BRPI0612464A2

BRPI0612464A2 - métodos de análise de uma amostra para a detecção da presença ou ausência de um organismo de interesse na amostra

Info

Publication number: BRPI0612464A2
Application number: BRPI0612464-0A
Authority: BR
Inventors: Frank R Burns
Original assignee: Du Pont
Priority date: 2005-04-19
Filing date: 2006-04-18
Publication date: 2010-11-23
Also published as: US20090042189A1; WO2006113706A3; JP2008536518A; WO2006113706A2; CA2604401A1; US20060281103A1; EP1874963A2

Abstract

MéTODOS DE ANáLISE DE UMA AMOSTRA PARA A DETECçãO DA PRESENçA OU AUSêNCIA DE UM ORGANISMO DE INTERESSE NA AMOSTRA. A presente invenção refere-se a um método para a análise de uma amostra para a detecção da presença ou ausência de um organismo de interesse na amostra que compreende: (a) a obtenção da amostra; (b) submeter a amostra a um tratamento de ruptura suficiente para fracionar quaisquer sequências de ácido nucléico presentes na amostra; e (c) a detecção para a presença ou ausência de um organismo de interesse na amostra. A etapa de detecção (c) pode compreender a realização da amplificação direcionada ao primer (de preferência, a reação em cadeia da polimerase) na amostra para produzir um resultado de amplificação e analisar o resultado da amplificação para um produto de amplificação, em que a presença ou ausência do produto da amplificação é indicativo da presença ou ausência do organismo de interesse na amostra.

Description

"MÉTODOS DE ANÁLISE DE UMA AMOSTRA PARA A DETECÇÃO DAPRESENÇA OU AUSÊNCIA DE UM ORGANISMO DE INTERESSE NAAMOSTRA"

O presente pedido reivindica o benefício do pedido de patenteprovisório US 60/672.922, depositado em 19 de abril de 2005, e do pedido depatente provisório US 60/707.886, depositado em 12 de agosto de 2005, sendocada um deles incorporado no presente como referência em sua totalidade.

Campo da Invenção

O campo da invenção refere-se à detecção de organismos, combase em ácidos nucléicos, em particular, aos métodos de amplificação do ácidonucléico e as técnicas para a detecção de organismos em uma amostra.

Antecedentes da Invenção

A detecção de um organismo, ou grupo de organismos, pode serrealizada pela detecção de seqüências específicas de ácido nucléicocaracterísticas daquele organismo ou grupo de organismos. A presença deseqüências específicas de ácido nucléico pode ser detectada diretamente oupela hibridização específica ou pela amplificação utilizando primers queamplificam as seqüências especificas de ácido nucléico.

Nos casos em que a amplificação é utilizada como parte dométodo de detecção, é importante que pelo menos uma cópia das seqüênciasespecíficas de ácido nucléico a ser amplificada esteja presente na amostra queé colocada na reação de amplificação. Quando os organismos estão presentesem baixas concentrações e/ou estão em uma matriz complexa que requer adiluição para proceder com a amplificação, a sensibilidade pode ser limitadapela necessidade de obter pelo menos uma cópia da seqüência específica deácido nucléico na reação.

Os ensaios de PCR específicos para fungos são descritos em G.Zhou et al., Development of a fungus-specific PCR assay for detecting Iow leveifungi in an indoor environment, Molecular and Cellular Probes (2000) 14,339-348. Esta referência descreve um método de agitação com partículas(bead-beating) da amostra antes da amplificação por PCR como a maneiramais eficaz de provocar uma quebra dos esporos e liberação do DNAfúngico. Especificamente, um procedimento de "primeira homogeneização"é descrito, em que 0,1 mL de amostra é diretamente adicionada em umtubo de 0,5 mL contendo cerca do mesmo volume de partículas. O tubo éfixado em um vórtex com corda elástica e é agitado no vórtexvigorosamente por 3 a 5 minutos ou colocado em um uMini-Bead Beater"("Mini-Agitador de Partículas") e homogeneizado por 3 minutos, entãoaquecido em um banho de água fervente por 5 a 10 minutos para inativaras nucleases liberadas. A referência relata maior eficiência de amplificaçãode PCR com menos inibição, quando é utilizado 20% dos meios nutrientese o procedimento de primeira homogeneização.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção inclui:

Um método de análise de uma amostra para a detecção dapresença ou ausência de um organismo de interesse na amostra, dito métodocompreende: (a) a obtenção da amostra; (b) submeter a amostra a umtratamento de ruptura suficiente para fracionar quaisquer seqüências de ácidonucléico presentes na amostra; e (c) a detecção para a presença ou ausênciade um organismo de interesse na amostra.

Um método de análise de uma amostra para a detecção dapresença ou ausência de um organismo de interesse na amostra, dito métodocompreende: (a) a obtenção da amostra; (b) a preparação da amostra aoconduzir pelo menos os seguintes processos na amostra: (1) enriquecimento,(2) separação das células da amostra, (3) Iise celular, e (4) extração total doDNA; (c) submeter a amostra a um tratamento de ruptura suficiente parafracionar quaisquer seqüências de ácido nucléico presentes na amostra; e (d) adetecção para a presença ou ausência de um organismo de interesse naamostra. De preferência, a etapa de preparação compreende conduzir oenriquecimento bacteriano e a separação das células bacterianas da amostraantes de dita etapa (c); ou conduzir o enriquecimento bacteriano, a separaçãodas células bacterianas da amostra, e a Iise celular, antes de dita etapa (c). Emoutra realização preferida, na etapa de preparação, a Iise celular é realizadasimultaneamente ou após dita etapa (c).

Um método de análise de uma amostra para a detecção dapresença ou ausência de um organismo de interesse na amostra, dito métodocompreende: (a) a obtenção da amostra; (b) o enriquecimento da amostra; (c)submeter a amostra enriquecida da etapa (b) a um tratamento de rupturasuficiente para fracionar quaisquer seqüências de ácido nucléico presentes naamostra; e (d) a detecção para a presença ou ausência de um organismo deinteresse na amostra, em que dita etapa (b) compreende o enriquecimento daamostra em um recipiente, e em que dita etapa (c) compreende submeter aamostra enriquecida de dita etapa (b) a dito tratamento de ruptura no mesmorecipiente da etapa (b) sem a remoção da amostra enriquecida do mesmo.

De preferência, o tratamento de ruptura compreende adicionar osabjetos físicos (por exemplo, partículas, tais como de silício ou zircônio) àamostra e agitar a amostra que contém os objetos físicos. De maiorpreferência, o tratamento de ruptura compreende qualquer tratamento deruptura físico, mecânico, químico, ou enzimático.

A etapa de detecção em quaisquer dos métodos acimacompreende, de preferência, a realização da amplificação direcionada aoprimer (por exemplo, reação em cadeia da polimerase) na amostra paraproduzir um resultado de amplificação e a análise do resultado da amplificaçãopara um produto da amplificação, em que a presença ou ausência do produtoda amplificação é indicativo da presença ou ausência do organismo deinteresse na amostra. De maior preferência, ainda, a etapa de detecçãocompreende: (i) a obtenção de pelo menos um conjunto de par de primer daamplificação determinado para amplificar uma seqüência alvo localizada dentrode uma região de seqüência do ácido nucléico repetitivo de um genoma doorganismo de interesse; (ii) realizar a amplificação direcionada ao primer daamostra utilizando pelo menos um conjunto de par de primer da amplificaçãopara produzir um resultado de amplificação; e (iii) analisar o resultado daamplificação para detectar a presença ou ausência do produto da amplificaçãoda seqüência alvo, em que a presença ou ausência do produto da amplificaçãoé indicativo da presença ou ausência do organismo de interesse na amostra.De preferência, a etapa de detecção possui pelo menos um aumento de dezvezes na sensibilidade na detecção para o organismo de interesse quandocomparado à detecção sem a realização de dita etapa (b).

De preferência, a análise do resultado da amplificação é realizadasimultaneamente com a execução da amplificação direcionada ao primer. Aanálise utiliza, de preferência, os métodos de detecção da nuclease 5'.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra o processo da análise da curva de fusão. Amudança na fluorescência do DNA alvo é capturada durante a fusão. A análisematemática do negativo na mudança do Iog da fluorescência dividida pelamudança na temperatura plotada versus a temperatura, resulta no pico dográfico conhecido como curva de fusão.

As transformações de dados envolvem o seguinte:

1. Interpolar dados para conseguir pontos de dados espaçadosuniformemente.

2. Adotar Iog de fluorescência (F).

3. Harmonizar Iog (F).4. Calcular -d(log F)/dt -dF/dT.

5. Reduzir dados para 11-13 pontos de dados espaçados separados porum grau, dependendo do organismo alvo.

Descrição Detalhada da Invenção

A descrição de cada referência apresentada no presente éincorporada como referência em sua totalidade.

Definições

Nesta descrição, uma série de termos e abreviações é utilizada.São fornecidas as seguintes definições.

A "reação em cadeia da polimerase" é abreviada como PCR.

O "polinucleotídeo", "seqüência de ácido nucléico", "seqüência denucleotídeo" ou "fragmento de ácido nucléico" são utilizadosintercambiavelmente e é um polímero de RNA ou DNA que é de fita simples oudupla, opcionalmente que contém bases de nucleotídeos sintéticas, nãonaturais ou alteradas. Os nucleotídeos (geralmente encontrados em sua formade monofosfato 5') são referidos como suas letras únicas como segue: "A" paraadenilato ou desoxiadenilato (para RNA ou DNA, respectivamente), "C" paracitidilato ou desoxicitidilato, "G" para guanilato ou desoxiguanilato, "U" parauridilato, "T" para desoxitimidilato, "R" para purinas (A ou G), Ύ" parapirimidinas (C ou Τ), "K" para G ou Τ, "H" para A ou C ou Τ, "I" para inosina e"N" para qualquer nucleotídeo.

O termo "produto da amplificação" refere-se soa fragmentos deácido nucléico produzidos durante uma reação de amplificação direcionada aoprimer. Os métodos típicos de amplificação direcionada ao primer incluem areação em cadeia da polimerase (PCR), reação em cadeia da Iigase (LCR) ouamplificação por deslocamento de fita (SDA). Se a metodologia PCR forselecionada, a composição da replicação pode compreender os componentespara a replicação do ácido nucléico, por exemplo, nucleotídeo trifosfato, duas(ou mais) seqüências de primers apropriados, polimerase termoestável,tampões, solutos e proteínas. Estes reagentes e os detalhes que descrevem osprocedimentos para seu uso na amplificação dos ácidos nucléicos sãofornecidos na patente US 4.683.202 (1987, Mullis, et al.) e patente US4.683.195 (1987, Mullis, et al.). Se a metodologia PCR for selecionada, ascomposições da replicação podem compreender, por exemplo: uma Iigasetermoestável (por exemplo, Iigase de T. aquaticus), dois conjuntos deoligonucleotídeos adjacentes (em que um membro de cada conjunto écomplementar a cada uma das fitas alvo), tampão Tris-HCI, KCI, EDTA, NAD,ditiotreitol e DNA de espermatozóide de salmão. Vide, por exemplo, Tabor etal., Proc. Acad. Sei. U.S.A., 82: 1074 1078 (1985)).

O termo "primer" refere-se a um oligonucleotídeo (sintético ou deocorrência natural), que é capaz de agir como um ponto de início da síntese ouda replicação de ácido nucléico ao longo de uma fita complementar quandocolocada nas condições em que a síntese de uma fita complementar écatalisada por uma polimerase.

O DNA recombinante padrão e as técnicas de clonagemmoleculares utilizadas no presente são bem conhecidos no estado da técnica esão descritas em Sambrook, J.,Fritsch, E. F. and Maniatis, T., MolecularCloning: A Laboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory: ColdSpring Harbor, NY (1989) (a partir deste momento "Maniatis"); e por Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, publicado por GreenePublishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987).

Voltando agora para as realizações preferidas:

Em uma realização preferida, um método para a análise de umaamostra para a detecção da presença ou ausência de um organismo deinteresse na amostra compreende: obtenção de uma amostra; submeter aamostra a um tratamento de ruptura suficiente para fracionar quaisquerseqüências de ácido nucléico presentes na amostra; e detecção da presençaou ausência de um organismo de interesse na amostra.

Em outra realização preferida, um método para aumentar asensibilidade da detecção de um organismo de interesse em uma amostracompreende: obtenção de uma amostra; submeter a amostra a um tratamentode ruptura suficiente para fracionar quaisquer seqüências de ácido nucléicopresentes na amostra; e detecção da presença ou ausência de um organismode interesse na amostra, em que a sensibilidade de dita etapa de detecção éaumentada, de preferência, em pelo menos 10 vezes, de maior preferência, depelo menos qualquer número inteiro de 11 a 100 vezes, de maior preferência,ainda, de 10 vezes a qualquer número inteiro de 11 a 100 vezes, de maiorpreferência, ainda, de qualquer número inteiro de 10-99 vezes para 100vezes, ou de maior preferência, de qualquer número inteiro de 10 - 100 vezespara qualquer número inteiro entre 100-10 vezes, quando comparado a nãorealização de dita etapa de submeter a amostra ao tratamento de ruptura.

De preferência, a etapa de detecção compreende realizar aamplificação direcionada ao primer (de preferência, reação em cadeia dapolimerase) na amostra para produzir um resultado de amplificação e a análisedo resultado da amplificação para um produto da amplificação, em que apresença ou ausência do produto da amplificação é indicativo da presença ouausência do organismo de interesse na amostra. De maior preferência, a etapadè detecção compreende: obtenção de pelo menos um conjunto de par deprimer de amplificação determinado para amplificar uma seqüência alvolocalizada dentro de uma região de seqüência do ácido nucléico repetitivo deum genoma do organismo de interesse; realizar a amplificação direcionada aoprimer da amostra utilizando pelo menos um conjunto de par de primer daamplificação para produzir um resultado de amplificação; e analisar o resultadoda amplificação para detectar a presença ou ausência do produto daamplificação da seqüência alvo, em que a presença ou ausência do produto daamplificaçãó é indicativo da presença ou ausência do organismo de interessena amostra.

De maior preferência, a análise do resultado da amplificação érealizada simultaneamente com a execução da amplificação direcionada aoprimer (por exemplo, reação em cadeia da polimerase). De maior preferência,ainda, a análise do produto da amplificação utiliza os métodos de detecção danuclease 5'.

Em outra realização preferida, em qualquer um dos métodos dapresente invenção, uma etapa de enriquecimento é realizada na amostra antesda etapa de submeter a amostra a um tratamento de ruptura. O enriquecimentoda amostra é realizado em um recipiente e, de preferência, a etapa desubmeter a amostra a um tratamento de ruptura é realizada na amostraenriquecida no mesmo recipiente em que a amostra foi enriquecida (isto é,ambos os tratamentos de enriquecimento e de ruptura podem ser realizados naamostra no mesmo recipiente). De preferência, o recipiente é um tubo deamostra, mas o recipiente também pode ser qualquer recipiente ou contêinerapropriado conhecido no estado da técnica, por exemplo, tubos de teste,béqueres, frascos, jarras, tubos de reação, ampolas, ou tubos de centrífuga.

Amostras Preferidas ε Organismos de Interesse

De preferência, a amostra é de um animal, fonte ambiental oualimentícia suspeita de contaminação pelo organismo de interesse.

O organismo de interesse pode ser qualquer ser vivo. Depreferência, o organismo de interesse é um microorganismo. Os organismosespecíficos de interesse que podem ser detectados pelos métodos da presenteinvenção incluem, de preferência, as bactérias e os fungos.

Os organismos particularmente preferidos de interesse são osorganismos fúngicos. Particularmente preferidos é o fungo Sacchromyces cervasiae.Acredita-se que os métodos da presente invenção sãoparticularmente vantajosos no aumento da sensibilidade de detecção dosorganismos fúngicos em uma amostra.

Sem estar ligado a qualquer teoria ou mecanismo particular,acredita-se que a maior sensibilidade é obtida particularmente em organismosfúngicos, uma vez que os genomas dos organismos fúngicos contêmtipicamente de 100 a 200 cópias de seus genes do ácido ribonucléicoribossomal (rRNA) conjuntamente ordenados em unidades repetidas de cercade 10.000 pares de base cada.

Em uma estratégia de amplificação de ácido nucléico direcionadaao primer, o equivalente de 4 pL do material sendo testado é colocado nareação de amplificação. Se houver 20 fungos haplóides por mL, então, namédia, um cromossomo que possui uma região de amplificação alvo no genedo rRNA é distribuído por 50 μL (= 1 mL/ 20). A amostra de 4 μL é, portanto,improvável de resultar em uma região de amplificação alvo estando presentequando a amplificação de ácido nucléico direcionado ao primer é realizado em4 pL de amostra.

Entretanto, ao submeter a amostra contendo um organismofúngico a um tratamento de ruptura (explicado abaixo) de acordo com apresente invenção, então em 1 mL de amostra contendo 20 fungos haplóides,se o tratamento de ruptura é realizado para fracionar as seqüências de ácidonucléico do genoma fúngico em cerca de 10.000 pares de base, o 1 mL deamostra possui agora a média de 2.000 a 4.000 alvos (de 100 a 200 genes derRNA) por mL, ou na média de 8 a 16 alvos por 4 pL de amostra, aumentandocom isso a sensibilidade na detecção, particularmente quando é empregada aamplificação de ácido nucléico direcionada ao primer.

Assim, de maior preferência, em outra realização preferida, osmétodos da presente invenção podem ser empregados para detectar ou paraaumentar a sensibilidade na detecção de qualquer organismo de interesse quepossui um genoma em que as seqüências de ácido nucléico repetitivas existeme servem como regiões alvo para a amplificação direcionada ao primer. Asensibilidade é aumentada por, de preferência, pelo menos 10 vezes, de maiorpreferência, pelo menos qualquer número inteiro de 11 a 100 vezes, de maiorpreferência, de 10 vezes a qualquer número inteiro de 11 a 100 vezes, demaior preferência, de qualquer número inteiro de 11 - 99 vezes a 100 vezesou, de maior preferência, de qualquer número inteiro de 10 - 100 vezes paraqualquer número inteiro de 100 - 10 vezes, quando comparado a nãorealização de um tratamento de ruptura de acordo com a presente invenção.

Tratamento de Ruptura Preferidos

Uma vez que a amostra é obtida, a próxima etapa é submeter aamostra a um tratamento de ruptura suficiente para fracionar qualquerseqüência de ácido nucléico presente na amostra. De preferência, asseqüências de ácido nucléico são do genoma do organismo de interesse paraos quais a amostra está sendo analisada.

O tratamento de ruptura pode compreender qualquer método ouprotocolo para as seqüências de ácido nucléico fracionados na amostra e, emparticular, para as seqüências de ácido nucléico fracionados do genoma doorganismo de interesse para o qual a amostra está sendo analisada. Otratamento de ruptura pode empregar abordagens físicas, químicas ouenzimáticas e não é limitada a estas abordagens específicas. Qualquerabordagem do fracionamento de ácido nucléico conhecido ou prontamenteaveriguável por um técnico no assunto regular pode ser utilizado e está inclusodentro da presente invenção. O tratamento de ruptura é realizado por umperíodo de tempo suficiente para fracionar quaisquer seqüências de ácidonucléico presentes na amostra e um técnico no assunto pode determinarprontamente o comprimento deste período de tempo dependendo da amostra edo organismo de interesse para o qual a amostra está sendo testada.

Os tratamentos de ruptura físicos preferidos incluem o uso deobjetos físicos, tais como partículas, em combinação com a agitação daamostra. As condições de agitação devem ser suficientes para produzir asforças de cisalhamento que rompem o DNA em fragmentos menores. Outrostratamentos de ruptura físicos incluem a sonicação, nebulização ou passagemda solução contendo DNA através de um orifício estreito.

Os tratamentos de ruptura químicos preferidos incluem otratamento com hidróxido de sódio, tratamento com dimetilsulfato seguido porpeperidina, tratamento com formato de peperidina seguido pelo tratamento compiperidince ou tratamento com hidrazina seguido por piperidina.

Os tratamentos de ruptura enzimáticos preferidos incluem adigestão com nucleases não específicas tais como DNase 1 ou a digestão comas endonucleases de restrição tais como EcoRI.

Em uma realização particularmente preferida, o tratamento deruptura compreende a adição de objetos físicos na amostra e a agitação daamostra contendo os objetos físicos. A agitação pode ser realizada por umperíodo de tempo suficiente para fracionar quaisquer seqüências de ácidonucléico presentes na amostra e um técnico no assunto regular podeprontamente determinar o comprimento deste período de tempo dependendoda amostra e do organismo de interesse para o qual a amostra está sendotestada. A agitação é realizada, de preferência, por pelo menos 6 minutos, demaior preferência, por pelo menos qualquer número inteiro de 6 a 20 minutos,de maior preferência, de 6 minutos a qualquer número inteiro de 6 - 20minutos, de maior preferência, ainda, de qualquer número inteiro de 6 - 19minutos a 20 minutos, ou de maior preferência, de qualquer número inteiro de 6- 20 minutos a qualquer número inteiro 20-6 minutos. Em uma realizaçãoparticularmente preferida, a agitação é realizada por pelo menos 15 minutos.Em outra realização preferida, a agitação é realizada por 15 a 20 minutos. Umequipamento particularmente preferido para a realização da agitação é oDisruptor Genie® (disponível pela Scientific Industries, Inc., Bohemia1 NY). Osobjetos físicos compreendem, de preferência, as partículas e, de maiorpreferência, as partículas de silício ou zircônio. Os objetos físicos tambémpodem compreender partículas de vidro.

Os métodos de acordo com a presente invenção podem serutilizados diretamente com quaisquer amostras clinicas ou ambientaisapropriadas, sem qualquer necessidade de preparação da amostra. Entretanto,a fim de obter maior sensibilidade, e em situações onde o tempo não é um fatorlimitante, é preferível que as amostras sejam tratadas previamente.

Em outra realização preferida, portanto, antes da detecção para oorganismo alvo de interesse na amostra, uma etapa de preparação da amostrapode ser realizada. De preferência, esta etapa de preparação podecompreender pelo menos um dos seguintes processos: enriquecimento (porexemplo, do organismo alvo) nos meios de cultura, separação das células (porexemplo, do organismo alvo) da amostra, Iise celular e extração de DNA. Demaior preferência, esta etapa de preparação compreende a realização doenriquecimento e da separação antes de submeter a amostra a um tratamentode ruptura. De maior preferência, ainda, esta etapa de preparação compreendea realização do enriquecimento, a separação e a Iise celular, antes desubmeter a amostra a um tratamento de ruptura. Em outra realização preferida,a lise celular é realizada simultaneamente ou após o tratamento de ruptura. Osexemplos das etapas de preparação da amostra realizadas em conjunto comos métodos da presente invenção são apresentadas no Exemplo 1 abaixo.

Os procedimentos de enriquecimento típicos empregam meiosque irão intensificar o crescimento e a saúde dos organismos alvo e tambémirão inibir o crescimento de quaisquer microorganismos secundários ou nãoalvo presentes. Os meios de seleção foram desenvolvidos para uma variedadede organismos e um técnico no assunto saberá selecionar os meiosapropriados para o organismo particular a ser enriquecimento. Uma discussãogeral e as receitas dos meios não seletivos são descritas em FDABacteriological Analytical Manual. (1998) publicado e distribuído pelaAssociation of Analytical Chemists1 Suite 400, 2200 Wilson Blvd1 Arlington, VA22201-3301.

Após o crescimento, uma amostra das misturas dos complexos éremovida para a análise posterior. O procedimento da amostragem pode seracompanhado por uma variedade de meios bem conhecidos pelos técnicos noassunto.

Em uma realização preferida, 20 pL da cultura enriquecida éremovida e adicionada a 200 pL da solução Iisada contendo a protease. Asolução Iisada é aquecida a 37° C por 20 minutos seguido pela inativação daprotease a 95° C por 10 minutos conforme descrito em Bax® System User'sGuide, Qualicon, Inc., Wilmington, DE.

Alternativamente, em uma realização de maior preferência, emqualquer dos métodos da presente invenção, uma etapa de enriquecimento érealizada na amostra antes da etapa em que se submete a amostra aotratamento de ruptura, em que o enriquecimento da amostra em realizado emum recipiente, e a etapa de submeter a amostra a um tratamento de ruptura érealizado na amostra enriquecida no mesmo recipiente em que a amostra foienriquecida (isto é, ambos os tratamentos de enriquecimento e de ruptura sãorealizados na amostra no mesmo recipiente). De preferência, o recipiente é umtubo de amostra, mas o recipiente também pode ser qualquer recipiente oucontêiner apropriado conhecido no estado da técnica, por exemplo, tubos deteste, béqueres, frascos, jarras, tubos de reação, ampolas, ou tubos decentrífuga.Detecção E Análise Preferidas

Uma variedade de métodos de detecção com base em ácidonucléico pode ser empregada para a detecção do(s) organismo(s) alvo deinteresse. Uma variedade de métodos de amplificação de ácido nucléicodirecionado ao primer são conhecidos no estado da técnica incluindo osmétodos de ciclização térmica (por exemplo, PCR1 RT-PCR e LCR), bem comoos métodos isotérmicos e a amplificação por deslocamento da fita (SDA)1 aamplificação com base na seqüência de ácido nucléico (NASBA) e a seqüênciade replicação auto sustentável (3SR) e 'amplificação da Q replicase'.

O método preferido é o de PCR.

De preferência, em qualquer método da presente invenção, aetapa de detecção utiliza um conjunto de par de primer de amplificaçãodeterminado para amplificar uma seqüência alvo localizada dentro de umaregião de seqüência do ácido nucléico repetitiva de um genoma do organismode interesse na amostra a ser testada.

Qualquer composição apropriada de replicação de ácido nucléico("composição de replicação") em qualquer formato pode ser utilizada.

Uma composição de replicação típica para a amplificação emPCR pode compreender, por exemplo, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, primers alvoespecíficos e uma polimerase adequada. Se a composição de replicaçãoestiver na forma líquida, os tampões apropriados conhecidos no estado datécnica podem ser utilizados (Sambrook, J. et al. 1989, Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2a edição, Cold Spring Harbor Laboratoty Press).

Alternativamente, se a composição de replicação estiver contida naforma de tablete, então os reagente de tabletização típicos podem ser incluídos taiscomo estabilizantes e agentes ligantes. A tecnologia de tabletização preferida éapresentada nas patentes US 4.762.857 e US 4.678.812, cada uma das quais éincorporada no presente como referência em sua totalidade.Em outra realização preferida, uma composição de replicaçãocontém um controle interno positivo. As vantagens de um controle internopositivo contido dentro de uma reação de PCR foram previamente descritas(patente US 6.312.930 e documento WO 97/11197, cada uma das quais éincorporada no presente como referência em sua totalidade) e incluem: (i) ocontrole pode ser amplificação utilizando um único primer; (ii) a quantidade deproduto controle de amplificação é independente de qualquer alvo de DNA ouRNA contido na amostra; (iii) o controle do DNA pode ser tabletizado comoutros reagentes de amplificação para facilitar o uso e o alto grau dereprodutibilidade em ambos os procedimentos teste manual e automatizados;(iv) o controle pode ser utilizado com a detecção homogênea, isto é, sem aseparação do produto de DNA dos reagentes; e (ν) o controle interno possuium perfil de fusão que é distinto dos outros produtos de amplificação potenciaisna reação. O DNA controle será de tamanho e composição base apropriadospara permitir a amplificação em uma reação de amplificação direcionada aoprimer. A seqüência de DNA controle pode ser obtida a partir do genoma deorganismos de interesse ou de outra fonte, mas deve ser amplificado demaneira reprodutível sob as mesmas condições que permitem a amplificaçãodo produto de amplificação alço.

A reação controle é útil para validar a reação de amplificação. Aamplificação do DNA controle ocorre dentro do mesmo tubo de reação que aamostra que está sendo testada e, portanto, indica uma reação de amplificaçãobem sucedida quando as amostras são alvos negativos, isto é, nenhum produtode amplificação alvo é produzido. A fim de obter a validação significativa dareação de amplificação, um número apropriado de cópias do DNA controledeve ser incluído em cada reação de amplificação.

Em alguns casos, pode ser útil incluir uma composição dereplicação de controle negativo adicional. A composição de replicação decontrole negativo irá conter os mesmos reagentes que a composição dereplicação, mas sem a polimerase. A função primária de tal controle émonitorar a fluorescência secundária falsa em um formato homogêneo quandoo método emprega um meio fluorescente de detecção. As composições dereplicação podem ser modificadas dependendo se elas são determinadas paraserem utilizadas na amplificação do DNA alvo ou do DNA controle.

As composições de replicação que irão amplificação o DNA alvo(composições de replicação teste) podem incluir (i) uma polimerase (em geraltermoestáveis), (ii) um par de primer capaz de hibridizar para o DNA alvo e (iii)tampões para a reação de amplificação proceder.

As composições de replicação que irão amplificar o DNA controle(controle positivo ou composição de replicação positiva) podem incluir (i) umapolimerase (em geral termoestáveis), (ii) o DNA controle; (iii) pelo menos umprimer capaz de hibridizar para o DNA controle; e (iv) tampões para a reaçãode amplificação proceder.

Um técnico no assunto irá entender que quaisquer condições dePCR em geral aceitáveis podem ser utilizadas para detectar de maneira bemsucedida o organismo alvo de interesse e, dependendo da amostra a sertestada e outras condições do laboratório, a otimização de rotina para ascondições de PCR podem ser necessárias para atingir a sensibilidade e aespecificidade ótima. De maneira ótima, eles obtém os produtos deamplificação por PCR de todos os alvos específicos pretendidos, enquanto nãofornecem o produto de PCR para outras espécies não alvo.

Em uma realização preferida, os seguintes reagentes e condiçõesde ciclização podem ser utilizados. Cinqüenta microlitros (50 μί) de Iisadoforam adicionados ao tubo de PCR contendo um tablete de reagente Bax®(fabricado pela Qualicon, Inc., Wilmington, DE), e o tablete contendo apolimerase Taq DNA, desoxinucleotídeos, SYBR® Green (Molecular Probes,Eugene, OR), os componentes do tampão e os primers para obter umaconcentração final no PCR de 0,150 micromols para cada primer. As condiçõesde ciclização de PCR preferidas: 94° C, 2 minutos iniciais da desnaturação deDNA, seguida por 38 ciclos de desnaturação a 94° C, 15 segundos,anelamento a 56° C por 45 segundos e alongamento a 70° C por 2 minutos,seguido por uma única espera final a 70° C.

Os resultados da amplificação direcionada ao primer podem seranalisados utilizando diversos métodos para detectar a presença ou a ausênciade um produto de amplificação.

A detecção homogênea refere-se a um método preferido para adetecção dos produtos da amplificação onde não é necessária nenhumaseparação (tal como por eletroforese em gel) dos produtos da amplificação dosmoldes ou primers. A mistura de detecção homogênea é tipicamenteacompanhada pela medida do nível de fluorescência da mistura de reação napresença ou ausência de um corante fluorescente.

Em uma realização preferida, a análise da curva de fusão do DNAé utilizada para obter a detecção homogênea, em particular com o hardwareΒΑΧ® System e os tabletes de reagente da Qualicon Inc. Os detalhes dosistema são dados na patente US 6.312.930 e nos documentos WO 97/11197e WO 00/66777, cada um dos quais é incorporado no presente como referênciaem sua totalidade.

A análise da curva de fusão detecta e quantifica a molécula deácido nucléico padrão de dupla fita ("dsDNA" ou "alvo") pelo monitoramento dafluorescência do produto de amplificação alvo ("amplicon alvo") durante cadaciclo de amplificação em pontos de tempo selecionados.

Como é bem conhecido pelo técnico no assunto, as duas fitas deum dsDNA separam ou fundem, quando a temperatura é maior do que suatemperatura de fusão. A fusão de uma molécula de dsDNA é um processo, esob uma dada condição de solução, a fusão inicia em uma temperatura(denominada TMs daqui por diante) e completa em outra temperatura(denominada Tme daqui por diante). O termo familiar, Tm, designa atemperatura em que a fusão está 50% completa.

Um ciclo de PCR típico envolve uma fase de desnaturação ondeo dsDNA é fundido, uma fase de anelamento do primer onde a temperatura éótima para os primers se ligarem ao alvo agora de fita simples, e uma cadeiade fase de elongação (em uma temperatura Te) onde a temperatura é ótimapara o funcionamento da DNA polimerase.

De acordo com a presente invenção, o Tms deve ser maior do queTe e Tme deve ser menor (com freqüência, substancialmente menor) do que atemperatura ao qual o DNA polimerase é inativado por aquecimento. Ascaracterísticas de fusão são efetuadas pelas propriedades intrínsecas de umadada molécula de dsDNA, tal como a composição de desoxinucleotídeo e ocomprimento do dsDNA.

Os corantes de intercalação irão se ligar à fita dupla de DNA. Ocomplexo corante/ dsDNA irá fluorescer quando exposto ao comprimento deonda de excitação apropriado da luz, que é dependente do corante e aintensidade da fluorescência pode ser proporcional à concentração do dsDNA.Os métodos para se ter vantagem no uso dos corantes de intercalação de DNApara detectar e quantificar o dsDNA são conhecidos no estado da técnica.Muitos corantes são conhecidos e utilizados no estado da técnica para estespropósitos. Os presentes métodos também tiram vantagem de tal relação.

Um exemplo de tal corante inclui os corantes de intercalação. Osexemplos de tais corantes incluem, mas não estão limitados a, SYBR Green I®,brometo de etídio, iodeto de propídio, TOTO® {Quinolinium, 1,1'-[1,3-propanodiilbis-[(dimetilimino)-3,1-propanodiil]]bis[4-[(3-metil-2(3H)-benzotiazolilideno)-metil]],tetraiodeto}, e YoPro® {Quinolinium, 4-[(3-metil-2(3H)-benzoxazolilideno)-metil]1-[3-(trimetilamônio)-propil], diiodeto}. De maior preferência para a presente invenção, éum corante de cianeto não assimétrico tal como SYBR Green I®, fabricado pelaMolecular Probes, Inc. (Eugene, OR).

As análises da curva de fusão são obtidas pelo monitoramento damudança na fluorescência enquanto a temperatura é aumentada. Quando atemperatura atinge o Tms específico para a amplicon do alvo, o dsDNA começaa desnaturar. Quando o dsDNA desnatura, o corante de intercalação dissociado DNA e a fluorescência diminui. A análise matemática do negativo namudança do Iog da fluorescência dividida pela mudança na temperaturaplotada versus a temperatura resulta no pico do gráfico conhecido como curvade fusão (Vide Figura 1, que ilustra a análise da curva de fusão em geral).

O processo de transformação de dados mostrados na Figura 1envolve o seguinte:

(1) Interpolar os dados para obter pontos de dados espaçadosigualmente;

(2) Tirar o Iog da fluorescência (F);

(3) Arredondar Iog F;

(4) Calcular-d(log F)/dT;

(5) Reduzir os dados a 11-13 pontos espaçados dos dados umgrau separado (dependendo do organismo alvo).

O método de detecção homogêneo presente pode ser utilizado paradetectar e quantificar os dsDNA, dos quais a presença e o nível dos organismosalvo pode ser determinado. Um pequeno número de alvos de dsDNA detectáveisestá entre 1 e 10 sob as condições e volumes de reação típicos.

A detecção homogênea pode ser empregada para realizar asamplificações de ácido nucléico direcionadas ao primer "em tempo real",utilizando os pares de primer da presente invenção (por exemplo, PCR "emtempo real" e RT-PCR "em tempo real"). Os métodos "em tempo real"preferidos são apresentados, por exemplo, nas patentes US 6.171.785 e US5.994.056. cada um dos quais é incorporado no presente como referência emsua totalidade.

Outro método de detecção é o método de detecção da nuclease5', conforme apresentado, por exemplo, nas patentes US 5.804.375, US5.538.848, US 5.487.972 e US 5.210.015, cada um dos quais são incorporadosno presente como referência em sua totalidade.

Uma variedade de outros métodos de detecção PCR é conhecidano estado da técnica incluindo a eletroforese em gel não desnaturante padrão(por exemplo, acrilamida ou agarose), eletroforese em gel por gradiente dedesnaturação, e eletroforese em gel por gradiente de temperatura. Aeletroforese em gel não desnaturante padrão é um método simples e rápidopara a detecção de PCR, mas pode não ser adequado para todas asaplicações.

A Eletroforese em Gel por Gradiente de Desnaturação (DGGE) éum método de separação que detecta as diferenças no comportamento dedesnaturação de pequenos fragmentos de DNA (200 - 700 pares de base). Oprincípio da separação é baseada em ambos os comprimentos do fragmento ea seqüência do nucleotídeo. Nos fragmentos que são do mesmo comprimento,uma diferença mínima como de um par de base pode ser detectada. Este é ocontraste para a eletroforese em gel não desnaturante, onde os fragmentos deDNA são separados apenas em tamanho. Esta limitação da eletroforese em gelnão desnaturante resulta porque a diferença na densidade de carga entre asmoléculas de DNA é próxima do neutro e desempenha um papel muitopequeno na separação. Conforme o tamanho do fragmento de DNA aumenta,sua velocidade através do gel diminui.

O DGGE é utilizado principalmente para separar os fragmentosde DNA de mesmo tamanho com base em seus perfis desnaturantes eseqüência. Utilizando o DGGE1 duas fitas de uma molécula de DNA separam,ou funde, quando é aplicado calor ou um desnaturante químico. Adesnaturação de um duplex de DNA é influenciada por dois fatores: (1) asligações de hidrogênio formadas entre os pares de base complementares (umavez que as regiões ricas em GC fundem em altas condições de desnaturaçãodo que as regiões que são ricas em AT); e (2) a atração entre as basesvizinhas na mesma fita, ou "empilhamento". Conseqüentemente, uma moléculade DNA pode possuir diversos domínios de fusão com cada uma das suascondições de desnaturação características individuais determinadas pela suaseqüência de nucleotídeo. O DGGE explora o fato de que normalmente asmoléculas de DNA idênticas que possuem o mesmo comprimento e seqüênciade DNA, com a exceção de apenas um nucleotídeo dentro de um domínioespecífico de desnaturação, irá desnaturar em diferentes temperaturas ou Tm-Assim, quando é feita a eletroforese da dupla fita (ds) do fragmento de DNAatravés de um gradiente de aumento de desnaturante químico, ele começa adesnaturar e sofre uma mudança tanto conformacional quanto de mobilidade.O fragmento de dsDNA será mais rápido do que um fragmento de (ss) DNA defita simples desnaturado, uma vez que a estrutura ramificada da porção de fitasimples da molécula se torna emaranhada na matriz do gel. Conforme oambiente desnaturante aumenta, o fragmento de dsDNA irá de dissociarcompletamente e a mobilidade da molécula através do gel é retardada naconcentração de desnaturante em que os domínios de desnaturaçãoparticularmente baixos da fita de DNA se dissociam. Na prática, a eletroforeseé realizada em uma temperatura constante (cerca de 60° C) e os desnaturantesquímicos são utilizados em concentrações que irão resultar em 100% dasmoléculas de DNA sendo desnaturadas (isto é, 40% de formamida e 7 M deuréia). O gradiente desnaturante variável é criado utilizando um marcador degradiente, tal que a composição de cada gel DGGE muda gradualmente de 0%de desnaturante até 100% de desnaturante. Obviamente, os gradientes quecontém um intervalo reduzido de desnaturante (por exemplo, 35% a 60%)também podem ser vertidos para aumentar a separação do DNA.

O princípio utilizado no DGGE também pode ser aplicado aosegundo método que utiliza um gradiente de temperatura ao invés de umgradiente de desnaturante químico. Este método é conhecido comoEletroforese em Gel com Gradiente de Temperatura (TGGE). Este método fazuso de um gradiente de temperatura para induzir a mudança conformacional dodsDNA para o ssDNA para separar os fragmentos de igual tamanho comseqüências diferentes. Como no DGGE, os fragmentos de DNA com diferentesseqüências de nucleotídeos irão se tornar imóveis em diferentes posições dogel. As variações no esquema do primer podem ser utilizadas como vantagemno aumento da utilidade do DGGE para a caracterização e identificação dosprodutos de PCR. Estes métodos e princípios de utilização das variações dosesquemas dos primers estão descritos em PCR Technology Principies andApplications, Henry A. Erlich Ed., M. Stockton Press, NY, págs 71 a 88 (1988).

Exemplos

A presente invenção é ainda exemplificada no seguinte Exemplo.Deve ser entendido que este Exemplo, enquanto indica as realizaçõespreferidas da presente invenção, é dado somente como meio de ilustração.

Exemplo 1

Uma cultura noturna de fungos de Sacchromyces cervasiae (S.cervasiae) em caldo de dextrose de bata foi diluída em série em 5 vezes emuma solução de 1% de triptona com 2 mM de EDTA (tetraacetato de etilenodiamina). Cada diluição foi simultaneamente analisada de acordo com cada umdos três métodos seguintes:

(1) A diluição foi plaqueada em agar de dextrose de batata paradeterminar a concentração de S. cervasiae.(2) Uma porção da amostra foi submetida à Iise celular químicaseguida pela amplificação de PCR utilizando uma levedura ΒΑΧ® System e umkit de detecção do ensaio de bolor (disponível pela DuPont Qualicon1Wilmington, DE), que utiliza primers específicos fúngicos que amplifica umaporção do gene de RNA 18s ribossomal e detecta a amplicon, em uminstrumento ΒΑΧ® System (disponível pela DuPont Qualicon, Wilmington, DE).

(3) Uma porção da amostra foi colocada em um tubo com 0,5 mMde partículas de sílica - zircônio, agitada por 15 minutos em um DisruptorGenie®, e então uma alíquota foi submetida à Iise celular química seguida pelaamplificação de PCR utilizando uma levedura ΒΑΧ® System e um kit dedetecção do ensaio de bolor, que utiliza primers específicos fúngicos queamplifica uma porção do gene de RNA 18s ribossomal e detecta a amplicon,em um instrumento ΒΑΧ® System.

As amostras correram com diferentes quantidades de unidadesformadoras de colônias de S. cervasiae como o sinal de início de acordo com osmétodos 2 a 3 acima. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Conformemostrado abaixo, o método 3 aumenta a sensibilidade da detecção em níveisabaixo de 2 CFU.

Tabela 1

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Claims

1. MÉTODO DE ANÁLISE DE UMA AMOSTRA PARA ADETECÇÃO DA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE UM ORGANISMO DEINTERESSE NA AMOSTRA, caracterizado pelo fato de que dito métodocompreende:(a) a obtenção de uma amostra;(b) submeter a amostra a um tratamento de ruptura suficientepara fracionar quaisquer seqüências de ácido nucléico presentes na amostra; e(c) a detecção para a presença ou ausência de um organismo deinteresse na amostra.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que em dita etapa (b), o tratamento de ruptura compreende aadição de objetos físicos na amostra e a agitação da amostra contendo osobjetos físicos.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que ditos objetos físicos compreendem partículas.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadopelo fato de que ditas partículas compreendem o silício ou o zircônio.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que em dita etapa (b), o tratamento de ruptura compreende umtratamento de ruptura físico, químico ou enzimático.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende ainda, antes de dita etapa (c), uma etapa depreparação da amostra ao conduzir pelo menos um dos seguintes processosna amostra: (1) enriquecimento, (2) separação das células da amostra, (3) Iisecelular, e (4) extração total do DNA.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que dita etapa de preparação compreende a realização doenriquecimento bacteriano e separação das células da amostra antes de ditaetapa (b).

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que dita etapa de preparação compreende a realização doenriquecimento bacteriano, separação das células da amostra e Iise celular,antes de dita etapa (b).

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que em dita etapa de preparação, dita Iise celular é realizadasimultaneamente com ou após dita etapa (b).

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita etapa de detecção (c) compreende a realização daamplificação direcionada ao primer na amostra para produzir um resultado deamplificação, e a análise do resultado da amplificação para um produto daamplificação, em que a presença ou ausência do produto da amplificação éindicativo da presença ou ausência do organismo de interesse na amostra.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que dita etapa de detecção (c) compreende:(i) a obtenção de pelo menos um conjunto de par de primer daamplificação, determinado para amplificar uma seqüência alvo localizadadentro de uma região de seqüência do ácido nucléico repetitivo de um genomado organismo de interesse;(ii) realizar a amplificação direcionada ao primer da amostrautilizando pelo menos um conjunto de par de primer da amplificação paraproduzir um resultado de amplificação; e(iii) analisar o resultado da amplificação de dita etapa (c) (ii) paradetectar a presença ou ausência do produto da amplificação da seqüência alvo,em que a presença ou ausência do produto da amplificação é indicativo dapresença ou ausência do organismo de interesse na amostra.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que em dita etapa (c), a amplificação direcionada aoprimer é uma reação em cadeia da polimerase.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que dita análise do resultado da amplificação érealizada simultaneamente com dita execução da reação em cadeia dapolimerase.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que em dita etapa (c) a dita análise do resultado daamplificação utiliza os métodos de detecção da nuclease 5'.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11,caracterizado pelo fato de que dita etapa (c) possui pelo menos um aumento devezes na sensibilidade na detecção do organismo de interesse quandocomparado à detecção sem a realização de dita etapa (b).

16. MÉTODO DE ANÁLISE DE UMA AMOSTRA PARA ADETECÇÃO DA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE UM ORGANISMO DEINTERESSE NA AMOSTRA, caracterizado pelo fato de que dito métodocompreende:(a) a obtenção da amostra;(b) o enriquecimento da amostra;(c) submeter a amostra enriquecida da etapa (b) a um tratamentode ruptura suficiente para fracionar quaisquer seqüências de ácido nucléicopresentes na amostra; e(d) detecção para a presença ou ausência de um organismo deinteresse na amostra, em que dita etapa de detecção compreende:(i) a obtenção de pelo menos um conjunto de par de primer daamplificação determinado para amplificar uma seqüência alvo localizada dentrode uma região de seqüência do ácido nucléico repetitiva de um genoma doorganismo de interesse;(ii) realizar a amplificação direcionada ao primer da amostrautilizando pelo menos um conjunto de par de primer da amplificação paraproduzir um resultado de amplificação; e(iii) analisar o resultado da amplificação de dita etapa (d) (ii) paradetectar a presença ou ausência do produto da amplificação da seqüência alvo,em que a presença ou ausência do produto da amplificação é indicativo dapresença ou ausência do organismo de interesse na amostra.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pelo fato de que dita etapa (b) compreende o enriquecimento daamostra em um recipiente, em que dita etapa (c) compreende submeter aamostra enriquecida de dita etapa (b) ao dito tratamento de ruptura no mesmorecipiente da etapa (b) sem a remoção da amostra enriquecida do mesmo.