BRPI0611702A2 - captura e caracterização de cromatina co-localizada (4c) - Google Patents

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Abstract

CAPTURA E CARACTERIZAçãO DE CROMATINA COLOCALIZADA (4C). A presente invenção diz respeito em um aspecto a um método para analisar a freqúência de interação de uma seqUência de nucleotideos alvo com uma ou mais seqUências de nucleotideos de interesse (por exemplo, um ou mais loci genâmicos) que compreende as etapas de: (a) fornecer uma amostra de DNA reticulado; (b) digerir o DNA reticulado com uma enzima de restrição primária; (c) ligar as seqUências de nucleotídeos reticuladas; (d) reverter a reticulação; (e) digerir as seqUências de nucleotideos com uma enzima de restrição secundária; (f) ligar uma ou mais seqUências de DNA de composição de nucleotídeo conhecida ao (s) sítio (s) de digestão de enzima de restrição secundária disponível que flanqueiam uma ou mais seqUências de nucleotideos de interesse; (g) amplificar uma ou mais seqüências de nucleotideos de interesse usando pelo menos dois iniciadores de oligonucleotídeo, em que cada iniciador hibridiza para as seqUências de DNA que flanqueiam as seqUências de nucleotídeos de interesse; (h) hibridizar as seqUência (s) amplificada(s) em um arranjo; e (i) determinar a freqUência de interação entre as seqUências de DNA.

Description

"CAPTURA E CARACTERIZAÇÃO DE CROMATINA CO-LOCALIZADA (4C)"
Campo da invenção
A presente invenção diz respeito à análise da fre-qüência de interação de duas ou mais seqüências de nucleotí-deos no espaço nuclear.
Antecedentes da invenção
Estudos na arquitetura nuclear de mamífero visamentender como 2. metros de DNA são dobrados em um núcleo de10 μη, permitindo ao mesmo tempo expressão precisa dos genesque especificam o tipo de célula, e como isto é confiavel-mente propagado durante cada ciclo da célula. Progresso nes-te campo vem amplamente dos estudos da microscopia, que re-velaram que genomas não são arranjados randomicamente no es-paço nuclear. Por exemplo, heterocromatina densamente empa-cotada é separada de eucromatina mais aberta, e os cromosso-mos ocupam territórios distintos no espaço nuclear. Existeum relacionamento confuso entre posição nuclear e atividadetranscricional. Embora a transcrição ocorra por todo o inte-rior nuclear, genes ativos que agrupam em cromossomos prefe-rencialmente localizam-se na borda ou fora de seu territóriode cromossomo. Genes individuais podem migrar mediante mu-danças em seu estado de transcrição, medida contra marcosnucleares relativamente maiores, tais como territórios decromossomo, centrômeros ou a periferia nuclear. Além domais, dezenas de genes transcritos ativamente de separadosdezenas de megabases no cromossomo podem se agrupar no nú-cleo, demonstrado recentemente por hibridização in situ defluorescência (FISH) para o locus β-globina e alguns outrosgenes selecionados. Com base na transcrição, organização ge-nômica é associada com a coordenação de replicação, recombi-nação e a probabilidade de Ioci translocar (que pode levar amalignidades) e o ajuste e reajuste de programas epigenéti-cos. Com base nestas observações, acredita-se que a organi-zação arquitetônica de DNA no núcleo da célula seja um con-tribuinte chave para a função genômica.
Diferentes ensaios foram desenvolvidos para permi-tir uma percepção na organização espacial de Ioci in vivogenômico. Um ensaio, denominado RNA-TRAP, foi desenvolvido(Carter et al. (2002) Nat. Genet. 32, 623) que envolve alve-jar peroxidase do rábano silvestre (HRP) transcritos de RNAembrionários, seguido por quantificação de deposição de bio-tina catalisada por HRP na cromatina por perto.
Um outro ensaio que foi desenvolvido é denominadotecnologia de captura de conformação de cromossomo (3C), quefornece uma ferramenta para estudar a organização estruturalde uma região genômica. Tecnologia 3C envolve análise PCRquantitativa de freqüências reticuladas entre dois fragmen-tos de restrição de DNA determinados, que dão uma medida desua proximidade no espaço nuclear (ver Figura 1). Original-mente desenvolvidos para analisar a conformação de cromosso-mos em levedura (Dekker et al., 2002), esta tecnologia foiadaptada para investigar o relacionamento entre expressão dogene e dobra da cromatina em agrupamentos confusos de genesde mamífero (ver, por exemplo, Tolhuis et al., 2002; Palstraet al., 2003; e Drissen et al., 2004). Resumidamente, tecno-logia 3C envolve reticulação in vivo de formaldeido de célu-las e digestão nuclear de cromatina com uma enzima de res-trição, seguido por fragmentos de ligação de DNA que foramreticulados em um complexo. Os produtos de ligação são emseguida quantificados por PCR. A etapa de amplificação doPCR requer o conhecimento da informação de seqüência paracada um dos fragmentos de DNA que devem ser amplificados.Assim, tecnologia 3C fornece uma medida de freqüências da
interação entre fragmentos de DNA selecionados.
Existe uma necessidade importante da tecnologia dealta produção que possa selecionar sistematicamente todo ogenoma de uma maneira imparcial para Ioci de DNA que fazemcontato uns com os outros no espaço nuclear.
A presente invenção procura fornecer melhorias natecnologia 3C.
Sumário da invenção
Tecnologia 3C atualmente permite aplicar análiseapenas a um número limitado de interações de DNA-DNA sele-cionadas devido às limitações da etapa de amplificação dePCR, que requer conhecimento de informação de seqüência es-pecifica pra cada fragmento a ser analisado. Além do mais, aseleção de fragmentos de restrição como candidatos para in-terações de DNA de longo alcance requer uma quantidade subs-tancial de conhecimento prévio (por exemplo, a localizaçãode sítios hipersensiveis) do locus de interesse, que não éfreqüentemente disponível. Dada a relevância funcional demuitas interações de DNA-DNA de longo alcance descrito dessamaneira, a capacidade de selecionar randomicamente elementosde DNA que laçam uma seqüência de interesse, tais como umgene promotor, intensificador, isolante, silenciador, origemde replicação ou MAR/SAR - ou uma região genômica de inte-resse - tais como uma região densa em genes ou pobre em ge-nes, ou elemento repetitivo - pode facilitar enormemente omapeamento de seqüências envolvidas em uma rede regulatória.
A presente invenção diz respeito à tecnologia 4C(isto é, captura e caracteriza cromatina co-localizada), quepermite a análise de alta produção da freqüência de intera-ção de duas ou mais seqüências de nucleotideos no espaço nu-clear.
Tecnologia 4C (captura e caracteriza cromatina co-localizada) é uma versão modificada de tecnologia 3C quepermite uma pesquisa ampla de genoma imparcial de fragmentosde DNA que interagem com ura locus de escolha. Resumidamente,análise 3C é realizada como usual, mas omitindo a etapa PCR.
O padrão 3C contém um bait (por exemplo, um fragmento derestrição de escolha que engloba um gene de interesse) liga-do a muitas seqüências de nucleotideos de interesse diferen-tes (representando o ambiente genômico deste gene). O padrãoé clivado por uma outra enzima de restrição secundária, eligado. Vantajosamente, uma ou mais seqüências de nucleoti-deos de interesse que são ligadas à seqüência de nucleoti-deos alvo são amplificadas usando pelo menos um (preferivel-mente, pelo menos dois) iniciador de oligonucleotideo, emque pelo menos um iniciador hibridiza para uma seqüência deDNA que flanqueia as seqüências de nucleotideos de interes-se. Tipicamente, isto produz um padrão de fragmentos de PCRque é altamente produtivel entre reações de amplificação in-dependentes e especificas para um determinado tecido. Em umamodalidade, HindIII e DpnII são usados como enzima de res-trição primária e secundária. Depois, os fragmentos amplifi-cados podem ser marcados e opcionalmente hibridizados paraum arranjo, tipicamente contra uma amostra de controle con-tendo DNA genômico digerido com a mesma combinação de enzi-mas de restrição.
Em uma modalidade preferida da presente invenção,os fragmentos ligados que são clivados por uma enzima derestrição secundária são subseqüentemente religados paraformar pequenos círculos de DNA.
A tecnologia 3C foi portanto modificada de maneiratal que todas as seqüências de nucleotídeos de interesse queinteragem com uma seqüência de nucleotídeos alvo fossem am-plificadas. Praticamente, isto significa que, em vez de de-senvolver uma reação de amplificação com iniciadores que sãoespecíficos para os fragmentos que se deseja analisar, é re-alizada uma amplificação usando oligonucleotídeo(s) inicia-dor(s) que hibridizam com uma seqüência de DNA que flanqueiaas seqüências de nucleotídeos de interesse. Vantajosamente,4C não é inclinado para o projeto de iniciadores PCR que sãoincluídos na etapa de amplificação do PCR e que podem por-tanto ser usados para pesquisar o genoma completo para ele-mentos de DNA de interação.
Aspectos do sumário da presente invençãoAspectos da presente invenção são apresentados nasreivindicações anexas.Em um primeiro aspecto, é fornecido um método paraanalisar a freqüência de interação de uma seqüência de nu-cleotideos alvo com uma ou mais seqüências de nucleotideosde interesse (por exemplo, um ou mais Ioci genômicos) quecompreende as etapas de: (a) fornecer uma amostra de DNA re-ticulado; (b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária; (c) ligar as seqüências de nucleotideosreticuladas; (d) reverter a reticulação; (e) digerir as se-qüências de nucleotideos com uma enzima de restrição secun-dária; (f) ligar uma ou mais seqüências de DNA de composiçãode nucleotideos conhecida ao(s) sitio(s) de digestão de en-zima de restrição secundária disponíveis que flanqueiam umaou mais seqüências de nucleotideos de interesse; (g) ampli-ficar uma ou mais seqüências de nucleotideos de interesseusando pelo menos dois oligonucleotídeos iniciadores, em quecada iniciador hibridiza para as seqüências de DNA que flan-queiam as seqüências de nucleotideos de interesse; (h) hi-bridizar as seqüência(s) amplificada(s) em um arranjo; e (i)determinar a freqüência de interação entre as seqüências deDNA.
Em um segundo aspecto, é fornecido um método paraanalisar a freqüência de interação de uma seqüência de nu-cleotideos alvo com uma ou mais seqüências de nucleotideos(por exemplo, um ou mais Ioci genômicos) que compreende asetapas de: (a) fornecer uma amostra de DNA reticulado; (b)digerir o DNA reticulado com uma enzima de restrição primá-ria; (c) ligar as seqüências de nucleotideos reticuladas;(d) reverter a reticulação; (e) digerir as seqüências de nu-cleotideos com uma enzima de restrição secundária; (f) cir-cularizar as seqüências de nucleotideos; (g) amplificar umaou mais seqüências de nucleotideos que são ligadas à seqüên-cia de nucleotideos alvo; (h) opcionalmente hibridizar asseqüências amplificadas com um arranjo; e (i) determinar afreqüência de interação entre as seqüências de DNA.
Em um terceiro aspecto é fornecida uma seqüênciade nucleotideos circularizada que compreende uma primeira euma segunda seqüência de nucleotideos, em que as extremida-des da primeira e de uma segunda seqüência de nucleotideossão separadas por diferentes sítios de reconhecimento de en-zima de restrição, e em que a dita primeira seqüência dé nu-cleotideos é uma seqüência de nucleotideos alvo e a dita se-gunda seqüência de nucleotideos é obtenível por DNA genômicoreticulado.
Em um quarto aspecto, é fornecido um método parapreparar uma seqüência de nucleotideos circularizada quecompreende as etapas de: (a) fornecer uma amostra de DNA re-ticulado, (b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária; (c) ligar as seqüências de nucleotideosreticuladas; (d) reverter a reticulação; (e) digerir as se-qüências de nucleotideos com uma enzima de restrição secun-dária; e (f) circularizar as seqüências de nucleotideos.
Em um quinto aspecto, é fornecido um método paraanalisar a freqüência de interação de uma seqüência de nu-cleotideos alvo com uma ou mais seqüências de nucleotideos(por exemplo, um ou mais Ioci genômicos) que compreende ouso da seqüência de nucleotideos circularizada.Em um sexto aspecto, é fornecido um arranjo desondas imobilizado em um suporte que compreende uma ou maissondas que hibridizam ou são capazes de hibridizar para aseqüência de nucleotideos circularizada.
Em um sétimo aspecto, é fornecido um conjunto desondas complementares em seqüência à seqüência de ácido nu-cléico adjacente para cada um dos sítios de reconhecimentoda enzima de restrição primária de uma enzima de restriçãoprimária em DNA genômico.
Em um oitavo aspecto, é fornecido um processo parapreparar um conjunto de sondas que compreende as etapas de:(a) identificar cada um dos sítios de reconhecimento da en-zima de restrição primária para uma enzima de restrição pri-mária no DNA genômico; (b) projetar sondas que são capazesde hibridizar para a seqüência adjacente a cada um dos sí-tios de reconhecimento da enzima de restrição primária noDNA genômico; (c) sintetizar as sondas; e (d) combinar assondas entre si para formar um conjunto de sondas, ou subs-tancialmente um conjunto de sondas.
Em um nono aspecto, é fornecido um conjunto desondas, ou substancialmente um conjunto de sondas, obtido ouobtenível pelo processo aqui descrito.
Em um décimo aspecto, é fornecido um arranjo quecompreende arranjo de sondas, ou substancialmente o conjuntode sondas aqui descrito
Em um décimo primeiro aspecto, é fornecido um ar-ranjo que compreende o conjunto de sondas de acordo com oaqui descrito.Em um décimo segundo aspecto, é fornecido um pro-cesso para preparar um arranjo que compreende a etapa de i-mobilizar em um suporte sólido substancialmente o arranjo desondas ou substancialmente o conjunto de sondas aqui descrito.
Em um décimo terceiro aspecto, é fornecido um pro-cesso para preparar um arranjo que compreende a etapa de i-mobilizar em um suporte sólido o arranjo de sondas ou o con-junto de sondas aqui descrito.
Em um décimo quarto aspecto, é fornecido um arran-jo obtido ou obtenivel pelo método aqui descrito.
Em um décimo quinto aspecto, é fornecido um métodopara identificar uma ou mais interações de DNA-DNA que sãoindicativas de um estado da doença particular que compreendea etapa de realizar as etapas (a)-(i) do primeiro e segundoaspectos da presente invenção, em que, na etapa (a) , uma a-mostra de DNA reticulado é fornecida de uma célula doente euma não doente, e em que uma diferença entre a freqüência deinteração entre as seqüências de DNA das células doentes enão doentes indica que a interação de DNA-DNA é indicativade um estado de doença particular.
Em um décimo sexto aspecto, é fornecido um métodode diagnóstico ou prognóstico de uma doença ou sindrome cau-sada ou associada com uma mudança em uma interação de DNA-DNA que compreende a etapa de realizar as etapas (a)-(i) doprimeiro e segundo aspectos da presente invenção, em que aetapa (a) compreende fornecer uma amostra de DNA reticuladode um sujeito; e em que a etapa (i) compreende comparar afreqüência de interação entre as seqüências de DNA com quede um controle não afetado; em que uma diferença entre o va-lor obtido do controle e o valor obtido do sujeito é indica-tiva que o sujeito sofre da doença ou sindrome ou é indica-tiva que o sujeito sofrerá da doença ou sindrome.
Em um décimo sétimo aspecto, é fornecido um métodode diagnóstico ou prognóstico de uma doença ou sindrome cau-sada ou associada com uma mudança em uma interação de DNA-DNA que compreende a etapa de: realizar as etapas (a)-(i) doprimeiro e segundo aspectos da presente invenção, em que aetapa (a) compreende fornecer uma amostra de DNA reticuladode um sujeito; e em que o dito método compreende a etapa a-dicional de: (j) identificar um ou mais Ioci que foi subme-tido a um ré-arranjo genômico que é associado com uma doença.
Em um décimo oitavo aspecto, é fornecido um métodode ensaio para identificar um ou mais agentes que modulamuma interação de DNA-DNA que compreende as etapas de: (a)colocar uma amostra em contato com um ou mais agentes; e (b)realizar as etapas (a) a (i) do primeiro e segundo aspectosda presente invenção, em que a etapa (a) compreende fornecerDNA reticulado da amostra;
em que uma diferença entre (i) a freqüência de in-teração entre as seqüências de DNA na presença do agente e(ii) a freqüência de interação entre as seqüências de DNA naausência do agente é indicativa de um agente que modula ainteração de DNA-DNA.
Em um décimo nono aspecto, é fornecido um métodopara detectar a localização de um ponto de ruptura equili-brado e/ou desequilibrado (por exemplo, uma translocação)que compreende a etapa de: (a) realizar as etapas (a) a (i)do primeiro e segundo aspectos da presente invenção; e (b)comparar a freqüência de interação entre as seqüências deDNA com a de um controle; em que uma transição de baixa aalta freqüência de interação de DNA-DNA na amostra comparadocom o controle é indicativa da localização de um ponto deruptura.
Em um vigésimo aspecto, é fornecido um método paradetectar a localização de uma inversão equilibrada e/ou de-sequilibrada que compreende as etapas de: (a) realizar asetapas (a) a (i) do primeiro e segundo aspectos da presenteinvenção; e (b) comparar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA com a de um controle; em que um padrão in-verso de freqüências de interação de DNA-DNA para a amostracomparadas com o controle é indicativo de uma inversão.
Em um vigésimo primeiro aspecto, é fornecido ummétodo para detectar a localização de uma deleção que com-preende as etapas de: (a) realizar as etapas (a) a (i) doprimeiro e segundo aspectos da presente invenção; (b) compa-rar a freqüência de interação entre as seqüências de DNA coma de um controle; em que uma redução na interação de fre-qüência de DNA-DNA para a amostra comparada com o controle éindicativa de deleção.
Em um vigésimo segundo aspecto, é fornecido um mé-todo para detectar a localização de uma duplicação que com-preende as etapas de: (a) realizar as etapas (a) a (i) doprimeiro e segundo aspectos da presente invenção; e (b) com-parar a freqüência de interação entre as seqüências de DNAcom a de um controle; em que um aumento ou uma diminuição nainteração de freqüência de DNA-DNA para a amostra do sujeitocomparado com o controle é indicativo de uma duplicação ouinserção.
Em um vigésimo terceiro aspecto, é fornecido umagente obtido ou obtenivel pelo método de arranjo aqui descrito.
Em um vigésimo quarto aspecto, é possibilitado ouso da seqüência de nucleotideos circularizada para identi-ficar uma ou mais interações de DNA-DNA em uma amostra.
Em um vigésimo quinto aspecto, é possibilitado ouso da seqüência de nucleotideos circularizada para o diag-nóstico ou prognóstico de uma doença ou sindrome causada ouassociada com uma mudança em uma interação de DNA-DNA.
Em um vigésimo sexto aspecto, é possibilitado ouso do arranjo de sondas ou o conjunto de sondas aqui des-crito para identificar uma ou mais interações de DNA-DNA emuma amostra.
Em um vigésimo sétimo aspecto, é possibilitado ouso do arranjo de sondas ou o conjunto de sondas aqui des-crito para o diagnóstico ou prognóstico da doença ou sindro-me causada ou associada com uma mudança em uma interação deDNA-DNA.
Em um vigésimo oitavo aspecto, é possibilitado ouso do arranjo aqui descrito para identificar uma ou maisinterações de DNA-DNA em uma amostra.Em um vigésimo nono aspecto, é possibilitado o usodo arranjo aqui descrito para o diagnóstico ou prognósticode uma doença ou sindrome causada ou associada com uma mu-dança em uma interação de DNA-DNA.
Em um trigésimo aspecto, é fornecido um método,um arranjo de sondas, um conjunto de sondas, um processo,um arranjo, um método de ensaio, um agente, ou um uso subs-tancialmente da forma aqui descrita e com referência aqualquer dos Exemplos ou Figuras.
Modalidades preferidas
Preferivelmente, a reação da ligação na etapa (f)resulta na formação de círculos de DNA.
Preferivelmente, a seqüência de nucleotídeos alvoé selecionada do grupo que consiste em um ré-arranjo genômi-co, promotor, um intensificador, um silenciador, um isolan-te, uma região de anexação de matriz, uma região de controlede locus, uma unidade de transcrição, uma origem de replica-ção, um ponto de acesso de recombinação, um ponto de rupturade translocação, um centrômero, um telômero, uma região den-sa em genes, uma região pobre em genes, um elemento repeti-tivo e um sítio de integração (viral).
Preferivelmente, a seqüência de nucleotídeos alvoé uma seqüência de nucleotídeos que é associada com uma do-ença, ou que causa a mesma, ou é localizada até 15 Mb oumais em um padrão de DNA linear de um locus que é associadocom uma doença ou que causa a mesma.
Preferivelmente, a seqüência de nucleotídeos alvosé selecionada do grupo que consiste em: AMLl, MLL, MYC, BCL,BCR , ABLI, IGH, LYLl, TALl, TAL2, LM02, TCR α/ δ, TCRfi e HOXou outros Ioci associados com doença como descrito em "Cata-logue of unbalanced Chromossome Aberrations in Man" 2nd edi-tion. Albert Schinzel. Berlin: Waiter de Gruyter, 2001.ISBN. 3-11-011607-3.
Preferivelmente, a enzima de restrição primária éuma enzima de restrição que reconhece um sitio de reconheci-mento de 6-8 bp.
Preferivelmente, a enzima de restrição primária éselecionada do grupo que consiste em BgllIr HindIIIr EcoRIrBamHIf Spei, PstI e NdeI.
Preferivelmente, a enzima de restrição secundáriaé uma enzima de restrição que reconhece um sitio de reconhe-cimento de seqüência de nucleotideos de 4 ou 5 bp.
Preferivelmente, o sitio de reconhecimento da en-zima de restrição secundária é localizado em mais que cercade 350 bp do sitio de restrição primário na seqüência de nu-cleotideos alvo.
Preferivelmente, a seqüência de nucleotideos émarcada.
Preferivelmente, as sondas são complementares emseqüência à seqüência de ácido nucléico adjacente a cada la-do de cada um dos sítios de reconhecimento da enzima de res-trição primária de uma enzima de restrição primária no DNAgenômico.
Preferivelmente, as sondas são complementares emseqüência à seqüência de ácido nucléico que está menos que300 pares de base de cada um dos sítios de reconhecimento daenzima de restrição primária de uma enzima de restrição pri-mária no DNA genômico.
Preferivelmente, as sondas são complementares àseqüência que está menos que 300 bp de cada um dos sítios dereconhecimento da enzima de restrição primária de uma enzimade restrição primária no DNA genômico.
Preferivelmente, as sondas são complementares àseqüência que está entre 200 e 300 bp de cada um dos sítiosde reconhecimento da enzima de restrição primária de uma en-zima de restrição primária no DNA genômico.
Preferivelmente, as sondas são complementares àseqüência que está entre.100 e 200 bp ou 0 a 100 bp de cadaum dos sítios de reconhecimento da enzima de restrição pri-mária de uma enzima de restrição primária no DNA genômico.
Preferivelmente, duas ou mais as sondas são capa-zes de hibridizar para a seqüência adjacente a cada sítio dereconhecimento da enzima de restrição primária de uma enzimade restrição primária no DNA genômico.
Preferivelmente, as sondas sobrepõem-se, ou sobre-põem-se parcialmente.
Preferivelmente, a sobreposição é menos que 10 nu-cleotídeos.
Preferivelmente, a seqüência de sonda correspondea toda ou parte da seqüência entre cada um dos sítios de re-conhecimento da enzima de restrição primária de uma enzimarestrição de primária e cada um dos primeiros sítios de re-conhecimento de enzima de restrição secundária vizinhos deuma enzima de restrição secundária.Preferivelmente, cada sonda é pelo menos 25 mer.
Preferivelmente, cada uma das sondas é 25-60 mer.
Preferivelmente, as sondas são produtos de ampli-ficação PCR.
Preferivelmente, o arranjo compreende cerca de300.000-400.000 sondas.
Preferivelmente, o arranjo compreende cerca de385.000 ou mais sondas, preferivelmente, cerca de 750.000sondas, mais preferivelmente, 6 χ 750.000 sondas.
Preferivelmente, o arranjo compreende ou consisteem uma representação do genoma completo de uma dada espécieem baixa resolução.
Preferivelmente, uma a cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9ou 10 sondas ordenadas em um padrão de cromossomo linear écontida no arranjo.
Preferivelmente, uma transição de freqüências dainteração baixa para alta é indicativa da localização de umponto de ruptura equilibrado e/ou desequilibrado.
Preferivelmente, um padrão inverso de freqüênciasda interação de DNA-DNA para a amostra do sujeito comparadacom o controle é indicativo de uma inversão equilibrada e/oudesequilibrada.
Preferivelmente, uma redução na interação da fre-qüência de DNA-DNA para a amostra do sujeito comparada com ocontrole, em combinação com um aumento na interação de fre-qüência de DNA-DNA para regiões mais distantes, é indicativade uma deleção equilibrada e/ou desequilibrada.
Preferivelmente, um aumento ou uma diminuição nafreqüência de interação de DNA-DNA para a amostra do sujeitocomparado com o controle é indicativo de uma duplicação ouinserção equilibrada e/ou desequilibrada.
Preferivelmente, cariotipagem espectral e/ou FISHé usado antes de realizar o dito método.
Preferivelmente, a doença é uma doença genética.
Preferivelmente, a doença é câncer.
Preferivelmente, as duas ou mais seqüências ampli-ficadas são diferencialmente marcadas.
Preferivelmente, as duas ou mais seqüências ampli-ficadas são identicamente marcadas quando as seqüências re-sidem em diferentes cromossomos.
Preferivelmente, as duas ou mais seqüências ampli-ficadas são identicamente marcadas quando as seqüências re-sidem no mesmo cromossomo a uma distância que é grande obastante para mínima sobreposição entre interação de sinaisde DNA-DNA.
Preferivelmente, em que o diagnóstico ou prognós-tico é diagnóstico ou prognóstico pré-natal.
Vantagens
A presente invenção tem inúmeras vantagens. Estasvantagens ficam aparentes na descrição seguinte.
A título de exemplo, a presente invenção é vanta-josa uma vez que ela fornece inter alia seqüências de nucle-otídeos, processos, sondas e arranjos comercialmente úteis.
A título de exemplo adicional, a presente invençãoé vantajosa uma vez que ela fornece a análise de alta produ-ção da freqüência de interação de duas ou mais seqüências denucleotídeos no espaço nuclear.
A titulo de exemplo adicional, a presente invençãoé vantajosa uma vez que, usando tecnologia 3C convencional,cada interação simples de DNA-DNA deve ser analisada por umaúnica reação de PCR contendo um único par de iniciadores.Análise de alta produção é portanto possível somente se oPCR for automatizado, mas o custo de tantos iniciadores serámuito alto. Desta maneira, alta produção (genoma amplo) aná-lise de interações de DNA-DNA não é viável com tecnologia 3Cconvencional. Ao contrário, a presente invenção permite ago-ra a seleção simultânea de milhares de interações de DNA-DNA. Análise de alta produção de interações de DNA-DNA deacordo com a presente invenção aumentará bastante a escala eresolução de análise.
A título de exemplo adicional, a presente invençãoé vantajosa uma vez que, usando tecnologia 3C convencional,a seleção é voltada para as seqüências de DNA cujos oligonu-cleotídeos iniciadores foram designados, solicitados e in-cluídos na análise. A escolha de tais oligonucleotídeos ini-ciadores é tipicamente com base no conhecimento concernenteà posição, por exemplo, (distante) de sítios melhoradorese/ou outros sítios elementos/ hipersensível reguladores queacredita-se serão reticulados com a seqüência de nucleotí-deos que está sendo investigada. Assim, 3C convencional évoltado para o projeto de iniciadores PCR que são incluídosna etapa de amplificação de PCR, ao passo que 4C não é vol-tado e pode ser usado para pesquisar o genoma completo paraelementos de DNA de interação. Isto se dá em virtude de aamplificação de seqüências reticuladas no 4C não ser baseadano conhecimento previsto de seqüências que reticulam com aseqüência de nucleotideos sendo investigada. Particularmen-te, em uma modalidade de 4C, seqüências que reticulam com aprimeira seqüência de nucleotideos (visada) podem ser ampli-ficadas usando iniciadores PCR que hibridizam para a seqüên-cia de nucleotideos. Assim, a presente invenção permite umaseleção ampla de genoma não voltado para interações de DNA-DNA.
A titulo de exemplo adicional, a presente invençãoé vantajosa porque usando tecnologia 3C convencional somentepermite a amplificação seletiva de uma interação simples deDNA-DNA. Isto não é informativo quando hibridizado em um ar-ranjo. A tecnologia foi melhorada de maneira que todos osfragmentos que interagem com uma primeira seqüência de nu-cleotideos (visada) sejam agora amplificados, por exemplo,amplificados seletivamente.
A titulo de exemplo adicional, a presente invençãoé vantajosa porque a tecnologia 4C pode ser usada para de-tectar aberrações genéticas balanceadas ou não balanceadas -tais como todos os tipos de translocações, deleções, inver-sões, duplicações e outros ré-arranjos genômicos - em ácidonucléico, por exemplo, cromossomos. Tecnologia 4C (que medea proximidade de fragmentos de DNA) pode ainda determinar apredisposição de um sujeito para adquirir certas transloca-ções, deleções, inversões, duplicações e outros ré-arranjosgenômicos (por exemplo, translocações, deleções, inversões,duplicações e outros ré-arranjos genômicos balanceados ounão balanceados). Uma vantagem em relação às estratégias a-tuais é que não é necessário conhecer a posição exata da mu-dança em virtude de a resolução de tecnologia 4C ser de ma-neira tal que ela pode ser usada para detectar ré-arranjosmesmo quando o s4C-bait' (definido pelos sítios de reconhe-cimento de enzima de restrição primária e secundária que sãoanalisados) é localizada fora (por exemplo, até uma megabaseou ainda mais) da mudança. Uma outra vantagem é que tecnolo-gia 4C permite o mapeamento preciso de mudanças, uma vez queela pode ser usada para definir os dois sítios de restrição(primária) entre os quais as mudanças ocorreram. Uma outravantagem é que células não precisam ser cultivadas antes dafixação. Assim, tumores sólidos, por exemplo, podem tambémser analisados por ré-arranjos genômicos.
A título de exemplo adicional, a presente invençãoé vantajosa em virtude de a tecnologia 4C poder também de-tectar mudanças (por exemplo, ré-arranjos) em um estado pré-maligno, isto é, antes de todas as células conterem estasmudanças. Assim, a tecnologia pode ser usada não somente nodiagnóstico de doença, mas também no prognóstico de doença.
A título de exemplo adicional, o desenho do arran-jo de acordo com a presente invenção é particularmente van-tajoso comparado com os arranjos de ladrilhamento genômicoexistentes - tais como arranjos de ladrilhamento genômicoNimblegen - uma vez que o desenho permite representação deuma parte muito grande do genoma por arranjo simples. A tí-tulo de exemplo, para uma enzima de restrição que reconheceuma seqüência de hexa-nucleotídeos, cerca de 3 arranjos comcerca de 385.000 sondas cada serão suficientes cobrir, porexemplo, o genoma humano ou de camundongo completo. Para umaenzima de restrição que reconhece mais que 6 bp, um arranjosimples de cerca de 385.000 sondas pode ser usado para co-brir, por exemplo, o genoma humano ou de camundongo comple-to. As vantagens do desenho do arranjo são que: (1) cadasonda é informativa uma vez que cada qual analisa um eventode ligação independente, facilitando muito a interpretaçãodo resultado; e (2) uma grande representação do genoma podeser localizada em um arranjo simples que é barato.
Tecnologia 4C pode ser vantajosamente usada para omapeamento fino de ré-arranjos pouco caracterizados origi-nalmente detectados por abordagens citogenéticas (microsco-pia luminosa, FISH, SKY, etc.).
Tecnologia 4C pode ser vantajosamente usada para aseleção simultânea em um arranjo simples para combinações deré-arranjos que ocorreram próximo aos múltiplos Ioci.Descrição resumida das figuras
Figura 1
O principio da tecnologia 3C
Figura 2
(a) 0 principio de uma modalidade de tecnologia4C. Análise 3C é realizada da maneira usual, como, por exem-plo, HindIII (H) como enzima de restrição. Após reversão dereticulações, a mistura de DNA conterá uma primeira seqüên-cia de nucleotideos (visada) ligada a muitos fragmentos di-ferentes. Estes fragmentos serão amplificados e marcados u-sando métodos de amplificação - tal como PCR inverso - empor exemplo, círculos DpnII, usando primeiramente iniciado-res específicos de seqüência de nucleotídeo (visados). Pro-dutos de amplificação marcados podem ser· hibridizados com osarranjos aqui descritos. HindIII e DpnII são dados como e-xemplos, mas outras combinações de enzimas de restrição -tais como 6 ou 8- e 4 ou 5-cortadores - podem também ser u-sadas. (b) Resultado de PCR separado por eletroforese de gelde duas amostras de fígado (LI, L2) e cérebro (BI, B2) fe-tais independentes, (c) Representação esquemática da locali-zação das sondas de microarranjo. Sondas foram projetadas em100 bp de sítios HindII. Assim, cada sonda analisa um possí-vel parceiro de ligação.
Figura 3
Tecnologia 4C detecta o ambiente genômico de β-globina (cromossomo 7). Razões não processadas são apresen-tadas (sinais 4C para β-globina em HS2 divididos por sinaisobtidos para amostra de controle) para sondas localizadas emregiões genômicas ~35 Mb em cromossomo de camundongo 10, 11,12, 14, 15, 7 e 8 (do topo até a base; regiões apresentadassão em distância idêntica de cada centrômero corresponden-te). Note o grande agrupamento de fortes sinais em torno dobait (globina) no cromossomo 7 (fileira 6), que demonstraque tecnologia 4C detecta fragmentos genômicos próximo dopadrão de cromossomo linear (de acordo com o fato de quefreqüências da interação são inversamente proporcionais àseparação do sítio genômico). Note que a região ligada emeis em torno do bait que apresenta altas intensidades de si-nal é grande (>5Mb), implicando, por exemplo, que transloca-ções podem ser detectadas mesmo com baits afastados mais que1 MB do ponto de ruptura.
Figura 4
Tecnologia 4C detecta o ambiente genômico deRad23A (cromossomo 8). Razões não processadas são apresenta-das (sinais 4C para Rad23A divididos por sinal obtido paraamostra de controle) para sondas localizadas em regiões ge-nômicas de ~15 Mb ou mais em cromossomo de camundongo 10,11, 12, 14, 15, 7 e 8 (do topo até a base; regiões apresen-tadas são em distância idêntica de cada centrômero corres-pondente). Note o grande agrupamento de fortes sinais emtorno do bait (Rad23A) no cromossomo 8 (fileira 7), que de-monstra que tecnologia 4C detecta fragmentos genômicos pró-ximo do padrão de cromossomo linear (de acordo com o fatoque freqüências da interação são inversamente proporcionaisà separação do sitio genômico). Note que a região ligada emeis em torno do bait que apresenta altas intensidades de si-nal é grande (>5Mb), implicando por exemplo que transloca-ções podem ser detectadas mesmo com baits afastados mais que1 MB do ponto de ruptura.
Figura 5
Interações 4C de β-globina no cromossomo 7(~135Mb) para um tecido de transcrição (fígado fetal) e umtecido de não transcrição (cérebro fetal) (analisado por umaabordagem de meio de corrida). Note que interações de longoalcance com β-globina diferem entre tecidos (provavelmentedependente do estado de transcrição do gene). Independentedo tecido, fortes sinais 4C limitam uma grande região (>5Mb) em torno do bait.
Figura 6
Uros e Eraf interagem com β-globina em células defígado fetal. A abordagem 4C revela que dois genes, Eraf eUros, interagem >30 Mb com o locus β-globina localizado a-fastado ~30 Mb. Estas duas interações foram previamente en-contradas por uma tecnologia diferente (Fluorescence In situHybridisation) descrito em Osborne et al., Nature Genetics36, 1065 (2004). Este exemplo mostra que interações de longoalcance detectadas pela tecnologia 4C podem ser verificadaspor FISH e refletem verdadeiramente a proximidade nuclear.
Figura 7
Tecnologia 4C identifica precisamente transiçõesentre regiões genômicas não relacionadas que são ligadas emeis. Para estes experimentos, foram usados camundongostransgênicos que contêm um cassete da região de controle delocus de β-globina humano (LCR) (~20 kb) inserido (por meiode recombinação homóloga) no locus Rad23A em cromossomo decamundongo 8. Tecnologia 4C foi realizada em fígados fetaisE14.5 de camundongos transgênicos que foram homozigotos paraesta inserção. Um fragmento HindIII no cassete da integração(HS2) foi usado como N4C-bait'. Os dados mostram que a tec-nologia 4C define precisamente tanto extremidades do cassetetransgênico (fileira de base: somente as sondas no LCR huma-no (~20kb) dá sinais 4C e não sondas no restante de -380 kbda seqüência de β-globina humano), e revela claramente a po-sição de integração em cromossomo de camundongo 8 (painelsuperior: comparar os sinais no cromossomo 8 (para posiçãode integração, ver seta) com sinais em 6 outros cromossomode camundongos) (cromossomos completos são representados).
Este exemplo mostra que a tecnologia 4C pode ser usada paradetectar a posição genômico de fragmentos de DNA etopicamen-te integrados (virus, transgene, etc.). Ele mostra que tran-sições entre regiões genômicas não relacionadas que são li-gadas em eis podem ser identificadas precisamente, que podemser usadas para identificar parceiros de pontos de rupturagenômico e localização.
Figura 8
Tecnologia 4C produz dados reprodutiveis, uma vezque o perfil para HS2 e β-globina são muito similares. Qua-tro experimentos 4C biologicamente independentes foram rea-lizados em fígados fetais E14.5, usando tanto o gene β-globina β-principal (2 fileiras superiores) quanto β-globinaHS2 (base de duas fileiras) como o bait. Estes baits são ~40kb separados no padrão de cromossomo linear mas mostrarampreviamente estar perto do espaço nuclear (Tolhuis et al.rMolecular Cell 10, 1453 (2002)) Uma região -5 Mb é descritaem cromossomo de camundongo 7 que é 20-20 Mb fora do locusβ-globina. Os dados mostram alta reprodutibilidade entre ex-perimentos independentes e demonstram que dois fragmentosperto do espaço nuclear compartilham parceiros de interaçãolocalizados em outro lugar no genoma.
Figura 9
A tecnologia 4C é aplicada para medir freqüênciasda interação de DNA-DNA com seqüência X (em cromossomo A) emcélulas de uma pessoa saudável (topo) e um paciente comtranslocação (A;B) (base). Intensidades de sinal represen-tando freqüências da interação de DNA-DNA (eixo-Y) são colo-cadas em gráfico para sondas solicitadas em padrões de cro-mossomo lineares (eixo-X) Em células normais, interações deDNA-DNA freqüentes são detectadas em cromossomo A em tornoda seqüência X. Em células de paciente, uma redução de 50 %nas freqüências da interação é observada para sondas em cro-mossomo A localizadas no outro lado do ponto de ruptura (BP)(comparar curva cinza (paciente) com linha preta (pessoasaudável). Além do mais, o translocação traz parte do cro-mossomo B na proximidade fisica imediata para a seqüência X,e interações de DNA-DNA freqüentes são agora observadas paraesta região no cromossomo Β. A transição abrupta das fre-qüências da interação baixa para alta neste cromossomo marcaa localização de seu ponto de ruptura.
Figura 10
Inversão(s) (balanceada(s)) podem ser detectadaspela tecnologia 4C. Parceitos inversos de freqüências da in-teração de DNA-DNA (medidos pela tecnologia 4C como intensi-dades de sinal de hibridização) são observados em sujeitodoente (curva cheia) comparado com não doente (curva ponti-lhada), que revela a presença e tamanho da inversão.
Figura 11
Detecção de deleção(s) heterozigoto pela tecnolo-gia 4C. Sondas com freqüências da interação de DNA-DNA redu-zidas (medidas pela tecnologia 4C como intensidades de sinalde hibridização) em sujeitos doentes (curva cinza) comparadocom não doentes (curva preta), revelam a posição e tamanhoda região deletada. Sinais de hibridização residuais na re-gião deletada do sujeito doente proveniente de alelo intacto(deleção heterozigoto). Deleção é tipicamente acompanhadapor um aumento nas intensidades de sinal para sondas locali-zadas diretamente além da região deletada (note que a curvacinza está acima da curva preta no lado direito da deleção),uma vez que estas regiões ficam em proximidade física imedi-ata com a seqüência 4C (bait).
Figura 12
Duplicação detectada pela tecnologia 4C. Sondascom maiores sinais de hibridização em um paciente (curvacheia) comparadas com um sujeito normal (curva pontilhada)indicam a posição e tamanho de duplicação. Duplicação detec-tada pela tecnologia 4C é tipicamente acompanhada por meno- 'res sinais de hibridização em doente em função de sujeitonão doente para sondas além da região duplicada (duplicaçãoaumenta sua separação do sítio genômico da seqüência 4C).
Figura 13
Interações de longo alcance com β-globina revela-das pela tecnologia 4C. a, Razões não processadas de 4C so-bre sinais de hibridização de controle, revelando interaçõesde β-globina HS2 com cromossomo 7 e dois cromossomos não re-lacionados (8 e 14). b-c, Dados não processados para duasamostras de fígado fetal (topo, em vermelho) e cérebro fetal(base, em azul) independentes colocados em gráfico junto comduas diferentes regiões 1-2 Mb em cromossomo 7. Agrupamentosaltamente produtíveis de interações são observados tanto nasduas amostras de fígado fetal (b) quanto nas duas amostrasde cérebro (c). d-e, Dados de meio de corrida para as mesmasregiões. Taxa de falsa descoberta foi ajustada em 5 % (linhapontilhada). f, Representação esquemática de regiões de in-teração com β-globina ativa (figado fetal, topo) e inativa(cérebro fetal, base) no cromossomo 7.
Figura 14
β-globina ativa e inativa interage com regiõescromossomais ativas e inativas, respectivamente, a, Compara-ção entre interações β-globina de longo alcance em figadofetal (meio de corrida 4C, topo), análise de expressão demicroarranjo em figado fetal (escala log, meio) e a locali-zação de genes (base) colocados em gráfico junto com uma re-gião 4 Mb que contém o gene Uros (30 Mb fora de β-globina) ,mostrando que β-globina ativa interage preferencialmente comoutros genes ativamente transcritos, b, A mesma comparaçãoem cérebro fetal em torno um agrupamento de gene OR locali-zado - 38 distante de globina, mostrando que β-globina ina-tiva interage preferencialmente com regiões inativas, c, Ca-racterização de regiões interagindo com β-globina em figadofetal (esquerdo) e cérebro, (direito) em termos de teor dogene e atividade.
Figura 15
Rad23A unipresentemente expresso interage com re-giões ativas muito similares, em figado e cérebro fetal. a,Representação esquemática de regiões em cromossomo 8 intera-gindo com Rad23A ativo em figado fetal (topo, vermelho) ecérebro (base, azul), b, Comparação entre interações Rad23Ade longo alcance (meio de corrida 4C) e análise de expressãode microarranjo (escala log) em fígado fetal (topo de doispainéis), interações Rad23A de longo alcance (meio de corri-da 4C) e análise de expressão de microarranjo (escala log)em cérebro fetal (painel 3 e 4) e a localização de genes(painel inferior) colocados em gráfico junto com uma região3 Mb de cromossomo 8. c, Caracterização de regiões intera-gindo com Rad23A em fígado (esquerdo) e cérebro (direito)fetal em termos de teor de gene e atividade.
Figura 16
Cryo-FISH confirma que tecnologia 4C identificaverdadeiramente regiões de interação, a, exemplo de parte deuma seção cryo (200 nm) mostrando mais que 10 núcleos, al-guns dos quais contendo o locus β-globina (verde) e/ou Uros(vermelho). Por causa do seccionamento, muitos núcleos nãocontêm sinais para esses dois Ioci. b-d, exemplos de sinaissobrepostos completamente (b) e parcialmente (c) e sinais decontato (d) , que foram todos pontuados como positivo parainteração, e-g, exemplos de núcleos contendo em alelos denão contato (e-f) e um núcleo contendo somente β-globina(g) , que foram todos pontuados como negativos para intera-ção. Representação esquemática de resultado cryo-FISH. Por-centagens de interação com β-globina (h) e Rad23A (i) sãoindicadas acima dos cromossomos para regiões positivamenteidentificadas (ponta de flecha vermelha) e negativamente i-dentificadas (ponta de flecha azul) pela tecnologia 4C. Osmesmos BACs foram usados para os dois tecidos. Freqüênciasda interação medidas por cryo-FISH entre dois agrupamentosde gene OR distantes em fígado fetal e cérebro são indicadosabaixo dos cromossomos.
Figura 17
Análise 4C de HS2 e β-principal deu resultado al-tamente similar. (a( Dados 4C não processadas de quatro a-mostras de fígado E14.5 independentes apresentaram um padrãomuito similar de interação com HS2 (topo) e β-principal (ba-se). (b) Um Existe uma grande sobreposição entre sondas pon-tuadas positivo para interação no experimento HS-2 e sondasque pontuam positivo para interação no experimento β-principal.
Figura 18
Uma comparação entre interações em eis e em trans.(a) Dados 4C não processados de dois experimentos indepen-dentes mostrando interações β-globina com uma região positi-vãmente identificada em eis (cromossomo 7, topo) e uma regi-ão em trans contendo o locus α-globina (chr.ll, base), (b)
Dados 4C não processadas de dois experimentos independentesmostrando interações Rad23A com uma região positivamente i-dentifiçada em eis (cromossomo 8, topo) e uma região emtrans que aparece em topo quando classificada de acordo como maior valor do meio de corrida. Nenhuma das regiões emtrans atendeu as condições rigorosas que permitiram a iden-tificação de regiões de longa interação em eis.
Figura 19
Regiões que interagem com β-globina também fazemcontato freqüentemente umas com as outras. Duas regiões (se-paradas uma da outra quase 60 Mb), contendo genes ativamentetranscritos e identificadas pela tecnologia 4C para intera-gir com β-globina em fígado fetal, mostraram freqüências deco-localização por cryo-FISH de 5,5 %, que foi significati-vamente mais que as freqüências de co-localização de fundo.
Descrição detalhada da invenção
Tecnologia 3c
O método 3C foi descrito com detalhe em Dekker atal. (2002), Tolhuis at al. (2002), Palstra at al. (2003),Splinter at al. (2004) and Drissen at al. (2004). Resumida-mente, 3C é realizado digerindo DNA reticulado com uma enzi-ma de restrição primária seguido por ligação em concentra-ções de DNA muito baixas. Nestas condições, ligação de frag-mentos reticulados, que é intramolecular, é fortemente favo-recida em relação a ligação de fragmentos aleatórios, que éintermolecular. A reticulação é em seguida revertida, e pro-dutos de ligação individuais são detectados e quantificadospela reação da cadeia polimerase (PCR) usando iniciadoresespecíficos de locus. A freqüência da reticulação (X) dedois Ioci específicos é determinada por reações PCR quanti-tativas usando controle e padrões reticulados, e X é expres-so como a razão da quantidade do produto obtido com o padrãoreticulado e com o padrão de controle.
De acordo com a presente invenção, um padrão 3C épreparado usando os métodos descritos por Splinter et at. ,(2004) Methods Enzymol. 375, 493-507. (isto é, fixação deformaldeído, digestão de enzima de restrição (primária), ré-ligação de fragmentos de DNA reticulados e purificação deDNA). Resumidamente, uma amostra - tal como células, tecidosou R núcleos - é fixada usando um agente de reticulação -tal como formaldeido. A digestão de enzima de restrição pri-mária é em seguida realizada de maneira que o DNA é digeridono contexto dos núcleos reticulados. Ligação intramolecularé em seguida realizada em baixas concentrações de DNA (porexemplo, cerca de 3,7 ng/pL), que favorece ligação entrefragmentos de DNA reticulados (isto é, ligação intramolecu-lar) relacionados a ligação entre fragmentos de DNA não re-ticulados (isto é, ligação intermolecular ou aleatória). Emseguida, as reticulações são revertidas e o DNA pode ser pu-rifiçado. O padrão 3C que é produzido contém fragmentos derestrição que são ligados em virtude de eles estarem origi-nalmente perto do espaço nuclear.
Uma vez que uma enzima de restrição primária é u-sada para digerir o DNA antes da etapa de ligação intramole-cular, um sitio de reconhecimento de enzima para a enzima deprimária restrição separará a primeira seqüência de nucleo-tideos (visada) e a seqüência de nucleotideos que foi liga-da. Desta maneira, o sitio de reconhecimento primário é lo-calizado entre a primeira seqüência de nucleotideos (visada)e a seqüência de nucleotideos ligada (isto é, a segunda se-qüência ligada).
Seqüência de nucleotideos
A presente invenção envolve o uso de seqüências denucleotideos (por exemplo, padrão 3Cs, padrão 4Cs, padrõesde DNA, padrões de amplificação, fragmentos de DNA e DNA ge-nômico), que podem ser disponíveis em bases de dados.
A seqüência de nucleotideos pode ser DNA ou RNA deorigem genômica, sintética ou recombinante, por exemplo, cD-NA. Por exemplo, seqüências de nucleotideos recombinantespodem ser preparadas usando técnicas de clonagem PCR. Istoenvolverá fazer um par de iniciadores flanquear uma regiãoda seqüência a qual se deseja clonar, colocar os iniciadoresem contato com mRNA ou cDNA obtido, por exemplo, de um mamí-fero (por exemplo, célula animal ou humana) ou célula nãomamífero, desenvolver uma reação da cadeia polimerase (PCR)em condições que realizam amplificação da região desejada,isolar o fragmento amplificado (por exemplo, purificando amistura da reação em um gel de agarose) e recuperar o DNAamplificado. Os iniciadores podem ser projetados para contersítios de reconhecimento de enzima de restrição adequadospara que o DNA amplificado possa ser clonado em um vetor declonagem adequado.
A seqüência de nucleotideos pode ser fita dupla oufita única, quer representando a fita de sentido como anti-sentido, ou suas combinações.
Para alguns aspectos, prefere-se que a seqüênciade nucleotideos seja DNA de fita única - tais como iniciado-res de fita única e sondas.
Para alguns aspectos, prefere-se que a seqüênciade nucleotideos seja DNA de fita dupla - tais como padrões3C e 4C de fita dupla.
Para alguns aspectos, prefere-se que a seqüênciade nucleotideos seja DNA genômico - tais como um ou mais lo-ci genômicos.
Para alguns aspectos, prefere-se que a seqüênciade nucleotideos seja DNA cromossômico.A seqüência de nucleotideos pode compreender umaprimeira seqüência de nucleotideos (visada) e/ou uma segundaseqüência de nucleotideos.
Os sítios de reconhecimento de enzima de restriçãoprimária e secundária serão diferentes uns dos outros e o-correrão tipicamente somente uma vez na seqüência de nucleo-tideos.
Em um aspecto, é fornecida uma seqüência de nucle-otideos circularizada que compreende uma primeira seqüênciade nucleotideos e (por exemplo, ligada a) uma segunda se-qüência de nucleotideos separadas (por exemplo, divididas,ou partidas) por um sítio de reconhecimento de enzima derestrição primária e uma secundária, em que a dita primeiraseqüência de nucleotideos é uma seqüência de nucleotideosalvo e a dita segunda seqüência de nucleotideos é obtenívelreticulando DNA genômico (por exemplo, in vivo ou in vitro).
Os sítios de reconhecimento de enzima de restrição primáriae secundária serão diferentes uns dos outros e ocorrerão ti-picamente somente uma vez na seqüência de nucleotideos.
Em um aspecto adicional, é fornecida uma seqüênciade nucleotideos circularizada que compreende uma primeiraseqüência de nucleotideos e (por exemplo, ligada) uma segun-da seqüência de nucleotideos separada (por exemplo, dividi-da, ou partida) por um sítio de reconhecimento de enzima derestrição primária e uma secundária, em que a dita primeiraseqüência de nucleotideos é uma seqüência de nucleotideosalvo e em que a dita primeira e segunda seqüências de nucle-otideos são obteníveis por um processo que compreende as e-tapas de (a) reticular DNA genômico de (por exemplo, in vivoou in vitro); (b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária; (c) ligar as seqüências de nucleotideosreticuladas; (d) reverter a reticulação; e (e) digerir asseqüências de nucleotideos com uma enzima de restrição se-cundária para circularizar as seqüências de nucleotideos.
Preferivelmente, a segunda seqüência de nucleoti-deos cruza (por exemplo, corta) a primeira seqüência de nu-cleotideos (visada). Desta maneira, a seqüência de nucleoti-deos compreende a segunda seqüência de nucleotideos, que se-para a primeira seqüência de nucleotideos (visada) em duasporções ou fragmentos - tal como aproximadamente duas por-ções igualmente dimensionadas ou fragmentos. Tipicamente, asporções ou fragmentos terão pelo menos cerca de 16 nucleotí-deos de comprimento.
Primeira seqüência de nucleotideos
A primeira seqüência de nucleotideos é uma seqüên-cia de nucleotideos alvo.
Da maneira aqui usada, o termo "seqüência de nu-cleotideos alvo" refere-se a seqüência que é usada como umaseqüência bait a fim de identificar uma ou mais seqüênciasao qual ela reticula (por exemplo, uma ou mais seqüências denucleotideos de interesse ou uma ou mais seqüências de com-posição de seqüência de nucleotideos desconhecida).
A seqüência de nucleotideos alvo é de seqüênciaconhecida.
Reticulação é indicativo de que a seqüência de nu-cleotideos alvo e a seqüência reticulada a ela estavam ori-ginalmente próximas no espaço nuclear. Determinando-se afreqüência para que seqüências fiquem próximas umas das ou-tras, é possível entender, por exemplo, a conformação decromossomos e regiões cromossomais no contexto espacial donúcleo (por exemplo, in vivo ou in vitro) . Além do mais, épossível entender as organizações estruturais confusas nogenoma, por exemplo, quando melhoradores ou outros elementosreguladores transcricionais comunicam com promotores distan-tes localizados em eis ou mesmo em trans. Além do mais, éainda possível entender o posicionamento de uma dada regiãogenômica em relação às seqüências de nucleotídeos presentesno mesmo cromossomo (em eis) bem como a seqüências de nucle-otídeos em outros cromossomos (em trans). Assim, é possívelmapear seqüências de nucleotídeos em diferentes cromossomosque freqüentemente compartilham sítios no espaço nuclear.Além do mais, é ainda possível detectar aberrações genéticasequilibradas e/ou desequilibradas - tais como translocações,deleções, inversões, duplicações e outros ré-arranjos genô-micos equilibrados e/ou desequilibrados (por exemplo, dele-ções ou translocações em um ou mais cromossomos) . A esterespeito, aberrações genéticas resultam em mudanças nas in-terações de DNA-DNA na posição que a mudança ocorreu, quepode ser detectada.
A primeira seqüência de nucleotídeos (visada) deacordo com a presente invenção pode ser qualquer seqüênciaem que se deseja determinar a freqüência de interação no es-paço nuclear com uma ou mais outras seqüências.
Em uma modalidade, a primeira seqüência de núcleo-tideos (visada) terá mais que cerca de 350 bp de comprimen-to, uma vez que uma enzima de restrição secundária é esco-lhida que corta a primeira seqüência de nucleotideos (visa-da) a cerca de 350 bp ou mais do sitio de restrição primá-rio.
Isto pode minimizar a propensão a formação de cir-culo, por causa das restrições topológicas (Rippe et al.(2001) Trends em Biochern. Sciences 26, 733-40). Adequada-mente, a primeira seqüência de nucleotideos (visada) após aamplificação compreende pelo menos cerca de 32 bp pelo fatode que o comprimento mínimo de pelo menos dois iniciadoresde amplificação usados para amplificar a segunda seqüênciade nucleotideos ser cerca de 16 bases cada.
Em uma modalidade preferida, a primeira seqüênciade nucleotideos (visada) pode compreender completamente ouparcialmente (por exemplo, um fragmento) , ou estar perto de(por exemplo, nas proximidades de) um promotor, um intensi-ficador, um silenciador, um isolante, uma região de anexaçãode matriz, uma região de controle de locus, uma unidade detranscrição, uma origem de replicação, uma recombinação deponto de acesso, um ponto de ruptura de translocação, umcentrômero, um telômero, uma região densa em genes, uma re-gião fraca de gene, um elemento repetitivo, um sítio de in-tegração (viral), uma seqüência de nucleotideos em que dele-ções e/ou mutações são relacionados com um efeito, por exem-plo, doença, efeito fisiológico, funcional ou estrutural -tal como um SNP (polimorfismo nucleotideos simples), ou se-qüência (s) de nucleotideos contendo tais deleções e/ou muta-ções, ou qualquer seqüência em que se deseja determinar afreqüência de interação no espaço nuclear com outras seqüências.
Da maneira supramencionada, a primeira seqüênciade nucleotideos (visada) pode compreender completamente ouparcialmente (por exemplo, um fragmento), ou estar perto de(por exemplo, nas proximidades) uma seqüência de nucleoti-deos em que aberrações genéticas - tais como deleções e/oumutações - são relacionadas a um efeito (por exemplo, umadoença). De acordo com esta modalidade da invenção a primei-ra (seqüência de nucleotideos alvo) pode portanto ser umaseqüência de nucleotideos (por exemplo, um gene ou um Io-cus) , adjacente (no padrão de DNA físico), ou na região ge-nômica em que mudanças foram associadas ou correlacionadoscom uma doença - tal como uma doença genética ou congênita.
Em outras palavras, a primeira seqüência de nucleotideos(visada) pode ser, ou pode ser escolhida com base na sua as-sociação com um fenótipo clínico. Em uma modalidade preferi-da, as mudanças são mudanças em um ou mais cromossomos, e adoença pode ser como uma conseqüência, por exemplo, de umaou mais deleções, uma ou mais translocações, uma ou mais du-plicações e/ou uma ou mais inversões, etc.
Exemplos não limitantes de tais genes/loci são A-MLlf MLL MYC, BCL, BCR, ABLl, imunoglobulina Ioci, LYLlfTALl, TAL2, LM02, TCR a/δ, TCRβ, HOX e outros Ioci em váriasleucemias Iinfoblásticas.
Outros exemplos são descritos em bases de dadoseletrônicos - tais como:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=cancerchromosomes
http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelma
http://www.progenetix.net/progenetix/P14 603437/ideogram.html
http://www.changbioscience.com/cytogenetics/cytol.pl?query=47,xy
http://www.possum.net.au/http://www.Imdatabases.com/http://www.wiley.com/legacy/products/subject/life/borgaonkar/index.html
http ://www.ncbi.nlm.nih. gov/entrez/query.fcgi?db=0MIM
http://www.sanger.ac.uk/PostGenomics/decipher/http://agserverOl.azn.nl:8080/ecaruca/ecaruca.Jsp
Outros exemplos são descritos em "Catalogue of un-balanced Chromosome Aberrations in Man" 2nd edition. AlbertSchiuzel. Berlin: Walter of Gruyter, 2001. ISBN 3-11-011607-3.
Em uma modalidade, o termo "adjacente" significa"diretamente adjacente", de maneira que não haja nucleotí-deos interferentes entre duas seqüências adjacentes.
Em uma outra modalidade, o termo "adjacente", nocontexto da seqüência de ácido nucléico e do sitio de reco-nhecimento da enzima de restrição primária, significa "dire-tamente adjacente", de maneira que não haja nucleotideos in-terferentes entre a seqüência de ácido nucléico e a sitio dereconhecimento de enzima de restrição primário.Segunda seqüência de nucleotídeos.
A segunda seqüência de nucleotídeos é obtenível,obtida, identificada, ou identificável para reticular DNAgenômico de (por exemplo, in vivo ou in vitro).
A segunda seqüência de nucleotídeos (por exemplo,seqüência de nucleotídeos de interesse) torna-se ligada àprimeira seqüência de nucleotídeos (visada) após tratar umaamostra com um agente de reticulação e digerir/ligar osfragmentos de DNA reticulados. Tais seqüências são reticula-das na primeira seqüência de nucleotídeos (visada) em virtu-de de eles estarem originalmente perto no espaço nuclear eligados à primeira seqüência de nucleotídeos (visada) emvirtude das condições de ligação favorecerem ligação entrefragmentos de DNA reticulados (intramolecular) nos eventosde ligação aleatória.
Doenças com base nas alterações - tais como trans-locações, deleções, inversões, duplicações e outros ré-arranjos genômicos - são de maneira geral causadas por inte-rações de DNA-DNA aberrantes. Tecnologia 4C mede freqüênciasde interação de DNA-DNA, que primeiramente são função da se-paração do sítio genômico, isto é, freqüências de interaçãode DNA-DNA são inversamente proporcionais à distância linear(em quilobases) entre dois Ioci de DNA presentes no mesmopadrão de DNA físico (Dekker et al., 2002). Assim, altera-ção(s) que cria(m) fisicamente novos e/ou diferentes padrõesde DNA, é(são) acompanhada(s) por interações de DNA-DNA al-teradas, e isto pode ser medido pela tecnologia 4C.
Adequadamente, a segunda seqüência de nucleotídeostem pelo menos 40 pares de base.
Agentes de reticul'ação - tal como formaldeído -podem ser usados para reticular proteínas em outras proteí-nas e ácido nucléico vizinhos. Assim, duas ou mais seqüên-cias de nucleotídeos podem ser reticuladas somente por meiode proteínas ligadas a (uma de) estas seqüências de nucleo-tídeos. Agentes de reticulação sem ser formaldeído podemtambém ser usados de acordo com a presente invenção, inclu-indo os agentes de reticulação que reticulam diretamente se-qüências de nucleotídeos. Exemplos de agentes que reticulamDNA incluem, mas sem limitações, luz UV, mitomicina C, ni-trogênio mustarda, melfalano, diepóxido de 1,3 butadieno,eis diaminadicloroplatina(II) e ciclofosfamida.
Adequadamente, o agente de reticulação formará re-ticulados que ligarão distâncias relativamente pequenas -tal como cerca de 2 Ã - selecionando assim interações ínti-mas que podem ser revertidas.
Reticulações podem ser realizadas, por exemplo,para incubar as células em formaldeído 2 % a temperatura am-biente - tal como para incubar células 1 χ IO7 em 10 mL deDMEM-IO % FCS suplementado com formaldeído 2 % por 10 minu-tos à temperatura ambiente.
Enzima de restrição primária
Da maneira aqui usada, o termo "enzima de restri-ção primária" refere-se a uma primeira enzima de restriçãoque é usada para digerir o DNA reticulado.
A enzima de restrição primária será escolhida de-pendendo do tipo de seqüência visada (por exemplo, locus) aser analisada. Deseja-se que experimentos preliminares sejamrealizados para otimizar as condições de digestão.
A enzima de restrição primária pode ser seleciona-da de enzimas de restrição que reconhecem pelo menos seqüên-cias 6 bp ou mais de DNA.
Enzimas de restrição que reconhecem seqüências 6bp de DNA incluem, mas sem limitações, AcII, HindII, SspI,BspLUIII, AgeI, MIuIf SpeI, BgIIl, Eco47III, StuI, Seal, Ci-ai, AvaIII, VspI, MfeI, PmaCI, PvuII, NdeI, Ncol, SmaI, Sa-cll, AvrII, PvuI, XmaII, SpII, XhoI, PstI, AfIII, EcoRI,' Aa-tll, Saci, EcoRV, SphI, NaeI, BsePI, NheI, BamHI, NarI, A-pal, KpnI, SnaI, SaII, ApaLI, HpaI, SnaBI, BspHI, BspMII,NruI, XbaI, BcII, MstI, Bali, Bspl407I, PsiI, AsuII e AhaII-I.
Enzimas de restrição que reconhecem mais que umaseqüência 6 bp de DNA incluem, mas sem limitações, BbvC I,Asei, AsiS I, Fse I, Not I, Pac I, Pme I, Sbf I, SgrA I, SwaI, Sap I, Cci NI, FspA I, Mss I, Sgf I, Smi I, Srf I eSse8387 I.
Para alguns aspectos da presente invenção, no casode enzimas de restrição reconhecerem seqüências 6 bp, BgIII,HindIII ou EcoRI são preferidos.
0 termo "sitio de reconhecimento de enzima de res-trição primária" refere-se ao sitio em uma seqüência de nu-cleotideos que é reconhecida e clivada pela enzima de res-trição primária.
Enzima de restrição secundária
Da maneira aqui usada, o termo "enzima de restri-ção secundária" refere-se a uma segunda enzima de restriçãoque é usada após a digestão de enzima de restrição primária,ligação de DNA reticulado, des-reticulação e purificação deDNA (opcional). Em uma modalidade, a enzima de restrição se-cundária é usada para fornecer extremidades de DNA definidaspara as seqüências de nucleotideos de interesse, que permitea ligação de seqüências de composição de nucleotideos conhe-cida nos sitios de reconhecimento de enzima de restrição se-cundária que flanqueiam as seqüências de nucleotideos de in-teresse.
Em uma modalidade, ligação de seqüências de compo-sição de nucleotideos conhecida com os sitios de reconheci-mento de enzima de restrição secundária que flanqueiam (porexemplo, estão de cada lado ou extremidade) as seqüências denucleotideos de interesse envolvem ligação em condições di-luídas para favorecer a ligação intramolecular entre os sí-tios de reconhecimento de enzima de restrição secundária queflanqueiam seqüências de nucleotideos visadas e as seqüên-cias de nucleotideos de interesse ligadas. Isto resulta efe-tivamente na formação de círculos de DNA em que seqüênciasde nucleotideos visadas conhecidas flanqueiam seqüências deinteresse desconhecidas.
Em uma outra modalidade, ligação de seqüências decomposição de nucleotideos conhecida com os sítios de reco-nhecimento de enzima de restrição secundária que flanqueiam(por exemplo, estão de cada lado ou extremidade) as seqüên-cias de nucleotideos de interesse envolvem a adição de se-qüências de DNA únicas de composição de nucleotideos conhe-cidas, seguido por ligação em condições que favorecem liga-ção intermolecular entre os sítios de reconhecimento de en-zima de restrição secundária que flanqueiam as seqüências denucleotídeos de interesse e introduzem seqüências de DNA ú-nicas de composição de nucleotídeos conhecida.
Em uma modalidade, a enzima de restrição secundá-ria é escolhida de maneira que nenhum sítio de enzima derestrição secundária fique em cerca de 350 bp (por exemplo,350-400 bp) do sítio de restrição primário.
Em uma outra modalidade, a enzima de restrição se-cundária é escolhida de maneira que o mesmo sítio de enzimade restrição secundária é provavelmente para ser localizadana seqüência de nucleotídeos ligada (isto é, a seqüência re-ticulada ligada). Uma vez que as extremidades da primeiraseqüência de nucleotídeos (visada) e da seqüência de nucleo-tídeos ligada podem ser extremidades compatíveis coesivas(ou rombas), as seqüências podem ainda ser ligadas a fim decircularizar o DNA. Desta maneira, a etapa de digestão é se-guida por ligação em condições diluídas que favorecem inte-rações intramoleculares e circularização opcional do DNA pormeio das extremidades compatíveis.
Preferivelmente, o sítio de reconhecimento da en-zima de restrição secundária é um sítio de reconhecimento deseqüência de nucleotídeos de 4 ou 5 bp. Enzimas que reconhe-cem seqüências de DNA de 4 ou 5 bp incluem, mas sem limita-ções, TspEI, MaeII, Alui, NIaIII, HpaII, FnuDII, MaeI, DpnI,MboI, HhaI, HaeIII, RsaI, TaqI, CviRI, MseI, Sthl32l, AciI,DpnII, Sau3AI e MnII.Em uma modalidade preferida, a enzima de restriçãosecundária é NlaIII e/ou DpnII. 0 termo "sitio de reconheci-mento de enzima de restrição secundária" refere-se ao sitiona seqüência de nucleotideos que é reconhecida e clivada pe-Ia enzima de restrição secundária.
Após a digestão com a enzima de restrição secundá-ria, uma reação adicional da ligação é realizada. Em uma mo-dalidade, esta reação da ligação liga as seqüências de DNAde composição de seqüência de nucleotideos conhecidas com ositio de digestão da enzima de restrição secundária de umaou mais seqüências que são ligadas à seqüência de nucleoti-deos alvo.
Enzima de restrição terciária
Da maneira aqui usada, o termo "enzima de restri-ção terciária" refere-se a uma terceira enzima de restriçãoque pode ser opcionalmente usada após a etapa de enzima derestrição secundária a fim de linearizar DNA circularizadoantes da amplificação.
Preferivelmente, a enzima de restrição terciária écomo enzima que reconhece um sitio de reconhecimento de 6 bpou mais nucleotideos. Preferivelmente, a enzima de restriçãoterciária digere a primeira seqüência de nucleotideos (visa-da) entre sitio de enzima de restrição primária e secundáriade reconhecimento. Como entendido pelos versados na técnica,é desejável que a enzima de restrição terciária não digira aprimeira seqüência de nucleotideos (visada) muito perto dossítios de reconhecimento de enzima de restrição primária esecundária de maneira que os iniciadores de amplificação nãopossam mais hibridizar. Desta maneira, prefere-se que o si-tio de restrição de reconhecimento de enzima terciária sejalocalizado pelo menos a mesma distância dos sítios de reco-nhecimento de enzima de restrição primária e secundária queo comprimento do iniciador a ser usado, de maneira que osiniciadores de amplificação possam ainda hibridizar.
Em uma modalidade preferida, a enzima de restriçãoterciária é uma que reconhece uma seqüência de 6-bp de DNA.0 termo "sítio de reconhecimento de enzima de restrição ter-ciária" refere-se ao sítio na seqüência de nucleotídeos queé reconhecida e clivada pela enzima de restrição terciária.
Sítio de reconhecimento
Endonucleases de restrição são enzimas que clivama espinha dorsal açúcar-fosfato de DNA. Em cenários maispráticos, uma dada enzima de restrição corta ambas fitas deDNA duplex em um trecho de apenas umas bases. Os substratospara enzimas de restrição são seqüências de DNA de fita du-pla denominadas sítios/seqüências de reconhecimento.
0 comprimento de sítios de reconhecimento de res-trição varia, dependendo da enzima de restrição que' é usada.0 comprimento da seqüência de reconhecimento dita com quefreqüência a enzima cortará uma seqüência de DNA.
A título de exemplo, inúmeras enzimas de restriçãoreconhecem uma seqüência de DNA de 4 bp. As seqüências e aenzima que reconhecem a seqüência de DNA de 4 bp incluem,mas sem limitações, AATT (TspEI), ACGT (MaeII), AGCT (Alui),CATG (NlaIII CCGG (HpaII) , CGCG (FnuDII), CTAG (Mael) , GATC(DpnI, DpnII, Sau3AI & MboI), GCGC (Hhal), GGCC (HaeIII),GTAC (RsaI) , TCGA (TaqI) , TGCA (CviRl), TTAA (Msel) , CCCG(Sthl321), CCGG (AciI) e CCTC (MnlI)
A titulo de exemplo adicional, inúmeras enzimas derestrição reconhecem uma seqüência de DNA de 6 bp. As se-qüências e a enzima que reconhecem a seqüência bp par bases6 de DNA incluem, mas sem limitações, AACGTT (AclI), AAGCTT(HindIII), AATATT (SspI), ACATGT (BspLUllI), ACCGGT (Agel),ACGCGT (MluI) , ACTAGT (SpeI), AGATCT (BgIII) , AGCGCT (E-co47III}, AGGCCT (StuI), AGTACT (ScaI), ATCGAT (ClaI) , ATG-CAT (AvaIII), ATTAAT (VspI), CATATG (MfeI), CACGTG (PmaCI),CAGCTG (PvuII) , CATATG (NdeI), CCATGG (NcoI), CCCGGG (SmaL)CCGCGG SacII), CCTAGII), CTCGAG (XhoI), CTGCAG (PstI), CTTA-AG (AfIII), GAATTC (EcoRI), GACGTC (AatII), GAGCTC (Saci),GATATC (EcoRV), GCATGC (SphI), GCCGGC (NaeI), GCCGGC (Bse-PI), GCTAGC (Nhel), GGATCC (BamHI), GGCGCC (NarI), GGGCCC(ApaI), GGTACC (KpnI), GTATAC (SnaI), GTCGAC (SaII), GTCGAC(ApaLI), GTTAAC (HpaI), TACGTA (SnaBI), TCATGA (BspHI),TCCGGA (BspMII), TCGCGA (NruI), TCTAGA (XbaI), TGATCA (BcI-I), TGCGCA (MstIl), TGGCCA (Bali), TGTACA (Bspl407I), TTATAA(PsiI), TTCGAA (AsuII) e TTTAAA (AhaIII).
A titulo de exemplo adicional, inúmeras enzimas derestrição reconhecem um 7 bp seqüência de DNA. As seqüênciase a enzima que reconhecem a seqüência de 7 bp de DNA inclu-em, mas sem limitações, CCTNAGG (SauI), GCTNAGC (EspI), GGT-NACC BstEII e TCCNGGA PfoI.
A titulo de exemplo adicional, inúmeras enzimas derestrição reconhecem uma seqüência de 8 bp de DNA. As se-qüências e a enzima que reconhecem a seqüência de 8 bp deDNA incluem, mas sem limitações, ATTTAAAT (SwaI), CCTGCAGG(Sse83871), CGCGGGCG (Sse2321), CGTCGACG (SgrDI), GCCCGGGC(SrfI), GCGATCGC (SgfI), GCGGCCGC (NotI), GGCCGGCC (FseI),GGCGCGCC (AscI), GTTTAAAC (PmeI) e TTAATTAA (PacI).
Inúmeras dessas enzimas contêm a seqüência CG quepodem ser metiladas in vivo. Inúmeras enzimas de restriçãosão sensíveis a esta metilação e não clivarão a seqüênciametilada, por exemplo, HpaII não clivará a seqüência CCmGG,ao passo que seu isosquizômero MspI é insensível a esta mo-dificação e clivará a seqüência metilada. Desta maneira, emalguns casos, as enzimas sensíveis a metilação eucarióticanão são usadas.
Em uma modalidade, um sítio de reconhecimento é umsítio de digestão.
Em uma modalidade, um sítio de reconhecimento deenzima de restrição é um sítio de digestão de enzima de res-trição.
Circularização
De acordo com uma modalidade da presente invenção,o material para 4C é preparado criando círculos de DNA dige-rindo o padrão 3C com uma enzima de restrição secundária,seguido por ligação.
Preferivelmente, é escolhida uma enzima de restri-ção secundária que corta a primeira seqüência de nucleotí-deos (visada) em mais que cerca de 350 bp (por exemplo, 350-400 bp) do sítio de restrição primário. Vantajosamente, istominimiza a propensão de formação de círculo por causa dasrestrições topológicas (Rippe et al. (2001) Trends in Bio-chem. Sciences 26, 733'40).
Preferivelmente, a enzima de restrição secundáriaé um cortador freqüente que reconhece um sitio de reconheci-mento de enzima de restrição de 4 ou um 5 bp. Assim é possí-vel obter fragmentos de restrição menores para eficiênciasiguais de amplificação de todos os fragmentos ligados duran-te a amplificação.
Antes da ligação e digestão da enzima de restriçãosecundária, o padrão de DNA compreenderá um sitio de reco-nhecimento de enzima secundária na primeira seqüência de nu-cleotideos (visada) localizada a mais que cerca de 350-400bp do sitio de restrição primário e um outro sitio de reco-nhecimento de enzima secundária localizado na seqüência denucleotideos que foi ligada (isto é, na segunda seqüência denucleotideos).
Preferivelmente, a etapa de digestão da enzima derestrição secundária é realizada por mais que 1 hora por to-da a noite e-seguida por inativação a quente da enzima.
Preferivelmente, o DNA nesta mistura da reação épurificado usando métodos/estojos convencionais que são co-nhecidos na tecnologia.
Após a etapa de digestão de enzima de restriçãosecundária, um sitio de enzima de restrição secundária serálocalizado a mais que 350-400 bp do sitio de restrição pri-mário na primeira seqüência de nucleotideos (visada), e umoutro sitio de enzima de restrição secundária será localiza-do na seqüência de nucleotideos ligada (isto é, a segundaseqüência de nucleotideos). Uma vez que as extremidades daprimeira seqüência de nucleotídeos (visada) e da seqüênciade nucleotídeos ligada têm extremidades compatíveis, as se-qüências podem ser ligadas a fim de circularizar o DNA.
A etapa de digestão é então seguida por ligação emcondições diluídas que favorecem interações intramolecularese circularização do DNA por meio das extremidades compatí-veis.
Preferivelmente, a reação da ligação é realizadaem uma concentração de DNA de cerca de 1-5 ng/μΐί.
Preferivelmente, a reação da ligação é realizadapor mais que 1 hora (por exemplo, 2, 3, 4 ou mais horas) acerca de 16-25 °C.
Desta maneira, após a reação da ligação, DNA cir-cularizado pode ser preparado. O DNA circularizado compreen-derá os sítios de reconhecimento pelo menos para a enzima derestrição secundária, ou as enzimas de restrição primárias eas secundárias. Em DNA circularizado contendo a primeira se-qüência de nucleotídeos (visada), a sítio de reconhecimentoda enzima de restrição primária e os sítios reconhecimentode enzima de restrição secundária definirão as extremidadesda primeira seqüência de nucleotídeos (visada) e a seqüênciade nucleotídeos ligada (isto é, a segunda seqüência de nu-cleotídeos) . Desta maneira a primeira seqüência de nucleotí-deos (visada) e a seqüência de nucleotídeos ligada são sepa-radas (por exemplo, divididas) pelo sítio de reconhecimentoda enzima de restrição primária e o sítio de reconhecimentode enzima de restrição secundária.
AmplificaçãoUma ou mais reações de araplificação podem ser rea-lizadas a fim de amplificar os padrões 4C de DNA.
Amplificação de DNA pode ser realizada usando inú-meros métodos diferentes que são conhecidos na tecnologia.
Por exemplo, DNA pode ser amplificado usando a reação em ca-deia da polimerase (Saiki et al., 1988); PCR mediada por li-gação, amplificação da replicase Qb (CahilI., Foster and Ma-lian, 1991; Chetverin and Spirin, 1995; Katanaev, Kurnasovand Spirin, 1995); a reação da cadeia ligase (LCR) (Lande-gren et al., 1988; Barany, 1991); o sistema de replicação deseqüência auto-sustentado. (Fahy, Kwoh e Gingeras, 1991) eamplificação de deslocamento de fita (Walker et al., 1992).
Preferivelmente, DNA é amplificado usando PCR. "P-CR" refere-se ao método de Κ, B. Mullis, patentes U.S.4.683.195, 4.683.202 e 4.65.188, que descrevem um método pa-ra aumentar a concentração de um segmento de uma seqüênciade nucleotideos em uma mistura de DNA genômico sem clonagemou purificação.
Em uma modalidade, é usado PCR inverso. PCR inver-so (IPCR) (descrito por Ochman et al. (1988) Genetics120(3), 621-3) é um método para a amplificação rápida in vi-tro de seqüências de DNA que flanqueiam uma região de se-qüência conhecida. 0 método usa a reação da cadeia polimera-se (PCR), mas ele tem os iniciadores orientados na direçãocontrária à orientação usual. 0 padrão para os iniciadoresreversos é um fragmento de restrição que foi ligado sobre sipróprio para formar um circulo. PCR inverso tem muitas apli-cações em genética molecular, por exemplo, a amplificação eidentificação de elementos reversíveis para flanquear se-qüenciadores. Para aumentar a eficiência e reprodutibilidadeda amplificação, prefere-se que os círculos de DNA sejam Ii-nearizados antes da amplificação usando uma enzima de res-trição terciária. Preferivelmente, é usada uma enzima derestrição terciária que é um cortador 6 bp ou mais. Preferi-velmente, a enzima de restrição terciária corta a primeira(visada) seqüência de nucleotídeos entre o sítio da enzimade restrição primária e secundária.
A digestão do padrão 3C com a enzima de restriçãosecundária, circularização opcional, ligação (por exemplo,ligação em condições diluídas) e linearização opcional deprimeira seqüência de nucleotídeos (visada) contendo círcu-los produz um padrão de DNA para amplificação ("padrão 4C deDNA").
Para a etapa de amplificação, pelo menos dois oli-gonucleotídeos iniciadores são usados, nos quais cada inici-ador hibridiza para uma seqüência de DNA que flanqueia asseqüências de nucleotídeos de interesse. Em uma modalidadepreferida, pelo menos dois oligonucleotídeos iniciadores sãousados, nos quais cada iniciador hibridiza para a seqüênciavisada que flanqueia as seqüências de nucleotídeos de interesse.
Em uma modalidade, o termo "flanquear" no contextode hibridização do iniciador significa que pelo menos um i-niciador hibridiza para uma seqüência de DNA adjacente a umaextremidade (por exemplo, a extremidade 5') da seqüência denucleotídeos de interesse e pelo menos um iniciador hibridi-za para uma seqüência de DNA nas outras extremidades (porexemplo, a extremidade 3') da seqüência de nucleotideos deinteresse. Preferivelmente, pelo menos um iniciador diretohibridiza para uma seqüência de DNA adjacente a uma extremi-dade (por exemplo, a extremidade 5') da seqüência de nucleo-tideos de interesse e pelo menos um iniciador reverso hibri-diza para uma seqüência de DNA nas outras extremidades (porexemplo, a extremidade 3') da seqüência de nucleotideos deinteresse.
Em uma modalidade preferida, o termo "flanquear"no contexto de hibridização do iniciador significa que pelomenos um iniciador hibridiza para uma seqüência visada adja-cente a uma extremidade (por exemplo, a extremidade 5') daseqüência de nucleotideos de interesse e pelo menos um ini-ciador hibridiza para uma seqüência visada nas outras extre-midades (por exemplo, a extremidade 3') da seqüência de nu-cleotideos de interesse. Preferivelmente, pelo menos um ini-ciador direto hibridiza para uma seqüência visada adjacentea uma extremidade (por exemplo, a extremidade 5') da seqüên-cia de nucleotideos de interesse, e pelo menos um iniciadorreverso hibridiza para uma seqüência visada nas outras ex-tremidades (por exemplo, a extremidade 3') da seqüência denucleotideos de interesse.
Da maneira aqui usada, o termo "iniciador" refere-se a um oligonucleotideo, quer de ocorrência natural como emuma digestão de restrição purificada quanto produzido sinte-ticamente, que é capaz de agir como um ponto de iniciação desíntese, quando colocado sob condições em que a síntese deum produto de extensão do iniciador que é complementar a umafita de ácido nucléico é induzida (isto é, a presença de nu-cleotideos e um agente de indução tal como polimerase de DNAe em uma temperatura e pH adequados). 0 iniciador é preferi-velmente fita única para eficiência máxima em amplificação,mas pode ser fita dupla. Caso seja fita dupla, o iniciador éprimeiro tratado para separar suas fitas antes usadas parapreparar produtos de extensão. Preferivelmente, o iniciadoré um oligodeoxiribonucleotídeo' 0 iniciador deve ser sufici-entemente grande para iniciar a síntese de produtos de ex-tensão na presença do agente de indução. Os comprimentos e-xatos dos iniciadores dependerão de muitos fatores, incluin-do temperatura, fonte de iniciador e o uso do método.
Adequadamente, os iniciadores terão pelo menos 15,preferivelmente pelo menos 20, por exemplo pelo menos 25, 30ou 40 nucleotideos em comprimento. Preferivelmente, os ini-ciadores de amplificação têm de 16 a 30 nucleotideos em com-primento.
Preferivelmente, os iniciadores são projetados omais perto possível dos sítios de reconhecimento de enzimade restrição primária e secundária que separam o primeiro(visado) seqüência de nucleotideos e a segunda seqüência denucleotideos. Os iniciadores podem ser projetados de maneiraque eles estejam dentro de cerca de 100 nucleotideos - talcomo cerca de 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, S, 7,6, 5, 4, 3, 2 ou 1 nucleotideos) fora do sítio de reconheci-mento de enzima de restrição primária e secundária.
Adequadamente, os iniciadores de amplificação sãoprojetados de maneira tal que suas extremidades 3' fiquemvoltadas para fora em direção aos sítios de reconhecimentode enzima de restrição primária e secundária para que a ex-tensão siga imediatamente através dos sítios de restriçãopara a segunda seqüência de nucleotídeos.
Se o método de amplificação que é usado é PCR in-verso, então prefere-se que as reações de amplificação sejamrealizadas a cerca de 100-400 ng de DNA do padrão 4C (porcerca de 50 μΐ, da mistura de reação de PCR) ou outras quan-tidades de DNA para as quais reações PCR em replicata dá re-sultado produtível (ver Figura 1) e inclui um número máximode eventos de ligação por reação de PCR.
Preferivelmente, a reação de amplificação de PCRinverso é realizada usando o sistema Expand Long TemplatePCR (Roche), usando tampão 1 de acordo com as instruções dofabricante.
Amostra
0 termo "amostra" da maneira aqui usada, tem sig-nificado natural. Uma amostra pode ser qualquer entidade fí-sica que compreende DNA que é ou pode ser reticulada. A a-mostra pode ser de material biológico, ou pode ser derivadadele.
A amostra pode ser de uma ou mais entidades, oupode ser derivada delas - tal como uma ou mais células, umou mais núcleos, ou uma ou mais amostras de tecido. As enti-dades podem ser de qualquer entidade em que DNA - tal comocromatina - está presente, ou podem ser deriváveis delas. Aamostra pode ser de uma ou mais células isoladas ou uma oumais amostras de tecido isoladas, ou um ou mais núcleos iso-lados ou podem ser derivada deles.
A amostra pode ser de células vivas e/ou célulasmortas e/ou lisatos nucleares e/ou cromatina isolada, ou po-de ser derivada deles.
A amostra pode ser de sujeito doente e/ou não do-ente, ou pode ser derivada dele.
A amostra pode ser de um sujeito que é suspeito desofrer de uma doença, ou pode ser derivada dele.
A amostra pode ser de um sujeito para ser testadocom relação à probabilidade de que ele sofrerá de uma doençano futuro, ou pode ser derivada dele.
A amostra pode ser de material de paciente viávelou não viável, ou pode ser derivada dele.
A fixação de células e tecidos par o uso para pre-parar o padrão 3C é descrito com detalhe em Splinter et at.,(2004) Methods Enzymol. 375, 493-507
Marcação
Preferivelmente, as seqüências de nucleotideos(por exemplo, padrões de DNA 4C amplificados, iniciadores ousondas etc.) são marcadas a fim de assistir em suas aplica-ções à jusante - tal como hibridização de arranjo. A titulode exemplo, os padrões de DNA 4C podem ser marcados usandoiniciação aleatória ou tradução por corte.
Uma ampla variedade de marcações (por exemplo, re-portadores) pode ser usada para marcar as seqüências de nu-cleotideos aqui descritas, particularmente durante a etapade amplificação. Marcações adequadas incluem agentes radio-nuclideos, enzimas, fluorescente, quimioluminescente, oucromogênicos bem como substratos, cofatores, inibidores,partículas magnéticas e similares. Patentes que preceituam ouso de tais marcações incluem US-A-3817837, US-A-3850752,US-A-3939350, US-A-3996345, US-A-4277437, US-A-4275149 e US-A-366241.
Marcações adicionais incluem, mas sem limitações,P-galactosidase, invertase, proteína fluorescente verde, Iu-ciferase, cloramfenicol, acetiltransferase, β-glucuronidase,exo-glucanase e glucoamilase. Marcações fluorescentes podemtambém ser usadas, bem como reagentes fluorescentes especi-ficamente sintetizados com propriedades químicas particula-res. Uma ampla variedade de meios para medir fluorescência édisponível. Por exemplo, algumas marcações fluorescentes a-presentam uma mudança no espectro de excitação ou emissão,algumas apresentam transferência de energia de ressonânciaonde um reportador fluorescente perde fluorescência, ao pas-so que uma segunda ganha em fluorescência, algumas apresen-tam uma perda (finalização) ou aparência de fluorescência,ao passo que algumas reportam movimentos rotacionais.
A fim de obter material suficiente para marcar,amplificações múltiplas podem ser ligadas, em vez de aumen-tar o número de ciclos de amplificação por reação. Alterna-tivamente, nucleotídeos da reação de amplificação (por exem-pio, 30 ciclos de PCR (sem marcação) + 10 ciclos de PCR(mais marcação)).
Arranjo
Em uma modalidade particularmente vantajosa, ospadrões de DNA 4C que são preparados de acordo com os méto-dos aqui descritos podem ser hibridizados em um arranjo.
Desta maneira, tecnologia de arranjo (por exemplo, microar-ranjo) pode ser usado para identificar seqüências de nucleo-tideos - tais como fragmentos genômicos - que freqüentementecompartilham um sitio nuclear com uma primeira (visada) se-qüência de nucleotideos.
Arranjos existentes - tal como arranjos de expres-são e genômicos - podem ser usados de acordo com a presenteinvenção. Entretanto, a presente invenção também procurafornecer arranjos inéditos (por exemplo, arranjos de DNA)como aqui descrito.
Um "arranjo" é uma coleção de ácidos nucléicos in-tencionalmente criada que pode ser preparada tanto sinteti-camente quanto bio-sinteticamente e classificada pela ativi-dade biológica em uma variedade de diferente formatos (porexemplo, bibliotecas de moléculas solúveis; e bibliotecas deoligos presos a contas de resina, chipes de silica, ou ou-tros suportes sólidos). Adicionalmente, o termo "arranjo"inclui as bibliotecas de ácidos nucléicos que podem ser pre-paradas localizando pontos de ácidos nucléicos essencialmen-te de qualquer comprimento (por exemplo, de 1 a cerca de1.000 monômeros de nucleotideos em comprimento) em um substrato.
Tecnologia de arranjo e as várias técnicas e apli-cações associadas com ela estão descritas de maneira geralem inúmeros livros texto e documentos. Isto inclui Lemieuxat aL, 1998, Molecular Breeding 4, 277-289, Schema andDavis. Parallel Analysis with Biological Chipes. in PCRMethods Manual (eds. M. Tunis, D. Gelfand, J. Sninsky),Schena and Davis, 1999, Genes, Genomas artd Chips. In DNAMcroarrays: A Practical Approach (ed. M. Schema), OxfordUniversity Press, Oxford, UK, 1999), The Chipping Forecast(Nature Geneties special issue; January 1999 Supplement),Mark Schema Mieroarray Bioehip Technology, (Eaton PublishingCompany), Comes, 2000, The Seientist 14(17]:25, Gwynne andPage, Mieroarray analysis: the next revolution in molecularbiology, Science, 1999 August 6; and Eakins and Chu, 1999,Trends in Biotechnology, 17, 217-218.
Tecnologia de arranjo supera as desvantagens commétodos tradicionais em biologia molecular, que de maneirageral funcionam em uma base "um gene em um experimento", re-sultando em baixa produção e o incapacidade para perceber a"imagem total" da função do gene. Atualmente, as principaisaplicações para tecnologia de arranjo incluem a identifica-ção de seqüência (mutação gene/gene) e a determinação de ní-vel de expressão (abundância) de genes. Perfilamento de ex-pressão do gene pode fazer uso de tecnologia de arranjo, op-cionalmente em combinação com técnicas proteômicas (Cells etal., 2000, FEBS Lett, 480(1):2-16; Lockhart and Wier, 2000,Nature 405(6788):827-836; Khm et at., 1999, 20(2):223-9).
Outras aplicações de tecnologia de arranjo são também conhe-cidas na tecnologia; por exemplo, descoberta do gene, pes-quisa do câncer (Marx, 2000, Science 289: 1670-1672; Scherf,et al., 2000, Nat Genet; 24(3): 236-44; Ross et al., 2000,Nat Genet. 2000 Mar; 24(3): 227-35), análise SNP (Wang etal., 1998, Science, 280(5366): 1077-82), descoberta de medi-camento, farmacogenômicos, diagnóstico de doença (por exem-plo, utilizando dispositivos microfluidicos: Chemical & En-gineering News, February 22, 1999, 77 (8) :27-36), toxicology(Rockett and Dix (2000), Xenobiotica, 30(2): 155-77; Afshariet al., 1999, Câncer Resl; 59(19): 4759-60) e toxicogenômi-cos (um híbrido de genômicos funcionais e toxicologia mole-cular).
De um modo geral, qualquer biblioteca pode ser ar-ranjada de uma maneira ordenada em um arranjo, separando es-pacialmente os elementos da biblioteca. Exemplos de biblio-tecas adequadas para arranjo incluem bibliotecas de ácidonucléico (incluindo bibliotecas de DNA, cDNA, oligonucleotí-deo, etc.), peptídeo, polipeptídeo e bibliotecas de proteí-na, bem como bibliotecas que compreendem qualquer molécula,tal como bibliotecas ligantes, entre outras.
As amostras (por exemplo, elementos de uma biblio-teca) são de maneira geral fixadas ou imobilizadas em umafase sólida, preferivelmente um substrato sólido, para Iimi-tar difusão e mistura das amostras. Em uma modalidade prefe-rida, bibliotecas de ligantes de ligação de DNA podem serpreparadas. Em particular, as bibliotecas podem ser imobili-zadas em uma fase sólida substancialmente planar, incluindomembranas e substratos não porosos tais como plástico e vi-dro. Além do mais, as amostras são preferivelmente arranja-das de uma maneira tal que indexação (isto é, referência ouacesso a uma amostra particular) é facilitada. Tipicamente,as amostras são aplicadas como pontos em uma formação de ma-lha. Sistemas de ensaio comuns podem ser adaptados com estepropósito. Por exemplo, um arranjo pode ser imobilizado nasuperfície de uma microplaca, tanto com múltiplas amostrasem um poço, quanto com uma única amostra em cada poço. Alémdo mais, o substrato sólido pode ser uma membrana, tais comoum nitrocelulose ou membrana de náilon (por exemplo, membra-nas usadas em experimentos tipo blot). Substratos alternati-vos incluem vidro, ou substratos a base de sílica. Assim, asamostras são imobilizadas por qualquer método adequado co-nhecido na tecnologia, por exemplo, por interações de carga,ou por acoplamento químico nas paredes ou base dos poços, ouo superfície da membrana. Outros meios de arranjar e fixarpodem ser usados, por exemplo, pipetação, gota e toque, dis-positivo piezoelétrico, tecnologia de jato de tinta e jatode bolha, aplicação eletrostática, etc. No caso de chipes abase de silicone, fotolitografia pode ser utilizada para ar-ranjar e fixar as amostras no chipe.
As amostras podem ser arranjadas "localizadas" nosubstrato sólido; isto pode ser feito à mão ou fazendo usode robótica para depositar a amostra. De um modo geral, ar-ranjos podem ser descritos como macroarranjos ou microarran-jos, a diferença sendo o tamanho dos pontos de amostra. Ma-croarranjos tipicamente contêm tamanhos da localização pon-tual da amostra de cerca de 300 microns ou mais e podem serfacilmente imageados por dispositivos de varredura de gel eblot existentes. Os tamanhos da localização pontual da amos-tra em microarranjos são tipicamente menos que 200 micronsde diâmetro e estes arranjos freqüentemente contêm milharesde pontos. Assim, microarranjos podem requerer robótica eequipamento de imageamento especializados, que podem preci-sar ser feitos sob medida. Instrumentação é descrita de ma-neira geral em uma revisão por Cortese, 2000, The Scientist14[11]:26.
Técnicas para produzir bibliotecas imobilizadas demoléculas de DNA foram descritas na tecnologia. De maneirageral, métodos da tecnologia mais antiga descreveram comosintetizar bibliotecas de molécula de ácido nucléico de fitaúnica, usando, por exemplo, técnicas de mascaramento paraconstruir várias mutações de seqüências nas várias posiçõesdiscretas no substrato sólido. Patente U.S. 5.837.832 des-creve um método melhorado para produzir arranjos de DNA imo-bilizados com substratos de silicone com base na tecnologiade integração em escala muito grande. Em particular, PatenteU.S. 5.837.832 descreve uma estratégia denominada "azuleja-raento" para sintetizar conjuntos específicos de sondas emlocais espacialmente definidos em um substrato que pode serusado para produzir as bibliotecas de DNA imobilizadas dapresente invenção. A patente U.S. 5837832 também fornece re-ferências para técnicas anteriores que podem também ser usadas.
Arranjos podem também ser construídos usando quí-mica de fotodeposição.
Arranjos de peptídeos (ou peptidomiméticos) podemtambém ser sintetizados em uma superfície de uma maneira quecoloca cada elemento da biblioteca distinto (por exemplo,seqüência de peptídeo única) em uma localização discreta,pré-definida no arranjo. A identidade de cada elemento dabiblioteca é determinada por sua localização espacial no ar-ranjo. Os locais no arranjo onde interações de ligação entreuma molécula pré-determinada (por exemplo, uma visada ousonda) e elementos da biblioteca reativos ocorrem é determi-nado, identificado assim as seqüências dos elementos da bi-blioteca reativos na base de localização espacial. Estes mé-todos são descrito em Patente U.S. 5.143.854; W090115070 eW092110092; Fodor et at. (1991) Science, 251: 767; Dower andFodor (1991) Ann. Rep.Med. Chem., 26: 211.
Para ajudar a detecção, marcações são tipicamenteusadas (da maneira supradiscutida) - tal como qualquer re-portador facilmente detectável, por exemplo, um reportadorfluorescente, bioluminescente, fosforescente, radioativo,etc. Tais reportadores, sua detecção, acoplamento em al-vos/sondas, etc. são discutidos em outro lugar neste docu-mento. Marcação de sondas e alvos é também revelada em Sha-Ion et al., 1996, Genoma Res 6(7):639-45.
Exemplos específicos de arranjos de DNA são como aseguir:
Formato I: sonda cDNA (500 ~ 5.000 bases de com-primento) é imobilizada em uma superfície sólida tal comovidro usando localização por robô e exposta a um conjunto dealvos tanto separadamente quanto em uma mistura. Este métodoé amplamente considerado tendo sido desenvolvido na StanfordUniversity (Ekins and Chu,1999, Trends in Biotechnology,1999, 17, 217-218).
Formato II: um arranjo de oligonucleotídeos (20-25-mer oligos, preferivelmente, 40-60 mer oligos) ou ácidonucléico de peptídeo (PNA) as sondas são sintetizadas tantoin situ (em-chipe) quanto por síntese convencional seguidopor imobilização em-chipe. O arranjo é exposto no DNA da a-mostra marcado, hibridizado, e a identidade/abundância deseqüências complementares são determinadas. Chipe de DNA co-mo este é vendido pela Affymetrix, Inc., sob a marca regis-trada GeneChip®. Agilent e Nimblegen também fornecem arran-jos adequados (por exemplo, arranjos de azulejamento genômico).
Exemplos de alguns formatos de microarranjo comer-cialmente disponíveis são apresentados na Tabela 1 a seguir(ver também Marshall e Hodgson, 1998, Nature Biotechnology,16(1), 27-31).
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Tabela 1: Exemplos de formatos de microarranjos dehibridização atualmente disponíveis
A fim de gerar dados de ensaios baseados em arran-jo, é detectado um sinal que significa a presença de ou au-sência de hibridização entre uma sonda e uma seqüência denucleotideos. A presente invenção contempla adicionalmentetécnicas de marcação direta e indireta. Por exemplo, marca-ção direta incorpora corantes fluorescentes diretamente nasseqüências de nucleotideos que hibridizam para o arranjo as-sociado a sondas (por exemplo, corantes são incorporados naseqüência de nucleotideos por síntese enzimática na presençade nucleotideos ou iniciadores de PCR marcados). Esquemas demarcação direta produzem sinais de hibridização fortes, ti-picamente usando famílias de corantes fluorescentes com es-truturas químicas e características similares, e são simplesde implementar. Em modalidades preferidas que compreendemmarcação direta de ácidos nucléicos, cianina ou análogos a-Iexa são utilizados em análise de arranjo comparativo demulti-flúor. Em outras modalidades, esquemas de marcação in-direta podem ser utilizados para incorporar epítopos nos á-cidos nucléicos, tanto antes de quanto após a hibridizaçãopara as sondas de microarranjo. Um ou mais manchamentos,procedimentos e reagentes são usados para marcar o complexohibridizado (por exemplo, uma molécula fluorescente que ligaaos epitopos, fornecendo assim um sinal fluorescente em vir-tude da conjugação de molécula do corante com o epitopo daespécie hibridizada).
Análise de dados é também uma importante parte deum experimento envolvendo arranjos. Os dados brutos de umexperimento do arranjo tipicamente são imagens, que precisamser transformadas em matrizes - tabelas, onde fileiras re-presentam, por exemplo, genes, colunas representam, por e-xemplo, várias amostras tais como tecidos ou condições expe-rimentais, e números em cada célula, por exemplo, caracteri-zam a expressão de uma seqüência particular (preferivelmen-te, uma segunda seqüência que foi ligada com a primeira (vi-sada) seqüência de nucleotideos) na amostra particular. Es-tas matrizes têm de ser analisadas ainda mais, se qualquerconhecimento a cerca dos processos biológicos subjacente ti-ver que ser extraído. Métodos de análise de dados (incluindoanálise de dados supervisionada e não supervisionada bem co-mo abordagens bioinformáticas) são revelados em Brazma andVilo J (2000) FEES Lett 480(1): 17-24.
Na forma aqui descrita, uma ou mais seqüências denucleotideos (por exemplo, o padrão de DNA) que são marcadase subseqüentemente hibridizadas para um arranjo compreendemuma seqüência de nucleotideos que é enriquecida por pequenostrechos de seqüências com uma assinatura distinta, isto é,cobrindo a seqüência de nucleotideos entre o sítio de reco-nhecimento da enzima de restrição primária que foi ligadadurante o procedimento 3C com a primeira (visada) seqüênciaqüência de nucleotideos, e seu respectivo sitio de reconhe-cimento de enzima de restrição secundária vizinho.
Um arranjo simples pode compreender múltiplas (porexemplo, duas ou mais) seqüências baits.
Sondas
Da maneira aqui usada, o termo "sonda" refere-se auma molécula (por exemplo, um oligonucleotideo, quer de o-corrência natural como em uma digestão de restrição purifi-cada quer produzido sinteticamente, recombinantemente ou poramplificação de PCR) , que é capaz de hibridizar com uma ou-tra molécula de interesse (por exemplo, um outro oligonucle-otideo) . Quando as sondas são oligonucleotideos, elas podemser fita única ou fita dupla. As sondas são usadas na detec-ção, identificação e isolamento de alvos particulares (porexemplo, seqüências de gene). Aqui descrito, contempla-seque sondas usadas na presente invenção podem ser marcadascom uma marcação para que seja detectável em qualquer siste-ma de detecção, incluindo, mas sem limitações, sistemas deenzima (por exemplo, ELISA, bem como enzima com base em en-saios histoquimicos), fluorescente, radioativo, e lumines-cente. Com relação a arranjos e microarranjos, o termo "son-da" é usado para referir-se a qualquer material hibridizávelque é afixado com o arranjo com o propósito de detectar umaseqüência de nucleotideos que foi hibridizado com a ditasonda. Preferivelmente, estas sondas têm 25-60 mers ou mais.
Estratégias para desenho de sonda são descritas emW095/11995, EP 717,113 e W097129212.
Uma vez que 4C permite uma pesquisa de genoma nãopredisposta ampla para interações, é vantajoso preparar umarranjo com sondas interrogando cada sitio de reconhecimentoda enzima de restrição primária no genoma possível (por e-xemplo, único/não repetitivo).
Assim, desenho do arranjo somente depende da esco-lha de enzima de restrição primária e não das seqüências denucleotídeos primária ou secundária atual.
Embora arranjos existentes possam ser usados deacordo com a presente invenção, prefere-se usar configura-ções alternativas.
Em uma configuração, uma ou mais sondas no arranjosão projetadas de maneira que elas possam hibridizar pertodos sítios que são digeridos pela enzima de restrição primá-ria. Mais preferivelmente, a(s) sonda(s) é(são) em cerca de20 bp do sítio de reconhecimento de enzima de restrição pri-mária. Mais preferivelmente, a(s) sonda(s) é(são) em cercade 50 bp do sítio de reconhecimento de enzima de restriçãoprimária.
Adequadamente, a(s) sonda(s) é(são) dentro de cer-ca de 100 bp (por exemplo, cerca de 0-100 bp, cerca de20.400 bp) do sítio de reconhecimento de enzima de restriçãoprimária.
Em uma configuração preferida, uma sonda simples,única, é projetada em 100 bp a cada lado dos sítios que sãodigeridos pela enzima de restrição primária.
Em uma outra configuração preferida, as posiçõesos sítios digerido pela enzima de restrição secundária comrelação às posições dos sítios digeridos pelos sítios derestrição primária são levadas em consideração. Nesta confi-guração, uma sonda simples, única, é projetada somente a ca-da lado dos sítios digeridos pela enzima de restrição primá-ria que têm o sítio de reconhecimento de enzima de restriçãosecundária perto a uma distância bastante grande por umasonda de um dado comprimento a ser projetada entre o sítiode reconhecimento de enzima de restrição primária e secundá-ria. Nesta configuração, por exemplo, nenhuma sonda é proje-tada ao lado de um sítio de reconhecimento da enzima de res-trição primária particular que tem um sítio de reconhecimen-to da enzima de restrição secundária dentro de 10 bp dessemesmo lado.
Em uma outra configuração, as sondas no arranjosão projetadas de maneira que elas possam hibridizar em am-bos os lados dos sítios que são digeridos pela enzima derestrição primária. Adequadamente, uma sonda simples a cadalado do sítio de reconhecimento da enzima de restrição pri-mária pode ser usada.
Ainda em uma outra configuração, duas ou mais son-das (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou mais) podem ser pro-jetadas a cada lado do sítio de reconhecimento de enzima derestrição primária, que podem em seguida ser usadas para in-vestigar o mesmo evento de ligação. Para o número e posiçãode sondas com relação a cada sítio de reconhecimento de en-zima de restrição primária, a localização genômica exata deseu sítio de reconhecimento de enzima de restrição secundá-ria vizinho pode ser levada em consideração.
Ainda em uma outra configuração, duas ou mais son-das (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou mais) pode ser pro-jetadas próximo a cada sitio de reconhecimento da enzima derestrição primária independente do sitio de reconhecimentode enzima de restrição secundária mais próxima. Nesta confi-guração, todas sondas devem estar perto dos sítios de reco-nhecimento da enzima de restrição primária (preferivelmentedentro de 300 bp do sítio de restrição).
Vantajosamente, o último desenho e também o dese-nho que usa 1 sonda por (lado) sítio de reconhecimento deenzima de restrição primária, permite o uso de diferentesenzimas de restrição secundária em combinação com uma dadaenzima de restrição primária.
Vantajosamente, o uso de múltiplas (por exemplo,2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 ou mais) sondas por sítio de reconhe-cimento da enzima de restrição primária pode minimizar oproblema de obter resultados negativos falsos por causa dofraco desempenho de sondas individuais. Além do mais, podetambém aumentar a confiabilidade de dados obtidos com um ex-perimento chipe simples e reduzir o número de arranjos re-queridos para tirar conclusões estatisticamente sólidas.
As sondas para o uso no arranjo podem ser maioresque 40 nucleotídeos em comprimento e podem ser isotérmicas.
Preferivelmente, sondas contendo seqüências de DNArepetitiva são excluídas.
Supõe-se que diagnóstico de sondas para os sítiosde restrição que flanqueiam diretamente ou que estão próxi-mas da primeira seqüência de nucleotídeos dêem sinais de hi-bridização muito fortes e podem também ser excluídas do de-senho da sonda.
0 arranjo pode tratar qualquer genoma incluindomamífero (por exemplo, humano, camundongo (por exemplo, cro-mossomo 7)), vertebrado (por exemplo, zebrafish)) , ou nãovertebrado (por exemplo, bacteriano, levedura, fúngico ouinseto (por exemplo, Drosófila)) genomas.
Em uma modalidade preferida adicional, o arranjocontém 2-6 sondas em torno de cada sítio de restrição primá-ria único e o mais próximo possível do sítio de digestão deenzima de restrição.
Preferivelmente, a distância máxima do sítio dedigestão de enzima de restrição é cerca de 300 bp.
Em um modalidade preferida adicional da presenteinvenção, são fornecidos arranjos para enzimas de restrição- tal como HindIII, EcoRI, BglII e NotI - que tratam os ge-nomas mamífero ou não mamífero. Vantajosamente, o desenhodos arranjos aqui descritos evita a necessidade de redese-nhar arranjos para cada seqüência visada, análise fornecidaé realizada na mesma espécie.
Conjuntos de sondas
Da maneira aqui usada, o termo "conjunto de son-das" refere-se a uma suíte ou uma coleção de sondas que hi-bridiza para cada um dos sítios de reconhecimento da enzimade restrição primária para uma enzima de restrição primáriaem um genoma.
Desta maneira, é fornecido, em um aspecto adicio-nal, um conjunto de sondas complementares em seqüência à se-qüência de ácido nucléico adjacente a cada uma dos sítios dereconhecimento de enzima de restrição primária para uma en-zima de restrição primária no DNA genômico.
Adequadamente, o conjunto das sondas é complemen-tar em seqüência aos primeiros 25-60 (por exemplo, 35-60,45-60, ou 50-60) ou mais nucleotideos que são adjacentes acada um dos sítios de reconhecimento da enzima de restriçãoprimária no DNA genômico. 0 conjunto de sondas pode ser com-plementar em seqüência com um lado (por exemplo, qualquer)ou ambos os lados do sítio de reconhecimento de enzima derestrição primária. Desta maneira, as sondas podem ser com-plementares em seqüência à seqüência de ácido nucléico adja-cente a cada lado de cada um dos sítios de reconhecimento daenzima de restrição primária no DNA genômico.
É também possível definir uma janela (por exemplo,300 bp ou menos - tal como 250 bp, 200 bp,150 bp ou 100 bp -do sítio de reconhecimento de enzima de restrição primária)em que uma ou mais sondas para o conjunto podem ser projeta-das. Tais fatores que são importantes na definição da janelana qual redesenha as sondas são, por exemplo, teor de GC,ausência de seqüências palindrômicas que podem formar estru-turas do grampo, tamanho máximo para distâncias de um tipode nucleotídeo simples. Desta maneira, o conjunto de sondaspode ser complementar em seqüência à seqüência de ácido nu-cléico que está menos que 300 bp de cada um dos sítios dereconhecimento da enzima de restrição primária no DNA genômico.
É também possível definir uma janela de cerca de100 bp do sítio de reconhecimento da enzima de restriçãoprimária a fim de identificar sondas ideais próximas a cadasitio de restrição.
Em modalidades adicionais da presente invenção, oconjunto das sondas é complementar à seqüência que está me-nos que 300 bp de cada um dos sítios de reconhecimento deenzima de restrição primária no DNA genômico, complementaresà seqüência que é entre 200 e 300 bp de cada um dos sítiosde reconhecimento da enzima de restrição primária no DNA ge-nômico e/ou complementares à seqüência que está entre 100 e200 bp de cada um dos sítios de reconhecimento da enzima derestrição primária no DNA genômico.
Em modalidades adicionais da presente invenção, oconjunto das sondas é complementar à seqüência que é de 0 a300 bp de cada um dos sítios de reconhecimento da enzima derestrição primária no DNA genômico, complementar à seqüênciaque está entre 0 a 200 bp de cada um dos sítios de reconhe-cimento da enzima de restrição primária no DNA genômico e/oucomplementar à seqüência que está entre 0 a 100 bp de cadaum dos sítios de reconhecimento da enzima de restrição pri-mária em DNA genômico (por exemplo, cerca de 10, 20, 30, 40,50, 60, 70, 80 ou 90 bp de cada um dos sítios de reconheci-mento da enzima de restrição primária no DNA genômico).
Duas ou mais sondas pode ainda ser projetadas quesão capazes de hibridizar para a seqüência adjacente a cadasítio de reconhecimento da enzima de restrição primária noDNA genômico.
As sondas podem sobrepor-se, ou sobrepõem-se par-cialmente. Se as sondas ficarem sobrepostas, então a sobre-posição é preferivelmente menos que 10 nucleotideos.
Podem também ser usados fragmentos de PCR repre-sentando o primeiro 1-300 nucleotideos (por exemplo, 1-20,1-40, 1-60, 1-80, 1-100, 1-120, 1-140, 1-160, 1-180,1-200,1-220, 1-240, 1-260 ou 1-280 nucleotideos) que flanqueiamcada sitio de reconhecimento da enzima de restrição primária.
Fragmentos de PCR podem também ser usados comosondas que correspondem exatamente a cada sitio genômico queé flanqueado pelo sitio de reconhecimento da enzima de res-trição primária e o primeiro sitio de reconhecimento de en-zima de restrição vizinho ao segundo. Desta maneira, a se-qüência de sondas pode corresponder a toda ou parte da se-qüência entre cada um dos sítios de reconhecimento da enzimade restrição primária e cada um dos sítios de reconhecimentode enzima de restrição primários vizinhos do secundário.
Tipicamente, as sondas, arranjos de sondas ou con-juntos de sondas serão imobilizados em um suporte. Suportes(por exemplo, suportes sólido,) podem ser feitos de uma vari-edade de materiais - tais como vidro, sílica, plástico, nái-lon ou nitrocelulose. Suportes são preferivelmente rígidos etêm uma superfície plana. Suportes tipicamente têm de cercade 1-10.000.000 regiões espacialmente endereçáveis discre-tas, ou células. Suportes tendo cerca de 10-1.000.000 oucerca de 100-100.000 ou cerca de 1000-100.000 células sãocomuns. A densidade de células é tipicamente pelo menos cer-ca de 1.000, 10.000, 100.000 ou 1.000.000 células dentro deum centímetro quadrado. Em alguns suportes, todas as célulassão ocupadas por misturas agrupadas de sondas ou um conjuntode sondas. Em outros suportes, algumas células são ocupadaspor misturas agrupadas de sondas ou um conjunto de sondas, eoutras células são ocupadas pelo menos até o grau de purezaobtenivel pelos métodos da síntese, por um tipo simples deoligonucleotídeo.
Preferivelmente, o arranjo aqui descrito compreen-de mais que uma sonda por sítio de reconhecimento de enzimação de corte 6 bp, ocorre, por exemplo, aproximadamente750.000 vezes por genoma humano ou camundongo.
Para uma enzima de restrição que reconhece uma se-qüência de reconhecimento >6 bp, um arranjo simples de cercade 2 χ 750.000 sondas pode ser usado para cobrir, por exem-pio, o genoma humano ou camundongo completo, com 1 sonda acada lado de cada sítio de restrição.
Em um desenho de arranjo preferido, o número totalde moléculas de sonda de uma dada seqüência de nucleotídeospresente no arranjo é em grande excesso em relação a frag-mentos homólogos presentes na amostra 4C a ser hibridizadacom tal arranjo. Dada a natureza de tecnologia 4C, fragmen-tos representando regiões genômicas perto da seqüência denucleotídeos analisada no padrão de cromatina linear será emgrande excesso na amostra de hibridização 4C (como descritona Figura 2). Para obter informação quantitativa a cerca deeficiência de hibridização de tais fragmentos abundantes,pode ser necessário reduzir a quantidade de amostra a serhibridizada e/ou aumentar o número de moléculas de uma dadadada sonda de seqüência de oligonucleotideos no arranjo.
Assim, para a detecção de elementos reguladores deDNA que fazem contato freqüentemente, por exemplo, um ele-mento promotor de gene, pode ser necessário usar um arranjocom sondas que representa somente a região genômica selecio-nada (por exemplo, cerca de 0, 540 Mb), mas com cada sondaúnica presente em múltiplas posições no arranjo (por exem-plo, cerca de 100, 200, 1000) . Tais desenhos podem tambémser preferidos com o propósito de diagnóstico para detectarlocal (por exemplo, em cerca de 10 Mb) ré-arranjos genômicos- tal como deleções, inversões, duplicações, etc. - em tornoum sitio (por exemplo, gene de interesse).
O arranjo pode compreender cerca de 3 χ 750.000sondas, 4 χ 750.000 sondas, 5 χ 750.000 sondas ou, preferi-velmente, 6 χ 750.000 sondas. Mais preferivelmente, o arran-jo compreende 6 χ 750.000 sondas com 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8ou mais sondas a cada lado de cada sitio de restrição. Maispreferivelmente, o arranjo compreende 6 χ 750.000 sondas,com 3 sondas em cada lado de cada sitio de restrição.
Arranjos de sondas ou conjuntos de sondas podemser sintetizados etapa por etapa em um suporte, ou podem seranexados de forma pré-sintetizada. Um método de síntese VL-SIPS.TM. (como. descrito em US 5.143.854 e EP 476.014), queexige o uso de luz para direcionar a síntese de sondas deoligonucleotídeo em arranjos miniaturizados de alta densida-de. Algoritmos para desenho de máscaras para reduzir o núme-ro de ciclos de síntese são descritos em US 5.571.639 e US.5.593.839. Arranjos podem também ser sintetizados de um modocombinatório, distribuindo monômeros às células de um supor-te por caminhos de fluxo mecanicamente restritos, descritosem EP 624.059. Arranjos podem também ser sintetizados porreagentes de localização em um suporte usando uma impressorajato de tinta (ver, por exemplo, EP 728.520).
No contexto da presente invenção, os termos "subs-tancialmente um conjunto de sondas" "substancialmente o ar-ranjo de sondas" significa que o conjunto ou o arranjo desondas compreende pelo menos cerca de 50, 60, 70, 80, 90,95, 96, 97, 98 ou 99 % do conjunto ou arranjo de sondas to-tal ou completo. Preferivelmente, o conjunto ou o arranjo desondas é um conjunto de sondas total ou completo (isto é,100 %).
Em uma modalidade preferida, o arranjo compreendeuma sonda simples única por lado de cada sitio de reconheci-mento enzima de restrição primária que é presente em um dadogenoma. Se este número de sondas exceder o número de sondasque pode ser contido por um arranjo simples, o arranjo podepreferivelmente ainda conter uma representação do genomacompleto de uma dada espécie, mas em baixa resolução, compor exemplo uma a cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, IO2, IO3ou IO4 etc. sondas ordenadas no padrão do cromossomo linearpresente no arranjo. Tais arranjos que tratam o genoma huma-no completo, ou outros, em resolução subideal podem ser pre-feridos com relação a arranjos de alta resolução que tratamparte do mesmo genoma, por exemplo, em casos onde devem serencontrados parceiros translocação.
Preferivelmente, a representação do genoma comple-to de uma dada espécie em baixa resolução é obtida por son-das no arranjo em que cada uma representa um fragmento derestrição simples obtido após digestão com uma enzima derestrição primária. Preferivelmente, isto é obtido ignorandocada segunda, terceira, quarta, quinta, sexta, sétima, oita-va, nona, décima, vigésima, trigésima, quadragésima, quin-quagésima, sexagésima, septuagésima, octagésima, nonagésimaou centésima, etc. sonda que hibridiza para o mesmo fragmen-to de restrição.
Preferivelmente, a representação do genoma comple-to de uma dada espécie em baixa resolução compreende sondasque são distribuídas igualmente juntamente com os padrões docromossomo lineares. Preferivelmente, isto é obtido ignoran-do uma ou mais sondas nas regiões genômicas que apresentamdensidade alta de sonda.
Hibridização
O termo "hibridização" da maneira aqui usada in-cluirá "o processo pelo qual uma fita de ácido nucléico une-se a uma fita complementar por meio de pareamento de base"bem como o processo de amplificação realizado por exemplo,em tecnologias de reação da cadeia de polimerase (PCR).
Seqüências de nucleotídeos capazes de hibridizaçãoseletiva serão feitas de maneira geral pelo menos-75 %, pre-ferivelmente pelo menos 85 ou 90 % e mais preferivelmentepelo menos 95 % ou 98 % homólogo a seqüência de nucleotídeoscomplementar correspondente em uma região de pelo menos 20,preferivelmente pelo menos 25 ou 30, por exemplo, pelo menos40, 60 ou 100 ou mais nucleotídeos contíguos."Hibridização especifica" refere-se a ligação, du-plexação, ou hibridização de uma molécula somente com umaseqüência de nucleotideos particular sob condições rigorosas(por exemplo, 65 0C e 0,1 χ SSC {1 χ SSC = NaCl 0,15 Μ, Na-citrato 0,015 M pH 7,0}). Condições rigorosas são condiçõessob as quais uma sonda hibridizará com sua seqüência visada,mas com nenhumas outras seqüências. Condições rigorosas de-pendem da seqüência, e são diferentes em circunstâncias di-ferentes. Seqüências maiores hibridizam especificamente emaltas temperaturas. De maneira geral, condições rigorosassão selecionadas para ser cerca de 5 0C menor que os pontosde fusão (Tm) para a seqüência especifica em um comprimentoe pH iônicos definidos. A Tm é a temperatura (sob intensida-de iônicas, pH, e concentração de ácido nucléico definidos)em que 50 % das sondas complementares em uma seqüência visa-da hibridizam para a seqüência visada em equilíbrio. (Comoas seqüências visadas estão de maneira geral presentes emexcesso, a Tm, 50 % das sondas são ocupadas em equilíbrio) .
Tipicamente, condições rigorosas incluem uma concentração desal de pelo menos cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração iô-nica Na (ou outros sais) a pH 7,0 a 8,3 e a temperatura épelo menos cerca de 30 0C para sondas pequenas. Condiçõesrigorosas podem também ser alcançadas com a adição de agen-tes desestabilizantes - tais como formamida ou sais de te-tralquila amônio.
Como é de conhecimento dos versados na técnica,uma hibridização de máxima severidade pode ser usada paraidentificar ou detectar seqüências de nucleotideos idênticasao passo que uma hibridização intermediária severa (ou bai-xa) pode ser usada para identificar ou detectar seqüênciasde polinucleotideos similares ou relacionadas.
São também descritos métodos para a hibridizaçãode arranjos de sondas com seqüências de nucleotideos marca-das ou não marcadas. As condições de reação de hibridizaçãoparticulares podem ser controladas para alterar a hibridiza-ção (por exemplo, aumentar ou diminuir a severidade de liga-ção da sonda/alvo). Por exemplo, temperatura da reação, con-centrações de ânions e cátions, adição de detergentes, e si-milares podem todos alterar as características de hibridiza-ção de sondas de arranjos e moléculas visadas.
Freqüência de interação
Freqüências de ligação de quantificação de frag-mentos de restrição dão uma medida de suas freqüências reti-culadas. Adequadamente, isto pode ser obtido usando PCR usa-do em tecnologia 3C convencional descrita por Splinter etat. (2004) (supra). Resumidamente, a formação de . produtosPCR pode ser medida varrendo as intensidades de sinal após aseparação em brometo de etídio manchado em gel de agarose,usando um imageador Typhoon 9200 (Molecular Dynamics, Sunny-vale, CA). Adequadamente, diversos controles são usados paraa interpretação correta de dados também descritos em Splin-ter et at. (2004) {supra).
Uma vez que a tecnologia 4C aqui descrita fornecepara a análise de alta produção da freqüência de interaçãode duas ou mais seqüências de nucleotideos no espaço nucle-ar, prefere-se que as freqüências de ligação de fragmentosde restrição sejam quantificadas usando os arranjos aquidescritos.
Para quantificação, sinais obtidos por uma amostra4C podem ser normalizados com sinais obtidos por uma amostrade controle. Amostra 4C e amostras(s) de controle(s) serãomarcadas com marcações diferentes e discerniveis (por exem-plo, corantes) e serão simultaneamente hibridizadas com oarranjo. Amostra (s) de controle (s) conterá(ão) tipicamentetodos fragmentos de DNA (isto é, todas segundas seqüênciasde nucleotideos potenciais que foram ligadas com a primeiraseqüência de nucleotideos (visada)) em quantidades equimola-res e, para excluir uma propensão na eficiência de hibridi-zação, elas devem ser similares em tamanho à(s) segunda(s)seqüência (s) de nucleotideos. Assim, o padrão de controleconterá tipicamente DNA genômico (do mesmo fundo genético aousado para obter o padrão 4C) , digerido tanto com a enzimade restrição primária quanto secundária e marcado pelo mesmométodo (por exemplo, iniciação aleatória) como o padrão 4C.
Tal padrão de controle possibilita corrigir, sonda-por-sonda, diferenças na eficiência de hibridização. A normali-zação de sinais de arranjo 4C para controlar sinais de ar-ranjo possibilita expressar o resultado em termos de enri-quecimento em relação a eventos aleatórios.
O padrão 4C marcado pode ainda ser hibridizado comum arranjo com ou sem uma amostra de controle diferencial-mente marcada e com ou sem um ou mais outros padrões 4C di-ferencialmente marcados. Outros padrões 4C podem ser não re-lacionados a este padrão 4C, por exemplo, ele podem serobtidos de diferente tecido e/ou obtidos com um conjunto di-ferente de iniciadores inversos de PCR. Por exemplo, o pri-meiro padrão 4C pode ser material do paciente e o segundopadrão 4C pode ser obtido de um sujeito saudável ou uma a-mostra de controle.
Por causa dos rigorosos padrões de hibridizaçãoque espera-se encontrar para ré-arranjos genéticos, não serásempre necessário comparar sujeitos doentes com sujeitossaudáveis. Desta maneira, múltiplos (por exemplo, dois oumais) padrões 4C, cada qual interrogando um locus diferentedo mesmo paciente ou sujeito, podem ser hibridizados para um(por exemplo, um ou mais) arranjo.
Os padrões 4C podem ser diferencialmente marcados(por exemplo, com hibridização de duas ou múltiplas cores)e/ou podem ser identicamente marcados no caso de tal Iocinormalmente residir em diferentes cromossomos ou no mesmocromossomo a uma distância grande o bastante para sobreposi-ção mínima entre interação de sinais de DNA-DNA. Como um e-xemplo, material de um sujeito com leucemia de célula T podeser processado para obter padrões 4C para TCR α/δ (marcadosem uma cor, a fim de detectar translocações) , eMLL,TALIrHOXll e LM02 (cada um marcado na mesma segunda cor,a fim de detectar outros ré-arranjos genéticos). Estes cincopadrões 4C podem ser hibridizados para um arranjo, que per-mitirá a análise simultânea em múltiplos Ioci por um ré-arranjo genômico associado com a doença.
Para quantificação de freqüências de interação,intensidades de sinal absoluto ou razões em relação à amos-tra de controle podem também ser consideradas. Além do mais,sinais de sondas adjacentes no padrão do cromossomo linearpodem ser usados para identificar regiões de interação cro-mossomais. Tal informação posicionai é preferivelmente ana-lisada ordenando as sondas no padrão do cromossomo linear eanalisando as intensidades absolutas de sinal, ou razões comrelação a sinais de padrão de controle, por abordagens dejanela deslizante, usando, por exemplo, abordagens de médiacorrida ou mediana corrida.
Método de ensaio
Em um aspecto adicional da presente invenção, éfornecido um método de arranjo para identificar um ou maisagentes que modulam uma interação de DNA-DNA.
Da maneira aqui usada, o termo "modular" refere-sea prevenir, diminuir, suprimir, restaurar, elevar, aumentarou de outra forma afetar a interação de DNA-DNA.
Em alguns casos, pode ser desejável avaliar doisou mais agentes juntos para o uso em modular a interação deDNA-DNA. Nestes casos, ensaios podem ser facilmente modifi-cados adicionando tal(s) agente(s) adicional(s) tanto simul-taneamente quanto subseqüentemente ao primeiro agente.
0 método da presente invenção pode também ser umaseleção, por meio do que inúmeros agentes são testados paramodular a atividade da interação de DNA-DNA.
Espera-se que os métodos de ensaio da presente in-venção sejam adequados tanto para seleção em pequena escalaquanto em grande escala de agentes, bem como em ensaiosquantitativos.Usos médicos de tais agentes terapêuticos estão noescopo da presente invenção, bem como os programas de desen-volvimento dos medicamento em si e composições farmacêuticasque compreendem tais agentes. Um programa de desenvolvimentode medicamento pode, por exemplo, envolver tomar um agenteidentificado ou identificável pelos métodos aqui descritos,opcionalmente modificando-o (por exemplo, modificar sua es-trutura e/ou fornecer uma composição inédita que compreendea dita fração) e desenvolver estudos adicionais (por exem-pio, estudos de toxicidade e /ou estudos em atividade, es-trutura ou função). Experiências podem ser realizadas em a-nimais não humanos e podem eventualmente ser realizadas emseres humanos. Tais experiências incluirão de maneira geraldeterminar o(s) efeito(s) de níveis de dosagem diferentes.Programas de desenvolvimento de medicamento podem utilizarcomputadores para analisar frações identificadas pela sele-ção (por exemplo, para prever estrutura e/ou função, paraidentificar possíveis agonistas ou antagonistas, para pes-quisar outras frações que podem ter estruturas ou funçõessimilares, etc.).
Teste de diagnóstico
Atualmente, várias ré-arranjos genômicos continuamdifíceis de detectar por técnicas citogenéticas molecularesdisponíveis. Embora o arranjo técnica de hibridização genô-mica comparativa (arranjo-CGII) seja uma técnica recém-desenvolvida para a detecção de amplificação e/ou deleçõescromossomais com uma resolução de 35-300 Kb, esta técnicanão é adequada para detectar translocações balanceadas e in-versões cromossomais. Por outro lado, cariotipagem espectral(SKY) ou cariotipagem convencional é freqüentemente realiza-da em material do paciente para a detecção de translocaçõescromossomais bem como mudanças numéricas, mas a resoluçãopara definir pontos de ruptura de translocação é baixa, fre-qüentemente 10-50 Mb e 540 Mb, respectivamente. Conseqüente-mente, resultados obtidos por ambos métodos e especialmenteSKY levarão a experimentos validações demorados e de muitamão-de-obra como hibridização in situ de fluorescência (FI-SH) e de estratégias de clonagem de ponto de ruptura molecular.
Tecnologia 4C envolve um procedimento que pode de-tectar qualquer ré-arranjo cromossomal com base nas freqüên-cias da interação entre seqüências alteradas de DNA fisica-mente ligadas. Tecnologia 4C é, portanto, usada para a iden-tificação de (recorrente) ré-arranjos cromossomais para amaioria dos males humanos / más formações congênitas múlti-plas ou retardo mental. Uma vantagem importante da tecnolo-gia 4C é que ela permite o mapeamento muito preciso do pontode ruptura para uma região de somente diversos milhares depares de base. Uma outra vantagem de tecnologia 4C é que ne-nhum conhecimento anterior é requerido na posição exata doponto de ruptura, uma vez que pontos de ruptura serão detec-táveis mesmo quando a seqüência 4C bait estiver localizada1-5 Mb fora do ponto de ruptura. Isto tem também a vantagemque a mesma seqüência bait pode ser usada para a detecção deré-arranjos cromossomais específicos cobrindo grandes áreasde ponto de ruptura. 0 mapeamento preciso de ré-arranjos ge-nômicos pela tecnologia 4C facilitará bastante a identifica-ção de gene(s) aberrantemente expresso(s) que dão suporte adoenças ou desordens genéticas que contribuirão importante-mente para um melhor entendimento das correlações genótipo-fenótipo, ajuda na tomada de decisão do tratamento e que a-diciona informação importante de prognóstico.
Em uma modalidade da presente invenção, a fim defornecer uma base para o diagnóstico ou prognóstico de doen-ça, são estabelecidos valores normais ou padrões de um su-jeito. Isto pode ser obtido testando amostras tomadas de su-jeitos normais - tal como animais ou humanos. A freqüênciada interação de DNA-DNA pode ser quantificada para compará-la com uma série de diluição de controles positivos. Em se-guida, valores de padrão obtidos de amostras normais podemser comparados com valores obtidos de amostras de sujeitosafetados ou potencialmente afetados por uma doença ou umadesordem. O desvio entre valores padrões e do sujeito esta-belece a presença do estado da doença.
Tais ensaios de diagnóstico podem ser feitos sobmedida para avaliar a eficácia de um regime de tratamentoterapêutico particular e podem ser usados em estudos ani-mais, em experiências clinicas, ou em monitoramento de tra-tamento de um paciente individual. A fim de fornecer uma ba-se para o diagnóstico de doença, pode-se estabelecer um per-fil normal ou padrão para a interação de DNA-DNA. Valores depadrão obtidos de amostras normais podem ser comparados comvalores obtidos de amostras de sujeitos potencialmente afe-tados por uma desordem ou doença. O desvio entre valores pa-drões e sujeito estabelece a presença do estado da doença.Se doença for estabelecida, um agente terapêutico existentepode ser administrado, e o perfil do tratamento ou valorespodem ser gerados. Finalmente, o método pode ser repetido emuma base regular para avaliar se os valores progridem a fa-vor ou contra o modelo normal ou padronizado. Perfis de tra-tamento sucessivos podem ser usados para mostrar a eficáciado tratamento por um período de diversos dias ou diversosmeses.
A tecnologia 4C detecta precisamente pelo menos 5Mb de DNA genômico ligado em eis com a seqüência de nucleo-tídeos que é analisada (ver Figura 2-3 e 5). Vantajosamente,a tecnologia 4C pode ser usada para detectar.qualquer aber-ração genômica que é acompanhada por uma mudança em separa-ção do sítio genômico entre seqüências ré-arranjadas e umaseqüência 4C (bait) de escolha. Tal mudança pode ser, porexemplo, um aumento ou diminuição na separação do sítio ge-nômico, ou pode ser uma subrepresentação (como em dele-ção(s)), ou sobrerepresentação (como em duplicações) de se-qüências proximais (por exemplo, de até 15 Mb ou mais) com aseqüência 4C (bait). Tipicamente, tais aberrações genômicasou ré-arranjos são uma causa ou estão associados com doenças- tais como câncer (por exemplo, leucemia) - e outras doen-ças genéticas ou congênitas aqui descritas.
Aberrações genéticas (por exemplo, aberrações ge-nômicas ou cromossomais - tais como aberrações genômicas oucromossomais balanceadas e/ou ou não balanceadas) incluem,mas sem limitações, ré-arranjos, translocações, inversões,inserções, deleções e outras mutações de ácido nucléico (porexemplo, cromossomos) e também perdas ou ganhos de parte outodos os cromossomos. Elas são a causa principal de desor-dens genéticas ou doenças, incluindo desordens congênitas edoenças adquiridas - tal como males. Em muitos ré-arranjos,dois diferentes cromossomos são envolvidos. Desta maneira,genes (ou fragmentos de genes) são removidos do contexto fi-siológico normal de um cromossomo particular e são localiza-dos em um cromossomo recipiente, adjacente a genes não rela-cionados ou fragmentos de genes (freqüentemente oncogenes ouproto-oncogenes).
Males podem incluir leucemias agudas, Iinfornas ma-lignos e tumores sólidos. Exemplos não limitantes de altera-ções são t(14;18) que ocorrem freqüentemente em NHL;t(12;21) que é freqüentemente encontrado em infância precur-sor-B-ALL; e a presença de llq23 (MLL (leucemia linfóide mi-elóica ou leucemia de linhagem misturada) gene) aberraçõesem leucemias agudas.
0 gene MLL na região do cromossomo llg23 é envol-vido em diversas translocações tanto em leucemias ALL quantomielóide aguda (AML). Até hoje, pelo menos dez genes parcei-ros foram identificados. Algumas dessas translocações,tais como t(4;ll) (q21; g23), t(ll;19) (q23; pl3) e t(l;ll)(p32; q23), ocorrem predominantemente em ALL, onde outros,como t(1;11) (q21; q23), t(2;ll) (p21; q23), t(6;ll) (q27;q23) e t(9;ll) 10 (p22; q23) são mais freqüentemente obser-vados em AML. Ré-arranjos envolvendo a região llq23 ocorremmuito freqüentemente em leucemias agudas infantis (em torno60-70 %), e em uma extensão muito menor em leucemias na in-fância e adulta (cada qual em torno 5 %).
Ré-arranjos em males linfóides freqüentemente en-volvem genes Ig ou TCR. Exemplos incluem os três tipos detranslocações (t(8;14), t(2;8), e t(8;22)) que são encontra-dos em linfomas de Burldtt, em que o gene MYC é acoplado àcadeia pesada Ig (IGH), kappa Ig (IGK), ou lambda Ig (IGL)segmentos do gene, respectivamente. Um outro tipo comum detranslocação nesta categoria é t(14;18) (q32 ;q21) que é ob-servado em cerca de 90 % de linfomas foliculares, um dos ti-pos NHL principais. Nesta translocação gene BCL2 é ré-arranjado em regiões dento do locus IGH dentro ou adjacenteaos segmentos do gene TH. O resultado dessa aberração docromossomo é o sobreexpressão da proteína BCL2, que desempe-nha um papel como um fator de sobrevivência no controle docrescimento, inibindo a morte de célula programada.
O gene BCL2 consiste em três exons, mas esses sãodispersos em uma grande área. Desses, o último exon codificauma grande região não traduzida de 3' (3' UTR). Esta UTR 3'é uma das duas regiões em que muitos pontos de ruptura t(14;18) são agrupados e é denominado a "região do ponto de rup-tura principal"; a outra região de ponto de ruptura envolvi-da em translocações t(14; 18) fica localizada 20-30 kb à ju-sante do locus BCL2 e é denominada a "menor região de agru-pamento". Uma terceira área de ponto de ruptura, BCL2 o VCR(região de agrupamento variante), é localizada no lado de 5'do locus BCL2 e está entre outras coisas envolvida em trans-locações variantes, isto é, t(2;18) e t(18;22), em que seg-mentos de gene IGK e IGL são os genes parceiro.
Assim, a titulo de exemplo, tecnologia 4C pode seraplicada à seleção de material do paciente para aberraçõesgenéticas próximas ou em Ioci que foram escolhidos com basena sua associação freqüente com um dado fenótipo clinico.Exemplos não limitantes adicionais de tal Ioci são AMLI,MLL, MYC, BCL, BCRf ABLI, Ioci de imonoglobulina, LYLl,TALl, TAL2, LM02, TCR α/δ, TCR/δ, HOX e outros Ioci em vá-rias leucemias linfoblásticas.
Vantajosamente, se uma aberração genética é sus-peita, a tecnologia 4C pode ser aplicada como a primeira eúnica seleção para verificar e mapear a presença da aberra-ção da maneira aqui explicada.
Detecção de ré-arranjos genômicos
Em uma modalidade particularmente preferida dapresente invenção, os métodos aqui descritos podem ser usa-dos para a detecção de ré-arranjos genômicos.
Atualmente, ré-arranjos genômicos - tais como pon-tos de ruptura de translocação - são muito difíceis de de-tectar. Por exemplo, microarranjos de hibridização genômicacomparativos (CGH) podem detectar diversos tipos de ré-arranjos, mas não conseguem detectar translocações. Setranslocação é suspeita em um paciente, mas parceiros cro-mossomo são desconhecidos, cariotipagem espectral (SKY) podeser realizado para encontrar parceiros de translocação e ob-ter uma estimativa aproximada dos locais de ponto de ruptu-ra. Entretanto, a resolução é muito fraca (freqüentementenão maior que ~50 Mb) e é freqüentemente necessário o mapea-mento fino adicional (que é tanto demorado quanto caro). Is-to é normalmente feito usando hibridização in situ de fluo-rescência (FISH), que novamente fornece resolução limitada.Usando FISH, pontos de ruptura podem ser localizados até +/-50 kb da região em resolução máxima.
Freqüências da interação de DNA-DNA basicamentesão função da separação do sitio genômico, isto é, as fre-qüências de interação DNA-DNA são inversamente proporcionaisà distância linear (em quilobases) entre dois Ioci de DNApresentes no mesmo padrão de DNA físico (Dekker et at. ,2002) . Assim, uma translocação, que cria um ou mais novospadrões DNA físicos, é acompanhada por interações de DNA-DNAalteradas próximo aos pontos de ruptura, e isto pode ser me-dido pela tecnologia 4C. Doenças com base nas translocaçõessão tipicamente causadas por interações de DNA-DNA aberran-tes, já que as translocações são o resultado da ligação fí-sica (interação) de braços de cromossomo quebrados (DNA).
Desta maneira, para a detecção de translocações,tecnologia 4C pode ser usada para identificar as interaçõesde DNA-DNA que são diferentes entre sujeitos doentes e nãodoentes.
A título de exemplo, tecnologia 4C pode ser apli-cada à seleção de material do paciente para translocaçõespróximas aos Ioci que foram escolhidos com base nas suas as-sociações freqüentes com um dado fenótipo clínico aquidescrito.
Se houver suspeita de translocação em um paciente,mas os parceiros cromossomos forem desconhecidos, um mapea-mento inicial pode ser realizado usando métodos atualmentedisponíveis como cariotipagem espectral (SKY). Isto pode i-dentificar os parceiros de translocação e fornecer uma esti-mativa bastante grosseira dos locais de ponto de ruptura(freqüentemente não maior que -50 Mb resolução). Tecnologia4C pode em seguida ser aplicada, usando seqüências 'bait'nesta região localizada, por exemplo, a cada 2 Mb, 5 Mb, 10Mb, 20 Mb (ou outros intervalos aqui descritos) para mapearfinamente o ponto de ruptura e identificar por exemplo o(s)gene(s) que é(são) mal-expressos em decorrência da translo-cação.
Tipicamente uma translocação será identificada pormeio de uma transição abrupta de freqüências da interaçãobaixa para alta em um cromossomo sem ser o que contém a se-qüência bait 4C, ou em qualquer lugar nesse mesmo cromossomo.
Em uma modalidade preferida, a amostra do sujeitoé em um estado pré-maligno.
Em uma modalidade preferida, a amostra do sujeitoconsiste em líquidos amnióticos cultivados ou não cultivadosobtidos por amniocentesis para diagnóstico pré-natal.
Em um desenho do arranjo preferido, sondas presen-tes em um arranjo simples representam o genoma completo deuma dada espécie em máxima resolução. Assim, arranjos paradetectar translocações e similares pela tecnologia 4C contêmsondas aqui descritas complementares, de cada lado de cadasítio de reconhecimento da enzima de restrição primária nogenoma de uma dada espécie (por exemplo, humana).
Em um outro desenho preferido, sondas presentes emum arranjo simples representam o genoma completo de uma dadaespécie, mas não em máxima resolução. Assim, arranjos paradetectar translocações e similares pela tecnologia 4C contêmsondas aqui descritas que são complementares a somente umlado de cada sitio de reconhecimento da enzima de restriçãoprimária no genoma de uma dada espécie (por exemplo, humana).
Em um outro desenho preferido, sondas presentes emum arranjo simples representam o genoma completo de uma dadaespécie; mas não em máxima resolução. Assim, arranjos paradetectar translocações, deleções, inversões, duplicações eoutros ré-arranjos genômicos pela tecnologia 4C contêm son-das aqui descritas que são complementares a um lado de cadaoutro sitio de reconhecimento da enzima de restrição primá-ria ordenadas junto com o padrão linear do genoma de uma da-da espécie (por exemplo, humana).
Assim, arranjos para detectar translocações, dele-ções, inversões, duplicações e outros ré-arranjos genômicospela tecnologia 4C contêm sondas aqui descritas que repre-sentam cada qual um fragmento de restrição simples, obtidoapós a digestão com uma enzima de restrição primária. Prefe-rivelmente, isto é obtido ignorando cada segunda, terceira,quarta, quinta, sexta, sétima, oitava, nona, décima, vigési-ma, trigésima, quadragésima, quinquagésima, sexagésima, sep-tuagésima, octagésima, nonagésima ou centésima etc., sondaque hibridiza para o mesmo fragmento de restrição. Arranjospara detectar translocações, deleções, inversões, duplica-ções e outros ré-arranjos genômicos pela tecnologia 4C podemconter sondas aqui descritas que são distribuídas igualmentejunto com os padrões do cromossomo lineares. Preferivelmen-te, isto é obtido ignorando uma ou mais sondas nas regiõesgenômicas que apresentam a mais alta densidade de sonda.
Em um outro desenho preferido, sondas presentes emum arranjo simples representam o genoma completo de uma dadaespécie, mas não em resolução máxima. Assim, arranjos paradetectar translocações, deleções, inversões, duplicações eoutros ré-arranjos genômicos pela tecnologia 4C contêm son-das aqui descritas complementares a um lado de cada tercei-ro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, nono, décimo, vi-gésimo, trigésimo, quadragésimo, quinquagésimo, sexagésimo,septuagésimo, octagésimo, nonagésimo, ou um centésimo etc.,sítio de reconhecimento da enzima de restrição primária or-denadas junto com o padrão linear do genoma de uma dada es-pécie (por exemplo, humana). Arranjos para detectar translo-cações, deleções, inversões, duplicações e outros ré-arranjos genômicos pela tecnologia 4C pode conter sondas a-qui descritas, que representam o genoma completo, mas comuma sonda simples cada 100 quilobases. Arranjos para detec-tar translocações, deleções, inversões, duplicações e outrosré-arranjos genômicos pela tecnologia 4C pode contêm sondasaqui descritas que representam cada sítio de reconhecimentode enzima de restrição primária simples no genoma que podeser representado por uma seqüência de sonda única.
Em um outro desenho de arranjo preferido, sondasaqui descritas em um arranjo simples representam regiões ge-nômicas de um dado tamanho - tal como cerca de 50 kb, 100kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb,5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb ou 10 Mb (por exemplo, cerca de50 kb-10 Mb) em torno de todo Ioci conhecido a ser envolvidoem translocações, deleções, inversões, duplicações e outrosré-arranjos genômicos.
Em um outro desenho de arranjo preferido, sondasaqui descritas em um arranjo simples representam regiões ge-nômicas de um dado tamanho - tal como cerca de 50 kb, 100kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb,5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb ou 10 Mb (por exemplo, cerca de50 kb-10 Mb) em torno um seleção de Ioci conhecidos envolvi-dos em translocações, deleções, inversões, duplicações e ou-tros ré-arranjos genômicos. Seleções podem ser feitas emcritérios educados, por exemplo, eles podem representar so-mente os Ioci que são implicados em um dado tipo de doença.
Em um outro desenho de arranjo preferido, sondasaqui descritas em um arranjo simples representam uma regiãogenômica de interesse de, por exemplo, 100 kb, 200 kb, 300kb, 400 kb, 500 kb, 600 kb, 700 kb, 800 kb, 900 kb, 1 Mb, 2Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb, 10 Mb, 20 Mb,30 Mb, 40 Mb, 50 Mb, 60 Mb, 70 Mb, 80 Mb, 90 Mb, ou 100 Mb(por exemplo, 100 kb-10 Mb) (parte de) um cromossomo ou múl-tiplos cromossomos, com cada sonda sendo representada múlti-plas (por exemplo, 10, 100, 1000) vezes para permitir medi-ções quantitativas de intensidades de sinal de hibridizaçãoem cada seqüência de sonda.Em um desenho experimental preferido, a seqüência4C (bait) é em cerca de 0 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 50kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb 10 Mb, 11 Mb, 12 Mb,13 Mb, 14 Mb ou 15 Mb (por exemplo, cerca de 0-15 Mb) oumais da seqüência ré-arranjada atual (isto é, ponto de rup-tura no caso de uma translocação).
Em uma hibridização preferida, dois padrões 4Cmarcados diferencialmente obtidos com uma seqüência (4Cbait) de um sujeito doente e não doente são hibridizados si-multaneamente com o mesmo arranjo. Diferenças nas interaçõesde DNA-DNA permitem a detecção do ponto de ruptura em eis(no mesmo cromossomo como o 4C bait) e em trans (no parceirode translocação).
Em uma hibridização preferida, múltiplos padrões4C diferencialmente marcados obtidos com uma seqüência (4Cbait) de sujeitos doentes e não doentes são hibridizados si-multaneamente com o mesmo arranjo. Diferenças nas interaçõesde DNA-DNA permitem a detecção do ponto de ruptura em eis(no mesmo cromossomo como o 4C bait) e em trans (no parceirode translocação).
Vantajosamente, análise multicor, em vez de duascores, em microarranjos pode ser utilizada, permitindo a hi-bridização simultânea de mais que duas amostras com um ar-ranjo simples. Desta maneira, hibridização multicor pode serusada em tecnologia 4C.
Em uma hibridização preferida, múltiplos padrões4C diferencialmente marcados obtidos com uma seqüência (4Cbait) de sujeito doentes e um padrão 4C diferencialmentemarcado de um sujeito não doente são hibridizados simultane-amente com o mesmo arranjo. Diferenças nas interações deDNA-DNA permitem a detecção do ponto de ruptura em eis (nomesmo cromossomo como o 4C bait) e em trans (no parceiro detranslocação).
Em uma outra hibridização preferida, dois padrões4C diferencialmente marcados do mesmo sujeito não doente,obtidos com duas seqüências diferentes (4C baits) que cadarepresenta um outro parceiro de translocação possível, sãohibridizados simultaneamente com o mesmo arranjo. Agrupamen-tos de sinais de hibridização fortes observados no padrãolinear dos cromossomos não relacionados com o cromossomo queleva a seqüência de interesse (4C-bait) identificarão o cro-mossomo parceiro de translocação e o ponto de ruptura noparceiro de translocação.
Em uma outra hibridização preferida, múltiplos pa-drões 4C diferencialmente marcados do mesmo sujeito não do-ente, obtidos com múltiplas diferentes seqüências (4C-baits)que representam cada qual um outro parceiro de translocaçãopossível, são hibridizados simultaneamente com o mesmo ar-ranjo. Agrupamentos de sinais de hibridização fortes obser-vados no padrão linear dos cromossomos não relacionadas como cromossomo que leva a seqüência de interesse (4C-bait) i-dentificarão o cromossomo parceiro de translocação e seuponto de ruptura para a seqüência de interesse.
Material usado para a detecção de translocações,deleções, inversões, duplicações e outros ré-arranjos genô-micos pela tecnologia 4C pode ser obtido por reticulação (eprocesso adicional, descrito) de células vivas e/ou célulasmortas e/ou lisatos nucleares e/ou cromatina isolada etc.(aqui descrito) de sujeitos doentes e/ou não doentes.
Detecção de Inversões
Inversões (por exemplo, inversões balanceadas) nãopodem ser detectadas por métodos - tal como técnica de hi-bridização genômica comparativa - mas podem ser detectadospela tecnologia 4C particularmente quando a inversão (balan-ceada) está perto (por exemplo, até cerca de 1-15 Mb oumais) da seqüência 4C (bait).
Detecção de inversões (balanceadas) é baseada naidentificação das interações de DNA-DNA que foram diferentesentre sujeitos doentes e não doentes. Inversões mudarão aposição relativa (em quilobases) no padrão de DNA físico detodas seqüências da região ré-arranjada (mas o mais central-mente localizado) medida contra uma seqüência próxima nomesmo cromossomo que é tomado como seqüência 4C (bait). Umavez que freqüências da interação de DNA-DNA são inversamenterelacionadas com a separação do sítio genômico, sujeitos do-entes darão parceiros inversos de intensidades de hibridiza-ção para todas as sondas localizadas na região genômica ré-arranjada, comparado com um sujeito não doente. Assim, tec-nologia 4C permite a identificação de posição e tamanho deinversões (balanceadas).
De acordo com este aspecto da presente invenção,um desenho do arranjo dedicado preferido compreende sondasem um arranjo simples representando regiões genômicas de umdado tamanho - tais como cerca de 50 kb, 100 kb, 200 kb, 300kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 7Mb, 8 Mb, 9 Mb ou 10 Mb) (por exemplo, 50 kb-10 Mb) em tornodo locus no qual a inversão ou outro ré-arranjo é suspeita.
Em um outro desenho do arranjo dedicado preferido,sondas em um arranjo simples representam regiões genômicasde um dado tamanho (50 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb,500 kb, 1 Mb, 2 Mb etc.) em torno do locus no qual a inver-são ou outro ré-arranjo é suspeita. Para análise quantitati-va confiável de intensidades de sinal a quantidade de sondapresente no arranjo é tipicamente em grande excesso para aquantidade de fragmentos cognatos que são hibridizados com oarranjo. Portanto, pode ser necessário ter cada sonda pre-sente múltiplas vezes no arranjo (por exemplo, 10, 20, 50,100, 1.000 vezes etc.). Além do mais, pode ser necessáriopara titular a quantidade de padrão que deve ser hibridizadocom o arranjo.
Detecção de deleções
A detecção de deleções é baseada na identificaçãodas interações de DNA-DNA que foram diferentes entre sujei-tos doentes e não doentes. Deleções resultarão na ausênciade interações de DNA com uma seqüência 4C (bait) localizadapróximo (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14 ou 15 Mb ou mais) na região deletada. Is-to pode resultar na ausência completa de sinais de hibridi-zação para todas sondas localizadas na região ré-arranjada,se a deleção estiver presente em ambos alelos (homozigotos),ou uma redução para sujeitos doentes em função de não doen-tes de intensidades de sinal, se a deleção estiver presentesomente em um alelo (heterozigoto). Deleção coloca seqüên-cias distais em proximidade imediata no padrão de DNA físicocom a seqüência 4C analisada (bait), que resultará em sinaisde hibridização maiores para sondas localizadas diretamentealém da região deletada.
Detecção de duplicação (s)
Detecção de duplicação é tipicamente baseada naidentificação das interações de DNA-DNA que são diferentesentre sujeitos doentes e não doentes. Sondas na região du-plicada apresentarão maiores sinais de hibridização com umaseqüência 4C (bait) localizada próximo da região ré-arranjada (por exemplo, cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14 ou 15 Mb ou mais), comparado com sinaisde um sujeito não doente de controle. Sondas além da regiãoduplicada são adicionalmente separadas umas das outras daseqüência 4C e, conseqüentemente, apresentarão menores si-nais de hibridização, comparados com sinais de um sujeitonão doente de controle.
Preferivelmente, um aumento ou uma diminuição nafreqüência de interação DNA-DNA para a amostra do sujeitocomparada com o controle é indicativo de uma duplicação ouinserção.
Preferivelmente, um aumento na freqüência de inte-ração de DNA-DNA para a amostra do sujeito comparada com ocontrole e/ou uma redução na freqüência de interação de DNA-DNA para regiões mais distantes é indicativo de uma duplica-ção ou inserção.Diagnóstico Pré-natal
Vantajosamente, a tecnologia 4C pode também serusada em diagnóstico pré-natal.
Ácido nucléico pode ser obtido de um feto usandovários métodos que são conhecidos na tecnologia. A titulo deexemplo, amninocentesis pode ser usada para obter fluido a-miniótico do qual células fetais em suspensão são extraídase cultivadas por diversos dias (Mercier & Bresson (1995) Am.Gnt., 38, 151-157). Ácido nucléico das células pode ser emseguida extraído. A coleção de choreal villi pode possibili-tar a dispensa da etapa de cultura e evitar a coleta defluido aminiótico. Estas técnicas podem ser aplicadas previ-amente (até 7 semanas de gestação para a coleção de chorialvilli e 13-14 semanas for amniocentesis) , mas com um riscode aborto ligeiramente maior.
Uma coleta direta de sangue fetal no nível do cor-dão umbilical pode também ser usada para obter ácido nucléi-co, mas tipicamente requer uma equipe de médicos de especia-lizada nesta técnica (Donner et at. (1995) Fetal Diagn.Ther.,10, 192-199).
Vantajosamente, aberrações genéticas (por exemplo,aberrações genômicas ou cromossomais) - tais como ré-arranjos, translocações, inversões, inserções, deleções eoutras mutações em cromossomos e ácido nucléico - podem serdetectadas neste estágio.
Preferivelmente, aberrações genéticas (por exem-plo, aberrações genômicas ou cromossomais) - tais como ré-arranjos, translocações, inversões, inserções, deleções eoutras mutações em cromossomos 21, 18, 13, X ou Y e tambémperdas ou ganhos de parte ou todos os cromossomos 21, 18,13, X ou Y podem ser detectadas, uma vez que esses são oscromossomos em que ocorre a maioria de aberrações no feto.
Determinação de sítios integração genômica
A tecnologia 4C também permite a determinação desitios de integração genômicos de. virus e transgênicos,etc., também quando múltiplas cópias são inseridas em dife-rentes posições no genoma (descrito na Figura 4).
Predisposição Determinante para adquirir certastranslocações
Vantajosamente, a tecnologia 4C pode também seraplicada aos sujeitos não doentes para medir o ambiente ge-nômico de Ioci freqüentemente envolvido em aberrações gené^ticas. Desta maneira, é possível determinar a predisposiçãodo sujeito em adquirir certas aberrações genéticas.
Assim, além dos usos médicos aqui descritos, apresente invenção pode ser usada em diagnóstico.
Sujeito
0 termo "sujeito" inclui mamíferos - tais como a-nimais e seres humanos.
Agente
0 agente pode ser um composto orgânico ou outrocomposto químico. 0 agente pode ser um composto, que é obte-nível ou produzido por qualquer fonte adequada, seja naturalou artificial. 0 agente pode ser uma molécula de aminoácido,um polipeptídeo, ou um derivado químico destes, ou uma com-binação destes. 0 agente pode ainda ser uma molécula de po-linucleotideo - que pode ser uma molécula sentido ou anti-sentido, ou um anticorpo, por exemplo, um anticorpo policlo-nal, um anticorpo monoclonal ou um anticorpo humanizado mo-noclonal.
Várias estratégias foram desenvolvidas para produ-zir anticorpos monoclonais com caracteres humano, que elimi-na a necessidade de uma linha celular humana de produção deanticorpo. Por exemplo, anticorpos monoclonais de camundongousados foram "humanizados" ligando regiões variáveis de roe-dor e regiões constantes de ser humano (Winter, G. and Mils-tein., C. (1991) Nature 349, 293-299). Isto reduz a imunoge-nicidade humano anticamundongo do anticorpo, mas imunogeni-cidade residual é retida em virtude da estrutura da região Vestranha. Além do mais, a especificidade de ligação antigenoé essencialmente que de o murino doador. Enxerto de CDR eestrutura de manipulação (EP 0239400) tem melhorado e refi-nado a manipulação de anticorpo até o ponto onde é possívelproduzir anticorpos murino humanizados que são aceitáveispara uso terapêutico em humanos. Anticorpos humanizados po-dem ser obtidos usando outros métodos bem conhecidos na tec-nologia (por exemplo, descrito em US-A-239400).
Os agentes podem ser anexados a uma entidade (porexemplo, uma molécula orgânica) por um ligante que pode serum ligante bifuncional hidrolisável.
A entidade pode ser projetada ou obtida de uma bi-blioteca de compostos, que pode compreender peptídeos, bemcomo outros compostos, tais como pequenas molécula orgânicas.A titulo de exemplo, a entidade pode ser uma subs-tância natural, uma macromolécula biológica, ou um extratofeito de materiais biológicos tais como bactéria, fungo, ouanimal (particularmente mamífero) células ou tecidos, umamolécula orgânico ou um inorgânica, um agente sintético, umagente semi-sintético, um mimético estrutural ou funcional,um peptídeo, um peptidomimético, um peptídeo clivado de umaproteína total, ou um peptídeo sintetizado sinteticamente(tal como, a título de exemplo, tanto usando um sintetizadorde peptídeo quanto por técnicas recombinantes ou suas combi-nações, um agente recombinante, um anticorpo, um agente na-tural ou um não natural, um proteína de fusão ou equivalentedestes e mutantes, derivados ou suas combinações.
Tipicamente, a entidade será um composto orgânico.Para alguns casos, os compostos orgânicos compreenderão doisou mais grupos hidrocarbila. Aqui, o termo "grupo hidrocar-bila" significa um grupo que compreende pelo menos CeHepode opcionalmente compreender um ou mais outros substituin-tes adequados. Exemplos de tais substituintes podem incluirhalo-, alcóxi-, nitro-, um grupo alquila, um grupo cíclicoetc. Além da possibilidade de o substituinte ser um grupocíclico, uma combinação de substituintes pode formar um gru-po cíclico. Se o grupo hidrocarbila compreender mais que umC, então os carbonos não precisam necessariamente ser liga-dos uns aos outros. Por exemplo, pelo menos dois dos carbo-nos podem ser ligados por meio de um elemento ou grupo ade-quado. Assim, o grupo hidrocarbila pode conter heteroátomos.Heteroátomos adequados serão aparentes aos versados na tec-nologia e incluem, por exemplo, enxofre, nitrogênio e oxigê-nio. Para algumas aplicações, preferivelmente a entidadecompreende pelo menos um grupo cíclico. 0 grupo cíclico podeser um grupo policíclico, tal como um grupo policíclico nãofundido. Para algumas aplicações, a entidade compreende pelomenos um dos ditos grupos cíclicos ligados a um outro grupohidrocarbila.
A entidade pode conter grupos halo - tal como gru-pos de flúor, cloro, bromo ou iodo.
A entidade pode conter um ou mais dos grupos al-quila, alcóxi, alquenila, alquileno e alquenileno - que po-dem ser cadeia não ramificada ou ramificada.
Promedicamento
Versados na tecnologia percebem que a entidade po-de ser derivada de um promedicamento. Exemplos de promedica-mentos incluem certos grupos protegidos que podem não possu-ir atividade farmacológica como tal, mas podem, em certosexemplos, ser administrados (tal como oralmente ou parente-ralmente) e depois metabolizados no corpo para formar umaentidade que é farmacologicamente ativa.
Promedicamentos adequados podem incluir, mas semlimitações, Doxorubicina, Mitomicina, Mustarda Fenol, Meto-traxato, Antifolatos, Cloramfenicol, Camptotecina, 5-Fluoruracila Cianeto, Quinina, Dipiridamol e Paclitaxel.
Será mais apreciado que certas frações conhecidascomo "pro frações", por exemplo, como descrito em "Desenhode Promedicamentos" por H. Bundgaard, Elsevier, 1985, podemser colocados em funcionalidades apropriadas dos agentes.Tais promedicamentos são também incluídos no escopo da in-venção.
O agente pode ser na forma de um sal farmaceutica-mente aceitável - tal como um sal de adição ácida ou um salde base - ou um solvato destes, incluindo um hidrato deste.Para uma revisão em sais adequados ver Berge et al, J.Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19.
O agente pode ser capaz de revelar outras proprie-dades terapêuticas.
O agente pode ser usado em combinação com um oumais outros agentes farmaceuticamente ativos.
Se forem administradas combinações de agentes ati-vos, então as combinações de agentes ativos podem ser admi-nistradas simultaneamente, separadamente ou seqüencialmente.
Isômeros estéreos e geométricos
A entidade pode existir como esteroisômeros e/ouisômeros geométricos - por exemplo, a entidade pode possuirum ou mais centros assimétricos e/ou geométricos e assim po-de existir em duas ou mais formas esteroisoméricas e/ou geo-métricas. A presente invenção contempla o uso de todos osesteroisômeros individuais e isômeros geométricos dessas en-tidades, e misturas destes.
Sal farmacêutico
O agente pode ser administrado na forma de um salfarmaceuticamente aceitável.
Sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conheci-dos pelos versados na tecnologia e, por exemplo, incluem osmencionados por Berge et al, em J. Pharm. Sci., 66, 1-19(1977): Sais de adição ácida adequados são formados de áci-dos que formam sais não tóxicos e incluem os sais cloridra-to, bromidrato, iodidrato, nitrato, sulfato, bissulfato,fosfato, hidrogenfosfato, acetato, trifluoracetato, glucona-to, lactato, salicilato, citrato, tartrato, ascorbato, suc-cinato, maleato, fumarato, gluconato, formato, benzoato, me-tanossulfonato, etanossulfonato, benzenossulfonato e p-toluenossulfonato.
Quando uma ou mais frações acidicas são presentes,sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis adequa-dos podem ser formados de bases que formam sais não tóxicose incluem os sais alumínio, cálcio, lítio, magnésio, potás-sio, sódio, zinco, e aminas farmaceuticamente ativas tal co-mo dietanolamina.
Um sal farmaceuticamente aceitável de um agentepode ser facilmente preparado misturando soluções do agentee o ácido ou base desejado, da maneira apropriada. 0 sal po-de precipitar a partir da solução e ser coletado por filtra-ção ou pode ser recuperado por evaporação do solvente.
0 agente pode existir em forma polimórfica.
0 agente pode conter um ou mais assimétricos car-bono átomos e, portanto, existe em duas ou mais formas este-roisoméricas. Onde um agente contém um grupo alquenila oualquenileno, isomerismo eis (E) e trans (Z) pode também o-correr. Δ presente invenção inclui o esteroisômeros do agen-te individual e, onde apropriado, as formas tautoméricas in-dividual destes, juntos com misturas destes.
Separação de diaesteroisômeros ou isômeros eis etrans pode ser obtida por técnicas convencionais, por exem-plo, por cristalização fracional, cromatografia ou H.P.L.C.de um mistura esteroisomérica do agente ou um sal adequadoou seus derivado. Um enantiômero individual do agente podetambém ser preparado por resolução, tal como por H.P.L.C. doracemato correspondente usando um suporte quiral adequado oupor cristalização fracional dos sais diaesteroisoméricosformados pela reação do racemato correspondente com um ácidoou base oticamente ativos adequados, da maneira apropriada.
0 agente pode também incluir todas as variaçõesisotópicas adequadas do agente ou um sal farmaceuticamenteaceitável destes. Uma variação isotópica de um agente ou umsal farmaceuticamente aceitável destes é definida como um noqual pelo menos um átomo é substituído por um átomo tendo omesmo número atômico mas uma massa atômica diferente da mas-sa atômica freqüentemente encontrada na natureza. Exemplosde isótopos que podem ser incorporados no agente e sais far-maceuticamente aceitáveis destes incluem isótopos de hidro-gênio, carbono, nitrogênio, oxigênio, fósforo, enxofre, flú-or e cloro tal como 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32p, 35S,18F e 36Cl, respectivamente.
Certas variações isotópicas do agente e sais far-maceuticamente aceitáveis destes, por exemplo, aquelas emque um isótopo radioativo tal como 3H ou 14C é incorporado,são usadas em medicamento e/ou estudos de distribuição detecido do substrato. Isótopos titulados, isto é, 3H, e car-bono-14, isto é, 14C, são particularmente preferidos por suafacilidade de preparação e detectabilidade. Adicionalmente,substituição com isótopos tal como deutério, isto é, 2H, po-de disponibilizar certas vantagens terapêuticas resultandoem maior estabilidade metabólica, por exemplo, maior meiavida in vivo ou exigências dosagem reduzida e, portanto, po-dera ser preferidos em algumas circunstâncias. Variações iso-tópicas do agente e sais farmaceuticamente aceitáveis destesdesta invenção podem de maneira geral ser preparados porprocedimentos convencionais usando variações isotópicas a-propriadas de reagentes adequados.
Sal farmaceuticamente ativo
O agente pode ser administrado como um sal farma-ceuticamente aceitável. Tipicamente, um sal farmaceuticamen-te aceitável pode ser facilmente preparado usando um ácidoou base desejados, da maneira apropriada. 0 sal pode preci-pitar a partir da solução e ser coletado por filtração oupode ser recuperado por evaporação do solvente.
Métodos de síntese química
O agente pode ser preparado por técnicas de sínte-se química.
Fica aparente aos versados na tecnologia que gru-pos funcionais sensíveis podem precisar ser protegidos edesprotegidos durante síntese de um composto da invenção.Isto pode ser obtido por técnicas convencionais, por exem-plo, como descrito em "Protective Groups in Organic Synthe-sis" by T W Greene and PGM Wuts, John Wiley and Sons Inc.(1991), e por P.J.Kociensld, em "Protecting Groups", GeorgTheme Verlag (1994).
É possível, durante algumas das reações, quequaisquer estereocentros presentes possam, em certas condi-ções, ser racemizados, por exemplo, se for usada uma base emuma reação com um substrato tendo um centro ótico que com-preende um grupo sensível a base. Isto é possível durante,por exemplo, uma etapa de guanilação. Deve ser possível evi-tar problemas potenciais tal como este pela escolha de regi-mes de seqüência de reação, condições, reagentes, de prote-ção/desproteção, etc. como é bem conhecido na tecnologia.
Os compostos e sais podem ser separados e purifi-cados por métodos convencionais.
Separação de diastereômeros pode ser obtida portécnicas convencionais, por exemplo, por cristalização fra-cional, cromatografia ou H.P.L.C. de um mistura esteroisomé-rica de um composto de formula (I) ou um sal adequado ouseus derivados. Enantiômero individual de um composto deformula (I) pode também ser preparado de um intermediáriooticamente puro correspondente ou por resolução, tal comopor H.P.L.C. do racemato correspondente usando um suportequiral adequado ou por cristalização fracional dos sais di-astereoméricos formados pela reação do racemato correspon-dente com um ácido ou base de forma adequada oticamente ativos.
0 agente pode ser produzido usando métodos quími-cos para sintetizar o agente no todo ou em parte. Por exem-pio, se o agente compreender um peptídeo, então o peptídeopode ser sintetizado por técnicas de fase sólida, clivado daresina, e purificado por cromatografia líquida preparativade alto desempenho (por exemplo, Creighton (1983) ProteinsStrutures And Molecular Principies, WH Freeman and Co, NewYork NY) . A composição dos peptideos sintéticos pode serconfirmada por análise ou seqüenciamento de aminoácido (porexemplo, o procedimento de degradação de Edman; Creighton,supra).
Síntese de agentes inibidores de peptídeo (ou va-riantes, homólogos, derivados, fragmentos ou miméticos des-tes) pode ser realizada usando várias técnicas de fase sóli-da (Roberge J Y et al (1995) Science 269: 202-204), e sínte-se automatizada pode ser obtida, por exemplo, usando o Sin-tetizador de Peptídeo ABI 43 1 A (Perkin Elmer) de acordocom as instruções fornecidas pelo fabricante. Adicionalmen-te, as seqüências de aminoácido compreendendo o agente podemser alteradas durante síntese direta e/ou combinadas usandométodos químicos com uma seqüência de outras subunidades, ouqualquer parte destes, para produzir um agente variante.
Derivado químico
O termo "derivado" ou "derivatizado" da maneiraaqui usada inclui modificação química de um agente. Ilustra-tivo de tais modificações químicas seria a substituição dehidrogênio por um grupo halo, um grupo alquila, um grupo a-cila ou um grupo amino.
Modificação química
O agente pode ser um agente modificado - tal como,mas sem limitações, um agente quimicamente modificado.
A modificação química de um agente pode tanto au-mentar quanto reduzir a interação de ligação de hidrogênio,interação de carga, interação hidrofóbica, interação Van DerWalls ou interação dipolo.
Em um aspecto, o agente pode agir como um modelopara o desenvolvimento de outros compostos (por exemplo, umpadrão).
Composições farmacêuticas
Em um aspecto adicional, é fornecida uma composi-ção farmacêutica que compreende um agente identificado pelométodo de arranjo aqui descrito misturado com um veiculofarmaceuticamente aceitável, diluente, excipiente ou adju-vante e/ou suas combinações.
Em um aspecto adicional, é fornecida uma composi-ção de vacina que compreende um agente.
Em um aspecto adicional, é fornecido um processode preparar uma composição farmacêutica que compreende mis-turar um agente identificado pelo ensaio com um diluente,veiculo, excipiente ou adjuvante farmaceuticamente aceitávele/ou suas combinações.
Em um aspecto adicional, é fornecido um método deprevenir e/ou tratar uma doença que compreende administrar aum agente ou uma composição farmacêutica ou uma vacina paraum sujeito.
As composições farmacêuticas podem ser para usohumano ou animal em medicina humana e veterinária e compre-enderá tipicamente qualquer um ou mais de um diluente, vei-culo, ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Veículos oudiluentes aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidosna tecnologia farmacêutica, e são descritos, por exemplo, emRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit 1985) . A escolha de veículo, excipiente oudiluente farmacêutico pode ser selecionada no sentido de en-tender a via de administração e prática farmacêutica padrão.
As composições farmacêuticas podem compreender como o veícu-lo, o excipiente ou diluente qualquer adequado ou além delesligante(s), lubrificante(s), agente(s) de suspensão, agen-te (s) de revestimento, agente(s) solubilizante(s).
Conservantes, estabilizadores, corantes e aindaagentes flavorizantes podem ser fornecidos na composiçãofarmacêutica. Exemplos de conservantes incluem benzoato desódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzóico.Antioxidantes e agente de suspensões podem ser também usados.
Pode haver diferentes exigências de composi-ção/formulação dependendo dos diferentes sistemas de distri-buição. A título de exemplo, a composição farmacêutica dapresente invenção pode ser formulada para ser administradausando uma minibomba ou por uma via mucosal, por exemplo,como uma aspersão nasal ou aerossol para inalação ou soluçãode ingestão,, ou parenteralmente em que a composição é formu-lada por uma forma injetável com ar, para distribuição, porexemplo, por uma via intravenosa, intramuscular ou subcutâ-nea. Alternativamente, a formulação pode ser projetada paraser administrada por inúmeras vias.
Se o agente tiver que ser administrado mucosalmen-te por meio da mucosa gastrintestinal, ele tem que ficar es-tável durante o trânsito por todo o trato gastrintestinal;por exemplo, ele deve ser resistente a degradação proteolí-tica, estável a pH ácido e resistente aos efeitos detergen-tes da bilis.
Quando apropriado, as composições farmacêuticaspodem ser administradas por inalação, na forma de um suposi-tório ou pessário, topicamente na forma de uma loção, solu-ção, creme, ungüento ou pó de talco, pelo uso de um adesivode pele, oralmente na forma de comprimidos contendo excipi-entes tal como amido ou lactose, ou em cápsulas ou óvulostanto sozinhos como em misturas com excipientes, ou na formade elixires, soluções ou suspensões contendo agentes flavo-rizantes ou corantes, ou as composições farmacêuticas podemser injetadas parenteralmente, por exemplo, intravenosamen-te, intramuscularmente ou subcutaneamente. Para administra-ção parenteral, as composições podem ser bem usadas na formade uma solução aquosa estéril que pode conter outras subs-tâncias, por exemplo, sais ou monossacarideos suficientespara tornar a solução isotônica com sangue. Para além domais bucal ou sublingual, as composições podem ser adminis-tradas na forma de comprimidos ou pastilhas que podem serformulados de uma maneira convencional.
Os agentes podem ser usados em combinação com umaciclodextrina. Ciclodextrinas são conhecidas por formar com-plexos de inclusão e não inclusão com moléculas de medica-mento. A formação de um complexo medicamento-ciclodextrinapode modificar a solubilidade, taxa de dissolução, proprie-dade de biodisponibilidade e/ou estabilidade de uma moléculade medicamento. Complexos de medicamento-ciclodextrina sãode maneira geral usadas para a maioria das formas de dosageme vias de administração. Como uma alternativa a complexaçãodireta com o medicamento, a ciclodextrina pode ser usada co-mo um aditivo auxiliar, por exemplo, as um veiculo, diluenteou solubilizante. Ciclodextrinas alfa, beta e gama são exem-pios mais normalmente usados e adequados e estão descritosem WO-A-91/11172, WO-A-94/02518 e WO-A-98155148.
Se o agente for uma proteína, então a dita proteí-na pode ser preparada ín situ no sujeito que está sendo tra-tado. A este respeito, seqüências de nucleotídeos que codi-ficam a dita proteína podem ser distribuídas pelo uso detécnicas não virais (por exemplo, pelo uso de lipossomas)e/ou técnicas virais (por exemplo, pelo uso de vetores re-trovirais) de maneira tal que a dita proteína seja expressaa partir da dita seqüência de nucleotídeos.
As composições farmacêuticas da presente invençãopodem também ser usadas em combinação com tratamentos con-vencionais.
Administração
0 termo "administrado" inclui distribuição portécnicas viral ou não viral. Mecanismos de distribuição vi-ral incluem, mas sem limitações, vetores adenovirais, veto-res virais adeno associados (AAV), vetores virais de herpes,vetores retrovirais, vetores lentivirais, e vetores baculo-virais. Mecanismos de administração não viral incluem trasn-fecção mediada por lipídeos, lipossomas, imunolipossomas,anfifilos faciais catiônicos (CFAs) e suas combinações.
Os componentes podem ser administrados sozinhos,mas de maneira geral serão administrados como uma composiçãofarmacêutica - por exemplo, quando os componentes estão mis-turados com um excipiente, diluente ou veiculo farmaceutica-mente adequado selecionado com relação à via de administra-ção visada e prática farmacêutica padrão.
Por exemplo, os componentes podem ser administra-dos na forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, so-luções ou suspensões, que podem conter agentes flavorizantesou corantes, para aplicações de liberação imediata, atrasa-da, modificada, pulsada ou controlada.
Se o produto farmacêutico for um comprimido, entãoos comprimidos podem conter excipientes tais como celulosemicrocristalina, lactose, citrato de sódio, carbonato decálcio, fosfato de cálcio dibásico e glicina, desintegrantestal como amido (preferivelmente amido de milho, batata outapioca), glicolato de amido de sódio, croscarmelose sódicae certos silicatos complexos, e aglutinantes de granulação,tais como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulose(EIPMC), hidroxipropilcelulose (CPC), sacarose, gelatina eacácia. Adicionalmente, agentes de lubrificação tais comoestearato de magnésio, ácido esteárico, beenato de glicerilae talco podem ser incluídos.
Composições sólidas de um tipo similar podem tam-bém ser empregadas como cargas em cápsulas de gelatina. Ex-cipientes preferidos a este respeito incluem lactose, amido,uma celulose, açúcar de leite ou polietileno glicol de altopeso molecular. Para suspensões aquosas e/ou elixires, o a-gente pode ser combinado com vários agentes adoçantes ouflavorizantes, matéria de cor ou corantes, com agentes deemulsificação e/ou suspensão e com diluentes tais como água,etanol, propileno glicol e glicerina e suas combinações.
As vias de administração (distribuição) podem in-cluir, mas sem limitações, um ou mais de oral (por exemplo,como um comprimido, cápsula, ou como uma solução de inges-tão) , tópica, mucosal (por exemplo, como uma aspersão nasalou aerossol para inalação), nasal, parenteral (por exemplo,por uma forma injetável), gastrintestinal, intraespinhal,intraporitoneal, intramuscular, intravenosa, intrauterina,intraocular, intradérmica, intracraniana, intratraqueal, in-travaginal, intracerebroventricular, intracerebral, subcutâ-nea, oftálmica (incluindo intravitreal ou infracameral),transdérmica, retal, bucal, vaginal, epidural, sublingual.
Niveis de dose
Tipicamente, um médico determinará a real dosagemque será mais adequada para um sujeito individual. 0 nivelde dose especifica e freqüência de dosagem para qualquer pa-ciente particular podem variar e dependerão de uma variedadede fatores, incluindo a atividade do composto especifico em-pregado, da estabilidade metabólica e extensão de ação dessecomposto, da idade, peso corpóreo, saúde geral, sexo, dieta,modo e tempo de administração, taxa de excreção, combinaçãode medicamento, da severidade da condição particular, e daterapia individual em andamento.
Formulação
0(s) componente(s) pode(m) ser formulado(s) em umacomposição farmacêutica, tal como misturando com um ou maisde um veiculo, diluente ou excipiente adequado, usando téc-nicas que são conhecidas na tecnologia
Doença
Aspectos da presente invenção podem ser usados pa-ra o tratamento e/ou prevenção e/ou diagnóstico e/ou prog-nóstico de uma doença - tais como as listadas em WO-A-98/09985.
Para facilidade de referência, parte dessa lista éagora fornecida: atividade inibitória de macrófago e/ou ini-bitória de célula T e, assim, atividade antiinflamatória ;atividade antiimune, isto é, efeitos inibitórios contra umaresposta imune celular e/ou humoral, incluindo uma respostanão associada com inflamação; doenças associadas com viruse/ou outros patógenos intracelulares; inibição da capacidadede macrófagos e células T aderirem nos componentes da matrizextracelular e fibronectina, bem como expressão de receptorfas supra-regulado em células T; inibição de reação imune einflamação indesejadas, incluindo artrite reumatóide, infla-mação associada com hipersensibilidade, reações alérgicas,asma, lupus eritomatoso sistêmico, doenças do colágeno e ou-tras doenças autoimunes, inflamação associada com ateroscle-rose, arteriosclerose, doença do coração aterosclerótico,lesão por reperfusão, parada cardíaca, infarto do miocárdio,desordens inflamatórias vasculares, síndrome do desconfortorespiratório ou outras doenças cardiopulmonares, inflamaçãoassociada com úlcera péptica, colite ulcerativa e outras do-enças do trato gastrintestinal, fibrose hepática, cirrosehepática ou outras doenças hepáticas, tireoidite ou outrasdoenças glandulares, glomerulonefrite ou outras doenças re-nais e urológicas, otite ou outras doenças otorrinolaringi-cas, dermatite ou outras doenças dérmicas, doenças perioden-tais ou outras doenças dentárias, orquite ou orquiepididimi-te, infertilidade, trauma orquidal ou outras doenças testi-culares imune relacionadas, disfunção placentária, insufici-ência placentária, aborto habitual, eclampsia, pré-eclampsiae outras doenças ginecológicas imune e/ou inflamatória rela-cionadas, uveite posterior, uveite intermediária, uveite an-terior, conjuntivite, corioretinite, uveroretinite, neuriteótica, inflamação intraocular, por exemplo, retinite ou ede-ma macular cistóide, oftalmia simpatética, esclerite, reti-nite pigmentosa, componentes imune e autoimune de doença defondus degenerativa, componentes inflamatórios de trauma o-cular, inflamação ocular causada por infecção, vítreo-retinopatias proliferativa, neuropatia ótica isquêmica agu-da, cicatriz excessiva, por exemplo, após operação de fil-tração de glaucoma, reação imune e/ou inflamação contra im-plantes oculares e outras doenças oftálmicas imune e infla-matórias relacionadas, inflamação associada com doenças oucondições ou desordens autoimunes onde tanto no sistema ner-voso central (CNS) quanto em qualquer outro órgão, supressãoimune e/ou de inflamação seria benéfica, doença de Parkin-son, complicação e/ou efeitos colaterais do tratamento dedoença de Parkinson, demência relacionada a AIDS, encefalo-patia relacionada a HIV, doença de Devic, Sydenham chorea,doença de Alzheimer e outras doenças degenerativas, condi-ções ou desordens do CNS, componentes inflamatórios de aci-dentes vasculares, síndrome pós-pólio, componentes imune einflamatórios de desordens psiquiátricas, mielite, encefali-te, pan-encefalite esclerosante subaguda, encefalomielite,neuropatia aguda, neuropatia subaguda, neuropatia crônica,síndrome de Guillaim-Arre, Sydernham chora, miastenia grave,pseudotumor cerebral, sindrome de Down, doença de Hunting-ton, esclerose lateral amiotrófica, componentes inflamató-rios de compressão CNS ou trauma CNS ou infecções do CNS,componentes inflamatórios de atrofias e distrofias muscula-res, e doenças, condições ou desordens imune e inflamatóriarelacionadas do sistema nervoso central e periférico, infla-mação pós-traumática, choque sético, doenças infecciosas,complicações inflamatórias ou efeitos colaterais de cirurgi-a, complicações de transplante de medula óssea ou outrascomplicações e/ou efeitos colaterais de transplante, compli-cações inflamatória e/ou imune e efeitos colaterais de tera-pia genética, por exemplo, por causa de infecção com um por-tador viral, ou inflamação associada com AIDS, para suprimirou inibir uma resposta imune humoral e/ou celular, para tra-tar ou atenuar doenças proliferativas de monócitos ou leucó-citos, ex., leucemia, reduzindo a quantidade de monócitos oulinfócitos, para a prevenção e/ou tratamento de rejeição deenxerto em casos de transplante de células, tecido e órgãosnaturais ou artificiais tais como córnea, medula óssea, ór-gãos, lentes, marcapassos, tecido de pele natural ou artifi-ciai. Desordens especificas relacionadas a câncer incluem,mas sem limitações: tumores sólidos; tumores levados pelosangue tais com leucemias; metástese de tumor; tumores be-nignos, por exemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neuro-fibromas, tracomas, e granulomas piogênicos; artrite reuma-tóide; psoriase; doenças angiongênicas oculares, por exem-plo, retinopatia diabética, retinopatia de prematuridade,degeneração macular, rejeição de enxerto de córnea, glaucomaneovascular, fibroplastia retrolental, rubeose; Sindrome deOsler-Webber; angiogênese miocardiana; neovascularização deplacas; telangiectasia; juntas hemofílicas; angiofibroma;granulação de ferida; colaterais coronarianas; colateraiscerebrais; más formações arteriovenosas; angiogênese do mem-bro isquêmico; glaucoma neovascular; fibroplasia retrolen-tal; neovascularização diabética; doenças relacionadas a he-liobacter, fraturas, vasculogêneses, hematopoiese, ovulação,menstruação e placentação.
Preferivelmente, a doença é câncer, tais como Ieu-cernia linfocitica aguda (ALL), leucemia mielóide aguda (A-ML) , câncer adrenocortical, câncer anal, câncer da bexiga,câncer do sangue, câncer dos ossos, tumor no cérebro, câncerde mama, câncer sistema genital feminino, câncer sistema ge-nital masculino, linfoma do sistema nervoso central, câncercervical, rabdomiosarcoma da infância, sarcoma da infância,leucemia linfocitica crônica (CLL), leucemia mielóide crôni-ca (CML), câncer do cólon e retal, câncer do cólon, câncerdo endométrio, sarcoma do endométrio, câncer do esôfago,câncer dos olhos, câncer da vesícula biliar, câncer gástri-co, câncer do trato gastrintestinal, leucemia da célula ca-pilar, câncer da cabeça e pescoço, câncer hepatocelular, do-ença de Hodgkin, câncer hipofaringeal, sarcoma de Kaposi,câncer do rim, câncer da laringe, leucemia, câncer do figa-do, câncer do pulmão, histiocitoma fibrosa maligna, timomamaligna, melanoma, mesotelioma, mieloma múltipla, mieloma,câncer da cavidade nasal e seios paranasais, câncer nasofa-ringeal, câncer do sistema nervoso, neuroblastoma, linfomade não Hodgkin, câncer da cavidade oral, câncer orofaringe-al, osteosarcoma, câncer do ovário, câncer do pâncreas, cân-cer de paratireóide, câncer do pênis, câncer da faringe, tu-mor da hipófase, neoplasma da célula plasma, linfoma primá-ria CNS; câncer de próstata, câncer retal, sistema respira-tório, retinoblastoma, câncer de glândula salivar, câncer depele, câncer do intestino delgado, sarcoma do tecido macio,câncer do estômago, câncer do estômago, câncer do testículo,câncer da tireóide, câncer sistema urinário, sarcoma uteri-na, câncer vaginal, sistema vascular, macroglobulinemia deWaldenstrom e tumor de Wilms.
Estojos
Os materiais para uso nos métodos da presente in-venção são idealmente adequados para preparação de estojos.
Um estojo como este pode compreender recipientes,com cada um ou mais dos várias reagentes (tipicamente emforma concentrada) usados nos métodos aqui descritos, inclu-indo, for exemplo, uma enzima de restrição primária, uma en-zima de restrição secundária, um agente de reticulação, umaenzima de ligação (por exemplo, um ligase) e um agente parareverter a reticulação (por exemplo, proteinase K).
Oligonucleotídeos podem também ser fornecidos emrecipientes que podem ser em qualquer forma, por exemplo,liofilizada, ou em solução (por exemplo, uma água destiladaou solução tamponada), etc.
Em um aspecto preferido da presente invenção, éfornecido um estojo que compreende um conjunto de sondas a-qui descritas, um arranjo e opcionalmente um ou mais marca-dores.
Um conjunto de instruções será também tipicamenteincluído.
Usos
Vantajosamente, a presente invenção pode ser usadaa fim de obter informação a cerca da organização espacial deseqüência de nucleotídeos - tais como Ioci genômicos in vi-tro ou in vivo.
A título de exemplo, a tecnologia 4C pode ser usa-da para estudar a organização tridimensional de um ou maisIoci do gene. De maneira particular, esta tecnologia podeser usada para estudar o papel de um ou mais fatores detranscrição na organização tridimensional de um ou mais Iocido gene.
A título de exemplo adicional, a tecnologia 4C po-de ser usada para estudar o papel de fatores de elementos deDNA trans-atuantes e cis-reguladores.
A título de exemplo adicional, a tecnologia 4C po-de ser usada para estudar regulamento gene de longo alcancein vitro ou in vivo.
A título de exemplo adicional, a tecnologia 4C po-de ser usada para estudar proximidade e interação infra cro-mossomal.
A título de exemplo adicional, a tecnologia 4C po-de ser usada p^ra estudar proximidade e interação inter-cromossomal.
A titulo de exemplo adicional, a tecnologia 4C po-de ser usada para identificar seqüências de nucleotideos quefuncionam com um promotor, intensificador, silenciador, iso-lante, região de controle de locus, origem de replicação,MAR, SAR, centrômero, telômero ou qualquer outra seqüênciade interesse em uma rede regulatória.
A titulo de exemplo adicional, a tecnologia 4C po-de ser usada para identificar genes responsáveis por um fe-nótipo (doença) em casos onde acontece de uma mutação e/oudeleção afetar um elemento regulador distante e seu mapea-mento portanto não consegue fornecer tal informação.
A titulo de exemplo adicional, a tecnologia 4C po-de ser usada para reconstruir eventualmente a conformaçãoespacial de Ioci do gene, grandes regiões genômicas ou mesmocromossomos completos.
A titulo de exemplo adicional, a tecnologia 4C po-de ser usada para definir seqüências âncora potenciais quesustenta certos cromossomos juntos no espaço nuclear.
A titulo de exemplo adicional, a tecnologia 4C po-de ser usada para reconstruir eventualmente o posicionamentodos cromossomos em alta resolução uns com relação aos outros.
A titulo de exemplo adicional, a tecnologia 4C po-de ser usada em diagnóstico (por exemplo, diagnóstico pré-natal) para detectar ou identificar ré-arranjos genômicose/ou aberrações - tais como translocações, deleções, inver-sões, duplicações.
Técnicas gerais de metodologia de dna recombinanteA presente invenção emprega, a menos que de outraforma indicada, técnicas convencionais de química, biologiamolecular, microbiologia, DNA recombinante e imunologia, queestão de acordo com a capacidade de um versado na tecnologi-a. Tais técnicas são explicadas na literatura. Ver, por e-xemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989,Molecular cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Bo-oks 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M.et at. (1995 and poriodic supplements; Current Protocols inMolecular Biologyr ch. 9, 13, and 16, rahn Wiley & Sons, NewYork, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, e A. Kahn, 1996, DNA Iso-lation and Sequencing: Essential Technics, John Wiley &Sons; M. J. Gait {Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis:A Practical approaeh, Irl Press; and, D. M. J. Lilley and J.E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Strueture PartA: Synthesis and Physieal Analysis of DNA Methods in Enzy-mology, Academic Press. Cada um desses textos gerais é aquiincorporado pela referência.
A invenção será agora adicionalmente descrita atitulo de exemplo, que deve servir para ajudar versados natecnologia realizar a invenção e não devem ser de maneiranenhuma para limitar o escopo da invenção.
Exemplo 1
Materiais & MétodosTecnologia 4C
As etapas iniciais do procedimento da tecnologia3C foram realizadas da maneira previamente descrita (Splin-ter at al. (2004). Methods Enzymol 375, 493-507 (2004), pro-duzindo produtos de ligação entre fragmentos HindIII. Estepadrão 3C ligado a HindIII (-50 pg) foi digerido toda a noi-te a 100 ng/pL com 50 U de uma enzima de restrição de cortefreqüente secundária, sendo tanto DpnII (HS2, Rad23A) quantoNlaIII (β principal). Para evitar restrições em formação decirculo de DNA (Rippe at al. (1995) Trends Biochem Sci 20,500-6), foi tomado cuidado para escolher uma enzima de res-trição secundária que não corte dentro de cerca de 350-400bp do sitio de restrição HindIII que demarca o fragmento derestrição de interesse (isto é, o 'bait'). Após a digestãoda enzima de restrição secundária, DNA foi fenol extraído,etanol precipitado e subseqüentemente ligado a baixa concen-tração (amostra de 50 pg em 14 mL usando 200 U ligase (Ro-che) , 4 horas a 16 0C) para promover DpnII ou formação decírculo DpnII. Produtos de ligação foram fenol extraído eetanol precipitado, usando glicogeno (Roche) como um veículo(20 pg/mL). Os círculos de interesse foram linearizados di-gerindo toda a noite com um 50 U de uma enzima de restriçãoterciária que corta o bait entre o sítio de reconhecimentode enzima de restrição primária e secundária, usando as se-guintes enzimas de restrição: Spel (HS2), PstI (Rad23A) ePflmI (β principal). Esta etapa de linearização foi realiza-da para facilitar hibridização subseqüente do iniciador du-rante a primeira rodada de amplificação de PCR. Produtos di-geridos foram purificados usando uma coluna de remoção denucleotídeos (250) QIAcquick (Qiagen).Reações de PCR foram realizadas usando o sistemaPCR de Expand Long Template (Roche), usando condições cuida-dosamente otimizadas para assegurar amplificação linear defragmentos medidos em até 1,2 kb (80 % de fragmentos de PCR4C são menores que 600 bp) . Condições do PCR foram como aseguir: 94 0C por 2 minutos, 30 ciclos de 94 0C por 15 se-gundos, 55 0C por 1 minuto e 68 0C por 3 minutos, seguidopor uma etapa final de 68 0C por 7 minutos. A quantidade má-xima de padrão que ainda apresenta faixa linear de amplifi-cação foi determinada. Para isto, diluições seriais de pa-drão foram adicionadas às reações de PCR, material do DNAamplificado foi corrido em um gel de agarose e produtos PCRforam quantificados usando software ImageQuant. Tipicamente,100-200 ng de padrão por 50 pL da reação de PCR deu produtosna faixa linear de amplificação. 16 a 32 reações de PCR fo-ram agrupadas e purificaram este padrão 4C usando o sistemade remoção de nucleotideos QIAquick (250) (Qiagen). Padrão4C purificado foi marcado e hibridizado com arranjos de a-cordo com padrão dos protocolos ChIP-chip (Nimblegen Systemsof Iceland, LLC) . DNA genômico diferencialmente marcado quefoi digerido com a enzima primária e secundária usado noprocedimento 4C, serviu como um padrão de controle para cor-rigir as diferenças nas eficiências de hibridização. Paracada experimento duas amostras independentemente processadasforam marcadas com orientações de corante alternados.
Seqüências de iniciadores 4C usadas:HS2:51 - ACTTCCTACACATTAACGAGCC-3',5'- GCTGTTATCCCTTTCTCTTCTAC-3'Rad23A:51 - TCACACGCGAAGTAGGCC-3' ,5'- CCTTCCTCCACCATGATGA-31
β principal:5' -AACGCATTTGCTCAATCAACTACTG-31,5' - GTTGCTCCTCACAITTTGCTTCTGAC-3'
Arranjos 4C
Arranjos e análise foram baseados em m34 construí-dos por NCBI. Sondas (60-mer) foram selecionadas das seqüên-cias 100 bp à montante - e à jusante dos sítios HindIII. Oteor de CG foi otimizado em 50 %, para sinais de hibridiza-ção uniformes. Para prevenir hibridização cruzada sondas quetiveram qualquer similaridade com repetições altamente abun-dantes (RepBase 10,09) foram removidas do conjunto de sonda.
Além do mais, sondas que deram mais que dois bons êxitos deBLAST no genoma foram também removidas do conjunto de sonda.
Alinhamentos de seqüência foram realizados usando MegaBLAST(Zhang et at. (2000) J Comput Biol Ir 203-14) usando a con-figuração padrão. Um bom êxito definido como um alinhamentode 30 nt ou mais.
Análise de dados 4C
A razão de sinal amostra-4C/genômico DNA foi cal-culado para cada sonda e os dados foram visualizados comsoftware SignalMap fornecido por Nimblegen Systems. Dadosforam analisados usando o pacote R (http://www.r-project.org), Spotfire and ExceL. Razões de hibridização não proces-sada apresentou agrupamentos de 20-50 sinais 4C positivosjunto com o padrão do cromossomo. Para definir estes agrupa-mentos, foi aplicada uma média corrida. Vários tamanhos dejanela foram usados, variando de 9-39 sondas, dos quais to-das identificaram os mesmos agrupamentos. Os resultados a-presentados foram baseados em um tamanho de janela de 29sondas (em média 60 kb) e foram comparados com a média cor-rida realizada em dados randomizados. Isto foi feito paracada arranjo separadamente. Conseqüentemente, todas as medi-ções foram apreciadas com relação a amplitude e ruído paraesse arranjo específico. A Taxa de falsa descoberta (FDR),definida como (número positivas falsos) / (número de positi-vos falsos + número de positivos verdadeiros) foi determina-da como a seguir: (número de positivos no conjunto randomi-zado) / (número de positivos nos dados). 0 nível do patamarfoi determinado usando uma abordagem de cima para baixo parao valor mínimo estabelecido para o qual: FDR<0,05.
Em seguida, experimentos biológicos duplicados fo-ram comparados. Janelas que atenderam o patamar em ambas du-plicatas foram consideradas positivas. Comparando dados ran-domizados, nenhuma janela ficou acima do patamar em ambasduplicatas. Janelas positivas diretamente adjacentes ao pa-drão do cromossomo foram ligadas (não é permitida nenhumafolga), criando áreas positivas.
Análise de expressão
Para cada tecido, três microarranjos independentesforam realizados de acordo com o protocolo Affymetrix (ca-mundongo 430 - 2 arranjos). Dados foram normalizados usandoRMA ca-tools; www.bioconductor.org) e para cada conjunto desonda foi calculada a média das medições dos três microar-ranjos. Além do mais, quando múltiplos conjuntos de sondarepresentaram o mesmo gene, foi também calculada a média.Mas5calls (Affy library: www.bioconductor.org) foi usado pa-ra estabelecer campos calls "presente", "ausente" e "margi-nal". Genes com um campo call "presente" em todos os trêsarranjos e um valor de expressão maior que 50 foram denomi-nados expresso. "Genes específicos de Fígado fetal" foramclassifiçados como genes que atenderam nossos critérios deser expresso em fígado fetal e tiveram valores de expressãomais que cinco vezes superiores comparados com cérebro fe-tal. Para fornecer uma medida de atividade transcricionalgeral em torno de cada gene, foi aplicada uma soma corrida.Para isto, nós usamos valores de expressão Iog-transformados. For cada gene nós calculamos a soma da ex-pressão de todos genes encontrados em uma janela 100 kb ámontante do início e 100 kb à jusante da extremidade do ge-ne, incluindo o próprio gene. Valores resultantes para genesativos encontrados nas regiões 4C positivas (n = 124, 123 e208 respectivamente para HS2 em fígado, Rad23A em cérebro eRad23A em fígado) foram comparados com os valores obtido pa-ra genes ativos fora áreas 4C positivas (n = 153, 301 e 186,respectivamente, onde η = 153 corresponde ao número de genesnão interagentes ativos, presentes entre a região mais inte-ragente centromérica e o telômero do cromossomo 7); os doisgrupos foram comparados usando um teste Wilcoxon de soma depoços unilaterais.
Sondas FISH
Os clones BAC seguintes (BACPAC Resources Centre)foram usado; RP23-370E12 para Hbb-1, RP23-317H16 para chr.7a 80,1 Mb (ou agrupamento de gene), RP23-334E9 para Uros,RP23-32C19 para chr.7 a 118,3 Mb, RP23-143F10 para chr.7 a130,1, RP23-470N5 para chr.7 a 73,1 Mb, RP23-247L11 para c-hr.7 a 135,0 Mb (ou agrupamento de gene), RP23-136A15 paraRad23A, RP23-307P24 para chr.8 at 21,8 Mb e RP23-460F21 parachr.8 a 122,4 Mb. Para uma sonda especifica do centrômero docromossomo 7 nós usamos clone PI 5279 (Genome Ststems Inc.)que anela no segmento de DNA D7Mit21. Sondas marcadas deprimo aleatório foram preparadas usando BioPrime Array CGHgenomic Labeling System (Invitrogeno). Antes da marcação,DNA foi digerido com DpnII e purificado com um conjunto deDNA limpo e concentrador 5 (pesquisa Zymo). DNA digerido(300 ng) foi marcado com SpectrumGreen dUTP (Vysis) ou flúorAlexa 594 dUTP (sondas Moleculares) e purificado por meio umestojo de purificação de GFX PCR DNA e Gel Band (AmershamBiosciences) para remover nucleotideos não incorporados. Es-pecificidade de sondas marcadas foi testada em esfregaços demetáfase preparado de células ES murina..
Crio-FISH
Crio-FISH foi realizado da maneira descrita ante-riormente 5. Resumidamente, fígado E14.5 e cérebro foram fi-xados por 20 minutos em 4 % de paraformaldeído/HEPES250 mM,pH 7,5 e cortados em pequenos blocos de tecido, seguido poruma outra etapa de fixação de 2 horas em 8 % de paraformal-deído a 4 °C. Blocos de tecido fixado foram imersos em 2,3 Mde sacarose por 20 minutos a temperatura ambiente, montadosem um suporte de corpo de prova e congelados rapidamente emnitrogênio líquido. Blocos de tecido foram armazenados emnitrogênio liquido até o seccionamento. Criosseções de ul-tratina de aproximadamente 200 nm foram cortadas usando umReichert Ultramicrotome E equipado com crio-acessório (Lei-ca). Usando um laço cheio com sacarose, seções foram trans-feridas para a laminula e armazenadas a -20 °C. Para hibri-dização, seções foram lavadas com PBS para remover sacarose,tratadas com 250 ng/mL de RNase em 2 χ SSC por 1 hora a 37°C, incubadas por 10 minutos em 0,1 M de HCL, desidratadasem uma série de etanol e desnaturadas por 8 minutos a 80 0Cem 70 % de formamida/2 χ SSC, pH 7,5. Seções foram novamentedesidratadas diretamente antes da hibridização da sonda. 500ng de sonda marcada foi co-precipitada com 5 pg de DNA decamundongo Cotl (Invitrogeno) e dissolvida em hybmix (50 %de formamida, 10 % de sulfato dextrano, 2 χ SSC, 50 mM detampão de fosfato, pH 7,5). Sondas foram desnaturadas por 5minutos a 95 °C, ré-aneladas por 30 minutos a 37 0C e hibri-dizadas por pelo menos 40 horas a 37 °C. Após lavagem pós-hibridização, núcleos foram contramanchados com 20 ng/mL DA-PI (Sigma) em PBS/0,05 % Tween-20 e montados em reagente an-tidesbotamento Prolong Gold (Sondas Moleculares) .
Imagens foram coletadas com um microscópio de epi-fluorescência Zeiss Ax-io Imageador ZI (x 100 plan apochro-mat, 1,4 oil objeativo), equipado com uma câmera CCD e soft-ware Isis FISH Imaging System (Metasystems). Um mínimo de250 β-globinas ou alelos Rad23A foi analisado e pontuado co-mo sobreposição ou não sobreposição com BACs localizados emoutro lugar no genoma, por uma pessoa que não conhece a com-binação da sonda aplicada às seções. Testes de ajuste em re-plicata (estatística G) 6 foram realizados para avaliar sig-nificância de diferenças entre valores medidos para regiõespositivas 4C contra negativas 4C. Revisão geral do resultadoé fornecida na Tabela 2.
Embora tenhamos encontrado diferenças estatistica-mente significativas entre freqüências de interação de fundo(0,4-3,9 %) e reais (5-20,4 %), pode ficar claro que fre-qüências medidas por crio-FISH são menores que as medidaspor outros usando protocolos FISH diferentes. O seccionamen-to pode separar alguns Ioci de interação e medições crio-FISH subestimarão ligeiramente portanto as verdadeiras fre-qüências de interação. Por outro lado, procedimentos atuais2D- e 3D FISH sobrestimarão estas porcentagens por causa daresolução limitada na direção z. No futuro, técnicas de mi-croscopia melhoradas em combinação com sondas FISH mais es-pecíficas revelarão melhores freqüências de interação verdadeiras.
Exemplo 2
0 procedimento 3C (isto é, fixação de formaldeído,(primária) digestão de enzima de restrição, re-ligação defragmentos de DNA reticulados e purificação de DNA) é reali-zado essencialmente como descrito (Splinter et at. , (2004)Methods Enzymol. 375: 493-507), produzindo uma mistura deDNA ('padrão 3C1) contendo fragmentos de restrição que sãoligados em virtude de eles estarem originalmente perto doespaço nuclear.
PCR inverso é realizada para amplificar todos osfragmentos ligados a um dado fragmento de restrição ('bait';escolhido em virtude de ele conter um promotor, intensifica-dor, isolante, região de anexação de matriz, origem de re-plicação ou qualquer outra primeira (visada) seqüência denucleotideos).
Para isto, círculos de DNA são criados digerindo opadrão 3C com uma enzima de restrição secundária (preferi-velmente, um cortador freqüente reconhecendo seqüências detetra- ou penta-nucleotídeos), seguido por ligação em condi-ções diluídas de maneira que interações intra-molecularessejam favorecidas. Para minimizar uma propensão à formaçãode círculo por causa das restrições topológicas (Rippe etal, (2001) Trends in Biochem. Sciences 26, 733-40), deve serescolhida uma enzima de restrição secundária que corta pre-ferivelmente o bait a X350-400 bp do sítio de restrição pri-mária. Para aumentar a eficiência e reprodutibilidade de am-plificação de PCR inversa, círculos são mais bem lineariza-dos antes da amplificação de PCR por uma enzima de restrição(por exemplo, um cortador de 6 ou mais bp) que corta o baitentre o sítio de restrição primário e secundária de diagnóstico.
Digestão do padrão 3C com a enzima de restriçãosecundária, circularização por meio de ligação em condiçõesdiluídas e linearização de círculos contendo bait são rea-lizados sob condições padrão para tais manipulações de DNAproduzir um padrão de DNA para amplificação de PCR inverso( 'padrão 4C' ).
Desta maneira, 10 μg de padrão 3C são digeridosem 100 pL com 20 U da enzima de restrição secundária (portoda a noite), seguido por inativação de calor da enzima epurificação do DNA. Ligação é realizada em 10 mL. (1 ng/μΐ,DNA) com 50 U T4 ligase (4 horas a 16 °C, 30 minutos a RT),seguido por purificação de DNA. Finalmente, a linearizaçãodos círculos de interesse é feita em 100 yL com 20 U de en-zima de restrição (por toda a noite), seguido novamente porpurificação de DNA.
Para PCR inversa, dois iniciadores específicosbait são projetados, cada qual o mais próximo possível dosítio de reconhecimento de enzima de restrição primária esecundária diretamente vizinha, respectivamente, e cada qualcom sua extremidade 31 voltada para fora para que a extensãose dê imediatamente nos sítios de restrição em um fragmentoligado ao bait. PCR inversa com estes iniciadores é preferi-velmente realizado em 100-400 ng do DNA de padrão 4C (por 50μΐϋ da reação da mistura de PCR) , para incluir um número má-ximo de eventos de ligação por reação de PCR. Nós realizamosPCR inversa aplicando o Sistema PCR de Padrão Expand Long(Roche), usando tampão 1 de acordo com procedimentos do fa-bricante.
São realizados os ciclos de PCR seguintes:
1. 2 minutos 94 0C
2. 15 segundos 94 0C
3. 1 minuto 55 0C
4.3 minutos 68 0C
5. etapa repetida 2-4 29 χ (ou nada entre 25-40 x)
6. 7 minutos 68 0C
7. fim.Gel eletroforese é realizado para analisar repro-dutibilidade entre reações de PCR individuais. Tipicamente,parceiros produtos idênticos devem ser obtidos.
A fim de obter material suficiente para marcar poriniciação aleatória e hibridização do arranjo, múltiplas re-ações de PCR (cada obtida após 30 ciclos de PCR) podem seragrupadas, (em vez de aumentar o número de ciclos de PCR porreação). Como uma alternativa para marcação com primo alea-tório, nucleotideos marcados podem ser incorporados nos úl-timos ciclos de PCR (por exemplo, 30 ciclos (sem marcação) +10 ciclos (marcação)).
Exemplo 3
Detecção de translocação usando tecnologia 4C
Tecnologia 4C é usada para medir as freqüências dainteração para a dada seqüência X presente em um dado cro-mossomo A em células de um sujeito saudável e em células deum paciente que carrega uma única translocação recíproco,entre cromossomo AeB com o ponto de ruptura perto da se-qüência X (apresentado na Figura 9).
Em células normais, esta análise revela sinais deelevada hibridização (isto é, interações freqüentes com X)para (quase) toda sonda localizada em 0,2-10 Mb da seqüênciaX em cromossomo A (o tamanho atual da região cromossomalmostrando fortes sinais de reticulação depende na maioriadas vezes da complexidade da amostra que foi hibridizada como arranjo). Em outro lugar no mesmo cromossomo A, bem comoem outros cromossomos, não é observada nenhuma região gran-de como esta (no padrão linear de DNA) de sondas com eleva-vados sinais de hibridização.
Em células de paciente, entretanto, sinais de hi-bridização com todas as sondas do cromossomo A localizadasno outro lado do ponto de ruptura são reduzidas para ~50 %(uma cópia do cromossomo A é ainda intacta e produzirá si-nais normais), ao passo que uma única (isto é, não presenteem células normais) concentração de sinais de elevada hibri-dização é observada para sondas vizinhas do ponto de rupturaem cromossomo B. De fato, a transição abrupta entre sondasmostrando no contra sinais de hibridização fortes em cromos-somo B revela a localização do ponto de ruptura em cromossomo B.
Exemplo 4
Resultado de análise de tecnologia 4C
Tecnologia 4C foi usada para caracterizar o ambi-ente genômico da região de controle do locus β-globina docamundongo (LCR), focado em um fragmento de restrição con-tendo seu sitio 2 hipersensivel (HS2). O LCR é um forte ele-mento regulador de transcrição especifico de eritróide re-querido para altos níveis de expressão do gene β-globina. Olocus β-globina está presente em cromossomo 7 na posição 97Mb, onde ele reside em um grande agrupamento 2,9 Mb, de ge-nes do receptor olfativo que são transcritos somente em neu-rônios olfativos. Interações foram analisadas em dois teci-dos: fígado fetal E14.5, onde o LCR é ativo e os genes β-globina são altamente transcritos, e cérebro fetal E14.5,onde o LCR é inativo e o genes globina são silenciosos. Emambos tecidos, a grande maioria de interações foi encontradacom seqüências em cromossomo 7 e muito poucas interações LCRforam detectadas com seis cromossomos não relacionados (8,10, 11, 12, 13, 14) (Figura 13a). Os sinais mais fortes emcromossomo 7 foram encontrados em uma região 5-10 Mb centra-lizados em torno da posição cromossomal de β-globina, de a-cordo com a idéia de que freqüências da interação são inver-samente proporcionais à distância (em pares de base) entreseqüências de DNA fisicamente ligadas. Não foi possível in-terpretar quantitativamente as interações nesta região. Nósinferimos que estas seqüências próximas foram juntamente comβ-globina tão freqüentes que sua grande sobre-representaçãoem nossas amostras de hibridização saturaram as sondas cor-respondente. Isto foi confirmado quando nós realizamos hi-bridização com amostras diluídas 1 : 10 e 1 : 100 e observa-mos que a intensidade do sinal foi reduzida em sondas fora ena borda, mas não nesta região (dados não apresentados).
O procedimento 4C forneceu dados altamente repro-dutíveis. A figura 2b-c apresenta razões não processadas desinais 4C com relação a sinais de hibridização de controlepara duas regiões em cromossomo 7 1,5 Mb, grosseiramente 25Mb e 80 Mb fora do gene β-globina. Neste nível de resolução,os resultados das amostras independentemente processadas fo-ram quase idênticos. Tanto em fígado fetal quanto em cére-bro, agrupamentos de sinais positivos foram identificados emcromossomo 7, freqüentemente em locais cromossomais dezenasde megabases fora de β-globina. Estes agrupamentos tipica-mente consistem em minimamente 20-50 sondas com maiores ra-zões de sinal justapostos no padrão do cromossomo (Figura13b-c). Cada sonda na análise de arranjo um evento de liga-ção independente. Além do mais, somente duas cópias de frag-mento de restrição HS2 estão presentes por célula, cada umadas quais pode somente ligar com um outro fragmento de res-trição. Portanto, a detecção de eventos de ligação indepen-dentes com 20 ou mais fragmentos de restrição vizinhos indi-cam fortemente que o locus correspondente faz contato com oLCR de β-globina em múltiplas células.
Para determinar a significância estatística destesagrupamentos, dados de experimentos individuais foram orde-nados em mapas cromossomais e analisados usando um algoritmode média corrida com um tamanho de janela de aproximadamente60 kb. A distribuição da média corrida de dados misturadosaleatoriamente foi usada para estabelecer um valor de Iimi-te, permitindo uma falsa taxa de descoberta de 5 %. Esta a-nálise identificou 66 agrupamentos em fígado fetal e 45 emcérebro que foram encontrados reprodutíveis em experimentosem duplicata (Figura. 13d-f). De fato, alta resolução FISHconfirmou que tais agrupamentos verdadeiramente representamIoci que interagem freqüentemente (ver a seguir).
Assim, a tecnologia 4C identifica Ioci de intera-ção de longo alcance pela detecção de eventos de ligação in-dependentes com múltiplos fragmentos de restrição agrupadosem uma posição cromossomal.
Uma série de experimentos 4C completamente inde-pendentes foi realizada com um conjunto de iniciadores dePCR inversa diferente que investigou o ambiente genômico dogene β principal, localizado ~50 kb à jusante de HS2. Em umfígado fetal, o gene β principal é altamente transcrito efreqüentemente recebe contato do LCR. Agrupamentos de inte-rações de longo alcance quase idênticos com β principal comocom HS2 foram encontrados, tanto em fígado fetal quanto emcérebro, substanciando adicionalmente que estes Ioci fazemcontato freqüentemente com o locus β-globina (Figura 17).
Exemplo 5
O locus β-globina ativo e inativo ocupa ambientegenômico distinto.
Uma Comparação entre o dois tecidos revelou que olocus β-globina ativamente transcrito em fígado fetal inte-rage com um conjunto de Ioci completamente diferente de suacontraparte transcricionalmente silenciosa em cérebro(t=0,03; Correlação de Spearman1S Rank) (Figura 13f) . Istoexclui que resultados sejam influenciados pela composição deseqüência das sondas. Em fígado fetal, os segmentos do DNAde interação foram localizados em uma região 70 Mb centrali-zada em torno do locus β-globina, com a maioria (40/66) lo-calizada em direção ao telômero do cromossomo 7. Em fetalcérebro, Ioci de interação foram encontrados em similares oumesmo grandes distâncias de β-globina comparados ao fígadofetal e com a grande maioria de interações (43/45) localiza-da em direção ao centrômero do cromossomo 7. Estes dados de-monstraram que o locus β-globina ativo e inativo faz contatocom diferentes partes do cromossomo 7.
Seis outros cromossomos (8, 10, 11, 12, 13 e 14)foram representados nos microarranjos. Sinais fortes de hi-bridização nestes cromossomos foram raros, aparecem típica-mente isolados no padrão de DNA linear e freqüentemente fo-ram ausentes dos experimentos em duplicata. Também, níveisde média corrida através destes cromossomos nunca chegaramperto reprodutivelmente dos níveis pontuados para cromossomo7 (Figura 19). Assim, outros dados mostraram que o locus β-globina basicamente faz contato com os Ioci em outro lugarno mesmo cromossomo, de acordo com a localização preferidadeste locus dentro de seu próprio território do cromossomo.Nós notamos que o locus β-globina foi também presente no ar-ranjo (cromossomo 11) e não pontuou positivo para interaçãocom β-globina, de acordo com a demonstração recente por FISHque camundongo α e β-globina não se encontraram freqüente-mente no espaço nuclear (Brown, J. M et at. (2006) J CellMal 172, 177-87).
A fim de um melhor entendimento da relevância dasinterações de longo alcance observadas no cromossomo 7, nóscomparamos os Ioci de interação com as posições cromossomaisde genes. Além do mais, análise de arranjo de expressãoAffymetrix foi realizada para determinar atividade de trans-crição nestas posições nos dois tecidos. Embora o tamanhomédio de áreas de interação em fígado fetal e cérebro sejacomparável (183 kb e 159 kb, respectivamente), diferençasdrásticas foram observadss em seu teor e atividade de gene.
Em fígado fetal, 80 % dos Ioci de interação de β-globinacontiveram um ou mais genes ativamente transcritos, ao passoque em cérebro fetal a grande maioria (87 %) não demonstrouatividade de gene detectável (Figura 15). Assim, o locus β-globina é incorporado em um ambiente genômico muito diferen-te nos dois tecidos. Em cérebro, onde o locus não é ativo,ele primeiramente faz contato com os Ioci transcricionaissilenciosos localizados em direção ao centrômero do cromos-somo 7. Em fígado fetal, onde o locus é altamente ativo, eleinterage preferencialmente com regiões ativamente transcri-tas localizadas mais proeminentemente em direção ao lado te-lomérico do cromossomo 7. Importantemente, tecnologia 4C i-dentificou ambos Uros e Eraf, (~30 Mb distante de β-globina)como genes interagindo com o locus β-globina em fígado fe-tal, de acordo com observações prévias feitas por FISH (Os-borne, C. S. et at. (2004) Nat Genet 36, 1065-71 (2004)).
Interessantemente, em cérebro em contatos foram observadoscom dois outros agrupamentos do gene receptor olfativo pre-sente em cromossomo 7 que foram localizados a cada lado de β-globina, e 17 e 37 Mb distante dela.
Nem todas regiões transcritas em cromossomo 7 in-teragem com o locus β-globina ativo em fígado fetal. Portan-to, nós pesquisamos denominador que compartilha exclusiva-mente pelo Ioci de interação mas não por outras regiões ati-vas em fígado fetal. Os genes β-globina, Uros e Eraf são to-dos genes específicos de eritróide que podem ser reguladospelo mesmo conjunto de fatores de transcrição, e é uma idéiaatrativa que esses fatores coordenam expressão de seus genesvisados no espaço nuclear. Nós comparados dados arranjos deexpressão Affymetrix de fígado fetal E14.5 com o de cérebrofetal para identificar genes preferencialmente expressos (>5vezes mais) em fígado fetal. Foram classificados 28 % dosgenes ativos como estes em cromossomo 7 como "fígado fetalespecifico", dos quais 25 % foram encontrados em uma áreaco-localizada. Assim, nós não encontramos nenhum enriqueci-mento de genes de "fígado fetal específico" nas áreas co-localizadas. Mais importantemente, 49 de 66 (74 %) regiõesde interação não continham um "fígado fetal-específico" econcluiu-se portanto que nossos dados não mostraram evidên-cia para expressão coordenada de genes específicos do tecidono espaço nuclear. Os genes β-globina são transcritos em ta-xas excepcionalmente altas e questionou-se em seguida se olocus preferencialmente interage com outras regiões de ati-vidade transcricional alta, sendo tanto genes altamente ex-pressos quanto áreas com uma alta densidade de genes ativos.
Usando contas Affymetrix como uma medida para atividade dogene, nós realizamos um algoritmo de soma de corrida paramedir diversas atividades transcricionais nas regiões 200 kbem torno dos genes ativamente transcritos. Esta análise re-velou que atividade transcricional em torno genes de intera-ção não foi maior que em torno de genes de não de interaçãoativos em cromossomo 7 (p = 0,9867; Wilcoxon Rank sum).
Exemplo 6
O ambiente genômico de um gene zelador é amplamen-te conservado entre os tecidos
Em seguida, foi investigado se um gene que é simi-larmente expresso em ambos tecidos também muda seu ambientegenômico. Rad23A é um gene ubiqüitariamente expresso que re-side em um denso agrupamento de genes basicamente de geneszeladores em cromossomo 8. Tanto em fígado fetal E14.5 quan-to em cérebro, este gene e muitos de seus vizinhos diretossão ativos. Análise 4C foi realizada e identificou muitasinterações de longo alcance com Ioci de até 70 Mb distantede Rad23A. Importantemente, interações com Rad23A foram al-tamente correlacionadas entre fígado fetal e cérebro (τ =0,73; correção de Spearman's Rank) (Figura 15a). Uma marcacompartilhada desses Ioci foi novamente que eles continhamgenes ativamente transcritos. Assim, em ambos tecidos gros-seiramente 70 % contiveram pelo menos um gene ativo (Figura15b-c). Regiões em torno de genes de interação revelam ni-veis mais altos estatisticamente significativos de atividadedo gene comparados com genes ativos em outro lugar no cro-mossomo, como determinado por um algoritmo de soma de corri-da (p < 0,001 para ambos tecidos). Assim, diferente do locusβ-globina, o gene Rad23A que é localizado em uma região ricaem gene preferencialmente interage em distância com outrasregiões cromossomais de maior atividade transcricional. Foiobservado por FISH que a área cromossomal contendo Rad23Areside basicamente na borda de (90 %) ou fora (10 %) de seuterritório do cromossomo (não publicado, D. Noordermeer, M.Branco, A. Pombo and W. de Laat) . Entretanto, a análise 4Crevelou somente interações infra-romossomais e nenhuma áreano cromossomo 7, 10, 11, 12, 13 ou 14 reprodutível atendeunossos rigorosos critérios para interação. Assim, Rad23A ébasicamente envolvido em interações intracromossomais quesão similares em dois tecidos muito diferentes. Se Rad23Ativer Ioci vizinhos preferidos nestes cromossomos não rela-cionados, eles não interagem freqüentemente o bastante paraser detectados nas condições aqui usadas para a tecnologia4C.
Exemplo 7
Validação de tecnologia 4C por microscopia de altaresolução
Para validar o resultado obtido pela tecnologia
4C, experimentos crio-FISH foram realizados. Crio-FISH é umatécnica de microscopia recentemente desenvolvida, que tem avantagem sobre protocolos 3D-FISH atuais, que preserva me-lhor a ultra-estrutura nuclear oferecendo, portanto, melhorresolução no eixo-z pela preparação de crio-seções ultrafi-nas (Branco, M. R.. & Pombo, A (2006). PLoS Biol 4, el38).Dados de 4C foram verificados medindo agora β-globina fre-qüente ou alelos Rad23A (sempre n>250) co-localizados commais que 15 regiões cromossomais selecionadas em seções ul-trafinas de 200 nm preparadas de fígado e cérebro E14.5. Im-portantemente, todas as freqüências da interação medidas porcrio-PISH estavam em perfeito acordo com o resultado 4C (Fi-gura 17). Por exemplo, regiões distantes que foram identifi-cadas para interagir com β-globina pela tecnologia 4C co-localizada mais freqüentemente do que as áreas intervenien-tes não detectadas por 4C (7,4 % e 9,7 %, contra 3,6 % e 3,5%, respectivamente). Também, os dois agrupamentos do recep-tor de gene olfativo distantes identificados pela tecnologia4C para interagir com β-globina em cérebro fetal, mas não emfreqüências de colocalização pontuadas no fígado respectiva-mente de 12,9 % e 7 % em cérebro, contra 3,6 % e 1,9 % emseções do fígado. Em resumo, freqüências de colocalizaçãomedidas por Ioci positivamente identificados pela tecnologia4C foram todas significativamente maiores que as freqüênciasmedidas pelos Ioci de fundo G . Nós concluímos que tecnolo-gia 4C identifica verdadeiramente Ioci de interação de DNA.
Finalmente, nós usamos crio-FISH para demonstrar que Iociidentificados interagindo com β-globina também fazem contatofreqüentemente uns com os outros. Isto foi verdadeiro paraduas regiões ativas separadas por grande distância cromosso-mal em fígado fetal (Figura 19) bem como para dois agrupa-mentos de gene OR inativos separados longe um do outro nocromossomo em cérebro (Figura 17). Interessantemente, fre-qüentes contatos entre estes dois agrupamentos de gene ORdistantes foram também encontrados em fígado fetal, onde e-Ies não interagirão com o agrupamento de gene OR que contémo locus β-globina ativamente transcrito. Estes dados indicamque interações nucleares entre agrupamentos de gene OR dis-tintos não foram uma peculiaridade do tecido do cérebro fe-tal analisado. Tentando especular que tais contatos espaci-ais facilitam a comunicação entre os muitos genes OR neces-sários para assegurar que é transcrito somente um alelo sim-pies por neurônio olfativo (Shykind, B. (2005) Hum Mol GenetSpec No 1, R33-9.
Exemplo 8
Organização nuclear de domínios de cromatina ati-vos e inativos
As observações aqui descritas demonstram que nãosomente regiões genômicas ativas, mas também inativas, for-mam regiões distintas no espaço nuclear que envolvem muitoscontatos de longo alcance, sugerindo fortemente que cadasegmento de DNA tem seu próprio conjunto de interações pre-ferido. Nossos dados sugerem que quando o locus β-globina éligado, ele deixa um ambiente transcricional silencioso ge-nômico e entra em uma área nuclear onde interações com domí-nios ativos são favorecidos. Presume-se que um reposiciona-mento drástico como este mediante ativação transcricionalpode bem ser uma marca distinta somente de genes específicosde tecido que atingiram um certo nível de expressão e, maisimportantemente, ficaram isolados dos outros genes ativos nopadrão de cromossomo linear, como é o caso para β-globina.
Propõe-se que a rede extensiva de interações de longo alcan-ce que são identificadas tanto entre Ioci genômicos inativosquanto entre ativos, reflita diferenças célula-para-célulaem conformações de cromossomo mais que sendo uma conseqüên-cia de movimentos dinâmicos durante interfase (Chakalova etat. (2005) Nat Rev Genet 6, 669-ΊΊ (2005). Presumidamente,diferentes graus de descondensação após a divisão celularimpulsionam as regiões genômicas ativas para fora da croma-tina inativa (Gilbert, N. et at. (2004) Cell IlSf 555-66(2004)) e contatos entre Ioci distante de composição de cro-matina similar são estabilizados basicamente por meio dasafinidades entre proteínas ligadas a cromatina. Justaposiçãoespacial entre Ioci distantes pode ser funcional, mas podetambém simplesmente ser a conseqüência dos parceiros de des-dobramento de um cromossomo. Enquanto Ioci individuais podemmover em um volume nuclear restrito, a conformação geral deum cromossomo será amplamente mantida por todo o ciclo celu-lar e exigindo divisão celular para restabelecimento. Estaidéia está de acordo com estudos de imageamento de célulavivas que mostram movimentos restritos de Ioci de DNA alvosno interior nuclear (Chubb et at. (2002) Curr Biol 12, 439-45 (2002)) e se ajustam bem aos estudos que mostram que ainformação da posição de cromatina nuclear é freqüentementepropagada durante a divisão celular sem ser conservado napopulação de células (Essers, J. et at. Mol Biol Cell 16,769-75 (2005); Gerlich, D. et at.. Cell 112, 751-64 (2003)).
Aspectos adicionais 1
Aspectos adicionais da presente invenção são apre-sentados a seguir nos parágrafos numerados.
1. Um conjunto de sondas complementares a cada la-do de cada sitio de reconhecimento da enzima de restriçãoprimária no genoma de uma dada espécie (por exemplo, humana).
2. Um conjunto de sondas complementares a somenteum lado de cada sitio de reconhecimento da enzima de restri-ção primária no genoma de uma dada espécie (por exemplo, humana).
3. Um conjunto de sondas complementares a um ladode cada outro sitio de reconhecimento da enzima de restriçãoprimária ordenado ao longo do padrão linear do genoma de umadada espécie (por exemplo, humana).
4. Um conjunto de sondas complementares a um ladode cada terceiro, quarto, quinto, sexto, sétimo, oitavo, no-no, décimo, vigésimo, trigésimo, quadragésimo, quinquagési-mo, sexagésimo, septuagésimo octagésimo, nonagésimo ou umcentésimo sitio de reconhecimento da enzima de restriçãoprimária ordenadas junto com o padrão linear do genoma deuma dada espécie (por exemplo, humana).
5. Um conjunto de sondas representando regiões ge-nômicas de um dado tamanho (por exemplo, cerca de 50 kb, 100kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb,5 Mb, 6 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb ou 10 Mb) (por exemplo,50 kb-10 Mb) em torno todos Ioci os conhecidos para ser en-volvidos em translocações, deleções, inversões, duplicaçõese outros ré-arranjos genômicos.
6. Um conjunto de sondas representando regiões ge-nômicas de um dado tamanho (por exemplo, cerca de 50 kb, 100kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1 Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb,5 Mb, 6 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb ou 10 Mb) (por exemplo,50 kb-10 Mb) em torno de uma seleção de Ioci conhecido paraser envolvida em translocações, deleções, inversões, dupli-cações e outros ré-arranjos genômicos.
7. Preferivelmente, a seqüência 4C (bait) está acerca de 50 kb, 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb, 500 kb, 1Mb, 2 Mb, 3 Mb, 4 Mb, 5 Mb, 6 Mb, 6 Mb, 7 Mb, 8 Mb, 9 Mb, 10Mb, 11 Mb, 12 Mb, 13 Mb, 14 Mb ou 15 Mb ou mais da seqüênciaré-arranjada atual (isto é, ponto de ruptura no caso de umatranslocação).
8. Um conjunto de sondas representando o genomacompleto de uma dada espécie, com cada sonda representandoum fragmento de restrição simples obtido ou obtenivel apósdigestão com uma enzima de restrição primária.
9. Um conjunto de sondas representando o genomacompleto de uma dada espécie, com sondas igualmente distri-buídas junto com os padrões do cromossomo lineares.
10. Um arranjo que compreende o conjunto de sondasde acordo com qualquer uma dos parágrafos 1-10.
11. Um método para analisar a freqüência de inte-ração de uma seqüência de nucleotideos alvo com uma ou maisseqüências de nucleotideos (por exemplo, um ou mais Ioci ge-nômicos) que compreende o uso de uma seqüência de nucleoti-deos ou um arranjo de sondas ou um conjunto de sondas ou umarranjo aqui descrito.
12. Um método para identificar uma ou mais intera-ções de DNA-DNA que são indicativas de um estado da doençaparticular que compreende o uso de uma seqüência de nucleo-tideos ou um arranjo de sondas ou um conjunto de sondas ouum arranjo aqui descrito.
13. Um método de diagnóstico ou prognóstico de umadoença ou sindrome causada ou associada com uma mudança emum DNA-DNA que compreende o uso de uma seqüência de nucleo-tideos ou um arranjo de sondas ou um conjunto de sondas ouum arranjo aqui descrito.
14. Um método de arranjo para identificar um oumais agentes que modulam uma interação de DNA-DNA que com-preende o uso de uma seqüência de nucleotideos ou um arranjode sondas ou um conjunto de sondas ou uma sonda aqui descrita
15. Um método para detectar a localização de umponto de ruptura (por exemplo, uma translocação) que compre-ende o uso de uma seqüência de nucleotideos ou um arranjo desondas ou um conjunto de sondas ou um arranjo aqui descrito.16. Um método para detectar a localização de umainversão que compreende o uso de uma seqüência de nucleotí-deos ou um arranjo de sondas ou um conjunto de sondas ou umarranjo aqui descrito.
17. Um método para detectar a localização de umadeleção que compreende o uso de uma seqüência de nucleotí-deos ou um arranjo de sondas ou um conjunto de sondas ou umarranjo aqui descrito.
18. Um método para detectar a localização de umaduplicação que compreende o uso de uma seqüência de nucleo-tideos ou um arranjo de sondas ou um conjunto de sondas ouum arranjo aqui descrito.
19. 0 uso de microarranjos em tecnologia 4C paraidentificar (todos) segmentos do DNA que estão perto proxi-midade da espacial de um segmento de DNA de escolha.
20. Um microarranjo contendo as sondas homólogasàs seqüências de DNA diretamente adjacente aos sítios de re-conhecimento da enzima de restrição primária presente na re-gião genômica que são incluídos na análise (que pode ser ogenoma completo ou parte do genoma): cada sonda localizapreferivelmente dentro de 100 bp, ou no máximo a 300 bp deum sítio de reconhecimento de enzima de restrição primáriaúnica, ou alternativamente é projetada entre cada sítio dereconhecimento da enzima de restrição primária e seu sítiode reconhecimento de enzima de restrição secundária perto.
21. Um arranjo aqui descrito que compreende sondascomplementares às seqüências de Ioci selecionados, em que odito arranjo é representativo do genoma completo de uma dadaespécie.
22. Um arranjo de acordo com o parágrafo 21, emque os Ioci são Ioci associados com uma ou mais doenças.
23. Um arranjo de acordo com o parágrafo 21 ou pa-rágrafo 22, em que as seqüências de Ioci selecionados inclu-em as seqüências que estão até 20 Mb distantes do dito Ioci.
24. Um método para analisar a freqüência de inte-ração de uma seqüência de nucleotideos alvo com uma ou maisseqüências de nucleotideos de interesse (por exemplo, um oumais Ioci genômico) que compreende as etapas de:
(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado;
(b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária;
(c) ligar as seqüências de nucleotideos reticuladas;
(d) reverter a reticulação;
(e) digerir as seqüências de nucleotideos com umaenzima de restrição secundária;
(f) ligar as seqüências de nucleotideos;
(g) amplificar uma ou mais seqüências de nucleoti-deos de interesse que são ligadas com a seqüência de nucleo-tideos alvo usando pelo menos dois iniciadores de oligonu-cleotideo, em que cada iniciador hibridiza para uma seqüên-cia conhecida de DNA que flanqueia as seqüências de nucleo-tideos de interesse;
(h) hibridizar as seqüências amplificadas para umarranjo; e
(i) determinar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA.
Aspectos adicionais 2
Aspectos ainda adicionais da presente invenção sãoapresentados a seguir nos parágrafos numerados.
1. Uma seqüência de nucleotideos circularizada quecompreende uma primeira e uma segunda seqüência de nucleoti-deos separadas por um sitio de reconhecimento de enzima derestrição primária e uma secundária, em que a dita primeiraseqüência de nucleotideos é uma seqüência de nucleotideosalvo e a dita segunda seqüência de nucleotideos é obtenivelpor DNA genômico de reticulação .
2. A seqüência de nucleotideos circularizada deacordo com o parágrafo 1, em que a seqüência de nucleotideosalvo é selecionada do grupo que consiste em um promotor, umintensificador, um silenciador, um isolante, uma região deanexação de matriz, uma região de controle de locus, uma u-nidade de transcrição, uma origem de replicação, uma pontoquente de recombinação, um ponto de ruptura de translocação,um centrômero, um telômero, uma região densa em genes, umaregião fraca em gene, um elemento repetitivo e um (viral)sitio de integração.
3. A seqüência de nucleotideos circularizada deacordo com o parágrafo 1, em que a seqüência de nucleotideosalvo é uma seqüência de nucleotideos que é associada com umadoença, ou que causa a mesma, ou está localizada a menos que15 Mb em um padrão de DNA linear de um locus que é associadocom uma doença, ou que causa a mesma.
4. A seqüência de nucleotideos circularizada deacordo com qualquer um dos parágrafos 1-3, em que a seqüên-cia de nucleotideos alvo é selecionada do grupo que consisteem: AMLlf MLL, MYCr BCLf BCRf ABLlf IGHf LYLlf TALlf TALlfLMO2f TCR α/β TCRβ e HOX ou outros Ioci associados com doen-ça como descrito em "Catalogue of Unbalanced Chromosome A-berrations in Man." 2nd edition. Albert Schinzel. Berlin:Walter de Gruyter, 2001. ISBN 3-11-011607-3.
5. A seqüência de nucleotideos circularizada deacordo com qualquer um dos parágrafos 1-4, em que o sitio dereconhecimento da enzima de restrição primária é um sitio dereconhecimento de 6-8 bp, preferivelmente selecionado dogrupo que consiste em BgIIIf HindIII, EcoRIf BamHIf SpeIfPstI e NdeI.
6. A seqüência de nucleotideos circularizada deacordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, em que ositio de reconhecimento da enzima de restrição secundária éum sitio de reconhecimento seqüência de nucleotideos de 4 ou5 bp.
7. A seqüência de nucleotideos circularizada deacordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, em que ositio de reconhecimento da enzima de restrição secundáriaestá localizado a mais que cerca de 350 bp do sitio de res-trição primária.
8. A seqüência de nucleotideos circularizada deacordo com qualquer um dos parágrafos anteriores, em que aseqüência de nucleotideos é marcada.
9. Uma seqüência de nucleotideos que compreendeuma primeira e uma segunda seqüência de nucleotideos separa-das por um sitio de reconhecimento de enzima de restriçãoprimária e uma secundária, onde a dita primeira seqüência denucleotideos é uma seqüência de nucleotideos alvo, a segundaseqüência de nucleotideos é obtenivel por DNA genômico dereticulação em que a dita segunda seqüência de nucleotideoscruza a seqüência de nucleotideos alvo.
10. Um método para preparar uma seqüência de nu-cleotideos circularizada que compreende as etapas de
(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado;
(b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária;
(c) ligar as seqüências de nucleotideos reticuladas;
(d) reverter a reticulação
(e) digerir as seqüências de nucleotideos com umaenzima de restrição secundária; e
(f) circular as seqüências de nucleotideos.
11. Um método para preparar uma seqüência de nu-cleotideos que compreende as etapas de:
(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado;
(b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária;
(c) ligar as seqüências de nucleotideos reticuladas ;
(d) reverter a reticulação;
(e) digerir as seqüências de nucleotideos com umaenzima de restrição secundária;
(f) circular as seqüências de nucleotideos; e(g) amplificar uma ou mais seqüências de nucleoti-deos ligadas à seqüência de nucleotideos alvo.
12. Um método de acordo com o parágrafo 11, em quea seqüência de nucleotideos circularizada visada é lineari-zada antes da amplificação.
13. Um método de acordo com o parágrafo 12, em quea seqüência de nucleotideos visada circularizada é lineari-zada usando uma enzima de restrição que reconhece um sitiode reconhecimento de 6 bp ou mais.
14. Um método de acordo com qualquer um dos pará-grafos 10-13, em que a seqüência reticulada de nucleotideosé amplificada usando PCR
15. Um método de acordo com o parágrafo 14, em quea seqüência reticulada de nucleotideos é amplificada usandoPCR inversa
16. Um método de acordo com o parágrafo 14 ou pa-rágrafo 15, em que é usado o Sistema PCR Padrão Expand Long(Roche).
17. Um método para analisar a freqüência de inte-ração de uma seqüência de nucleotideos alvo com uma ou maisseqüências de nucleotideos (por exemplo, um ou mais Ioci ge-nômico) que compreende o uso de uma seqüência de nucleoti-deos de acordo com qualquer um dos parágrafos 1-9.
18. Um arranjo de sondas imobilizadas em um supor-te que compreende uma ou mais sondas que hibridizam ou sãocapazes de hibridizar para uma seqüência de nucleotideos deacordo com qualquer um dos parágrafos 1-9.
19. Um conjunto de sondas complementares em se-qüência com a seqüência de ácido nucléico adjacente a cadaum dos sítios de reconhecimento da enzima de restrição pri-mária de uma enzima primária restrição no DNA genômico.
20. Um conjunto de sondas de acordo com o parágra-fo 19, em que as sondas são complementares em seqüência coma seqüência de ácido nucléico adjacente a cada lado de cadaum dos sítios de reconhecimento da enzima de restrição pri-mária de uma enzima de restrição primária no DNA genômico.
21. Um conjunto de sondas de acordo com o parágra-fo 19 ou parágrafo 20, em que as ditas sondas são complemen-tares em seqüência com a seqüência de ácido nucléico que es-tá menos que 300 pares base de cada um dos sítios de reco-nhecimento da enzima de restrição primária de uma enzima derestrição primária no DNA genômico.
22. Um conjunto de sondas de acordo com qualquerum dos parágrafos 19-21, em que as sondas são complementaresà seqüência que está a menos de 300 bp de cada um dos sítiosde reconhecimento da enzima de restrição primária de uma en-zima de restrição primária em DNA genômico.
23. Um conjunto de sondas de acordo com qualquerum dos parágrafos 19-22, em que as sondas são complementaresà seqüência que está entre 200 e 300 bp de cada um dos sí-tios de reconhecimento da enzima de restrição primária deuma enzima de restrição primária no DNA genômico.
24. Um conjunto de sondas de acordo com qualquerum dos parágrafos 19-23, em que as sondas são complementaresà seqüência que está entre 100 e 200 bp de cada um dos sí-tios de reconhecimento da enzima de restrição primária deuma enzima de restrição primária no DNA genômico.
25. Um conjunto de sondas de acordo com qualquerum dos parágrafos 19-24, em que duas ou mais das sondas sãoprojetadas que são capazes de hibridizar com a seqüência ad-jacente a cada sitio de reconhecimento da enzima de restri-ção primária de uma enzima de restrição primária no DNA ge-nômico .
26. Um conjunto de sondas de acordo com o parágra-fo 25, em que as sondas sobrepõem-se, ou sobrepõem-se parcialmente.
27. Um conjunto de sondas do parágrafo 26, em quea sobreposição é menos que 10 nucleotideos.
28. Um conjunto de sondas de acordo com qualquerum dos parágrafos 19-27, em que a seqüência de sondas cor-responde a toda ou parte da seqüência entre cada um dos sí-tios de reconhecimento da' enzima de restrição primária deuma enzima de restrição primária e cada um dos primeiros sí-tios de reconhecimento de enzima de restrição secundária vi-zinhos de uma enzima de restrição secundária.
29. Um conjunto de sondas de acordo com qualquerum dos parágrafos 19-28, em que cada sonda é pelo menos 25 mer.
30. Um conjunto de sondas de acordo com qualquerum dos parágrafos 19-29, em que cada uma das sondas é 25-60 mer.
31. Um processo para preparar um conjunto de son-das que compreende as etapas de:
(a) identificar cada um dos sítios de reconheci-mento da enzima de restrição primária para uma enzima derestrição primária em DNA genômico;
(b) projetar sondas que são capazes de hibridizarcom a seqüência adjacente a cada um dos sítios de reconheci-mento da enzima de restrição primária no DNA genômico;
(c) sintetizar as sondas; e
(d) combinar as sondas entre si para formar umconjunto de sondas ou substancialmente um conjunto de sondas.
32. Um processo de acordo com o parágrafo 31, emque as sondas são produtos de amplificação PCR.
33. Um conjunto de sondas, ou substancialmente umconjunto de sondas obtido ou obtenível pelo processo de a-cordo com o parágrafo 31 ou parágrafo 32.
34. Um arranjo compreendendo um arranjo de sondasde acordo com o parágrafo 18 ou substancialmente o conjuntode sondas de acordo com qualquer um dos parágrafos 19-30 ou 33.
35. Um arranjo que compreende o conjunto de sondasde acordo com qualquer um dos parágrafos 19-30 ou 33.
36. Um arranjo de acordo com o parágrafo 34 ou pa-rágrafo 35, em que o arranjo compreende cerca de 300.000-400.000 sondas.
37. Um arranjo de acordo com qualquer um dos pará-grafos 34-36, em que o arranjo compreende cerca de 385.000ou mais sondas, preferivelmente, cerca de 750.000 sondas,mais preferivelmente, 6 χ 750.000 sondas.
38. Um arranjo de acordo com qualquer um dos pará-grafos 34-37, em que, se o número de sondas exceder o númerode sondas que pode ser contido em um arranjo simples, entãoo arranjo compreenderá ou consistirá em uma representação dogenoma completo de uma dada espécie em baixa resolução.
39. Um arranjo de acordo com o parágrafo 38, emque uma a cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 sondas ordenadasem um padrão de cromossomo linear é contida no arranjo.
40. Um processo para preparar um arranjo que com-preende a etapa de imobilizar em um suporte substancialmentesólido o arranjo de sondas de acordo com o parágrafo 18 ousubstancialmente o conjunto de sondas de acordo com qualquerum dos parágrafos 19-30 ou 33.
41. Um processo para preparar um arranjo que com-preende a etapa de imobilizar em um suporte sólido o arranjode sondas de acordo com o parágrafo 18 ou o conjunto de son-das de acordo com qualquer um dos parágrafos 19-30 ou 33.
42. Um arranjo obtido ou obtenivel pelo método deacordo com o parágrafo 40 ou parágrafo 41.
43. Um método para analisar a freqüência de inte-ração de uma seqüência de nucleotídeos visada com uma oumais seqüências de nucleotídeos (por exemplo, um ou mais Io-ci genômico) que compreende as etapas de:
(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado;
(b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária;
(c) ligar as seqüências de nucleotídeos reticuladas ;
(d) reverter a reticulação;(e) digerir as seqüências de nucleotídeos com umaenzima de restrição secundária;
(f) circular as seqüências de nucleotídeos;
(g) amplificar uma ou mais seqüências de nucleotí-deos que são ligadas à seqüência de nucleotídeos alvo;
(i) hibridizar opcionalmente as seqüências ampli-ficadas para um arranjo; e
(h) determinar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA.
44. Um método para identificar uma ou mais intera-ções de DNA-DNA que são indicativas de um estado da doençaparticular que compreende as etapas de:
(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado de umacélula doente e um não doente;
(b) digerir o DNA reticulado em cada um das amos-tras com uma enzima de restrição primária;
(c) ligar as seqüências de nucleotídeos reticuladas;
(d) reverter a reticulação;
(e) digerir as seqüências de nucleotídeos com umaenzima de restrição secundária;
(f) circular as seqüências de nucleotídeos;
(g) amplificar uma ou mais seqüências que são li-gadas à seqüência de nucleotídeos alvo;
(h) hibridizar opcionalmente as seqüências de nu-cleotídeos amplificadas para um arranjo; e
(i) determinar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA,em que uma diferença entre o freqüência de intera-ção entre as seqüências de DNA das células doentes e não do-entes indica que a interação de DNA-DNA é indicativo de umestado de doença particular.
45. Um método de diagnóstico ou prognóstico de umadoença ou síndrome causada ou associada com uma mudança emuma interação de DNA-DNA que compreende as etapas de:
(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado de umsujeito;
(b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária;
(c) ligar o seqüências de nucleotideos reticuladas;
(d) reverter a reticulação;
(e) digerir as seqüências de nucleotideos com umaenzima de restrição secundária;
(f) circular as seqüências de nucleotideos;
(g) amplificar uma ou mais seqüências que são li-gadas à seqüência de nucleotideos alvo;
(h) hibridizar opcionalmente as seqüências ampli-ficadas de nucleotideos para um arranjo;
(i) determinar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA; e
(j) comparar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA com aquela de um controle não afetado;em que uma diferença entre o valor obtido do con-trole e o valor obtido do sujeito é indicativo que o sujeitosofre da doença ou sindrome ou é indicativo que o sujeitosofrerá da doença ou sindrome.
46. Um método de acordo com o parágrafo 45, em queuma transição das freqüências da interação baixa para alta éindicativa da localização de um ponto de ruptura.
47. Um método de acordo com o parágrafo 45 em queum padrão inverso de freqüências de interação de DNA-DNA pa-ra a amostra do sujeito comparado com o controle é indicati-vo de uma inversão.
48. Um método de acordo com o parágrafo 45 em queuma redução na interação de freqüência de DNA-DNA com a a-mostra do sujeito comparado com o controle, em combinaçãocom um aumento na interação de freqüência de DNA-DNA pararegiões mais distantes, é indicativa de deleção.
49. Um método de acordo com o parágrafo 45, em queum aumento ou uma diminuição na interação de freqüência deDNA-DNA com a amostra do sujeito comparado com o controle éindicativo de uma duplicação ou inserção.
50. Um método de acordo com qualquer um dos pará-grafos 45-49, em que cariotipagem espectral e/ou FISH é usa-do antes de realizar o dito método.
51. Um método de acordo com qualquer um dos pará-grafos 45-50, em que a doença é uma doença genética.
52. Um método de acordo com qualquer um dos pará-grafos 45-51, em que a doença é câncer.
53. Um método de diagnóstico ou prognóstico de umadoença ou sindrome causada ou associada com uma mudança emuma interação de DNA-DNA que compreende as etapas de:
(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado de umsujeito;
(b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária;
(c) ligar as seqüências de nucleotideos reticuladas;
(d) reverter a reticulação;
(e) digerir as seqüências de nucleotideos com umaenzima de restrição secundária;
(f) circular as seqüências de nucleotideos;
(g) amplificar duas ou mais seqüências que são li-gadas à seqüência de nucleotideos alvo(s);
(h) marcação o duas ou mais seqüências amplifica-das;
(i) hibridizar as seqüências de nucleotideos em umarranjo;
(j) determinar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA; e
(j) identificar um ou mais Ioci que foram submeti-dos a um ré-arranjo genômico que é associado com uma doença.
54. Um método de acordo com o parágrafo 53, em queas duas ou mais seqüências amplificadas são diferencialmentemarcadas.
55. Um método de acordo com o parágrafo 54, em queas duas ou mais seqüências amplificadas são identicamentemarcadas quando as seqüências residem em diferentes cromos-somos.
56. Um método de acordo com o parágrafo 53, em queas duas ou mais seqüências amplificadas são identicamentemarcadas quando as seqüências residem no mesmo cromossomo emuma distância que é grande o bastante para sobreposição mí-nima entre interação de sinais de DNA-DNA.
57. Um método de arranjo para identificar um oumais agentes que modulam uma interação de DNA-DNA que com-preende as etapas de:
(a) colocar em contato uma amostra com um ou maisagentes;
(b) fornecer DNA reticulado da amostra;
(c) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária;
(d) ligar as seqüências de nucleotídeos reticuladas;
(e) reverter a reticulação;
(f) digerir as seqüências de nucleotídeos com umaenzima de restrição secundária;
(g) circular as seqüências de nucleotídeos;
(h) amplificar uma ou mais seqüências de nucleotí-deos que são ligadas à seqüência de nucleotídeos alvo;
(i) hibridizar opcionalmente as seqüências ampli-ficadas de nucleotídeos para um arranjo; e
(j) determinar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA,
em que uma diferença entre (i) a freqüência de in-teração entre as seqüências de DNA na presença do agente e(ii) a freqüência de interação entre as seqüências de DNA naausência do agente é indicativo de um agente que modula ainteração de DNA-DNA.
58. Um método para detectar a localização de umponto de ruptura (por exemplo, uma translocação) que compre-ende as etapas de:
(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado;(b) di-gerir o DNA reticulado com uma enzima de restrição primária;
(c) ligar as seqüências de nucleotideos reticuladas ;
(d) reverter a reticulação;
(e) digerir as seqüências de nucleotideos com umaenzima de restrição secundária;
(f) circular as seqüências de nucleotideos;
(g) amplificar uma ou mais seqüências que são li-gadas à seqüência de nucleotideos alvo;
(h) hibridizar opcionalmente as seqüências ampli-ficadas de nucleotideos para um arranjo;
(i) determinar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA; e
(j) comparar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA com aquela de um controle;
em que um transição de baixa a alta interação defreqüência de DNA-DNA na amostra comparado com o controle éindicativo da localização de um ponto de ruptura.
59. Um método para detectar a localização de umainversão que compreende as etapas de:
(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado;
(b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária;
(c) ligar as seqüências de nucleotideos reticula-das ;
(d) reverter a reticulação;
(e) digerir as seqüências de nucleotideos com umaenzima de restrição secundária;
(f) circular as seqüências nucleotideos;
(g) amplificar uma ou mais seqüências que são li-gadas à seqüência de nucleotideos alvo;
(h} hibridizar opcionalmente as seqüências ampli-ficadas de nucleotideos para um arranjo;
(i) determinar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA; e
(j) comparar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA com a de um controle;
em que um padrão inverso de freqüências da intera-ção de DNA-DNA com a amostra comparado com o controle é in-dicativo de um inversão.
60. Um método para detectar a localização de umadeleção que compreende as etapas de:
(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado;
(b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária;
(c) ligar as seqüências de nucleotideos reticulada ;
(d) reverter a reticulação;
(e) digerir as seqüências de nucleotideos com umaenzima de restrição secundária;
(f) circular as seqüências de nucleotideos;
(g) amplificar uma ou mais seqüências que são li-gadas à seqüência de nucleotideos alvo;
(h) hibridizar opcionalmente as seqüências ampli-ficadas de nucleotideos com um arranjo;
(i) determinar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA; e
(j) comparar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA com a de um controle;
em que uma redução na interação de freqüência deDNA-DNA com a amostra comparado com o controle é indicativode deleção.
61. Um método para detectar a localização de umaduplicação que compreende as etapas de:
(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado;
(b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária;
(c) ligar as seqüências de nucleotideos reticuladas;
(d) reverter a reticulação,
(e) digerir as seqüências de nucleotideos com umaenzima de restrição secundária;
(F) circular as seqüências de nucleotideos;
(g} amplificar uma ou mais seqüências que são li-gadas à seqüência de nucleotideos alvo;
(h) hibridizar opcionalmente as seqüências ampli-ficadas de nucleotideos para um arranjo;
(i) determinar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA; e
(j) comparar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA com a de um controle;
em que um aumento ou uma diminuição em freqüênciade interação de DNA-DNA com a amostra do sujeito comparadocom o controle é indicativo de uma duplicação ou inserção.
62. Um agente obtido ou obtenivel pelo método dearranjo de acordo com o parágrafo 57.
63. Uso de uma seqüência de nucleotideos de acordocom qualquer um dos parágrafos 1-9 para identificar uma oumais interações de DNA-DNA em uma amostra.
64. Uso de uma seqüência de nucleotideos de acordocom qualquer um dos parágrafos 1-9 para o diagnóstico ouprognóstico de uma doença ou sindrome causada ou associadacom uma mudança em uma interação de DNA-DNA.
65. Uso de um arranjo de sondas de acordo com oparágrafo 18 ou o conjunto de sondas de acordo com qualquerum dos parágrafos 19-30 ou 33 para identificar uma ou maisinterações de DNA-DNA em uma amostra.
66. Uso de um arranjo de sondas de acordo com oparágrafo 18 ou o conjunto de sondas de acordo com qualquerum dos parágrafos 19-30 ou 33 para o diagnóstico ou prognós-tico de uma doença ou sindrome causada ou associada com umamudança em uma interação de DNA-DNA.
67. Uso de um arranjo, de acordo com qualquer umdos parágrafos 34-39 ou 42 para identificar uma ou mais in-terações de DNA-DNA em uma amostra.
68. Uso de um arranjo de acordo com qualquer umdos parágrafos 34-39 ou 42 para o diagnóstico ou prognósticode uma doença ou sindrome causada ou associada com uma mu-dança em uma interação de DNA-DNA.
69. Uso de acordo com qualquer um dos parágrafos 64, 66 ou 68, em que o diagnóstico ou prognóstico é diagnós-tico ou prognóstico pré-natal.
70. Um método substancialmente aqui descrito e comreferência a qualquer dos Exemplos ou Figuras.
71. Um arranjo de sondas substancialmente aquidescrito e com referência a qualquer dos Exemplos ou Figuras.
72. Um conjunto de sondas substancialmente aquidescrito e com referência a qualquer dos Exemplos ou Figuras.
73. Um processo substancialmente aqui descrito, ecom referência a qualquer dos Exemplos ou Figuras.
74.Um arranjo substancialmente aqui descrito e comreferência a qualquer dos Exemplos ou Figuras.
75. Um método de arranjo substancialmente aquidescrito e com referência a qualquer dos Exemplos ou Figuras.
76. Um agente substancialmente aqui descrito e comreferência a qualquer dos Exemplos ou Figuras.
77. Um uso substancialmente aqui descrito e comreferência a qualquer dos Exemplos ou Figuras.
Tabela 2
<table>table see original document page 174</column></row><table><table>table see original document page 175</column></row><table><table>table see original document page 176</column></row><table>
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Claims (66)

1. Método para analisar a freqüência de interaçãode uma seqüência de nucleotideos alvo com uma ou maisseqüências de nucleotideos de interesse (por exemplo, um oumais Ioci genômicos) , CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende as etapas de:(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado;(b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária;(c) ligar as seqüências de nucleotideosreticuladas;(d) reverter a reticulação;(e) digerir as seqüências de nucleotideos com umaenzima de restrição secundária;(f) ligar uma ou mais seqüências de DNA decomposição de nucleotideo conhecida ao(s) sitio(s) dedigestão de enzima de restrição secundária disponível(s) queflanqueia(m) uma ou mais seqüências de nucleotideos deinteresse;(g) amplificar uma ou mais seqüências denucleotideos de interesse usando pelo menos dois iniciadoresde oligonucleotídeo, em que cada iniciador hibridiza para asseqüências de DNA que flanqueiam as seqüências denucleotideos de interesse;(h) hibridizar a(s) seqüência(s) amplificada(s) emum arranjo; e(i) determinar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que a reação da ligação na etapa(f) resulta na formação de circulos de DNA.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência de nucleotideosalvo é selecionada do grupo que consiste em um rearranjogenômico, promotor, um intensificador, um silenciador, umisolante, uma região de anexação de matriz, uma região decontrole de locus, uma unidade de transcrição, uma origem dereplicação, um ponto quente de recombinação, um ponto deruptura de translocação, um centrômero, um telômero, umaregião densa em genes, uma região pobre em genes, umelemento repetitivo e um sitio de integração (viral).
4. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que aseqüência de nucleotideos alvo é uma seqüência denucleotideos que está associada com uma doença, ou causa amesma, ou é localizada até 15 Mb ou mais em um padrão de DNAlinear de um locus que é associado com uma doença, ou causaa mesma.
5. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que aseqüência de nucleotideos alvo é selecionada do grupo queconsiste em; AMLl, MLLf MYC, BCLf BCRf ABLlf IGHf LYLlfTALlf TAL2 f LMO 2 f TCRa/δ, TCRp e HOX ou outros Iociassociados com doença descritos em "Catalogue of UnbalancedChromosome Aberrations in Man" 2a edição. Albert Schiuzel.Berlin: Walter of Gzrryter, 2001. ISBN 3-11-011607-3.
6. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que aenzima de restrição primária é uma enzima de restrição quereconhece um sitio de reconhecimento de 6-8 bp.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6,CARACTERIZADO pelo fato de que a enzima de restriçãoprimária é selecionada do grupo que consiste em BglII,HindIIIf EcoRI, BamtiIf SpeIf PstI e NdeI.
8. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que aenzima de restrição secundária é uma enzima de restrição quereconhece um sitio de reconhecimento de seqüência denucleotideos de 4 ou 5 bp.
9. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que ositio de reconhecimento da enzima de restrição secundáriaestá localizado em mais que cerca de 350 bp do sitio derestrição primária na seqüência de nucleotideos alvo.
10. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que aseqüência de nucleotideos é marcada.
11. Método para analisar a freqüência de interaçãode uma seqüência de nucleotideos alvo com uma ou maisseqüências de nucleotideos (por exemplo, um ou mais Iocigenômicos), CARACTERIZADO pelo fato de que compreende asetapas de:(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado;(b) digerir o DNA reticulado com uma enzima derestrição primária;(c) ligar as seqüências reticuladas denucleotídeo;(d) reverter a reticulação;(e) digerir as seqüências de nucleotideos com umaenzima de restrição secundária;(f) circular as seqüências de nucleotídeo;(g) amplificar a uma ou mais seqüências denucleotideos que são ligadas à seqüência de nucleotideosalvo;(h) hibridizar opcionalmente as seqüênciasamplificadas em um arranjo; e(i) determinar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA.
12. Seqüência de nucleotideos circularizada,CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma primeira e umasegunda seqüência de nucleotídeo, em que cada extremidade daprimeira e da segunda seqüência de nucleotideos sãoseparadas por diferentes sítios de reconhecimento de enzimade restrição, e em que a dita primeira seqüência denucleotideos é uma seqüência de nucleotideos alvo e a ditasegunda seqüência de nucleotideos é obtenível por DNAgenômico reticulado.
13. Método para preparar uma seqüência denucleotideos circularizada, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende as etapas de:(a) fornecer uma amostra de DNA reticulado;(b) digerir o DNA reticulado com uma enzimarestrição primária;(c) ligar as seqüências de nucleotideosreticuladas;(d) reverter a reticulação;(e) digerir as seqüências de nucleotideos com umaenzima de restrição secundária; e(f) circular as seqüências de nucleotideo.
14. Método para analisar a freqüência de interaçãode uma seqüência de nucleotideos alvo com uma ou maisseqüências de nucleotideos (por exemplo, um ou mais Iocigenômicos), CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o usode uma seqüência de nucleotideos conforme definida nareivindicação 12.
15. Arranjo de sondas imobilizadas em um suporte,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma ou mais sondasque hibridizam ou são capazes de hibridizar para umaseqüência de nucleotideos conforme definida na reivindicação 12.
16. Conjunto de sondas, CARACTERIZADO pelo fato deque é complementar em seqüência à seqüência de ácidonucléico adjacente a cada um dos sítios de reconhecimentodas enzimas de restrição primária de uma enzima de restriçãoprimária no DNA genômico.
17. Conjunto de sondas, de acordo com areivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que as sondassão complementares em seqüência à seqüência de ácidonucléico adjacente a cada lado de cada um dos sítios dereconhecimento da enzima de restrição primária de uma enzimade restrição primária no DNA genômico.
18. Conjunto de sondas, de acordo com areivindicação 16 ou 17, CARACTERIZADO pelo fato de que asditas sondas são complementares na seqüência à seqüência deácido nucléico que está menos que 300 pares de base de cadaum dos sítios de reconhecimento da enzima de restriçãoprimária de uma enzima de restrição primária no DNAgenômico.
19. Conjunto de sondas, de acordo com qualquer umadas reivindicações 16-18, CARACTERIZADO pelo fato de que assondas são complementares à seqüência que está menos que 300bp de cada um dos sítios de reconhecimento da enzima derestrição primária de uma enzima de restrição primária noDNA genômico.
20. Conjunto de sondas, de acordo com qualquer umadas reivindicações 16-19, CARACTERIZADO pelo fato de que assondas são complementares à seqüência que está entre 200 e-300-bp de cada um dos sítios de reconhecimento da enzima derestrição primária de uma enzima de restrição primária noDNA genômico.
21. Conjunto de sondas, de acordo com qualquer umadas reivindicações 16-20, CARACTERIZADO pelo fato de que assondas são complementares à seqüência que está entre 100 e-200 bp ou 0 a 100 bp de cada um dos sítios de reconhecimentoda enzima de restrição primária de uma enzima de restriçãoprimária no DNA genômico.
22. Conjunto de sondas, de acordo com qualquer umadas reivindicações 16-21, CARACTERIZADO pelo fato de queduas ou mais sondas são capazes de hibridizar para aseqüência adjacente a cada sitio de reconhecimento da enzimade restrição primária de uma enzima de restrição primária noDNA genômico.
23. Conjunto de sondas, de acordo com areivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que as sondassobrepõem-se, ou sobrepõem-se parcialmente.
24. Conjunto de sondas, de acordo com areivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que asobreposição é de menos do que 10 nucleotideos.
25. Conjunto de sondas, de acordo com qualquer umadas reivindicações 16-24, CARACTERIZADO pelo fato de que aseqüência de sondas corresponde a toda ou parte da seqüênciaentre cada um dos sítios de reconhecimento da enzima derestrição primária de uma enzima de restrição primária ecada um dos primeiros sítios de reconhecimento de enzima derestrição secundária vizinhos de uma enzima de restriçãosecundária.
26. Conjunto de sondas, de acordo com qualquer umadas reivindicações 16-25, CARACTERIZADO pelo fato de quecada sonda está a pelo menos 25 mer.
27. Conjunto de sondas, de acordo com qualquer umadas reivindicações 16-2 6, CARACTERIZADO pelo fato de quecada uma das sondas está a 25-60 mer.
28. Processo para preparar um conjunto de sondas,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:(a) identificar cada um dos sítios dereconhecimento da enzima de restrição primária para umaenzima de restrição primária no DNA genômico;(b) projetar sondas que são capazes de hibridizarpara a seqüência adjacente a cada um dos sítios dereconhecimento da enzima de restrição primária no DNAgenômico;(c) sintetizar as sondas; e(d) combinar as sondas entre si para formar umconjunto de sondas, ou substancialmente um conjunto desondas.
29. Processo de acordo com a reivindicação 28,CARACTERIZADO pelo fato de que as sondas são produtos deamplificação PCR.
30. Conjunto de sondas, ou substancialmente umconjunto de sondas, CARACTERIZADO pelo fato de que é obtidoou obtenível pelo processo conforme definido nareivindicação 28 ou 20.
31. Arranjo, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende o arranjo de sondas de acordo com a reivindicação 15, substancialmente o conjunto de sondas conformedefinido em qualquer uma das reivindicações 16-27 ou 30.
32. Arranjo, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende o conjunto de sondas conforme definido emqualquer uma das reivindicações 16-27 ou 30.
33. Arranjo, de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADO pelo fato de que o arranjo compreende cerca de 300.000-400.000 sondas.
34. Arranjo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 32-33, CARACTERIZADO pelo fato de que oarranjo compreende cerca de 385.000 ou mais sondas,preferivelmente cerca de 750.000 sondas, maispreferivelmente 6 χ 750.000 sondas.
35. Arranjo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 31-34, CARACTERIZADO pelo fato de que oarranjo compreende ou consiste em uma representação dogenoma completo de uma dada espécie em baixa resolução.
36. Arranjo, de acordo com a reivindicação 35,CARACTERIZADO pelo fato de que uma de cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 sondas ordenadas em um padrão de cromossomolinear é contida no arranjo.
37. Processo para preparar um arranjo,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa deimobilizar em um suporte sólido substancialmente o arranjode sondas conforme definido na reivindicação 15, ousubstancialmente o conjunto de sondas conforme definido emqualquer uma das reivindicações 16-27 ou 30.
38. Processo para preparar um arranjo,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a etapa deimobilizar em um suporte sólido o arranjo de sondas conformedefinido na reivindicação 16, ou substancialmente o conjuntode sondas conforme definido em qualquer uma dasreivindicações 16-27 ou 30.
39. Arranjo, CARACTERIZADO pelo fato de que éobtido ou obtenivel pelo método conforme definido nareivindicação 37 ou 38.
40. Método para identificar uma ou mais interaçõesde DNA-DNA que são indicativas de um estado da doençaparticular, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende aetapa de realizar as etapas (a)-(i) conforme definidas nasreivindicações 1-11, em que na etapa (a) uma amostra de DNAreticulado é fornecida de uma célula doente e uma nãodoente, e em que uma diferença entre a freqüência deinteração entre as seqüências de DNA das células doente enão doente indica que a interação de DNA-DNA é indicativa deum estado de doença particular.
41. Método de diagnóstico ou prognóstico de umadoença ou sindrome causada ou associada com uma mudança emuma interação de DNA-DNA, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende a etapa de realizar as etapas (a)-(i) conformedefinidas nas reivindicações 1-11, em que a etapa (a)compreende fornecer uma amostra de DNA reticulado de umsujeito; e em que a etapa (i) compreende comparar afreqüência de interação entre as seqüências de DNA com a deum controle não afetado; em que uma diferença entre o valorobtido do controle e o valor obtido do sujeito é indicativaque o sujeito sofre da doença ou sindrome ou é indicativaque o sujeito sofrerá da doença ou sindrome.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41,CARACTERIZADO pelo fato de que uma transição de freqüênciade interação baixa para alta é indicativa da localização deum ponto de ruptura equilibrado e/ou desequilibrado.
43. Método, de acordo com a reivindicação 41,CARACTERIZADO pelo fato de que um padrão inverso defreqüências da interação de DNA-DNA para a amostra dosujeito comparado com o controle é indicativa de um inversãoequilibrada e/ou desequilibrada.
44. Método, de acordo com a reivindicação 41,CARACTERIZADO pelo fato de que uma redução na freqüência deinteração de DNA-DNA para a amostra do sujeito comparada como controle, em combinação com um aumento na freqüênciainteração de DNA-DNA para regiões mais distantes, éindicativa de uma deleção equilibrada e/ou desequilibrada.
45. Método, de acordo com a reivindicação 41,CARACTERIZADO pelo fato de que um aumento ou uma diminuiçãona freqüência interação de DNA-DNA para a amostra do sujeitocomparado com o controle é indicativo de uma duplicação ouinserção equilibrada e/ou desequilibrada.
46. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 41-45, CARACTERIZADO pelo fato de quecariotipagem espectral e/ou FISH é usado antes de realizar odito método.
47. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 41-46, CARACTERIZADO pelo fato de que adoença é uma doença genética.
48. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 41-47, CARACTERIZADO pelo fato de que adoença é câncer.
49. Método de diagnóstico ou prognóstico de umadoença ou sindrome causada ou associada com uma mudança emuma interação de DNA-DNA, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende a etapa de: realizar as etapas (a)-(i) conformedefinidas nas reivindicações 1-11, em que a etapa (a)compreende fornecer uma amostra de DNA reticulado de umsujeito; e em que o dito método compreende a etapa adicionalde: (j) identificar um ou mais Ioci que foram submetidos aum rearranjo genômico que é associado com uma doença.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49,CARACTERIZADO pelo fato de que as duas ou mais seqüênciasamplificadas são diferencialmente marcadas.
51. Método, de acordo com a reivindicação 49,CARACTERIZADO pelo fato de que as duas ou mais seqüênciasamplificadas são identicamente marcadas quando as seqüênciasresidem em diferentes cromossomos.
52. Método, de acordo com a reivindicação 49,CARACTERIZADO pelo fato de que as duas ou mais seqüênciasamplificadas são identicamente marcadas quando as seqüênciasresidem no mesmo cromossomo a uma distância que é grande obastante para mínima sobreposição entre sinais de interaçãode DNA-DNA.
53. Método de arranjo para identificar um ou maisagentes que modulam uma interação de DNA-DNA, CARACTERIZADOpelo fato de que compreende as etapas de:(a) colocar em contato uma amostra com um ou maisagentes; e(b) realizar as etapas (a) a (i) conformedefinidas nas reivindicações 1-11, em que a etapa (a)compreende fornecer DNA reticulado da amostra;em que uma diferença entre (i) a freqüência deinteração entre as seqüências de DNA na presença do agente e(ii) a freqüência de interação entre as seqüências de DNA naausência do agente é indicativa de um agente que modula ainteração de DNA-DNA.
54. Método para detectar a localização de um pontode ruptura equilibrado e/ou desequilibrado (por exemplo, umatranslocação), CARACTERIZADO pelo fato de compreender asetapas de:(a) realizar as etapas (a) a (i) conformedefinidas nas reivindicações 1-11; e(b) comparar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA com a de um controle;em que uma transição da freqüência de interação deDNA-DNA baixa para alta na amostra comparada com o controleé indicativa da localização de um ponto de ruptura.
55. Método para detectar a localização de umainversão equilibrada e/ou desequilibrada, CARACTERIZADO pelofato de que compreende as etapas de:(a) realizar as etapas (a) a (i) conformedefinidas nas reivindicações 1-11; e(b) comparar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA com a de um controle;em que um padrão inverso de freqüências deinteração de DNA-DNA para a amostra comparadas com ocontrole é indicativo de um inversão.
56. Método para detectar a localização de umdeleção, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:(a) realizar as etapas (a) a (i) conformedefinidas nas reivindicações 1-11; e(b) comparar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA com a de um controle;em que uma redução na freqüência de interação deDNA-DNA para a amostra comparada com o controle é indicativade deleção.
57. Método para detectar a localização de umduplicação, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende asetapas de:(a) realizar as etapas (a) a (i) conformedefinidas nas reivindicações 1-11; e(b) comparar a freqüência de interação entre asseqüências de DNA com a de um controle;em que um aumento ou uma diminuição na freqüênciade interação de DNA-DNA para a amostra do sujeito comparadocom o controle é indicativo de uma duplicação ou inserção.
58. Agente, CARACTERIZADO pelo fato de que éobtido ou obtenivel pelo método de arranjo, conformedefinido na reivindicação 53.
59. Uso da seqüência de nucleotideo, conformedefinida na reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de queé para identificar uma ou mais interações de DNA-DNA em umaamostra.
60. Uso da seqüência de nucleotideo, conformedefinida na reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de queé para o diagnóstico ou prognóstico de uma doença ousindrome causada ou associada com uma mudança em umainteração de DNA-DNA.
61. Uso do arranjo de sondas, conforme definido nareivindicação 15, ou do conjunto de sondas, conformedefinido em qualquer uma das reivindicações 16-27 ou 30,CARACTERIZADO pelo fato de que é para identificar uma oumais interações de DNA-DNA em uma amostra.
62. Uso do arranjo de sondas, conforme definido nareivindicação 15, ou do conjunto de sondas, conformedefinido em qualquer uma das reivindicações 16-27 ou 30,CARACTERIZADO pelo fato de que é para o diagnóstico ouprognóstico de uma doença ou sindrome causada ou associadacom uma mudança em uma interação de DNA-DNA.
63. Uso do arranjo, conforme definido em qualqueruma das reivindicações 31-36 ou 39, CARACTERIZADO pelo fatode que é para identificar uma ou mais interações de DNA-DNAem uma amostra.
64. Uso do arranjo, conforme definido em qualqueruma das reivindicações 31-36 ou 39, CARACTERIZADO pelo fatode que é para o diagnóstico ou prognóstico de uma doença ousindrome causada ou associada com uma mudança em umainteração de DNA-DNA.
65. Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 61, 63 e 65, CARACTERIZADO pelo fato de que odiagnóstico ou prognóstico é diagnóstico ou prognóstico pré-natal.
66. Método, um arranjo de sondas, um conjunto desondas, um processo, um arranjo, um método de ensaio, umagente ou um uso, CARACTERIZADO pelo fato de que ésubstancialmente da forma aqui descrita e com referência aqualquer dos Exemplos ou Figuras.
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