BRPI0611821A2 - nanossensor para diagnóstico, método para produzir o mesmo, uso do mesmo, método de detecção - Google Patents

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Abstract

NANOSSENSOR PARA DIAGNóSTICO, MéTODO PARA PRODUZIR O MESMO, USO DO MESMO, MéTODO DE DETECçãO. Esta invenção refere-se geralmente à tecnologia de biossensores, e refere-se mais particularmente a biossensores multifuncionais novos baseados em conjuntos ordenados de nanoilhas magnéticas, semicondutoras e metálicas para aplicações médicas, biológicas, bioquímicas, químicas e ambientais.

Description

NANOSSENSOR PARA DIAGNOSTICO, MÉTODO PARA PRODUZIR O MESMO, USO DO MESMO, MÉTODO DE DETECÇÃO
DESCRIÇÃO
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção refere-se geralmente à tecnologia de biossensores, e refere-se mais particularmente a biossensores multifuncionais novos baseados em conjuntos ordenados de nanoilhas magnéticas, semicondutoras e metálicas para aplicações médicas, biológicas, bioquímicas, químicas e ambientais.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A ciência e a engenharia da escala nano mostraram grande compromisso com a fabricação de novos biossensores com resposta mais rápida e maior sensibilidade do que aquela de configurações de sensores planares, devido a suas dimensões pequenas combinadas com uma superfície de contato aumentada dramaticamente e forte ligação com reagentes químicos e biológicos. Tais biossensores têm aplicações importantes na medicina, na pesquisa biológica e bioquímica, assim como para o monitoramento e proteção ambiental e na indústria alimentícia.
Nos últimos anos a tecnologia da nanopartícula tem sido usada para construir sensores e biossensores químicos para detectar vários analitos de contaminadores no ar para a presença de segmentos de DNA particulares no sangue e em outras amostras.
Nanopartículas de metal encapsuladas poderiam ser funcionalizadas com tipos diferentes de ligantes para dar um sensor químico que usa mudanças nas características elétricas da nanopartícula de metal e deste modo poderia funcionar como um nariz eletrônico para a fase de gás ou uma língua eletrônica para a fase líquida como é descrito, por exemplo, na US 2005/0142030.
Além do mais, o WO 2004/086044 descreve que nanopartículas de prata ou nanopartículas de ouro poderiam servir como nanossensores de um modo ou de outro se aumentadas em tamanho e funcionalizadas adequadamente. Entretanto, para tirar vantagem completa das características físicas de partículas de tamanho pequeno tal como para espectroscopia de ressonância de plásmon de superfície localizada (LSPR) como método de detecção, estas partículas precisam ter tamanho e características físicas uniformes e/ou precisam ser organizadas geometricamente uniformes em substratos.
Uma outra limitação das nanopartículas de metal como descrito nos documentos mencionados acima é sua produção por meio de síntese química molhada. Este tipo de produção inabilita o controle preciso sobre o tamanho e forma da partícula e não permite imobilizaçáo uniforme das partículas nos substratos.
Mais recentemente, substâncias químicas e biossensores utilizando nanotubos, tais como nanotubos de carbono de parede única ou parede múltipla foram apresentados. Tais sensores foram produzidos usando técnicas de fabricação semicondutoras convencionais para fornecer nanotubos orientados na horizontal ou não-horizontal ou fios em superfícies sólidas como é descrito no WO 2005/031299 ou no WO 2005/093831. Entretanto, técnicas de fabricação semicondutoras convencionais não permitem a organização geométrica de nanoestruturas em superfícies sólidas como técnicas litográficas fazem.
A litografia como técnica para a produção de superfícies nanoestruturadas existe em vários tipos. Um tipo de litografia é a litografia de feixe de elétrons e tem sido usada, por exemplo, na FR 2 860 872 para criar uma distribuição de "porções" elipsoidais ou circulares em uma superfície de duas dimensões, ou para ela. Uma grande desvantagem desta técnica é que ela é muito dispendiosa.
A eletrodeposição de nanopartículas em nanotubos ou fios como é descrito na US 2005/0157445 fornece dispositivos elétricos miniaturizados mas precisam de elementos condutores. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
O objetivo primário desta invenção é endereçar a nova tecnologia de biossensor multifuncional baseada em semicondutores metálicos e nanoilhas magnéticas e conjuntos de nanoilhas fornecendo um novo nanossensor para fins diagnósticos em medicina, pesquisa biológica e bioquímica, assim como em monitoramento e proteção ambiental e na indústria alimentícia. A superfície das nanopartículas pode ser funcionalizada com material interativo bioorgânico que devido a sua especificidade interage seletivamente com outras moléculas. Ao controlar quimicamente a superfície das nanopartículas, elas podem ser "programadas" para reconhecer e ligar moléculas, outras nanopartículas (semicondutoras) ou uma superfície de substrato adequadamente sistematizada seletivamente como a membrana externa celular.
Particularmente, é um objetivo desta invenção fornecer nanotransdutores baseados em nanoilhas de metal nobre através de estímulos ressoantes das oscilações coletivas da condução de elétrons nas nanoilhas, as chamadas ressonâncias de plásmon de superfície. Este fenômeno pode ser ligado ao evento de ligação entre os receptores e seus alvos. A condutividade elétrica altamente aperfeiçoada destes nanotransdutores traduz em sensitividade sem precedente e possibilitam o projeto de novos dispositivos de sensor para a detecção de patogenias e toxinas de interesse, para a segurança da pátria, segurança da alimentação, segurança ambiental, e saúde pública.
O uso de nanoilhas metálicas nobres resulta em transdução de sinais aumentada do evento de ligação entre o material interativo bioorgânico e suas substâncias alvo e levam a um aumento em sensitividade do nano-biossensor em termos de limite inferior e variação dinâmica de detecção.
A presente invenção supera as seguintes limitações da técnica anterior:
- alto custo de produção tal como em litografia de feixe de elétrons e em eletrodeposição; - distribuição/imobilização irregular de nanopartículas, tubos ou fios em substratos como em técnicas de fabricação de semicondutores convencionais;
- tamanho e forma irregulares de partículas devido a síntese da química molhada.
A presente invenção fornece nanotriângulos metálicos nobres restringidos a superfície em que são distribuídos em geometria hexagonal, e a dimensão desta geometria hexagonal pode ser variada por meio de litografia de nanoesfera (NSL).
Além disso, nanotriângulos restringidos a superfície, nanoesferas restringidas a superfície e nanomorfologias horizontais em formato de haste podem ser obtidas de nanotriângulos por meio de um processo de sinterização adicional. 0 mecanismo de transdução de sinal do nanossensor para diagnóstico de acordo com a invenção é baseado em sua sensitividade as mudanças do índice de refração locais como uma função de nanoestruturas metálicas nobres restringidas a superfície, controladas em forma e tamanho, periódicas. 0 nanossensor de acordo com a invenção devido à distribuição periódica demonstra ser suficientemente sensível para a detecção de níveis ultrabaixos de biomarcadores em fluidos fisiológicos. Além disso, o nanossensor mostra interações não-específicas mínimas após a bioconjugação, e permite a análise de espécies biológicas em um ambiente isento de agentes tensoativos. Isto é extremamente importante porque a ausência de um agente tensoativo permite que espécies biológicas sejam analisadas em seu estado nativo.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Um conjunto altamente periódico de nanoilhas metálicas agindo como nanotransdutores forma uma estrutura integral nova chamada de um "Nanossensor para Diagnóstico". Este "Nanossensor para Diagnóstico" é depositado em um dispositivo que poderia ter a forma de uma agulha ou fio ou tubo ou chip e feito de material transparente (vidro, safira) ou não- transparente (substratos de silício, aço inoxidável, polímeros biocompatíveis). O "Nanossensor para Diagnóstico" é feito usando-se litografia de nanoesfera (NSL) para criar nanoilhas metálicas. Esta técnica permite o controle total do tamanho e formato da parte funcional do nanossensor. Um aspecto importante nos espectros óticos das nanoilhas ou das partículas de metal de tamanho nano (Ag, prata; Au, ouro) é a banda do plásmon de superfície. A banda do plásmon de superfície é devida à oscilação de elétrons coletiva ao redor do modo de superfície das partículas. Por exemplo, nanopartículas Ag têm uma forte absorção em torno de 390nm enquanto as nanopartículas Au têm a banda do plásmon em torno de 520 nm. A posição de pico e largura da banda da absorção de plásmon da superfície são relacionadas ao tamanho e formato. Para nano-hastes de ouro, entretanto, o espectro de absorção muda dramaticamente e um espectro bimodal pode ser detectado com posição de pico dependente da relação do aspecto das nano-hastes.
A modificação subseqüente das superfícies nanoestruturadas de um cateter ou um arame para molas com material interativo bioorgânico é apresentada como um exemplo na figura 10. Esta etapa e especialmente a ligação do DNA, outras moléculas ou células nas superfícies de partículas leva a uma mudança na constante dielétrica deste sistema e pode facilmente ser detectada pelo método ótico. 0 Nanossensor para Diagnóstico alcança resolução espacial de escala nanométrica e, portanto, fornece informação em tempo real precisa em relação não somente a concentração de um analito específico de natureza orgânica ou inorgânica, mas também sua distribuição espacial. A operação de sensores feita com nanofios, nanotubos ou nanocontatos é baseada principalmente na mudança reversível nas propriedades eletrônicas e óticas.
Em geral a sensitividade e especificação do Nanossensor para diagnóstico de acordo com a invenção são baseadas no efeito de tamanho quanta e pode ocorrer com a diminuição do tamanho das nanopartículas de acordo com a invenção.
O "Nanossensor para Diagnóstico" desta invenção pode ser usado para detectar materiais biológicos, tais como proteínas, carboidratos, ou ácidos nucléicos ou células assim como materiais não-biológicos, tais como polímeros sintéticos ou nanopartículas não-orgânicas. 0 "Nanossensor para Diagnóstico" poderia ser usado sob condições in vivo como também in vitro.
A presente invenção considera a funcionalização das nanoestruturas metálicas nobres restringidas a superfície com a longa cadeia de ligadores cruzados hetero-bifuncionais. Os ligadores cruzados possibilitam a bioconjugação estável das nanoestruturas metálicas nobres restringidas a superfície com anticorpos específicos.
0 nanossensor devido a sua distribuição periódica demonstra ser suficientemente sensível para a detecção de níveis ultrabaixos de biomarcadores em fluidos fisiológicos. Além do mais, o nanossensor mostra interações não-específicas mínimas após a bioconjugação, e permite a análise de espécies biológicas em um ambiente isento de agentes tensoativos. Isto é extremamente importante porque a ausência de um agente tensoativo permite que espécies biológicas sejam analisadas em seus estados nativos. Estes três aspectos importantes da presente invenção não são conhecidos do estado da técnica.
VANTAGENS DA INVENÇÃO
Na área humana e biomédica existe uma necessidade de melhor detecção e diagnose. Os materiais em escala nano são insaciáveis para produzir novos dispositivos de diagnóstico e detecção. Na escala de comprimento nanométrico, os materiais exibem propriedades novas como limitação de tamanho quântico. Suas propriedades de superfície se tornam importante de modo crescente. Nanopartículas feitas de metais (ouro, prata, etc.), semicondutores (CdS, CdTe, CdSe, Si, etc) ou partículas (superpara-)magnéticas formam uma plataforma ideal para materiais em escala nano funcionalizados. 0 tamanho das partículas pode ser variado de alguns nanômetros até 100 nm. 0 tamanho da partícula pequeno implica em alta sensitividade e seletividade se elas pudessem ser mais funcionalizadas pela deposição precisa de material interativo bioorgânico para a ligação de um dado analito.
O "Nanossensor para Diagnóstico" de acordo com a invenção é feito pelo uso de litografia de nanoesfera (NSL) para criar nanoilhas metálicas. Esta técnica permite o controle total de tamanho e formato da parte funcional do nanossensor abaixo de medidas inferiores a 10 nm. Deposições subseqüentes de material interativo bioorgânico nas nanoestruturas fornecem um dispositivo sanduíche para interagir com alvos orgânicos e inorgânicos. Porque a sensitividade e especificação de qualquer biossensor dependem do tamanho de uma dada unidade de sensor, a invenção descrita aqui permite sensitividades bem abaixo da variação pmol. Em geral, o Nanossensor para diagnóstico de acordo com a invenção é baseado no efeito de tamanho quântico/quantas e pode ser regulado com a diminuição do tamanho de nanoparticulas utilizadas que são depositadas em vários materiais de apoio e são subseqüentemente funcionalizadas com material interativo bioorgânico para fornecer um dispositivo sanduíche para interagir com alvos orgânicos ou inorgânicos.
Montando o "Nanossensor para Diagnóstico" em apoios biocompatíveis como material de cateter ou arame para molas como é usado na medicina o "Nanossensor para Diagnóstico" provê um cateter especial de célula/molecular que poderia ser usado para fins diagnósticos in vivo. Como tal o "Nanossensor para Diagnóstico" de acordo com a invenção é para a detecção direta e isolamento de moléculas raras ou células fora do sangue periférico ou do corpo. Esta técnica de aplicação capacita procedimentos diagnósticos que não eram possíveis antes: diagnose pré-natal de aberração de cromossomos usando trofoblastos fetais presentes na circulação maternal; diagnose de câncer e monitoramento da terapia de câncer baseada na detecção de células de câncer disseminadas no corpo.
O "Nanossensor para Diagnóstico" de acordo com a invenção permite a detecção de uma interação resultante entre o material interativo bioorgânico e a substância alvo pela medida das oscilações coletivas da condução de elétrons nas nanoilhas, a chamada ressonância de plásmon de superfície, ou detecção de propriedades óticas de partículas semicondutoras (luminescência) ou as propriedades superparamagnéticas pelas partículas magnéticas. Estes métodos de detecção possibilitam o uso do wNanossensor para Diagnóstico" de acordo com a invenção em ação, isto é, sem a infra-estrutura de um laboratório. Deste modo, o "Nanossensor para Diagnóstico" poderia ser usado ao lado da cama, em uma sala cirúrgica, na ambulância, e no campo de batalha.
O tratamento de superfície de Nanossensores com NSC leva a resultados surpreendentes:
- saída do caminho trilhado
- uma nova percepção do problema
- satisfação de uma necessidade ou desejo de longa data.
- até agora todos os esforços de especialistas foram em vão
- a simplicidade de uma solução prova a ação inventiva, especialmente se ela substitui uma doutrina mais complexa
- o desenvolvimento de tecnologia científica movida em uma outra direção
- a realização incentiva o desenvolvimento
- concepções errôneas sobre a solução de acordo com o problema (preconceito)
progresso técnico, tal como: aperfeiçoamento, desempenho aumentado, redução de preço, poupança de tempo, material, etapas de trabalho, custos dos recursos que são difíceis de obter, confiabilidade melhorada, correção dos defeitos, qualidade melhorada, nenhuma manutenção, eficiência aumentada, melhor rendimento, aumento de possibilidades técnicas, provisão de um outro produto (não necessariamente melhor), abertura de um segundo caminho (não necessariamente melhor), abertura de um novo campo, primeira solução para uma tarefa, produto reserva, alternativas, possibilidade de racionalização, automação ou miniaturização ou enriquecimento do fundo farmacêutico
- escolha especial (se uma certa possibilidade, o resultado da qual era imprevisível, é escolhida entre um grande número de possibilidades, ela é uma escolha com sorte patenteável)
- erro em uma citação
- campo jovem de tecnologia
- invenção combinada; uma combinação de um número de elementos conhecidos, com um efeito surpreendente
- licenciamento
- elogio de especialistas e
- sucesso comercial
O método para a produção do nanossensor para diagnóstico compreende dois procedimentos separados, mas inter- relacionados:
(1) a produção de conjuntos periódicos de nanoestruturas.
(2) conjuntos nanoestruturados funcionalizantes usando material interativo bioorgânico que poderia ser ligado aos conjuntos diretamente ou indiretamente através de tecnologias de ligação.
(1)
Para produzir conjuntos periódicos de nanoestruturas, um método relativamente barato e simples de litografia de nanoesferas ou nanopartículas (NSL) será usado para a criação de automòntagem de objetos esféricos periódicos ou quase periódicos como poliestireno ou partículas de sílica com um diâmetro na variação de 200 até 2000 nm (figura la) . As partículas ordenadas de modo bi ou tridimensional(2-D, 3-D) serão usadas como uma máscara para a seguinte deposição de várias quantidades de metais diferentes (Au, Ag, Pt) ou semicondutores (CdS, CdTe, CdSe). Após o processo de evaporação o levantamento da máscara será executado. Os conjuntos de partículas variantes metálicas 2-D(figura lb) ou 3-D permitem o controle da distância entre as nanopartículas assim como sua ordenação cúbica, hexagonal ou mais complicada. A quantidade de materiais depositados através da máscara pode determinar diretamente suas propriedades eletrônicas e óticas.
A produção de conjuntos periódicos de nanoestruturas envolve as seguintes etapas:
a) Produção de uma máscara bidimensional que consiste em partículas de poliestireno monodispersas esféricas de tamanhos de 200 nm até 7000 nm. Esta produção envolve a agregação controlada das partículas entre solventes de comportamento de superfície diferente para a estruturação precisa da máscara bidimensional. A morfologia final da máscara é determinada usando tratamento mecânico e temperatura para fornecer triângulos, raízes, pontos e outros.
b) Deposição da máscara em substratos planares (placas ou chip) ou substratos não-planares (cateteres, arames para molas, stents). Os substratos poderiam ser biocompatíveis para aplicações in vivo do sensor.
c) Evaporação de metais nobres, semicondutores ou materiais magnéticos (ouro, platina, prata, CdSe, CdTe, Cobalto, níquel) através da máscara.
d) Dissolução da máscara por temperatura ou tratamento químico.
(2)
Para funcionalizar conjuntos nanoestruturados, material interativo bioorgânico é ligado a superfícies dos conjuntos usando várias estratégias. Estas estratégias incluem o padrão de interação estreptavidina-biotina como é mostrado na figura 7. Também é incluída a ligação direta de anticorpos (monoclonais) como IgG ou fragmentos dele a superfície do conjunto por meio de adesão ou interação eletrostática. Em acréscimo, a ligação covalente de estruturas moleculares com alvo específico como anticorpos ou fragmentos deles, oligômeros feitos de ácidos nucléicos, ou peptídeos ou glicopeptídeos poderiam ser executados usando a tecnologia de ligação como é descrito no exemplo detalhado abaixo. A última técnica permite a ligação precisa de moléculas de alvo especifico a nanoilhas dando resolução espacial em escala de nanômetro e, portanto, fornece informação em tempo real precisa considerando não somente a concentração de um analito especifico, mas também sua distribuição espacial.
O "Nanossensor para Diagnóstico" é para aplicação médica, para pesquisa bioquímica e biológica, assim como para proteção e monitoramento ambiental e segurança alimentícia. Em relação a aplicação médica, o "Nanossensor para Diagnóstico" é montado como um dispositivo para uso (1) in vivo e (2) in vitro.
(1) : O "Nanossensor para Diagnóstico" para uso in vivo
Para o dispositivo in vivo "Nanossensor para Diagnóstico" é montado em arame para molas permitindo que um cateter especial de célula ou molecular obtenha componentes celulares ou moleculares raros diretamente da circulação ou do corpo em geral (figura 9).
Como dispositivo para aplicação in vivo o "Nanossensor para Diagnóstico" montado, por exemplo, em arames para molas fornece um cateter especial molecular ou de célula que é útil para a diagnose pré-natal de aberrações de cromossomos, diagnose de câncer e o monitoramento de doenças crônicas como o câncer, doenças metabólicas, infecciosas, alérgicas e inflamatórias. Este dispositivo é usado conforme a descrição abaixo.
a) Puncionar um vaso sangüíneo (veia ou artéria) usando uma agulha profunda.
b) Colocar o nanossensor através da agulha profunda ou através de uma linha venosa padrão dentro do vaso sangüíneo como é mostrado na figura 9.
c) Substituir a agulha mas mantendo o nanossensor no lugar.
d) Após o tempo de incubação apropriado (entre 5 a 60 minutos) o nanossensor é substituído pelas moléculas e/ou células fixadas para processamento posterior.
Como um cateter especial de célula o "Nanossensor para Diagnóstico" de acordo com a invenção é para o isolamento de células raras do sangue periférico, por exemplo, trofoblastos. Trofoblastos são células fetais que aparecem no sangue materno em torno da sétima semana gestacional em uma concentração de cerca de 1-2 per ml. 0 cateter especial da célula equipado com um anticorpo monoclonal que é direcionado diante de ligas HLA-G celulares mas não solúveis circulando especificamente trofoblastos no sangue materno. O número de células confinadas ao cateter especial de células depende do período de retenção na circulação materna e da concentração de células efetivas. Números apropriados de trofoblastos para a diagnose pré-natal de aberração de cromossomos e outros defeitos genéticos poderiam ser coletados após um período de retenção de 30± minutos in vivo. Após a substituição do cateter a ponta do cateter com as células fixadas é colocada em um tubo coletor para o transporte para laboratórios especializados.
(2): O "Nanossensor para diagnóstico para o uso in vitro
Para o dispositivo in vitro o "Nanossensor para Diagnóstico" é montado em apoio transparente e planar para fornecer "um laboratório em um chip" permitindo determinação dos alvos quantitativa e qualitativa pela medição das freqüências da ressonância de plásmon nas superfícies nanoestruturadas ou luminescência ou propriedades magnéticas dependendo do material que é depositado sobre o apoio usando litografia de nanoesfera.
Como dispositivo para aplicação in vitro o "Nanossensor para Diagnóstico" é para procedimentos diagnósticos "em ação"(por exemplo, na mesa de cabeceira, no centro cirúrgico, na ambulância ou no campo de batalha)que deveria ser usado como descrito abaixo.
De acordo com o efeito de restrição do tamanho quântico partículas metálicas de tamanho nano mostram espectros de absorção ótica diferentes dependendo do tamanho. A banda do plásmon de superfície é devida à oscilação de elétrons coletiva ao redor da superfície das partículas. Por exemplo, nanopartículas Ag (prata) têm banda do plásmon de superfície ao redor de 390 nm enquanto partículas Au têm a banda do plásmon ao redor de 520 nm. A posição de pico, intensidade e largura da banda da absorção de plásmon de superfície estão diretamente relacionadas ao tamanho, morfologia (formato), e funcionalidade da superfície das partículas (veja figuras 11 e 12).
Pela cobertura de conjuntos bidimensionais de partículas de ouro com avidina seus picos de plásmon mudam em direção ao comprimento de onda mais longo e podem ser facilmente detectados como é mostrado na figura 12.
A invenção pode ser mais ilustrada pelos seguintes exemplos:
Exemplo 1:
A ordenação bidimensional de partículas de látex como uma base para a litografia de nanoesfera (NSL) foi usada por nós e por outros no passado S2,3,4,5,6,7,8. A evaporação ou crepitação de materiais diferentes através de uma máscara de partículas de látex possibilita a produção de treliças de ilhas triangulares em vários substratos, o formato das ilhas sendo determinado pelo formato da abertura entre as esferas na máscara. Claramente, o tamanho da abertura entre as esferas depende do tamanho das gotas na monocamada. Para superar esta limitação, nós fortalecemos a monocamada para reduzir o tamanho das aberturas na máscara de um inicial de 200 nm para 30 nm. Este resultado foi muito além de nossas expectativas, e foi essencial para a fabricação de partículas de nanopontos (figura 6) e nanoanéis isolados (figura 7).
Em nosso trabalho recente nós demonstramos que se a amostra está se movendo durante o processo de deposição, as estruturas evaporadas podem se tornar muito mais complexas e variar de estruturas em formas esféricas a hastes e fios. 9 Agora nós aperfeiçoamos mais a nossa técnica. As melhorias envolvem a diminuição do tamanho das aberturas entre as partículas pelo tratamento com temperatura aplicado a máscara de nanoesfera antes do processo de evaporação e o uso de material diferente em tamanho nanométrico para a deposição em vários apoios.
1. Preparação da Máscara de Nanoesfera
Um pedaço de silício, aço inoxidável, vidro ou substrato de safira (1 cm2) poderia ser usado para a deposição de partículas de látex de poliestireno (PS). Nesta primeira etapa, as partículas de látex (diâmetro= 540 nm) em solução de etanol/água são vagarosamente aplicadas a superfície da água em uma travessa Petri de 15 cm usando uma pipeta de vidro. A quantidade de solução que poderia ser distribuída para cobrir a superfície completa da água com uma monocamada envolvida condensada hexagonal pl8 (hcp) é limitada pelo tamanho da travessa Petri e o diâmetro das esferas. Cerca de 70% desta quantidade de solução é aplicada a superfície da água, o que deixou alguns lugares para relaxamento da tensão e evitou a formação de rachaduras na treliça durante as próximas etapas da preparação. Neste estágio a monocamada tem os maiores cristais de aproximadamente 2 cm2, com formatos muito irregulares. Para promover o crescimento de cristais grandes, ondas suaves são aplicadas ao meio líquido por uma inclinação do vaso cuidadosa e vagarosa. Após este tratamento, cristais de aproximadamente 25 cm2 são criados para mostrar cores de difração claras. Finalmente, a monocamada é depositada em um substrato pela evaporação vagarosa de água.
2. Recozimento
Após o processo de secagem, o recozimento das máscaras é realizado. A monocamada de nanoesferas de látex 540-nm PS em um substrato Si condutivo é imersa em uma mistura (25 ml) de água/etanol/acetona (3:1:1). O aquecimento por microondas é usado até a temperatura de ebulição da mistura, então pulsos de microondas adicionais são aplicados com a duração de 3 s e período de 28 s. O aumento do número de pulsos causa o recozimento gradual da máscara e uma diminuição do tamanho das aberturas. A dependência da morfologia da abertura nos números de pulsos é apresentada na figura 2. O ambiente liquido da amostra assegurou recozimento bastante homogêneo - os tamanhos das características se tornam uniformes sobre toda a área da amostra. 0 controle do tamanho da abertura foi muito bom e reproduzivel. Com a monocamada de látex 540-0s nós fomos capazes de ajustar o tamanho da abertura de um tamanho inicial de 200 nm até 25 nm (figuras 2 e 3) . As máscaras fortalecidas têm espessuras diferentes - quanto mais a amostra é fortalecida, mais plana e fina ela é.
3. Deposição de Metal
A deposição de metal é realizada por evaporação usando um evaporador de feixe-e. O sistema de evaporação é modificado para assegurar controle sobre o ângulo de evaporação (è) e a rotação de amostra ao mesmo tempo (figura 4.)
4. Preparação de Nanoestruturas com Morfologia Diferente
Uma máscara fortalecida com abertura de 30-nm (figura 3) é usada para a fabricação de nanopartículas magnéticas Co ou nanopartículas Au em uma treliça de favo de mel. Uma camada de Co ou Au é evaporada (10 nm em 0,01 nms-1) com a amostra colocada perpendicular com o feixe de evaporação. 0 resultado para as partículas Co é apresentado na figura 5. 0 tamanho das partículas nanopontos Co varia em um regime pequeno e algumas estão faltando. Estas diferenças estão em toda a amostra e aparecem durante o processo de recozimento, mais provavelmente por causa das pequenas diferenças (CV= 2,4%) nos diâmetros de esfera PS.
Nós usamos máscaras similares para a fabricação de nano anel. Nesta experiência Fe foi depositado (100 nm) através do gabarito fortalecido da figura 3 no ângulo de evaporação D=258, e a amostra foi girada durante a deposição. Os anéis tinham diâmetros internos (~100 nm) e externos (~150 nm) (inserção da figura 6) , que poderia ser controlado pela alteração do ângulo de evaporação. A espessura dos anéis na figura 6 é de aproximadamente 7 nm e pode também ser controlada pela alteração do tamanho da abertura da máscara da nanoesfera e da quantidade do metal depositado. Em um documento anterior, nos discutimos a relação entre o ângulo de evaporação e a quantidade de metal depositado. Recentemente ocorreram muitas tentativas de fabricar nano anéis. 1011 Entretanto, nosso método combina um controle muito bom das dimensões das estruturas e materiais de fabricação com a reprodutibilidade e simplicidade do processo de preparação.
Exemplo 2:
Nós usamos a seguinte estratégia para ligar especificamente IgG monoclonais a nanoilhas Au que foram montadas em substratos transparentes e não-transparentes.
Uma solução de 20 mM de sucinimidil 6—[3' — (2 — piridilditio)-propionamido] hexanoato, (um reagente SPDP)12 em DMSO (sulfóxido de dimetil) ou etanol foi incubado com nossos conjuntos periódicos de nanoestruturas na presença de 150 mM DTT (ditiotreitol) por 30 minutos. Este procedimento permite ligação covalente de tiol a nanoilhas Au.
10 F. Yan, W.A. Goedel, Nano Lett. 2004,4,1193.
11 J. McLellan, M. Geissler, Y. Xia, J. Am. Cehem. Soe. 2004, 126, 10830.
12 N-sucinimidil 3-(2-piridilditio)propionato (reagentes SPDP) são um grupo único de ligadores cruzados heterobifuncionais reativos de sulfidril e amina. Se eles são usados para formas ligações cruzadas de amina com sulfidril ou de amina com amina entre moléculas, os reagentes SPDP produzem disulfideo contendo ligações que podem ser clivadas mais tarde com agentes redutores tais como ditiotreitol (DTT). A porção amina reativa de reagentes SPDP é o éster N-hidroxisucinimida (NHS). Reações são mais comumente realizadas em fosfato, carbonato/bicarbonato, ou tampões de borato com pH 7-8. Outros tampões podem ser usados desde que eles não contenham aminas primárias (ou tióis ou reagente redutor de disulfideo), a taxa de reação e degradação por hidrólise aumenta com o aumento do pH; por exemplo, a meia-vida do éster NHS está há várias horas em pH 7 e menos de 10 minutos em pH 9. Os reagentes éster -NHS como SPDP e LC-SPDP têm solubilidade aquosa limitada e devem ser dissolvidos em solvente orgânico antes de serem adicionados a uma mistura de reação. Reagentes éster-NHs-sulfo como Sulfo-LCSPDP são solúveis em água e podem ser adicionados diretamente a misturas de reação aquosas.
A porção reativa sulfidril dos reagentes SPDP é o grupo 2- piridilditio, que reage otimamente com sulfidrilas entre pH 7 e 8. a reação resulta em deslocamento de um grupo piridina-2-tiona, a concentração do qual pode ser determinada pela medida da absorção em 34 3 nm. Os tampões de reação devem ser isentos de tióis e agentes redutores de disulfideo até que a supressão ou redução do 2-piridil disulfideo seja desejada.
Duas estratégias básicas podem ser usadas para formar ligações cruzadas cliváveis entre proteínas com reagentes SPDP, dependendo se uma ou nenhuma proteína já possui grupos de sulfidril (-SH) em adição as aminas primárias. Ambos os métodos de conjugação resultam em ligações cruzadas que contém uma ligação disulfideo no braço espaçador, que pode ser clivado por redução com ditiotreitol (DTT) ou outro agente redutor. Na maioria dos casos, as reticulações criadas usando reagentes SPDP podem ser clivadas com 25 mM DTT em pH 4,5 sem a redução dos elos de disulfideo de proteína nativa. Entretanto, quando a preservação de elos de disulfideo nativo não é uma preocupação a clivagem com DTT pode ser realizada mais eficientemente em pH de 7-9. Experiências de ligações cruzadas com reagentes SPDP não são limitadas a aquelas envolvendo proteínas. Qualquer uma variedade de moléculas com aminas primárias (- NH2) e grupos de sulfidril pode ser modificada ou ter ligação cruzada usando um reagente SPDP.
Após a limpeza dos conjuntos com material interativo bioorgânico de tampão (PBS-EDTA) em concentrações de 0,5 até 2 mg/ml foi incubada com o conjunto por uma hora ou durante a noite. Nós descrevemos coberturas como é mostrado na figura 8 para o caso em que IgG monoclonal em uma concentração de 1 mg/ml foi usado. A dimensão de uma marca de ponto único no ouro é 12 nm, correspondendo ao peso molecular médio de uma única molécula IgG de 150 kD.
Dois exemplos de como o "Nanossensor para Diagnóstico" para uso in vitro são aplicados:
1) Produção segura, rotulação e transfusão de componentes do sangue
Os componentes do sangue são transfundidos em pacientes sob orientações especiais para assegurar segurança do receptor. Estas orientações incluem determinação do tipo sangüíneo (basicamente tipo Reso e ABO) de produtos do sangue e receptor. Além do mais, contaminações por vírus de produtos do sangue precisam ser excluídas por medidas específicas. Além disso, os componentes do sangue são rotulados durante a armazenagem em recipientes ou bolsas mostrando o tipo sangüíneo e identificação para procedimentos de "revisão". 0 "Nanossensor para Diagnóstico" de acordo com a invenção é funcionalizado com o material interativo bioorgânico apropriado que possibilita da determinação de vários tipos de sangue humano ou vírus contaminantes em potencial (HIV, hepatite B, hepatite C). Se o material interativo bioorgânico apropriado é conjugado a nanopartícuias autoluminescentes, a interação com o analito correspondente reduz ou obterá a luminescência que poderia ser facilmente detectada pelo olho. 0 "Nanossensor para Diagnóstico" de acordo com a invenção montado deste modo poderia ser incorporado dentro da linha através da qual o sangue é coletado durante a doação de sangue, incluído dentro das bolsas que são usadas para a armazenagem dos componentes do sangue, ou com um dispositivo de "imersão" para determinar o tipo sangüíneo do receptor na pequena quantidade de sangue obtida do receptor. Em qualquer um destes casos, o tipo sangüíneo ou vírus contaminantes poderiam ser determinados sem equipamento adicional.
2) Determinação da homeostase de pacientes pela medição quantitativa dos componentes do soro
A medição quantitativa dos componentes do soro é freqüentemente usada para determinar, por exemplo, a coagulação ou homeostase de glicose de um paciente. 0 "Nanossensor para Diagnóstico" de acordo com a invenção é funcionalizado com o material interativo bioorgânico apropriado que possibilita a determinação dos vários componentes do sistema de coagulação ou da glicose. A ligação de um dado componente do sistema de coagulação ou glicose ao conjunto nanoestruturado funcionalizado muda as freqüências de ressonância de plásmon na superfície nanoestruturada do "Nanossensor para Diagnóstico" de acordo com a invenção e deste modo possibilita a medição quantitativa do componente de interesse. Esta medição poderia ser realizada em um fotômetro-espectral regular ou um fotômetro manual que opera com baterias para uso "em ação".
As figuras mostram as seguintes circunstâncias:
Figura 1: ilustração esquemática (a) e imagem típica AFM (b) de nanopartículas de ouro após o processo de evaporação e levantamento da máscara.
Figura 2: uma máscara de látex 540-nm fortalecida em 25 ml de mistura de água/EtOH/acetona por A) 1, B) 2, C) 4, D) 6, E) 7, e F) 10 pulsos de microondas.
Figura 3: imagem SEM da máscara de látex 54 0-nm PS fortalecida com medidas de todas as aberturas abaixo de 50 nm.
Figura 4: diagrama do sistema de evaporação modificado:
1) recipiente de amostra, 2) fonte de evaporação, 3)crisol, 4) sistema de resfriamento de água, 5) fonte de feixe de elétron, 6) postigo, 7) campo magnético, θ é o ângulo de evaporação e α é o ângulo de rotação da amostra.
Figura 5: nanopartículas Co ordenadas esfericamente evaporadas através de uma máscara de látex 540-nm PS fortalecida. 0 diâmetro de uma partícula única é de aproximadamente 30nm.
Figura 6: quadro SEM de nano anéis Fe ordenados evaporados através de uma máscara de látex 540-nm PS fortalecida.
0 diâmetro externo do anel único é 150 nm e a largura do anel é 20-30 m.
Figura 7: apresentação gráfica de como o DNA ou estruturas celulares são detectadas por anticorpos específicos. Anticorpos são reticulados através da estreptavidina-biotina para nanopartículas Au. As nanopartículas Au decoram a superfície nanoestruturada de um cateter ou arame de mola ou stent. Esta técnica é a primeira abordagem do nano-sanduiche para a produção de um Nanossensor para Diagnóstico.
Figura 8: moléculas IgG covalentemente presas a nanoilhas Au através do ligador SPDP. O diâmetro de um ponto único é 12nm, correspondendo ao peso molecular médio do IgG (150 kD).
Figura 9: nanossensores para diagnósticos montados em um arame de mola para fornecer um cateter especial molecular ou uma célula.
Figura 10: cateter especial de célula no lugar. Um arame de mola com nanossensores para diagnósticos montados em sua superfície é colocado dentro de uma veia periférica através de uma linha venosa padrão. Após o tempo de incubação apropriado o cateter especial de célula é substituído por moléculas raras ou células de interesse fixadas a sua superfície para análise de laboratório posterior.
Figura 11: influência do tamanho da partícula na ressonância de plásmon. 0 tamanho diferente da máscara (380, 540, 980, ou 1710 nm) fornece deposições de nanopartículas correspondentes em substrato transparente que gera espectros típicos.
Figura 12: exemplo típico de mudanças de espectro da ressonância de plásmon após a deposição de material interativo bioorgânico (avidina neste caso) em conjuntos nanoestruturados.

Claims (19)

1. Nanossensor para diagnóstico, consistindo em um condutor compreendendo áreas de nanoestruturas metálicas arcadas bidimensionadas com moléculas de detecção, caracterizado pelo fato de que as nanoestruturas metálicas são distribuídas como nanotriângulos restringidos a superfície e periódicas dispostas em um conjunto hexagonal produzido por litografia de nanoesfera.
2. Nanossensor para diagnóstico, caracterizado pelo fato de compreender: a) uma deposição de nanoestruturas como metal nanopadronizado, semicondutores e/ou ilhas magnéticas em superfícies transparentes ou não-transparentes, planares ou não-planares, nas quais as nanoestruturas são distribuídas como nanotriângulos restringidos à superfície e periódicos dispostos em um conjunto pequeno misturado hexagonal, e b) deposição subseqüente de material interativo bioorgânico nas nanoestruturas como descrito em 2.a) para fornecer um dispositivo sanduíche para a interação com alvos orgânicos ou inorgânicos.
3. Nanossensor para diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de compreender nanoesferas restringidas à superfície e/ou nanomorfologias horizontais em formato de hastes obtidas por um processo de sinterização adicional dos nanotriângulos restringidos à superfície.
4. Nanossensor para diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as ditas ilhas nano-padronizadas compreendem um conjunto periódico nanoestruturado de nanoilhas metálicas montadas de uma morfologia variada tal como nanoagulhas, fios, tubos, anéis ou esferas.
5. Nanossensor para diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de o dito substrato planar ou não-planar é feito de aço inoxidável, vidro, silício, ou polímeros biocompatíveis e poderia ser em geral transparente, não-transparente, condutivo ou não-condutivo.
6. Nanossensor para diagnóstico/ de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que as ditas ilhas metálicas são feitas de metais nobres como ouro, platina, e prata, ou semicondutores como CdSe, CdTe e conseqüentemente Cobalto e Niquel.
7. Nanossensor para diagnóstico, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o dito material interativo bioorgânico poderia ser anticorpos ou parte de anticorpos, peptideos, oligômeros feitos de ácidos nucléicos, ou em geral compostos orgânicos ou inorgânicos estruturados em receptores que interagem especificamente com alvos.
8. Método para produzir nanossensor para diagnóstico, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ilhas nanopadronizadas são obtidas por litografia de nanoesfera (NSL).
9. Método para produzir nanossensor para diagnóstico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a litografia de nanoesfera possibilita a criação de nanotriângulos metálicos restringidos à superfície e mônodispersos.
10. Método, de acordo com uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que o dito dispositivo nanoestruturado compreende um conjunto de nanoilhas preparadas de modo que o dito conjunto tenha uma geometria harmoniosa.
11. Método, de acordo com uma das reivindicações precedentes de 8 a 10, caracterizado pelo fato de que o material interativo bioorgânico está ligado às estruturas nanopadronizadas através de adesão, interação eletrostática, ligação química, ou ligação covalente ou não-covalente.
12. Método, de acordo com uma das reivindicações precedentes de 8 a 11, caracterizado pelo fato de que a ligação da substância alvo à superfície metálica bioconjugada induz a uma interação coletiva com o elétron de superfície (ressonância de plásmon).
13. Método, de acordo com uma das reivindicações precedentes de 8 a 12, caracterizado pelo fato de que a ligação da substância alvo à superfície semicondutora bioconjugada cria uma saída na interação que poderia ser detectada pela medição da luminescência ou fluorescência.
14. Método, de acordo com uma das reivindicações precedentes de 8 a 13, caracterizado pelo fato de que a ligação da substância alvo à superfície magnética bioconjugada pode ser medida pela interação entre ferro e materiais superparamagnéticos.
15. Método, de acordo com uma das reivindicações precedentes de 8 a 14, caracterizado pelo fato de que toda nanoilha metálica ou não-metálica atua como um sensor individual.
16. Método de detecção, como definido nas reivindicações -12, 13, 14, caracterizado pelo fato de que a montagem de substâncias alvo a nanoilhas individuais é detectada e medida quantitativamente.
17. Uso de nanossensor para diagnóstico, como definido em uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser, em particular, para diagnose pré-natal, diagnose de câncer e/ou monitoramento da terapia de câncer.
18. Uso de nanossensor para diagnóstico, como definido em uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para a produção segura, rotulação e transfusão de componentes do sangue.
19. Uso de nanossensor para diagnóstico, como definido em uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser uma interação resultante entre o material interativo bioorgânico e a substância alvo (pela medição das oscilações coletivas dos elétrons de condução nas nanoilhas) ou propriedades óticas de partículas semicondutoras (luminescência), ou as propriedades superparamagnéticas pelas partículas magnéticas são detectadas.
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