BRPI0612645A2 - uso de anticorpos anti-madcam para o tratamento de doença celìaca e espru tropical - Google Patents

Abstract

USO DE ANTICORPOS ANTI-MADCAM PARA O TRATAMENTO DE DOENçA CELìACA E ESPRU TROPICAL. Uso de anticorpos para o tratamento de doença celíaca e espru tropical. O pedido se relaciona ao uso de um anticorpo anti-MAdCAM para a fabricação de um medicamento para o tratamento de doença celiaca e/ou espru tropical. Métodos para tratamento de doença celíaca e/ou espru tropical usando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-MAdCAM também estão incluídos.

Description

"USO DE ANTICORPOS ANTI-MADCAM PARA O TRATAMENTODE DOENÇA CELÍACA E ESPRU TROPICAL"

Uso de anticorpos anti-MAdCAM para o tratamento dedoença celiaca e espru tropical

A invenção se relaciona ao uso de anticorpos anti-MAdCAM para a fabricação de um medicamento para o tratamentode doença celiaca e/ou espru tropical.

A molécula de adesão celular adressina de mucosa(MAdCAM) é um membro da superfamilia das imunoglobulinas dereceptores de adesão celular. Ela é uma das moléculas de a-desão envolvidas no recrutamento de linfócitos para tecidosquando necessário, por meio de interação com uma molécula deintegrina na superfície dos linfócitos.

Foi mostrado que anticorpos que inibem a ligaçãode MAdCAM a seu par de ligação integrina, α4β7, por exemplo,anticorpos anti-MAdCAM (por exemplo, MECA-367; US 5.403.919,US 5.538.724) ou anticorpos anti-a4p7 (por exemplo, Act-1;US 6.551.593,=), podem inibir o extravasamento de leucócitosno intestino inflamado e podem, portanto, ser vantajosos notratamento de doença intestinal inflamatória (IBD).

Anticorpos anti-MAdCAM tal como MECA-3 67, entre-tanto, não são úteis terapeuticamente em pacientes humanos;MECA-367 se liga a MAdCAM de camundongo e não mostra afini-dade pela molécula de MAdCAM humana. Além disso, sendo umanticorpo de rato, ele levará a uma resposta imune em paci-entes humanos e, portanto, não é adequado para uso terapêu-tico. Anticorpos monoclonais de camundongo, direcionadoscontra MAdCAM humana foram descritos (WO 96/24673), mas es-ses provavelmente também são imunogênicos em humanos. Recen-temente, anticorpos anti-MAdCAM humana completamente huma-nos, terapeuticamente úteis com especificidade e afinidadeprimorosas a MAdCAM humana e de primata foram desenvolvidose divulgados em WO 2005/067620.

Um inibidor da interação entre MAdCAM e integrinaα4β7, tal como um anticorpo anti-MAdCAM de bloqueio, ou umanticorpo para integrina α4β7 (tal como MLN02, que é Act-Ihumanizado, descrito em WO 01/078779), foi postulado comosendo útil no tratamento de doença intestinal inflamatória(IBD). Entretanto, foi demonstrado que inibidores desta in-teração incluindo anticorpos de bloqueio a MAdCAM, tambémsão úteis no tratamento de doença celiaca e espru tropical.

A doença celiaca (também conhecida como enteropa-tia sensível a glúten ou espru celíaco) é uma patologia dointestino delgado. A patologia afeta até 1 em 300 pessoas noReino Unido, Europa e EUA. A doença celiaca é uma patologiacomum e pode afetar qualquer um em qualquer idade. Pensou-seque ela seria mais comum em homens, mas provavelmente ocorreigualmente em homens e mulheres.

Glúten, uma mistura de duas proteínas, gliadina eglutenina, é encontrado no trigo, cevada e centeio. Ele rea-ge com o intestino delgado, causando lesão pela ativação dosistema imune para atacar o revestimento delicado do intes-tino, que é responsável por absorver nutrientes e vitaminas.A patologia freqüentemente é diagnosticada na infância apóso desmame quando cereais são introduzidos na dieta, emboraela possa ser diagnosticada em qualquer idade. Os sintomaspodem ser sutis e o paciente pode sentir-se mal sem motivopor algum tempo antes do diagnóstico ser feito.

Os primeiros sintomas geralmente incluem tornar-seirritadiço e triste, com pouco apetite e dificuldade em ga-nhar peso. Fezes (movimentos intestinais) podem se tornarpálidas, volumosas e de cheiro desagradável. Algumas crian-ças começam com vômito e diarréia, então a elas é freqüente-mente dado o diagnóstico errôneo de "gastroenterite". 0 es-tômago pode se tornar inchado e os músculos dos braços epernas se tornarem definhados e fracos. Em adultos os sinto-mas podem ser similares, incluindo perda de peso com pali-dez, diarréia ofensiva ou constipação e inchaço abdominalcom "vento". Metade dos adultos com doença celiaca não têmquaisquer sintomas intestinais. Eles procuram seus médicospor causa de cansaço extremo, problemas psicológicos comodepressão, dor nos ossos e às vezes mesmo fraturas (devidoao afinamento dos ossos), úlceras na boca ou uma vesicula-ção, brotoeja cutânea que coça em geral nos cotovelos e joe-lhos (chamadas dermatite herpetiforme).

Algumas mulheres com doença celiaca têm dificulda-de em engravidar e podem ser diagnosticadas por causa disto.

Aborto recorrente (perda espontânea de um gravidez) algumasvezes está associado com doença celiaca. Algumas mulheressão diagnosticadas durante a gravidez porque seus intestinosnão conseguem absorver ferro e vitaminas suficientes paramanter a demanda estando grávidas, tornando-as gravementeanêmicas. Bebês que são pequenos para sua idade no útero(retardo de crescimento intra-uterino) são mais freqüente-mente nascidos de mães com doença celiaca.

Se não tratada, a doença celiaca pode levar a ane-mia, doença óssea e raramente, algumas formas de câncer. 0tratamento mais importante no momento é evitar toda comidaque contenha glúten. Isto geralmente resulta na melhora oumesmo desaparecimento, da lesão no revestimento do intesti-no. Entretanto, a lesão voltará a ocorrer se o glúten forre-introduzido na dieta.

Embora a doença celiaca não seja prevenivel, se-guindo uma dieta sem glúten pode-se reverter a lesão no in-testino delgado. Isto requer considerável disciplina. Há umanecessidade em encontrar um medicamento com um baixo riscode efeitos colaterais que permitirá a pacientes comer umadieta normal e evitar deficiências minerais e vitaminicas eoutras patologias associadas com a doença celiaca.

Espru tropical é um problema digestivo que ocorrenos trópicos e subtrópicos. Pessoas com espru tropical nãoabsorvem nutrientes adequadamente, especialmente vitaminaB12 e ácido fólico. A diarréia é o principal sintoma do es-pru tropical; pessoas que comem muita comida gordurosa podemter diarréia mais grave que aquelas em dietas pobres em gor-dura. Outros sintomas incluem cólicas, náuseas, perda de pe-so, gases e indigestão.

Espru tropical afeta cerca de uma pessoa em um mi-lhão e ocorre de cerca de 30 graus norte do Equador até 30graus sul dele. Ele é mais comum em certos paises, incluindoíndia, Haiti, Cuba, Porto Rico e República Dominicana. É ra-ro ou ausente na África, nas Bahamas e Jamaica. A patologiaaflige residentes dos países afetados assim como viajantes,embora geralmente afete apenas viajantes que ficam por seismeses ou mais.

A causa de espru tropical não foi identificada,mas provavelmente é devido a uma combinação de fatores, in-cluindo infecção e nutrição pobre, que agem juntos para Ie-sionar o revestimento do intestino delgado, tornando estemenos apto a absorver nutrientes.

0 diagnóstico de espru tropical pode ser complica-do, porque muitas doenças têm sintomas similares. Testes defezes e sangue são realizados para descartar outras causasde diarréia. Se esses são negativos e o paciente viveu nostrópicos por um período prolongado de tempo, então esprutropical é uma causa potencial para a doença. Uma biópsiapode ser realizada para examinar as vilosidades para o acha-tamento típico das vilosidades do intestino delgado.

Certos testes sangüíneos também podem auxiliar nodiagnóstico de espru tropical. Devido à doença impedir cer-tas vitaminas e minerais de serem absorvidos, níveis baixosde albumina, cálcio ou vitaminas D, A, K e E podem ser ob-servados. O paciente também pode ter anemia devido a defici-ências em vitamina B12 e folato. Além disso, amostras fecaispodem demonstrar uma quantidade excessiva de gordura.

O tratamento geralmente é de três a seis meses deantibióticos e suplementos de ácido fólico (também chamadofolato). Pessoas com deficiência em vitamina B12 também re-ceberão suplementos vitamínicos.

Aspectos da InvençãoUm aspecto da invenção é o uso de um anticorpo quese liga especificamente a MAdCAM para a fabricação de um me-dicamento para o tratamento de doença celiaca e/ou esprutropical. Um outro aspecto da invenção é um método para tra-tamento de doença celiaca e/ou espru tropical, de preferên-cia doença celiaca, usando uma quantidade terapeuticamenteeficaz de um anticorpo anti-MAdCAM.

Um outro aspecto da invenção é o uso de um anti-corpo anti-integrina α4β7 para a fabricação de um medicamen-to para o tratamento de doença celiaca e/ou espru tropical,de preferência doença celiaca. De preferência, o anticorpoanti-integrina α4β7 é Act-I humanizado, também chamadoMLN02. Um outro aspecto da invenção é um método para trata-mento de doença celiaca e/ou espru tropical, de preferênciadoença celiaca, usando uma quantidade terapeuticamente efi-caz de um anticorpo anti-a4p7, de preferência MLN02.

Um outro aspecto da invenção é o uso de um inibi-dor da adesão mediada por MAdCAM-integrina α4β7 para a fa-bricação de um medicamente para o tratamento de doença celí-aca e/ou espru tropical. Ainda um outro aspecto da invençãoé um método para tratamento de doença celiaca e/ou esprutropical, usando uma quantidade terapeuticamente eficaz deum inibidor da adesão mediada por MAdCAM-integrina α4β7.

De preferência o anticorpo anti-MAdCAM ou porçãode ligação a antigeno deste usado na invenção se liga espe-cificamente a MAdCAM. Ainda de maior preferência, pelo menosas seqüências de CDR do citado anticorpo são seqüências deCDR humanas, ou uma porção de ligação a antigeno de um anti-corpo humano. De preferência, o anticorpo é um anticorpo hu-mano, de maior preferência um anticorpo monoclonal humano ouporção de ligação a antigeno deste, ainda de maior preferên-cia um anticorpo ou porção de ligação a antigeno deste queage como um antagonista de MAdCAM.

De preferência, o anticorpo ou porção possui pelomenos uma das seguintes propriedades:

(a)liga-se a células humanas;

(b)tem uma seletividade por MAdCAM sobre VCAM oufibronectina de pelo menos 100 vezes;

(c)liga-se a MAdCAM humana com um Kd de 3 χ IO-10Mou menos; ou

(d)inibe a ligação de células que expressam α4β7 aMAdCAM humana;

(e)inibe o recrutamento de linfócitos para o teci-do linfóide gastrintestinal.

De preferência, o anticorpo ou porção de ligação aantigeno inibe a ligação de MAdCAM humana a α4β7 e tem pelomenos uma das seguintes propriedades:

(a)compete de maneira cruzada com um anticorpo dereferência para ligação a MAdCAM;

(b)compete com um anticorpo de referência para li-gação a MAdCAM;

(c)liga-se ao mesmo epitopo de MAdCAM que um anti-corpo de referência;

(d)liga-se a MAdCAM com consideravelmente o mesmoKd que um anticorpo de referência;

(e)liga-se a MAdCAM com consideravelmente a mesmataxa de desligamento que um anticorpo de referência;

em que o anticorpo de referência é selecionado dogrupo que consiste em: anticorpo monoclonal 1.7.2, anticorpomonoclonal 1.8.2, anticorpo monoclonal 6.14.2, anticorpo mo-noclonal 6.22.2, anticorpo monoclonal 6.34.2, anticorpo mo-noclonal 6.67.1, anticorpo monoclonal 6.73.2, anticorpo mo-noclonal 6.77.1, anticorpo monoclonal 7.16.6, anticorpo mo-noclonal 7.20.5, anticorpo monoclonal 7.26.4, anticorpo mo-noclonal 9.8.2, anticorpo monoclonal 6.22.2-mod, anticorpomonoclonal 6.34.2-mod, anticorpo monoclonal 6.67.1-mod, an-ticorpo monoclonal 6.77.1-mod e anticorpo monoclonal 7.26.4-mod.

Em um outro aspecto da invenção a região variávelde cadeia pesada, a região variável de cadeia leve ou ambasdo anticorpo anti-MAdCAM possuem pelo menos 90% de identida-de na seqüência de aminoácidos com a região ou regiões cor-respondentes de um anticorpo monoclonal selecionado do grupoque consiste em: anticorpo monoclonal 1.7.2, anticorpo mono-clonal 1.8.2, anticorpo monoclonal 6.14.2, anticorpo mono-clonal 6.22.2, anticorpo monoclonal 6.34.2, anticorpo mono-clonal 6.67.1, anticorpo monoclonal 6.73.2, anticorpo mono-clonal 6.77.1, anticorpo monoclonal 7.16.6, anticorpo mono-clonal 7.20.5, anticorpo monoclonal 7.26.4, anticorpo mono-clonal 9.8.2, anticorpo monoclonal 6.22.2-mod, anticorpo mo-noclonal 6.34.2-mod, anticorpo monoclonal 6.67.1-mod, anti-corpo monoclonal 6.77.1-mod e anticorpo monoclonal 7.26.4-mod.

De preferência o anticorpo é selecionado do grupoque consiste em:

(a)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, sem asseqüências sinais;

(b)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8, sem asseqüências sinais;

(c)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12, sem asseqüências sinais;

(d)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16, sem asseqüências sinais;

(e)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20, sem asseqüências sinais;

(f)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24, sem asseqüências sinais;

(g)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 28, sem asseqüências sinais;

(h)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 32, sem asseqüências sinais;

(i)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36, sem asseqüências sinais;(j)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40, sem asseqüências sinais;

(k)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 44, sem asseqüências sinais;

(1)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 48, sem asseqüências sinais;

(m)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 54, sem asseqüências sinais;

(n)ura anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 58, sem asseqüências sinais;

(o)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 62, sem asseqüências sinais;

(p) um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 66, sem asseqüências sinais;

(q)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 68, sem asseqüências sinais.

Em um outro aspecto da invenção, o anticorpo mono-clonal ou porção de ligação a antigeno deste é selecionadodos seguintes anticorpos:

(a)a cadeia pesada compreende as seqüências de a-minoácidos CDRl, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de um anticor-po de referência selecionado do grupo que consiste em:1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod

(b) a cadeia leve compreende as seqüências de ami-noácidos CDRl, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de um anticorpo dereferência selecionado do grupo que consiste em: 1.7.2,1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1,7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,6.67.1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod

(c)o anticorpo compreende uma cadeia pesada de (a)e uma cadeia leve de (b); e

(d)o anticorpo de (c) em que as seqüências de ami-noácidos de CDR de cadeia pesada e cadeia leve são selecio-nadas do mesmo anticorpo de referência.

Em um outro aspecto da invenção, o anticorpo mono-clonal ou porção de ligação a antigeno deste compreende:

(a)uma cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácidos de região variável de cadeia pesada de um anti-corpo selecionado do grupo que consiste em: 1.7.2 (SEQ IDNO: 2), 1.8.2 (SEQ ID NO: 6), 6.14.2 (SEQ ID NO: 10), 6.22.2(SEQ ID NO: 14), 6.34.2 (SEQ ID NO:. 18), 6.67.1 (SEQ ID NO:22), 6.73.2 (SEQ ID NO: 26), 6.77.1 (SEQ ID NO: 30), 7.16.6(SEQ ID NO: 34), 7.20.5 (SEQ ID NO: 38), 7.26.4 (SEQ ID NO:42) e 9.8.2 (SEQ ID NO: 46), 6.22.2-mod (SEQ ID NO: 52),6.34.2-mod (SEQ ID NO: 56), 6.67.1-mod (SEQ ID NO: 60),6.77.1-mod (SEQ ID NO: 64) e 7.26.4-mod (SEQ ID NO: 42);(b)uma cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácidos de região variável de cadeia leve de um anticor-po selecionado do grupo que consiste em: 1.7.2 (SEQ ID NO:4), 1.8.2 (SEQ ID NO: 8), 6.14.2 (SEQ ID NO: 12), 6.22.2(SEQ ID NO: 16), 6.34.2 (SEQ ID NO: 20), 6.67.1 (SEQ ID NO:24), 6.73.2 (SEQ ID NO: 28), 6.77.1 (SEQ ID NO: 32), 7.16.6(SEQ ID NO: 36), 7.20.5 (SEQ ID NO: 40), 7.26.4 (SEQ ID NO:44) e 9.8.2 (SEQ ID NO: 48), 6.22.2-mod (SEQ ID NO: 54),6.34.2-mod (SEQ ID NO: 58), 6.67.1-mod (SEQ ID NO: 62),6.77.1-mod (SEQ ID NO: 66) e 7.26.4-mod (SEQ ID NO: 68); ou

(c)a cadeia pesada de (a) e a cadeia leve de (b).

Um outro aspecto da invenção é o uso da cadeia pe-sada e/ou leve do citado anticorpo anti-MAdCAM da região va-riável ou de outra porção de ligação a antigeno deste, oumoléculas de ácido nucléico codificando qualquer um dos an-tecedentes e um veiculo farmaceuticamente aceitável. Esteaspecto da invenção inclui o uso de fragmentos de quaisquerdos anticorpos antecedentes, incluindo, mas não limitando afragmentos Fab, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv de cadeiaúnica (scFv).

De preferência, o anticorpo anti-MAdCAM é um anti-corpo anti-MAdCAM inibitório humano selecionado de 1.7.2,1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1,7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod como descrito em WO2005/067620 (com ou sem a seqüência sinal) ou a região vari-ável de qualquer uma das citadas seqüências de aminoácidos,ou uma ou mais CDRs dessas seqüências de aminoácidos. 0 an-ticorpo anti-MAdCAM de preferência compreende uma cadeia pe-sada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadade SEQ ID NO: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 38, 42, 46,52, 56, 60 ou 64 como mostrado em WO 2005/067620 (com ou sema seqüência sinal) ou a seqüência de aminoácidos da regiãovariável, ou de qualquer uma ou mais CDRs das citadas se-qüências de aminoácidos. 0 anticorpo anti-MAdCAM de prefe-rência é um anticorpo anti-MAdCAM humano compreendendo a se-qüência de aminoácidos do inicio da CDRl até o final da CDR3de qualquer uma das seqüências acima mencionadas. 0 anticor-po anti-MAdCAM usado na invenção também pode ser um anticor-po anti-MAdCAM compreendendo um ou mais regiões FR de quais-quer das seqüências acima mencionadas.

O anticorpo anti-MAdCAM usado na invenção tambémpode incluir um anticorpo anti-MAdCAM compreendendo uma dasseqüências de aminoácidos acima mencionadas em que uma oumais modificações foram feitas. Por exemplo, cisteinas noanticorpo, que podem ser reativas quimicamente, são substi-tuídas com um outro resíduo, tal como, sem limitação, alani-na ou serina. A substituição pode ser feita em uma CDR ouregião estrutural de um domínio variável ou no domínio cons-tante de um anticorpo.

Uma substituição de aminoácidos também pode serfeita para eliminar potenciais sítios proteolíticos no anti-corpo. Tais sítios podem ocorrer em uma CDR ou região estru-tural de um domínio variável ou no domínio constante de umanticorpo. A substituição de resíduos de cisteína e remoçãode sítios proteolíticos podem diminuir a heterogeneidade noproduto de anticorpo. Pares asparagina-glicina, que formampotenciais sítios de desaminação, podem ser eliminados pelaalteração de um ou de ambos os resíduos. Uma substituição deaminoácidos pode ser feita para adicionar ou para removerpotenciais sítios de glicosilação na região variável de umanticorpo usado na invenção.

A lisina C-terminal da cadeia pesada do anticorpoanti-MAdCAM usado na invenção pode ser clivado. As cadeiaspesada e leve dos anticorpos anti-MAdCAM podem opcionalmenteincluir uma seqüência sinal.

Vinte anticorpos monoclonais anti-MAdCAM humanosinibitórios preferidos para uso na invenção (1.7.2, 1.8.2,6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6,7.20.5, 7.26.4 e 9.8.2) são descritos em detalhe em WO2005/067620, incorporados aqui inteiramente como referência.

Classes e subclasses de anticorpos anti-MAdCAM

O anticorpo pode ser uma molécula de IgG, de IgM,de IgE,. de IgA ou de IgD. De preferência, o anticorpo é deuma classe IgG e é de uma subclasse, IgGi, IgG2, IgG3 ouIgG4. De maior preferência, o anticorpo anti-MAdCAM é de umasubclasse IgG2 ou IgG4. De maior preferência, o anticorpoanti-MAdCAM é da mesma classe e subclasse do anticorpo1.7.2, 1.8.2, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod que é IgG2, ou6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, ou e 9.8.2,que é IgG4 conforme descrito em WO 2005/067620.

A classe e subclasse de anticorpos anti-MAdCAM po-dem ser determinadas por qualquer método conhecido na técni-ca. Em geral, a classe e subclasse de um anticorpo podem serdeterminadas usando anticorpo que são específicos para umaclasse e subclasse particulares de anticorpo. Tais anticor-pos estão disponíveis comercialmente. ELISA, Western Blotassim como outras técnicas podem determinar a classe e sub-classe. Senão, a classe e subclasse podem ser determinadaspor seqüenciamento do todo ou de uma porção dos domíniosconstantes das cadeias pesada e/ou leve dos anticorpo, com-parando suas seqüências de aminoácidos com as seqüências deaminoácidos conhecidas de várias classes e subclasses de i-munoglobulinas e determinando a classe e subclasse dos anti-corpo como a classe que mostra a maior identidade de seqüência.

Seletividade por molécula e espécie

O anticorpo anti-MAdCAM usado na invenção demons-tra tanto seletividade por espécie como por molécula. 0 an-ticorpo anti-MAdCAM pode se ligar a MAdCAM humana, de cino-molgo ou canina. Outros anticorpos anticorpo anti-MAdCAM u-sados na invenção não se ligam a espécies de macaco do NovoMundo tal como um sagüi. Alguém pode determinas a seletivi-dade por espécie de um anticorpo anti-MAdCAM usando métodosbem conhecidos na técnica. Por exemplo, alguém pode determi-nar seletividade por espécie usando Western Blotr FACS,ELISA ou imuno-histoquímica. Em uma modalidade preferida,alguém pode determinar a seletividade por espécie usando i-muno-histoquímica.

Um anticorpo anti-MAdCAM usado na invenção que seliga especificamente a MAdCAM tem seletividade por MAdCAMsobre VCAM, fibronectina ou qualquer outro antigeno que épelo menos de 10 vezes, de preferência pelo menos 20, 30,40, 50, 60, 70, 80 ou 90 vezes, da maior preferência pelomenos 100 vezes. De preferência, o anticorpo anti-MAdCAM nãoexibe qualquer ligação apreciável a VCAM, fibronectina ouqualquer outro antigeno fora MAdCAM. Alguém pode determinara seletividade do anticorpo anti-MAdCAM por MAdCAM usandométodos bem conhecidos na técnica seguindo os ensinamentosda especificação. Por exemplo, alguém pode determinar a se-letividade usando Western Blotf FACS, ELISA ou imuno-histoquimica.

Afinidade de ligação de anticorpos anti-MAdCAM porMAdCAM

Os anticorpos anti-MAdCAM usados na invenção depreferência se ligam especificamente a MAdCAM com alta afi-nidade. Um anticorpo anti-MAdCAM usado na invenção se ligaespecificamente a MAdCAM com Kd de 3 χ IO-8M ou menos, comomedido por ressonância de plasma de superfície, tal como BI-Acore. De preferência, o anticorpo se liga especificamente aMAdCAM com Kd de 1 χ IO"8 ou menos ou 1 χ IO-9M ou menos. Demaior preferência, o anticorpo se liga especificamente aMAdCAM com Kd de 1 χ IO-10M ou menos. Um anticorpo usado nainvenção se liga especificamente a MAdCAM com Kd de 2,66 χIO-10M ou menos, 2,35 χ IO-11M ou menos ou 9 χ IO-12M ou menos.

De preferência, o anticorpo se liga especificamente a MAdCAMcom Kd de 1 χ IO-11M ou menos. De preferência, o anticorpo seliga especificamente a MAdCAM com consideravelmente o mesmoKd que um anticorpo selecionado de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5,7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod como descrito em WO 2005/067620.

Um anticorpo com "consideravelmente o mesmo Kd"que um anticorpo de referência tem um Kd que é ± 100 pM, depreferência ± 50 pM, de maior preferência ± 20 pM, ainda demaior preferência ± 10 pM, ± 5 pM ou ± 2 pM, comparado ao Kddo anticorpo de referência no mesmo experimento. De prefe-rência, o anticorpo se liga a MAdCAM com consideravelmente omesmo Kd que um anticorpo que compreende um ou mais domíniosvariáveis ou uma ou mais CDRs da um anticorpo selecionado de1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod como descrito emWO 2005/067620. De preferência, o anticorpo se liga a MAdCAMcom consideravelmente o mesmo Kd que um anticorpo que com-preende uma das seqüências de aminoácidos selecionada de SEQID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62,64, 66 ou 68 como descrito em WO 2005/067620 (com ou sem aseqüência sinal), ou o domínio variável deste. De preferên-cia, o anticorpo se liga a MAdCAM com consideravelmente omesmo Kd que um anticorpo que compreende uma ou mais CDRs daum anticorpo que compreende uma seqüência de aminoácidos se-lecionada de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20,22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52,54, 56, 58, 62, 64, 66 ou 68 como descrito em WO2005/067620.A afinidade de ligação de um anticorpo anti-MAdCAMpode ser determinada por qualquer método conhecido na técni-ca. Em uma modalidade, a afinidade de ligação pode ser medi-da por ELISAs competitivos, RIAs ou ressonância de plasma desuperfície. Em uma modalidade ainda mais preferida, a afini-dade de ligação e taxa de dissociação são medidas usando umBIAcore. Um exemplo de determinação de afinidade de ligaçãopode ser encontrado em WO 2005/067620.

Meia-vida de anticorpos anti-MAdCAM

O anticorpo anti-MAdCAM usando na invenção tem umameia-vida de pelo menos um dia in vítro ou in vivo. De pre-ferência, o anticorpo ou porção deste tem uma meia-vida depelo menos três dias. De maior preferência, o anticorpo ouporção deste tem uma meia-vida de quatro dias ou maior. Ain-da de maior preferência, o anticorpo ou porção deste tem umameia-vida de oito dias ou maior. 0 anticorpo ou porção deligação a antígeno deste usada na invenção também pode serderivada ou modificada tal que ela tenha uma meia-vida mai-or, conforme discutido abaixo. Em uma outra modalidade pre-ferida, o anticorpo pode conter mutações pontuais para au-mentar a meia-vida sérica, tal como descrito em WO 00/09560.

A meia-vida de anticorpo pode ser medida porquaisquer meios conhecidos por alguém que tem conhecimentoordinário da técnica. Por exemplo, a meia-vida de anticorpopode ser medida por Western blot, ELISA ou RIA por um perío-do de tempo apropriado. A meia-vida de anticorpo pode sermedida em qualquer animal apropriado, tal como um primata,por exemplo, macaco cinomolgo ou um humano.Identificação de epitopos de MAdCAM reconhecidospor anticorpo anti-MAdCAM

A invenção também provê o uso de um anticorpo an-ti-MAdCAM humano que se liga ao mesmo antigeno ou epitopoque um anticorpo anti-MAdCAM humano provido aqui. Adicional-mente, a invenção provê o uso de um anticorpo anti-MAdCAMhumano que compete ou compete de maneira cruzada com um an-ticorpo anti-MAdCAM humano. De preferência, o anticorpo an-ti-MAdCAM humano é 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2,6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-modou 7.26.4-modcomo descrito em WO 2005/067620. De preferência, o anticorpoanti-MAdCAM humano compreende um ou mais domínios variáveisou uma ou mais CDRs de um anticorpo selecionado de 1.7.2,1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1,7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. De preferência, o an-ticorpo anti-MAdCAM humano compreende uma das seqüências deaminoácidos selecionada de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42,44, 46, 48, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 66 ou 68 como descritoem WO 2005/067620 (com ou sem a seqüência sinal), ou um do-mínio variável deste. De preferência, o anticorpo anti-MAdCAM humano compreende uma ou mais CDRs de um anticorpoque compreende uma das seqüências de aminoácidos selecionadade SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 52, 54, 56,58, 62, 64, 66 ou 68 como descrito em WO 2005/067620.Alguém pode determinar se um anticorpo anti-MAdCAMse liga ao mesmo antigeno que um outro anticorpo anti-MAdCAMusando uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Porexemplo, alguém pode usar um anticorpo anti-MAdCAM conhecidopara capturar o antigeno, eluir o antigeno do anticorpo an-ti-MAdCAM e então determinar se o anticorpo teste se ligaráao antigeno eluido. Alguém pode determinar se um anticorpocompete com um anticorpo anti-MAdCAM pela ligação do anti-corpo anti-MAdCAM a MAdCAM sob condições saturadas e entãomedir a habilidade do anticorpo teste em se ligar a MAdCAM.Se o anticorpo teste é capaz de se ligar à MAdCAM ao mesmotempo em que um anticorpo anti-MAdCAM, então o anticorpoteste se liga a um epitopo diferente que o anticorpo anti-MAdCAM. Entretanto, se o anticorpo teste não for capaz de seligar à MAdCAM ao mesmo tempo, então o anticorpo teste com-pete com o anticorpo anti-MAdCAM humano. Este experimentopode ser realizado usando ELISA, ou ressonância de plasma emsuperfície ou, de preferência, BIAcore. Para testar se umanticorpo anti-MAdCAM compete de maneira cruzada com um ou-tro anticorpo anti-MAdCAM, alguém pode usar o método de com-petição descrito acima em duas direções, isto é, determinan-do se o anticorpo conhecido bloqueia o anticorpo teste e vi-ce-versa.

Uso de gene de cadeia leve e pesada

A invenção também provê o uso de um anticorpo an-ti-MAdCAM que compreende uma região variável de cadeia levecodificada por um gene κ humano. De preferência, a regiãovariável de cadeia leve é codificada por uma família gênica018, 012, Β3, Α26, Α3, Α2 de Vk humana. De preferência, acadeia leve compreende não mais que onze, não mais que seisou não mais que onze três substituições de aminoácidos apartir da seqüência 018, 012, B3, A26, A3, A2 de Vk humanade linhagem germinativa. De preferência, as substituições deaminoácidos são substituições conservativas.

De preferência, a VL do anticorpo anti-MAdCAM con-tém as mesmas mutações, em relação à seqüência de aminoáci-dos de linhagem germinativa, que qualquer uma ou mais dasVLs de anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2,6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-moddescritos em WO 2005/067620. A invenção inclui o uso de umanticorpo anti-MAdCAM que utiliza os mesmos genes Vk humanoe Jk humano que um anticorpo exemplificado. 0 anticorpo podecompreender uma ou mais das mesmas mutações de linhagem ger-minativa que um ou mais anticorpos exemplificados, ou o an-ticorpo pode compreender substituições diferentes em uma oumais posições que um ou mais dos anticorpos exemplificados.

Por exemplo, a VL do anticorpo anti-MAdCAM pode conter umaou mais substituições de aminoácidos que são as mesmas da-quelas presentes no anticorpo 7.16.6 e uma outra substitui-ção de aminoácidos que é a mesma que a de anticorpo 7.26.4.Desta maneira, alguém pode misturar e parear característicasdiferentes de ligação de anticorpo a fim de alterar, por e-xemplo, a afinidade do anticorpo por MAdCAM ou sua taxa dedissociação do antígeno. As mutações podem ser feitas namesma posição daquelas encontradas em qualquer uma ou maisdas VLs de anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2,6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod, mas substituições de aminoácidos conservados são feitasem vez de usar o mesmo aminoácido. Por exemplo, se a substi-tuição de aminoácidos comparada com a linhagem germinativaem um dos anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2,6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-modé glutamato, alguém pode substituir conservativamente poraspartato. De maneira similar, se a substituição de aminoá-cidos é serina, alguém pode substituir conservativamente portreonina.

A cadeia leve do anticorpo anti-MAdCAM pode com-preender uma seqüência de aminoácidos que é a mesma que aseqüência de aminoácidos da VL de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5,7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.2 6.4-mod. A cadeia leve de preferência compreendeseqüências de aminoácidos que são as mesmas que as de regi-ões CDR da cadeia leve de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2,6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4,9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou7.2 6.4-mod. A cadeia leve pode compreender uma seqüência deaminoácidos com pelo menos uma região CDR da cadeia leve de1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. A cadeia leve po-de compreender seqüências de aminoácidos com CDRs de dife-rentes cadeias leves que usam os mesmos genes Vk e Jk. Depreferência, as CDRs de diferentes cadeias leves são obtidasde 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. De preferência, acadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos selecio-nada de SEQ ID NOS: 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, 32, 36, 40,44, 48, 54, 58, 62, 64, 66 ou 68 de WO 2005/067620 com ousem a seqüência sinal. De preferência, a cadeia leve compre-ende uma seqüência de aminoácidos codificada por uma seqüên-cia nucleotidica selecionada de SEQ ID NOS: 3, 7, 11, 15,19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 53, 61, 65 ou 67 de WO2005/067620 (com ou sem a seqüência sinal), ou uma seqüêncianucleotidica que codifica uma seqüência de aminoácidos quetem 1-11 inserções, deleções ou substituições de aminoácidosdai. De preferência, as substituições de aminoácidos sãosubstituições de aminoácidos conservados. O anticorpo ouporção deste pode compreender uma cadeia leve lambda.

A presente invenção também provê o uso de um anti-corpo anti-MAdCAM ou porção deste que compreende uma seqüên-cia de gene VH humano ou uma seqüência derivada de um geneVH humano. A seqüência de aminoácidos de cadeia pesada podeser derivada de uma família de gene 4-4, 3-33, 3-30, 3-23,3-21, 3-15, I-IB de VH humano. De preferência, a cadeia pe-sada compreende não mais que quinze, não mais que seis ounão mais que três alterações de aminoácidos a partir da se-qüência de gene 4-4, 3-33, 3-30, 3-23, 3-21, 3-15, 1-18 deVH humano de linhagem germinativa.

As SEQ ID NOS: 2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34,38, 42 e 46 divulgadas em WO 2005/067620 proveram as seqüên-cias de aminoácidos das cadeias pesadas completas de vinteanticorpos anti-MAdCAM para uso na invenção. Todas as SEQ IDNOs aqui referidas se relacionam às seqüências realmente di-vulgadas em WO 2005/067620.

De preferência, a VH do anticorpo anti-MAdCAM con-tém as mesmas mutações, em relação à seqüência de aminoáci-dos de linhagem germinativa, que qualquer uma ou mais dasVHs de anticorpos 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2,6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2,6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. Similar ao discutido acima, o anticorpo compreende umaou mais das mesmas mutações de linhagem germinativa que umou mais anticorpos exemplificados. 0 anticorpo também podecompreender substituições diferentes em uma ou mais das mes-mas posições que um ou mais dos anticorpos exemplificados.Por exemplo, a VH do anticorpo anti-MAdCAM pode conter umaou mais substituições de aminoácidos que são as mesmas da-quelas presentes no anticorpo 7.16.6 e uma outra substitui-ção de aminoácidos que é a mesma que a de anticorpo 7.26.4.

Desta maneira, alguém pode misturar e parear característicasdiferentes de ligação de anticorpo a fim de alterar, por e-xemplo, a afinidade do anticorpo por MAdCAM ou sua taxa dedissociação do antígeno. Uma substituição de aminoácidoscomparada com a linhagem germinativa pode ser feita na mesmaposição que uma substituição de linhagem germinativa comoencontrado em qualquer uma das VHs de anticorpo de referên-cia 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-rnod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod, mas a posição ésubstituída com um resíduo diferente, que é uma substituiçãoconservativa comparada com o anticorpo de referência.

De preferência, a cadeia pesada do anticorpo anti-MAdCAM usado na invenção compreende uma seqüência de aminoá-cidos que é a mesma que a seqüência de aminoácidos da VH de1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. De maior prefe-rência, a cadeia pesada compreende seqüências de aminoácidosque são as mesmas que as de regiões CDR da cadeia pesada de1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. De preferência, acadeia pesada pode compreende uma seqüência de aminoácidoscom pelo menos uma região CDR da cadeia pesada de 1.7.2,1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1,7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod, ou a cadeia pesada po-de compreender seqüências de aminoácidos com CDRs de dife-rentes cadeias pesadas. De preferência, as CDRs de diferen-tes cadeias pesadas são obtidas de 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2,6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5,7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-mod. De preferência, a cadeia pesada compreen-de uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOS:2, 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, 34, 42, 46, 52, 60 ou 64 de WO2005/067620 com ou sem a seqüência sinal. A cadeia pesadatambém pode compreender uma seqüência de aminoácidos codifi-cada por uma seqüência nucleotidica selecionada de SEQ IDNOS: 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 29, 33, 37, 41, 45, 51, 55, 59ou 63 de WO 2005/067620, ou uma seqüência nucleotidica quecodifica uma seqüência de aminoácidos que tem 1-15 inser-ções, deleções ou substituições de aminoácidos dai. As subs-tituições são de preferência substituições de aminoácidosconservados.

Ácidos nucléicos, vetores, células hospedeiras emétodos recombinantes para fazer anticorpo

Os ácidos nucléicos, vetores, células hospedeirase métodos recombinantes para fazer esses anticorpos são des-critos em WO 2005/067620.

Anticorpos derivados e marcados

Um anticorpo ou porção de anticorpo da invençãopode ser derivado ou ligado a uma outra molécula (por exem-pio, um outro peptideo ou proteína). Em geral, os anticorposou porções destes são derivados tal que a ligação a MAdCAMnão é afetada adversamente pela derivação ou marcação. Con-seqüentemente, os anticorpos e porções de anticorpo usadasna invenção destinam-se a incluir tanto formas intactas comomodificadas dos anticorpos anti-MAdCAM humanos descritos a-qui. Por exemplo, um anticorpo ou porção de anticorpo usadona invenção pode ser ligado funcionalmente (por acoplamentoquímico, fusão genética, associação não covalente ou de ou-tro modo) a uma ou mais outras entidades moleculares, talcomo um outro anticorpo (por exemplo, um anticorpo biespecí-fico ou um diacorpo), um agente de detecção, um agente cito-tóxico, um agente farmacêutico e/ou uma proteína ou peptídeoque pode mediar a associação do anticorpo ou porção de anti-corpo com uma outra molécula (tal como uma região de cernede estreptavidina ou um marcador de poli-histidina).

Um tipo de anticorpo derivado é produzido por re-ticulação de dois ou mais anticorpos (do mesmo tipo ou detipos diferentes, por exemplo, para criar anticorpos biespe-cíficos). Reticuladores adequados incluem aqueles que sãoheterobifuncionais, que têm dois grupos distintamente reati-vos separados por uma espaçador apropriado (por exemplo, és-ter m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) ou homobifun-cionais (por exemplo, suberato de dissuccinimidila). Taisligantes estão disponíveis a partir de Pierce Chemical Com-pany, Rockford, III.

Um outro tipo de anticorpo derivado é um anticorpomarcado. Agentes de detecção úteis com os quais um anticorpoou porção de anticorpo da invenção pode ser derivado incluemcompostos fluorescentes, incluindo fluoresceína, isotiocia-nato de fluoresceína, rodamina, cloreto de 5-dimetilamina-l-naftalenossulfonila, ficoeritrina, lantanídeo fósforos e se-melhantes. Um anticorpo também pode ser marcado com enzimasque são úteis para detecção, tal como peroxidase de rabane-te, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina, glicoseoxidase e semelhantes. Quando um anticorpo é marcado com umaenzima detectável, ele é detectada pela adição de reagentesadicionais que a enzima usa para produzir um produto de rea-ção que pode ser distinguido. Por exemplo, quando o agenteperoxidase de rabanete está presente, a adição de peróxidode hidrogênio e diamobenzidina leva a um produto de reaçãocolorido, que é detectável. Um anticorpo também pode sermarcado com biotina e detectado através de medição indiretade ligação de avidina ou estreptavidina. Um anticorpo podeser marcado com um agente magnético, tal como gadolinio. Umanticorpo também pode ser marcado com um epitopo polipeptí-dico pré-determinado reconhecido por um repórter secundário(por exemplo, seqüências de par de ziperes de leucina, sí-tios de ligação para anticorpos secundários, domínios de li-gação a metal, marcadores de epitopo). Em algumas modalida-des, marcadores são aderidos por braços espaçadores de vá-rios comprimentos para reduzir potencial impedimento estérico.

Um anticorpo anti-MAdCAM também pode ser marcadocom um aminoácido radiomarcado. 0 radiomarcador pode ser u-sado tanto para fins diagnósticos como terapêuticos. Por e-xemplo, o radiomarcador pode ser usado terapeuticamente comouma toxina para tecido doente ou tumores que expressam MAd-CAM. Exemplos de marcadores para polipeptídeos incluem, masnão estão limitados a, os seguintes radioisótopos ou radio-nucletos - H, C, N, S, Y, ic, ιη, ι, i.

Um anticorpo anti-MAdCAM também pode ser derivadocom um grupo químico tal como polietileno glicol (PEG), umgrupo metila ou etila, ou um grupo de carboidrato. Essasgrupos podem ser úteis para melhorar as características bio-lógicas do anticorpo, por exemplo, para aumentar a meia-vidasérica ou para aumentar a ligação tecidual. Esta metodologiatambém se aplicaria a quaisquer fragmentos de ligação a an-tigeno ou versões de anticorpos anti-MAdCAM.

Composições farmacêuticas e kits

Em um aspecto adicional, a invenção provê composi-ções compreendendo um anticorpo anti-MAdCAM humano inibitó-rio e métodos para tratar indivíduos com tais composições.

Em algumas modalidades, o indivíduo do tratamento é humano.

Em outras modalidades, o indivíduo é um indivíduo veteriná-rio. Em algumas modalidades, o indivíduo veterinário é umcachorro ou primata não humano.

O tratamento pode envolver a administração de umou mais anticorpos monoclonais anti-MAdCAM inibitórios, oufragmentos de ligação a antígeno destes, sozinhos ou com umveículo farmaceuticamente aceitável. Anticorpos anti-MAdCAMinibitórios e composições os compreendendo, podem ser admi-nistrados em combinação com um ou mais de outros agentes te-rapêuticos, diagnósticos ou profiláticos. Agentes terapêuti-cos adicionais incluem agentes antiinflamatórios ou imunomo-dulatórios. Esses agentes incluem, mas não estão limitadosa, os corticosteróides tópicos e orais tal como prednisolo-na, metilprednisolona, NCX-1015 ou budenosídeo; os aminosa-licilatos tal como mesalazina, olsalazina, balsalazida ouNCX-4 56; a classe de imunomoduladores tal como azatioprina,β-mercaptopurina, metotrexato, ciclosporina, FK506, IL-IO(Ilodecakin), IL-Il (Oprelevkin), IL-12, antagonistas deMIF/CD74, antagonistas de CD40, tal como TNX-100/5-D12, an-tagonistas de OX40L, GM-CSF, pimecrolimo ou rapamicina; aclasse de agentes anti-TNFa tal como infliximab, adalimumab,CDP-870, onercept, etanercept; a classe de agentes antiin-flamatórios, tal como inibidores de PDE-4 (roflumilast,etc), inibidores de TACE (DPC-333, RDP-58, etc) e inibidoresICE (VX-740, etc) assim como antagonistas de receptor de IL-2, tal como da daclizumab, a classe de antagonistas de molé-cula de adesão seletiva, tal como natalizumab, MLN-02 ou a-licaforsen, classes de agentes analgésicos tal como, mas nãolimitando a, inibidores de COX-2, tal como rofecoxib, valde-coxib, celecoxib, moduladores de canal (α2δ) sensível a vol-tagem tipo P/Q, tal como gabapentina e pregabalina, antago-nistas de receptor NK-1, moduladores de receptor canabinóidee agonistas de receptor opióide, assim como agentes antineo-plásicos, antitumorais, antiangiogênicos ou quimioterapêuti-cos. Tais agentes adicionais podem ser incluídos na mesmacomposição ou administrados separadamente.

Conforme aqui utilizado, "veículo farmaceuticamen-te aceitável" significa qualquer e todos os solventes, meiosde dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e anti-fúngicos, agentes isotônicos e de aumento ou retardo de ab-sorção e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis.

Alguns exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis sãoágua, salina, salina tamponada com fosfato, tampão de aceta-to com cloreto de sódio, dextrose, glicerol, polietilenoglicol, etanol e semelhantes, assim como combinações destes.

Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos,por exemplo, açúcares, polialcoois tais como manitol, sorbi-tol ou cloreto de sódio na composição. Exemplos adicionaisde substâncias farmaceuticamente aceitáveis são agentes ten-soativos, agentes umidificantes ou quantidade menores desubstâncias auxiliares tal como de agentes umidificantes ouemulsificantes, conservantes ou tampões, que melhoram a vidade prateleira ou eficácia do anticorpo.

As composições usadas nesta invenção podem estarem uma variedade de formas, por exemplo, formas de dosagemliquida, semi-sólida e sólida, tal como soluções líquidas(por exemplo, soluções injetáveis e infusionáveis), disper-sões ou suspensões, comprimidos, pílulas, massa liofilizada,pós secos, lipossomos e supositórios. A forma preferida de-pende do modo de destino de administração e aplicação tera-pêutica. Composições preferidas típicas estão na forma desoluções injetáveis ou infusionáveis, tal como composiçõessimilares àquelas usadas para imunização passiva de humanos.O modo preferido de administração é parenteral (por exemplo,intravenoso, subcutâneo, intraperitoneal, intramuscular, in-tradérmico). Em uma modalidade preferida, o anticorpo é ad-ministrado por infusão ou injeção intravenosa. Em uma outramodalidade preferida, o anticorpo é administrado por injeçãointramuscular, intradérmica ou subcutânea. Se desejado, oanticorpo pode ser administrado pelo uso de uma bomba, ene-ma, supositório ou reservatório indwelling ou semelhante.

Composições terapêuticas tipicamente devem ser es-téreis e estáveis sob condições de fabricação e estocagem. Acomposição pode ser formulada como uma solução, massa liofi-lizada, pó seco, microemulsão, dispersão, lipossomo ou outraestrutura encomendada adequada para alta concentração dedroga. Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas pe-la incorporação do anticorpo anti-MAdCAM na quantidade ne-cessária em um solvente apropriado com um ou uma combinaçãode ingredientes enumerados acima, conforme necessário, se-guidas por esterilização. No caso de pós estéreis para apreparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos pre-feridos de preparação são secagem a vácuo e secagem por con-gelamento que rende um pó do ingrediente ativo mais qualqueringrediente adicional desejado a partir de uma solução pre-viamente estéril desse. Geralmente, dispersões são prepara-das pela incorporação do composto ativo em um veiculo esté-ril que contém um meio de dispersão básico e os outros in-gredientes necessários a partir daqueles enumerados acima.

As características desejadas de uma solução podem ser manti-das, por exemplo, pelo uso de agentes tensoativos e o tama-nho de partícula requerido no caso de dispersão pelo uso deagentes tensoativos, fosfolipídeos e polímeros. A absorçãoprolongada de composições injetáveis podem ser provocada pe-la inclusão na composição de um agente que retarde a absor-ção, por exemplo, sais de monoestearato, materiais poliméri-cos, óleos e gelatina.

Os anticorpos da presente invenção podem ser admi-nistrados por uma variedade de métodos conhecidos na técni-ca, embora para muitas aplicações terapêuticas, a via/modode administração preferido seja infusão subcutânea, intra-muscular, intradérmica ou intravenosa. Como será apreciadopelo técnico versado, a via e/ou modo de administração vari-ará dependendo dos resultados desejados.

Em certas modalidades, as composições de anticorpopodem ser preparadas com um veiculo que protegerá o anticor-po contra liberação rápida, tal como uma formulação de Iibe-ração controlada, incluindo implantes, emplastros transdér-micos e sistemas de distribuição microencapsulada. Polímerosbiodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tal comoacetato de etileno vinila, polianidretos, ácido poliglicóli-co, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático. Muitos mé-todos para a preparação de tais formulações são patenteadosou geralmente conhecidos por aqueles versados na técnica.Veja, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug De-livery Systems (J. R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc.,New York (1978) ).

Em certas modalidades, um anticorpo anti-MAdCAM dainvenção pode ser administrado oralmente, por exemplo, comum diluentes inerte ou um veículo comestível assimilável. 0composto (e outros ingredientes, se desejado) também podemser revestidos por uma cápsula gelatinosa dura ou mole, com-primidos em comprimidos, ou incorporados diretamente na die-ta do indivíduo. Para administração terapêutica oral, os an-ticorpos anti-MAdCAM podem ser incorporados com excipientese usados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bu-cais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes,hóstias e semelhantes. Para administrar um composto da in-venção por outra administração fora a parenteral, pode sernecessário revestir o composto com, ou co-administrar o com-posto com, um material para prevenir sua inativação.As composições da invenção podem incluir uma"quantidade terapeuticamente eficaz" ou uma "quantidade pro-filaticamente eficaz" de um anticorpo ou porção de ligação aantigeno da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente efi-caz" se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e porperiodos de tempo necessários, para atingir o resultado te-rapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficazdo anticorpo ou porção de anticorpo pode variar de acordocom fatores tal como o estado da doença, idade, sexo, e pesodo indivíduo e a habilidade do anticorpo ou porção de anti-corpo para elicitar uma resposta desejada no indivíduo. Umaquantidade terapeuticamente eficaz também é aquela em quequaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do anticorpo, ouporção de anticorpo, são superados pelos efeitos terapeuti-camente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente eficaz"se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por perío-dos de tempo necessários, para atingir o resultado profilá-tico desejado. Tipicamente, desde que uma dose profiláticaseja usada em indivíduos antes de ou em estágio precoce dadoença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor quea quantidade terapeuticamente eficaz.

Regimes de dosagens podem ser ajustados para pro-ver a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta te-rapêutica ou profilática). Por exemplo, um único bolus podeser administrado, várias doses divididas podem ser adminis-tradas durante o tempo ou a dose pode ser reduzida ou aumen-tada proporcionalmente como indicado pelas exigências da si-tuação terapêutica. É especialmente vantajoso formular com-posições parenterais na forma de unidade de dosagem para fa-cilitar a administração e uniformidade de dosagem. A formade unidade de dosagem como aqui utilizada se refere a unida-des discretas fisicamente adequadas para dosagens unitáriaspara os indivíduos mamíferos a serem tratados; cada unidadecontendo uma quantidade pré-determinada de composto ativocalculada para produzir o efeito terapêutico desejado em as-sociação com o veículo farmacêutico requerido. A especifica-ção para as formas de unidade de dosagem da invenção são di-tadas por e diretamente dependentes (a) das característicasúnicas do anticorpo anti-MAdCAM ou porção deste e do efeitoterapêutico ou profilático particular a ser obtido e (b) daslimitações inerentes da técnica de fazer compostos como umanticorpo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

Uma faixa exemplar, não limitante para uma quanti-dade terapeuticamente. ou profilaticamente eficaz de um anti-corpo ou porção de anticorpo da invenção é de 0, 025 até 50mg/kg, de maior preferência 0,1 até 50 mg/kg, de maior pre-ferência 0,1-25, 0,1 até 10 ou 0,1 até 3 mg/kg. Em algumasmodalidades, a formulação contém 5 mg/mL de anticorpo em umtampão de acetato de sódio 20 mM, pH 5,5, NaCl 140 mM e po-lissorbato 80 0,2 mg/mL. Em outras modalidades, a formulaçãocontém 10 mg/mL de anticorpo em acetato de sódio triidratado2,73 mg/mL, manitol 45 mg/mL, EDTA dissódico diidratado 0,02mg/mL, polissorbato 80 0,2 mg/mL ajustado a pH 5,5 com ácidoacético glacial, por exemplo, para uso intravenoso. Em ou-tras modalidades, uma formulação contém 50 mg/mL de anticor-po, acetato de sódio triidratado 2,73 mg/mL, manitol 45mg/mL, EDTA dissódico diidratado 0,02 mg/mL, polissorbato 800,4 mg/mL ajustado a pH 5,5 com ácido acético glacial, porexemplo, para uso subcutâneo ou intradérmico. É para notar-se que valores de dosagem podem variar com o tipo e gravida-de da condição a ser aliviada. Entenda-se adicionalmente quepara qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem espe-cíficos devem ser ajustados com o tempo de acordo com a ne-cessidade individual e o julgamento profissional da pessoaque administra ou supervisiona a administração das composi-ções e que faixas de dosagem expostas aqui são exemplaresapenas e não se destinam a limitar o âmbito ou prática dacomposição reivindicada.

Em uma modalidade, o anticorpo é administrado emuma formulação como uma solução aquosa estéril que tem um pHque varia de cerca de 5,0 até cerca de 6,5 e compreendendode cerca de 1 mg/mL até cerca de 200 mg/mL de anticorpo, decerca de 1 milimolar até cerca de 100 milimolar de tampão dehistidina, de cerca de 0,01 mg/mL até cerca de 10 mg/mL depolissorbato 80, de cerca de 100 milimolar até cerca de 400milimolar de trealose e de cerca de 0,01 milimolar até cercade 1,0 milimolar de EDTA dissódico diidrato.

Um outro aspecto da presente invenção provê kitscompreendendo um anticorpo anti-MAdCAM ou porção de anticor-po da invenção ou uma composição compreendendo tal anticor-po. Um kit pode incluir, além do anticorpo ou composição,agentes diagnósticos ou terapêuticos. Um kit também pode in-cluir instruções para uso em um método diagnóstico ou tera-pêutico. Em uma modalidade preferida, o kit inclui o anti-corpo ou uma composição o compreendendo e um agente diagnós-tico que pode ser usado em um método descrito abaixo. Em umaoutra modalidade preferida, o kit inclui o anticorpo ou umacomposição que o compreende e um ou mais agentes terapêuti-cos que podem ser usados em um método descrito abaixo.

Terapia gênica

Os anticorpos usados na invenção podem ser admi-nistrados a um paciente em necessidade destes através de te-rapia gênica. A terapia pode ser in vivo ou ex vivo. Em umamodalidade preferida, moléculas de ácido nucléico codifican-do tanto uma cadeia pesada como uma cadeia leve são adminis-tradas a um paciente. Em uma modalidade mais preferida, asmoléculas de ácido nucléico são administradas tal que elassejam integradas estavelmente em cromossomos de células Bporque essas células são especializadas em produzir anticor-pos. Em uma modalidade preferida, células B precursoras sãotransfectadas ou infectadas ex vivo e re-transplantadas emum paciente em necessidade destas. Em uma outra modalidade,células B precursoras ou outras células são infectadas invivo usando um virus recombinante conhecido por infectar otipo celular de interesse. Vetores típicos para terapia gê-nica incluem lipossomos, plasmídeos e vetores virais. Veto-res virais exemplares são retrovírus, adenovírus e vírus a-deno-associados. Após infecção in vivo ou ex vivo níveis deexpressão de anticorpo podem ser monitorados tomando uma a-mostra do paciente tratado e usando qualquer imunoensaio co-nhecido na técnica ou discutido aqui.

Em uma modalidade preferida, o método de terapiagênica compreende as etapas de administrar uma molécula deácido nucléico isolada codificando a cadeia pesada ou umaporção de ligação a antigeno desta de um anticorpo anti-MAdCAM e expressar a molécula de ácido nucléico. Em uma ou-tra modalidade, o método de terapia gênica compreende as e-tapas de administrar uma molécula de ácido nucléico isoladacodificando a cadeia leve ou uma porção de ligação a antige-no desta de um anticorpo anti-MAdCAM e expressar a moléculade ácido nucléico. Em um método mais preferido, o método deterapia gênica compreende as etapas de administrar uma molé-cula de ácido nucléico isolada codificando a cadeia pesadaou uma porção de ligação a antigeno desta e uma molécula deácido nucléico isolada codificando a cadeia leve ou uma por-ção de ligação a antigeno desta de um anticorpo anti-MAdCAMda invenção e expressar as moléculas de ácido nucléico. 0método de terapia gênica também pode compreender a etapa deadministrar um outro agente antiinflamatório ou imunomodula-tório.

Inibiçâo de adesão dependente de a4p7/MAdCAM poranticorpo anti-MAdCAM

A invenção também provê o uso de um anticorpo an-ti-MAdCAM que se liga a MAdCAM e inibe a ligação e adesão decélulas que portam integrina_a4p7 a MAdCAM ou outros ligan-tes cognatos, tal como L-selectina, a MAdCAM. Em uma modali-dade preferida, a MAdCAM é humana e está na forma solúvel oué expressada na superfície de uma célula. Em uma outra moda-lidade preferida, o anticorpo anti-MAdCAM é um anticorpo hu-mano. Em uma outra modalidade, o anticorpo ou porção desteinibe a ligação entre α4β7 e MAdCAM com um valor de IC50 denão mais que 50 nM. Em uma modalidade preferida, o valor deIC50 não é mais que 5 nM. Em uma modalidade mais preferida,os valores de IC50 não são menos que 5 nM. Em uma modalidademais preferida, o valor de IC50 não é menos que 0,05 μς/πΛ,0,04 ug/mL ou 0,03 μg/mL. Em uma outra modalidade preferida,o valor de IC50 é menos que 0,5 pg/mL, 0,4 μg/mL ou 0,3μg/mL. 0 valor de IC50 pode ser medido por qualquer métodoconhecido na técnica. Tipicamente, um valor de IC5o pode sermedido por ELISA ou ensaio de adesão. Em uma modalidade pre-ferida, o valor de IC50 é medido por ensaio de adesão usandocélulas ou tecido que expresse MAdCAM de maneira nativa oucélulas ou tecido que tenha sido engenheirado para express-sar MAdCAM.

A menos que definido de outro modo aqui, termoscientíficos e técnicos usados junto com a presente invençãoterão os significados que são comumente entendidos por aque-les de conhecimento ordinário da técnica. Adicionalmente, amenos que requerido de outro modo pelo contexto, termos sin-gulares incluirão plurais e termos plurais incluirão o sin-gular. Geralmente, nomenclaturas usadas junto com, e técni-cas de, cultura de células e tecidos, biologia molecular,imunologia, microbiologia, genética e hibridização e químicade ácidos nucléicos e proteínas aqui descritas são aquelasbem conhecidas e comumente usadas na técnica. Os métodos etécnicas da presente invenção são geralmente realizados deacordo com métodos convencionais bem conhecidos na técnica ecomo descritos em várias referências gerais e mais específi-cas que são citadas e discutidas durante toda a presente es-pecificação a menos que indicado de outro modo. Veja, porexemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY (1989) e Ausubel et al., Current Protocolsin Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) eHarlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1990), quesão incorporados aqui como referência. Reações enzimáticas etécnicas de purificação são realizadas de acordo com especi-ficações do fabricante, como comumente realizado na técnicaou como aqui descrito. Técnicas padrões são usadas para sín-teses químicas, análises químicas, preparação, formulação edistribuição farmacêutica, e tratamento de pacientes.

O termo "polipeptídeo" abrange proteínas nativasou artificiais, fragmentos protéicos e análogos polipeptídi-cos de uma seqüência protéica. Um polipeptídeo pode ser mo-nomérico ou polimérico.

O termo "proteína isolada" ou "polipeptídeo isola-do" é uma proteína ou polipeptídeo que em virtude de sua o-rigem ou fonte de derivação (1) não está associado com com-ponentes naturalmente associados que acompanham-no em seuestado nativo, (2) é livre de outras proteínas da mesma es-pécie, (3) é expressado por uma célula de uma espécie dife-rente, ou (4) não ocorre na natureza. Assim, um polipeptídeoque é sintetizado quimicamente ou sintetizado em um sistemacelular diferente da célula da qual ele se origina natural-mente estará "isolado" de seus componentes naturalmente as-sociados. Uma proteína também pode ser conferida considera-velmente livre de componentes naturalmente associados porisolamento usando técnicas de purificação de proteína bemconhecidas na técnica.

Uma proteína ou polipeptídeo é "consideravelmentepuro", "consideravelmente homogêneo" ou "consideravelmentepurificado" quando pelo menos cerca de 60 até 75% de uma a-mostra exibe uma única espécie de polipeptídeo. O polipeptí-deo ou proteína pode ser monomérico ou multimérico. Um poli-peptídeo ou proteína consideravelmente pura tipicamente com-preenderá cerca de 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% p/p de uma a-mostra de proteína, mais geralmente cerca de 95% e de prefe-rência terá mais de 99% de pureza. A pureza ou homogeneidadeprotéica pode ser indicada por vários meios bem conhecidosna técnica, tal como eletroforese em gel de poliacrilamidade uma amostra protéica, seguida por visualização de umabanda polipeptídica única ao corar o gel com um corante bemconhecido na técnica. Para certas finalidades, maior resolu-ção pode ser provida pelo uso de HPLC ou de outros meios bemconhecidos na técnica para purificação.

O termo "fragmento polipeptídico" conforme aquiutilizado se refere a um polipeptídeo que tem uma deleçãoamino-terminal e/ou carbóxi-terminal, mas onde a seqüênciade aminoácidos remanescente é idêntica às posições corres-pondentes na seqüência que ocorre naturalmente. Em algumasmodalidades fragmentos possuem pelo menos 5, 6, 8 ou 10 ami-noácidos de comprimento. Em outras modalidades, fragmentospossuem pelo menos 14 aminoácidos de comprimento, de maiorpreferência pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, geral-mente pelo menos 50 aminoácidos de comprimento, ainda demaior preferência pelo menos 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 a-minoácidos de comprimento.

O termo "análogo polipeptídico" conforme aqui uti-lizado se refere a um polipeptideo que compreende um segmen-to de pelo menos 25 aminoácidos que tem identidade conside-rável com uma porção de uma seqüência de aminoácidos e quetem pelo menos uma das seguintes propriedades: (1)ligaçãoespecifica a MAdCAM sob condições de ligação adequadas, (2)habilidade para inibir a ligação de integrina α4βν e/ou L-selectina a MAdCAM, ou (3) habilidade para reduzir a expres-são em superfície celular de MAdCAM in vitro ou in vivo. Ti-picamente, análogos peptídicos compreendem uma substituiçãode aminoácido conservativa (ou inserção ou deleção) em rela-ção à seqüência que ocorre naturalmente. Análogos tipicamen-te possuem pelo menos 20 aminoácidos de comprimento, de pre-ferência pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 ou 200 ami-noácidos de comprimento ou maior e pode freqüentemente sertão longo quanto um polipeptideo que ocorre naturalmentecompleto.

Uma "imunoglobulina" é uma molécula tetramérica.

Em uma imunoglobulina que ocorre naturalmente, cada tetrâme-ro é composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptí-dicas, cada par tendo uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) euma "pesada" (cerca de 50-70 kDa) . A porção amino-terminalde cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100até 110 ou mais aminoácidos responsáveis primariamente peloreconhecimento de antigeno. A porção carbóxi-terminal de ca-da cadeia define a região constante responsável primariamen-te pela função efetora. As cadeias leves humanas são classi-ficadas como cadeias leves κ e λ. Cadeias pesadas são clas-sifiçadas como μ, δ, γ, α, ou ε e definem o isotipo do anti-corpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. Nascadeias leve e pesada, as regiões variáveis e constantes sãounidas por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoáci-dos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" decerca de 10 ou mais aminoácidos. Veja geralmente, Fundamen-tal Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press,NY (1989)) (incorporada como referência em sua totalidadepara todos os fins) . As regiões variáveis de cada par de ca-deia leve/pesada formam o sitio de ligação de anticorpo talque uma imunoglobulina intacta tem dois sítios de ligação.

Cadeias de imunoglobulina exibem a mesma estruturageral de regiões estruturais conservadas (FR) unidas portrês regiões variáveis, também . chamadas regiões determinan-tes de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeiasde cada par são alinhadas pelas regiões estruturais paraformam um sítio de ligação específico a epítopo. Da extremi-dade N-terminal até a C-terminal, tanto a cadeia leve como apesada compreendem os domínios FRl, CDR1, FR2, CDR2, FR3,CDR3 e FR4. A atribuição de aminoácidos a cada domínio é deacordo com as definições de Kabat, Sequences of Proteins ofImmunological Interest (National Institutes of Health, Be-thesda, Md (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk, J Mol Biol196: 901-917 (1987); Chothia et al. , Nature 342: 877-883(1989), cada uma das quais está incorporada aqui como refe-rência em sua totalidade.

Um "anticorpo" se refere a uma imunoglobulina in-tacta ou a uma porção de ligação a antigeno deste que compe-te com o anticorpo intacto por ligação especifica. Em algu-mas modalidades, um anticorpo é uma porção de ligação a an-tigeno deste. Porções de ligação a antigeno podem ser produ-zidas por técnicas de DNA recombinante ou por clivagem enzi-mática ou química de anticorpos intactos. Porções de ligaçãoa antigeno incluem, inter alia, fragmentos Fab, Fab' ,F(ab')2, Fv, dAb e de região determinante de complementari-dade (CDR), anticorpos de cadeia única (scFv), anticorposquiméricos, diacorpos e polipeptídeos que contém pelo menosuma porção de uma imunoglobulina que e suficiente para con-ferir ligação a antigeno específica ao polipeptídeo. Umfragmento Fab é um fragmento monovalente que consiste dosdomínios VL, VH, CL e CHI; um fragmento F(ab)2 é um fragmen-to bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados poruma ponte dissulfeto na região de dobra; um fragmento Fdconsiste nos domínios VH e CHI; um fragmento Fv consiste nosdomínios VL e VH de um único braço de um anticorpo; e umfragmento dAb (Ward et al. , Nature 341: 544-546 (1989)) con-siste em um domínio VH.

Conforme aqui utilizado, um anticorpo que é refe-rido como, por exemplo, 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2,6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4 ou9.8.2, é um anticorpo monoclonal que é produzido pelo hibri-doma do mesmo nome. Por exemplo, anticorpo 1.7.2 é produzidopelo hibridoma 1.7.2. Um anticorpo que é referido como6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod ou 7.26.4-modé um anticorpo monoclonal cuja seqüência foi modificada apartir de seu parente correspondente por mutagênese sítio-dirigida.

Um anticorpo de cadeia única (scFv) é um anticorpoem que regiões VL e VH são pareados para formar uma moléculamonovalente através de um ligante sintético que permite aeles serem feitos como uma cadeia protéica única (Bird etal., Science 242: 423-426 (1988) e Huston et al., Proc NatlAcad Sci USA 85: 5879-5883 (1988)). Diacorpos são anticorposbivalentes, biespecificos em que domínios VL e VH são ex-pressados em uma única cadeia polipeptídica, mas usando umligante que é muito curto para permitir pareamento entre osdois domínios na mesma cadeia, forçando desse modo que osdomínios se pareiem com domínios complementares de uma outracadeia e criando dois sítios de ligação a antígeno (veja,por exemplo, Holliger, P. et al., Proc Natl Aead Sci USA 90:6444-6448 (1993) e Poljak, R. J. et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)). Uma ou mais CDRs de um anticorpo da invençãopodem ser incorporadas em uma molécula covalentemente ou nãocovalentemente para torná-la uma imunoadesina que se ligaespecificamente a MAdCAM. Uma imunoadesina pode incorporara(s) CDR(s) como parte(s) de uma cadeia polipeptídica maior,pode ligar covalentemente a(s) CDR(s) a uma outra cadeia po-lipeptídica, ou pode incorporar a(s) CDR(s) não covalente-mente. As CDRs permitem que a imunoadesina se ligue especi-ficamente a um antígeno particular de interesse.Um anticorpo pode ter um ou mais sítios de liga-ção. Se houver mais de um sítio de ligação, os sítios de li-gação podem ser idênticos um ao outro ou podem ser diferen-tes. Por exemplo, uma imunoglobina que ocorre naturalmentetem dois sítios de ligação idênticos, um anticorpo de cadeiaúnica ou fragmento Fab tem um sítio de ligação, enquanto umanticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" (diacorpo) temdois sítios de ligação diferentes.

Um "anticorpo isolado" é um anticorpo que (1) nãoestá associado com componentes naturalmente associados, in-cluindo outros anticorpos associados naturalmente, que acom-panham-no em seu estado nativo, (2) é livre de outras prote-ínas da mesma espécie, (3) é expressado por uma célula deuma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza. Exem-pios de anticorpos isolados incluem um anticorpo anti-MAdCAMque foi purificado por afinidade usando MAdCAM, um anticorpoanti-MAdCAM que foi produzido por um hibridoma ou outra li-nhagem celular in vitro e um anticorpo anti-MAdCAM humanoderivado de um mamífero transgênico ou planta.

Conforme aqui utilizado, o termo "anticorpo huma-no" significa um anticorpo em que as seqüências de regiãovariável e constante são seqüências humanas. 0 termo abrangeanticorpos com seqüências derivadas de genes humanos, masque foram alterados, por exemplo, para diminuir possível i-munogenicidade, aumentar afinidade, eliminar cisteínas ousítios de glicosilação que podem causar enovelamento indese-jado, etc. 0 termo abrange tais anticorpos produzidos recom-binantemente em células não humanas que podem conferir gli-cosilação não típica de células humanas. 0 termo também a-brange anticorpos que foram criados em um camundongo trans-gênico que compreende alguma ou todos os Ioci de cadeia pe-sada e leve de imunoglobulina humana.

Em um aspecto, a invenção provê um anticorpo huma-nizado. Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado é umanticorpo que é derivado de uma espécie não humana, em quecertos aminoácidos nos domínios estruturais e constantes dascadeias pesada e leve foram mutados para evitar ou liquidaruma resposta imune em humanos. Em algumas modalidades, umanticorpo humanizado pode ser produzido pela fusão dos domí-nios constantes de um anticorpo humano com os domínios vari-áveis de uma espécie não humana. Exemplos de como fazer an-ticorpos humanizados podem ser encontrados em Patentes dosEstados Unidos Nos. 6.054.297, 5.886.152 e 5.877.293. Em al-gumas modalidades, um anticorpo anti-MAdCAM humanizado dainvenção compreende a seqüência de aminoácidos de uma oumais regiões estruturais de um ou mais anticorpo anti-MAdCAMda invenção.

Em um outro aspecto, a invenção inclui o uso de um"anticorpo quimérico". Em algumas modalidades o anticorpoquimérico se refere a um anticorpo que contém uma ou maisregiões de um anticorpo e uma ou mais regiões de um ou maisoutros anticorpos. Em uma modalidade preferida, uma ou maisdas CDRs são derivadas de um anticorpo anti-MAdCAM humano dainvenção. Em uma modalidade mais preferida, todas as CDRssão derivadas de um anticorpo anti-MAdCAM humano da inven-ção. Em uma outra modalidade preferida, as CDRs de mais deum anticorpo anti-MAdCAM humano da invenção são misturadas epareadas em um anticorpo quimérico. Por exemplo, um anticor-po quimérico pode compreender uma CDRl de uma cadeia leve deum primeiro anticorpo anti-MAdCAM humano pode ser combinadacom CDR2 e CDR3 da cadeia leve de um segundo anticorpo anti-MAdCAM humano e as CDRs da cadeia pesada podem ser derivadosde um terceiro anticorpo anti-MAdCAM. Adicionalmente, as re-giões estruturais podem ser derivadas de um dos mesmos anti-corpos anti-MAdCAM, de um ou mais anticorpos diferentes, talcomo um anticorpo humano, ou de um anticorpo humanizado.

Um "anticorpo de neutralização", "um anticorpo i-nibitório" ou anticorpo antagonista é um anticorpo que inibea ligação de célula que expressam α4β7, ou qualquer outroligante cognato ou células que expressam o ligante cognato,a MAdCAM em pelo menos cerca de 20%. Em uma modalidade pre-ferida, o anticorpo reduz, inibe a ligação de integrina α4β7ou células que expressam α4β7 a MAdCAM em pelo menos 40%, demaior preferência em 60%, ainda de maior preferência em 80%,85%, 90%, 95% ou 100%. A redução de ligação pode ser medidapor quaisquer meios conhecidos por alguém versado na técni-ca, por exemplo, como medido em um ensaio de ligação compe-titiva in vitro. Um exemplo de medição da redução na ligaçãode células que expressam α4β7 a MAdCAM é apresentada no E-xemplo I.

Fragmentos ou análogos de anticorpos podem serprontamente preparados por aqueles de conhecimento ordinárioda técnica seguindo os ensinamentos desta especificação. Ex-tremidades amino- e carbóxi-terminais de fragmentos ou aná-logos ocorrem próximos a limites de domínios funcionais. Do-mínios estruturais e funcionais podem ser identificados porcomparação dos dados de seqüência nucleotídica e/ou de ami-noácidos com banco de dados de seqüência públicos ou de pro-prietários. De preferência, métodos de comparação computado-rizada são usados para identificar motivos de seqüência oudomínios de conformação protéica previstos que ocorrem emoutras proteínas de estrutura e/ou função conhecidas. Méto-dos para identificar seqüências de proteínas que enovelam emuma estrutura tridimensional conhecida são conhecidos (Bowieet al., Science 253: 164 (1991)).

O termo "KGff" se refere à constante para dissocia-ção de um anticorpo do complexo antígeno/anticorpo.

O termo "Kd" se refere a constante de dissociaçãode uma interação antígeno/anticorpo particular. Diz-se queum anticorpo se liga a um antígeno quando a constante dedissociação é < 1 μΜ, de preferência ^ 100 nM e da maiorpreferência 10 nM.

0 termo "epítopo" inclui qualquer determinanteprotéico capaz de ligação específica a uma imunoglobulina oureceptor de célula T ou de interagir de outro modo com umamolécula. Determinantes de epítopo geralmente consistem emagrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativastal como aminoácidos ou cadeias laterais de carboidrato egeralmente têm características estruturais tridimensionaisespecíficas assim como características de carga específicas.

Um epítopo pode ser "linear" ou "conformacional". Em um epí-topo linear, todos os pontos de interação entre a proteína ea molécula que interage (tal como um anticorpo) ocorrem li-nearmente ao longo da seqüência primária de aminoácidos daproteína. Em um epítopo conformacional, os pontos de intera-ção ocorrem de resíduos de aminoácidos a outros na proteínaque estão separados um do outro.

Conforme aqui utilizado, os vinte aminoácidos con-vencionais e suas abreviações seguem uso convencional. VejaImmunology - A Synthesis (2nd Edition, E. S. Golub e D. R.Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)),que é incorporado aqui como referência. Estereoisômeros (porexemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais,aminoácidos artificiais tal como aminoácidos a-dissubstituídos, aminoácidos N-alquil, ácido lático e outrosaminoácidos não convencionais também podem ser componentesadequados para polipeptídeos da presente invenção. Exemplosde aminoácidos não convencionais incluem: -hidroxiprolina,γ-carboxiglutamato, ε-Ν,N,N-trimetilisina, ε-Ν-acetilisina eoutros aminoácidos similares e iminoácidos (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na notação polipeptídica usada aqui, o sen-tido para o lado esquerdo é o sentido amino-terminal e osentido para o lado direito é o sentido carbóxi-terminal, deacordo com uso e convenção padrões.

O termo "polinucleotídeo" como referido aqui sig-nifica uma forma polimérica de nucleotídeos de pelo menos 10bases de comprimento, ribonucleotídeos ou desoxirribonucleo-tídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotí-deo. 0 termo inclui formas de fita simples e fita dupla deDNA.O termo "polinucleotideo isolado", conforme aquiutilizado, significará um polinucleotideo de origem genômi-ca, cDNA ou sintética, ou alguma combinação desses, que de-vido a sua origem, o "polinucleotideo isolado" (1) não estáassociado com todo ou uma porção de um polinucleotideo com oqual o "polinucleotideo isolado" é encontrado na natureza,(2) está ligado operacionalmente a um polinucleotideo quenão está ligado na natureza, ou (3) não ocorre na naturezacomo parte de uma seqüência maior.

O termo "oligonucleotídeo" referido aqui incluinucleotideos que ocorrem naturalmente e nucleotideos modifi-cados ligados por ligações oligonucleotidicas que ocorremnaturalmente e que não ocorrem naturalmente. Oligonucleoti-deos são um subgrupo de polinucleotideo que geralmente com-preendem um comprimento de 200 bases ou menos. De preferên-cia, oligonucleotideos têm 10 até 60 bases de comprimento.Oligonucleotideos geralmente são de fita simples, por exem-plo, para sondas; embora oligonucleotideos possam ser de fi-ta dupla, p. ex, para uso na construção de um mutante gêni-co. Oligonucleotideos da invenção podem ser oligonucleoti-deos de sentido ou anti-sentido.

O termo "nucleotideos que ocorrem naturalmente"referido aqui inclui desoxirribonucleotideos e ribonucleotí-deos. 0 termo "nucleotideos modificados" referido aqui in-clui nucleotideos com grupos de açúcar substituídos ou modi-ficados e semelhantes. 0 termo "ligações oligonucleotidicas"referido aqui inclui ligações oligonucleotidicas tal comofosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodi-selenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoami-dato e semelhantes. Veja por exemplo, Laplanche et al., Nu-cl. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al. , J. Am. Chem.Soe. 106: 6077 (1984); Stein et al., Nuel Aeids REs 16: 3209(1988); Zon et al. , Anti-Caneer Drug Design 6: 539 (1991);Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Praetieal Ap-proach, pp. 87-108 (F. Eekstein, Ed., Oxford UniversityPress, Oxford England (1991); Stee et al., Patente US No.5.151.510; Uhlman e Peyman, Chemical Reviews, 90: 543(1990), as divulgações das quais são incorporadas aqui comoreferência. Um oligonucleotideo pode incluir um marcador pa-ra detecção, se desejado.

Seqüências "operacionalmente ligadas" incluem tan-to seqüências de controle de expressão que são contíguas aogene de interesse como seqüências de controle de expressãoque agem em trans ou a uma distância para controlar o genede interesse. 0 termo "seqüência de controle de expressão"como aqui utilizado se refere a seqüências polinucleotídicasque são necessárias para promover a expressão e processamen-to de seqüências codificantes às quais elas estão ligadas.Seqüências de controle de expressão incluem seqüências acen-tuadoras (enhancer), promotoras, de início e de término detranscrição apropriadas; sinais de processamento de RNA efi-cientes; seqüências que melhoram a eficiência de tradução(isto é, seqüência de consenso de Kozak); seqüências que me-lhoram a estabilidade protéica; e quando desejado, seqüên-cias que melhoram a secreção protéica. A natureza de taisseqüências de controle difere dependendo do organismo hospe-deiro; em procariotos, tais seqüências de controle geralmen-te incluem promotor, sitio de ligação ribossomal e seqüênciade término de transcrição; em eucariotos, geralmente, taisseqüências de controle incluem seqüências de promotores e detérmino de transcrição. 0 termo "seqüências de controle"destina-se a incluir, no mínimo, todos os componentes cujapresença é essencial para expressão e processamento e tambémpodem incluir componentes adicionais cuja presença é vanta-josa, por exemplo, seqüências líder e seqüências de par defusão.

O termo "vetor", conforme aqui utilizado, destina-se a se referir a uma molécula de ácido nucléico capaz detransportar um outro ácido nucléico ao qual ele está ligado.

Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alçade DNA de dupla fita circular em que segmentos de DNA adi-cionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetorviral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligadosno genoma viral. Certos vetores são capazes de replicaçãoautônoma em uma célula hospedeira em que eles são introduzi-dos (por exemplo, vetores bacterianos que tem uma origem dereplicação bacteriana e vetores mamíferos epissomais). Ou-tros vetores (por exemplo, vetores mamíferos não epissomais)podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira naintrodução na célula hospedeira e desse modo são replicadosjunto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetoressão capazes de direcionar a expressão de genes aos quais e-Ies estão operacionalmente ligados. Tais vetores são referi-dos aqui como "vetores de expressão recombinante" (ou sim-plesmente, "vetores de expressão"). Em geral, vetores de ex-pressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estãofreqüentemente na forma de plasmideos. Na presente especifi-cação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados alternadamentecomo o plasmideo é a forma mais comumente usada de vetor.

Entretanto, a invenção destina-se a incluir outras formas devetores de expressão, tais como. vetores virais (por exemplo,retrovirus de replicação defeituosa, adenovirus e virus ade-no-ássociados), que possuem funções equivalentes.

0 termo "célula hospedeira recombinante" (ou sim-plesmente "célula hospedeira"), conforme aqui utilizado,destina-se a se referir a uma célula em que um vetor de ex-pressão recombinante foi introduzido. Deve-se entender quetais termos destinam-se a se referir não apenas à célulasubmetida particular, mas à progênie de tal célula. Comocertas modificações podem ocorrer em gerações sucedentes de-vido à mutação ou influências ambientais, tal progênie podenão, de fato, ser idêntica à célula parental, mas ainda es-tão incluídas no âmbito do termo "célula hospedeira", con-forme aqui utilizado.

0 termo "hibridiza seletivamente" referido aquisignifica se ligar detectavelmente e especificamente. Poli-nucleotídeos, oligonucleotídeo e fragmentos destes de acordocom a invenção se hibridizam seletivamente a fitas de ácidonucléico sob condições de hibridização e lavagem que minimi-zam a quantidade apreciáveis de ligação detectável a ácidosnucléicos não específicos. Condições de "alta estringência"ou "altamente estringentes" podem ser usadas para obter con-dições de hibridização seletiva como conhecido na técnica ediscutido aqui. Um exemplo de condições de "alta estringên-cia" ou "altamente estringentes" é um método para incubar umpolinucleotideo com um outro polinucleotideo, em que um po-linucleotideo pode ser afixado a uma superfície sólida comouma membrana, em um tampão de hibridização de SSPE 6X ouSSC, formamida 50%, reagente de Denhardfs 5X, SDS 0,5%, DNAde esperma de salmão fragmentado, desnaturado 100 ug/mL emuma temperatura de hibridização de 42°C por 12-16 horas, se-guido por lavagem duas vezes a 55°C usando um tampão de la-vagem de SSC IX, SDS 0,5%. Veja também Sambrook et al. , su-pra, pp. 9.50-9.55.

O termo "identidade de seqüência porcentual" nocontexto de seqüências nucleotídicas se refere aos resíduosem duas seqüências que são os mesmos quando alinhados paramáxima correspondência. O comprimento de comparação de iden-tidade de seqüência pode ser uma extensão de pelo menos cer-ca de nove nucleotídeos, geralmente pelo menos cerca de 18nucleotídeos, mais geralmente pelo menos 24 nucleotídeos,tipicamente pelo menos cerca de 28 nucleotídeos, mais tipi-camente pelo menos 32 nucleotídeos e de preferência pelo me-nos cerca de 36, 48 ou mais nucleotídeos. Há vários algorit-mos conhecidos na técnica que podem ser usados para mediridentidade de seqüência nucleotídica. Por exemplo, seqüên-cias polinucleotídicas podem ser comparadas usando FASTA,Gap ou Bestfit, que são programas no Wisconsin Package ver-são 10.3, Accelrys, San Diego, CA. FASTA, que inclui, porexemplo, os programas FASTA2 e FASTA3, provê alinhamentos eidentidade de seqüência porcentual das regiões da melhor so-breposição entre as seqüências teste e de busca (Pearson,Methods Enzymol 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol Biol132: 185-219 (2000); Pearson Methods Enzymol 266: 227-258(1996); Pearson J Mol Biol 276: 71-84 (1998); incorporadoaqui como referência). A menos que especificado de outro mo-do, parâmetros padrões para um programa ou algoritmo parti-cular são usados. Por exemplo, identidade de seqüência por-centual entre seqüências nucleotidicas pode ser determinadasusando FASTA com seus parâmetros padrões (um tamanho de pa-lavra de 6 o fator NOPAM para a matriz de pontuação) ou u-sando Gap como seus parâmetros padrões como provido no Wis-consin Package versão 10.3, aqui incorporado como referência.

Uma referência para uma seqüência nucleotidica a-brange seu complemento a menos que especificado de outro mo-do. Assim, uma referência a uma molécula de ácido nucléicoque tem uma seqüência particular, deve ser entendido comoabrangendo sua fita complementar, com sua seqüência comple-mentar.

Na técnica de biologia molecular, pesquisadoresusam os temos "identidade de seqüência porcentual", "simila-ridade de seqüência porcentual" e "homologia de seqüênciaporcentual" alternadamente. Neste pedido, esses termos terãoo mesmo significado em relação às seqüências nucleotidicasapenas.

0 termo "similaridade considerável" ou "similari-dade de seqüência considerável", quando se refere a um ácidonucléico ou fragmento deste, indica que, quando alinhado o-timamente com inserções ou deleções nucleotidicas com um ou-tro ácido nucléico (ou sua fita complementar), há identidadede seqüência nucleotidica em pelo menos cerca de 85%, depreferência pelo menos cerca de 90% e de maior preferênciapelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases nu-cleotidicas, como medido por algoritmo bem conhecido de i-dentidade de seqüência, tal como FASTA, BLAST ou Gap, con-forme discutido acima.

Como aplicado a polipeptideos, o termo "identidadeconsiderável" significa que duas seqüências peptidicas,quando otimamente alinhadas, tal como pelos programas GAP ouBESTFIT usando pesos de frestas padrões, compartilham pelomenos 75% ou 80% de identidade de seqüência, de preferênciapelo menos 90% ou 95% de identidade de seqüência, ainda demaior preferência pelo menos 98% ou 98% de identidade de se-qüência. De preferência, posições de resíduos que não sãoidênticas diferem por substituições de aminoácidos conserva-tivas. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é umaem que um resíduo de aminoácido é substituído por um outroresíduo de aminoácido que tem uma cadeia lateral (grupo R)com propriedades químicas similares (por exemplo carga ouhidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácidosconservada não alterará consideravelmente as propriedadesfuncionais de uma proteína. Em casos em que duas ou mais se-qüências de aminoácidos diferem uma da outra por substitui-ções conservativas, a identidade de seqüência porcentual ougrau de similaridade pode ser ajustado para cima para corri-gir a natureza conservativa da substituição. Meios para fa-zer este ajuste são bem conhecidos por aqueles versados natécnica. Veja, por exemplo, Pearson, Methods Mol Biol 24:307-31 (1994), incorporado aqui como referência. Exemplos degrupos de aminoácidos que tem cadeias laterais com proprie-dade químicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáti-cas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) ca-deias laterais alifática-hidroxila: serina e treonina; 3)cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4)cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e trip-tofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e his-tidina; e 6) cadeias laterais contendo enxofre são cisteínae metionina. Grupos de substituição de aminoácidos conserva-tivos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalani-na-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina.

Senão, uma substituição conservativa é qualqueralteração que têm um valor positivo na matriz de Iog-probabilidade PAM250 em Gonnet et al., Science 256: 1443-45(1992), incorporada aqui como referência. Uma substituição"moderadamente conservativa" é qualquer alteração que tem umvalor negativo na matriz de log-probabilidade PAM250.

A similaridade de seqüência para polipeptídeos étipicamente medida usando programa de análise de seqüências.

Programa de análise protéica pareia seqüências similares u-sando medidas de similaridade designadas para várias substi-tuições, deleções e outras modificações, incluindo substitu-ições de aminoácidos conservativas. Por exemplo, GCG contémprogramas tal como "Gap" e "Bestfit" que podem ser usadoscom parâmetros padrão para determinar homologia de seqüênciaou identidade de seqüência entre polipeptideos intimamenterelacionados, tal como polipeptideos homólogos de espéciesdiferentes de organismos ou entre uma proteína selvagem euma muteína desta. Veja, por exemplo, Wisconsin Package ver-são 10.3. Seqüências polipeptídicas também podem ser compa-radas usando FASTA usando parâmetros padrões ou recomenda-dos, um programa no Wisconsin Package versão 10.3. FASTA(por exemplo, FASTA2 e FASTA3) provê alinhamentos e identi-dade de seqüência porcentual das regiões da melhor sobrepo-sição entre as seqüências teste e de busca (Pearson (1990);Pearson (2000)). Um outro algoritmo preferido quando compa-rando uma seqüência da invenção a um banco de dados contendoum grande número de seqüências de diferentes organismo é oprograma de computador BLAST, especialmente blastp oublastn, usando parâmetros padrões. Veja, por exemplo, Alts-chul et al. , J Mol Biol 215: 403-410 (1990); Altschul etal., Nucleic Acids Res 25: 3389-402 (1997); incorporadas a-qui como referência.

0 comprimento de seqüências polipeptídicas compa-radas por homologia geralmente será pelo menos cerca de 16resíduos de aminoácidos, geralmente pelo menos cerca de 20resíduos, mais geralmente pelo menos cerca de 24 resíduos,tipicamente pelo menos cerca de 28 resíduos e de preferênciamais de 35 resíduos. Quando se busca um banco de dados con-tendo seqüências de um grande número de diferentes organis-mos, é preferível comparar seqüências de aminoácidos.Conforme aqui utilizado, os termos "marcador" ou"marcado" se refere à incorporação de uma outra molécula noanticorpo. Em uma modalidade, o marcador é um marcador de-tectável, por exemplo, incorporação de um aminoácido radio-marcado ou adesão a um polipeptideo de unidades de biotinilaque podem ser detectadas por avidina marcada (por exemplo,estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou ativida-de enzimática que possa ser detectada por métodos óticos oucolorimétricos). Em uma outra modalidade, o marcador podeser terapêutico, por exemplo, um conjugado a droga ou toxi-na. Vários métodos para marcar polipeptideos e glicoproteí-nas são conhecidos na técnica e podem ser usados. Exemplosde marcadores para polipeptideos incluem, mas não estão li-mitados a, os seguintes: radioisótopos ou radionucletos (porexemplo, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), marcadoresfluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, lantanideo fós-foros), marcadores enzimáticos (por exemplo, peroxidase derabanete, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina);marcadores quimioluminescentes, grupos de biotinila, epíto-pos polipeptidicos pré-determinados reconhecidos por um re-pórter secundário (por exemplo, seqüências de par de ziperesde leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários,domínios de ligação de metal, marcadores de epítopo), agen-tes magnéticos, tal como quelatos de gadolínio, toxinas talcomo toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D,brometo de etídeo, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenopo-sídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina,daunorrubicina, diidróxi antracin diona, mitoxantrona, mi-tramicina, actinomicina D, 1-desidrotestosterona, glicocor-ticóides, procaina, tetracaína, lidocaina, propranolol e pu-romicina e análogos ou homólogos destes. Em algumas modali-dades, marcadores estão aderidos por braços espaçadores devários comprimentos para reduzir potencial impedimento estérico.

Claims (11)

1. Uso, CARACTERIZADO pelo fato de ser de um anti-corpo anti-MAdCAM ou porção de ligação a antigeno deste paraa fabricação de um medicamento para o tratamento de doençaceliaca e/ou espru tropical.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato do medicamente ser para o tratamentode doença celiaca.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou reivin-dicação 2, CARACTERIZADO pelo fato do anticorpo anti-MAdCAMser um anticorpo monoclonal humano.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato do anticorpo ou porção possuir pelomenos uma das seguintes propriedades:(a)se liga a células humanas;(b)tem uma seletividade por MAdCAM sobre VCAM oufibronectina de pelo menos 100 vezes;(c) se. liga a MAdCAM humana com um Kd de 3 χ IO-10Mou menos; ou(d)inibe a ligação de células que expressam α4β7 aMAdCAM humana;(e)inibe o recrutamento de linfócitos para o teci-do linfóide gastrintestinal.

5. Uso, de acordo com quaisquer das reivindicaçõesde 1 até 4, CARACTERIZADO pelo fato do citado anticorpo ouporção de ligação a antigeno inibir a ligação de MAdCAM hu-mana a α4β7 e em que o anticorpo ou porção deste tem pelomenos uma das seguintes propriedades:(a)compete de maneira cruzada com um anticorpo dereferência para ligação a MAdCAM;(b)compete com um anticorpo de referência para li-gação a MAdCAM;(c)liga-se ao mesmo epitopo de MAdCAM que um anti-corpo de referência;(d)liga-se a MAdCAM com consideravelmente o mesmoKd que um anticorpo de referência;(e)liga-se a MAdCAM com consideravelmente a mesmataxa de desligamento que um anticorpo de referência;em que o anticorpo de referência é selecionado dogrupo que consiste em: anticorpo monoclonal 1.7.2, anticorpomonoclonal 1.8.2, anticorpo monoclonal 6.14.2, anticorpo mo-noclonal 6.22.2, anticorpo monoclonal 6.34.2, anticorpo mo-noclonal 6.67.1, anticorpo, monoclonal 6.73.2, anticorpo mo-noclonal 6.77.1, anticorpo monoclonal 7.16.6, anticorpo mo-noclonal 7.20.5, anticorpo monoclonal 7.26.4, anticorpo mo-noclonal 9.8.2, anticorpo monoclonal 6.22.2-mod, anticorpomonoclonal 6.34.2-mod, anticorpo monoclonal 6.67.1-mod, an-ticorpo monoclonal 6.77.1-mod e anticorpo monoclonal 7.26.4-mod.

6. Uso, de acordo com quaisquer das reivindicaçõesde 1 até 5, CARACTERIZADO pelo fato da região variável decadeia pesada, da região variável de cadeia leve ou ambas doanticorpo anti-MAdCAM possuírem pelo menos 90% de identidadeem seqüência de aminoácidos com a região ou regiões corres-pondentes de um anticorpo monoclonal selecionado do grupoque consiste em: anticorpo monoclonal 1.7.2, anticorpo mono-clonal 1.8.2, anticorpo monoclonal 6.14.2, anticorpo mono-clonal 6.22.2, anticorpo monoclonal 6.34.2, anticorpo mono-clonal 6.67.1, anticorpo monoclonal 6.73.2, anticorpo mono-clonal 6.77.1, anticorpo monoclonal 7.16.6, anticorpo mono-clonal 7.20.5, anticorpo monoclonal 7.26.4, anticorpo mono-clonal 9.8.2, anticorpo monoclonal 6.22.2-mod, anticorpo mo-noclonal 6.34.2-mod, anticorpo monoclonal 6.67.1-mod, anti-corpo monoclonal 6.77.1-mod e anticorpo monoclonal 7.26.4-mod.

7. Uso, de acordo com quaisquer das reivindicaçõesde 1 até 6, CARACTERIZADO pelo fato do anticorpo ser sele-cionado do grupo que consiste em:(a) um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 4, sem asseqüências sinais;(b)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 8, sem asseqüências sinais;(c)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 12, sem asseqüências sinais;(d)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 16, sem asseqüências sinais;(e)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20, sem asseqüências sinais;(f)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 24, sem asseqüências sinais;(g)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 28, sem asseqüências sinais;(h)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 30 e SEQ ID NO: 32, sem asseqüências sinais;(i)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 34 e SEQ ID NO: 36, sem asseqüências sinais;(j)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40, sem asseqüências sinais;(k)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 44, sem asseqüências sinais;(l)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 48, sem asseqüências sinais;(m)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 52 e SEQ ID NO: 54, sem asseqüências sinais;(n)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 56 e SEQ ID NO: 58, sem asseqüências sinais;(o)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 60 e SEQ ID NO: 62, sem asseqüências sinais;(ρ)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 64 e SEQ ID NO: 66, sem asseqüências sinais;(q)um anticorpo compreendendo as seqüências de a-minoácidos expostas em SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 68, sem asseqüências sinais.

8. Uso, de acordo com quaisquer das reivindicaçõesde 1 até 7, CARACTERIZADO pelo fato da lisina C-terminal decadeia pesada ser clivada do anticorpo anti-MAdCAM.

9. Uso, de acordo com quaisquer das reivindicaçõesde 1 até 8, CARACTERIZADO pelo fato do anticorpo monoclonalou porção de ligação a antigeno deste ser selecionado dosseguintes anticorpos:(a)a cadeia pesada compreende as seqüências de a-minoácidos CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada de um anticor-po de referência selecionado do grupo que consiste em:- 1.7.2, 1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2,- 6.77.1, 7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod, 6.67.1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod(b)a cadeia leve compreende as seqüências de ami-noácidos CDRl, CDR2 e CDR3 de cadeia leve de um anticorpo dereferência selecionado do grupo que consiste em: 1.7.2,-1.8.2, 6.14.2, 6.22.2, 6.34.2, 6.67.1, 6.73.2, 6.77.1,-7.16.6, 7.20.5, 7.26.4, 9.8.2, 6.22.2-mod, 6.34.2-mod,-6.67.1-mod, 6.77.1-mod e 7.26.4-mod(c)o anticorpo compreende uma cadeia pesada de (a)e uma cadeia leve de (b); e(d)o anticorpo de (c) em que as seqüências de ami-noácidos de CDR de cadeia pesada e cadeia leve são selecio-nadas do mesmo anticorpo de referência.

10. Uso, de acordo com quaisquer das reivindica-ções de 1 até 9, CARACTERIZADO pelo fato do anticorpo mono-clonal ou porção de ligação a antigeno compreender:(a)uma cadeia pesada compreendendo a seqüência deaminoácidos de região variável de cadeia pesada de um anti-corpo selecionado do grupo que consiste em: 1.7.2 (SEQ IDNO: 2), 1.8.2 (SEQ ID NO: 6), 6.14.2 (SEQ ID NO: 10), 6.22.2(SEQ ID NO: 14), 6.34.2 (SEQ ID NO: 18), 6.67.1 (SEQ ID NO:22), - 6.73.2 (SEQ ID NO: 26), 6.77.1 (SEQ ID NO: 30), 7.16.6(SEQ ID NO: 34), 7.20.5 (SEQ ID NO: 38), 7.26.4 (SEQ ID NO:- 42) e 9.8.2 (SEQ ID NO: 46), 6.22.2-mod (SEQ ID NO: 52),- 6.34.2-mod (SEQ ID NO: 56), 6.67.1-mod (SEQ ID NO: 60),- 6.77.1-mod (SEQ ID NO: 64) e 7.26.4-mod (SEQ ID NO: 42);(b)uma cadeia leve compreendendo a seqüência deaminoácidos de região variável de cadeia leve de um anticor-po selecionado do grupo que consiste em: 1.7.2 (SEQ ID NO:- 4), 1.8.2 (SEQ ID NO: 8), 6.14.2 (SEQ ID NO: 12), 6.22.2(SEQ ID NO: 16), 6.34.2 (SEQ ID NO: 20), 6.67.1 (SEQ ID NO:- 24), 6.73.2 (SEQ ID NO: 28), 6.77.1 (SEQ ID NO: 32), 7.16.6(SEQ ID NO: 36), 7.20.5 (SEQ ID NO: 40), 7.26.4 (SEQ ID NO:- 44) e 9.8.2 (SEQ ID NO: 48), 6.22.2-mod (SEQ ID NO: 54),- 6.34.2-mod (SEQ ID NO: 58), 6.67.1-mod (SEQ ID NO: 62),- 6.77.1-mod (SEQ ID NO: 66) e 7.26.4-mod (SEQ ID NO: 68); ou(c) a cadeia pesada de (a) e a cadeia leve de (b) .

11. Uso, CARACTERIZADO pelo fato de ser de um an-ticorpo anti-integrina α4β? ou porção de ligação a antigenodeste para a fabricação de um medicamento para o tratamentode doença celiaca e/ou espru tropical.