BRPI0612183A2

BRPI0612183A2 - metionina-alanina-prolina e/ou isoleucina-treonina-prolina ou seus sais, seus usos, métodos de tratamento, medicamento, suplemento alimentìcio, alimento, composições, processos de produção de isoleucina-treonina-prolina ou seu sal, de produção de metionina-alanina-prolina ou seu sal e de produção de metionina-alanina-prolina e/ou isoleucina-treonina-prolina

Info

Publication number: BRPI0612183A2
Application number: BRPI0612183-7A
Authority: BR
Inventors: Luppo Edens; Cinderella Christina Gerhardt; Platerink Christianus Jacobus Van; Swen Wolfram
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 2005-04-28
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2010-10-26
Also published as: ZA200709006B; AU2006239562A1; AU2006239562B2; EP1881841A1; WO2006114195A1; US20090143311A1

Abstract

METIONINA-ALANINA-PROLINA EIOU ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SEUS SAIS, SEUS USOS, MéTODOS DE TRATAMENTO, MEDICAMENTO, SUPLEMENTO ALIMENTìCIO, ALIMENTO, COMPOSIçõES, PROCESSOS DE PRODUçãO DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SEUSAL, DE PRODUçãO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA OU SEU SAL E DE PRODUçãO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA EIOU ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA. A presente invenção descreve o uso de metionina-alanina-prolína (MAP) e/ou isoleucina-treonina-prolina (ITP) ou seu sal como um nutracêutico, preferencialmente um medicamento.

Description

"METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINAOU SEUS SAIS, SEUS USOS, MÉTODOS DE TRATAMENTO, MEDICAMENTO,SUPLEMENTO ALIMENTÍCIO, ALIMENTO, COMPOSIÇÕES, PROCESSOS DEPRODUÇÃO DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SEUSAL, DE PRODUÇÃODE METIONINA-ALANINA-PROLINA OU SEU SAL E DE PRODUÇÃO DEMETIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a composição nutracêutica inovadora.

Antecedentes da Invenção

A presente invenção refere-se a composições que compreendemòs tripeptídeos Metionina-Alanina-Prolina (Met-Ala-Pro, de agora em dianteΜΑΡ) e/ou Isoleucina-Treonina-Prolina (Ile-Thr-Pro1 de agora em diante ITP).

Mais especificamente, a presente invenção refere-se a composições quecompreendem MAP e/ou ITP utilizados para melhorar a saúde ou para aprevenção e/ou tratamento de doenças. As composições são especialmente úteispara o tratamento ou prevenção de pressão sangüínea alta (de agora em diante:hipertensão) e insuficiência cardíaca, ou condições associadas tais como anginapectoris, enfarte do miocárdio, apoplexia, doença obstrutiva arterial periférica,arteriosclerose e nefropatia. Em outro aspecto, a presente invenção refere-se aouso de MAP e/ou ITP na fabricação de composição nutracêutica para consumoconcomitante no tratamento ou prevenção de hipertensão e insuficiência cardíaca.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de tratamentoou prevenção de hipertensão e insuficiência cardíaca, ou associada tal como anginapectoris, enfarte do miocárdio, apoplexia, doença obstrutiva arterial periférica,arteriosclerose e nefropatia, em que quantidade eficaz de composição quecompreende MAP e/ou ITP é administrada a indivíduo necessitado dessetratamento.

Sabe-se que a hipertensão é uma das causas de morte prematuraque podem ser prevenidas mais importantes em todo o mundo. Além disso,mesmo uma pressão sangüínea na extremidade superior da faixa normal éconsiderada um aumento do risco de morte prematura. Hipertensão é um fatorde risco importante para doenças cardíacas coronarianas e o fator de riscomais importante para apoplexia. Ele contribui para cerca da metade de todasas doenças cardiovasculares, que representaram 16,7 milhões de mortesglobais em 2002. O risco de doença cardiovascular dobra para cada aumento dedez pontos na pressão sangüínea diastólica ou a cada aumento de vinte pontos dapressão sistólica. Na maior parte dos países, até um terço dos adultos sofre dehipertensão. A incidência de hipertensão está aumentando com a idade e estatendência é especialmente proeminente nos países em desenvolvimento. Alémdisso, estima-se que 40% dos pacientes hipertensos permaneçam sem diagnóstico.

Atualmente, não há terapia curativa disponível para pacienteshipertensos e o objetivo principal do tratamento é reduzir a pressão sangüíneapara níveis mais seguros. Modificações da alimentação e estilo de vida, taiscomo mais exercícios, redução da ingestão de sal e administração eficaz doestresse, podem também representar ferramentas para a prevenção dahipertensão. Por sua vez, isso pode reduzir a necessidade de medicamentos,que são comumente associados a efeitos colaterais que variam de tosse secaaté perda de energia para atividades da vida diária. Existe, portanto, enormedemanda para prevenção e tratamento de hipertensão por meio desuplementos alimentícios que sejam seguros e não associados aos efeitoscolaterais de drogas atualmente utilizadas para o tratamento de hipertensão.

Atualmente, os inibidores de ECA, antagonistas receptores deangiotensina II, bloqueadores de canais de cálcio, diuréticos e bloqueadoresbeta são amplamente utilizados para o tratamento de hipertensão. Inibidores deECA reduzem os níveis de angiotensina II, hormônio peptídico conhecido poraumentar a pressão sangüínea. Antagonistas receptores de angiotensina Ilbloqueiam a ligação de angiotensina Il ao seu receptor e, desta forma exercemefeitos redutores da pressão sangüínea. Bloqueadores de canais de cálcioreduzem a entrada de cálcio em células da parede dos vasos sangüíneos e,desta forma, reduzem a constrição de vasos sangüíneos, o que, por sua vez,reduz a pressão sangüínea. Diuréticos geram maior excreção urinária de sódioe água, o que gera redução da pressão sangüínea. Bloqueadores betabloqueiam a ação de norepinefrina e epinefrina sobre receptores adrenérgicosbeta e, desta forma, reduzem a constrição de vasos sangüíneos e abaixam apressão sangüínea.

Descrição da Invenção

A presente invenção refere-se a MAP e/ou ITP ou sal de MAPe/ou seu sal de ITP como nutracêutico, preferencialmente medicamento. Apresente invenção também se refere ao uso de MAP e/ou ITP ou sal de MAPe/ou sal de ITP como um nutracêutico, preferencialmente um medicamento, aouso de MAP e/ou ITP ou sal de MAP e/ou sal de ITP para a fabricação denutracêutico, preferencialmente medicamento, ao uso de MAP e/ou ITP ou salde MAP e/ou sal de ITP para a melhoria da saúde ou a prevenção e/outratamento de doenças, ao uso de MAP e/ou ITP ou sal de MAP e/ou sal deITP para a fabricação de nutracêutico, preferencialmente medicamento para otratamento de doenças cardiovasculares tais como hipertensão e insuficiênciascardíacas, ao uso de MAP e/ou ITP ou sal de MAP e/ou sal de ITP para otratamento de pré-diabetes ou diabetes, ao uso de MAP e/ou ITP ou sal deMAP e/ou sal de ITP para o tratamento ou prevenção de obesidade, ao uso deMAP e/ou ITP ou sal de MAP e/ou sal de ITP para aumentar a insulinaplasmática ou para aumentar a sensibilidade à insulina plasmática, ao uso deMAP e/ou ITP ou sal de MAP e/ou sal de ITP para aumentar a insulinaplasmática ou para aumentar a sensibilidade para insulina plasmática dediabetes do tipo 2 ou pré-diabetes, ao uso de MAP e/ou ITP ou sal de MAPe/ou sal de ITP para reduzir as concentrações de glicose pós-prandial emsangue com diabetes do tipo 2 ou pré-diabetes, ao uso de MAP e/ou ITP ou salde MAP e/ou sal de ITP para aumentar a secreção de insulina pós-prandial emsangue com diabetes do tipo 2 ou pré-diabetes, ao uso de MAP e/ou ITP ou salde MAP e/ou sal de ITP em que MAP e/ou ITP encontram-se na forma desuplemento alimentar, ao uso de MAP e/ou ITP ou sal de MAP e/ou sal de ITPpara a fabricação de produto alimentício funcional para o tratamentoterapêutico dos efeitos de estresse, ao uso de MAP e/ou ITP ou sal de MAP e/ousal de ITP em aplicações tópicas, preferencialmente em aplicações de cuidadospessoais, e ao uso de MAP e/ou ITP ou sal de MAP e/ou sal de ITP em alimentaçãoe alimentos para animais de estimação. MAP é o tripeptídeo preferido e é preferidonos usos de acordo com a presente invenção.

Além disso, a presente invenção refere-se a um método detratamento de diabetes do tipo 1 e 2 e para a prevenção de diabetes do tipo 2em indivíduos com pré-diabetes ou tolerância a glicose alterada (IGT) quecompreende a administração a paciente necessitado desse tratamento de MAPe/ou ITP ou sal de MAP e/ou sal de ITP e a método de tratamento de pessoasque sofrem de hipertensão ou insuficiência cardíaca ou sua prevenção, quecompreende a administração a paciente necessitado desse tratamento de MAPe/ou ITP ou sal de MAP e/ou sal de ITP.

Segundo um aspecto adicional da presente invenção, é descritométodo de síntese química de MAP e/ou ITP ou sal de MAP e/ou sal de ITP.Além disso, a presente invenção refere-se a um medicamento que compreendeMAP e/ou ITP ou sal de MAP e/ou sal de ITP como ingrediente ativo, umsuplemento alimentar que compreende MAP e/ou ITP ou sal de MAP e/ou salde ITP como ingrediente ativo, um alimento que compreende MAP e/ou ITP ousal de MAP e/ou sal de ITP como ingrediente ativo, composição quecompreende MAP e/ou ITP ou sal de MAP e/ou sal de ITP como medicamentoou para benefícios à saúde, uma composição em que o benefício à saúde é otratamento dos efeitos de estresse, a composição é preferencialmente alimentoou ração, composição que compreende MAP e/ou ITP ou sal de MAP e/ou salde ITP para uso como agente tópico local preferencialmente para uso emcuidados pessoais e a uma composição que é uma loção, um gel ou umaemulsão.

Segundo a presente invenção, foi descrito de modosurpreendente que tanto MAP quanto ITP inibem enzima de conversão deangiotensina I (ECA) e, desta forma, exibem efeitos redutores da pressãosangüínea. A inibição de ECA resulta na redução de vasoconstrição, aumentoda vasodilatação, aumento da excreção de sódio e água que, por sua vez, geraredução da resistência vascular periférica e da pressão sangüínea e aumentodo fluxo sangüíneo local. Desta forma, as composições do presente sãoparticularmente eficazes para a prevenção e o tratamento de doenças quepodem ser influenciadas por inibição de ECA, que incluem, mas sem limitar-sea hipertensão, insuficiência cardíaca, angina pectoris, enfarte do miocárdio,apoplexia, doença obstrutiva arterial periférica, arteriosclerose, nefropatia,insuficiência renal, disfunção erétil, disfunção endotelial, hipertrofia ventricularesquerda, vasculopatia diabética, retenção de fluidos e hiperaldosteronismo. Ascomposições podem também ser úteis na prevenção e tratamento dedisfunções gastrointestinais (diarréia, síndrome intestinal irritável), inflamações,diabetes mellitus, obesidade, demência, epilepsia, confusão geriátrica e mal deMeniere. Além disso, as composições podem aumentar a função cognitiva e amemória (incluindo mal de Alzheimer), sensação de saciedade, limitam lesõesisquêmicas e evitam a re-oclusão de artéria após cirurgia de ponte de safenaou angioplastia. Diabetes mellitus é uma doença crônica disseminada que até omomento não tem cura. A incidência e prevalência de diabetes mellitus estáaumentando exponencialmente e está entre as disfunções metabólicas maiscomuns em países desenvolvidos e em desenvolvimento. Diabetes mellitus éuma doença complexa derivada de diversos fatores causadores ecaracterizada por impedimento do metabolismo de carboidratos, proteínas egorduras, associado a deficiência da secreção de insulina e/ou resistência àinsulina. Isso resulta em aumento da alimentação e das concentrações deglicose no soro pós-prandial, o que gera complicações se mantido semtratamento. Existem duas categorias principais da doença, diabetes mellitusdependente de insulina (IDDM, T1DM) e diabetes mellitus não dependente deinsulina (NIDDM, T2DM). T1DM = diabetes mellitus do tipo 1. T2DM = diabetesmellitus do tipo 2.

Diabetes T1DM e T2DM são associadas a hiperglicemia,hipercolesterolemia e hiperlipidemia. A deficiência de insulina absoluta einsensibilidade a insulina em T1DM e T2DM, respectivamente, gera redução dautilização de glicose pelo fígado, músculos e tecido adiposo e a aumento dosníveis de glicose no sangue. Hiperglicemia descontrolada é associada aaumento e mortalidade prematura devido a aumento do risco de doençasmicrovasculares e macrovasculares, incluindo nefropatia, neuropatia,retinopatia, hipertensão, apoplexia e doenças cardíacas. Evidências recentesdemonstraram que um estrito controle glicêmico é fator importante naprevenção destas complicações em T1DM e T2DM. Portanto, controleglicêmico ideal por drogas ou regimes terapêuticos é uma abordagemimportante para o tratamento de diabetes. Terapia de T2DM envolveinicialmente alterações alimentícias e de estilo de vida. Quando estas medidasdeixam de manter controle glicêmico adequado, os pacientes são tratados comagentes hipoglicêmicos orais e/ou insulina exógena. Os agentesfarmacológicos orais atuais para o tratamento de T2DM incluem aqueles quepotencializam secreção de insulina (agentes de sulfoniluréia), os queaumentam a ação de insulina no fígado (agentes de biguanida), agentessensibilizantes de insulina (tiazolidinodionas) e agentes que atuam para inibir aabsorção de glicose (inibidores de α-glicosidase). Entretanto, os agentesdisponíveis atualmente geralmente deixam de manter controle glicêmicoadequado a longo prazo, devido à deterioração progressiva de hiperglicemia,resultante da perda progressiva da função das células pancreáticas. Aproporção de pacientes capazes de manter os níveis de glicemia alvo énotadamente reduzida ao longo do tempo, necessitando da administração deagentes farmacológicos adicionais/alternativos. Além disso, as drogas podempossuir efeitos colaterais indesejados e são associadas a altas taxas de falhasprimárias e secundárias, por fim, o uso de drogas hipoglicêmicas pode sereficaz no controle dos níveis de glicose no sangue, mas podem não evitar todasas complicações de diabete. Desta forma, os métodos atuais de tratamento paratodos os tipos de diabetes mellitus deixam de atingir os ideais de normoglicemia e aprevenção de complicações diabéticas.

Portanto, embora as terapias selecionadas no tratamento deT1DM e T2DM sejam baseadas essencialmente na administração de insulina ede drogas hipoglicêmicas orais, existe a necessidade de suplemento nutricionalseguro e eficaz com efeitos colaterais mínimos para o tratamento e prevençãode diabetes. Muitos pacientes estão interessados em terapias alternativas quepoderão minimizar os efeitos colaterais associados a alta dosagem de drogas erender benefícios clínicos adicionais. Pacientes com diabetes mellitus possueminteresse especial em tratamento considerado "natural" com suaves efeitosantidiabéticos e sem efeitos colaterais importantes, que podem ser utilizadoscomo tratamento adjuvante. T2DM é uma doença crônica progressiva, quenormalmente não é reconhecida até a ocorrência de danos significativos àscélulas pancreáticas responsáveis pela produção de insulina (células β dasilhotas de Langerhans). Existe, portanto, interesse crescente nodesenvolvimento de suplemento alimentício que possa ser utilizado para evitardanos às células β e, desta forma, o progresso para T2DM manifesta empessoas em risco, especialmente, em idosos, que apresentam alto risco dedesenvolvimento de T2DM. A proteção de células β pancreáticas pode seratingida por meio da redução dos níveis de glicose e/ou lipídios do sangue,pois glicose e lipídios exercem efeitos prejudiciais sobre as células β. Aredução dos níveis de glicose do sangue pode ser atingida por meio dediferentes mecanismos, tais como por meio de aumento da sensibilidade àinsulina e/ou de redução da produção de glicose hepática. A redução dosníveis de lipídios no sangue pode também ser atingida por meio de diferentesmecanismos, tais como por meio de aumento da oxidação de lipídios e/ouarmazenagem de lipídios. Outra possível estratégia para proteger as células βpancreáticas seria a redução do estresse oxidativo. Estresse oxidativo tambémcausa danos às células β com subseqüente perda de secreção de insulina eprogressão para T2DM manifesta.

Portanto, T2DM é uma doença complicada resultante de defeitoscoexistentes em diversos locais de órgãos: resistência à ação de insulina emtecidos musculares e adiposos, defeito na secreção de insulina pancreática,produção de glicose hepática sem restrições. Estes defeitos sãofreqüentemente associados a anormalidades de lipídios e disfunçõesendoteliais. Dadas as diversas lesões patofisiológicas em T2DM, terapia decombinação é abordagem atraente para a sua administração.

A presente invenção refere-se a composições nutracêuticasinovadoras que compreendem MAP e/ou ITP. As composições nutracêuticasque compreendem MAP e/ou ITP podem também compreender um hidrolisado,proteínas não hidrolisadas e carboidratos como ingredientes ativos para otratamento ou prevenção de diabetes mellitus ou outras condições associadasà tolerância à glicose alterada, tais como síndrome X. Em outro aspecto, apresente invenção refere-se ao uso dessas composições como suplementonutricional para o mencionado tratamento ou prevenção, tal como na forma deaditivo para preparações multivitamínicas que compreendem vitaminas eminerais que são essenciais para a manutenção da função metabólica normal,mas não são sintetizadas no corpo. Em ainda outro aspecto, a presenteinvenção refere-se a método de tratamento de diabetes mellitus tipo 1 e 2 epara a prevenção de T2DM nos indivíduos com pré-diabetes, ou tolerância àglicose alterada (IGT) ou obesidade, que compreende a administração apaciente necessitado desse tratamento de MAP e/ou ITP e hidrolisados deproteínas ou proteínas não hidrolisadas e/ou carboidratos.

As composições de acordo com a presente invenção sãoparticularmente destinadas ao tratamento de T1DM e T2DM e para a prevenção deT2DM nos indivíduos com pré-diabetes ou tolerância à glicose alterada (IGT).

A presente invenção refere-se a composição que compreendeMAP e/ou ITP e opcionalmente hidrolisado de proteína. Além disso, estacomposição compreende aminoácido e o aminoácido é preferencialmenteleucina. MAP e/ou ITP e opcionalmente um hidrolisado de proteína éconvenientemente utilizado para aumentar a insulina plasmática no sangue,preferencialmente para diabetes tipo 2 ou pré-diabetes.

Revela-se, surpreendentemente, que este MAP e/ou ITP pode serutilizado para diabetes tipo 2 ou pré-diabetes, preferencialmente para reduziras concentrações de glicose pós-prandial ou para aumentar a secreção deinsulina no sangue pós-prandial

As composições que compreendem combinação de MAP e/ou ITPe hidrolisados de proteínas ou proteínas não hidrolisadas e/ou carboidratosestimulam sinergicamente a secreção de insulina e aumentam o descarte deglicose para tecidos alvo sensíveis a insulina tais como tecido adiposo,músculos do esqueleto e fígado e, portanto, fornecem efeitos sinérgicos notratamento de diabetes mellitus.Reconhece-se geralmente que doenças relativas ao estresse e osefeitos negativos de tensão sobre o corpo possuem impacto significativo sobremuitas pessoas. Nos últimos anos, os efeitos de estresse e sua contribuiçãopara o desenvolvimento de várias doenças e condições ganharam aceitaçãomais ampla na comunidade médico-científica. Os consumidores agora estão setornando cada vez mais conscientes destes problemas potenciais e estão setornando cada vez mais interessados na redução ou prevenção do impactonegativo possível de estresse sobre a sua saúde.

É objeto adicional da presente invenção fornecer produtoalimentício ou ingrediente que pode ser incorporado ao presente, que éapropriado para uso no auxílio do corpo a lidar com os efeitos do estresse.

É objeto adicional fornecer produto alimentício que possui altaconcentração de ingrediente que forneça benefício à saúde, tal como ajudar ocorpo a lidar com os efeitos negativos do estresse.

Segundo um aspecto, a presente invenção fornece o uso dotripeptídeo MAP e/ou do tripeptídeo ITP e/ou seus sais para a fabricação de produtoalimentício funcional para o tratamento terapêutico dos efeitos de estresse.

Certos peptídeos são conhecidos por exibirem efeitos anti-estresseAcredita-se, portanto, que os tripeptídeos MAP e ITP e/ou seus sais sejam muitoapropriados para uso no fornecimento desse benefício à saúde. Os técnicos noassunto sabem bem como determinar essas propriedades para um material.

O termo nutracêutico, da forma utilizada no presente, indica autilidade no campo farmacêutico e nutricional de aplicação. Desta forma, ascomposições nutracêuticas inovadoras podem encontrar uso como suplementode alimentos e bebidas e como formulações farmacêuticas ou medicamentospara aplicação enteral ou parenteral que podem ser formulações sólidas, taiscomo cápsulas ou pastilhas, ou formulações líquidas, tais como soluções oususpensões. Como será evidente a partir do descrito adiante, a expressãocomposição nutracêutica também compreende alimentos e bebidas quecontenham MAP e/ou ITP e, opcionalmente, hidrolisados de proteína ouproteínas não hidrolisadas e/ou carboidratos, bem como composiçõessuplementares, tais como suplementos alimentícios, que contenham osingredientes ativos mencionados acima.

A expressão suplemento alimentar, da forma utilizada nopresente, indica produto ingerido oralmente que contém "ingredientealimentício" destinado a suplementar a alimentação. Os "ingredientesalimentícios" nestes produtos podem incluir: vitaminas, minerais, ervas ououtros produtos botânicos, aminoácidos e substâncias tais como enzimas,tecidos de órgãos, glandulares e metabólitos. Suplementos alimentícios podemtambém ser extratos ou concentrados e podem ser encontrados em muitasformas tais como pastilhas, cápsulas, géis moles, cápsulas gelatinosas,líquidos ou pós. Eles podem também apresentar-se em outras formas, taiscomo barra, mas se o forem, informações no rótulo do suplemento alimentíciogeralmente não representarão o produto como alimento convencional ou itemisolado de refeição ou alimento.

MAP e/ou ITP pode ser elaborado por meio de hidrólise oufermentação de qualquer substrato apropriado que contenha os fragmentos MAPe/ou ITP. Convenientemente, o substrato de proteína contém os dois fragmentosMAP e/ou ITP. Preferencialmente, o substrato de proteína é caseína ou leite. Ostripeptídeos MAP (Met-AIa-Pro) e ITP (IIe-Thr-Pro) podem também ser elaboradospor meio de síntese química utilizando métodos convencionais.

Segundo a presente invenção, constatou-se surpreendentemente queuma composição que compreende MAP e/ou ITP estimula a secreção de insulinapancreática e aumenta o descarte de glicose para tecidos alvo sensíveis a insulina.Portanto, composições que compreendem MAP e/ou ITP podem ser utilizadas paraevitar ou tratar T1DM e T2DM e para a prevenção de T2DM nos indivíduos compré-diabetes, impedimento da tolerância à glicose (IGT).

O uso de combinações de MAP e/ou ITP e hidrolisados deproteína ou proteínas não hidrolisadas e/ou carboidratos, que individualmenteexercem diferentes mecanismos de ação, são eficazes para atingir e manterníveis alvos de glicose no sangue em pacientes diabéticos.

As combinações dos ingredientes ativos identificados acima foramconcebidas devido às suas ações diferentes, para utilizar-se de efeitossinérgicos e de múltiplos órgãos. Devido a distintos mecanismos de ação dosingredientes ativos individuais, as combinações não apenas aumentam ocontrole glicêmico, mas também resultam em redução da dosagem de drogasem alguns ambientes e minimizam efeitos adversos. Devido aos seusmecanismos e locais de ação distintos, as combinações específicas desuplementos alimentícios discutidas acima também se utilizam de efeitossinérgicos para atingir grau de redução de glicose maior que pode ser atingidopor agentes isolados. Desta forma, embora as terapias selecionadas notratamento terapêutico de T1DM e T2DM baseie-se essencialmente naadministração de insulina e de drogas hipoglicêmicas orais, terapia nutricionalapropriada também é de importância fundamental para o tratamento bemsucedido de diabéticos. Suplemento com minerais e multivitamínico pode seradicionado às composições nutracêuticas de acordo com a presente invençãopara obter quantidade adequada de nutriente essencial que falta em algunsalimentos. O suplemento mineral e multivitamínico pode também ser útil paraevitar doenças e proteger contra perdas nutricionais e deficiências devido apadrões de estilo de vida e padrões alimentícios inadequados comuns às vezesobservados em diabetes. Além disso, estresse oxidativo foi implicado nodesenvolvimento de resistência à insulina. Substância de oxigênio reativo podedificultar a absorção de glicose estimulada por insulina ao prejudicar a cascatade sinalização de receptor de insulina. O controle de estresse oxidativo comantioxidantes tais como α-tocoferol (vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C)pode ser importante no tratamento de diabetes. Portanto, a ingestão desuplemento multivitamínico pode ser adicionada às substâncias ativasmencionadas acima para manter uma nutrição bem equilibrada.

Além disso, a combinação de MAP e/ou ITP com minerais taiscomo magnésio (Mg2+), cálcio (Ca2+) e/ou potássio (K+) pode ser utilizada paramelhoria da saúde e prevenção e/ou tratamento de doenças que incluem, massem limitar-se a doenças cardiovasculares e diabetes.

Em um aspecto preferido da presente invenção, a composiçãonutracêutica de acordo com a presente invenção contém MAP e/ou ITP ehidrolisados de proteínas. MAP e/ou ITP encontra-se adequadamente presentena composição de acordo com a presente invenção em quantidade parafornecer dosagem diária de cerca de 0,001 g por quilo de peso do corpo acerca de 1 g/kg de peso do corpo do paciente a quem deve ser administrada.Alimento ou bebida contém adequadamente cerca de 0,05 g por porção a cercade 50 g por porção de MAP e/ou ITP. Caso a composição nutracêutica sejaformulação farmacêutica, essa formulação pode conter MAP e/ou ITP emquantidade de cerca de 0,001 g a cerca de 1 g por unidade de dosagem, talcomo por cápsula ou pastilha, ou cerca de 0,035 g por dose diária a cerca de70 g por dose diária de formulação líquida. Hidrolisados de proteínas estãoadequadamente presentes na composição de acordo com a presente invençãoem quantidade para fornecer dosagem diária de cerca de 0,01 g/kg de peso docorpo a cerca de 3 g/kg de peso do corpo do paciente a quem deve seradministrado. Alimento ou bebida contém adequadamente cerca de 0,1 g porporção a cerca de 100 g por porção de hidrolisados de proteínas. Caso acomposição nutracêutica seja uma formulação farmacêutica, essa formulaçãopode conter hidrolisados de proteínas em quantidade de cerca de 0,01 g acerca de 5 g por unidade de dosagem, tal como por cápsula ou pastilha, oucerca de 0,7 g por dose diária a cerca de 210 g por dose diária de formulaçãolíquida.

Em outro aspecto preferido da intervenção, a composição contémMAP e/ou ITP conforme especificado acima e proteínas não hidrolisadas. Proteínasnão hidrolisadas estão adequadamente presentes na composição de acordo com apresente invenção em quantidade para fornecer dosagem diária de cerca de 0,01 gp/ kg de peso do corpo a cerca de 3 g/kg de peso do corpo do paciente a quemdeve ser administrada. Alimento ou bebida contém adequadamente cerca de 0,1 gpor porção a cerca de 100 g por porção de proteínas não hidrolisadas. Caso acomposição nutracêutica seja uma formulação farmacêutica, essa formulação podeconter proteínas não hidrolisadas em quantidade de cerca de 0,01 g a cerca de 5 gpor unidade de dosagem, tal como por cápsula ou pastilha, ou cerca de 0,7 g pordose diária a cerca de 210 g por dose diária de formulação líquida. Em ainda outroaspecto preferido da intervenção, a composição contém MAP e/ou ITP ehidrolisados de proteína ou proteínas não hidrolisadas conforme especificado acimae carboidratos. Carboidratos estão adequadamente presentes na composição deacordo com a presente invenção em quantidade para fornecer dosagem diária decerca de 0,01 g/kg de peso do corpo a cerca de 7 g/kg de peso do corpo dopaciente a quem deve ser administrada. Alimento ou bebida contémadequadamente cerca de 0,5 g por porção a cerca de 200 g por porção decarboidratos. Caso a composição nutracêutica seja uma formulação farmacêutica,essa formulação pode conter carboidratos em quantidade de cerca de 0,05 g acerca de 10 g por unidade de dosagem, tal como por cápsula ou pastilha, ou cercade 0,7 g por dose diária a cerca de 490 g por dose diária de formulação líquida.

Composições nutracêuticas preferidas de acordo com a presenteinvenção compreendem MAP e/ou ITP e hidrolisados de proteína ou proteínasnão hidrolisadas e/ou carboidratos, especialmente as combinações de:

MAP e/ou ITP e hidrolisados de proteínas;MAP e/ou ITP e hidrolisados de proteínas e carboidratos;

MAP e/ou ITP e proteínas não hidrolisadas;

MAP e/ou ITP e proteínas não hidrolisadas e carboidratos.

É de preferência superior a combinação de MAP e/ou ITP ehidrolisados de proteínas.

Faixas de dosagem (para pessoa de 70 kg):

MAP e/ou ITP: 0,005 a 70 g/dia.

Hidrolisados de proteínas: 0,07 a 210 g/dia.

Proteínas não hidrolisadas: 0,07 a 210 g/dia.Carboidratos: 0,1 a 490 g/dia.

Os tripeptídeos MAP (Met-AIa-Pro) e ITP (IIe-Thr-Pro) podem serelaborados por meio de uma série de métodos que incluem síntese química,hidrólise enzimática e fermentação de soluções que contêm proteínas.

A identificação de peptídeos biologicamente ativos em misturascomplexas tais como hidrolisados de proteínas ou líquidos resultantes dafermentação é tarefa desafiadora. Além das questões básicas: estamosutilizando o substrato de proteína correto, estamos utilizando a enzima correta,estamos utilizando a cultura microbiana correta, pode-se esperar que diversospeptídeos biologicamente ativos estejam presentes em amostras complexascontendo milhares de peptídeos. As abordagens de identificação tradicionaisque empregam ciclos repetidos de fracionamento cromatográfico de líquidos dealta eficiência (HPLC) e avaliação bioquímica geralmente são demorados epropensos a perdas dos peptídeos biologicamente ativos presentes, o quetorna a detecção de bioatividade relevante extremamente difícil. No presentetrabalho, utilizou-se equipamento muito sofisticado e muitos hidrolisados deproteínas e caldos de fermentação diferentes foram selecionados, gerando porfim a identificação dos dois peptídeos inovadores MAP e ITP que possuempropriedades inibidoras de ECA. Na nossa abordagem, teste bioquímico defluxo contínuo foi acoplado em linha a sistema de fracionamento de HPLC. Oefluente da coluna de HPLC foi dividido entre bioteste de ECA de fluxocontínuo e método de análise química (espectrometria de massa). Hidrolisadosbrutos e caldos de fermentação foram separados por meio de HPLC, após oquê a presença de compostos biologicamente ativos foi detectada por meio doteste bioquímico em linha. Espectros de massa foram registradoscontinuamente, de forma que informações estruturais fossem imediatamentedisponíveis quando peptídeo exibisse sinal positivo no teste bioquímico. Ostripeptídeos MAP e ITP identificados por meio da abordagem mencionadaacima podem ser produzidos por meio de vários métodos, que incluemprocessos de produção economicamente viáveis. A produção por meio desíntese química é possível utilizando métodos convencionais, conformedescrito, por exemplo, em Peptides: Chemistry and Biology de N. Sewald e H.D. Jakubke1 Eds. WiIey-VCH Verlag GmbH, 2002, Capítulo 4. Métodos eficazespara o custo específicos de síntese química de peptídeos apropriada paraprodução em larga escala baseiam-se no uso de cloroformatos de alquila oucloreto de pivaloíla para ativação do grupo carboxílico combinado com o uso demetil ésteres para proteção C-terminal e grupos benziloxicarbonila (Z) ou terc-butiloxiarbonila para N-proteção. No caso de MAP, por exemplo, metiléster deL-prolina pode ser acoplado a Z-Ala ativado por cloroformato de isobutila; odipeptídeo resultante pode ser Z-desprotegido por meio de hidrogenóliseutilizando hidrogênio e Pd sobre C e novamente acoplado com Z-Met ativadopor cloroformato de isobutila; do tripeptídeo resultante, o metil éster éhidrolisado utilizando NaOH e, após Z-desproteção por meio de hidrogenólise,é obtido o tripeptídeo Met-Ala-Pro. De forma similar, Ile-Thr-Pro pode sersintetizado mas, durante as reações de acoplamento, a função hidróxi de Thrrequer proteção com benzila; na etapa final, este grupo é removidosimultaneamente durante a Z-desproteção. MAP e/ou ITP podem também serelaborados por meio de hidrólise enzimática ou de abordagens fermentativasque utilizam qualquer substrato de proteína que contenha as seqüências deaminoácidos MAP e/ou ITP. Convenientemente, o substrato de proteínacontém os dois fragmentos, MAP e ITP. Substratos de proteínas preferidospara essas abordagens enzimáticas ou fermentativas são leite bovino ou afração de caseína de leite bovino. Por meio da otimização das condições defermentação ou hidrólise, a produção das moléculas biologicamente ativasMAP e/ou ITP pode ser maximizada. Os técnicos no assunto que tentammaximizar a produção saberão como ajustar os parâmetros do processo, taiscomo hidrólise/tempo de fermentação, hidrólise/temperatura de fermentação,enzima/tipo de microorganismo e concentração etc.

MAP e/ou ITP ou composições que compreendem MAP e/ou ITPsão convenientemente hidrolisados e preferencialmente elaborados de acordocom processo que envolve as etapas a seguir:

(a) hidrólise enzimática de substrato de proteína apropriado quecompreende MAP ou ITP na sua seqüência de aminoácidos, resultando em produtode proteína hidrolisada que compreende os tripeptídeos MAP e/ou ITP;

(b) separação do produto de proteína hidrolisada de fração ricaem tripeptídeo MAP e/ou tripeptídeo ITP; e, opcionalmente,

(c) concentração e/ou secagem da fração da etapa (b) para obterlíquido concentrado ou sólido rico em tripeptídeo MAP e/ou tripeptídeo ITP.

A etapa (a) da hidrólise enzimática pode ser qualquer tratamentoenzimático do substrato de proteína apropriado que gera hidrólise da proteína,o que resulta em liberação de tripeptídeos MAP e/ou ITP. Embora diversascombinações de enzimas possam ser utilizadas para liberar os tripeptídeosdesejados do substrato de proteína, a enzima preferida utilizada no presenteprocesso é endoprotease específica de prolina ou oligopeptidase específica deprolina. Substrato de proteína apropriada pode ser qualquer substrato que englobea seqüência de aminoácidos MAP e/ou ITP. Substratos de proteínas conhecidos porenglobarem MAP são, por exemplo, caseína, glúten de trigo, isolado de proteína degirassol, proteína de arroz e proteína de ovo. Substratos de proteínas apropriadosenglobam preferencialmente as seqüências de aminoácidos AMAP ou PMAP àmedida que ocorrem em beta-caseína bovina, fração de alfa-gliadina de glúten detrigo e na fração 2S de isolado de proteína de girassol.

O substrato de caseína pode ser qualquer material que contenhaquantidade substancial de beta-caseína e alfa-s2-caseína. Exemplos desubstratos apropriados são leite bem como caseína, caseína em pó,concentrados de pó de caseína, isolados de pó de caseína ou beta-caseína oualfa-s2-caseína. Preferencialmente, substrato que contém alto teor de caseína,tal como isolado de proteína de caseína (CPI).

A enzima pode ser qualquer enzima ou combinação de enzimasque seja capaz de hidrolisar proteína tal como beta-caseína e/ou alfa-s2-caseína,resultando na liberação de um ou mais dos tripeptídeos de MAP e/ou ITP.

A etapa de separação (b) pode ser executada de qualquer formaconhecida do técnico no assunto, tal como por meio de precipitação, filtragem,centrifugação, extração ou cromatografia e suas combinações.Preferencialmente, a etapa de separação (b) é executada utilizando métodosde micro ou ultrafiltragem. O tamanho dos poros das membranas utilizadas naetapa de filtragem, bem como a carga da membrana, podem ser utilizados paracontrolar a separação do tripeptídeo MAP e/ou do tripeptídeo ITP. Ofracionamento de hidrolisados de proteína de caseína utilizando membranas deUF/NF carregadas é descrito em Y. Poilot et al, Journal of Membrane Science158 (1999): 105-114.

A etapa de concentração (c) pode envolver nanofiltração ouevaporação da fração gerada pela etapa (b) para gerar líquido altamenteconcentrado. Caso adequadamente formulado, tal como baixa atividade emágua (Aw)1 baixo pH e, preferencialmente, conservante tal como benzoato ousorbato, essas composições líquidas concentradas formam uma maneiraatrativa de armazenagem dos tripeptídeos de acordo com a presente invenção.

Opcionalmente, a etapa de evaporação é seguida por etapa de secagem, talcomo por meio de secagem por pulverização ou secagem por congelamento,para gerar um sólido que contém alta concentração de MAP e/ou ITP.

O processo enzimático compreende preferencialmente uma únicaetapa de incubação de enzimas. O processo enzimático de acordo com apresente invenção refere-se ainda ao uso de protease específica de prolina queé preferencialmente livre de atividades enzimáticas contaminantes. Proteaseespecífica de prolina é definida como protease que hidrolisa união de peptídeosna extremidade carbóxi-terminal de prolina. A protease específica de prolinapreferida é protease que hidrolisa a união de peptídeos na extremidadecarbóxi-terminal de resíduos de prolina e alanina. A protease específica de prolinaé preferencialmente capaz de hidrolisar grandes moléculas de proteínas tais comopolipeptídeos ou a própria proteína. O processo de acordo com a presente invençãopossui em geral tempo de incubação de menos de 24 horas, preferencialmente otempo de incubação é de menos de dez horas e, de maior preferência, menos dequatro horas. A temperatura de incubação é geralmente de mais de 30 0C,preferencialmente mais de 40 0C e, de maior preferência, mais de 50 0C.

Outro aspecto da presente invenção é a purificação e/ou separaçãodos tripeptídeos MAP e ITP de proteína hidrolisada. A maior parte da proteínahidrolisada de acordo com a presente invenção é preferencialmente capaz deprecipitar-se sob condições de pH selecionadas. Este processo de purificaçãocompreende a alteração do pH até o pH no qual a maior parte da proteínahidrolisada e não hidrolisada precipita-se e separa as proteínas precipitadas dostripeptídeos (bioativos) que permanecem em solução.

Para obter os tripeptídeos do presente com resíduo de prolina nasua extremidade carbóxi-terminal, o uso de protease que pode dividir-se nolado carbóxi-terminal de resíduos de prolina oferece opção preferida. Aschamadas prolil oligopeptidases (EC 3.4.21.26) possuem a possibilidadeexclusiva de divisão preferencial de peptídeos no lado carboxila de resíduos deprolina. Prolil oligopeptidases também possuem a possibilidade de dividirpeptídeos no lado carboxila de resíduos de alanina, mas esta última reação émenos eficiente que a divisão de uniões de peptídeos envolvendo resíduos deprolina. Em todas as proteases específicas de prolina adequadamentecaracterizadas isoladas de mamíferos bem como de fontes microbianas, foiidentificado domínio de peptidase exclusivo que exclui peptídeos grandes dolocal ativo da enzima. Na verdade, estas enzimas são incapazes de degradarpeptídeos que contenham mais de cerca de trinta resíduos de aminoácidos, detal forma que estas enzimas sejam agora denominadas "prolil oligopeptidases"(Fulop et al, Ce//, vol. 94, 161-170, 24 de julho de 1998). Conseqüentemente,estas prolil oligopeptidases necessitam de hidrólise prévia com outrasendoproteases antes que possam exercer a sua ação hidrolítica. Conformedescrito em WO 02/45523, entretanto, mesmo a combinação de proliloligopeptidase com essa outra endoprotease resulta em hidrolisadoscaracterizados por proporção significativamente ampliada de peptídeos comresíduo de prolina carbóxi-terminal. Por este motivo, esses hidrolisados formamexcelente ponto de partida para o isolamento dos tripeptídeos com efeitosinibidores de ECA in vitro, bem como maior resistência a degradaçãoproteolítica gastrointestinal.

"Peptídeo" ou "oligopeptídeo" é definido no presente como cadeiade pelo menos dois aminoácidos que são ligados por meio de ligações depeptídeos. Os termos "peptídeo" e "oligopeptídeo" são considerados sinônimos(como é comumente reconhecido) e cada termo pode ser utilizado de formaintercambiável conforme requeira o contexto. "Polipeptídeo" é definido nopresente como cadeia que contém mais de trinta resíduos de aminoácidos.

Todas as fórmulas de (oligo)peptídeos e polipeptídeos ou seqüências nopresente são escritas da esquerda par a direita na direção de amino terminalpara carbóxi terminal, de acordo com a prática comum. O código de uma letrade aminoácidos utilizado no presente é comumente conhecido na técnica epode ser encontrado em Sambrook et al (Molecular Cloning: A LaboratoryManual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor NY1 1989).

Endoprotease é definida no presente como enzima que hidrolisauniões de peptídeos em polipeptídeo de forma endo e pertence ao grupo EC3.4. As endoproteases são divididas em subclasses com base em mecanismocatalítico. Existem sub-subclasses de endoproteases de serina (EC 3.4.21),endoproteases de cisteína (EC 3.4.22), endoproteases aspárticas (EC 3.4.23),metaloendoproteases (EC 3.4.24) e endoproteases de treonina (EC 3.4.25).

Exoproteases são definidas no presente como enzimas que hidrolisam ligaçõesde peptídeos adjacentes a grupo α-amino terminal ("aminopeptidases") ouligação de peptídeos entre o grupo carboxila terminal e o penúltimo aminoácido("carboxipeptidases").

O documento WO 02/45524 descreve protease específica deprolina que pode ser obtida a partir de Aspergillus niger. A enzima derivada deA. niger divide-se preferencialmente no terminal carbóxi de prolina, mas podetambém dividir-se na terminação carbóxi de hidroxiprolina e, seja comeficiência mais baixa, no terminal carbóxi de alanina. WO 02/45524 tambémensina que não existe homologia clara entre esta enzima derivada de A. niger eas prolil oligopeptidases conhecidas de outras fontes de mamíferos emicrobianas. Ao contrário de prolil oligopeptidases conhecidas, a enzima de A.niger possui pH ácido ideal. Embora as prolil oligopeptidases conhecidas, bemcomo a enzima derivada de A. niger, sejam as chamadas proteases de serina,a enzima de A. niger pertence a uma subfamília completamente diferente. Aenzima de A. niger secretada aparentemente é membro da família S28 depeptidases de serina em vez da família S9 na qual foram agrupadas as proliloligopeptidases mais citosólicas (Rawling, N. D. e Barrett1 A. J., Biochim.Biophys. Acta 1298 (1996) 1-3). A preparação de enzimas derivadas de A.niger utilizada no processo de acordo com a presente invençãopreferencialmente é essencialmente pura, o que indica que nenhuma atividadeendoproteolítica significativa diferente da atividade endoproteolítica inerente àendoprotease específica de prolina pura está presente. Tambémdemonstramos que nossa preparação de enzimas derivadas de A. nigerutilizada preferencialmente de acordo com a presente invenção não contémnenhuma atividade colateral exoproteolítica, mais especificamenteaminopeptidolítica. Preferencialmente, a atividade exoproteolítica está ausentena preparação de enzimas derivadas de A. niger utilizada no processo deacordo com a presente invenção. Prova experimental para a noção de que aatividade endoproteolítica específica de prolina é essencialmente ausente emlinhagens de Aspergillus não recombinantes pode ser encontrada em WO02/45524. Como o processo de acordo com a presente invenção é possível pormeio da incubação do substrato de caseína somente com a endoproteaseespecífica de prolina, as condições de incubação ideais como temperatura, pHetc. podem ser facilmente selecionadas e não necessitam ser fixadas emcondições abaixo da ideal, como seria o caso se duas ou mais enzimas foremaplicadas. Além disso, evita-se a formação de subprodutos indesejados, taiscomo peptídeos não bioativos ou aminoácidos livres adicionais que geramsabores estranhos ao caldo. Ter mais graus de liberdade na seleção dascondições de reação possibilita seleção mais fácil de outros critérios. É muitomais fácil, por exemplo, selecionar agora condições que sejam menossensíveis a infecções microbianas e otimizar as condições de pH relativas aetapas de precipitação de proteínas subseqüentes. A enzima de Aspergillus nãoé oligopeptidase, mas endopeptidase verdadeira capaz de hidrolisar proteínasintactas, grandes peptídeos bem como moléculas de peptídeos menores sem anecessidade de endoprotease acessória. Esta nova e surpreendente descrição abrea possibilidade de uso da enzima de A. niger para a preparação de hidrolisadoscom altos teores sem precedentes de peptídeos com resíduo de prolina carbóxi-terminal pois nenhuma endoprotease acessória é necessária. Esses hidrolisadosnovos podem ser preparados a partir de materiais de partida proteináceosdiferentes, seja de origem vegetal ou animal. Exemplos desses materiais de partidasão caseínas, gelatina, proteínas de peixe ou ovo, glúten de trigo, proteína de soja eervilhas, bem como proteína de arroz e proteína de girassol. Como se sabe que osódio desempenha papel importante em hipertensão, substratos preferidos para aprodução de peptídeos inibidores de ECA são cálcio e potássio, em vez de sais desódio destas proteínas.

O pH ideal da prolil endoprotease derivada de A. niger é de cercade 4,3. Devido a este baixo pH ideal, a incubação de caseinato de leite bovinocom a prolil endoprotease derivada de A. niger não é auto-evidente. Caseinatode leite bovino irá precipitar-se caso o pH caia abaixo de 6,0, mas sob pH 6,0 aenzima de A. niger possui atividade apenas limitada. Mesmo sob esta condiçãoum tanto desfavorável, incubação com a prolil endoprotease derivada de A.niger pode gerar vários peptídeos inibidores de ECA conhecidos, tais como IPPe LPP. Muito surpreendentemente, nenhum VPP é produzido sob estascondições. Caseína de leite bovino incorpora uma série de proteínas diferentesque incluem beta-caseína e capa-caseína. Segundo as seqüências aminoconhecidas, beta-caseína engloba os tripeptídeos inibidores de ECA IPP1 VPPe LPP. Capa-caseína engloba apenas IPP. O fato de que a enzima derivada deA. niger não contém nenhuma atividade de aminopeptidase mensurável sugerefortemente que o IPP formado é liberado a partir da seqüência -A107-1108-Ρ109-Ρ110- presente em capa-caseína. Presumivelmente, a união depeptídeos carbóxi-terminais de IPP é dividida pela atividade principal da prolilendoprotease derivada de A. niger, enquanto a divisão da ligação Ala-Ileprecedente é realizada pela sua atividade lateral específica de Ala. De formasimilar, a ausência de VPP pode ser explicada com base na ausência deatividade lateral de aminopeptidase. VPP é contido em beta-caseína naseqüência -P8i-V82-V83-V84-P85-P86-· Desta forma, a endoprotease específica deprolina extirpa a seqüência VWPP, mas é incapaz de liberar VPP.

Estes resultados são obtidos mediante incubação do caseinatocom a endoprotease derivada de A. niger em processo enzimático simples deuma etapa. Soluções aquosas que contêm proteína são altamente suscetíveisa infecções microbianas, especialmente se mantidas por várias horas sobvalores de pH acima de 5,0 e sob temperaturas de 50 0C ou menos.Especialmente toxinas microbianas que podem ser produzidas durante estasetapas de incubação prolongada são propensas a sobreviver a etapas deaquecimento subseqüentes e formam ameaça potencial a processos de graualimentício. A presente invenção utiliza preferencialmente temperatura deincubação de mais de 50 0C. Em combinação com o processo enzimático deuma etapa em que a incubação de enzimas é conduzida por período de menosde 24 horas, preferencialmente menos de oito horas, de maior preferênciamenos de quatro horas, o processo de acordo com a presente invençãooferece a vantagem de estabilidade microbiológica aprimorada. Utilizando arazão entre enzima e substrato do presente em combinação com as condiçõesde alta temperatura, o corte de IPP e LPP completa-se em período deincubação de três horas.

Como os peptídeos inibidores de ECA IPP e LPP podem serextirpados de caseína utilizando uma única endoprotease essencialmente pura, apresente invenção resulta em quantidade menor de peptídeos hidrossolúveis quenos processos do estado da técnica. Dentre esses peptídeos hidrossolúveis, IPP eLPP estão presentes em quantidades consideráveis. Isso é especialmenteimportante caso alta concentração de tripeptídeos inibidores de ECA sejanecessária sem muitos outros compostos, freqüentemente menos ativos.

Segundo o processo do presente, preferencialmente pelo menos20%, de maior preferência pelo menos 30%, de preferência superior pelomenos 40% de seqüência -I-P-P- ou -L-P-P- presente em proteína sãoconvertidos no tripeptídeo IPP ou LPP, respectivamente.

Nos Exemplos, ilustramos o efeito de purificação por cinco vezesdos peptídeos bioativos por nova e surpreendente etapa de purificação. A basedeste processo de purificação é formada pelas propriedades exclusivas daendoprotease específica de prolina derivada de A. niger. A incubação com estaenzima libera as partes mais bioativas da molécula de substrato na forma detripeptídeos hidrossolúveis. As partes não ou menos bioativas da molécula desubstrato permanecem em grande quantidade em partes de peptídeos oupolipeptídeos não divididas e, portanto, muito maiores das moléculas desubstratos. Devido às solubilidades limitadas em água destas partes depeptídeos ou polipeptídeos maiores sob condições de pH selecionadas, estaspartes não ou menos bioativas da molécula de substrato são facilmenteseparadas dos tripeptídeos bioativos muito mais solúveis. Neste processo, ohidrolisado inicial é formado durante o breve período de incubação de enzimasa 55 0C, pH 6,0, e é aquecido opcionalmente em seguida até temperaturaacima de 80 0C para matar todos os microorganismos contaminantes edesativar a propil endopeptidase derivada de A. niger. Em seguida, ohidrolisado é acidificado para realizar queda de pH para 4,5 ou pelo menosabaixo de 5,0. Neste valor de pH, que não pode ser utilizado para desativar aprolil endopeptidase derivada de A. niger porque representa a condição idealpara a enzima, todos os peptídeos grandes do caseinato precipitaram-se, deforma que somente os peptídeos menores permaneçam em solução. Como oscaseinatos precipitados podem ser facilmente removidos por meio de etapa dedecantação ou filtragem ou centrifugação em baixa velocidade (ou seja, menosde 5000 rpm), a fase aquosa contém alta proporção de peptídeos bioativoscom relação à quantidade de proteína presente. Segundo os dados de Kjeldahl180 a 70% da proteína de caseinato são removidos por meio da etapa decentrifugação em alta velocidade, o que indica purificação de quatro a cincovezes dos peptídeos inibidores de ECA. Concluímos que este princípio depurificação pode ser convenientemente aplicado para também obter peptídeosbiologicamente ativos obtidos de material proteináceo diferente de caseína.

Além disso, não apenas hidrolisados produzidos enzimaticamente, mastambém proteínas que são fermentadas por microorganismos apropriadospodem ser separadas e purificadas de acordo com o processo do presente. Aincubação de enzima e substrato em valor de pH próximo de onde o substratose precipitará e a enzima ainda está ativa, permitirá esta etapa de purificação.

Devido ao baixo pH ideal da prolil endoprotease derivada de A. niger,precipitações de substratos na faixa de pH 1,5 a 6,5 podem ser consideradas.

Em vista do seu comportamento de precipitação específico, precipitações deglúten acima de pH 3,5, precipitações de proteínas de girassol acima de pH 4,0e abaixo de pH 6,0, precipitações de clara de ovo acima de pH 3,5 e abaixo depH 5,0 formam exemplos de condições por meio das quais a proteínahidrolisada precipita-se e as proteínas precipitadas podem ser separadas daproteína hidrolisada ou peptídeos.

Após a decantação, filtragem ou centrifugação em baixavelocidade, os sobrenadantes que contêm os peptídeos biologicamente ativospodem ser recuperados em estado purificado. Etapa de evaporação e secagempor pulverização subseqüente gerará processo econômico de obtenção depasta ou pó em grau alimentício com alta bioatividade. Mediante a digestão decaseinatos de acordo com o processo descrito, é obtido pó branco e inodorocom alta concentração de peptídeos inibidores de ECA. Alternativamente, aevaporação ou nanofiltragem pode ser utilizada para concentrar adicionalmenteos peptídeos bioativos. A formulação adequada desse concentrado por meio doaumento da atividade em água (Aw) em combinação com ajuste de pH e aadição de conservante em grau alimentício como benzoato ou sorbato geraráconcentrado líquido em grau alimentício microbiologicamente estabilizado dospeptídeos redutores da pressão sangüínea. Caso apropriadamente diluído àconcentração de tripeptídeo correta, é obtido material de partida versátil eapropriado para dotar todos os tipos de alimentos e bebidas de propriedadesde inibição de ECA. Se necessário, o sobrenadante obtido após a decantação,filtragem ou centrifugação em baixa velocidade pode ser adicionalmenteprocessado para aumentar a palatabilidade do produto final. O sobrenadantepode ser colocado em contato, por exemplo, com carvão ativado em póseguido por etapa de filtragem para remover o carvão. Para minimizar o saboramargo do produto final, o sobrenadante obtido após a decantação, filtragemou centrifugação em baixa velocidade pode também ser submetido a incubaçãocom outra protease, tal como subtilisina, tripsina, protease neutra ouendoprotease específica de glutamato. Se necessário, a concentração dosingredientes bioativos MAP e/ou ITP pode ser aumentada ainda mais por meiode etapas de purificação subseqüentes nas quais realiza-se uso do caráterhidrofílico/hidrofólico específico dos tripeptídeos MAP e ITP. Os métodos depurificação preferidos incluem nanofiltragem (separação por tamanho),extração, por exemplo, com hexano ou butanol seguida porevaporação/precipitação ou contato do hidrolisado acidulado conforme obtidocom resinas cromatográficas da faixa Amberlite XAD (Roehm). Além disso,podem ser utilizadas resinas de butil-sefarose fornecidas pela Pharmacia.

Em outro Exemplo, descrevemos a identificação dos novospeptídeos inibidores de ECA MAP e ITP em hidrolisado de caseína preparadoutilizando a endoprotease específica de prolina derivada de A. niger emcombinação com o novo processo de purificação de peptídeos. Somente o usodesta endoprotease isolada e essencialmente pura em combinação com aremoção de grande proporção dos peptídeos não bioativos e equipamento deidentificação e separação altamente sofisticado permitiu-nos rastrear eidentificar estes novos tripeptídeos inibidores de ECA. Nos peptídeos bioativosderivados de caseína (CDBAP) preparados de acordo com os Exemplos (apósprecipitação), os tripeptídeos MAP e ITP foram identificados em quantidadescorrespondentes com 2,9 mg de MAP/grama de CDBAP (4,8 mg deMAP/grama de proteína em CDBAP) e 0,9 mg de ITP/grama de CDBAP (1,4mg de ITP/grama de proteína em CDBAP). Característica adicional de CDBAPé o seu teor de prolina extraordinariamente alto de 24% em base molar. Ostestes descritos neste Exemplo 7 ilustram os valores IC50 muito baixos para osdois novos tripeptídeos no teste Matsui modificado, ou seja, 0,5 micromol/l paraMAP e 10 micromol/l para ITP. Esta descoberta é ainda mais surpreendente seconsiderarmos que IPP, um dos peptídeos inibidores de ECA naturais mais eficazesconhecidos, possui valor IC50 neste teste Matsui modificado de 2,0 micromol/l.

Segundo o processo do presente, preferencialmente pelo menos20%, de maior preferência pelo menos 30%, de preferência superior pelo menos40% de seqüência -M-A-P- ou -I-T-P- presente em proteína são convertidos notripeptídeo MAP ou ITP, respectivamente. A utilidade dos peptídeos inibidores deECA recém identificados MAP e ITP é adicionalmente ilustrada nos Exemplos. Noúltimo Exemplo, demonstramos que os dois peptídeos sobrevivem a condições deincubação que simulam as condições de digestão tipicamente encontradas no tratogastrointestinal. Com base nestes dados, concluímos que os tripeptídeosinovadores são propensos a sobreviver no trato gastrointestinal de mamíferos (taiscomo seres humanos), o que indica potencial econômico considerável se utilizadospara o tratamento de hipertensão.

Nos Exemplos, demonstramos que o peptídeo inibidor de ECAsuperior MAP não pode somente ser produzido em experimentos de hidróliseenzimática, mas é também detectável em preparações de leite fermentadascom microorganismo em grau alimentício apropriado. Fomos incapazes dedemonstrar, entretanto, a presença de peptídeo ITP nesse produto fermentado.

Os peptídeos MAP e/ou ITP obtidos antes ou depois de adicionaisetapas de purificação cromatográfica, por exemplo, podem ser utilizadas paraincorporação em produtos alimentícios que são amplamente consumidosregularmente. Exemplos destes produtos são margarinas, cremes, váriosprodutos lácteos tais como manteiga ou iogurtes ou bebidas que contêm leiteou soro. Embora estas composições sejam tipicamente administradas a sereshumanos, elas podem também ser administradas a animais, preferencialmentemamíferos, para aliviar a hipertensão. Além disso, a alta concentração deinibidores de ECA nos produtos obtidos torna estes produtos muito úteis paraincorporação em suplementos alimentícios na forma de pílulas, pastilhas ousoluções, pastas ou pós altamente concentrados. Suplementos alimentícios deliberação lenta que garantirão liberação contínua dos peptídeos inibidores deECA são de interesse específico. Os peptídeos MAP e/ou ITP de acordo com apresente invenção podem ser formulados na forma de pó seco, por exemplo,em pílulas, pastilhas, grânulos, sachês ou cápsulas. Alternativamente, asenzimas de acordo com a presente invenção podem ser formuladas na formade líquido, por exemplo, em xarope ou cápsulas. As composições utilizadasnas várias formulações contendo as enzimas de acordo com a presenteinvenção podem também incorporar pelo menos um composto do grupo queconsiste de veículo fisiologicamente aceitável, adjuvante, excipiente,estabilizante, tampão e diluente, termos estes que são utilizados no seu sentidocomum para indicar substâncias que assistem na embalagem, fornecimento,absorção, estabilização ou, no caso de adjuvante, aumento do efeito fisiológicodas enzimas. O fundo relevante sobre os vários compostos que podem serutilizados em combinação com as enzimas de acordo com a presente invençãoem forma de pó pode ser encontrado em Pharmaceutical Dosage Forms,segunda edição, volumes 1, 2 e 3, ISBN 0-8247-8044-2, Mareei Dekker, Inc.Embora os peptídeos inibidores de ECA de acordo com a presente invençãoformulados na forma de pó seco possam ser armazenados por períodos umtanto longos, o contato com a umidade ou ar úmido deverá ser evitadoselecionando-se embalagens adequadas, tais como blister de alumínio. Umaforma de aplicação oral relativamente nova é o uso de vários tipos de cápsulasde gelatina ou pastilhas com base em gelatina.

Em vista da relevância de peptídeos inibidores naturais de ECAno combate à hipertensão, o processo novo e eficaz para seu custo dopresente oferece um ponto de partida atraente para produtos alimentíciossuavemente hipotensivos ou mesmo veterinários. Como o processo atualtambém inclui uma etapa de purificação surpreendentemente simples, aspossibilidades de suplementos alimentícios concentrados redutores da pressãosangüínea também são aumentadas.

Como a endo protease específica de prolina de acordo com apresente invenção ou utilizada de acordo com a presente invenção, indica-se opolipeptídeo mencionado nas reivindicações 1 a 5, 11 e13de WO 02/45524.Portanto, esta endo protease específica de prolina é u m polipeptídeo quepossui atividade endoproteolítica específica de prolina, selecionado a partir dogrupo que consiste de:

(a) polipeptídeo que contém seqüência de aminoácidos quepossui pelo menos 40% de identidade de seqüência de aminoácidos com osaminoácidos 1 a 526 de SEQ ID N0 2 ou seu fragmento;

(b) polipeptídeo que é codificado por polinucleotídeo que sehibridiza sob condições de baixa estringência com (i) a seqüência de ácidosnucléicos de SEQ ID N0 1 ou seu fragmento que é pelo menos 80% ou 90%idêntica sobre sessenta, preferencialmente sobre cem nucleotídeos, de maiorpreferência pelo menos 90% idêntica sobre duzentos nucleotídeos; ou (ii)seqüência de ácidos nucléicos complementar à seqüência de ácidos nucléicosde SEQ ID N0 1. SEQ ID N0 1 e SEQ ID N0 2 conforme exibido em WO02/45524. Preferencialmente, o polipeptídeo encontra-se em forma isolada.

O polipeptídeo preferido utilizado de acordo com a presenteinvenção possui seqüência de aminoácidos que possui pelo menos 50%,preferencialmente pelo menos 60%, preferencialmente pelo menos 65%,preferencialmente pelo menos 70%, de maior preferência pelo menos 80%, depreferência ainda maior pelo menos 90%, de preferência ainda maior pelomenos 95% e, de preferência superior, pelo menos 97% de identidade com osaminoácidos 1 a 526 de SEQ ID N0 2 ou que compreende a seqüência deaminoácidos de SEQ ID N0 2.

Preferencialmente, o polipeptídeo é codificado por polinucleotídeoque se hibridiza sob condições de baixa estringência, de maior preferênciacondições de média estringência e, de preferência superior, condições de altaestringência, com (i) a seqüência de ácido nucléico da SEQ ID N0 1 ou seufragmento; ou (ii) seqüência de ácido nucléico complementar à seqüência deácidos nucléicos de SEQ ID N0 1.

A expressão "capaz de hibridização" indica que o polinucleotídeoalvo de acordo com a presente invenção pode hibridizar-se ao ácido nucléicoutilizado como sonda (tal como a seqüência de nucleotídeos descrita em SEQID N0 1 ou seu fragmento ou o complemento de SEQ ID N0 1) em nívelsignificativamente acima do fundo. A presente invenção também inclui ospolinucleotídeos que codificam a endoprotease específica de prolina de acordocom a presente invenção, bem como seqüências de nucleotídeos que sãocomplementares a ela. A seqüência de nucleotídeos pode ser RNA ou DNA1incluindo DNA genômico, DNA sintético ou cDNA. Preferencialmente, aseqüência de nucleotídeos é DNA e, de maior preferência, seqüência de DNAgenômico. Tipicamente, polinucleotídeo de acordo com a presente invençãocompreende seqüência contígua de nucleotídeos que é capaz de hibridizar-sesob condições seletivas na seqüência de codificação ou no complemento daseqüência de codificação de SEQ ID N0 1. Estes nucleotídeos podem sersintetizados de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

Um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção podehibridizar-se à seqüência de codificação ou no complemento da seqüência decodificação de SEQ ID N0 1 em nível significativamente acima do fundo.Hibridização de fundo pode ocorrer, por exemplo, devido a outros cDNAspresentes em biblioteca de cDNA. O nível de sinal gerado pela interação entrepolinucleotídeo de acordo com a presente invenção e a seqüência decodificação ou complemento da seqüência de codificação de SEQ ID N0 1 étipicamente de pelo menos dez vezes, preferencialmente pelo menos vintevezes, de maior preferência pelo menos cinqüenta vezes e, de preferênciaainda maior, pelo menos cem vezes, tão intensa quanto as interações entreoutros polinucleotídeos e a seqüência de codificação de SEQ ID N0 1. Aintensidade da interação pode ser medida, por exemplo, por meio deradiomarcação da sonda, tal como com 32P. Hibridização seletiva pode sertipicamente atingida utilizando condições de baixa estringência (0,3 M decloreto de sódio e 0,03 M de citrato de sódio a cerca de 40 0C), médiaestringência (tal como 0,3 M de cloreto de sódio e 0,03 M de citrato de sódio acerca de 50 0C) ou alta estringência (tal como 0,3 M de cloreto de sódio e 0,03M de citrato de sódio a cerca de 60 0C).

O Pacote UWGCG fornece o programa BESTFIT, que pode serutilizado para calcular a identidade (utilizado, por exemplo, com suasconfigurações padrão).

Os algoritmos PILEUP e BLAST N podem também ser utilizadospara calcular identidade de seqüências ou para alinhar seqüências (tais como aidentificação de seqüências equivalentes ou correspondentes, tais como suasconfigurações padrão).

Um programa para realizar análises BLAST é disponível aopúblico por meio do Centro Nacional de Informações Biotecnológicas(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve a identificação, emprimeiro lugar, de um par de seqüências de alta avaliação (HSPs) por meio daidentificação de palavras curtas com comprimento W na seqüência de consultaque coincidem ou satisfazem a avaliação limite com valor positivo T quandoalinhada com palavra com o mesmo comprimento em seqüência de banco dedados. T é indicado como limite de avaliação de palavras da vizinhança. Estascoincidências de palavras da vizinhança iniciais agem como sementes parainiciar pesquisas para encontrar HSPs que as contêm. As palavrascoincidentes são estendidas nas duas direções ao longo de cada seqüênciaenquanto a avaliação de alinhamento cumulativo puder ser aumentada.Extensões para as palavras coincidentes em cada direção são suspensasquando: a avaliação de alinhamento cumulativo cair pela quantidade X a partirdo seu valor máximo atingido; a avaliação acumulativa vai para zero ou menos,devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos com avaliaçãonegativa; ou o final de qualquer seqüência é atingido. Os parâmetros doalgoritmo BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade doalinhamento. O programa BLAST utiliza como padrões comprimento de palavra(W) de 11, os alinhamentos de matriz de avaliação BLOSUM62 (B) de 50,expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4 e comparação das duas linhas.

O algoritmo BLAST realiza análise estatística da similaridadeentre duas seqüências. Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmoBLAST é a probabilidade de soma menor (P(N))1 que fornece indicação daprobabilidade segundo a qual uma correspondência entre duas seqüências denucleotídeos ou aminoácidos ocorreria ao acaso. Uma seqüência éconsiderada similar a outra seqüência, por exemplo, se a menor probabilidadede soma em comparação entre a primeira seqüência e a segunda seqüênciafor de menos de cerca de 1, preferencialmente menos de cerca de 0,1, demaior preferência menos de cerca de 0,01 e, de preferência superior, menos decerca de 0,001.

As linhagens do gênero Aspergillus possuem posição de graualimentício e enzimas derivadas destes microorganismos são conhecidamentede fonte de grau alimentício insuspeita. Segundo outra realização preferida, aenzima é secretada pela sua célula produtora e não por enzima não secretadadenominada citosólica. Desta forma, enzimas podem ser recuperadas do caldocelular em estado essencialmente puro, sem etapas de purificação caras.

Preferencialmente, a enzima possui alta afinidade relativa ao seu substrato sobo pH e condições de temperatura vigentes.

Os produtos nutracêuticos de acordo com a presente invençãopodem ser de qualquer tipo de alimento. Eles podem compreender ingredientesalimentícios comuns além do produto alimentício, tais como aromas, açúcar, frutas,minerais, vitaminas, estabilizantes, espessantes etc. em quantidades apropriadas.

Preferencialmente, o produto nutracêutico compreende 50 a 200mmol/kg de K+ e/ou 15 a 60 mmol/kg de Ca2+ e/ou 6 a 25 mmol/kg de Mg2+, demaior preferência 100 a 150 mmol/kg de K+ e/ou 30 a 50 mmol/kg de Ca2+ e/ou10 a 25 mmol/kg de Mg2+ e, de preferência superior, 110 a 135 mmol/kg de K+e/ou 35 a 45 mmol/kg de Ca2+ e/ou 13 a 20 mmol/kg de Mg2+. Estes cátionspossuem efeito benéfico de redução adicional da pressão sangüínea quandoincorporado aos produtos nutracêuticos de acordo com a presente invenção.

Convenientemente, o produto nutracêutico compreende uma oumais vitaminas Β.

O ácido fólico vitamina B é conhecido por participar dometabolismo de homocisteína, aminoácido na alimentação humana. Por umasérie de anos, altos níveis de homocisteína foram correlacionados à altaincidência de doenças cardiovasculares. Acredita-se que a redução dehomocisteína pode reduzir o risco de doenças cardiovasculares.

As vitaminas B6 e B12 são conhecidas por interferirem com abiossíntese de purina e tiamina, para participar da síntese do grupo metila noprocesso de metilação de homocisteína para a produção de metionina e em váriosprocessos de crescimento. A vitamina B6 (cloridrato de piridoxina) é um suplementovitamínico conhecido. A vitamina B12 (cianocobalamina) contribui com a saúde dosistema nervoso e está envolvida na produção de glóbulos vermelhos do sangue.

Também é conhecida como vitamina em suplementos alimentícios.

Devido ao seu efeito positivo combinado sobre a redução do riscode doença cardiovascular, prefere-se que produtos de acordo com a presenteinvenção compreenda vitamina B6 e vitamina B12 e ácido fólico.

A quantidade das vitaminas B no produto nutracêutico pode sercalculada pelos técnicos no assunto com base em quantidades diárias destasvitaminas B fornecidas no presente: ácido fólico: 200 a 800 μg/dia,preferencialmente 200 a 400 μg/dia; vitamina B6: 0,2 a 2 mg/dia,preferencialmente 0,5 a 1 mg/dia e vitamina B12: 0,5 a 4 μg/dia,preferencialmente 1 a 2 μg/dia.

Preferencialmente, o produto nutracêutico compreende de 3 a 25%em peso de esterol, de maior preferência de 7 a 15% em peso de esterol. Avantagem da incorporação de esterol é que causará redução do nível de LDL-colesterol em sangue humano, o que resultará na redução do risco cardiovascular.

Ao fazer-se referência a esterol, este inclui os estanóis saturadose derivados esterificados de esterol/estanol ou misturas de quaisquer destes.No presente pedido, ao fazer-se referência a esteroléster, issotambém inclui seus derivados saturados, os ésteres de estanol e combinaçõesde ésteres de esterol e estanol. Esteróis ou fitoesteróis, também conhecidoscomo esteróis de plantas ou esteróis vegetais podem ser classificados em trêsgrupos, 4-desmetilesteróis, 4-monometilesteróis e 4,4'-dimetilesteróis. Emóleos, eles existem principalmente na forma de esteróis livres e ésteres deesterol de ácidos graxos, embora glicosídeos de esterol e glicosídeos deesterol acilados também estejam presentes. Existem três fitoesteróis principais,nomeadamente beta-sitoesterol, estigmaesterol e campesterol. Desenhosesquemáticos dos componentes pretendidos são fornecidos em Influence ofProcessing on Sterols of Edible Vegetable Oils, S. P. Kochhar; Prog. Lipid Res.22; págs. 161-188. Os derivados 5 alfa-saturados correspondentes tais comositostanol, campestanol e ergostanol e seus derivados encontram-se nopresente relatório descritivo indicados como estanóis. Preferencialmente, oesterol ou estanol (opcionalmente esterificado) é selecionado a partir do grupoque compreende éster de ácido graxo de β-sitosterol, β-sitostanol, campesterol,campestanol, estigmasterol, brassicasterol, brassicastenol ou sua mistura.

Os esteróis ou estanóis opcionalmente são ao menosparcialmente esterificados com ácido graxo. Preferencialmente, os esteróis ouestanóis são esterificados com um ou mais ácidos graxos C2-C22· Para opropósito da presente invenção, a expressão ácido graxo C2-C22 designaqualquer molécula que compreende cadeia principal C2-C22 e pelo menos umgrupo ácido. Embora não preferido dentro do contexto do presente, a cadeiaprincipal C2-C22 pode ser parcialmente substituída ou cadeias laterais podemestar presentes. Preferencialmente, entretanto, os ácidos graxos C2-C22 sãomoléculas lineares que compreendem um ou dois grupos ácidos como grupo(s)posterior(es). São de maior preferência ácidos graxos Cs-C22 lineares queocorrem em óleos naturais.Exemplos apropriados de quaisquer destes ácidos graxos sãoácido acético, ácido propiônico, ácido butírico, ácido capróico, ácido caprílico eácido cáprico. Outros ácidos apropriados são, por exemplo, ácido cítrico, ácidoláctico, ácido oxálico e ácido maleico. São de maior preferência ácido mirístico,ácido láurico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido araquídico, ácido beênico,ácido oléico, ácido cetoleico, ácido erúcico, ácido elaídico, ácido Iinoleico eácido linolênico. Quando desejado, pode-se utilizar mistura de ácidos graxospara esterificação dos esteróis ou estanóis. É possível, por exemplo, utilizargordura ou óleo de ocorrência natural como fonte do ácido graxo e conduzir aesterificação por meio de reação de interesterificação.

Os ingredientes nutracêuticos descritos acima, que contribuempara o aumento da saúde cardiovascular, K+, Ca2+ e Mg2+, vitaminas B (ácidofólico, B6, B12) e esteróis são coletivamente indicados no presente comoingredientes para a saúde do coração.

Os Exemplos a seguir ilustram adicionalmente a presente invenção.

A. Composições farmacêuticas podem ser preparadas pormeio de procedimentos de formulação convencionais utilizando os ingredientesespecificados abaixo.

Exemplo 1

Cápsula de gelatina mole:

Cápsulas de gelatina mole são preparadas por meio deprocedimentos convencionais utilizando ingredientes especificados abaixo:

Ingredientes ativos: MAP e/ou ITP 0,1 g, hidrolisados de proteína 0,3 g.Outros ingredientes: glicerol, água, gelatina, óleo vegetal.

Exemplo 2

Cápsula de gelatina dura:

Cápsulas duras de gelatina são preparadas por meio deprocedimentos convencionais utilizando ingredientes especificadosabaixo:

Ingredientes ativos: MAP e/ou ITP 0,3 g, hidrolisados de proteína 0,7 g.Outros ingredientes:

Cargas: lactose, celulose ou derivados de celulose qs.Lubrificante: estearato de magnésio, se necessário (0,5%).

Exemplo 3

Pastilha:

Pastilhas são preparadas por meio de procedimentosconvencionais, utilizando ingredientes especificados abaixo:Ingredientes ativos: MAP e/ou ITP 0,4 g, proteína não hidrolisada 0,4 g.

Outros ingredientes: celulose microcristalina, dióxido de silicone(S1O2), estearato de magnésio, carmelose sódica cruzada.

B. Itens alimentícios podem ser preparados por meio deprocedimentos convencionais, utilizando ingredientes especificados abaixo.

Exemplo 4

Refrigerante com 30% de suco.Porção típica: 240 ml.Ingredientes ativos:

MAP e/ou ITP e hidrolisados de proteína e maltodextrina comofonte de carboidrato são incorporados neste item alimentício:

MAP e/ou ITP: 0,5 a 5 g por porção.Hidrolisados de proteína: 1,5 a 15 g por porção.Maltodextrina: 3 a 30 g por porção.

I. Um composto de refrigerante é preparado a partir dosingredientes a seguir:

Concentrados de suco e aromas hidrossolúveis.

[g]

1.1 Concentrado de laranja<table>table see original document page 40</column></row><table>

Ingredientes ativos (isso indica o ingrediente ativo mencionadoacima: MAP e/ou ITP e hidrolisados de proteína e maltodextrina nasconcentrações mencionadas acima.

Concentrados de suco de fruta e aromas hidrossolúveis sãomisturados sem incorporação de ar. O corante é dissolvido em águadesionizada. Ácido ascórbico e ácido cítrico são dissolvidos em água. Benzoatode sódio é dissolvido em água. A pectina é adicionada mediante agitação edissolvida mediante ebulição. A solução é resfriada. Óleo de laranja e aromassolúveis em óleo são previamente misturados. Os ingredientes ativosmencionados em 1.6 são misturados secos e agitados em seguida,preferencialmente na mistura de concentrado de suco de fruta (1.1).

A fim de preparar o composto de refrigerante, todas as partes 3.1.1 a3.1.6 são misturadas entre si antes da homogeneização utilizando Turrax e, emseguida, homogeneizador sob alta pressão (P1 = 200 bar, P2 = 50 bar).

II. Xarope engarrafado é preparado a partir dos ingredientes aseguir:

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Os ingredientes do xarope engarrafado são misturados entre si. Oxarope engarrafado é diluído com água até 1 I de bebida pronta para beber.

Variações:

Em vez de utilizar benzoato de sódio, a bebida pode serpasteurizada. A bebida pode também ser carbonizada.

Exemplo 5

Incubação de caseinato de potássio com a endoproteaseespecífica de prolina de A. niger gera rapidamente IPP e LPP1 mas não VPP.

Neste experimento, a endoprotease específica de prolinaessencialmente pura e sobreproduzida de A. niger foi incubada comcaseinato de potássio para testar a liberação dos peptídeos inibidores deECA IPP, VPP e LPP. A endoprotease utilizada foi essencialmente pura, oque significa que nenhuma atividade endoproteolítica significativa diferenteda atividade endoproteolítica inerente à endoprotease específica de prolinapura (ou seja, divisão carbóxi-terminal de resíduos de prolina e alanina) estápresente.

Para limitar a absorção de sódio como resultado da ingestão depeptídeos inibidores de ECA ao máximo possível, caseinato de potássio foiutilizado como substrato nesta incubação.

O caseinato foi suspenso em água a 65 0C em concentração de10% (p/p) de proteína, após o quê o pH foi ajustado em 6,0 utilizando ácidofosfórico. Em seguida, a suspensão foi resfriada a 55 0C e a endoproteaseespecífica de prolina derivada de A. niger foi adicionada em concentraçãode 4 unidades/grama de proteína (vide o capítulo Materiais e Métodos paradefinição de unidades). Sob agitação contínua, esta mistura foi incubada por24 horas. Nenhum ajuste de pH adicional foi conduzido durante esseperíodo. Amostras foram tomadas após uma, duas, três, quatro, oito e 24horas de incubação. De cada amostra, a atividade enzimática foi encerradapor meio de aquecimento imediato da amostra a 90 0C por cinco minutos.Após resfriamento, o pH de cada amostra foi rapidamente reduzido para 4,5utilizando ácido fosfórico, após o quê a suspensão foi centrifugada por cincominutos a 3000 rpm em centrífuga superior de mesa Hereaus. Osobrenadante completamente transparente foi utilizado para análise deLC/MS/MS para quantificar os peptídeos VPP, IPP1 LPP, VWPP e VWPPFno sobrenadante (vide o capítulo Materiais e Métodos).

Caseína de leite bovino incorpora uma série de proteínasdiferentes que incluem beta-caseína e capa-caseína. Segundo asseqüências amino conhecidas, beta-caseína engloba os tripeptídeosinibidores de ECA IPP, VPP e LPP. Em beta-caseína, IPP está contido naseqüência -P71-Q72-N73-I74-P75-P76-, VPP está contido na seqüência -P8i-V82-V83-V84-P85-P86- e LPP está contido na seqüência -P150-L151-P152-P153-· Capa-caseína, que está presente em preparações de caseinato precipitadas emácido em concentração molar de quase 50% da concentração de beta-caseína, engloba apenas IPP. Em capa-caseína, IPP está contido naseqüência -A107-I108-P109-P110-. Os demais componentes de proteínas decaseína não contêm IPP1 VPP ou LPP.

As Tabelas 2 e 3 exibem as concentrações dos peptídeospresentes nos sobrenadantes acidificados e centrifugados conforme calculadopor grama de caseinato de potássio adicionado à mistura de incubação.Conforme exibido na Tabela 2, IPP atinge a sua concentração máxima apósuma hora de incubação. Além disso, a concentração de IPP não aumenta mais.

A formação do pentapeptídeo VWPP exibe a mesma cinética da geração deIPP. Conforme teoricamente esperado, o rendimento molar de VWPP é similarao rendimento molar do peptídeo LPP. O rendimento de LPP e VWPP atingequase 60% do que seria teoricamente viável. O fato de que a concentraçãomáxima de LPP somente é atingida após três horas de incubação sugere que adivisão daquela parte específica da molécula de beta-caseína talvez seja umpouco mais difícil. Ao contrário com VWPP, o hexapeptídeo VWPPF não éformado. Esta observação sugere que a endoprotease específica de prolinadivide eficientemente a união -P-F- no presente, gerando VWPP. O tripeptídeoIPP é formado imediatamente, mas o seu rendimento molar é de não mais decerca de um terço do rendimento molar máximo de VWPP ou LPP. Como otripeptídeo IPP está contido tanto em beta-caseína quanto em capa-caseína,este resultado é inesperado. Explicação provável para esta observação é que aprotease específica de prolina pode gerar IPP mas a partir da porção capa-caseína somente dos caseinatos. Em vista da seqüência de aminoácidosrelevante de capa-caseína, isso sugere que a união de peptídeos -A107-lio8- édividida pela atividade específica de alanina da enzima. Se verdadeiro, aquantidade de IPP liberada atinge cerca de 40% da quantidade que estápresente em capa-caseína, mas não mais de cerca de 10% do IPP que estáteoricamente presente em beta mais capa caseína. Este mecanismo de divisãopara a liberação de IPP também explica por quê VPP não pode ser formado apartir da sua molécula precursora VWPP: a atividade endoproteolíticanecessária simplesmente não está presente na preparação de enzima derivadade A. niger utilizada.

Tabela 2

Teores Molares de Peptídeo de Sobrenadantes Acidificados Calculadospor Grama de Proteína Adicionado

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Tabela 3

Concentrações de Peptídeos em Sobrenadantes Acidificados Calculadosem mg/g de proteína adicionado

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Exemplo 6

Incorporação de etapa de precipitação de caseína ácidaresulta em concentração de cinco vezes de peptídeos inibidores de ECA:

Conforme descrito no Exemplo 5, caseinato de potássio emconcentração de 10% (p/p) proteína foi submetido a incubação com aendoprotease específica de prolina derivada de A. niger sob pH 6,0. Apósvários períodos de incubação, amostras foram aquecidas para suspenderadicionalmente a atividade enzimática, após o quê o pH foi reduzido para4,5 para minimizar a solubilidade de caseína. Moléculas de caseínainsolúveis foram removidas por meio de centrifugação em baixavelocidade. Nas Tabelas 2 e 3, fornecemos concentrações de peptídeosinibidores de ECA calculadas com base na concentração inicial de 10% deproteína. Entretanto, como resultado da acidificação e da etapa decentrifugação subseqüente, grande proporção da proteína adicionada foiremovida. Para considerar estes teores de proteína reduzidos, foramconduzidas análises de nitrogênio (Kjeldahl). Segundo os últimos dados,concluiu-se que os diversos sobrenadantes contêm os níveis de proteínaexibidos na Tabela 4.

Tabela 4

Teores de Proteína de Sobrenadantes Acidificados

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Considerando estes dados, calculamos novamente aconcentração dos peptídeos inibidores de ECA presentes em cadasobrenadante, mas desta vez utilizando os seus teores reais de proteína. Estesdados recalculados são exibidos na Tabela 5.

Tabela 5

Concentrações de Peptídeos em Sobrenadantes Acidificados Calculadaspor Grama de Proteína Presente

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Comparação dos dados apresentados nas Tabelas 3 e 5 exibeclaramente que a etapa de acidificação simples seguida por decantaçãoindustrialmente viável, filtragem ou etapa de centrifugação em baixa velocidaderesulta em aumento de cinco vezes da concentração dos peptídeos inibidoresde ECA específicos.

Exemplo 7

Identificação dos tripeptídeos inibidores de ECA inovadores ε potentesMAP e ITP em hidrolisados de caseína concentrados

Para facilitar análise mais completa dos peptídeos bioativospresentes, o hidrolisado de caseína obtido por meio da digestão com A. nigerpuro derivou endoprotease específica de prolina e purificada por meio deprecipitação ácida foi preparada em escala preparativa. Com este propósito,3000 gramas de caseinato de potássio foram suspensos em 25 litros de água a75 0C. Após homogeneização completa, o pH foi lentamente ajustado em 6,020 utilizando ácido fosfórico diluído. Após resfriamento a 55 0C1 as endoproteasesespecíficas de prolina derivadas de A. niger foram adicionadas emconcentração de quatro unidades de enzima por grama de caseinato (vide ocapítulo Materiais e Métodos para definição da unidade). Após incubação (comagitação) por três horas a 55 0C1 o pH foi reduzido para 4,5 por meio de lentaadição de ácido fosfórico concentrado. Nesta preparação em maior escala, aetapa de tratamento a quente para desativar a endoprotease específica deprolina nesta parte do processo foi omitida. Em seguida, a suspensão foirapidamente resfriada para 4 0C e mantida por uma noite (sem agitação) a estatemperatura. Na manhã seguinte, a camada superior transparente foidecantada e evaporada para atingir nível de 40% de matéria seca. Este últimolíquido concentrado foi submetido a tratamento UHT de quatro segundos a 1400C e ultrafiltrado em seguida a 50 °C. Após a filtragem com gérmen, o líquidofoi seco por pulverização. Este material é denominado a seguir PeptídeosBioativos Derivados de caseína (CDBAP). Utilizando os procedimentos deLC/MS descritos no capítulo Materiais e Métodos, foi determinado o teor deIPP1 LPP e VPP do produto em pó. Segundo o seu teor de nitrogênio, o produtoem pó contém teor de proteína de cerca de 60% (utilizando fator de conversãode 6,38). Os teores de IPP1 LPP e VPP do pó são fornecidos na Tabela 6. Acomposição de aminoácidos do produto CDBAP é fornecida na Tabela 7. Muitonotável é o aumento do teor de prolina molar do material seco por pulverizaçãoobtido após a precipitação de ácido: de 12% iniciais para cerca de 24%.

Tabela 6

<table>table see original document page 47</column></row><table>Tabela 7

Composição de Aminoácidos do Material de Partida de Caseinato dePotássio ε CDBAP (Teores de Aminoácidos Após a Hidrólise Ácida εExibidos como Percentuais do Teor de Aminoácidos Molar)

<table>table see original document page 48</column></row><table>

A presença de peptídeos inibidores de ECA inovadores emCDBAP foi pesquisada utilizando separação cromatográfica bidimensionalcombinada com teste de inibição de ECA e espectrometria de massa paraidentificação. Na primeira análise, a mistura de peptídeos foi separada sobrecoluna de cromatografia de líquidos (LC) ODS3 e perfis de inibição de ECAforam gerados a partir das várias frações obtidas. Em segunda análise, asfrações da primeira coluna que exibem alta inibição de ECA foramadicionalmente separadas em coluna Biosuite LC utilizando diferente perfil degradiente. As frações recolhidas desta segunda coluna foram divididas emduas partes: uma parte foi utilizada para a medição da inibição de ECA emlinha, enquanto a outra parte foi submetida a análise MS e MS-MS paraidentificar os peptídeos presentes.

Todas as análises foram realizadas utilizando sistema HPLCAlliance 2795 (Waters, Etten-Leur, Holanda) equipado com detector UV detraço duplo. Para identificação dos peptídeos, o sistema HPLC foi acoplado aespectrômetro de massa Q-TOF do mesmo fornecedor. Nos testes, 20 μΙ desolução 10% (p/v) de CDBAP em água Mili-Q foram injetados em coluna 150 χ2.1 Inertsil 5 ODS3 com tamanho de partícula de 5 μηι (Varian, Middelburg,Holanda). A fase móvel A consistiu de solução de ácido trifluoroacético a 0,1%(TFA) em água Mili-Q. A fase móvel B consistiu de solução de TFA a 0,1% emacetonitrila. A composição de eluente inicial foi de 100% A. O eluente foimantido a 100% A por cinco minutos. Em seguida, gradiente linear foi iniciadoem dez minutos até 5% B, seguido por gradiente linear em dez minutos a 30%Β. A coluna sofreu fluxo por meio de elevação da concentração de B para 70%em cinco minutos e foi mantido a 70% B por outros cinco minutos e mantido a70% B por outros cinco minutos. Em seguida, o eluente foi alterado para 100%A em um minuto e equilibrado por nove minutos. O tempo de condução total foide cinqüenta minutos. O fluxo de efluente foi de 0,2 ml/min e a temperatura dacoluna foi definida em 60 0C. Cromatograma de UV foi registrado em 215 nm.Frações de eluente foram recolhidas em placa de 96 cavidades, utilizandotempo de intervalo de um minuto, resultando em volumes de frações de 200 μΙ.O efluente nas cavidades foi neutralizado por meio da adição de 80 μΙ desolução a 0,05% de hidróxido de amônio aquoso (25%). O solvente foievaporado até secar sob nitrogênio a 50 0C. Em seguida, o resíduo foireconstituído em 40 μΙ de água Mili-Q e misturado por um minuto.

Para o teste de inibição de ECA em linha, 27 μΙ de 33,4 mU/ml deECA (enzima obtida da Sigma) em solução salina tamponada com fosfato(PBS), pH 7,4, com concentração de cloreto de 260 mM foram adicionados e amistura foi mantida em incubação por cinco minutos sobre misturador de placasde 96 cavidades a 700 rpm. Após o período de incubação, 13 μΙ de 0,35 mM desolução de ácido hipúrico, histidina e Ieucina (HHL) em tampão PBS foramadicionados e misturados por um minuto a 700 rpm. A mistura foi mantida emreação por sessenta minutos a 50 0C em forno GC. Após a reação, a placa foiresfriada em gelo em fusão.

A placa de 96 cavidades foi analisada em seguida sobre colunade HPLC de flash. Da mistura de reação de cada cavidade, 30 μΙ foraminjetados sobre coluna HPLC Chromlith Flash RP18e 25 χ 4,6 mm (Merck,Darmstadt, Alemanha) equipada com coluna de guarda RP18e 10 χ 4,6 mmdo mesmo fornecedor. A fase móvel isocrática consistiu de solução a 0,1%de TFA em água/acetonitrila 79/21. O fluxo de eluente foi de 2 ml/min e atemperatura da coluna foi de 25 0C. As injeções foram realizadas com tempode intervalo de um minuto. Ácido hipúrico (H) e HHL foram monitorados a280 nm. As alturas de pico de H e HHL foram medidas e a inibição de ECA(ECA I) de cada fração foi calculada de acordo com a equação:

<formula>formula see original document page 50</formula>

Inibição percentual de IECAa do analisado:

DCw: grau de divisão por ECA de HHL em H e HL em água.

DCa: grau de divisão de HHL em H e HL para o analisado.

O grau de divisão foi calculado por meio da expressão da alturade pico de H na forma de fração da soma das alturas de pico de H e HHL.

A inibição de ECA mais alta foi medida nas frações em eluição entre18 e 26 minutos. Esta região foi recolhida e novamente injetada em coluna Biosuitede 150 χ 2,1 mm com tamanho de partícula de 3 μτη (Waters, Etten-Leur, Holanda).A fase móvel A do presente consistiu de solução de ácido fórmico a 0,1% (FA) emágua Mili-Q. A fase móvel B consistiu de solução de FA a 0,1% em metanol. Acomposição de eluente inicial foi de 100% A. O eluente foi mantido a 100% A porcinco minutos. Em seguida, gradiente linear foi iniciado em quinze minutos até 5%B, seguido por gradiente linear em trinta minutos a 60% Β. O eluente foi mantido em60% B por outros cinco minutos. Por fim, o eluente foi reduzido a 100% da fasemóvel A em um minuto e equilibrado por dez minutos. O tempo total de conduçãofoi de 65 minutos. O fluxo de eluente foi de 0,2 ml/min e a temperatura de coluna foidefinida em 60 0C. O traço de UV foi registrado a 215 nm. Frações foram recolhidasda coluna Biosuite em tempo de intervalo de dez segundos. As frações foramnovamente divididas em duas partes, uma parte foi utilizada para medir a atividadeutilizando o método de inibição de ECA em linha descrito anteriormente, enquanto aoutra parte foi utilizada para identificar os peptídeos ativos utilizando MS e MS-MS.

Dois picos cromatográficos com íons moleculares de 326,2080 Dae dois outros picos com íons moleculares de 330,2029 Da e 318,1488 Dacorresponderam ao aumento da inibição de ECA medido na área entre 18 e 26minutos. Utilizando MS-MS, estes peptídeos foram identificados como osisômeros estruturais IPP e LPP (-0,6 ppm), ITP (-4,8 ppm) e MAP (+2,8 ppm),respectivamente. As fontes de proteínas dos peptídeos são capa-caseína f108-110 (IPP), β-caseína Í151-153 (LPP), a-s2-caseína f119-121 (ITP) e β-caseínaf102-104 (MAP). IPP e LPP foram relatados anteriormente como peptídeosinibidores de ECA com valores IC50 de 5 e 9,6 μΜ, respectivamente (Y.Nakamura, M. Yamamoto, K. Sakai, A. Okubo, S. Yamazaki, T. Takano, J.Dairy Sei. 78 (1995) 777-783; Y. Aryoshi, Trends in Food Science and Technol.4 (1993) 139-144). Entretanto, de nosso conhecimento, os tripeptídeos ITP eMAP nunca foram relatados como peptídeos inibidores de ECA potentes.

MAP, ITP e IPP foram sintetizados quimicamente e a atividade decada peptídeo foi medida utilizando teste Matsui modificado descrito a seguir.A quantificação de MAP e ITP nas várias amostras foi realizadaem instrumento Micromass Quattro Il MS operado na eletropulverizaçãopositiva, modo de monitoramento de múltiplas reações. O método HPLCutilizado foi similar ao descrito acima. As configurações de MS (ESI+) foram asseguintes: voltagem de cone 37 V, voltagem capilar 4 kV, secagem de gásnitrogênio a 300 l/h. Temperatura da fonte e do nebulizador: 100 0C e 250 0C1respectivamente. Os peptídeos sintetizados foram utilizados para preparar linhade calibragem utilizando o íon precursor 318.1 e os íons de produto somados227,2 e 347,2 para MAP e utilizando o íon precursor 320.2 e os íons de produtosomados 282.2 e 501.2 para ITP. Segundo estas análises, os tripeptídeosinibidores de ECA inovadores MAP e ITP estão presentes no produto CDBAPem quantidades correspondentes a 2,9 mg de MAP/grama de CDBAP ou 4,8mg de MAP/grama de proteína em CDBAP e 0,9 mg de ITP/grama de CDBAPe 1,4 mg de ITP/grama de proteína em CDBAP. Para determinar a atividade deinibição de ECA de MAP e ITP, os tripeptídeos quimicamente sintetizadosforam testados de acordo com o método de Matsui et al (Matsui, T. et al (1992),Biosci. Biotech. Biochem. 56: 517-518) com algumas modificações menores.

As várias incubações são exibidas na Tabela 8.

Tabela 8

Procedimento de Teste de Inibição de ECA Matsui

Os componentes foram adicionados em tubo de 1,5 ml comvolume final de 120 μΙ.

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Cada uma das quatro amostras continha 75 μΙ de 3 mM de hipurilhistidina Ieucina (Hip-His-Leu, Sigma) dissolvidos em 250 mM de solução deborato que contém 200 mM de NaCI, pH 8,3. ECA foi obtido da Sigma. Asmisturas foram incubadas a 37 0C e suspensas após trinta minutos por meio daadição de 125 μΙ de 0,5 M de HCI. Em seguida, adicionou-se 225 μΙ debicina/solução de NaOH (1 M NaOH: 0,25 M bicina (4:6)), seguidos por 25 μΙ de0,1 M TNBS (ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfônico, Fluka, Suíça; em 0,1 M deNa2HPC>4). Após a incubação por vinte minutos a 37 0C, adicionou-se 4 ml de 4mM de Na2SO3 em 0,2 M de NaH2P04 e a absorção de luz a 416 nm foimedida com espectrofotômetro UV/Vis (Shimadzu UV-1601 com controladorCPS, Holanda).

A quantidade de atividade de inibição de ECA (IECA) foi calculadana forma de percentual de inibição em comparação com a taxa de conversãode ECA na ausência de inibidor de acordo com a fórmula a seguir:

IECA (%) = ((controle 1 - controle 2) - (amostra 1 - amostra2))/(controle 1 - controle 2)) * 100, em que:

controle 1 = absorção sem componente inibidor de ECA (=atividade máxima de ECA) [AU].

controle 2 = absorção sem componente inibidor de ECA e semECA (fundo) [AU].

amostra 1 = absorção na presença de ECA e o componenteinibidor de ECA [AU].

amostra 2 = absorção na presença do componente inibidor deECA, mas sem ECA [AU].

A IC50 dos tripeptídeos MAP e ITP sintetizados quimicamenteconforme obtido é exibida na Tabela 9, junto com valores IC50 obtidos nasmedições em linha utilizadas na fase de seleção do experimento. A medição deIPP sintetizado quimicamente foi incluída como referência interna para asdiversas medições.Tabela 9

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Exemplo 8

Peptídeos inibidores de ECA inovadores MAP ε ITP são propensos asobreviver no trato gastrointestinal humano

Após o consumo, proteínas de alimentação e peptídeos sãoexpostos a vários processos enzimáticos digestivos no trato gastrointestinal. Afim de determinar a estabilidade dos peptídeos bioativos recém identificados notrato gastrointestinal humano, a preparação de CDBAP (elaborada conformedescrito no Exemplo 7) foi submetida a tratamento gastrointestinal (TGI) quesimula as condições digestivas tipicamente encontradas no corpo humano. Asamostras obtidas após vários tempos de incubação no sistema modelo TGIforam analisadas utilizando o sistema HPLC-Bioteste-MS ou HRS-MS em linhapara quantificar quaisquer peptídeos MAP e ITP residuais. O procedimento TGIfoi realizado em dispositivo misturador padronizado que incorpora frasco de100 ml (conforme fornecido pela Vankel, Estados Unidos). A temperatura dobanho de água foi definida em 37,5 0C e a velocidade das pás foi selecionadade tal forma que a amostra fosse mantida em suspensão (100 rpm).

Cerca de 3,4 gramas de CDBAP (nível de proteína de cerca de60%) foram dissolvidos/suspensos em 100 ml de água Mili-Q. Durantesimulação gástrica, foram utilizados 5 M de HCI para reduzir o pH. Ao final dasimulação gráfica e durante a fase duodenal, foram utilizados 5 M de NaOHpara elevar o pH.

A suspensão de CDBAP foi previamente aquecida a 37,5 0C e 5ml da suspensão foram removidos para dissolver 0,31 g de pepsina (ordemFluka n° 77161). Em t = 0 min, os 5 ml com a pepsina agora dissolvida foramadicionados de volta à suspensão. Em seguida, o pH da suspensão de CDBAPfoi ajustado lenta e manualmente, utilizando medidor de pH separado deacordo com o esquema a seguir:

t = 20 min pH reduzido para 3,5

t = 40 min pH para 3,0

t = 50 min pH para 2,3

t = 60 min pH para 1,8

t = 65 min pH elevado para 2,7

t = 75 min pH para 3,7

t = 80 min pH para 5,3

A t = 90 min, 0,139 g de oito vezes pancreatina USP (ordemSigma n° P7545) foram misturados cuidadosamente em outros 5 ml dasuspensão de CDBAP e imediatamente adicionados de volta. A incubaçãoprosseguiu de acordo com o esquema a seguir:

t = 93 min pH para 5,5

t = 95 min pH para 6,3

t= 100 min pH para 7,1

O experimento foi suspenso a t = 125 min e o pH foi verificado(era ainda pH 7).

Em seguida, as amostras foram transferidas para um béquer ecolocadas em microondas até a ebulição. Em seguida, as amostras foramtransferidas para tubos de vidro e incubadas a 95 0C por sessenta minutos paradesativar toda a atividade de protease. Após resfriamento, as amostras foramcolocadas em tubos Falcon e centrifugadas por dez minutos a 3000 χ g. Osobrenadante foi seco por congelamento. A concentração total N do pó obtido foideterminada e convertida em nível de proteína utilizando o fator Kjeldahl de caseína(6,38). Segundo estes dados, o nível de proteína da preparação de CDBAP após oprocedimento TGI foi de 48,4%. Os níveis de MAP e ITP que sobrevivem aotratamento proteolítico de acordo com o procedimento TGI foram determinadosconforme descrito no Exemplo 7 e os dados obtidos sãoO exibidos na Tabela 10.

Segundo os resultados do experimento, tanto MAP quanto ITPexibem alta resistência contra a digestão de TGI. Em combinação com os baixosvalores IC50 para estes tripeptídeos (também conforme determinado no Exemplo 7),os dados sugerem potencial considerável para os dois peptídeos inibidores de ECAinovadores como peptídeos redutores da pressão sangüínea.

Tabela 10

Concentrações de MAP ε ITP Antes ε Depois da Passagem Através deTrato Gastrointestinal Humano Simulado (Procedimento TGI)

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Exemplo 9

Digestão gastrointestinal in vitro simulada de MAP ε ITP sintéticos

A fim de medir a estabilidade dos peptídeos no tratogastrointestinal (Gl), utilizou-se microdissolução. Este teste a seguir foi utilizadopara testar a estabilidade Gl de MAP e ITP.

Componentes:

Para a dissolução, foram utilizadas as soluções a seguir:

0,1 mol/l de HCI1 mol/l de NaHCO3Fluido gástrico simulado;1,0 g de cloreto de sódio em 3,5 ml de 0,1 mol/l de HCI em 500 mlde água (com gases retirados em banho de sonificação, 10 min)

Condições gástricas das enzimas (quantidades necessárias emvolume total de 1 ml):

2,9 mg de pepsina em 0,45 mg de Amano Lipase-FAPI 5 em 50 μΙde fluido gástrico simulado

Condições intestinais das enzimas (quantidades necessárias emvolume total de 1 ml):

9 mg de pancreatina (Sigma P8096) em 0,125 mg de extrato debílis em 50 μΙ de 1,0 mol/l de NaHCO3

Procedimento:

Condições gástricas:

- cada ampola foi cheia com:

- 0,82 ml de fluido gástrico simulado + 70 μΙ de MiIiQ + 10 μg (10 χdiluído) Mistura 1;

- tomar amostra quando T = 37,5 0C (t = 0), adicionar 50 μΙ demistura de pepsina e Iipase (agitar);

- o pH é medido e ajustado em 3,5 com 0,1 mol/l de HCI;

- incubação por sessenta minutos, após sessenta minutos éretirada amostra.

Condições intestinais:

- adiciona-se 50 μΙ de pancreatina, o pH é medido e ajustado em

6,8 com HCI;

- são tomadas amostras em cinco, trinta e sessenta minutos apósa adição de pancreatina (agitar);

- todas as amostras são mantidas a 95 0C por sessenta minutospara suspender a atividade da enzima;

- após o resfriamento, as amostras foram armazenadas a -20 0Caté análise;

- as amostras foram centrifugadas e analisadas com HPLC-MRM-MS.Para as Tabelas 11 e 12, a concentração medida dos peptídeos éfornecida em ng/ml, calculada para a concentração relativa de MAP.

Tabela 11

Digestão Gastrointestinal in Vitro Simulada de MAP Sintético -1 Micrograma/ml

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Quando - for indicado, indica que as medições não foram tomadas.

Tabela 12

Digestão Gastrointestinal in Vitro Simulada de MAP Sintético -10 Microgramas/ml

<table>table see original document page 58</column></row><table>Quando - for indicado, indica que as medições não foram tomadas.

Tabela 13

Digestão Gastrointestinal in Vitro Simulada de ITP Sintético -1Micrograma/ml

<table>table see original document page 59</column></row><table>

Quando - for indicado, indica que as medições não foram tomadas.

Tabela 14

Digestão Gastrointestinal in Vitro Simulada de ITP Sintético -10Microgramas/ml

<table>table see original document page 59</column></row><table>Quando - for indicado, indica que as medições não foram tomadas.

Os resultados acima demonstram que o tripeptídeo MAP exibeestabilidade razoavelmente boa sob condições gastrointestinais, especialmenteapós uma hora sob condições estomacais. Embora MAP sofra degradaçãoadicional antes de atingir o final do intestino, a maior parte dos peptídeos éabsorvida pouco depois do estômago, ou seja, no duodeno e na parte próximado jejuno. Acredita-se, entretanto, que MAP seja protegido contra essadegradação na presença de outros peptídeos no hidrolisado de caseína.

Os resultados também demonstram a excelente estabilidade sobcondições gastrointestinais de ITP. Esta excelente estabilidade podecompensar a potência um pouco mais baixa de ITP como inibidor de ECA.

Estes resultados demonstram que o tripeptídeo MAP exibeestabilidade razoavelmente boa sob condições gastrointestinais, especialmenteapós uma hora sob condições estomacais. Ele sofre, entretanto, degradaçãoadicional antes de atingir o final do intestino. Acredita-se, entretanto, que MAPseja protegido contra essa degradação na presença de outros peptídeos nohidrolisado de caseína; isso explica as aparentes diferenças de estabilidadepara MAP exibidas nos Exemplos 8 e 9.

Exemplo 10

Preparação de leite fermentado que contém MAP

Conforme descrito no Exemplo 7, o tripeptídeo inibidor de ECAaltamente potente MAP foi identificado em hidrolisado de caseína preparado deacordo com o procedimento enzimático descrito no Exemplo 7. Imaginamos,entretanto, se o tripeptídeo MAP poderia também ser obtido utilizando aabordagem mais comum de fermentação de leite desnatado. Para testar isso,fez-se uso de linhagem de Iactobacilos caracterizada por fita API50CHL(disponível por meio da bioMerieux S. A., 69280 Marcy-1'Etoile, França). Alinhagem utilizada foi capaz de fermentar D-glicose, D-frutose, D-manose, N-acetil glucosamina, maltose, Iactose1 sacarose e trealose. Segundo o banco dedados APILAB Plus (versão 5.0; também disponível por meio da bioMerieux), alinhagem foi caracterizada como Lactobacillus delbrueckii subespécie Lactis05-14. A linhagem foi depositada no Centraal Bureau voor Schimmelculturen,Baarn, Holanda (CBS 109270).

Para preparar cultivo prévio para o experimento de fermentaçãoreal, leite desnatado estéril (Yopper da Campina, Holanda) foi inoculado com 2a 4% de cultivo da linhagem de Lactobacillus delbrueeki e cultivado por 24horas a 37 0C.

No experimento de fermentação real, leite reconstituído de 4,2%MPC-80 (Campina, Holanda), 0,5% de Iactose e 0,3% de Lacprodan 80(Campina, Holanda) foi pasteurizado por dois minutos a oitenta graus. Após oresfriamento, o leite foi inoculado com 2% em peso do cultivo prévio e realizou-se fermentação em jarras de 150 ml sob condições estáticas e realizado semcontrole de pH a 40 0C.

Após 24 horas, amostra foi retirada e centrifugada por dezminutos a 14,000 g. O pH da amostra obtida foi de 5,3 e a concentração deMAP de 18,3 mg/l. Entretanto, ITP não pôde ser detectado no leite fermentado.

Claims

1. METIONINA-ALANINA-PROLINA (MAP) E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA (ITP) OU SAL DE MAP E/OU SAL DEITP1 caracterizado pelo fato de serem como um nutracêutico, preferencialmenteum medicamento.

2. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser como um nutracêutico, preferencialmente um medicamento.

3. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser para a fabricação de um nutracêutico, preferencialmente ummedicamento.

4. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizado pelofato de ser para melhoria da saúde ou prevenção e/ou tratamento de doenças.

5. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser para a fabricação de um nutracêutico, preferencialmente ummedicamento para o tratamento de doenças cardiovasculares tais comohipertensão e insuficiência cardíaca.

6. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser para o tratamento de pré-diabetes ou diabetes ou para otratamento de obesidade.

7. MÉTODO DE TRATAMENTO de diabetes do tipo 1 e 2 e paraa prevenção de diabetes do tipo 2 em indivíduos com pré-diabetes ou tolerância àglicose alterada (IGT)1 caracterizado pelo fato de que compreende a administraçãoa um paciente necessitado desse tratamento de metionina-alanina-prolina e/ouisoleucina-treonina-prolina ou sal de metionina-alanina-prolina e/ou sal deisoleucina-treonina-prolina.

8. MÉTODO DE TRATAMENTO de pessoas que sofrem dehipertensão ou insuficiência cardíaca, ou sua prevenção, caracterizado pelo fatode que compreende a administração a um paciente necessitado dessetratamento de metionina-alanina-prolina e/ou isoleucina-treonina-prolina ou salde metionina-alanina-prolina e/ou sal de isoleucina-treonina-prolina.

9. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser para aumentar a insulina plasmática ou a sensibilidade parainsulina plasmática.

10. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE METI ONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser para aumentar a insulina plasmática ou a sensibilidade parainsulina plasmática de diabetes do tipo 2 ou pré-diabetes.

11. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser para reduzir as concentrações de glicose pós-prandial emsangue com diabetes do tipo 2 ou pré-diabetes.

12. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE M ETIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser para aumentar a secreção de insulina pós-prandial em sanguecom diabetes do tipo 2 ou pré-diabetes.

13. USO, de acordo com uma das reivindicações 2 a 12,caracterizado pelo fato de que metionina-alanina-prolina e/ou isoleucina-treonina-prolina encontra-se na forma de um suplemento alimentar.

14. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser para a fabricação de um produto alimentício funcional para otratamento terapêutico dos efeitos de estresse.

15. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE M ETIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser em aplicação tópica, preferencialmente em aplicação decuidados pessoais.

16. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE M ETIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser em alimento e ração para animais de estimação.

17. MEDICAMENTO, caracterizado pelo fato de quecompreende metionina-alanina-prolina e/ou isoleucina-treonina-prolina ou sal demetionina-alanina-prolina e/ou sal de isoleucina-treonina-prolina comoingrediente ativo.

18. SUPLEMENTO ALIMENTAR, caracterizado pelo fato deque compreende metionina-alanina-prolina e/ou isoleucina-treonina-prolina ousal de metionina-alanina-prolina e/ou sal de isoleucina-treonina-prolina comoingrediente ativo.

19. ALIMENTO, caracterizado pelo fato de que compreendemetionina-alanina-prolina e/ou isoleucina-treonina-prolina ou sal de metionina-alanina-prolina e/ou sal de isoleucina-treonina-prolina como ingrediente ativo.

20. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de quecompreende metionina-alanina-prolina e/ou isoleucina-treonina-prolina ou sal demetionina-alanina-prolina e/ou sal de isoleucina-treonina-prolina comomedicamento ou para benefícios à saúde.

21. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 20,caracterizada pelo fato de que o benefício à saúde é o tratamento dos efeitosde estresse e, preferencialmente, a composição é um alimento ou ração.

22. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de quecompreende metionina-alanina-prolina e/ou isoleucina-treonina-prolina ou sal demetionina-alanina-prolina e/ou sal de isoleucina-treonina-prolina para uso comoagente tópico, preferencialmente para uso em cuidados pessoais.

23. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 22,caracterizada pelo fato de que é uma loção, um gel ou uma emulsão.

24. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizado pelofato de que compreende a síntese química por meio de acoplamento deisoleucina, treonina e prolina para formar isoleucina-treonina-prolina econversão opcional de ITP em seu sal.

25. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA OU SAL DE METIONINA-ALANINA-PROLINA, caracterizado pelofato de que compreende a síntese química por meio de acoplamento demetionina, alanina e prolina para formar metionina-alanina-prolina e conversãoopcional de metionina-alanina-prolina em um sal.

26. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizado pelo fatode que compreende a fermentação de uma proteína apropriada por ummicroorganismo adequado que seja capaz de produzir metionina-alanina-prolinae/ou isoleucina-treonina-prolina a partir da proteína.

27. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizado pelo fatode que a proteína é caseína e, preferencialmente, o microorganismo estáproduzindo ácido láctico.

28. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar diabetes do tipo 1 e 2 e para a prevenção de diabetes do tipo 2 em indivíduos que apresentem pré-diabetes ou tolerância à glicose alterada (IGT).

29. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir ahipertensão ou insuficiência cardíaca.

30. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar pré-diabetes oudiabetes.

31. USO DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OUISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA OU SAL DE METIONINA-ALANINA-PROLINA E/OU SAL DE ISOLEUCINA-TREONINA-PROLINA, caracterizadopelo fato de ser na preparação de um medicamento para tratar obesidade.