BRPI0612529A2 - conjugados de anticorpo-medicamento de psma - Google Patents

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BRPI0612529A2
BRPI0612529A2 BRPI0612529-8A BRPI0612529A BRPI0612529A2 BR PI0612529 A2 BRPI0612529 A2 BR PI0612529A2 BR PI0612529 A BRPI0612529 A BR PI0612529A BR PI0612529 A2 BRPI0612529 A2 BR PI0612529A2
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psma
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Dangshe Ma
Paul J Maddon
William C Olson
Svetlana O Doronina
Brian E Toki
Peter D Senter
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Psma Dev Company Llc
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Abstract

CONJUGADOS DE ANTICORPO-MEDICAMENTO DE PSMA. Essa invenção se refere, de modo geral, aos conjugados de anticorpo-medicamento (ADCs) Especificamente, a invenção se refere aos ADCs que compreendem um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga ao antigeno de membrana específico da próstata (PSMA) e é conjugado à monometilauristatina norefredina ou monometilauristatina fenilalanina. O conjugado de anticorpo-medicamento possui uma seletividade de célula PC-3^TM^ em relação à célula C4-2 ou LNCaP^TM^ de pelo menos 250. A invenção também se refere, em parte, às composições e aos métodos de uso de ADCs. Os métodos fornecidos incluem, por exemplo, métodos para tratar uma doença mediada por PSMA.

Description

"CONJUGADOS DE ANTICORPO-MEDICAMENTO DE PSMA"PEDIDOS CORRELATOS
Esse pedido reivindica o beneficio de acordo com35 U.S.C. §119 do Pedido Provisório dos Estados Unidos60/692.399, depositado em 20 de junho de 2005 e PedidoProvisório dos Estados Unidos número 60/792.360, depositadoem 14 de abril de 2006, o conteúdo dos mesmos sendoincorporado aqui como referência em sua totalidade.
SUPORTE GOVERNAMENTAL
Os aspectos da invenção foram constituídos empre-gando os fundos do National Institutes of Health GrantsCA107 653 (DM) e CA96075 (GPD) . Consequentemente, o governopossui direitos com relação a essa invenção.
CAMPO DA INVENÇÃO
Essa invenção se refere, de modo geral, aos conju-gados de anticorpo-medicamento (ADCs). Especificamente, ainvenção se refere aos ADCs que compreendem um anticorpo oufragmento de ligação de antígeno do mesmo que se liga aoantígeno de membrana específico da próstata (PSMA) e éconjugado à monometilauristatina norefedrina (MMAE) oumonometilauristatina fenilalanina (MMAF). 0 conjugado deanticorpo-medicamento possui uma seletividade de célula PC-3™ em relação à célula C4-2 ou LNCaP™ de pelo menos 250. Ainvenção também se refere, em parte, às composições e aosmétodos de uso de ADCs. Os métodos fornecidos incluem, porexemplo, métodos para tratar uma doença mediada por PSMA.ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
O câncer da próstata é a doença mais comum e asegunda causa lider de morte por câncer em homens nosEstados Unidos (Jemal A, e outros, CA Câncer J. Clin 2005;
55:10-30). O câncer de próstata localizado é tratadotipicamente com cirurgia ou radiação e doença recorrentepode ser controlada temporariamente com ablação deandrogênio (Klein E. A, e outros, Urol Clin North Am 2003;30:315-30). Contudo, quase todos carcinomas de próstataeventualmente se tornam refratários ao hormônio e entãoprogridem rapidamente (Denmeade SR, e outros, Nat Rev Câncer2002; 2:389-96). O câncer da próstata independente deandrogênio ou refratário ao hormônio provou ser amplamenteresistente à quimioterapia convencional. Com a exceção docuidado paliativo, a única quimioterapia aprovada é doce-taxel em combinação com prednisona, que oferece um beneficiode sobrevivência modesto (2,4 meses) Gulley J, e outros, AmJ. Ther. 2004; 351:1513-20; Petrylak DP, e outros, New EnglJ Med 2004; 351:1513-20). São necessárias novas terapiasmolecularmente alvejadas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção provida aqui se refere aos ADCs queexibem seletividade especificamente alta. Em um aspecto dainvenção, um conjugado de anticorpo-medicamento é provido,compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antí-geno do mesmo, que se liga ao PSMA e é conjugado paramonometilauristatina norefedrina ou monometilauristatinafenilalanina, onde o conjugado de anticorpo-medicamentopossui uma seletividade de célula PC-3™ para célula C4-2 ouLNCaP™ de pelo menos 250. Em uma modalidade, a seletividadeé de pelo menos 500, 1.000, 2.500, 6.000 ou 13.000. Em outramodalidade, a seletividade é de 1.567, 6.286 ou 13.636. Emalgumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação deantigeno do mesmo é conjugado em pelo menos 3, 4 ou 5moléculas de monometilauristatina norefredina ou monometi-lauristatina fenilalanina.
São providos aqui, em algumas modalidades, exemplosde anticorpos que podem ser usados nas composições e métodosda invenção. Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmentode ligação de antigeno do mesmo é um anticorpo monoclonal oufragmento de ligação de antigeno do mesmo que se ligaespecificamente ao PSMA. Ainda em outra modalidade, o anti-corpo ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo é umanticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de antigeno domesmo que se liga especificamente a um domínio extracelulardo PSMA. Em uma modalidade adicional, o anticorpo ou frag-mento de ligação de antigeno do mesmo é um anticorpomonoclonal ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo quese liga especificamente a um epítopo conformacional do PSMA.
Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmentode ligação de antigeno do mesmo i) inibe competitivamente aligação específica de um segundo anticorpo ao seu epítopoalvo no PSMA, ou ii) se liga a um epítopo em PSMA definidopor um anticorpo selecionado do grupo consistindo no PSMA3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1,Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3,Abgenix 4.a28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1,Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1 eAbgenix 4.152.1. Em outras modalidades, o anticorpo oufragmento de ligação de antigeno do mesmo se liga a umepitopo no PSMA definido por um anticorpo selecionado dogrupo consistindo em anticorpos compreendendo (a) uma cadeiapesada codificada por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma região ou regiões de codificação de umaseqüência de nucleotideo selecionada do grupo consistindonas seqüências de nucleotideo estabelecidas como SEQ ID NOs:2-7, e (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula deácido nucléico compreendendo uma região ou regiões decodificação de uma seqüência de nucleotideo selecionada dogrupo consistindo nas seqüências de nucleotideo estabele-cidas como SEQ ID NOs: 8-13.
Em algumas modalidades, o segundo anticorpo éselecionado do grupo consistindo no PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3,PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2,Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1 , Abgenix 4.4.1 , Abgenix4.177.3, Abgenix 4.16.1 , Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3,Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1,Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1, Abgenix 4.152.1 eanticorpos compreendendo (a) uma cadeia pesada codificadapor uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma regiãoou regiões de codificação de uma seqüência de nucleotideoselecionada do grupo consistindo nas seqüências de nucleo-tideo estabelecidas como SEQ ID NOs: 2-7, e (b) uma cadeialeve codificada por uma molécula de ácido nucléico compre-endendo uma região ou regiões de codificação de uma seqüên-cia de nucleotideo selecionada do grupo consistindo nasseqüências de nucleotideo estabelecidas como SEQ ID NOs: 8-13.
Em outras modalidades, o segundo anticorpo é sele-cionado do grupo consistindo em AB-PG1-XG1-006, AB-PGl-XGl-026 e anticorpos compreendendo (a) uma cadeia pesada codifi-cada por uma molécula de ácido nucléico compreendendo umaregião ou regiões de codificação de uma seqüência de nucleo-tideo selecionada do grupo consistindo nas seqüências denucleotideo estabelecidas como SEQ ID NOs: 2 e .3, e (b) umacadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma região ou regiões de codificação de umaseqüência de nucleotideo selecionada do grupo consistindonas seqüências de nucleotideo estabelecidas como SEQ ID NOs:8 e 9. Em uma modalidade, o segundo anticorpo compreende (a)uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácidonucléico compreendendo uma região ou regiões de codificaçãode uma seqüência de nucleotideo estabelecida como SEQ ID NO:2, e (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula deácido nucléico compreendendo uma região ou regiões decodificação de uma seqüência de nucleotideo estabelecidacomo SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade adicional, o segundoanticorpo compreende (a) uma cadeia pesada codificada poruma molécula de ácido nucléico compreendendo uma região ouregiões de codificação de uma seqüência de nucleotideoestabelecida como SEQ ID NO: 3, e (b) uma cadeia leve codi-ficada por uma molécula de ácido nucléico compreendendo umaregião ou regiões de codificação de uma seqüência denucleotideo estabelecida como SEQ ID NO: 9. Em algumasmodalidades, o anticorpo do conjugado de anticorpo-medica-mento é um anticorpo codificado por uma molécula de ácidonucléico compreendendo uma seqüência de nucleotideo que é depelo menos 90% idêntica a uma seqüência de nucleotideocodificando um anticorpo selecionado do grupo consistindo emAB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026 e anticorpos compreendendo(a) uma cadeia pesada codificada por uma molécula de ácidonucléico compreendendo uma região ou regiões de codificaçãode uma seqüência de nucleotideo selecionada do grupoconsistindo nas seqüências de nucleotideo estabelecidas comoSEQ ID NOs: 2 e 3, e (b) uma cadeia leve codificada por umamolécula de ácido nucléico compreendendo uma região ouregiões de codificação de uma seqüência de nucleotideo sele-cionada do grupo consistindo nas seqüências de nucleotideoestabelecidas como SEQ ID NOs: 8 e 9. Em uma modalidade, oanticorpo é codificado por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma seqüência de nucleotideo que é de pelomenos 95% idêntica. Em outra modalidade, o anticorpo é codi-ficado por uma molécula de ácido nucléico compreendendo umaseqüência de nucleotideo que é de pelo menos 97% idêntica.Ainda em outra modalidade, o anticorpo é codificado por umamolécula de ácido nucléico compreendendo uma seqüência denucleotideo que é de pelo menos 98% idêntica. Em umamodalidade adicional, o anticorpo é codificado por uma molé-cula de ácido nucléico compreendendo uma seqüência denucleotideo que é de pelo menos 99% idêntica.
Em outras modalidades, o anticorpo ou fragmento deligação de antigeno do mesmo, dos conjugados de anticorpo-medicamento providos aqui é AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026ou um fragmento de ligação de antigeno do mesmo. Ainda emoutras modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação deantigeno do mesmo é selecionado do grupo consistindo emanticorpos compreendendo (a) uma cadeia pesada codificadapor uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma regiãoou regiões de codificação de uma seqüência de nucleotideoselecionada do grupo consistindo nas seqüências de nucleo-tideo estabelecidas como SEQ ID NOs.: 2 e 3, e (b) uma cadeialeve codificada por uma molécula de ácido nucléico compre-endendo uma região ou regiões de codificação de uma seqüên-cia de nucleotideo selecionada do grupo consistindo nasseqüências de nucleotideo estabelecidas como SEQ ID NOs: 8 e9, e fragmentos de ligação de antigeno dos mesmos. Em umamodalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação de antigenodo mesmo compreende (a) uma cadeia pesada codificada por umamolécula de ácido nucléico compreendendo uma região ouregiões de codificação de uma seqüência de nucleotideo esta-belecida como SEQ ID NO: 2, e (b) uma cadeia leve codificadapor uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma regiãoou regiões de codificação de uma seqüência de nucleotideoestabelecida como SEQ ID NO: 8, e fragmentos de ligação deantigeno dos mesmos. Em outra modalidade, o anticorpo oufragmento de ligação de antigeno do mesmo compreende (a) umacadeia pesada codificada por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma região ou regiões de codificação de umaseqüência de nucleotideo estabelecida como SEQ ID NO: 3, e(b) uma cadeia leve codificada por uma molécula de ácidonucléico compreendendo uma região ou regiões de codificaçãode uma seqüência de nucleotideo estabelecida como SEQ ID NO:9, e fragmentos de ligação de antigeno dos mesmos.
Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmentode ligação de antigeno do mesmo é IgGl, IgG2, IgG3, IgG4,IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD, IgE ou possui constante deimunoglobulina e/ou domínio variável de IgGl, IgG2, IgG3,IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD ou IgE.
Nas concretizações adicionais, o anticorpo é umanticorpo monoclonal. Ainda em outras modalidades, o anti-corpo é um anticorpo humanizado. Também em outras modali-dades, o anticorpo é um anticorpo humano. Ainda em outrasmodalidades, o anticorpo é um anticorpo recombinante. Nasconcretizações adicionais, o anticorpo é um anticorpo quimé-rico. Ainda nas modalidades adicionais, o anticorpo é umanticorpo biespecífico ou multiespecífico. Ainda em outrasmodalidades, o anticorpo é um anticorpo de cadeia simples.
Em outras modalidades, o fragmento de ligação deantigeno é um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2 ou umfragmento Fv. Ainda em outras modalidades, o fragmento deligação de antigeno é um fragmento contendo CDR3.
Em algumas modalidades, a monometilauristatinanorefredina (MMAE) ou monometilauristatina fenilalanina(MMAF) é conjugada ao anticorpo ou fragmento de ligação deantigeno do mesmo com um composto da fórmula (Fórmula 1) -An-Ym-Zm-Xn-Wn-, onde A é uma unidade acila carboxílica; Y éum aminoácido; Z é um aminoácido; XeW são cada umespaçador auto imolativo; η é um inteiro de 0 ou 1; e m é uminteiro de 0 ou 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Em algumas modalidades,o conjugado da presente invenção é representado pela fórmula(Fórmula 2): L-(An-Ym-Zm-Xn-Wn-D)p onde L é um anticorpo oufragmento de ligação de antigeno do mesmo que se liga aoPSMA, D é MMAE ou MMAF e ρ é um inteiro de 1, 2, 3, 4, 5, 6,7 ou 8. 0 restante dos componentes do conjugado são conformedefinidos imediatamente acima. Em uma modalidade, a unidadecarboxílica xxAn" é ligada ao anticorpo ou fragmento deligação de antigeno do mesmo através de um átomo de enxofredo anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo:
<formula>formula see original document page 10</formula>
Em uma modalidade, A é:
<formula>formula see original document page 10</formula>onde q é 1-10. Portanto, em uma modalidade, o con-jugado da Fórmula 2 é:
<formula>formula see original document page 11</formula>
onde L, Υ, Ζ, X, W, D, n, m, q e ρ são conformedefinidos anteriormente.
Em outra modalidade, A é 4-(N-succinimidometil)cicloexano-l-carbonila, m-succinimidobenzoila, 4-(p-succini-midofenil)-butirila, 4-(2-acetamido)benzoila, 3-tiopropio-nila, 4-(1-tioetil)-benzoila, 6-(3-tiopropionilamido)-hexa-noila ou maleimida caproila. Em uma modalidade adicional, Aé maleimida caproila.
Em outra modalidade, Y é alanina, valina, leucina,isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina.Ainda em outra modalidade, Y é valina. Em uma modalidadeadicional, Z é lisina, lisina protegida com acetila ouformila, arginina, arginina protegida com tosila ou gruposnitro, histidina, ornitina, ornitina protegida com acetilaou formila ou citrulina. Ainda em outra modalidade, Z écitrulina. Em uma modalidade Ym-Zm é valina-citrulina. Emoutra modalidade, Ym-Zm é uma seqüência de proteína que éseletivamente clivável por uma protease.
Em uma modalidade adicional, X é um compostopossuindo a fórmula:<formula>formula see original document page 12</formula>
onde T é 0, Ν, ou S. Em outra modalidade, X é umcomposto possuindo a fórmula -HN-R1 -COT onde R1 é alquilaC1-C5, T é 0, N ou S. Em uma modalidade adicional, X é umcomposto possuindo a fórmula:
<formula>formula see original document page 12</formula>
onde T é 0, N, ou S, R2 é H ou alquila C1-C5. Emuma modalidade, X é p-aminobenzilcarbamoilóxi. Em outramodalidade, X é álcool p-aminobenzilico. Em uma modalidadeadicional, X é p-aminobenzilcarbamato. Ainda em uma modali-dade adicional, X é p-aminobenziloxicarbonila. Em outramodalidade, X é ácido γ-aminobutírico; ácido α,α-dimetil γ-aminobutirico ou ácido β,β-dimetil γ-aminobutírico.
Em algumas modalidades, W é:
<formula>formula see original document page 12</formula>
onde T é 0, S ou N.Em outras modalidades, m e η são 0.
Em uma modalidade, o conjugado de anticorpo-medi-camento é AB-PGl-XGl-006-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil-monometilauristatina norefredina.
Em outra modalidade, o conjugado de anticorpo-medicamento éAB-PGl-XGl-006-maleimida caproil-valina-citrulina-p-amino-benziloxicarbonil-monometilauristatina fenilalanina. Em umamodalidade adicional, o conjugado de anticorpo-medicamento éAB-PGl-XGl-00 6-maleimida caproil-monometilauristatina feni-lalanina. Em outra modalidade, o conjugado de anticorpo-medicamento é AB-PGl-XGl-026-maleimida caproil-valina-citru-lina-p-aminobenziloxicarbonil^monometilauristatina norefre-dina. Ainda em outra modalidade, o conjugado de anticorpo-medicamento é AB-PGl-XG1-02 β-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil-monometilauristatina feni-lalanina. Em uma modalidade adicional, o conjugado deanticorpo-medicamento é AB-PG1-XG1-02β-maleimida caproil-monometilauristatina fenilalanina. Em outra modalidade, oconjugado de anticorpo-medicamento é um anticorpo de ligaçãoao PSMA ou fragmento de ligação de antigeno do mesmoconjugado no composto conforme mostrado na Figura 6A, Figura6B ou Figura 6C.
Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo-medicamento se liga às células vivas. Em uma modalidade, acélula é uma célula tumoral. Em outra modalidade, a célulatumoral é uma célula de tumor da próstata. Em uma modalidadeadicional, a célula tumoral é uma célula da neovasculaturade um tumor que não o da próstata. Em outras modalidades, oconjugado de anticorpo-medicamento não requer Iise da célulapara se ligar ao PSMA. Ainda em outras modalidades, oconjugado de anticorpo-medicamento leva à interrupção dociclo celular. Ainda em outras modalidades, o conjugado deanticorpo-medicamento inibe o crescimento das célulasexpressando PSMA. Em uma modalidade, o conjugado deanticorpo-medicamento media morte de célula especifica dascélulas expressando o PSMA com um IC5o inferior a 1 χ IO"10Μ. Em outra modalidade, o IC50 é inferior a 1 χ IO"11. Aindaem outra modalidade, o IC50 é inferior a 1 χ IO"12 Μ. Em umamodalidade adicional, o conjugado de anticorpo-medicamentomedia morte de célula especifica das células expressandoPSMA com um IC50 de 42 a 208 χ IO-12M. Ainda em outra modali-dade, o conjugado de anticorpo-medicamento media morte decélula especifica de células expressando PSMA com um IC50 de42 a 208 χ IO"10 Μ. Ainda em uma modalidade adicional, oconjugado de anticorpo-medicamento media morte de célulaespecifica de células expressando PSMA com um IC5o de 60 a208 χ IO"12 M. Em outra modalidade, o conjugado de anticorpo-medicamento media morte de célula especifica de célulasexpressando PSMA com um IC50 de 65 a 208 χ IO"12 Μ. Em umamodalidade, o conjugado de anticorpo-medicamento media mortede célula especifica de células expressando PSMA com um IC50de 11 χ IO"12 M. Em outra modalidade, o conjugado deanticorpo-medicamento media morte de célula especifica decélulas expressando PSMA com um IC5o de 42 χ IO"11 Μ. Aindaem outra modalidade, o conjugado de anticorpo-medicamentomedia morte de célula especifica de células expressando PSMAcom um IC50 de 60 χ IO"12 Μ. Em uma modalidade adicional, oconjugado de anticorpo-medicamento media morte de célulaespecifica de células expressando PSMA com um IC50 de 83 χIO"12 Μ.
Em outra modalidade, o conjugado de anticorpo-medicamento, quando administrado aos camundongos com umregime de q4d χ 6 em uma dose de 6 mg/kg efetua uma taxa decura de pelo menos 20%, 30%, 40% ou 50%. Em uma modalidade,a taxa de cura é de 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oumais. Em uma modalidade, os camundongos são aqueles que sãoum modelo de câncer de próstata humano independente deandrogênio. Em outra modalidade, os camundongos são camun-dongos nus enxertados intramuscularmente com células C4-2 napata posterior esquerda. Em uma modalidade adicional, oscamundongos são aqueles conforme fornecidos nos Exemplos.
Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo-medicamento é ligado a um marcador. Em outras modalidades, omarcador é um marcador fluorescente, um marcador de enzima,um marcador radioativo, um marcador ativo de ressonânciamagnética nuclear, um marcador luminescente ou um marcadorde cromoforo.
Em algumas modalidades, o conjugado de anticorpo-medicamento é embalado em uma forma liofilisada. Em outrasmodalidades, o conjugado de anticorpo-medicamento é embaladoem um meio aquoso. Nas concretizações adicionais, o conju-gado de anticorpo-medicamento está na forma estéril.
Também são providas aqui as composições compreen-dendo um ou mais conjugados de anticorpo-medicamento. Emalgumas modalidades, a composição compreende dois ou maisconjugados de anticorpo-medicamento diferentes. Em outrasmodalidades, é provida uma composição compreendendo um oumais conjugados de anticorpo-medicamento e um ou maisanticorpos anti-PSMA não conjugados.
Em algumas modalidades, a composição compreendeadicionalmente um veiculo farmaceuticamente aceitável, exci-piente ou estabilizador. Em outras modalidades, a composiçãocompreende, adicionalmente, um agente antitumor, um agenteimunoestimulador, um imunomodulador, um corticosteróide ouuma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o agente anti-tumor é um agente citotóxico, um agente que atua na neovas-culatura do tumor ou uma combinação dos mesmos. Em outramodalidade, o agente antitumor é docetaxel. Ainda em outramodalidade, o imunomodulador é uma citocina, quimiocina,adjuvante ou uma combinação dos mesmos. Ainda em outramodalidade, o agente imunoestimulador é interleucina-2, a-interferon, γ-interferon, fator-a de necrose de tumor,oligonucleotideos imunoestimuladores ou uma combinação dosmesmos. Em uma modalidade adicional, o corticosteróide éprednisona ou hidrocortisona. Ainda em outra modalidade, acomposição compreende prednisona e docetaxel.
São providos vários métodos para uso dos conjuga-dos de anticorpo-medicamento e composições da invenção. Emuma modalidade, é provido um método para inibição docrescimento da célula expressando PSMA compreendendo contatoda célula expressando PSMA com uma quantidade de um conju-gado de anticorpo-medicamento eficaz para inibir o cresci-mento da célula expressando PSMA. Em outra modalidade, éprovido um método para efetuar interrupção do ciclo celularem uma célula expressando PSMA compreendendo contatando acélula expressando PSMA com uma quantidade de um conjugadode anticorpo-medicamento eficaz para levar a interrupção dociclo celular na célula expressando PSMA. Ainda em outramodalidade, é provido um método para tratamento de doençamediada por PSMA compreendendo administração a um indivíduoportador da doença mediada por PSMA de uma quantidade de umconjugado de anticorpo-medicamento eficaz para tratar adoença mediada por PSMA. Em uma modalidade adicional, éprovido um método para inibir o crescimento de um tumorcompreendendo contato das células expressando PSMA da neo-vasculatura do tumor com uma quantidade de um conjugado deanticorpo-medicamento eficaz para inibir o crescimento dotumor.
Em uma modalidade, a doença mediada por PSMA écâncer. Em outra modalidade, o câncer é um câncer da prósta-ta. Ainda em outra modalidade, o câncer não é câncer dapróstata. Em algumas modalidades, o câncer que não é câncerda próstata é câncer da bexiga, câncer pancreático, câncerpulmonar, câncer dos rins, sarcoma, câncer de mama, câncerdo cérebro, carcinoma neuroendócrino, câncer de cólon,câncer testicular ou melanoma.
Em algumas modalidades, o método compreende, adi-cionalmente, co-administração de outro agente terapêuticopara tratar a doença mediada por PSMA. Em outras moda-lidades, o método compreende, adicionalmente, contato dacélula expressando PSMAs com outro agente terapêutico. Emalgumas modalidades, o outro agente terapêutico é adminis-trado antes, durante ou após a administração do conjugado deanticorpo-medicamento. Em uma modalidade, o outro agenteterapêutico é um agente antitumor, um agente imunoestimu-lador, um imunomodulador, um corticosteróide ou uma combi-nação dos mesmos. Em outra modalidade, o agente antitumor éum agente citotóxico, um agente que atua na neovasculaturado tumor ou uma combinação dos mesmos. Ainda em outramodalidade, o agente antitumor é docetaxel. Ainda em outramodalidade, o imunomodulador é uma citocina, quimiocina,adjuvante ou uma combinação dos mesmos. Ainda em outra moda-lidade, o agente imunoestimulador é interleucina-2, a-interferon, γ-interferon, fator-a de necrose de tumor,oligonucleotideos imunoestimuladores ou uma combinação dosmesmos. Em uma modalidade adicional, o corticosteróide éprednisona ou hidrocortisona. Em uma modalidade, o agenteterapêutico é uma vacina.. Em outra modalidade, a vacinaimuniza o indivíduo contra PSMA. Em outra modalidade, ométodo compreende, adicionalmente, administração de outroagente terapêutico. Em uma modalidade, ainda o outro agenteterapêutico é prednisona. Em uma modalidade, portanto, amboso docetaxel e a prednisona são administrados.
A célula expressando PSMA, em algumas modalidades,é uma célula tumoral da próstata ou uma célula da neovas-culatura de um tumor diferente daquele da próstata. Emalgumas modalidades, a célula expressando PSMA é uma céluladependente de androgênio ou uma célula independente deandrogênio.
Cada uma das limitações da invenção engloba váriasmodalidades da invenção. Portanto, é antecipado que cada umadas limitações da invenção envolvendo qualquer elemento oucombinação de elementos pode ser incluída em cada aspecto dainvenção.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 é um gráfico que mostra a porcentagemde internalização e ligação total de mAb de PSMA marcado111In nas células C4-2. As células C4-2 foram incubadas commAb marcado 111In a 37 °C, CO2 a 5%. Nas épocas designadas, ascélulas foram lavadas para remover mAb não ligado e mAbligado a superfície foi extraído usando um tampão de pHbaixo. A radioatividade (contagens por minuto (CPM)) doeluído de pH baixo e microesfera de célula foi contadaseparadamente usando um contador gama. A porcentagem deinternalização (Figura IA) foi calculada como CPM damicroesfera de célula/(CMP da microesfera de célula + CMP doeluato de pH baixo) χ 100. A ligação total (Figura 1B)representa a CMP da microesfera de célula mais a CPM doeluato de pH baixo.
A Figura 2 é um gráfico mostrando a ligação de mAbde PSMA e ADC para células 3T3™-PSMA. Células 3T3™-PSMAforam incubadas com concentrações crescentes de mAb do PSMA(quadrados cheios), ADC do PSMA (quadrados abertos) ou ADCde controle de isotipo (triângulos abertos). As célulasforam incubadas sobre gelo por 1 hora e lavadas para removermAb ou ADC não ligado. As células foram então incubadas comIgG-GITC anti-humano de cabra, lavadas novamente eexaminadas quanto a citometria de fluxo. Intensidades defluorescência médias (MFIs) foram colocadas em forma degráfico como uma função da concentração de mAb ou ADC.
A Figura 3 é um gráfico mostrando a citotoxicidadein vitro de ADC de PSMA e ADC de controle nas linhagenscelulares de câncer da próstata PSMA positivo e PSMAnegativo. As células C4-2 PSMA positivo (Figura 3A) ecélulas PC-3™ de PSMA negativo (Figura 3B) em microplacas de96 poços foram expostas aos ADCs em várias concentrações.Após 96 horas, a sobrevivência celular nas culturas tratadase não tratadas foi avaliada usando Alamar Blue.
A Figura 4 é um gráfico mostrando a sobrevivênciaKaplan-Meier e níveis de PSA no soro em um estudo dexenoenxerto. Os camundongos nus foram implantados intramus-cularmente com células C4-2, cedidos aleatoriamente aosgrupos de tratamento (6 camundongos por grupo) de acordo como PSA do soro no dia 17 e então tratados q4d χ 3 com ADC doPSMA ou veículo. A Figura 4A mostra a sobrevivência dosanimais tratados com 0 (controle de veículo, linha pontilha-da), 2 mg/kg (linha cheia fina) e 10 mg/kg de ADC do PSMA. AFigura 4B provê os valores médios de PSA em 30 dias noscamundongos tratados com 0 (colunas cheias), 2 mg/kg (colunasvazias) e 10 mg/kg (colunas abertas) de ADC de PSMA. Osdados do dia 30 para o grupo de controle incluem avaliaçõesdo dia 27 para dois camundongos que não sobreviveram 30dias.A Figura 5 mostra curvas de sobrevivência Kaplan-Meier de animais tratados em outro estudo de xenoenxerto. Oscamundongos nus foram implantados intramuscularmente comcélulas C4-2, aleatoriamente cedidos aos grupos de trata-mento (5 camundongos por grupo) de acordo com o PSA do sorono dia 14 e então tratados q4d χ 6 com ADC do PSMA econtroles. Os camundongos foram tratados com 0 (controle doveiculo, círculos cheios), 6 mg/kg de mAb do PSMA nãomodificado (triângulos cheios), 6 mg/kg ADC de controle(triângulos abertos), 3 mg/kg ADC do PSMA (quadradosabertos) e 6 mg/kg de ADC do PSMA (quadrados cheios).
A Figura 6 mostra as estruturas químicas de trêsligantes de medicamento diferentes. A Figura 6A provê aestrutura de vcMMAe (maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenζiloxicarbonil- monometilauristatina Ε). A Figura 6Bprovê a estrutura de vcMMAF (maleimidocaproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil-monometilauristatina F).
A Figura 6C provê a estrutura de mcMMAF (maleimidocaproil-monometillauristatina F).
A Figura 7 demonstra a citotoxicidade in vivo deADCs do PSMA (vcMMAE (Figura 7A), vcMMAF (Figura 7B), mcMMAF(Figura IC)) em linhagens celulares de câncer da próstatapositivo-PSMA (C4-2) e negativo-PSMA (PC-3™). As células nasmicroplacas de 96 poços foram expostas aos ADCs em váriasconcentrações. Após 4 dias, a sobrevivência celular nasculturas tratadas e não tratadas foi avaliada usando AlamarBlue.A Figura 8 ilustra os efeitos de ADC do PSMA nociclo celular. Em cada painel, o pico a esquerda correspondeà fase Gi e o pico a direita à fase G2/M. A porcentagem decélulas em G2/M aumentou marcantemente quando do tratamentocom ADC de PSMA, consistente com uma parada na divisãocélula que ocorre após síntese de DNA. 0 ADC de PSMA nãoafetou a ciclagem das células 3T3™ parenterais.
A Figura 9 mostra os resultados de uma comparaçãode ADCs de PSMA versus vcMMAF.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção se refere, em parte, à desco-berta surpreendente de que os ADCs compreendendo anticorpode ligação ao PSMA ou fragmento de ligação de antígeno domesmo conjugado à MMAE (também referida aqui como monome-tilauristatina E e monometilauristatina norefredina) ou MMAF(também referida aqui como monometilauristatina F e monome-tilauristatina fenilalanina) são especificamente úteis paraexterminar células expressando PSMA. Os ADCs podem ter umaseletividade de célula PC-3™ para célula C4-2 ou LNCaP™ depelo menos 250. Em algumas modalidades, os ADCs exibemdeterminados níveis de extermínio de célula (de célulasexpressando PSMA), por exemplo, valores de IC50 que estão ouestão próximos das concentrações picomolares. Em outrasmodalidades, os ADCs afetam a taxa de cura de pelo menos20%, 30%, 40% ou 50% em camundongos tratados com ADC com umregime de q4d χ 6 em uma dose de 6 mg/kg. Portanto,composições e métodos do uso desses ADCs são providos. Emalgumas modalidades, os camundongos são aqueles conformefornecidos nos Exemplos. Em uma modalidade, os camundongossão aqueles que são um modelo de câncer de próstata humanoindependente de androgênio. Em outra modalidade, oscamundongos são camundongos nus enxertados com células C4-2intramuscularmente na pata traseira esquerda.
Os anticorpos ou fragmentos de ligação de antigenodos mesmos dos ADCs são qualquer anticorpo ou fragmento deligação de antigeno do mesmo que se liga ao PSMA. Em umamodalidade, o anticorpo ou um fragmento de ligação de antí-geno do mesmo se liga especificamente ao PSMA (por exemplo,se liga especificamente a um domínio extracelular de PSMA,se liga especificamente a um epítopo conformacional de PSMA,etc.) e pode inibir competitivamente a ligação específica deum segundo anticorpo ao seu epítopo alvo em PSMA, onde osegundo anticorpo é selecionado do grupo consistindo em PSMA3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1,Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22,3,Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1,Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1,Abgenix 4.152.1 e anticorpos compreendendo (a) uma cadeiapesada codificada por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma região ou regiões de codificação de umaseqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindonas seqüências de nucleotídeo estabelecidas como SEQ ID NOs:2-7, e (b) uma cadeia leve codificada por uma molécula deácido nucléico compreendendo uma região ou regiões de codi-ficação de uma seqüência de nucleotideo selecionada do grupoconsistindo nas seqüências de nucleotideo estabelecidas comoSEQ ID NOs: 8-13. 0 segundo anticorpo, portanto, incluiquaisquer anticorpos produzidos por hibridomas ou codifi-cados por plasmideos mostrados abaixo na Tabela 1. Esseshibridomas e plasmideos foram depositados de acordo com osrequisitos do Tratado de Budapeste com Relação aoReconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismospara os Fins de Procedimentos de Patente na American TypeCulture Collection ("ATCC") como uma Autoridade DepositáriaInternacional e fornecidas as Designações de Depósito dePatente mostradas acima e na Tabela 1.
TABELA 1
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Para determinar inibição competitiva, váriosensaios conhecidos dos versados na técnica podem serempregados. Por exemplo, ensaios de competição cruzada podemser empregados para determinar se um anticorpo ou fragmentode ligação de antigeno do mesmo inibe competitivamenteligação ao PSMA por outro anticorpo ou fragmento de ligaçãode antigeno do mesmo. Esses incluem métodos à base de célulasempregando citometria de fluxo ou análise de ligação de fasesólida. Também podem ser usados outros ensaios que avaliam acapacidade dos anticorpos ou fragmentos de ligação deantigeno dos mesmos de competição cruzada para moléculas dePSMA que não são expressas na superfície das células, nafase sólida ou na fase de solução.
Em algumas modalidades, os anticorpos ou fragmentosde ligação de antigeno dos mesmos inibem competitivamente aligação específica de um segundo anticorpo ao seu epítopoalvo no PSMA em pelo menos cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%,60%, 70%, 80%, 90%, 95%, ou 99%. A inibição pode ser avalia-das em várias taxas molares ou taxas de massa; por exemplo,experimentos de ligação competitiva podem ser conduzidos com2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 7 vezes, 10 vezes oumais excesso molar de um primeiro anticorpo ou fragmento deligação de antigeno do mesmo em relação a um segundoanticorpo ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo.
Em outra modalidade o anticorpo ou um fragmento deligação de antigeno do mesmo se liga, especificamente, a umepitopo no PSMA definido por um anticorpo selecionado dogrupo consistindo em PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3,PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, 4.248.2, 4.360.3, 4.7.1, 4.4.1,4.177.3, 4.16.1, 4.22.3, 4.28.3, 4.40.2, 4.48.3, 4.49.1,4.209.3, 4.219.3, 4.288.1, 4.333.1, 4.54.1, 4.153.1,4.232.3, 4.292.3, 4.304.1, 4.78.1, e 4.152.1. PSMA 3.7, PSMA3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2,Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3,Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1,Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1, Abgenix 4.152.1 eanticorpos compreendendo (a) uma cadeia pesada codificadapor uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma regiãoou regiões de codificação de uma seqüência de nucleotideoselecionada do grupo consistindo nas seqüências denucleotideo estabelecidas como SEQ ID NOs: 2-7, e (b) umacadeia leve codificada por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma região ou regiões de codificação de umaseqüência de nucleotideo selecionada do grupo consistindonas seqüências de nucleotideo estabelecidas como SEQ ID NOs:8-13. Os anticorpos ou fragmentos de ligação de antigeno dosADCs, portanto, incluem aqueles que se ligam especificamentea um epitopo em PSMA definido pelos anticorpos produzidospelos hibridomas ou codificados pelos plasmideos providosacima, na Tabela 1.
Para determinar o epitopo, pode-se empregar métodosde mapeamento padrão do epitopo conhecidos na técnica. Porexemplo, fragmentos (peptídeos) de antigeno do PSMA (porexemplo, peptídeos sintéticos) que se ligam ao anticorpopodem ser usados para determinar se um anticorpo candidatoou fragmento de ligação de antigeno do mesmo se liga aomesmo epitopo. Para epítopos lineares, sobrepondo peptídeosde um comprimento definido (por exemplo, 8 ou mais amino-ácidos) são sintetizados. Os peptídeos podem ser ramificadospor 1 aminoácido, tal que, uma série de peptídeos cobrindocada fragmento de 8 aminoácidos da seqüência de proteína dePSMA são preparados. Poucos peptídeos podem ser preparadosusando ramificações maiores, por exemplo, de 2 ou 3 amino-ácidos. Além disso, os peptídeos maiores (por exemplo, de 9,10 ou 11 mers) podem ser sintetizados. A ligação dospeptídeos aos anticorpos ou fragmentos de ligação deantigeno pode ser determinada usando metodologias padrãoincluindo ressonância de plasmônio de superfície (BIAC0RE) eensaios ELISA. Para exame dos epítopos conformacionais,podem ser empregados fragmentos de PSMA maiores. Outrosmétodos que empregam espectrometria de massa para definirepitopos conformacionais foram descritos e podem ser usados(vide, por exemplo, Baerga-Ortiz e outros, Protein Science11:1300-1308, 2002 e referências citadas aqui). Ainda outrosmétodos para determinação do epitopo são providos nostrabalhos de referência laboratorial padrão, tais como,Unidade 6.8 ("Phage Display Selection and Analysis of B-cellEpitopes") e Unidade 9.8 ("Identification of AntigenicDeterminants Using Synthetic Peptide Combinatorial Libraries")de Current Protocols in Immunology, Coligan e outros, eds. ,John Wiley & Sons. Os epitopos podem ser confirmados porintrodução de mutações ou deleções de ponto em um epitopoconhecido e então testando a ligação com um ou maisanticorpos ou fragmentos de ligação de antigeno, para deter-minar quais mutações reduzem a ligação dos anticorpos oufragmentos de ligação de antigeno.
Nas modalidades especificas, os anticorpos dosADCs, ou dos quais se derivam os fragmentos de ligação deantigeno ADCs, são aqueles produzidos por hibridomas refe-ridos aqui como PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11,PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMAA3.1.3, PSMA A3.3.1, Abgenix 4.248.2, Abgenix 4.360.3,Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2,Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1,Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix4.304.1, Abgenix 4.78.1, e Abgenix 4.152.1, respectivamente.Em outras modalidades, os anticorpos são aqueles codificadospelos plasmideos mostrados na Tabela 1. Ainda em outrasmodalidades especificas, os anticorpos são aqueles que com-preendem uma cadeia pesada codificada por uma molécula deácido nucléico compreendendo a cadeia pesada codificandoregião ou regiões de uma seqüência de nucleotideo selecio-nada do grupo consistindo nas seqüências de nucleotideoestabelecidas como SEQ ID NOs: 2-7, e uma cadeia levecodificada por uma molécula de ácido nucléico compreendendoa cadeia leve codificando região ou regiões de uma seqüênciade nucleotideo selecionada do grupo consistindo nasseqüências de nucleotideo estabelecidas como SEQ ID NOs: 8-13.
Conforme empregado aqui, as denominações doshibridomas ou plasmideos depositados podem ser usadasintercambiavelmente com as denominações dos anticorpos. Ficaclaro a um versado na técnica quando a denominação se refereao anticorpo ou quanto ela se refere aos plasmideos ouhibridomas que codificam ou produzem os anticorpos, respec-tivamente. Adicionalmente, as denominações do anticorpopodem ser uma forma abreviada do nome mostrado na Tabela 1.Por exemplo, o anticorpo AB-PG1-XG1-006 pode ser referidocomo AB-PGl-XG1-006, PG1-XG1-006, XG1-006, 006, etc. Emoutro exemplo, a denominação do anticorpo PSMA 4.232.3 podese referir ao PSMA 4.232.1, 4.232.3, 4.232.1, 4.232, etc.Pretende-se que todas as variações na denominação do anti-corpo se refiram ao mesmo anticorpo e não a um diferente.Os anticorpos dos ADCs, ou dos quais se deriva ofragmento de ligação de antigenos dos ADCs, incluem aquelescodificados por conjuntos específicos de seqüências de cadeiapesada e leve. Em uma modalidade, o anticorpo (AB-PG1-XG1-006) é codificado por uma molécula de ácido nucléico quecompreende uma região ou regiões de codificação das seqüên-cias de ácido nucléico estabelecidas como SEQ ID NOs: 2 e 8.
Em outra modalidade, o anticorpo (AB-PG1-XG1-026) é codifi-cado por uma molécula de ácido nucléico que compreende umaregião ou regiões de codificação das seqüências de ácidonucléico estabelecidas como SEQ ID NOs: 3 e 9. Ainda emoutra modalidade, o anticorpo (AB-PG1-XG1-051) é codificadopor uma molécula de ácido nucléico que compreende uma regiãoou regiões de codificação das seqüências de ácido nucléicoestabelecidas como SEQ ID NOs: 4 e 10. Ainda em outramodalidade, o anticorpo (AB-PG1-XG1-069) é codificado poruma molécula de ácido nucléico que compreende uma região ouregiões de codificação das seqüências de ácido nucléicoestabelecidas como SEQ ID NOs: 5 e 11. Em outra modalidade,o anticorpo (AB-PG1-XG1-077) é codificado por uma moléculade ácido nucléico que compreende uma região ou regiões decodificação das seqüências de ácido nucléico estabelecidascomo SEQ ID NOs: 6 e 12. Ainda em outra modalidade, oanticorpo (PSMA 10.3) é codificado por uma molécula de ácidonucléico que compreende uma região ou regiões de codificaçãodas seqüências de ácido nucléico estabelecidas como SEQ IDNOs: 7 e 13. Em outras modalidades, os anticorpos dos ADCsou dos quais se deriva o fragmento de ligação de antigenosdos ADCs, incluem uma região de cadeia variável codificadapor uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma regiãoou regiões de codificação de uma seqüência de nucleotideoselecionada do grupo consistindo nas seqüências de nucleo-tideo estabelecidas como SEQ ID NOs: 14, 18, 22, 26 e 30 euma região variável de cadeia leve codificada por umamolécula de ácido nucléico compreendendo uma região ouregiões de codificação de uma seqüência de nucleotideo sele-cionada do grupo consistindo nas seqüências de nucleotideoestabelecidas como SEQ ID NOs: 16, 20, 24, 28 e 32. Em umamodalidade, o anticorpo (AB-PG1-XG1-006) inclui uma seqüênciavariável de imunoglobulina codificada por moléculas de ácidonucléico que compreendem uma região ou regiões de codifi-cação das seqüências de ácido nucléico estabelecidas comoSEQ ID NOs: 14 e 16. Da mesma forma, o anticorpo pode ser umque inclui uma seqüência variável de imunoglobulina quecompreende as seqüências de aminoácido estabelecidas comoSEQ ID NOs: 15 e 17. Em outra modalidade,, o anticorpo (AB-PG1-XG1-026) inclui uma seqüência variável de imunoglobulinacodificada por moléculas de ácido nucléico compreendendo umaregião ou regiões de codificação das seqüências denucleotideo estabelecidas como SEQ ID NOs: 18 e 20 ou incluiuma seqüência variável de imunoglobulina que compreende asseqüências de aminoácido estabelecidas como SEQ ID NOs 19 e21. Ainda em outra modalidade, o anticorpo (AB-PG1-XG1-051)inclui uma seqüência variável de imunoglobulina codificadapelas moléculas de ácido nucléico compreendendo uma regiãoou regiões de codificação das seqüências de nucleotideoestabelecidas como SEQ ID NOs: 22 e 24 ou inclui uma seqüên-cia variável de imunoglobulina que compreende as seqüênciasde aminoácido estabelecidas como SEQ ID NOs: 23 e 25. Aindaem outra modalidade, o anticorpo (AB-PG1-XG1-069) inclui umaseqüência variável de imunoglobulina codificada pelas molé-culas de ácido nucléico compreendendo uma região ou regiõesde codificação das seqüências de nucleotideo estabelecidascomo SEQ ID NOs: 26 e 28 ou inclui uma seqüência variável deimunoglobulina que compreende as seqüências de aminoácidoestabelecidas como SEQ ID NOs: 27 e 29. Em outra modalidade,o anticorpo (AB-PG1-XG1-077) inclui uma seqüência variávelde imunoglobulina codificada pelas moléculas de ácidonucléico compreendendo uma região ou regiões de codificaçãodas seqüências de nucleotideo estabelecidas como SEQ ID NOs:30 e 32 ou inclui uma seqüência variável de imunoglobulinaque compreende as seqüências de aminoácido estabelecidascomo SEQ ID NOs: 31 e 33. Em outras modalidades, o anticorpoinclui uma região variável de cadeia pesada compreendendouma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindonas seqüências de aminoácido estabelecidas como: SEQ ID NOs:15, 19, 23, 27 e 31, e uma região variável de cadeia levecompreendendo uma seqüência de aminoácido selecionada dogrupo consistindo nas seqüências de aminoácido estabelecidascomo: SEQ ID NOs: 17, 21, 25, 29 e 33.
Conforme usado aqui, uma "região de codificação"se refere a uma região de uma seqüência de nucleotideo quecodifica uma seqüência de polipeptideo. Seu emprego aqui éconsistente com o significado reconhecido e conhecido natécnica.
Em determinadas modalidades, os anticorpos dosADCs, ou dos quais se derivam os fragmentos e ligação deantigeno dos ADCs, são aqueles que são codificados pormoléculas de ácido nucléico que são altamente homólogas comos ácidos nucléicos precedentes. A molécula homóloga doácido nucléico pode compreender, em algumas modalidades, umaseqüência de nucleotideo que é de pelo menos cerca de 90%idêntica a seqüência de nucleotideo provida aqui. Em outrasmodalidades, a seqüência de nucleotideo é de pelo menoscerca de 95% idêntica, pelo menos cerca de 97% idêntica,pelo menos cerca de 98% idêntica, ou pelo menos cerca de 99%idêntica a uma seqüência de nucleotideo provida aqui. Ahomologia pode ser calculada usando várias ferramentas desoftware publicamente disponíveis conhecidas dos versados natécnica. Exemplos de ferramentas incluem o sistema BLASTdisponível no website do National Center for BiotechnologyInformation (NCBI) at the National Institutes of Health.
Um método para identificar seqüências de nucleo-tideo altamente homólogas é através da hibridização do ácidonucléico. Assim, a invenção também inclui anticorpos pos-suindo propriedades de ligação de PSMA e outras propriedadesdescritas aqui, que são codificados por moléculas de ácidonucléico que hibridizam sob condições de estringência altanas moléculas de ácido nucléico precedentes. A identificaçãodas seqüências correlatas pode também ser obtida usandoreação da cadeia da polimerase (PCR) e outras técnicas deampliação apropriadas para clonagem de seqüências de ácidonucléico correlatas. Os iniciadores de PCR podem serselecionados para ampliar porções de uma seqüência de ácidonucléico de interesse, tal como, uma CDR.
O termo "condições de estrigência alta" conformeusado aqui, se refere aos parâmetros com os quais a técnicaestá familiarizada. Parâmetros de hibridização de ácidonucléico podem ser encontrados em referências que compilamtais métodos, por exemplo, Molecular Cloning: A LaboratoryManual, J. Sambrook, e outros, eds., Segunda Edição, ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NewYork, 1989, ou Current Protocols in Molecular Biology, F.M,Ausubel, e outros, eds., John Wiley & Sons, Inc., New York.Um exemplo de condições de estringência alta é a hibri-dização a 65°C no tampão de hibridização (3,5X SSC, Ficoll a0,02%, polivinil pirrolidona a 0,02%, Albumina de SoroBovina a 0,02%, 2,5 mM NaH2PO4 (pH7) , SDS a 0,5%, 2mM EDTA) .SSC é 0,15M cloreto de sódio/O,015M citrato de sódio, pH7;SDS é dodecil sulfato de sódio; e EDTA é ácido etilenodiamino tetracético. Após hibridização, uma membrana na qualo ácido nucléico é transferido é lavada, por exemplo, em 2XSSC a temperatura ambiente e então a 0,1 - 0,5 X SSC/0,1 XSDS a temperaturas de até 68°C.
Conforme usado aqui, o termo "anticorpo" se refereà glicoproteina compreendendo pelo menos duas cadeias leves(L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeiapesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada(abreviada aqui como HCVR ou VH) e uma região constante decadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é compre-endida de três domínios, ChI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve écompreendida de uma região variável de cadeia leve (abre-viada como LCVR ou Vl) and uma região constante de cadeialeve. A região constante de cadeia leve é compreendida de umdomínio, CL. As regiões Vh e Vl podem ser adicionalmentesubdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadasregiões de determinação de complementariedade (CDR),interespaçadas com regiões que são mais conservadas,denominadas regiões de estrutura (FR). Cada Vh e Vl écomposta de três CDRs e quatro FRs, dispostas de terminaisamino para terminais carbóxi na seguinte ordem: FRl, CDR1,FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 . As regiões variáveis das cadeiaspesada e leve contêm um domínio de ligação que interage comum antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podemmediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores dehospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (porexemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) dosistema complemento clássico.
0 termo "fragmento de ligação de antígeno" de umanticorpo conforme usado aqui, se refere uma ou mais porçõesde um anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especifi-camente a um antígeno (isto é, PSMA). Foi demonstrado que afunção de ligação de antígeno de um anticorpo pode serrealizada por fragmentos de um anticorpo de comprimentopleno. Exemplos de fragmentos de ligação englobados no termo"fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo incluemi) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindonos domínios Vl, Vh, Cl e ChI; ü) um fragmento F(ab')2, umfragmento bivalente compreendendo dois fragmento Fabsligados por uma ponte de dissulfeto à região de impedimento;iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios Vh e ChI; iv)um fragmento Fv consistindo nos domínios Vl e Vh de umaramificação simples de um anticorpo, v) um fragmento dAb(Ward e outros, (1989) Nature 341 :544-546) que consiste emum domínio VH; e vi) uma região de determinação de comple-mentariedade isolada (CDR). As CDRs, especificamente asregiões CDR3, e mais especificamente a cadeia pesada CDR3contribuem para a especificidade do anticorpo. Uma vez queessas regiões CDR e especificamente a região CDR3 conferemespecificidade de anticorpo no anticorpo, essas regiõespodem ser incorporadas aos anticorpos ou fragmentos deligação de antígeno para conferir a especificidade deantígeno idêntica àquele anticorpo ou peptídeo. Adicional-mente, embora os dois domínios do fragmento Fv, V e Vh sejamcodificados por genes separados, eles podem ser unidos,usando métodos recombinantes, por um ligante sintético quepermite que os mesmos sejam feitos como uma cadeia deproteína simples, onde as regiões Vl e Vh emparelham paraformar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeiasimples (scFv); vide, por exemplo, Bird e outros (1988)Science 242:423-426; e Huston e outros (1988) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeiasimples são também destinados a englobarem o termo"fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo. Essesfragmentos de anticorpo são obtidos usando procedimentosconvencionais, tais como, procedimentos de fragmentaçãoproteolitica, conforme descrito em J. Goding, AntibodiesMonoclonal: Principies and Practicer pp 98-118 (Ν. Y.Academic Press 1983), que é incorporado aqui como referên-cia, bem como por outras técnicas conhecidas daquelesversados na técnica. Os fragmentos são classificadas quantoa utilidade da mesma maneira como nos anticorpos intactos.
Os anticorpos, ou fragmentos de ligação de antí-geno dos mesmos, dos ADCs são, em algumas modalidades,isolados. "Isolado", conforme usado aqui, se refere a umanticorpo (ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo),que é substancialmente isento de outros anticorpos (oufragmentos de ligação de antigeno) possuindo especificidadesantigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isoladoque se liga especificamente ao PSMA é substancialmente isentode anticorpos que se ligam especificamente aos antigenosdiferentes do PSMA). Um anticorpo isolado que se liga espe-cificamente a um epitopo, isoforma ou variante do PSMA pode,contudo, ter reatividade cruzada com relação a outrosantigenos, por exemplo, de outras espécies (por exemplo,homólogos de espécies do PSMA). Além disso, um anticorpoisolado (ou fragmento de ligação de antigenos do mesmo) podeser substancialmente isento de outro material celular e/ousubstâncias químicas. Conforme usado aqui, "ligação especí-fica" se refere à ligação do anticorpo a um antigeno prede-terminado, nesse caso, PSMA. Tipicamente, o anticorpo seliga com uma afinidade que é de pelo menos duas vezes maiorque sua afinidade para ligação a um antigeno não específico(por exemplo BSA, caseina), que é um antigeno diferente doPSMA, uma isoforma ou variante do PSMA, ou um antigenoproximamente correlato.
Os anticorpos englobam vários isotipos de anti-corpo, tais como, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2,IgAsec, IgD, IgE. Conforme usado aqui, "isotipo" se refere àclasse do anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que écodificado pelos genes da região constante de cadeia pesada.Os anticorpos podem ser de comprimento pleno ou podem incluirapenas um fragmento de ligação de antigeno, tal como, aconstante de anticorpo e/ou domínio variável de IgGl, IgG2,IgG3, IgG4, IgM5 IgAl 5 IgA2, IgAsec, IgD ou IgE ouconsistiria em um fragmento Fab, um fragmento F(ab')2 e umfragmento Fv.
Os anticorpos dos ADCs, ou dos quais se deriva ofragmento de ligação de antígenos dos ADCs, são em algumasmodalidades, monoclonais. Os anticorpos podem ser produzidospor várias técnicas bem conhecidas na arte. A produção deanticorpo monoclonal pode ser efetuada por técnicas bemconhecidas na arte. 0 termo "anticorpo monoclonal", conformeusado aqui, se refere à preparação de moléculas de anticorpode composição molecular simples. Um anticorpo monoclonalmostra uma especificidade de ligação simples e afinidadepara um epítopo específico. 0 processo de produção deanticorpo monoclonal envolve a obtenção de células somáticasimunes com o potencial para produção de anticorpo, especifi-camente Iinfócitos B, que foram previamente imunizados com oantigeno de interesse, tanto in vivo quanto in vitro e quesão apropriados para fusão com a linhagem de mieloma dacélula B.
Os Iinfócitos de mamífero tipicamente são imuni-zados por imunização in vivo do animal (por exemplo, umcamundongo) com a proteína ou polipeptídeo desejado. Taisimunizações são repetidas conforme necessário, em intervalosde até várias semanas de modo a obter uma titulação sufi-ciente de anticorpos. Uma vez imunizados, os animais podemser usados como uma fonte de linfócitos produzindo anticor-pos. Seguindo-se o último reforço do antígeno, os animaissão sacrificados e as células do baço removidas. Oslinfócitos de camundongo fornecem uma porcentagem maior defusões estáveis com as linhagens de mieloma do camundongodescritas aqui. Por exemplo, o camundongo BALB/c. Contudo,outras cepas de camundongo, coelho, hamster, carneiro ou rãpodem também ser usadas como hospedeiros para prepararcélulas produzindo anticorpos. Vide, Goding (em MonoclonalAntibodies: Principies and Practice, segunda edição, pp. 60-61, Orlando, Fla., Academic Press, 1986). Especificamente,cepas de camundongo que possuem genes de imunoglobulinahumana inseridos no genoma (e que não podem produzirimunoglobulinas de camundongo) podem ser usados. Exemplosincluem as cepas de camundongo HuMAb produzidas pelaMedarex/GenPharm International, e as cepas de XenoCamundongoproduzidas pela Abgenix. Tais camundongos produzem moléculasde imunoglobulina completamente humana em resposta àimunização. Em algumas modalidades, portanto, os ADCscompreendem um anticorpo monoclonal humano ou um fragmentode ligação do mesmo que se liga ao PSMA.
Aquelas células de produção de anticorpo que estãono estágio de divisão de plasmablasto se fundem de formapreferida. Células somáticas podem ser obtidas dos nodoslinfáticos, baços e sangue periférico de animais iniciadoscom antigeno e as células linfáticas de escolha depenem emuma grande extensão de sua utilidade empírica no sistema defusão específico. Os linfócitos secretando anticorpo sãoentão fundidos com as células de mieloma de célula B(camundongo) ou células transformadas, que são capazes dereplicar indefinidamente na cultura da célula, pelo queproduzindo uma linhagem de célula secretando imunoglobulina,imortal. As células fundidas resultantes ou hibridomas, sãocultivadas e as colônias resultantes classificadas para aprodução dos anticorpos monoclonais desejados. As colôniasde produção de tais anticorpos são clonadas e crescem tantoin vivo quanto in vitro para produzir grandes quantidades deanticorpo. Uma descrição da base teórica e metodologiaprática de fusão de tais células é estabelecida em Kohler eMilsteinf Nature 256:495 (1975), que é incorporada aqui comoreferência.
Alternativamente, células somáticas humanas capazesde produzir anticorpo, especificamente linfócitos B, sãoapropriadas para fusão com as linhagens de células de mieloma.Embora possam ser empregados os linfócitos B de baços quesofreram biopsia, amigdalas e nodos linfáticos de um indiví-duo, os linfócitos de célula B de sangue periférico maisfacilmente acessáveis podem também ser usados. Os linfócitospodem ser derivados de pacientes com carcinomas de próstatadiagnosticados ou outro câncer expressando PSMA. Além disso,as células B humanas podem ser imortalizadas diretamentepelo virus Epstein-Barr (Cole e outros, 1995, MonoclonalAntibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Embora alguns procedimentos de hibridização da célulasomática possam ser empregados, outras técnicas para produ-zir anticorpos monoclonais podem ser empregadas, tais como,transformação virótica ou oncogênica dos linfócitos B.
Linhagens de célula de mieloma apropriadas parauso nos procedimentos de fusão de produção de hibridomapodem ser de produção diferente de anticorpo, possuemeficiência de fusão alta e deficiências de enzima que tornamas mesmas incapazes de crescerem em determinados meiosseletivos que sustentam o crescimento de hibridomas desejados.
Exemplos de tais linhagens de células de mieloma que podemser usadas para a produção de linhagens de célula fundidaincluem P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4.1, Sp2/0-Ag'4,FO, NSO/U, MPC-I1, MPCl1-X45-GTG 1.7, S194/5XX0 BuI, todasderivadas de camundongos; R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F e4B210 derivadas de ratos e U-266, GMl 500-GRG2, LICR-LON-HMy2, UC729-6, todas derivadas de seres humanos (Goding, emMonoclonal Antibodies: Principies and Practice, segundaedição, pp. 65-66, Orlando, Fla., Academic Press, 1986;Campbell, em Monoclonal Antibody Technology, LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. 13,Burden and Von Knippenberg, eds. pp. 75-83, Amsterdam,Elseview, 1984).
A fusão com as células de mieloma de mamíferos ououtros parceiros e fusão capazes de replicar indefinidamentena cultura celular é efetuada por técnicas padrão e bemconhecidas, por exemplo, por emprego de polietileno glicol("PEG") ou outros agentes de fusão (vide, Milstein andKohler, Eur. J. Jmmunol. 6:511 (1976), que é incorporado aquicomo referência) .
Em outras modalidades, os anticorpos dos ADCs, oudos quais se deriva o fragmento de ligação de antígenos dosADCs, são anticorpos recombinantes. O termo "anticorporecombinante", conforme usado aqui, se destina a incluiranticorpos que são preparados, expressos, criados ou isola-dos por meios recombinantes, tais como, anticorpos isoladosde um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênicopara outros genes de imunoglobulina das espécies, anticorposexpressos usando um vetor de expressão recombinante trans-fectado em uma célula hospedeira, isolado de um recombi-nante, biblioteca de anticorpo combinatório ou anticorpospreparados, expressos, criados ou isolados por qualqueroutro dispositivo que envolva junção das seqüências gênicasde imunoglobulina a outras seqüências de DNA.
Ainda em outras modalidades, os anticorpos sãoquiméricos ou anticorpos humanizados. Conforme usado aqui, otermo "anticorpo quimérico" se refere a um anticorpo quecombina a variável de murino ou regiões hipervariáveis com aregião constante humana ou regiões de estrutura constante ouvariável. Conforme usado aqui, o termo "anticorpo humanizado"se refere a um anticorpo que retém apenas os CDRs de ligaçãode antigeno do anticorpo de origem, em associação às regiõesde estrutura humanas (vide, Waldmann, 1991, Science 252:1657).
Espera-se que tais anticorpos quiméricos ou humanizadosmantendo a especificidade do anticorpo de murino tenhamimunogenicidade reduzida, quando administrados in vivo paraaplicações de acordo com a invenção.
De acordo com uma modalidade alternativa, os anti-corpos monoclonais da presente invenção podem ser modifica-dos para estarem na forma de um anticorpo biespecifico, ouum anticorpo multiespecifico. O termo "anticorpo biespecí-fico" se destina a incluir qualquer agente, por exemplo, umaproteína, peptídeo ou proteína ou complexo de peptídeo, quepossua duas especificidades de ligação diferentes que seligam ou interagem com a) um antigeno de superfície de célulae b) um receptor Fc na superfície de uma célula efetora. Otermo "anticorpo multiespecifico" se destina a incluir qual-quer agente, por exemplo, uma proteína, peptídeo ou proteínaou complexo de peptídeo, que tenha mais de duas especifi-cidades de ligação diferentes que se ligam ou interagem coma) um antigeno de superfície de célula e b) um receptor Fcna superfície de uma célula efetora e c) pelo menos um outrocomponente. Consequentemente, os anticorpos incluem, porémnão estão limitados aos anticorpos biespecificos, triespecí-ficos, tetraespecíficos e outros anticorpos multiespecificosque são direcionados ao PSMA e aos receptores Fc nas célulasefetoras. O termo "anticorpos biespecificos" incluem adicio-nalmente os diacorpos. Os diacorpos são anticorpos bivalen-tes, biespecíficos onde os domínios Vh e Vl são expressos emuma cadeia de polipeptideo simples, porém usando um liganteque é muito curto para permitir emparelhamento entre os doisdomínios na mesma cadeia, pelo que, forçando os domínio aemparelhar com domínios complementares de outra cadeia ecriando dois sítios de ligação de antígeno (vide, porexemplo, Holliger, P., e outros (1993) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 90:6444-6448; Poijak, R.J., e outros (1994)Structure 2:1121-1123).
Um anticorpo biespecífico pode ser formado de umaregião de ligação de antígeno específica para PSMA e umaregião de ligação de antígeno específica para uma célulaefetora que possui atividade tumoricida ou. inibidora detumor. As duas regiões de ligação de antígeno do anticorpobiespecífico são tanto quimicamente ligadas ou podem serexpressas por uma célula transformada geneticamente paraproduzir ο. anticorpo biespecífico. (Vide, de modo geral,Fanger e outros, 1995 Drug News & Perspec. 8 (3) : 133-137) .Células efetoras apropriadas possuindo atividade tumoricidaincluem, porém não estão limitadas às células T citotóxicas(primariamente células CD8 + ) , células exterminadoras naturais,etc. Uma quantidade eficaz de um anticorpo biespecífico deacordo com a invenção pode ser administrada a um indivíduocom câncer e o anticorpo biespecífico extermina e/ou inibe aproliferação das células cancerígenas após localização nossítios de tumores primários ou metastáticos portando PSMA.Em determinadas modalidades, os anticorpos dosADCs, ou dos quais se derivam os fragmentos de ligação deantigeno dos ADCs, são anticorpos humanos. O termo "anti-corpo humano", conforme usado aqui, se destina a incluiranticorpos possuindo regiões variáveis e constantes deriva-das das seqüências de imunoglobulina de idioplasma humano.
Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos deaminoácido não codificados por seqüências de imunoglobulinade idioplasma humano (por exemplo, mutações introduzidas pormutagênese especifica aleatória ou de sitio in vitro ou pormutação somática in vivo). Contudo, o termo "anticorpohumano" conforme usado aqui, se destina a incluir anticorposonde as seqüências de CDR derivadas do idioplasma de outrasespécies de mamífero, tais como, um camundongo que foienxertado nas seqüências de estrutura humana (referidas aquicomo "anticorpos humanizados"). Os anticorpos humanos dire-cionados contra PSMA podem ser gerados usando camundongostransgênicos portando partes do sistema imune humano aoinvés do sistema do camundongo. Alguns exemplos dos quaisforam descritos acima.
Anticorpos monoclonais completamente humanos podemtambém ser preparados por imunização de camundongos trans-gênicos para grandes quantidades de locais de cadeia leve epesada de imunoglobulina humana. Vide, por exemplo, PatentesUS números 5.591.669, 5.598.369, 5.545.806, 5.545.807,6.150.584 e referências citadas aqui, o conteúdo das mesmassendo incorporado aqui como referência. Esses animais foramgeneticamente modificados, tal que, existe uma deleçãofuncional na produção de anticorpos endógenos (por exemplo,murino). Os animais são adicionalmente modificados paraconter toda ou uma porção do local do gene de imunoglobulinade idioplasma humano, tal que, a imunização desses animaisresulta na produção de anticorpos completamente humanos parao antigeno de interesse. Seguindo-se a imunização dessescamundongos (por exemplo, XenoCamundongo (Abgenix), camun-dongos HuMAb (Medarex/GenPharm)), anticorpos monoclonais sãopreparados de acordo com a tecnologia de hibridoma padrão.
Esses anticorpos monoclonais possuem seqüências de amino-ácido da imunoglobulina humana e portanto, não provocarãorespostas de anticorpo anti-camundongo humanas (HAMA) quandoadministrados aos seres humanos. Em geral, porém não comolimitação, os camundongos possuem 6-16 semanas de vidaquando da primeira imunização. Por exemplo, uma preparaçãopurificada ou enriquecida de antigeno do PSMA (por exemplo,PSMA recombinante ou células expressando PSMA) é usada paraimunizar intraperitonealmente os camundongos (IP) , emboraoutras vias de imunização conhecidas de um versado na técnicasejam também possíveis. O antigeno do PSMA é injetado emcombinação com um adjuvante, tal como, adjuvante de Freundcompleto e em algumas modalidades, a injeção inicial éseguida por imunizações de reforço com antigeno em um adju-vante, tal como, adjuvante de Freund incompleto. A respostaimune é monitorada no curso do protocolo de imunização comamostras de plasma obtidas, por exemplo, de sangramentosretroorbitais. O plasma é classificado por ELISA e oscamundongos com titulações suficientes de imunoglobulinahumana anti-PSMA são usados para fusões. Os camundongosrecebem reforço intravenoso com antigeno 3 dias antes dosacrifício e o baço é removido.
0 anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno domesmo dos ADCs pode ser, em algumas modalidades, selecionadoquanto a capacidade de ligar célula viva expressando PSMAs.
A fim de demonstrar a ligação da célula viva expressandoPSMAs, pode ser usada citometria de fluxo. Por exemplo,linhagens de célula expressando PSMAs (desenvolvidas emcondições de crescimento padrão) ou células de câncer depróstata que expressam PSMA são misturadas com váriasconcentrações de anticorpos monoclonais em PBS contendoTween 80 a 0,1% e soro de camundongos a 20% e incubadas a37 ° C por 1 hora. Após lavagem, as células são reagidas comanticorpo secundário IgG anti-humano marcado com fluores-ceína (se os anticorpos anti-PSMA humanos forem usados) sobas mesmas condições que a coloração de anticorpo primária.
As amostras podem ser analisadas por um instrumento classi-ficador de célula ativada por fluorescência (FACS) usandopropriedades de difusão de luz e lateral para reter célulassimples. Um ensaio alternativo usando microscopia fluores-ceínica pode ser usado, além ou ao invés do ensaio de cito-metria de fluxo. As células podem ser coloridas e examinadaspor microscopia fluoresceinica. Esse método permite visua-lização das células individuais, porém pode ter sensibi-lidade diminuída, dependendo da densidade do antigeno.Segue-se que os ADCs, em algumas modalidades, se ligam àscélulas vivas. Os ADCs, em algumas modalidades, portanto,não requerem Iise da célula para se ligarem ao PSMA.
Os anticorpos podem promover, em algumas modali-dades, a citólise de células expressando PSMA. A citólisepode ser mediada por complemento ou pode ser mediada porcélulas efetoras. Em uma modalidade, a citólise é realizadaem um organismo vivo, tal como um mamífero, e a célula vivaé uma célula tumoral. Exemplos de tumores que podem seralvejados com os anticorpos ou fragmentos de ligação deantígeno dos mesmos incluem, qualquer tumor que expressePSMA (isso inclui tumores com neovasculatura expressandoPSMA), tal como, próstata, bexiga, pâncreas, pulmão, cólon,rins, melanomas e sarcomas. Em uma modalidade, a célulatumoral é uma célula de câncer da próstata.
O teste de atividade citológica in vitro porensaio de liberação de cromo pode prover uma classificaçãoinicial antes do teste com modelos in vivo. Esse teste podeser realizado usando ensaios de liberação de cromo padrão.
Em resumo, células polimorfonucleares (PMN) ou outras célulasefetoras, de doadores saudáveis podem ser purificadas porcentrifugação de densidade Ficoll Hypaque, seguido por Iisedos eritrócitos de contaminação. PMNs lavadas podem sersuspensas em RPMI suplementado com soro fetal de bezerroinativado por calor a 10% e misturadas com células marcadas51Cr expressando PSMA, em várias taxas de células efetoraspara células tumorais (células efetoras: células tumorais).IgGs anti-PSMA purificadas podem então ser adicionadas emvárias concentrações. IgG irrelevante pode ser usado como umcontrole negativo. Os ensaios podem ser realizados por 0-120minutos a 37°C. As amostras podem ser analisadas quanto acitólise por medição da liberação de 51Cr no sobrenadante dacultura. Anticorpos monoclonais anti-PSMA e/ou ADCs podemtambém ser testados em combinações entre si para determinarse a citólise é melhorada com múltiplos anticorpos monoclo-nais e/ou ADCs. Os anticorpos que se ligam ao PSMA e/ou ADCstambém podem ser testados em um modelo in vivo (por exemplo,no camundongo) para determinar sua eficácia na mediação dacitólise e extermínio das células expressando PSMA, porexemplo, células tumorais.
Os anticorpos dos ADCs, ou dos quais se derivam osfragmentos de ligação de antígeno dos ADCs podem serselecionados, por exemplo, com base nos critérios que seseguem, que não se destinam a serem exclusivos:
1) ligação às células vivas expressando PSMA;
2) alta afinidade de ligação ao PSMA;
3) ligação a um único epítopo no PSMA (isto é,um epítopo não reconhecido por um anticorpo produzidopreviamente);
4) opsonização das células expressando PSMA;
5) mediação de inibição do crescimento, fagoci-tos e e/ou extermínio das células expressando PSMA na pre-sença de células efetoras;
6) modulação (inibição ou melhoramento) dasatividades de NAALADase, folato hidrolase, dipeptidil pepti-dase IV e/ou um γ-glutamil hidrolase;7) inibição do crescimento, parada do ciclocelular e/ou citotoxicidade na ausência de células efetoras;
8) internalização do PSMA;
9) ligação ao epitopo conformacional no PSMA;
10) reatividade cruzada mínima com células outecidos que não expressam PSMA; e
11) ligação preferencial às formas diméricas dePSMA ao invés de formas monoméricas de PSMA.
Os anticorpos podem satisfazer um ou mais e possi-velmente todos esses critérios.
Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento deligação de antígeno do mesmo se liga a um epitopo confor-macional, tal como um epitopo conformacional dentro dodomínio extracelular do PSMA. Para determinar se umanticorpo anti-PSMA ou fragmento de ligação de antígeno domesmo se liga aos epítopos conformacionais, cada anticorpopode ser testado nos ensaios usando proteína nativa (porexemplo, imunoprecipitação de não desnaturação, análisecitométrica de fluxo da ligação de superfície da célula) eproteína desnaturada (por exemplo, Western blot, imunopre-cipitação das proteínas desnaturadas). Uma comparação dosresultados indicará se o anticorpo ou fragmento de ligaçãode antígeno do mesmo se liga um epitopo conformacional.
Anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmosque se ligam à proteína nativa porém não à proteínadesnaturada são, em algumas modalidades, aqueles que seligam aos epítopos conformacionais. Segue-se que, os ADCs,em algumas modalidades, se ligam aos epitopos conforma-cionais de PSMA.
Em outra modalidade, o anticorpo ou fragmento deligação de antigeno do mesmo se liga a um epitopo especificode dimero em PSMA. Geralmente, anticorpos ou fragmentos deligação de antigeno dos mesmos que se ao epitopo especificode dimero preferivelmente se ligam ao dimero de PSMA aoinvés do monômero de PSMA. Para determinar se um anticorpoou fragmento de ligação de antigeno do mesmo se ligapreferencialmente (isto é, seletiva e/ou especificamente) aum dimero de PSMA, o anticorpo ou fragmento de ligação deantigeno do mesmo pode ser testado nos ensaios (por exemplo,imunoprecipitação seguido por Western blotting) usando pro-teína de PSMA dimérica nativa e proteína de PSMA monoméricadissociada. Uma comparação dos resultados indicará se oanticorpo ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo seliga preferivelmente ao dimero. Em algumas modalidades, osanticorpos ou fragmentos de ligação de antigeno dos mesmosse ligam ao dimero de PSMA, porém não à proteína de PSMAmonomérica. Segue-se que os ADCs, em algumas modalidades, seligam a um epitopo específico de dimero no PSMA.
A invenção, portanto, também inclui ADCs que seligam seletivamente aos multímeros do PSMA. Conforme usadoaqui, especificamente com relação à ligação dos multímerosdo PSMA pelos ADCs, "se liga seletivamente" significa que umanticorpo preferivelmente se liga a um multímero da proteínado PSMA (por exemplo, com avidez maior, maior afinidade deligação) que a um monômero da proteína do PSMA. Em algumasmodalidades, os ADCs da invenção se ligam a um multimero daproteína do PSMA com uma avidez/afinidade de ligação que é1,1 vezes, 1,2 vezes, 1,3 vezes, 1,4 vezes, 1,5 vezes, 1,6vezes, 1,7 vezes, 1,8 vezes, 1,9 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4vezes, 5 vezes, 7 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40vezes, 50 vezes, 70 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes,500 vezes, 1000 vezes ou mais que a exibida pelo ADS para ummonômero da proteína do PSMA. O ADC pode, em algumasmodalidades, se ligar seletivamente um multimero da proteínado PSMA, e não a um monômero da proteína do PSMA, isto é, seliga exclusivamente a um multimero da proteína do PSMA. Emalgumas modalidades, o ADC se liga seletivamente a um dímeroda proteína do PSMA.
Um multimero da proteína do PSMA, conforme usadoaqui, é um complexo protéico de pelo menos duas proteínas doPSMA ou fragmentos do mesmo. O multimero da proteína doPSMAs pode ser composto de várias combinações de proteínasdo PSMA de comprimento pleno (por exemplo, SEQ ID NO: 1),PSMA solúvel recombinante (PSMArs, por exemplo, aminoácidos44-750 da SEQ ID NO: 1) e fragmentos dos precedentes queformam multímeros (isto é, que retém o domínio da proteínanecessário para formar dímeros e/ou multímeros de PSMA deordem maior). Em algumas modalidades, pelo menos uma dasproteínas do PSMA formando um multimero é um polipeptídeo dePSMA solúvel, recombinante (PSMArs) . Os multímeros da pro-teína do PSMAs podem ser dímeros, tais como aqueles formadosda proteína do PSMA solúvel, recombinante. Em uma moda-lidade, o dímero é um homodímero de PSMArs. Acredita-se queo multimero da proteína do PSMAs referido aqui assuma umaconformação nativa e possa ter tal conformação. As proteínasdo PSMA em determinadas modalidades são ligadas nãocovalentemente para formar ao multimero da proteína do PSMA.
Por exemplo, foi descoberto que a proteína . do PSMA seassocia não covalentemente para formar dímeros sob condiçõesnão desnaturantes. O multimero da proteína do PSMAs podemanter as atividades do PSMA. A atividade do PSMA pode seruma atividade enzimática, tal como, atividade de folatohidrolase, atividade de NAALAD, atividade de dipeptidilpeptidase ou atividade γ-glutamil hidrolase. Métodos paratestar a atividade do PSMA dos multímeros são bem conhecidosna técnica (revisto por 0'Keefe e outros em: ProstateCâncer: Biology, Genetics, and the New Therapeutics. L.W.K.Chung, W.B. Isaacs e J.W. Simons (eds.) Humana Press,Totowa, NJ, 2000, pp. 307-326).
0 anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno domesmo dos ADCs pode se ligar e ser internalizado com PSMAexpresso nas células. 0 mecanismo pelo qual o anticorpo oufragmento de ligação de antígeno do mesmo é internalizadocom PSMA não é crítico para a prática da presente invenção.
Por exemplo, o anticorpo ou fragmento de ligação de antígenodo mesmo pode induzir internalização do PSMA. Alterna-tivamente, a internalização do anticorpo ou fragmento deligação de antígeno do mesmo pode ser o resultado da rotinade internalização do PSMA. Segue-se que o ADC pode serinternalizado com PSMA expresso nas células.Os anticorpos ou fragmentos de ligação de antigenodos mesmos, e, portanto, os ADCs da invenção, podem serligar especificamente ao PSMA de superfície da célula e/ouPSMArs com afinidade subnanomolar. As afinidades de ligaçãopodem ser de cerca de 1 X IO-9M ou menos, cerca de 1 X IO-10Mou menos, ou cerca de 1 X IO-11M ou menos. Em uma modalidadeespecifica a afinidade de ligação é inferior a cerca de 5 X10-10M.
Os anticorpos ou fragmentos de ligação de antigenodos mesmos podem, em algumas modalidades, modular pelo menosuma atividade enzimática do PSMA. A atividade pode serselecionada do grupo consistindo em dipeptidase ácida ligadaem α N-acetilada (NAALADase), folato hidrolase, dipeptidildipetidase IV, atividade γ-glutamil hidrolase e combinaçõesdas mesmas in vitro ou in vivo. A modulação pode ser omelhoramento ou inibição de pelo menos uma atividade enzimá-tica de PSMA.
Os níveis de tecido da NAALADase podem ser deter-minados por solubilização detergente dos tecidos dehomogeneização, fragmentação do material insolúvel porcentrifugação e medição da atividade de NAALADase no sobre-nadante remanescente. Da mesma forma, a atividade deNAALADase nos fluidos corpóreos pode também ser medida pelaprimeira fragmentação do material celular por centrifugaçãoe realização de um ensaio de enzima típico para atividade deNAALADase do sobrenadante. Os ensaios da enzima NAALADaseforam descritos por Frieden, 1959, J. Biol, Chem., 234:2891.Nesse ensaio, o produto de reação da enzima NTVALADase éácido glutâmico. Esse é derivado da clivagem catalisada daenzima de N-acetilaspartilglutamato para render o ácido N-acetilaspártico e ácido gutâmico. 0 ácido glutâmico, em umaetapa que requer NAD(P)+, rende 2-oxoglutarato mais NAD(P)Hem uma reação catalisada por glutamato desidrogenase. 0progresso da reação pode ser medido fácil e convenientementepela alteração na absorvância em 340 nm devido à conversãode NAD(P)+ em NAD(P)H.
A atividade da folato hidrolase do PSMA pode sermedida por realização de ensaios de enzima conforme descritoem Heston e outros (por exemplo, Clin. Câncer Res. 2(9):1445-51, 1996; Urology 49(3A Suppl) :104-12, 1997) . Folatohidrolases, tais como, PSMA, removem os glutamatos ligadospor gama dos folatos poliglutamatos. A atividade da folatohidrolase pode ser medida usando substratos, tais como,metotrexato tri-gama glutamato (MTXGlu3), metotrexato di-gama glutamato (MTXGlu2) ou pteroilpentaglutamato (PteGlu5),por exemplo, usando eletroforese capilar (vi.de Clin. CâncerRes. 2(9):1445-51, 1996). As incubações programadas de PSMAcom substratos poliglutamatos são seguidas por separação edetecção dos produtos de hidrólise.
Um ADC da invenção compreende um anticorpo oufragmento de ligação de antigeno do mesmo conjugado à MMAEou MMAF. 0 anticorpo ou fragmento de ligação de antigeno domesmo pode ser, em algumas modalidades, conjugado à MMAE ouMMAF com um composto da fórmula que se segue (Fórmula 1) :An-Ym-Zm-Xn-Wn, onde A é uma unidade acila carboxílica; Y éum aminoácido; Z é um aminoácido; XeW são cada umespaçador auto imolativo; η é um inteiro de 0 ou 1; e m é uminteiro de 0 ou 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Um conjugado da presenteinvenção, em algumas modalidades, é representado pelafórmula (Fórmula 2) : L-{An-Ym-Zm-Xn-Wn-D}p onde L é umanticorpo ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo quese liga ao PSMA, D é MMAE ou MMAF e ρ é um inteiro de 1, 2,3r 4, 5, 6, 7 ou 8. Os outros componentes são conformedescritos acima. Em uma modalidade, a unidade carboxilica"An" é ligada ao anticorpo ou fragmento de ligação doantigeno através de um átomo de enxofre derivado doanticorpo ou fragmento de ligação do antigeno:
<formula>formula see original document page 57</formula>
Em uma concretização, A é:
<formula>formula see original document page 57</formula>
onde q é 1-10. Portanto, em uma concretização, oconjugado é:
<formula>formula see original document page 57</formula>onde L, Υ, Ζ, X, W, D, n, m, q e ρ são conformedefinidos anteriormente.
Em outra modalidade, A é 4-(N-succinimidometil)cicloexano-l-carbonila, m-succinimidobenzoila, 4-(p-succini-midofenil)-butirila, 4-(2-acetamido)benzoila, 3-tiopropio-nila, 4-(1-tioetil)-benzoila, 6-(3-tiopropionilamido)-hexanoil ou maleimida caproila. Em uma modalidade adicional,A é maleimida caproila. Exemplos representativos de váriasunidades acila carboxilica e métodos para sua síntese eanexação são descritos na Patente US número 6.214.345, oconteúdo total da mesma sendo incorporado aqui comoreferência.
Em outra modalidade, Y é alanina, valina, leucina,isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano ou prolina.
Ainda em outra modalidade, Y é valina. Em uma modalidadeadicional, Z é lisina, lisina protegida com acetila ouformila, arginina, arginina protegida com tosila ou gruposnitro, histidina, ornitina, ornitina protegida com acetilaou formila ou citrulina. Ainda em outra modalidade, Z écitrulina. Em uma modalidade Ym-Zm é valina-citrulina. Emoutra modalidade, Ym-Zm é uma seqüência de proteína que éseletivamente clivável por uma protease.
Em uma modalidade adicional, X é um compostopossuindo a fórmula:<formula>formula see original document page 59</formula>
onde T é 0, Ν, ou S. Em outra modalidade, X é umcomposto possuindo a fórmula -HN-R1-COT onde R1 é alquila Ci-C5, T é 0, N ou S. Em uma modalidade adicional, X é umcomposto possuindo a fórmula:
<formula>formula see original document page 59</formula>
onde T é 0, N, ou S, R2 é H ou alquila Ci-C5. Emuma modalidade, X é p-aminobenzilcarbamoilóxi. Em outramodalidade, X é álcool p-aminobenzila. Em uma modalidadeadicional, X é p-aminobenzilcarbamato. Ainda em uma modali-dade adicional, X é p-aminobenziloxicarbonila. Em outramodalidade, X é ácido γ-aminobutírico; ácido α,α-dimetil γ-aminoutirico ou ácido β,β-dimetil γ-aminobutírico.
Em algumas modalidades, W é:
<formula>formula see original document page 59</formula>
onde T é 0, S ou N.Em uma modalidade, o composto da Fórmula 1 émaleimidocaproila. Maleimidocaproila foi utilizado paraconjugação de duas auristatinas especificas em anti-CD30 mAb(AClO) (Doronina, Svetlana e outros "Novel Linkers forMonoclonal Antibody-Mediated Delivery of Anticancer Agents",AACR, Anaheim, CA, Abstraet No. 1421, 16-20 de abril de2005). A maleidimoeaproiIa reagente com grupos tiol paraformar um tioéster.
MMAE ou MMAF pode ser conjugada em um anticorpo oufragmento de ligação de antigeno do mesmo empregando métodosconhecidos pelos versados na técnica (vide, por exemplo,Niemeyer, CM, Bioconjugation Protocols, Strategies eMethodsf Humana Press, 2004) ou conforme descrito aqui. Emalgumas modalidades, mais de uma molécula da MMAE ou MMAF éconjugada no anticorpo ou fragmento de ligação de antigenodo mesmo. Em outras modalidades, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8moléculas de MMAE ou MMAF são conjugadas no anticorpo oufragmento de ligação de antigeno do mesmo. Ainda em outrasmodalidades, pelo menos 3, 4 ou 5 moléculas da MMAE ou MMAFsão conjugadas no anticorpo ou fragmento de ligação deantigeno do mesmo. Nas concretizações adicionais, 3, 4 ou 5moléculas de MMAE ou MMAF são conjugadas no anticorpo oufragmento de ligação de antigeno do mesmo.
Foi verificado que os ADCs da invenção possuemníveis especificamente altos de seletividade quando oextermínio de células que não expressam PSMA é comparado aoextermínio de células expressando PSMA. Portanto, em algumasmodalidades, os ADCs possuem uma seletividade de célula aPC-3™ para célula C4-2 ou célula LNCaP™ de pelo menos 250.Em outras modalidades, a seletividade é de pelo menos 300,350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200,1.300, 1.400,· 1.500, 1.600, 1.700, 1.800, 1.900, 2.000,2.250, 2.500, 2.750, 3.000, 3.500, 4.000, 4.500, 5.000,5.500, 6.000, 6.500, 7.000, 7.500, 8.000, 8.500, 9.000,9.500, 10.000, 11.000, 12.000, 13.000, 14.000, 15.000,17.500, 20.000 ou mais. Em algumas modalidades, aseletividade está entre 250-500, 500-750, 750-1.000, 1.000-2.000, 2.000-5.000, 5.000-10.000, 10.000-15.000 ou 15.000-20.000. "Seletividade", conforme definida aqui, se refere àrazão de valores IC50 de um ADC nas células PC-3™ (célulasnão expressando PSMA) para células C4-2 ou células LNCaP™(células expressando PSMA).
Também foi verificado que os ADCs da invençãomediam, em algumas modalidades, extermínio de célula especí-fica expressando PSMA em concentrações muito baixas, taiscomo, em ou próximo as concentrações picomolares. Os ADCs,em algumas modalidades, exibem IC50S em concentraçõesinferiores a menos de cerca de 1 X 10"loM, menos de cerca de1 X 10-11M, ou menos de cerca de 1 X 10"12M. Em umamodalidade especifica, um IC50 é obtido a uma concentraçãode menos de cerca de 1,5 X IO-11M. Em outra modalidade, osADCs providos exibiram IC50S entre 10-210, 40-210, 60-210 ou65-210 pM. Ainda em outra modalidade, os ADCs providosexibiram IC50S de cerca de 10, 40, 60 ou 80 pM. Ainda emoutra modalidade, os ADCs providos exibiram IC50S de cercade 11, 42, 60 ou 83 pM.Foi verificado também que os ADCs, em algumasmodalidades, afetam a taxa de cura em camundongos em pelomenos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%. Emoutras modalidades, a taxa de cura em camundongos é de cercade 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%. Ainda emoutras modalidades, a taxa de cura é 20-40%, 40-60% ou 60-80%. Conforme usado aqui, "taxa" se refere ao número decamundongos ainda vivos após cerca de 500 dias do inicio deum período de estudo, sem evidência de um tumor e sem níveisde PSA mensuráveis, dividido pelo número de camundongos nocomeço do período de estudo. Para avaliar a taxa de cura, oscamundongos recebem 6 mg/kg de ADC com um regime de q4d χ 6.
Em algumas modalidades, o número de camundongos no começo doestudo é de pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 17, 20,25, 30 ou mais camundongos. Detalhes adicionais com relaçãoa um exemplo de tal estudo, são providos aqui a seguir nosExemplos. Em uma modalidade, os camundongos são aqueles quesão um .modelo de câncer de próstata humano independente deandrogênio. Em outra modalidade, os camundongos são camun-dongos nus enxertados com células C4-2 intramuscularmente napata esquerda traseira. Técnicas para determinar a presençade um tumor e para medir os níveis de PSA são bem conhecidosdos versados na técnica comum.
A ligação dos ADCs da invenção às células vivasexpressando PSMAs pode inibir o crescimento de célulasexpressando PSMA, resulta na interrupção do ciclo celular(por exemplo, interrupção de G2/M), promove a apoptose decélulas expressando PSMA, etc. Conforme usado aqui, "resultana interrupção do ciclo celular" se refere a um aumento nonúmero de células na fase G2/M em razão da administração deum ADC. Em algumas modalidades, os ADCs podem efetuar aapoptose. Em outras modalidades, os ADCs resultam em ambasinterrupção do ciclo da célula e apoptose subsequente. OsADCs da invenção, portanto, podem ser empregados em váriosmétodos in vitro e in vivo para efetuar esses pontos finaispossíveis. Especificamente, os ADCs da invenção pode serusados nos métodos para tratar doença mediada por PSMA.
Conforme usado aqui, uma "doença mediada por PSMA"é qualquer doença onde PSMA é a causa ou um sintoma dadoença. Doenças mediada por PSMA também incluem doenças oudistúrbios onde existe uma aberração (por exemplo, superex-pressão) de PSMA. PSMA é uma glicoproteína de membrana doTipo II de 100 kD expressa nos tecidos da próstata(Horoszewicz e outros, 1987, Anticancer Res. 7:927-935;Patente US número 5.162.504). PSMA foi caracterizado como umtipo de proteína de transmembrana possuindo identidade deseqüência com o receptor de transferrina (Israeli e outros,1994, Câncer Res. 54: 1807-1811) e com atividade NAALADase(Carter e outros, 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.93:749-753). De forma mais importante, PSMA é expresso emquantidades aumentadas no câncer de próstata e níveiselevados de PSMA são também detectáveis nos soros dessespacientes (Horoszewicz e outros, 1987; Rochon e outros,1994, Prostate 25:219-223; Murphy e outros, 1995, Prostate26:164-168; e Murphy e outros, 1995, Anticancer Res.15:1473-1479). Portanto, um transtorno mediado por PSMA é,por exemplo, câncer de próstata. A expressão de PSMA aumentacom a progressão da doença, se tornando mais alta na doençametatástica, refratária hormonal para a qual não existeainda terapia Além disso, dados provocativos indicam quePSMA é também expresso abundantemente na neovasculatura devários outros tumores importantes, incluindo célulastumorais de bexiga, pâncreas, sarcoma, melanoma, pulmão erins, porém não na vasculatura normal. As doenças mediadaspor PSMAs, portanto, incluem canceres onde PSMA é expressonas células tumorais ou na neovasculatura do tumor.
Portanto, são providas composições e métodos, quepodem ser usados para tratar qualquer transtorno mediado porPSMA. Por exemplo, ADCs podem ser usados para inibir aneovascularização de um tumor. Em outro exemplo, ADCs dePSMA podem ser usados para exterminar células tumorais. Emalgumas modalidades, dois ou mais ADCs diferentes são usadosem combinação. Em outra modalidade, um ou mais anticorposanti-PSMA não conjugados ou fragmentos de ligação deantigeno dos mesmos podem ser combinados com um ou mais ADCsem uma terapia simples para obter um efeito terapêuticodesejado. Como uma ilustração, um anticorpo anti-PSMA nãoconjugado que media extermínio altamente eficaz das célulasalvo na presença de células efetoras e/ou que inibe ocrescimento das células expressando PSMA pode ser usado comum ou mais ADCs. Ainda em outra modalidade, os ADCs podemser combinados com um ou mais agentes terapêuticos adicio-nais. Tais agentes terapêuticos incluem agentes antitumor,tais como docetaxel; corticosteróides, tal como prednisonaou hidrocortisona; agentes imunoestimuladores; ou algumacombinação dos mesmos.
Agentes antitumor incluem agentes citotóxicos,agentes quimioterapêuticos e agentes que atuam na neovascu-latura do tumor. Agentes citotóxicos incluem radionuclídeoscitotóxicos, toxinas químicas e toxinas de proteína. Oradionuclídeo citotóxico ou isótopo radioterapêutico podeser um isótopo de emissão alfa, tal como, Ac, At, Bi,213Bi, 212Pb, 224Ra ou 223Ra. Alternativamente, o radionuclídeocitotóxico pode ser um isótopo de emissão beta, tal como,186Rh, 188Rh, 177Lu, 90Y, 131I, 67Cu, 64Cu, 153Sm ou 166Ho.
Adicionalmente, o radionuclídeo citotóxico pode emitir Augere elétrons de baixa energia e inclui os isótopos 125I, 123I ou77Br.
Toxinas químicas apropriadas ou agentes quimiote-rapêuticos incluem elementos da família enedina das molé-culas, tais como, caliqueamicina e esperamicina. As toxinasquímicas podem também ser tomadas do grupo consistindo emmetrotrexato, doxorubicina, melfalano, clorambucila, ARA-C,vindesina, mitomicina C5 cis-platina, etoposídeo, bleomicinae 5-fluoruracila. Outros agentes antineoplásticos incluemdolastatinas (Patentes US números 6.034.065 e 6.239.104) ederivados dos mesmos. Dolastatinas e derivados da mesmaincluem dolastatina 10 (dolavalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina-dolafenina) e os derivados de auristatina PHE(éster metílico de dolavalina-valina-dolaisoleuina-dolaproina-fenilalanina) (Pettit, G.R. e outros, AnticancerDrug Des. 13(4):243-277, 1998; Woyke, T. e outros,Antimicrob. Agents Chemother. 45 (12):3580-3584, 2001), eaurastatina E e semelhantes. Toxinas também incluem leciti-nas venenosas, toxinas de plantas, tais como, ricina, abrina,modecina, botulina e toxina da difteria. Outros quimioagen-tes terapêuticos são conhecidos pelos versados na arte.
Os agentes que atuam na vasculatura do tumorincluem agentes de ligação de tubulina, tais como, combres-tatina A4 (Griggs e outros, Lancet Oncol. 2:82, 2001),angiostatina e endostatina (revisto em Rosen, Oncologist5:20, 2000, incorporado aqui como referência) e proteína 10induzível por interferon (Patente US número 5.994.292).Vários outros agentes antiangiogênicos são também contem-plados e incluem: 2ME2, Angiostatina, Angiozima, Anti-VEGFRhuMAb, Apra (CT-2584), Avicina, Benefina, BMS275291,Carboxiamidotriazol, CC4047, CC5013, CC7085, CDC801, CGP-41251 (PKC 412), CM101, Promedicamento Combretastatina A-4,EMD 121974, Endostatina, Flavopiridol, Genisteina (GCP),Extrato de Chá Verde, IM-862, ImmTher, Interferon alfa,Interleucina-12, Iressa (ZD 1839), Marimastat, Metastat(Col-3), Neovastat, Octreotido, Paclitaxel, Penicilamina,Fotofrina, Fotopoint, PI-88, Prinomastat (AG-3340), PTK787(ZK22584), R0317453, Solimastat, Esqualamina, SU 101, SU5416, SU-6668, Suradista (FCE 26644), Suramina (Metaret),Tetratiomolibdato, Talidomida, TNP-470 e Vitaxina. Agentesantiangiogênicos adicionais são descritos em Kerbel, J.Clin. Oncol. 19(18s):45s-51s, 2001, que é incorporado aquicomo referência.Os ADCs podem ser administrados com um ou maisagentes imunoestimuladores para induzir ou melhorar umaresposta imune, tal como IL-2 e oligonucleotideos imunoesti-muladores (por exemplo, aqueles contendo motivos CpG).
Agentes imunoestimuladores podem, em algumas modalidades,estimular ramificações especificas do sistema imune, taiscomo, células exterminadoras naturais (NK) que mediamcitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).Agentes imunoestimuladores incluem interleucina-2, a-interferon, γ-interferon, fator alfa de necrose de tumor(TNFa), oligonucleotideos imunoestimuladores ou uma combina-ção dos mesmos. Imunomoduladores incluem citocinas, quimio-cinas, adjuvantes ou uma combinação dos mesmos. Quimiocinasúteis no aumento das respostas imunes incluem, porém nãoestão limitados ao SLC5 ELC, ΜΙΡ3α, ΜΙΡ3β, IP-10, MIG, ecombinações dos mesmos.
O outro agente terapêutico também pode ser umavacina. Em algumas modalidades, a vacina imuniza um indi-víduo contra PSMA. Tais vacinas, em algumas modalidadesincluem antígenos, tais como, dímeros de PSMA, opcionalmenteum ou mais adjuvantes para induzir ou melhorar uma respostaimune. Um adjuvante é uma substância que potencializa aresposta imune. Adjuvantes de qualquer tipo são bem conhe-cidos. Exemplos específicos de adjuvantes incluem monofos-foril lipídeo A (MPL, SmithKline Beecham); saponinasincluindo QS21 (SmithKline Beecham); oligonucleotideosimunoestimuladores (por exemplo, oligonucleotideos CpGdescritos por Kreig e outros, Nature 374:546-9, 1995);adjuvante de Freund incompleto; adjuvante de Freund completo;montanida; vitamina E e várias emulsões de água em óleopreparadas de óleos biodegradáveis, tais como, esqualenoe/ou tocoferol, Quil A, Ribi Detox, CRL-1005, L-121, ecombinações dos mesmos. Formulações, tais como aquelasdescritas no Pedido US número de série 10/976352 também sãocontempladas para uso como vacinas nos métodos providos aqui.
A revelação de tais formulações é incorporada aqui comoreferência.
As vacinas podem incluir, em algumas modalidades,um ou mais dos multímeros de proteína do PSMA isoladodescritos aqui, tais como, o dímero de proteína do PSMA. Emalgumas modalidades, uma composição de multímero de proteínado PSMA contém pelo menos cerca de 10% do multímero deproteína do PSMA (da quantidade total de proteína do PSMA nacomposição). Em outras modalidades, a composição do multí-mero da proteína do PSMA contém pelo menos cerca de 20%,30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ou99,5% do multímero da proteína do PSMA. Em uma modalidade, acomposição do multímero da proteína do PSMA contém multímeroda proteína do PSMA substancialmente puro, substancialmentesem monômero de proteína do PSMA. Fica entendido que a listade porcentagens específicas inclui por inferência, todas asporcentagens entre as porcentagens citadas aqui.
As citocinas também podem ser usadas nos protocolosde vacinação como um resultado de suas propriedades regula-doras de linfócitos. Muitas citocinas úteis para tais finssão conhecidas de um versado na técnica, incluindo interleu-cina-2 (IL-2); IL-4; IL-5; IL-12, que mostrou melhorar osefeitos protetores das vacinas (vide, por exemplo, Science268: 1432-1434, 1995); GM-CSF; IL-15; IL-18; combinações dosmesmos e semelhantes. Assim, as citocinas podem ser adminis-tradas em conjunto com o antigeno, quimiocinas e/ou adjuvan-tes para melhorar uma resposta imune.
Os outros agentes terapêuticos podem estar presen-tes nas composições da invenção ou ser usados dos métodos dainvenção na forma não conjugada ou na forma conjugada, talcomo conjugada a um anticorpo anti-PSMA ou fragmento deligação de antigeno do mesmo. 0 acoplamento de uma ou maismoléculas de toxina ao anticorpo anti-PSMA ou fragmento deligação de antigeno do mesmo pode incluir muitos mecanismosquímicos, por exemplo, ligação covalente, ligação deafinidade, intercalamento, ligação de coordenada e complexação.
A ligação covalente pode ser obtida tanto porcondensação direta das cadeias laterais existentes ou porincorporação das moléculas de ligação em ponte externas.
Muitos agentes bivalentes ou polivalentes são úteis noacoplamento das moléculas de proteína às outras proteínas,peptídeos ou funções amina, etc. Por exemplo, a literaturaestá repleta de agentes de acoplamento tais como, carbodi-imidas, diisocianatos, glutaraldeídos, diazobenzenos e hexa-metileno diaminas. Essa lista não pretende ser exaustiva dosvários agentes de acoplamento conhecidos na técnica, porém éexemplar dos agentes de acoplamento mais comuns.Em algumas modalidades, é contemplado que se podedesejar primeiro derivatizar o anticorpo e então anexar oagente terapêutico ao produto derivatizado. Agentes de reti-culação apropriados para uso desse modo incluem, por exemplo,SPDP (N-succinimidil-3-(2- piridilditio)propionato) , e SMPT,4-succinimidil-oxicarbonil-metil-(2-piridilditio)tolueno.
Além disso, as toxinas da proteína podem serfundidas ao anticorpo anti-PSMA ou fragmento de ligação deantígeno do mesmo por métodos genéticos para formar umaproteína de fusão de imunotoxina híbrida. As proteínas defusão podem incluir seqüências de peptídeo adicionais, taiscomo, espaçadores de peptídeo que anexam, operativamente,por exemplo, o anticorpo anti-PSMA e a toxina, à metida quetais seqüências adicionais não afetem apreciavelmente oalvejamento ou atividades de toxina da proteína de fusão. Asproteínas podem ser anexadas a um ligante de peptídeo ouespaçador, tal como, peptídeo espaçador de glicina-serina ouuma articulação do peptídeo, como é bem conhecido na técnica..
Assim, por exemplo, o terminal C de um anticorpo anti-PSMAou fragmento de ligação de antígeno do mesmo pode serfundido ao término N da molécula de toxina da proteína, paraformar uma imunotoxina que retém as propriedades de ligaçãodo anticorpo anti-PSMA. Outras disposições de fusão serãoconhecidas dos versados na técnica. Para expressar a imuno-toxina de fusão, o ácido nucléico codificando uma proteínade fusão é inserido no vetor de expressão, de acordo com osmétodos padrão, para expressão estável da proteína de fusão,tal como nas células de mamíferos, tais como células CHO. Aproteína de fusão pode ser isolada e purificada das célulasou sobrenadante da cultura usando metodologia padrão, talcomo, uma coluna de afinidade de PSMA.
Radionuclideos são acoplados, tipicamente, a umanticorpo ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo porquelação. Por exemplo, no caso de radionuclídeos metálicos,um quelante bifuncional é geralmente empregado para ligar oisótopo ao anticorpo ou outra proteína de interesse. Tipica-mente, o quelante é primeiro anexado ao anticorpo e o conju-gado de queIante-anticorpo é contatado com o radioisótopometálico. Vários quelantes funcionais foram desenvolvidospara essa finalidade incluindo a série de ácido dietile-notriamina pentacético (DTPA) de aminoácidos descritos nasPatentes US números 5.124.471, 5.286.850 e 5.434.287, quesão incorporadas aqui como referência. Como outro exemplo,agentes quelantes bifuncionais à base de ácido hidroxâmicosão descritas na Patente US número 5.756.825, o conteúdo damesma sendo incorporado aqui como referência. Outro exemploé o agente quelante denominado p-SCN-Bz-HEHA(ácido 1,4,7,10,13, 16-hexaazaciclo-octadecano-N, N' , N", N"', N"", N"'"-hexaacéti-co) (Deal e outros, J. Med. Chem. 42:2988, 1999), que é umquelante eficaz ou radiometal, tal como, 225Ac. Ainda outroexemplo é o DOTA (ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecanoΝ, N', N", N"'-tetraacético) , que é um agente quelantebifuncional (vide McDevitt e outros, Science 294:1537-1540,2001) que pode ser usado em um método de duas etapas paramarcação seguido por conjugação.Outros agentes terapêuticos também incluem vírusseletivos de replicação. Os vírus competentes de replicação,tais como, via p53 de alvejamento de adenovírus mutantedll520, ONYX-O15, extermina células tumorais seletivamente(Biederer, C. e outros, J. Mol. Med. 80 (3) :163-175, 2002).
Os vírus podem ser, em algumas modalidades, conjugados aosanticorpos do PSMA ou fragmentos de ligação de antígeno dosmesmos.
As composições providas na presente invenção podemser empregadas em conjunto com outras modalidades detratamento terapêutico. Tais outros tratamentos incluemcirurgia, radiação, criocirurgia, termoterapia, tratamentohormonal, quimioterapia, vacinas e outras imunoterapias.
Os ADCs da invenção, tal como através de seusanticorpos ou fragmento de ligação de antígeno dos mesmos,podem ser ligados a um marcador. Os marcadores incluem, porexemplo, marcadores fluorescentes, marcadores de enzima,marcadores radioativos, marcadores ativos de. ressonânciamagnética nuclear, marcadores luminescentes ou marcadores decromoforo.
As composições providas podem incluir um veículofisiológica ou farmaceuticamente aceitável, excipiente ouestabilizador misturado ao ADC. Em algumas modalidades,quando a composição compreende dois ou mais ADCs diferentes,cada um dos anticorpos ou fragmentos de ligação do antígenodos ADCs se liga a um epítopo conf ormacional distinto doPSMA.Conforme usado aqui, "célula alvo" significa qual-quer célula indesejável em um indivíduo (por exemplo, um serhumano ou animal) que pode ser alvejada por um ADC dainvenção. Em algumas modalidades, a célula alvo é uma célulaexpressando ou superexpressando PSMA. As células expressandoPSMA ou células expressando-PSMA, tipicamente incluemcélulas tumorais, tais como, próstata, bexiga, pâncreas,pulmão, rins, células de tumor do cólon, bem como células demelanoma e sarcoma.
As composições farmacêuticas da invenção podem seradministradas em terapia de combinação, isto é, combinadascom outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinaçãopode incluir uma composição da presente invenção com pelomenos um agente antitumor, imunomodulador, agente imunoesti-mulador ou terapia convencional. O outro agente pode serconjugado ou formado como molécula de fusão recombinante comum anticorpo de PSMA ou fragmento de ligação de antígeno domesmo para alvejamento direcionado doa gente às célulasexpressando-PSMA. Em outra modalidade, o outro agente tera-pêutico pode não ser conjugado. Agentes terapêuticosadicionais podem ser administrado sou contatados com célulasexpressando-PSMA através de co-administração. "Co-admi-nistração", conforme usado aqui, se refere à administraçãode dois ou mais agentes terapêuticos simultaneamente comouma mistura em uma composição simples ou seqüencialmente, epróximo o bastante no tempo, de modo que os compostos podemexercer um efeito aditivo ou mesmo sinergistico. Ainda emoutras modalidades, um agente terapêutico adicional pode seradministrado antes, durante ou após a administração de um oumais ADCs ou composições do mesmos.
Conforme usado aqui "veiculo farmaceuticamenteaceitável" ou "veiculo fisiologicamente aceitável" incluiqualquer e todos os sais, solventes, meios de dispersão,revestimentos, agentes antibacterianos e antifungos, agentesisotônicos ou de retardo de absorção e semelhantes que sãofisiologicamente compatíveis. Em algumas modalidades, oveículo é apropriado para administração intravenosa, intra-muscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica(por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da rota deadministração, o composto ativo pode ser revestido em ummaterial para proteger o composto da ação dos ácidos eoutras condições naturais que podem inativar o composto.
Quando administradas, as preparações farmacêuticasda invenção são aplicadas em quantidades farmaceuticamenteaceitáveis e em composições farmaceuticamente aceitáveis. 0termo "farmaceuticamente aceitável" significa um materialnão tóxico que não interfere com a eficácia da atividadebiológica dos ingredientes ativos. Tais preparações podemconter, rotineiramente, sais, agentes de tamponamento, pre-servantes, veículos compatíveis e opcionalmente outrosagentes terapêuticos, tais como, agentes de potencializaçãoimune suplementares incluindo adjuvantes, quimiocinas ecitocinas. Quando usados em remédios, os sais seriam farma-ceuticamente aceitáveis, porém sais não farmaceuticamenteaceitáveis podem ser convenientemente empregados parapreparar sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos e nãoestão excluídos do escopo da invenção.
Um sal retém a atividade biológica desejada docomposto de origem e não fornece quaisquer efeitos toxicoló-gicos indesejáveis (vide, por exemplo, Berge, S.M., e outros(1977) J. Pharm. Sei. 66: 1-19). Exemplos de tais saisincluem sais de adição de ácido e sais de adição de base.Sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidosinorgânicos não tóxicos, tais como, clorídrico, nítrico,fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodrídico, fosforoso esemelhantes, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos, taiscomo, ácidos mono alifáticos e dicarboxílicos, ácidosalcanóicos substituídos com fenila, ácidos hidróxialcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos15 e aromáticos e semelhantes. Sais de adição de base incluemaqueles derivados de metais alcalino terrosos, tais como,sódio, potássio, magnésio, cálcio e semelhantes, bem como deaminas orgânicas não tóxicas, tais como, Ν,N1-dibenziletile-nodiamina, N-metilglucamina, quioroprocaína, colina, dieta-nolamina, etilenodiamina, procaína e semelhantes.
Um ADC pode ser combinado, caso desejado, com umveículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo farma-ceuticamente aceitável" conforme usado aqui, significa umaou mais cargas sólidas ou líquidas compatíveis, diluentes ousubstâncias de encapsulamento que são apropriadas paraadministração a um ser humano. O termo "veículo" indica umingrediente orgânico ou inorgânico, natural ou sintético,com o qual o ingrediente ativo é combinado para facilitar aaplicação. Os componentes das composições farmacêuticastambém podem ser co-misturados de modo que não existeinteração que possa prejudicar substancialmente a eficáciafarmacêutica desejada.
As composições farmacêuticas podem conter agentesde tamponamento apropriados incluindo: ácido acético em umsal; ácido citrico em um sal; ácido bórico em um sal; eácido fosfórico em um sal.
As composições farmacêuticas também podem conter,opcionalmente, preservativos apropriados, tais como: cloretode benzalcônio; clorobutanol; parabenos e timerosal.
As composições farmacêuticas podem ser represen-tadas, convenientemente, na forma de dosagem unitária epodem ser preparadas por qualquer um dos métodos bemconhecidos na arte da farmácia. Todos os métodos incluem aetapa de colocação do agente ativo em associação com umveiculo que constitui um ou mais dos ingredientes acessó-rios. Em geral, as composições são preparadas por colocaçãouniforme ou intima do composto ativo em associação com umveiculo liquido, um veiculo sólido finamente dividido ouambos e então, caso necessário, conformando o produto.
As composições apropriadas para administraçãoparenteral compreendem, convenientemente, uma preparaçãoaquosa estéril ou não aquosa de compostos, que é, em algumasmodalidades, isotônica com o sangue do receptor. Essapreparação pode ser formulada de acordo com os métodosconhecidos usando agentes de dispersão ou umectação aprotraidos e agentes de suspensão. A preparação injetável,estéril, pode também ser uma solução injetável estéril ouuma suspensão em um diluente ou solvente parenteralmenteaceitável, não tóxico, por exemplo, como uma solução em 1,3-butano diol. Entre os veículos e solventes aceitáveis quepodem ser empregados estão água, solução de Ringer e soluçãoisotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos estéreis,fixos são convencionalmente empregados como um solvente oumeio de suspensão. Para esse fim, qualquer óleo fixocombinado pode ser empregado incluindo mono ou diglicerídeossintéticos. Além disso, ácidos graxos, tais como, ácidooléico, podem também ser usados na preparação de injetáveis.
Formulações veículo apropriadas para administração oral,subcutânea, intravenosa, intramuscular, etc. podem serencontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, MackPublishing Co., Easton, PA.
Os compostos ativos podem ser preparados com veí-culos· que protegerão o composto contra liberação rápida,tais como, em uma formulação de liberação controladaincluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas deliberação microencapsulada. Os polímeros biodegradáveis,biocom-patíveis podem ser usados, tais como, acetato deetileno vinila, polianidridos, ácido poliglicólico,colágeno, poli-ortoésteres e ácido polilático. Muitosmétodos para a preparação de tais formulações sãopatenteados ou geralmente conhecidos dos versados na arte.Vide, por exemplo, Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc.,New York, 1978.Os terapêuticos da invenção podem ser administra-dos por qualquer via convencional, incluindo injeção ou porinfusão gradual com o tempo. A administração pode ser, porexemplo, oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular,intracavidade, intratumor ou transdérmica. Quando os compos-tos contendo os anticorpos são usados terapeuticamente, asvias de administração incluem intravenosa e aerossolpulmonar. As técnicas para preparação de sistemas deliberação aerossol contendo anticorpos são bem conhecidasdos versados na técnica. De modo geral, tais sistemas utili-zariam componentes que não prejudicariam significativamenteas propriedades biológicas dos anticorpos, tais como,capacidade de ligação de paratopo (vide, por exemplo,Sciarra and Cutie, "Aerosols", em Remington's PharmaceuticalSciences, 18a edição, 1990, pp. 1694-1712; incorporada aquicomo referência). Aqueles versados na técnica podemdeterminar, prontamente, os vários parâmetros e condiçõespara produção de aerossóis de anticorpo sem recorrer aexperimentação indevida.
As composições da invenção são administradas emquantidades eficazes. Uma "quantidade eficaz" é aquelaquantidade de qualquer um dos ADCs providos aqui quesozinhos, ou em conjunto com doses adicionais e/ou outrosagentes terapêuticos, por exemplo, tratam uma doença mediadapor PSMA em um indivíduo. Isso pode envolver apenas alentidão temporária do progresso da doença, embora emalgumas modalidades, envolva parada permanente de progressãoda doença. Isso pode ser monitorado por métodos de rotina. Aresposta desejada para o tratamento da doença ou condiçãopode também ser retardar o inicio ou mesmo prevenir o inicioda doença ou condição. Uma quantidade que é eficaz pode sera quantidade de um ADC sozinho que produza o ponto finalterapêutico desejado. Uma quantidade que é eficaz é também aquantidade de um ADC em combinação com outro agente queproduz o resultado desejado.
Tais quantidades dependerão, naturalmente, dadoença mediada por PSMA especifica que está sendo tratada,da gravidade da condição, dos parâmetros dos pacientesindividuais incluindo idade, condição física, tamanho epeso, a duração do tratamento, a natureza da terapia concor-rente (se houver), a via específica de administração efatores semelhantes dentro do conhecimento e experiência domédico. Esses fatores são bem conhecidos de um versado natécnica comum e podem ser empregados com não mais queexperimentação de rotina. É geralmente preferido que umadose máxima de componentes individuais ou combinações dosmesmos seja utilizada, isto é, a dose mais altamente segurade acordo com o julgamento médico. Será entendido pelosversados na técnica, contudo, que um paciente pode insistirem uma dose mais baixa ou dose tolerável por razões médicas,psicológicas ou virtualmente por quaisquer outras razões.
As composições farmacêuticas usadas nos métodosprecedentes preferivelmente são estéreis e contém uma quan-tidade eficaz de um ADC, sozinho ou em combinação com outroagente, para produção da resposta desejada em uma unidade depeso ou volume apropriada para administração a um paciente.A resposta pode ser, por exemplo, medida por determinaçãodos efeitos fisiológicos da composição do ADC, "tais como,regressão de um tumor ou diminuição dos sintomas da doença.Outros ensaios serão conhecidos dos versados na técnica epodem ser empregados para medir o nivel de resposta.
As doses de ADCs administradas a um indivíduopodem ser escolhidas de acordo com parâmetros diferentes,especi-ficamente de acordo com o modo de administração usadoe o estado do indivíduo. Outros fatores incluem o período detratamento desejado. No evento de uma resposta em um indiví-duo ser insuficiente nas doses iniciais aplicadas, dosesmaiores (ou efetivamente doses maiores por uma via de libe-ração diferente, mais localizada) podem ser empregadas àmedida que a tolerância do paciente permita.
Em geral, as doses podem variar de cerca de 10μg/kg a cerca de 100.000 μg/kg. Em algumas modalidades, asdoses podem variar de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 20mg/kg. Ainda em outras modalidades, as doses variam de cercade 0,1 mg/kg a 5 mg/kg, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg ou 0,1 mg/kg a15 mg/kg. Ainda em outras modalidades, as doses variam decerca de 1 mg/kg a 5 mg/kg, 5 mg/kg a 10 mg/kg, 10 mg/kg a15 mg/kg ou 15 mg/kg a 20 mg/kg. Nas modalidades adicionais,a dose é de cerca de 0,1 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg,3 mg/kg, 5 mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 17mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg ou 30 mg/kg. Em outra modalidade,a dose é de cerca de 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg ou 6 mg/kg.
Com base na composição, a dose pode ser liberada continua-mente, tal como por bombeamento contínuo ou em intervalosperiódicos. Em algumas modalidades, quando o ADC é admi-nistrado intravenosamente, a dose está entre 0,1 e 20 mg/kgou qualquer outro valor dentro dessa faixa. Intervalos detempo desejados de doses múltiplas de uma composição espe-cifica podem ser determinados, sem experimentação indevidapelo versado na arte. Outros protocolos para administraçãodas composições providas serão conhecidos pelos versados naarte comum, onde a quantidade da dose, programação de admi-nistração, sítios de administração, modo de administração esemelhantes variam do precedente. Em algumas modalidades, osindivíduos recebem administração do ADC com um regime dedose de q4d χ 3 ou q4d χ 6. Em uma modalidade, a dose éadministrada intravenosamente. Em outra modalidade, o regimede dosagem é uma dose intravenosa simples.
A administração das composições do ADC aos mamí-feros diferentes de seres humanos, por exemplo, para fins deteste ou fins de veterinária terapêutica, é realizada subs-tancialmente de acordo com as mesmas condições descritasacima.
As composições da presente invenção possuem utili-dades terapêuticas e de diagnóstico in vitro e in vivo. Porexemplo, essas moléculas podem ser administradas às célulasna cultura, por exemplo, in vitro ou ex vivo, ou em um indi-víduo, por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir ou diag-nosticar várias doenças mediadas por PSMA. Conforme usadoaqui, o termo "indivíduo" se destina a incluir seres humanose animais. Os indivíduos incluem um paciente humanopossuindo um transtorno caracterizado por expressão, típica-mente expressão aberrante (por exemplo, superexpressão) doPSMA, tais transtornos estando incluídos na definição de"Doença mediada por PSMA".
As composições providas aqui podem ser utilizadasna terapia in vivo do câncer. Os ADCs podem ser usados parainibir a proliferação das células malignas ou tecidosseguindo administração e localização dos conjugados. Ascomposições providas podem incluir anticorpos anti-PSMA, emalgumas modalidades, que podem mediar a destruição do tumorpor fixação de complemento ou citotoxicidade celulardependente de anticorpo. Alternativamente, as composiçõespodem conter um agente terapêutico adicional para resultarnos efeitos terapêuticos sinergisticos (Baslya andMendelsohn, 1994 Breast Câncer Res. and Treatment 29:127-138).
As composições da invenção também podem ser admi-nistradas em conjunto, em algumas modalidades, com anticor-pos anti-PSMA complementos e/ou não conjugados. Conseqüen-temente, dentro do escopo da invenção, se encontram composi-ções compreendendo ADC e soro ou complemento. Essas compo-sições são vantajosas pelo que o complemento está localizadoem proximidade com os anticorpos humanos ou fragmentos deligação de antígeno dos mesmos. Alternativamente, os ADCs,anticorpos ou fragmentos de ligação de antígeno dos mesmose/ou complemento ou soro podem ser administrados separadamente.
0 uso da terapia da presente invenção possuivários benefícios. Uma vez que os ADCs preferivelmentealvejam o PSMA, por exemplo, nas células de câncer dapróstata, outro tecido pode ser poupado. Como resultado, otratamento com tais agentes biológicos é seguro,especificamente para pacientes mais velhos. Espera-se que otratamento de acordo com a presente invenção sejaespecificamente eficaz, em algumas modalidades, porque podedirecionar níveis altos de ADCs para a medula óssea e nodoslinfáticos, onde as metás-tases do câncer, tal como, câncerde próstata, podem predo-minar. 0 tratamento, de acordo coma presente invenção, pode ser eficazmente monitorado comparâmetros clínicos, tais como, antígeno específico do soroda próstata e/ou aspectos patológicos do câncer de umpaciente, incluindo, estágio, classificação Gleason, invasãoextracapsular, seminal, vesi-cular ou perineural, margenspositivas, nodos linfáticos envolvidos, etc.
Alternativamente, esses parâmetros podem ser usados paraindicar quando tal tratamento deve ser empregado.
Também se encontram dentro do escopo da invençãoos kits compreendendo composições, por exemplo, um ou maisADCs, da invenção e instruções de uso. Os kits podem conter,adicionalmente, pelo menos um reagente adicional, tal como,complemento, um agente quimioterapêutico, um corticosteróideou um ou mais anticorpos que se ligam ao . PSMA. Outros kitspodem também incluir multímeros do PSMA. Em outra concre-tização, um kit pode compreender um veículo sendo divididoem compartimentos para receber em confinamento próximo, umou mais dispositivos de recipiente ou série de dispositivosde recipiente, tais como, tubos de teste, ampolas, frascos,garrafas, seringas ou semelhantes. Um primeiro dispositivode compartimento ou série de dispositivos de compartimentopode conter um ou mais anticorpos anti-PSMA ou fragmentos deligação de antigeno dos mesmos. Um segundo dispositivo derecipiente ou série de dispositivos de recipientes podemconter, em algumas modalidades, MMAE ou MMAF ou um compostoda fórmula 1 conjugado à MMAE ou MMAF. Em algumas modali-dades, um terceiro dispositivo de recipiente ou série dedispositivos de recipiente contém um composto da fórmula 1.
Os kits para uso na localização de tumor in vivo e método deterapia contendo os ADCs podem ser preparados. Os componen-tes dos kits podem ser embalados tanto no meio aquoso quantona forma -Iiof ilizada. Os componentes dos conjugados de ADCpodem ser fornecidos na forma completamente conjugada, naforma de intermediários ou como frações separadas a seremconjugadas pelo usuário do kit.
Conforme usado aqui, com relação aos polipeptí-deos, proteínas ou fragmentos dos mesmos, "isolado" signi-fica separado de seu ambiente nativo e presente em quanti-dade suficiente para permitir sua identificação ou uso.
Isolado, quando se refere a uma proteína ou polipeptídeo,significa, por exemplo: (i) produzido seletivamente porclonagem de expressão ou (ii) purificado por cromatografiaou eletroforese. Proteínas isoladas ou polipeptídeos podemser, porém não necessariamente, substancialmente puros. 0termo "substancialmente puro" significa que as proteínas oupolipeptídeos são essencialmente isentos de outras substân-cias com as quais eles podem se encontrados na natureza ounos sistemas in vivo a uma extensão prática e apropriadapara seu uso pretendido. Polipeptideos substancialmentepuros podem ser produzidos por técnicas bem conhecidas naarte. Uma vez que uma proteína isolada pode ser misturadacom um veículo farmaceuticamente aceitável na preparaçãofarmacêutica, a proteína pode compreender apenas uma pequenaporcentagem em peso da preparação. A proteína não obstante,é isolada pelo que, foi separada das substâncias com asquais ela pode ser associada nos sistemas vivos, isto é,isolada de outras proteínas.
As composições providas aqui podem estar na formaliofilizada ou serem providas em um meio aquoso.
A presente invenção é adicionalmente ilustradapelos Exemplos que se seguem, que de modo algum devem sertidos como limitantes. Todo o conteúdo de todas as referên-cias (incluindo referências de literatura, patentes emitidas,pedidos de patente publicados, e pedidos de patente copen-dentes) citados através desse pedido são dessa forma expres-samente incorporados como referência.EXEMPLOS
Exemplo 1: Atividade Antitumor Potente de um Anticorpo Mono-clonal Completamente Humano, Conjugado com Auristatina para
Antigeno de Membrana Especifico da Próstata
Materiais e Métodos
Linhagens das Células e Anticorpos
LNCaP™ (CRL-17 4 O) , PC-3™ (CRL-1435), e 3T3(TM)(CRL-2752) foram obtidos na American Type Culture Collection(Rockville, MD) . A linhagem de célula C4-2, uma linhagem desubcélula de LNCaP™, foi obtida na Cleveland ClinicFoundation (Cleveland, OH). Uma linhagem de célula PSMA-3T3™foi obtida no Memorial Sloan-Kettering Câncer Center (NewYork, NY). LNCaP(TM), C4-2 e PC-3™ foram cultivados em RPMI1640 (Life Technologies, Gaithersburg, MD), e 3T3™ e PSMA-3τ3™ foram cultivados em DMEM (Life Technologies) . Os meiosde cultura foram suplementados com soro fetal bovino a 10%(Hyclone, Logan, UT), L-glutamina, penicilina e estreptomi-cina (Life Technologies). Células C4-2, LNCaP™ e PSMA-3T3™foram determinadas para expressar PSMA em níveis de aproxi-madamente 2 χ IO5, β χ IO5 e > 1 χ IO6 cópias/células, res-pectivamente, de acordo com os métodos publicados (Ma D, eoutros, Leukemia 2002; 16:60-6.). C4-2 é um subclone inde-pendente de androgênio das células LNCAP™ dependentes deandrogênio. PC-3™ é uma linhagem de célula cancerígena dapróstata não diferenciada que não expressa PSMA. MAbs dePSMA (AB-PG1-XG1-006 (PTA-4403 e PTA-4404) e Abgenix 4.40.2(PTA-4360)) foram produzidos conforme descrito anteriormenteno Pedido de Patente US número 10/395.894 e Schulke N eoutros, PNAS USA, 2003; 100:12590-5, cada um dos quais sendoincorporado aqui como referência, em sua totalidade. Abgenix4.40.2 foi usado como um controle. Um mAb do PSMA plenamentehumano (IgGl,κ) surgiu no camundongo transgênico para olocal do gene de imunoglobulina humana (XenoMice™, Abgenix,Inc., Fremont, CA) seguindo-se imunização com PSMA solúvel,recombinante e células LNCaP conforme descrito anteriormente(Schulke N e outros, PNAS USAf 2003; 100:12590-5).
Internalização de PSMA
MAbs foram modificados com quelatos bifuncionaisdo ácido cicloexil-dietilenotriamina-pentaacético (CHX-DTPA)obtido no National Câncer Institute (Bethesda, MD), emarcado com 111In (PerkinElmer, Boston, MA) conforme descritoanteriormente (Ma D, e outros, Leukemia 2002;16:60-6; NikulaTK, e outros, J. Nucl. Med 1999;40: 166-76). MAb marcado com111In foi determinado como sendo > 90% imunoreativo por incu-bação do radioconjugado com um excesso de células PSMA-3T3™e medindo a fração de ligação de acordo com os métodospublicados (Ma D, e outros, Leukemia 2002; 16:60-6; NikulaTK, e outros, J. Nucl. Med 1999;40: 166-76). Para análise deinternalização, mAb marcado com 111In foi incubado com 2 χIO5 células de C4-2 a 37 0C em CO2 a 5%. Em pontos de temposeqüenciais, mAb não ligado foi removido por lavagem em PBSe mAb da superfície da célula foi eluído usando tampão de pHbaixo (pH 2,4, glicina/NaCl). O eluato de pH baixo foicontado separadamente da microesfera da célula, e a porcen-tagem de internalização foi calculada conforme descritoanteriormente (McDevitt MR, e outros, Câncer Res 2000;60:6095-100).
Preparação de Conjugados de Anticorpo-Medicamento
A síntese e projeto dos ligantes e a conjugação doligante ao medicamento citotóxico foram realizados conformedescrito na Patente US número 6.884.889 e Patente US número6.214.345, cada uma incorporada aqui como referência, em suatotalidade. A conjugação de mAbs com maleimidocaproil (mc)-valina (Val)-citrulina (Cit)-monometil auristatina E (MMAE)foi realizada conforme descrito (Doronina SO, e outros, Nat.Biotechnology. 2003;21 :778-84) . MAb de PSMA e IgGl humanade controle de isotipo (Calbiochem, San Diego, CA) em PBScontendo 50 mM de borato, pH 8,0, foram tratados comditiotreitol (DTT) (10 mM final) a 37°C por 30 minutos. Asconcentrações finais de reação foram 7,5 mL - 8,0 mL, 1 mL0,5 M borato de sódio, pH 8 e 0,5 M NaCl, 1 mL, 100 mM deDTT, e 0,5 mL ou 0 mL, respectivamente de PBS. Essa soluçãofoi incubada a 40°C por 1 hora e o anticorpo purificado emuma coluna de filtração de gel. A coluna foi equilibrada com10 mM de DTPA em PBS a 10 mL/minuto, carregada com 10,0 mLde mistura de redução de anticorpo e eluída a 8 mL/min emtampão de PBS/DTPA. A concentração de anticorpo-cisteínatióis produzida foi determinada por titulação com 5,5'-ditio-bis-(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) (Pierce ChemicalCo., Rockford, IL). Um equivalente químico pode ser obtidona Sigma (St. Louis, MO).
O Abgenix de mAb completamente reduzido 4.40.2(22,6 mL de 7,8 μΜ mAb, 75,6 μπ\ de cisteína tiol) foiparei almente reoxidado com 35, 43 μΐι de 10 mM DTNB, e o mAbcompletamente reduzido AB-PG1-XG1-006 (25,1 mL de 11,2 μΜ demAb, 95,8 μΜ de cisteina tiol) foi parcialmente reoxidadocom 56, 27 μΐ; de 10 nM DTNB. A cor da solução se tornouimediatamente amarela.
O medicamento mc-Val-Cit-carbamato de paraamino-benzil-MMAE (vcMMAE) foi então conjugado em mAbs parcial-mente reoxidados como se segue: os mAbs foram primeiro res-friados para 0°C. vcMMAE (5 equivalentes molares por anti-corpo: 89,7 e 140,6 μΐ^ respectivamente, de uma solução deestoque 10 mM de vcMMAE) foi dissolvido em 5 mL de aceto-nitrila, então adicionado a uma solução de anticorpo,enquanto vortexando cuidadosamente. As mistura de reaçãoforam incubadas em gelo. Nenhuma alteração de cor adicionalfoi observada. As misturas de reação foram saturadas com 20equivalentes molares de cisteina/medicamento. O conjugadofoi purificado usando uma coluna de filtração de gel a 40C eeluido com PBS a 8,0 mL/minuto. Os ADCs foram determinadoscomo possuindo ^ 98% de mAb monomérico 3,0-3,5 medicamentospor mAb usando os métodos publicados (Doronina SO e outros,Nat Biotechnol. 2003;21:778-84).
Alternativamente, a conjugação de mAbs com malei-midocaproil (mc)-valina(Val)-citrulina (Cit)-monometil auris-tatina E (MMAE) foi realizada conforme descrito (DoroninaSO, e outros, Nat. Biotechnology. 2003;21 :778-84). MAb doPSMA e IgGl humana de controle de isotipo (Calbiochem, SanDiego, CA) em PBS contendo 50 mM de borato, pH 8,0, foramtratados com ditiotreitol (DTT) (10 mM final) a 37°C por 30minutos. Os mAbs foram trocados no PBS contendo 1 mM de DTPA(Aldrich, Milwaukee, WI) por passagem através de uma colunaSephadex G-25 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Assoluções de mAb foram resfriadas para 4°C e combinadas com oderivado de medicamento maleimido em CH3CN frio. Após umahora, as reações foram saturadas com excesso de cisteina eos conjugados foram concentrados e trocados no tampão PBS.Os ADCs foram determinados como possuindo ^ 98% de mAbmonomérico 3,0-3,5 medicamentos por mAb usando os métodospublicados (Doronina SO e outros, Nat Biotechnol. 2003;21:778-84).
Reatividade dos ADCs com PSMA de Superfície da Célula
A ligação do mAb do PSMA e ADC às células PSMA-#T3™ e parenteral 3T3™ foi analisada usando citômetro defluxo FACSCalibur (BD Bioscience, San Diego, CA). Em resumo,2 χ IO5 células PSMA-3T3™ (ou 3T2™) foram incubadas comconcentrações diferentes de mAb ou ADC em gelo por 1 hora.Após a lavagem, a presença do anticorpo de ligação foidetectada usando IgG-FITC anti-humano de cabra (CaltagLaboratories, Burlingame, CA). O anticorpo de controle-isotipo e ADC foram examinados em paralelo.
Ensaio de Citoloqia In vitro
Células PSMA positivo (C4-2, LINCaP™ ou PSMA-3T3™)e células PSMA negativo (PC-3™ ou 3T3™) foram adicionadas àsmicroplacas de 96 poços (Falcon, BD Biosciences, San Jose,CA) a 2,5 χ IO3 células/poço e incubadas por toda a noite a37 ° C e 5% CO2. As células foram então incubadas com ADCsdiluídos em série por 4 dias. 0 meio de cultura da célulafoi substituído com meio fresco contendo Alamar Blue a 10%(Biosource International, Camarillo, CA), e as células foramincubadas por 4 horas. As placas foram então lidas em umaleitora de placa de fluorescência usando um comprimento deonda de excitação de 530 nm e um comprimento de onda deemissão de 590 nm. A sobrevivência celular foi comparada nasculturas tratada e não tratada e a concentração de ADCnecessária para 50% de extermínio celular (valor IC5o) foideterminada.
Modelo de Xenoenxerto de Câncer de PróstataIndependente de Androgênio
Todos os estudos com animais foram realizados deacordo com as diretrizes do Animal Care and Use Committee.Camundongos machos nus, atímicos (National Câncer Institute,Frederick, MD) com 6 a 8 semanas de vida foram implantadoscom uma injeção intramuscular de 5 χ IO6 células C4-2 mistu-radas com Matrigel a 50% (Beckon Dickinson Labware, Bedford,MA) na pata esquerda traseira, conforme descrito (McDevittMR, e outros, Câncer Res 2000; 60:6095-100). Aproximadamente1 dia antes do início do tratamento, os animais foram alea-torizados de acordo com os níveis de soro de antígeno espe-cífico para próstata (PSA) conforme medido por ELISA(Medicorp, Montreal, Quebec, Canadá). ADC, mAbs e veículo decontrole foram administrados através de injeção na veia dacauda. Nas primeiras séries de experimentos, os camundongosforam tratados em grupos de 6 com 2 ou 10 mg/kg de ADC doPSMA ou com veículo de controle. 0 tratamento foi iniciado17 dias após a implantação e consistiu em 3 injeções emintervalos de 4 dias (q4d χ 3) . A segunda série de experi-mentos examinou os níveis de dose de 0,3 ou 6 mg/kg. Otratamento foi iniciado 14 dias após o implante e consistiuem 6 injeções em intervalos de 4 dias (q4d χ 6) . Os animaisforam monitorados por sua aparência física, peso corpóreo,nível do PSA e tamanho do tumor. As razões de sobrevivênciaforam completamente registradas nos estudos.
Análises Estatísticas
Os efeitos do tratamento foram examinados quantoao significado através de testes t (para níveis de PSA) outestes de classificação logarítmica (para sobrevivência dosanimais) usando análises emparelhadas de duas terminações.Os dados foram considerados significativos quando P < 0,05.
Resultados
Internalização do mAb do PSMA em Células Cancerí-genas de Próstata Humana
A internalização foi examinada usando células mAbdo PSMA marcadas com 111In ou C4-2. A ligação total e aporcentagem de internalização com o decorrer do tempo sãoilustradas na Figura 1. Metade do mAb ligado foi interna-lizada em cerca de duas horas (Figura IA) . A ligação totalaumentou com o passar do tempo, presumivelmente devido àreciclagem do PSMA (Figura 1B) . Assim, o mAb do PSMA éprontamente internalizado nas células expressando PSMA.
Reatividade de ADC do PSMA com Células Expressando PSMAA citometria de fluxo foi empregada para comparara ligação de mAb do PSMA e ADC. 0 mAb não modificado e o ADCdemonstraram nivel comparáveis de ligação ao PSMA-3T3™ emrelação a uma ampla faixa de diluições (Figura 2) . Nem aquantidade máxima de ligação, nem a concentração necessáriaspara metade da ligação máxima foram apreciavelmente efetua-das por conjugação. Nenhuma ligação significativa foi obser-vada para . o ADC de controle de isotipo ou anticorpo nascélulas PSMA-3T3™ ou para mAb PSMA ou ADC nas célulasparenterais 3T3™.
Potência In Vitro e Seletividade do ADC do PSMAPSMA e ADCs de controle foram testados quanto acitotoxicidade in vitro contra linhagens de células cance-rígenas da próstata humana e células PSMA-3T3™. A Figura 3ilustra curvas de resposta de dose para células C4-2positivas para PSMA e células PC-3™ negativas para PSMA emum experimento representativo, e valores de IC50 para asvárias linhagens de célula são listados na Tabela 2. 0 ADCdo PSMA eliminou potencialmente todas as linhagens decélulas positivas para PSMA examinadas nos valores IC5o de65210 pM, considerando-se que essas concentrações não tiveremefeito nas células negativas para PSMA. Em contraste,concentrações aproximadamente 1.000 vezes maiores foramnecessárias para o ADC de controle, cuja atividade eraindependente da expressão de PSMA (Figura 3 e Tabela 2)Tabela 2: Resumo da citotoxicidade in vitro(valores de IC50 em pM)
<table>table see original document page 94</column></row><table>
* A seletividade se iguala à taxa de valores IC50 observados parae ADC de controle.
Eficácia do ADC do PSMA em um Modelo de Xeno-enxerto de Câncer de Próstata Independente de Androgênio
A eficácia in vivo do ADC do PSMA foi avaliada emum modelo de camundongo de câncer de próstata humano inde-pendente de androgênio. Camundongos nus foram enxertados comcélulas C4-2 intramuscularmente na pata esquerda traseira.Aproximadamente 14-17 dias mais tarde, os níveis de PSA nosoro foram medidos e usados para distribuir aleatoriamenteos animais aos grupos de tratamento. Os animais foram trata-dos intravenosamente com ADC do PSMA, e os animais forammonitorados quando a carga do tumor, níveis do PSA e outrosparâmetros por um período de 500 dias.
No primeiro experimento, os animais foram tratadosq4d χ 3 com 0, 2 ou 10 mg/kg de ADC do PSMA. Quando deixadossem tratamento, os tumores cresceram rapidamente e os animaistiveram uma sobrevivência média de 32 dias. Ao contrário, osgrupos tratados com 2 mg/kg e 10 mg/kg de ADC do PSMAtiveram sobrevidas médias de 58 dias (P = 0,0035) e 94,5dias (P = 0,0012), respectivamente (tabela 3, Figura 4A). 0tratamento do ADC do PSMA melhorou significativamente asobrevivência em até 4,5 vezes em um modo dependente dadose. Não houve evidência de toxicidade relacionada ao tra-tamento.
Os níveis de PSA do soro foram medidos com o tempopelo ELISA. A Figura 4B mostra a concentração do PSA médiaem cada grupo nos dias de estudo 17, 23 e 30. 0 tratamentocom 10 mg/kg reduziu os níveis de PSA > 10 vezes de 8,8 ±11,7 ng/mL no dia 17 para 0,7 ± 0,9 ng/mL no dia 30,considerando-se que os níveis de PSA no grupo de controleaumentaram > 60 vezes em relação ao mesmo período de tempo.Uma resposta intermediária foi observada em 2 mg/kg de ADCdo PSMA. As diferenças nos níveis de PSA no dia 30 foramsignificativas para ambos os grupos de dose de 2 mg/kg (P =0, 0048) e 10 mg/kg (P = 0, 0006). Três dos seis animais nogrupo de 10 mg/kg tiveram PSA não detectável no dia 52 doestudo.
Para estender essas averiguações, um segundo estudodo ADC do PSMA foi conduzido, também incluindo mAb não modi-ficado e ADC de controle de isotipo. Após a aleatorização odia 14 com um nível médio de PSA de 2,0 ± 1,1 ng/mL em cadagrupo (n = 5), os animais foram tratados com um regime deq4d χ 6. As curvas de sobrevivência Kaplan-Meier para cadagrupo são ilustradas na Figura 5. Os animais tratados comveículo de controle, 6 mg/kg de mAb do PSMA não modificado e6 mg/kg de ADC de controle tiveram tempos de sobrevivênciamédia semelhantes de 29, 31 e 31 dias, respectivamente; eessas diferentes não foram significativas. Contudo, asobrevivência média foi estendida para 49 dias e 148 diaspara animais tratados com 3 mg/kg e 6 mg/kg de ADC do PSMA,respectivamente (tabela 3) . 0 tratamento do grupo ADC doPSMA com 6 mg/kg aperfeiçoou a sobrevivência pós aleatoriza-ção em 7,9 vezes em relação ao grupo ADC de controle (P =0, 0018). No dia 500, 2 dos 5 animais não apresentaram evi-dência de tumor, nenhum PSA mensurável e foram consideradoscomo curados pelo tratamento. Como no primeiro o estudo, otratamento teve um impacto significativo nos níveis de PSAno dia 29 (P = 0, 0068 para 6 mg/kg de PSMA e gruposveiculo) . Além disso, no grupo de 6 mg/kg de ADC do PSMA, oPSA do soro diminuiu para níveis não detectáveis após otratamento e permaneceu não detectável até o dia 63 em 4 dos5 animais. Não houve toxicidade associada à terapia com ADC.
A aparência física e a atividade não foram afetadas pelotratamento e os pesos corpóreos dos animais tratados etratados com veículo de controle não foram significativa-mente diferentes em qualquer momento.
Tabela 3: Resumo dos tempos médios de sobrevivência deanimais portando tumor de C4-2 tratados com ADC do PSMA
<table>table see original document page 96</column></row><table>*Em comparação ao grupo de veículo de controle em uma análise declassificação logaritmica de dois lados. NA = não aplicável.
Exemplo 2: Avaliação de mAb do PSMA Conjugado aos TrêsLiqantes de Medicamento DiferentesFoi avaliado o mAb do PSMA quando conjuqado comvcMMAE e dois outros liqantes de medicamento, vcMMAf e mcMMAF.
As estruturas químicas plenas de três ligantes-medicamentodiferentes são ilustradas na Figura 6.
Preparação de Três Conjugados de Ligante deMedicamento do mAb do PSMA
Os três ligantes de medicamento foram diretamenteconjugados no mAb do PSMA através de uma ligação de tioéterpara preparar aproximadamente quatro medicamentos por conju-gados de anticorpo. A redução parcial dos dissulfetos daintercadeia de mAb prosseguiu com um leve excesso de tris(2-carboxietil) fosfina (TCEP) em pH 7,2 e 37°C e conjugaçãosubseqüente dos tióis livres com ligantes de medicamento foiquantitativa. Em resumo, o mAb de PSMA (10 mg, 67,5 nmol emPBS) foi incubado a 37 0C com 1 mM de DTPA e 169. nmol de TCEPpor 90 minutos. Em três pontos de tempo durante a incubação(30, 60 e 90 minutos), as alíquotas de 50 μg de mAb foramremovidas e reagidas com um excesso de vcMMAE. A análise dosADCs resultantes por cromatografia de interação hidrófobapermitiu que o progresso da redução prosseguisse. Os resul-tados indicaram que o mAb foi rapidamente reduzido sob ascondições acima, estando essencialmente completo após 1hora. Adicionalmente, a extensão da redução resultou em umacarga de medicamento média de 5 medicamentos/mAb.Para preparar um ACD de 4 cargas com ligantes demedicamento do mAb parcialmente reduzido acima, 0,5 equiva-lentes de DTNB foram adicionados para reoxidar a populaçãode mAb a um nivel desejado. Então, 3 mg desse material (20,3nmol) foram reagidos com 101 nmol de vcMMAE, vcMMAF oumcMMAF em uma solução de reação de sulfóxido de dimetila(DMSO) a 15%. Essa reação prosseguiu por 1 hora a 0°C e foientão saturada com um excesso de 20 vezes N-acetil cisteina.Os ADCs foram separados por medicamento não reagido e outrasimpurezas de molécula pequena por cromatografia de exclusãode tamanho (SEC) em uma coluna PD-10 (Amersham Biosciences/GE Healthcare, Piscataway, NJ) e concentrados com umdispositivo de concentração centrifuga (30 kD MWCO) (AmiconBioseparations, Millipore Corporation, Bedford, MA).
Um resumo da caracterização dos três conjugados deligante de medicamento é fornecido nas Tabelas 4-6 paravcMMAE, vcMMAF e mcMMAF, respectivamente. Para cada um dostrês ligantes de medicamento, ADC contém aproximadamente 4medicamentos por mAb, conforme determinado por distribuiçãode carga de cadeia H/L e distribuição de espécies e < 2% demedicamento livre, conforme determinado por uso de HPLC defase inversa (RP). Não foram detectados agregados utilizandoSEC-HPLC para todos os conjugados. Além disso, osrendimentos de mAb total foram de 70-80%.Tabela 4: Certificado de teste 699028A de Redução Parcial do
Conjugado de mAb do PSMA vcMMAE
<table>table see original document page 99</column></row><table>
Tabela 5: Certificado de teste 699028B de Redução Parcial doConjugado de mAb do PSMA vcMMAF
<table>table see original document page 99</column></row><table>Tabela 6: Certificado de teste 699028C de Redução Parcial doConjugado de mAb do PSMA mcMMAF
<table>table see original document page 100</column></row><table>
Potência e Seletividade dos Conjugados de mAb doPSMA em Células de Câncer de Próstata Humano
Estudos de citotoxicidade in vitro foram conduzi-dos com linhagens de células PSMA positivas e PSMA negati-vas. Em resumo, as células PSMA positivo (C4-2, LINCaP™ ouPSMA-3T3™) e células PSMA negativo (PC-3™ ou 3T3™) foramadicionadas às microplacas de 96 poços a 2,5 χ 10células/poço e incubadas por toda a noite a 37 0C e 5% CO2.As células foram então incubadas com ADCs diluídos em sériepor 4 dias e analisadas quanto a porcentagem de extermíniode células em comparação aos controles não tratados usandoAlamar Blue a 10%. A concentração de ADCs necessária para50% de extermínio de células (valor IC50) foi determinada.A Figura 7 ilustra curvas de resposta de dose deconjugados de vcMMAE (Figura 7A), vcMMAF (Figura 7B) emcMMAF (Figura 7C) para células C4-2 PSMA positivo e célulasPQ - 3™ PSMA negativo em um experimento representativo. Umresumo da potência (IC50) e seletividade nas linhagens decélulas C4-2 e PC-3™ é listado na Tabela 7. Os IC50S nascélulas C4-2 expressando PSMA estavam nas concentraçõespicomolares de 11, 42 e 60 para os conjugados vcMMAF, mcMMAFe vcMMAE respectivamente. Em contraste, os IC50S nas célulasPC-3™ PSMA negativo eram superiores a 90 nM variando de 94 a264 nM. Com base na potência de cada conjugado em P C-3™ eC4-2, uma seletividade foi calculada como sendo de 13.636;6.28 6 e 1.567 para os conjugados vcMMAF, mcMMAF e vcMMAErespectivamente. O conjugado vcMMAF era o mais potente nalinhagem de célula C4-2 PSMA positivo e o mcMMAF foi o menostóxico na linhagem de célula de controle PC-3™. Emcomparação ao conjugado de vcMMAE, houve um aperfeiçoamentode 4 vezes e 9 vezes na seletividade dos conjugados mcMMAF evcMMAF respectivamente.
Tabela 7: Resumo da potência in vitro (Valores de IC50 empM) e seletividade
<table>table see original document page 101</column></row><table>Mecanismo de Extermínio de Célula por Conjugado deMedicamento mAb do PSMA
Análise do ciclo celular foi realizada para deter-minar o mecanismo de citotoxicidade mediado por mAb conju-gado com MMAE. Células PSMA-3T3™ ou C4-2 foram cultivadas napresença de 0,2 nM ADC do PSMA ou 20 nM mAb do PSMA nãomodificado. As células não tratadas serviram como umacultura de controle. Em 12, 24 e 48 horas as células foramcoloridas com iodeto de propidio (PI) para detectar DNAtotal e analisadas por citometria de fluxo. Conformeindicado na Figura 8, as células tratadas com ADC do PSMAforam interrompidas na fase G2. Em 48 horas de tratamento, aporcentagem das células com um conjunto duplicata de cromossomas foi > 50% para as culturas ADC do PSMA e 2% paraculturas não tratadas. A interrupção do ciclo celularrequereu a presença da toxina, nesse caso MMAE, como apenas3% das células tratadas com mAb não modificado estavam nafase G2/M em 48 horas. Os dados demonstram que o tratamentodas células de câncer de próstata com ADCs de MMAE levou aima interrupção G2/M e então apoptose das células alvo.
Cada patente, pedido de patente e referênciasanteriores que foram citados nesse pedido são incorporadosaqui em sua totalidade, como referência. A recitação dereferências não é uma admissão de que qualquer uma dasreferências seja uma referência da técnica anterior. Tendodescrito as modalidades presentemente preferidas e de acordocom a presente invenção, acredita-se que outras modifica-ções, variações e alterações serão sugeridas aos versados natécnica, em vista dos ensinamentos estabelecidos aqui.Portanto, deve ser entendido que tais variações, modifi-cações e alterações estejam dentro do escopo da presenteinvenção, conforme definido pelas reivindicações apensas.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<ue> PSI® DSVEIIO?MENI? OOM?ANYr L,E,,C,
MA, DanfSftôMADDQNf Faal tf.OIjSON, WiIliaa C-DORONINÃ, SvetlanaΤΟΚΕ, BrianSSNTEfí, f^tek
<120> CONJUGADOS DK ANTICORPO-HKDICAHENTO DH PSHA·<130>· PD7 4 Ii 70 QQ B ROQ Q
<150> US 60/792,360<l5l> 14/04/2006
<150> OS 60/692,3^9<151> 20/06/2005
<1S0> 33
<17D>* PatenIn- versão 3.1
<2ΐα> ι
<211> 750
<212> PftT
<213> Ηαπιο ■ aapieag
<4og> ι
Hefc ΐκρ ftsn Leu teu Mis Glu Thr Asp Ser Ala Vai Ala Thr Ala Arg1 5 10 15
Arg Pro Arg - Trp teu Cya Ala Gly Ala Leu Val Leu Ala Gly Gly Phe20 35 30
Pbd Lôü Leu Gly Phe Lea Phe Gly Trp Phe Ile Lya Ser Ser i\sn SÀtí35 40 45
Ale fhx Asn Iie Thr Pro LyS Hia Asn Mot Lys Ala Phe Leu Agp filia50 SS SpLeu Lys Ala Glu Aan Ile Lys Lys Phe Lau Tyr Aan Phe Thr Gln Ils65 70 75 80
Pro Hia Leu Ala Gly Thr Glu. Gln Ash Phe.Gln Leu Ala Lya GIn Ile85 90 95
Gln Ser Gln Trp Lya Glu Phe Gly Leu Asp Ser Val Glu Leu Ala His10Ó 105 110
Tyr Asp Val Leu Leu Ser Tyr Pro Asn Lys Thr His Pro Asn Tyr- Ile115 120 125
Ser- Iie lie. Ash Glu Aso Gly Asn Glu Ile Phe Asn Thr Ser Leu, Phet"130 " 135 140
Glu Pro Pro Pro Pro Gly Tyr Glu Asn Val Ser Aap Ila Val Pro Pro145 150, 155 160
Phe SeT Alâ Phe Ser Pro Gln GIy Met Frq GIu Gly Asp Leu Val Tyr155 170 175
Val Asrn Tye Ala Arg Thr Glu Asp Phe Phe Lys Leu Glu Arg Asp Met180 185 190
Lys Ile Asn Cys Ser Gly LyS Ilef Val lie Ala Arg fyr Gly Lys Val195 200 205
Phe Arg Gly Asn Lys Val Lys Asn Alá Gln Leu Ala Gly Ala Lys Gly2IQ 215 220
Val Ile Leu Tyr Ser Asp Pro Ala Asp Tyr Phe Ala Pro Gly Val Lys225 230: 235 240
Ser Tyr Pro Asp Gly Trp Asn Leu Pro Gly Gly Gly Val Gln Arg Gly245 ■250 255
Asn Ile Leu Asn Leu Asn Gly Ala Gly Asp Pro Leu Thr Pro Gly Tyr260 265- 270
Pro Ala Asn Glu Tyr Ala Tyr Arg Arg Gly Ilô Ala Glu AIa Val Gly275 260 285
Leu Peo Ser Ile Pro Val His Pro Ile Gly Tyr Tyr Asp Ala Gln Lys290 295 300Leu Lea Glu Lys Met Gly Gly Ser Ala Pro Pro Asp Ser Ser Trp Axg305 310 315 320
Gly Ser Leu Lys Val Pro Tyr Asn Val Gly Pro Gly Phe Thr Gly Aan325 330 335
Phe Ser Thr Gln X?ys Val Lys Met His Ile His Ser Thr Asn Glu Val340 345 350-
Thr Arg Ile Tyr Asn vai Ile Gly Thr Leu Arg Gly Ala Val Glvs Pró355 ' 360 365
Asp Arg Tyr Val Ile Leu Qly Gly His Arg Asp Ser Trp Val Phe Gly37 0 375: 380
Gly II© Asp. Pro Gln Ser Gly Ala Ala Val Val His Glu Ile Val Arg335 390 395 40Q
Ser Phe Gly Thr Leu Lys Lys Glu Gly Trp Arg Pro Arg Arg Thr Ile405 410 415
Leu Pha Al^ Ser Trp Asp Ala-Glu Glu Pha Gly Leu Leu Gly Ser Thr420 425 430
tplu Trp Ala Glu Glu Asn Ser Arg Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Ala435 440 445
Tyr Ile Asn Ala Asp Ser Ser Ila 'Glu- Gly Asn Tyr Thr Leu Arg Val450 455 460
Asp Cys Thr Pro Leu Met Tyr Ser-Ley Val His Asn Leu Thr Lys Glu455 470 <«75 460
Leu Lys Ser Pro Asp Glu Gly Phe Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Glu Ser485 4SO 495
Trp Thr Lys Lys Ser Pro Ser Pro Glu Phe Ser Gly Met Pro Arg lie500 505 510
Ser Lys Leu Gly Ser Gly Asn Asp Phe Glu Val Pha Phe Gln Arg Leu515 520 525
Gly Ile Ala Ser Gly Arg Ala Arg Tyr Thr Lys Asn Trp Glu Thi Asn530 535 540
Lys Phe Ser Gly Tyr Pro Leu Tyr His Ser Val Tyr Glu Thr Tyr Glu545 550 555 560
Leu Val Glu Lys Phe Tyr Asp Pro Met Phe Lys Tyr His Leu Thr Val565 570 575
Ala Gln Val Arg Gly Gly Met Val Phe Glu Leu Ala Asn Ser Ile Val580 585 590
Leu Pro Phe Asp Cys Arg Asp Tyr Ala. Val Val Leu Arg- Ly3 Tyr Ala595 600 605
Asp Lys Ile Tyr Ser Ile Ser Met Lys His Pro Gln Glu MefLys Thr
610 615 620
Tvr Ser Val Ser Phe Asp Ser Leu Phe Ser Ala Val Lys Asn Phe Thr
625 630 635 640
Glu Ils Ala Ser Lys Phe Ser Glu Arg Leu Gln Asp- Phe Asp Lya Ser645 650 655
Asn Prò Ile Val Leü Arg Met Met Asn Aap Gln Leu Met Phe Leu Glu660 665 6.70.
Arg Ala Phé Tle Asp Pro Leu Gly Leu Pro Asp Arg Pro Phe Tyr Arg
67 5 680
His VaI Ile Tyr Ala Pro Ser Ser His Asn Lys fyr Ala Gly Glu Ser690 695 700
Phe Pro Gly Ile Tyr Asp Ala Leu Phe Asp Ile Glu Ser Lys Val Asp705 710 715 720
Pro Ser Lys Ala Trp Gly Glu Val Lys Arg Gln Ile Tyr Val Ala Ala725 730 735
Phe Thr Val Gln Ala Ala Ala Glu Thr Leu Ser Glu Val Ala740 745 750
<210> 2
<211> 7570
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220><223> Plasmídeo<400> 2
gacggatcgg gagafcctcçc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ecgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggâggtcgct gagtagtgcg 120
cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatetgc XSO
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc csgatatacg cgttgacatt 24Ò
gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtç attagttcat agcccatata 300
tggãgttecg cgttacataa ettácggtaá atggcccgcc tggctgaecg cccaaegacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactfctcc 420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
átcafcafcgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taáatggccc gcctggcatt 540
âtgeccagta catgacctta tgggactttc ctactfcggca gtacatctaç gtattagtca 600
tegetattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
ãctcacgggg atttccaagt ctecaeccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta, acaactccgç ccea.ttgacg caaâtgggcg 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa: gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840
ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctaga 900-
ggtaccaagc ttggatetea ccstggagtt gggactgcgc tggggcttcc tcgttgctct 9-60
tttaagaggt gtccagfcgtc aggtgcaatt ggtggagtct gggggaggcg tggtccagcc 1020
tgggaggtcc ctgagaotct cctgtgcagc gtctggattc gccttçagta gatatggcafc 1080
gcactgggtc cgccaggctc caggcaaggg gctçgaçtgg gtggcagtta tatggtatça 1140
tggaagtaat aaatactatg cagáctccgt gaagggccçja ttcaccatet ccagagacaa lá00
ttccaagaac acgcagtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggctgtgta 1260
ttactgtgcg- agaggcggtg acttcctçtá ctactactat tacggtatgg acgtctgggg 1320
ccasgggacc acggtçacçg tctcçtçagü ctceaccaag ggeccatcgg tcttccccct 1380
ggcaccctct agcaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctçcc tggtcaaggs 1440
ctácttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgfegca 1500
caccticccg gctgtcctae agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg fcggtgaccgfc 1560
gçcGtccagc agcttgggca cecagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa 1620
caccaaggtg gacãagagãg ttggtgagag gccagcacag ggagggaggg tgtctgctgg 1680
aagccaggct cagcgctcct gcctggacgc atcccggcta tgcagtccca gtccagggca 1740gcaaggcagg ccccgtctgc ctcttcacccgggagagggt cttctggctt tttccccaggacccaggccc tgcacacaaa ggggcaggtggggaggaccc tgcccctgac ctaageccactcggacacct tctcicctcc cagattccagaatcttgtga caaasctcac acatgcccaccctccagctc aaggcgggac aggtgccctaccgggtgctg acacgtccaç ctccatçtcttcagtcttcc fccttcccccc aaaaeccaaggtçacatgcg tggtggtgga cgtgagccacgtggacggcg tggaggtgca taatgccaagacgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtctacaagtgca aggtctceaa caaagccctcgçcaaaggtg ggacòcgtgg ggfcgcgagggctcfcgccctg a.gagtgaccg ctgtaçcaacacaggtgtac accctgcccc catccegggactgcctggtc aaaggcttct atcccagcgagccggagaac aactacaaga ccacgccfcccctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcagcgtgatgcat, gaggctctgc acaaccactataaatgagaa ttectegagfc etagagggeegccttctagt tgccagccat ctgfctgtttgaggtgecãct cccaetgtcc tttcctaatataggtgtcat tctattctgg ggggtggggtag^caatagc aggcatgctg gggatgçggtcagctggggc tctagggggt atccccacgctgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctaccgctttcttc cçttcctttc tcgccacgttgggcatccct ttagggttcc gatttagtgcttagggtgat ggttcaçgta gtgggccatcgttggagtcc acgttcttta atagtggact
ggaggcctct gcccgcccca ctcatgctca 1800
ctctgggcag gcacaggcta ggtgccccta; 1860
ctgggctcag acctgccaag agccatatcc 1920
cccaaaggcc aaactctcca ctccctcagc 1980
taactcccaa tcttctctct gcagagccca 2040
cgtgcccagg taagccagcc caggcctcgç 2100
gagtagcctg catccaggga caggccccag 2160
tcctcagcac ctgaactcct ggggggaccg 2220
gacaccctca tgatotcçcg gacccctgag 2280
gaagaccctg aggtcaagtt eaactggtac 2340
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 2400
ctgcaceagg actggcfcgaa tggeaaggag 2460
ccagccccca tcgagaaaac catcfcccaaa 2520
ccacatggãc agaggccggc tcggcccace 2580
otçtgtocct acagggcaga cccgagaacc 2640
ggagatgacc aagaaccagg teagcctgac 2700
catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca 2760
cgtgctggac tccgacggct ccttcfctcct 2820
gtggcagce.g gggaacgtct tctcafcgctc 2880
cacgcagaag agcctcfcccc tgtctccggg 2940
Cgtttaaaee cgetgafccag cctegaetgt 3000
cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga 3050
aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag 3120
ggggcaggac agcaaggggg aggattggga 3180
gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac 3240
gccctgtagc ggcgcatfcaa gcgcggcggg 3300
acttgccagc gccctagcgc ccgctccttfc 3360
cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg 3420
tttacggcac ctcgaeccca áaaaacttga 3480
gccctgatag acggtttttc gccctttgac 3540
cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc 3600tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgggg atttcggcet attggttaaa 3660
aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattaattc tgfcggaatgt gtgtcagtta 3720
gggtgtggaa agtceccagg ctccccaggc aggcagaagt atgcaaagca tgcafcctcaa 3780
ttagtcagca accaggtgtg gaaagtcccc aggctcccca gcaggcagaa gtatgcaaag 3840
catgcatctc aattagtcãg caaccatagt cccgccccta actccgccca tcccgcccct 3900
aactccgbcc agttccgccc ettctccgcc ccatggctga ctaatttttt ttatttatgc 3960
agaggecgag gccgcctctg cctctgagct attccagaag tagtgaggag gcttttttgg 4020
aggcctaggc ttttgcaaaa agctcccggg agcttgtata tccattttcg gatctgatca 4080
geacgtgatg aaaaagcctg aactcaccge gacgtctgtc gagaagtttc tgatcgaaaa 4140
gttcgaeagc gtctecgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag 4200
cttcgatgta ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agcfcgcgecg atggtttcta 4260
caaagatcgt tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgãttc cggaagtgct 4320
tgacaitggg gaattcagcg agagcctgae çtattgcatc tcccgccgtg cacagggtgt 4380
cacgttgoaa gãcctgcctg aaaecgaact gcccgctgtt ctgcagccçg tcgcggaggc 4440
eatggatgog ategctgcgg ccgatcttag ecagacgagc gggttcggcc cattcggacc 4500
gcaaggaatc ggtcaataca ctacatggeg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca 4560
tgtgtãtcac tggcaaaçtg' tgatggacga caccgtcagt gcgtécgtcg cgcaggctct 4620
cgatgagctg atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggçacçtcg tgcâcgcgga 4680
tttcggctcc aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca ttgactggag 4740
cgaggcgatg ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac átcttcttct ggaggccgtg 4300
gttggcttgt atggagcagc agacgcgcta cttcgagcgg aggeatccgg agcfctgeagg 4860
ateçccgcgg ctccgggcgt atatgctceg cattggtctt gaccaactct atcagagctt 4 920
ggttgacggc aatttcgatg atgcagcttg ggegcagggt cgatgcgacg caatcgtccg 4 980
atccggagcc gggactgtcg ggcgtacaca aatcgcccgc agaagcgcgg ccgtctggac 5040
cgatggctgt gtagaagtac tcgccgatag tggaaaccga cgccccagca ctcgtccgag 5X00
ggcaaaggaa tagcacgtgc tacgagattt cgattccacc gccgccttct atgaaaggtt 5160
gggcttcgga atcgttttcc gggacgcegg ctggatgatc etccagcgcg gggatctcat 5220
gctggagttc ttcgcccacc ccaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag 5280
caatagcatc acaaatttca caaataaagc attttttfcca ctgcattcta gttgtggttt 5340gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctgtataccg tcgacctcta gctagagctt
5400ggcgtaâtca tggtcatagc tgttteotgt gtgaaafctgt tatccgctca caatteeaea 5460
caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 5520
cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt çgtgccagct 55Θ0
gcattaatga atcggccaac gcgcggggãg aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 5640
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcsgctca 5700
Ctcasaggcg gtaafcacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacátgtg 5760
agcaaaaggc cagcaaaaggr ccaggaaccg taaaaaggcc gegtfcgctgg cgtttttcca 5820taggctccgc ccccctgacg agcatcaçaa aaatcgacgc tcaagteaga ggtggegaaacccgacagga çtataaagat accaggcgtt, tccccctgga agctccctcg tgegctctccfcgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttegg gaagcgtggcgctttctcaa tgctcacgct gtaçgtatct cagttcggtg taggtcgttç gctccaagct
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 6120
tcttgagtcç aacccggtaa gacacgactt atcgeeacfcg gcagcagcca ctggtaacag 6180
gattageaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 6240
cggctâcaet agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 6300
aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 6360
tgtttgcaag çagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 6420
ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcátgag 6480
attateaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaafe 6540Ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacctatctcágcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagataactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgcí: gcaatgatac cgcgagacccacgctcaeeg gctccagsatt tatcagcaat' aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcagaagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc. gggaagctag
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgçta çaggcatcgt 6900.
ggtgtcácgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 6960
agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcgg.tc ctccgatcgt 7020
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggfet atggcagcac tgcataattc 7080
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtaet caaccaagtc 7140
attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 7200
taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaaegtt cttcggggcg 7260
66006660672067806340aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgeaec 7320
caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 7360
gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactett 7440
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tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagfcgec 7560
acctgacgtc 7570
<210> 3<211> 7597<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Plasmídeo<400> 3
çacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60
ccgcatagtt aagecagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcçct gagtagtgcg 120
çgagcaaaat ttaagctaca aeaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180
ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240
gattattgac.tagttatiaa fcagtaatcaa ttacggggtc attagttcat ageccatata 300
tggagttccg cgttacataa cttaeggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgfcatg ttcccatagt aacgccaata gggactttec 420
attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480
atcatatgcc aagtacgccc ectattgaeg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 54 0
atgcccagta catgacctfca tgggaotttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600
tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacâtcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660
aotcacgggg atttccaagt etecacccca ttgacgtcaa tgggagtfctg ttttçgcaçc 720
aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc eccattgaçg caaatgggog 780
gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca B40ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggetagaçgtaccaagc ttggatctca ccatggggtc aaeegeeatc ctcaccátgg agttggggct
gcgctgggtt ctectcgttg ctcttttaag aggtgtccag tgtcaggtgc agctggtgga 1020
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tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcafcc aatgtatctt atcatgtctg 5400
■bataccgtcg acctctagct agagcttggc gtaatcatgrg tcatagctgt ttcetgtgtg 546Ó
aaattgttat ccgctcacaa ttecacacaa eataegagcc ggaagcataa agtgtaaagc 5520
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<210> 4<21I> 757 9<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Plasroídeo<400> 4
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7579<210> 5<211> 7558<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<22Q>
<223> Plasmídeo<400> 5
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ggtcgaetct cagtacaate tgctctgatg 60ettgtgtgtt ggaggtcgefc gagtagtgcg 120gettgacCga caattgcatg aagaatctgc 180atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240ttacggggtc attagttcat ageccatata 300atggccegcc tggctgaccg cccaacgaec 360ttcccatagt aacgccaata gggaetttcc 420aaactgccca Gttggcagta catcaagtgt 480tcaatgacgg taaatggeec gcctggcatt 546ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600agtacatcaa tgggçgtgga tagcggtttg 660ttgacgfccaa tgggagtttg ttttggeace 720acaactccgc cccattgacg caaátgggcg 780gcagagcfcct ctggctaact agagaaccca 840ctcactatag ggagacccaa gctggctaga 900aaccgtcatc ctcgccctce tcctggctgt 960ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc 1020itefcggatac agctttacca gttactggat 1080cctggagtgg âtggggatca tctstcctgg 1140ccaaggccag gtcaccatcfc cagccgacaa 1200cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta 1260ccectttgac tactggggcc agggaaccct 1320cccatcggtc ttccccctgg caccctctag 1380gggctgcctg gtcaaggact acttccccga 1440accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgctgtcctacag tcctcaggãc fcctactccctcttgggcacc cagacctaca tctgcaacgtcaagagaçtt ggtgagagge cageaeaggggcgctcctgc ctggacgcat cccggctatgccgtctgect cttcacccgg aggectctgctctggctttt tccccaggct ctgggcaggccacacaaagg ggcaggtgct gggctcagaccccctgacct aagcccaccc caaaggccaatctcctcooa gattccagta actccçaatcaaactcacác atgcceaecg tgcccaggtaggcgggacag gtgccctaga gtagcctgcaacgtecacct ccatctcttc ctcagcacctttccccccaa aacccaagga cãccctcatggtggtggacg tgagccacga agaccctgaggaggtgcata ãtgccaagac aaagccgcgggtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggacgtctccaaca aagccctccc agcccccatcâcccgtgggg tgcgagggcc aeatggacagagtgaccgct gtaccaacct ctgtccctaccctgccccca teccgggagg agatgaccaaaggcttctat cccagcgaca tcgccgtggactacaagacc acgcctcceg fcgctggactccaccgtggac aagagcaggfc ggeagcagggggctctgcac aaccactaca cgcagaagagCQtcgagtct agagggcccg tttaaacccgccagceatct gttgtttgcc cctcccccgtcacfcgtcctt tcctaataaa atgaggaaattattctgggg ggtggggtgg ggcaggacaggcatgctggg gatgcggtgg gctcrtatggc
cctgaccagc çgcgtgcaca ccttcccggc 1500çagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag 1560gaatcacaag cecagcaaca ccaaggtgga 1620agggagggtg fccfegctggaa gccaggctca 1680cagtcccagt ccagggcagc aaggcaggcc 1740ccgccccact catgctcagg gagagggtct 1000acaggctagg tgeccctaac çcaggccctg 1860ctgccaagag ccatatccgg gaggaccctg 1920actctccact ccctcagctc ggacaccttc 1980ttctctetgc agagçccaaa tcttgtgaca 2040agccagccça ggeçfccgcec tccagctcaa 2100tccagggaca ggeceeagee gggtgctgac 2160gaactcctgg ggggacegtc agtcttcctc 222,0atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 2260gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 2340gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 2400tggctgaatg gcaaggagta eaagtgcaag 2460gagaaaacca tctccaaagc caaaggtggg 2520aggccggctc ggcccaccct ctgccctgag 2580agggcagecc cgagaaccac aggtgtaeac 2640gaaccaggtc agectgácct gcctggtcaa 2700gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 2760cgaeggctcc fc.tcttcctct atagcaagct 2820gaacgtettc tcatgotccg fcgatgcatga 2880cctctccctg tctccgggta aatgagaatt 2940ctgatcagee tcgactgtgc cttctagttg 3000gccttccttg âccctggaag gtgccactcc 3060tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc 3120caagggggag gattgggaag acaatagcag 3180ttctgaggcg gaaagaacca gctggggctc 3240tagggggtat ccccacgcgc cctgtagcgg cgcattaage gcggcgggtg tggtggttac 3300
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ttaecaaaaa. tttaacgcga attaattctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag 3720
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«S00> 6 . . ..
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tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 6420
gatcttttet acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaác tcacgttaag ggattttggt 6480
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 6540
atcaatetaa agtatatatg agtaaacttg gtcfegacagt taccsatgot taatcagtga 6600
ggcacctatc tcagcgatct gfcctatttcg ttcatgcata gttgcctgac tccccgtcgt 6660
gtagataact acgatacggg agggcttacc atcíggcccc agtgctgcaa tgataccgcg 6720
agacccacgc teaccggctc cagatttatc ágcaataaac cagccagceg gaagggcega 6780
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 6840
agctagãgta agtagttcgc eagttaatag tttgegcaae gttgttgcca ttgctacagg 6900
catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggfcat ggcUcattc ãgcfeceggtt cccaacgatc 6960
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gatcgttgté agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgCã 7080
taattctctt actgtcatgc eatccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 7140
caagtcattc igagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tettgeecgg cgfccaataog 7200
ggataatacc gcgccacata gcagaabttt aaaagtgctc atcattggaa a.acgttcttc 7260
ggggcg&aaa ctctcaagga tcttaccgct gttgaga.tcc agttcgatgt aacccaoteg 7320
tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagg gtttctgggt gagcaaaaac 73Θ0
aggaaggeaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgsca cggaaatgtt gaatacteat 7440
aotcttcctt tttcaatatt attgaageat ttatcagggt tattgtctca tgagcggatá 7500
catatttgaa tgtatttagà aaaataaaca aatággggfct ccgógcacat ttccccgaaa 7560
7576
agtgccacct gacgtc
<210> 7<211> 7561<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Plasmídeo
<400> 7 , . sn
gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg ουccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120
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gattattgac tagtfcattaa tagtaatcââ ttacggggtc attagtteat âgceeatata 300
tggagttçeg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360
cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420
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actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 72.0
aaaatcáacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780
gfeaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gqagagctct ctggctaact agagaaccca 840
çtgcttactg gcfctatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa getggctaga 900
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gtccctgaga ctctcctgtg eagcgtctgg attcaccttc agtaccfcatg gcatgcactg 10ÓÕ
ggtccgccag gctccaggca aqgggctgga gtgggtggca gttacatggc atgatggaag 1140
^aataaatac tatgcagact ccgtgaaggg ccgatteacc atctccagag acaáctcçaa 1200
f
gaacacgctg tatctgcaaa tgaaca.gcct gagagccgag gacacggctg tgtattactg 1260
tgcgagagga ggagtgggag câacttacta ctactactac ggtatggacg tctggggcGa 1320
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aggaecctgc ccctgaccta agcccacccc aaaggccaaa ctctccactc cctcagctcg 1980gacacctfcct ctccteccag attccagtaa ctcccaatct tctctctgca gágcccaaatcttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag gcctcgccct
ccagctcaag gcgggacagg tgccetagag tagcctgcat ccagggacag gccccagccg 21SO
ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcacetg aactcctggg gçgaccgtca 2220
gfccfctcctct tcececcaaa acccaãg<jac acdctcatga tctcccggac ccctgaggtc 2280
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tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc tgtccctaca gggcagcccc gagaaccaca 2640
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ttgceagcca fcctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccqtgg aaggtgccac 3060
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29403000
34203480aagtecccag gctccecagg caggcegaagaaccaggtgt ggaaagtccc caggetcccccaattagtca gcaaccatag tcccgcccctcaattocgcc cafctctcegc cccatggctgggccgcctct gcctotgagc tattccagaacttttgcaaa aagctcccgg gaçcttgtatgaaaaagect gaaetcaccg cgacgtctgtcgtctccgac çtgatgeage tetcggagggaggsgggcgfc ggatatgtcc tgcgggtaaattatgtttat çggcacttfcg catcggccgcggaattcagc gagagcctga cctáttgcatagacctgcct gaaaccgaac tgcccgctgtgatcgotgcg geega.tctta gccagacgagcggtcaatac actacatggc gtgatttcatctggcaaact gfcgatggacg ocaccgtcaggatgctttgg gcegaggact gccccgaagtcaaeaatgtc ctgãcggaca atggccgcatgttcggggat tcccaatacg aggtcgccaatatggagcag cagacgcgct acttcgagcggctccgggcg tatatgctcc gcattggtctcaatfctcgat gatgcagott gçgcgcaggg.egggactgtc gggcgtacac aaatcgcccgtgtagaagta ctcgccgata gtggaaaccgatagcacgtg ctacgagatfc tcgattccacaatcgttttc cgggacgccg gctggatgatcttcgcceac cecaacttgfc fctattgeagccaçaaatttc acaaataaag catttttttccatcaatgta tcttatcatg tctgtataccatggtcatag ctgtttcctg tgtgãaattgagccggaagc ataaagtgta aagcctgggg
tatgcaaagc atgcatctca attagtcage 3780agcaggcaga agtatgcaaa gcatgcatct 3840aactccgccc atcccgcccc taactccgcc 3900actaatttfct tttatttatg cagaggecga 3960gtagtgagga ggcttttttg gaggcetagg 4020atecatttte ggatctgate agcacgtgat 4080cgagaagttt ctgatcgaaa agttcgacag 4140cgaagaatct cgtgctttca gcttcgatgt 4200tagctgegCG gatggtttct acaaagatcg 4260getcccgatt ccggaagtgc tfcgacattgg 4320ctcecgcegt geacagggtg tcacgttgca 4380tctgcágccg gtcgeggagg ccatggatgc 444Ôcgggttcggc ceattcggac egeaaggaat 4500atgcgcgatt gctgatcccc atgtgtatca 4560tgcgfcccgtc gcgeaggctc tcgatgogct 4620çcggcacctc gtgcacgcçg atttcggctc 4680aacagcggte attgaetgça gcgaggcgat 4140.eatcttctte tggaggccgt ggttggottg 4800gaggcatccg gagcttgcag gatcgccgcg 4860tgacc&actc tafccag.agct tggttgacgg 4920tcgatgcgac gcaatcgtcc gatccggagc 4 980cagaagcgcg gccgtetgga ccgatggctg 5040acgccccagc actcgtccga gggcaaagga 5100cgccgcctto tatgaaaggt tgggcttcgg 5160cctecagcgc ggggatctca. tgctggagtt 5220ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat 5280actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 5340gtcgacctct agctagagct tggegtaatc 5400ttatccgctc açaattccãc acaãcataeg 5460tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 5520tgcgttgegc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 5580
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7561
<210> 8<21i> 6082<212>· DNA
<213> Seqüência Artificiai<220>
<22 3> Plasrnídeo<4 00> .3
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<213> Seqüência Artificial<220>
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<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Plasroídeo<400> 13
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cãacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg gggatttcgg. 234Q
cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttàa ògcgaattaa ttctgtggaa 2400
tgtgtgtcag ttagggtgtg gaaagtcccc aggctcccea ggcaggcaga agtatgcaaa 2460
gcatgcatct caattagtca gcaaecaggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca 2520
gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccaí agtcccgccc Gtaactccgc 2580
ccatcccgcc cctaactcçg eceagttccg cccattctcc gccccatggc tgactaattt 2640
tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct ctgeetetga gctattccag aagtagtgag 2700
gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctccc gggagcttgt atatccattt 2760
tcggatctgâ teaagagaca ggatgaggat agtttcgcat gattgaacaa gatggattgc 2820
acgcaggttc tccggccgct tgggtggaga ggçtattcgg etatgactgg gcacaacaga 2880
caatcggctg ctctgafcgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt 2940
ttgtcaagac cgacctgtce ggtgccctga stgaactgca ggacgaggca gcgcggctat 3000
cgtggctggc cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cçacgttgtc actgaagcgg 3060
gaagggactg gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tetcctgteã tctcaccttg 3120
ctcctgccga gaaagtatec atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgettgatc 3180
cggctacctg cccattcgae caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga 3240tggaagccgg tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaça gcatcagggg ctegcgccag 3300.
ccgaactgtt cgccaggctc aaggcgcgca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc 3360
atggçgatgc ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgctfettct ggattcatcg 3420
acfcgfcggccg gctgggtgtq gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acecgtgata 3480
ttgctgaaga gcttggcgac gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg 3540
ctcccgattc gcâgcgcatc gcettcfcatc gccttcttga cgagttcfcfcc tgagcgggac 3600
tctggggttc gaaatgaccg accaagcgac geccaâcctg ccatcacgag atttcgattc 3660
caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggcfcfc cggaatcgfct ttccgggacg ccggctggat 3720
gatcçtccag cgcggggatc tcatgctgga gttettcgee caccccaact tgtttatfcgc 3780
agcttataat ggttacaaat aaagcaatág catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 3840
ttcactgcat tcfcagttgfcg gtfctgtcçaa, actcatcaat .gtàtcttatc atgtetgtat 3900
accgtegace tctagctaga gcfcíggcgta atcatggtca tagçtgtttç ctgtgtgaaa 3960
ttgttatccg GtGacaattc cacacaacat acga.gccgga agcataaagt gtaaagcctg- 4020
gggtgcctaa tgagtgagct aáctcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcea 4080
gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg 4140
tttgegtstt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 4200
gctgcggcga gcggtatcsg ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 4260
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccageaa■aaggccagga accgtaaaaa 4320
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 438Õ
acgctcaagt cagaggtggc gaaacqcgac aggactataa agataceagg cgtttccccc 4440
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc 4500
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc 4560.
ggtgtaggtc- gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa cccccçgttc agcccgaccg 4620
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gfcccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 4680
actggeagca gecactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctecaga 4740
gttcttgsag tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatetgegc 4800
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacsaac 4860
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 4920
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggfcctgac gctcagtgga acgaasactc 4980
acçttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 504 0ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatátgag taaacttggt ctgacagtta 5100
ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt cafcceafcagt 5160
tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gataeggçag ggcttaccat ctggccccag 5220
tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatfctateag caataaacca 5280
gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatceagtc 5340
tattaattgt tgccgggaatg ctagagtaag fcagttegcca gttaatagtt tgcgcaacgt 5400
tgttgccatt getacaggcs tcgtggtgtc acgetcgtcg tttggtatgg cttcattcaç 5460
etccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatcccçc atgtt.gi.gea aaaaagcggt 5520
tagcteetfcc ggtcçtecgá tegtfcgtcag áagtaagttg gccgeagtgt tafccacícat S58Ò
ggttatggca gcactgcata attctcttac tgícatgcça tccgtaagat gcttttctgt 5640
gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgfc afcgeggcgac cgagttgcfcc 5700
ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcafc 5760
cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact qtcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag 5820
ttecgatgtaa eceactcgtg cacccáãctg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt 5880
ttCtgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggògacacg 5940
gaaatgttga atacteatac tcttectttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 6000
ttgtctcatg agcggataccL tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6060
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtc 6094
<210> 14<211> 4&1<21Z> DNA
<213> Seqüência Artificial.C220>
Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, peptídeo de sinal, região
V, porção da região C e junção de clonagem 31Xbal/NheI (pesada) e
NheI (leve)
<400> 14
ggatctcacc atggagttgg gactgcgctg gggcttcctc gttgctcttt taagaggfcgt 60
ccagtgtcag gtgcaattgg tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct 120
gagactctcc tgtgcaçcgt ctggattcgc cttcagtaga tatggcatgc actgggtccg 180
ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tggtatgatg gaagtaataa 240
atactatgea gacteegtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac 300gcagtatctg caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg gctgtgtatt actgtgçgag 360
aggcggtgac ttcctctact actactatta cgçtatggac gtctggggcc aagggaecac 420
ggtcaccgtc tcctcagoct Gcâccsa^gg cccstcçfçtc fcfcccçcctçfçf câccctcâç 480
e 481
<2Í0> 15
<211> 142
<212> PftT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Met Glu Leu Gly Leu Arg Trp Gly Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30
Pro GXy Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Alá Ser Gly Phe Ala Phe35 40 45
Ser Arg Tyr Gly Met His Trp Vsil Arg Gln Ala Pro> Gly ILys Gly Leu50 55 60
Glu Trp Vai Ala Val Ila Trp. Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr. Ala65 70 75 60-
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie; Ser Arg Asp- Sân. Sar Lys Asir85 30 95
Thr- Gln Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala GIul Agp Thr Ala Val100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asp Phe Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly115 120 125
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thx Thr Vai Thr Vai Ser Ser130 135 140
<21Q> 16<211> 463<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220> <223> Inclui junção de clonagem
V, porção da região C e junção de clonagem 3'Xbal/Nhel (pesada) eNheI (leve)<400> 16 ggatctcacc atgaggçftcc ctgctcagct cctgggactc ctgctgctct ggctcccaga 60taccagatgt gacatccága tgacccagtc tccatcctce ctgtctgcat ctgtaggaga 120cagagtcacc atcacttgcc gggcgagtcá gggcattagc aattatttag cctggtatca 180gcagaaaaca gggaaagttc ctaagttcct gatctãtgaa gcatccactt tgcaâtcagg 240ggtcccatet cggfctcagtg gcggtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag 300cctgcagcct gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaat tataacagtg ccccattcaic 360tttcggccct gggaccsaag tggatatcaa acgaactgtg gctgcaccct ctgtcttcat 420cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgct age 463
<2ΐο> η
<211> 127<212> PRT<213> Homo aapiens<400> 17
Mst Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro15 10 15
Asp Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser20 25 30
Ala Ser Val GIy Asp Arg Val Thx Ile Thr Cys Arg Ala. Ser Gln Gly35 40 45
Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Lya Val Pro50 55 60
Lys Pho Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Tyr Asn100 105 IlO
Ser Ala Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys115 120 125
<210> 18
<211> 508
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220><223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, peptídeo de sinal, regiãoV, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) eNheI (leve)
<400> 16
ggatctcacc atggggtcaa ccgccatcct caccatggag ttggggctgc gctgggttct 60cctcgttgçt cttttaagag gtgtccagtg tcaggtgcag ctggtggagt ctgggggagg 120cgtggtccag- cctgggaggt ccctgagact ctcsctçtgca gcgtctggat tcaccttcag ISOtaactatgtc atgcactggg tccgccaggc tccaggcasg gggctggagt gggtggcaat 240tatatggtat gatggaagta atáaatacta tgcagactcc gtgaagggec gattcaccat 300ctceagàgae aattccaaga .açacgctgta tctg.caaatg aacagcctga gagccgagga 360caeggçtgtg tattsctgtg cgggtggafca taactggaac tacgagtacc actactacgg 420tatggacgtc tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc tcagcetcca ccaagggccc 480atoggtcttc cccctggcac cctctagc 508'
<21Q>
<211> 143
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Mat GIu Leu Gly Leu Arg Ifrp Val
1 5
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val20
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser35 40
Lau Leu Val Ala Leu Leu Arg Gly10 15
Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln25 30
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe45
Ser Aan Tyr Val Met His Trρ ValSO 55
Glu Trp Vai Ala Ile Ile Trp Tyr6$ 70
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr85
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Aan Ser100
Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Asn115 120
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu60
Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala75 80
lie Set Arg Asp Asn Ser Lys Aan90 95
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vãl105 110
Trp Asn Tyr Glu Tyr His Tyr Tyr125
GIy Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Vâl Ser Ser130 - 135 140<210> 20<211> 463<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, peptideo de sinal, regiãoV, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) eWheI (leve)
<400> 20
ggàtctcacc atgagggtcç ççgctcagct ccfcggggctc ctgctgctct gttteccagg €0
tgccagatgt gacatccaga ígacccagtc tccetççtca ctgtctgcat ctgtaggaga 120
cagagtcacc atcacttgtc gggcgagtca gggcattacc aattatttag cctggtttga 180
gcagaaaòca gggaaagccc ctaagtccct tatetatgct gçatccagtt tgcaaagtgg: 240
ggtcccatca aagttcageg gcagtggafec tgggacagat ttcagtctca ccatcagcag 300
cctgcagcct gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt acccgatcac. ,360
cttcggccaa gggaeacgac. tggagattaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat 420
cttcccgcca tctgatgagc agttgaaatc tggaactgct age 463
<210> 21
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapienô
<400> 21
Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro1 5 10 15
Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cya Arg Alá Ser Gln Gly35 40 45
Ile Thr Asn Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro50 55 60
Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser65 70 75 80
Lya Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Lsu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn100 105 IiO
Ser Tyr Pro lie Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Lea Glu Ile Lys115 120 125
<210> 22
<211> 490
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, peptídeo de sinal, regiãoV, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) eNheI (leve)
<4Õ0> 22
ggatctcacc atggagttgg gacttagctg ggttitcctc gttgetettt táagaggtgt 6.0
ccagtgtcèg gtccagctgg tggagtetgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct 120
gagactctcc fcgtgcagcgt ctggafetcac cttcagtagc tafcggeatgc actggçtccg 130
ccãggctcca ggcaaggggc tggactgggt ggcaattatt tggcatgatg gaagtaataa 240
ãtactatgca cfaetecgtga agggccgatt csccatotcc agagacaatt ccaagaagac 300
gctgtacctg caaatgaaca gtttgagagc cgaggacacg gctgtgtatt aotgtgcggg 360
agcttgggcc tatgactacg gtgactatga atactacttc gçtatggacg tctggggcca 420
agggãccacg gtcaccgtct eeteagçctc caccaagggc ccatcggtct tccccctggc 480
accctctagc 490
<210> 23
<211> 145
<212> PRT
<213» Homo sapiens
<400> 23
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg GIy1 S 10 IS
Vâl Gln Cys Gln Val Gln Lau Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30
Pro Gly Arg S®r Leu Arg Leu Ser Cys Ala Alá Ser Gly Phe Thr Pha35 40 45
Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60Aap Trp Val65
Ala Ile Iie Trp70
His Asp Gly Ser Asn Lys75
Tyr Tyr Ala80
Asp Ser Val Lyg Gly Arg Phe85
Thr Xle Ser Arg Asp Asn Ser90
Ly3 LysSS
Thr leu Tyr Lsu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val .10Ô 105 110
Tyr fyr Cys Ala Arg Ala Trp Ala Tyr Asp Tyr Gly Asp Tyr Glu Tyr115 120 125
Tyr Phe Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Ths Thr Val Thr Vsl Sar130 135 140
Ser145
<210> 24<211> 463<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<22 3> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, peptídeo de sinal, regiãoV, porção da região C e junção de clonagem 3'Xbal/Nhel (pesada) eNheI (leve)
<4 G0> 24
ggatcteacc atgagggtcc ctgctcagct cctggggctc ctgetgctet gtttcecagg 60
tgecagatgt gacatccaga tgacccagtc. tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga 120
cagagtcacc atcacttgtc gggcgagtca gggcattagc cattatttág cctggtttca 180
gçagaaacca gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct geatccágfct tgcaaagtgg 240
ggtcccàtca aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag 300
cctacagcct gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt tcccgctcac 360
tttcggcgga gggaccaagg tggagateaa acgaactgtg gctgcacea.t ctgtcttçat <320
cfcfccccgcea tctgatgagc agttgaaatc fcggaactgct age 463
<210> 25
<211> 127
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Lau Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Pro1 5 XO 15
Gly Ala Aeg Cyg Asp Ile Gln Mst Thr Gln Ser Fro Ser Ser Leu Ser20 25 30
Aia Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cya Arg Ala Ser Gln Gly35 40 45
Ile Ser Hls Tyr Leu Ala Trp Phe Gln Glii Lys Pro Gly Lys Ala Pro50 55 60
Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Léu Gln Ser Gly Val Pro S©r65 70 75 80
Lys Phs Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyir Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn100 105 110
Ser Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lya Val Glu Ile Lys115 120 125
<210> 26
<21i> 4 69
<212 > DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, peptídeo de sinal, regiãoV, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) eNheI (leve)
<40Q> 26 ggatcceacc atçgggtcaa cçgtcatcct cgccctcçtc. ctggctgttc .tccaaggagt 60:ctgtgccgag gtgcagctgg tgcagtctgg agcagaggtg aaaaagcccg gggagtcfccfc 120.çaagatctcc tgtaagggtt ctggatacag ctttaccagt taçtggatcg gctgggtgcg 180ccagatgccc gggaaaggcc tggagtggat ggggàtcatc tatcctggtg actctgatac 240cagatacagc ccgtccttcc aaggccaggt caccatctca gccgacaagt ccáteagcac 300cgcctacctg cagtggagca gcctgaaggc ctcggacacc gccatgtatt actgtgcgag 360acggatggca gcagctggcc cctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc 420ctcagcctcc accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctctagc 469
<21Q> 27<2il> 138<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 27
Met Gly Ser rThr Val Ile Leu Ala Iieu Leu Leu Ala Val Leu Gln Oly1 5 10 15
Val Cys Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Giy Ala Glu Val Lys Lys20 25 30
Pro Giy Glu Ser Leu Lys Ile Sèr Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe35 40 45
Thr Ser Tyr Trp II® Gly Trp Val Arg Gln Mefc Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60
Glu Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser65 70 75 80
Pro Ser Phe Glrx Gly Gln Val Thr Ile Ser Ma Aap Lys Ser Ile Ser85 90 95
Thr Ala Tyr Lsu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Met Ala Ala Ála Gly Pró Phe Asp Tyr Trp115 120 125
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135
<210> 28
<211> 466
<212> DfJA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, peptídeo de sinal, regiãoV, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) eNheI (leve)
<400> 28
ggatctcacc atgagççtcc ccgctcagct tctcttcctt cfcgciactct ggctcccaga 60
taccactgga ggaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga 120
aagagccacc ctctcctgcâ ggaccagtca gagtattggc tggaacttag cctggtacca 180
acagaaacct ggccaggctc cdaggctcct gatctatggt gcatcttcca ggaccactgg 240
tatcccagcc aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag 300
cctgcagtct gaagattctg cagtttatta ctgtcagcat tatgataact ggcccatgtg 360
cagttttggc caggggaccg agctggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt 420
catcfctcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaaot gctagc 466<210> 29<211> 128
<212> PRT
<2Χ3> Homo sapiens
<400> 29
Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Pha Leu Leu Leu Léu Trp' Leu Pro1 5 10 15
Asp Thir Thr Gly Gly Ila Val Met Thr Gln Ser £ro Ala Thr Leu Ser20 25 30
Val Ser Pro Gly Glu Arg- Ala Thr Lau Ser Gys Arg Thr Ser Gin Ser.35 40 45
lie Gly Trp Asn Leu Ala Trp Tyr Glri Gln Lys Fro Gly Gln Ala Pro50. 55 60
Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Thr Thr Gly Ue Pro Ala65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Giy Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser85 90' 95
Ser LeuGln Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp.100 105 ' 110
Asn Trp fro Met Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Glu Leu Glu IXe Lys115 120 125
<210> 30
<211> 4Θ7
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<22Ò>
<223> Inclui junção de clonagem BamHI/BglII, peptideo de sinal, região V,porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) e MheI(leve)
<400> 30
ggatctcacc atggagtttg ggctgtgctg gattfctcctc gttgctcttt taagaggtgt 60
ccagtgtcag gtgcagctgg tggagtctgg gggaçgcgtg gtccagcccg ggâggtccct 120
gagactctcc tgtgcagcct ctggattcac cttcatfcagc tatggcatgc actgggtccg 180
ccaggctcca ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata tcatatgatg gaagtaataa 240
atactatgca çactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagaacac 300gctgtatctg caaatgaaca gcctgagagc tgaggacacg gctgtgtatt actgtgcgag 3δ0
agfcattagtg ggagcfcttat attattataa ctactacggg afcggacgtct gçggccaagg 420
gaccacggte accgtçtcct cagcctccac caagggccca tçggtcttcc ccctggcacc 480
ãtçtãgc 487
<210> 31
<211> 144
<212> PR?
<213> Eomo sapíens
<I00> 31
M@t Glu Phe Gly fceu Cys Trp Ile Phe teu Val Ala Leu Leu -Arg Gly1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln20 25 30
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phs Thr Phe35 40 45
Ile Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Ly3 Gly Leu50 SS 60
Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala65 70 7S 80
Asp Ser Val Itys Gly Arg^ Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala. Glu Asp Thr Ala Val100 ' 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leti Val Gly Ala Leu Tyr Tyr Tyr Asn Tyr115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser130 135 140
<210> ,32<211> 47&<212> DWA<213> Seqüência Artificial<220> <223> Inclui junção de clonagem
V, porção da região C e junção de clonagem 3'XbaI/NheI (pesada) eNheI (leve)
<400> 32ggatctcacc gfcgagggtcc ctgctcagct cctggggctg ctaatgctct ggatacctgg 60
atccagtgca gatattgtga tgaccgagaç tccãctctct ctgtccgtca cçcctggaca 120
gccggcctcc atctcetgca agtctagtca gagcctcctg catagtgatg gaaagaccfct 180
tttgtattçg tatctgcaga agccaggcca gcctccacag ctcctgatct atgaggtttc 240
caaccggttc tctggagtgc cagataggtt cagtggcago gggtcaggga cagatttcac 300
actgaaaatc agccgggtgg aggctgagga tgttgggott tattactgca tgcaaagtat 360
acagcttccg ctcactttcg gcggagggac caaggtggag atcaaacgaa ctgtggctgc 420
accatotgtc ttcatcttcc cgccatctgs tgagcagttg aaatctggaa ctgctagc 478
<210> 33
<211> 132
<212> PRT
<213> Hoitio sapi@ns
<400> 33
Met Arg Vai Pro Ala Gln Leu Leu Gly LeU Leu Met I*eu Trjp Ile Fto1 5 m 15;
Gly Ser Ser Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Fro leu Ser Leu Sei20 25 30
Val Thr Pro Gly Gln Pro Ala Sar Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser35 40 45
Leu Leu Hi3 Ser Asp Gly Lys Thr Phe Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys50 55 60
Prg Gly Gla Pro Pro Gln leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Sar Gly 5er Gly Ser Gly Thr Asp Phe85 90 95
Thr Lev Lys Ile S©r Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Leu Tyr Tyr100 105 110
Cys Met Gln Ser Ile Gln Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys115 .120 125
Val Glu Ile Lys130

Claims (62)

1. Conjugado de anticorpo-medicamento,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:um anticorpo ou fragmento de ligação de antigenodo mesmo, que se liga ao antigeno de membrana especifico dapróstata (PSMA), conjugado à monometilauristatinanorefredina ou monometilauristatina fenilalanina
2. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oconjugado de anticorpo-medicamento possui uma seletividadede célula PC3 em relação à célula C4-2 ou LNCaP de pelomenos 250.
3. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo é umanticorpo monoclonal ou fragmento de ligação de antigeno domesmo que se liga especificamente:(a) ao PSMA;(b) a um domínio extracelular de PSMA; ou(c) a um epítopo conformacional do PSMA.
4. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo(i) inibe competitivamente a ligação específica deum segundo anticorpo ao seu epítopo alvo em PSMA, ou(ii) se liga a um epítopo em PSMA definido por umanticorpo selecionado do grupo consistindo em PSMA 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA 7.3, PSMA- 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA Α3.1.3, PSMA Α3.3.1, Abgenix 4.248.2,Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix 4.4.1, Abgenix- 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3, Abgenix 4.28.3,Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix 4.49.1, Abgenix- 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1, Abgenix 4.333.1,Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix 4.232.3, Abgenix- 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1, Abgenix 4.152.1 eanticorpos compreendendo:(a) uma cadeia pesada codificada por uma moléculade ácido nucléico compreendendo uma região ou regiões decodificação de uma seqüência de nucleotideos selecionada dogrupo consistindo nas seqüências de nucleotideosestabelecidas como SEQ ID NOs: 2-7, e(b) uma seqüência leve codificada por uma moléculade ácido nucléico compreendendo uma região ou regiões decodificação de uma seqüência de nucleotideos selecionada dogrupo consistindo nas seqüências de nucleotideosestabelecidas como SEQ ID NOs: 8-13, ou(c) uma região variável de cadeia pesadacodificada por uma molécula de ácido nucléico compreendendouma região ou regiões de codificação de uma seqüência denucleotideos selecionada do grupo consistindo nas seqüênciasde nucleotideos estabelecidas como SEQ ID NOs: 14, 18, 22, 26 e 30, e(d) uma região variável de cadeia leve codificadapor uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma regiãoou regiões de codificação de uma seqüência de nucleotideosselecionada do grupo consistindo nas seqüências denucleotideos estabelecidas como SEQ ID NOs: 16, 20, 24, 28 e 32.
5. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que osegundo anticorpo é selecionado do grupo consistindo em PSMA- 3.7, PSMA 3.8, PSMA 3.9, PSMA 3.11, PSMA 5.4, PSMA 7.1, PSMA- 7.3, PSMA 10.3, PSMA 1.8.3, PSMA A3.1.3, PSMA A3.3.1,Abgenix 4.24 8.2, Abgenix 4.360.3, Abgenix 4.7.1, Abgenix- 4.4.1, Abgenix 4.177.3, Abgenix 4.16.1, Abgenix 4.22.3,Abgenix 4.28.3, Abgenix 4.40.2, Abgenix 4.48.3, Abgenix- 4.49.1, Abgenix 4.209.3, Abgenix 4.219.3, Abgenix 4.288.1,Abgenix 4.333.1, Abgenix 4.54.1, Abgenix 4.153.1, Abgenix- 4.232.3, Abgenix 4.292.3, Abgenix 4.304.1, Abgenix 4.78.1,Abgenix 4.152.1 e anticorpos compreendendo:(a) uma cadeia pesada codificada por uma moléculade ácido nucléico compreendendo uma região ou regiões decodificação de uma seqüência de nucleotideos selecionada dogrupo consistindo nas seqüências de nucleotideosestabelecidas como SEQ ID NOs: 2-7, e(b) uma seqüência leve codificada por uma moléculade ácido nucléico compreendendo uma região ou regiões decodificação de uma seqüência de nucleotideos selecionada dogrupo consistindo nas seqüências de nucleotideosestabelecidas como SEQ ID NOs: 8-13, ou(c) uma região variável de cadeia pesadacodificada por uma molécula de ácido nucléico compreendendouma região ou regiões de codificação de uma seqüência denucleotideos selecionada do grupo consistindo nas seqüênciasde nucleotídeos estabelecidas como SEQ ID NOs: 14, 18, 22, 26 e 30, e(d) uma região variável de cadeia leve codificadapor uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma regiãoou regiões de codificação de uma seqüência de nucleotídeosselecionada do grupo consistindo nas seqüências denucleotídeos estabelecidas como SEQ ID NOs: 16, 20, 24, 28 e 32.
6. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que osegundo anticorpo é selecionado do grupo consistindo em AB-PGl -XG1-006, AB-PGl-XGl-026 e anticorpos compreendendo:(a) uma cadeia pesada codificada por uma moléculade ácido nucléico compreendendo uma região ou regiões decodificação de uma seqüência de nucleotídeos selecionada dogrupo consistindo nas seqüências de nucleotídeosestabelecidas como SEQ ID NOs: 2 e 3, e uma seqüência levecodificada por uma molécula de ácido nucléico compreendendouma região ou regiões de codificação de uma seqüência denucleotídeos selecionada do grupo consistindo nas seqüênciasde nucleotídeos estabelecidas como SEQ ID NOs: 8 e 9; ou(b) uma cadeia pesada codificada por uma moléculade ácido nucléico compreendendo uma região ou regiões decodificação de uma seqüência de nucleotídeos estabelecidacomo SEQ ID NO: 2, e uma seqüência leve codificada por umamolécula de ácido nucléico compreendendo uma região ouregiões de codificação de uma seqüência de nucleotídeosestabelecida como SEQ ID NO: 8; ou(c) uma cadeia pesada codificada por uma moléculade ácido nucléico compreendendo uma região ou regiões decodificação de uma seqüência de nucleotideos estabelecidacomo SEQ ID NO: 3, e uma seqüência leve codificada por umamolécula de ácido nucléico compreendendo uma região ouregiões de codificação de uma seqüência de nucleotideosestabelecida como SEQ ID NO: 9; ou(d) uma região variável de cadeia pesadacodificada por uma molécula de ácido nucléico compreendendouma região ou regiões de codificação de uma seqüencia denucleotideos selecionada do grupo consistindo nas seqüênciasde nucleotideos estabelecidas como SEQ ID Nos: 14 e 18, euma região variável de cadeia leve codificada por umamolécula de ácido nucléico compreendendo uma região ouregiões de codificação de uma seqüência de nucleotideosselecionada do grupo consistindo nas seqüênciasestabelecidas como SEQ ID NOs: 16 e 20, ou(e) uma região variável de cadeia pesadacodificada por uma molécula de ácido nucléico compreendendouma região ou regiões de codificação de uma seqüência denucleotideos estabelecida como SEQ ID NO: 14, e uma regiãovariável de cadeia leve codificada por uma molécula de ácidonucléico compreendendo uma região ou regiões de codificaçãode uma seqüência de nucleotideos estabelecida como SEQ ID NO: 16, ou(f) uma região variável de cadeia pesadacodificada por uma molécula de ácido nucléico compreendendouma região ou regiões de codificação de uma seqüência denucleotideos estabelecida como SEQ ID NO: 18, e uma regiãovariável de cadeia leve codificada por uma molécula de ácidonucléico compreendendo uma região ou regiões de codificaçãode uma seqüência de nucleotideos estabelecida como SEQ IDNO: 20.
7. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo é codificado por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma seqüência de nucleotideos que é pelo menos 90, 95, 97, 98 ou 99% idêntica a uma seqüência denucleotideos codificando um anticorpo selecionado do grupoconsistindo em: AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026 e anticorposcompreendendo:(a) uma cadeia pesada codificada por uma moléculade ácido nucléico compreendendo uma região ou regiões decodificação de uma seqüência de nucleotideos selecionada dogrupo consistindo nas seqüências de nucleotideosestabelecidas como SEQ ID NOs: 2 e 3, e(b) uma seqüência leve codificada por uma moléculade ácido nucléico compreendendo uma região ou regiões decodificação de uma seqüência de nucleotideos selecionada dogrupo consistindo nas seqüências de nucleotideosestabelecidas como SEQ ID NOs: 8 e 9, ou(c) uma região variável de cadeia pesadacodificada por uma molécula de ácido nucléico compreendendouma região ou regiões de codificação de uma seqüência denucleotideos selecionada do grupo consistindo nas seqüênciasde nucleotideos estabelecidas como SEQ ID NOs: 14 e 18, e(d) uma região variável de cadeia leve codificadapor uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma regiãoou regiões de codificação de uma seqüência de nucleotideosselecionada do grupo consistindo nas seqüências denucleotideos estabelecidas como SEQ ID NOs: 16 e 20.
8. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo é AB-PG1-XG1-006, AB-PG1-XG1-026 ou um fragmento de ligação deantigeno do mesmo.
9. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo éselecionado do grupo consistindo em:(a) anticorpos compreendendo uma cadeia pesadacodificada por uma molécula de ácido nucléico compreendendouma região ou regiões de codificação de uma seqüência denucleotideos selecionada do grupo consistindo nas seqüênciasde nucleotideos estabelecidas como SEQ ID NOs: 2 e 3, e umaseqüência leve codificada por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma região ou regiões de codificação de umaseqüência de nucleotideos selecionada do grupo consistindonas seqüências de nucleotideos estabelecidas como SEQ IDNOs: 8 e 9, efragmento de ligação de antigenos do mesmo;(b) anticorpos compreedendo uma cadeia pesadacodificada por uma molécula de ácido nucléico compreendendouma região ou regiões de codificação de uma seqüência denucleotídeos estabelecida como SEQ ID NO: 2, e uma cadeialeve codificada por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma região ou regiões de codificação de umaseqüência de nucleotídeos estabelecida como SEQ ID NO: 8, efragmento de ligação de antígenos do mesmo; e(c) anticorpos compreendendo uma cadeia pesadacodificada por uma molécula de ácido nucléico compreendendouma região ou regiões de codificação de uma seqüência denucleotídeos estabelecida como SEQ ID NO: 3, e uma cadeialeve codificada por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma região ou regiões de codificação de umaseqüência, de nucleotídeos estabelecida como SEQ ID NO: 9, efragmento de ligação de antígenos do mesmo; e(d) anticorpos compreendendo uma região variávelde cadeia pesada codificada por uma molécula de ácidonucléico compreendendo uma região ou regiões de codificaçãode uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupoconsistindo nas seqüências de nucleotídeos estabelecidascomo SEQ ID NOs: 14 e 18, e uma região variável de cadeialeve codificada por uma molécula de ácido nucléicocompreendendo uma região ou regiões de codificação de umaseqüência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindonas seqüências de nuclotídeos estabelecidas como SEQ ID NOs:- 16 e 20, efragmento de ligação de antígenos do mesmo; e(f) anticorpos compreendendo uma região variávelde cadeia pesada codificada por uma molécula de ácidonucléico compreendendo uma região ou regiões de codificaçãode uma seqüência de nucleotídeos estabelecida como SEQ IQNO: 18, e uma região variável cadeia leve codificada por umamolécula de ácido nucléico compreendendo uma região ouregiões de codificação de uma seqüência de nucleotídeosestabelecida como SEQ ID NO: 20, efragmento de ligação de antígenos do mesmo.
10. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo éIgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD, IgE oupossui uma constante de imunoglobulina e/ou domínio variávelde IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD ouIgE.
11. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo é um anticorpo monoclonal, humanizado, humano,recombinante, quimérico, biespecífico ou multiespecífico.
12. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de ofragmento de ligação de antígeno é um fragmento Fab, umfragmento F(ab')2, um fragmento Fv, ou um fragmento contendoCDR3.
13. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que aseletividade da célula PC-3 para célula C4-2 ou LNCaP é depelo menos 500, 1.000, 2.500, 6.000 ou 13.000.
14. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oanticorpo ou fragmento de ligação de antigeno do mesmo éconjugado a pelo menos 2, 3 ou 4 moléculas demonometilauristatina norefedrina ou monometilauristatinafenilalanina.
15. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que amonometilauristatina norefredina ou monometilauristatinafenilalanina é conjugada ao anticorpo ou fragmento deligação de antigeno do mesmo com um composto da fórmula:<formula>formula see original document page 176</formula>onde A é uma unidade de acila carboxílica; Y é umaminoácido; Z é um aminoácido; XeW são cada um espaçadorauto imolativo; η é um inteiro de 0 ou 1; e m é um inteirode 0 ou 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
16. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que A é:(b) 4-(N-succinimidometil)cicloexano-l-carbonila,(c) m-succinimidobenzoila,(d) A-(p-succinimidofenil)-butirila,(e) 4-(2-acetamido)benzoila,(f) 3-tiopropionila,(g) 4-(1-tioetil)-benzoila,(h) 6-(3-tiopropionilamido)-hexanoila, ou(i) capropila maleimida.
17. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que Y éalanina, valina, leucina, isoleucina, metionina,fenilalanina, triptofano ou prolina.
18. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que Z élisina, lisina protegida com acetila ou formila, arginina,arginina protegida com tosila ou grupos nitro, histidina,ornitina, ornitina protegida com acetila ou formila oucitrulina.
19. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que Ym-Zmé valina-citrulina.
20. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que Ym-Zmé uma seqüência de proteína que é seletivamente clivável poruma protease.
21. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que X é:(a) um composto possuindo a fórmula:<formula>formula see original document page 177</formula>onde T é 0, N ou S;(b) um composto possuindo a fórmula:-HN-R1-COTonde R1 é alquila C1-C5f T é O, N ou S;(c) um composto possuindo a fórmula:<formula>formula see original document page 178</formula>onde T é 0, N, ou S, R é H oualquila C1-C5;(d) p- aminobenzilcarbamoiloxi;(e) álcool p-aminobenzilico;(f) p-aminobenzilcarbamato;(g) p- aminobenziloxicarbonila; ou(h) ácido γ-aminobutírico; ácido α,α-dimetil γ-aminobutirico ou ácido β,β-dimetil γ-aminobutírico.
22. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que W é:<formula>formula see original document page 178</formula>onde T é 0, S ou N.
23. Conjugado de anticorpo-medicamento de acordocom qualquer uma das reivindicações 15-22, CARACTERIZADOpelo fato de que m e η são 0.
24. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que é AB-PGl-XGl-006-maleimida caproil-valina-citrulina-p-aminobenziloxocarbonil-monometilauristatina norefredina, AB-PGl-XGl-O06-maleimida capropil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil-monometilauristatina feniIalanina,AB-PGl-XGl-O06-maleimida capropil-monometilauristatinafenilalanina, AB-PGl-XGl-026-maleimida capropil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil-monometilauristatinanorefredina, AB-PGl-XGl-026-maleimida capropil-valina-citrulina-p-aminobenziloxicarbonil-monometilauristatinafenilalanina, ou AB-PGl-XGl-026-maleimida capropil-monometilauristatina fenilalanina.
25. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oconjugado de anticorpo-medicamento se liga a células vivas,preferivelmente a uma célula tumoral, mais preferivelmentea uma célula tumoral da próstata.
26. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oconjugado de anticorpo-medicamento se liga às célulasendoteliais da neovasculatura de um tumor, não requer Iiseda célula para se ligar ao PSMA, conduz à suspensão do ciclocelular, e/ou inibe o crescimento das células de expressãode PSMA.
27. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oconjugado de anticorpo-medicamento media morte celularespecifica de células expressando PSMA com um IC50:(a) inferior a 1 χ 10"loM, 1 χ 10-11M ou 1 χ 10"12 Μ;(b) de 11, 42, 60 ou 65 a 208 χ 10-12M; ou(c) de 11, 42, 60 ou 83 χ 10-12M.
28. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que oconjugado de anticorpo-medicamento quando administrado acamundongos com um regime de q4d χ 6 em uma dose de 6 mg/kgafeta a razão de cura em pelo menos 20%, 30%, 40% ou 50%.
29. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que éligado a um marcador, preferivelmente a um marcadorfluorescente, um marcador de enzima, um marcador radioativo,um marcador ativo em ressonância magnética nuclear, ummarcador luminescente ou um marcador cromoforo.
30. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que éembalado na forma liofilizada ou aquosa.
31. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que estána forma estéril.
32. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de quecompreende:(a) o conjugado de anticorpo-medicamento, deacordo com a reivindicação 1 e um veiculo, excipiente ouestabilizador farmaceuticamente aceitável.(b) uma combinação de dois ou mais conjugados deanticorpo-medicamento diferentes, de acordo com areivindicação 1 e um veiculo, excipiente ou estabilizadorfarmaceuticamente aceitável.
33. Composição, de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um agenteantitumor, um agente imunoestimulador, um imunomodulador,corticosteróide ou uma combinação dos mesmos.
34. Composição, de acordo com a reivindicação 33,CARACTERIZADA pelo fato de que o agente antitumor é umagente citotóxico, um agente que atua na neovasculaturatumoral ou uma combinação dos mesmos, preferivelmentedocetaxel.
35. Composição, de acordo com a reivindicação 33,CARACTERIZADA pelo fato de que o imunomodulador é umacitocina, quimiocina, adjuvante ou uma combinação dosmesmos.
36. Composição, de acordo com a reivindicação 33,CARACTERIZADA pelo fato de que o agente imunoestimulador éinterleucina-2, α-interferon, γ-interferon, fator-a denecrose tumoral, oligonucleotideos imunoestimuladores ou umacombinação dos mesmos.
37. Composição, de acordo com a reivindicação 33,CARACTERIZADA pelo fato de que o corticosteróide éprednisona ou hidrocortisona.
38. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de quecompreende:um ou mais conjugados de anticorpo-medicamento deacordo com a reivindicação 1, e um ou mais anticorpos anti-PSMA não conjugados.
39. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom qualquer uma das reivindicações 1-28, CARACTERIZADO pelofato de ser para o uso em um método para inibir ocrescimento de uma célula expressando PSMA, em que oconjugado deve ser colocado em contato com a célulaexpressando PSMA.
40. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de que acélula expressando PSMA é uma célula tumoral da próstata,uma célula da neovasculatura de um tumor diferente daqueleda próstata, uma célula dependente de androgênio ou umacélula independente de androgênio.
41. Conjugado de anticorpo-medicamento, de acordocom a reivindicação 39, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende, no referido método, a célula expressando PSMA é,adicionalmente, colocada em contato com um agente antitumor,um agente imunoestimulador, um imunomodulador,corticosteróide ou uma combinação dos mesmos.
42. Método ex vivo para inibir o crescimento deuma célula expressando PSMA, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende colocar em contato a célula expressando PSMA comuma quantidade de um conjugado anticorpo-medicamento, deacordo com qualquer uma das reivindicações 1-28, efetivapara inibir o crescimento da célula expressando PSMA.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42,CARACTERIZADO pelo fato de que a célula expressando PSMA éuma célula tumoral da próstata, uma célula da neovasculaturade um tumor diferente daquele da próstata, uma céluladependente de androgênio ou uma célula independente deandrogênio.
44. Método, de acordo com a reivindicação 42,CARACTERIZADO pelo fato de que compreende, adicionalmente,colocar em contato a célula expressando PSMA com um agenteantitumor, um agente imunoestimulador, um imunomodulador,corticosteróide, ou uma combinação dos mesmos.
45. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1-28, CARACTERIZADO pelofato de ser para o uso em um método de efetuar a suspensãodo ciclo celular em uma célula expressando PSMA, em que oconjugado é colocado em contato com a célula expressandoPSMA.
46. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1-2 8, CARACTERIZADO pelofato de ser para o uso em um método de tratamento de umadoença mediada por PSMA.
47. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo coma reivindicação 4 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a doençamediada por PSMA é câncer.
48. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo coma reivindicação 47, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer écâncer da próstata ou câncer é diferente daquele dapróstata, e o referido câncer diferente daquele da próstata,opcionalmente, é câncer da bexiga, câncer pancreático,câncer de pulmão, câncer dos rins, sarcoma, câncer de mama,câncer de cérebro, carcinoma neuroendócrino, câncer decólon, câncer testicular ou melanoma.
49. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo coma reivindicação 4 6, CARACTERIZADO pelo fato de que, noreferido método, outro agente terapêutico é co-administradopara tratar a doença mediada por PSMA, onde a co-administração é antes, durante ou após a administração doconjugado de anticorpo-medicamento.
50. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo coma reivindicação 4 9, CARACTERIZADO pelo fato de gue o outroagente terapêutico é um agente antitumor, um agenteimunoestimulador, um imunomodulador, corticosteróide ou umacombinação dos mesmos.
51. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo coma reivindicação 41 ou 50, ou método, de acordo com areivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de gue o agenteantitumor é um agente citotóxico, um agente que atua naneovasculatura tumoral ou uma combinação dos mesmos e,preferivelmente, docetaxel.
52. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo coma reivindicação 41 ou 50, ou método, de acordo com areivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de que oimunomodulador é uma citocina, quimiocina, adjuvante ou umacombinação dos mesmos.
53. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo coma reivindicação 41 ou 50, ou método, de acordo com areivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de que o agenteimunoestimulador é interleucina-2, α-interferon, γ-interferon, fator-a de necrose tumoral, oligonucleotideosimunoestimuladores ou uma combinação dos mesmos.
54. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo coma reivindicação 41 ou 50, ou método, de acordo com areivindicação 44, CARACTERIZADO pelo fato de que ocorticosteróide é prednisona ou hidrocortisona.
55. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo coma reivindicação 4 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o agenteterapêutico é uma vacina, preferivelmente uma vacina queimuniza contra PSMA.
56. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo comas reivindicações 49-51, CARACTERIZADO pelo fato de que, noreferido método, outro agente terapêutico, preferivelmenteprednisona, ainda é administrado.
57. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo comqualquer uma das reivindicações 1-28, CARACTERIZADO pelofato de ser para o uso em um método para para inibir ocrescimento de um tumor, em que o referido conjugado écolocado em contato com as células expressando PSMA daneovasculatura tumoral, para assim inibir o crescimento dotumor.
58. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo coma reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de que, noreferido método, as células expressando PSMA sãoadicionalmente colocadas em contato com um agente antitumor,um agente imunoestimulador, um imunomodulador,corticosteróide ou uma combinação dos mesmos.
59. Conjugado anticorpo-medicamento, de acordo coma reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fato de que:(a) o agente antitumor é um agente citotóxico, umagente que atua na neovasculatura tumoral ou uma combinaçãodos mesmos;(b) o imunomodulador é uma citocina, quimiocina,adjuvante ou uma combinação dos mesmos; e/ou(c) o agente imunoestimulador é interleucina-2, a-interferon, γ-interferon, fator-a de necrose tumoral,oligonucleotídeos imunoestimuladores ou uma combinação dosmesmos.
60. Composição, de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição possui menos de 2% de medicamento livre como determinado por fase reversaHPLC.
61. Composição, de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição possui mais queou igual a 98% de anticorpo monomérico.
62. Composição, de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADA pelo fato de que a composição não possuiagregados detectáveis como determinado por SEC-HPLC.
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