BRPI0612708B1 - Use of an aqueous solution, suspension or mixture of the same, obtained from air parts and / or parts below the tulbaghia violacea soil and agapanthus africanus soil to inhibit fungic infection of a harvest, avoid the micelial growth of a fungus and stimulate root growth and changes - Google Patents

Abstract

extratos e compostos de "tulbagmia violacea" e seu uso como agentes biológicos para proteção de plantas. a presente invenção refere-se a extratos e preparações à base da espécie tulbaghia violacea (harv.) (alho selvagem), que provoca uma atividade antimicrobiana, de preferência antifúngica, significativa in vitro e in vivo, mesmo sob condições de campo e de estufa. além disso, esses extratos derivados de partes do solo, assim como de partes aéreas da planta provocam uma atividade bioestimulante significativa, expressa, acima de tudo, por um metabolismo de crescimento aumentado, que sustenta o crescimento de sementes. além disso, extratos ou preparações combinadas de tulbaghia violacea e espécies do gênero agapanthus mostram maior eficácia antifúngica e bioestimuíante, em comparação com os extratos ou preparações da espécie única, indicando que há participação de sinergia nos processos biológicos envolvidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE UMA SOLUÇÃO, SUSPENSÃO OU MISTURA AQUOSA DAS MESMAS, OBTIDA A PARTIR DE PARTES AÉREAS E/OU PARTES ABAIXO DO SOLO DE TULBAGHIA VIOLACEA (ALHO SELVAGEM) E AGAPANTHUS AFRICANUS PARA INIBIR INFECÇÃO FÚNGICA DE UMA COLHEITA, EVITAR O CRESCIMENTO MICELIAL DE UM FUNGO E ESTIMULAR O CRESCIMENTO DA RAIZ E MUDAS".

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a extratos vegetais, particularmente à base de Tulbaghia violacea (alho selvagem) e a suas combinações com outros extratos derivados de outras plantas. A invenção também refere-se ao isolamento, purificação e identificação de compostos nesses extratos. Os extratos vegetais e as substâncias isoladas mostram atividade antimicro-biana significativa, particularmente atividade antifúngica, e eficácia bioesti-mulante, quando aplicados a outras plantas in vitro e in vivo, incluindo sob condições de campo. Os produtos de acordo com esta invenção são adequados para uso como agentes protetores de plantas para muitas colheitas e plantas econômicas, como uma alternativa a pesticidas químicos. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A agricultura mundial sofre, particularmente em países em desenvolvimento como na África, grandes perdas anuais de colheitas e outras plantas econômicas devido a doenças de plantas. Mais de 30% dos alimentos, fibras, rações e energia produzidos em sistemas de produção de colheitas são destruídos por insetos e doenças anualmente em uma escala global. Essas perdas de rendimento são altas como resultado de sistemas de produção de baixa entrada, porque fazendeiros em países em desenvolvimento não podem arcar com fungicidas sintéticos, dependendo de práticas de controle de doença não convencionais que freqüentemente proporcionam resultados duvidosos.

Em contraste, produtores de colheitas e plantas em países desenvolvidos se baseiam principalmente em pesticidas sintéticos para controlar doenças de plantas. É um fato estabelecido que o uso de pesticidas quí- micos sintéticos proporcionam muitos benefícios para produtores de colheitas. Esses benefícios incluem rendimentos de colheitas mais elevados, melhor qualidade da colheita e maior produção de alimentos para uma população mundial cada vez maior. / O desenvolvimento de uma ampla gama de substâncias químicas com diferentes formulações permitiu o controle de uma ampla gama de patógenos de plantas e rendimentos de colheitas substancialmente aumentados. Mais de uma década atrás, os produtores de colheitas gastaram quase 20 bilhões de dólares em pesticidas e 150 milhões de dólares em outras técnicas de proteção de plantas mundialmente para controlar pragas em geral. Apenas a participação de fungicidas no mercado mundial foi de 20% em anos recentes, ao passo que a Europa representou 30% do mercado. Entretanto, o mesmo nível de controle de patógenos não foi conseguido em países em desenvolvimento, parcialmente como resultado de a tecnologia de pesticidas não ser acessível à maioria dos fazendeiros probres de recursos. A incapacidade das modernas abordagens, tecnologias e substâncias químicas de atingir fazendeiros em países em desenvolvimento é unicamente resultado dos altos custos com relação ao valor das colheitas cultivadas por esses fazendeiros. Consequentemente, as colheitas são rotineiramente submetidas ao ataque de um amplo espectro de uma diversidade de patógenos, e esses fazendeiros constantemente experimentam graves danos à colheita. Além disso, as perdas de rendimento estão aumentando, a despeito do elevado uso de pesticidas, mesmo em países desenvolvidos. Além do mais, o controle de doenças de plantas não é facilmente conseguido com uma única aplicação de fungicida, mas requer aplicações freqüentes durante o período de crescimento da colheita. Entretanto, pesticidas sintéticos podem apresentar riscos e perigos para o ambiente, particularmente quando usando inapropriadamente por fazendeiros em países em desenvolvimento, que não possuem a habilidade técnica para manipulá-los, e que são incapazes de adotar essa tecnologia facilmente. Isso pode resultar em resíduos indesejáveis deixados no alimento, água e ambiente e pode causar toxicidade para seres humanos e animais, contaminação de solos e lençóis freáticos e pode levar ao desenvolvimento de populações de pragas de colheitas que sejam resistentes ao tratamento com agroquímicos. Particularmente fungicidas sintéticos contendo enxofre e cobre são tóxicos para mamíferos, vida selvagem e muitos insetos benéficos.

Além disso, na África e no Oriente Próximo, pesticidas obsoletos se tornaram uma fonte de grande preocupação ambiental adicional. Alguns estoques têm mais de 30 anos de idade e são mantidos em condições precárias, por causa das instalações de armazenamento inadequadas e falta de pessoal treinado no controle de armazenamento. Estoques de pesticidas obsoletos são bombas-relógios em potencial. Vazamento, infiltração e vários acidentes relacionados a pesticidas são muito comuns e disseminados. Além disso, a aplicação freqüente de pesticidas resultou em mutação fúngica e, subseqüentemente, novas cepas resistentes (Khun, 1989, Pesticide Science 14:272-293), cujo combate normalmente requer pesticidas mais fortes, com impactos ainda mais fortes sobre o ambiente.

Por todas essas razões, há uma resistência considerável e crescente dos consumidores, particularmente em países desenvolvidos, iniciada politicamente pelos partidos verdes, quanto ao uso de substâncias quími-cas/pesticidas sintéticos particularmente, representando uma razão para mudar da aplicação de pesticidas químicos para o uso de agentes protetores de plantas derivados naturalmente para reduzir a poluição e os riscos à saúde causados pelos pesticidas.

Como resultado, a pesquisa da possível utilização de recursos biológicos e sua aplicação em potencial na agricultura se tornou muito relevante. Uma abordagem promissora com relação a isso é o uso de produtos vegetais naturais como uma alternativa interessante a substâncias químicas sintéticas, devido ao aparente impacto menos negativo sobre o ambiente.

Isso se aplica particuiarmente à pesquisa de componentes e a-gentes bioativos derivados naturaimente amigáveis para o ambiente com, por exemplo, uma atividade antimicrobiana de amplo espectro.

Espera-se que produtos naturais de plantas tenham uma estreita faixa de alvos e um modo de ação altamente específico, mostrem limitada persistência em campo, tenham um prazo de validade mais curto e não a-presentem riscos residuais. Em geral, são mais seguros para seres humanos e para o ambiente do que pesticidas químicos sintéticos convencionais e podem ser facilmente adotados por fazendeiros em países em desenvolví- mento, que tradicionalmente usam extratos de plantas para o tratamento de doenças humanas.

Uma razão adicional para explorar o uso de extratos vegetais ou produtos naturais como pesticidas biológicos mais amplamente pode ser encontrada na própria planta. Plantas desenvolveram compostos químicos altamente específicos que proporcionam mecanismos de defesa contra o ataque por organismos causadores de doenças, incluindo ataque fúngico, invasão microbiana e infecção viral (Cowan, 1999, Clinicai Microbiology Re-views 12:564-582). Essas substâncias bioativas ocorrem em plantas como metabólitos secundários e proporcionaram uma rica fonte de compostos biologicamente ativos que podem ser usados como novos agentes protetores de colheitas. Na natureza, algumas plantas têm o potencial de sobreviver em condições ambientais muito adversas. Isso iniciou o postulado de que essas plantas poderíam ser utilizadas como fontes para o desenvolvimento de produtos naturais para aplicação em agricultura pelo homem como herbicidas, bactericidas, fungicidas naturais ou produtos em forma bruta ou semipurifi-cada. Metabólitos secundários de plantas são distintos de metabólitos primários, pelo fato de em geral serem não essenciais para os processos metabó-licos básicos, como respiração e fotossíntese. São numerosos e disseminados, particularmente em plantas superiores, e freqüentemente estão presentes em pequenas quantidades (1-5%) em comparação com metabólitos primários (carboidratos, proteínas, lipídios). Metabólitos secundários são provavelmente produzidos quando requerido no sistema de plantas e são sintetizados em tipos especializados de células. Ecologicamente, os metabólitos secundários desempenham papéis essenciais na atração de polinizadores, como adaptações a estresses ambientais e servem como defesas químicas contra insetos e predadores superiores, microorganismos e mesmo outras plantas (aleloquímicos). Estresse abiótico, como limitação de nutrientes, intensidade da luz, estresse de água e outros, foi considerado como capaz de desencadear a formação de metabólitos secundários. Um tipo de interação planta-patógeno relacionada a estresse biótico envolve a produção de metabólitos como parte do arsenal de defesas da planta contra invasão microbia- na e é considerado determinante de doença. Metabólitos secundários com propriedades antimicrobianas incluem terpenóides (por exemplo, iridóides, sesquiterpenóides, saponinas), contendo nitrogênio e/ou enxofre (por exemplo, alcalóides, aminas, amidas), alifáticos (particularmente alcanos de cadeia longa e ácidos graxos) e aromáticos (por exemplo, fenólicos, flavonói-des, bibenzilas, xantonas e benzoquinonas).

Outra área relacionada de sistemas de cultivo orgânico é o potencial de aplicar extratos vegetais naturais como reguladores do crescimento de plantas ou bioestimulantes. Foram identificados muitos compostos vegetais naturais que afetam o crescimento e o desenvolvimento de plantas. Metabólitos secundários de plantas também podem mostrar atividades bioestimulantes em plantas, outras plantas incluídas. Provavelmente, o composto mais eficaz para aumentar o rendimento de colheitas, a eficiência de colheitas e o vigor de sementes foi identificado como um brassinoesteróide (Mandava, 1988, Plant Physiology Plant Molecular Biology 39:23-52). Bras-sinoesteróides também foram identificados como substâncias bioestimulantes de uma mistura de extratos vegetais derivados de uma espécie de cravo específica e uma espécie de alfafa específica (EP 1 051 075 B1). Conse-qüentemente, existe um grande interesse em identificar compostos vegetais naturais com a capacidade de manipular o crescimento de plantas e o desenvolvimento durante um curto período, por exemplo, uma estação de crescimento.

Uma consideração adicionai é que plantas cujos extratos, por exemplo, mostrem propriedades antimicrobianas e/ou bioestimulantes poderíam ser cultivadas como colheitas agrícolas alternativas para servir de fontes de compostos ativos na produção de pesticidas naturais ou reguladores do crescimento de plantas.

Embora as plantas sejam uma fonte valiosa para o desenvolvimento de novos produtos naturais com o potencial de uso para o controle de doenças em sistemas de produção de colheitas orgânicas, apenas um pequeno número de plantas foi investigado quanto ao possível uso no controle de doenças de plantas em agricultura. Entretanto, com relação a esse núme- ro relativamente pequeno de plantas investigadas, foi realizado um número de atividades de pesquisa científica relativamente grande durante os últimos anos. Algumas delas são relacionadas a seguir: . Demonstrou-se (Pretorius et al., 2002, Annals of Applied Bio-logy 141: 117-124) que se obtinha a inibição do crescimento de micélios com extratos de duas espécies da subclasse Liliidae, a saber Aristea eckionii e Agapanthus inapertus. O extrato bruto de A. eckionii teve o melhor desempenho de todos os extratos, pois inibiu totalmente o crescimento de micélios de todos os sete organismos de teste patogênicos para plantas e teve um desempenho superior à inibição por um fungicida sintético de amplo espectro (carbendazim/difenoconazol). Extratos brutos de A. inapertus mostraram inibição completa de quatro e forte inibição dos três fungos patogênicos para plantas restantes. . Sementes de plantas também contêm compostos com propriedades antimicrobianas. Extratos de sementes de 50 espécies de plantas, pertencentes a diferentes famílias, foram avaliados quanto à sua capacidade de inibir o crescimento de Trichoderma viride in vitro (Bharathimatha et al., 2002, Acta Phytopathologica et Entomologica Hungarica 37:75-82). Dos vários extratos de sementes, o de Harpullia cupanioides (Roxb.), pertencente à família Sapindaceae, apresentou atividade antifúngica muito elevada. . O produto vegetal natural Milsana®, extraído de sanguinária gigante (Reynoutría sacchalinensis), é provavelmente o melhor conhecido (Daayf, 1995, PlantDisease 79:577-580). Relatou-se que o produto controla míldio pulverulento, causado por Sphaerotheca fuliginea, em pepino inglês longo sob condições de estufa, e também mostrou atividade de amplo espectro contra míldio pulverulento de tomate, maçã e begônia, assim como míldio penugento de vinhas e ferrugem de feijão. . Amadioha (2002, Archives of Phytopathology and Plant Protec-tion 35:37-42) avaliou as atividades antifúngicas de diferentes extratos de A. indica. O extrato oleoso de sementes, assim como extratos aquosos e etanó-licos de folhas das plantas foram eficazes na redução do crescimento radial de Cochliobolus miyabeanus em cultura e no controle da disseminação da doença de pontos marrons no arroz. . Kishore et al. (2002, International Arachis Newsletter 22:46-48) relataram a atividade antimicrobiana de extratos aquosos de folhas de Law-sonia inermis e Datura metei contra Mycosphaerella berkeleyi, que causam manchas em folhas tardias de amendoins (Arachis hypogaea). . Um estudo direcionado para a identificação de propriedades bioestimulantes em extratos vegetais foi realizado por Cruz et al. (2002, Acta Horticulturae 569:235-238) por tratamento das raízes de feijão, milho e tomate com um lixiviado aquoso de Callicarpa acuminate. O extrato aquoso de C. acuminata inibiu o crescimento de radícuias de tomate, mas não teve nenhum efeito sobre o crescimento de raízes de milho ou feijões. . Extratos de alguns cultivares de luzerna tiveram um efeito estimulante em termos de germinação de sementes, assim como crescimento da raiz e hipocotiledôneo, ao passo que outros mostraram o efeito oposto direto, confirmando que plantas de colheita também podem ser afetadas por extratos vegetais direcionados ao controle do crescimento de ervas daninhas (Tran e Tsuzuki, 2002, Journal of Agronomy and Crop Science 188:2-7). . Leksomboon et al. (2001, Kasetsart Journal, Natural Sciences 35:392-396) demonstraram o efeito antibacteriano de extratos aquosos de folhas e outros de Hiblscus sabdariffa, Psidium guajava, Punica granatum, Spondias pinnata e Tamarindus indica contra Xanthomonas axonopodis, o agente causai do cancro cítrico tanto sob condições laboratoriais, quanto de campo. . Os efeitos antibacterianos de 45 plantas medicinais foram avaliados contra uma ampla gama de bactérias por Morais et al. (2002 Acta Horticulturae 569:87-90). Extratos brutos de cinco dessas plantas inibiram significativamente o crescimento de Xanthomonas campestris pv. vesicatoría [X. vesicatoria], Ralstonia solanacearum e Clavibacter michiganense subsp. mi-chiganense [C. michiganensis subsp. michiganensis], todos patógenos do tomate.

Outro produto natural, carvona, derivado de sementes de endro e cariz, foi desenvolvido para inibir o crescimento de patógenos de armazenamento e para suprimir o brotamento de batatas no depósito (Moezelaar et al.t 1999, em: Modem fungicides and antifungal compounds II; Intercept Limited, p. 453-467). A carvona é atualmente comercializada como Talent® na Holanda. . No pedido de patente europeu EP 1 051 075, descreve-se uma preparação de uma combinação de espécies da família do cravo e espécies de alfafa (ComCat®), que revela, dentro de uma razão específica, um efeito bioestimulante sinérgico. ComCat® demonstrou um aumento do crescimento vegetal consistente e eficiência fisiológica na utilização da planta tratada de nutrientes disponíveis. ComCat®, que aumenta a saúde de legumes, flores e colheitas agrícolas, não é um fertilizante, mas, ao invés, é um intensificador biológico que estimula a planta a utilizar mais apropriadamente os nutrientes disponíveis. Além disso, ativa e induz alelopatia e resistência a doenças na planta tratada e estimula uma maior produção de açúcares, que são os blocos de construção para celulose e corpos de frutificação. O resultado é uma planta mais produtiva e mais saudável, com caules de planta mais fortes, melhor florescimento e maior biomassa de fruta (Agraforum: Alemanha, 2002, folha de dados técnicos).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção apresenta extratos e preparações à base da espécie Tulbaghia violacea (Harv.) {alho selvagem), que provocam uma atividade antimicrobiana, de preferência antifúngica, significativa in vitro e in vivo, mesmo sob condições de campo e de estufa. Além disso, esses extratos derivados das partes de solo, assim como das partes aéreas da planta provocam uma atividade bioestimulante significativa, expressa, acima de tudo, por um metabolismo de crescimento aumentado sustentando o crescimento de sementes. Além disso, extratos ou preparações combinadas de Tulbaghia violacea e espécies do gênero Agapanthus mostram uma eficácia antifúngica e bioestimulante mais elevada em comparação com extratos ou preparações da espécie única, indicando que uma sinergia participa nos processos biológicos envolvidos. A invenção apresenta, além disso, composições de combinações de extratos ou preparações de diferentes espécies de plantas. Essas combinações compreendem preparações de Tulbaghia violacea (alho selvagem) e outras espécies de plantas, como espécies do gênero Agapanthus, de preferência A. africanus. Na combinação preferida, T. violacea e uma espécie de Agapanthus, de preferência A. africanus, são misturados a 1:1 (p/p). Alternativamente, de acordo com a invenção, uma preparação da espécie T. violacea é combinada com uma preparação de uma mistura de espécies da família do cravo e espécies de alfafa, de preferência em uma razão específica. Em outra modalidade, a invenção apresenta combinações da espécie T. vioiacea com espécies do gênero Agapanthus e uma mistura de espécies da família do cravo e espécies de alfafa. Essas combinações provocam uma atividade protetora de plantas aumentada e sinérgica, de preferência uma atividade antifúngica e bioestimulante, em comparação com as preparações de componente único correspondentes. A invenção apresenta, finalmente, compostos isolados e purificados dos ditos extratos/preparações, que também mostram atividade significativa de proteção de plantas, particularmente atividade antifúngica, quando aplicados a outras plantas in vitro e in vivo, incluindo o cultivo em campo.

As preparações de acordo com a invenção podem ser apresentadas como extratos brutos ou como pó seco, dependendo do processo de sua fabricação. As preparações podem compreender, além disso, particularmente para uso no cultivo no campo, cargas ou materiais de veículo sólidos, de preferência pulverulentos, de acordo com o estado da técnica. Além disso, as preparações de acordo com a invenção podem compreender aditivos convencionais que aumentam ou modulam o efeito da preparação.

As preparações de acordo com a invenção também podem ser apresentadas em uma forma líquida, de preferência aquosa, que pode ser usada como uma pulverização e, portanto, ser facilmente atomizada nas á-reas de cultivo. Nessas soluções ou suspensões, os extratos e preparações da invenção revelam sua atividade protetora de plantas total em uma faixa de concentração entre 0,2 g (extrato/pó)/1 a 2 g/L, de preferência de 0,5 g/L a 1 g/L. Com relação à atividade antifúngica das preparações, o termo "atividade protetora de plantas total" significa 100% de inibição do crescimento de micélios de um patógeno vegetal fúngico típico, em comparação com um pesticida de referência padrão. A invenção também apresenta processos para a fabricação dos extratos brutos e preparações de pó seco com base na extração das plantas ou partes de plantas com solventes polares orgânicos, como metanol ou e-tanol ou suas misturas. A invenção apresenta, por fim, um processo de isolamento, purificação e identificação de substâncias dos ditos extratos que mostrem atividade antifúngica e bioestimuíante significativa em plantas doentes in vitro e in vivo.

Em maiores detalhes, a invenção apresenta: . Uma preparação adequada para proteção biológica de plantas à base de plantas ou partes de plantas de Tuibaghia vioiacea (alho selvagem) na forma de um extrato bruto, obtenível pelas seguintes etapas: (i) secagem do material vegetal a 30-40°C excluindo-se a luz solar; (ii) trituração do material vegetal seco a um tamanho de grão entre 0,2-2 mm; (iii) encharcamento do material triturado em um solvente orgânico polar selecionado do grupo que consiste em metanol e etanol, formando, assim, uma suspensão/solução; (iv) realização de uma extração sob agitação da suspensão e separação do sobrenadante da fase sólida; (v) repetição da etapa (iii) e (iv) pelo menos mais uma vez; (vi) combinação das fases orgânicas solúveis da etapa (iv) e remoção do solvente orgânico por evaporação a vácuo a 30-40°C, obtendo-se, assim, o resíduo de extrato bruto. . Uma preparação adequada para proteção biológica de plantas à base de plantas ou partes de plantas de Tuibaghia vioiacea (alho selvagem) na forma de um pó seco, obtenível pelas seguintes etapas: (i) secagem do material vegetal a 30-40°C excluindo-se a luz solar; (ii) trituração do material vegetal seco a um tamanho de grão menor que 0,1 mm; (iii) encharcamento do material triturado em metanol, formando, assim, uma suspensão/solução; (iv) realização de uma extração sob agitação da suspensão; (v) evaporação do solvente sem separação prévia da fase sólida da fase orgânica solúvel; (vi) encharcamento do resíduo de fase sólida evaporado em eta-nol e repetição das etapas (iv) e (v); e (vii) secagem do resíduo de fase sólida evaporado, obtendo-se, assim, um pó seco. . Uma preparação correspondente, em que se usa uma ou mais das diferentes partes aéreas das plantas. . Uma preparação correspondente, em que se usam partes de solo da planta. . Uma preparação correspondente que compreende um, mais ou todos os seguintes compostos: 2,4,5,7-tetratiaoctano; 2.4.5.6.8- pentatianonano; 2.3.5.7.9- pentatiadecano; 2,4,6-tritiaeptano; e 2,4-ditiapentano. . Uma preparação correspondente também compreendendo materiais de veículo sólidos pulverulentos ou cargas e/ou aditivos que aumentem ou regulem o efeito da preparação. . Uma preparação na forma de uma solução ou suspensão aquosa à base de uma preparação seca conforme acima especificada. . Uma preparação correspondente, em que a concentração de extrato bruto ou pó seco está na faixa de 0,2 g/L a 2 g/L, de preferência de 0,5-1,0 g/L. . Uma composição compreendendo uma primeira preparação vegetal conforme acima especificada e pelo menos uma segunda preparação vegetal na forma de um extrato bruto, pó seco ou uma suspensão ou solução aquosa dela, a dita segunda preparação vegetal exercendo um efeito protetor de plantas adicional sobre as plantas ou suas partes tratadas com a composição. . Uma composição correspondente, em que a dita segunda preparação vegetal deriva de uma espécie do gênero Agapanthus, de preferência A. africanuns, e é obtida por etapas de processo análogas às da dita primeira preparação vegetal. . Uma composição correspondente, em que a segunda preparação vegetal deriva de uma mistura de espécies da família do cravo e espécies de alfafa, em que a proporção em peso do material de espécies de cravo está entre 80 e 99%, a dita segunda preparação vegetal sendo obtida por etapas de processo análogas às da dita primeira preparação vegetal. . Uma composição de três componentes compreendendo: (i) uma primeira preparação vegetal conforme acima especificada, (ii) uma segunda preparação vegetal derivada de uma espécie do gênero Agapanthus, e (iii) uma terceira preparação vegetal derivada de uma mistura de espécies da família do cravo e espécies de alfafa, em que a proporção em peso do material seco das espécies de cravo está entre 80 e 99%, cada preparação na forma de um extrato bruto, pó seco ou uma suspensão ou solução aquosa dele, as ditas segunda e terceira preparações exercendo um efeito protetor de plantas adicional sobre plantas ou suas partes tratadas com a composição. . Uso da preparação/composição conforme acima especificada como um agente biológico protetor de plantas. . Uso da dita preparação/composição, em que o agente biológico protetor de plantas é um agente antimicrobiano, como um agente antibacte-riano ou um agente antifúngico, de preferência um agente antifúngico. . Uso da dita preparação, em que o agente antifúngico inibe o crescimento de micélios de fungos. . Uso correspondente para a prevenção de infecção de colheitas por fungos sob condições de campo. . Uso da dita preparação/composição, em que o agente biológico protetor de plantas é um agente bioestimulante, que provoca, de preferência, indução de crescimento e/ou induz resistência adquirida sistêmica em plantas ou partes de plantas tratadas com o agente. . Uso correspondente, em que o agente bioestimulante provoca estimulação do crescimento de mudas. . Composto isolado da dita preparação conforme acima especificada selecionada do grupo que consiste em: 1CH3S3CH2SSS7CH2S9CH3 (2,4,5,6,8-pentatianonano) 1CH3SS4CH2S6CH2S8CH2S10CH3 (2,3,5,7,9-pentatiadecano) 1CH3S3CH2S5CH2S7CH3 (2,4,6-tritiaeptano) 1CH3S3CH2S5CH3 (2,4-ditiapentano) . Composição adequada para proteção de plantas, compreendendo pelo menos dois, de preferência todos os compostos selecionados do grupo que consiste em: 2,3,5,7,9-pentatiadecano; 2,4,5,6,8-pentatianonao; 2,4,6-tritiaeptano; 2,4-ditiapentano; 2,4,5,7-tetratiaoctano. . Uso dos ditos compostos/composições como agente biológico protetor de plantas. . Uso dos ditos compostos/composições como agente antifúngi-co, que inibe, de preferência, o crescimento de micélios de fungos. . Processo para a preparação de um extrato bruto ou uma preparação de pó seco ou suspensões ou soluções aquosas dele, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que se realizam as seguintes etapas: (i) secagem do material vegetal a 30-40*0 excluindo-se a luz solar; (ii) trituração do material vegetal seco a um tamanho de grão entre 0,2-2 mm, de preferência 1 mm; (iii) encharcamento do material triturado em um solvente orgânico polar selecionado, como metanol ou etanol, formando, assim, uma sus-pensão/solução; (iv) realização de uma extração sob agitação da suspensão e separação do sobrenadante da fase sólida; (v) repetição da etapa (iii) e (iv) pelo menos mais uma vez; (vi) combinação das fases orgânicas solúveis da etapa (iv) e remoção do solvente orgânico por evaporação a vácuo a 30-40°C, obtendo-se, assim, o resíduo de extrato bruto; e, no caso da preparação de uma preparação aquosa: (vii) suspensão do extrato bruto resultante em água a uma concentração adequada; ou, alternativamente, as etapas de: (ia) secagem do material vegetal a 30-40°C excluindo-se a luz solar; (iia) trituração do material vegetal seco a um tamanho de grão menor que 0,1 mm; (iiia) encharcamento do material triturado em um primeiro solvente orgânico polar, como etanol ou metanol, formando, assim, uma sus-pensão/solução; (iva) realização de uma extração sob agitação da suspensão; (va) evaporação do solvente sem separação prévia da fase sólida da fase orgânica solúvel; (via) encharcamento do resíduo de fase sólida evaporado em um segundo solvente orgânico polar e repetição das etapas (iva) e (va); (viia) secagem do resíduo de fase sólida evaporado, obtendo-se, assim, um-pó seco; e, no caso da preparação de uma preparação aquosa: (viii) suspensão do pó seco resultante em água a uma concentração adequada. . Um processo correspondente, em que o solvente orgânico polar da etapa (iii) é metanol ou etanol a 90-100%. . Um processo correspondente, em que o dito primeiro solvente orgânico polar da etapa (iiia) é metanol a 90-100%, e o dito segundo solvente orgânico polar da etapa (via) é etanol a 90-100%. . Um processo correspondente, em que o respectivo solvente é usado para extrações a uma concentração de 1,0-3,0 mUg de peso seco do material vegetal triturado. . Um processo correspondente, em que a concentração do extrato bruto ou do material em pó seco na solução ou suspensão aquosa está entre 0,2 g/L e 2 g/L, de preferência entre 0,5 g/L e 1 g/L.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO (A) Definições Gerais Usam-se os termos e expressões acima e abaixo, de acordo com o entendimento desta invenção, com os seguintes significados: o termo "agente de proteção de planta" ou "agente protetor de planta" significa, se não especificado de outra forma, qualquer tipo de agente, produto, extrato, composição sintética ou natural que seja eficaz em um sentido amplo para a proteção e saúde de uma planta contra infecção e lesões por patógenos in vitro e/ou irt vivo. O termo inclui agentes, produtos, extratos, composições ou componentes isolados únicos de extratos que possam mostrar algumas atividades e/ou propriedades biológicas diferentes, como atividade/eficácia antimicrobiana, antiviral, antifúngica e bioestimulan-te, atividade indutora/promotora de crescimento (com relação à planta a ser protegida), atividade inibidora de crescimento (com relação à(s) planta(s) competitiva(s) com a planta a ser protegida), atividade indutora/promotora de resistência adquirida sistêmica e/ou imunológíca e atividade indutora/promotora de aleiopatia. O termo "proteção biológica de planta" significa, de acordo com a invenção, se não especificado de outra forma, que a proteção de uma planta é conseguida por substâncias ou fontes de ocorrência natural ou derivadas naturalmente, de preferência de plantas, e não por meios ou agentes sintéticos ou químicos, que não ocorram na natureza, de preferência plantas ou partes de plantas. O termo "agente biológico de proteção (protetor) de planta" é, assim, consequentemente, um extrato vegetal, uma preparação vegetal, uma composição à base de plantas ou suas partes, ou um agente isolado de um extrato/preparação/composição vegetal, todos mostrando eficácia significativa contra um patógeno vegetal in vitro e/ou in vivo. Esse termo também inclui compostos quimicamente sintetizados que sejam estrutural e funcionalmente idênticos ao composto derivado naturalmente isolado, mas exclui expressamente pesticidas quimicamente sintetizados e compostos relacionados sem nenhuma contrapartida derivada naturalmente. O termo "pesticida" significa, de acordo com a invenção, se não especificado de outra forma, compostos, agentes ou composições sintéticas que não ocorram ou não sejam derivadas naturalmente, que tenham eficácia protetora de plantas. O termo "patógeno de planta" significa um composto ou composição ou material vivo, como um microorganismo (incluindo vírus), que cause doença ou lesão à planta. Em um âmbito mais estreito da invenção, o termo focaliza microorganismos patogênicos, incluindo produtos metabólicos desses microorganismos. O termo "antimicrobiano", de acordo com a invenção engloba uma eficácia ou atividade contra microorganismos, incluindo vírus, bactérias e fungos, que reduz ou elimina in vitro e/ou in vivo o número (relativo) de microorganismos ativos que ataquem a planta ou suas partes a serem protegidas. Assim, o termo inclui os termos "antiviral", "antibacteriano" e "anti-fúngico". Um "agente antimicrobiano" de acordo com a invenção é um agente biológico protetor de planta, conforme acima especificado, que previna ou reduza infecções ou lesões de uma planta causadas por um microorganismo patogênico. O termo "antibacteriano" significa, de acordo com a invenção, uma atividade ou eficácia (por exemplo, de um agente ou extrato, etc.) que reduza ou elimine o número (relativo) de bactérias ativas. Um "agente antibacteriano" de acordo com a invenção é um agente biológico protetor de planta, conforme acima especificado, que previna ou reduza infecções ou lesões in vitro e/ou in vivo de uma planta causadas por uma bactéria patogênica. O termo "antiviral" significa, de acordo com a invenção, uma ati- vidade ou eficácia (por exemplo, de um agente ou extrato, etc.) que reduza ou elimine o número (relativo) de vírus ativos. Um "agente antivira!" de acordo com a invenção é um agente biológico protetor de planta, conforme acima especificado, que previna ou reduza infecções ou lesões in vitro e/ou in vivo de uma planta causadas por um vírus patogênico. O termo "antifúngico" significa, de acordo com a invenção, uma atividade ou eficácia (por exemplo, de um agente ou extrato, etc.) que reduza ou elimine o número (relativo) de fungos ativos. Um "agente antifúngico" de acordo com a invenção é um agente biológico protetor de planta, conforme acima especificado, que previna ou reduza infecções ou lesões in vitro e/ou in vivo de uma planta causadas por um fungo patogênico. A atividade antifúngica pode levar à inibição do crescimento de mícélios, assim como a geraminação de esporos de fungos. O termo "bioestimulante" significa, de acordo com a invenção, se não especificado de outra forma, uma atividade ou eficácia que estimule, aumente ou melhore muitos processos diferentes na planta ou partes de plantas, como melhor geração de substâncias promotoras de crescimento, como açúcares e aminoácidos, melhor suprimento adequado de células com nutrientes disponíveis e reguladores de crescimento, metabolismo celular intensificado, melhor descontaminação de células, defesa imune intensificada, promoção do crescimento e rendimento, indução de resistência adquirida sistêmica (SAR), inibição do crescimento e rendimento de plantas competitivas (alelopatia). A atividade bioestimulante pode ser causada por agentes, extratos de plantas e composições, incluindo compostos metabólicos sintetizados pela planta a ser protegida após a indução de sua síntese pelo dito agente bioestimulante. Um "agente bioestimulante" de acordo com a invenção é um agente biológico protetor de planta, conforme acima especificado, que mostre as propriedades bioestimulantes acima especificadas em uma planta tratada com esse agente in vitro e/ou in vivo.

Um "regulador do crescimento de planta" é um composto ou uma mistura de substâncias naturais ou sintéticas que modifique ou controle um ou mais processos fisiológicos específicos dentro de uma planta. Se o composto for produzido dentro da planta é chamado de hormônio vegetal, por exemplo, auxinas, gíberelinas, ácido abscfsico e etileno. "SAR" (Resistência Adquirida Sistêmica) ocorre em uma planta ou suas partes, de acordo com a invenção, se mostrar indução ou aumento da atividade de enzimas relacionadas à defesa ou proteção (proteínas PR). Essas enzimas incluem, por exemplo, peroxidase, β-1,3-glucanase e NAD-PH oxidase. (B) Descrição da Planta Tulbaghia violacea é conhecida como alho selvagem, e o nome se origina do fato de que, embora seu sabor seja próximo ao do alho real, supõe-se que não deixa odores desagradáveis no hálito. O nome da espécie "violacea" vem do latim para "violeta". Pertence à família Alliaceae (Líllíacea-e). Tulbaghia violacea se originou na África do Sul. É cultivado como um ornamento em jardins botânicos e em jardins domésticos por todo o sul da Á-frica e é cultivado em alguns países estrangeiros, como EUA e Reino Unido. Tulbaghia violacea é usada em alimentos como substituto do alho. O alho selvagem é tradicionalmente usado para febre e resfriados, mas também para asma e tuberculose. As folhas são usadas para tratar câncer do esôfago. Tulbaghia violacea é uma erva perene, formadora de moitas, vigorosa e que se espalha, com folhagem do tipo grama e rizomas do tipo bulbo. A in-florescência consiste em 3-40 umbelas floridas. Os cimos das flores se localizam em caules longos, finos e solitários, que ficam bem acima da folhagem. As flores nos caules são pequenas e agrupadas em umbelas nas pontas das hastes. A altura madura da planta é de 30 a 60 cm. As flores são de uma cor púrpura lilás ou violeta. Tulbaghia violacea é muito fácil de cultivar e suporta negligências durante muitos anos. As plantas formam moitas que não precisam ser divididas, a menos que as flores mostrem sinais de deterioração. A planta é capaz sobreviver em solo muito ruim ou em solo de jardim comum, mas cresce com maior sucesso em solo argiloso bom generosamente misturado com composto. A drenagem deve ser boa, particularmente em áreas de chuvas de inverno. As plantas requerem umidade a intervalos regulares durante todo o ano, mas mais particularmente durante o verão. São robustas e podem ser cultivadas em locais frios. A propagação é por sementes ou divisões. (C) Microorganismos Sete patógenos fúngicos de plantas sul-africanos comuns são escolhidos para teste quanto às propriedades fungitóxicas dos extratos de plantas. Esses patógenos fúngicos incluíam Botrytis cinerea Pers:. Fr. {Hifo-micetos), Fusarium oxysporum Schlechtend.: Fr, (Hifomicetos), Sclerotinia rollfisii Sacc. (Agonomicetos), Rhizoctonia solani Kühn (Agonomicetos), Brotyosphaeria dothidea (Moug.: Fr.) Ces. & De Not. (Loculoascomicetos), Phythium ultimum Trow (Oomicetos) e Mycosphaerella pinodes (Berk. + Blox.).

As bactérias patogênicas para plantas usadas neste estudo incluem Agrobacterium tumefaciens (Smith e Townsend), Clavibacter michiga-nensis (Smith), Erwinia carotovora pv. carotovora (Jones), Xanthomonas campestris Pammel pv. Phaseoli (Dawson), fíalstonia solanacearum (Smith) e a bactéria humana Moraxella catarrhalis (Frosch + Kolle). (D) Triagem de extratos brutos de Tulbaghia violacea quanto à atividade antimicrobiana e bioestimulante in vitro 1. Geral Extratos de certas plantas de T. violacea possuem propriedades antimicrobiana e bioestimulante e têm o potencial de ser exploradas como produtos naturais no controle de doenças de plantas ou para promover o crescimento de colheitas. O potencial bioestimulante dos extratos foi avaliado in vitro seguindo-se seu efeito sobre a taxa de respiração de uma monocultura de células de levedura, a germinação de sementes de agrião, assim como o crescimento de radícula e coleóptilo de mudas de agrião.

Os extratos brutos de partes aéreas e abaixo do solo de T. violacea revelam significativa atividade bioestimulante sobre a taxa de respiração de células de levedura, assim como como sobre o crescimento de radícula e coleóptilo de mudas de agrião, mas não têm nenhum efeito sobre a germinação das sementes.

Os extratos brutos também mostram alguma atividade antibacte-riana in vitro contra quatro das sete bactérias testadas.

Os extratos brutos provocam uma atividade antifúngica significativa (P < 0,05) contra seis fungos fitopatogênicos economicamente importantes. Os extratos brutos têm desempenho melhor que o fungicida padrão u-sado como controle positivo e inibem completamente o crescimento de micé-lios de cinco dos seis fungos, incluindo o Pythium ultimum altamente resistente. 2. Recuperação de Extrato Bruto do Material de Planta Seco Depois de secar e triturar, 7,96% (p/p) de material seco de partes aéreas e 26,1% (p/p) de material seco de partes abaixo do solo podem ser obtidos a partir do material de T. violacea fresco original (Tabela 1). Depois da extração, 14% (p/p) de material bruto seco podem ser recuperados a partir do material de partes aéreas seco, ao passo que 6,7% (p/p) de material bruto seco podem ser recuperados a partir do material de partes abaixo do solo seco.

Tabela 1: Recuperação de Extrato Bruto do Material de Planta Seco 3. Atividade antibacteriana in vitro de extratos brutos de Γ. violacea Das seis bactérias fitopatogênicas usadas como organismos de teste, o crescimento de três patógenos de plantas (C. michiganensis, R. so-lanacearum, X. campestris) foi significativamente inibido tanto por extratos brutos de partes abaixo do solo, quanto aéreas, mostrando os resultados para M. catharrhalis (Tabela 2).

Tabela 2: Inibição do Crescimento in vitro de Bactérias Patogênicas para Plantas por Extratos Brutos de Diferentes Órgãos de Tulbaghia violácea As outras três bactérias eram muito mais resistentes ao tratamento com os extratos brutos e não foram afetadas pelos extratos. 4. Atividade Antifúnaica de Extratos Brutos de T. violacea O extrato da parte abaixo do solo de T. violacea inibiu completamente (100%) o crescimento de micélios de B. cinerea, S. rolfsii e P. ulti-mum e mostrou uma inibição muito grande {> 95%) tanto de F. oxysporum, quanto de R. solani. A menor inibição observada (90%) foi contra B. dothidea (Figura 1). A inibição do crescimento de micélios pelo extrato de partes aéreas também foi muito elevada (> 95%) para B. cinerea, S. rolfsii e P. ulti-mum e > 80% para fí. solani e B. dothidea. Fusarium oxysporum (75% de inibição) foi o mais resistente contra o tratamento com extrato de partes aéreas. Estatisticamente, tanto os extratos brutos de partes aéreas, quanto abaixo do solo de T. violacea tiveram desempenho melhor que o fungicida padrão (P < 0,05) em termos de inibição do crescimento de micélios de quatro dos seis fungos testados. Entretanto, ambos os extratos se compararam favoravelmente com o fungicida padrão em termos de inibição do crescimento de micélios. A figura 2 ilustra a atividade antifúngica in vitro dos mesmos dois extratos brutos de T. violacea após armazenamento a -20°C durante um a-no. Em comparação com o fungicida padrão, observou-se uma diminuição na atividade antifúngica de > 30% tanto para os extratos brutos de partes aéreas, quanto abaixo do solo armazenados em um congelador a -20°C durante um ano. A Tabela 3 mostra a atividade antifúngica média in vitro de extratos de diferentes órgãos de plantas de T. violacea (1 mg/mL) in vitro, em comparação com o fungicida Eria® padrão.

Tabela 3: Atividade antifúngica in vitro de extratos brutos de diferentes órgãos de T. violacea Fungicida padrão de amplo espectro; carbendazim/dife-noconazol (Eria®) Diferentes letras após os valores indicam diferenças estatisticamente significativas 5. Atividade Bioestimulante de Extratos Brutos de T. violacea Tanto extratos brutos de partes aéreas, quanto abaixo do solo de T. violacea aumentaram a taxa de respiração de uma monocultura de células de levedura acentuadamente nos primeiros 90 minutos de incubação (figura 3), em comparação tanto com controles de água, quanto de Com-Cat®. Entretanto, após 120 minutos de incubação, as diferenças na taxa de respiração eram menos pronunciadas, pois a taxa máxima provavelmente foi atingida. Embora o bioestimulante comercial ComCat® também tivesse um efeito crescente sobre a taxa de respiração de células de levedura, essa não foi tão acentuada como o efeito de ambos os extratos brutos de T. violacea. Não foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa (P < 0,05) na porcentagem de germinação de sementes de agrião entre sementes tratadas e não tratadas (Tabela 4).

Tabela 4: Porcentagem média (%) de germinação de sementes de agrião, tratadas com extratos de partes aéreas e abaixo do solo de T. violacea, a 25°C durante um período de incubação de 96 horas. ComCat® e água destilada serviram de controles.

Entretanto, tanto os extratos brutos de partes aéreas, quanto abaixo do solo de T. violacea tiveram um efeito estimulante significativo tanto sobre o crescimento de coleóptilos, quanto de raízes de mudas de agrião, quando comparados ao controle de água. Não houve nenhuma diferença significativa na atividade bioestimulante entre os extratos e o bioestimulante comercial ComCat® (figura 4 e 5). (6) Propriedades Antifúnaicas de Extratos Brutos de A. africanus Combinados com Extratos de Tulbaahia violacea Um extrato bruto ou um pó seco de uma espécie do gênero A-gapanthus, como A. africanus, é preparado de maneira análoga aos métodos aqui descritos para T. violacea. Os extratos ou pós secos são misturados em uma razão de 1:1, e se aplicam soluções aquosas em diferentes concentrações variando de 0,25 mg/ml_ a 2 mg/mL. É interessante notar que uma mistura a 50:50 dos dois extratos, aplicada a 0,5 mg/mL, mostra um controle total dos seis fungos de teste (Tabela 5), ao passo que, em comparação, com a aplicação separada da concentração de duas vezes (1 mg/mL) da preparação de A. africanus ou da preparação de T. violacea, a inibição do crescimento de micélios dos fungos de teste não é completa. Mesmo a uma concentração de 0,25 mg/mL de uma preparação combinada de extrato/pó seco (1:1) leva a uma inibição global do mesmo sistema de fungo de mais de 90%, indicando que uma sinergia significativa é eficaz no sistema de combinação. O mesmo efeito é observável com outros agentes protetores de plantas.

Tabela 5: Atividade Antifúngica in vitro de Extratos Brutos das Partes Acima do Solo de T. violacea (X) e A. afrícanus (Y) e Usadas Juntas em uma Razão de 1:1 e Aplicadas a 0,5 mg/mL

Fungicida padrão de amplo espectro; carbendazim/difenoconazol (Eria®) Diferentes letras após os valores indicam diferenças estatisticamente significativas (71 Sumário dos Resultados Os efeitos fungitóxicos in vitro tanto dos extratos brutos de partes aéreas, quanto acima do solo de T. violacea são significativamente mais elevados do que os do fungicida sintético. Todos os fungos de teste são sensíveis aos extratos, enfatizando seu potencial de amplo espectro. À luz do fato de que T. violacea é fácil de cultivar e pode suportar negligências durante muitos anos, é um forte candidato a cultivo em grande escala como uma planta doadora no caso de a produção de um fungicida natural ser considerada. O declínio da fungitoxicidade de extratos de Γ. violacea de um ano de idade a -20°C é ambientalmente desejável para uso sob condições de campo. À luz da atual ênfase no cultivo orgânico, o desenvolvimento de um fungicida natural a partir de extratos de 7. violacea deve ser fortemente considerado. O fato de que o extrato de parte aérea é tão potente quanto o extrato de parte abaixo do solo na inibição do crescimento de micélios de um amplo espectro de patógenos de plantas indica que plantas cultivadas pode-riam ser colhidas de maneira não destrutível. Partes abaixo do solo podem, então, permanecer no solo para a produção da colheita da próxima estação de maneira sustentável.

Além disso, tanto extratos brutos de partes aéreas e abaixo do solo de T. violacea, quanto o bioestimulante comercial ComCat® aumentam significativamente a taxa de respiração de uma monocultura de células de levedura nos primeiros 90 minutos e reduzem o ritmo após 120 minutos de incubação, indicando um efeito bioestimulante significativo. Isso significa que tanto os extratos, quanto ComCat® estimulam a produção de dióxido de carbono mais do que a água, isto é, aumentam a taxa de respiração, tomando mais energia disponível para a germinação e crescimento de mudas. Consequentemente, parece existir uma correlação positiva entre uma alta taxa de respiração e o crescimento de mudas, pois extratos brutos de ambos os órgãos estimulam significativamente o crescimento de radículas e coleóptilos de mudas de agrião durante um período de 96 horas, em comparação com o controle de água. Nesse estudo, não se pode observar nenhuma diferença significativa entre os extratos brutos e ComCat® na estimulação do crescimento de mudas, colocando os extratos de T. violacea em igualdade com o bioestimulante comercial. Estatisticamente (P < 0,05), a germinação de sementes de agrião não mostra nenhuma resposta significativa a extratos de ambos os órgãos, em comparação com os controles tanto de ComCat®, quanto de água. Esse estudo revela que os extratos de T. violacea de fato possuem propriedades bioestimulantes, particularmente com relação à intensificação do crescimento de mudas. Isto representa um desafio para a pesquina em grande escala dessa questão para avaliar, além disso, o potencial de aplicação sob condições de campo. Em sumário, a atividade anti-fúngica de amplo espectro média acima de extratos brutos de T. violacea, assim como a menor atividade antibacteriana e as propriedades bioestimulantes significativas levam à conclusão de que o extrato bruto de T. violacea é favorável para o uso dessas plantas na proteção biológica de plantas.

Extratos/pós secos combinados à base de preparações de duas ou mais plantas com propriedades protetoras de plantas, em que pelo menos uma é T. violacea, mostram uma eficácia antifúngica e bioestimulante de ampla gama pelo menos in vitro, com base em efeitos sinérgicos. (E) Controle in vivo de Mvcosphaereila oinodes em Folhas de Ervilha (Pisum sativum) por Extratos de Tulbaahia violacea 1. Geral A ferrugem Ascochyta de ervilhas (Pisum sativum) causada por Mycosphaerelia pinodes (Berk & Blox.) Vesterger ocorre no mundo todo e causa perdas de rendimento de até 30%. É uma doença de importância e-conômica e pode causar será redução de rendimento de ervilhas cultivadas tanto para consumo humano, quanto animal. É uma grande restrição à produção de ervilhas no campo, e é o patógeno foliar mais destrutivo da ervilha em muitos países. O fungo infecta mudas de ervilha ao emergirem, causando lesões em cinta no caule. A infecção dos caules resulta em pequenas raias marrons que depois ficam de cor azul-preta, que reduzem as popula- ções de ervilhas no campo e aumentam o alastramento. As lesões necróti-cas se desenvolvem em todas as partes aéreas da planta de ervilha, incluindo as vagens, cultivada a partir de sementes contaminadas.

Mycosphaerella pinodes se dissemina mediante picnidiosporos durante toda a estação. Depois da germinação dos esporos, o fungo cresce sobre a superfície da planta antes de formar um aspersório e penetrar na cutícula. Os sintomas podem aparecer até 24 horas após a infecção sob condições ótimas e se caracterizam por lesões marrons a púrpura coales-centes no tecido aéreo. Esporos não germinados permanecem viáveis durante até 21 dias sob condições secas. A infecção e o desenvolvimento da doença são altamente dependentes da temperatura e da umidade da folha.

Um extrato bruto em metanol de partes aéreas de T. violacea é testado contra Mycosphaerella pinodes, a causa de manchas pretas ou ferrugem Ascochyta em ervilhas (Pisum sativum). O extrato bruto previne a infecção por esporos de M. pinodes das folhas de ervilha, quando as folhas são inoculadas com esporos tanto antes, quanto depois do tratamento com o extrato, confirmando a inibição completa da germinação de esporos. O extrato bruto não mostra nenhuma reação fitotóxica sobre as folhas, mesmo à maior concentração aplicada. 2. Atividade Antifúnaica in vivo de Preparações de T. violacea sob Condições de Estufa O tratamento de folhas de ervilha destacadas com o extrato bruto primeiro, seguido por inoculação com esporos 30 minutos depois, suprime totalmente: a formação de lesões nas folhas (Tabela 6) a todas as concentrações testadas. Esse também é o caso para o tratamento com fungicida padrão antes da inoculação. Entretanto, quando as folhas são inoculadas com os esporos primeiro, seguido pelo tratamento com diferentes concentrações do extrato bruto, formam-se lesões nas folhas tratadas com as baixas concentrações de extrato de 0,25 mg/mL e 0,5 mg/mL (2,38 e 1,88 mm, respectivamente; Tabela 6). A inoculação com esporos seguida por tratamento com extrato bruto de partes aéreas às mesmas duas baixas concentrações mostrou uma supressão significativamente melhor (P < 0,05) do desenvolvimen- to da lesão do que a inoculação com esporos seguida por tratamento com o fungicida padrão (3,63 mm), mas este inibiu significativamente a formação de lesões, quando comparado com o controle (apenas inoculação de esporos, 9,44 mm). A concentrações de 1,0 e 2,0 mg/mL, o extrato de partes aéreas de T. violacea inibiu totalmente a infecção de folhas de ervilha por esporos de M. pinodes (Tabela 6).

No ensaio de triagem in vivo usando folhas de ervilha inoculadas com esporos de M. pinodes antes ou depois do tratamento com os extratos de plantas, o extrato bruto de T. violacea pode inibir a germinação de esporos de M. pinodes 100% à menor concentração usada (0,25 mg/mL), quando o extrato foi aplicado antes da inoculação com esporos. Esse é um valor muito favorável em comparação com outras plantas, como extratos de Aga-panthus africanus, que mostra uma inibição de 100% a uma concentração de no mínimo 1 mg/mL.

Tabela 6: Atividade in vivo de Extratos Brutos das Partes Acima do Solo de T. violacea Contra Mycospaerella pinodes Sobre Folhas de Ervilha ‘Fungicida padrão de amplo espectro; carbendazim/difenoconazol (Eria®) (3) Efeitos Fitotóxicos de Preparações de T. violacea Sobre Fo- lhas de Ervilhas sob Condições de Estufa A classificação de fitotoxicidade in vivo do extrato bruto das partes aéreas de T. violacea em termos de sua interação com e potencial para induzir necrose em folhas de ervilha revelou que o extrato bruto não era fito-tóxico, mesmo à maior concentração testada (Tabela 7), e que o efeito sem sintomas do extrato era similar ao da água e controles de fungicida padrão. Tabela 7: Classificação de Sintomas de Fitotoxicidade Foliar Média em uma Escala de Seis Categorias após Inoculação Direta de Folhas de Ervilha no Quarto Nó com Diferentes Concentrações de um Extrato Bruto de Partes Aéreas de Tulbaghia violacea Os valores designados com diferentes letras diferiram significativamente (P < 0,05) de acordo com o procedimento estatístico de Diferença Menos Significativa (LSD). 14) Discussão Geral Nenhuma das quatro concentrações (0,25,0,5, 1,0 e 2,0 mg/mL) de um extrato bruto de partes aéreas de T. violacea é fitotóxico para folhas de ervilha (Pisum sativum). Quando as folhas de ervilha são tratadas com o extrato primeiro e seguido por inoculação com esporos 30 minutos depois, o extrato suprime a germinação de M. pinodes totalmente, mesmo à menor concentração de 0,25 mg/mL. Isso indica que o extrato bruto de partes aéreas de T. violacea mostram potencial para ser usado como uma medida preventiva contra ferrugem Ascochyta causada por M. pinodes em folhas de ervilha, sem causar lesões à planta. De acordo com Benner (1993, Pesticide Science 39:95-102), a fitotoxicidade é um fator decisivo na avaliação de extratos de plantas quanto à sua aplicação em potencial como pesticidas naturais em agricultura.

Além disso, quando as folhas de ervilha foram inoculadas com esporos de M. pinodes 30 min. antes do tratamento com o extrato bruto de partes aéreas de T. violacea, a concentração de 1 mg/mL inibiu totalmente a germinação de esporos e a subseqüente formação de lesão, indicando que o extrato bruto também possui o potencial para ser usado como uma medida corretiva contra ferrugem Ascochyta.

Os resultados obtidos nesse estudo confirmam o potencial de um extrato bruto de T. violacea para controlar infecções fúngicas de colheitas, pelo menos sob condições controladas. Mesmo a concentração quatro vezes maior que era necessária para inibir corretivamente a germinação de esporos de M. pinodes, em comparação com a menor concentração que era necessária como medida preventiva, ainda se encontra dentro de uma faixa economicamente viável de 1 g/L. Considerando-se que uma média de 400 litros de solução de fungicida normalmente são aplicados por hectare sob condições agrícolas, essa concentração está em linha com os fungicidas atuais comercialmente disponíveis. Uma concentração inibitória mínima (MIC) de 1 g/L também é muito menor que a MIC relatada para um extrato bruto de bulbõ de Eucomis autumnalis (Pretorius et al., 2002, Annals of Applied Bioiogy 141:125-131).

Esses achados são valiosos para avaliar a aplicação em potencial do extrato bruto de partes aéreas de T. violacea em um sistema de controle de pragas integrado (IPM) em termos de minimização das perdas de colheitas causadas pela ferrugem Ascochyta. (5) Controle de Carvão Coberto e Solto de Sorgo por um Extrato Bruto de Partes Aéreas de Tulbaghia violacea sob Condições de Campo O sorgo (Sorghum bicolor L. Moench) é uma importante fonte de alimentos em muitos países não desenvolvidos e serve de principal alimento para a maioria das pessoas. É predominantemente cultivado em sistemas de produção de pequena escala sob uma ampla gama de condições ambientais. Entretanto, a produção de sorgo é de menos de 1,0 toneladas/ha devido a várias razões. O carvão de semente coberta de sorgo (Sporísoriium sorghi Link, G. P. Clinton) e de semente solta (Sporisoríum cruenta Kuhn, A. A. Pot-ίθή são os principais fatores responsáveis pelos baixos rendimentos. Ambas as doenças ocorrem freqüentemente quando o sorgo é cultivado sem tratamento das sementes contra esses dois patógenos. Um extrato bruto de partes aéreas de Tuibaghia violacea pode ser avaliado contra carvão de semente coberta (Sporísoriium sorghi) e solta (Sporísoriium cruentum) sob condições de campo. O extrato bruto é aplicado à taxa de 2,0 mg/mL em lotes de 90,0 g de sementes de sorgo por inoculação artificial de conjuntos separados de sementes de sorgo com esporos de carvão a uma taxa de 0,5% (p/p). Um fungicida padrão, Thiram (65 W), é aplicado como um tratamento de sementes a uma taxa de 0,25%/kg de sementes de sorgo e serve de controle positivo. A incidência de doença observada durante a colheita é expressa como uma porcentagem das plantas infectadas. Ambos os tratamentos reduzem significativamente (P < 0,05) a incidência tanto de carvão de semente solta, quanto coberta e resultam em aumentos de rendimento significativos em comparação com o controle não tratado. A incidência de carvão coberto e solto e o rendimento podem ser sígníficativamente correlacionados (R2-0,92, P < 0,05) e (R2 = 0,75, P = 75). Desses resultados, considera-se que o extrato bruto de partes aéreas de Γ. violacea tem o potencial de ser desenvolvido em um biofungicida ambientalmente amigável para aplicação em sistemas de cultivo em pequena escala, em que substâncias químicas sintéticas estão fora do alcance do fazendeiro de subsistência médio. O tratamento de sementes de sorgo com um extrato bruto de partes aéreas de T. violacea antes do plantio reduziu completamente (100%) (P < 0,05) a incidência de carvão coberto (Tabela 8a) e reduziu significativamente a incidência de carvão solto (Tabela 8b), em comparação com os controles não tratados correspondentes, e se comparou favoravelmente com o fungicida sintético, Thiram, no controle de carvão de semente coberta. Tabela 8a: Efeito de um Extrato Bruto de Partes Aéreas de T, violacea sobre a Porcentagem de Incidência da Doença de Carvão de Semente Coberta no Sorgo sob Condições de Campo Tabela 8b: Efeito de um Extrato Bruto de Partes Aéreas de T. violacea sobre a Porcentagem de Incidência da Doença de Carvão de Semente Solta no Sorgo sob Condições de Campo Os valores designados com diferentes letras diferiram significativamente (P < 0,05) de acordo com o procedimento estatístico de Menor Diferença Significativa (LSD) de Duncan. A inoculação de sementes de sorgo pré-plantadas com esporos de carvão coberto e solto, sem tratar também as sementes com Thiram ou extrato bruto de A. violacea (controles não tratados), diminuiu significativamente os rendimentos finais (Tabelas 7a e 7b). No caso do carvão coberto, a perda de rendimento foi de 46,7% e, no caso do carvão solto, 55,2%. Entretanto, em ambos os casos, não houve nenhuma diferença significativa de rendimento entre os gráficos traçados com Thiram ou extrato bruto de T. violacea. Uma diferença significativa no rendimento entre os controles tratados com Thiram e não tratados também foi observada em ambos os casos. A porcentagem de incidências de carvão coberto e solto estava negativamente correlacionada (R2 = -0,92 e -75, respectivamente) com o rendimento de grãos de sorgo, indicando o impacto negativo que ambas as doenças de carvão tinham no rendimento. O pré-tratamento de sementes de sorgo com um extrato bruto de partes aéreas de T. violacea a uma taxa de 2 g/L previne completamente a infecção de semente coberta e reduz significativamente a incidência de carvão de semente soita sob condições de campo. Isso é favoravelmente comparável com a diminuição na incidência de doença pelo fungicida sintético padrão, Thiram, e confirma a eficácia do extrato bruto. Embora a incidência de carvão de semente coberta seja relativamente baixa (9%) em comparação com a incidência de carvão solto (25%) nos controles não tratados, todas as plantas (100%) cultivadas a partir de sementes inoculadas podem ser totalmente protegidas contra a infecção por carvão de semente coberta, ao passo que a incidência de carvão solto é significativamente reduzida após o tratamento das sementes com o extrato bruto de partes aéreas de T. violacea. As diferenças significativas nos rendimentos de grãos obtidas entre plantas cultivadas a partir de sementes tratadas e não tratadas confirma o impacto que ambas as doenças têm sobre o rendimento, assim como a eficácia do extrato bruto no controle de ambas as doenças. O tratamento de sementes de sorgo com um extrato bruto de partes aéreas de T. violacea não tem nenhum efeito inibitório aparente sobre a germinação de sementes ou o crescimento de mudas. Isto, juntamente com as atividades antifúngicas in vitro e in vivo significativas demonstradas nesse estudo para um extrato bruto de partes aéreas de T. violacea contra um amplo espectro de patógenos fúngicos, confirma tanto seu potencial de aplicação, quanto a confiabilidade. : Em geral, embora o fungicida sintético Thiram seja muito eficaz no controle de infecção por carvão de semente coberta e solta no sorgo, a aplicação de extratos brutos de plantas, incluindo T. violacea, parece uma alternativa conveniente, eficaz e econômica para a maioria dos fazendeiros de subsistência que não podem arcar com substâncias químicas sintéticas. (6) Efeito de Tulbaghia sobre o Mecanismo de Defesa de Plantas (SAR) As plantas (por exemplo, trigo e girassol) provocam, quando tratadas com um extrato de Tulbaghia violacea e outra planta de referência (A africanus) de acordo com a invenção, uma ativação significativa de proteínas PR, como NADPH oxidase, peroxidase e β-1,3-glucanase. Plantas de trigo tratadas com o extrato de T. vioíacea exibem dois picos na atividade de NADPH oxidase. O primeiro pico é atingido 6 h após o tratamento com um aumento induzido na atividade de 36% com relação ao tempo de amostragem precedente, em comparação com o controle não tratado. O segundo pico muito mais elevado é atingido 12 h após o tratamento com um aumento induzido na atividade de 100% com relação ao tempo de amostragem precedente (figura 8), após o que a atividade declina. Girassol tratado com o extrato de T. vioíacea exibe um aumento na atividade de NADPH oxidase de 88,5% durante as primeiras 6 h após o tratamento. Esse nível elevado de atividade é mantido durante 48 h após o tratamento, seguido por um declínio abrupto até 96 h após o tratamento (figura 9). O tratamento de trigo com o extrato de T. vioíacea resulta em uma enorme indução na atividade da peroxidase de 460% após 24 h. Essa atividade também permanece elevada durante o período de teste (figura 10). No caso de girassol, os extratos de T. vioíacea induzem significativamente a atividade de peroxidase, particularmente após 48 h e 96 h (figura 11). Para T. vioíacea, a indução foi de 112% após 48 h e 150% após 96 h. O controle de girassol, entretanto, mostrou um leve aumento na atividade de peroxidase durante o período de 96 h, indicando alguma resistência natural. Extratos de Tulbaghia induzem mecanismos de defesa em plantas de trigo e girassol. Esses extratos induzem resistência adquirida localizada, a acumulação de proteínas PR por ativação de gene e, finalmente, resistência adquirida sistemática. O fato de que os extratos induzem uma resposta de defesa tanto em amostras de trigo, quanto girassol indicam que os extratos são responsáveis pela indução de uma resposta de defesa de amplo espectro genérica. O aumento induzido pelo extrato nas atividades de enzimas relacionadas a defesa foi menor, mas comparável ao aumento obtido durante a infecção com cultivares resistentes. (F) Isolamento, Purificação e Identificação de Compostos Antifúngicos de Extratos de Partes do Solo e Áreas de Tulbaghia vioíacea (1) Recuperação de extratos semipurificados líquido-líquido do extrato bruto em metanol A maioria dos compostos tanto nos extratos de partes aéreas, quanto abaixo do solo são mais solúveis em hexano do que nos solventes mais polares usados. Até 9,20 g (14,6%) de compostos de partes aéreas e 7,43 g (8,4%) de partes abaixo do solo podem ser recuperados em hexano, em comparação com a recuperação muito menor nos solventes mais polares (Tabela 9).

Tabela 9: Recuperação de compostos de Tufbaghia vioíacea por solventes para aumentar os valores de DC usando um procedimento de extração líqui-do-líquido (2) Propriedades Antimicrobianas dos Extratos Líquido-líquido de Partes Aéreas e Abaixo do Solo de T. vioíacea Embora todas as extrações líquido-líquido das partes aéreas de 7. vioíacea mostrem atividade antifúngica contra a maioria dos organismos de teste em maior ou menor medida, a dos extratos em hexano e éter dietíli-co são significativamente (P < 0,05) maiores (Figura 6). A inibição do crescimento de micélios de todos os fungos de teste por um ou por ambos os extratos em hexano e éter dietílico é maior que 80%, exceto no caso de P. ultimum, bem-conhecido por sua resistência contra fungicidas, assim como R. sofani (61 %). Ambos esses extratos se comparam favoravelmente com o fungicida padrão usado como um controle positivo. Compostos antifúngicos nas partes abaixo do solo (Figura 7) de 7. vioíacea mostram a mesma tendência a se acumularem nas frações de hexano e éter dietílico após a extração líquido-líquido, como foi o caso com as partes aéreas (Figura 6). Entretanto, no caso de B. dothidea, todos os extratos mostram atividade antifúngica excepcionalmente elevada. (3) Fracionamento por Cromatografia em Coluan (CCF) dos Extratos em He-xano mais Ativos Apenas compostos na extração ativa líquido-líquido em hexano podem ser adicionalmente purificados por meio de cromatografia em coluna no caso tanto das partes aéreas, quanto abaixo do solo de T. violacea. A razão para essa decisão é o fato de que seis vezes mais compostos podem ser recuperados do extrato em hexano, em comparação com o extrato ativo em éter dietílico, no caso de partes aéreas, e quatro vezes mais no caso de partes abaixo do solo. Mais de 1.500 frações de cromatografia em coluna podem ser obtidas dos extratos em hexano para cada uma das partes aéreas e abaixo do solo. Depois de poderem ser submetidas a Q-TLC, as frações com perfis similares são combinadas. Vinte e oito frações de coluna combinadas podem ser obtidas para as partes aéreas e 20 para as partes abaixo do soio dessa maneira. Os resultados são mostrados na Tabela 10. Apenas quatro frações de coluna combinadas (A5, A6, A7 e A8) das partes aéreas apresentam atividade antifúngica acima da média (100, 95, 52,6 e 60,5%), respectivamente, ao passo que apenas duas frações combinadas (B2 e B3) de partes acima do solo são ativas (87 e 97%, respectivamente). O restante das frações é incapaz de suprimir o crescimento de micélios de F. oxysporum eficazmente (Tabela 10). Apenas frações de coluna combinadas que mostram mais de 50% de inibição do crescimento de micélios do fungo de teste em média podem ser adicionalmente purificadas por meio de cromatografia de camada fina preparatória (P-TLC). A razão para tomar 50% de inibição como critério é para compensar a possibilidade de que substâncias ativas possam agir sinergicamente e de que, na separação, a atividade possa declinar.

Tabela 10: Porcentagem (%) de Inibição do Crescimento de Micéllos do Organismo de Teste, Fusarium oxyporum, por Frações Combinadas de Croma-tografia em Coluna de Extrações de Partes Aéreas e Abaixo do Solo de T. violacea (B = Partes Abaixo do Solo e A = Partes Aéreas) Valores com valores negativos (-) indicam estimulação do crescimento de micélios.

Apenas as seis frações ativas combinadas de cromatografia de coluna mostradas na Tabela 10 (A5) Ag, A?, A8) B2 e B3) são submetidas a purificação adicional por meio de P-TLC. (4) Purificação por Cromatografia de Camada Fina Preparatória (P-TLC) Direcionada a Atividade de Frações Ativas Combinadas de Cromatografia em Coluna A purificação direcionada a atividade de compostos nas seis frações de coluna combinadas feita por meio de P-TLC produziu quatro compostos (A5.2, A&1, A7.1 e A7i2) de frações de partes aéreas que mostram atividade antifúngica maior que 50% (100, 85, 87 e 50%, respectivamente) e dois (B2.2 e B3,2) de frações da parte abaixo do solo (87 e 72%, respectivamente; Tabela 11), Esses seis compostos são identificados, e suas estruturas químicas podem ser elucidadas por meio de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN). Interessantemente, na separação, compostos na fração de cromatografia de coluna 8 (A8) das partes aéreas que mostraram 60,5% de inibição do crescimento de micélios (Tabela 10), quando juntos em forma semipurificada, perdem sua atividade antifúngica após a separação por P-TLC (Tabela 11).

Tabela 11: Porcentagem (%) da Inibição do Crescimento de Micélios de F. oxysporum por Diferentes Compostos de T. violacea após Separação por P-TLC (5) Identificação de Compostos Ativos Purificados dos Extratos de Partes Aéreas e Abaixo do Solo de T. violacea por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Espectrometria de Massa Para se obter um nível aceitável de pureza, os extratos complexos em hexano semipurificados de partes aéreas e abaixo do solo de T. violacea são submetidos a fracionamento cromatográfico, que é seguido por separação por P-TLC. O fracionamento do extrato em hexano por cromato-grafia em coluna de sílica com hexano-acetona (95:5) como eluente a uma taxa de fluxo de 30 mL/h, seguido por várias purificações por P-TLC em hexano-acetona (9,5:0,5), resulta em 6 frações razoavelmente puras (vide acima). O bioensaio das frações revela que apenas duas frações das partes abaixo do solo e quatro das partes aéreas mostram resultados promissores relevantes a essa investigação. A presença de trilinoleato de glicerol em todas as frações prejudica a separação e torna a elucidação estrutural difícil. Uma purificação adicional das frações por P-TLC fornece compostos razoavelmente puros (B2.2 e B3.2 das partes abaixo do solo e A5.2, Α6.ι, A7.1 e A7.2 das partes aéreas), cujas estruturas podem ser determinadas por métodos espectroscópicos de RMN padronizados e espectrometria de massa. Um forte aroma de alho sugere que os compostos pertencem à classe do tiol (mercaptano). A ausência de prótons aromáticos e alcenóides (entre δ 5-8) nos espectros de 1H RMN de todos os compostos elimina o caráter aromático em suas estruturas. Entretanto, espectros de 1H RMN simples de todos os compostos apresentam apenas picos de singletos ressonando entre ct 2,0 e 4,5. Nenhum dos espectros de 13C RMN correspondentes de todos os compostos mostra ressonância acima de 45 ppm, eliminando ainda mais os caracteres de ligação C=S e C=0 nas estruturas. Esses achados estreitam as possibilidades dos com- postos para pertencerem à classe tio ou oxo alifática. Uma avaliação adicional dos espectros de 13C RMN mostra que o sinal mais desprotegido aparece em -45 ppm, o que é característico da ligação tio (C-S).

Os seis compostos a seguir com atividade antifúngica foram encontrados e identificados de acordo com esta invenção: Composto (1): Fórmula empírica: 2,4,5,7-tetratiaoctano O composto (1) ou B2.2 pode ser isolado da fração de coluna impura B2 por meio de purificação por P-TLC (hexano:acetona: 9,5:0,5) como um óleo amarelo. O espectro 1H RMN do composto (1) mostra um singleto em ôh 4,00 (Ôc 45,2 ppm), integrando para 4 prótons, e um singleto em Ôh 2,21 (ôc 17,3 ppm), integrando para 6 prótons, o que sugere um grupo tio-metileno e dois tiometila. Os prótons de metileno em Ôh 4,00 e os prótons de metila em ôh 2,11 são consistentes com a presença dos grupos CH2-S e CH3-S, respectivamente. A espectroscopia de massa por ionização de elétrons (EIMS) de (1) mostra 0 pico de base a m/z 186, consistente com a fórmula molecular C4H10S4, e isso concorda com a estrutura (1) sugerida, um composto anteriormente isolado por Burton e Kaye (1992).

Composto (2) Fórmula empírica: 2,4,5,6,8-pentatianonano Após a separação por P-TLC (hexano:acetona: 9,5:0,5), o composto (2) ou B3.2 pode ser isolado como um óleo amarelo das frações de coluna combinadas B3. No espectro de 1H RMN do composto (2) (Placa 6.3), apenas dois singletos em Ôh 4,15 e ôh 2,29, integrando para 2 prótons e 6 prótons, respectivamente, podem ser observados. Os dados de 1H RMN de (2) são muito similares aos de (1), sugerindo uma estrutura muito similar. As integrais dos picos sugeriu a presença de dois grupos tiometileno e dois tio-metila. A atribuição da estrutura (2) se baseia na comparação dos deslocamentos químicos dos prótons nos espectros de 1H RMN dos compostos (1 e 2). Os prótons mais desprotegidos no espectro de 1H RMN de (2) requerem átomos de enxofre na estrutura.

Composto (3) Fórmula empírica: 2,3,5,7,9-pentatiadecano A purificação da fração A5 por P-TLC (hexano:acetona: 9,5:0,5) fornece 0 composto (3) ou A5.2 como um óleo amarelo, que mostra similaridade aos compostos (1 e 2). O espectro de 1H RMN do composto (3) exibe três prótons de metileno em torno de ôh 4,00 e dois prótons de metila em torno de δΗ 2,00, consistente com a presença de grupos CH2-S e CH3-S, respectivamente. As ressonâncias dos picos no espectro de 13C RMN concordam com os picos correspondentes do espectro de 1H RMN. Os singletos em δΗ 3,8 (ôc 37,2 ppm), ôH 3,95 (ôc 40,9 ppm) e ôH 4,11 (ôc 45,5 ppm) são atribuídos a H-8, H-6 e H-4, respectivamente. Os prótons de metila foram observados em ôH 2,18 (ôc 15,0 ppm), H-10 e 2,25 (ôc 15,6 ppm), H-1. A espectroscopia de massa por ionização de elétrons (EIMS) mostra [M+] em m/z 232, consistente com a fórmula molecular C5H12S5, e isso concorda com a estrutura sugerida do composto (3).

Composto (4) Fórmula estrutural: 2,4,6-tritiaeptano Tentativas de purificar o composto Αβ.ι para fornecer composto (4) não foram bem-sucedidas. O espectro de 1H RMN do composto (4) mostra dois singletos de metileno e um singleto de metila, correspondendo ao espectro de 13C RMN. Em comparação com 0 espectro de 1H RMN do com posto (1), este indica uma mistura de compostos (4) e (1) em quantidades quase iguais. Além disso, observa-se que no espectro de 1H RMN do composto (4), o próton de metileno (ôh 4,5) é desprotegido em comparação com o do composto (1), devido a um átomo de enxofre extra na estrutura de (1). Quando os prótons de metileno (ôh 4,00) e os prótons de metila (ôh 2,21) do composto (1) são eliminados do espectro, os prótons restantes podem ser alocados ao composto (4).

Composto (5) Fórmula empírica: 2,4-ditiapentano O isolamento por P-TLC do composto A7.i da fração A7 (hexa-no:acetona: 9,5:0,5) fornece o composto (5) como um óleo amarelo. Os prótons de metileno e metila ressonando como singletos em ôh 3,67 e 2,18, respectivamente, são observados no espectro de 1H RMN. O metileno CH2-S menos desprotegido (Ô 3,67), em comparação com o CH2-SS integrando para 2 prótons, e os prótons de metila CH3-S característicos integrando para seis prótons, podem ser atribuídos a H-2 e H-1, respectivamente.

Composto (6) Fórmula empírica: Tiossulfonato de metila A separação por P-TLC (hexano:acetona: 9,5:0,5) do composto 6 <A7.2) da fração A7 também é um óleo amarelo. Embora 0 espectro de 1H RMN do composto (6) mostre picos que pertençam a ácido linoléico, um sin-gleto proeminente em Ô 3,7 que não é parte desses picos foi observado. Devido à impureza do composto isolado, a massa precisa não pôde ser determinada. A atribuição da estrutura (6) tentativa se baseia inteiramente na posição ressonante dos prótons de metila no espectro de 1H RMN. Os átomos de enxofre e oxigênio eletronegativos desprotegeram os prótons de -CH3, deslocando-os para o deslocamento químico δ 3,7, em oposição aos prótons de CH3S, que ressonam em torno de δ 2,10. (6) Discussão Nesse estudo, o procedimento de extração líquido-líquido de partes aéreas e abaixo do solo de T. violacea mostra que hexano extrai substancialmente mais compostos do que os outros solventes orgânicos éter dietílico, acetato de etila e diclorometano, indicando que a planta contém uma grande quantidade de substâncias razoavelmente não polares. Isso pode ser confirmado tanto por medição da recuperação de massa, quanto por perfis de cromatografia de camada fina qualitativa (Q-TLC) dos extratos líquido-líquido. Embora seis vezes menos compostos possam ser recuperados do extrato em éter dietílico das partes aéreas e quatro vezes menos do extrato de partes abaixo do solo, em comparação com o hexano, o éter dietílico extrai a segunda maior quantidade de compostos. Muito menos compostos podem ser recuperados dos solventes mais polares restantes, acetato de etila e diclorometano. O bioteste subsequente de atividade antifúngica confirma que a maioria das substâncias ativas estão contidas nos extratos em hexano e éter dietílico, pois ambos mostram maior atividade contra todos os seis fungos de teste. Entretanto, embora muito menor, os extratos líquido-líquido em acetato de etila e diclorometano também mostram atividade antifúngica em alguma medida, indicando que os princípios ativos parecem ter sido finamente distribuídos entre solventes orgânicos ou que outras substâncias, mais polares, também sejam ativas. Para alguns fungos (por exemplo, B. cinerea, S. rolfsii e B. dothidea), não há nenhuma diferença significativa na inibição do crescimento de micélios entre os extratos em hexano e éter dietílico dos extratos tanto de partes áreas, quanto abaixo do solo. Como substancialmente mais compostos podem ser recuperados do extrato em hexano, e o éter dietílico também sendo razoavelmente não polar, especula-se que os princípios ativos contidos nesses dois solventes sejam provavelmente os mesmos. A separação por cromatografia de coluna direcionada para atividade de com- postos nos extratos em hexano fornece quatro frações ativas combinadas dos extratos de partes aéreas e duas das partes abaixo do solo. A purificação direcionada para atividade subseqüente de compostos dessas frações de coluna por meio de P-TLC resulta no isolamento de seis compostos puros que mostram todos atividade antifúngica acima da média. Por meio de es-pectroscopia de RMN, suas estruturas químicas podem ser elucidadas, e os compostos identificados. Das partes abaixo do solo de T. violacea, dois compostos antifúngicos podem ser identificados como o conhecido 2,4,5,7-tetraiaoctano e o novo 2,4,5,6,8-pentatianonano. Das partes aéreas, quatro compostos antifúngicos podem ser identificados. Desses, apenas o tiossul-fonato de metila é conhecido, ao passo que 2,3,5,7,9-pentatiadecano, 2,4,6-tritiaeptano e 2,4-ditiapentano são mais provavelmente compostos novos. O que é surpreendente é o fato de que todos os compostos antifúngicos purificados dos extratos em hexano de partes aéreas e abaixo do solo de T. violacea, exceto o tiossulfonato de metila, são alcanos alifáticos contendo enxofre razoavelmente simples.

Finalmente, um aspecto que precisa de consideração especial é o fato de que o extrato bruto metanólico de T. violacea mostra maior atividade antifúngica de amplo espectro contra todos os fungos de teste do que os extratos líquido-líquido e as frações de cromatografia de coluna semipurificadas. Além disso, uma das frações de cromatografia de coluna semipurificadas ativas (Ae das partes aéreas) mostra alta atividade antifúngica, mas na separação dos compostos contidos nessa fração, a atividade foi perdida. Isso complica o isolamento e a identificação de todas as substâncias ativas das plantas e indica fortemente que a resistência natural de plantas contra condições de estresse biótico depende grandemente do efeito sinérgico ou combinado de diferentes compostos ativos. A presença conhecida de sapo-ninas e flavonóides polares em T. violacea que são agentes antiinfecciosos (Pretorius, 2003, Current Medicinal Chemistry: Anti-infective Agents 2:335-353), em combinação com a presença de compostos contendo enxofre ativo identificados de acordo com esta invenção, pode explicar a atividade antifúngica mais elevada detectada nos extratos brutos e semipurificados, em comparação com a de compostos purificados.

LEGENDAS DAS FIGURAS

Figura 1: porcentagem (%) de inibição do crescimento in vitro de fungos patogênicos para plantas por extratos frescos brutos em metanol de T. violacea a uma concentração de 1 g/L. As barras designadas com diferentes ietras para cada fungo diferiram significativamente (P < 0,05) de acordo com o procedimento estatístico de Diferença Significativa Média de Tukey (MSD). Eixo dos y: inibição de crescimento de micélios (%). 1 = parte aérea; 2 = parte abaixo do solo; 3 = fungicida.

Figura 2: porcentagem (%) de inibição do crescimento in vitro de fungos patogênicos para plantas por extratos frescos brutos em metanol de T. violacea a uma concentração de 1 g/L, após armazenamento a -20°C durante um ano. As barras designadas com diferentes letras para cada fungo diferiram significativamente (P < 0,05) de acordo com o procedimento estatístico de Diferença Significativa Média de Tukey (MSD). Eixo dos y: inibição de crescimento de micélios (%). 1 = parte aérea; 2 = parte abaixo do solo; 3 * fungicida, Figura 3: efeito dos extratos brutos de partes aéreas e abaixo do solo de T. violacea sobre a taxa de respiração de uma monocultura de células de levedura a intervalos de 30 minutos durante um período de três horas. ComCat® e água destilada serviram de con-: troles. Eixo dos x: tempo (min); eixo dos y: liberação de CO2 (cm3).

Figura 4: efeito de extratos brutos de partes aéreas e abaixo do solo de T. violacea sobre 0 crescimento de radículas de mudas de agrião a intervalos de 24 horas durante um período de incubação de 96 horas. ComCat® e água destilada serviram de controles. Eixo dos x: tempo (h); eixo dos y: crescimento da radícula (mm).

Figura 5: efeito de extratos brutos de partes aéreas e abaixo do solo de T. violacea sobre 0 crescimento de coleóptilos de mudas de agrião a intervalos de 24 horas durante um período de incubação de 96 horas. ComCat® e água destilada serviram de controles. Eixo dos x: tempo (h); eixo dos y: crescimento do coleóptilo (mm).

Figura 6: porcentagem (%) de inibição do crescimento de micélios in vitro de fungos patogênicos para plantas por extratos semipurificados de partes aéreas de T. vioiacea a uma concentração de 1 g/L. As barras designadas com diferentes letras para cada fungo diferiram significativamente (P < 0,05) de acordo com o procedimento estatístico de Diferença Significativa Média de Tukey (MSD). Eixo dos y: inibição de crescimento de micélios (%). 1 = hexano; 2 = éter dietílico; 3 = acetato de etila; 4 = diclorometano; 5 = fungicida.

Figura 7: porcentagem (%) de inibição do crescimento de micélios in vitro de fungos patogênicos para plantas por extratos semipurificados de partes abaixo do solo de T. vioiacea a uma concentração de 1 g/L. As barras designadas com diferentes letras para cada fungo diferiram significativamente (P < 0,05) de acordo com o procedimento estatístico de Diferença Significativa Média de Tukey (MSD). Eixo dos y: inibição de crescimento de micélios (%). 1 = hexano; 2 = éter dietílico; 3 = acetato de etila; 4 = diclorometano; 5 = fungicida.

Figura 8: padrão de atividade da NADPH oxidase em trigo tratado com um extrato de Tulbaghia e um extrato de Agapanthus (como referência), de acordo com a invenção na dependência do tempo após o tratamento.

Figura 9: padrão de atividade da NADPH oxidase em girassol tratado com um extrato de Tulbaghia e um extrato de Agapanthus (como referência), de acordo com a invenção na dependência do tempo após o tratamento.

Figura 10: padrão de atividade da peroxidase em trigo tratado com um extrato de Tulbaghia e um extrato de Agapanthus (como referência), de acordo com a invenção na dependência do tempo após o tratamento.

Figura 11: padrão de atividade da peroxidase em girassol tratado com um extrato de Tulbaghia e um extrato de Agapanthus (como referência), de acordo com a invenção na dependência do tempo após o tratamento.

EXEMPLOS

Realizou-se uma análise de variância (ANOVA) nos dados dos exemplos delineados abaixo, usando-se o programa estatístico NCSS 2000, para identificar diferenças entre os tratamentos. O procedimento de diferença significativa média de Tukey (MSD) para comparação de médias (Steele e Torrie, 1980, Principies and procedures of statistics, 2â edição, Nova Iorque: McGraw-Hili) foi aplicado para separar médias (P < 0,05).

Exemplo 1: Material Vegetal Plantas de Tulbaghia vialacea inteiras foram inicialmente coletadas na Reserva Natural de Blyde River Canyon (BRC) na África do Sul. A identificação taxonômica da espécie foi realizada por um taxonomista do Museu Nacional, Bloemfontein, África do Sul. Um espécime de comprovante foi processado de acordo com procedimentos padronizados e depositado no herbário do museu. Amostras a granel das espécies foram posteriormente coletadas nos Jardins Botânicos, Bloemfontein, entre janeiro e março de 2001, 2002 e 2003.

Exemplo 2: Preparação do Material Vegetal Padrões de segurança sanitária e laboratorial foram seguidos na manipulação do material desconhecido, pois era considerado perigoso. O material vegetal foi previamente examinado quanto a qualquer forma de infecção ou lesão por insetos, e esse material infectado não foi usado. As plantas foram divididas em (a) partes aéreas (caules e folhas) e (b) partes abaixo do solo (rizoma e raízes). Depois de se determinar a massa fresca das diferentes partes de plantas, o material vegetal foi secado em um forno durante duas semanas a 35°C, e a massa seca foi determinada. Subseqüen-temente, o material vegetal seco foi triturado, usando-se um moinho de corte Retsch SM 2000, e a massa seca foi novamente determinada. Depois da trituração, pequenas quantidades representativas de cada amostra foram transferidas para bolsas Ziploc de plástico, fechadas e armazenadas em um congelador a -20°C até que os extratos brutos fossem preparados. A porcentagem de perda durante a trituração foi calculada da seguinte maneira: Porcentagem de perda na trituração = [(massa líquida da amostra seca)-(massa líquida da amostra triturada x 100]/(massa líquida da amostra seca) Exemplo 3: Preparação de Extratos Brutos As duas amostras trituradas (partes aéreas e abaixo do solo) foram transferidas para jarros Qorpak de 5 litros separados, marcadas e cobertas com metanol a 100% a uma razão de dois mL g'1 de peso seco. As tampas foram firmemente fechadas, lacaradas com parafina para evitar vazamentos e colocadas em um moinho rolos durante 24 horas. A extração foi realizada duas vezes por substituiçãodo metanol. Subseqüentemente, cada amostra foi filtrada duas vezes, primeiro sob vácuo através de uma camada dupla de papel de filtro Whatman (Ns 3 e Ns 1), usando-se um funil Buchner, e, então, por gravidade através de uma única folha de papel de filtro Whatman Ns 1. A maior parte do metanol foi removida dos extratos por meio de destilação a vácuo a 35-40°C, usando-se um Evaporador Rotativo Buchi. No dia seguinte, o mesmo procedimento foi seguido com o material vegetal re-extraído. Filtrados finais do material vegetal extraído duas vezes foram combinados e concentrados até secar sob vácuo por meio de um Concentrador Speedvac a -140°C durante 24 horas. Depois de determinar os rendimentos de matéria seca, as partes aéreas e abaixo do solo brutas foram armazenadas separadamente a -20°C para uso posterior.

Exemplo 4: Triagem de extratos brutos em metanol de T. violacea quanto à atividade antibacteriana (a) Preparação de culturas-mãe de Bactérias A atividade antibacteriana foi qualitativamente avaliada por meio da técnica de ensaio de difusão em placa de ágar (Rios et ai., 1988, Journal of Ethnopharmacology 23: 127-149). Usou-se ágar de contagem de placa (PCA) para preparar culturas-mãe dos seis patógenos de plantas e uma bac- téria humana a seguir antecipadamente: Clavibacter michiganense pv. ml· chiganense, Pseudomonas syringae pv syringae, Erwinia carotovora subsp carotovora, Agrobacterium tumefaciens, Ralstonia solanacearum, Xantho-monas campestrís pv phaseoli, todos patógenos de plantas, assim como Mo-raxella catharrhalis (MC), um patógeno humano. Foram preparadas duas culturas de estoque para cada bactéria, das quais uma era uma cultulra de trabalho, e a outra uma cultura de reserva. As culturas foram armazenadas a 5-15°C, exceto a de Moraxella, que foi armazenada a 4°C.

Das culturas-mãe de bactérias, sete placas de ágar nutriente (NA) foram separadamente inoculadas com as sete bactérias dois dias antes do bioensaio antibacteriano. Essas foram incubadas a 25°C, exceto a placa de Moraxella, que foi incubada a 35°C um dia antes do bioensaio, para obter colônias de linhagem pura.

Todas as culturas foram verificadas quanto à contaminação. Depois de dois dias, as colônias puras não contaminadas das culturas de bactérias de 2 dias de idade foram transferidas das placas de ágar para sete tubos de ensaio marcados contendo água destilada esterilizada, no caso dos patógenos de plantas, e água salina esterilizada, no caso de Moraxella. Suspensões de bactérias diluídas foram comparadas com o padrão McFar-land para se obter a concentração requerida de 1 x 106 ÜFC (unidades formadoras de colônia) por mL. (b) Bioensaio Antibacteriano Cinco gramas de ágar nutriente foram dissolvidos em 200 mL de água destilada, autoclavados a 121 °C durante 20 minutos e transferidos para sete placas de Petri para resfriar e endurecer. Os extratos brutos foram ensaiados como suspensões aquosas em DMSO (sulfóxido de dimetila) a 10% (v/v) a uma concentração de 50 mg mL’1 por transferência de um máximo de 40 μί em furos de 5 mm feitos no ágar com um saca-rolhas estéril. Todas as atividades foram realizada em uma cabine de fluxo laminar pré-esterilizada para evitar contaminação. Cada placa de teste foi dividida em cinco partes, e os extratos, assim como a solução em DMSO a 10% (v/v) (controle positivo), foram transferidos para os furos no ágar. As placas foram deixadas durante 20 minutos para permitir que os extratos e o DMSO se difundissem no ágar e foram subsequentemente incubadas a 25°C (patógenos de plantas) ou 35°C (Moraxella) durante três dias. Cada placa foi inoculada com as diferentes suspensões bacterianas usando-se suabes estéreis, espalhadas uniformemente sobre a placa. Depois de três dias, as zonas de inibição foram medidas usando-se um calibre digital, excluindo-se o furo (Heisey e Gorham, 1992), e usadas como um indicador de atividade antibacteriana. Exemolo 5: Triagem de extratos brutos em metanol de T. violacea quanto à atividade antifúngica Usou-se um método de diluição de ágar modificado (Rios et al., 1988, 1.c.) para a determinação da inibição do crescimento de micélios dos organismos de teste pelos extratos brutos. (a) Preparação de Culturas-mãe de Fungos Ágar de extrato de malte a dois por cento (4 g de extrato de mal-to; Difco, 2,8 g de ágar Técnico; Difco) foi preparado em 200 mL de água destilada e autociavado durante 20 minutos a 121 °C. Subsequentemente, o meio foi resfriado em um banho de água a 45°C, e 60 μΐ_ de uma solução de estreptomicina a 33% (m/v) foram adicionados ao meio basal para controle do crescimento bacteriano. O meio de ágar foi, então, transferido para placas de Petri e deixado endurecer. Duas culturas-mãe para cada fungo foram preparadas para os seis fungos patogênicos para plantas a seguir: Botrytis cinerea, Fusarium oxyporum, Sclerotium rolfsii, fíhizoctonia solarti, Botrys-phaeria dothidea e Pythium ultimum. Um inóculo de cada fungo foi colocado voltado para baixo sobre o meio de ágar em placas de Petri (duas replica-ções) e incubado a 25°C durante 8 a 10 dias. Subseqüentemente, 12 garrafas de cultura de vidro foram enchidas até a metade com água destilada e autoclavadas durante 20 minutos a 121°C. Pedaços de ágar contendo os organismos de um par de placas de Petri (duas replicações por fungo) foram, então, transferidos para as garrafas de cultura autoclavadas, lacradas com parafina e armazenadas a 4°C, exceto o fíhizoctonia solani e o Pythium ultimum, que foram armazenados a 25°C. (b) Bioensaio Ágar de extrato de malte a dois porcento (MEA) foi preparado conforme descrito para a preparação das culturas-mãe. Cada extrato foi dissolvido em 100 mL de água destilada estéril e acrescentadas ao ágar para fornecer uma concentração final de 1 mg/mL (1 g/L). O meio, também contendo estreptomicina a 33%, foi transferido para placas de Petri de plástico estéreis de 90 mm e deixado endurecer. O centro de cada placa de teste foi subseqüentemente inoculado com um tampão de 5 mm de tampão, para cada um dos patógenos separadamente, e incubado durante três dias a 25 ± 2°C em uma cabine de crescimento. O crescimento de micélios radiais foi determinado após três dias por cálculo da média de dois diâmetros de colônia perpendiculares em cada replicata (três replicatas por organismo). Uma placa inoculada para patógeno, contendo apenas o meio basal, serviu de controle. As médias de duas medições foram usadas para calcular a porcentagem (%) de inibição: Além disso, uma placa contendo 1 pg/mL de carbenda-zim/difenoconazol (Eria® - 187,5 g L'1 EC) foi usada como um fungicida padrão contra cada organismo de teste separadamente, para determinar a eficácia (expressa como % de inibição) dos extratos por comparação. Cada tratamento foi realizado em triplicata.

Exemplo 6: Triagem de extratos brutos em metanol de T. violacea quanto à atividade bioestimulante Foram aplicados dois métodos para determinar o potencial bioestimulante dos extratos brutos de órgãos de T. violacea: Método 1: método manométrico para determinar o efeito dos extratos brutos sobre a taxa de respiração de uma monocultura de células de levedura.

Um respirômetro de vidro especialmente construído com uma seção abaulada curta (reservatório) para conterás células de levedura e um tubo calibrado longo, fechado na extremidade superior para coletar gás C02, foi usado para determinar o efeito dos extratos brutos de órgãos (partes aéreas e abaixo do solo) de T. violacea sobre a taxa de respiração de células de levedura. Levedo de padeiro seco (0,8 g) foi colocado no reservatório do respirômetro. Subsequentemente, 70 ml_ de cada um dos extratos de órgãos anteriormente preparados a uma concentração de 0,5 mg mí_'1 e contendo 5 mg mL'1 de glicose para servir de substrato respiratório para as células de levedura foram adicionados ao respirômetro. O aparelho foi inclinado para os lados para liberar bolhas de ar aprisionadas no levedo de padeiro seco e colocado em um banho de água preaquecido a 29°C. ComCat®, um bioesti-mulante comercial (EP1 051 075), foi usado como um controle positivo a 0,5 mg/L (concentração ótima de acordo com os fabricantes; Agraforum, Alemanha), e água destilada foi usada como um segundo controle. O dióxido de carbono liberado pelas células de levedura foi medido em cm3 a intervalos de 30 minutos durante um período de incubação de três horas, por leitura do volume de gás liberado do tubo calibrado. Os testes foram realizados em triplicata. Método 2: Efeito de diferentes extratos de órgãos sobre a porcentagem de germinação de sementes de agrião e subsequente crescimento das mudas Duas folhas de papel de germinação especial (30 x 30 cm) foram usadas para testar o efeito dos extratos brutos de órgãos de T. violacea sobre a germinação de sementes de agrião, assim como o crescimento subse-qüente das mudas. Uma linha a 10 cm da parte superior foi traçada em uma folha, e 20 sementes de agrião foram uniformemente espaçadas na linha. Uma segunda folha de papel de germinação foi colocada sobre a primeira e umectada com soluções a 0,5 mg mL'1 dos extratos brutos, água destilada (controle negativo) ou uma solução a 0,5 mg L'1 de ComCat® (controle positivo). Ambas as folhas de papel foram enroladas longitudinalmente e colocadas em pé em frascos Erlenmeyer contendo os extratos brutos de partes aéreas ou abaixo do solo, água destilada ou a solução de ComCat® e mantidas a 25°C em uma câmara de crescimento no escuro. A germinação de sementes, assim como os comprimentos dos coleóptilos e raízes foram de- terminados a intervalos de 24 horas durante um período de incubação de quatro dias. Os testes foram realizados em triplicata.

Exemolo 7: Cultivo de plantas de ervilha (Pisum sativum) Cem sementes de Pisum sativum cv. Mohanderfer, obtidas em um mercado de sementes local, foram semeadas a 2 cm da superfície em 20 potes a cinco sementes por pote, usando-se solo Bainsvlei e aplicando-se uma mistura de fertilizante NPK padrão. As plantas foram deixadas crescer durante quatro semanas em uma estufa, enquanto se mantinha o solo em capacidade de campo. Depois de quatro semanas, duas folhas completamente expandidas da mesma idade foram cuidadosamente removidas dos quartos nós de cada planta e usadas para monitorização do potencial de extratos de partes aéreas de T. violacea para controlar ferrugem; Ascochyta in vivo.

Exemplo 8: Isolamento de Mycosphaerella pinodes Mycosphaerella pinodes foi isolada de folhas e caules doentes de vários cultivares de inverno de ervilha do campo no momento da senes-cência. As coletas de material de plantas infectadas foram feitas nas áreas de crescimentos de ervilhas central e do sudeste da Etiópia. Pedaços do tecido doente foram superficialmente esterilizados durante 1 minuto em età-nol a 96% (v/v), 3 minutos em uma solução de hipocloreto de sódio a 3,5% (v/v) (Moussart et al., 1998, European Journal of Plant Pathology 104:93-102) e 30 segundos em etanol a 96% (v/v). Os tecidos foram subseqüente-mente transferidos assepticamente para ágar farelo de milho acrescentado de estreptomicina (0,3 mL/L) em placas de Petri de 9 cm e incubados a 20 ± 1°C em uma câmara de crescimento. Os isolados inicialmente obtidos do material de plantas foram, então, cultivados em meio de Coon (Ali et al., 1978, Austrafian Journal of Agrícultural Research 29:841-849), consistindo em 4 g de maltose, 2 g de KNOe, 1,2 g de MgS04, 2,7 g de KH2PO4 e 20 g de ágar. As culturas foram incubadas durante 14 dias para se obterem picni-diosporos. Para se obter um isolado derivado de uma única célula uninucle-ada, uma suspensão de picnidiosporos foi espalhada em ágar água a 15%, incubada durante uma noite a 20 ± ΓΟ e examinada sob um microscópio de dissecção (ampliação de 80x). Um tubo germinativo de um picnidiosporo foi cortado e transferido para ágar de Coon (Clulow & Lewis, 1992, Plant Patho-logy 41:362-369). Seis isolados de M. pinodes foram obtidos. Todos os isolados de esporo único e culturas foram mantidos em placas de ágar de Coon e armazenados no escuro a 5°C.

Exemplo 9: Preparação de uma suspensão de esporos de M. pinodes Ágar farelo de aveia foi preparado por aquecimento suave de 30 g de aveia em 1 litro de água destilada durante uma hora, agitando-se fre-qüentemente e, subseqüentemente, filtrando-se através de uma peneira fina, após o que o volume foi reajustado a um litro. Vinte gramas de ágar técnico e 0,1 g de Keltane AP foram adicionados ao filtrado para fornecer uma concentração de ágar de 2% (m/v). O ágar foi autoclavado durante 15 min, vertido em placas de Petri e deixado resfriar antes da inoculação de três placas de farelo de aveia com micélios de M. pinodes. As placas foram incubadas em um incubador com fotoperíodo de 12 horas a 20°C durante 14 dias, para assegurar a produção de picnidiosporos. Para preparar o inóculo (suspensão de esporos), adicionou-se água destilada estéril às culturas de 14 dias de idade, desalojando suavemente os esporos com uma barra de vidro estéril. A suspensão foi subseqüentemente filtrada através de quatro camadas de gaze grosseira para remover os micélios, e a concentração de picnidiosporos foi determinada por meio de um hemocitômetro. A concentração de picnidiosporos foi ajustada a 1 x 106 esporos por mL (Nasir & Hoppe, 1997, An-naís of Applied Biology 18:32-33) com água destilada estéril antes da inoculação das folhas de ervilhas.

Exemplo 10: Avaliação in vivo da fitotoxicidade do extrato bruto Sementes de ervilhas foram plantadas em potes de plástico em solo Bainsvlei e cultivadas em uma estufa (temperatura mínima de 18°C). Quatro semanas após o plantio, quando as folhas nos terceiro e quarto nós estavam completamente expandidas, três folhas do quarto nó por replicata foram removidas das plantas, colocadas sobre papel de filtro Schleicher e Schull n2 595 e molhadas com 4 mL de água destilada estéril em placas de Petri de 9 cm. Trinta pL de cada solução a 0,25, 0,5,1,0 e 2,0 mg/mL de ex- trato bruto foram colocados separadamente em cada uma das três folhas por placa de Petri e replicados três vezes. O tratamento das folhas com água e um fungicida padrão (carbendazim/difenoconazol) serviu de controle. Placas de Petri contendo as folhas tratadas foram incubadas a 20°C em um incuba-dor de dia/noite, programado para um ciclo de 16 horas de dia, enquanto 2 mL de água destilada estéril foram adicionados diariamente para manter o papel de filtro úmido. Seis dias após o tratamento, os sintomas de fitotoxici-dade foram avaliados nas folhas usando-se uma escala de seis categorias [0 = sem sintomas; 1 = < 5% de manchas necróticas; 2 = > 5% de manchas necróticas; 3 = < 50% de área inoculada necrótica; 4 = 50-100% de área i-noculada necrótica; 5 = necrose espalhando-se além das áreas inoculadas] baseada em observações estereomicroscópicas (Clulow et al., 1991b, Journal of Phytopathology 131:322-332).

Exemplo 11: Avaliação in vivo de propriedades antifúngicas do extrato bruto Folhas de ervilha do quarto nó foram obtidas e mantidas sobre papel de filtro úmido em placas de Petri conforme descrito para o teste de avaliação de fitotoxicídade. O controle in vivo da infecção por esporos de M. pinodes das folhas por diferentes concentrações (0,25, 0,5, 1,0 e 2,0 mg/mL) do extrato de partes aéreas de T. violacea foi seguido de duas maneiras, a saber, por inoculação das folhas com 15 pL de uma suspensão de esporos (1 x 105 esporos por mL; Nasir e Hoppe, 1997,1 .c.) 30 minutos antes da a-plicação das diferentes concentrações do extrato bruto separadamente, e da maneira contrária. Um fungicida padrão, carbendazim/difenoconazol, atualmente usado contra ferrugem Ascochyta em ervilhas (Bretag et al., 1995, Australian Journal of Experimental Agriculture 35:525-530; Moussart et al., 1998, European Journal of Plant Pathology 104:93-102), assim como folhas inoculadas apenas com a suspensão de esporos, serviram de controles. Três folhas por placa de Petri representaram uma replicata, e o experimento foi realizado em triplicata. Placas de Petri contendo as folhas diferentemente tratadas foram incubadas a 20°C, a temperatura ótima para geraminação de esporos de M. pinodes, em um incubador de dia/noite, pois a iluminação é necessária para a germinação de esporos (Roger e Tivoli, 1996, Mycological Research 100:304-306). Após incubação d urante seis dias, as lesões foliares foram medidas e os danos às folhas comparados aos dos controles. Exemplo 12: Análise estatística dos dados Realizou-se uma análise de variância (ANOVA) dos dados, u-sando-se o programa de análise estatística SAS (SAS Institute Inc., 1999, SAS Institute software: Usage and reference. Versão 6. SAS Institute). O procedimento LSD (menor diferença significativa) de Duncan para comparação de médias foi aplicado para separar as médias (P < 0,05). Tratamentos diferindo significativamente foram indicados nas tabelas por designação de diferentes conjuntos de letras.

Exemplo 13: Tratamento das sementes Diferentes lotes de sementes de sorgo foram artificialmente ino-culadas separadamente tanto com esporos de carvão de semente coberta (Sporisoríum sorghi), quanto solta (Sporisorium cruentum) à taxa de 5% (p/p) antes da aplicação dos tratamentos de sementes. Um extrato bruto aéreo de T. violacea foi posto em suspensão em água a uma taxa de 2,0 g/L. Lotes de sementes de sorgo de 90 g cada foram tratados com 15 mL do extrato bruto por misturação completa em uma pequena bolsa de plástico 24 h antes do plantio. Um fungicida de revestimento de sementes sintético padrão, Thiram (65 W), foi aplicado da mesma maneira à taxa de 0,25% (p/p) por kg de semente e serviu de controle positivo. Sementes de sorgo também foram artificial e separadamente inoculadas tanto com esporos de carvão solto, quanto coberto, mas não foram tratadas com o extrato ou fungicida sintético, para servirem de segundo controle.

Exemplo 14: Ensaio de campo Conduziu-se um ensaio de campo sob irrigação no Centro de Pesquisas de Melkassa, Etiópia, em 2003. Os lotes foram dispostos em um desenho de bolos completos aleatórios, e os tratamentos foram aplicados três vezes. Sementes de sorgo tratadas foram plantadas manualmente em cinco fileiras, deixando 0,75 cm entre as fileiras, em lotes de 18,75 m2. Aplicou-se fertilizante padrão, e os lotes foram mantidos em capacidade de campo por meio de irrigação por sulcos. A incidência de doença foi registra- da como porcentagem de plantas Infectadas. O rendimento de grãos foi determinado no lote inteiro.

Exemplo 15: Extração líquido-líquido direcionada para atividade Os seguintes solventes orgânicos, dispostos em ordem de polaridade crescente (constantes dielétricas) foram usados para semi-purificação (extração líquido-líquido) dos extratos brutos de partes aéreas e abaixo do solo separadamente: hexano (DC = 2,0), éter dietílico (DC = 4,3), acetato de etila (DC = 6,0), cloreto de metileno (DC = 8,9). A extração foi feita tanto para partes aéreas, quanto abaixo do solo. Cerca de 63,30 g do extrato de partes aéreas e 88,24 g do extrato de partes abaixo do solo, em metanol, foram dissolvidos em 50 mL de água destilada e misturados com 50 mL de hexano (razão de 1:1). Cada mistura foi agitada vigorosamente durante 20 minutos em um agitador mecânico e subseqüentemente transferida para um funil de separação, deixando-se que as duas fases líquidas se separassem. A camada de hexano superior separada foi transferida para um béquer, ao passo que a camada de extrato bruto inferior foi novamente misturada com 50 mL de hexano fresco e agitada como antes. O fracionamento foi repetido 20 vezes com solvente fresco, para otimizar a recuperação dos compostos. O mesmo procedimento foi seguido com os outros solventes orgânicos. As quatro frações separadas foram evaporadas até secar sob vácuo, em um banho de água a 35°C, por meio de um rotoevaporador Büchi. A massa de material seco recuperado foi determinada para cada fração. Do material seco de cada fração, prepararam-se soluções de estoque a 1 mg mL'1 em água. Para estabelecer o sucesso do processo de fracionamento, obteve-se um perfil de cromatografia em camada fina qualitativa (TLC) para cada fração em uma placa de Sílica-gel 60 de 0,5 mm, usando-se clorofórmio : metanol : água (80:20:10) como fase móvel (Exemplo 16). Para determinar onde os ingredientes ativos estavam localizados, os oito extratos foram triados quanto às propriedades antifúngicas. Usou-se o mesmo procedimento descrito no Exemplo 5.

Exemplo 16: Fracionamento por cromatografia de coluna direcionada para atividade (CCF) Antes da separação por cromatografia de coluna de compostos ativos nos extratos em hexano semipurificados obtidos por meio de extração líquido-líquido, usando-se Sílica-Gel como fase estacionária, o sistema solvente mais eficaz foi testado usando-se placas de TLC de Sílica-Gel. Os sistemas solventes testados variaram do menos polar ao mais polar e incluíram: hexano : acetona (9,5:0,5-6:4); hexano : acetato de etila (8:2-6:4); hexano : acetona : acetato de etila (6:2:2); hexano : acetona : metanol (6:3:1) e clorofórmio : metanol (9:1-5:5). Tanto para extratos de partes aéreas, quanto abaixo do solo, o sistema solvente mais adequado foi determinado como hexano : acetona (9,5:0,5 e 9:1, respectivamente). Uma bureta de vidro comum (1,5 m x 2 cm) foi usada como coluna de separação. Depois de colocar um pequeno pedaço de lã de algodão no fundo da coluna, uma pasta semi-fluida de Sílica-Gel 60, previamente preparada usando-se o sistema solvente, foi lentamente vertida na coluna e deixada endurecer até se atingir uma altura final de 1,49 m. Tomou-se cuidado para evitar a formação de bolhas de ar. Um funil de separação enchido com cerca de 1,5 litros do sistema solvente foi colocado no topo da coluna, para assegurar um suprimento contínuo da fase móvel e para manter uma coluna de solvente de 10 cm acima da fase estacionária. A coluna foi equilibrada durante uma noite antes de se determinar o volume do leito, e o extrato semi-purificado ativo foi carregado na coluna. Doze g dos extratos líquido-líquido ativos secos foram dissolvidos em um volume adequado de solvente hexano:acetona e suavemente carregados na coluna usando-se uma pipeta. Deixou-se endurecer sobre a superfície da sílica e se difundir na fase estacionária antes de se deixar a fase móvel migrar sob gravidade.

Os compostos foram eluídos a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min, e se coletaram frações de 12 mL usando-se um coletor de fração durante um período de dois a dois meses e meio. As colunas foram constantemente mo-nitorizadas para assegurar que não secassem. Foram coletadas frações até que as colunas estivessem descoloridas. Subseqüentemente, o sistema solvente hexano:acetona (9,5:0,5) foi substituído por um mais polar de hexa- no:acetona a uma razão de 9:1 ou 8:2, 7:3, 6:4 ou 5:5. Perto do fim do processo de separação, mais compostos foram removidos das colunas por meio de metanol a 100%.

Exemplo 17: Cromatografia de camada fina qualitativa (Q-TLC) Realizou-se a cromatografia de camada fina qualitativa (TLC) em placas de alumínio Kieselgel 6OF254, 0,25 mm, de 10 x 20 cm (Merck). A revelação das placas de TLC no solvente apropriado foi seguida por pulverização com formaldeído (40%)-ácido sulfúrico (2:98) ou com anisaldefdo-ácido sulfúríco-etanol (5:5:90) e aquecimento a 120°C. Um total de cerca de 3.600 tubos de ensaio foram coletados para cada extrato durante a separação por cromatografia de coluna acima delineada. A cromatografia de camada fina qualitativa (Q-TLC) foi realizada nos compostos separados em cada terceira fração de tubo de ensaio coletada. O mesmo sistema solvente usado para separação por cromatografia de coluna também foi usado para a separação por TLC. As placas foram reveladas e subseqüentemente investigadas sob luz UV a 254 e 365 nm. Pontos fluorescentes visíveis foram marcados com um lápis antes de se pulverizar as placas com 0 reagente de vaniiina-ácido sulfúrico para mostrar os pontos. Os valores de RF de compostos separados, assim como os perfis de TLC das diferentes frações de coluna foram comparados. Frações de coluna mostrando perfis e valores de RF similares foram combinadas. Frações de coluna combinadas foram evaporadas sob pressão reduzida a 40°C em um evaporador rotativo, e a massa das frações secas foi determinada.

Exemplo 18: Determinação da atividade antifúngica de frações de cromatografia de coluna combinadas Para se determinar em que frações de coluna a maioria dos compostos antifúngicos estavam localizados, 0 mesmo procedimento delineado conforme acima descrito foi seguido, usando-se apenas F. oxysporum, relativamente resistente ao extrato de parte aérea como organismo de teste. Apenas as frações de cromatografia de coluna combinadas mais ativas foram consideradas para purificação adicional.

Exemplo 19: Cromatografia de camada fina preparatória (P-TLC) Apenas compostos nas frações de cromatografia de coluna combinadas mais ativas foram adicionalmente purificados por meio de cromatografia de camada fina preparatória (P-TLC). A separação foi realizada em placas de vidro de 20 x 20 cm revestidas com 1,0 mm de Kieselgel PF254 (Merck, Alemanha), que foram secadas ao ar e usadas sem ativação anterior. Aproximadamente 250-300 mg de cada fração de coluna combinada ativa foram dissolvidos em um pequeno volume (3-5 mL) de metanol, clorofórmio ou fase móvel, dependendo do solvente mais eficaz. A solução foi espalhada sobre as linhas basais de cerca de 20 placas de P-TLC nessas bandas uniformes finas, aplicando-se pequenos volumes de uma vez e secando-se entre as aplicações, até que cerca de 15 mg fossem aplicados por placa. Para separar todos os compostos em uma fração de coluna combinada, neste caso, foram usadas cerca de 20-25 placas de P-TLC. Hexano.acetona (9,5:0,5) foi usado como sistema solvente para revelar as placas em tanques de vidro. Quando a fase móvel atingiu a linha frontal, as placas foram removidas dos tanques de revelação e colocadas em uma coifa ventilada para secar. Subsequentemente, as placas foram examinadas sob luz UV a 254 e 365 nm, e as bandas fluorescentes foram marcadas com a ponta afiada de uma espátula, antes de as bandas serem raspadas usando-se uma espátula, e transferidas para frascos marcados correspondentes. Os compostos foram cobertos com um voiume adequado de clorofórmio e eluídos de sílica por agitação vigorosa durante 10 min antes da filtragem por sucção através de inúmeros cadinhos com etiquetas correspondentes às etiquetas das bandas de sílica. Os filtrados foram coletados em frascos pré-pesados correspondentes, colocados em um armário ventilado para secar, a massa de recuperação foi determinada e testada quanto à atividade antifúngica.

Exemplo 20: Determinação da atividade antifúngica de compostos purificados por meio de cromatografia de camada fina preparatória (P-TLC) Para determinar quais dos compostos separados por meio de P-TLC eram ativos, 0 mesmo procedimento delineado no Exemplo 5 foi seguido, usando-se F. oxysporum apenas como organismo de teste. Apenas os compostos mais ativos foram adicionalmente purificados.

Exemplo 21: Purificação final dos compostos ativos isolados Apenas os compostos isolados mais ativos foram novamente testados quanto à pureza em um sistema de cromatografia de camada fina analítica original (TLC) (Mikes e Chalmers, 1979, Laboratory Handbook of Chromatographic and Allied Methods. Ellis Horwood Ltd., Londres), seguindo-se os procedimentos de Q-TLC (vide seção 6.2.3.3) e P-TLC (vide aci- . ma), com ligeiras modificações das fases móveis. Usou-se clorofór-mio:metanol:água (80:20:10 v/v) ou tolueno:acetona:acetato de etila (7:2:1 v/v; Wagner e Bladt, 1996, Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatogra-phy Atlas, Segunda Edição, Springer, Nova Iorque) como sistema solvente, para separar compostos ativos de quaisquer outros compostos que pudessem ter compartilhado a mesma posição nas placas de Q-TLC ou P-TLC. Depois de secar as placas em uma corrente de ar, os compostos foram detectados sob luz UV a 254 e 365 nm, ou as placas foram tingidas com H2S04 etanólico a 5% (v/v) ou vanilina a 1% (m/v) (1 g em 100 mL de H2S04; Wagner e Bladt, 1996).

Compostos não puros foram novamente submetidos a TLC preparatória acidificada com HCl a 1% (v/v), até que fossem obtidos compostos puros. Apenas compostos puros que mostrassem a maior atividade antifún-gica foram submetidos a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) para identificá-los e para elucidar suas estruturas moleculares.

Exemplo 22: RMN e espectroscopia de massa Para identificar os compostos mais bioativos purificados das partes de planta aéreas e abaixo do solo e para elucidar suas estruturas moleculares, os compostos isolados foram lavados repetidamente com acetona para se obter um nível aceitável de pureza. Subseqüentemente, os compostos foram submetidos a espectroscopia de ressonância magnética nuclear (13C e 1H 1D e 2D RMN). A espectroscopia de RMN foi realizada em um es-pectrômetro Bruker ADVANCE 300MHz DRX 300, a 23°C (296°K) com te-trametiisilano (Si(CH3)4; TMS) como padrão interno. Os solventes usados foram deuterioclorofórmio (CDCI3) ou deuterioacetona [(CDafeCO], conforme indicado. Os deslocamentos químicos foram relatados em partes por milhão (ppm) na escala δ, e as constantes de acoplamento foram dadas em Hz. Os espectros de MS e as determinações de massa foram obtidos com um es-pectrômetro de massa Kratos MS-80 no modo de impacto de elétrons (Et) de foco duplo. t REIVINDICAÇÕES

Claims (10)

1. Uso de uma solução ou suspensão aquosa obtida de partes aéreas de Tulbaghia violacea (alho selvagem) para inibir infecção fúngica de uma plantação in vivo que é aplicada à dita plantação antes ou depois da inoculação de esporo in vivo sob condições de estufa ou de campo, caracterizado pelo fato de que a solução ou suspensão compreende um composto 2,3,5,7,9-pentatiadecano, que é um composto antifúngico ativo, em que a solução ou suspensão é aplicada a uma concentração de 0,2 - 2,0 g de um extrato bruto ou pó seco /1 de solução ou suspensão e inibe infecção fúngica da plantação com uma taxa de inibição entre 75 e 100%, e em que a dita solução ou suspensão é obtida pelas seguintes etapas: (i) secagem das partes aéreas de Tulbaghia violacea a 30-40*0 excluindo-se a luz solar; (ii) trituração das partes aéreas secas a um tamanho de grão entre 0,2 e 2 mm; (iii) encharcamento do material triturado em um solvente orgânico polar selecionado do grupo que consiste em metanol e etanol, formando, assim, uma suspensão/solução; (iv) realização de uma extração sob agitação da suspensão e separação do sobrenadante da fase sólida; (v) repetição das etapas (iii) e (iv) pelo menos mais uma vez; (vi) combinação dos sobrenadantes separados das etapas (iv), e remoção do solvente orgânico por evaporação a vácuo a 30-40Ό, obtendo-se, assim, o resíduo de extrato bruto, e (vii) dissolução do dito extrato bruto em água para obter a solução ou suspensão aquosa com uma concentração de 0,2 - 2,0g de extrato bruto/l de solução ou suspensão, ou alternativamente pelas seguintes etapas: (ia) secagem das partes aéreas de Tulbaghia violacea a 30-40Ό excluindo-se a luz solar; (iia) trituração das partes aéreas secas a um tamanho de grão menor que 0,1 mm; (iiia) encharcamento do material triturado em metanol, formando, assim, uma suspensão/solução; (iva) realização de uma extração sob agitação da suspensão; (va) evaporação do solvente sem separação prévia da fase sólida da fase orgânica solúvel; (via) encharcamento do resíduo de fase sólida evaporado em etanol e repetição das etapas (iv) e (v); e (viia) secagem do resíduo de fase sólida evaporado, obtendo-se, assim, um pó seco,e (viiia) dissolução do dito extrato bruto em água para obter a solução ou suspensão aquosa com uma concentração de 0,2 - 2,0g de pó seco /1 de solução ou suspensão.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução ou suspensão é aplicada a plantação antes da inoculação do esporo com uma concentração de 0,25 g a 1,0 g de extrato bruto ou pó seco /1 de solução ou suspensão e inibe infeção fúngica da plantação com uma taxa de inibição entre 80 e 100%.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução ou suspensão é aplicada a plantação após a inoculação do esporo com uma concentração de 0,5 g a 2,0 g de extrato bruto ou pó seco / I de solução ou suspensão e inibe infeção fúngica da plantação com uma taxa de inibição entre 80 e 100%.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a plantação são sementes de sorgo antes de plantar e a infecção fúngica são manchas em grãos soltos e cobertos.

5. Uso de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a concentração da solução ou suspensão é 2,0g de extrato bruto ou pó seco /I de solução ou suspensão e evita infeção com manchas de grãos cobertos em 100%.

6. Uso de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o tratamento não apresenta efeito inibitório nem em germinação de sementes nem em crescimento de mudas.

7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a solução ou suspensão é aplicada na forma pulverizada.

8. Uso de uma solução ou suspensão aquosa obtida a partir de partes aéreas e partes abaixo do solo de Tulbaghia violacea (alho selvagem) para estimular o crescimento da raiz e mudas de uma plantação e induzir resistência sistêmica adquirida (RSA) e resposta de defesa contra patógenos de planta na plantação, que podem ser medidas através de aumento na atividade NADPH oxidase ou peroxidase, caracterizado pelo fato de que a solução ou suspensão compreende os compostos: 2,4,5,7-tetratiaoctano, 2.4.5.6.8- pentatianonano, 2.3.5.7.9- pentatiadecano, 2,4,6-tritiaeptano, e 2,4-ditiapentano, e é aplicada a uma concentração de 0,2 - 2,0 g de um extrato bruto ou pó seco /1 de solução ou suspensão e inibe infecção fúngica da plantação com uma taxa de inibição entre 75 e 100%, e em que a dita solução ou suspensão é obtida pelas seguintes etapas: (i) secagem das partes aéreas e partes abaixo do solo de Tulbaghia violacea a 30-40*0 excluindo-se a luz solar; (ii) trituração das partes aéreas e partes abaixo do solo secas a um tamanho de grão entre 0,2 e 2 mm; (iii) encharcamento do material triturado em um solvente orgânico polar, selecionado do grupo que consiste em metanol e etanol, formando, assim, uma suspensão/ solução; (iv) realização de uma extração sob agitação da suspensão e separação do sobrenadante da fase sólida; (v) repetição das etapas (iii) e (iv) pelo menos mais uma vez; (vi) combinação dos sobrenadantes separados das etapas (iv) e (v), e remoção do solvente orgânico por evaporação a vácuo a 30-40*0, ob-tendo-se, assim, um resíduo de extrato bruto, e (vii) dissolução do dito extrato bruto em água para obter a solução ou suspensão aquosa com uma concentração de 0,2 - 2,0g de extrato bruto/l de solução ou suspensão, ou, alternativamente, pelas seguintes etapas: (ia) secagem das partes aéreas e partes abaixo do solo de Tulbaghia violá-cea a 30-40Ό excluindo-se a luz solar; (iia) trituração das partes aéreas e partes abaixo do solo secas a um tamanho de grão menor que 0,1 mm; (iiia) encharcamento do material triturado em metanol, formando, assim, uma suspensão/solução; (iva) realização de uma extração sob agitação da suspensão; (va) evaporação do solvente sem separação prévia da fase sólida da fase orgânica solúvel; (via) encharcamento do resíduo de fase sólida evaporado em etanol e repetição das etapas (iva) e (va); (viia) secagem do resíduo de fase sólida evaporado, obtendo-se, assim, um pó seco, e (viiia) dissolução do dito pó seco em água para obter a solução ou suspensão aquosa com uma concentração de 0,2 - 2,0g de pó seco /I de solução ou suspensão.

9. Uso de uma mistura de soluções ou suspensões aquosas obtida a partir de partes aéreas de uma primeira espécie de planta Tulbaghia violacea (alho selvagem) e uma segunda espécie de planta Agapanthus afri-canus para inibir o crescimento micelial de fungos, caracterizado pelo fato de que uma solução ou suspensão aquosa com uma concentração de 0,25 a 2,0g de um extrato bruto ou pó seco /I de solução ou suspensão é aplicada aos fungos, em que a dita solução ou suspensão é uma mixtura de razão 1:1 de uma solução ou suspensão obtida a partir de partes aéreas da primeira espécie de planta Tulbaghia violácea (alho selvagem) compreendendo um composto 2,3,5,7,9-pentatiadecano como um agente antifúngico, e uma solução ou suspensão obtida a partir de partes aéreas da segunda espécie de planta Agapanthus africanus, em que a mistura de razão 1:1 aplicada inibe o crescimento micelial com uma taxa de inibição entre 90 e 100% que é maior quando comparada com as ditas soluções ou suspensões obtidas a partir das espécies separadas, e em que a dita solução ou suspensão é obtida para cada espécie pelas seguintes etapas: (i) secagem das partes aéreas das espécies de planta a 30-40*0 excluindo-se a luz solar; (ii) trituração das partes aéreas secas a um tamanho de grão entre 0,2 e 2 mm; (iii) encharcamento do material triturado em um solvente orgânico polar, selecionado do grupo que consiste em metanol e etanol, formando, assim, uma suspensão/solução; (iv) realização de uma extração sob agitação da suspensão e separação do sobrenadante da fase sólida; (v) repetição das etapas (iii) e (iv) pelo menos mais uma vez; (vi) combinação dos sobrenadantes separados das etapas (iv) e (v), e remoção do solvente orgânico por evaporação a vácuo a 30-40*0, ob-tendo-se, assim, um resíduo de extrato bruto; (vii) dissolução do dito extrato bruto em água para obter a solução ou suspensão aquosa com uma concentração de 0,2 - 2,0g de extrato bruto/l de solução ou suspensão, e (viii) preparação de uma mistura de razão 1:1 da solução ou suspensão da primeira espécie e da solução ou suspensão da segunda espécie. ou, alternativamente, pelas seguintes etapas: (ia) secagem das partes aéreas das espécies de planta a 30-400 excluindo-se a luz solar; (iia) trituração das partes aéreas a um tamanho de grão menor que 0,1 mm; (iiia) encharcamento do material triturado em metanol, formando, assim, uma suspensão / solução; (iva) realização de uma extração sob agitação da suspensão; (va) evaporação do solvente sem separação prévia da fase sólida da fase orgânica solúvel; (via) encharcamento do resíduo de fase sólida evaporado em etanol e repe- tição das etapas (iva) e (va); (viia) secagem do resíduo de fase sólida evaporado, obtendo-se, assim, um pó seco, (viiia) dissolução do dito pó seco em água para obter a solução ou suspensão aquosa com uma concentração de 0,2 - 2,0g de pó seco /1 de solução ou suspensão, e (ixa) preparação de uma mistura de razão 1:1 da solução ou suspensão da primeira espécie e da solução ou suspensão da segunda espécie.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que uma taxa de inibição de 100% é alcançada a uma concentração de 0,5g da mistura 1:1/1, em que a taxa de inibição é maior quando comparada às respectivas soluções ou suspensões obtidas a partir das espécies separadas em uma concentração duas vezes maior.