BRPI0612184A2 - usos de um polipetìdeo de domìnio 1 do wisp-1 - Google Patents

Abstract

USOS DE UM POLIPETìDEO DE DOMìNIO 1 DO WISP-1. A presente invenção refere-se a métodos e composições para o uso na modulação da(s) atividade(s) do polipeptídeo WISP-1. Os antagonistas WISP-1 incluem os anticorpos anti-WISP-1, imunoadesinas WISP-1 e WISP-1 variantes (e proteínas de fusão destes) que inibem ou neutralizam a indução ou a secreção de HAS2, HA, CD44 ou RHAMM pelo polipeptídeo WISP-1 humano nativo em pelo menos em um tipo célula de mamífero. A presente invenção fornece também os métodos para diagnóstico in vitro, in situ e/ou in vivo e/ou o tratamento de células de mamíferos ou condições patológicas associadas aos polipeptídeos WISP-1 nativos.

Description

"USOS DE UM POLIPETÍDEO DE DOMÍNIO 1 DO WISP-1"

Campo Da Invenção

A presente invenção refere-se, de forma geral, aos métodos e composições para utilização na modulação da(s) atividade(s) do polipeptídeo WISP, particularmente, polipeptídeos WISP-1. A presente invenção também se refere a métodos de diagnóstico e/ou tratamento in vitro, in situ e/ou in vivo de células de mamíferos ou condições patológicas associadas aos polipeptídeos WISP.

Antecedentes Da Invenção

O fator de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF) é um fator de crescimento induzido em fibroblastos por muitos fatores, incluindo o TGF-β, e é essencial para a capacidade do TGF-β de induzir o crescimento independente de ancoragem (AIG), uma característica de células transformadas. O CTGF é também mitogênico e quimiotático para células, e portanto acredita-se que os fatores de crescimento desta família possuem um papel importante no desenvolvimento normal, no crescimento, e reparo do tecido humano. Cinco proteínas estão relacionadas ao CTGF, incluindo Cyr61, Nov, WISP-1, WISP2 e WISP-3 que foram isolados, clonadas, seqüenciadas e caracterizadas como pertencentes à família do gene CCN. Oemar and Luescher1 Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17:1483 - 1489 (1997); Brigstock, Endocrine Rev., 20:189- 206 (1999). O gene que codifica o Cyr61 foi descrito por promover a angiogênese, crescimento do tumor, e vascularização. Babic et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 95: 6355-6360 (1998). O gene Nov é expresso no rim essencialmente no estágio embrionário, e alterações da expressão de Nov, relativo ao rim normal, foram detectadas em nefroblastomas aviários e em tumores de Wilms humano. Martinerie et ai, Oncogene, 9: 2729-2732 (1994). O Wt1 infra-regula a expressão de Nov humana, no qual a infra-regulação pode representar um elemento chave na nefrogênese normal e tumoral. Martinerie et ai, Oncogene, 12: 1479-1492 (1996).

Os diferentes membros da família CCN interagem com várias macromoléculas solúveis ou associadas a matriz em particular glico- conjugadas a sulfatos (Bork, FEBS Letters, 327:125-130). Esta interação foi usada para purificar o Cyr61 e o CTGF pela cromatografia por afinidade em agarose-heparina (Frazier et ai, J. Invest Dermatol., 107:404-411 (1996); Kireeva et ai, Mol. Celi Bioi, 16:1326-1334 (1996))). O Cyr61 é secretado e associado com a matriz extracelular e a superfície da célula devido a sua afinidade ao heparan-sulfato (Yang et ai, Celi Growth Diff., 2:351-357 (1991)). Recentemente, foi demonstrado que o WISP-1 interage com a decorina e o biglicano, dois proteoglicanos secretados dermatan sulfato.(Desnoyers, et ai, J. Bioi Chem., 276:47599-47607 (2001)).

A proteína murina ELM1 foi recentemente identificada em células pouco metastáticas. Hashimoto et ai, J. Exp. Med., 187:289-296 (1998). O gene elml, um ortologo de WISP-1 do rato divulgado abaixo, é um outro membro da família do gene CNN. Este suprime o crescimento do tumor in vivo e a metástase de células de melanoma murino K-1735. Um outro artigo recente sobre o rCop-1, o ortólogo de WISP-2 do rato descrito abaixo, descreve a perda da expressão deste gene após a transformação da célula. Zhang et ai, Mol. Celi Bioi, 18:6131-6141 (1998).

Wnts são codificados por uma grande família de genes cujos membros são encontrados em nematódeos, insetos, peixes cartilaginosos e em vertebrados. Holland et ai, Dev. Suppl., 125-133 (1994). Acredita-se que os Wnts funcionam em uma variedade de processos do desenvolvimento e fisiológicos uma vez que muitas espécies diferentes têm múltiplos genes de Wnt conservados. McMahon, Trends Genet., 8: 236-242 (1992); Nusse and Varmus, Cell1 69: 1073-1087 (1992). Os genes Wnt codificam as glicoproteínas secretadas as quais acredita-se funcionar como sinais parácrinos ou autócrinos ativos em diversos tipos de células primitivas. McMahon1 supra (1992); Nusse and Varmus, supra (1992). A família do fator do crescimento Wnt inclui mais de dez genes identificados no camundongo (Wnt-1, -2, -3A, -3B, -4, -5A, -5B, -6, - 7A, -7B, -8A1 -8B, -10B, -11, -12, e -13) (vide, por exemplo, Gavin et ai., Genes Dev., 4: 2319-2332 (1990); Lee et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 92: 2268- 2272 (1995); Christiansen et ai., Mech. Dev., 51: 341-350 (1995)) e pelo menos nove genes identificado em humanos (Wnt-1, -2, -3, -5A, -7A, -7B, -8B, -10B, e -11) pela clonagem de cDNA. Vide, por exemplo., Vant Veer et al., Mol.Cell.Biol., 4: 2532-2534 (1984).

O proto-oncogene Wnt-1 {int-1) foi identificado originalmente nos tumores de mama induzidos pelo vírus do tumor mamário de camundongo (MMTV) devido a uma inserção da seqüência de DNA viral. Nusse and Varmus, Cell, 31: 99-109 (1982). Em camundongos adultos, o nível da expressão de mRNA do Wnt-1 é detectado apenas nos testículos durante os estágios mais avançados do desenvolvimento do esperma. A proteína Wnt-1 tem aproximadamente 42 KDa e contém uma região amino-terminal hidrofóbica, que pode funcionar como uma seqüência sinalizadora para a secreção (Nusse and Varmus, supra, 1992). A expressão do Wnt-2 é detectada em fetos de camundongo e em tecidos de adultos e sua distribuição não se sobrepõem a expressão padrão do Wnt-1. O Wnt-3 está associado com a tumorigênese mamária de camundongo. A expressão do Wnt-3 em embriões do camundongos é detectada nos tubos neurais e nas germinações dos membros. Os Wnt-5a transcritos são detectados no desenvolvimento dos membros dianteiros e traseiros em 9,5 a 14,5 dias e os níveis mais elevados estão concentrados no ectoderma apical da ponta distai dos membros. Nusse e Varmus, supra (1992). Recentemente, um fator de crescimento Wnt, denominado Wnt-x, foi descrito (W095/17416) juntamente com a detecção da expressão de Wnt-x em tecido ósseo e em células derivadas de osso. Foi também descrito o papel da Wnt-x na manutenção de osteoblastos maduros e o uso do fator de crescimento Wnt-x como um agente terapêutico no desenvolvimento de outros agentes terapêuticos para tratar doenças relacionadas ao osso.

As Wnts podem ter um papel na sinalização local da célula. Peifer e Polakis, Science, 287:1606-1609 (2000). Estudos bioquímicos demonstraram que muitas das proteínas Wnt secretadas podem ser encontradas preferivelmente associadas à superfície celular ou a matriz extracelular do que livremente difusa no meio. Papkoff e Schryver, Mol. Cell. Biol., 10: 2723-2730 (1990); Bradley e Brown1 EMBO J., 9: 1569-1575 (1990).

Estudos de mutações em genes da Wnt demonstraram um papel importante da Wnts no controle do crescimento e no modelamento do tecido. Na drosófila, o wingless (wg) codifica um gene relacionado ao Wnt (Rijsewik et ai, Cell, 50: 649-657 (1987)) e as mutações no wg alteram o padrão do ectoderma embrionário na neurogênese, e crescimento do disco imaginai. Morata e Lawerence1 Dev. Biol., 56: 227-240 (1977); Baker, Dev. Biol., 125: 96- 108 (1988); Klingensmith e Nusse1 Dev. Bioi, 166: 396-414 (1994). No Caenorhabditis elegans, o lin-44 codifica um homólogo da Wnt que é necessário para divisões de células assimétricas. Herman e Horvitz, Development, 120: 1035-1047 (1994). Mutações por eliminação (Knock-out) em camundongos demonstrou a Wnt como essencial para o desenvolvimento do cérebro. (McMahon e Bradley1 Cell, 62: 1073-1085 (1990); Thomas e Cappechi1 Nature, 346: 847-850 (1990)), e o desenvolvimento embrionário inicial do rim (Stark et ai, Nature, 372: 679-683 (1994)), da cauda(Takada et ai, Genes Dev, 8: 174-189 (1994)), e dos membros. Parr e McMahon1 Nature, 374: 350- 353 (1995). A super-expressão da Wnt-1 nas glândulas mamárias pode resultar em uma hiperplasia da mama (McMahon, supra (1992); Nusse e Varmus1 supra (1992)), desenvolvimento alveolar precoce (Bradbury et ai, Dev. Bioi, 170: 553-563 (1995)), e adenocarcinoma de mama (Li et ai, Oncogene, 19:1002- 1009 (2000)).

A Wnt-5a e Wnt-5b são expressas no mesoderma posterior e lateral e no mesoderma extra-embrionário do embrião murino entre os dias 7-8.

Gavin et ai supra (1990). Estes domínios embriônicos contribuem para região AGM e tecidos do saco vitelínico no qual são derivados os precursores hematopoiéticos multipotente e HSCs. Dzierzak e Medvinsky1 Trends Genei, H: 359-366 (1995); Zon et al., em Gluckman e Coulombel, ed., Colloque1 INSERM, 235: 17-22 (1995), apresentado no workshop internacional em Hematopoiese fetal e Neonatal e mecanismo de falha da medula óssea, Paris França, 3 a 6 de Abril de 1995; Kanatsu e Nishikawa, Development, 122: 823- 830 (1996). A Wnt-5a, Wnt-λOb, e outras Wnts têm sido detectadas nos patas, indicando um possível papel no desenvolvimento e modelação do microambiente precoce do osso, como demonstrado pela Wnt-7b. Gavin et ai, supra (1990); Christiansen et ai, Mech. Devei 51: 341-350 (1995); Parr e McMahon1 supra (1995).

Para uma revisão sobre o Wnt, vide Cadigan e Nusse, Genes & Dev., 11: 3286-3305 (1997).

Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14717-14722 (1998) descreveram a clonagem e a caracterização de dois genes, WISP-1 e WISP-2, que supra-regulados na linhagem de células epiteliais mamárias C57MG de camundongo transformada pelo Wnt-1, e um terceiro gene relacionado, WISP- 3. (Vide também, documento WO 99/21998 publicado em 6 de maio de 1999; documento WO 99/21999 publicado em 6 de maio 1999). Pennica et ai relataram que estes genes WISP podem ser à jusante da sinalização de Wnt-1 e que níveis aberrantes da expressão de WISP no câncer de cólon pode ter um papel importante na tumorigênese do cólon. WISP-1 foi identificado recentemente como um gene regulado pela β-catenina e a caracterização de sua atividade oncogênica demonstrou que WISP-1 pode contribuir para a tumorigênese mediada pela β-catenina. (Xu et ai, Gene & Develop., 14:585- 595 (2000)). A superexpressão de WISP-1 nas células normais de rim de camundongo (NRK-49F) induz a transformação morfológica, o crescimento celular acelerado e aumento da densidade de saturação. Além disso, estas células formam rapidamente tumores quando injetadas em camundongos nude, sugerindo que o WISP-1 possa ter algum papel na tumorigênese (Xu et al., supra 2000). O WISP-1 é superexpresso também em linhagens de células transformadas de câncer de mama humano e em aproximadamente 47% de câncer de mama humano primário associado com determinadas características avançadas. Xie et ai, Câncer Res,, 61:8917-8923 (2001); Saxena et ai, Moi Cell Biochem., 228:99-104 (2001); Michaelson et ai, Oncogene, 20:5093-5099 (2001). Um variante de particular WISP-1 foi descrito também por estar superexpresso em aproximadamente 86% de células de carcinoma gástrico escamoso humano. Tanaka et ai, Oncogene, 20:5525-5532 (2001).

Hurvitz et al., Nature Genetics, 23:94-97 (1999) descreveram um estudo envolvendo o WISP3 em que nove mutações diferentes de WISP3 em indivíduos sem ligação e foram encontrados para estarem associados com uma desordem esquelética recessiva autossômica, displasia pseudorreumatoide progressiva (PPD). A expressão do WISP3 por RT-PCR foi observada por Hurvitz et al. em sinoviócito humano, condrócitos da cartilagem articular, e em células progenitoras mesenquimais derivadas da medula óssea.

O pedido de patente PCT W098/21236 publicado em 22 de maio de 1998 divulga um fator de crescimento de tecido conjuntivo humano gene-3 (CTGF-3) que codifica um membro da superfamília dos fatores de crescimento de 26 kD. O documento W098/21236 divulga que a seqüência de aminoácido do CTGF-3 foi deduzida de um clone humano do cDNA de osteoblasto, e que o CTGF-3 é expresso em múltiplos tecidos como o ovário, testículo, coração, pulmão, músculo esquelético, medula adrenal, córtex adrenal, timo, próstata, intestino delgado e cólon.

O ácido hialurônico (também referido como HA, hialuronato ou hialuronan) é reconhecido na literatura como sendo um componente importante da matriz extracelular (vide, por exemplo, Hardingham et al., FASEB J., 6:861- 870 (1992); Laurent et al., FASEB J., 6:2397-2404 (1992)). O HA é um componente da pele e tecido mesenquimal onde este facilita a migração da célula durante a cicatrização da ferida, inflamação e morfogênesa embrionária. (Knudson et ai, FASEB J., 7:1233-1241 (1993); Knudson et ai, CIBA Found. Symp., 143:150-169 (1989)). O HA foi também relatado por desempenhar um papel importante em determinados tipos de metástases. (Naor et ai, CD44: Structure, Function and Association with the Malignant Process, Advances in Câncer Research, Academic Press (1997), páginas 241-319). As maiores concentrações de HA são encontradas na pele e no sistema musculoesquelético para o qual se estima mais de 50% do HA total do corpo (Banerji et ai, J. Cell Bioi, 144:789-801 (1999)).

Vários investigadores divulgaram receptores que se ligam ao HA. Um dos receptores identificados para se ligar ao HA é a proteína CD44. (vide, por exemplo, Culty et ai, J. Cell Biology, 111:2765-2774 (1990); Aruffo et ai, Cell, 61:1303-1313 (1990); Naor et ai, CD44: Structure, Function and Assoeiation with the Malignant Process, Advanees in Câncer Research, Academic Press (1997), páginas 241-319); Ropponen et ai, Câncer Res^, 58:342-347 (1998); Masaki et ai, Câncer, 92:2539-2546 (2001). CD44 é uma família de glicoproteínas da superfície celular gerada a partir de um único gene por splicing alternativo e por glicosilação diferencial. (Wielenga et al., Am. J. Pathology, 154:515-523 (1999)). CD44 é acreditado por funcionar como um receptor de adesão celular, ligando moléculas extracelulares, especificamente o hialuronato, à célula e ao cito-esqueleto (Wielenga et ai, supra). O CD44 é expresso em células epiteliais, mesenquimais e linfóides. (Lesley et ai, Adv. Immunol., 54:271-335 (1994)). Wielenga et al. relataram que a expressão de CD44 pode ser regulada pelo via da WNT1 baseado em determinadas experiências que analisam a expressão de CD44 na mucosa intestinal dos camundongos e dos seres humanos com defeitos genéticos no APC ou no Tcf- 4. (Wielenga et ai, supra).

Outros receptores de HA caracterizados até esta data incluem RHAMM (também referido como receptor para motilidade mediada por ácido hialurônico), uma proteína intracelular de 58 kD expressa temporariamente na superfície de linfócitos transformados (Hardwick et al., J. Cell Biol., 117:1343- 1350 (1992); Turley et al., Exp. Cell Res., 207:277-282 (1993)). A expressão de RHAMM em fibroblastos foi relatada por promover a metástase e desempenhar um papel importante na transformação do H-Ras. (Hall et al., infra).

Outro receptor que se liga ao HA foi descrito por Banerji et al. (Banerji et al., supra). Banerji et al. descreveram um receptor nas paredes dos vasos linfáticos, denominadas como "LYVE-1", que é um resíduo 322 de um polipeptídeo de membrana integral tipo I que possuí uma similaridade de 41% ao receptor CD44. Diferentemente do receptor CD44 para o HA, a proteína LYVE-1 está ausente em vasos sangüíneos. Além disso, Iayilin (Bono et al., Moi Bioi Cell, 12:891-900 (2001)) e HARE (Zhou et ai, J. Bioi Chem., 275:37733-37741 (2000)) também foram descritos como receptores de HA.

Descrição Resumida Da Invenção A Depositante surpreendentemente revelou que o WISP-1 pode induzir a expressão do mRNA do HAS2 (hialuronan sintetase 2), CD44, e do RHAMM, a síntese da proteína CD44, e a secreção do HA. A indução ou a secreção de tais moléculas pode promover ou aumentar o crescimento da célula de câncer, o motilidade e/ou o potencial metastático. A presente invenção fornece assim, por exemplo, antagonistas de WISP-1 e os métodos de uso de tais antagonistas. Os antagonistas descritos no presente encontram- se úteis para, entre outras coisas, o diagnóstico in vitro, in situ, ou in vivo ou tratamento das células de câncer de mamíferos ou outras circunstâncias patológicas associadas com a indução ou secreção de HAS2, HA, CD44 ou RHAMM.

Em exemplos de realizações da presente invenção, são fornecidos antagonistas de WISP-1 isolados. Tais antagonistas podem incluir anticorpos, tais como, anticorpos WISP-1. Em exemplos de realizações da presente invenção preferidas, os antagonistas podem bloquear ou neutralizar a indução de WISP-1 ou a secreção de HAS2, HA, CD44 ou RHAMM. Tais anticorpos antagonistas podem, por exemplo, ser anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Os antagonistas de WISP-1 contemplados para o uso na presente invenção incluem as imunoadesinas WISP-1, os variantes de WISP-1, formas modificadas covalentes deste, ou proteínas da fusão destes. Por exemplo, tais antagonistas podem incluir WISP-1 peguilado ou WISP-1 fundido às seqüências heterólogas, tais como, epítopo marcado ou zíperes de leucina. Os métodos contemplam o uso de um único tipo de molécula antagonista ou de uma combinação de dois ou mais tipos de antagonistas.

Os métodos da presente invenção incluem métodos para o tratamento de condições patológicas ou doenças nos mamíferos associadas com ou resultantes do WISP-1, incluindo, a indução ou secreção de HAS2, HA, CD44 ou RHAMM pela WISP-1. Nos métodos de tratamento, os antagonistas WISP-1 podem ser administrados ao mamífero que sofre de tal circunstância patológica ou doença. Por exemplo, a presente invenção fornece um método que consta da exposição de célula(s) de mamífero, tal como célula(s) de câncer, a um ou mais antagonista de WISP-1 em uma quantidade eficaz para reduzir, neutralizar ou bloquear a indução de WISP-1 ou a secreção de HAS2, HA1 CD44 ou RHAMM. A célula pode estar em cultura de células ou em um mamífero, por exemplo, um mamífero que sofre de câncer.

A presente invenção fornece também as composições que compreendem um ou mais antagonista de WISP-1. Opcionalmente, as composições da presente invenção incluirão veículos ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis. Preferivelmente, as composições incluirão um ou mais antagonistas de WISP-1 em uma quantidade que seja terapeuticamente eficaz para tratar uma condição patológica ou uma doença.

A presente invenção fornece também artigos manufaturados e kits que incluem um ou mais antagonista de WISP-1.

A presente invenção fornece também métodos de conduzir ensaios de seleção para identificar as moléculas candidatas, tais como compostos de pequenas moléculas, polipeptídeos ou anticorpos, que agem como antagonistas com respeito a obstruir ou neutralizar a indução de WISP-1 ou a secreção de HAS2, HA, CD44 ou RHAMM.

Exemplos de realizações mais particulares da presente invenção incluem os antagonistas de WISP-1 isolados que inibem ou neutralizam a indução ou secreção de HAS2, HA, CD44 ou RHAMM pelo polipeptídeo WISP- 1 nativo em pelo menos um tipo de célula de mamífero, o dito antagonista é selecionado de um grupo que consiste de um anticorpo anti-WISP-1, uma imunoadesina WISP-1, um WISP-1 variante, e proteínas de fusão destes. O antagonista pode compreender de um anticorpo anti-WISP-1 que se liga ao polipeptídeo WISP-1 nativo do ser humano, que compreende dos aminoácidos 23-367 das figuras 9A-9C ou um ou mais domínios de WISP-1 que compreende dos aminoácidos codificados pelas seqüências SEQ ID No.: 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; ou 11 no presente. O anticorpo anti-WISP-1 pode ser um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.

A presente invenção fornece também composições que incluem os antagonistas descritos no presente e um veículo, opcionalmente o veículo é um veículo farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção fornece também métodos de inibir ou neutralizar a indução de WISP-1 ou a secreção de HAS2, HA, CD44 ou RHAMM nas células de mamíferos, compreendendo na exposição das ditas células de mamíferos a uma quantidade eficaz do antagonista de WISP-1, em que o dito antagonista WISP-1 é selecionado do grupo consistindo de:

a) uma imunoadesina WISP-1;

b) um polipeptídeo WISP-1 ligado a um polímero não proteináceo selecionado de um grupo consistindo de polietilenoglicol, polipropileno glicol, e polioxialquileno;

c) um anticorpo WISP-1; e

d) uma variante WISP-1.

As imunoadesinas WISP-1 empregadas nos métodos podem incluir uma seqüência WISP-1 fundida a uma região Fc de uma imunoglobulina.

Os anticorpos anti-WISP-1 empregados nos métodos podem se ligar ao WISP- 1 nativo do ser humano que consta dos aminoácidos 23-367 das figuras 9A-9C, ou um ou o mais domínios de WISP-1 descritos nos exemplos abaixo. Nos métodos, as células de mamíferos podem constar de células de câncer, e opcionalmente as células compreendem células de câncer de cólon ou células de câncer colorretal, células de câncer de mama, células de câncer de pulmão, ou células de câncer de cérebro (tais como glioma ou glioblastoma).

Em outra realização particular da presente invenção, são fornecidos métodos para tratar câncer em um mamífero, compreendendo da administração ao dito mamífero uma quantidade eficaz do antagonista de WISP-1. Opcionalmente, nos ditos métodos, o antagonista pode inibir ou neutralizar pelo menos a indução ou secreção de HAS2, HA, CD44 ou RHAMM pelo polipeptídeo WISP-1 nativo do ser humano em um tipo de célula de mamífero e o dito antagonista é selecionado do grupo que consiste de um anticorpo anti-WISP-1, uma imunoadesina WISP-1 e um WISP-1 variante. Opcionalmente, o antagonista pode agir inibindo o crescimento da célula de câncer ou a metástase da célula de câncer. O câncer no mamífero pode incluir;

células de câncer de cólon ou colorretal, células de câncer de mama, células de câncer de pulmão ou células de câncer de cérebro (tais como, o glioma ou glioblastoma). Opcionalmente, o antagonista empregado nos métodos inibe ou reduz o crescimento ou a metástase da célula de câncer. Além disso, nos métodos, o quimioterápico, a radiação, a pró-droga, o agente citotóxico, o agente inibidor de crescimento, ou a citocina podem também ser administrados ao mamífero.

Em uma realização mais particular da presente invenção, são fornecidos anticorpos que se ligam especificamente a um ou mais domínios do polipeptídeo WISP-1 (descrito com mais detalhes nos exemplos abaixo) compreendendo de aminoácidos codificados pelas seqüências SEQ ID No.: 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; ou 11 no presente. Opcionalmente, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Opcionalmente, o anticorpo monoclonal compreende do anticorpo 3D11, 11C2, 9C10, 5D4, ou 9C11 secretado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-4624, PTA-4628, PTA- 4626, PTA-4625, ou PTA-4627, respectivamente.

São fornecidos também anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo ao qual o anticorpo monoclonal 3D11, 11C2, 9C10, 5D4, ou 9C11 produzido pela linhagem celular da célula do hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-4624, PTA-4628, PTA-4626, PTA-4625, ou PTA- 4627, respectivamente, se liga.

Ainda em outra realização particular da presente invenção, é fornecida a linhagem de células do hibridoma que produz o anticorpo monoclonal 3D11, 11C2, 9C10, 5D4, ou 9C11 depositado na ATCC com o número de acesso PTA-4624, PTA-4628, PTA-4626, PTA-4625, ou PTA-4627, respectivamente, e o anticorpo monoclonal 3D11, 11C2, 9C10, 5D4, ou 9C11 secretado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA- 4624, PTA-4628, PTA-4626, PTA-4625, ou PTA-4627, respectivamente.

Há também os anticorpos monoclonais anti-WISP-1 isolados, compreendendo dos anticorpos que se ligam ao polipeptídeo WISP-1 e competitivamente inibem a ligação ao dito polipeptídeo WISP-1 pela ligação do anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-4624, PTA-4628, PTA-4626, PTA-4625, ou PTA-4627.

Há também os anticorpos anti-WISP-1 quiméricos ou humanizados que se ligam especificamente ao polipeptídeo WISP-1 e compreendem (a) uma seqüência derivada do anticorpo 3D11, 11C2, 9C10, 5D4, ou 9C11 secretado pelo hibridoma depositado na ATCC com o número de acesso PTA-4624, PTA-4628, PTA-4626, PTA-4625, ou PTA-4627 respectivamente. Opcionalmente, tais anticorpos podem constar de uma cadeia pesada, uma cadeia leve ou regiões variáveis derivadas do anticorpo 3D11, 11C2, 9C10, 5D4, ou 9C11.

Os anticorpos anti-WISP-1 podem estar ligados a um ou mais polímeros não-proteináceos selecionados do grupo consistindo de polietilenoglicol, polipropileno glicol e polioxialquileno, ou a um agente ou enzima citotóxica, um radioisótopo, um composto fluorescente ou composto quimoluminescente.

Breve Descrição Das Figuras

As figuras 1A-1F exibem a promoção de WISP-1 da produção hialuronan. O ensaio de exclusão de partícula demonstra um revestimento hialuronan na superfície do NRK/WISP-1H (A) e NRK/WISP-1L (B) mas ausente na NRK/controle (C). NRK/WISP-1H (D) e NRK/controle (E) foram corados para hialuronan com bHABP. F, O curso de tempo da acumulação de HA no meios NRK/WISP-1H e NRK/controle.

As figuras 2A-2C exibem o WISP-1 aumentando a expressão de mRNA de HAS2, CD44 e RHAMM e a expressão da proteína CD44. A1 Análise de PCR-RT em tempo real de HAS1, HAS2, HAS3, CD44, RHAMM e a expressão do mRNA da hialuronidase (HyaI) em células NRK/WISP-1H, NRK/WISP-1L e NRK/controle. Os resultados são dados como vezes da indução sobre a expressão em células NRK/controle. B, análise por citometria de fluxo da expressão de CD44 em células NRK/WISP-1H e NRK/controle. A área sombreada representa a intensidade de fluorescência do anticorpo secundário sozinho. C, análise por westernblot da proteína CD44 em células NRK/WISP-1H e NRK/controle. A coloração para actina foi usada como um controle de carga.

As figuras 3A-3G demonstram que a expressão de WISP-1 aumenta a motilidade da célula e modifica a morfologia celular. As células NRK/controle (A) formaram colônias definidas quando plaqueadas em baixa densidade em quanto que as células NRK/WISP-1L (B) e NRK/WISP-1H (C) se dispersaram. NRK/WISP-1H (E) mostrou uma morfologia des-diferenciada fusiformes com Iamelipodia comparada às células NRK/controle (D). F1 a migração aleatória das células NRK/WISP-1H e NRK/controle foram mensuradas por 15 horas utilizando microscopia com captura de imagens em tempos pré-determinados de tempo (time-lapse). Os resultados representam a distância típica média da migração das céluals em um campo. G, a motilidade das células NRK/WISP-1H e NRK/controle foram avaliadas por um ensaio de cicatrização de ferida e medidas após 15 horas usando a microscopia time- lapse. Os dados representam os resultados de um experimento típico.

As figuras 4A-4C exibem que a adição de WISP-1 induz a expressão de mRNA de HAS2 e a migração haptotática de células NRK. A, análise por PCR-RT em tempo real da expressão de HAS2 e CD44 em células NRK cultivadas em superfície revestida. Em determinados casos os substratos revestidos são adicionalmente incubados com WISP-1 (tratamento). Os resultados são dados na quantidade de indução sobre a expressão das células NRK plaqueadas em superfície não revestida, não tratada. O lado de baixo dos filtros da câmara de Boyden modificados foram revestido e as células NRK (B) ou SW480 (C) foram adicionadas à câmara superior. Em determinados casos, as adições foram feitas diretamente na câmara mais baixa. A motilidade da célula foi avaliada contando as células que migraram para lado mais baixo da inserção.

As figuras 5A-5E mostram a sobre-expressão de WISP-1, HAS2 e CD44 e o aumento da motilidade celular nas células C57MG/Wnt-1 e em células de tumores de mama de camundongos transgênicos MMTV-Wnt-1. A, análise por RT-PCR em tempo real da expressão de WISP-1, HAS2 e CD44 em células C57MG/Wnt-1 e C57MG/controle. Os resultados são dados como o aumento da indução sobre a expressão em células C57MG/controle. B, análise por Western blot da concentração de CD44 em células C57MG/Wnt-1 e C57MG/controle. A coloração para actina foi usada como um controle de carga. C, células C57MG/controle formaram colônias distintas quando plaqueadas em baixa densidade enquanto que as células C57MG/Wnt-1 se dispersaram. A análise semi-quantitativa do RT-PCR de HAS2 (D) e CD44 (E) em tumores de mama de camundongos trans gênicos MMTV-Wnt-1. Os resultados são expressos como aumento relativo da indução sobre a expressão no tecido glandular de mama normal.

As figuras 6A-6H mostram a expressão de WISP-1, HAS2 e CD44 e a acumulação de HA nos tumores de mama transgênicos MMTV-Wnt-1. Hibridização in situ de WISP-1 (A, B) HAS2 (C, D) e CD44 (E, F), imuno- histoquímica do CD44 (G) e coloração fluorescente bHABP do (H) hialuronan em tumores de mama de camundongo transgênico MMTV-Wnt-1. t, tumor, s, estroma.

As figuras 7A-7L demonstram que a expressão WISP-1 promove a colonização metastática do pulmão e crescimento metastático do tumor. O efeito do WISP-1 foi analisado injetando células NRK/controle, NRK/WISP-1L ou NRK/WISP-1H na veia da cauda de camundongos nude. Em vários períodos após a injeção, foram obtidas imagens dos pulmões por MRI (A, D1 G1 J), retirados e gravadas imagens da macroscopia (B, E1 H1 K) e características histológicas (C, F1 I, L). A severidade da invasão no pulmão pelos tumores foi classificada como normal (A1 B1 C); classe I (D, E1 F); classe Il (G, H1 I) ou classe Ill (J, K, L).

As figuras 8A-B demonstram que o anticorpo CD44 impede a metástase das células NRK/WISP-1H. 2,5 χ 105 células NRK/WISP-1H foram injetadas na veia da cauda de camundongos nude. Os camundongos foram tratados duas vezes por semana com 10 mg/kg de anticorpo CD44, um isotipo do anticorpo como controle ou apenas tampão (PBS). Os pulmões foram retirados após quatro semanas para a análise anatômica macroscópica. A foto de um pulmão normal é mostrada para a comparação.

As figuras 9A-9C exibem o nucleotídeo (SEQ ID NO:2) e seqüência putativa do aminoácido da WISP-1 (SEQ ID NO: 1) nativa do ser humano.

As figuras 11A-B exibem as propriedades de ligação dos anticorpos WISP-1 a várias construções e preparações de WISP-1.

As figuras 12A-G exibem diagramas de vários domínios do polipeptídeo WISP-1 e dos resultados dos ensaios conduzidos para identificação dos epítopos reconhecidos pelos anticorpos WISP-1 11C2, 5D4, 9C11, e 3D11, respectivamente. A figura 12C ilustra a seqüência de aminoácido fornecida no SEQ ID No.: 20.

A figura 13 exibe os resultados em um ensaio conduzido para identificar o epítopo reconhecido pelo anticorpo WISP-1 9C10.

A figura 14 exibe os resultados de um ensaio de ELISA que demonstra a detecção de WISP-1 pelos anticorpos WISP-1.

Figura 15 exibe os resultados de um ensaio de ligação por ELISA demonstrando que os anticorpos WISP-1 que reconhecem a região variável de WISP-1 podem inibir a ligação do WISP-1 com a heparina.

A Figura 16A exibe os resultados de um ensaio que detecta a inibição da haptotaxia das células NRK pelos anticorpos WISP-1.

As figuras 17A-E exibem os resultados de um estudo in vivo sobre os efeitos dos anticorpos WISP-1. Após 3 semanas, a severidade das lesões encontrada em animais tratados com o anticorpo WISP 1 foi extremamente atenuada quando comparada ao controle (Fig. 17 a, b). O número de nódulos e a área média dos focos metastáticos encontrados nos camundongos tratados com anticorpos WISP 1 (n=5) foram reduzidos comparados aos animais tratados com anticorpo controle (Fig. 17 c, d). A área pulmonar total coberta pelas lesões foi reduzida em 82-97% comparado aos animais tratados com anticorpo isotipo controle (fig. 17e)

A figura 18 é um diagrama de barras que mostra a expressão de WISP-1 em linhagens de células 4T1/controle, 4T1/WISP-1L, 4T1/WISP-1H, NRK/controle, NRK/WISP-1L, e WISP-1 H mensuradas por RT-PCR semi- quantitativo (Taqman).

A figura 19 exibe os resultados de um ensaio in vitro na formação de colônias de linhagens de células 4T1/controle, 4T1/WISP-1L, e 4T1/WISP-1H.

A figura 20 exibe os resultados de um ensaio in vitro mensurando o índice de invasão utilizando um sistema modificado de Matrigel na câmara de Boyden e linhagens de células 4T1/controle, 4T1/WISP-1L, e 4T1/WISP-1H.

As figuras 21A-B exibem os efeitos da expressão de WISP-1 na tumorigênese de células epiteliais de mama. O efeito do WISP-1 foi analisado injetando as células 4T1/controle 1, 4T1/controle 2, 4T1/WISP-1L ou 4T1/WISP-1H em camundongos Balb/C. O volume do Tumor (21 A) e o peso do tumor (21 B) são divulgados.

A figura 22 é um diagrama de barras que ilustra a expressão relativa de HAS2 e CD44 nos tumores formados pelas células 4T1 /controle, 4T1/WISP-1L e 4T1/WISP-1H inoculadas.

As figuras 23A-F ilustram os efeitos da WISP-1 na metástase de células epiteliais de mama avaliadas in vivo inoculando as células 4T1 nos panículos adiposos mamário dos camundongos e examinando a extensão da propagação metastática por tomografia computada e histologia. Após 31 dias, os camundongos inoculados com as células 4T1/WISP-1L ou 4T1/WISP-1H tiveram metástase extensiva no pulmão (Fig. 23b e 23d) comparado aos camundongos injetados com células 4T1/controle (Fig. 23a e 23c). Utilizando a técnica de imuno-histoquímica, observou-se também que os focos metastáticos de 4T1/WISP-1 pulmonar expressaram níveis elevados de CD44 (Fig. 23e). Nestes tumores, o CD44 foi localizado na membrana plasmática das células 4T1/WISP-1 (Fig. 23f).

A figura 24A exibe a expressão de WISP-1 em linhagens de células NRK/controle, NRK/WISP-1_1234, NRK/WISP-1_134, NRK/WISP- 1_234, NRK/WISP-1_123 e NRK/WISP-1_124, mensurada por RT-PCR semi- quantitativo (Taqman); os resultados são expressos como aumento relativo da expressão de WISP-1 em NRK/WISP-1_1234. A figura 24B ilustra os efeitos destas construções no tumorigênese in vivo; os resultados são exibidos pelo efeito no volume do tumor.

A figura 25 exibe a análise histológica dos tumores extirpados referidos na figura 24 e demonstrou que as células neoplásicas dos tumores NRK/WISP-1_234 foram fenotipicamente similares às células neoplásicas dos tumores NRK/WISP-1_1234. Nestes tumores, as células pareceram fibroblásticas, diferenciadas e fusiformes. As células neoplásicas dos tumores NRK/WISP-1_134 eram fenotipicamente diferentes e pareciam menos diferenciadas, freqüentemente multinucleadas e possuíam uma taxa mitótica ativa demonstrada pela presença de múltiplas figuras mitóticas (setas).

A figura 26 mostra a análise histológica dos tumores extirpados em xenoenxertos de NRK/WISP-1_134 referido na figura 24, e mostra as células neoplásicas invadindo diversos vasos sangüíneos junto ao tumor.

A figura 27 mostra a invasão aumentou expressão comparada ao controle em que células HEK 293 transfectadas com um vetor vazio foram plaqueadas em um sistema de câmara de Boyden modificado. As células 4T1 demonstraram uma aumento da invasão de 4 vezes enquanto que as células HEK 293 expressando construções WISP-1_1234, WISP-1_134 ou WISP-123 foram semeadas na câmara de baixo.

As figuras 28A-28B ilustram os efeitos da WISP-1 domínio-1 solúvel na invasão de células 4T1 promovida pela WISP-1, avaliada usando um sistema modificado de câmara de Boyden revestida de Matrigel. Os resultados são expressos como aumento relativo da invasão comparada às células controle 4T1/. WISP-1-domínio-1-His e WISP-1-domínio-1-Fc demonstraram uma atividade antagonística dose dependente para a invasão de 4T1 promovida por WISP-1.

A figura 29 ilustra uma análise por hibridização in situ em tecidos do modelo de xenoenxerto de HPAC de adenocarcinomas pancreáticos humano para avaliar a expressão de WISP-1

A figura 30 exibe um gráfico que ilustra os efeitos das construções de WISP-1 no volume do tumor em um modelo de camundongo nude.

A figura 31 mostra as análises por hibridização in situ em que avaliam a expressão de WISP-1 em adenocarcinoma pancreático humano primário.

A figura 32 mostra a expressão de WISP-1 avaliada pela coloração por imuno-histoquímica em adenocarcinomas primários de cólon.

Descrição Detalhada da Invenção

I. Definições

O termo "polipeptídeo WISP" refere-se à família da seqüência nativa e variante das proteínas WISP humana e de camundongo descritos no presente cujos genes são induzidos pelo menos pelo WnM. Este termo inclui WISP-1 e variantes deste. Tais proteínas WISP-1 são adicionalmente descritas abaixo e no pedido de patente PCT W099/21998 publicada em 6 de maio de 1999, patente US 6,387,657 B1 emitido em 14 de maio de 2002, e em Pennica et al., Proc. Natl. Acad. Sci.. 95:14717-14722 (1998).

Os termos "polipeptídeo WISP-1", "WISP-1 homólogo" e variantes gramaticais desses, como usados no presente, abrange a proteína da seqüência de WISP-1 nativa e variante (que estão definidos mais adiante no presente). O polipeptídeo WISP-1 pode ser isolado de uma variedade de fontes como, por exemplo, de tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou podem ser preparados por métodos recombinantes ou sintéticos, ou por qualquer combinação destas técnicas e técnicas similares.

O termo "polipeptídeo WISP-1 compreende um polipeptídeo que contém a mesma seqüência de aminoácidos do polipeptídeo WISP-1 correspondente derivado da natureza. Esses polipeptídeos WISP-1 de seqüência nativa podem ser isolados da natureza ou podem ser produzidos através de meios sintéticos e/ou recombinantes. A expressão "polipeptídeo WISP-1 de seqüência nativa" engloba especificamente formas secretadas ou truncadas de polipeptídeo WISP-1 divulgados no presente, formas variantes de ocorrência natural (tais como formas alternativamente submetidas a splicing) e variantes alélicas de ocorrência natural do polipeptídeo WISP-1. Em uma realização da presente invenção , o polipeptídeo WISP-1 de seqüência nativa é um polipeptídeo de seqüência nativa madura ou contígua dos resíduos de aminoácidos 23 a 367 da Figura 9 ao aminoácidos 1 a 367 da figura 9 respectivamente, com ou sem metionina N-terminal.

Em outro exemplo de realização da presente invenção, o polipeptídeo de seqüência nativa do WISP-1 é o polipeptídeo WISP-1 de seqüência nativa humana de comprimento total ou madura que compreende os aminoácidos 23 a 367 ou 1 a 367 da figura 9 em que o resíduo da valina na posição 184 ou o resíduo da alanina na posição 202 foi/foram modificadas por um resíduo de isoleucina ou serina, respectivamente, com ou sem metionina N- terminal. Em outro exemplo de realização da presente invenção, o polipeptídeo WISP-1 de seqüência nativa é o polipeptídeo WISP-1 de seqüência nativa humana de comprimento total ou madura que compreende os aminoácidos 23 a 367 ou 1 a 367 da figura 9 em que o resíduo de valina na posição 184 e o resíduo de alanina na posição 202 foi/foram trocados por isoleucina ou serina, respectivamente, com ou sem metionina N-terminal.

Em outro exemplo de realização da presente invenção, o polipeptídeo WISP-1 de seqüência nativa é um que é codificado por uma seqüência de nucleotídeo que inclui um splice da WISP-1 humana de outros variantes seqüência nativa, incluindo SEQ ID N0: 23, 24, 25, 26, 27, 28, ou 29 exibidos no documento W099/21998, com ou sem metionina no N-terminal.

O termo de "WISP-1 variante" significa um polipeptídeo WISP-1 ativo como definido abaixo tendo pelo menos 80%, preferencialmente pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, mais preferencialmente pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, a identidade da seqüência de aminoácidos de pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, mais preferivelmente pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% com a identidade da seqüência de aminoácidos do WISP-1 humano maduro que tem a seqüência deduzida do aminoácido mostrado na figura 9, ou um fragmento solúvel deste. Tais variantes incluem, por exemplo, os polipeptídeos WISP-1 em que um ou mais resíduos de aminoácido é adicionado ou suprimido do N ou C-terminal das seqüências de cadeia completa ou maduras da figura 9, ou polipeptídeos WISP-1 em que um ou mais resíduos de aminoácido é introduzido ou suprimido da seqüência ou dos domínios internos do polipeptídeo, incluindo variantes de outras espécies, mas excluem um polipeptídeo WISP-1 de seqüência nativa. Preferivelmente tal variante age como um antagonista, como abaixo definido.

Um "domínio extracelular", "ECD" ou "secretado" refere-se a forma do polipeptídeo que está essencialmente livre dos domínios transmembrana e citoplasmático. Uma forma secretada de uma proteína ou polipeptídeo pode ou não incluir uma seqüência sinal.

"Circunstâncias estritas" são aquelas que (1) empregam força iônica alta e temperaturas baixas para lavar, por exemplo, 0,015M de cloreto de sódio/0,0015M citrato de sódio/0,1% dodecil sulfato de sódio a 50°C; (2) empregam durante o hibridização um agente desnaturante, tal como a formamida, por exemplo, formamida a 50% (vol/vol) com 0,1% de albumina do soro bovino /0,1% Ficol/0,1% polivinilpirrolidona/50 mM de tampão fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de citrato de sódio a 42°C; (3) empregam 50%, de formamida, 5x SSC (0,75 M de NaCI , 0,075M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% pirofosfato de sódio, 5 χ solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), 0,1% de SDS, e 10% de sulfato de dextran a 42°C, com lavagens a 42°C em 0,2 χ SSC e 0,1% SDS; ou (4) empregam um tampão 10% de sulfato de dextran, 2 χ SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio), e 50% formamida a 55°C, seguido por uma lavagem de alta estringência que consiste de 0,1 χ SSC contendo EDTA a 55°C.

"Circunstâncias moderadamente estritas" estão descritas em Sambrook e et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1989), e inclui o uso de uma solução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, temperatura, força iônica, e porcentagem de SDS) menos estringente do que as condições descritas acima.

Um exemplo de circunstâncias moderadamente estritas é uma condição, tal como, a incubação overnight a 37°C em uma solução contendo: formamida a 20%, 5 χ SSC (150 mM de NaCl, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5 χ solução de Denhardt, 10% sulfato de dextran, e 20 mg/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado, seguido por lavagens em filtros em 1 χ SSC a aproximadamente 37-50°C. O técnico hábil reconhecerá como ajustar a temperatura, a força iônica, etc., como necessário para acomodar fatores tais como o tamanho da sonda e etc.

"Isolado", quando utilizado para descrever os vários polipeptídeos descritos no presente, indica o polipeptídeo que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente do seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do seu ambiente natural são materiais que tipicamente interfeririam com usos terapêuticos ou diagnóstico para o polipeptídeo e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não-proteináceos.

Em realizações preferidas, a proteína será purificada (1) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácidos interna ou N- terminal através do uso de um seqüenciador de copo de fiação; ou (2) até a homogeneidade através de SDS-PAGE sob condições de redução ou não- redução, utilizando azul de Coomassie ou, preferencialmente, corante de prata.

O polipeptídeo isolado inclui polipeptídeo in situ em células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo não esteja presente. Normalmente, entretanto, o polipeptídeo isolado será preparado através de pelo menos uma etapa de purificação.

O termo "seqüências controle" refere-se às seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência de codificação operacionalmente ligado a um organismo hospedeiro particular. As seqüências de controle que são apropriadas para procariotos, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora, e um sítio de ligação do ribossomo. As células eucariotas são conhecidas para utilizar promotores, sinais do polidenilação e amplificadores.

Ácido nucléico é "operacionalmente ligado" quando é colocado em uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. DNA para uma seqüência prévia ou líder de secreção é operacionalmente ligado, por exemplo, a DNA para um polipeptídeo caso seja expresso na forma de uma proteína prévia que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou um amplificador é operacionalmente ligado a uma seqüência de codificação se afetar a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomo é operacionalmente ligado a uma seqüência de codificação caso seja posicionada de forma a facilitar a tradução. Geralmente, "operacionalmente ligado" indica que as seqüências de DNA que são ligadas são contíguas e, no caso de líder de secreção, contíguas e em fase de leitura. Entretanto, os amplificadores não necessitam ser contíguos. A ligação é obtida através de ligação em sítios de restrição convenientes. Caso esses sítios não existam, os ligantes ou adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos são utilizados de acordo com a prática convencional.

Um "lipossomo" é uma pequena vesícula composta por vários tipos de lipídeos, fosfolipídios e/ou surfactantes que são úteis para a entrega de uma droga (como por exemplo, insulina e variantes de insulina descritos no presente) a um mamífero. Os componentes do lipossomo são arranjados geralmente em uma formação de dupla camada, similar ao arranjo lipídico das membranas biológicas.

Os termos "aminoácido" e "aminoácidos" indicam todos os L-alfa- aminoácidos de ocorrência natural. Esta definição destina-se a incluir norleucina, ornitina e homocisteína. Os aminoácidos são identificados pelas suas designações de uma ou três letras:

<table>table see original document page 26</column></row><table>

Na Listagem de Seqüências e nas Figuras, algumas outras designações de uma letra ou três letras podem ser empregadas para indicar e identificar dois ou mais aminoácidos ou nucleotídeos em uma dada posição na seqüência.

"Percentual (%) de identidade de seqüências de aminoácidos", com relação às seqüências de polipeptídeos identificadas no presente, é definido como o percentual de resíduos de aminoácidos em uma seqüência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos no qual a seqüência do polipeptídeo identificada no presente, após o alinhamento das seqüências e introdução de gaps, se necessário, para atingir o percentual máximo de identidade de seqüência, sem considerar qualquer substituição conservadora como parte da identidade de seqüências. O alinhamento para propósitos de determinação do percentual de identidade de seqüências de aminoácidos pode ser atingido de várias formas que se encontram dentro do conhecimento do estado da técnica, tais como o uso de softwares de computador disponível ao público, tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo qualquer algoritmo necessário para atingir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das seqüências sendo comparadas. Para os propósitos do presente, entretanto, os valores percentuais (%) de identidade de seqüências de aminoácidos são obtidos conforme descrito abaixo, utilizando o programa de computador de comparação de seqüências ALIGN-2, em que o código fonte completo para o programa ALIGN-2 é fornecido na tabela abaixo. O programa de computador de comparação de seqüências ALIGN-2 foi desenvolvido pela Genentech1 Inc. e o código fonte foi depositado com a documentação do usuário no Escritório Norte-Americano de Direitos Autorais, Washington DC 20559, Estados Unidos, onde foi registrado com o n° de Registro de Direitos Autorais Norte-Americano TXU510087. O programa ALIGN-2 é disponível ao público através da Genentech1 Inc., South San Francisco, Califórnia, Estados Unidos. O programa ALIGN-2 deverá ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, preferencialmente UNIX digital V4.0D. Todos os parâmetros de comparação de seqüências são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

O termo "epítopo marcado" quando utilizado no presente refere-se a um polipeptídeo quimérico que compreende um polipeptídeo fundido a um "polipeptídeo marcado". O polipeptídeo marcado tem bastantes resíduos para fornecer um epítopo contra o qual um anticorpo pode ser feito. O polipeptídeo marcado é preferivelmente também original de modo que o anticorpo não reaja cruzadamente com outros epítopos. Os polipeptídeos marcados apropriados têm geralmente pelo menos seis resíduos de aminoácido e geralmente entre aproximadamente 8 a 50 resíduos de aminoácido (preferivelmente, entre 10 e 20 resíduos de aminoácido).

Da forma utilizada no presente, o termo "imunoadesina" designa moléculas similares a anticorpos que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga ("adesina") com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma seqüência de aminoácidos com a especificidade de ligação desejada, que é diferente do sítio de ligação e reconhecimento de antígenos de um anticorpo (ou seja, é "heteróloga") e uma seqüência de domínio constante de imunoglobulina. A parte de adesina de uma molécula de imunoadesina é tipicamente uma seqüência de aminoácidos contígua que compreende pelo menos o sítio de ligação de um receptor ou um ligante. A seqüência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida a partir de qualquer imunoglobulina, tal como os subtipos IgG- 1, lgG-2, lgG-3 ou igG-4, IgA (incluindo lgA-1 e lgA-2), IgE, IgD ou IgM.

O termo "antagonista" é utilizado no sentido mais amplo e inclui qualquer molécula que bloqueie, iniba ou neutralize, no todo ou em parte, uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo WISP-1, in vitro, in situ, ou in vivo. Exemplos dessas atividades biológicas dos polipeptídeos WISP-1 incluem a indução ou secreção de HAS2, HA, CD44 ou RHAMM em pelo menos um tipo de células de mamíferos. Um antagonista pode funcionar de maneira direta ou indireta. O antagonista pode funcionar, por exemplo, para bloquear, inibir ou neutralizar, no todo ou em parte, uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo WISP-1, in vitro, in situ, ou in vivo, como resultado, por exemplo, do bloqueio ou inibição da sua ligação ao polipeptídeo WISP-1. O antagonista pode também funcionar para bloquear, inibir ou neutralizar indiretamente, no todo ou em parte, uma ou mais atividades biológicas do polipeptídeo WISP-1, in vitro, in situ, ou in vivo como resultado, por exemplo, do bloqueio ou inibição de outra molécula efetora.

O termo "antagonista de WISP-1" refere-se a toda a molécula a que bloqueia, inibi ou neutraliza uma atividade biológica do WISP-1 e a incluí, mas não está limitado parcialmente ou inteiramente a, anticorpos, imunoadesinas, imunoadesinas WISP-1, proteínas de fusão de WISP-1, formas covalentes modificadas de WISP-1, WISP-1 variantes e proteínas de fusão destas, anticorpos WISP-1, e formas mais elevadas de oligômeros de WISP-1 (dímeros, agregados) ou formas homo ou héteropoliméricas de WISP-1. Para determinar se uma molécula antagonista de WISP-1 bloqueia, inibe ou neutraliza parcialmente ou inteiramente a atividade biológica de WISP-1, pode ser conduzidos ensaios para avaliar os efeitos da molécula antagonista, por exemplo, várias células (como descrito nos exemplos) ou em modelo in vivo de metástase de câncer de pulmão em murinos. Os vários ensaios podem ser conduzidos na forma de ensaios conhecidos in vitro ou in vivo. Preferivelmente, os antagonistas de WISP-1 empregados nos métodos descritos no presente serão capazes de bloquear ou neutralizar pelo menos um tipo de atividade da WISP-1, que pode opcionalmente ser determinado nos ensaios, tal como descrito no presente.

O termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente, por exemplo, anticorpos monoclonais isolados, composições de anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos de cadeia simples e fragmentos de anticorpos. "Anticorpo", da forma utilizada no presente, inclui moléculas de anticorpos ou imunoglobulina intactas, anticorpos policlonais, anticorpos multi-específicos (ou seja, anticorpos biespecíficos formados a partir de pelo menos dois anticorpos intactos) e fragmentos de imunoglobulina (tais como Fab, F(ab')2 ou Fv), desde que exibam qualquer das propriedades agonísticas ou antagonísticas desejadas descritas no presente.

Os anticorpos são tipicamente proteínas ou polipeptídeos que exibem especificidade de ligação para um antígeno específico. Os anticorpos nativos são normalmente glicoproteínas heterotetraméricas, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Tipicamente, cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto a quantidade de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia leve e pesada também contém pontes dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia pesada contém, em uma extremidade, um domínio variável (Vh) seguido por uma série de domínios constantes. Cada cadeia leve contém um domínio variável em uma extremidade (Vl) e um domínio constante na sua outra extremidade; o domínio constante da cadeia leve é alinhado ao primeiro domínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável da cadeia leve é alinhado ao domínio variável da cadeia pesada. Acredita-se que os resíduos de aminoácidos específicos formem uma superfície intermediária entre os domínios variáveis de cadeia leve e pesada [Chothia et al., J. Mol. Biol.. 186:651-663 (1985); Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 82:4592-4596 (1985)]. As cadeias leves de anticorpos de qualquer espécie vertebrada podem ser atribuídas a um dentre dois tipos claramente distintos, denominados kappa e lambda, com base nas seqüências de aminoácidos dos seus domínios constantes. Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínio constante das suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser atribuídas a classes diferentes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA1 IgD, IgE, IgG e IgM1 e várias delas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), tais como lgG-1, lgG-2, IgG- 3 e lgG-4; IgAI e lgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados alfa, delta, epsílon, gama, e mi, respectivamente.

"Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de anticorpo intacto, geralmente a ligação de antígeno ou região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv, diacorpos, moléculas de anticorpos de cadeia simples e anticorpos multiespecíficos formados com fragmentos de anticorpos. O termo "variável" é utilizado no presente para descrever certas porções dos domínios variáveis que diferem de seqüência entre os anticorpos e são utilizadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para o seu antígeno específico. Entretanto, a variabilidade normalmente não é distribuída regularmente ao longo dos domínios variáveis de anticorpos. Ela é tipicamente concentrada em três segmentos denominados regiões determinantes de complementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis, tanto nos domínios variáveis de cadeia leve como de cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas dos domínios variáveis são denominadas estruturas (FR). Cada um dos domínios variáveis de cadeia leve e pesada nativas compreendem 4 regiões FR1 que adotam em grande parte configuração de folha-β, conectadas por 3 CDRs1 que formam alças (Ioops) que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha-β. As CDRs em cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação de antígenos de anticorpos [vide, Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1987)]. Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tais como a participação do anticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpos.

A expressão "anticorpo monoclonal", da forma utilizada no presente, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos a um único sítio antigênico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos convencionais (policlonais) que tipicamente incluem anticorpos diferentes dirigidos a diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado a um único determinante sobre o antígeno.

Os anticorpos monoclonais do presente incluem anticorpos quiméricos, híbridos e recombinantes produzidos através da divisão de domínio variável (incluindo hipervariável) do anticorpo de interesse com um domínio constante (por exemplo, anticorpos "humanizados"), ou uma cadeia leve com uma cadeia pesada, ou uma cadeia de uma espécie com uma cadeia de outra espécie, ou fusões com proteínas heterólogas, independentemente da espécie de origem ou designação da classe ou subclasse de imunoglobulina, bem como fragmentos de anticorpos (tais como Fab, F(ab')2 e Fv), desde que exibam as propriedades ou atividades biológicas desejadas. Vide, por exemplo, a Patente US 4.816.567 e Mage et al., in Monoclonal Antibodv Production Techniques and Applications, pp.79-97 (Mareei Dekker, Inc.: New York, 1987).

Desta forma, o adjetivo "monoclonal" indica a característica do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser considerado como exigindo a produção do anticorpo através de qualquer método específico. Os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser preparados, por exemplo, através do método de hibridoma descrito em primeiro lugar por Kohler and Milstein, Nature1 256:495 (1975), ou podem ser fabricados através de métodos de DNA recombinante, tais como descrito na Patente US 4.816.567. Os "anticorpos monoclonais" também podem ser isolados a partir de bibliotecas de fagos geradas através da utilização das técnicas descritas, por exemplo, em McCafferty et ai, Nature, 348:552-554 (1990).

Formas "humanizadas" de anticorpos não-humanos (tais como murinos) são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina ou seus fragmentos (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subseqüências de ligação de antígenos de anticorpos) que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não-humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor), nas quais os resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do paciente são substituídos por resíduos de uma CDR de espécie não-humana (anticorpo doador), tal como camundongo, rato ou coelho que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região de estrutura Fv (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não-humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor nem nas seqüências de estrutura ou CDR importadas. Estas modificações são realizadas para refinar adicionalmente e otimizar o desempenho dos anticorpos. Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois, domínios variáveis nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem às de imunoglobulina não-humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são as de uma seqüência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado também compreenderá idealmente pelo menos uma porção de um domínio ou região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana.

Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma seqüência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um humano e/ou foi fabricado utilizando qualquer das técnicas de fabricação de anticorpos humanos conhecidas na técnica ou descritas no presente. Esta definição de anticorpo humano inclui anticorpos que compreendem pelo menos um polipeptídeo de cadeia pesada humano ou pelo menos um polipeptídeo de cadeia leve humano, tal como um anticorpo que compreende polipeptídeos de cadeia leve murinos e cadeia pesada humanos. Anticorpos humanos podem ser produzidos utilizando diversos métodos conhecidos na técnica. Em uma realização, o anticorpo humano é selecionado a partir de uma biblioteca de fagos, em que aquela biblioteca de fagos expressa anticorpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnoloqy, 14:309-314 (1996): Sheets et al. PNAS, (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom e Winter1 J. Mol. Biol.. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol.. 222:581 (1991)). Anticorpos humanos podem também ser fabricados através da introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, tais como camundongos, nos quais os genes de imunoglobulina endógenos foram parcial ou completamente desativados. Mediante desafio, é observada a produção de anticorpos humanos, que relembra de perto a observada em humanos em todos os aspectos, incluindo a rearranjo gênico, montagem e repertório de anticorpos.

Esta abordagem é descrita, por exemplo, nas Patentes US 5.545.807, US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.661.016 e nas publicações científicas a seguir: Marks et al., BiorTechnology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature. 368:812- 13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnoloqv. 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); Lonberg e Huszar, lntern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995). Alternativamente, o anticorpo humano pode ser preparado através da imortalização de linfócitos B humanos, produzindo um anticorpo dirigido contra um antígeno alvo (esses linfócitos B podem ser recuperados de um indivíduo ou podem ter sido imunizados in vitro). Vide, por exemplo, Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy. Alan R. Liss, pág. 77 (1985); Boemer et ai, J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991); e Patente US 5.750.373.

A expressão "região Fc" é utilizada para definir uma região C- terminal de uma cadeia pesada de imunoglobulina que pode ser gerada através de digestão de papaína de um anticorpo intacto. A região Fc pode ser uma região Fc de seqüência nativa ou uma região Fc variante. Embora os limites da região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina possam variar, a região Fc de cadeia pesada de IgG humano é normalmente definida como estendendo-se a partir de um resíduo de aminoácidos por volta da posição Cys226, ou por volta da posição Pro230, até o carbóxi-terminal da região Fc (utilizando no presente o sistema de numeração de acordo com Kabat et ai, supra). A região Fc de uma imunoglobulina geralmente compreende dois domínios constantes, um domínio CH2 e um domínio CH3, e compreende opcionalmente um domínio CH4.

Por "cadeia de região Fc", indica-se no presente uma das duas cadeias de polipeptídeo de uma região Fe.

O "domínio CH2" de uma região Fc de IgG humano (também denominado como domínio "Cy2") normalmente estende-se a partir de um resíduo de aminoácido perto da posição 231 até um resíduo de aminoácido perto da posição 340. O domínio CH2 é exclusivo por não parear-se fortemente com outro domínio. Por outro lado, duas cadeias de carboidrato ramificadas N- ligadas são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molécula IgG nativa intacta. Especulou-se que o carboidrato pode fornecer um substituto para o pareamento entre domínios e ajudar a estabilizar o domínio CH2. Burton, Molec. Immunol. 22: 161-206 (1985). O domínio CH2 no presente pode ser um domínio CH2 de seqüência nativa ou domínio CH2 variante.

O "domínio CH3" compreende o estiramento de resíduos C- terminais até um domínio CH2 em uma região Fc (ou seja, de um resíduo de aminoácido de cerca na posição 341 até um resíduo de aminoácido de cerca na posição 447 de um IgG). A região CH3 do presente pode ser um domínio CH3 de seqüência nativa ou um domínio CH3 variante (por exemplo, domínio CH3 com uma "protuberância" introduzida em uma de suas cadeias e uma "cavidade" introduzida correspondente na outra de suas cadeias; vide a Patente US 5.821.333). Esses domínios CH3 variantes podem ser utilizados para elaborar anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos), conforme descrito no presente.

"Região de articulação" é geralmente definida como estendendo- se de cerca de Glu216, ou cerca de Cys26, a cerca de Pro230 de IgGI humano (Burton, Moíec. Immunol. 22: 161-206 (1985)). As regiões de articulação de outros isotipos de IgG podem ser alinhadas com a seqüência de IgGI através da colocação dos primeiro e último resíduos de cisteína, formando ligações S-S intercadeias pesadas nas mesmas posições. A região de articulação do presente pode ser uma região de articulação de seqüência nativa ou uma região de articulação variante. As duas cadeias de polipeptídeos de uma região de articulação variante geralmente retêm pelo menos um resíduo de cisteína por cadeia de polipeptídeo, de tal forma que as duas cadeias de polipeptídeos da região de articulação variante possam formar uma ligação dissulfeto entre as duas cadeias. A região de articulação preferida do presente é uma região de articulação humana de seqüência nativa, tal como uma região de articulação de IgGI humana de seqüência nativa.

Uma "região Fc funcional" possui pelo menos uma "função efetora" de uma região Fc de seqüência nativa. Exemplos de "funções efetoras" incluem ligação de C1q; citotoxicidade dependente de complemento (CDC); ligação de receptor Fc; citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC); fagocitose; regulação negativa de receptores da superfície celular (tais como receptor de células B; BCR) etc. Essas funções efetoras geralmente necessitam que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (tal como um domínio variável de anticorpo) e podem ser determinadas utilizando vários testes conhecidos na técnica para avaliar essas funções efetoras de anticorpos.

Uma "região Fc de seqüência nativa" compreende uma seqüência de aminoácidos idêntica à seqüência de aminoácidos de uma região Fc encontrada na natureza. "Região Fc variante" compreende uma seqüência de aminoácidos que difere daquela de uma região Fc de seqüência nativa em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. Preferencialmente, a região Fc variante contém pelo menos uma substituição de aminoácido em comparação com uma região Fc de seqüência nativa ou com a região Fc de um polipeptídeo parental, tal como cerca de uma a dez substituições de aminoácidos e, preferencialmente, cerca de uma a cerca de cinco substituições de aminoácidos em uma região Fc de seqüência nativa ou na região Fc do polipeptídeo parental. A região Fc variante do presente possuirá preferencialmente pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência com uma região Fc de seqüência nativa e/ou com uma região Fc de um polipeptídeo parental e, de maior preferência, pelo menos cerca de 90% de identidade de seqüência com ele, de maior preferência, pelo menos cerca de 95% de identidade de seqüência com ele.

"Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos" e "ADCC" designa uma resposta mediada por células na qual células citotóxicas não-específicas que expressam receptores Fc (FcRs) (tais como Células natural killer (NK), neutrófilos e macrófagos) reconhecem o anticorpo ligado sobre uma célula alvo e causam, em seguida, a Iise da célula alvo. As células primárias para a mediação de ADCC, células NK, expressam apenas FcDRIll, enquanto monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR sobre células hematopoiéticas é resumida na Tabela 3, pág. 464, de Ravetch e Kinet, Annu. Rev: Immunol., 9: 457-92 (1991). Para determinar a atividade ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um teste ADCC in vitro, tal como o descrito na Patente US 5.500.362 ou US 5.821.337. As células efetoras úteis para esses testes incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC) e células natural killer (NK). Alternativa ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser determinada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o descrito em Clynes et ai, PNAS (USA.), 95: 652-656 (1998).

"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam uma ou mais FcRs e desempenham funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e desempenham função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares sangüíneas periféricas (PBMC)1 células natural killer (NK)1 monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladas a partir de uma fonte nativa, tal como sangue ou PMBCs, conforme descrito no presente.

As expressões "receptor Fc" ou "FcR" são utilizadas para descrever um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que liga um anticorpo de IgG (receptor gama) e inclui receptores das subclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e, alternativamente, formas divididas desses receptores. Os receptores de FcyRII incluem FcyRIIA ("receptor de ativação") e FcyRIIB ("receptor de inibição"), que contêm seqüências de aminoácidos similares que diferem principalmente nos seus domínios citoplasmáticos. Receptor de ativação FcyRIIA contém uma unidade de ativação com base em tirosina imunorreceptora (ITAM) no seu domínio citoplasmático. Receptor de inibição FcyRIIB contém uma unidade de inibição com base em tirosina imunorreceptora (ITIM) no seu domínio citoplasmático (analisado em Daéron, Annu. Rev. Immunol., 15: 203-234 (1997)). FcRs são analisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9: 457-92 (1991); Capei et ai, Immunomethods 4: 25-34 (1994); e de Haas et ai, J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41 (1995). Outros FcRs1 incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo "FcR" no presente. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsível pela transferência de IgGs maternos para o feto (Guyer et al., J. Immunol., 117: 587 (1976); e Kim et al., J. Immunol.. 24: 249 (1994)).

"Citotoxicidade dependente de complemento" e "CDC" designam a lise de um alvo na presença de complemento. O processo de ativação de complementos é iniciado pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) a uma molécula (tal como um anticorpo) em complexo com um antígeno cognato. Para determinar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio CDC, conforme descrito, por exemplo, em Gazzano- Santoro et al., J. Immunol. Methods. 202: 163 (1996).

Anticorpo "maturado por afinidade" é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais de suas CDRs, o que resulta em aumento da afinidade do anticorpo para o antígeno, em comparação com anticorpo parental que não possui essa(s) alteração(ões). Os anticorpos maturados por afinidade preferidos possuirão afinidades nanomolares ou até picomolares para o antígeno alvo. Os anticorpos maturados por afinidade são produzidos através de procedimentos conhecidos na técnica. Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992) descreve a maturação por afinidade através de troca de domínios Vh e Vl . A mutagênese aleatória de resíduos de estrutura e/ou CDR é descrita por: Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 91: 3809-3813 (1994); Schier et al., Gene, 169: 147-155 (1995); Yelton et al., J. ImmunoL 155: 1994- 2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol., 154 (7): 3310-9 (1995); e Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992).

O termo "imunoespecífico", da forma utilizada em "ligação imunoespecífica de anticorpos", por exemplo, designa a interação de ligação específica de antígenos que ocorre entre o sítio de combinação de antígenos de um anticorpo e o antígeno específico reconhecido por aquele anticorpo.

Os termos "câncer", "canceroso", "metástase" e "maligno" designam ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas sem limitar-se a, carcinoma, incluindo adenocarcinoma, linfoma, blastoma, melanoma, sarcoma e leucemia. Exemplos mais específicos desses cânceres incluem carcinoma de células escamosas, câncer do pulmão de células pequenas, câncer do pulmão de células não-pequenas, câncer gastrointestinal, linfoma de Hodgkin e não-Hodgkin, câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer do ovário, câncer do fígado tal como carcinoma hepático e hepatoma, câncer da bexiga, câncer de mama, câncer do cólon, câncer colorretal, carcinoma endométrico, mieloma (tal como mieloma múltiplo), carcinoma das glândulas salivares, câncer nos rins tal como carcinoma das células renais e tumores de Wilms, carcinoma das células basais, melanoma, câncer de próstata, câncer da vulva, câncer da tireóide, câncer dos testículos, câncer do esôfago e vários tipos de câncer da cabeça e do pescoço. Cânceres preferidos para tratamento no presente incluem câncer de mama, câncer gástrico, câncer de pulmão, câncer de cólon ou coloretal, glioma e glioblastoma.

O termo "pró-droga", da forma utilizada no presente pedido, designa uma forma precursora ou derivada de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica para células cancerosas em comparação com a droga parental e é capaz de ser ativada de forma enzimática ou convertida na forma parental mais ativa. Vide, por exemplo, Wilman, Prodrugs in Câncer Chemotherapy, Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615a Reunião de Belfast (1986) e Stella et ai, Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et ai, (ed.), págs. 247-267, Humana Press (1985). As pró-drogas de acordo com a presente invenção incluem, mas não se limitam a, pró-drogas que contêm fosfato, pró-drogas que contêm tiofosfato, pró-drogas que contêm sulfato, pró-drogas que contêm peptídeos, pró-drogas modificadas com D- aminoácidos, pró-drogas glicosiladas, pró-drogas que contêm beta-lactama, pró-drogas que contêm fenoxiacetamida opcionalmente substituída ou pró- drogas que contêm fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outras pró-drogas de 5-fluorouridina que podem ser convertidas na droga citotóxica livre mais ativa. Exemplos de drogas citotóxicas que podem ser derivadas em forma de pró-droga para uso na presente invenção incluem, mas sem limitar-se a, os agentes quimioterápicos descritos abaixo.

A expressão "agente citotóxico", da forma utilizada no presente, indica uma substância que inibe ou evita o funcionamento das células e/ou causa a destruição das células. A expressão destina-se a incluir isótopos radioativos (tais como At211, I1311 I125, Y901 Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápicos e toxinas tais como toxinas de moléculas pequenas ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou aimal, incluindo seus fragmentos e/ou variantes.

Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento de condições como o câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem agentes alquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida (CYTOXAN®); sulfonatos de alquila, tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas, tais como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etilenoiminas e metilamelaminas, incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); camptotecin (incluindo o análogo sintético topotecan); briostatin; calistatin; CC-1065 (incluindo seus análogos sintéticos adozelesin, carzelesin e bizelesin); criptoficinas (particularmente criptoficin-1 e criptoficin-8); dolastatin; duocarmicin (incluindo os análogos sintéticos KW-2189 e CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio, tais como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracila; nitrossuréias, tais como carmustina, clorozotocin, fotemustina, Iomustina1 nimustina, ranimustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enedina (por exemplo, caliqueamicin, especialmente caliqueamicin (11 e caliquemicin vide, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Enql., 33: 183-186 (1994); dinemicina, incluindo dinemicina A; esperamicina; bem como neocarzinostatina cromóforo e cromóforos antibióticos de enedina cromoproteína relacionados), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorrubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, doxorrubicin (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino- doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicin e desoxidoxorubicin), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabólitos, tais como metotrexato e 5- fluorouracila (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterin, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; andrógenos, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositores de ácido fólico, tal como ácido frolinico; aceglatona; aldofosfamido glicosídeo; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidamina; maitansinóides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitacrina; pentostatin; fenamet; pirarubicin; ácido podofilínico; 2-etilidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxin; sizofiran; espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurin A, roridin A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, tais como paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton NJ1 Estados Unidos) e doxetaxel (TAXOTERE®, Rhône- Poulenc Rorer1 Antony1 França); clorambucil; gencitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; platina; etoposida (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposida; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; capecitabina; e os sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima. Também estão incluídos nesta definição agentes anti- hormonais que agem para regular ou inibir a ação hormonal sobre tumores, tais como anti-estrógenos, incluindo, por exemplo, tamoxifen, raloxifeno, 4(5)- imidazóis inibido por aromatase, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, queoxifeno, LY117018, onapristona e toremifeno (Fareston); e anti-andrógenos, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, Ieuprolida e goserelina; e sais, ácidos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis de quaisquer dos acima.

"Agente inibidor do crescimento", da forma utilizada no presente, designa um composto ou composição que inibe o crescimento de uma célula, seja in vitro ou in vivo. Desta forma, o agente inibidor do crescimento é aquele que reduz significativamente o percentual de células que sobreexpressam esses genes em fase S. Exemplos de agentes inibidores do crescimento incluem agentes que bloqueiam o progresso do ciclo celular (em um local diferente da fase S), tais como agentes que induzem a suspensão de G1 e a suspensão da fase M. Os bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxol e inibidores topo II, tais como doxorrubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposida e bleomicin. Estes agentes que suspendem G1 também se difundem para a suspensão da fase S, por exemplo, agentes alquilantes de DNA1 tais como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatin, metotrexato, 5-fluorouracila e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado Cell Cycle Regulation, Oncogenes and Antineoplastic Drugs de Murakami et ai, (WB Saunders: Filadélfia, Estados Unidos, 1995), especialmente a pág. 13.

O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadas por uma população de células que agem sobre outra célula como mediadores intercelulares. Exemplos dessas citocinas são linfocinas, monocinas e hormônios de polipeptídeos tradicionais. Encontram-se incluídos entre as citocinas hormônios do crescimento, tais como hormônio do crescimento humano, hormônio do crescimento humano N-metionila e hormônio do crescimento bovino; hormônio da paratireóide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; pró-relaxina; hormônios de glicoproteínas tais como hormônio estimulante dos folículos (FSH), hormônio estimulante da tireóide (TSH) e hormônio luteinizante (LH); fator do crescimento hepático; fator de crescimento fibroblástico; prolactina; lactogênio da placenta; fator α e β de necrose tumoral; Apo-2 ligante (também referida como TRAIL), substância inibidora de mulleriana; peptídeo associado à gonadotropina de camundongos; inibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento dos nervos; fator de crescimento das plaquetas, fatores de crescimento de transformação (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fator de crescimento similar à insulina I e II; eritropoietina (EPO); fatores osteoindutores; interferons, tais como interferon-α, β e γ; fatores estimulantes de colônias (CSFs) tais como macrófago-CSF (M-CSF); granulócito-macrófago- CSF (GM-CSF); e granulócito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; e outros fatores de polipeptídeos que incluem LIF e Iigante de kits (KL). Da forma utilizada no presente, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celular recombinante e equivalentes biologicamente ativos das citocinas de seqüências nativas.

O "tratamento" é uma intervenção executada com a intenção de impedir o desenvolvimento ou alterar a patologia de uma desordem. Assim sendo, "tratamento" refere-se ao tratamento terapêutico e as medidas profiláticas ou preventivas, em que o objetivo é impedir ou retardar (diminuir) a condição patológica ou desordem. Aqueles na necessidade de tratamento incluem indivíduos que já possuem a desordem bem como indivíduos em que a desordem deve ser impedida. No tratamento de uma desordem, um agente terapêutico pode diretamente diminuir ou aumentar o valor da resposta de um componente patológico da desordem, ou inverter a doença mais suscetível ao tratamento por outros agentes terapêuticos, por exemplo, antibióticos, anti- fúngicos, agentes anti-inflamatórios, quimioterápicos, etc.

A expressão "quantidade eficaz" é a concentração mínima do antagonista WISP-1 que causa, induz ou resulta em uma melhoria detectável ou redução de uma condição patológica. Em um método de tratar o câncer, uma quantidade eficaz é aquela que causa, induz, ou resulta na redução do número células de câncer ou do volume do tumor. Além disso, "quantidade terapeuticamente eficaz" é a concentração mínima (quantidade) do antagonista WISP-1 administrada a um mamífero que seja eficaz pelo menos em atenuar um sintoma patológico.

Administração "crônica" refere-se à administração do(s) fator(es) de forma contínua, ao contrário de modo agudo, de forma a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) por um maior período de tempo. Administração "intermitente" é o tratamento que não é efetuado de forma consecutiva sem interrupção, sendo natureza cíclica.

"Mamífero", para os propósitos de tratamento, refere-se a qualquer animal classificado como mamífero, incluindo seres humanos, animais domésticos e de criação e animais de zoológico, esportivos ou de estimação, tais como cães, cavalos, gatos, vacas etc. Preferencialmente, o mamífero é humano.

A administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui a administração simultânea (concomitante) e consecutiva em qualquer ordem.

"Veículo" como utilizado no presente inclui veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são preferencialmente atóxicos para as células e/ou os pacientes nas dosagens e concentrações empregadas. Freqüentemente o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução tampão aquosa de pH. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo o ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos que incluem glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sais tais como sódio; e/ou surfactantes não iônicos tais como TWEEN®, polietilenoglicol (PEG), PLURONICS®, e ácido hialurônico (HA). II. Métodos E Composições da Invenção

Como descrito adicionalmente nos exemplos abaixo, o peticionário surpreendentemente encontrou que a expressão ectópica de WISP-1 em fibroblastos provocou a produção do HA, ou seja, a produção aumentada de HA induz sua acumulação na superfície das células e nos meios de cultura. Acredita-se que o HA na superfície das células pode aumentar o crescimento e a tumorigênese independente de ancoragem (Kosaki et al., Câncer Res.,59:1141-1145 (1999)) e pode diminuir a inibição de contato da proliferação celular, e desse modo promover a migração da célula (Ichikawa et a/., J. Invest. Dermatol., 113:935-939 (1999); Itano et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 99:3609-3614 (2002)). A formação do revestimento de hyialuronan foi também correlacionada com o potencial metastático celular (Zhang et al., Câncer Res., 55:428-433 (1995); Toole et al., J. Biol. Chem., 277:4593-4596 (2002)). A análise de expressão da síntese de HA (HAS1, HAS2, e HAS3) revelou que WISP-1 promove a indução de HAS2 em quanto que os níveis de RNAm de HAS1 e HAS3 mRNA permanecem os mesmos. HAS2 é o alvo principal do fator do crescimento e da síntese de HÁ supra-regulada por citocina (Pienimaki et al., J. Biol. Chem.. 276:20428-20435 (2001)). A expressão ectópica de HAS2 aumenta a secreção de HA e induz a formação do revestimento de hialuronan (Kosaki et al., supra). Além disso, acredita-se que HAS2 desempenha um papel importante na transformação do epitélio no mesênquima mediada pelo hialuronan durante a morfogênese cardíaca (Camenisch et al., J. Clin. Invest.. 106:349-360 (2000)). Pela transição do epitélio para mesênquima este é também importante na invasão tumoral e na metástase, foi postulado que HAS2 desempenha um papel importante na progressão de tumores epiteliais (Boyer et al., Biochem. Pharmacol.. 60:1091- 1099 (2000); Hay1 Acta Anat.. 154:8-20 (1995); Árias, CeH1 105:425-431 (2001)). Estes resultados indicam que a secreção de HA induzida pela WISP-1 pode ser importante na invasão tumoral e na metástase.

A WISP-1 também induz a expressão de dois receptores de HA, CD44 e RHAMM. Pela indução da expressão do receptor de HA e aumentando a produção de HA1 a WISP-1 pode ativar um Ioop autócrino e/ou parácrino. A interação do hialuronan com o CD44 e RHAMM promove a locomoção celular e a proliferação in vitro da célula e o crescimento e metástase in vivo do tumor (Turley et ai, J. Biol. Chem.. 277:4589-4592 (2002); Sy et ai, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 213:129-153 (1996); Hall et ai, J. Neurooncol.. 26:221-229 (1995)).

Os efeitos da WISP-1 na migração celular foram analisados em um ensaio celular de cicatrização por microscopia time-lapse, e os dados mostraram que a expressão de WISP-1 promoveu a motilidade celular. Além disto, as células isoladas mostraram uma migração aumentada sugerindo que WISP-1 poderia agir através de um mecanismo autócrino. A WISP-1 recombinante purificada promoveu a expressão de HAS2 e CD44, embora ligada a uma superfície. Esta indução foi maior quando WISP-1 presa através de sua interação com a decorina. Similarmente, a WISP-1 promoveu motilidade celular enquanto ligada à superfície, sugerindo que a WISP-1 pode também agir através de um mecanismo parácrino enquanto presa a um substrato. Os exemplos no presente demonstram que a motilidade celular induzida por WISP- 1 foi mediada pelo CD44, abolindo a migração com o uso de um anticorpo anti- CD44. O motilidade celular induzida por WISP-1 foi inibido também com anticorpos WISP-1. Além disso, a atividade da WISP-1 haptotática não foi restrita a um único tipo de célula, induzindo a migração de fibroblasto normal e célula de adenocarcinoma de cólon.

Por acreditar-se que WISP-1 é um efetor a jusante de Wnt-1, a linhagem de células C57MG/Wnt-1 foi analisada pelos fenótipos encontrados nas células NRK/WISP-1. Consistente com o papel da WISP-1 a jusante de Wnt-1, as células C57MG/Wnt-1 super-expressaram HAS2 e CD44 e tiveram um índice de proteína CD44 mais elevada comparado à linhagem parental desta célula. Além disso, células C57/Wnt-1 espontaneamente dispersas em cultura demonstram uma morfologia des-diferenciada fusiformes similar às células NRK/WISP-1H.

A análise da expressão foi também executada em um grupo de tumores de mama MMTV-Wnt-1, e a expressão elevada de CD44 e HAS2 foi detectada em todos os tumores de mama de camundongos transgênicos MMTV-Wnt-1. Nestes tumores, a expressão de WISP-1 foi localizada em fibroblastos do estroma enquanto que o CD44 e HAS2 foram expressos por células de tumor epitelial. Embora negativo para a expressão de HAS2, o estroma peritumoral conteve níveis elevados de HA visto que o parênquima do tumor corou-se fracamente para HA. Embora seja aceito que os fibroblastos são responsáveis pela produção de HA, a origem do HA estromal não é conhecida definitivamente. Pelo fato da expressão de HAS2 ser encontrada apenas no parênquima, os resultados experimentais divulgados no presente sugerem que as células do tumor são responsáveis pela síntese e deposição do HA no estroma. O acúmulo de hialuronan no estroma peritumoral é freqüentemente encontrado em diversos tipos de tumores e foi previamente descrito para adenocarcinomas de ovário, mama, próstata e cólon (Ropponen et al., Câncer Res., 58:342-347 (1998); Lipponen et al., Eur. J. Câncer. 37:849- 856 (2001); Auvinen et al., Am. J. Pathol., 156:529-536 (2000); Anttila et al., Câncer Res., 60:150-155 (2000)). Além disso, níveis de HÁ elevados no estroma esteve associado com pouca diferenciação, comportamento metastático e prognóstico desfavorável.

Pelo fato do HA e CD44 estarem associados com a invasão tumoral, o potencial metastático das células expressando WISP-1 foi avaliado in vivo. Após a inoculação na cauda, as células NRK/WISP-1 colonizaram prontamente os pulmões dos camundongos injetados e deram forma a tumores invasivos. As células NRK/WISP-1 exibiram um potencial metastático significante enquanto as células NRK não. A observação histológica revelou que as células NRK/WISP-1 povoaram a vasculatura e invadiram as vias áreas pulmonares. A colonização pulmonar foi proporcional ao número de células injetadas, ao tempo após a injeção e à expressão de WISP-1. Além disso, o peticionário encontrou o potencial metastático proporcional aos níveis de expressão do CD44 e HAS2, e o tratamento dos camundongos inoculados com células NRK/WISP-1 H com anticorpo CD44 ou anticorpo WISP-1 diminuiu extremamente o número e o tamanho dos tumores no pulmão. Assim, é provável que os níveis de WISP-1 promoveram a colonização do pulmão através de um mecanismo hialuronan-CD44. Isto é consistente com relatos prévios que demonstraram a importância do CD44 e de sua interação com HA no crescimento do tumor, na metástase e a retenção de células metastáticas na vasculatura do pulmão. (Sy et al., supra; Kogerman et ai, Proc. Natl. Acad. Sci., 94:13233-13238 (1997)).

Embora ativação da via da Wnt pelo APC ou pela β-catenina as mutações podem tipicamente estar associadas com o câncer coloretal, diversas linhas de evidência sugerem que desempenha também um papel em outros tipos de câncer incluindo o adenocarcinoma de mama (Polakis, Genes Dev.. 14:1837-1851 (2000); Brown1 Breast Câncer Res., 3:351-355 (2001)). O truncamento da APC e o aumento nos níveis de β-catenina foram encontrados em linhagens de células de câncer de mama humano (Schlosshauer et ai, Carcinoqenesis, 21:1453-1456 (2000)). Mutações somáticas do gene da foram encontrados em cânceres de mama primários (Furuuchi et ai, Am. J. Pathol., 156:1997-2005 (2000)). Além disto, as mutações que ativam a β-catenina promovem adenocarcinomas de mama de camundongos Michaelson et ai, Qncoqene, 20:5525-5532 (2001)). Níveis elevados de Wnt-1 e β-catenina foram encontrados em carcinomas mama ductais invasivos e correlacionados com prognóstico pobre. (Lin et ai, Proc. Natl. Acad. Sci.. 97:4262-4266 (2000)).

É possível então que a expressão de WISP-1 encontrada em determinados adenocarcinomas de mama é resultado da ativação da via da Wnt. Os peticionários encontraram também, pela análise por Taqman1 que a WISP-1 é super-expressa em cânceres, tais como, o câncer de mama e tumores gliais.

Por pelo menos estas razões, acredita-se que os antagonistas de WISP-1 serão especialmente úteis no tratamento e diagnóstico de várias desordens patológicas, tais como o câncer. A presente invenção fornece adequadamente métodos para modular, bloquear ou neutralizar a atividade da WISP-1 em células de mamíferos que compreende a exposição das células a uma quantidade desejada de antagonista de WISP-1. Preferivelmente, a quantidade de antagonista de WISP-1 empregada será uma quantidade eficaz para reduzir ou inibir o crescimento da célula de câncer, a metástase ou a motilidade. Isto pode ser realizado in vivo ex vivo de acordo, por exemplo, com os métodos e exemplos descritos abaixo. As circunstâncias ou desordens exemplares a serem tratados com tais antagonistas WISP-1 incluem circunstâncias referidas clinicamente nos mamíferos como câncer.

Métodos diagnósticos também são fornecidos no presente. Por exemplo, os antagonistas podem ser empregados para detectar cânceres invasivos ou metastáticos. A molécula do antagonista pode ser usada, por exemplo, em ensaios para se detectar ou quantificar células de câncer metastático em uma amostra. Uma amostra como, por exemplo, células obtidas de um mamífero, podem ser incubadas na presença de um antagonista marcado, e a detecção do antagonista marcado ligado à amostra pode ser executada.

Os antagonistas que podem ser empregados nos métodos incluem, mas não são limitados a, imunoadesinas WISP-1, proteínas de fusão contendo WISP-1, formas covalentemente modificadas de WISP-1, WISP-1 variantes, proteínas da fusão destas e anticorpos WISP-1. As várias técnicas que podem ser empregadas na produção dos antagonistas são descritas no presente. Por exemplo, são descritos os métodos e as técnicas para se preparar polipeptídeos WISP-1. Algumas modificações adicionais nos polipeptídeos, anticorpos WISP-1 também estão descritas.

Além da seqüência nativa de comprimento total da WISP-1 descrita no presente, contempla-se que variantes do polipeptídeo WISP-1 podem ser preparados. Os variantes de WISP-1 podem ser preparados introduzindo mudanças apropriadas de nucleotídeos no DNA codificador e/ou pela síntese do polipeptídeo desejado. Os conhecedores da técnica apreciarão que as mudanças de aminoácido podem alterar processos pós-translacional do anticorpo, tais como a mudança do número ou na posição dos locais de glicosilação ou alterar as características de ancoramento da membrana.

As variações no WISP-1 descritos no presente podem ser feitas, por exemplo, usando algumas das técnicas e diretrizes para as mutações conservativas e não conservativas determinadas, por exemplo, na patente US 5.364.934. As variações podem ser uma substituição, uma deleção ou inserção de um ou mais códons que codificam o polipeptídeo resultando em uma mudança na seqüência de aminoácidos em comparação ao polipeptídeo da seqüência nativa. Opcionalmente a variação é pela substituição de pelo menos um aminoácido com qualquer outro aminoácido em um ou mais dos domínios do polipeptídeo WISP-1. A orientação em determinar que resíduo de aminoácido pode ser introduzido, substituído ou deletado sem afetar adversamente a atividade desejada pode ser encontrada comparando a seqüência do polipeptídeo WISP-1 com moléculas protéicas homólogas conhecidas, minimizando o número de mudanças na seqüência do aminoácido feitas nas regiões de elevada homologia. As substituições de aminoácidos podem ser o resultado de substituir um aminoácido com um outro aminoácido que tem propriedades estruturais e/ou químicas similares, tais como a substituição de uma Ieucina por uma serina, isto é, substituições conservadoras de aminoácidos. Inserções ou deleções podem opcionalmente estar no alcance de cerca de 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada sistematicamente fazendo inserções, deleções ou substituições de aminoácidos na seqüência e testando a atividade exibida pelas variantes resultantes da seqüência parental.

Os fragmentos de polipeptídeos WISP-1 são fornecidos no presente. Tais fragmentos podem ser truncados no N-terminal ou C-terminal, ou podem faltar resíduos internos, por exemplo, quando comparados com um anticorpo nativo ou uma proteína de comprimento total. Certos fragmentos faltam resíduos de aminoácido que não são essenciais para a atividade biológica desejada do polipeptídeo WISP-1.

Os fragmentos de polipeptídeos WISP-1 podem ser preparados por um grande número de técnicas convencionais. Os fragmentos de peptídeo desejado podem ser sintetizados quimicamente. Uma alternativa abordada envolve a geração de fragmentos de polipeptídeo pela digestão enzimática, por exemplo, tratando a proteína com uma enzima conhecida para clivar proteínas em locais definidos por resíduos particulares de aminoácido, ou digerindo o DNA com enzimas apropriadas e isolando o fragmento desejado. Ainda em outra técnica apropriada que envolve o isolamento amplificação de um fragmento de DNA que codifica o fragmento do polipeptídeo desejado, pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Os oligonucleotídeos que definem o término desejado do fragmento de DNA são empregados nos primers 5' e 3' no PCR.

Em um exemplo de realização específico, as substituições conservadoras de interesse são mostradas na tabela abaixo sob o título de substituições preferidas. Se tais substituições resultarem em uma mudança na atividade biológica, neste caso mais mudanças substanciais, denominadas substituições exemplares na tabela, ou como descritas mais abaixo nas referências às classes de aminoácidos, são introduzidos e os produtos são selecionados.

<table>table see original document page 54</column></row><table> Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são atingidas através da seleção de substituições que difiram significativamente no seu efeito sobre a manutenção (a) da estrutura da cadeia principal de polipeptídeo na área da substituição, por exemplo, na forma de folha ou em conformação helicoidal; (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo; ou (c) do volume da cadeia lateral. Os resíduos de ocorrência natural são divididos em grupos com base nas propriedades comuns da cadeia lateral:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;

(3) ácidos: asp, glu;

(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;

(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Substituições não-conservadoras causarão a substituição de um membro de uma dessas classes por outra classe. Tais resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos locais conservados da substituição ou, mais preferivelmente, nos locais (não-conservados) restantes.

As variações podem ser feitas usando métodos conhecidos no estado da técnica como, por exemplo, a mutagênese mediada por oligonucleotídeos (sítio dirigidos), exploração da alanina e a mutagênese dirigida por PCR. Mutagênese local dirigida [Carter et ai, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et ai, Nucl. Acids Res.. 10:6487 (1987)], cassete mutagênese [Wells et ai, Gene, 34:315 (1985)], mutagênese de seleção e limitação [Wells et ai, Philos. Trans. R. Soe. London SerA. 317:415 (1986)] ou outras técnicas conhecidas podem ser executadas no DNA clonado para produzir o DNA do anticorpo ou polipeptídeo variante.

A análise de seleção do aminoácido pode também ser empregada para identificar um ou mais aminoácidos ao longo de uma seqüência contígua.

Entre a varredura de aminoácidos preferidos estão os aminoácidos neutros relativamente pequenos. Tais aminoácidos incluem a alanina, glicina, serina, e a cisteína. A alanina é tipicamente o aminoácido de seleção preferido entre este grupo porque elimina a cadeia lateral além do carbono beta é menos provável alterar a conformação da cadeia principal do variante [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. A alanina é preferida também tipicamente porque é o aminoácido o mais comum. Além disso, encontra-se freqüentemente em posições enterradas e expostas [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. Se a substituição da alanina não render quantidades adequadas de variantes, um aminoácido isotérico pode ser usado.

Qualquer resíduo da cisteína não envolvida em manter a conformação apropriada do polipeptídeo WISP-1 também pode ser substituída, geralmente com serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e para impedir ligações cruzadas aberrantes. Inversamente, ligação(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao polipeptídeo WISP-1 para melhorar sua estabilidade.

A descrição abaixo refere-se principalmente à produção de polipeptídeo WISP-1 através de cultura de células transformadas ou transfectadas com um vetor que contém o ácido nucléico que codifica o polipeptídeo WISP-1. Contempla-se que métodos alternativos, bem conhecidos na técnica, possam ser empregados para preparar o polipeptídeo WISP-1. Por exemplo, a seqüência de aminoácidos apropriada, ou porções desta, podem ser produzidas através da síntese direta de peptídeo utilizando técnicas de fase sólida [vide, por exemplo, Stewart et al., Solid-Phase Peptide Svnthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. Sínteses de proteínas in vitro podem ser realizadas utilizando técnicas manuais ou por automação. Sínteses automatizadas podem ser realizadas, por exemplo, pelo uso de um Sintetizador de Peptídeo de Biosistemas Aplicado (Foster, CA) utilizando as instruções do fabricante. Várias porções de polipeptídeo WISP-1 podem ser quimicamente sintetizados e combinados utilizando métodos químicos ou enzimátícos para a produção do polipeptídeo WISP-1 desejado. Os métodos e as técnicas descritas são similarmente adequadas para a produção de WISP-1 variantes, formas modificadas de WISP-1 e anticorpos WISP-1.

1. Isolamento do Dna que Codifica o Polipeptídeo WISP-1

O DNA que codifica o polipeptídeo WISP-1 pode ser obtido a partir de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de um tecido que acredita- se possuir o mRNA do polipeptídeo WISP-1 e expressá-lo a níveis detectáveis. Assim, o DNA do polipeptídeo WISP-1 humano pode ser convenientemente obtido de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido humano. O gene que codifica o polipeptídeo WISP-1 pode também ser obtido a partir de uma biblioteca genômica ou através de procedimentos sintéticos conhecidos (por exemplo, síntese de ácido nucléico automatizada).

As bibliotecas podem ser selecionadas com sondas (tais como oligonucleotídeos de pelo menos cerca de 20-80 bases) designadas para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada pelo mesmo. A seleção da biblioteca genômica ou de cDNA com sonda selecionada pode ser realizada através do uso de procedimentos padrão, tal como descrito em Sambrook et ai, Molecular Cloninp: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).Um meio alternativo de isolar o gene que codifica o polipeptídeo WISP-1 é o uso do metodologia do PCR [Sambrook et ai, supra; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratorv Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Técnicas para a seleção de uma biblioteca de cDNA são de técnicas bem conhecidas. As seqüências de oligonucleotídeos selecionadas como sondas devem ter um comprimento suficiente e suficientemente não- ambígüas, de forma que falso-positivos sejam minimizados. O oligonucleotídeo é preferencialmente marcado de forma que este possa ser detectado através da hibridização do DNA na biblioteca a ser selecionada. Métodos de marcação são de técnicas bem conhecidas, e incluem o uso de radio marcadores como ATP marcada com P321 biotinilação ou marcação enzimática. Condições de hibridização, incluindo estringência moderada e alta estringência, são fornecidas em Sambrook et ai, supra.

As seqüências identificadas nestes métodos de seleção de bibliotecas podem ser comparadas e alinhadas a outras seqüências conhecidas, depositadas e disponíveis em base de dados públicas, como no GenBank, ou outras bases de dados de seqüência privadas. A identidade da seqüência (tanto no nível dos aminoácidos quanto no nível dos nucleotídeos), em regiões específicas da molécula ou ao longo da seqüência do comprimento total, pode ser determinada com o uso de métodos de técnicas conhecidas, tal como descrito no presente.

Ácidos nucléicos que possuem a seqüência de codificação da proteína podem ser obtidos através da seleção de bibliotecas genômicas ou de cDNA selecionados utilizando a seqüência de aminoácido deduzida, descrita no presente para a primeira etapa, e, se necessário, utilizando procedimentos convencionais de extensão por primers, como descrito em em Sambrook et ai, supra, para detectar e processar precursores e intermediários do mRNA que possam não terem sido transcritos de forma reversa em cDNA.

2. Seleção ε Transformação de Células Hospedeiras

As células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com vetores de expressão ou clonagem descritos no presente para produção do polipeptídeo WISP-1 e cultivadas em meio nutriente convencional modificado de forma a estar apropriado para a indução de promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas. As condições de cultura, tais como o meio, temperatura, pH e similares, podem ser selecionadas pelo técnico hábil no assunto sem experimentação indevida. Em geral, princípios, protocolos e técnicas práticas para maximizar a produtividade de culturas celulares podem ser encontrados em Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler1 ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et ai, supra.

Os métodos de transfecção de células eucarióticas e transformação de células procarióticas são conhecidos pelos técnicos conhecedores do assunto, por exemplo, CaCh, CaPO4, mediado por Iipossomo e eletroporação. Dependendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é realizada através do uso de técnicas padrões apropriadas para tais células. O tratamento com cálcio que emprega o cloreto de cálcio, como descrito em Sambrook et al., supra, ou eletroporação, é geralmente utilizado para procariontes. Infecção com Agrobacterium tumefaciens é utilizada para transformação de determinadas células vegetais, como descrito por Shaw et al., Gene. 23:315 (1983) e pelo documento WO 89/05859 publicado em 29 de junho de 1989. Para células de mamíferos sem paredes celulares, o método de precipitação em fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Viroloqy. 52:456- 457 (1978) pode ser empregado. Aspectos gerais de sistemas de transfecções de células hospedeiras de mamíferos foram descritos na patente US 4.399.216. Transformações em leveduras são tipicamente realizadas de acordo com o método de Van Solingen et al., J. Bact.. 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA). 76:3829 (1979). Entretanto, outros métodos para a introdução de DNA em células, tal como por microinjeção nuclear, eletroporação, fusão de protoplasto bacteriano com células intactas, ou policátions, tal como polibreno e poliornitina, também podem ser utilizados. Para diversas técnicas de transformação de células de mamíferos, vide Keown et ai, Methods in Enzvmoloqv. 185:527-537 (1990) e Mansour et ai, Nature, 336:348-352 (1988).

Células hospedeiras apropriadas no presente para clonagem ou expressão de DNA em vetores incluem células eucarióticas superiores, procarióticas ou leveduras. Procariontes apropriados incluem, mas sem se limitar a: eubactérias, tais como organismos gram-negativos ou gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae como E. coli. Várias linhagens de E. coli são disponíveis publicamente, tais como linhagem MM294 de E. coli K12 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); linhagem W3110 de E. coli (ATCC 27.325) e K5 772 (ATCC 53.635). Outras células hospedeiras procarióticas apropriadas incluem Enterobacteriaceae tais como Escherichia, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, tal como, Salmonella typhimurium, Serratia, como, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli como B. subtilis e B. Iicheniformis (por exemplo, B. Iicheniformis 41P descrita no DD 266.710 publicada em 12 de Abril de 1989); Pseudomonas como P. aeruginosa, e Streptomyces. Ditos exemplos são apenas ilustrativos, e não Iimitativos da presente invenção. A linhagem W3110 pode, por exemplo, ser modificada para causar uma mutação gênica nos genes que codificam proteínas endógenas para o hospedeiro, sendo que exemplos de ditos hospedeiros incluem linhagem 1A2 de E. coli W3110, que possui o genótipo tonA completo; linhagem 9E4 de E. coli W3110, que possui o genótipo tonA ptr3 completo; linhagem 27C7 de E. coli W3110 (ATCC 55.244), que possui o genótipo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac169 degP ompT karí completo; linhagem 37D6 de E. coli W3110, que possui o genótipo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 HvG karí completo; linhagem 40B4 de E. coli W3110, que e linhagem 37D6 com uma mutação de deleção degP não- resistente a canamicina; e uma linhagem de E. coli que possui protease periplasmática mutante descrita na patente US 4.946.783 emitida em 7 de agosto de 1990. Alternativamente, métodos de clonagem in vitro, tal como, PCR ou outras reações polimerases de ácido nucléico, são apropriados.

Além de procariontes, micróbios eucariontes tais como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de expressão ou clonagem apropriados para vetores que codificam polipeptídeo WISP-1. Saccharomyces eerevisiae é um microorganismo hospedeiro eucarionte inferior comumente utilizado. Outros microorganismos incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Nature. 290: 140 [1981]; EP 139.383 publicada em 2 de maio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (patente U.S. 4.943.529; Fleer et aí., Bio/Technoloqy. 9:968-975 (1991)) tal como, por exemplo, K. Iaetis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et ai, J. Bacteriol., 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgarieus (ATCC 16.045), K. wiekeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et ai, Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Piehia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et ai, J. Basic Microbiol.. 28:265-278 [1988]); Candida; Triehoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 76:5259-5263 [1979]); Schwanniomyees tal como Schwanniomyees oeeidentalis (EP 394.538 publicada em 31 de Outubro de 1990); e fungos filamentosos tais como, por exemplo, Neurospora, Penieillium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicado em 10 de janeiro de 1991), e hospedeiros Aspergillus, tais como, A. nidulans (Ballance et ai, Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 112:284-289 [1983]; Tilburn et ai, Gene. 26:205-221 [1983]; Yelton et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 81: 1470-1474 [1984]) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J.. 4:475-479 [1985]). Leveduras metilotróficas são apropriadas no presente e incluem, sem se limitar a, levedura capaz de crescer em metanol selecionada a partir dos gêneros: Hansenula, Candida, Kloeekera, Piehia, Saccharomyees, Torulopsis, e Rhodotorula. Um lista de espécies específicas que exemplificam esta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Anthony, The Biochemistry of Methvlotrophs, 269 (1982).

Células hospedeiras apropriadas para a expressão do polipeptídeo WISP-1 glicosilados são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células invertebradas incluem células de insetos tais como Drosophila S2 e Spodoptera Sf9, bem como células vegetais, tais como culturas celulares de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco. Foram identificadas numerosas linhagens baculovirais e variantes e células hospedeiras de insetos permissivas correspondentes de hospedeiros como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta), e Bombyx mori. Uma série de linhagens virais para transfecção estão disponíveis publicamente, tais como, a variante L-1 de Autographa califomica NPV e a linhagem Bm-5 de Bombyx mori NPV1 e ditos vírus podem ser utilizados como o vírus do presente de acordo com a presente invenção, em particular para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

Entretanto, há maior interesse em células de vertebrados, e propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecido) se tornou um procedimento rotineiro. Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são; linhagem CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em suspensão de cultura, Graham et ai, J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de hamster filhotes (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather1 Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macacos (CV1 ATCC CCL 70); células de rim do macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA1 ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células do fígado de ratos do tipo buffalo (buffalo rat Iiver cells) (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et ai, Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou por clonagem como acima descrito para a produção do polipeptídeo WISP-1 e cultivadas em meio nutriente convencional modificado de forma a ser apropriado para a indução dos promotores, seleção de transformantes ou amplificação dos genes que codificam as seqüências desejadas.

3. Seleção E Uso de um Vetor Replicável

O ácido nucléico (tal como, cDNA ou DNA genômico) que codifica o polipeptídeo WISP-1 pode ser inserido em um vetor replicável para clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. Vários vetores estão publicamente disponíveis. O vetor pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídeo, cosmídeo, partícula viral ou fago. A seqüência de ácido nucléico apropriada pode ser inserida no vetor através de uma série de procedimentos. Em geral, o DNA é inserido em sítio(s) de endonuclease de restrição apropriado pelo uso de técnicas conhecidas. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não se limitam a, uma ou mais seqüências sinais, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento amplificador, um promotor e uma seqüência de finalização de transcrição. A construção de vetores apropriados que contém um ou mais dos componentes ditos emprega técnicas padrões de ligação que são conhecidas pelo técnico no hábil no assunto.

O WISP-1 pode ser produzido de forma recombinante não apenas diretamente, mas também como uma fusão de polipeptídeo com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma seqüência sinal ou outro polipeptídeo que possui um sítio de clivagem específico no N-terminal da proteína ou um polipeptídeo maduro. Em geral, a seqüência sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma parte do DNA que codifica o polipeptídeo WISP-1 que é inserido no vetor. A seqüência sinal pode ser uma seqüência sinal procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou líderes de enterotoxina II estáveis ao calor. Para a secreção em levedura a seqüência sinal pode ser, por exemplo, líder invertase de levedura, fator α líder (incluindo fator α líderes de Saccharomyces e Kluyveromyces, descrito na patente U.S. 5.010.182), ou fosfatase ácida líder, a glucomilase líder de C. albicans (EP 362.179 publicada em 4 de Abril de 1990), ou o sinal descrito no documento WO 90/13646 publicada em 15 de Novembro de 1990. Em expressão celular de mamíferos, as seqüências sinais de mamíferos podem ser utilizadas para secreção direta da proteína, tais como seqüências sinais de polipeptídeos secretados da mesma espécie, ou espécies relacionadas, bem como líderes de secreção viral.

Tanto os vetores de clonagem quanto os vetores de expressão contém uma seqüência de ácido nucléico que permite a replicação do vetor em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Tais seqüências são bem conhecidas para uma série de bactérias, leveduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é apropriada para a maior parte das bactérias gram-negativas, a origem do plasmídeo 2μ é apropriada para levedura, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos.

Os vetores de clonagem e expressão irão conter, tipicamente, um gene de seleção, também denominado como marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, tal como ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes essenciais não disponíveis a partir do meio complexo, tal como, o gene que codifica D-alanina racemase para Bacilli.

Exemplos de marcadores de seleção apropriados para células de mamíferos são aqueles que permitem a identificação de células competentes que adiquerem o ácido nucléico que codifica o polipeptídeo WISP-1, tal como DHFR ou timidina quinase. Uma célula hospedeira apropriada quando é utilizado o DHFR do tipo selvagem é a linhagem de células CHO deficiente na atividade de DHFR, preparada e propagada como descrito por Urlaub et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980). Um gene de seleção apropriado para uso em leveduras é o gene trpl presente no plasmídeo YRp7 de levedura [Stinchcomb et ai, Nature, 282:39 (1979); Kingsman et ai, Gene, 7:141 (1979); Tschemper et ai, Gene, 10:157 (1980)]. O gene trpl fornece um marcador de seleção para uma linhagem mutante de levedura que não apresenta a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4- 1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

Vetores de expressão e clonagem normalmente apresentam um promotor operacionalmente ligado à seqüência de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo WISP-1 de forma a direcionar a síntese de mRNA. Promotores reconhecidos por uma série de células hospedeiras potenciais são conhecidos. Os promotores apropriados para uso com hospedeiros procarióticos incluem os sistemas promotores de β-lactamase e Iactose [Chang et ai, Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al, Nature. 281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor de triptofano (frp) [Goeddel, Nucleic Acids Res.. 8:4057 (1980); EP 36.776], e promotores híbridos tais como o promotor tac [deBoer et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 80:21-25 (1983)]. Promotores para uso em sistemas bacterianos também apresentarão uma seqüência Shine-Dalgarno (S.D.) operacionalmente ligada ao DNA que codifica o polipeptídeo WISP.

Exemplos de seqüências promotoras apropriadas para uso em hospedeiros de leveduras incluem os promotores para 3-fosfoglicerato quinase [Hitzeman et ai, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess et ai, J. Adv. Enzvme Req.. 7:149 (1968); Holland1 Biochemistry, 17:4900 (1978)], tal como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato decarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase, e glicoquinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores inducíveis que possuem a vantagem adicional de transcrição controlada através de condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativas associadas com metabolismo de nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Vetores e promotores apropriados para uso em expressão de levedura são descritos adicionalmente na patente EP 73.657.

A transcrição do polipeptídeo WISP a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir de genomas de vírus tais como polioma vírus, fowlpox vírus (UK 2.211.504 publicada em 5 de Julho de 1989), adenovírus (tal como Adenovírus 2), papilloma vírus bovino, sarcoma vírus de aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite B e Vírus 40 de símios (SV40), através de promotores mamíferos heterólogos, tais como, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, e a partir de promotores de choque térmico (heat- shock), contanto que os ditos promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras. A transcrição de um DNA que codifica o polipeptídeo WISP-1 por eucariotos superiores pode ser aumentada através da inserção de uma seqüência enhancer no vetor. Amplificadores são elementos de atuação eis do DNA, usualmente de cerca de 10 a 300 bp, que agem sobre o promotor para aumentar sua transcrição. Muitas seqüências enhancers são conhecidas a partir de genes de mamíferos (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína, e insulina). Tipicamente, entretanto, pode-se utilizar um enhancer de um vírus de célula eucariótica. Exemplos incluem o enhancer SV40 sobre o lado posterior (late side) da origem de replicação (bp 100-270), o enhancer anterior ao promotor do citomegalovírus, o enhancer de polioma sobre o lado posterior da origem de replicação, e enhancers de adenovírus. O enhancer pode sofrer splicing no vetor, na posição 5' ou 3' para a seqüência de codificação do polipeptídeo WISP-1, no entanto, está preferencialmente localizado em um sítio 5' do promotor.

Vetores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (levedura, fungo, inseto, células vegetais, animais, humanas, ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) irão apresentar, adicionalmente, seqüências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do mRNA. Tais seqüências são comumente disponíveis a partir da extremidade 5', ocasionalmente 3', regiões não-traduzidas de DNAs ou cDNAs virais ou eucarióticos. Ditas regiões contém segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não- traduzida do mRNA que codifica o anticorpo ou polipeptídeo.

Outros métodos, vetores, e células hospedeira apropriadas para a adaptação à síntese de anticorpo ou polipeptídeo na cultura de células de vertebrados recombinante estão descritos em Gething et ai, Nature. 293:620- 625 (1981); Mantei et ai, Nature. 281:40-46 (1979); patente EP 117.060; e patente EP 117.058. 4. Cultura de Células Hospedeiras

As células hospedeiras utilizadas para a produção do polipeptídeo WISP da presente invenção podem ser cultivadas em uma série de meios. Meios comercialmente disponíveis tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM)1 (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio Eagle Modificado da Dulbecco ((DMEM), Sigma) são apropriados para a cultura de células hospedeiras. Além disso, qualquer meio descrito em Ham et ai, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et ai, Anal. Biochem. 102:255 (1980), patentes US 4.767.704; US 4.657.866; US 4.927.762; US 4.560.655; ou US 5.122.469; documento WO 90/03430; documento WO 87/00195; ou patente US Re. 30.985 pode ser utilizado como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer dos ditos meios podem ser suplementados conforme necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tal como insulina, transferina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tal como cloreto de sódio, cálcio, magnésio e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como a droga GENTAMYCIN™), elementos traços (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário pode também ser incluído em concentrações apropriadas que serão conhecidas pelos técnicos conhecedores do assunto. A condições de cultura, tais como temperatura, pH, e similares, são aquelas anteriormente utilizadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para os técnicos conhecedores do assunto.

5. Detecção da Amplificação / Expressão Gênica

A amplificação e/ou expressão gênica pode ser mensurada diretamente em uma amostra, por exemplo, através de Southern blotting convencional, Northern blotting para quantificar a transcrição de mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blotting (análise de DNA), ou hibridização in situ, utilizando uma sonda marcada de forma apropriada, com base nas seqüências fornecidas no presente. Alternativamente, anticorpos que possam reconhecer duplexos específicos, incluindo duplexos de DNA, duplexos de RNA, duplexos híbridos de DNA-RNA ou duplexos DNA-proteína podem ser empregados. Os anticorpos podem ser marcados e o ensaio pode ser realizado onde o duplexo se liga à superfície, de forma que pela formação do duplexo na superfície, a presença do anticorpo ligado ao duplexo pode ser detectado.

A expressão gênica, alternativamente, pode ser mensurada através de métodos imunológicos, tais como coloração por imuno-histoquímica de células ou secções de tecidos e ensaio de cultura celular ou fluídos corporais, para quantificar diretamente a expressão do produto gênico. Anticorpos úteis para a coloração de imuno-histoquímica e/ou ensaio de amostras de fluídos podem ser tanto monoclonais quanto policlonais, e podem ser preparados em qualquer mamífero. De forma conveniente, os anticorpos podem ser preparados contra um polipeptídeo de seqüência nativa ou contra um peptídeo sintético com base na seqüência de DNA fornecida no presente ou contra uma seqüência exógena fundida ao DNA do polipeptídeo e que codifica um epítopo de anticorpo específico.

6. Purificação do Polipeptídeo WISP Formas de polipeptídeo WISP podem ser recuperadas a partir do meio de cultura ou de Iisados de células hospedeiras. Se o polipeptídeo WISP estiver ligado à membrana, ele pode ser liberado da membrana utilizando uma solução detergente apropriada (tal como Triton-X 100) ou através da clivagem enzimática. As células empregadas na expressão do polipeptídeo WISP-1 podem ser rompidas por vários meios químicos e físicos, tais como ciclagem a frio (freeze-thaw cycling), sonicação, ruptura mecânica ou agentes de Iise celular.

Pode-se desejar purificar o polipeptídeo WISP-1 a partir de proteínas ou polipeptídeos de células recombinantes. Os procedimentos a seguir são exemplos de procedimentos de purificação apropriados: através de fracionamento em uma coluna de troca iônica; precipitação em etanol, HPLC de fase reversa; cromatografia em sílica ou em uma resina de troca catiônica tal como DEAE; cromatofocusação; SDS-PAGE; precipitação em sulfato de amônio; gel filtração utilizando, por exemplo, Sephadex G-75; colunas de proteína A Sepharose para remover contaminantes tais como IgG; e colunas de quelação de metais para ligar formas marcadas de epítopos do anticorpo ou polipeptídeo. Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e tais métodos são de técnicas conhecidas e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzvmologv. 182 (1990); Scopes1 Protein Purification: Principies and Practice. Springer-Verlag1 New York (1982). A etapa(s) de purificação selecionada dependerá, por exemplo, da natureza do processo de produção utilizado e do anticorpo ou polipeptídeo específico produzido.

Formas solúveis de WISP-1 podem ser empregados como antagonistas nos métodos da presente invenção. Tais formas solúveis de WISP-1 podem compreender modificações, como descritas abaixo (como pela fusão a uma imunoglobulina, a um epítopo marcado ou ziper de leucina). As moléculas de imunoadesina são adicionalmente contempladas para o uso nos métodos do presente. As imunoadesinas WISP-1 podem compreender várias formas de WISP-1, tal como o polipeptídeo de cadeia total bem como formas solúveis da fusão de polipeptídeos WISP-1 ou fragmento deste. Em um exemplo de realização específica, a molécula pode compreender uma fusão do polipeptídeo WISP-1 com uma imunoglobulina ou uma região específica de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente de imunoadesina, tal fusão podia ser à região de Fc de uma molécula de IgG. As fusões de Ig incluem preferivelmente a substituição (domínio transmembrana suprimido ou inativado) de uma forma solúvel do polipeptídeo no lugar de uma região variável dentro de uma molécula de lg. Em um exemplo de realização específica a incorporação preferida, a fusão da imunoglobulina inclui as regiões de articulação, CH2 e CH3, ou CH1, CH2 e CH3 de uma molécula lgG1. Para a produção de fusões de imunoglobulina, vide também a patente US 5.428.130 concedida em 27 de junho de 1995 e Chamow et ai, TIBTECH, 14:52-60 (1996).

O projeto o mais simples e o mais direto de imunoadesina combina os domínios de ligação de adesina (por exemplo, o WISP-1) com a região Fc de uma cadeia pesada de imunoglobulina. Ordinariamente, ao preparar as imunoadesinas da presente invenção, o ácido nucléico que codifica o domínio de ligação da adesina será C-terminal fundido ao ácido nucléico que codifica o N-terminal de uma seqüência do domínio constante da imunoglobulina, porém as fusões do N-terminal também são possíveis.

Tipicamente, em tais fusões o polipeptídeo quimérico codificado reterá pelo menos a região de articulação funcionalmente ativa, os domínios Ch2 e Ch3 da região constante de uma cadeia pesada de imunoglobulina. As fusões são feitas também no C-terminal da fração Fc de um domínio constante, ou imediatamente no N-terminal ao Ch1 da cadeia pesada ou à região correspondente da cadeia leve. O local preciso em que a fusão é feita não é crítico; os locais específicos são bem conhecidos e podem ser selecionados a fim otimizar a atividade biológica, a secreção ou as características de ligação da imunoadesina.

Em um exemplo de realização preferido, a seqüência do adesina é fundida ao N-terminal da região Fc da imunoglobulina G1 (lgG1). É possível fundir a região constante da cadeia pesada inteira à seqüência da adesina. Entretanto, mais preferivelmente, uma seqüência que começa na região de articulação apenas a montante do local de clivagem da papaína que define quimicamente a Fc IgG (isto é, resíduo 216, ligado ao primeiro resíduo da região constante da cadeia pesada para ser 114), ou locais análogos de outras imunoglobulinas são usados na fusão. Em uma realização particular da presente invenção, a seqüência de aminoácido da adesina é fundida (a) a região de articulação e o CH2 e o Ch3 ou (b) o Ch1, região de articulação, domínios CH2 e Ch3, de uma corrente pesada de IgG.

Para imunoadesinas biespecíficas, as imunoadesinas são montadas como múltimeros, e particularmente como heterodímeros ou heterotetrâmeros. Geralmente, estas imunoglobulinas montadas terão unidades de estruturas conhecidas. Uma unidade estrutural básica de quatro cadeias é a forma em que IgG, IgD, e IgE existem. Uma unidade de quatro cadeias é repetida nas imunoglobulinas de peso molecular mais elevadas; IgM existe geralmente como um pentâmero de quatro unidades básicas unidas por ligações de bissulfeto. O globulina de IgA, e ocasionalmente o globulina IgG, podem também existir na forma multimérica no soro. No exemplo do multímero, cada uma das quatro unidades pode ser a mesma ou diferente.

Várias imunoadesinas montados exemplarmente dentro do escopo da presente invenção são diagramadas esquematicamente abaixo:

(a) ACl-ACl;

(b) ACh-(ACh, ACl-ACh, ACl-VhCh, or VlCl-ACh);

(c) ACl-ACh-(ACl-ACh, ACl-VhCh1 VlCl-ACh, or VlCl-VhCh);

(d) ACl-VhCh-(ACh, or ACl-VhCh, or VlCl-ACh);

(e) VlCl-ACh-(ACl-VhCh, or VlCl-ACh); and

(f) (A-Y)11-(VlCl-VhCh)2,

onde, cada A representa seqüências idênticas ou diferentes do aminoácido da adesina; Vl é um domínio variável da cadeia leve da imunoglobulina;

Vh é um domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina;

Cl é um domínio constante da cadeia leve da imunoglobulina;

Ch é um domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina;

η é um inteiro mais extremamente 1;

Y designa o resíduo de um agente de reticulação covalente;

Nos interesses do presente, as estruturas antecedentes mostram somente as características chaves; não indicam ligação (J) ou outros domínios de imunoglobulinas, nem são as ligações de bissulfeto mostradas. Entretanto, onde tais domínios são requeridos para atividade de ligação, serão construídos para estarem presentes nas posições ordinárias que ocupam nas moléculas de imunoglobulina.

Alternativamente, as seqüências da adesina podem ser introduzidas entre a cadeia pesada da imunoglobulina e as seqüências da cadeia leve, de modo que uma imunoglobulina que compreende uma cadeia pesada quimérica é obtida. Nesta incorporação, as seqüências da adesina são fundidas na extremidade 3' de uma cadeia pesada da imunoglobulina em cada braço de uma imunoglobulina, entre a região de articulação e o domínio CH2, ou entre os domínios Ch2 e Ch3. Construções similares foram relatadas por Hoogenboom etal., Mol. Immunol., 28:1027-1037 (1991).

Embora a presença de uma cadeia leve da imunoglobulina não fosse necessária nas imunoadesinas da presente invenção, uma cadeia leve de imunoglobulina pode estar presente associada covalentemente a um polipeptídeo da cadeia pesada da fusão adesina-imunoglobulina, ou diretamente fundida a adesina. No caso anterior, o DNA que codifica a cadeia leve da imunoglobulina é tipicamente co-expresso com o DNA que codifica a proteína de cadeia pesada da fusão adesina-imunoglobulina. Sobre a secreção, a cadeia pesada hibrída e a cadeia leve serão covalentemente associadas para fornecer uma estrutura parecida com imunoglobulina que compreende de duas cadeias pesadas de imunoglobulina ligadas por pontes de bissulfeto. Os métodos apropriados para a preparação de tais estruturas são divulgados, por exemplo, na patente US 4.816.567 emitida em 28 de março de 1989. Imunoadesinas são mais convenientemente construídas pela fusão das seqüência de cDNA que codificam o in-frame da parcela da adesina a uma seqüência do cDNA da imunoglobulina. Entretanto, a fusão aos fragmentos genômicos d a imunoglobulina pode também ser usada (vide, por exemplo Aruffo et ai, ÇeN, 61:1303-1313 (1990); e Stamenkovic et a/., ÇeN. 66:1133- 1144 (1991)). O último tipo de fusão requer a presença de seqüências regulatórias de Ig para a expressão. Os cDNAs que codificam as regiões constantes da cadeia pesada de IgG podem ser isoladas baseadas em seqüências publicadas das bibliotecas do cDNA derivadas do baço ou dos linfócitos do sangue periféricos, por hibridização ou pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). Os cDNAs que codificam a "adesina" e as peças de imunoglobulina da imunoadesina são introduzidos no tandem em um vetor de plasmídeo que direciona a expressão eficiente nas células hospedeiras escolhidas.

Em outra realização da presente invenção, o WISP-1 ou antagonista de WISP-1 pode ser modificado ligando covalentemente o polipeptídeo do receptor a uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG), polipropileno glicol, ou polioxialquilenos, de maneira determinada nas patentes US 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ou 4.179.337, ou outras moléculas parecidas, tais como, o poliglutamato. Tais formas peglicadas podem ser preparadas usando técnicas conhecidas.

As formas de zíper de Leucina destas moléculas são também contempladas pela presente invenção. "Zíper de leucina" é um termo usado na técnica para se referir a uma seqüência rica em Ieucina que realce, promova, ou dirija a dimerização ou trimerização de seu sócio na fusão (por exemplo, a seqüência ou molécula ao qual o zíper de Ieucina é fundido ou ligado). Vários polipeptídeos do zíper de Ieucina foram descritos no estado da técnica. Vide, por exemplo, Landschulz et al. Science. 240:1759 (1988); Patente US 5.716.805; documento WO 94/10308; Hoppe et al., FEBS Letters. 344:1991 (1994); Maniatis et al., Nature. 341:24 (1989). Aqueles hábeis na técnica apreciarão que uma seqüência de zíper de Ieucina pode ser fundida na extremidade 5' ou 3' da molécula do WISP-1 ou do antagonista de WISP-1.

Os polipeptídeos WISP-1 da presente invenção podem também ser modificados de maneira a formar moléculas quiméricas pela fusão do polipeptídeo a um outro polipeptídeo heterólogo ou seqüência de aminoácido. Preferivelmente, tal polipeptídeo ou seqüência heteróloga de aminoácido é aquela que age oligomerizando a molécula quimérica. Em uma realização da presente invenção, tal molécula quimérica compreende uma fusão do polipeptídeo WISP-1 com um polipeptídeo marcado que fornece um epítopo ao qual um anticorpo anti-polipeptídeo marcado possa se ligar seletivamente. O epítopo marcado é geralmente colocado no carbóxi ou amino-terminal do polipeptídeo. A presença de tais formas de epítopo-marcado do polipeptídeo pode ser detectada utilizando um anticorpo contra o polipeptídeo marcado. Também, a provisão do epítopo marcado permite o polipeptídeo ser prontamente purificado pela purificação por afinidade usando um anticorpo anti- epítopo marcado ou outro tipo de matriz da afinidade que se liga ao epítopo marcado. Os vários polipeptídeos marcados e seus respectivos anticorpos são bem conhecidos no estado da técnica. Exemplos que incluem marcadores poli- histidina (poli-his) ou poli-histidina-glicina (poli-his-gly); o polipeptídeo marcado HA do flu e seu anticorpo 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol.. 8:2159-2165 (1988)]; os marcadores c-myc e seus anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9Ε10 [Evan et al., Molecular and Cellular Bioloqy. 5:3610-3616 (1985)]; e o marcador da glicoproteína (gD) do Herpes vírus simples e seus anticorpos [Paborsky et al., Protein Engineerinq. 3(6):547-553 (1990)]. Outros polipeptídeos marcados incluem o peptídeo Flag [Hopp et al., BioTechnoIogy, 6:1204-1210 (1988)]; o peptídeo do epítopo KT3 [Martin et al., Science. 255:192-194 (1992)]; um peptídeo do epítopo -tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; e o peptídeo marcado da proteína T7 gene 10 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87:6393-6397 (1990)].

Contempla-se que os anticorpos anti-WISP-1 podem também ser empregados nos métodos divulgados no presente. Exemplos de tais moléculas incluem anticorpos que neutralizam ou bloqueiam que podem reduzir o crescimento, a metástase ou a motilidade da célula de câncer. O anti-WISP-1 pode ser um anticorpo monoclonal.

Os anticorpos monoclonais podem ser fabricados, por exemplo, utilizando o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975). No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster, é imunizado com um agente imunizante para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente os linfócitos podem ser imunizados in vitro.

O agente imunizante incluirá tipicamente um polipeptídeo WISP-1 ou uma proteína de fusão deste, como uma proteína de fusão WISP-1-lgG.

Geralmente, outros linfócitos periféricos do sangue ("PBLs") são usados se as células de desejadas forem de origem humana, ou células do baço ou Iinfonodos são utilizadas se forem desejadas células de mamíferos não humanos. Os linfócitos são fundidos em seguida com uma linhagem de células imortalizada, utilizando um agente de fusão apropriado, tal como o polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, págs. 59 a 103 (Academic Press, 1986)). Linhagens de células imortalizadas são geralmente células de mamíferos transformadas, particularmente células de mielomas de roedores, bovinos e de origem humana. Geralmente, são utilizadas linhagens celulares de mieloma de ratos e camundongos. As células de hibridoma podem ser cultivadas em um meio de cultura apropriado que contém, preferencialmente, uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células imortalizadas não-fundidas. Por exemplo, se as células parentais não contenham a enzima hipoxantina-guanina-fosforribosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência em HGPRT.

Células imortalizadas preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, apoiam a produção estável em alto nível de anticorpos pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. As linhagens de células imortalizadas mais preferidas são linhagens de mieloma murino que podem ser obtidas no caso pela Salk Institute Celi Distribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia. Mieloma humano e heteromieloma humano/camundongo também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); e Brodeur et ai, Monoclonal Antibodv Production Technigues and Applications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Estados Unidos, 1987)].

O meio de cultura em que são cultivadas células de hibridoma é testado para determinar a produção de anticorpos monoclonais voltados ao WISP-1. Preferencialmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada através de imunoprecipitação ou de um ensaio de ligação in vitro, tais como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoenzimático (ELISA). Tais técnicas e ensaios são conhecidas no estado da técnica. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinada, por exemplo, através da análise de Scatchard descrita em Munson et ai, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).

Após a identificação de células de hibridoma que produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas, os clones podem ser sub-clonados através da limitação de procedimentos de diluição e cultivados através de métodos padrão [Goding, supra1. Meios de cultura apropriados para este propósito incluem, por exemplo, meio de Dulbeceo Modified EagIe1S (D-MEM) ou RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo na forma de tumores de ascite em mamíferos.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados do meio de cultura, liquido ascítico por meio de procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulina, tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade.

Os anticorpos monoclonais podem também ser feitos por métodos de DNA recombinante, tais como aqueles descritos na patente US 4.816.567.

O DNA codificador dos anticorpos monoclonais da presente invenção é facilmente isolado e seqüenciado utilizando procedimentos convencionais (utilizando, por exemplo, sondas de oligonucleotídeos que sejam capazes de se ligar, especificamente, a genes codificadores das cadeias pesada e leve de anticorpos monoclonais). As células de hibridoma servem de fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida para células hospedeiras, tais como células de E. coli, células COS de símios, células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína de imunoglobulina para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA pode também ser modificado, por exemplo, pela substituição das seqüências humanas do domínio constante das cadeias leve e pesada pelas seqüências murinas homólogas, Morrison, et ai, Proc. Nat. Acad. Sei. 81. 6851 (1984), ou por meio de ligação covalente da seqüência codificadora de imunoglobulina, no todo ou em parte, com a seqüência codificadora para um polipeptídeo não-imunoglobulina.

Tipicamente, tais polipeptídeos que não são imunoglobulina são substituídos pelos domínios constantes de um anticorpo da presente invenção ou são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígeno de um anticorpo da presente invenção para criar um anticorpo bivalente quimérico compreendendo um local combinando ao antígeno que têm a especificidade para WISP-1 e um outro local combinando ao antígeno que tem a especificidade para um antígeno diferente.

Anticorpos quiméricos ou híbridos podem também ser preparados in vitro, utilizando métodos conhecidos na química de proteínas sintéticas, incluindo aqueles que envolvem agentes reticulantes. Imunotoxinas, por exemplo, podem ser construídas utilizando uma reação de troca de dissulfeto ou através da formação de ligação tioéter. Exemplos de reagentes apropriados para este propósito incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato.

Fragmentos Fv de cadeia simples podem também ser produzidos, tal como descrito em Iliades et ai, FEBS Letters. 409: 437-441 (1997). O acoplamento desses fragmentos de cadeia simples utilizando vários Iigantes é descrito em Kortt et al., Protein Enqineerinq. 10: 423-433 (1997). Uma variedade de técnicas para a produção e manipulação de anticorpos recombinantes são bem conhecidas no estado da arte. Exemplos ilustrativos de tais técnicas que são tipicamente utilizadas pelos técnicos hábeis no assunto estão descritas com mais detalhes abaixo. (I) Anticorpos Humanizados

Geralmente, um anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte não-humana. Esses resíduos de aminoácidos não-humanos são muitas vezes denominados resíduos "importados", que são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et ai, Nature. 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et ai, Science, 239: 1534-1536 (1988)), através da substituição de seqüências CDR ou CDRs de roedores pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano.

Conseqüentemente, esses anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto tenha sido substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não-humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos, em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

É importante que os anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, os anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das seqüências parentais e diversos produtos humanizados conceituais, utilizando modelos tridimensionais das seqüências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensionais são comumente disponíveis e familiares para os técnicos no assunto. São disponíveis programas de computador que ilustram e exibem prováveis estruturas de conformação tridimensional de seqüências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção dessas exibições permite a análise do papel provável dos resíduos no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, ou seja, a análise dos resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata ligar seu antígeno. Desta forma, os resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das seqüências importada e de consenso, de forma que seja atingida a característica desejada do anticorpo, tal como maior afinidade para o(s) antígeno(s) alvo(s). Geralmente, os resíduos de CDR são direta e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação de antígenos.

(li) Anticorpos Humanos Os anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados através do método de hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano/de camundongos para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), e Brodeur et al., Monoclonal Antibodv Production Technigues and Applications, págs. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque, Estados Unidos, 1987).

É agora possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Descreveu-se, por exemplo, que a deleção homozigótica do gene da região de ligação de cadeia pesada de anticorpos (Jh) em camundongos quiméricos e mutantes de linhagem germinativa resulta na inibição completa da produção de anticorpos endógenos. A transferência do conjunto de genes de imunoglobulina da linhagem germinativa humana nesses camundongos com mutação da linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos mediante desafio de antígenos. Vide, por exemplo, Jakobovits et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 90, 2551-255 (1993); Jakobovits et ai, Nature, 362: 255-258 (1993).

Mendez et ai, (Nature Genetics 15: 146-156 (1997)) ampliaram adicionalmente a tecnologia e geraram uma linhagem de camundongos transgênicos denominada "Xenocamundongo II" que, quando desafiada com um antígeno, gera anticorpos totalmente humanos de alta afinidade. Isso foi atingido pela integração em linhagem germinativa de Ioci de cadeia leve e cadeia pesada humana megabase em camundongos com deleção em segmento Jh endógeno, conforme descrito acima. O Xenocamundongo Il abriga 1020 kb de Iocus de cadeia pesada humana que contém cerca de 66 genes Vh, regiões Dh e Jh completas e 3 regiões constantes diferentes (μ, δ e χ) e também abriga 800 kb de Iocus κ humano que contém 32 genes Vk1 segmentos Jk e genes Ck. Os anticorpos produzidos nesses camundongos relembram de perto os observados em humanos em todos os aspectos, incluindo o rearranjo gênico, montagem e repertório. Os anticorpos humanos são preferencialmente expressos sobre anticorpos endógenos, devido à deleção no segmento Jh endógeno que evita o rearranjo gênico no locus murino.

Alternativamente, a tecnologia de exibição de fagos (McCafferty et al, Nature 348, 552-553 (1990)) pode ser utilizada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não-imunizados. De acordo com esta técnica, os genes de domínio V de anticorpos são clonados em quadro em um gene de proteína de revestimento maior ou menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos na forma de fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita simples do genoma de fago, seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe essas propriedades. Desta forma, o fago imita algumas das propriedades da célula B. A exibição de fagos pode ser realizada em uma série de formatos; para sua análise, vide, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571 (1993). Várias fontes de segmentos de gene V podem ser utilizadas para exibição de fagos. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991), isolaram um conjunto diverso de anticorpos anti- oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados dos baços de camundongos imunizados. Pode ser construído um repertório de genes V de doadores humanos não-imunizados e, anticorpos para um conjunto diverso de antígenos (incluindo autoantígenos) pode ser isolado, seguindo-se essencialmente as técnicas descritas por Marks et ai, J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBQ J. 12, 725-734 (1993). Em uma resposta imunológica natural, os genes de anticorpos acumulam mutações em alta velocidade (hipermutação somática). Algumas das mudanças introduzidas conferirão afinidade mais alta e as células B que exibem imunoglobulina de superfície de alta afinidade são preferencialmente replicadas e diferenciadas durante desafio de antígeno subseqüente. Este processo natural pode ser imitado através do emprego da técnica conhecida como "alteração de cadeias" (Marks et ai, Bio/Technol. 10, 779-783 (1992)). Neste método, a afinidade de anticorpos humanos "primários" obtidos através de exibição de fago pode ser aprimorada através da substituição seqüencial dos genes da região V de cadeia leve e pesada com repertórios de variantes de ocorrência natural (repertórios) de genes de domínio V obtidos a partir de doadores não-imunizados. Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidades na faixa nM. Uma estratégia de elaboração de repertórios de anticorpos de fagos muito grandes (também conhecida como "a mãe de todas as bibliotecas") foi descrita por Waterhouse et ai, Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993). A alteração de genes pode também ser utilizada para derivar anticorpos humanos de anticorpos de roedores, em que o anticorpo humano possui afinidades e especificidades similares ao anticorpo de roedor inicial. De acordo com este método, que também é denominado "impressão de epítopos", o gene de domínio V de cadeia leve ou pesada de anticorpos de roedores obtido através da técnica de exibição de fagos é substituído com um repertório de genes de domínio V humanos, criando quimeras de roedores-humanos. A seleção sobre antígeno resulta no isolamento de variável humana capaz de restaurar um sítio de ligação de antígenos funcional, ou seja, o epítopo governa (imprime) a escolha do parceiro. Quando o processo for repetido, a fim de substituir o domínio V de roedor remanescente, é obtido um anticorpo humano (vide o pedido de patente PCT documento WO 93/06213, publicado em 1 de abril de 1993). Ao contrário da humanização tradicional de anticorpos de roedores através de enxerto de CDR, esta técnica fornece anticorpos completamente humanos, que não possuem resíduos de CDR ou estrutura com origem em roedores.

Como discutido abaixo, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem compreender opcionalmente anticorpos monoméricos e anticorpos diméricos, bem como formas multivalentes de anticorpos. Os técnicos no assunto podem construir esses dímeros ou formas multivalentes através de métodos conhecidos na técnica. Métodos de preparação de anticorpos monovalentes também são bem conhecidos na técnica. Um método envolve, por exemplo, a expressão recombinante de cadeia leve de imunoglobulina e cadeia pesada modificada. A cadeia pesada geralmente é truncada em qualquer ponto da região Fc1 de forma a evitar a reticulação da cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos com outro resíduo de aminoácido ou são deletados, de forma a evitar a reticulação.

(III) Anticorpos Biespecíficos

Os anticorpos biespecíficos são anticorpos monoclonais, preferencialmente humanos ou humanizados, que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. No caso atual, uma das especificidades de ligação é para o WISP-1. Por exemplo, o anticorpo biespecífico se liga especificamente ai WISP-1 ou variantes de WISP-1 e outro membro da família CNN (por exemplo, WISP-2, WISP-3, CTGF1 Cyr61, ou Nov) ou outras moléculas tal como, CD44 estão dentro do escopo da presente invenção.

Os métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias pesadas possuem especificidades diferentes [Milstein e Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)]. Devido à seleção aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que normalmente é realizada através de etapas de cromatografia de afinidade, é um tanto problemática e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são descritos no documento WO 93/08829 (publicado em 13 de maio de 1993) e em Traunecker et ai, EMBO 10, 3655-2659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente e, de maior preferência, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de antígeno e anticorpo) são fundidos à seqüências de domínios constantes de imunoglobulina. A fusão ocorre preferencialmente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões de articulação, CH2 e CH3. Prefere-se ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para ligação de cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados e são co-transfectados em um organismo hospedeiro apropriado. Isso proporciona grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos 3 fragmentos de polipeptídeos em realizações quando razões desiguais das três cadeias de polipeptídeos utilizadas na construção fornecem os rendimentos ideais. É possível, entretanto, inserir as seqüências de codificação para 2 ou todas as 3 cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em razões iguais resultar em altos rendimentos ou quando as razões não foram de significância específica. Em uma realização preferida da presente abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com uma primeira especificidade de ligação em um braço, e um par de cadeias leve e pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Descobriu-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de uma cadeia leve de imunoglobulina em apenas metade da molécula biespecífica fornece forma fácil de separação. Esta abordagem é descrita no documento WO 94/04690, publicado em 3 de março de 1994.

Para detalhes adicionais sobre a geração de anticorpos biespecíficos, vide, por exemplo, Suresh et ai, Methods in Enzymology, 121: 210 (1986).

(iv) Anticorpos Heteroconjugados

Os anticorpos heteroconjugados também se encontram dentro do escopo da presente invenção. Os anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos ligados covalentemente. Esses anticorpos foram propostos, por exemplo, para dirigir células do sistema imunológico a células indesejadas (Patente US 4.676.980) e para o tratamento de infecções por HIV (Documentos WO 91/00360 e WO 92/200373; e patente EP 03.089). Anticorpos heteroconjugados podem ser elaborados utilizando qualquer método de reticulação conveniente. Agentes reticulantes apropriados são bem conhecidos na técnica e são descritos na Patente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas reticulantes.

(v) Fragmentos de Anticorpo

Em certas realizações, o anticorpo anti-WISP-1 (incluindo anticorpos murinos, humanos e humanizados e variantes de anticorpos) é um fragmento de anticorpo. Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados através de digestão proteolítica de anticorpos intactos (vide, por exemplo, Morimoto et ai, J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-117 (1992) e Brennan et ai, Science 229: 81 (1985)). Entretanto, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab'-SH, por exemplo, podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et ai, Bio/Technoloqy 10: 163-167 (1992)). Em outra realização, o F(ab')2 é formado utilizando o zíper de Ieucina GCN4 para promover a montagem da molécula F(ab')2. De acordo com outra abordagem, fragmentos Fv1 Fab ou F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura de células hospedeiras recombinantes. Uma série de técnicas de produção de fragmentos de anticorpos será evidente para os técnicos no assunto. Pode-se realizar digestão, por exemplo, utilizando papaína. Exemplos de digestão de papaína encontram-se descritos no documento WO 94/29348, publicado em 22 de dezembro de 1994, e na Patente US 4.342.566. A digestão de anticorpos por papaína produz tipicamente 2 fragmentos de ligação de antígenos idênticos, denominados fragmentos Fab, cada qual com um único sítio de ligação de antígenos, e um fragmento Fc residual. O tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab')2 que contém 2 sítios de combinação de antígenos e ainda é capaz de reticular antígeno.

Os fragmentos Fab produzidos na digestão do anticorpo também contêm os domínios constantes da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no carbóxi-terminal do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo. Fab'-SH é a denominação do presente para Fab', em que o(s) resíduo(s) de cisteína dos domínios constantes contém um grupo tiol livre. Os fragmentos de anticorpo F(ab')2 foram originalmente produzidos na forma de pares de fragmentos Fab' que contêm cisteínas articuladas entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos também são conhecidos.

Os anticorpos são glicosilados em posições conservadas nas suas regiões constantes (Jefferis e Lund, Chem. Immunol. 65: 111-128 (1997); Wright e Morrison, TibTECH 15: 26-32 (1997)). As cadeias laterais de oligossacarídeos das imunoglobulinas afetam a função da proteína (Boyd et ai, Mol. Immunol. 32: 1311-1318 (1996); Wittwe e Howard, Biochem. 29: 4175- 4180 (1990)) e a interação intramolecular entre porções da glicoproteína que podem afetar a confirmação e apresentaram superfície tridimensional da glicoproteína (Hefferis e Lund, supra; Wyss e Wagner, Current Opin. Biotech. 7: 409-416 (1996)). Os oligossacarídeos podem também servir para dirigir uma dada glicoproteína a certas moléculas com base em estruturas de reconhecimento específicas. Relatou-se, por exemplo, que, em IgG agalactosilado, a fração de oligossacarídeo "sai" do espaço entre CH2 e os resíduos de N-acetilglicosamina terminais tornam-se disponíveis para se ligar à proteína de ligação da manose (Malhotra et al., Nature Med. 1: 237-243 (1995)). A remoção por glicopeptidase dos oligossacarídeos de CAMPATH-1H (anticorpo IgGI monoclonal murino humanizado recombinante que reconhece o antígeno CDw52 de linfócitos humanos) produzidos em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) resultou em uma redução completa em Iise mediada por complemento (CMCL) (Boyd et al., Mol. Immunol. 32: 1311-1318 (1996)), embora a remoção seletiva de resíduos de ácido siálico utilizando neuraminidase resultassem em ausência de perda de DMCL. Relatou-se que a glicosilação de anticorpos afeta a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). Particularmente, relatou-se que as células de CHO com expressão regulada por tetraciclina de P(1,4)-N-acetilglucosaminiltransferase Ill (GnTIII)1 formação catalisadora de gIicosiltransferase de GIcNAc em bisecção, possuem atividade ADCC aprimorada (Umana e al, Mature Biotech. 17: 176- 180 (1999)).

Variantes de glicosilação de anticorpos são variantes em que o padrão de glicosilação de um anticorpo é alterado. Alteração indica a deleção de uma ou mais unidades carboidrato encontradas no anticorpo, adição de uma ou mais unidades carboidrato ao anticorpo, alteração da composição de glicosilação (padrão de glicosilação), extensão da glicosilação, etc. Variantes de glicosilação podem ser preparadas, por exemplo, através da remoção, modificação e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação na seqüência do ácido nucléico que codifica o anticorpo.

A glicosilação de anticorpos é tipicamente N-Iigada ou O-ligada. N-ligada designa a ligação da unidade carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeos asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido, com exceção de prolina, são as seqüências de reconhecimento para a ligação enzimática da unidade carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Por esta razão, a presença de qualquer dessas seqüências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligada designa a ligação de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5- hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina também possam ser utilizadas.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente obtida pela alteração da seqüência de aminoácidos, de forma que contenha uma ou mais das seqüências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode também ser feita através da adição de um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original, ou substituição por estes (para sítios de glicosilação O- ligados).

A glicosilação (incluindo o padrão de glicosilação) de anticorpos pode também ser alterada sem alterar a seqüência de nucleotídeos subjacente. A glicosilação depende, em grande parte, da célula hospedeira utilizada para expressar o anticorpo. Como o tipo de célula utilizado para a expressão de glicoproteínas recombinantes, tais como anticorpos, como potenciais produtos terapêuticos raramente é a célula nativa, podem ser esperadas variações significativas do padrão de glicosilação dos anticorpos (vide, por exemplo, Hse et ai, J. Biol. Chem. 272: 9062-9070 (1997)). Além da seleção de células hospedeiras, os fatores que afetam a glicosilação durante a produção recombinante de anticorpos incluem o modo de crescimento, formulação dos meios, densidade da cultura, oxigenação, pH, esquemas de purificação e similares. Vários métodos foram propostos para alterar o padrão de glicosilação atingido em um organismo hospedeiro específico, incluindo a introdução ou a sobre-expressão de certas enzimas envolvidas na produção de oligossacarídeos (Patentes US 5.047.335, US 5.510.261 e US 5.278.299). A glicosilação, ou certos tipos de glicosilação, pode ser removida enzimaticamente da glicoproteína, utilizando, por exemplo, endoglicosidase H (Endo H). Além disso, a célula hospedeira recombinante pode ser elaborada geneticamente, tal como tornada defeituosa no processamento de certos tipos de polissacarídeos. Estes e outros métodos similares são bem conhecidos na técnica.

A estrutura de glicosilação de anticorpos pode ser facilmente analisada através de métodos convencionais de análise de carboidratos, incluindo cromatografia de lectinas, NMR1 espectrometria de massa, HPLC, GPC1 análise da composição de monossacarídeos, digestão enzimática seqüencial e HPAEC-PAD, que utiliza cromatografia de troca aniônica de alto pH para separar os oligossacarídeos com base na carga. Também são conhecidos métodos de liberação de oligossacarídeos para propósitos analíticos, que incluem, sem limitação, tratamento enzimático (comumente realizado utilizando peptídeo-N-glicosidase F/endo-p-galactosidase), eliminação utilizando ambiente alcalino severo para liberar principalmente estruturas O-Iigadas e métodos químicos que utilizam hidrazina anidra para liberar oligossacarídeos N e O-ligados.

Triacorpos também se encontram dentro do escopo da presente invenção. Estes anticorpos são descritos, por exemplo, em Iliades et ai, supra, e Kortt et al., supra.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser modificados através de conjugação do anticorpo a um agente citotóxico (como uma molécula de toxina) ou uma enzima ativadora de pró-drogas que converte uma pró-droga (tal como um agente quimioterápico de peptidila, vide o documento WO 81/01145) em uma droga anti-câncer ativa. Vide, por exemplo, o documento WO 88/07378 e a Patente US 4.975.278. Esta tecnologia também é denominada "Terapia de Pró-Drogas Mediada por Enzima Dependente de Anticorpos" (ADEPT).

O componente de enzima do imunoconjugado útil para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de atuar sobre uma pró-droga, de forma a convertê-la na sua forma citotóxica mais ativa. Enzimas que são úteis no método de acordo com a presente invenção incluem, mas sem limitar-se a, fosfatase alcalina útil para a conversão de pró-drogas que contêm fosfato em drogas livres; arilsulfatase útil para a conversão de pró-drogas que contêm sulfato em drogas livres; citosina deaminase útil para a conversão de 5- fluorocitosina não-tóxica na droga anti-câncer, 5-fluorouracil; proteases, tais como serratia protease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tais como catepsinas BeL) que são úteis para a conversão de pró-drogas que contêm peptídeos em drogas livres; caspases, tais como caspase-3; D- alanilcarboxipeptidases, úteis para a conversão de pró-drogas que contêm substituintes D-aminoácidos; enzimas que clivam de carboidratos, tais como beta-galactosidase e neuraminidase, úteis para a conversão de pró-drogas glicosiladas em drogas livres; beta-lactamase útil para a conversão de drogas derivadas com beta-lactamas em drogas livres; e penicilina amidases, tais como penicilina V amidase ou penicilina G amidase, úteis para a conversão de drogas derivadas nos seus nitrogênios amina com grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em drogas livres. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como "abzimas", podem ser utilizados para converter as pró-drogas de acordo com a presente invenção em drogas ativas livres (vide, por exemplo, Massey, Nature 328: 457- 458 (1987)). Conjugados de anticorpo e abzima podem ser preparados conforme descrito no presente para fornecimento da abzima a uma população de células de tumor.

As enzimas podem ser ligadas covalentemente aos anticorpos através de métodos de técnicas bem conhecidas, tais como o uso de reagentes reticulantes heterobifuncionais. Alternativamente, as proteínas de fusão que compreendem pelo menos a região de ligação de antígenos de um anticorpo de acordo com a presente invenção ligada a pelo menos uma parte funcionalmente ativa de uma enzima de acordo com a presente invenção podem ser construídas utilizando métodos de DNA recombinante bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Neuberger et al., Nature, 312: 604- 608 (1984).

São contempladas modificações adicionais de anticorpos. O anticorpo pode ser ligado, por exemplo, a um dentre uma série de polímeros não-proteináceos, tais como polietilenoglicol, polipropilenoglicol, polioxialquilenos ou copolímeros de polietilenoglicol e polipropilenoglicol. O anticorpo pode também ser acondicionado em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de aglutinação ou por polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metacrilato de metila), respectivamente), em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (tais como lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Estas técnicas são descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Oslo, A., Ed. (1980). Para aumentar a meia-vida do anticorpo em soro pode-se incorporar um epítopo de ligação de receptores salvos ao anticorpo (especialmente fragmento de anticorpo), conforme descrito, por exemplo, na Patente US 5.739.277. Da forma utilizada no presente, a expressão "epítopo de ligação de receptores salvos" designa um epítopo da região Fc de uma molécula IgG (tal como IgGi, IgG2, IgG3 ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia-vida em soro in vivo da molécula IgG.

Formulações

Os antagonistas de WISP-1 descritos no presente são opcionalmente empregados em um veículo. Veículos apropriados e suas formulações são descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed., 1980, Mack Publishing Co. editado por Osol et al. Tipicamente, é utilizada uma quantidade apropriada de sal farmaceuticamente aceitável no veículo para tornar a formulação isotônica. Exemplos do veículo incluem solução salina, solução de Ringer e solução de dextrose. O pH do veículo é preferencialmente de cerca de 5 a cerca de 8 e, de maior preferência, cerca de 7,4 a cerca de 7,8. Será evidente para os técnicos no assunto que certos veículos podem ser, de maior preferência, dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração de agente ativo sendo administrada. O veículo pode apresentar- se na forma de formulação Iiofilizada ou solução aquosa.

Veículos, excipientes ou estabilizantes aceitáveis são preferencialmente atóxicos para as células e/ou os pacientes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes que incluem ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzilamônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; álcool fenólico, butílico ou benzílico; alquilparabenos tais como metil ou propilparabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeo de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos que incluem glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sais tais como sódio; e/ou tensoativos não-iônicos, tais como TWEEN®, PLURONICS® ou polietilenoglicol (PEG).

A formulação pode também conter mais de um composto ativo, conforme o necessário para a indicação específica que está sendo tratada, preferencialmente, formulações com atividades complementares que não se prejudicam entre si.

Os antagonistas descritos no presente podem também ser acondicionados em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de aglutinação ou por polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli- (metacrilato de metila), respectivamente), em sistemas de fornecimento de drogas coloidais (tais como lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas), ou em macroemulsões. Estas técnicas estão descritas em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo deverão ser estéreis. Isso é facilmente obtido por filtragem através de membranas de filtragem estéreis.

Podem ser elaboradas preparações de liberação sustentada. Exemplos apropriados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o agente ativo, matrizes estas que se encontram na forma de artigos moldados, tais como filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (tais como poli-(metacrilato de 2- hidroxietila) ou álcool (poli)-vinílico, polilactídeos (Patente US 3.773.919)), copolímeros de ácido L-glutâmico e □ etil-L-glutamato, etilenovinilacetato não- degradável, copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico degradáveis tais como o LUPRON DEPOT® (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido láctico e ácido glicólico e acetato de leuprolida) e ácido póli-D-(-)-3- hidroxibutírico. Embora polímeros tais como etilenovinilacetato e ácido láctico- ácido glicólico permitam a liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos.

Modos de Terapia

As moléculas descritas no presente são úteis no tratamento de várias condições patológicas, tal como o câncer. Estas condições podem ser tratadas pela adminstração de um ou mais antagonistas descritos no presente.

O diagnóstico em mamíferos das várias condições patológicas descritas no presente pode ser realizado pelo médico hábil no assunto. São disponíveis no estado da técnica métodos de diagnóstico que permitem, por exemplo, o diagnóstico ou detecção de câncer ou doenças relacionadas à imunidade em mamíferos. Os cânceres podem ser identificados, por exemplo, através de métodos que incluem, mas sem limitar-se a, apalpação, análise sangüínea, raio-X, NMR e similares.

0(s) antagonista(s) pode(em) ser administrado(s) de acordo com métodos conhecidos, tais como administração intravenosa na forma de mistura ou de infusão contínua ao longo de um período de tempo, através de vias intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinhal, subcutânea, intraarticular, intrassinovial, intratecal, oral, tópica ou inalatória. Opcionalmente, a administração pode ser realizada através de infusão por minibombas, utilizando-se vários dispositivos disponíveis comercialmente. Os antagonistas ou agonistas podem também ser empregados utilizando-se métodos de terapia genética que foram descritos no estado da técnica.

As dosagens e cronogramas eficazes para a administração de antagonistas podem ser determinadas empiricamente e encontra-se dentro dos conhecimentos de um técnico hábil no assunto. Podem-se empregar dosagens únicas ou múltiplas. Acredita-se atualmente que uma dosagem ou quantidade eficaz de antagonista utilizada isoladamente pode variar de cerca de 1 :g/kg a cerca de 100 mg/kg de peso do corpo ou mais por dia. A escala de dosagens entre as espécies pode ser realizada de maneira conhecida no estado da técnica, conforme descrito, por exemplo, em Mordenti et al, Pharmaceut. Res., 8: 1351 (1991).

Quando for empregada a administração in vivo de um antagonista, as quantidades de dosagem normais podem variar de cerca de 10 ng/kg até 100 mg/kg de peso do corpo do mamífero ou mais por dia, preferencialmente, cerca de 1 Mg/kg/dia a 10 mg/kg/dia, dependendo da via de administração. Orientações quanto às dosagens específicas e métodos de fornecimento são fornecidas na literatura; vide, por exemplo, as Patentes US 4.657.760, US 5.206.344 ou US 5.225.212. Antecipa-se que diferentes formulações serão eficazes para diferentes compostos de tratamento e diferentes disfunções e que a administração destinada a um órgão ou tecido, por exemplo, pode necessitar um fornecimento diferente daquele para outro órgão ou tecido. Os técnicos no assunto compreenderão que a dosagem de antagonista que deve ser administrada variará dependendo, por exemplo, do mamífero que receberá a terapia, da via de administração e de outras drogas ou terapias sendo administradas ao mamífero.

Dependendo do tipo de células e/ou da gravidade da doença, cerca de 1 pg/kg a 150 mg/kg (tal como 0,1 a 20 mg/kg) de anticorpo antagonista é uma possível dose inicial para administração, seja, por exemplo, através de uma ou mais administrações separadas ou através de infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderá variar de cerca de 1 pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é sustentado até que ocorra supressão desejada de sintomas da doença. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis.

Um único tipo de antagonista pode ser usado nos métodos da presente invenção. Por exemplo, uma molécula de imunoadesina WISP-1 pode ser administrada. Alternativamente, o medico hábil pode optar em empregar no método uma combinação de antagonistas, por exemplo, uma combinação de imunoadesina WISP-1 e de anticorpo WISP-1. Contempla-se que outras terapias adicionais podem ser empregadas nos métodos. A uma ou mais terapias diferentes podem incluir, mas sem limitar-se a, administração de terapia de radiação, citoquina(s), agente(s) inibidor(es) do crescimento, agente(s) quimioterápico(s), agente(s) citotóxico(s), inibidores de tirosina quinase, inibidores de ras farnesil transferase, inibidores da angiogênese e inibidores de quinase dependente de ciclina que são conhecidos no estado da técnica e definidos adicionalmente com particularidade no Capítulo I acima.

Além disso, as terapias com base em anticorpos terapêuticos que dirigem antígenos tumorais tais como Rituxan™ ou Herceptin™, bem como anticorpos anti-angiogênicos, tais como anti-VEGF.

Cronogramas de preparação e dosagem para agentes quimioterápicos podem ser utilizados de acordo com as instruções dos fabricantes ou conforme determinado empiricamente pelos técnicos no assunto. Cronogramas de preparação e dosagem para essa quimioterapia também se encontram descritos em Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore MD, Estados Unidos (1992). O agente quimioterápico pode preceder ou seguir a administração, por exemplo, de um agonista ou antagonista ou pode ser fornecido simultaneamente com ele. O agonista ou antagonista pode também ser combinado, por exemplo, com um composto antiestrogênio, tal como tamoxifeno, ou antiprogesterona, tal como onapristona (vide a Patente EP 616.812) em dosagens conhecidas para essas moléculas.

Pode também ser desejável administrar anticorpos contra outros antígenos, tais como anticorpos que se ligam a CD20, CD11a, CD18, CD40, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, fator endotelial vascular (VEGF) ou outros membros da família TNFR (tais como DR4, DR5, OPG, TNFR1 e TNFR2).

Alternativamente ou adicionalmente, dois ou mais anticorpos que ligam dois ou mais antígenos idênticos ou diferentes descritos no presente podem ser co- administrados ao paciente. Às vezes, pode também ser benéfico administrar uma ou mais citocinas ao paciente. Em uma realização, os antagonistas do presente são co-administrados com um agente inibidor de crescimento. O agente inibidor de crescimento pode ser administrado, por exemplo, em primeiro lugar, seguido pelo antagonista da presente invenção.

O antagonista e uma ou mais terapias diferentes podem ser administradas simultânea ou seqüencialmente. Após a administração do antagonista, as células tratadas in vitro podem ser analisadas. Quando houver um tratamento in vivo, os mamíferos tratados podem ser monitorados de diversas formas bem conhecidas pelos técnicos hábeis no assunto.

Artigos Manufaturados

Em outra realização da presente invenção, é fornecido um artigo manufaturado que contém materiais úteis para o tratamento das disfunções descritas acima. O artigo manufaturado compreende um recipiente e rótulo. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, ampolas, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados por uma série de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para o tratamento da condição e pode apresentar um orifício de aceso estéril (o recipiente pode ser, por exemplo, uma ampola ou saco de solução intravenosa que contém uma tampa perfurável por agulha de injeção hipodérmica). Os agentes ativos na composição podem compreender antagonista(s). O rótulo sobre o recipiente ou associado a ele indica que a composição é utilizada para o tratamento da condição selecionada. O artigo manufaturado pode compreender adicionalmente um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como uma solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode incluir ainda outros materiais desejáveis do ponto de vista de um usuário e comercial, que incluem outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e bulas com instruções de uso.

Os exemplos a seguir são oferecidos apenas como forma de ilustração e não pretende de maneira alguma limitar o escopo da presente invenção.

Todas as referências de patentes e da literatura citadas na presente especificação atual são incorporadas ao presente pela referência em sua totalidade.

Exemplos

Os reagentes disponíveis comercialmente referidos nos exemplos foram usados de acordo com instruções do fabricante a menos que indicados de outra maneira. A fonte das células identificadas nos seguintes exemplos, e durante toda a especificação, pelos números ATCC American Type Culture Collection, Manassas, Virgínia. A menos que notável de outra maneira, a presente invenção usa procedimentos padrões de tecnologia de DNA recombinante, tais como aquelas descritas acima no presente e nos seguintes livros textos: Sambrook et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press NY, 1989; Ausubel et ai, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley lnterscience, NY1 1989; Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc., NY1 1990; Harlow et ai, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, 1988; Gait1 MJ, Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984; R.l. Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.

Uma descrição dos ensaios e dos materiais consultados nos seguintes exemplos é fornecida abaixo:

Proteínas e Anticorpos: A proteína da fusão WISP-1-Fc humana de comprimento total foi expressa e purificada como descrita previamente (Desnoyers et ai, J. Biol Chem., 276:47599-47607 (2001)). O anticorpo CD44 camundongo anti-rato (clone 0X49) foi da BD Bioscience (Bedford MA). O anticorpo controle camundongo do isotipo lgG2a era da de Pharmingen. O conjugado FITC camundongo anti-rato CD44 era da Serotec (Raleigh, NC) e o anticorpo de camundongo conjugado FITC controle do isotipo IgGI era da DAKO (Dinamarca). O CD44 camundongo anti-rato (clone KM114) era da Pharmingen. O anticorpo para actina (clone C4) era da ICN biomedicals (Aurora, OH). Os anticorpos monoclonais WISP-1 Murinos anti-humanos foram gerados e selecionados usando WISP-1-Fc como um imunogênico e os protocolos e reagentes descritos nos exemplos da patente US 6.387.657 dos E.U. publicada em 14 de maio de 2002. Cinco de tais anticorpos monoclonais foram depositados pelo peticionário com o ATCC, como notável abaixo.

Células e espécimes de tecido: As linhagens de células NRK-49F e SW480 (ATCC, Manassas, VA) foram mantidas no meio High glucose Dulbecco's Modified Eagle's ( HGDMEM) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS). C57MG Parental, C57MG que expressam Wnt-1 (C57MG/Wnt-1), NRK-49F que expressam níveis elevados de hWISP-1 (NRK/WISP-1H), NRK-49F que expressam uns níveis mais baixos de hWISP-1 (NRK/WISP-1L) e NRK-49F que contêm um vetor vazio (NRK/controle) foram obtidos de Arnold Levine (Princeton University, Princeton, NJ) e mantidos nos meios contendo 2,5 pg ml"1 de puromicina (Xu et al., Genes Dev., 14:585-595 (2000)). Os ratos transgênicos para Wnt-1 obtidos de Harold Varmus (National Câncer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD) foram produzidos com os ratos p53 nulos obtidos do Jackson Laboratories (Bar Harbor, MA) para gerar o camundongo transgênico Wnt-1/p53 knock-out. Os espécimes de tumor de mama e do epitélio do dueto mamário foram retirados destes camundongos para a análise.

Ensaio de exclusão de partícula: O ensaio de sedimentação do eritrócito foi usado como descrito previamente, com pequenas modificações. (Knudson et al., J. Cell Sci., 99:227-235 (1991)). NRK/WISP-1 ((fibroblastos normais do rim de camundongos transfectados com WISP-1; vide, Xu et al., Genes Dev.. 14:585-595 (2000)) e células NRK/controle (fibroblastos normais de rim de camundongos; obtido de Arnold Levine, Princeton University, Princeton, NJ) (1 χ 10^5 células/poço) foram semeados em placas Falcon de 6 poços (Becton Dickinson1 Franklin Lanes, NJ) e mantidos em meio High Glucose Dulbecco's modified Eagle's suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) (Life Technologies, Gaithersburg, MD) durante a noite a 37°C, 5% de CO2. No dia seguinte, os meios foram removidos e permitidos a 10^8 RBCs de carneiro (Inter-Cell Technologies, Hopewell, NJ) em 750μl de PBS/0,1% BSA (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) foram adicionados e repousados por 15 minutos. As células foram observadas utilizando se um microscópio invertido Nikon Diaphot 300, e as imagens digitais foram adquiridas usando uma câmera digital SONY DKC-5000 (Japão).

Coloração de Hyaluronan em Células Cultivadas: A coloração do hyaluronan foi realizada como préviamente descrito, com pequenas modificações (Pienimaki et ai, J. Biol. Chem.. 276:20428-20435 (2001)). Células NRK/WISP-1 e NRK/controle (8-10 X 10^3) foram plaqueadas em 8 poços de câmara plástica e mantidas (como descrito acima) durante à noite a 37°C, 5% CO2. No dia seguinte as células foram lavadas com tampão salina fosfato (PBS) e fixadas com 4% de paraformaldeído em PBS por 20 minutos a temperatura ambiente. As células forma lavadas em PBS e os sítios de ligação não específicos foram saturados por 30 minutos com água destilada contendo 1% de soro bovino fetal (BSA) e 0,1% de Triton X-100 (Calbiochem, LaJoIIa, CA). A proteína de ligação HA biotinilada (HA-BP) (Seikagaku America, Falmouth, MA) (em 5pg/ml PBS/3% BSA) foi adicionada e incubada durante a noite a temperatura ambiente. No dia seguinte as células foram lavadas com PBS e incubadas por 30 minutos com 1:1000 estreptoavidina conjugado com FITC (DAKO) em TBS e 1%/BSA. As células foram lavadas em PBS, montadas utilizando Vectashield (Burlingame, CA) contendo 1 pg/ml Hoechst 33342 (Molecular Probes1 Eugene, Or) e visualizada sob um microscópio de fluorescência Nikon Eclipse 800. As imagens forma adquiridas com uma câmera CCD Photometrics 300 operada a -40°C conectada a um computador Apple G3. (O mesmo processo foi utilizado para colorações em cortes congelados de tumores de mama dos camundongos transgênicos Wnt-1).

RT-PCR em tempo real: O nível relativo da expressão do RNA foi determinado usando RT-PCR em tempo real como relatado previamente (Winer et ai., Anal. Biochem., 270:41-49 (1999)). O RNA total foi extraído das células com Tri-Reagente usando o protocolo do fabricante (Molecular Research Center). Os primers específicos e as sondas fluorogênicas foram projetadas e usadas para amplificar e quantificar o nível da expressão gênica. Os sinais específicos dos genes foram normatizados para o gene housekeeping gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase. Foram calculados a média dos dados triplicados para cada circunstância. Todos os reagentes TaqMan RT-PCR foram comprados da Applied Biosystems (Foster City, CA). Para testar o efeito de WISP-1 recombinante na expressão do gene, as placas de petri (35 mm) foram revestidas durante a noite a 4 0C com 75 pg ml"1 de hWISP-1-Fc em PBS. No dia seguinte, as células (3 X 105 células/placas) foram plaqueadas na superfície revestida e a análise da expressão foi executada após 18 horas. Em determinados casos a superfície revestida foi lavada e tratada por mais 2 horas a temperatura ambiente antes da células ser semeada.

Análise por FACS: As células foram colhidas por tripsinização, lavadas com PBS e incubadas em PBS 1% BSA/ 20% glicose contendo 1 pg ml-1 de FITC conjugado com anti-CD44 (Serotec, Raleigh, NC) ou um Ab isotipo controle (DAKO, Dinamarca) por 30 minutos a temperatura ambiente. As células foram lavadas com o mesmo tampão e analisadas em um EPICS XL- MCL (Coulter, Miami1 FL). Western Blot: NRK/C e NRK/W1H foram cultivadas até a confluência em placas de 10 cm2. As células foram lavadas com PBS e extraídas com 300 μΙ_Ι de 1% Triton-XIOO em TBS por 5 minutos. As proteínas forma precipitadas utilizando adicionando 10 volumes de acetona ao extrato.

As amostras foram reduzidas, desnaturadas e carregadas em um gel de poliacrilamida SDS no gradiente 4-20%. O gel foi transferido às membranas de PVDF e sondado com um anticorpo CD-44 anti-rato (0X49) ou um CD44 anti- camundongo (KM114) em uma concentração de 1 pg/ml e detectado usando um anticorpo secundário IgG anti-camundongo conjugado com HRP e os reagentes de detecção de Amersham ECL. A detecção da actina nas amostras foi usada como o controle do carregamento.

Ensaio de Disperção: As células foram plaqueadas em placas de 24 poços em baixa concentração (~1000 células/poço) e permitidas a formar colônias em 3 dias. As células foram coradas usando Diff-Quik (Dade Behring1 Newark, DE) e as colônias foram observadas sob o microscópio.

Ensaio de cicatrização com células: A migração celular foi avaliada usando um ensaio de cicatrização com células descrito previamente com pequenas modificações (Pienimaki et al, J. Biol. Chem., 276:20428-20435 (2001)). Momentaneamente, as células foram cultivadas até que alcançarem a confluência. Uma linha (~1 mm) foi extraída na camada da célula usando uma micropipeta equipado com uma ponta descartável amarela. A migração celular sobre a área extraída foi monitorada por microscopia time-lapse sobre 15 horas. A área recentemente ocupada pelas células após este período foi mensurada usando o software de imagem NIH calibrado com um micrômetro.

Microscopia time-lapse: As células foram plaqueadas em HGDMEM/10% FBS e sua migração aleatória foi observada por 15 horas usando a microscopia time-lapse. A distância coberta pelas células foi mensurada usando o software de imagem NIH calibrado com um micrômetro de estágio.

Ensaio de Migração: A haptotaxia foi mensurada usando um sistema modificado da câmara de Boyden como previamente descrito (Bourguignon et ai, J. Biol. Chem.. 275:1829-1838 (2000)). O lado inferior do filtro de membrana com porosidade de 8 μηη de 24-poços no formato PET (FaIcon) foi coberto durante a noite a 4°C com 50 μl de proteína (50 pg ml"1) em PBS. As inserções revestidas forma enxaguadas em meio livre de soro e 0,5 χ 105 células NRK em 0,5 ml HGDMEM/10% FBS foram adicionadas na câmara superior. A câmara inferior foi preenchida com 0,75 ml do mesmo meio e as placas foram incubadas durante a noite a 37°C. A câmara superior foi limpa no dia seguinte com um cotonete de algodão e as células que migraram para lado inferior da inserção foram coradas com o kit de coloração Diff-Quik (Dade Behring Inc.) e contadas sob o microscópio. Foram calculados a média das triplicadas para cada circunstância.

Em determinados casos, as inserções revestidas foram lavadas e tratadas por mais 2 horas a temperatura ambiente.

Hibridização In situ: Os primers de PCR foram projetados para amplificar um fragmento de 740 bp do WISP-1 murino que mede 440-1180nt do NM 018865 (superior-5" GGCTGCCATCTGTGACCCA (SEQ ID NO:12) e inferior-5' CATAGGACCT GCCGGGAGAA A (SEQ ID ΝΟ.Ί3)) ou um fragmento de 706 bp do WISP-1 murino que mede 204-910 nt da NM_018865 (superior- 5' GCCGTGGCAGTCCTGAGGG (SEQ ID NO: 14) e inferior- 5' CAGCACCGGG CATTGACGTT A (SEQ ID ΝΟ.Ί5)) ou um fragmento de 464 bp do CD44 murino que mede nt 144-608 do M27129 (superior- 5' TGGAGAAAAATGGCCGCTAC A (SEQ ID NO: 16)) e inferior-5' TGGGGTGCTC TTCTCGATGG (SEQ ID NO: 17)) ou um fragmento de 630 bp do HAS2 murino medindo cerca de nt 927-1557 do NM 008216 (superior - 5' GGACAAATCGGCCACGTACA T (SEQ ID NO: 18) e inferior -5' CTTGCTCCAT CGGGTCTGC (SEQ ID NO: 19)). Extensões incluídas nos primers que codificam sítios para iniciação dos 27 nucleotídeos T7 ou T3 RNA polimerase para permitir a transcrição in vitro das sondas sense ou antisense, respectivamente, dos produtos amplificados. (Lu et ai, Cell Vision, 1:169-176 (1994)). Todos os tecidos foram fixados em formalina a 4% e emblocados em parafina. Os cortes de espessura de 3-5 mícrons foram desparafinizados, desproteinados em 4 mg/ml de proteinase K por 30 minutos a 37°C e processado para a hibridização in situ como previamente descrito. (Holcomb et al., EMBO J., Aug 2000 1;19(15):4046-55). As probes sense e antisense marcadas com 33P-UTP foram hibridizadas nos cortes a 55°C durante a noite.

As probes não hibridizadas foram removidas pela incubação com 20mg/ml de RNase A por 30 minutos a 37°C, seguido por um enxágue de alta estrigência a 55°C em 0,1 X SSC por 2 horas e desidratadas através de um gradiente de etanol. As lâminas foram mergulhadas na emulsão de trilha nuclear NBT2, expostas em caixas de lâminas plásticas seladas contendo dessecante por 4 semanas a 4°C, contra corado com hematoxilina e eosina.

Exemplo 1

As linhagens de células estáveis de fibroblasto que expressam altos (NRK/WISP-1H) ou baixos (NRK/WISP-1L) níveis de WISP-1 e uma linhagem de células controle que contém um vetor vazio (NRK/controle) foram usadas para avaliar o efeito de WISP-1 na produção do HA. Como demonstrado pelo ensaio da exclusão de partícula, as células NRK/WISP-1H acumularam um grande revestimento pericelular de hialuronan capaz de excluir eritrócitos sedimentando (Fig. 1a). NRK/WISP-1L acumulou uma matriz pericelular menor (1b) enquanto que nenhuma célula NRK/controle foi cercada de matriz (Fig. 1c) ou as células NRK/WISP-1H tratadas com haluronidase (dados não mostrados).

A acumulação da superfície celular associada a o AH foi avaliada também por coloração fluorescente utilizando uma proteína ligada a AH biotinilada (bHABP). A coloração revelou a acumulação do HA na superfície da célula NRK/WISP-1H (Fig. 1d) enquanto que nenhuma coloração foi detectada em células controle NRK (Fig. 1e).

O efeito de WISP-1 no secreção do HA foi avaliado comparando a acumulação do HA nos meios de cultura das células NRK/WISP-1H e NRK/controle sobre o tempo. Após 24 horas, a concentração de HÁ nos meios da NRK/WISP-1H era 3,5 vezes maior do que nos meios da células NRK/controle e aumentou gradualmente à 8 vezes após 144 h (Fig. 1f). Estes resultados juntos mostram que a expressão de WISP-1 em células NRK promove a acumulação do HA na superfície da célula e nos meios de cultura.

Exemplo 2

Para identificar a enzima responsável pela ativação de WISP-1 para a produção do HA, a expressão da conhecida HA sintase (HAS1, HAS2 e HAS3) em células NRK/WISP-1H, NRK/WISP-1L e NRK/controle foram analisadas. A expressão HAS2 foi aumentada até 10 vezes em células que produzem WISP-1 enquanto que os níveis do mRNA HAS1 e HAS3 eram idênticos ao controle (Fig 2a). Os níveis de mRNA do CD44 e do RHAMM estavam aumentados também na linhagem de células NRK/WISP-1 enquanto que a expressão do hialuronidase remanesceu não modificada (Fig 2a). Além disso, os níveis do mRNA de HAS2, CD44 e RHAMM forma proporcionais à expressão WISP-1. Como demonstrado pela análise de FACS (Fig 2b) e por Western Blot (Fig 2c), o aumento na expressão de mRNA do CD44 nas células NRK/WISP-1H resultou em um aumento de 4 vezes no nível da proteína CD44.

Exemplo 3

O HA foi mostrado por estimular a migração celular interagindo com os dois receptores de superfície da célula, CD44 e RHAMM (Hall et al., supra; Bourguignon et al., supra). Devido ao WISP-1 a produção de HA e a expressão de CD44 e RHAMM aumentaram, a motilidade das células que expressaram WISP-1 foi avaliada. Quando plaqueadas em baixa densidade, as células NRK/controle se proliferavam e davam forma a colônias bem definidas (Fig. 3a). As células NRK/WISP-1L se proliferaram deram forma a grupos menos definidos enquanto algumas células partiram de colônias crescentes (Fig 3b). Nenhuma colônia de NRK/WISP-1H foi observada, as células s e dispersavam em um padrão aleatório (Fig. 3c). O contrário do controle (Fig. 3d), As células que expressavam WISP-1 demonstraram também uma morfologia hiper alongada com o Iamelipodia prolongada característica de motilidade elevada (Fig. 3e). Usando um microscópio time-lapse, um aumento de 4 vezes na distância de migração das células NRK/WISP-1H foi observado comparado às células controle (Fig. 3f). As células NRK/WISP-1H também mostraram um aumento de 2,5 vezes na área de migração em um ensaio de cicatrização com células (Fig. 3g). Juntos estes resultados demonstram que a expressão WISP-1 pode promover a migração celular.

Exemplo 4

Para determinar se a adição ectópica de WISP-1 poderia promover a expressão HAS2 e a migração celular, um ensaio foi conduzido usando WISP-1-IgG recombinante purificado (Desnoyers et ai, supra). A adição WISP-1 aos meios de cultura não promoveu a expressão HAS2 (dados não mostrados). Quando as células NRK foram plaqueadas em uma superfície revestida com WISP-1-IgG1 a expressão de HAS2 aumentou comparado às células plaqueadas em plástico sem revestimento ou em uma superfície revestida como uma proteína quimérica de IgG irrelevante (TNFR-IgG) (Fig. 4a). Embora o decorin sozinho promovesse a expressão HAS2, esta indução foi três vezes maior depois que a superfície revestida foi incubada com WISP- 1. Os efeitos da adição ectópica de WISP-1 na migração de células NRK foram também examinados. Em um ensaio "transwell", a WISP-1-IgG induziu a migração haptotática das células NRK quando revestidas na superfície inferior do filtro (Fig. 4b). O revestimento de uma proteína quimérica irrelevante de IgG (TNFR-IgG) ou a adição de WISP-1-lgG à câmara inferior não promoveu a migração. Um anticorpo CD44 ou WISP-1 (Fig. 4b) inibiram a migração haptotática induzida pelo WISP-1. Além disso, a atividade haptotática de WISP-1 não foi limitada aos fibroblastos enquanto promoveu também a migração de células SW480, uma linhagem de células de adenocarcinoma de cólon (Fig. 4c). Junto estes resultados demonstram que a adição de WISP-1 ectópica aumenta a expressão de HAS2 e promove a migração de células através de um mecanismo mediado por CD44. Acredita-se, embora não inteiramente compreendido, que a apresentação de WISP-1 pode ser importante para a migração enquanto este pode necessitar estar preso a um substrato para eliciar esta atividade.

Exemplo 5

Por se acreditar que WISP-1 seja um efetor a jusante da Wnt- 1, a expressão de WISP-1, HAS2 e CD44 em uma linhagem de células epiteliais de mama estáveis transfectadas com Wnt-1 (C57MG/Wnt-1) foi analisada. Quando comparada à linhagem de células controle (C57MG), as células C57MG/Wnt-1 mostraram um aumento de 2,7, 5,8 e 3 vezes na expressão de mRNA do WISP-1, HAS2 e CD44 respectivamente (Fig 5a). Como demonstrado pelo Western blot, as células C57/Wnt-1 mostraram também um aumento de 6 vezes no índice de proteína CD44 (Fig. 5b). Além disso, ao contrário da linhagem de células controle, as células expressando Wnt-1 não formaram colônias distintas e se dispersaram quando colocadas em culturas de densidade baixa (Fig. 5c). Estes resultados mostram que a expressão de HAS2 e CD44 e a motilidade da célula estão elevadas nas linhagens de células onde a expressão de WISP-1 é provocada pela Wnt-1. Exemplo 6

A expressão Wnt-1 no epitélio mamário promove o desenvolvimento de tumor em ratos transgênicos (Li et a!., Oncogene1 19:1002- 1009 (2000); Tsukamoto et a/., Ce]], 55:619-625 (1988)). Pois WISP-1 é um efetor a jusante putativo de Wnt-1, a expressão de mRNA do HAS2 e CD44 em tumores de mama espontâneos de camundongos MMTV-Wnt-1 transgênicos foi mensurada. Quando comparada ao epitélio do dueto mamário, a expressão de mRNA do HAS2 estava aumentada entre 2,5 a 5,5 vezes em todos os tumores de mama analisados (n=5; Fig. 5d). Similarmente, a expressão de mRNA do CD44 foi induzida entre 2,2 e 4,2 vezes em todos os tumores (n=5; Fig. 5e). Estes resultados demonstram que HAS2 e CD44 são superexpresso nos tumores de mama dos camundongos MMTV-Wnt-1 transgênicos que expressam WISP-1.

Exemplo 7

A hibridização in situ demonstrou a expressão elevada de WISP-1 no estroma peritumoral de tumores de mama de camundongos transgênicos MMTV-Wnt-1 (Fig. 6a, b). Em contraste, a expressão de HAS2 (6c-d) e CD44 (Fig. 6 e-f) foi encontrada apenas em células epiteliais tumorais. A localização do CD44 no parênquima do tumor foi confirmada por imuno-histoquímica (Fig. 6g). A coloração da proteína de ligação revelou uma acumulação associada ao hialuronan com o estroma do tumor (Fig. 6h). A intensidade de coloração mais elevada foi encontrada na vizinhança imediata do lóbulo do tumor enquanto que uma coloração mais fraca foi localizada no epitélio do dueto mamário normal. Estes achados são consistentes com a sugestão de que WISP-1 pode regular as interações entre o tumor e as células do estroma que envolve o ácido hialurônico e o CD44.

Exemplo 8

O potencial de metástase e de crescimento de linhagens transformadas foi avaliado como descrito previamente (Welch et ai, Câncer Res.. 60:1552-1556 (2000)). Camundongos suíços fêmeas de nove semanas de idade nu/nu foram usados. Momentaneamente, as células foram colhidas por tripsinização e lavadas duas vezes com PBS. Foi injetado na veia lateral da cauda de cada camundongo 100 μΙ de uma suspensão que continha 5 χ 104 ou 2,5 χ 105 células. Em um injeção posterior de 2, 3 e 4 semanas, os camundongos foram examinados usando a imagem de ressonância latente cine-magnético (MRI) para a evidenciação de lesões pulmonares e as necropsias foram executadas. Os pulmões foram perfundidos com fixador de Bouin, extirpados e cortes corados por H&E foram feitos para a avaliação da colonização pulmonar do tumor.

As seções longitudinais do pulmão esquerdo, e uma única seção transversal dos lóbulos cranial, mediai, caudal, e acessórios do pulmão direito foram avaliados. Histologicamente, os pulmões afetados tiveram células neoplásicas fusiformes que infiltraram o interstício pulmonar. Entretanto, devido a severidade das mudanças serem variáveis o seguinte sistema de classificação foi estabelecido.

I = Envolvimento mínimo do interstício pulmonar - 10-20% do pulmão foi afetado. Os ninhos e conjuntos de células neoplásicas fusiformes perturbava o interstício pulmonar multifocalmente. Os focos afetados são geralmente ao longo da superfície pleural, estendendo ao interstício. Nenhum vaso ou grandes vias aéreas são afetadas.

II = Envolvimento moderado do interstício pulmonar - 20 - 50% do pulmão é afetado. Os ninhos e os conjuntos de células neoplásicas fusiformes perturbava o interstício pulmonar multifocalmente. Alguns vasos ou grandes vias aéreas estão preenchidos com células fusiformes. As células fusiformes dão forma freqüentemente a uma larga faixa ou a um grande maciço subjacente a pleura e estende-se ao interstício. O mesotélio sobrejacente está aumentado (reativo).

III = Envolvimento severo do interstício pulmonar - 50 - 100% do pulmão é afetado. Os ninhos e os conjuntos de células neoplásicas fusiformes perturbava o interstício pulmonar multifocalmente. Os vasos ou grandes vias aéreas estão preenchidos com células fusiformes. As células fusiformes dão forma freqüentemente a uma larga faixa ou a um grande maciço subjacente a pleura e estende-se ao interstício. As células fusiformes são freqüentemente envoltas em um material de basofílico a amfofílico acelular. O mesotélio sobrejacente está aumentado (reativo). Uma área mínima não afetada permanece para a troca de gases.

Os resultados da colonização do pulmão dos camundongos nude inoculados com células NRK/WISP-1H, NRK/WISP-1L e NRK/controle são sumarizados nas figuras 7 e tabela que exibe os efeitos da expressão de WISP-1 sobre o potencial metastático da NRK1 a seguir:

<table>table see original document page 112</column></row><table>

Nos camundongos inoculados com NRK/WISP-1H ou NRK/WISP- 1L, células formam massas no pulmão de maneira tempo e dose-dependente. As lesões mais severas foram vistas nos camundongos injetados com 2,5 X105 NRK/WISP-1H e necropsiados 4 semanas após a injeção. 2 e 3 semanas após a injeção, os camundongos tiveram a formação menos severa mas progressiva do tumor (classe I - II; vide o sistema de classificação acima). Os camundongos injetados com 2,5 X105 NRK/WISP-1L tiveram somente a formação mínima do tumor de pulmão 4 semanas após a injeção. Após 4 semanas da injeção, os camundongos inoculados com 0,5 X105 células NRKAA/ISP-1L estavam normais ou tinham uma infiltração neoplásica mínima (classe I), enquanto que os ratos injetados com 0,5x105 células NRK/WISP-1H mostraram uma infiltração neoplásica aumentada (classe III). A observação Histológica revelou que os pulmões dos animais inoculados com células NRK/controle eram normais (Fig. 7a-c). Nos animais injetados com NRK/WISP-1, as células neoplásicas fusiformes formaram inicialmente conjuntos pequenos, projetando- se, ou subjacentes à superfície pleural dos pulmões (classe I; Fig. 7d-f) envolto freqüentemente em um de material que ia basofílico ao material pálido acelular anfofílico. Em animais mais severamente afetados, as células neoplásicas deram forma a uma faixa larga confluente subjacente a pleura (classe II; Fig. 7g-i). Nos animais mais severamente afetados, os vasos sangüíneos e as grandes vias aéreas foram preenchidos com células fusiformes. (classe III; Fig. 7j-l). A análise por MRI mostrou uma densidade aumentada (hipersinal) que esboça os pulmões direitos e esquerdos ao longo da pleura nos animais com invasão histológica de classe Il e classe III. A severidade das lesões por MRI era consistente com a contagem histológica (Figuras 7a, d, g, j). Estes resultados indicam que a expressão de WISP-1 promove o potencial de crescimento metastático celular.

Exemplo 9

Células NRK/WISP-1H (2,5 χ 105) foram inoculadas na veia da cauda de camundongos nude. Começando no dia da inoculação da célula, os camundongos foram injetados intraperitonealmente duas vezes por semana com 10 mg/kg de anticorpo CD44, um anticorpo isotipo controle ou apenas tampão (PBS). Os pulmões foram fixados e extirpados após quatro semanas para a análise anatômica macroscópica.

Após 4 semanas, a severidade dos lesões encontrada nos animais tratados com anticorpo CD44 (n=5) variava do normal à classe I enquanto que todos os animais tratados com anticorpo controle ou salina (n=10) tiveram lesões de classe Ill (Fig. 8a). A área média de focos metastático nos pulmões dos animais tratados com anticorpo CD44 foi reduzida em 99% (P<0,00003) comparado aos animais tratados com anticorpo controle (Fig. 8b).

Exemplo 10

Um ensaio foi realizado para examinar especificidade de ligação de determinados anticorpos WISP-1. WISP-1 de camundongo de comprimento total (número de acesso GeneBank NM_018865) e WISP-1 humano de comprimento total (número de acesso GeneBank AF100779 de GenBank; Fig. 9) clonado em vetor de expressão que codifica a região Fc da IgGi humana a jusante da seqüência de WISP 1. A proteína recombinante resultante da fusão (WISP-1-Fc) sintetizada em um sistema de expressão em baculovirus usando células de inseto Sf9 e purificada à homogeneidade do meio condicionado livre de soro por cromatografia por afinidade em proteína A-Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech). O comprimento total de WISP-1 humano foi expresso também com um amino-terminal marcado com hexa-histidina (WISP- 1-His) em uma fita de E. coli. O Iisato da célula foi submetido a cromatografia em uma coluna de agarose Ni2+-NTA (Qiagen). O WISP-1-His foi eluído com um gradiente de 0 a 500 mM de imidazole. As frações contendo o WISP-1-His misturadas e então dializadas. O WISP-1 de um sistema de expressão em mamíferos foi obtido Iisando células NRK estáveis transfectadas com WISP-1 humano (Arnold Levine; Universidade de Princeton, Princeton1 NJ) com tampão de amostra SDS-PAGE. Um Iisato de células controle foi gerado com células NRK estáveis transfectadas com um vetor vazio.

O WISP-1 (50 ng) de vários sistemas de expressão foram submetidos a eletroforese em um gel de poliacrilamida SDS e eletro-transferido para membranas de polivinildifluoride (PVDF) e sondado com diferentes anticorpos monoclonais WISP-1.

Os anticorpos WISP-1 3D11.D7 (referido também no presente como "3D11"), 11C2.C10 (referido também no presente como "11C2"), 9C11.C7 (referido também no presente como "9011") e 5D4.F6 (referido também no presente como "5D4") ligam-se especificamente a WISP-1 gerado pelos sistemas de expressão em baculovirus, bactéria e mamíferos (Fig. 11a). Estes anticorpos não se ligaram ao WISP-1 murino do baculovirus e não reconheceram nenhuma proteína do Iisado controle. Os anticorpos WISP-1 6F8, 3A7, 10H12, 3A11, 6E3, 3H10, 5G1, e 10B1 reconheceram o WISP-1 humano e murino somente quando gerados com o sistema de expressão do baculovirus (Fig. 11b). Estes anticorpos não reconheceram o WISP-1 humano quando produzidos em um sistema de expressão bacteriano ou mamífero. O anticorpo do clone 9C10 não se ligou a nenhuma proteína após o Wester blot.

Estes resultados sugerem que os anticorpos WISP-1 3D11, 11C2, 9C11 e 5D4 reconhecem especificamente o WISP-1 humano e podem ser usados para a detecção de WISP-1 por Western blot.

Exemplo 11

Um ensaio foi conduzido para identificar os epítopos reconhecidos pelos anticorpos WISP-1 11C2, 9C11, 5D4 e 3D11.

O comprimento total de WISP-1 humano (número de acesso do GeneBank AF100779) clonado em um vetor de expressão plRESpuro2 (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) codificando 6 histidinas a jusante da seqüência WISP-1. Deleções mutantes foram geradas também removendo um, dois ou três domínios do WISP-1 humano. As construções resultantes foram também clonadas no vetor de expressão plRESpuro2. A nomenclatura utilizada para se identificar as diferentes construções de WISP-1 refere-se aos domínios contidos nelas, (ver Fig. 12B) O domínio 1 é o domínio de ligação da proteína do fator do crescimento similar a insulina (IFGBP), o domínio 2 é o domínio do fator C de Von Willebrand (VWFc)1 o domínio 3 é o domínio do trombospondina (TSP) e o domínio 4 é o domínio do C-terminal (CT). A região variável reside entre os domínios 2 e 3. Estas regiões e domínios de WISP-1 são ilustrados na Fig. 12A.

As seqüências que codificam estes domínios do WISP-1 são como segue:

Seqüências de construções de WISP 1

Domínio 1:

GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGC AGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACG ACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCA ATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGC TGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCT CAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACC GGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGG AGTGTGTGCACAGGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAG TGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTGCTGGAATTAATTC (SEQ ID NO:3)

Domínio 2:

GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGC AGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACTGCAGTGGTCGGTGTGGGCTGC GTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTG CAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTG TGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCG TGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTGCGGCCGCACA CCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAAC (SEQ ID Ν0:4)

Domínio 3:

GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGC AGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACTGCAGCATGGCACAGGAACTGC ATAGCCTACACAAGCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGG GGGTCTCCACTCGGATCTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAA GAGAGCCGCCTCTGCAACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACT CATTAAGGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGC CGCATAGATAACTGATCCAGTGT (SEQ ID NO:5)

Domínio 4:

GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGC AGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACTGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCT GTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAG CACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAATAGGTG CTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGA TGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAA CCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCC TGACTTCTCAGAAATTGCCAACGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACC ATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTG (SEQ ID NO:6)

Domínio 1,2:

GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGC AGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACG ACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCA ATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGC TGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCT CAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACC GGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGG AGTGTGTGCACAGGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGC TACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTG CATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCC CCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACT GCTGTGAGCAGTGGGTATGTGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCAT CACTAAGTGAGGCCGCATAGATAAC (SEQ ID Ν0:7) Domínio 1,2,3:

GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGC AGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACG ACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCA ATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGC TGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCT CAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACC GGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGG AGTGTGTGCACAGGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGC TACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTG CATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCC CCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACT GCTGTGAGCAGTGGGTATGTGAGGACGACGCCAAGAGGCCACGCAAGAC CGCACCCCGTGACACAGGAGCCTTCGATGCTGTGGGTGAGGTGGAGGCA TGGCACAGGAACTGCATAGCCTACACAAGCCCCTGGAGCCCTTGCTCCAC CAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGGATCTCCAATGTTAACGCCCAGT GCTGGCCTGAGCAAGAGAGCCGCCTCTGCAACTTGCGGCCATGCGATGT GGACATCCATACACTCATTAAGGCgGCCGCACACCACCATCACCATCACCA TCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTGCTGGA (SEQ ID NO:8)

Domínio 1,2,4:

GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGC AGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACG ACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCA ATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGC TGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCT CAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACC GGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGG AGTGTGTGCACAGGTGGTCGGTGTGGGCTGCGTCCTGGATGGGGTGCGC TACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTGCAAGTACAACTGCACGTG CATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTGTGCCTCCGAGTGCGCCCC CCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCGTGAGCATACCTGGCCACT GCTGTGAGCAGTGGGTATGTCTGCAGGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGT GTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCA CACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCATGGACAATAGGTGCT GCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATG GGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACC TGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTG ACTTCTCAGAAATTGCCAACGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCAT CACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTGTGCTGGAATTAATTCG CTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGG GCATGACTTCTGCGCTA (SEQ ID NO:9)

Domínio 1,3,4:

GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGC AGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCCCTCTCTCCAGCCCCTACG ACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGACACCTCCTCACGCCCCCA ATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCATCCCCACCCCGCTGCCCGC TGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGAGTGCTGTAAGATGTGCGCT CAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCTGCCATCTGTGACCCCCACC GGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACCGCCCGAGGTACGCAATAGG AGTGTGTGCGCATGCTGTGGGTGAGGTGGAGGCATGGCACAGGAACTGC ATAGCCTACACAAGCCCCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGG GGGTCTCCACTCGGATCTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAA GAGAGCCGCCTCTGCAACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACT CATTAAGGCAGGGAAGAAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCA TGAACTTCACACTTGCGGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGT ACTGTGGAGTTTGCATGGACAATAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGA CTATCGACGTGTCCTTCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAG GTCCTATGGATTAATGCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAAT GACATCTTTGCTGACTTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAAC GCGGCCGCACACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAG ATAAC (SEQ ID NO: 10)

Domínio 2,3,4:

GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGC AGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACTGCAGTGGTCGGTGTGGGCTGC GTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTG CAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTG TGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCG TGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTGAGGACGACGC CAAGAGGCCACGCAAGACCGCACCCCGTGACACAGGAGCCTTCGATGCT GTGGGTGAGGTGGAGGCATGGCACAGGAACTGCATAGCCTACACAAGCC CCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGGAT CTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAAGAGAGCCGCCTCTGCA ACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACTCATTAAGGCAGGGAAG AAGTGTCTGGCTGTGTACCAGCCAGAGGCATCCATGAACTTCACACTTGC GGGCTGCATCAGCACACGCTCCTATCAACCCAAGTACTGTGGAGTTTGCA TGGACAATAGGTGCTGCATCCCCTACAAGTCTAAGACTATCGACGTGTCCT TCCAGTGTCCTGATGGGCTTGGCTTCTCCCGCCAGGTCCTATGGATTAAT GCCTGCTTCTGTAACCTGAGCTGTAGGAATCCCAATGACATCTTTGCTGAC TTGGAATCCTACCCTGACTTCTCAGAAATTGCCAACGCGGCCGCACACCA CCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATCCAGTG TGCTGGAATTAATTCGCTGTCTGCGA (SEQ ID NO:11)

As células (HEK 293T) foram transfectadas com diferentes construções, e os meios de cultura foram coletados após 48 horas. Um mililitro de meio de cultura foi incubado com 20 μΙ de agarose de cobalto por 1 hora, centrifugado e lavado. As proteínas adsorvidas foram eluídas aquecendo a pellet a 100 0C por 5 minutos em 20 μΙ de tampão de amostra SDS-PAGE. As amostras foram submetidas a eletroforese, eletro transferidas para PVDF e foram sondadas com diferentes anticorpos WISP-1.

Os anticorpos 11C2, 9C11 e 5D4 reconheceram somente as construções de WISP-1 que continham os 19 primeiros aminoácidos da região variável situada entre o domínio 2 e 3 (Fig. 12C; 12E; 12G). O anticorpo 3D11 da WISP-1 reconheceu apenas as construções de WISP-1 que continham o domínio 1 (aminoácidos de 24 a 117; Fig. 12D; 12F).

Estes resultados indicam que os anticorpos 11C2, 9C11 e 5D4 reconhecem especificamente a região variável de WISP-1 enquanto que o anticorpo 3D11 reconhece especificamente o domínio 1 do WISP-1.

Exemplo 12

Um ensaio foi conduzido para identificar o epítopo reconhecido pelo anticorpo WISP-1 9C10.F5 (também referido no presente como "9C10").

Os meios de cultura das células HEK 293T transfectadas com vários construções de deleções de WISP-1 (como descrito acima no exemplo 11) incubadas com 1 pg de anticorpo WISP-1 9C10 e 20 μΙ de proteína A- agarose por 1 hora a temperatura ambiente. O imunocomplexo precipitado por centrifugação e eluído aquecendo o pellet a 100°C por 5 minutos em 20 μΙ do tampão da amostra SDS-PAGE. As amostras foram submetidas a eletroforese, eletro-transferidas para PVDF e foram sondadas com diferentes anticorpos WISP-1 11C2.

O anticorpo imunoprecipitado 9C10 somente construído que contêm o domínio 1 do WISP-1 (fig. 13). Estes resultados demonstram que o anticorpo 9C10 reconhece especificamente o domínio 1 do WISP-1 e pode ser usado para a imunoprecipitação.

Exemplo 13

O anticorpo WISP-1 9C10 (100 μΙ de 2 pg/ml em tampão carbonato, pH 9,6) foi utilizado para revestir as placas Maxisorb durante a noite a 4 °C. As placas foram bloqueadas com 200 μΙ de PBS/3% BSA por 1 hora.

Uma curva padrão foi feita de diluições seriadas de WISP-1-Fc (100 μl em PBS/3% BSA) e incubado por 1 hora. Após a incubação, as placas foram lavadas com 100 μl de PBS/0,05% Tween e os anticorpos WISP-1 (100 μl de 2 ug/ml) em PBS/3% BSA (biotinilado 11C2 ou 55B) foram incubados por 1 hora. Para 11C2 biotinilado, as placas foram incubadas adicionalmente com mais 2 pg/ml de estreptoavidina conjugada com HRP. Para 55B, as placas foram lavadas e incubadas com IgG asno anti-coelho conjugado com HRP por 1 hora.

No fim da incubação, os poços foram lavados 6 vezes com 200 μl de PBS contendo 0,05% de Tween 20, e o sinal foi visualizado usando 100 μl de substrato cromogênico HRP (TMB) (Kirkegaard & Perry Laboratories).

A reação foi parada com 100 μΙ do de ácido fosfórico a 1 M, e foi mensurada a OD em 450 nm. A ligação inespecífica foi determinada em incubações paralelas pela omissão do microtítulo do poço revestido. Nenhum sinal foi gerado quando o WISP-1-Fc ou um anticorpo WISP-1 foi omitido.

Utilizando um anticorpo 9C10 para a captura e anticorpos 11C2 e 55B para a detecção, um ELISA foi realizado capaz de detectar a concentração de WISP-1 em concentrações tão baixas quanto 0,4 pg/ml (Fig. 14). Este ELISA pode ser útil para detectar a proteína WISP-1 em líquidos biológicos tais como o soro. Exemplo 14

As placas de Maxisorb foram revestidas durante a noite a 4 0C com 50 μl/poço de 10 pg/ml de heparina (Sigma). Os sítios de ligação inespecíficos foram bloqueados com 200μl de PBS/3% BSA por 1 hora. As placas foram então incubadas por 1 hora com 50 μΙ de 6 pg/ml de hWISP-1-Fc em PBS/3% BSA na presença de diluições seriadas de anticorpos WISP-1. As placas foram lavadas com PBS/0,05% Tween e incubadas adicionalmente por 1 hora com 50 μΙ de 2 μg/ml IgG-Fc anti-humano conjugado com HRP em PBS/3% BSA. As placas foram lavadas, e 100 μΙ do substrato HRP (TMB) foi adicionado. O aparecimento da cor foi parado com 100 μΙ de ácido fosfórico 1 Mea OD foi mensurada em 450 nm.

Os anticorpos WISP-1 11C2, 5D4 e 9C11 inibiram a ligação de WISP-1 à heparina com um IC5o de 1,9, 2,5 e 3,7 pg/ml, respectivamente (Fig. 15). O anticorpo 3D11 reduziu moderadamente a ligação de WISP-1 a heparina com uma inibição máxima de 62% na concentração a mais elevada testada (40 μg/ml). O anticorpo 9C10 não atenuou a ligação de WISP-1 com a heparina, demonstrando uma curva de inibição similar ao anticorpo controle irrelevante.

Estes resultados demonstram que os anticorpos que reconhecem a região variável podem inibir a ligação da WISP-1 com a heparina. Devido aos dois anticorpos WISP-1 reconhecerem o domínio 1 tem se pouco ou quase nenhum efeito na ligação do WISP-1 com a heparina, acredita-se atualmente que é menos provável que o domínio 1 participe desta interação.

Exemplo 15

A haptotaxia foi mensurada utilizando um sistema de câmara de Boyden modificada. O lado inferior do filtro de membrana com porosidade de 8 μm de 24-poços no formato PET (Becton Dickinson, Franklin Lakes, New Jersey) foi coberto durante a noite a 4°C com 50 μl de proteína (50 μg ml) em PBS. Células normais de rim de rato (NRK; 5 χ 104/0,5 ml HGDMEM/10% FBS) foram adicionadas à câmara superior, a câmara inferior foi preenchida com o mesmo meio e as placas incubadas a 37 0C. No dia seguinte, a câmara superior foi limpa com um cotonete de algodão, e as células que migraram para o lado inferior da inserção foram coradas e contadas sob um microscópio. Foi calculado a média dos dados em triplicata para cada circunstância. Em determinados casos, as inserções revestidas foram lavadas e tratadas adicionalmente por 2 horas em temperatura ambiente.

Em um ensaio transwell, o WISP-1-Fc sobre a superfície inferior dos filtros induz a migração haptotática de células NRK (Fig. 16A). O revestimento com uma proteína de IgG quimérica irrelevante (TNFR-Fc) ou a adição de WISP-1-Fc à câmara inferior não promoveu a migração. Na presença de WISP-1-Fc revestida, cinco diferentes anticorpos (9C10, 11C2, 3D11, 9C11, 5D4) inibiram notavelmente a migração celular. Na ausência do revestimento de WISP-1-Fc, estes anticorpos não mostraram nenhum efeito na migração celular. Estes resultados demonstram que os anticorpos WISP-1 podem modular a migração celular na presença de WISP-1. Bloqueando a migração das células, os anticorpos WISP-1 podem desempenhar um papel terapêutico importante em impedir a progressão do câncer.

Um resumo das características e das propriedades dos anticorpos 3D11, 9C10, 11C2, 5D4, e 9C11 discutidas nos exemplos acima é fornecido na tabela abaixo:

<table>table see original document page 124</column></row><table> Exemplo 16

Camundongos suíços nu/nu fêmeas de nove semanas de idade foram injetados na veia lateral da cauda com 100 μΙ de uma suspensão que contendo 2,5 χ 10^5 células. Começando no dia da inoculação, os camundongos foram tratados semanalmente com injeção intraperitoneal (10 mg/kg) dos anticorpos WISP-1 (9C11, 11C2, 5D4, 9C10, 3D11) ou o anticorpo isotipo controle. Após 3 semanas, os pulmões forma perfundidos com formalina tamponada a 4%, foram retirados e foram realizados cortes corados por H&E.

Os cortes longitudinais do pulmão esquerdo, e uma seção transversal dos lóbulos cranial, mediai, caudal, e acessórios do pulmão direito foram avaliadas. Para cada lâmina foi contado o número de focos metastáticos e a área média de focos metastáticos usando um software SPOT RT (Diagnostic Instruments Incorporated, Burlingame, Califórnia). A área (Mm2) foi determinada no mínimo em cinco focos metastáticos individuais em quatro cortes de pulmão.

Após 3 semanas, a severidade dos lesões encontradas nos animais tratados com o anticorpo WISP-1 foi extremamente atenuada quando comparada ao controle (Fig. 17 a, b). O número de nódulos e a área média dos focos metastáticos encontradas nos camundongos tratados com anticorpos WISP-1 (n=5) estavam reduzidas comparadas aos animais tratados com anticorpo controle (Fig. 17 c, d). Além disso, sob do tratamento do anticorpo WISP-1, a área pulmonar total coberta pelas lesões foi reduzida em 82-97% quando comparado aos animais tratados com anticorpo isotipo controle (Fig. 17e). Estes resultados demonstram a eficácia in vivo dos anticorpos WISP-1 na redução da carga tumoral relacionada à metástase. Embora o mecanismo de ação dos anticorpos WISP-1 não seja totalmente compreendido, acredita-se que sua eficácia pode ser mediada pela redução no crescimento e na habilidade e/ou capacidade em inibir a motilidade, invasão e semear de células de câncer em um local do tecido. Exemplo 17

O WISP-1 de comprimento total de camundongo (número de acesso GenBank NM_018865) foi clonado no vetor de expressão mamífero pRK. A construção resultante (pRK-WISP-1; 18ug) foi co-transfectada com 2ug de plasmídeos pSVi-puromicina em uma linhagem de células de mamíferos de adenocarcinoma de camundongo 4T1 (obtida do Dr. Fred Miller, Barbara Ann Karmanos Câncer lnstitute, Detroit, Ml) usando o Fugene6 (Roche) de acordo com instruções do fabricante. Após 2 dias, as células foram selecionadas em 2 pg/ml de puromicina. Após 2 semanas, clones foram isolados e a expressão de WISP-1 foi avaliada por imunofluorescência. O mesmo procedimento foi usado para gerar linhagem de células controle usando um vetor vazio. As linhagens de células resultantes 4T1/controle e 4T1/WISP-1 foram mantidas nos meios de Iscove que contêm 10% FBS e 3 pg/ml puromicina.

A expressão de WISP-1 nas linhagens celulares 4T1/controle, 4T1/WISP-1L, 4T1/WISP-1H, NRK/controle, NRK/WISP-1L e NRK/WISP-1H foi mensurada por RT-PCR semi-quantitativo (Taqman) usando primers e probes que não distinguem entre o gene WISP-1 do ser humano e do camundongo.

A WISP-1 não foi expressa em linhagens de células 4T1/controle. A expressão de WISP-1 na linhagem de células 4T1/WISP-1H foi 2 vezes maior do que na linhagem 4T1/WISP-1L, mas 700 vezes menor do que na linhagem NRKM/ISP-1H (Figura 18).

Exemplo 18

Para avaliar o efeito de WISP-1 na dispersão da célula 4T1, 100.000 células 4T1/controle, 4T1/WISP-1L ou 4T1/WISP-1H foram semeadas em placas de 6 poços com meios Iscove contendo 10% de Soro Bovino Fetal. Quando plaqueadas em baixa, as células 4T1/controle proliferaram e formaram colônias bem definidas (Fig. 19). As células 4T1/WISP-1L proliferaram formaram grupos menos definidos enquanto algumas células partiram das colônias crescentes (Fig. 19). Nenhuma colônia de células 4T1/WISP-1H foi observada, e as células estavam dispersas em um padrão aleatório (Fig. 19). Juntos estes resultados sugerem que a expressão WISP-1 promove a migração celular.

Exemplo 19

O efeito do WISP-1 na invasão da célula 4T1 foi avaliada também usando uma matrigel coberta em sistema de câmara de Boyden modificada de 24-poços no formato PET e porosidade de 8 μm (Falcon). As células 4T1/controle, 4T1/WISP-1 L ou 4T1/WISP-1 H (100.000 células) foram adicionadas à câmara superior em meio Iscove 0,5 ml. A câmara inferior foi preenchida com 0,75 ml do mesmo meio contendo 5% de soro bovino fetal e as placas incubadas durante a noite a 37°C. A câmara superior foi limpa no dia seguinte com um cotonete de algodão e as células que migraram para o lado inferior da inserção foram coradas com o kit de coloração Diff-Quik (Dade Behring Inc.) e contadas sob o microscópio. Foi calculado a média em triplicatas para cada circunstância. As células 4T1/WISP-1 H e 4T1/WISP-1 L demonstraram um aumento de 12 e 6 vezes na invasão comparada ao 4T1/controle, respectivamente (Fig. 20). Estes resultados sugerem que o WISP-1 promove a invasão tumorigênica mamária da célula epitelial e pode desempenhar um papel no metástase.

Exemplo 20

Os efeitos da WISP-1 na tumorigênese das células epiteliais mamárias foram avaliados injetando 1,5x105 células (4T1/controle 1, 4T1/controle 2, 4T1/WISP-1L ou 4T1/WISP-1H) no panículo adiposo mamário de quatro camundongos fêmeas BALB/c de 6-8 semanas de idade. Os volumes dos tumores foram mensurados três vezes por semana. Trinta dias após a injeção, os ratos foram sacrificados, os tumores retirados e pesados.

A inoculação de células 4T1/WISP-1L (Fig 21a; quadrado vazio) e células 4T1/WISP-1H (Fig. 21a; quadrado cheio) gerou tumores que cresceram mais rapidamente quando comparados às células 4T1/controle 1 e 4T1/controle 2 (Fig. 21a; círculos vazios e cheios). Após 31 dias, os tumores formados pelas células 4T1/WISP-1L e 4T1/WISP-1L inoculadas forma 4 vezes maior (Fig. 21a) e 3 vezes mais pesados (Fig. 21b) do que os tumores formados pelas células 4T1/controle. Estes resultados sugerem que WISP-1 pode aumentar a proliferação de células epiteliais mamárias do tumor.

Exemplo 21

A expressão de HAS2 e de CD44 nos tumores formados pelas células 4T1/controle, 4T1/WISP-1L e 4T1/WISP-1H inoculadas, foram mensuradas. Quando comparada ao tumor das células 4T1/controle, a expressão CD44 foi entre 5 e 23 vezes maior nos tumores das células 4T1/WISP-1 (Fig. 22). Por outro lado, a expressão de HAS2 permaneceu idêntica em todos os tumores analisados. Estes resultados sugerem que a WISP-1 aumenta a expressão de CD44 nos ratos inoculados com células 4T1.

O superexpressão de CD44 nestes tumores pode contribuir para a promoção da metástase.

Exemplo 22

Os efeitos da WISP-1 na metástase de células epiteliais mamárias foram avaliados inoculando células 4T1 no panículo adiposo mamário de camundongos (vide o exemplo 20) e examinando a extensão da propagação metastática por micro tomografia computadorizada e histologia. Após 31 dias, os ratos inoculados com células 4T1/WISP-1L ou 4T1/WISP-1H tiveram metástase extensiva no pulmão (Fig. 23b e 23d) comparado aos ratos injetados com células 4T1/controle (Fig. 23a e 23c). Nenhuma diferença significativa foi observada entre o potencial metastático das células 4T1/WISP-1L e 4T1/WISP- 1H. Os camundongos inoculados com células 4T1/controle tiveram uma média de 2,11 focos pulmonares com uma massa média de 0,68 gramas enquanto que os camundongos inoculados com células 4T1/WISP-1 tiveram uma média de 20,25 focos pulmonares com uma massa média de 12,46 gramas. Também, a contagem média da histologia do pulmão nos camundongos injetados com células 4T1/WISP-1 foi de 0,92 comparado com 0,11 dos camundongos injetados com células NRK/controle.

Utilizando a imuno-histoquímica, observou-se também que os focos metastáticos pulmonares de 4T1/WISP-1 expressaram níveis elevados de CD44 (Fig. 23e). Nestes tumores, o CD44 foi localizado na membrana plasmática das células 4T1/WISP-1 (Fig. 23f). Juntos estes resultados demonstram que WISP-1 promove o potencial metastático das células 4T1, aumentando o número de focos metastáticos no pulmão (10 vezes maior) e o tamanho (18 vezes maior). A expressão de CD44 também foi mantida depois que as células 4T1/WISP-1 foram metastizadas para os pulmões.

As observações clínicas dos camundongos inoculados com células 4T1/controle 1, ou 4T1/WISP-1 demonstraram que a expressão de WISP-1 promoveu a metástase em locais secundários adicionais. Dois ratos inoculados com células 4T1/WISP-1H tiveram uma massa branca descolorada no rim enquanto que nenhum outro camundongo teve evidências de tumores no rim.

Exemplo 23

Construção do WISP-1 humano mutante com deleção e de comprimento total descrita acima foram transfectadas nas células normais de rim de rato (NRK-49F). Após 48 horas, os meios de cultura foram suplementados com 2 pg/ml de puromicina. Após 2 semanas, os pools de células expressando foram analisados e as linhagens de células resultantes foram mantidas no meio High glucose Dulbecco's Modified Eagle's (HGDMEM) suplementadas com o soro bovino fetal 10% (FBS) e puromicina 2 pg/ml.

A expressão da WISP-1 nas linhagens de células NRK/controle, NRK/WISP-1_1234, NRK/WISP-1_134, NRKyWISP-1_234, NRK/WISP-1_123 e NRK/WISP-1_124 foi mensurada por RT-PCR semi-quantitativo (Taqman). Os resultados são expressos como a quantidade relativa da expressão de WISP-1 em células NRKM/ISP-1_1234 (Fig. 24A). A expressão WISP-1 em NRK/WISP- 1_134 e em NRK/WISP-1_234 foi de 0,035 e 0,09 vezes comparada a NRK/WISP-1_1234 respectivamente. NRK/WISP-1_123 expressou 16,1 vezes e NRK/WISP-1_124 7,6 vezes comparado a NRK/WISP-1_1234.

A contribuição de domínios particulares a tumorigênese promovida pela WISP-1 foi avaliada injetando 5x106 células (NRK/controle, NRK/WISP-1_1234, NRK/WISP-1_123, NRK/WISP-1_124, NRK/WISP-1_134, NRK/WISP-1_234) subcutaneamente em camundongos nude fêmeas de 6-8 semanas de idade (10 camundongos/grupo). O volume dos tumores foi medido semanalmente. Após 35 dias os ratos foram sacrificados, os tumores extirpados e foram analisados histologicamente.

A inoculação de células NRK/WISP-1_1234 (Fig. 24B; triângulos cheios), NRK/WISP-1_134 (Fig. 24B; círculos cheios) e NRK/WISP-1_234 (Fig. 24B; quadrados cheios) geraram tumores. Entretanto a inoculação de células NRK/WISP-1_123 (Fig. 24B; quadrados vazios), NRK/WISP-1_124 (Fig. 24B; círculos vazios) e NRK/controle (Fig. 24B; triângulos vazios) não geraram tumores. Após 35 dias, os tumores formados por células NRK/WISP-1_234 foram comparáveis ao tamanho dos tumores formados pelas células NRK/WISP-1 1234. Entretanto os tumores formados pelas células NRK/WISP- 1_134 foram 2,5 vezes maiores do que os tumores formados pelas células NRK/WISP-1_1234. Estes resultados sugerem que os domínios 1 e 2 não estão necessários para o WISP-1 prover a tumorigênese em células NRK, mas os domínios 3 e 4 são necessários para a tumorigênese promovida pelo WISP- 1 em células NRK. Acredita-se que os antagonistas de WISP-1 da presente invenção podem preferivelmente se ligar e/ou bloquear os domínios 3 e/ou 4 de WISP-1.

Além disso, os resultados sugerem que a deleção do domínio 2 de WISP-1 pode aumentar seu potencial tumorigênico.

A análise histológica dos tumores excisados (Fig. 25) revelou que as células neoplásicas dos tumores NRK/WISP-1_234 eram fenotipicamente similares às células neoplásicas dos tumores NRK/WISP-1_1234. Nestes tumores, as células pareceram fibroblásticos, diferenciado e fusiformes. Porém as células neoplásicas dos tumores NRK/WISP-1_134 eram fenotipicamente diferentes e pareciam menos diferenciadas, freqüentemente multinucleadas e tinham uma taxa mitótica ativa como demonstrada pela presença de figuras mitóticas múltiplas (setas). Além disso, as células neoplásicas invadiram diversos vasos sangüíneos adjacentes aos tumores NRK/WISP-1_134 (Fig. 26). Estes resultados indicam que a expressão de WISP-1_134 pode conferir a tumorigenicidade às células NRK promovendo o crescimento in vivo e o potencial invasivo. Além disso, a expressão desta construção induz uma transformação fenotípica característica de células neoplásicas agressivas.

Exemplo 24

A contribuição dos domínios WISP-1 específicos na invasão das células 4T1 foi avaliada usando uma matrigel coberta em sistema de câmara de Boyden modificada de 24-poços no formato PET e porosidade de 8 pm (Biosciences de BD). As células estáveis HEK 293 (20x106) que expressam as construções WISP-1 previamente mencionadas (WISP-1_1234, WISP-1_134, WISP-1_123, WISP-1_12, WISP-1_23, WISP-1_3, WISP-1_1 e WISP-1_4) foram semeadas na câmara inferior com 0,75 ml dos meios 50:50 (mistura 1:1 do meio F-12 HAM e DME) contendo 5% de soro bovino fetal e as placas foram mantidas overnight a 37 0C. No dia seguinte, células 4T1 (100.000 células) foram adicionadas à câmara superior em 0,5 ml de meio sem soro 50:50 e as placas foram incubadas overnight a 37 0C. No dia seguinte a câmara superior foi limpa com um cotonete de algodão e as células que migraram para lado inferior da inserção foram coradas com o kit de coloração Diff-Quik (Dade Behring Inc.) e contadas sob o microscópio. Os dados foram calculados com a média de triplicatas para cada circunstância e os resultados foram expressos como quantidade da invasão comparada a um controle em que células HEK 293 transfectadas com um vetor vazio foram plaqueadas. As células 4T1 demonstraram um aumento na invasão de 4 vezes quando as células HEK 293 que expressam as construções WISP-1_1234, WISP-1_134 ou WISP-123 foram semeadas na câmara inferior (Fig. 27). As células HEK 293 que expressam a construção WISP-112 aumentaram a invasão das células 4T1 em apenas 2,5 vezes. O aumento na invasão da célula 4T1 foi marginal quando as células HEK 293 que expressam WISP-1_23, WISP-1_3, WISP-1_1 ou WISP-1_4 foram semeadas na câmara inferior. Estes resultados sugerem que o domínio 1 é necessário para a invasão promovida pela WISP-1 da célula 4T1. Além disso, os dados mostram que o domínio 1 de WISP-1 sozinho não é suficiente para promover a invasão das células 4T1.

Exemplo 25

Um ensaio foi conduzido para avaliar a atividade antagonística do domínio 1 do WISP-1 na invasão de células 4T1 promovida por WISP-1. O domínio 1 do WISP 1 foi clonado em um vetor de expressão imediatamente a jusante da seqüência humana da região IgGi Fe. A proteína recombinante resultante da fusão (WISP-1-domínio 1-Fc) sintetizada em um sistema de expressão em mamíferos usando células de ovários de hamster chinês (CHO) e purificadas até a homogeneidade do meio condicionado por cromatografia por afinidade em proteína A-Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech). O comprimento total de WISP-1 humano foi expresso também com um amino-terminal marcado com hexa-histidina (WISP-1 -domínio-1-His) em um sistema da expressão de CHO e purificado à homogeneidade do sobrenadante da cultura por cromatografia em uma coluna de agarose Ni2+-NTA (Qiagen). As frações que contêm o WISP-1domínio-1-His eluído foram então ligadas e dializadas.

O efeito antagonístico do WISP-1-dominio-1His solúvel purificado na invasão promovida pelo WISP-1 da célula 4T1 foi avaliado usando uma matrigel coberta em sistema de câmara de Boyden modificada de 24-poços no formato PET e porosidade de 8 μηι (Biosciences de BD). As células 4T1/controle ou 4T1/WISP-1 (100.000 células) foram adicionadas à câmara superior em 0,5 ml de meio Iscove. A câmara inferior foi preenchida com 0,75 ml do mesmo meio contendo 5% de soro bovino fetal. As várias concentrações de WISP-1-domínio-1-Fc ou WISP-1-domínio-1-His foram adicionadas a câmara superior e inferior e as placas foram incubadas overnight a 37 °C. A câmara superior foi limpa no dia seguinte com um cotonete de algodão e as céluals que migraram para o lado inferior da inserção foram coradas com o kit de coloração Diff-Quik (Dade Behring Inc.) e contadas sob o microscópio. Foi calculada a média em triplicatas para cada circunstância. Os resultados foram expressos como invasão relativa comparada às células controle 4T1/. O WISP- 1- domínio-1-His e WISP-1- domínio-1-Fc demonstraram uma atividade antagonística dose dependente para a invasão das células 4T1 promovida pelo WISP-1 (Fig. 28). O WISP-1-domínio-1-His e WISP-1- domínio-1-Fc mostraram um IC5O aparente de 0,01 pg/ml. Estes resultados sugerem que o WISP-1- domínio-1 purificado antagoniza a invasão promovida pelo WISP-1 da célula.

Exemplo 26

Um estudo animal foi conduzido para avaliar a expressão de WISP-1 no modelo do xenoenxerto de HPAC de adenocarcinomas pancreáticos humanos. 5x106 células pancreáticas humanas dos adenocarcinomas (linhagem de células HPAC, Cat. N0 CRL-2119; ATCC1 Manassas1 VA, EUA;) foram injetados subcutaneamente em camundongos nude fêmeas de 6-8 semanas de idade. Após 21 dias os camundongos foram sacrificados, os tumores excisados e a expressão de WISP-1 foi analisada por hibridização in situ usando uma sonda específica para WISP-1 humana e uma sonda específica para WISP-1 de camundongo (Fig. 29). Os resultados demonstram uma expressão forte do WISP-1 de camundongo nas áreas que correspondem ao estroma do tumor. Por outro lado, nenhuma expressão de WISP-1 humana foi encontrada nos tumores excisados. Além disso, os tumores revelaram uma coloração forte para α-actina de músculo liso e uma coloração fraca para vimentina sobre o estroma tumoral em reações por imuno- histoquímica. Estes resultados indicam que a inoculação das células HPAC em camundongos nude induz o recrutamento de um estroma miofibroblástico no qual o WISP-1 é expresso.

Exemplo 27

Um estudo animal foi conduzido para avaliar a eficácia in vivo do WISP-1 -domínio-1 em retardar o crescimento tumoral. O WISP-1_1 e WISP-1 - _12 humano, construídos clonados em um vetor de expressão (pIRES Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) foram transfectados na linhagem de células de adenocarcinoma pancreático humano HPAC. Após 48 horas, os meios de cultura foram suplementados com 2 μg/m! puromicina. Após 2 semanas, os pools de células que expressavam foram analisados e as linhagens de células resultantes foram mantidas nos meios 50:50 (mistura 1:1 do meio F-12 de HAM e DME) suplementada com o 10% de soro bovino fetal (FBS) e o 2 pg/ml puromicina.

A eficácia in vivo do WISP-1 -domínio-1 em retardar o crescimento tumoral foi avaliada injetando 5x106 células (HPAC/WISP-1_12, HPAC/WISP-1_1) subcutaneamente camundongos nude fêmeas de 6-8 semanas de idade (10 camundongos/grupo). O volume dos tumores foi medido duas vezes por semana até o 25° dia. Os resultados demonstram que a expressão de WISP-1_1 ou WISP- 1_12 em células HPAC retarda o seu crescimento in vivo. O volume do tumor das células HPAC/WISP-1 _12 e HPAC/WISP-1_1 foi 12% e 54% menor comparado respectivamente aos tumores de células HPAC controle (Fig. 30). Estes resultados indicam que o WISP-1-domínio-1 e WISP-1- domínio-12 expressos por células HPAC retardam o crescimento do tumor possivelmente antagonizando a atividade promovida pelo WISP-1 de camundongo.

Exemplo 28

Estudos por hibridização in situ foram conduzidos para avaliar a expressão de WISP-1 em adenocarcinomas pancreáticos primários humanos. Utilizando um microarranjo de tumores (TMA), mostrou-se que 68% (125/184) dos núcleos das amostras eram positivos para a expressão de WISP-1. Além disso, nestas amostras a expressão de WISP-1 foi restrita ao compartimento estromal (Fig. 31). Estes resultados indicam uma incidência elevada da expressão de WISP-1 no compartimento estromal de tumores pancreáticos primários humanos.

Exemplo 29

A coloração por Imuno-histoquímica foi conduzida para avaliar a expressão de WISP-1 em adenocarcinomas primários de cólon. Um painel de 15 amostras de adenocarcinomas primários humanos foi corado para WISP-1 usando um anticorpo policlonal de cabra específico para WISP-1 (R&D systems; cat. No. AF1627). A WISP-1 foi detectada em 100% (15/15) das amostras analisadas. Em todos os casos a WISP-1 estava situada no compartimento estromal que cerca os tumores (Fig. 32). Estes resultados indicam que WISP-1 é prevalente no compartimento estromal de adenocarcinomas de cólon humano.

Construções de WISP-1:

Domínio 2,3:

GAATTCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGACGCTGGCAGCAGTGACAGC AGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACTGCAGTGGTCGGTGTGGGCTGC GTCCTGGATGGGGTGCGCTACAACAACGGCCAGTCCTTCCAGCCTAACTG CAAGTACAACTGCACGTGCATCGACGGCGCGGTGGGCTGCACACCACTG TGCCTCCGAGTGCGCCCCCCGCGTCTCTGGTGCCCCCACCCGCGGCGCG TGAGCATACCTGGCCACTGCTGTGAGCAGTGGGTATGTGAGGACGACGC CAAGAGGCCACGCAAGACCGCACCCCGTGACACAGGAGCCTTCGATGCT GTGGGTGAGGTGGAGGCATGGCACAGGAACTGCATAGCCTACACAAGCC CCTGGAGCCCTTGCTCCACCAGCTGCGGCCTGGGGGTCTCCACTCGGAT CTCCAATGTTAACGCCCAGTGCTGGCCTGAGCAAGAGAGCCGCCTCTGCA ACTTGCGGCCATGCGATGTGGACATCCATACACTCATTAAGGCGGCCGCA CACCACCATCACCATCACCATCACTAAGTGAGGCCGCATAGATAACTGATC CAGTGTGCTGGAATTAATTCGCTGTCTGCGA (SEQ ID N0:21)

Domínio 1-IgG:

CCTCGGTTCTATCGATTGAATTCCACCATGAGGTGGTTCCTGCCCTGGAC GCTGGCAGCAGTGACAGCAGCAGCCGCCAGCACCGTCCTGGCCACGGCC CTCTCTCCAGCCCCTACGACCATGGACTTTACTCCAGCTCCACTGGAGGA CACCTCCTCACGCCCCCAATTCTGCAAGTGGCCATGTGAGTGCCCGCCAT CCCCACCCCGCTGCCCGCTGGGGGTCAGCCTCATCACAGATGGCTGTGA GTGCTGTAAGATGTGCGCTCAGCAGCTTGGGGACAACTGCACGGAGGCT GCCATCTGTGACCCCCACCGGGGCCTCTACTGTGACTACAGCGGGGACC GCCCGAGGTACGCAATAGGAGTGTGTGCACAGGTGGTCGGTGTGGGGGT CACCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGG GGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATG ATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACG AAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCAT AATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTG TGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGA GTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTG CCCCCATCCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCT GGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGA CGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGC AGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAAC CACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACG GCCCTAGAGTCGACCTGCAGAAGCTTGGCCGCCATGGCCC(SEQ ID NO:22)

Depósito De Material

Os materiais a seguir foram depositados na Coleção Norte- Americana de culturas de Tipos, 10801 University Blvd., Manassas VA 20110- 2209, Estados Unidos (ATCC):

Material Dep. ATCC N0 Data de Depósito

3D11.D7 PTA-4624 Sept. 4, 2002

11C2.C10 PTA-4628 Sept. 4,2002

9C10.F5 PTA-4626 Sept. 4,2002

5D4.F6 PTA-4625 Sept. 4,2002

9C11.C7 PTA-4627 Sept. 4,2002

Este depósito foi realizado com base nas disposições do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimentos de Patentes e as Regulamentações com base nele (Tratado de Budapeste). Isso garante a manutenção de uma cultura viável do depósito por 30 anos a partir da data do depósito. O depósito será disponibilizado pela ATCC com base nos termos do Tratado de Budapeste e sujeito a um acordo entre a Genentech, Inc. e a ATCC, que garante a disponibilidade permanente e irrestrita da progênie da cultura do depósito ao público mediante emissão da patente US correspondente ou mediante a abertura ao público de qualquer pedido de patente norte-americano ou estrangeiro, o que ocorrer primeiro, e garante a disponibilidade da progênie às partes determinadas pelo Comissário de Patentes e Marcas Comerciais dos Estados Unidos com direito a tal, de acordo com 35 USC 122 e as regras do Comissário a este respeito (incluindo 37 CFR 1.14, com referência específica a 886 OG 638).

O cessionário do presente pedido concordou que, se uma cultura dos materiais em depósito morrer ou for perdido ou destruído quando cultivado sob condições apropriadas, os materiais serão imediatamente substituídos mediante notificação por outro idêntico. A disponibilidade do material depositado não deve ser considerada como licença para a prática da presente invenção em contravenção dos direitos concedidos com base na autoridade de qualquer governo de acordo com as suas leis de patentes.

O antecedente descritivo acima é considerado suficiente para permitir que os técnicos no assunto pratiquem a presente invenção. A presente invenção não deve ter seu escopo limitado pelo exemplo apresentado no presente. Na realidade, várias modificações da presente invenção, além das exibidas e descritas no presente, tornar-se-ão evidentes para os técnicos no assunto a partir do relatório descritivo acima e se encontrarão dentro do escopo das reivindicações anexas. Listagem de Seqüências

<110> LUC DESNOYERS

ELLEN FILVAROFF

<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA A MODULAÇÃO E DETECÇÃO DA ATIVIDADE DE WISP

<130> P1918R1P1

<140> US 11/105,876

<150> US 10/519,621 <151> 28-12-2004

<150> US 60/392,652 <151> 29-06-2002

<150> US 60/408,739 <151> 06-09-2002

<160> 22

<210> 1 <211> 367 <212> PRT

<213> Homo sapiens <4 00> 1

Met Arg Trp Phe Leu Pro Trp Thr Leu Ala Ala Val Thr Ala Ala 15 10 15

Ala Ala Ser Thr Val Leu Ala Thr Ala Leu Ser Pro Ala Pro Thr 20 25 30

Thr Met Asp Phe Thr Pro Ala Pro Leu Glu Asp Thr Ser Ser Arg 35 40 45

Pro Gln Phe Cys Lys Trp Pro Cys Glu Cys Pro Pro Ser Pro Pro 50 55 60

Arg Cys Pro Leu Gly Val Ser Leu Ile Thr Asp Gly Cys Glu Cys 65 70 75

Cys Lys Met Cys Ala Gln Gln Leu Gly Asp Asn Cys Thr Glu Ala 80 85 90

Ala Ile Cys Asp Pro His Arg Gly Leu Tyr Cys Asp Tyr Ser Gly 95 100 105

Asp Arg Pro Arg Tyr Ala Ile Gly Val Cys Ala Gln Val Val Gly 110 115 120

Val Gly Cys Val Leu Asp Gly Val Arg Tyr Asn Asn Gly Gln Ser 125 130 135

Phe Gln Pro Asn Cys Lys Tyr Asn Cys Thr Cys Ile Asp Gly Ala 140 145 150 Val Gly Cys Thr Pro Leu Cys Leu Arg Val Arg Pro Pro Arg Leu 155 160 165

Trp Cys Pro His Pro Arg Arg Val Ser Ile Pro Gly His Cys Cys 170 175 180

Glu Gln Trp Val Cys Glu Asp Asp Ala Lys Arg Pro Arg Lys Thr 185 190 195

Ala Pro Arg Asp Thr Gly Ala Phe Asp Ala Val Gly Glu Val Glu 200 205 210

Ala Trp His Arg Asn Cys Ile Ala Tyr Thr Ser Pro Trp Ser Pro 215 220 225

Cys Ser Thr Ser Cys Gly Leu Gly Val Ser Thr Arg Ile Ser Asn 230 235 240

Val Asn Ala Gln Cys Trp Pro Glu Gln Glu Ser Arg Leu Cys Asn 245 250 255

Leu Arg Pro Cys Asp Val Asp Ile His Thr Leu Ile Lys Ala Gly 260 265 270

Lys Lys Cys Leu Ala Val Tyr Gln Pro Glu Ala Ser Met Asn Phe 275 280 285

Thr Leu Ala Gly Cys Ile Ser Thr Arg Ser Tyr Gln Pro Lys Tyr 290 295 300

Cys Gly Val Cys Met Asp Asn Arg Cys Cys Ile Pro Tyr Lys Ser 305 310 315

Lys Thr Ile Asp Val Ser Phe Gln Cys Pro Asp Gly Leu Gly Phe 320 325 330

Ser Arg Gln Val Leu Trp Ile Asn Ala Cys Phe Cys Asn Leu Ser 335 340 345

Cys Arg Asn Pro Asn Asp Ile Phe Ala Asp Leu Glu Ser Tyr Pro 350 355 360

Asp Phe Ser Glu Ile Ala Asn 365

<210> 2 <211> 2830 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 2

cccacgcgtc cgctgggccc agctcccccg agaggtggtc ggatcctctg 50

ggctgctcgg tcgatgcctg tgccactgac gtccaggcat gaggtggttc 100

ctgccctgga cgctggcagc agtgacagca gcagccgcca gcaccgtcct 150

ggccacggcc ctctctccag cccctacgac catggacttt actccagctc 200 cactggagga cacctcctca cgcccccaat tctgcaagtg gccatgtgag 250 tgcccgccat ccccaccccg ctgcccgctg ggggtcagcc tcatcacaga 300 tggctgtgag tgctgtaaga tgtgcgctca gcagcttggg gacaactgca 350 cggaggctgc catctgtgac ccccaccggg gcctctactg tgactacagc 400 ggggaccgcc cgaggtacgc aataggagtg tgtgcacagg tggtcggtgt 450 gggctgcgtc ctggatgggg tgcgctacaa caacggccag tccttccagc 500 ctaactgcaa gtacaactgc acgtgcatcg acggcgcggt gggctgcaca 550 ccactgtgcc tccgagtgcg ccccccgcgt ctctggtgcc cccacccgcg 600 gcgcgtgagc atacctggcc actgctgtga gcagtgggta tgtgaggacg 650 acgccaagag gccacgcaag accgcacccc gtgacacagg agccttcgat 700 gctgtgggtg aggtggaggc atggcacagg aactgcatag cctacacaag 750 cccctggagc ccttgctcca ccagctgcgg cctgggggtc tccactcgga 800 tctccaatgt taacgcccag tgctggcctg agcaagagag ccgcctctgc 850 aacttgcggc catgcgatgt ggacatccat acactcatta aggcagggaa 900 gaagtgtctg gctgtgtacc agccagaggc atccatgaac ttcacacttg 950 cgggctgcat cagcacacgc tcctatcaac ccaagtactg tggagtttgc 1000 atggacaata ggtgctgcat cccctacaag tctaagacta tcgacgtgtc 1050 cttccagtgt cctgatgggc ttggcttctc ccgccaggtc ctatggatta 1100 atgcctgctt ctgtaacctg agctgtagga atcccaatga catctttgct 1150 gacttggaat cctaccctga cttctcagaa attgccaact aggcaggcac 1200 aaatcttggg tcttggggac taacccaatg cctgtgaagc agtcagccct 1250 tatggccaat aacttttcac caatgagcct tagttaccct gatctggacc 1300 cttggcctcc atttctgtct ctaaccattc aaatgacgcc tgatggtgct 1350 gctcaggccc atgctatgag ttttctcctt gatatcattc agcatctact 1400 ctaaagaaaa atgcctgtct ctagctgttc tggactacac ccaagcctga 1450 tccagccttt ccaagtcact agaagtcctg ctggatcttg cctaaatccc 1500 aagaaatgga atcaggtaga cttttaatat cactaatttc ttctttagat 1550 gccaaaccac aagactcttt gggtccattc agatgaatag atggaatttg 1600 gaacaataga ataatctatt atttggagcc tgccaagagg tactgtaatg 1650 ggtaattctg acgtcagcgc accaaaacta tcctgattcc aaatatgtat 1700 gcacctcaag gtcatcaaac atttgccaag tgagttgaat agttgcttaa 1750

ttttgatttt taatggaaag ttgtatccat taacctgggc attgttgagg 1800

ttaagtttct cttcacccct acactgtgaa gggtacagat taggtttgtc 1850

ccagtcagaa ataaaatttg ataaacattc ctgttgatgg gaaaagcccc 1900

cagttaatac tccagagaca gggaaaggtc agcccatttc agaaggacca 1950

attgactctc acactgaatc agctgctgac tggcagggct ttgggcagtt 2000

ggccaggctc ttccttgaat cttctccctt gtcctgcttg ggttcatagg 2050

aattggtaag gcctctggac tggcctgtct ggcccctgag agtggtgccc 2100

tggaacactc ctctactctt acagagcctt gagagaccca gctgcagacc 2150

atgccagacc cactgaaatg accaagacag gttcaggtag gggtgtgggt 2200

caaaccaaga agtgggtgcc cttggtagca gcctggggtg acctctagag 2250

ctggaggctg tgggactcca ggggcccccg tgttcaggac acatctattg 2300

cagagactca tttcacagcc tttcgttctg ctgaccaaat ggccagtttt 2350

ctggtaggaa gatggaggtt taccagttgt ttagaaacag aaatagactt 2400

aataaaggtt taaagctgaa gaggttgaag ctaaaaggaa aaggttgttg 2450

ttaatgaata tcaggctatt atttattgta ttaggaaaat ataatattta 2500

ctgttagaat tcttttattt agggcctttt ctgtgccaga cattgctctc 2550

agtgctttgc atgtattagc tcactgaatc ttcacgacaa tgttgagaag 2600

ttcccattat tatttctgtt cttacaaatg tgaaacggaa gctcatagag 2650

gtgagaaaac tcaaccagag tcacccagtt ggtgactggg aaagttagga 2700

ttcagatcga aattggactg tctttataac ccatattttc cccctgtttt 2750

tagagcttcc aaatgtgtca gaataggaaa acattgcaat aaatggcttg 2800

attttttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2830

<210> 3 <211> 440 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 3

gaattcacca tgaggtggtt cctgccctgg acgctggcag cagtgacagc 50 agcagccgcc agcaccgtcc tggccacggc cctctctcca gcccctacga 100 ccatggactt tactccagct ccactggagg acacctcctc acgcccccaa 150 ttctgcaagt ggccatgtga gtgcccgcca tccccacccc gctgcccgct 200 gggggtcagc ctcatcacag atggctgtga gtgctgtaag atgtgcgctc 250

agcagcttgg ggacaactgc acggaggctg ccatctgtga cccccaccgg 300

ggcctctact gtgactacag cggggaccgc ccgaggtacg caataggagt 350

gtgtgcacag gcggccgcac accaccatca ccatcaccat cactaagtga 400

ggccgcatag ataactgatc cagtgtgctg gaattaattc 440

<210> 4 <211> 340 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 4

gaattcacca tgaggtggtt cctgccctgg acgctggcag cagtgacagc 50 agcagccgcc agcaccgtcc tggccactgc agtggtcggt gtgggctgcg 100 tcctggatgg ggtgcgctac aacaacggcc agtccttcca gcctaactgc 150 aagtacaact gcacgtgcat cgacggcgcg gtgggctgca caccactgtg 200 cctccgagtg cgccccccgc gtctctggtg cccccacccg cggcgcgtga 250 gcatacctgg ccactgctgt gagcagtggg tatgtgcggc cgcacaccac 300 catcaccatc accatcacta agtgaggccg catagataac 340

<210> 5 <211> 321 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 5

gaattcacca tgaggtggtt cctgccctgg acgctggcag cagtgacagc 50

agcagccgcc agcaccgtcc tggccactgc agcatggcac aggaactgca 100

tagcctacac aagcccctgg agcccttgct ccaccagctg cggcctgggg 150

gtctccactc ggatctccaa tgttaacgcc cagtgctggc ctgagcaaga 200

gagccgcctc tgcaacttgc ggccatgcga tgtggacatc catacactca 250

ttaaggcggc cgcacaccac catcaccatc accatcacta agtgaggccg 300

catagataac tgatccagtg t 321

<210> 6 <211> 442 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 6

gaattcacca tgaggtggtt cctgccctgg acgctggcag cagtgacagc 50 agcagccgcc agcaccgtcc tggccactgc agggaagaag tgtctggctg 100 tgtaccagcc agaggcatcc atgaacttca cacttgcggg ctgcatcagc 150

acacgctcct atcaacccaa gtactgtgga gtttgcatgg acaataggtg 200

ctgcatcccc tacaagtcta agactatcga cgtgtccttc cagtgtcctg 250

atgggcttgg cttctcccgc caggtcctat ggattaatgc ctgcttctgt 300

aacctgagct gtaggaatcc caatgacatc tttgctgact tggaatccta 350

ccctgacttc tcagaaattg ccaacgcggc cgcacaccac catcaccatc 400

accatcacta agtgaggccg catagataac tgatccagtg tg 442

<210> 7 <211> 619 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 7

gaattcacca tgaggtggtt cctgccctgg acgctggcag cagtgacagc 50 agcagccgcc agcaccgtcc tggccacggc cctctctcca gcccctacga 100 ccatggactt tactccagct ccactggagg acacctcctc acgcccccaa 150 ttctgcaagt ggccatgtga gtgcccgcca tccccacccc gctgcccgct 200 gggggtcagc ctcatcacag atggctgtga gtgctgtaag atgtgcgctc 250 agcagcttgg ggacaactgc acggaggctg ccatctgtga cccccaccgg 300 ggcctctact gtgactacag cggggaccgc ccgaggtacg caataggagt 350 gtgtgcacag gtggtcggtg tgggctgcgt cctggatggg gtgcgctaca 400 acaacggcca gtccttccag cctaactgca agtacaactg cacgtgcatc 450 gacggcgcgg tgggctgcac accactgtgc ctccgagtgc gccccccgcg 500 tctctggtgc ccccacccgc ggcgcgtgag catacctggc cactgctgtg 550 agcagtgggt atgtgcggcc gcacaccacc atcaccatca ccatcactaa 600 gtgaggccgc atagataac 619

<210> 8

<211> 885

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 8

gaattcacca tgaggtggtt cctgccctgg acgctggcag cagtgacagc 50 agcagccgcc agcaccgtcc tggccacggc cctctctcca gcccctacga 100 ccatggactt tactccagct ccactggagg acacctcctc acgcccccaa 150 ttctgcaagt ggccatgtga gtgcccgcca tccccacccc gctgcccgct 200 gggggtcagc ctcatcacag atggctgtga gtgctgtaag atgtgcgctc 250 agcagcttgg ggacaactgc acggaggctg ccatctgtga cccccaccgg 300 ggcctctact gtgactacag cggggaccgc ccgaggtacg caataggagt 350 gtgtgcacag gtggtcggtg tgggctgcgt cctggatggg gtgcgctaca 400 acaacggcca gtccttccag cctaactgca agtacaactg cacgtgcatc 450 gacggcgcgg tgggctgcac accactgtgc ctccgagtgc gccccccgcg 500 tctctggtgc ccccacccgc ggcgcgtgag catacctggc cactgctgtg 550 agcagtgggt atgtgaggac gacgccaaga ggccacgcaa gaccgcaccc 600 cgtgacacag gagccttcga tgctgtgggt gaggtggagg catggcacag 650 gaactgcata gcctacacaa gcccctggag cccttgctcc accagctgcg 700 gcctgggggt ctccactcgg atctccaatg ttaacgccca gtgctggcct 750 gagcaagaga gccgcctctg caacttgcgg ccatgcgatg tggacatcca 800 tacactcatt aaggcggccg cacaccacca tcaccatcac catcactaag 850 tgaggccgca tagataactg atccagtgtg ctgga 885 <210> 9 <211> 1014 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gaattcacca tgaggtggtt cctgccctgg acgctggcag cagtgacagc 50 agcagccgcc agcaccgtcc tggccacggc cctctctcca gcccctacga 100 ccatggactt tactccagct ccactggagg acacctcctc acgcccccaa 150 ttctgcaagt ggccatgtga gtgcccgcca tccccacccc gctgcccgct 200 gggggtcagc ctcatcacag atggctgtga gtgctgtaag atgtgcgctc 250 agcagcttgg ggacaactgc acggaggctg ccatctgtga cccccaccgg 300 ggcctctact gtgactacag cggggaccgc ccgaggtacg caataggagt 350 gtgtgcacag gtggtcggtg tgggctgcgt cctggatggg gtgcgctaca 400 acaacggcca gtccttccag cctaactgca agtacaactg cacgtgcatc 450 gacggcgcgg tgggctgcac accactgtgc ctccgagtgc gccccccgcg 500 tctctggtgc ccccacccgc ggcgcgtgag catacctggc cactgctgtg 550 agcagtgggt atgtctgcag gcagggaaga agtgtctggc tgtgtaccag 600 ccagaggcat ccatgaactt cacacttgcg ggctgcatca gcacacgctc 650 ctatcaaccc aagtactgtg gagtttgcat ggacaatagg tgctgcatcc 700 cctacaagtc taagactatc gacgtgtcct tccagtgtcc tgatgggctt 750 ggcttctccc gccaggtcct atggattaat gcctgcttct gtaacctgag 800 ctgtaggaat cccaatgaca tctttgctga cttggaatcc taccctgact 850 tctcagaaat tgccaacgcg gccgcacacc accatcacca tcaccatcac 900 taagtgaggc cgcatagata actgatccag tgtgctggaa ttaattcgct 950 gtctgcgagg gccagctgtt ggggtgagta ctccctctca aaagcgggca 1000 tgacttctgc gcta 1014

<210> 10 <211> 904 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 10

gaattcacca tgaggtggtt cctgccctgg acgctggcag cagtgacagc 50 agcagccgcc agcaccgtcc tggccacggc cctctctcca gcccctacga 100 ccatggactt tactccagct ccactggagg acacctcctc acgcccccaa 150 ttctgcaagt ggccatgtga gtgcccgcca tccccacccc gctgcccgct 200 gggggtcagc ctcatcacag atggctgtga gtgctgtaag atgtgcgctc 250 agcagcttgg ggacaactgc acggaggctg ccatctgtga cccccaccgg 300 ggcctctact gtgactacag cggggaccgc ccgaggtacg caataggagt 350 gtgtgcgcat gctgtgggtg aggtggaggc atggcacagg aactgcatag 400 cctacacaag cccctggagc ccttgctcca ccagctgcgg cctgggggtc 450 tccactcgga tctccaatgt taacgcccag tgctggcctg agcaagagag 500 ccgcctctgc aacttgcggc catgcgatgt ggacatccat acactcatta 550 aggcagggaa gaagtgtctg gctgtgtacc agccagaggc atccatgaac 600 ttcacacttg cgggctgcat cagcacacgc tcctatcaac ccaagtactg 650 tggagtttgc atggacaata ggtgctgcat cccctacaag tctaagacta 700 tcgacgtgtc cttccagtgt cctgatgggc ttggcttctc ccgccaggtc 750 ctatggatta atgcctgctt ctgtaacctg agctgtagga atcccaatga 800 catctttgct gacttggaat cctaccctga cttctcagaa attgccaacg 850 cggccgcaca ccaccatcac catcaccatc actaagtgag gccgcataga 900

taac 904 <210> 11 <211> 922 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 11

gaattcacca tgaggtggtt cctgccctgg acgctggcag cagtgacagc 50 agcagccgcc agcaccgtcc tggccactgc agtggtcggt gtgggctgcg 100 tcctggatgg ggtgcgctac aacaacggcc agtccttcca gcctaactgc 150 aagtacaact gcacgtgcat cgacggcgcg gtgggctgca caccactgtg 200 cctccgagtg cgccccccgc gtctctggtg cccccacccg cggcgcgtga 250 gcatacctgg ccactgctgt gagcagtggg tatgtgagga cgacgccaag 300 aggccacgca agaccgcacc ccgtgacaca ggagccttcg atgctgtggg 350 tgaggtggag gcatggcaca ggaactgcat agcctacaca agcccctgga 400 gcccttgctc caccagctgc ggcctggggg tctccactcg gatctccaat 450 gttaacgccc agtgctggcc tgagcaagag agccgcctct gcaacttgcg 500 gccatgcgat gtggacatcc atacactcat taaggcaggg aagaagtgtc 550 tggctgtgta ccagccagag gcatccatga acttcacact tgcgggctgc 600 atcagcacac gctcctatca acccaagtac tgtggagttt gcatggacaa 650 taggtgctgc atcccctaca agtctaagac tatcgacgtg tccttccagt 700 gtcctgatgg gcttggcttc tcccgccagg tcctatggat taatgcctgc 750 ttctgtaacc tgagctgtag gaatcccaat gacatctttg ctgacttgga 800 atcctaccct gacttctcag aaattgccaa cgcggccgca caccaccatc 850 accatcacca tcactaagtg aggccgcata gataactgat ccagtgtgct 900 ggaattaatt cgctgtctgc ga 922

<210> 12 <211> 19 <212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 12 ggctgccatc tgtgaccca 19

<210> 13 <211> 21 <212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 13 cataggacct gccgggagaa a 21 <210> 14 <211> 19 <212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 14 gccgtggcag tcctgaggg 19

<210> 15 <211> 21 <212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 15 cagcaccggg cattgacgtt a 21

<210> 16 <211> 21 <212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 16 tggagaaaaa tggccgctac a 21

<210> 17 <211> 20 <212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 17 tggggtgctc ttctcgatgg 20

<210> 18 <211> 21 <212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 18 ggacaaatcg gccacgtaca t 21

<210> 19 <211> 19 <212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 19 cttgctccat cgggtctgc 19

<210> 20 <211> 42 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 20

Glu Gln Trp Val Cys Glu Asp Asp Ala Lys Arg Pro Arg Lys Thr 15 10 15

Ala Pro Arg Asp Thr Gly Ala Phe Asp Ala Val Gly Glu Val Glu 20 25 30 Ala Trp His Arg Asn Cys Ile Ala Tyr Thr Ser Pro 35 40

<210> 21 <211> 625 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 21

gaattcacca tgaggtggtt cctgccctgg acgctggcag cagtgacagc 50 agcagccgcc agcaccgtcc tggccactgc agtggtcggt gtgggctgcg 100 tcctggatgg ggtgcgctac aacaacggcc agtccttcca gcctaactgc 150 aagtacaact gcacgtgcat cgacggcgcg gtgggctgca caccactgtg 200 cctccgagtg cgccccccgc gtctctggtg cccccacccg cggcgcgtga 250 gcatacctgg ccactgctgt gagcagtggg tatgtgagga cgacgccaag 300 aggccacgca agaccgcacc ccgtgacaca ggagccttcg atgctgtggg 350 tgaggtggag gcatggcaca ggaactgcat agcctacaca agcccctgga 400 gcccttgctc caccagctgc ggcctggggg tctccactcg gatctccaat 450 gttaacgccc agtgctggcc tgagcaagag agccgcctct gcaacttgcg 500 gccatgcgat gtggacatcc atacactcat taaggcggcc gcacaccacc 550 atcaccatca ccatcactaa gtgaggccgc atagataact gatccagtgt 600

gctggaatta attcgctgtc tgcga 625

<210> 22 <211> 1131 <212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 22

cctcggttct atcgattgaa ttccaccatg aggtggttcc tgccctggac 50 gctggcagca gtgacagcag cagccgccag caccgtcctg gccacggccc 100 tctctccagc ccctacgacc atggacttta ctccagctcc actggaggac 150 acctcctcac gcccccaatt ctgcaagtgg ccatgtgagt gcccgccatc 200 cccaccccgc tgcccgctgg gggtcagcct catcacagat ggctgtgagt 250 gctgtaagat gtgcgctcag cagcttgggg acaactgcac ggaggctgcc 300 atctgtgacc cccaccgggg cctctactgt gactacagcg gggaccgccc 350 gaggtacgca ataggagtgt gtgcacaggt ggtcggtgtg ggggtcaccg 400 acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 450 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc 500 ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc 550 ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 600 aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag 650 cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt 700 gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 750 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc 800 ccgggaagag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag 850 gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 900 gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt 950 cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga 1000 acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1050 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgagtgcgac ggccctagag 1100

tcgacctgca gaagcttggc cgccatggcc c 1131

Claims (15)

1. USO DE UM POLIPETÍDEO DE DOMÍNIO 1 DO WISP-1, consistindo essencialmente dos aminoácidos 24-117 da SEQ ID NO: 1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para inibir ou neutralizar a indução ou secreção de HAS2, HA, CD44 ou RHAMM por WISP-1 em células de mamíferos.

2. USO DE UM POLIPETÍDEO DE DOMÍNIO 1 DO WISP-1, consistindo essencialmente de um polipeptídeo com pelo menos cerca de 95% de identidade aos aminoácidos 24-117 da SEQ ID NO: 1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para inibir ou neutralizar a indução ou secreção de HAS2, HA, CD44 ou RHAMM por WISP-1 em células de mamíferos.

3. USO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de domínio 1 do WISP-1 é ligado a uma região Fc de uma imunoglobulina.

4. USO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as referidas células de mamíferos compreendem células de câncer pancreático, células de câncer de cólon ou colo-retais, células de câncer de mama, células de câncer de pulmão ou células de câncer cerebral.

5. USO DE UM POLIPETÍDEO DE DOMÍNIO 1 DO WISP-1, consistindo essencialmente dos aminoácidos 24-117 da SEQ ID NO: 1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para inibir motilidade de célula cancerosa.

6. USO DE UM POLIPETÍDEO DE DOMÍNIO 1 DO WISP-1, consistindo essencialmente de um polipeptídeo com pelo menos cerca de 95% de identidade aos aminoácidos 24-117 da SEQ ID NO: 1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para inibir motilidade de célula cancerosa.

7. USO, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de domínio 1 do WISP-1 é ligado a uma região Fc de uma imunoglobulina.

8. USO, de acordo com uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que a referida célula cancerosa é uma célula de câncer pancreático, célula de câncer de cólon ou colorretal, célula de câncer de mama, célula de câncer de pulmão ou célula de câncer cerebral.

9. USO DE UM POLIPETÍDEO DE DOMÍNIO 1 DO WISP-1, consistindo essencialmente dos aminoácidos 24-117 da SEQ ID NO: 1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratar câncer.

10. USO DE UM POLIPETÍDEO DE DOMÍNIO 1 DO WISP-1, consistindo essencialmente de um polipeptídeo com pelo menos cerca de 95% de identidade aos aminoácidos 24-117 da SEQ ID NO 1, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratar câncer.

11. USO, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de domínio 1 do WISP-1 é ligado a uma região Fc de uma imunoglobulina.

12. USO, de acordo com uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o referido câncer é um câncer pancreático, câncer de cólon ou colorretal, câncer de mama, câncer de pulmão ou câncer cerebral.

13. USO, de acordo com uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo inibe ou reduz metástase ou crescimento de células cancerosas.

14. USO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo inibe ou reduz metástase de célula câncer de pulmão em um local no mamífero secundário ou diferente do local do tumor de pulmão primário no mamífero.

15. USO, de acordo com uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o referido polipeptídeo inibe ou neutraliza a indução ou secreção de HAS2, HA, CD44 ou RHAMM pelo polipeptídeo WISP- -1 nativo humano em pelo menos um tipo de célula de mamífero.