, refere-se aum grupo que apresenta um ou mais hidrogênios ou outros átomos removi-dos de um carbono e substituídos por um grupo adicional. Grupos substituí-dos neste relatório poderão ser substituídos por um a cinco, ou um a trêssubstituintes. Exemplos representativos de tais substituintes incluem, massem se limitar aos mesmos, grupos alifáticos, grupos aromáticos, alquila,alquenila, alquinila, arila, alcóxi, halo, arilóxi, carbonila, acrila, ciano, amino,nitro, grupos que contêm fosfato, grupos que contêm enxofre, hidroxila, al-quilcarbonilóxi, arilcarbonilóxi, alcoxicarbonilóxi, áriloxicarbonilóxi, alquilcar-bonila, arilcarbonila, alcoxicarbonila, aminocarbonila, alquilaminocarbonila,dialquilaminocarbonila, alquiltiocarbonila, acilamino, amidino, imino, alquiltio,ariltio, tiocarboxilato, alquilsulfinila, trifluormetila, azido, heterociclila, alquilari-la1 heteroarila, semicarbazido, tio-semicarbazido, maleimido, oximino, imida-to, cicloalquila, cicloalquilcarbonila, dialquilamino, arilcicloalquila, arilcarboni-la, arilalquilcarbonila, arilcicloalquilcarbonila, arilfosfinila, arilalquilfosfinila,arilcicloalquilfosfinila, arilfosfonila, arilalquilfosfonila, arilcicloalquilfosfonila,arilsulfonila, arilalquilsulfonila, arilcicloalquilsulfonila, combinações destes esubstituições nos mesmos.

O termo "tratar" ou "tratamento", quando se referindo a proteçãode um mamífero de uma condição, significa prevenção, supressão, repres-são ou eliminação da condição. Prevenção da condição envolve administraruma composição desta invenção a um mamífero antes de início da condição.Supressão da condição envolve administrar uma composição desta invençãoa um mamífero após indução da condição, mas antes de seu aparecimentoclínico. Repressão da condição envolve administrar uma composição destainvenção a um mamífero após aparecimento clínico da condição tal que acondição seja reduzida ou mantida. Eliminação da condição envolve admi-nistrar uma composição desta invenção a um mamífero após aparecimentoclínico da condição tal que o mamífero não mais sofra da condição.

O termo "célula tumoral", como usado neste relatório, significaqualquer célula caracterizada por resistência a estímulos apoptóticos.

O termo "insaturado", como usado neste relatório, refere-se aum grupo em que pelo menos uma ligação de dois átomos adjacentes comvalência disponível da cadeia principal não se ligue a outros átomos.

O termo "não-substituído", como usado neste relatório, refere-sea um grupo que não apresenta quaisquer grupos adicionais ligados a ele ousubstituídos nele.

O termo "variante", quando usado no contexto de um peptídeoou polipeptídeo, significa um peptídeo ou polipeptídeo que difere em se-qüência de aminoácidos pela inserção, supressão ou substituição conserva-tiva de aminoácidos, mas retém pelo menos uma atividade biológica. Parafins desta invenção, "atividade biológica" inclui, mas sem se limitar a mesma,à capacidade de ser ligado por um anticorpo específico. Uma substituiçãoconservativa de um aminoácido, isto é, substituição de um aminoácido porum aminoácido diferente de propriedades similares (por exemplo, hidrofilici-dade, grau e distribuição de regiões carregadas) é reconhecida no estado datécnica como tipicamente envolvendo alterações em quantidade menor. Es-sas alterações em quantidade menor podem ser identificadas, em parte,considerando o índice hidropático de aminoácidos, como entendido no esta-do da técnica (Kyte e outros, J. Moi Biol. 157:105-132, 1982). O índice hi-dropático de um aminoácido baseia-se em uma consideração de sua hidro-fobicidade e carga.-Sabe-se no estado da técnica que aminoácidos de índi-ces hidropáticos similares podem ser substituídos e todavia reter função protéica.

Em um aspecto, aminoácidos que apresentam índices hidropáticos de±2 são substituídos. A hidrofilicidade de aminoácidos pode também ser usa-da para revelar substituições que resultariam em proteínas que retêm funçãobiológica. Uma consideração da hidrofilicidade de aminoácidos no contextode um peptídeo permite cálculo da maior hidrofilicidade média local dessepeptídeo, uma medida útil que é relatada correlacionar-se bem com antige-nicidade e imunogenicidade. Patente Estados Unidos No. 4.554.101, incor-porada aqui como referência. Substituição de aminoácidos que apresentamvalores de hidrofilicidade similares pode resultar em peptídeos que retêmatividade biológica, por exemplo imunogenicidade, como é entendido no es-tado da técnica. Em um aspecto, substituições são realizadas com aminoá-cidos que apresentam valores de hidrofilicidade de ±2 entre si. Tanto o índi-ce de hidrofobicidade quanto o valor de hidrofilicidade de aminoácidos sãoinfluenciados pela cadeia lateral particular desse aminoácido. Consistentecom essa observação, substituições de aminoácidos que são compatíveiscom função biológica são entendidas depender da similaridade relativa dosaminoácidos e particularmente das cadeias laterais desses aminoácidos,conforme revelado pela hidrofobicidade, hidrofilicidade, carga, tamanho eoutras propriedades.

2. Lipopeptídeos

Um lipopeptídeo poderá ser usado como agente para induzir ati-vidade de NF-κΒ. Lipopeptídeos são parte das membranas externas de bac-térias gram-negativas, bactérias gram-positivas e micoplasma. Lipopeptí-deos bacterianos não apresentam homologia de seqüências compartilhadas,mas se caracterizam pelo aminoácido incomum com término N S-(2,3-diidroxipropil)-L-cisteína que é acilado por dois ou três ácidos graxos. Lipo-peptídeos bacterianos são fortes imunomoduladores que ativam respostasprecoces do hospedeiro após infecção mediante sinalização por meio deheterodímeros TLR2-TLR1 ou TLR2-TLR6, levando à ativação de NF-κΒ eprodução de citocina. Análogos sintéticos dos lipopeptídeos com término Nde lipopeptídeos naturais são potentes ativadores de TLRs e NF-κΒ, bemcomo são ímunoadjuvantes in vivoe in vitro.

O lipopeptídeo poderá ser um composto de fórmula:

<formula>formula see original document page 16</formula>

em que

R1 representa H ou -CO-R4,

R2, R3 e R4 independentemente são H ou alifático opcionalmentesubstituído;

X é H ou um peptídeo; e

Z é S ou CH2.

0 lipopeptídeo poderá compreender dois ou três ácidos graxos.

Os substituintes alifáticos de R2, R3 e R4 poderão compreender de 6 a 20átomos de carbono. R2, R3 e R4 poderão ser C6-C20 alquila, C6-C20 alquenilaou C6-C20 alquinila. Exemplos representativos de substituintes alquila em R2,

R3 e R4 incluem C6, C8, C9, Ci0, Ci2, Ci4 e Ci6. Exemplos representativos desubstituintes alquenila em R2, R3 e R4 incluem Ci0:id1 trans, Ci8:iD9 e Ci8:2D9, 12.

O peptídeo poderá compreender entre pelo menos 4 ou 5 ami-noácidos e não mais de 20, 30 ou 40 aminoácidos. A porção peptídeo podeser essencial para atividade e a atividade do lipopeptídeo poderá ser modu-lada pela seqüência de aminoácidos, mas atividade biológica poderá ser in-sensível à maioria das seqüências de peptídeos (Spohn e outros, Vaccine,22(19):2494-9, 2004). O peptídeo pode compreender uma seqüência apre-sentada na Tabela 1, qualquer seqüência pelo menos 80%, 85%, 90% ou95% idêntica a ela, ou qualquer análogo, derivado, fragmento, homólogo,variante ou substituição da mesma. O peptídeo poderá transportar uma car-ga líquida negativa.

Tabela 1

<table>table see original document page 17</column></row><table><table>table see original document page 18</column></row><table><table>table see original document page 19</column></row><table>

Os primeiros quatro a cinco aminoácidos da porção peptídeo deum lipopeptídeo poderão ser selecionados daqueles listados para cada posi-ção na Tabela 2. Essa tabela baseia-se em Spohn e outros, Vaccine,22(19):2494-9, 2004; e Reutter e outros, J. Peptide Res., 65, 375-383, 2005.

Tabela 2

<table>table see original document page 19</column></row><table>

O lipopeptídeo poderá ser um estereoisômero RR ou RS, oumistura destes, com relação à estereoquímica do lipoaminoácido com térmi-no Ν. O lipopeptídeo poderá ser solúvel em água.

3. Tratamento de Tensão

Um agente que induz atividade de NF-κΒ poderá ser usado paraproteger células normais de condições ou tratamentos que causam tensãocelular, disparando desse modo apoptose. Exemplos representativos decondições ou tratamentos incluem tratamentos de câncer, por exemplo tera-pia com radiação ou quimioterapia; choque de temperatura; exposição a do-ses nocivas de radiação, por exemplo operários em usinas de energia nu-clear, a indústria de defesa ou produção radiofarmacêutica, ou soldados;envelhecimento celular; ferimento; envenenamento; e infecção.

O agente poderá ser administrado simultânea ou metronomica-mente com outros tratamentos. O termo "simultâneo" ou "simultaneamente",como usado neste relatório, significa que o agente e outro tratamento sejamadministrados dentro de 48 horas, preferencialmente 24 horas, mais prefe-rencialmente 12 horas, ainda mais preferencialmente 6 horas, e bem maispreferencialmente 3 horas ou menos, um do outro. O termo "metronomica-mente", como usado neste relatório, significa a administração do agente emtempos diferentes do outro tratamento e sob uma certa freqüência relativapara repetir a administração.

O agente poderá ser administrado em qualquer ponto antes deexposição à tensão, incluindo, mas sem se limitar às mesmas, cerca de48 h, 46 h, 44 h, 42 h, 40 h, 38 h, 36 h, 34 h, 32 h, 30 h, 28 h, 26 h, 24 h,22 h, 20 h, 18 h, 16 h, 14 h, 12 h, 10 h, 8 h, 6 h, 4 h, 3 h, 2 h ou 1 h antes deexposição. O agente poderá ser administrado em qualquer ponto após expo-sição à tensão, incluindo, mas sem se limitar às mesmas, cerca de 1 h, 2 h,3 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 26 h, 28 h,30 h, 32 h, 34 h, 36 h, 38 h, 40 h, 42 h, 44 h, 46 h ou 48 h após exposição.

a. Câncer de NF-κΒ Constitutivamente Ativo

A condição poderá ser um câncer de NF-κΒ constitutivamenteativo. O agente que induz atividade de NF-κΒ poderá ser administrado emcombinação com um tratamento de câncer, tal como quimioterapia ou tera-pia com radiação.

O tratamento de câncer poderá compreender administração deum agente citotóxico ou agente citostático, ou combinação destes. Agentescitotóxicos impedem que células cancerosas se multipliquem mediante: (1)interferência na capacidade da célula em replicar DNA e (2) indução de mor-te celular e/ou apoptose nas células cancerosas. Agentes citostáticos atuamvia modulação, interferência ou inibição dos processos de transdução desinais celulares que regulam proliferação celular.

Classes de compostos que poderão ser usados como agentescitotóxicos incluem o seguinte: agentes de alquilação (incluindo, sem limita-ção, nitrogênio mostardas, derivados de etilenimina, alquil sulfonatos, nitro-souréias e triazenos): uracil mostarda, clormetina, ciclofosfamida (Cyto-xan®), ifosfamida, melfalano, clorambucil, pipobromano, trietileno-melamina,trietilenotiofosforamina, bussulfano, carmustina, lomustina, estreptozocina,dacarbazina e temozolomida; antimetabólitos (incluindo, sem limitação, an-tagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e ini-bidores de adenosino desaminase): metotrexato, 5-fluoruracil, floxuridina,citarabina, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, fosfato de fludarabina, pentosta-tina e gemcitabina; produtos naturais e seus derivados (por exemplo, vincaalcalóides, antibióticos antitumor, enzimas, Iinfocinas e epipodofilotoxinas):vinblastina, vincristina, vindesina, bleomicina, dactinomicina, daunorubicina,doxorubicina, epirubicina, idarubicina, ara-c, paclitaxel (paclitaxel é comerci-almente disponível como Taxo®), mitamicina, desoxico-formicina, mitomici-na-c, l-asparaginase, interferons (preferencialmente IFN-α), etoposida e te-niposida.

Outros agentes citotóxicos proliferativos são navelbene, CPT-11,anastrazol, letrazol, capecitabina, reloxafina, ciclofosfamida, ifosamida e dro-loxafina.

Agentes que afetam microtúbulos interferem em mitose celular esão bem-conhecidos no estado da técnica por sua atividade citotóxica. A-gentes que afetam microtúbulos que poderão ser usados incluem, mas semse limitar aos mesmos, alocolchicina (NSC 406042), halicondrina B (NSC609395), colchicina (NSC 757), derivados de colchicina (por exemplo, NSC33410), dolastatina 10 (NSC 376128), maitansina (NSC 153858), rizoxina(NSC 332598), paclitaxel (TaxoJ®, NSC 125973), derivados de TaxoI® (porexemplo, derivados (por exemplo, NSC 608832), tiocolchicina NSC 361792),tritil cisteína (NSC 83265), sulfato de vinblastina (NSC 49842), sulfato devincristina (NSC 67574), epotilonas naturais e sintéticas, incluindo, mas semse limitar aos mesmos, epotilona A, epotilona B e discodermolida (ver Servi-ce, (1996) Science, 274:2009) estramustina, nocodazol, MAP4 e similares.

Exemplos de tais agentes são também descritos in Bulinski (1997) J. CellSei. 110:3055 3064; Panda (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:10560-10564; Muhlradt (1997) CancerRes. 57:3344-3346; Nicolaou (1997) Nature387:268-272; Vasquez (1997) Moi Biol. CeH 8:973-985; e Panda (1996) J.Biol. Chem 271:29807-29812.

Também adequados são agentes citotóxicos tal como epidofilo-toxina; uma enzima antineoplástica; um inibidor de topoisomerase; procar-bazina; mitoxantrona; complexos de coordenação de platina tais como cis-platina e carboplatina; modificadores de resposta biológica; inibidores decrescimento; agentes terapêuticos anti-hormonais; leucovorina; tegafur; efatores de crescimento hematopoiético.

Agentes citostáticos que poderão ser usados incluem, mas semse limitar aos mesmos, hormônios e esteróides (incluindo análogos sintéti-cos): 17 α-etinilestradiol, dietilstilbestrol, testosterona, prednisona, fluoximes-terona, propionato de dromostanolona, testolactona, megestrolacetato, me·tilprednisolona, metil-testosterona, prednisolona, triamcinolona, hlorotriani-seno, hidroxiprogesterona, aminoglutetimida, estramustina, medroxiproges-teronacetato, leuprolida, flutamida, toremifeno e zoladex.

Outros agentes citostáticos são antiangiogênicos, tais como ini-bidores de metaloproteinase matricial, e outros inibidores de VEGF, tais co-mo anticorpos anti-VEGF, e pequenas moléculas tais como ZD6474 eSU6668 são também inclusos. Anticorpos anti-Her2 de Genentech poderãotambém ser utilizados. Um inibidor adequado de EGFR é EKB-569 (um inibi-dor irreversível). Também são inclusos anticorpo C225 imunoespecífico Im-clone para EGFR e inibidores de src.

Também adequado para uso como agente citostático Casodetâ)(bicalutamida, Astra Zeneca) que torna não-proliferativos carcinomas depen-dentes de androgênio. Ainda outro exemplo de um agente citostático é o an-tiestrogênio Tamoxiferi^ que inibe a proliferação ou crescimento de câncerde mama dependente de estrogênio. Inibidores da transdução de sinais pro-Iiferativos celulares são agentes citostáticos. Exemplos representativos in-cluem inibidores de fator de crescimento epidérmico, inibidores de Her-2,inibidores de MEK-1 quinase, inibidores de MAPK quinase, inibidores de PI3,inibidores de Src quinase e inibidores de PDGF.O tratamento de câncer poderá compreender terapia com radia-ção. A terapia com radiação poderá ser radiação com feixe externa, terapiacom radiação interna ou terapia com radiação conformai, em que um compu-tador é utilizado para perfilar o feixe de radiação para combinar com perfil dotumor. A radiação usada em terapia com radiação poderá vir de várias fontesque incluem raios X, feixe de elétrons ou raios-gama. As doses e tempos deadministração da radiação durante terapia com radiação podem variar e va-riarão dependendo do local e grau do câncer. O agente que induz atividadede NF-κΒ poderá ser administrado com um agente radioprotetor (ver seção3d) em combinação com a terapia com radiação, conforme descrito acima.

Cânceres que podem ser tratados incluem, mas sem se limitaraos mesmos, o seguinte: carcinoma, incluindo aquele da bexiga (incluindocâncer de bexiga acelerado e metastático), mama, cólon (incluindo câncercolorretal), rins, fígado, pulmão (incluindo câncer de pulmão de pequenas enão-pequenas células e adenocarcinoma de pulmão), ovário, próstata, testí-culos, trato genitourinário, sistema linfático, laringe, pâncreas (incluindo car-cinoma pancreático exócrino), boca, faringe, esôfago, estômago, intestinodelgado, cólon, reto, vesícula biliar, cerviz, tireóide e pele (incluindo carci-noma de células escamosas); tumores hematopoiéticos de linhagem linfóide,incluindo leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda,Iinfoma de células B, Iinfoma de células T, Iinfoma de Hodgkins, Iinfoma não-Hodgkins, Iinfoma de célula pilosas, Iinfoma histiocítico e Iinfoma de Bur-ketts; tumores hematopoiéticos de linhagem mielóide, incluindo Ieucemiasmielógenas agudas e crônicas, síndrome mielodisplástica, leucemia mielóidee leucemia pró-mielocítica; tumores do sistema nervoso central e periférico,incluindo astrocitoma, neuroblastoma, glioma e schwanomas; tumores deorigem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteos-sarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xenoderma pigmentoso,queratoactantoma, seminoma, câncer folicular de tireóide e teratocarcinoma.

b. Tratamento de Efeitos Colaterais de Tratamento de Câncer

A condição poderá também ser dano em tecido normal atribuívelao tratamento de um câncer de NF-κΒ constitutivamente ativo. O agente queinduz atividade de NF-κΒ poderá ser administrado em combinação com umtratamento de câncer conforme descrito acima.

c. Modulação de Envelhecimento Celular

A condição poderá também ser envelhecimento celular.

d. Radiação

A condição poderá também ser exposição a radiação. Exposiçãoa radiação ionizante (IR) pode ser de curto ou longo prazo; ela poderá seraplicada como dose única ou doses múltiplas, no corpo inteiro ou localmen-te. Assim, acidentes nucleares ou ataques militares poderão envolver expo-sição a uma única alta dose de irradiação de corpo inteiro (às vezes seguidade um envenenamento de longo prazo com isótopos radioativos). Igualmen-te, uma única dose de radiação é geralmente usada para o pré-tratamentode pacientes de transplante de medula óssea quando é necessário prepararos órgãos hematopoiéticos do hospedeiro para a medula óssea do doadormediante "limpeza" desses órgãos dos precursores sangüíneos do hospedeiro.

Em nível molecular e celular, partículas de radiação poderão le-var a bloqueio no DNA e reticulação entre DNA, proteínas, membranas celu-lares e outras estruturas macromoleculares. Radiação ionizante poderá tam-bém induzir dano secundário aos componentes celulares dando origem aradicais livres e espécies de oxigênio reativas (ROS). Sistemas de reparomúltiplos neutralizam esse dano, tais como diversos caminhos de reparo deDNA que restauram a integridade e fidelidade do DNA, e produtos químicosantioxidantes e enzimas que seqüestram os radicais livres e ROS e reduzemas proteínas e lipídeos oxidados. Sistemas de observação celular estão pre-sentes para detectar os defeitos de DNA e retardar progressão do ciclo celu-lar até o dano ser reparado ou uma decisão submeter a célula a parada decrescimento ou morte celular programada (apoptose) ser atingida.

Em nível do organismo, os efeitos imediatos de níveis baixos emoderados de radiação são grandemente causados por morte celular, o queleva a inflamação induzida por radiação. Em níveis de radiação maiores, aschamadas síndromes hematopoiéticas e gastrointestinais conduzem morteinduzida por radiação a longo prazo. A síndrome hematopoiética caracteriza-se pela perda de células hematopoiéticas e seus progenitores, tornandodesse modo impossível regenerar sangue e o sistema linfóide. Morte usual-mente ocorre como conseqüência de infecção (devido a imunossupressão),hemorragia e/ou anemia. A síndrome gastrointestinal caracteriza-se por mor-te celular maciça no epitélio intestinal, predominantemente no intestino del-gado, seguida da desintegração da parede intestinal e morte em conseqüên-cia de bacteremia e septicemia. A síndrome hematopoiética manifesta-sesob doses menores de radiação e leva a uma morte mais retardada do que asíndrome gastrointestinal. Doses muito altas de radiação podem causar mor-te quase instantânea por surgimento de degeneração neuronal.

Organismos que sobrevivem um período de toxicidade aguda deradiação poderão sofrer conseqüências a longo prazo que incluem carcino-gênese e fibrose induzidas por radiação que se desenvolvem em órgãos ex-postos (por exemplo, rins, fígado ou pulmões) meses e mesmo anos após irradiação.

Indutores de NF-κΒ possuem forte atividade pró-sobrevivênciaem nível celular e poderão ser usados para tratar os efeitos de eventos deradiação natural, exposição a baixas doses de radiação, radiação adminis-trada como parte de terapia de câncer ou acidentes nucleares. Adicional-mente, uma vez que indutores de NF-κΒ atuam por meio de mecanismosdiferentes de todos os radioprotetores presentemente conhecidos, eles po-derão ser usados em combinação com outros radioprotetores, aumentando,desse modo, dramaticamente a escala de proteção de radiação ionizante.

Historicamente, radioprotetores têm geralmente sido antioxidan-tes e seqüestrantes de radicais livres - tanto sintéticos e naturais. Mais re-centemente, citocinas e fatores de crescimento têm sido adicionados à listade radioprotetores; o mecanismo de sua radioproteção é considerado serdevido a seu efeito facilitador da regeneração de tecidos sensíveis. Não hádistinção funcional clara entre os dois grupos de radioprotetores, contudo,uma vez que algumas citocinas induzem a expressão das proteínas antioxi-dantes celulares, tais como superóxido de manganês dismutase (MnSOD) emetalotioneína, seu uso poderá ser vantajoso.

Os radioprotetores poderão ser qualquer agente que trata osefeitos de exposição a radiação, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos,antioxidantes, seqüestrantes de radicais livres, citocinas, flagelina e TGFplatente. Antioxidantes e seqüestrantes de radicais livres que poderão serusados incluem, mas sem se limitar aos mesmos, tios, tais como cisteína,cisteamina, glutationa e bilirrubina; amifostina (WR-2721); vitamina A; vita-mina C; vitamina E; e flavonóides tais como manjericão sagrado dos índios(Ocimum sanctum), orientina e vicenina. Citocinas e fatores de crescimentoconferem radioproteção mediante restauração e/ou proteção das populaçõesde células-tronco radiossensíveis. Citocinas que poderão ser usadas incluemfator de células-tronco (SCF, Iigante de kit c), Iigante de Flt-3, fragmento IL-1b-rd de interleucina-1 e fator de crescimento de queratinócitos (KGF). Di-versos outros fatores, embora não citocinas por natureza, estimulam a proli-feração dos imunócitos e, assim, poderão ser usados. Estes incluem, 5-AED(5-androstenodiol), que é um esteróide que estimula a expressão de citoci-nas, e compostos sintéticos, tal como tri-cloro(dioxoetileno-0,0'-)telurato deamônio (AS-101). TGFp latente, flagelina e derivados de flagelina são fortesindutores de atividade de NF-κΒ como sabido in Pedidos Internacionais dePatente Nos. PCT/US2004/040656 e PCT/US2004/040753, e Pedido de Pa-tente Estados Unidos No. 60/693.826, cujos conteúdos são incorporadosaqui como referência.

4. Composição

Proporcionadas aqui também são composições que compreen-dem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um indutor de NF-κΒ. Acomposição poderá ser uma composição farmacêutica, que poderá ser pro-duzida utilizando métodos bem-conhecidos no estado da técnica. Como des-crito acima, a composição que compreende um indutor de NF-κΒ poderá seradministrada a um mamífero para o tratamento de condições associadas aapoptose que incluem, mas sem se limitar aos mesmos, exposição a radia-ção, efeito colateral de tratamentos de câncer, tensão e envelhecimento ce-lular. A composição poderá também compreender agentes adicionais queincluem, mas sem se limitar aos mesmos, um radioprotetor ou um fármacoquimioterápico.

a. Administração

Composições proporcionadas por esta invenção poderão seradministradas sob qualquer maneira, incluindo, mas sem se limitar aosmesmos, oralmente, parenteralmente, sublingualmente, transdermicamente,retalmente, transmucosamente, topicamente, via inalação, via administraçãobucal ou combinações dessas vias de administração. Administração parente-ral inclui, mas sem se limitar aos mesmos, administração intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, intrapial e intra-articular.Para uso veterinário, a composição poderá ser administrada como uma for-mulação adequadamente aceitável de acordo com prática veterinária normal.O veterinário pode imediatamente determinar o regime de dosagem e via deadministração que seja a mais apropriada para um animal particular.

b. Formulação

Composições proporcionadas aqui poderão ser na forma decomprimidos ou losangos formulados de maneira convencional. Por exem-plo, comprimidos e cápsulas para administração oral poderão conter excipi-entes convencionais que incluem, mas sem se limitar aos mesmos, agentesde ligação, cargas, lubrificantes, agentes de desintegração e agentes deumectação. Agentes de ligação incluem, mas sem se limitar aos mesmos,xarope, acácia, gelatina, sorbitol, tragacanto, mucilagem de amidoe polivinil-pirrolidona. Cargas incluem, mas sem se limitar aos mesmos, lactose, açú-car, celulose microcristalina, amido de milho, fosfato de cálcio e sorbitol. Lu-brificantes incluem, mas sem se limitar aos mesmos, estearato de magnésio,ácido esteárico, talco, polietilenoglicol e sílica. Agentes de desintegraçãoincluem, mas sem se limitar aos mesmos, amido de batata e amido glicolatode sódio. Agentes de umectação incluem, mas sem se limitar aos mesmos,Iauril sulfato de sódio. Comprimidos poderão ser revestidos de acordo commétodos bem conhecidos no estado da técnica.

Composições proporcionadas nesta invenção poderão tambémser formulações líquidas que incluem, mas sem se limitar aos mesmos, sus-pensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes e elixires. Ascomposições poderão também ser formuladas como um produto seco paraconstituição com água ou outro veículo adequado antes de uso. Tais prepa-rações líquidas poderão conter aditivos que incluem, mas sem se limitar aosmesmos, agentes de suspensão, agentes de emulsificação, veículos não-aquosos e conservantes. Agentes de suspensão incluem, mas sem se limitaraos mesmos, xarope de sorbitol, metilcelulose, xarope de glicose/açúcar,gelatina, hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose, gel de estearato de alumí-nio e gorduras hidrogenadas cosmetíveis. Agentes de emulsificação incluem,mas sem se limitar aos mesmos, lecitina, monooleato de sorbitano e acácia.

Veículos não-aquosos incluem, mas sem se limitar aos mesmos, óleos cos-metíveis, óleo de amêndoa, óleo de coco fracionado, ésteres oleosos, propi-Ienoglicol e álcool etílico. Conservantes incluem, mas sem se limitar aosmesmos, p-hidroxibenzoato de metila ou de propila e ácido sórbico.

Composições proporcionadas aqui poderão também ser formu-ladas como supositórios, que poderão conter bases para supositórios queincluem, mas sem se limitar aos mesmos, manteiga de cacau ou glicerídeos.

Composições proporcionadas nesta invenção poderão também ser formula-das para inalação, as quais poderão ser em uma forma que inclui, mas semse limitar aos mesmos, uma solução, suspensão ou emulsão que poderãoser administradas como um pó seco ou na forma de um aerossol usando umpropelente, tal como diclorodifluormetano ou triclorofluormetano. Composi-ções proporcionadas aqui poderão também ser formuladas como formula-ções transdérmicas que compreendem veículos aquosos ou não-aquososque incluem, mas sem se limitar aos mesmos, cremes, pomadas, loções,pastas, emplastro medicado, adesivo ou membrana.

Composições proporcionadas aqui poderão também ser formu-ladas para administração parenteral, incluindo, mas sem se limitar aos mes-mos, injeção ou infusão contínua. Formulações para injeção poderão ser naforma de suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquo-sos, e poderão conter agentes de formulação que incluem, mas sem se limi-tar aos mesmos, agentes de suspensão, de estabilização e dispersão. Acomposição poderá também ser proporcionada em forma de pó para recons-tituição com um veículo adequado, incluindo, mas sem se limitar aos mes-mos, água estéril sem pirogênio.

Composições proporcionadas aqui poderão também ser formu-ladas como uma preparação de depósito que poderá ser administrada medi-ante implantação ou injeção intramuscular. As composições poderão serformuladas com materiais poliméricos ou hidrófobos adequados (como umaemulsão em um óleo aceitável, por exemplo), resinas de troca iônica ou co-mo derivados moderadamente solúvel (como um sal moderadamente solú-vel, por exemplo).

c. Dosagem

Uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente exigido parauso em terapia varia com a natureza da condição que é tratada, a extensãode tempo em que indução de atividade NF-κΒ é desejada e a idade e a con-dição do paciente, e é por fim determinada pelo médico assistente. Em geral,entretanto, doses empregadas para tratamento de um ser humano adultotipicamente situam-se na faixa de 0,001 mg/kg a cerca de 200 mg/kg por dia.

A dose poderá ser de cerca de 1 Dg/kg a cerca de 100 Dg/kg por dia. A dosedesejada poderá ser convenientemente administrada em uma única dose, oucomo doses múltiplas administradas em intervalos apropriados, por exemplocomo duas, três, quatro ou mais sub-doses por dia. Doses múltiplas freqüen-temente desejadas ou exigidas, porque atividade de NF-DB em células nor-mais poderá ser diminuída uma vez que o agente não seja mais administrado.

A dosagem de um indutor de NF-κΒ poderá ser qualquer dosa-gem, incluindo, mas sem se limitar as mesmas, cerca de 1 μg/kg, 25 μg/kg,50 μg/kg, 75 μg/kg, 100 μg/kg, 125μg/kg, 150μg/kg) 175μg/kg, 200 μg/kg,225 μg/kg, 250 μg/kg, 275 μg/kg, 300 μg/kg, 325^g/kg, 350μg/kg,375 μg/kg, 400 μg/kg, 425 fig/kg, 450 μg/kg, 475 μg/kg, 500 μg/kg,525 μg/kg, 550 μg/kg, 575 μg/kg, 600μg/kg, 625 μg/kg, 650 μg/kg,675 μg/kg, 700 jig/kg, 725 μg/kg, 750 μg/kg, 775 μg/kg, 800 μg/kg)825 μg/kg, 850 μg/kg, 875 μg/kg, 900 μg/kg, 925 μg/kg, 950 μg/kg, 975 μg/kgou 1 μςι/kg.

5. Seleção de Métodos

O método proporcionado aqui também se refere a métodos deidentificação de agentes que induzem atividade de NF-κΒ. Um agente queinduz atividade de NF-κΒ poderá ser identificado por um método que com-preende adicionar um indutor suspeito de atividade de NF-κΒ em um siste-ma de expressão ativado por NF-κΒ, comparando o nível de expressão ati-vada por NF-κΒ com um controle, por meio do que um indutor de atividadede NF-κΒ é identificado pela capacidade de aumentar o nível de sistema deexpressão ativado por NF-κΒ.

Agentes candidatos poderão estar presentes em uma biblioteca(isto é, uma coleção de compostos). Tais agentes poderão, por exemplo, sercodificados por moléculas de DNA em uma biblioteca de expressão. Agentescandidatos poderão estar presentes em meios condicionados ou em extratoscelulares. Outros desses agentes incluem compostos conhecidos no estadoda técnica como "moléculas pequenas", que apresentam pesos molecularesmenores que 105 dáltons, preferencialmente menores que 104 dáltons, e a-inda mais preferencialmente menores que 103 dáltons. Tais agentes candi-datos poderão ser proporcionados como membros de uma biblioteca combi-natória, que inclui agentes sintéticos (por exemplo, peptídeos) preparados deacordo com reações químicas múltiplas predeterminadas. Aqueles versadosno estado da técnica entenderão que diversos agrupamentos dessas biblio-tecas poderão ser preparados de acordo com procedimentos estabelecidos,e membros de uma biblioteca de agentes candidatos podem ser simultâneaou seqüencialmente selecionados como descrito neste relatório.

A seleção de métodos poderá ser realizada em vários formatos,incluindo ensaios in vitro, baseado em células e in vivo. Quaisquer célulaspoderão ser usadas em ensaios baseados em células. Preferencialmente,células que poderão ser usadas incluem células de mamíferos, mais prefe-rencialmente células de primatas humanos e não-humanos. Seleção à basede células poderá ser realizada usando células tumorais geneticamente mo-dificadas que expressam marcadores substitutos para ativação de NF-κΒ.Tais marcadores incluem, mas sem se limitar aos mesmos, β-galactosidasebacteriana, Iuciferase e proteína fluorescente com alto grau de verde(EGFP). A quantidade de expressão do marcador substituto poderá ser me-dida utilizando técnicas padrões no estado da técnica, incluindo, mas sem selimitar às mesmas, colorimetria, Iuminometria e fluorimetria.

ccs As condições sob as quais um modulador suspeito é adicionadoa uma célula, tal como mistura, são condições em que a célula pode sofrerapoptose ou sinalização se essencialmente nenhum outro composto regula-dor está presente que pudesse interferir em apoptose ou sinalização. Condi-ções eficazes incluem, mas sem se limitar aos mesmos, meio apropriado,temperatura, pH e condições de oxigênio que permitam crescimento celular.

Um meio apropriado é tipicamente um meio sólido ou líquido que compreen-de fatores de crescimento e fontes assimiláveis de carbono, nitrogênio e fos-fato, bem como sais, minerais, metais e outros nutrientes apropriados, taiscomo vitaminas, e inclui um meio eficaz em que a célula pode ser cultivadatal que essa célula possa exibir apoptose ou sinalização. Por exemplo, parauma célula de mamífero, o meio poderá compreender meio de Eagle modifi-cado da Dulbecco contendo soro fetal de bezerro a 10%.

Células poderão ser cultivadas em uma variedade de recipien-tes, incluindo, mas sem se limitar aos mesmos, frascos de cultura de tecidos,tubos de ensaio, placas de micro-título e placas de Petri. Cultura é realizadaa uma temperatura, pH e teor de dióxido de carbono apropriados para a cé-lula. Tais condições de cultura estão também dentro da capacidade do esta-do da técnica.

Métodos para adicionar um modulador suspeito à célula incluemeletroporação, microinjeção, expressão celular (isto é, usando um sistemade expressão que inclui moléculas de ácidos nucléicos desprotegidas, vírusrecombinantes, vetores de expressão de retrovírus e expressão de adenoví-rus), uso de agentes de emparelhamento de íons e uso de detergentes parapermeabilização celular.

Esta invenção possui múltiplos aspectos, ilustrados pelos exem-plos seguintes não-limitativos.Exemplo 1

Deficiência de p53 Acelera Desenvolvimento da Síndrome Gl em Camundonqos

A causa primária de morte em conseqüência de radiação ioni-zante (IR) de mamíferos depende da dose de radiação. Sob doses de até 9-10 Gy, camundongos morrem de 12-20 dias depois, principalmente de de-pleção letal da medula óssea, isto é, a síndrome hematopoiética (HP). Sobessa dose, camundongos irradiados podem ser resgatados de Ietalidade portransplante de medula óssea. Animais que receberam >13-15 Gy morrementre 7-12 dias após tratamento (antes que síndrome hematopoiética pu-desse matá-los) de complicações de dano ao intestino delgado, isto é, a sín-drome gastrointestinal (Gl). Sabe-se bem que a proliferação celular das célu-las epiteliais do intestino delgado limita-se às criptas em que células-tronco eprogenitores de proliferação precoces localizam-se. Após um par de divisõescelulares, descendentes já diferenciados de células-tronco crípticas deslo-cam-se para as vilosidades a serem irradiadas na extremidade vilosa. Nointestino delgado do camundongo, a "viagem" inteira da célula (isto é, docompartimento proliferativo à extremidade da vilosidade) normalmente levaentre 3 e 5 dias. Embora reação do intestino delgado a radiação-gama tenhasido bem examinada em um nível patomorfológico, a causa exata de Ietali-dade Gl, incluindo o evento primário, ainda permanece obscura. Morte pode-rá ocorrer como conseqüência direta do dano às células epiteliais crípticas,seguido de desnudação das vilosidades que levam a desequilíbrio de fluidoe eletrólito, bacteremia e endotoxemia. Além de inflamação e respostas es-tromático, disfunções endoteliais parecem ser importantes fatores que con-tribuem para letalidade.

Em ambas as síndromes HP e Gl1 dano letal a tecido resulta deapoptose maciça dependente de p53. Adicionalmente, tem sido mostradoque perda de cabelo dependente de p53 (alopécia) ocorre como resultadode quimioterapia experimental ou radiação. Assim, parece que p53 poderiadesempenhar um papel na sensibilização de células a tensão genotóxica.

Para examinar o papel de p53 em morte induzida por radiação,camundongos foram tratados com o inibidor de p53 de pequenas moléculas,pifitrina-alfa (PFTa) (Komarov e outros, Science 285:1733-7, 1999) imedia-tamente antes de irradiação-gama. Camundongos C57BI/6J (machos de 6-8semanas foram usados aqui e abaixo, se não indicado de outra maneira)foram injetados intraperitonealmente com 10 mg/kg de PFTa e em seguidairradiados usando uma fonte de 137Césio Shepherd 4000 Ci sob uma taxa dedoses de 4 Gy por minuto. Camundongos protegidos com PFTa de uma úni-ca dose de 9 Gy de radiação-gama ou uma dose radiação cumulativa fracio-nada de 12,5 Gy (5 χ 2,5 Gy). Em contraste, PFTa não teve efeito na sobre-vivência de camundongos tratados com altas doses únicas, isto é, 12,5 ou25 Gy, de IR (Figura 1a).

Para examinar adicionalmente o papel de p53 na síndrome Gl,camundongos do tipo selvagem e deficientes de p53 foram expostos a bai-xas (10 Gy) e altas (15 Gy) doses de radiação-gama. Como mostrado naFigura 1b, camundongos deficientes de p53 foram resistentes a baixas do-ses de radiação que mataram pela síndrome HP, mas muito mais sensíveisa doses mais altas de radiação que mataram pela síndrome Gl. Seções pa-rafinadas coradas com hematoxilino-eosina do intestino delgado de camun-dongos do tipo selvagem e p53 nulo em 0, 24, 48, 72 e 96 h após uma dosede 15 Gy dose de radiação-gama são mostradas na Figura 1d. Os camun-dongos deficientes de p53 exibiram dano acelerado em células epiteliais.

Coração TUNEL nas criptas (em 24 h) revelaram que apoptose foi evidenteem tipo selvagem, mas não em epitélio deficiente de p53. Para examinarisso adicionalmente, camundongos do tipo selvagem foram expostos a 11Gy de irradiação de corpo inteiro e, em seguida, 12 h depois, injetados com1,5 χ 107 células de medula óssea de camundongos C57BI/6J isogenéticosdo tipo selvagem ou p53 nulo. (Essa dose de radiação causou 100% de Ieta-Iidade em camundongos de controle não-reconstituídos). Dois meses depois,após recuperação completa de hematopoiese, os dois grupos de animais foram tratados com 15 Gy de radiação-gama em todo o corpo. Como mos-trado na Figura 1c, não houve diferença nas taxas de morte entre os camun-dongos dos dois grupos que diferiram no status de p53 de sua medula óssea(ambos tinham células intestinais do tipo selvagem).

A dinâmica de proliferação celular e sobrevivência celular foi a-dicionalmente examinada no intestino delgado de camundongos do tipo sel-vagem e p53 nulo. Camundongos do tipo selvagem e p53 nulo de quatrosemanas foram injetados intraperitonealmente com 14Otimidina (10 μΟϊ poranimal) e em seguida metade de cada grupo foi exposto a 15 Gy de radia-ção-gama. Auto-radiografia de seções de corpo inteiro revelaram que após24 h, as células nas criptas intestinais de camundongos deficientes de p53continuaram a proliferar, considerando que aquelas nos camundongos dotipo selvagem mostraram-se inativas (Figura 2a, esquerda). Camundongosdo tipo selvagem e p53 nulo de quatro semanas foram tratados com 15 Gyde radiação-gama, e 2 h antes de serem sacrificados foram injetados comBrdU (50 mg/kg) e os intestinos imunocorados. Em 24 h após irradiação,houve muitas células proliferativas nos camundongos p53 nulo, mas poucasnos camundongos do tipo selvagem. Em contraste, em 96 h, houve poucascélulas proliferativas nos camundongos p53 nulo, considerando que os ca-mundongos do tipo selvagem apresentaram mais células marcadas.

Para caracterizar isso adicionalmente, o número de células posi-tivas a BrdU foram contadas no intestino delgado de camundongos do tiposelvagem e p53 nulo em diferentes pontos de tempo após 15 Gy de radia-ção-gama. Três animais foram analisados em relação a cada ponto de tem-po, cinco seções transversais ilíacâs foram preparadas a partir de cada ani-mal e analisadas microscopicamente para estimar o número de criptas e vi-losidades. Números de células positivas a BrdU nas criptas foram contadosem cinco campos aleatórios sob ampliação de 200x (100-300 criptas) e onúmero médio de células positivas a BrdU foi traçado (Figura 2b). O númerode células positivas a BrdUno camundongos p53 nulo atingiu pico em 10 h eem seguida declinou, considerando que o número de células positivas a Br-dU em camundongos do tipo selvagem declinou durante as primeiras 20 h eem seguida aumentou. A localização de células marcadas com BrdU foi tra-çada no intestino delgado de camundongos do tipo selvagem e p53 nulo emdiferentes pontos de tempo após 15 Gy de radiação-gama. BrdU foi injetado30 min antes de irradiação e camundongos foram sacrificados em 0, 48, 72 e96 h. Em camundongos p53 nulo, não houve migração acelerada de célulasmarcadas com BrdU das criptas às vilosidades (compare tipo selvagem ep53 nulo em 48 h), seguido de rápida eliminação das células marcadas emcamundongos p53 nulo (Figura 2c).

Assim, proliferação celular contínua nas criptas de epitélio irradi-ado deficiente de p53 correlaciona-se com a morte acelerada de células da-nificadas da cripta e rápida destruição das vilosidades. Em camundongos dotipo selvagem, contudo, p53 prolonga sobrevivência mediante indução deparada de crescimento nas criptas do intestino delgado, preservando dessemodo integridade do intestino. Assim, a função pró-apoptótica de p53 pro-move a síndrome hematopoiética, enquanto sua função de parada de cres-cimento retarda desenvolvimento da síndrome gastrointestinal. Desse modo,supressão farmacológica de p53 será inútil (se não prejudicial) contra sín-drome Gl. Portanto, é necessário desenvolver abordagens alternativas a ra-dioproteção de epitélio de intestino delgado que dependerão de um outromecanismo, tais como, por exemplo, ativação de NF-κΒ e subseqüente inibi-ção de morte celular.

Exemplo 2

Lipopeptídeos Retardam Morte de Camundongos Causada por Irradiacão-qama de Corpo Inteiro

Lipopeptídeos são potentes ativadores de NF-κΒ e, como tal,poderão atuar como inibidores de morte apoptótica. Para determinar se lipo-peptídeos funcionam como radioprotetores, vários lipopeptídeos foram inici-almente testados para determinar a dose máxima tolerável (MTD). Várioslipopeptídeos foram então testados para medir seu efeito protetor em ca-mundongos suíços NIH em síndromes hematopoiéticas letais ou gastrointes-tinal nd após exposição a 10 Gy ou 13-15 Gy de radiação-gama de corpointeiro, respectivamente. Lipopeptídeos (0,3-10 μg/camundongo) foram ad-ministrados subcutaneamente 30 minutos antes de irradiação. Lipopeptídeostestados que proporcionaram radioproteção são mostrados na Tabela 3.Tabela 3

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Os resultados de um experimento representativo usando R-PAm2C-SKKKK (SEQ ID NO: 8) (daqui por diante, esse composto é chama-do CBLB601) a <0,1 MTD são mostrados na Figura 3. Como esperado, ca-mundongos de controle irradiados com 10 Gy morreram entre 11 e 15 diaspós-tratamento, enquanto todos os animais que receberam CBLB601 vive-ram além de 35 dias pós-tratamento. Similarmente, camundongos de contro-le irradiados com 13 Gy morreram entre 6 e 10 dias pós-tratamento, enquan-to todos os animais, exceto um, que receberam CBLB601 viveram além de35 dias pós-tratamento. A capacidade radioprotetora de CBLB601 foi adicio-nalmente analisada medindo o efeito de radiação sobre as dimensões dobaço. Como mostrado na Figura 4, camundongos tratados com CBLB601mostraram redução significativamente menor no tamanho do baço. CBLB601também protegeu o timo de radiação (dados não mostrados). A capacidadede CBLB601 em proteger eficazmente esplenócitos, sustentar recuperaçãorápida do timo e proteger o trato Gl de dano por radiação indica que Iipopep-tídeos poderão ser usados como radioprotetores.

Exemplo 3

Eficácia Radioprotetora de Uma Única Dose de CBLB601 Contra Irradiacão-gama de Corpo Inteiro

CBLB601, um R-Pam2-Iipopeptideo com a porção peptídeo con-sistindo de C-SKKKK (SEQ ID NO: 8), foi selecionado para caracterizaçãomais detalhada como radioprotector baseado em sua capacidade de ativarNF-κΒ e dados preliminares in vivo sobre radioproteção em camundongossuíços NIH (ver Exemple 2). Os objetivos desse estudo foram determinar adose ótima, via de administração e tempo de administração de CBLB601para servir como protetor. Camundongos ICR de 10-15 semanas de idadeforam usadas, com 10-15 animais por grupo ou condição.

A dose NOAEL (Nível de Efeitos Adversos Não Óbvios) foi de-terminada injetando intraperitonealmente (i.p.) camundongos ICR com dosescrescentes de CBLB601 (0,3; 1; 3; 10; 30; 60; 100 pg/camundongo). Ca-mundongos de controle foram injetados com PBS. Os camundongos foramobservados por duas semanas. Durante a primeira semana eles foram pe-sados diariamente. Não houve diferenças no peso entre os camundongostratados com CBLB601 e de controle. Mortalidade foi observada 1-2 diaspós-tratamento sob 100 pg de CBLB601/camundongo, mas não sob qual-quer das doses menores. Entretanto, sob dose de 60 pg, os camundongosmostraram sinais de morbidez, tais como movimento lento e pele escamosa,em torno de 3-4 dias após tratamento. Sob dose de 30 μς, não houve dife-renças notáveis entre os camundongos tratados e de controle. Desse modo,NOAEL para CBLB601 foi determinado como sendo 30 pg/camundongo.

O programa ótimo de administração intraperitoneal de CBLB601foi determinado injetando o composto em diferentes tempos antes de irradia-ção. Previamente, verificou-se que CBLB601 foi protetor contra 10 Gy, masnão contra doses de irradiação superiores (ver Exemple 2). Portanto, todosos experimentos de otimização foram realizados 10 Gy de irradiação de cor-po inteiro (TBI). Uma dose de 3 pg de BCLB601/camundongo (1/10 NOAEL)foi escolhida como dose de partida. Desse modo, 3 pg de CBLB601 foraminjetados i.p. em camundongos ICR 0,5 h, 1 h, 6 h e 24 h ou 1 h, 24 h, 48 h,72 h, 96 h antes de 10 Gy de TBI (como descrito no Exemplo 1). Após irradi-ação, os camundongos foram observados por 30 dias e sua sobrevivênciaregistrada. Os resultados desses experimentos são resumidos na Figura 5.Injeção de CBLB601 24 h antes de irradiação produziu claramente a melhorradioproteção (90-100% de sobrevivência em 30 dias). Quando o compostofoi administrado 48 h antes de irradiação, a radioproteção foi de -30%. Ad-ministração de CBLB601 1h antes de irradiação produziu resultados incon-sistentes variando de 80% de proteção em um experimento (Figura 5B) aquase nenhuma proteção (20%) em um outro experimento (Figura 5A). Ne-nhuma radioproteção foi observada quando o fármaco foi administrado 0,5 h(10%), 6 h (20%), 72 h e 96 h antes de TBI.

Para determinar a dose ótima radioprotetora de CBLB601, otempo de injeção e nível de irradiação foram mantidos constantes, enquantoa dose de CBLB601 foi variada. Camundongos ICR foram injetados i.p. com1, 3, 10, 20 ou 30 pg de CBLB601/camundongo ou 0,1; 0,3; 1; 3; 10 ou 15de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação (10 Gy de TBI), e suasobrevivência foi monitorada por 30 dias. A melhor dose protetora foi 3pg/camundongo, que sustentou uma sobrevivência de 100% (Figura 6 A eB). Eficácia quase similar foi obtida com as doses de 1 e 10 pg/camundongo,que resgataram 90% dos camundongos (em um experimento). Em contraste,doses superiores a CBLB601 (20 e 30 pg/camundongo) levaram a mortali-dade acelerada quando administradas em combinação com irradiação, emcomparação com camundongos de controle injetados com PBS. Alguns si-nais dessa toxicidade combinada foram detectáveis já sob a dose de 10pg/camundongo. Assim, a dose protetora ótima de CBLB601 foi determinadacomo sendo de 3 pg/camundongo. Desse modo, embora pareça que C-BLB601 conferiu radioproteção sob doses 10-30 vezes menores que NOA-EL, as margens de segurança de CBLB601 foram significativamente reduzi-das quando CBLB601 foi administrado em combinação com irradiação.

Para determinar o nível de radiação que foi protegido por C-BLB601, camundongos tratados com radioprotetor e de controle foram ex-postos a níveis crescentes de TBI. Grupos de camundongos ICR foram inje-tados i.p. com 3 pg de CBLB601/camundongo ou PBS, e em seguida 24 hdepois receberam doses de 10, 11, 12, 13, 14 e 15 Gy de TBI. Sobrevivênciafoi registrada por 30 dias. A Figura 7A mostra a mortalidade dependente dedoses de radiação de camundongos injetados com PBS. Todos os camun-dongos irradiados com 10-11 Gy de TBI morreram entre 12-14 dias pós-irradiação, o que foi típico para morte devido a falha hematopoiética. Todosos camundongos que receberam 14-15 Gy de TBI morreram entre 7-9 diaspós-irradiação, o que foi típico de mortalidade devido a dano intestinal indu-zido por radiação. Camundongos que foram irradiados com 12-13 Gy de TBImorreram em tempos intermediários, o que foi típico de uma etiologia mistade mortalidade induzida por radiação. A Figura 7B mostra a mortalidade de-pendente de doses de radiação de camundongos pré-tratados com C-BLB601. Camundongos injetados com 3 pg de CBLB601 24 h antes de irra-diação foram, como esperado, totalmente protegidos de 10 Gy de TBI. Ape-sar das diferenças óbvias na sobrevivência entre camundongos de controlee camundongos tratados, os efeitos protetores de CBLB601 não atingiramsignificância estatística sob essa condição. Para atingir uma diferença esta-tisticamente significativa de 10% entre camundongos de controle e camun-dongos tratados com CBLB601, grupos experimentais de pelo menos 50camundongos têm de ser usados. Embora CBLB601 tenha resgatado 100%de camundongos de 10 Gy de TBI, sua proteção sob 11 Gy de TBI foi so-mente de 20%. Não houve proteção de irradiação em níveis maiores que 11Gy, indicando que CBLB601 foi incapaz de resgatar animais do componentegastrointestinal de radiotoxicidade. Além disso, sob doses de irradiação de11, 12 e 13 Gy, os camundongos tratados com CBLB601 morreram comuma cinética acelerada, isto é, similar àqueles que receberam doses de 14-15 Gy, em comparação com camundongos de controle injetados com PBS.

Isso poderá ser indicativo de uma toxicidade combinada do fármaco e dairradiação. Desse modo, parece que sob níveis de irradiação maiores, C-BLB601 não conferiu proteção e foi também mais tóxico.

CBLB601 foi administrado intramuscularmente para determinar avia ótima de administração desse composto (especialmente uma vez queesta seria a via preferida de administração para humanos). A Figura 8 mos-tra as taxas de sobrevivência de camundongos injetados intramuscularmente(i.m.) com 1, 3 ou 10 pg de CBLB601/camundongo 24 h antes de irradiação.

Todas as três doses de CBLB601 conferiram radioproteção; e não houvesinal de toxicidade combinada sob a dose i.m. de 10 pg/camundongo, comohouve para a dose i.p. de 10 pg/camundongo (Figura 6). Em um outro expe-rimento, doses crescentes de CBLB601 administradas i.m. foram testadascontra doses de 10, 11 e 12 Gy de HBI (Figura 9). Houve um deslocamentonão-estatisticamente significativo para aumento de mortalidade de camun-dongos injetados com as doses mais altas (10, 30 pg) de CBLB601 antes deexposição a 10 Gy de TBI. Um resumo da dependência de doses da radio-proteção de CBLB610 administrado i.p. ou i.m. 24 h antes de 10 Gy de TBI émostrado na Figura 10. A partir desses dados, concluiu-se que a via i.m. deadministração foi tão eficaz quanto a via i.p., e a dose ótima (3pg/camundongo) foi a mesma para ambas as vias de administração. Alémdisso, concluiu-se que transferência i.m. poderá ser mais segura porque elaapresentou um índice terapêutico maior (dose tóxico/dose eficaz): 10-30 pa-ra administração i.m. (Figura 8 e 9: 30 pg/camundongo/1-2 pg/camundongo)vs 3-10 para administração i.p. (Figura 6: 10 pg/camundongo/1-3pg/camundongo). Adicionalmente, recálculo da dose eficaz por peso corpo-ral revelou uma janela menor para transferência intraperitoneal em compara-ção com transferência intramuscular; isto é, 90-110 pg/kg para transferênciai.p. e-60-115 pg/kg para transferência i.m. (Figura 11).

O programa ótimo de administração intramuscular de CBLB601foi determinado variando o tempo entre transferência de fármaco e irradia-ção. Camundongos ICR foram injetados i.m. com 3 pg de C-BLB601/camundongo 24 h, 6 h, 3 h e 1 h antes de TBI e +1 h, +3 h após TBI(Figura 12A), bem como 48 h, 36 h, 24 h, 12 h e 6 h antes de TBI (Figura12B). Esses experimentos revelaram que, similarmente à via de transferên-cia intraperitoneal, o tempo ótimo para transferência intramuscular de C-BLB601 foi de 24 h antes de 10 Gy de TBI. Administração intramuscular de 3pg de CBLB610/camundongo após (1 h e 3 h) 10 Gy de TBI não teve efeitoprotetor (Figura 12A). Além disso, doses de CBLB601 mais altas (10 e 30pg/camundongo) injetadas i.m. 1 h após 10 Gy de TBI levaram a níveis ele-vados de toxicidade combinada (Figura 13C). Esses dados são resumidosna Figura 13.

Para determinar DMF (fator de modificação de doses), 3 pg deCBLB601/camundongo foram injetados i.m. 24 h antes de irradiação e ca-mundongos de controle foram injetados com PBS. Tanto grupos injetadoscom fármaco quanto grupos de controle receberam uma única dose de TBIcobrindo a faixa de doses que leva a 10-90% de mortalidade dentro dos in-tervalos de tempo escolhidos (7 dias para a mortalidade por síndrome gas-trointestinal e 30 dias para a mortalidade por síndrome hematopoiética). Osgráficos de mortalidade percentual-doses de radiação foram construídos eLD50/7 e LD50/30 (LD50 em 7 dias e 30 dias, respectivamente) foram calcula-dos usando análise estatística probit ou logit. DMF (também conhecido comofator de redução de doses, DRF) foi calculado como razão de LD50 de radia-ção para grupos de camundongos tratados com CBLB601 e LD50 de radia-ção para grupos de camundongos tratados com veículo para o ponto detempo de sobrevivência escolhido, 7 ou 30 dias. Para calcular DMF30, que éo DMF no 30s dia pós-irradiação, foram determinados os valores de LD50/30de radiação para camundongos tratados com PBS ou 3 pg de CBLB601.Para isso, grupos injetados com PBS foram irradiados com doses de 6; 6,5;7 e 7,7 Gy de TBI, e grupos injetados com CBLB601 foram irradiados comdoses de 10; 10,5; 1.1; 11,5 e 12 Gy de TBI. O LD50/30 para CBLB601 foi cal-culado usando análise ProBit e foi estimado situar-se na faixa de 11,07-11,61 Gy, com a média de -11,32 Gy (ver Figura 14). Contudo, inconsistên-cia na resposta a algumas doses de radiação (7 Gy pareceram não-tóxicos,considerando que 6,5 Gy causaram 60% de Ietalidade em 30 dias) nos ca-mundongos de controle impediu um cálculo preciso do DMF30 para C-BLB601. Todavia, esperava-se que o LD50/30 para camundongos ICR fosseem torno de 7 Gy [uma média da maioria de cepas de camundongos; Mono-be e outros, Radiother Oncology 73 Supl. 2: S12709, 2004)]. Assim, o valorde DMF30 para CBLB601 foi estimado aproximadamente como -1,6.

Exemplo 4

Status Imune de Camundongos Resgatados de Doses Letais de TBI porCBLB601

Camundongos que foram resgatados de 10 Gy de TBI por admi-nistração de CBLB601 poderão ter sistemas imunes comprometidos e, por-tanto, poderão não ter vida "normal". Para verificar o status de seus sistemasimunes, camundongos ICR foram expostos a doses letais (10 Gy) ou não-Ietais (6 Gy) de TBI 24 h após terem sido injetados (i.m.) com 3 pg de C-BLB601/camundongo ou PBS. Grupos de cinco camundongos de cada con-dição foram sacrificados exatamente três dias e seus baços e timos foramremovidos e pesados. Os pesos dos baços foram normalizados com os pe-sos corporais dos animais correspondentes e os resultados são apresenta-dos na Figura 15. Camundongos tratados com PBS que foram expostos a 6Gy de radiação levaram cerca de 13-14 dias para restaurar seus baços apesos normais, considerando que camundongos tratados com CBLB601 ex-postos a 6 Gy de radiação apresentaram pesos normais dos baços em tornodo 8e dia. Animais injetados com PBS não sobreviveram a 10 Gy de TBI1considerando que camundongos injetados com CBLB601 não só sobrevive-ram à dose letal dose de radiação, como também restauraram completamen-te seus pesos dos baços em torno dos 13-14 dias pós-irradiação. Levaramum período mais longo de tempo (-30 dias) para restaurar os timos a pesosnormais (não mostrados).

Os baços e timos de camundongos de controle e camundongosinjetados com CBLB601 foram examinados microscopicamente em relação aalterações morfológicas 3, 10 e 30 dias após irradiação. Três dias pós-irradiação, o baço e o timo de camundongos de controle irradiados em corpointeiro com 10 Gy e camundongos tratados com CBLB601 revelaram lesõesinduzidas por irradiação, incluindo depleção linfóide moderadamente grave egrave do baço e do timo, e atrofia grave da polpa vermelha do baço. Dezdias pós-irradiação, animais tratados com CBLB601 mostraram uma melho-ria em relação aos animais de controle na recuperação da atrofia esplênicada polpa vermelha; todos os animais tratados com CBLB601 mostraram he-matopoiese extramedular multifocal suave a moderada (EMH)j considerandoque nenhum dos controles apresentaram EMH. Não houve evidência de re-cuperação da depleção esplênica da polpa branca em qualquer dos gruposem 10 dias. Hiperplasia linfóide regenerativa no timo foi evidente em ambosos grupos no 10- dia, com a regeneração ligeiramente mais avançada noscamundongos de controle que nos camundongos tratados como CBLB601.

Em torno do 30Q dia pós-irradiação, todos os animais apresentavam polpavermelha esplênica normal, a maioria dos animais mostrava recuperaçãototal ou aproximadamente total de elementos linfóides e todos tinham timosessencialmente normais.

Para testar a resposta imune de camundongos resgatados deuma dose letal de irradiação-gama (10 Gy de TBI) por CBLB601, diversosgrupos de desses camundongos foram submetidos a imunização com umantígeno forte, Salmonella flagellin. Os camundongos foram primeiro imuni-zados 8, 18 ou 20 semanas após irradiação, em cujo tempo eles tinham 18,25 e 33 semanas de idade, respectivamente. Camundongos virgens não-irradiados com 29 semanas de idade foram usados como controle positivopara a resposta imune. Os camundongos receberam um reforço de flagelinauma semana após a primeira imunização, e um outro reforço três semanasapós o segundo reforço; títulos de anticorpos antiflagelina foram medidos nosoro dos camundongos. Para testar a resposta imune secundária, os ca-mundongos foram submetidos a sangria novamente um mês depois de as-segurar redução dos títulos de anticorpos. Isso foi seguido de um terceiroreforço da injeção de antígenos e de medição de títulos de anticorpos anti-flagelina 10 dias depois. Quando do terceiro reforço, os camundongos sobirradiação tinham 38, 30 e 23 semanas de idade e os camundongos de con-trole, 34 semanas de idade.

A resposta imune um mês após a primeira imunização (três se-manas após o primeiro reforço) é mostrada na Figura 16A. Os camundongosirradiados tratados com CBLN601 montaram uma resposta humoral imunerobusta contra flagelina que foi indistinguível daquela dos camundongos vir-gens de controle. Também parece que o nível de resposta imune não foi de-pendente do tempo que se passou após irradiação, uma vez que todos osgrupos apresentaram uma boa resposta. Embora houvesse alguma variaçãoindividual no grupo pós-irradiação de 20 semanas, sabe-se bem que respos-ta imune pode ser prejudicada em animais mais velhos. Títulos de anticorposforam verificados novamente um mês após a primeira sangria, e eles esta-vam ainda assim elevados sete semanas após imunização (Figura 16B). Aresposta imune secundária (Figura 16C) foi mais intensa do que a primeiraresposta (Figura 16A). Esses dados indicam fortemente que CBLB601 nãosó resgataram camundongos de TBI letal, mas também permitiram total res-tauração de um sistema imune funcional.

Exemplo 5

Ativação de NF-κΒ e Radioprotecão Proporcionada por Outros Lipopeptídeos

Lipopeptídeos adicionais foram sintetizados e testados em rela-ção a ativação de NF-κΒ e sua capacidade de proteger camundongos dedoses letais de radiação. Os nomes dos compostos e seus constituintes-chave são mostrados na Tabela 4. Para alguns dos compostos, os peptídeoslivres correspondentes foram também sintetizados e testados.

Tabela 4

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Atividade repórter dependente de NF-κΒ foi medida em 293 cé-lulas que expressaram o heterodímero TLR2/YLR6. A ativação in vitro deNF-κΒ por CBLB613 foi comparável àquela de CBLN601 (Figura 17). Oscompostos CBLB614 e CBLB615 apresentam derivados do peptídeo de C-BLB612 (ver Tabela 4) sucessivamente mais curtos. Todos os três compos-tos ativaram o NF-κΒ repórter e todos foram ativadores melhores do que doque CBLB601 (Figura 18A, B). Nenhum dos peptídeos não-palmitoiladoscorrespondentes ativaram o NF-κΒ repórter (Figura 18B). O componentepeptídeo de CBLB617 apresenta uma carga (-4), que deve impedi-lo de inte-ragir com marcadores de superfície celular negativamente carregados. Aativação de NF-κΒ por CBLB617 foi comparável àquela de CBLB601 (Figura 19). A Tabela 5 resume a atividade e solubilidade in vitro de todos os compostos.

Tabela 5

<table>table see original document page 45</column></row><table>

A atividade radioprotetora in vivo de alguns dos compostos foitambém testada. Camundongos ICR foram injetados intramuscularmentecom várias doses dos compostos de teste e em seguida 24 horas depois queos camundongos foram expostos a 10 Gy de TBI. Sobrevivência foi monito-rada por 30 dias. A Figura 20 mostra a atividade protetora de CBLB613. Do-ses de 10, 30 e 82,5 pg de CBLB613/camundongo proporcionaram 100% deproteção e revelaram-se não-tóxicas em combinação com a radiação (emcontraste com CBLB601). Os compostos relacionados CBLB612, CBLB614e CBLB615 foram testados em relação a atividade radioprotetora contra 10Gy de TBI. Doses de 1, 3, 10 e 30 pg/camundongo (CBLB612 foi tambémtestado sob 60 pg/camundongo) foram injetadas i.m. em camundongos ICR24 h antes de irradiação. Como mostrado na Figura 21, todos os três com-postos proporcionaram 90-100% de radioproteção quando administradosnas doses mais altas. A radioproteção foi claramente dependents de doses,sem nenhuma toxicidade em combinação com radiação. A potência doscompostos são CBLB612>CBLB614>CBLB615. A atividade radioprotetorade CBLB617 está presentemente sob avaliação usando o procedimento pa-drão. Após 13 dias, não houve toxicidade visível à dose mais alta (87,5pg/camundongo), embora houvesse 7-90% de sobrevivência sob doses de10-87,5 pg/camundongo, respectivamente. Em resumo, CBLB612 e C-BLB613 são significativamente radioprotetores melhores do que CBLB601 eapresentam índices terapêuticos maiores (-20 para CBLB612 e CBLB613 vs3 para CBLB601).

A capacidade de CBLB612 em funcionar como um mitigador dedano por radiação sob dose mais baixa foi também examinada. Para isso, 50pg de CBLB612/camundongo foram injetados intramuscularmente 1 h apósexposição a 8,5; 9 ou 10 Gy de TBI. Tratamento com CBLB612 elevou a ta-xa de sobrevivência sob cada dose de radiação (Figura 22). Por exemplo,sob 8,5 Gy, 90% dos camundongos tratados com CBLB612 e 50% dos ca-mundongos tratados com PBS sobreviveram 27 dias (p=0,03), e sob 9 Gy70% dos camundongos tratados com CBLB612 e 50% dos camundongostratados com PBS sobreviveram 27 dias (p=0,0006). Nenhuma diferença foiobservada entre grupos tratados com CBLB612 e grupos de controle sobdoses de radiação menores devido à baixa sobrevivência de camundongosde controle (não mostrada). Esses dados indicam que CBLB612 poderá fun-cionar como um mitigador de radiação, bem como radioprotetor.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Cleveland Biolabs, inc.Shakhov, Alexander N.Gudkov, Andrei

<120> MÉTODOS DE PROTEÇÃO CONTRA APOPTOSE MEDIANTE USO DE LIPOPEPTÍDEOS

<130> 050991-110422

<150> 60/689,810<151> 2005-06-13

<160> 52

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 1

Ser Asn Asn Ala1

<210> 2

<211> 5<212> PRT<213> Artificial

<220>

<223> PEPTfDEO SINTÉTICO

<400> 2

Gly ser ser His His1 5

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 3

Lys Gln Asn Val ser1 5

<210> 4

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 4Asn Asn ser Gly Lys1 5

<210> 5

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 5

Gln Pro Asp Arg Tyr1 5

<210> 6

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 6

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<210> 7

<211> 5

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<213> Artificial

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 7

Ser Glu Glu Glu Glu1 5

<210> 8

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<213> Artificial

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 8

ser Lys Lys Lys Lys1 5

<210> 9

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO<400> 9

Ser Asn Asn Asn Ala1 5

<210> 10

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<213> Artificial

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 10

Ser Pro Pro Pro Pro1 5

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 11

Gly Gln His His Met1 5

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<213> Artificial

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 12

Gly Gln His His His1 5

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 13

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<223> PEPTiDEO SINTÉTICO<400> 14

Gly ser His His Met1 5

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<223> PEPTiDEO SINTÉTICO

<400> 15

Ser Gln Met His His1 5

<210> 16

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<223> PEPTiDEO SINTÉTICO

<400> 16

Gly Glu Thr Asp Lys1 5

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<211> 5

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<223> PEPTiDEO SINTÉTICO

<400> 17

Gly Glu Glu Ser Asn

1 5

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<211> 5

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<223> PEPTfDEO SINTÉTICO

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Gly Glu Glu Asp Asp

1 5

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO<400> 19

Thr Glu Asn Val Lys Glu1 5

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<212> PRT

<213> Artificial

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<223> PEPTlDEO SINTÉTICO

<400> 20

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<210> 21

<211> 9

<212> PRT

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<223> PEPTiDEO SINTÉTICO

<400> 21

Val Gln Gly Glu Glu Ser Asn Asp Lys

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<213> Artificial

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<223> PEPTiDEO SINTÉTICO

<400> 22

Phe Glu Pro pro Pro Ala Thr Thr Thr

1 5

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<223> PEPTlDEO SINTÉTICO

<400> 23

Gly Asp Lys Tyr Phe Lys Glu Thr Glu

<210> 24<211> 9

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<213> Artificial

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<223> PEPTlDEO SINTÉTICO<400> 24

Gly Asp Pro Lys His Pro Lys Ser Phe1 5

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<213> Artificial

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 25

Gly Gly Gln Glu Lys Ser Ala Ala Gly

<210> 26

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<213> Artificial

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<223> PEPTlDEO SINTÉTICO

<400> 26

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<211> 9

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<213> Artificial

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 27

Pro Pro cys Pro Gly Cys Pro Pro Cys1 5

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<212> PRT

<213> Artificial

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<223> PEPTlDEO SINTÉTICO

<400> 28

ASD Asn Glu Glu Lys Pro Thr Pro Glu Gln Asp1 5 10<210> 29

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<212> PRT

<213> Artificial

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<223> PEPTiDEO SINTÉTICO

<400> 29

Gly Asn Gly Gly Ala Pro Ala Gln Pro Lys Gly1 5 10

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<213> Artificial

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<223> PEPTlDEO SINTÉTICO

<400> 30

Phe Glu Pro Pro Pro Ala Thr Thr Thr Lys Ser Lys

1 5 10

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<211> 13

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<220>

<223> PEPTiDEO SINTÉTICO

<400> 31

Gly Asn Asn Asp Glu Ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys1 5 10

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<213> Artificial

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO<400> 32

Gly Asp Pro Lys His Pro Lys Ser Phe Thr Gly Trp Val Ala15 10

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<212> PRT

<213> Artificial

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<223> PEPTiDEO SINTÉTICO

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<213> Artificial

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

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1 5 10 15

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

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Gly Asp Lys Thr Pro Ser Thr Lys Ser Ala Gly Lys Val Glu Asn Lys

15 10 15

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<212> PRT

<213> Artificial

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

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Gly Glu Thr Asp Lys Glu Gly Lys Ile Ile Arg Ile Phe Asp Asn Ser

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<22 3> peptldeo sintético<400> 38

ser ser Thr Ser Glu Asn Asn GTy Asn Gly Asn Gly Asn Gly Gly Thr1 5 10 15

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<223> peptídeo sintético<400> 39

Gly Asn Asn Asp Glu ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys ser Glu Glu1 5 10 15

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<210> 40

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<220>

<223> peptídeo sintético

<400> 40

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10

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Gly Asn Asn Asp Glu ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys ser L^s Lys

<210> 41

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<220>

<223> peptídeo sintético

<400> 41

Gly Asn Asn Asp Glu ser Asn Ile Ser Phe Lys Glu Lys ser Pro Pro1 5 10 15

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<210> 42<211> 18<212> PRT<213> Arti fi ci al

<220>

<223> PEPTiDEO SINTÉTICO<400> 42

Ser Ser Asn Lys Ser Thr Thr Gly Ser Gly Glu Thr Thr Thr Ala Ala1 5 10 15

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<210> 43

<211> 19

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<223> PEPTiDEO SINTÉTICO<400> 43

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Lys Lys Lys

<210> 44

<211> 19

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<223> PEPTlDEO SINTÉTICO

<400> 44

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<210> 45

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<220>

<223> PEPTlDEO SINTÉTICO

<400> 45

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<210> 46<211> 21<212> PRT

<213> Artificial

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<223> PEPTÍDEO SINTÉTICO

<400> 46

Ala Asp vai Ile Ala Lys Ile Val Glu Ile Val Lys Gly Leu Ile Asp1 5 10 15

Gln Phe Thr Gln Lys20

<210> 47

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<212> PRT

<213> Artificial

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<223> PEPTiDEO SINTÉTICO

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Gly Ala Ala Ser Ser Leu Thr Tyr Glu Ser Ser Val Gln Leu Val Val1 5 10 15

Ser Asp Asn ser ser20

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<212> PRT

<213> Artificial

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<223> PEPTiDEO SINTÉTICO

<400> 48

Gly Gly Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Ala Glu Thr Pro Ala Ala Ala1 5 10 15

Ala Glu Ala Ala Ser20

<210> 49

<2U> 20

<212> PRT

<213> Artificial

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<223> PEPTfDEO SINTÉTICO

<400> 49

Gly Gln Thr Asp Asn Asn ser Ser Gln Ser Gln Gln Pro Gly ser Gly10 15

Thr Thr Asn Thr20

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<211> 22

<212> PRT

<21Β> Artificial

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<223> PEPTlDEO SINTÉTICO

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Ser Gly Ala Leu Ala Ala Thr Ser Asp Asp Asp Val Lys Lys Ala Al1 5 10 15

Thr vai Ala Ile vai Ala20

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<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial

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<22 3> PEPTiDEO SINTÉTICO<400> 51

ser Ile Val ser Thr Ile Ile Glu vai Val Lys Thr Ile Val Asp Jl1 5 10 15

Val Lys Lys Phe Lys Lys20

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<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> PEPTlDEO SINTÉTICO<400> 52

ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Al15 10 15

Asp Ala Leu Thr Ala Pro20

Claims (21)

1. Método de proteção de um mamífero dos efeitos de um oumais tratamentos ou condições que disparam a apoptose, compreendendoadministrar ao referido mamífero uma composição compreendendo umaquantidade farmaceuticamente eficaz de um composto de fórmula: <formula>formula see original document page 59</formula> na qual:R1 representa H ou -CO-R4,R2, R3 e R4 são, independentemente, H ou Ce-Ci6 alifático op-cionalmente substituído;X é um peptídeo; eZé Sou CH2.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual a condição éselecionada do grupo que consiste de radiação, ferimento, envenenamento,infecção e choque de temperatura.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, no qual a condição éradiação.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual o tratamentoé um tratamento de câncer.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, no qual o referidotratamento é quimioterapia ou terapia de radiação.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual o peptídeo éSEQ ID NO: 21.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual o peptídeocompreende qualquer uma seqüência das SEQs ID NOs: 1 -52.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual os primeiroscinco aminoácidos do peptídeo são escolhidos dos aminoácidos nas posi-ções referidas na Tabela 2.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual o peptídeocompreende uma seqüência selecionada do grupo que consiste nas SEQsID NOS: 8, 16, 17, 18, 20 e 21, e substituições destes.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, no qual Ri é H e R2e R3 são C16 alifáticos ou substituições destes.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual o compos-to é um estereoisômero RR ou RS, ou mistura dos mesmos.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual o compos-to é de formula: <formula>formula see original document page 60</formula>

13. Método de acordo com a reivindicação 3, no qual a composi-ção é administrada em combinação com um radioprotetor.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, no qual o radio-protetor é um antioxidante.

15. Método de acordo com a reivindicação 14, no qual o antioxi-dante é selecionado do grupo que consiste em amifostina e vitamina E.

16. Método de acordo com a reivindicação 13, no qual o radio-protetor é uma citocina.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, no qual a citocinaé fator de células-tronco.

18. Método de acordo com a reivindicação 13, no qual o radio-protetor é flagelina.

19. Método de acordo com a reivindicação 13, no qual o radio-protetor é TGFB latente.

20. Método de acordo com a reivindicação 13, no qual o radio-protetor é um ativador de um TLR.

21. Método de acordo com a reivindicação 1, no qual apoptose édisparada em um tecido selecionado do grupo que consiste em baço, timo,trato gi, pulmões, rins, fígado, sistema cardiovascular, endotélio dos vasossangüíneos, sistema nervoso central e periférico, células progenitoras hema-topoiéticas (medula óssea), sistema imune, folículos pilosos e sistema re-produtivo.