BRPI0611988A2

BRPI0611988A2 - uso de pelo menos um citoquina da famìlia il-6 famìlia gp130, composição farmacêutica, kit farmacêutico e método para o tratamento de uma enfermidade viral

Info

Publication number: BRPI0611988A2
Application number: BRPI0611988-3A
Authority: BR
Inventors: Rafael Aldabe Arregui; Esther Larrea Leoz; Civeira Murillo Maria Pilar; Prieto Valtuena Jesus
Original assignee: Proyecto Biomedicina Cima Sl
Priority date: 2005-06-16
Filing date: 2006-06-16
Publication date: 2010-10-13
Also published as: WO2006134195A8; EP1905447A2; ES2302402A1; AU2006258966B8; RU2008100307A; JP2008546672A; CN101257918A; EP1905447A4; MX2007016060A; WO2006134195A3; US20090130055A1; WO2006134195A2; CN101257918B; RU2413529C2; CA2612282A1; US7829077B2; AU2006258966A1; US20110027224A1; JP5154412B2; CA2612282C

Abstract

USO DE PELO MENOS UMA CITOQUINA DA FAMìLIA IL-6 - FAMìLIA gp3O, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, KIT FARMACêUTICO E MéTODO PARA O TRATAMENTO DE UMA ENFERMIDADE VIRAL A presente invenção refere-se ao uso de pelo menos uma citoquina da família IL-6 -gp13O, preferentemente selecionada entre a IL-11, o fator inibidor de leucemia (LIF), oncostatina M (OSM), cardiotrofina 1, fator neurotrófico ciliar (CNTF), a citoquina semelhante à cardiotrofina (CLC) e suas combinações ou uma seqúência de DNA que codifica a mesma, na preparação de uma composição farmacêutica que se destina à adminis- tração combinada com pelo menos um IFN-<244> ou uma sequência de DNA que o codifica o mesmo, para o uso no tratamento de enfermidades virais. A invenção também se refere a uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade farmaceuticamente aceitável de, pelo menos, uma citoquina proveniente da família IL-6 -gp13O ou uma sequência de DNA que codifica a mesma, e uma quantidadefarmaceuticamente aceitável de pelo menos um IFN-<244> ou uma sequência de DNA que o codifica, um kit farmacêutico e um método para o tratamento de enfermidades virais com a administração combinada das mencionadas citoqui- nas e o IFN-<244>.

Description

USO DE PELO MENOS UMA CITOQUINA DA FAMÍLIA IL-6 - FAMÍ-LIA gp130, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, KIT FARMACÊUTICO EMÉTODO PARA O TRATAMENTO DE UMA ENFERMIDADE VIRAL

A presente invenção refere-se ao uso depelo menos uma citoquina em combinação com um interfe-ron para a preparação de composições concebidas para otratamento de enfermidades virais.

Estado da Técnica

O sistema interferon (IFN) é a primeiralinha de defesa contra enfermidades em mamíferos. Osinterferons do Tipo I (que incluem diversos subtipos deIFN-a e IFN-β) são moléculas com atividade antiviral,que são induzidas em células de mamíferos na resposta ainfecções virais. A ação do IFN-α é mediada pelainteração com uma multi-subunidade de receptor celularde superfície, que consiste em duas subunidadesreceptoras, receptor 1 IFN-α (IFNARl) e IFNAR2.

Identificou-se somente uma forma de cadeia de IFNARl; etrês variantes da subunidade IFNAR2 foram reconhecidas:uma que é de comprimento pleno, IFRNAR2c, e duasisoformas truncadas, IFNAR2b e IFNAR2a. A varianteIFNAR2c está envolvida na aglutinação com ligantes e atransdução de sinais, enquanto que as duas formastruncadas, IFNAR2b e IFNAR2 a - que não têm domíniosintracelulares — inibem o sinal de IFN-α, através dacompetição com IFNAR2c pela aglutinação com a IFN-α.

A cascata de sinalização de IFN-α éiniciada quando IFN-α se une com o receptor. A uniãode IFN-oí com o receptor conduz à ativação de tirosina-quinasas associadas com IFNAR (Janus quinasa 1 (Jakl) etirosina-quinasa 2 (Tyk2)), as quais fosforilam as duassubunidades, IFNARl e IFNAR2. IFNARl fosforiladaproporciona um ponto de ligação para o ativador dofator de transcrição 2 e transdutor do sinal que contémum domínio de homologia 2 com Src (STAT2) , quando éfosforilado por Tyk2 ou Jakl. Os outros STATs,incluindo STATl, STAT3 e STAT5, por conseguinte, sãorecrutados ao receptor para fosforilação e ativção. Osmonômeros ativados STATl e STAT2 são então uma vez maisliberados para o citosol, onde eles formamheterodímeros e se unem com o fator 9 reegulador deinterferon/Proteínaa p48, para formar um complexo ativode fatores de transcrição conhecido como fator gênico 3estimulado por interferon (ISGF3). 0 complexo étranslocado para o núcleo e une-se ao elemento deresposta ao estímulo com IFN (ISRE) a fim de iniciar atranscrição dos genes alvo, incluindo algumas proteínasantivírus e imunorreguladoras. IFN-α também induz aformação de outros complexos STAT, incluindoSTATl/STATl, STAT1/STAT3 e STAT3/STAT3, que se unem coma seqüência γ ativada nas regiões promotoras de genessensíveis. Nos hepatócitos humanos primários, IFN-aativa STATl, STAT2, STAT3 e STAT5, seguido pela induçãode uma ampla variedade de genes antivírus eproapoptóticos que podem contribuir para a atividadeantitumor e antivírus de IFN-α nos fígados humanos.Em contraste com IFN-α, que ativa STATl,STAT2 e STAT3, no caso de IFN de tipo II (IFN γ), aunião com o receptor conduz à fosforilação exclusiva deSTATl por Jakl e Jak2, e isto é seguido pelahomodimerização de STATl e a translocação nuclear dohomodimero.

As infecções virais representam um enormeproblema de saúde em todo o mundo. Entre os virus quecausam infecções crônicas, s~~ao importantes aquele queprovoca a hepatite B (HBV) e aquele que provoca ahepatite C (HCV), como os fatores etiológicosprincipais de hepatite crônica viral e cirrosehepática; estes distúrbios afetam mais de 500 milhõesde pessoas no mundo todo (cerca de 300 milhões afetadospor HBV e 200 milhões por HCV). O HBV causes infecçãocrônica principalmente nos casos de transmissão eindivíduos imunodeprimidos. A infecção por HCV, poroutro lado, é notável pela sua tendência em desenvolvercronicidade na maior parte dos casos, o que sugere queeste vírus desenvolveu mecanismos particularmenteefetivos para evitar o sistema interferon. Ospacientes com infecção crônica por HCV assim como ospacientes com a hepatite crônica B falham na resposta àterapia com interferon. Na hepatite crônica B, aresposta antivírus sustentada ocorre em menos do que40% dos casos [1] . No caso de hepatite crônica C,muito embora a maioria dos pacientes infectados comgenotipos HCV 2 ou 3 exibam resposta virológicasustentada (SVR) depois de 24 ou de 28 semanas deterapia de combinação com IFN-α pegilado e ribavirina[2], somente 50% daqueles infectados com genótipo 1alcançaram SVR com este regime terapêutico [2] . Umavez que mais de 80% dos pacientes infectados com HCV nomundo ocidental e Asia correspondem ao genótipo 1,necessita-se urgentemente de meios mais eficazes paraaumentar a eficácia antivírus de IFN-α. Os mecanismossubjacentes da resistência ao IFN-α observados em HCV eoutras enfermidades virais crônicas são, não obstante,pobremente compreendidos e existe uma grandenecessidade de encontrar estratégias terapêuticascapazes de superar a resistência à terapia com IFN-αdestes enfermidades.

A resposta da célula infectada pelo virusao interferon-α depende de vários fatores determinan-tes, incluindo aqueles relacionados com o vírus eaqueles específicos relacionados com o hóspede.Diversos produtos gênicos de HCV demonstraram modular aresposta do hóspede à terapia com IFN e influenciar agravidade da enfermidade viral, particularmente no casode enfermidade hepática. Foi divulgado que proteínasnão-estruturais (NS5A) e proteínas estruturais (E2) deHCV interagem com PKR, uma das moléculas chaveimplicadas no desenvolvimento de um estado antivírus emresposta ao IFN [3, 4] . Isto poderia bloquear a PKR,dando como resultado uma inibição da atividade de IFNem células infectadas por HCV. Por outro lado, váriosestudos demonstraram que o sinal de STATl induzido porIFN-α é afetado tanto em camundongos transgênicos comHCV como em biopsias hepáticas de pacientes com HCVcrônico [5, 6].

Foi observado que em amostras hepaticasinfectadas HCV, e em células hepáticas portadoras de umreplicon de HCV genômico (comprimento completo), há umadiminuição marcada na quantidade de ARNm de IFNAR2 e deSTAT3. É relevante o fato de haver-se achado que aativação de STATl, STAT2 e STAT3 por IFN-α foibloqueada em células hepáticas que continham umreplicon de HCV de comprimento pleno, indicando assimque a replicação de HCV pode bloquear a sinalização deIFN-α nas células infectadas. É também interessante ofato de que nestas células não se vê afetada a ativaçãode STATl quando foram incubadas com a molécula pró-inflamatória IFN-γ, o que sugere que o bloqueio daativação de STATl produzido por HCV é especifico para acascata de sinalização de IFN do tipo I, e que nãoafeta a via de sinalização do IFN de tipo II.

Existem outras citoquinas que ativam a viade sinalização de Jak-STAT, em particular, membros dafamília da IL-6, que compreende IL-6, IL-Il, fatorinibidor da leucemia (LIF), oncostatin (OSM),cardiotrofina-1 (CT-I), o fator neurotrófico ciliar(CNTF) e citoquina semelhante a cardiotrofina (CLC)[7]. Estas citoquinas se unem aos complexos receptoresda membrana plasmática que compreendem a cadeiareceptora de transdução de sinais comum gpl30 [7]. Atransdução de sinais implica a ativação dos membros dafamília de tirosina-quinase Jak, conduzindo à ativaçãodos fatores de transcrição STATl e STAT3. Thesecitoquinas potentialmente ativam STAT3 e, em menorextensão, STATl através de uma subunidade receptoracomum gpl30. Não obstante, ainda que tenha sidomostrado que IL-6 induz alguns efeitos antivírus [8], aatividade antivírus desta citoquina é muito menor doque aquela do interferon-α.

A presente invenção refere-se ao uso deuma interleuquina da família da IL-6, preferentemente,a cardiotrofina-1 (CT-I) ou oncostatin M (OSM):

(1) para potenciar a atividade antivírus dointerferon-alfa (IFN-α);

(2) para superar a resistência ao interferonobservada em pacientes que sofrem de infecção viralcrônica, que não responde à terapia de IFN-α (por simesma ou associada com outros componentes antivírus);

(3) para conseguir um tratamento combinado deinterleuquina da família IL-6, preferentemente CT-I ouOSM, mais IFN-α como terapia antivírus aperfeiçoadapara qualquer tipo de infecção viral, e comparticularidade infecção com o vírus de hepatite C(HCV), em que a combinação preferida de CT-l-IFN-α ouOSM-IFN-a provou ser especialmente potente na inibiçãoda replicação de HCV.A presente invenção conseguiu os seguintesobjetivos:

(1) mostrar que a combinação de IFN-α com umainterleuquina da família de IL-6, e preferentemente coma CT-I e a OSM, produz um efeito antivírus mais potentedo que aquele induzido por uma citoquina (IFN oucitoquina da família IL-6) unicamente; e

(2) mostrar que o IFN-α associado com umacitoquina da família IL-6, em particular, a CT-I ou aoncostatin M, é capaz de superar o bloqueio da cascatade sinalização do IFN-α (e, conseqüentemente, aatenuação do efeito da IFN-α que é produzida quando ovírus, preferentemente HCV, se replica na célulainfectada).

Descrição da Invenção

A presente invenção refere-se, em primeirolugar, ao uso to the use de pelo menos one citoquina dafamília IL-6 - família gpl30 - ou uma seqüência de DNAque a codifica, na preparação de uma composiçãofarmacêutica para a administração combinada com pelomenos um IFN-α ou uma seqüência de DNA que a codifica,no tratamento de enfermidades virais, sendo a ditacitoquina selecionada entre cardiotrofina-1, IL-11,fator de inibição de leucemia, oncostatin M, fatorneutrófico ciliar, citoquina semelhante àcardiotrofina, e suas combinações; e, ainda de formamais preferencial, a dita citoquina é cardiotrofina-1ou oncostatin Μ.

Da maneira que é utilizado neste contexto,a citoquina da "família IL-6", por exemplo, CT-1,refere-se to:

- à forma native completa da dita citoquina;qualquer fração ativa da dita citoquina, istoé, qualquer seqüência de polipeptídeo parcialda dita citoquina que mantém os efeitosfisiológicos da citoquina completa reivindicadana presente invenção; e

qualquer derivado de polipeptídico da ditacitoquina, isto é, qualquer seqüênciapolipeptídica que tenha uma homologia com adita citoquina nativa maior do que 80%, commaior preferência superior a 90% e com maiorpreferência ainda superior a 95%, e quemantenha os efeitos fisiológicos da citoquinacompleta reivindicados na presente invenção.

A citoquina da família IL-6 (seja elacompleta, uma fração ativa ou um derivadopolipeptídico) pode proceder tanto da forma nativa,como de qualquer forma de citoquina recombinante, apartir de qualquer forma polinucleotídica que acodifica para a citoquina completa, a fração ativa ou oderivado polipeptídico.

Além disso, dentro da proteína da famíliade IL-6, considerada completa ou como uma fração ativa,ou dentro da citoquina recombinante, um ou váriosaminoácidos podem ter sidosuprimidos, substituídos ouadicionados à proteína por meio de qualquer uma dasformas mencionadas, sempre que dr mantenha a atividadeprevista na presente invenção.

Por outro lado, de acordo com a presenteinvenção, o IFN-α da invenção é qualquer tipo de IFN-a.De acordo com uma concretização específica, o dito IFN-α é selecionado a partir de IFN-a-2a, IFN-a-2b, IFN-a-5, interferon de consenso, IFN-a purificado, IFN-apegilado e as suas combinações. Em outra concretizaçãoespecífica, o IFN-α é selecionado a partir de IFN-a-2bpegilado, IFN-a-2a pegilado, IFN-a-5 pegila e as suascombinações.

O uso combinado de um IFN-α e de umacitoquina da família IL-6 é pojetado preferentementepara o tratamento de uma enfermidade viral. Como umexemplo de enfermidades virais que podem ser tratadasatravés do uso combinado de interferon e uma citoquinada família IL-6, podem ser mencionadas as seguintes,entre outras: enfermidades provocadas pelo vírus daencefalomiocardite, hepatite B e C, HIV, infecçõesvirais cutâneas (varicela, herpes zoster, sarampo),infecções virais respiratórias, enfermidades virais dosistema nervoso central, enfermidades virais hepáticas,enfermidades virais das glândulas salivares,monãoucleoses infeccios e verrugas warts.

Preferentemente, a enfermidade viral é umahepatite C.Além disso, de acordo com a presenteinvenção, a citoquina - ou citoquinas - da família IL-6e o IFN-α podem ser administrados separadamente,estando presentes em diferentes composiçõesfarmacêuticas; ou podem ser administrados em conjunto,estando presentes em uma mesma composição farmacêutica.

Um objeto adicional da presente invençãoé, conseqüentemente, uma composição farmacêutica quecompreende uma quantidade farmaceuticamente aceitávelde pelo menos uma citoquina da família IL-6 - gpl30family- ou uma seqüência de DNA que a codifica, e umaquantidade farmaceuticamente aceitável de pelo menos umIFN-α, ou uma seqüência de DNA que o codifica.

Na dita composição farmacêutica quecompreende pelo menos um IFN-α, ou uma seqüência de DNAque o codifica, e pelo menos uma citoquina da famíliaIL-6, ou uma seqüência de DNA que a codifica, acitoquina da família IL-6 é preferentemente selecionadaa partir de IL-6, IL-11, fator inibidor de leucemia,oncostatin M, cardiotrofina-1, fator neurotroficociliar, citoquina semelhante a cardiotrofina e as suascombinações; e ainda com maior preferência, a ditacitoquina da família IL-6 é cardiotrofin-1 ouoncostatin M.

Na composição farmacêutica da invenção, oIFN-α é qualquer tipo de IFN-α. Em uma concretizaçãopreferida, o IFN-α foi selecionado a partir de IFN-a-2a, IFN-a-2b, IFN-oí-5, interferon consenso, IFN-oípurificado, IFN-α pegilado e as suas combinações. Emuma outra concretização preferida adicional, o IFN-α éselecionado a partir de IFN-a-2b pegilado, IFN-a-2apegilado, IFN-a-5 pegilado e as suas combinações.

Em uma concretização especifica, aseqüência de DNA que codifica a citoquina da famíliaIL-6 (seja ela completa, uma fração ativa ou umderivado polipeptídico) ou o IFN-α está incorpora em umvetor de expressão, por exemplo, um plasmidio ou umvetor viral, que é preferentemente unidooperacionalmente com uma seqüência de controle queregula a expressão da citoquina ou do IFN-α. Aconstrução do dito vetor de expressão com a seqüênciade DNA pode ser realizada por meio de métodos detecnologia recombinante convencionais contidos emmanuais tais como, por exemplo, "Molecular Cloning: ALaboratory Manual", by J. Sambrook, D.W. Russel Eds.2001, 3rd ed. Cold Spring Harbor, New York. Estasconcretizações da composição farmacêutica são deinteresse para terapias que utilizam transferênciagenética (terapia genética).

A composição farmacêutica da invenção podecompreender ainda pelo menos um excipiente que éfarmaceuticamente compatível com a citoquina da famíliaIL-6, ou com com a seqüência de DNA que a codifica, e éfarmaceuticamente compatível com o IFN-α ou com aseqüência de DNA que a codifica.

Além disso, em uma composição farmacêuticada família IL-6 citoquina - ou com a seqüência de DNAque a codifica — e o IFN-α - ou com a seqüência de DNAque o codifica — podem ser realizados em agentescarreadores respevtivos.

Constituem exemplos válidos da composiçãofarmacêutica da invenção, sem se ficar limitado àsmesmas qualquer composição sólida (por exemplo,comprimidos, cápsulas, grânulos, e assemelhados) ouliquida (por exemplo, soluções, suspensões, emulsões, eassemelhadas) para administração por qualquer via deadministração apropriada, por exemplo, oral, nasal,parenteral, tópica, transdérmica, retal, e outras.

Em uma concretização especifica, a ditacomposição farmacêutica pode estar em uma formafarmacêutica de administração por via oral, seja emforma sólida ou líquida. Exemplos ilustrativos dasformas farmacêuticas de administração por via oralincluem comprimidos, cápsulas, granulados, soluções,suspensões, e outras, e podem conter os excipientesconvencionais, tais como aglutinantes, diluentes,desintegrantes, lubrificantes, humectantes, e outras, epodem ser preparadas por métodos convencionais. Acomposição farmacêutica também pode ser adaptada parasua administração parenteral, em forma de, por exemplo,soluções estéreis, suspensões ou produtos liofílicos,na forma de dosagem apropriada; neste caso a ditacomposição farmacêutica incluirá os excipientesadequados, tais como amortecedores, tensioativos, eassemelhados. Em qualquer caso, os excipientes serãoselecionados com base na forma farmacêutica deadministração selecionada. Uma revisão das diferentesformas farmacêuticas de administração de fármacos ,para estas e outras vias alternativas possíveis e desua preparação pode ser encontrada, por exemplo, nolivro "Tecnologia farmacêutica" ["PharmaceuticalTechnology"], by J.L. Vila Jato, 1997 Vols. I e II, Ed.Sintesis, Madrid; or in "Handbook de PharmaceuticalManufacturing Formulations", by S.K. Niazi, 2004 Vols.I to VI, CRC Press, Boca Raton.

Em uma concretização específica, acomposição farmacêutica é pojetada para administraçãoparenteral, preferentemente subcutânea, intravenosa,intramuscular ou intraperitoneal.

Em uma concretização específica dacomposição farmacêutica da invenção, o IFN-α está naforma pegilada. Alguns exemplos para a preparação decomposições com formas pegiladas de IFN-α podem serencontradas na US 5.762.923 e US 5.766,582. Éigualmente possível adquirir algumas destas formaspegiladas comercialmente, tais como, por exemplo, PEG-Intron (IFN-a-2b pegilado) pela Schering Corporation(Kenilworth, N.J., U.S.A.) e PEGASYS (IFN-a-2a) pelaHoffmann La Roche (Nutley, N.J., U.S.A.).

Para sua aplicação em terapia, tanto acitoquina da família IL-6 quanto o IFN-α encontrar-se-ão preferentemente em uma forma farmaceuticamenteaceitável ou substancialmente pura, isto é eles terãoum nivel de pureza farmaceuticamente aceitável exluindoos excipientes farmaceuticamente aceitáveis e nãoincluindo material considerado tóxico aos níveis dedosagem normais. Os níveis de pureza para a citoquinada família IL-6 e o IFN-α são preferentementesuperiores a 50%, com maior preferência superiores a70%, e com maior preferência superiores a 90%. Em umaconcretização preferida, eles são superiores a 95%.

De uma maneira geral, a quantidadeterapeuticamente efetiva da citoquina da família IL-6 edo IFN-α a ser administrado serão dependentes, entreoutros fatores, do indivíduo que vai ser tratado, daseveridade da enfermidade que padeça o dito indivíduo,da forma de administração selecionada, e outros. Poreste motivo, as doses mencionadas neste invenção devemser consideradas tão somente como guias para aqueleversado na matéria, e ester deve ajustar as doses emfunção dass variáveis citadas anteriormente. Nãoobstante, pode-se administrar citoquina da família IL-6e o IFN-α, uma ou mais vezes ao dia, por exemplo, 1, 2,3 ou 4 vezes ao dia.

Como um exemplo ilustrativo, e sem queisto suponha uma limitação do âmbito de proteção, emuma concretização específica na qual se combinamcardiotrofina-1 e IFN-a-2a (ou 2b), a quantidade diáriatotal típica de cardiotrofina-1 estará entre 1 pg/kg e10 mg/kg de peso corpóreo; e e a quantidade típicatotal diária de IFN-a-2a está compreendida entre 1,5 e10 MUI por dia ou entre 40 e 300 microgramas por semanade pegilado IFN-α. Normalmente, o nivel de dosagemserá mais alto nas primeiras semanas de tratamento,reduzindo-se a dose em etapas posteriores. De formaassemelhada, o regime de administração pode ser diário,de 3 vezes por semana, ou também semanal. Por outrolado, a cardiotrof ina-1 e o IFN-α podem seradministrados seguindo-se diferentes regimes deadministração (por exemplo, diferente via deadministração ou diferente freqüência).

Um objetivo adicional da presente invençãoé um kit farmacêutico para o tratamento de umaenfermidade viral que compreende pelo menos:

um primeiro componente que compreende pelomenos uma citoquina da família IL-6 famíliagpl30 (seja ela completa, uma fração ativa ouum derivado polipeptídico, tais como foramdefinidos anteriormente) ou uma seqüência deDNA que codifica a dita citoquina; eum segundo componente que compreende pelo menosum IFN-α ou uma seqüência de DNA que codifica odito IFN-α.

O kit de acordo com a a invençãopreferentemente compreende uma citoquina da família IL-6 selecionada a partir de IL-6, IL-11, fator inibidorda leucemia, oncostatin M, cardiotrofina-1, fatorneurotrófico ciliar, a citoquina semelhante acardiotrof ina e suas combinações; e ainda com maiorpreferência, a citoquina da família IL-6 écardiotrofina-1 ou oncostatin M.

O kit de acordo com a invenção compreendeum IFN-a de qualquer tipo, preferentemente umselecionado a partir de IFN-a-2a pegilado, IFN-a-2bpegilado, IFN-a-5, interferon consenso, IFN-apurificado, IFN-α pegilado e as suas combinações. Emuma outra concretização adicional preferida, o IFN-α éselecionado a partir de IFN-a-2b pegilado, IFN-a-2apegilado, IFN-a-5 pegilado e suas combinações.

Em uma concretização específica, aseqüência de DNA que codifica a citoquina da famíliaIL-6 (seja ela completa, uma fração ativa, ou umderivado polipeptídico) ou o IFN-α do kit estáincorporada em um vetor de expressão.

No kit da presente invenção, o primeirocomponente e o segundo componente podem compreenderalém disso pelo menos um excipiente farmaceuticamenteaceitável que é compatível com a citoquina da famíliaIL-6 - ou uma seqüência de DNA que a codifica — e com oIFN-α - ou uma seqüência de DNA que o codifica.

De acordo com a presente invenção, o kitdefinido anteriormente pode compreender o primeiro e osegundo componente em composições farmacêuticasseparadas; ou então o primeiro e o segundo componentepodem estar presentes no kit em uma mesma composiçãofarmacêutica.Este kit pode compreender, além disso, umterceiro componente que compreende um ou maisexcipientes farmaceuticamente compatíveis com acitoquina da família IL-6 - ou uma seqüência de DNA quea codifica — e com o IFN-α - ou uma seqüência de DNAque o codifica.

O dito terceiro componente podecompreender, além disso, um ou mais agentes carreadoresfarmaceuticamente compatíveis com a citoquina dafamília IL-6 - ou uma seqüência de DNA que a codifica —e com o IFN-α - ou uma seqüência de DNA sequence que ocodifica.

Um objetivo adicional da presente invençãoé um método para o tratamento de uma enfermidade viralque compreende administrar de uma maneira combinada umaquantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos umacitoquina da família IL-6 - família gpl30 - (seja elacompleta, uma fração ativa ou um derivadopolipeptídico, tais como foram definidosanteriormente), ou uma seqüência de DNA que a codifica,e uma quantidade terapeuticamente efetiva de pelo menosum IFN-α, ou uma seqüência de DNA que a codifica.

Em uma concretização específica aseqüência de DNA que codifica a citoquina da famíliaIL-6 ou o IFN-α do método está incorporado em um vetorde expressão.

No método definido anteriormente, aenfermidade viral pode ser produzida pelo vírus daencefalomiocardite, hepatite B e C, HIV, infecçõescutâneas virais (varicela, herpes zoster, sarampo) ,infecções virais respiratórias, infecções virais dosistema nervoso central, infecções virais hepáticas,infecções virais das glândulas salivares, monãoucleoseinfecciosa e verrugas genitais.

De acordo com uma concretização preferidado método da invenção, a enfermidade viral é hepatite C.

De acordo com o método da invenção, acitoquina da família IL-6 é preferentemente selecionadaa partir de IL-6, a IL-11, o fator inibidor daleucemia, oncostatina M, cardiotrofina-1, fatorneurotrófico ciliar, a citoquina semelhante àcardiotrofina e as suas combinações, preferentementeentre a Ia IL-11, o fator inibidor da leucemia,oncostatina M, cardiotrofina-1, fator neurotróficociliar, a citoquina semelhante à cardiotrofina e assuas combinações; e de maneira ainda mais preferida, acitoquina da família IL-6 é a cardiotrofina-1 ouoncostatina M.

No método definido de acordo com ainvenção, o IFN-α é qualquer tipo de IFN-α. Em umaconcretização preferida, ele é selecionado a partir deIFN-a-2a, IFN-a-2b, IFN-a-5, interferon consenso, IFN-apurificado, IFN-α pegilado e as suas combinações; emuma outra concretização preferida adicional, o IFN-α éselecionado a partir de IFN-a-2b pegilado, IFN-a-2apegilado, IFN-a-5 pegilado e as suas combinações.

Além disso, de acordo com o método dainvenção, este pode compreender a administraçãocombinada e simultânea da citoquina da família dainterleuquina, preferentemente, cardiotrofina-1, e oI FN-oí.

Neste método, a citoquina da família IL-6(seja ela completa, uma fração ativa ou um derivadopolipeptídico) e o IFN-α podem estar presentes na mesmacomposição farmacêutica que é administrada ao paciente;ou então a citoquina da família IL-6 e o IFN-α podemser administrados em composições farmacêuticasseparadas.

A presente invenção mostra que quando seestimulam as células hepáticas que compreendem umreplicon completo de HCV com IFN-α e uma interleuquinada família IL-6, com particularidade a cardiotrofina-1e a oncostatina M:

(1) se supera o efeito inibidor de HCVsobre a fosforilação de STAT3, que se produz quando ascélulas são incubadas com IFN-α sozinho ou com umacitoquina da família IL-6 (por exemplo, CT-I ou OSM)sozinha alone.

(2) se gera uma indução mais elevada degenes sensíveis ao interferon (ISGs), tais como 2'-5'-oligoadenilato sintase (2'-5'OAS), e níveis mais altosde STATl e STAT3 do que quando as células são incubadascom citoquina unicamentealone.(3) se inibe a replicação do virus maisefetivamente do que quando se usa a citoquinaunicamente.

(4) A interação entre IFN-α e CT-1, ouentre IFN-a e OSM, é de forte sinergismo.

Descrição Breve das figuras

A Figura 1 mostra uma análise dafosforilação de STATl, STAT2 e STAT3. As células Huh7(Huh7) e células Huh7 que contêm um replicon genômicocompleto de HCV (Core-3') foram tratadas durante 15, 60e 120 minutos com 50 Ul/ml de IFN-a-2 (IFN-a) ou com 20ng/ml de cardiotrofina-1 (CT-1), ou com uma combinaçãode IFN-a-2 e CT-1, e as quantidades de fosforiladoSTATl, STAT2 e STAT3 presentes nos extratos celularesforam analisadas por meio de transferência Western.

A Figura 2 mostra uma análise quantitativade ARNm mediante RT-PCR em tempo real de STATl, STAT3e 2'-5'OAS, presente em células Huh7 que contêm umreplicon completo de HCV, tratado durante 3 dias com 5ou 50 IU/ml de IFN-a-2 (IFN 5, IFN 50), sozinho (-CT)ou em combinação com 20 ng/ml de CT-I (+CT); e com 5 ou50 Iü/ml de IFN-a-2, sozinho (-0SM) ou em combinaçãocom 20 ng/ml de OSM (+OSM). Controle: células nãotratadas.

A Figura 3 mostra uma análise quantitativamediante RT-PCR em tempo real, de ARN de HCV presenteem células Huh7 que contêm um replicon completo de HCV,tratadas durante 3 dias com IFN-a-2 ou IFN-a-5 (5 or 50IU/ml) e 20 ng/ml de CT-I ou OSM ou IL-6.

A Figura 4 mostra o efeito comparativeantiviral da combinação IFN-oc-2 ou IFN-a-5 (5 U/ml)mais CT-I ou OSM ou IL-6 (20ng/mL), mediante RT-PCR emtempo real, de ARN de HCV presente em células Huh7 quecontêm um replicon complete de HCV, tratadas com asditas citoquinas.

A Figura 5 mostra a percentagem de célulasHuh7 protegidas contra a infection com o virus daencefalomiocardite. Células Huh7 foram pré-tratadasdurante 24 horas com 5 ng/ml ou 50 ng/ml de CT-I ediferentes quantidades de IFN-oí-2, e foram infectadascom IO5 UFP do virus da encefalomiocardite the (EMCV) ,e depois de 24 horas, as células foram secadas comcorante cristal violeta a fim de medir a quantidade decélulas viáveis.

CONCRETIZAÇÕES DA INVENÇÃO

Experiência 1

Estudo do efeito da combinação de IFN-cx-2 e CT-I sobrea cascata de sinalização nas células que mantém areplicação de HCV (figura 1).

Em células Huh7 (uma linha celular dehepatoma) não transfectadas a adição de 50 IU/ml deIFN-a-2 (interferon-a-2) induziu fosforilação de STATl,STAT2 e STAT3, com ativação máxima de STATl e STAT2 a 1hora e 2 horas e de STAT3 a 1 hora (ver figura IA).Não obstante, nas células Huh7 transfectadas com umreplicon HCV de comprimento pleno, observou-se quehavia uma inibição marcada na fosforilação de STATl,S TAT 2 e STAT3 depois da incubação com IFN-a-2.

Portanto, produziu-se uma ausência completa de STAT3 eSTATl ativadas e produziu-se uma inibição marcada daativação de STAT2 (ver figura IA).

Por outro lado, em Huh7 não transfectadas,constatou-se que a adição de 20 ng/ml de CT-I conduziuà ativação tanto de STAT3 quaanto de STATl (maisintensamente no caso de STAT3), com valores máximos aos15 minutos e 1 hora, e uma diminuição substancial nas 2horas (Figura 1B) . Como se esperava, CT-I não induziuqualquer ativação de STAT2. Em células Huh7transfectadas com um replicon completo de HCV, aativação de STAT3 por CT-I foi substancialmentereduzida, enquanto que a fosforilação de STATl foiapenas ligeiramente afetada (Figura 1B).

Quando se incubaram células Huh7 não-transfectadas com uma mistura de 50 IU/ml de IFN-a-2 e20 ng/ml de CT-1, detetou-se uma fosforilação maisintensa e duradoura de STAT3 e STATl que quando seincubaram com cada uma das citoquinas sozinhas. Aativação de STAT2 foi similar àquela encontrada comIFN-a-2 sozinho. É importante o fato de que quando ascélulas Huh7 transfectadas com um replicon complete deHCV foram incubadas com a mistura IFN-a-2 (50 IU/ml)mais CT-I (20 ng/ml), constatou-se que a fosforilaçãode STAT 3 foi produzida sem nenhum dano, sendo aativação de STAT3 não só mais intensa, mas também maisduradoura do que quando as células não-transfectadasforam incubadas com IFN-a-2 sozinho (Figura 1C). Estefato é notável, posto que, como foi mencionado (e estáilustrado nas Figuras IA e 1B), a replicação de HCV nascélulas Huh7 reduz seriamente a ativação de STAT3,tanto por IFN-a-2 como por CT-I separadamente, e porisso é surpreendente que este bloqueio desapareça porincubação das células com as duas citoquinas emconjunto, abrindo assim uma nova perspectiva para umaestratégia promissora no tratamento das enfermidadesvirais. Deve ser observado, também, que quando secombina IFN-a-2 e CT-I para tartar células comreplicação de HCV, não só se produz uma ativação deSTAT3 potente e sustentada, mas também se produ umaativação de STATl de maneira similar àquela encontradaquando se incubam células não-transfectadas com CT-Isozinha e mais intensamente que quando células nãotransfectadas são incubadas com IFN-a-2 sozinho(comparar Figuras IA e 1B) . É importante notar queIFN-a-2 foi incapaz de ativar STATl nas células comreplicação sustentada de HCV, enquanto que a combinaçãode CT-I mais IFN-a-2 wasfoi capaz de ativar de maneiramuito eficaz este importante fator antiviral em célulascom replicação de HCV. Isto mostra claramente que háum aperfeiçoamento na atividade antiviral combinando-seIFN-a-2 e CT-1, permitindo a fosforilação de STAT2,muito embora a níveis claramente inferiores àquelesquando se usan células sem replicação de HCV (verFigura 1C).

Em conclusão, quando as células comreplicação sustentada de HCV foram tratadas com IFN-a-2de uma maneira isolada não houve ativação de STATl eSTAT3, e unicamente se observaram baixos níveis deSTAT2. A ausência de STATl e STAT3 ativados - doisindutores importantes do estado antiviral da célulapoderia prevenir a formação de heterodímeros STATl-STAT2, de heterodímeros STAT1-STAT3, e de homodímerosSTATl e STAT3, aniquilando assim a defesa antiviral dacélula. O eso de CT-I em combinação com IFN-a-2permite a formação de altos níveis de STATl e STAT3ativados, restaurando assim o mecanismo de resistênciaviral da célula.

Nas experiências que estão ilustradas naFigura 1, pode ser observado que a infecção por HCVdetermina não só uma ativação defeituosa de STATl, mastambém uma redução dos níveis das proteínas STAT3 eSTAT2. Os estudos representados na Figura 1 mostram osefeitos a curto prazo da incubação seja com IFN-a-2 oucom CT-I, ou com a combinação dos dois. Nasexperiências que se descrevem adiante mostra-se que coma incubação durante 72 horas, pode-se observar que otratamento combinado de CT-I e IFN-a-2, ou OSM e IFN-a-2, deu como resultado uma expressão aumentada de STAT3,compensando assim o efeito de HCV nas célulasinfectadas (ver Figura 2).

Método Experimental 1

Estabelecimento de linhas celulares Euhlportadoras do replicon do HCV de comprimento pleno.

Estabeleceram-se células Huh7 que expressavam oreplicon de HCV de comprimento pleno tal como sedescreveu [9] . Resumindo, linearizaram-se pl389/Core-3'/5.1 com ScaI (New England Biolabs, USA) e foramusados como gabaritos para a síntese de RNA usando-se aRNA polimerase T7 (Promega, USA). Utilizaram-se 20 ugde RNA sintetizado para eletroporar IO7 células Huh7 e,24 horas depois, adicionaram-se 500 μg/ml de G418(Gibco, USA). Duas vezes por semana, o meio de culturasuplementado foi substituído por G418 e, 4 semanasdepois da transfecção, coletaram-se as colôniasresistentes a G418 misturadas e usaram-se paraposterior análise.

Análise por transferência Western.Semearam-se células Huh7 que expressavam ou nãoexpressavam o replicon do HCV de comprimento pleno a200,000/cavidade em placas de 6 cavidades em D-MEM(Gibco) com 10% de FCS (Gibco) . Adicionaram-se 50IU/ml de IFN-a-2 (Intron A, Schering-Plough), ou 20ng/ml de CT-I (R&D Systems, UK) , ou uma combinação deIFN-a-2 (50 IU/ml) mais CT-I (20 ng/ml) durantediferentes períodos de tempo: 15 minutos, 1 hora e 2horas. Subseqüentemente, as células Huh7 foram lisadasem amortecedor de Iise (Tris-HCl 60 mM pH 6,8, SDS 2%,glicerol 2,5%, 2-mercaptoetanol 0,7 M e azul debromofenol 0,02%). As amostras foram convertidas emgéis de SDS-poliacrilamida (Bio-Rad Laboratories, CA) a7,5% sob condições redutoras. Depois da eletroforese,transferiram-se para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad Laboratories) e tingiram-se com solução vermelha dePonceau (Sigma-Aldrich, Germany), para verificar sehavia uma carga igual de proteínas. As membranas foramincubadas em TBS-T (50 mM Tris-HCl (pH 7, 6), 200 mMNaCl e 0,1% de Tween-20) com leite desidratado a 5%.As proteínas foram detectadas por incubação com oanticorpo primário específico em TBS-T durante 1 hora.Depois as membranas foram lavadas em TBS-T e adicionou-se anticorpo secundário conjugado com peroxidasedurante 1 hora. As membranas foram submetidas alavagens extensas em TBS-T e visualizaram-se as bandasproteicas específicas usando-se o sistema de detecçãode quimioluminiscência "Western LightningChemiluminescence Reagent Plus" (Perkin Elmer, USA) ,seguindo-se as instruções do fabricante.

Posteriormente autorradiografaram-se as membranas equantificaram-se as bandas por análise densiométricarealizada mediante o programa Molecular Analyst/PC(Bio-Rad Laboratories).

Anticorpos. Compraram-se os anticorposanti-f osfo-STATltyr701 e anti-fosfo-STAT3tyr705 e oanticorpo IgG anti-coelho conjugado a HRP, a partir daCell Signaling Technology (USA). Obtiveram-se osanticorpos anti-STAT3, anti-fosfO-STATlser727, anti-STAT2e anti-fosf o-STAT2tyr 689 a partir da UpstateBiotechnology (USA). O anticorpo anti-STATl era daSanta Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). O anticorpoanti-actina esra da Sigma-Aldrich (Germany).

A fim de se determinar se uma citoquina dafamília IL-6 com IFN-α dá lugar a um estado antiviralmais forte da célula, realizaram-se experiênciasadicionais dirigidas a: a) a avaliação de se a terapiade combinação de IFN-α mais a citoquina da família IL-6pode aumentar a expressão de genes sensíveis aointerferon mais intensamente que qualquer dascitoquinas por si mesmas; b) a determinação de se aterapia de combinação de IFN-α mais a citoquina dafamília IL-6 poderia ser mais potente na inibição dareplicação do HCV que cada citoquina separadamente; c)a avaliação de se a terapia de combinação de IFN-oí-2mais citoquina da família IL-6 poderia ser maiseficiente na hora de defender as células contra osefeitos citopáticos de um vírus não relacionado com oHCV, e d) a determinação do tipo de interação entreIFN-α e a citoquina da família IL-6.

Experiência 2. Avaliação do efeito da trapia decombinação de IFN-a-2 mais CT-If ou IFN-a-2 mais OSM,sobre a indução de genes sensíveis ao interferon (ISGs)(Figura 2)Estudou-se a expressão dos ISGs 2' -5'OAS,STATl e STAT3, em células Huh7 portadoras do repliconde HCV depois de incubação durante 72 horas com IFN-a-2(5 ou 50 IU/ml) ou CT-I (20 ng/ml) , ou OSM (20 ng/ml) ,ou a combinação IFN-a-2 + OSM ou a combinação IFN-a-2 +OSM (vide as Figuras 2A-2F). Observa-se que, enquantoCT-I ou OSM por si mesmas não eram capazes de aumentara expressão destes ISGs ou o eram fracamente, a adiçãode CT-I ou OSM doses baixas ou altas de IFN-a-2 davalugar a um marcante aumento da expressão dos ISGs, oque indica que CT-I ou OSM pode aumentar de formamarcante a capacidade de IFN-a-2 para regular de formacrescente os genes antivírus em células que suportam areplicação viral. Muito embora os três ISGs aquianalisados tenham efeitos antivírus significativos, oaumento da expressão de STAT3 combinando CT-I ou OSM eIFN-a-2 é particularmente relevante, uma vez que estesfatores não só possuem propriedades antivírus, mastambém exibem uma potente atividade citroprotetora eantiinflamatória.

Método experimental 2

Análise da expressão do ARNm dos ISGs porRT-PCR em tempo real. Semearam-se células Huh7 queexpressavam o replicon do HCV de comprimento pleno a100.000/cavidade em placas de 6 cavidades em D-MEM(Gibco) , com 10% de FCS (Gibco) . Adicionaram-se 50 ou5 IU/ml de IFN-a-2 sozinho ou em combinação com com 20ng/ml de CT-1, ou com 20 ng/ml OSM. Manteve-se ocultivo celular durante três dias. Substituiu-sediariamente o meio de cultivo suplementado com ascitoquienas anteriores. Obteve-se o RNA totalseguindo-se o protocolo de "Ultraspec RNA IsolationSystem" (Biotech, USA), que é baseado no métododescrito por Chomczynski e Sacchi [10]. Trataram-sedois microgramas de RNA total com DNAase (Gibco-BRL,UK) antes da transcrição inversa com M-MLV ReverseTranscriptase (Gibco BRL) na presença de RNaseOUT(Gibco-BRL). Mediu-se a expressão dos STAT, do 2 -5'OAS e da β-actina por PCR em tempo real usando-se umICycler e a IQ SYBR Green Supermix (Bio-RadLaboratories, CA) . Utilizaram-se alíquotas de 2-μ1 dopool de cDNA para cada PCR, que continha preparadoresde sentido e sentido inverso específicos para cada gene(Tabela 1) em um volume final de 20 μΐ. Paradeterminar a especificidade dos produtos de PCRobtidos, analisou-se a temperatura de dissociação dosmesmos. Os resultados foram normalizados segundo aquantificação de β-actina na mesma amostra. Expressou-se a quantidade de cada transcrito pela formula2ct(actina)-ct(gene)^ CQm ct sendo Q pontO no qual afluorescência aumenta significativamente acima dafluorescência de fundo.Tabela 1. Preparadores usados neste estudo

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Experiência 3. Estudo dos efeitos da combinação deIFN-oí mais citoquina da família IL-6 sobre a replicaçãodo HCV em células Huh 7 transfectadas com o replicon deHCV de comprimento pleno (Figura 3) .

Devido à indução mais forte dos ISGsobservada ao combinar IFN-α mais CT-I ou OSM, desejava-se analisar se esta combinação era superior ao IFN-asozinho, ou à citoquina da família IL-6 sozinha naredução da carga viral nas células com o replicon doHCV de comprimento pleno. Assim, incubaram-se célulasHuh7 portadoras do replicon de HCV com IFN-α (IFN-a-2ou IFN-a-5, a 5 ou 50 IU/ml) , sozinho ou em combinaçãocom citoquinas da família IL-6 (IL-6, CT-1, OSM; a 20ng/ml); ou com as citoquinas da família IL-6: OSM, CT-Ie IL-6 por si sós têm um modesto efeito antivírus.Mediu-se a quantidade de HCV RNA depois de 72 horas decultivo (Figuras 3A, 3B, 3C) . Na Figura 3, pode serobservado que as citoquina da família IL-6s: OSM, CT-Ie IL-6, por si mesmas têm um modesto efeito antivírus.

Não obstante, a CT-I e a OSM aumentaram fortemente oefeito antivírus, tanto do IFN-a-2 quanto do IFN-a-5,quando se usaram estas citoquinas em doses baixas (5IU/ml) ou altas (50 IU/ml) doses (Figuras 3A e 3B). AIL-6 aumentou de uma forma mais fraca o efeitoantivírus, tanto do IFN-a-2 como do IFN-a-5 (Figura3C). Desta forma a terapia de combinação de IFN-a-2 ouIFN-a-5 mais CT-I ou OSM aumenta em um fator deaproximadamente 5 e 10, respectivamente, o efeitoantivírus do IFN-α, e a terapia combinada de IFN-a-2 ouIFN-a-5 mais IL-6 aumenta em um fator deaproximadamente 2.

Na Figura 4 representa-se comparativamenteo efeito potenciador da IL-6, da CT-I e da OSM (20ng/mL) sobre a ação antivírus do IFN-a-2 (5 U/mL)(Figura 4A) ou do IFN-a-5 (Figura 4B) . Observa-seclaramente o maior efeito potenciador antivírus dascombinações IFN-a/CT-1 e IFN-a/OSM frente à combinaçãoIFN-a/IL-6.

Método experimental 3

Análise do RNA HCV por PCR em tempo real.Semearam-se células Huh7 que expressavam o replicon doHCV de comprimento pleno a 100,000/cavidade em placasde 6 cavidades em D-MEM com 10% de FCS. Adicionaram-se50 ou 5 IU/ml de IFN-a-2 ou IFN-a-5 sozinhos, ou emcombinação com 20 ng/ml de CT-I ou OSM ou IL-6.Manteve-se o cultivo celular durante três dias.

Substituiu-se o meio de cultivo suplementado com ascitoquinas anteriores diariamente.

Obteve-se o RNA total das células Huh7transfectadas com o replicon do HCV de comprimentopleno seguindo-se o protocolo de "Ultraspec RNAIsolation System" (Biotech, USA), que é baseado nométodo descritos por Chomczynski e Sacchi [10] .Trataram-se dois microgramas de RNA total com DNAasa(Gibco-BRL) antes da transcrição inversa com M-MLVReverse Transcriptase (Gibco BRL) na presença deRNaseOUT (Gibco-BRL). Mediu-se a expressão do HCV RNAe do mRNA da β-actina por PCR quantitativa em temporeal usando-se um Icycler e o IQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad Laboratiories). Usaram-se alíquotas de 2-μ1do pool de cDNA para cada PCR, que continhapreparadores sentido e anti-sentido específicos daregião não traduzida 5' do HCV ou para o gene da β-actina (Tabela 1) em um volume final de 20 μΐ. Paradeterminar a especificidade dos produtos de PCR,analisou-se a temperatura de dissociação dos mesmos.Normalizaram-se os resultados de acordo com aquantificação de β-actina na mesma amostra. Expressou-se a quantidade de HCV RNA através da formula 2ct(actina)"ct(hcv) ^ Sendo et o ponto acima do qual a f luorescênciasobre de forma significativa acima da fluorescência defundo.

Experiência 4. Estudo dos efeitos dacombinação de IFN-a-2 mais CT-I na defesa contra osefeitos citopáticos do vírus da encefalomiocardite(EMCV) (Figura 5) .

Com o objeto de determinar se o efeitosinérgico da terapia de combinação se produz também emoutras infecções virais diferentes do HCV, analisou-sea proteção obtida mediante este tratamento contra oefeito citopático do EMCV em células Huh7. incubaram-se células Huh7 com doses decrescentes de IFN-a-2, de250 a 1 IU/ml, na presence ou ausência de uma dosebaixa (5 ng/ml) ou alta (50 ng/ml) de CT-I einfectaram-se 24 horas depois com EMCV. Observa-se quea CT-I por si só (sob uma dose baixa ou alta) tevepouco efeito citoprotetor sobre células infectadas porEMCV, uma vez que a adição desta citoquina sob dosesmuito baixas de IFN-a-2 não aperfeiçoa a viabilidadecelular. Não obstante, a CT-1, tanto em dose baixacomo alta, aumentava marcantemente a proteção induzidapelo IFN-a-2 contra o efeito citopático do EMCV. Estasinergia foi observada ao usar doses de IFN-a-2 entre250 e 28 IU/ml, sendo a sinergia mais pronunciada a umadose de IFN-a-2 de 83 e 28 IU/ml. Estes dados mostramque a sinergia antivirus do IFN-a-2 e da CT-I não serestringe ao HCV, mas é aplicada a um amplo espectro deenfermidades virais.Método experimental 4

Ensaio citoprotetor de IFN-ct-2 e CT-Icontra EMCV em células Huhl. Determinou-se a atividadecitoprotetora de IFN-a-2 e de CT-I medindo-se acapacidade destas citoquinas para proteger células Huh7contra o efeito citopático do virus daencefalomiocardite. Realizou-se o ensaio em uma placade microtitulação de 96 cavidades. Primeiro, semearam-se 2xl04 células Huh7 por cavidade em 150 μΐ de um meioque continha diluições seriadas de IFN-a-2 sozinho (de250 a 1 IU/ml) ou estas diluições seriadas de IFN-a-2mais 50 ou 5 ng/ml de CT-I, e foram incubadas durante24 horas. Adicionaram-se IO5 PFU de virus EMC porcavidade e mediu-se o efeito citopático a 24 horas comose segue: depois de se eliminar o meio, lavaram-se ascavidades duas vezes com PBS e tingiram-se com soluçãocorante de cristal violeta (0,5% em metanol-água 1:4v/v). Promoveu-se a leitura da densidade óptica a 540nm. Expressaram-se os resultados como percentagem decélulas protegidas contra o efeito citopático do EMCV.

Experiência 5. Estudo do tipo de interaçãoentre IFN-α e citoquinas da família IL-6 sobre areplicação de HCV em células Huh7 transfectadas com oreplicon do HCV de comprimento pleno.

Devido ao efeito antivirus potenciadorobservado ao combinar IFN-α e uma citoquina da famíliaIL-6, desejou-se determiner o tipo de interação que seestabelece na combinação de IFN-a-2 ou IFN-a-5 com acitoquina da família IL-6: IL-6, OSM e CT-I.

Realizaram-se estudos antivírus combinandoconcentrações fixas de IFN-a-2 e IFN-a-5 (5 ou 50IU/ml) com ou without IL-6, OSM e CT-I (20 ng/mL) emcélulas Huh7 transfectadas com o replicon de HCV decomprimento pleno. A análise matemática sobre o tipode interação que se estabelece entre o IFN-α e acitoquina da família IL-6s foi realizada por análisemultivariante segundo o método descrito por T.C.Chou(11). 0 tipo de interação entre duas substâncias mede-se mediante um fator denomina índice de interação "I",onde I= dl/Dl+d2/D2; sendo dl, d2, as concentrações dosinibidores na combinação e Dl, D2, as concentrações dosinibidores 1 e 2 que separadamente exercem a mesmainibição que a combinação. Então, se "I" é igual a 1as substâncias não reagem entre si (efeito aditivo), se"I" é menor do que 1 a combinação é sinérgica e se "I"é maior que 1, a combinação é antagônica. A tabela 2mostra a valoração padronizada da sinergia em função dovalor de "I".

Tabela 2:

<table>table see original document page 36</column></row><table>Os índices de interação obtidos para asdiferentes combinações de IFN-α e citoquinas da famíliaIL-6 descritas anteriormente foram em todos os casosmenores do que 1, pelo que a combinação Interferon-a (2ou 5) e as citoquinas da família IL-6 (IL-6, OSM, CT-1)é sinérgica (Tabela 3). Os dados obtidos mostram aindaque o efeito sinérgico é sempre bem maior nascombinações Interferon-a/OSM e Interferon-a/CT-1(I<0,3, sinergismo forte), faceà combinação Interferon-a/IL-6 onde se estabelece sinergismo (I < 0,7).

Tabela 3:

<table>table see original document page 37</column></row><table>Método experimental 5

Análise do HCV RNA por PCR quantitativa emtempo real. Semearam-se células Huh7 que expressavam oreplicon do HCV de comprimento pleno a 20.000/cavidadeem placas de 24 cavidades em D-MEM com 10% de FCS.Realizaram-se diferentes tipos de tratamentos:adicionaram-se 50 ou 5 Iü/ml de IFN-a-2 ou IFN-a-5 maisou menos 20 ng/ml de CT-1, OSM ou IL-6 (R&D Systems,UK). Manteve-se o cultivo celular durante três dias.O meio de cultura suplementado foi substituído com asditas citoquinas diariamente.

Obteve-se o RNA total de células Huh7transfectadas com o replicon HCV de comprimento plenoutilizando o Kit Nucleic Acid Purification LysisSolution (Applied BioSystems, Foster City, CA) e osistema semiautomático ABI PRISM 6100 Nucleic AcidPrepStation (Applied BioSystems). Trataram-se doismicrogramas de RNA total com DNAase (Gibco-BRL) antesantes da transcrição inversa com M-MLV ReverseTranscriptase (Gibco BRL) na presença de RNaseOUT(Gibco-BRL). Mediu-se a expressão do HCV RNA e do mRNAda β-actina por PCR quantitativa em tempo real usandoum Icycler e a IQ SYBR Green Supermix (Bio-RadLaboratiories). Usaram-se alíquotas de 2 μΐ do pool deADNc para cada PCR, que continha iniciadores no sentidoe direção inversa específicos da região não traduzida5' do HCV ou para o gene da β-actina (Tabela 1) em umvolume final de 20 μΐ. Para se determinar aespecificidade dos produtos de PCR, analisou-se atemperatura de dissociação dos mesmos. Normalizaram-seos resultados de acordo com a quantificação de β-actinana mesma amostra. Expressou-se a quantidade de HCV RNAatravés da formula 2ct(actina)"ct(HCV), sendo ct o ponto emque a fluorescência aumenta significativamente acima dafluorescência de fundo.

Para o cálculo do índice de Interação foiaplicável a seguinte equação:

I=dl/Dl+d2/D2

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<160> 10

<170> PatentIn versão 3.1

<210> SEQ. ID. NO: 1<211> 20<212> DNA

<213> Oligonucleotideo sintético<400> 1

ttaagaggca actccgatgg 20

<210> SEQ. ID. NO: 2<211> 20<212> DNA

<213> Synthetic oligonucleotide<400> 2

agcagactgc aaactcacca 20

<210> SEQ. ID. NO: 3<211> 22<212> DNA

<213> Oligonucleotideo sintético<400> 3

gctattcaca accactcatt ca

<210> SEQ. ID. NO: 4<211> 22<212> DNA

<213> Oligonucleotideo sintético<400> 4

acaagataca gccacataga ca

<210> SEQ. ID. NO: 5<211> 20<212> DNA

<213> Oligonucleotideo sintético<400> 5

gtccgtggaa ccatacacaa

<210> SEQ. ID. NO: 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Oligonucleotideo sintético

<400> 6

caatggtatt gctgcaggtg

<210> SEQ. ID. NO: 7<211> 17<212> DNA

<213> Oligonucleotideo sintético<400> 7

agcctcgcct ttgccga

<210> SEQ. ID. NO: 8<211> 15<212> DNA

<213> Oligonucleotideo sintético<400> 8

ctggtgcctg gggcg

<210> SEQ. ID. NO: 9<211> 20<212> DNA

<213> Oligonucleotideo sintético<400> 9

cctgtgagga actactgtct

<210> SEQ. ID. NO: 10<211> 20<212> DNA

<213> Oligonucleotideo sintético<400> 10

ctatcaggca gtaccacaag

Claims

1. - Uso de pelo menos uma citoquina da fa-mília IL-6 - família gpl30 - ou uma seqüência de DNAque a codifica, caracterizado por ser para a preparaçãode uma composição farmacêutica concebida para a admi-nistração combinada com pelo menos um interferon-α ouuma seqüência de DNA que a codifica, no tratamento deenfermidades virais, sendo a dita citoquina selecionadaa partir de IL-11, fator de inibição de leucemia, on-costatina M, cardiotrofina-1, fator neurotrófico cili-ar, citoquina semelhante a cardiotrofina e as suas com-binações.

2. - Uso de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a citoquina é cardito-trofina-1 ou oncostatina M.

3. - Uso de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o interferon-α é sele-cionado a partir de interferon-a-2a, interferon-a-2b,interferon-a-5, interferon consenso, interferon-α puri-ficado, o interferon-α pegilado e as suas combinações.

4. - Uso de acordo com as reivindicações 1ou 2, caracterizado pelo fato de que o interferon-α éselecionado a partir de interferon-a-2b pegilado, in-terferon-a-2A pegilado, interferon-a-5 pegilado e assuas combinações.

5. - Uso de acordo com as reivindicações 1ou 2, caracterizado pelo fato de que a citoquina da fa-mília IL-6 é selecionada a partir da proteína nativacompleta, uma seqüência polipeptidica parcial da ditacitoquina que mantém os efeitos fisiológicos da cito-quina completa e uma seqüência polipeptidica que temuma homologia com a dita citoquina nativa maior do que 80% e que mantém os efeitos fisiológicos da citoquinacompleta.

6. - Uso de acordo com a reivindicação 5caracterizado pelo fato de que a dita seqüênciapolipeptidica tem uma homologia com a dita citoquinanativa maior do que 90%.

7. - Uso de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de que a dita seqüência poli-peptidica tem uma homologia com a dita citoquina nativamaior do que 95%.

8. - Uso de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a enfermidade viral éhepatite C.

9. - Uso de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato deque a citoquina da família IL-6 e o interferon-α sãoadministrados separadamente em composições farmacêuti-cas diferentes.

10. - Uso de acordo com qualquer uma dasreivindicações precedentes, caracterizado pelo fato deque a citoquina da família IL-6 e o interferon-α sãoadministrados em conjunto na mesma composição farmacêu-tica.

11. - Composição farmacêutica, caracteriza-da pelo fato de que ela compreende uma quantidade far-maceuticamente aceitável de pelo menos uma citoquina dafamília IL-6 - família gpl30 —, ou uma seqüência de DNAque a codifica, e uma quantidade farmaceuticamente a-ceitável de pelo menos um interferon-α, ou uma seqüên-cia de DNA que a codifica, sendo a dita citoquina dafamília IL-6 selecionada a partir de IL-11, do fator deinibição de leucemia, oncostatina M, cardiotrofina-1,fator neurotrófico ciliar, a citoquina semelhante àcardiotrofina e combinações das mesmas.

12. -Composição farmacêutica de acordo coma reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que acitoquina da família IL-6 é cardiotrofina-1 ou oncosta-tina M.

13. - Composição farmacêutica de acordo comqualquer uma das reivindicações 11 a 12, caracterizadapelo fato de que a citoquina da família IL-6 é selecio-nado a partir da proteína nativa completa, da seqüênciapolipeptídica parcial da dita citoquina que mantém osefeitos fisiológicos da citoquina completa e uma se-qüência polipeptídica que tem uma homologia com a ditacitoquina nativa maior do que 80% e que mantém os efei-tos fisiológicos da citoquina completa.

14. - Composição farmacêutica de acordo coma reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que adita seqüência polipeptídica tem uma homologia com adita citoquina nativa maior do que 90%.

15. - Composição farmacêutica de acordo coma reivindicação 13, caracterizada pelo fato de a ditaseqüência polipeptidica tem uma homologia com a ditacitoquina nativa maior do que 95%.

16. - Composição farmacêutica de acordo comqualquer uma das reivindicações 11 a 15, caracterizadapelo fato de que o interferon-α foi selecionado a par-tir de interferon-a-2a, interferon-a-2b, interferon-a--5, Interferon consenso, interferon-a purificado, inter-feron-α pegilado e as suas combinações.

17. - Composição farmacêutica de acordo comqualquer uma das reivindicações 11 a 16, caracterizadapelo fato de que o interferon-α é selecionado a partirde interferon-α -2b pegilado, interferon-a-2a pegilado,interferon-a-5 pegilado e as suas combinações.

18. - composição farmacêutica de acordo comqualquer uma das reivindicações 11 a 17, caracterizadapelo fato de que ela contém, adicionalmente, pelo menosum excipiente, que é farmaceuticamente compatível com acitoquina da família IL-6, ou com a seqüência de DNAque a codifica, e com o interferon-α, ou a seqüência deDNA que o codifica.

19. - Composição farmacêutica de acordo coma reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que acitoquina da família IL-6 e o interferon-α são carrea-dos em agentes carreadores respectivos.

20. - Kit farmacêutico para o tratamento deume enfermidade viral, caracterizado pelo fato de que omesmo compreende pelo menos:- um primeiro componente que compreendepelo menos uma citoquina da família IL-6 -família gpl30- ou uma seqüência de DNA que codifica a dita citoqui-na; sendo a dita citoquina selecionada a partir de IL-11, o fator inibidor da leucemia, oncostatina M, cardi-otrofina-1, fator neutrófico ciliar, a citoquina seme-lhante a cardiotrofina e as suas combinações,um segundo componente que compreendepelo menos um interferon-α ou uma seqüência quecodifica o dito interferon-a.

21. - Kit de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que a citoquina da famíliaIL-6 é cardiotrofina-1 ou oncostatin M.

22. - Kit de acordo com as reivindicações 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que a citoquina dafamília IL-6 é selecionada entre a proteína nativacompleta, uma seqüência polipeptídica parcial da ditacitoquina que mantém os efeitos fisiológicos dacitoquina completa e uma seqüência polipeptídica quetem uma homologia com a dita citoquina nativa maior doque 80% e que mantém os efeitos fisiológicos dacitoquina completa.

23. - Kit de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que a dita seqüênciapolipeptídica tem uma homologia com a dita citoquinanativa maior do que 90%.

24. - Kit de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que a dita seqüência poli-peptidica tem uma homologia com a dita citoquina nativamaior do que 95%.

25. - Kit de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o interferon-α éselecionado a partir de interferon-a-2a, interferon-a-2b, interferon-a-5, interferon consenso, IFN-apurificado, o interferon-α pegilado e as suascombinações.

26. - Kit de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o interferon-α é sele-cionado a partir de interferon-a-2b pegilado, interfe-ron-a-2a pegilado, interferon-a-5 pegilado e as suascombinações.

27. - Kit de acordo com as reivindicações 22 a 26, caracterizado pelo fato de que compreende,além disso, um terceiro componente, que compreende umou mais excipientes que são farmaceuticamentecompatíveis com a citoquina da família IL-6, ou aseqüência de DNA que a codifica, e com o interferon-α,ou a seqüência de DNA que o codifica.

28. - Kit de acordo com qualquer uma dasreivindicações 22 a 27, caracterizado pelo fato de que,adicionalmente, ele compreende um terceiro componenteque compreende um ou mais agentes carreadores que sãofarmaceuticamente compatíveis com a citoquina dafamília IL-6 e com o interferon-α.

29. - Kit de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o primeiro componentecompreende, adicionalmente, pelo menos um excipiente,que é farmaceuticamente aceitável e compatível com acitoquina da família IL-6 e com o interferon-a.

30. - Kit de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o segundo componentecompreende, adicionalmente, um ou mais excipientes quesão farmaceuticamente aceitáveis e compatíveis com acitoquina da família IL-6 e com o interferon-a.

31. - Kit de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundocomponentes estão presentes em composiçõesfarmacêuticas separadas.

32. - Kit de acordo com a reivindicação 22,caracterizado pelo fato de que o primeiro e segundocomponentes estão presentes na mesma composiçãofarmacêutica.

33. - Método para o tratamento de uma en-fermidade viral, caracterizado pelo fato de compreendera administração combinada de uma quantidade terapeuti-camente efetiva de pelo menos uma citoquina da famíliaIL-6 - família gpl30 - selecionada a partir de IL-11, ofator de inibição de leucemia, oncostatina M, cardio-trofina-1, fator neurotrófico ciliar, a citoquina seme-lhante a cardiotrofina e as suas combinações, e umaquantidade terapeuticamente efetiva de pelo menos uminterferon-a.

34. - Método de acordo com a reivindicação-33, caracterizado pelo fato de que a enfermidade viralé uma hepatite C.

35. - Método de acordo com uma das reivin-dicações 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que a ci-toquina da família IL-6 é selecionada a partir da pro-teína nativa completa, uma seqüência polipeptídica par-cial da dita citoquina que mantém os efeitos da cito-quina completa, e uma seqüência polipeptídica que temuma homologia com a dita citoquina nativa maior do que 80% e que mantém os efeitos fisiológicos da citoquinacompleta.

36. - Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a dita seqüênciapolipeptídica tem uma homologia com a dita citoquinanativa maior do que 90%.

37 - Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a dita seqüência po-lipeptídica tem uma homologia com a dita citoquina na-tiva maior do que 95%.

38. - Método de acordo com uma das reivin-dicações 33 a 37, caracterizado pelo fato de que com-preende a administração combinada da cardiotrofina-1 einterferon-a.

39. - Método de acordo com uma das reivin-dicações 33 a 37, caracterizado pelo fato de que com-preende a administração combinada da oncostatina M einterferon-a.

40. - Método de acordo com uma das reivin-dicações 33 a 37, caracterizado pelo fato de que com-preende a administração combinada e simultânea da car-diotrofina-1 e interferon-a.

41. - Método de acordo com uma das reivin-dicações 33 a 37, caracterizado pelo fato de que com-preende a administração combinada e simultânea da on-costatina M e interferon-a.

42. - Método de acordo com uma das reivin-dicações 33 a 41, caracterizado pelo fato de que o in-terferon-a foi selecionado a partir de interferon-a-2a,interferon-a-2b, interferon-a-5, Interferon consenso,interferon-a purificado, interferon-α pegilado e assuas combinações.

43. - Método de acordo com uma das reivin-dicações 33 a 42, caracterizado pelo fato de que o in-terferon-α é selecionado a partir de interferon-a-2bpegilado, interferon-a-2a pegilado, interferon-a-5 pe-gilado e as suas combinações.

44. - Método de acordo com uma das reivin-dicações 30 a 39, caracterizado pelo fato de que a ci-toquina da família IL-6 e o interferon-α estão presen-tes na mesma composição farmacêutica que se administraao paciente.

45. - Método de acordo com uma das reivin-dicações 33 a 43, caracterizado pelo fato de que a ci-toquina da família IL-6 e o interferon-α são adminis-trados em composições farmacêuticas separadas.