BRPI0612367A2 - solução para a marcação de células ou de tecidos, kit, método de marcação ex vivo de células ou de um tecido, uso de uma solução e método de diagnóstico in vitro de um cáncer ou de uma displasia - Google Patents

Abstract

SOLUçãO PARA A MARCAçãO DE CELULAS OU DE TECIDOS, KIT, MéTODO DE MARCAçãO EX WVO DE CéLULAS OU DE UM TECIDO, USO DE UMA SOLUçãO E MéTODO DE DIAGNóSTICO IN VITRO DE UM CáNCER OU DE UMA DISPLASIA. A presente invenção refere-se à combinação, em uma solução ou em um kit, de um fixador biológico ou citológico, e de um ou mais compostos fotoativáveis da familia das quinonas, em particular a hipericina, a hipocrelina A e/ou a hipocrelina B. A presente invenção refere-se também a um método de marcação de células ou tecidos por um ou mais compostos fotoativáveis da familia das quinonas, no qual as células ou tecidos postos em contato com um fixador histológico ou citológico são marcados, simultaneamente ou depois, pelo ou pelos compostos fotoativáveis da família das quinonas.

Description

"SOLUÇÃO PARA A MARCAÇÃO DE CÉLULAS OU DE TECIDOS, KIT,MÉTODO DE MARCAÇÃO EX VIVO DE CÉLULAS OU DE UM TECIDO, USODE UMA SOLUÇÃO E MÉTODO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO DE UMCÂNCER OU DE UMA DISPLASIA"

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se à combinação, em uma solução ouem um kit, de uma fixador histológico ou citológico, e de um ou mais compostosfotoativáveis da família das quinonas.

A presente invenção refere-se também a um método demarcação de células ou tecidos com um ou mais compostosfotoativáveis da família das quinonas, no qual as células ou tecidospostos em contato com um fixador histológico ou citológico são marcados,simultaneamente ou depois, pelo ou pelos compostos fotoativáveis dafamília das quinonas.

Antecedentes da Invenção

Entre os compostos ativados da família das quinonas, pode-secitar em particular quinonas policíclicas tais como a hipericina, a hipocrelina Aou a hipocrelina B, ou seus derivados.

O termo "derivado" significa um composto modificadoquimicamente no qual a modificação é considerada como rotina pelo químicode competências normais, tal como um éster ou uma amida de um ácido,grupos de proteção, tais como um grupo benzila para um álcool ou um tiol, eum grupo terc-butoxicarbonila para uma amina.

A hipocrelina A (1H-ciclo-hepta[ghi]perileno-5,11-diona, 1-acetil-2,3-di-hidro-2,6,12-tri-hid róxi-4,8,9,13-tetrametóxi-2-metil-cis) e a hipocrelina B(1H-ciclo-hepta[ghi]perileno-5,12-diona, 3-acetil-6,11-di-hidróxi-4,8,9,13-tetrametóxi-2-metil) são quinonas isoladas a partir dos fungos Hypocrellabambusae e Shiraia bambusicola.<formula>formula see original document page 3</formula>

Esses pigmentos são utilizados em combinação com umafototerapia para o tratamento de diversas doenças da pele. Recentementeforam identificadas propriedades antivirais e mostrou-se que essas quinonasconstituem fotossensibilizadores potentes no tratamento fotodinâmico docâncer (Hirayama et al., 1997; Zhang et al., 1998).

Os valores máximos de absorção e de emissão de fluorescência,medidos no metanol, são respectivamente 463 nm e 600 nm para a hipocrelinaA1 e 459 nm e 616 nm para a hipocrelina B.

A hipericina tem por fórmula química 1,3,4,6,8,13-hexa-hidróxi-10,11-dimetilfenantrol(1,10l9l8Iopqra)perileno-7l14-diona:

A hipericina é um pigmento natural isolado de plantas do gêneroHypericum que constitui um inibidor seletivo potente da proteína cinase C.

A hipericina apresenta uma diversidade de propriedadesfarmacológicas que vão desde uma atividade bacteriana ou antiviral a umaatividade antineoplásica e à indução do apoptose. A hipericina é conhecida delonga data por seus efeitos fotossensibilizadores e como insumo nacomposição de um antidepressivo (o millepertuis).É uma molécula fluorescente que apresenta um máximo deabsorção de 581 nm e um máximo de emissão de fluorescência de 594 nm,medido no etanol.

Mostrou-se que a hipericina perfundida na bexiga se acumulaseletivamente nas células carcinomatosas uroteliais. Essa característica, associadaa suas propriedades fotossensibilizadoras e fluorescentes, levou muitas equipes apropor um diagnóstico do câncer de bexiga por citologia de fluorescência ex vivo(Olivo et a!., 2003a; Olivo et al., 2003b; Pytel et Schmeller, 2002). O uso dehipericina como tratamento fotodinâmico das lesões carcinomatosas da bexiga foitambém proposto (Kamuhabwa et al., 2004). Esses métodos implicam a infusão invivo de hipericina na bexiga do paciente.

É também conhecido que a hipericina é uma molécula lipófila quepode ser incorporada à bicamada lipídica das membranas celulares. Osmecanismos exatos de integração não são conhecidos mas supõe-se que essaintegração é mediada por um transporte ativo. Por isso, atualmente a hipericinasó foi utilizada em células vivas.

Até hoje, era de fato considerado necessário praticar umamarcação com hipericina em células vivas, por exemplo, cultivando in vitrocélulas em uma solução que contém a hipericina, ou ainda colocando ahipericina extemporaneamente em contato com células ou tecidosrecentemente retirados, de modo que a hipericina possa ser incorporada pelascélulas vivas.

Contra qualquer expectativa, o inventor demonstrou agora que ahipericina, misturada com um fixador, é incorporada muito rapidamente porcélulas tumorais colocadas em suspensão na mistura fixador/hipericina, mesmoque as células tenham sido mortas pelo contato com o fixador. A colocação emevidência do fato da hipericina ser fixada com a mesma eficácia pelas células,mortas ou vivas, abre novas possibilidades para a marcação citológica ouhistológica com hipericina, e mais geralmente com compostos fotoativáveis dafamília das quinonas.

A fixação é uma operação destinada a matar as células paraconservá-las, de preferência no estado em que elas se encontravam durante avida. Se não há fixação, há risco de autólise. Os melhores fixadores sãoaqueles que, ao mesmo tempo em que agem rapidamente, produzem o menornúmero possível de modificações secundárias ou de artifícios suscetíveis dedar uma idéia muito falsa da morfologia interna das células.

Agora, é possível estudar as células ou os tecidos a qualquermomento, sem precisar mantê-los em vida, realizando uma marcação com umou mais compostos fotoativáveis da família das quinonas, em particular com ahipericina, simultânea ou consecutivamente à fixação das células ou tecidospor um fixador citológico ou histológico.

Além disso, demonstrou-se que quando células tumorais sãopostas em suspensão em uma solução de fixador contendo dosesmicromolares de hipericina, a afinidade da hipericina com as células é tal que aquase totalidade da hipericina é incorporada pelas células. Como a fase líquidada suspensão celular não contém praticamente mais hipericina, é entãopossível realizar uma análise direta das células (análise morfológica e/ou daemissão de fluorescência) sem enxágüe da suspensão celular. Essapropriedade permite, portanto, considerar uma automatização da preparaçãocelular/tissular e da análise das células.

Descrição da Invenção

A presente invenção refere-se portanto a uma solução quecompreende um fixador histológico ou citológico e um ou mais compostosfotoativáveis da família das quinonas. De preferência, o ou os compostosfotoativáveis da família das quinonas são selecionados a partir do grupo quecompreende a hipericina, a hipocrelina Aea hipocrelina B. Ainda de modopreferencial, a referida composição compreende, ou é constituída de, umfixador histológico ou citológico e de hipericina.

Por "fixador histológico ou citológico" ou "solução de fixaçãohistológica ou citológica", entende-se uma solução comumente utilizada emanálise histológica ou citológica para realizar a fixação das células ou tecidos.

Exemplos de fixadores citológicos incluem fixadores à base de álcool etílico, deálcool metílico, ou de propileno glicol (PEG). Como exemplos de fixadoreshistológicos pode-se citar fixadores à base de formaldeído, como uma soluçãode formol puro a 10% (o "formol puro" que corresponde à solução aquosa deformaldeído a 40%, geralmente vendida no comércio com o nome de "formol),uma solução de formol - NaCI (constituída por exemplo por mistura de 10 molde formol puro, 0,9 g de NaCI e 90 ml de água), uma solução de formol - ácidòacético (por exemplo, 100 ml de formol puro, 50 ml de ácido acético glacial e850 ml de água), o líquido de Bouin alcoólico (ou Duboscq Brasil; por exemplo250 ml de formol puro, 70 ml de ácido acético glacial, 5 g de ácido pícrico e 680ml de etanol a 70°). Outros exemplos de fixadores incluem o fixador álcool -formol - ácido acético (20 ml de formol puro, 50 ml de ácido acético glacial, 750ml de álcool etílico absoluto, e 180 ml de água), ou ainda fixadores à base decloreto de zinco (formol 10%, 10-50 g/l de cloreto de zinco, e ácido acético 5%ou NaCI 9 g/l, eventualmente álcool absoluto 75%).

A solução de acordo com a presente invenção compreendevantajosamente 1 a 20 micromols/ml, de preferência 1 a 15 micromols/ml, depreferência 1 a 10 micromols/ml, e mais preferencialmente ainda 1 a 2micromols/ml de compostos fotoativáveis da família das quinonas.

A presente invenção refere-se também a um kit que compreendeum fixador histológico ou citológico e um ou mais compostos fotoativáveis dafamília das quinonas. De preferência, o ou os compostos fotoativáveis dafamília das quinonas são selecionados a partir do grupo que compreende ahipericina, a hipocrelina Aea hipocrelina Β. Ainda de modo preferencial, o kitde acordo com a presente invenção compreende um fixador histológico oucitológico e hipericina. O kit pode opcionalmente compreender ainda umtampão de lavagem apropriado, uma bula ou qualquer outra solução oudispositivo apropriado.

A presente invenção refere-se também a um método de marcação exvivo de células ou de um tecido por um ou mais compostos fotoativáveis da famíliadas quinonas. O referido método compreende as etapas que consistem em:

(a) colocar em contato uma amostra de células ou de tecido comuma solução de fixação histológica ou citológica;

(b) simultânea ou consecutivamente, colocar em contato areferida amostra de células ou de tecido com uma solução que compreende umou mais compostos fotoativáveis da família das quinonas, durante um temposuficiente para que as células ou o tecido os incorporem; e

(c) eventualmente lavar a referida amostra de células ou detecido.

De modo preferencial, a solução que compreende o ou oscompostos fotoativáveis da família das quinonas é a solução de fixaçãohistológica ou citológica. As etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente. Oprazo de fixação de uma suspensão celular é muito curto (da ordem de algunsminutos) e o de amostra tissular da ordem de uma hora. Ora, a incorporação decompostos fotoativáveis da família das quinonas, em particular a hipericina, porcélulas em suspensão leva geralmente de 1 a 2 horas. A diferença no prazo deincorporação dos compostos fotoativáveis da família das quinonas e no prazode fixação das células ou tecidos garante que, de acordo com o método dapresente invenção, os compostos fotoativáveis da família das quinonas sejamincorporados mesmo que as células já tenham sido fixadas, em outraspalavras, estejam mortas.De preferência, o ou os compostos fotoativáveis da família dasquinonas são escolhidos no grupo constituído pela hipericina, a hipocrelina A ea hipocrelina B. Ainda de modo preferencial, o método é um método demarcação ex vivo de células ou de um tecido pela hipericina.

As células ou o tecido são preferencialmente células tumorais oususpeitas de serem tumorais. A amostra de células ou de tecido pode assim serobtida por coleta de amostra ou biópsia em um paciente suspeito de sofrer decâncer e no qual se procura mostrar a presença de células tumorais. A amostrapode também ter sido obtida de um paciente no qual foi diagnosticado um câncer epara o qual se avalia a eficácia de um tratamento terapêutico medindo a evoluçãoao longo do tempo da incorporação da hipericina pelas células cancerosas.

As células ou tecidos podem provir de qualquer órgão, porexemplo útero, fígado, estômago, pulmão, esôfago, bexiga, próstata, seio, etc.

Uma amostra de células pode, por exemplo, ser uma coleta de líquido tal comourina, ascite, líquido pleural ou pericárdico; de um esfregaço tal como umesfregaço cervical, vaginal, vulvar ou esofagiano; de um corrimento mamilar ouainda de uma punção de órgão, por exemplo uma glândula superficial tal comoo seio, a tireóide e a parótida ou de órgão profundo, tal como o rim, o fígado, osovários, etc. Uma amostra de tecido pode ser uma biópsia ou uma exéresetotal ou parcial de qualquer órgão.

O paciente pode ser um animal, de preferência um mamífero talcomo um ser humano, um roedor, um cão, um gato. De preferência, o pacienteé um ser humano.

A presente invenção refere-se ainda ao uso de uma solução quecompreende um fixador histológico ou citológico e um ou mais compostosfotoativáveis da família das quinonas, para o diagnóstico de um câncer ou de umadisplasia ou o acompanhamento da eficácia terapêutica de um tratamento, ou deum câncer.A presente invenção propõe mais especificamente um método dediagnóstico de um câncer ou de uma displasia, no qual é realizada umamarcação de células ou de um tecido por um ou mais compostos fotoativáveisda família das quinonas de acordo com o método descrito mais acima, e emque a presença de células ou de um tecido marcado pelo ou pelos compostosfotoativáveis da família das quinonas é reveladora da presença de célulastumorais ou displásicas. De preferência, o ou os compostos fotoativáveis dafamília das quinonas são selecionados no grupo constituído pela hipericina, ahipocrelina Aea hipocrelina B.

De acordo com um modo de realização, o método de diagnósticode um câncer ou de uma displasia compreende as etapas que consistem em:

(a) colocar em contato uma amostra de células ou de tecido comuma solução de fixação histológica ou citológica;

(b) simultânea ou consecutivamente, colocar em contato areferida amostra de células ou de tecido com uma solução que compreendehipericina, durante um tempo suficiente para que as células ou o tecidoincorporem a hipericina;

(c) eventualmente lavar a referida amostra de células ou de tecido; e

(d) detectar a presença de células ou tecido marcado pela hipericina;

em que a presença de células ou tecido marcado pela hipericina é reveladorada presença de um câncer ou de uma displasia.

A detecção de uma marcação de células ou tecido por compostosfotoativáveis da família das quinonas pode ser facilmente efetuada medindo-sea fluorescência emitida pelas células ou o tecido, em particular nasproximidades de 600 nm para a hipericina, a hipocrelina A ou a hipocrelina B.

Os resultados mostram que existe uma grande afinidade dahipericina com certas células tumorais com uma localização preferencialperinuclear, ao passo que as células normais só mostram uma afinidade muitopequena com uma localização periférica ao nível da membrana celular.

Além disso, de acordo com um modo de realização da presenteinvenção, pelo menos a etapa (d), e de preferência todas as etapas, sãorealizadas de modo automatizado, permitindo assim a crivação automática deamostras.

De preferência, detecta-se então uma marcação perinuclear dascélulas.

A presente invenção será ilustrada mais detalhadamente nosexemplos apresentados a seguir, dados a título não limitativo.

Exemplos

Exemplo 1

Células de um glioblastoma de linhagem humana são cultivadasem caixa de Petri.

A hipericina é colocada em suspensão em uma solução de fixadorcitológico Sakomano, com uma concentração de 2 micromols por ml, quatrohoras antes dos experimentos. A solução de fixador que compreende ahipericina é conservada ao abrigo da luz.

As células de glioblastoma são fixadas diretamente colocando-asna solução de fixador preparada à base de hipericina durante uma hora.

São realizados testes comparativos com um microespectrofluorímetropara comparar o nível de intensidade de fluorescência e a qualidade do espectro defluorescência medidos em culturas de células de glioblastoma vivas idênticas,incubadas na mesma concentração durante uma hora na solução de fixadorcitológico Sakomano que contém hipericina, e as células fixadas.

Os resultados mostram que os espectros são totalmentesuperponíveis e que as intensidades de fluorescência são idênticas entre ascélulas' ainda vivas e as células fixadas.Exemplo 2

Células de uma linhagem de carcinoma malpígio epidermóide docolo do útero de tipo HELA são cultivadas em caixa de Petri. Elas são fixadas a ·seguir em um fixador citológico de tipo Sakomano que já contém célulasepiteliais normais provenientes de um esfregaço do colo do útero de modo averificar a afinidade da hipericina com as células tumorais em uma suspensãocelular que contém vários tipos de células normais e de células tumorais.

A hipericina é posta a seguir em suspensão durante uma hora nasuspensão celular fixada a uma concentração de 2 μηι/ml e conservada aoabrigo da luz.

São realizados testes comparativos com ummicroespectrofluorímetro para comparar o nível de intensidade de fluorescênciae a qualidade do espectro de fluorescência medidos para as diferentes célulasda suspensão, incubadas à mesma concentração durante uma hora na soluçãode fixador citológico Sakomano que contém a hipericina.

Os resultados mostram que existe uma grande afinidade dahipericina com as células tumorais HELA com uma localização preferencialmuito particular perinuclear, ao passo que as células normais só mostram umaafinidade muito pequena com uma localização periférica ao nível da membranahumana.

As células que apresentam assim uma marcação muito particularpodem ser detectadas por meios de reconhecimento automáticos. Assim, épossível considerar uma crivação automatizada das amostras citológicas e emparticular do esfregaço do colo do útero a fim de não selecionar espalhamentoscelulares patológicos.

Referências

Hirayama J., et al. (1997) Photoinactivation of virus infectivity byhipocrellin A; Photochem. Photobiol. 66, 697Kamuhabwa A1 Agostinis P1 Ahmed Β, Landuyt W1 vanCleynbreugel Β, van Poppel Η, de Witte Ρ. (2004) Hypericin as a potentialphototherapeutic agent in superficial transitional cell carcinoma of the bladder.Photochem. Photobiol. Sci.; 3(8):772-80. Epub 2004 Apr 2.

Olivo M1 Lau W1 ManivasagerV1 Bhuvaneswari R1 Wei Z1 Soo KC1Cheng C1 Tan PH. (2003b) Novel photodynamic diagnosis of bladder câncer: exvivo fluorescence cytology using hypericin. Int J Oncol.; 23(6):1501-4.

Olivo M1 Lau W1 Manivasager V1 Tan PH1 Soo KC1 Cheng C.(2003a) Macro-microscopic fluorescence of human bladder câncer usinghypericin fluorescence cistocoscopy and laser confocal microscopy. Int JOncol.; 23(4):983-90.

Pytel A1 Schmeller N. (2002) New aspect of photodynamicdiagnosis of bladder tumors: fluorescence cytology. Urology.; 59(2):216-9.

Zhang J., et al.; (1998) Photodynamic effects of hypocrellin A onthree human malignant cell Iines by inducing apoptotic cell death. J.Photochem. Photobiol. B. 43,106.

Claims (16)

1. SOLUÇÃO PARA A MARCAÇÃO DE CÉLULAS OU DETECIDOS, caracterizada pelo fato de que compreende um fixador histológicoou citológico e um ou mais compostos fotoativáveis da família das quinonas,selecionados a partir do grupo que compreende a hipericina, a hipocrelina A ea hipocrelina B.

2. SOLUÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de que compreende de 1 a 20 micromols/ml de compostosfotoativáveis da família das quinonas.

3. SOLUÇÃO, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2,caracterizada pelo fato de que compreende um fixador histológico ou citológicoe hipericina.

4. KIT, que compreende um fixador histológico ou citológico eum ou mais compostos fotoativáveis da família das quinonas, caracterizadopelo fato de que são selecionados a partir do grupo que compreende ahipericina, a hipocrelina Aea hipocrelina B.

5. KIT, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de que compreende um fixador histológico ou citológico e hipericina.

6. MÉTODO DE MARCAÇÃO EX VIVO DE CÉLULAS OU DEUM TECIDO, por um ou mais compostos fotoativáveis da família das quinonas,caracterizado pelo fato de que compreende as etapas que consistem em:(a) colocar em contato uma amostra de células ou de tecido comuma solução de fixação histológica ou citológica;(b) simultânea ou consecutivamente, colocar em contato areferida amostra de células ou de tecido com uma solução que compreende umou mais compostos fotoativáveis da família das quinonas selecionados a partirdo grupo que compreende a hipericina, a hipocrelina Aea hipocrelina B,durante um tempo suficiente para que as células ou o tecido incorporem o(s)composto(s) fotoativável(eis) da família das quinonas;(c) eventualmente lavar a referida amostra de células ou de tecido.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que a referida solução, que compreende um ou mais compostosfotoativáveis da família das quinonas, é a solução de fixação histológica oucitológica e as etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6 ou 7,caracterizado pelo fato de que as células ou os tecidos são marcados comhipericina.

9. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 6 a 8,caracterizado pelo fato de que a amostra de células ou de tecido provém de umpaciente suspeito de sofrer de câncer.

10. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 6 a 9,caracterizado pelo fato de que a amostra de células é uma coleta de líquido,um esfregaço, um corrimento mamilar ou uma punção de órgão.

11. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 6 a 10,caracterizado pelo fato de que amostra de tecidos é uma biópsia ou umaexérese total ou parcial de um órgão.

12. USO DE UMA SOLUÇÃO, de acordo com uma dasreivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que é para o diagnóstico in vitrode um câncer ou de uma displasia, ou para o acompanhamento da eficáciaterapêutica de um tratamento do câncer.

13. MÉTODO DE DIAGNÓSTICO IN VITRO DE UM CÂNCEROU DE UMA DISPLASIA, caracterizado pelo fato de que compreende asetapas que consistem em:(a) colocar em contato uma amostra de células ou de tecido comuma solução de fixação histológica ou citológica;(b) simultânea ou consecutivamente, colocar em contato areferida amostra de células ou de tecido com uma solução que compreende umou mais compostos fotoativáveis da família das quinonas selecionadas a partirdo grupo que compreende a hipericina, a hipocrelina Aea hipocrelina B1durante um tempo suficiente para que as células ou o tecido incorporem o(s)composto(s) fotoativável(eis) da família das quinonas;(c) eventualmente lavar a referida amostra de células ou de tecido; e(d) detectar a presença de células ou tecido marcado pelo(s)composto(s) fotoativável(eis) da família das quinonas;em que a presença de células ou tecido marcado pelo(s) composto(s)fotoativável(eis) da família das quinonas é reveladora da presença de umcâncer ou de uma displasia.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que compreende as etapas que consistem em:(a) colocar em contato uma amostra de células ou de tecido com15 uma solução de fixação histológica ou citológica;(b) simultânea ou consecutivamente, colocar em contato areferida amostra de células ou de tecido com uma solução que compreendehipericina, durante um tempo suficiente para que as células ou o tecidoincorporem a hipericina;(c) eventualmente lavar a referida amostra de células ou de tecido; e(d) detectar a presença de células ou tecido marcado pela hipericina;em que a presença de células ou tecido marcado pela hipericina é reveladorada presença de um câncer ou de uma displasia.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13 ou 14,caracterizado pelo fato de que pelo menos a etapa (d) é realizada de modoautomatizado.

16. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 13 a 15,caracterizado pelo fato de que é detectada uma marcação perinuclear.