BRPI0612843A2 - composição farmacêutica, métodos para fabricar a composição, e, uso de uma formulação - Google Patents

composição farmacêutica, métodos para fabricar a composição, e, uso de uma formulação Download PDF

Info

Publication number
BRPI0612843A2
BRPI0612843A2 BRPI0612843-2A BRPI0612843A BRPI0612843A2 BR PI0612843 A2 BRPI0612843 A2 BR PI0612843A2 BR PI0612843 A BRPI0612843 A BR PI0612843A BR PI0612843 A2 BRPI0612843 A2 BR PI0612843A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
peg
lipid
liposomes
pharmaceutical composition
factor viii
Prior art date
Application number
BRPI0612843-2A
Other languages
English (en)
Inventor
Ramani Karthik
D. Miclea Razvan
V. Balu-Iyer Sathy
M. Straubinge Robert
Original Assignee
The Research Foundation Of State University Of New York
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by The Research Foundation Of State University Of New York filed Critical The Research Foundation Of State University Of New York
Publication of BRPI0612843A2 publication Critical patent/BRPI0612843A2/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/36—Blood coagulation or fibrinolysis factors
    • A61K38/37—Factors VIII
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6907—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a microemulsion, nanoemulsion or micelle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6919—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a ribbon or a tubule cochleate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1274—Non-vesicle bilayer structures, e.g. liquid crystals, tubules, cubic phases or cochleates; Sponge phases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

COMPOSIçãO FARMACêUTICA, METODOS PARA FABRICAR A COMPOSIçãO, E, USO DE UMA FORMULAçãO. A presente invenção fornece composições e métodos para reduzir a imunogenicidade e aumentar a meia vida em circulação de proteínas terapêuticas tais como o Fator VIII. As composições compreendem estruturas lipídicas tais como lipossomas, micelas e cocleados que compreendem um lipídeo negativamente carregado e fosfatidil derivado de polietileno glicol etanolaniina.

Description

"COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, MÉTODOS PARA FABRICAR ACOMPOSIÇÃO, E, USO DE UMA FORMULAÇÃO"
Este pedido reivindica prioridade para o Pedido ProvisórioU.S. no. 60/695.080 depositado em 29 de junho de 2006, a divulgação do qualé aqui incorporada por referência.
Este trabalho foi patrocinado pelos fundos do governo sob aconcessão Ne ROl HL-70227 do National Institutes of Health. O governo temcertos direitos na invenção
CAMPO DA INVENÇÃO
Esta invenção no geral diz respeito a meios para reduzir aimunogenicidade de produtos terapêuticos e mais particularmente fornececomposições e métodos para reduzir a imunogenicidade do Fator VIII.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
A hemofilia A é um distúrbio de hemorragia hereditáriocaracterizado pela deficiência ou disfunção do Fator VIII (FVIII). O FVIIIserve como um co-fator crítico no caminho intrínseco da cascata dacoagulação. A terapia de reposição com FVIII humano recombinante (rFVIII)ou FVIII derivado de plasma é a terapia mais comum utilizada no controle deepisódios hemorrágicos. Entretanto, a indução de anticorpos neutralizantescontra a proteína administrada em aproximadamente 15 a 30% dos pacientes éuma complicação principal na terapia [1-3]. Os anticorpos neutralizantesfreqüentemente alvejam o domínio C2, que também está envolvido na ligaçãoaos fosfolipídeos in vivo.
O FVIII é uma glicoproteína de domínio múltiplo grande queconsiste dos domínios Al, A2, Β, A3, Cl e C2 [4,5]. Estudos de mapeamentode epítopo sistemáticos têm revelado que os anticorpos anti-FVIII sãoprincipalmente regiões definidas alvo nos domínios A2 (cadeia pesada), A3 eC2 (cadeia leve) de FVIII [6,7]. O determinante epitópico dentro do domínioΑ2 foi mapeado para os resíduos Arg484-Ile-508 [8,9]. Os anticorpos quealvejam esta região mostraram inibir a forma ativada de FVIII (FVIIIa) pelainteração bloqueadora do domínio A2 com fator IXa (FLXa) [10]. Odeterminante epitópico principal dentro do domínio A3 compreende dosresíduos de 1811 a 1818 eos anticorpos contra esta região também impedema interação de FVIII com FIXa resultando na perda da atividade de co-fator[11]. Os determinantes epitópicos dentro do domínio C2 foram mapeadospara os resíduos 2181 a 2312 [12,13] que abrangem os epítoposimunodominantes, universais CD4+, 2191 a 2210, 2241 a 2290, 2291 a 2330[14,15]. Os anticorpos contra o domínio C2 interferem com a ligação de FVIIIà superfície de membrana de plaqueta rica em fosfatidilserina (PS) que éessencial para a amplificação da cascata de coagulação.
Por causa da resposta imune, gerada contra o Fator VIIIadministrado, existe uma necessidade quanto a identificação de formulaçõesnas quais a imunogenicidade do Fator VIII é reduzida preferivelmente semafetar adversamente a meia vida em circulação.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Foi investigado se o uso de lipossomas e outras estruturaslipídicas que compreendam lipídeos negativamente carregados (tais comofosfolipídeos incluindo fosfatidilserina) e fosfolipídeos derivados com PEGpode realçar a imunogenicidade de proteínas tais como o Fator VIII.
Em um exemplo, a imunogenicidade de rFVIII associado come/ou incorporado em lipossomas que compreendem PS e PE derivado comPEG foi avaliada em um modelo de murino para a hemofilia A. Os animaistratados com estas composições tiveram títulos mais baixos tanto deanticorpos totais quanto de anticorpos anti-rFVIII inibidores, comparadoscom os animais tratados apenas com rFVIII. O índice de estimulação médiade células do baço isoladas a partir de animais que recebem as composiçõesda presente invenção foi inferior àquele para os animais que receberamapenas rFVIII. A análise de citocina sugeriu que a redução naimunogenicidade de rFVIII administrada na presença destas composiçõeslipossômicas pode ser mediada, em parte, pela produção de LL-IO reduzida.Os estudos farmacocinéticos a seguir da dosagem intravenosa (i.v.) indicaramque a meia vida em circulação de rFVIII usando estas composições foiaumentada.
Conseqüentemente, são aqui fornecidas composições em que aimunogenicidade da proteína é reduzida sem comprometer significantementea meia vida em circulação. As composições compreendem lipossomas e/ououtras estruturas lipídicas que compreendam lipídeos negativamentecarregados, lipídeos anfipáticos derivado com PEG e a proteína tal comoFVIII. Os lipossomas ou outras estruturas lipídicas que compreendem PEGcomo aqui descritas, são aludidas neste pedido como sendo "PEGuiladas".Também são fornecidos métodos para a preparação e uso das composições.
As abreviações aqui usadas são: APTT, tempo detromboplastina parcial ativada; ACD, ácido citrato dextrose; BPS,fosfatidilserina cerebral; BSA, albumina sérica bovina; DMPC,dimiristoilfosfatidilcolina; DMPE-PEG2000, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metóxi(polietileno glicol)-2000]; ELISA, ensaioimunossorvente ligado à enzima; FVIIIa, FVIII ativado; FIXa, fator IXa; Ig,imunoglobulina; KO, silenciado; PB, tampão de fosfato; PBA, tampão defosfato contendo albumina; PBT, tampão de fosfato contendo tween; PA,ácido fosfatídico; PC, fosfatidilcolina; PS, fosfatidilserina; rFVIIa, fator VIIIarecombinante; rFVIII, fator VIII humano recombinante; RES, sistemareticuloendotelial; TB, tampão de Tris.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
Figura 1: Estrutura terciária de rFVIII na presença e ausênciade lipossomas PEGuilados. O espectro de emissão de fluorescência foiadquirido na faixa de 300 a 400 mn. O monocromador de excitação foiajustado a 280 mn. A concentração de proteína usada foi de ~ 4 μ g/ml.
Figuras 2A e 2B: (A) Títulos de anticorpo anti-FVTII totais e(B) Anticorpos anti-rFVIII Inibidores em camundongos hemofílicos a seguirda administração de rFVIII na ausência e presença de lipossomas PEGuiladosque compreende de DMPC:BPS (70:30) no final de 6 semanas. Cada pontorepresenta valores de camundongo individual que recebeu tratamento e abarra horizontal representa a média dos títulos de anticorpo ou inibidorestotais. Com propósitos de comparação, os dados obtidos a seguir daadministração de rFVIII na presença de lipossoma DMPCrBPS nãoPEGuilado também está demonstrado. As amostras de sangue foram obtidas 2semanas depois da 4a injeção. Os títulos de anticorpo anti-FVIII totais foramdeterminados pelo ELISA e os títulos de inibidores foram determinados peloEnsaio de Bethesda. A análise estatística foi realizada como descrito nosExemplos.
Figuras 3A e 3B: Resposta de proliferação de célula T CD4+de camundongos hemofílicos, representados como o índice de estímulo, paraepítopos imunodominantes múltiplos que carregam rFVIII intacto (100 (3A)ou 1000 ng/reservatório (3B)), as duas doses subcutâneas seguintes de 21 μgde rFVIII, rFVIII lipossômico não PEGuilado, rFVIII lipossômico PEGuiladoou rFVIII lipossômico isento de PS. O cálculo do índice de estimulação e aanálise estatística é descrita nos Exemplos. Cada ponto representa valores deanimais individuais e a barra horizontal representa a média do índice deestimulação.
Figura 4: Secreção de IL-10 pelas células T CD4+ inoculadascom antígeno de animais administrados com duas doses subcutâneas de 2 μgde rFVIII livre ou rFVIII lipossômico PEGuilado. As células T enriquecidascom CD4+ foram inoculadas com rFVIII (1000 ng/ reservatório). Cada pontorepresenta valores de animais individuais e a barra horizontal representa onível de IL-IO médio secretado no meio de cultura. A análise estatística foirealizada como descrita nos Exemplos.
Figura 5: Atividade de rFVTII plasmático versus perfis detempo a seguir da administração de rFVIII, rFVIII lipossômico PEGuilado ounão PEGuilado em camundongos hemofílicos.
Figura 6: Anticorpos anti-rFVIII inibidores em camundongoshemofílicos a seguir da administração de rFVIII na ausência e presença delipossomas PEGuilados de várias composições lipídicas no final de 6semanas. Cada ponto representa valores de camundongo individual querecebeu tratamento e a barra horizontal representa a média dos títulos deanticorpo total ou inibidor. As amostras de sangue foram obtidas 2 semanasdepois da 4a injeção. Os títulos inibidores foram determinados pelo Ensaio deBethesda. A análise estatística foi realizada como descrita nos Exemplos.
Figura 7: Exemplos de algumas composições lipossômicas dapresente invenção e seu tamanho de lipossoma, eficiência de associação deproteína e imunogenicidade.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
A presente invenção fornece formulações de rFVIII. Asformulações compreendem lipossomas e/ou outras estruturas lipídicas (taiscomo micelas ou cocleados) que compreendem um lipídeo negativamentecarregado tal como PS ou PA. Os lipossomas também compreendem umprimeiro lipídeo antipático derivado com PEG (tal como PE) e um segundolipídeo anfipático tal como PC, PE (não derivado com PEG) ou PG. Além dolipídeo negativamente carregado, as micelas podem compreender PC e/ou PEnão derivado com PEG. Além do lipídeo negativamente carregado, oscocleados também podem compreender PC.
As composições da presente invenção são tais que o Fator VIIIé menos imunogênico e tem meia vida mais longa em circulação do que oFator VIII livre. Em particular, esta invenção fornece preparações de rFVIIIlipídico em que os epítopos imunodominantes são protegidos. Por causa dabaixa imunogenicidade e da meia vida em circulação mais longa, a freqüênciade administração da proteína pode ser reduzida.
As composições da presente invenção compreendem estruturaslipídicas que compreendem um lipídeo negativamente carregado, um lipídeoanfipático derivado com PEG. Fator VIII ou outras proteínas ou polipeptídeospodem estar associados com (isto é, absorvidos na superfície) ou estarincorporados nestas estruturas. É considerado que as proteínas associam-secom os lipídeos negativamente carregados tais como PS ou PA.
Os exemplos de lipídeos antipáticos são PC, PE e PG. Osexemplos de lipídeo negativamente carregado são PS e PA. Um exemplo deum lipídeo que pode ser derivado com PEG é PE. Deve ser mencionado quePE pode ser usado nas estruturas lipídicas por si só e/ou como derivado comPEG.
Em uma forma de realização, a proteína é FVIII. Os dados invivo são apresentados em um modelo de murino de hemofilia A. Os dadosindicam que a administração de PS contendo rFVIII lisossômico PEGuiladoreduz a imunogenicidade da proteína e resulta em aumento no Xm de rFVIII.
Para os lipossomas da presente invenção, a quantidade doslipídeos negativamente carregados está na faixa de 30 a 50% em mol. Aquantidade de lipídeos anfipáticos está na faixa de 50 a 70% em mol. O PEderivado com PEG está entre 1 e 15% em mol. Opcionalmente, os lipossomastambém podem compreender colesterol na faixa de 0 a 30% em mol. Em umaforma de realização, a razão de PC para PS está na faixa de 50:50 a 90:10. Emuma forma de realização, a razão é de 70:30. Até 20% do PS ou PC podem sersubstituídos por PE não derivado com PEG.
Os fosfolipídeos da presente invenção têm duas cadeias deacila. O comprimento das cadeias de acila ligados à cadeia principal deglicerol varia no comprimento de 12 a 22 átomos de carbono. As duas cadeiasde acila ligadas à cadeia principal de glicerol podem ser as mesmas oudiferentes. As cadeias de acila podem ser saturadas ou insaturadas. Algunsexemplos não limitantes de cadeias de acila de 12 a 22 átomos de carbono
saturadas e não saturadas são mostrados nas Tabelas IAe IB:
Tabela 1
<table>table see original document page 8</column></row><table>
Tabela IB
<table>table see original document page 8</column></row><table>
As fosfatidilserinas de cadeia curta (6 a 12 átomos de carbono)são lipídeos solúveis em água únicos que podem existir como micelas nasconcentrações acima das concentrações micelares críticas. As fosfatidilserinasde cadeia curta interagem com rFVIII e influenciam a estabilidade,imunogenicidade e parâmetros farmacocinéticos de rFVIII. O PE derivadocom PEG também pode ser usado nas micelas.
Adicionalmente, as estruturas cocleadas ou cilíndricas quecompreendem lipídeos negativamente carregados e PE derivado com PEGtambém podem ser preparadas. Estas podem ser úteis como sistemas deliberação de medicamento. Para a preparação de cocleados, fosfolipídeos decadeia longa (de 12 a 22 átomos de carbono) são usados.
As micelas podem compreender 100% em mol de PS e de 1 a15% em mol de PE derivado com PEG. Opcionalmente, até 50% de PSpodem ser substituídos por PC e/ou até 5% de PS pode ser substituído por PE(não derivado com PEG). Para as micelas até 50% porcento de PS podem sersubstituídos por PC e/ou até 5% por PE.Os cocleados também podem compreender 100% em mol dePS. Até 30% em mol do PS podem ser substituídos por PC.
As composições do presente método pode ser preparado pordiversos métodos. Por exemplo em uma forma de realização, o métodocompreende preparar lipossomas que compreendem PS, PC e/ou PE,associando e/ou incorporando o FVIII nos lipossomas e adicionando PEderivado com PEG aos lipossomas associados/incorporados com o FVIII.Para a incorporação de PE derivado com PEG nos lipossomas, é preferível tero PE derivado com PEG em uma concentração mais baixa do que o CMC demodo que preferivelmente as micelas não sejam formadas. No geral aformação de micelas diminuirão o processo de incorporação de PE derivadocom PEG nos lipossomas.
Em uma outra forma de realização, PC (e otimamente PE), PSe PE derivado com PEG são usados para preparar lipossomas e depois FVIII éadicionado de modo a associá-lo com e/ou incorporá-lo nos lipossomas.
Em uma outra forma de realização, a incorporação dequantidades variáveis de PEG pode ser obtida pela inclusão de quantidadesvariáveis de PE ativado (ativado por intermédio de grupos amino, carboxilaou tiol) e depois da incorporação de FVIII o PE ativado pode sercovalentemente ligado ao PEG ativado. A presença de PE foi mostradamelhorar as propriedades de ligação de FVIII com PS. Em uma variação destaforma de realização, um espaçador pode ser usado entre o PE e PEG. Umespaçador adequado tem entre 6 e 12 átomos de carbono. Outros espaçadorestendo o mesmo comprimento como 6 a 12 átomos de carbono podem serusados.
Em uma outra forma de realização, os lipossomas dasestruturas lipídicas também podem compreender colesterol. Para esta formade realização, o colesterol é adicionado na etapa de fabricar os lipossomas ouas outras estruturas lipídicas.Os lipossomas da presente invenção estão entre 80 e 500 nm.Em uma forma de realização, os lipossomas têm de 100 a 200 nm nodiâmetro. A razão molar da proteína para lipídeo está entre 1:1000 a 1:20.000.Os cocleados são no geral formados em tampões com alta viscosidade e têmuma faixa média variando entre 150 a 300 nm. As micelas estão na faixa de70 a 90 nm.
O polietileno glicol útil na presente invenção pode ter pesosmoleculares entre 700 e 30.000. Os exemplos de pesos moleculares úteis paraPEG são 750, 1000, 2000, 3000, 5000, 20000, 30000 Da. Uma variedade demétodos são conhecidos para derivar PEG para um lipídeo. Por exemplo, aderivação pode ser feita através de um grupo de cloreto cinâmico ou pelo usode um reagente de ligação de carbonil diimidazol. Mais detalhes podem serencontrados na Patente U.S. no. 5.013.556. Uma variedade de lipídeos de PEderivado com PEG são comercialmente disponíveis. Os exemplos incluemmas não são limitados a DMPE-PEG, DPPE-PEG e DSPE-PEG. A derivaçãode PE com PEG é através da ligação covalente.
Os exemplos de composições lipossômicas úteis e suaspropriedades são apresentadas na Tabela 2 (Figura 7).
Os seguintes exemplos são apresentados para ilustrar ainvenção. Estes não são intencionados a serem limitantes.
EXEMPLO 1
Este exemplo descreve a preparação de lipossomas contendoPC. Neste exemplo, a proteína foi primeiro associada com lipossomascontendo PS e depois PEG foi adicionado a estes.
Materiais
rFVIII (Baxter Biosciences, Carlsband, CA) foi usado como oantígeno. Plasma de controle de coagulação normal e plasma deficiente emFVIII para o ensaio de atividade foi adquirido da Trinity Biotech (CoWicklow, Irlanda). Fosfatidilserina cerebral (BPS), dimiristoilfosfatidil-colina(DMPC) e l,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metóxi(polietileno glicol)-2000] (DMPE-PEG2000) dissolvidos emclorofórmio foram obtidos da Avanti Polar Lipides (Alabaster, AL),armazenados a -IO0C e usados sem outra purificação. Água estéril, isenta depirógeno foi adquirida da Henry Schein Inc. (Melville, NY). Aimunoglobulina anti-camundongo de cabra (Ig, IgM + IgG + IgA, H + L)conjugada à fosfatase alcalina foi da Southern Biotechnology Associates, Inc.(Birmingham, Alabama). O anticorpo monoclonal ESH 8 foi obtido daAmerican Diagnostica Inc, (Greenwich, CT). A albumina sérica bovina isentade IgG (BSA), a dietanolamina e a acetona foram obtidas da Sigma (SaintLouis, MO). O sal dissódico de p-Nitrofenil fosfato foi adquirido da Pierce(Rockford, IL). O l,6-difenil-l,3,5-hexatrieno (DPH), o meio de cultura deRPMI-1640, a penicilina, a estreptomicina, a L-Glutamina, o 2-mercaptoetanol e Polimyxin B foram todos obtidos da Invitrogen Corp.,(Carlsband, CA). A H-timidina foi obtida da Perkin Elmer Inc. (Boston,MA). Todos os outros sais de tampão usados no estudo foram obtidos daFisher Scientific (Fairlawn, NJ) e foram usados sem purificação.Determinação da Concentração Micelar Crítica (CMC) de DMPE-PEG2000.
A CMC de DMPE-PEG2000 foi determinada usando a sondade fluorescência DPH como descrito previamente [16]. Em resumo, a soluçãode DPH (2 μΐ, [DPH] = 30 μΜ em acetona) foi adicionada a váriasconcentrações de 1 ml de DMPE-PEG2000 seguida pela incubação a 37°C por2 h. A intensidade de fluorescência das dispersões foi medida usando umfluorômetro PTI (Photon Technology International, Lawrenceville, NJ)equipado com uma lâmpada de arco de xenônio. O comprimento de onda deexcitação (Ex) da sonda foi ajustado a 360 nm e a emissão (Em) foimonitorada a 430 nm. A concentração da dispersão onde a intensidade dafluorescência aumentou abruptamente foi definido como a CMC e foidescoberta ser -100 μΜ.
Preparação de Lipossomas de Polietileno Glicol - PS (PEGuilado):Metodologia de Transferência de PEG
As quantidades requeridas de DMPC (Tc -23°C) e BPS (T -6a 8°C foram dissolvidos em clorofórmio e o solvente foi evaporado usandoum rotaevaporador (Buchi-R200, Fisher Scientific) para formar uma películafina nas paredes de um frasco de fundo redondo. Qualquer solvente residualfoi removido da amostra sob uma corrente de nitrogênio seco. Os lipossomasforam formados pela reidratação da película de lipídeo fina em Tampão deTris (TB, 300 mM NaCl, 25 mM de Tris, 5 mM de CaCl2.2H20, pH = 7,0,preparado em água isenta de pirogênio estéril) a 37°. As razões molares doslipídeos usados no presente estudo foram DMPC:BPS (70:30% em mol). Oslipossomas foram extrusados através de membrana de policarbonato de 200μπι empilhada tripla diversas vezes usando uma extrusora de alta pressão(Mico, Inc., Middleton, WI) a uma pressão de -200 a 250 psi (-1,38 a 1,72MPa). Os lipossomas foram filtrados estéreis através de uma unidade defiltração millex®-GP de 0,22 μιη (Millipore Corporation, Bedford, MA). Arecuperação de lipídeo foi estimada pela determinação do teor de fósforo pelométodo de Bartlett [17]. A distribuição de tamanho dos lipossomas foideterminada usando um analisador de tamanho de partícula Nicomp ModeloCW 380 (Particle Sizing Systems, Santa Barbara, CA) como descritopreviamente [18]. Os lipossomas classificados por tamanho foram associadoscom quantidade apropriada de rFVIII pela incubação a 37°C com oscilaçãosuave por -30 minutos. A PEGuilação da mistura de proteína-lipossoma foiobtida pela adição da mistura de proteína-lipossoma a uma película seca deDMPB-PEG2000. Foi garantido que o volume da mistura de proteína-lipossoma adicionado à película de PEG seca não resultasse na formação demicelas de PEG. A incorporação de PEG foi confirmada por MALDI-TOF(dados não mostrados). A % em mol final de PEG na preparação foi de 4%em mol do lipídeo total. A razão molar entre a proteína e o lipídeo foi mantidaa 1:10.000 durante todo os experimentos. Para estimar a quantidade deproteína associada com lipossomas PEGuilados, a proteína livre foi separadada proteína associada com o lipossoma PEGuilado usando a técnica decentrifugação de gradiente de densidade de dextrano descontínua [19]. Aporcentagem de proteína ativa associada foi determinada pelo ensaio deAPTT de estágio único [20]. A porcentagem de associação foi estimada ser ~27,6 ± 9,6% (± S.E.M, η = 5). As preparações foram usadas imediatamentedepois da preparação.
Considerações teóricas para a incorporação de polietileno glicol (PEG) emlipossomas.
Neste exemplo, PEG foi incorporado nos lipossomas a seguirda associação da proteína sobre a superfície dos lipossomas ao invés deincorporar o PEG durante a preparação da película de lipídeo. E consideradoque este método de incorporação de PEG reduzirá a possibilidade de que oPEG interfira com a capacidade da proteína para se associar com lipossomascomo um resultado do impedimento estérico. Acredita-se que as seguintesconsiderações teóricas afirmam contra a possibilidade de que a presença daproteína na superfície dos lipossomas comprometem a eficiência da inserçãode PEG.
O diâmetro médio dos lipossomas usados no estudo foi de 200nm. Sob a hipótese de que a espessura da bicamada é de 40 Â e a áreaocupada por cada molécula de fosfolipídeo é de 70 Â2, o número devesículas/μmol de fosfolipídeo foi estimado ser ~4,8 χ 10 vesículas. Paraestudos de imunização, 2 μg de proteína foram administrados por animal ecom base no excesso molar de proteína para lipídeo usado (1:10.000), cadaanimal recebeu -71,4 nmoles de lipídeo. A estrutura tridimensional doderivado de FVIII ligado à membrana pela cristalografia eletrônica revelouque os domínios FVIII têm um arranjo compacto no qual o domínio C2 daproteína interage com os fosfolipídeos [21]. Com base na dimensão da célulaunitária para o mapa bidimensional e a área de superfície total dos lipossomasde diâmetro médio de 200 nm, foi estimado que o número máximo demoléculas de FVIII que seriam empacotadas na superfície dos lipossomas éde ~ 2400. Entretanto, dado que o número máximo de moléculas de proteína /vesícula foi projetado ser -33 com base na razão de proteína para lipídeoutilizada em nossos estudos, a avaliação teórica acima revela que a maioria dasuperfície dos lipossomas ainda não está ocupada e disponível pararevestimento pelo PEG.
EXEMPLO 2
Este exemplo descreve as características dos lipossomaspreparados no Exemplo 1.
Espectroscopia de Fluoreseêneia
Os espectros de emissão de rFVIII e rFVIII associado comlipossomas PEGuilados foram obtidos usando fluorômetro de PTI (QuantaMaster, Photon Technology International, Lawrenceville, NJ). As amostrasforam excitadas a 280 nm e o espectro de emissão foi obtida a partir de 300 a400 nm. Uma largura de fenda de 4 nm foi usada nos caminhos tanto deexcitação quanto de emissão. A concentração da proteína foi de ~4 μg/ml euma cubeta de comprimento de curso variável foi usada para minimizar osefeitos de filtro internos.
As mudanças estruturais terciárias na proteína foraminvestigadas pela espectroscopia de fluoreseêneia (Figura 1). O espectro deemissão de FVIII livre mostrou um máximo de emissão de 333 nm. Aproteína associada com lipossomas PEGuilados demonstraram uma mudançapara azul significante no máximo de emissão a 325 nm e foi acompanhada porum aumento grande na intensidade (dados não mostrados). A mudança paraazul pronunciada no máximo de emissão sugere a possibilidade deintercalação ou encapsulação substanciais de domínios hidrofóbicos de rFVIIIna bicamada lipossômica. Isto foi em contraste com as mudanças modestas noespectro de emissão que foi observado a seguir da associação da proteína aoslipossomas que carecem de PEG. Na ausência de PEG, os dados indicaramapenas mudanças conformacionais mínimas e a maior parte da proteína naforma ligada à membrana estava na superfície dos lipossomas. Acredita-seque a mudança do comprimento de onda seja o resultado da mudança naconstante dielétrica no microambiente de resíduos de triptofano (Trp) queparticipa na ligação de membrana devido à presença de PEG na superfície delipossomas ou acessibilidade reduzida de moléculas de solvente aos resíduosde Trp devido ao efeito estérico de PEG. As mudanças na constante dielétricado solvente circundante mostraram influenciar a mudança de um fluoróforopela alteração da organização das moléculas de solvente em torno do estadoexcitado do fluoróforo [25].
EXEMPLO 3
Este exemplo descreve a preparação de micelas contendo PS.
As películas de lipídeo comprimidas de dicaproil fosfatidilserina (DCPS) edicaproil fosfatidiltioetanol (DCPSE) (razão molar 97:3, lipídeo total 5μπιο^) foram preparadas a partir de uma solução de estoque de clorofórmiopela evaporação do solvente em um rota-evaporador. As películas foramreconstituídas com 1 ml de tampão de Tris (5 mM de CaCl2, 25 mM de Tris e300 mM de NaCl5 pH = 7) por turbilhonamento para obter 5 mM de soluçõesde lipídeo. O estoque de rFVIII concentrado foi diluído com a solução delipídeo de 5 mM e incubado a 37°C por 30 minutos. O método de PEGuilaçãoé similar à PEGuilação dos lipossomas pré-formados usando moléculas dePEG ativadas. A PEGuilação foi obtida ligando-se uma molécula de PEGativada (mPEG maleimida linear ou ramificado) ao grupo tiol livre presenteno grupo de ponta de fosfolipídeo (DCPSE).
EXEMPLO 4
Este exemplo descreve a preparação de estruturas cocleadas oucilindros contendo PS. Os lipossomas classificados por tamanho de 100 nmou menos contendo fosfatidilserina cerebral pura (BPS) e dioleoilfosfatidiltioetanolamina (DOPSE) (razão molar 99:1) foram preparados emum tampão de Tris isento de Ca2+. O complexo de rFVIII - lipossoma foigerado pela incubação de soluções de rFVIII concentradas na presença doslipossomas classificados por tamanho por 30 minutos a 37°C. A viscosidadedo complexo lipossômico de rFVIII foi aumentado pela adição de solução dedextrano (20% de p/v) para se obter uma concentração de dextrano final de 5ou 10% p/v. O crescimento controlado de cilindros cocleados é iniciadosalpicando-se íons Ca na solução (concentração final 5 mM) e incubando amistura em temperatura mais baixa por 30 minutos. A PEGuilação foi obtidapela ligação a uma molécula de PEG ativada (mPEG maleimida linear ouramificado) ao grupo tiol livre presente no grupo de ponta de fosfolipídeo(DOPSE). Além disso, a PEGuilação de cilindros nanococleados pode serrealizada pelo engendramento de uma ligação covalente entre as moléculas dePEG ativadas (éster de N-hidróxi-succinimida de ácidos PEG carboxílicos(PEG-NHS)) e grupo amino livre presentes no grupo de ponta de BPS. APEGuilação direta de rFVIII pelo reagente de PEG-NITS é muito improvávelcom base em um grande excesso de grupos amino presentes no grupo deponta de PS.
EXEMPLO 5
Este exemplo descreve a complexação do complexolipossômico de rFVIII com PEG pela tecnologia de PEG ativado. Oslipossomas de DMPC:BPS:dioleoilfosfatidiltioetanol (DOPSE) (razão molarde 70:25:5) foram preparados como descrito abaixo. As quantidadesrequeridas de DMPC5 BPS e DOPSE foram dissolvidas em clorofórmio. Umapelícula lipídica fina foi formada nas paredes de um tubo de vidro, pelaremoção do solvente em um rotoevaporador de Buchi-R200 (FisherScientific). Os lipossomas foram preparados pela reidratação da película delipídeo com tampão de Tris (TB 25 mm Tris, 300 mM de NaCl, 5 mM deCaC^ pH = 7,4) a 37°C. Os lipossomas foram extrusados oito vezes atravésde membranas de policarbonato de 100 nm empilhada dupla usando umaextrusora de alta pressão (Lipex Biomembranes, Inc.) a uma pressão de -200psi (1,38 MPa). A distribuição de tamanho das partículas foi monitoradausando um analisador de tamanho Nicomp modelo CW380 (Particle SizingSystem).
Preparação de proteína lipossômica
A associação da proteína com os lipossomas pré-formados foiobtida pela incubação da proteína na presença dos lipossomas a 37°C por 30minutos com oscilação suave ocasional. A razão molar da proteína para foimantida a mesma para a toda preparação (1:10.000).
A PEGuilação pode ser obtida pelo engendramento de umaligação covalente entre um grupo tiol livre presente no grupo de ponta dolipídeo DOPSE e um derivado de PEG ativado. Um tal derivado pode serrepresentado pelo mPEG-maleimida ou PEG maleimida ramificado. Outrosderivados de PEG ativados que alvejam um grupo tiol livre são igualmenteadequadas para formar uma ligação covalente entre o lipossoma e a porção dePEG.
A vantagem deste método é que os grupos tiol são menosfreqüentemente presentes na superfície das moléculas de proteína. Assim oexcesso grande de lipídeos (razão de proteína:lipídeo é de 1:10000 onde 5%dos lipídeos são DOPSE) é esperado reduzir a ligação de PEG ativado aorFVIII e diminui a sua atividade.
EXEMPLO 6
Este exemplo descreve estudos in vivo usando as composiçõesdescritas no Exemplo 1. Uma colônia de camundongos hemofílicos (com umadeleção alvo no exon 16 do gene de FVIII) [22]. Números iguais decamundongos machos e fêmeas, adultos, de idade de 8 a 12 semanas foramusados para os estudos visto que as características de sua resposta imune arFVIII mostraram ser comparáveis [23].
As amostras de sangue foram obtidas pela punção cardíaca eadicionados a uma razão 10:1 (v/v) para a ácido citrato dextrose (ACD,contendo 85 mM de citrato de sódio, 110 mM de D-glicose e 71 mM de ácidocítrico). O plasma foi separado pela centrifugação e as amostras foramarmazenadas a -80°C até a análise. Todos os estudos foram realizados deacordo com as diretrizes do Institutional Animal Care e Use Committee(IACUC) na University at Buffalo.
A imunização de camundongos silenciado em FVIII (n = 12)consistiu de quatro injeções subcutâneas (s.c.) de rFVIII ou lipossomasPEGuilados de rFVIII (2 μg) em intervalos semanais. As amostras de sangueforam obtidas no final de 6 semanas.
Medições de Anticorpo
Detecção de Anticorpos Anti-rFVIII Totais
Os títulos de anticorpo anti-rFVIII totais foram determinadospelo ELISA. Em resumo, placas Nunc-Maxisorb de 96 reservatórios foramrevestidas com 50 μΐ de 2,5 μg/ml de rFVIII em tampão de carbonato (0,2 M,pH = 9,4) e incubados a 4°C durante a noite. As placas foram depois lavadas6 vezes com 100 μΐ de tampão de fosfato (PB; 10 mM de Na2HPO4, 1,8 mMde KH2PO4, 14 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl) contendo 0,05% de Tween 20(PBT). Os sítios de ligação de proteína não específicos sobre a superfícieabsortiva do plástico foram bloqueados pela incubação de 200 μΐ de tampãoPB contendo 1% de albumina sérica bovina (PBA) por 2 horas na temperaturaambiente. As placas foram lavadas 6 vezes com PBT e depois 50 μΐ de váriasdiluições de amostras de plasma de camundongo em PBA foram adicionadase incubadas a 37°C por 1 hora. As placas foram lavadas 6 vezes com PBT eincubadas com 50 μΐ da diluição 1:1000 de Ig anti-camundongo de cabraconjugada com fosfatase alcalina em PBA, na temperatura ambiente por 1hora. As placas foram lavadas 6 vezes com PBT e 100 μΐ de solução de p-nitrofenil fosfato a 1 mg/ml em tampão de dietanolamina (que consiste dedietanolamina 1 M, 0,5 mM de MgCl2). As placas foram incubadas natemperatura ambiente por 30 minutos e a reação foi extinta pela adição de 100μΐ de NaOH3 Ν. O produto da reação de fosfatase alcalina foi determinadopela absorbância a 405 nm usando uma leitora de placa Spectramax(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA). Os resultados deimunogenicidade foram expressados como segue: a regressão linear foirealizada sobre os valores de absorbância obtidos com anticorpo anti-FVIIIhumano de IgG de murino monoclonal, ESH8 que se liga ao domínio C2.Metade da diferença entre a absorbância máxima e mínima prognosticada foicalculada como o fator específico de placa (PSF). Uma regressão linear daplotagem de valores de absorbância de várias diluições (1:100 a 1:40.000)versus o Iog da diluição foi usada para calcular a diluição que deu umadensidade ótica igual ao PSF. A diluição assim obtida foi considerada o títulodo anticorpo da amostra.
Detecção de Anticorpos Anti-rFVIII Inibidores
Os anticorpos anti-rFVIII inibidores (neutralizadores) foramdetectados usando a modificação de Nijmegen do ensaio de Bethesda [24]. Aatividade de rFVIII residual foi medida usando o ensaio de APTT de umestágio [20]. Cada diluição foi testada em duplicata. Uma Unidade deBethesda (BU) é a atividade inibidora que produz 50% de inibição daatividade de rFVIII. O ponto de 50% de inibição foi determinado pelaregressão linear de pontos de dados que caem pelo menos dentro da faixa de20 a 80% de inibição.
Estudos de Proliferação de Célula T
Camundongos hemofílicos fêmeas, de idade de 8 a 12 semanasforam imunizados usando duas injeções subcutâneas (s.c.) de rFVIII ourFVIII lipossômico PEGuilado (2 μg de proteína por injeção) em intervalossemanais. Os camundongos de controle não receberam nenhum rFVIII. Osanimais foram sacrificados três dias depois da segunda injeção e o baço foicolhido como uma fonte de células T. As células de baço foram esgotadas decélulas CD8+ usando pérolas magnéticas revestidas com um anticorpomonoclonal anti-camundongo de rato para o antígeno de membrana Lyt 2(Dynal Biotech, Oslo, Noruega) expressado em células CD8, usando oprotocolo do fabricante. As células remanescentes (2 χ IO5 células/ 200 μΐ)foram cultivadas em placas de fundo chato de 96 reservatórios com rFVIII(100 ng/ reservatório ou 1000 ng/ reservatório) em meio de cultura de RPMI-1640 completa contendo 10.000 U/ml de penicilina, 10 mg/ml deestreptomicina, 2,5 mM de piruvato de sódio, 4 mM de L-Glutamina, 0,05mM de 2-mercaptoetanol, 2 mg/ml de Polimixina B e 0,5% de soro decamundongo hemofílico inativado por calor. Um μΟΐ/ΓβεεΓν^όπο de H-timidina (6,7 Ci/mmol) foi adicionado depois de 72 horas de cultura a 37°C.
No final de 16 h, as células foram colhidas usando um Micromate Harvester(Packard, Meriden, CT) e a incorporação de H-timidina foi medida usandoum contador de cintilação e luminescência de microplaca TopCount®(Packard Instrument Company, Meriden, CT). Os grupos de tratamentoconsistiram de 3 animais em réplica e as células de cada camundongoindividual foram testadas em quadruplicata quanto à proliferação dependentede antígeno. Os dados são relatados como um índice de estimulação (SI), queé a razão da incorporação de 3H-timidina média na presença do antígeno paraa incorporação média na ausência do antígeno. Este método normalizou osdados de cada experimento e possibilita a comparação de experimentosrealizados em tempos diferentes.
Análise de citocina
Depois de 72 horas de incubação, os sobrenadantes das célulasT estimuladas com antígeno foram coletadas e armazenadas a -70°C até outraanálise. O sobrenadante foi analisado pelo ELISA de captura de anticorpo(R&D systems, Minneapolis, MN). IFN-γ foi medido como uma citocina Thlrepresentativa e IL-10 foi medida como uma citocina Th2 representativa.Estudos de Farmacocinéticas
Vinte e sete camundongos hemofílicos machos (20 a 26 g, 8 a12 semanas de idade) receberam 400 IU/kg de rFVIII ou rFVIII lipossômicoPEGuilado como uma única injeção de bolo i.v. via a veia peniana. Asamostras de sangue (-600 μΐ) foram coletadas,08, 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 36 e48 h após a dose pela punção cardíaca (n = 2 a 3 camundongos/ponto detempo) e adicionadas a ACD. O plasma foi separado e armazenado a -IO0Caté a análise. As amostras de plasma foram analisadas quanto a atividade daproteína pelo ensaio cromogênico (Coamatic FVIII, DiaPharma Group, WestChester, OH). As atividades calculadas em cada ponto de tempo foram depoisutilizadas para estimar os parâmetros farmacocinéticos básicos pela análisenão compartimental usando WinNonlin (Pharsight Corporation,Mountainview, CA).
Análise Estatística
Os dados foram analisados pelo ANOVA usando o AnalystApplication da SAS (SAS Institute Inc., Cary, NC) ou Minitab (Minitab Inc.,State College, PA). O teste de comparação múltipla post-hoc de Dunnette foiusado para detectar as diferenças signifícantes (p < 0,05).
RESULTADOS
É mostrado na Figura 2A os títulos de anticorpo anti-rFVIIItotal na ausência e presença de lipossomas PEGuilados compreendidos deDMPC e BPS. Os animais tratados com rFVIII lipossômico PEGuiladodemonstraram títulos de anticorpo significantemente mais baixos (1123,1 ±189,5, ± S.E.M, η = 12, valor ρ < 0,05) em comparação com os animaistratados com rFVIII (13,166,7 ± 2042,2, ± S.E.M, η = 15). Estes resultadosindicam que a formação de anticorpo é reduzida na presença de lipossomasPEGuilados.Os anticorpos neutralizadores (isto é, os anticorpos específicoscontra o Fator VIII), que interferem com a atividade da proteína foramdetectados usando o ensaio de Bethesda. A Figura 2B mostra os títulos deanticorpo inibidores, expressados em Unidades Bethesda (BU) a seguir dostratamentos com rFVIII e rFVIII lipossômico PEGuilado no final de 6semanas. Os dados indicaram que os anticorpos neutralizadores foramsignificantemente mais baixos na presença de lipossomas PEGuilados (73,65±31,25 BU/ml, ± S.E.M, η = 12, valor ρ < 0,05) em comparação ao rFVIIIsozinho (689,7 ± 78,1 BU/ml, ± S.E.M., η = 13). Estes resultados indicaramque os lipossomas PEGuilados não apenas reduziram os títulos de anticorpoanti-FVIII globais mas também diminuíram os títulos de anticorpos queinativam a proteína. Com propósitos de comparação os títulos de anticorpototal e inibidor a seguir da administração de lipossomas de PC/PS nãoPEGuilados também são demonstrados. Os dados indicaram que os títulos deanticorpo total e inibidor médios na presença de lipossomas PEGuiladosforam mais baixos do que aqueles de lipossomas não PEGuilado, embora asdiferenças não fossem estatisticamente diferentes (p > 0,05).
Para determinar se as células T específicas de FVIII foramestimuladas in vivo a seguir da imunização com rFVIII lipossômicoPEGuilado, a resposta de proliferação de célula T para a inoculação de rFVIIIin vitro foi avaliada. O índice de estimulação média de células de baçoisoladas de animais que receberam tratamento com rFVIII lipossômicoPEGuilado foi mais baixo comparado com animais que receberam apenastratamento com rFVIII (Figura 3). Os dados sugerem diferenças possíveis nosclones de célula T que foram ativados para a expansão clonal dependendo seos animais foram expostos ao rFVIII na presença e ausência de lipossomascontendo PS PEGuilados.
Para determinar se a redução na imunogenicidade de rFVIII napresença de lipossomas contendo PS PEGuilado foi um resultado da secreçãode IL-IO reduzida, a análise de citocina de células T estimuladas por antígenofoi realizada a seguir da imunização de animais com rFVIII livre oulipossômico. Como mostrado na Figura 4, o nível de IL-IO médiosecretado pelas células T de animais administrados com rFVIII associadocom lipossomas PEGuilado foi mais baixo do que para estes animaisadministrados apenas com rFVIII. Os níveis negligenciáveis de IFN-7foram detectados no meio de cultura para todos os grupos de tratamento(dados não mostrados). De ponta a ponta, os dados sugerem que a reduçãona imunogenicidade de rFVIII administrado na presença de lipossomas10 contendo PS PEGuilado pode ser mediada, em parte, pela produção de IL-reduzida. Além disso, os dados sugerem que a redução naimunogenicidade não é o resultado da polarização da resposta deThl/Th2.
Embora não seja intenção estar ligado por nenhuma teoriaparticular, acredita-se que a inclusão de PS em lipossomas contribua para aimunomodulação. Considerando que a resposta de anticorpo ao rFVIII sejaum processo dependente da célula T, é possível que a redução naimunogenicidade de rFVIII na presença de lipossomas contendo PSPEGuilado possa resultar da repressão de clones de célula T específicos derFVIII in vivo.
Além da redução na imunogenicidade de rFVIII, aassociação de rFVIII com lipossomas contendo PS também pode estendero tempo de circulação de rFVIII in vivo e assim reduzir a freqüência deadministração da proteína requerida para controlar a hemofilia A. osestudos farmacocinéticos (PK) sugeriram que a meia vida em circulação(ti/2) do rFVIII lipossômico PEGuilado aumentou em ~ 35% em relação aorFVIII sozinho (Tabela 1). A exposição sistêmica entre os tratamentos foisimilar (Figura 5 e Tabela 2).Tabela 2
Resumo de parâmetros PK obtidos a seguir da análise não compartimental
<table>table see original document page 24</column></row><table>
*, Em 36 horas após a administração, todos os animais tratados com complexo de rFVIIInão PEGuilado, tiveram níveis plasmáticos de rFVIII abaixo do Limite De Detecção. Paraestimar o parâmetro PK, os níveis plasmáticos de rFVIII em 36 horas foi ajustado igual aolimite de detecção (0,035 IU/ml). AUC indica a área sob a curva; Vss é o volume dedistribuição em estado constante e CL é a depuração.
EXEMPLO 6
Estes exemplos fornecem uma análise comparativa delipossomas associados a PEG preparados com ou sem um fosfolipídeonegativamente carregado. Os títulos de inibidores foram determinados comodescrito no Exemplo 5 para rFVIII livre, FVIII associado com ou incorporadoem lipossomas preparados com PS e rFVIII associados com ou incorporadosem lipossomas preparados sem PS. Como mostrado na Figura 6, os títulos deanticorpo inibidor para rFVIII associado com ou incorporado em lipossomaspreparados com PS são significantemente mais baixos do que os títulos pararFVIII livre e para rFVIII associado com ou incorporado em lipossomaspreparados sem PS.
Aqueles habilitados na técnica podem otimizar preparaçõesindividuais. Além disso, a observação de que a imunogenicidade do rFVIIIlipossômico PEGuilado contendo PS é muito mais baixa do que a do rFVIIIsozinho representa um progresso significante na direção do desenvolvimentode formulações que são menos imunogênicas.
Referências:
[1] J. Klinge, Ν. M. Ananyeva, C. A. Hauser, E. L. Saenko,Hemophilia A - from basic science to clinicai practice, Semin ThrombHemost 28 (2002) 309-322.
[2] K. Fijnvandraat, W. S. Bril, J. Voorberg, Immunobiology ofinhibitor development in hemophilia A, Semin Thromb Hemost 29 (2003) 61-68.
[3] P. Lollar, Molecular characterization of the immune response tofactor VIII, Vox Sang 83 Supl 1 (2002) 403-408.
[4] P. A. Foster, T. S. Zimmerman, Factor VIII structure andfunction, BloodRev 3 (1989) 180-191.
[5] P. J. Fay, Factor VIII structure and function, Thromb Haemost 70(1993) 63-67.
[6] D. Scandella, M. Mattingly, S. de Graaf, C. A. Fulcher,Localization of epitopes for human factor VIII inhibitor antibodies byimmunoblotting and antibody neutralization, Blood 74 (1989) 1618-1626.
[7] P. Lollar, Analysis of factor VIII inhibitors using hybridhuman/porcine factor VIII, Thromb Haemost 78 (1997) 647-651.
[8] J. F. Healey, I. M. Lubin, H. Nakai, E. L. Saenko, L. W. Hoyer,D. Scandella, P. Lollar, Residues 484-508 contain a major determinant of theinhibitory epitope in the A2 domain of human factor VIII, J Biol Chem 270(1995) 14505-14509.
[9] I. M. Lubin, J. F. Healey, R. T. Barrow, D. Scandella, P. Lollar,Analysis of the human factor VIII A2 inhibitor epitope by alanine scanningmutagenesis, J Biol Chem 272 (1997) 30191-30195.
[10] P. J. Fay, D. Scandella, Human inhibitor antibodies specific forthe factor VIII A2 domain disrupt the interaction between the subunit andfactor IXa, J Biol Chem 274 (1999) 29826-29830.
[11] D. Zhong, E. L. Saenko, M. Shima, M. Felch, D. Scandella,Some human inhibitor antibodies interfere with factor VIII binding to factorIX, Blood 92 (1998) 136-142.
[12] J. F. Healey, R. T. Barrow, Η. M. Tamim, I. M. Lubin, M.Shima, D. Scandella, P. Lollar, Residues Glu2181-Val2243 contain a majordeterminant of the inhibitory epitope in the C2 domain of human factor VIII,Blood 92(1998)3701-3709.
[13] D. Scandella, G. E. Gilbert, M. Shima, H. Nakai, C. Eagleson, M.Felch, R. Prescott, K. J. Rajalakshmi, L. W. Hoyer, E. Saenko, Some factorVIII inhibitor antibodies recognize a common epitope corresponding to C2domain amino acids 2248 through 2312, which overlap a phospholipid-binding site, Blood 86 (1995) 1811-1819.
[14] Μ. T. Reding, D. K. Okita, Β. M. Diethelm-Okita, T. A.Anderson, Β. M. Conti-Fine, Human CD4+ T-cell epitope repertoire on theC2 domain of coagulation factor VIII, J Thromb Haemost 1 (2003) 1777-1784.
[15] Κ. P. Pratt, J. Qian, E. Ellaban, D. K. Okita, Β. M. Diethelm-Okita, B. Conti-Fine, D. W. Scott, Immunodominant T-cell epitopes in thefactor VIII C2 domain are located within an inhibitory antibody binding site,Thromb Haemost 92 (2004) 522-528.
[16] K. Sou, T. Endo, S. Takeoka, E. Tsuchida, Poly(ethylene glycol)-modification of the phospholipid vesicles by using the spontaneousincorporation of poly(ethylene glycol)-lipid into the vesicles, BioconjugChem 11 (2000)372-379.
[17] G. R. Bartlett, Phosphorus assay in column chromatography, JBiol Chem 234 (1959) 466-468.
[18] V. S. Purohit, K. Ramani, R. S. Kashi, M. J. Durrani, T. J.Kreiger, S. V. Balasubramanian, Topology of factor VIII bound tophosphatidylserine-containing model membranes, Biochim Biophys Acta1617 (2003)31-38.
[19] T. D. Heath, B. A. Macher, D. Papahadjopoulos, Covalentattachment of immunoglobulins to liposomes via glycosphingolipids,Biochim Biophys Acta 640 (1981) 66-81.
[20] J. Over, Methodology of the one-stage assay of Factor VIII(VIII:C), Scand J Haematol Suppl 41 (1984) 13-24.[21] S. Stoilova-McPhie, Β. O. Villoutreix, Κ. Mertens5 G. Kemball-Cook, A. Holzenburg, 3-Dimensional structure of membrane-boundcoagulation factor VIII: modeling of the factor VIII heterodimer within a 3-dimensional density map derived by electron crystallography, Blood 99(2002) 1215-1223.
[22] L. Bi5 A. M. Lawler, S. E. Antonarakis, K. A. High5 J. D.Gearhart5 Η. H. Kazazian5 Jr., Targeted disruption of the mouse factor VIIIgene produces a model of haemophilia A5 Nat Genet 10 (1995) 119-121.
[23] J. Qian5 M. Borovok5 L. Bi5 Η. H. Kazazian5 Jr., L. W. Hoyer,Inhibitor antibody development and T cell response to human factor VIII inmurine hemophilia A, Thromb Haemost 81 (1999) 240-244.
[24] B. Verbruggen, I. Novakova, H. Wessels, J. Boezeman, M. vanden Berg5 E. MauserBunschoten, The Nijmegen modification of the Bethesdaassay for factor VIIIiC inhibitors: improved specificity and reliability,Thromb Haemost 73 (1995) 247-251.
[25] J. R. Lakowicz5 Principies of fluorescence spectroscopy, KluwerAcademic/Plenum.

Claims (24)

1. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende lipossomas compreendendo:a) fosfatidil etanolamina (PE) derivado com polietileno glicol(PEG),b. um lipídeo anfipático selecionado do grupo que consiste defosfatidil colina, fosfatidil glicerol e combinações destes e opcionalmente, PE.c. um lipídeo de carga negativa selecionado do grupo queconsiste de fosfatidilserina (PS), ácido fosfatídico (PA) e combinações destes; ed. Fator VIII,em que a imunogenicidade do Fator VIII é reduzida emrelação à imunogenicidade do Fator VIII livre.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a razão do lipídeo anfipático para o lipídeonegativamente carregado está entre 50:50 a 90:10 e a quantidade de PEderivado com PEG é de 1 a 15% em mol.
3. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o lipídeo anfipático é PC e o lipídeonegativamente carregado é PS.
4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que a razão de PC para PS é de 70:30.
5. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o lipídeo anfipático é PC e PE e o lipídeonegativamente carregado é PS e a razão de PC:PS:PE é de 80:10:10 ou 70:10:20.
6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato de que a razão de PC:PS:PE derivado com PEG é de 70:30:15.
7. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o lipossoma compreende ainda PE que não éderivado com PEG na quantidade de 1 a 10%.
8. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que as duas cadeias de acila dos fosfolipídeos têmentre 12 e 22 átomos de carbono em cada cadeia, em que as duas cadeias deacila têm o número igual ou diferente de átomos de carbono.
9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8,caracterizada pelo fato de que a cadeia de acila é selecionada do grupo queconsiste de ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico.
10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação-1, caracterizada pelo fato de que ainda compreende de 0,5 a 30% em mol decolesterol.
11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação,caracterizada pelo fato de que existe um espaçador de 6 a 12 átomos decarbono entre as porções de PE e PEG do PE derivado com PEG.
12. Método para fabricar a composição como definida nareivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:a) preparar lipossomas que compreendam um lipídeoantipático e um lipídeo negativamente carregado,b) adicionar a proteína de Fator VIII aos lipossomas para fazercom que a proteína se associe com ou incorpore nos lipossomas; ec) adicionar lipídeo anfipático derivado com PEG a b) tal quede 1 a 15 porcento em mol de PEG se torne complexado com os lipossomasassociados/incorporados com a proteína.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o lipídeo anfipático é PC, o lipídeo negativamente carregadoé PS e o PEG é derivado para PE.
14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que a razão de PC:PS:PE é de 70:30:15.
15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que o PE é selecionado do grupo que consiste de DMPE, DPPE eDSPE.
16. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de que os lipossomas preparados na etapa a compreendem umlipídeo antipático, um lipídeo negativamente carregado e colesterol.
17. Método para fabricar a composição farmacêutica comodefinida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende:a) preparar lipossomas que compreendam um lipídeonegativamente carregado, um lipídeo anfipático e PE derivado com PEG; eb) adicionar o Fator VIII,para formar lipossomas tal que a imunogenicidade do FatorVIII é reduzida em relação à imunogenicidade do Fator VIII livre.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o lipídeo negativamente carregado é PS e o lipídeo anfipáticoé PC.
19. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o PE do PE derivado com PEG é selecionado do grupo queconsiste de DMPE, DPPE e DSPE.
20. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que os lipossomas na etapa a compreendem ainda colesterol.
21. Método para fabricar a composição farmacêutica comodefinida na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende:a) preparar lipossomas que compreendam PC, PS e PEativado;b) adicionar o Fator VIII;c) adicionar PEG ativado tal que o PEG ativado se ligue ao PEativado.
22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que um braço espaçador que compreende de 6 a 12 átomos decarbono é ligado ao PEG ou PE.
23. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende micelas e/ou estruturas cocleadas compreendendo:a) PEG derivado com PE,b) um lipídeo de carga negativa selecionado do grupo queconsiste de PS, PA e combinações destes;c) opcionalmente um lipídeo anfipático selecionado do grupoque consiste de PC, PE, PG e combinações destes, ed) Fator VIII,a quantidade de PE derivado com PEG é de 1 a 15% em mol,em que a imunogenicidade do Fator VIII é reduzida em relação àimunogenicidade do Fator VIII livre.
24. Uso de uma formulação em que a proteína é associada comou incorporada nas estruturas lipídicas que compreendam lipossomas, micelase estruturas cocleadas, em que as estruturas lipídicas compreendem umlipídeo negativamente carregado e PEG derivado com PE, caracterizado pelofato de ser na preparação de um medicamento para reduzir a imunogenicidadede uma proteína do Fator VIII administrada, em que a imunogenicidade daproteína administrada é menor do que a imunogenicidade da proteína do FatorVIII livre e em que a meia vida circulante da proteína administrada é maior doque a meia vida circulante da proteína do Fator VIII livre.
BRPI0612843-2A 2005-06-29 2006-06-29 composição farmacêutica, métodos para fabricar a composição, e, uso de uma formulação BRPI0612843A2 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US69508005P 2005-06-29 2005-06-29
US60/695,080 2005-06-29
PCT/US2006/025519 WO2007002886A2 (en) 2005-06-29 2006-06-29 Compositions and methods for less immunogenic pr0tein-lip1d complexes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BRPI0612843A2 true BRPI0612843A2 (pt) 2010-11-30

Family

ID=37596074

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0612843-2A BRPI0612843A2 (pt) 2005-06-29 2006-06-29 composição farmacêutica, métodos para fabricar a composição, e, uso de uma formulação

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20070141135A1 (pt)
EP (1) EP1898939A2 (pt)
JP (1) JP2008544990A (pt)
CN (1) CN101304757A (pt)
AU (1) AU2006263566A1 (pt)
BR (1) BRPI0612843A2 (pt)
CA (1) CA2613705A1 (pt)
NZ (1) NZ565039A (pt)
WO (1) WO2007002886A2 (pt)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2007357B1 (en) * 2006-03-30 2016-11-09 The Research Foundation Of State University Of New York Compositions of less immunogenic and long-circulating protein-lipid complexes
GB0905348D0 (en) 2009-03-27 2009-05-13 Ucl Business Plc Carrier
US10617640B2 (en) 2009-07-07 2020-04-14 The Research Foundation For The State University Of New York Phosphoserine containing compositions for immune tolerance induction
EP2704688B1 (en) * 2011-05-05 2019-07-10 Matinas BioPharma Nanotechnologies, Inc. Cochleate compositions and methods of making and using same
EP2763659B1 (en) * 2011-10-06 2017-07-19 The Research Foundation Of State University Of New York Compositions and methods for immune tolerance induction
GB201417589D0 (en) * 2014-10-06 2014-11-19 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Pharmaceutical Formulations
GB201518170D0 (en) * 2015-10-14 2015-11-25 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Colloidal particles for subcutaneous administration with intravenous administration of therapeutic agent
GB201518172D0 (en) * 2015-10-14 2015-11-25 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Colloidal particles for use in medicine
GB201518171D0 (en) * 2015-10-14 2015-11-25 Cantab Biopharmaceuticals Patents Ltd Colloidal particles for topical administration with therapeutic agent
CN109689028A (zh) * 2016-07-12 2019-04-26 马丁尼斯生物制药纳米技术公司 用于中枢神经系统递送和治疗隐球菌感染的脂质卷包封的抗真菌化合物
CN112384284B (zh) * 2018-03-23 2024-08-27 华盛顿大学 免疫抑制性材料及相关方法
JP2020026397A (ja) * 2018-08-09 2020-02-20 国立大学法人 岡山大学 ＴｒｋＢアンタゴニストを含む医薬組成物
GB201915855D0 (en) * 2019-10-31 2019-12-18 Univ Oxford Innovation Ltd An extracellular vesicle
CA3184687A1 (en) * 2020-07-01 2022-01-06 Sathy V. Balu-Iyer Method for preparation of liposomes

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4127502A (en) * 1977-06-10 1978-11-28 Eastman Kodak Company Stabilizers for reconstituted, lyophilized samples
US4795806A (en) * 1987-07-16 1989-01-03 Miles Laboratories, Inc. Phospholipid affinity purification of Factor VIII:C
US5580856A (en) * 1994-07-15 1996-12-03 Prestrelski; Steven J. Formulation of a reconstituted protein, and method and kit for the production thereof
US6323322B1 (en) * 1997-04-30 2001-11-27 Enzon, Inc. Single-chain antigen-binding proteins capable of glycosylation, production and uses thereof
CA2329768C (en) * 1998-04-27 2008-06-10 Opperbas Holding B.V. Pharmaceutical composition comprising factor viii and neutral liposomes
US20020132982A1 (en) * 2000-11-30 2002-09-19 Balasubramanian Sathyamangalam V. AHF associated dispersion system and method for preparation
ZA200305980B (en) * 2001-02-12 2007-01-31 Res Dev Foundation Modified proteins, designer toxins, and methods of making thereof
WO2003013245A1 (en) * 2001-08-07 2003-02-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Polyamines and analogs for protecting cells during cancer chemotherapy and radiotherapy
US20040229793A1 (en) * 2003-02-05 2004-11-18 Balasubramanian Sathyamangalam V. Compositions and methods for less immunogenic protein formulations

Also Published As

Publication number Publication date
CN101304757A (zh) 2008-11-12
US20070141135A1 (en) 2007-06-21
NZ565039A (en) 2010-04-30
AU2006263566A1 (en) 2007-01-04
CA2613705A1 (en) 2007-01-04
WO2007002886A3 (en) 2007-05-03
EP1898939A2 (en) 2008-03-19
WO2007002886A2 (en) 2007-01-04
JP2008544990A (ja) 2008-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8110218B2 (en) Compositions and methods for less immunogenic protein-lipid complexes
JP4545928B2 (ja) 第ｖｉｉｉ因子及び中性リポソームを含有する薬学的組成物
JP5160534B2 (ja) 低免疫原性および長時間循環性タンパク質−脂質複合体の組成物
Purohit et al. Lower inhibitor development in hemophilia A mice following administration of recombinant factor VIII-O-phospho-L-serine complex
Peng et al. PEGylation of a factor VIII–phosphatidylinositol complex: pharmacokinetics and immunogenicity in hemophilia a mice
US20070141135A1 (en) Compositions and methods for less immunogenic protein-lipid complexes
JP2024532164A (ja) 血友病ａの治療における使用のための修飾コロイド粒子
JP7573582B2 (ja) Ｐｅｇ化リポソームおよび血液凝固因子の製剤処方
US7875288B2 (en) Method for treating blood coagulation disorders
Peng et al. Phosphatidylinositol containing lipidic particles reduces immunogenicity and catabolism of factor VIII in hemophilia a mice
Shetty et al. Soy Phosphatidylinositol Containing Nanoparticle Prolongs Hemostatic Activity of B‐Domain Deleted F actor VIII in H emophilia A Mice
US10064922B2 (en) Compositions and methods for immune tolerance induction
Ramani et al. Passive transfer of polyethylene glycol to liposomal‐recombinant human FVIII enhances its efficacy in a murine model for hemophilia A
JP2008528696A (ja) 低免疫原性のタンパク質製剤のための組成物および方法
CN1774281B (zh) 包含蛋白质和/或多肽以及胶体颗粒的药物组合物
Ramani et al. Preclinical Evaluation of PEGylated Liposomal-Recombinant Human FVIII in a Murine Model of Hemophilia A
Gaitonde et al. Intravenous administration of Factor VIII–O-Phospho-L-Serine (OPLS) complex reduces immunogenicity and preserves pharmacokinetics of the therapeutic protein
MX2008000223A (en) Compositions and methods for less immunogenic pr0tein-lip1d complexes
Miclea et al. Effect of phosphatidylethanolamine and polyethylene glycol on the immunogenicity and pharmacokinetic properties of PS containing liposomal B domain deleted rFVIII in a murine model of hemophilia A
Purohit et al. Interaction of dicaproyl phosphatidylserine with recombinant factor VIII and its impact on immunogenicity
US20240358801A1 (en) Modified colloidal particles for use in the treatment of haemophilia a
JP2006528965A (ja) 血友病の治療のための第ＶＩＩＩ因子および第ＩＸａ因子を含む組成物
WO2007123691A2 (en) Method for treating blood coagulation disorders
BRPI0621020A2 (pt) inibição da resposta imune anti-fviii

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B08F Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette]

Free format text: REFERENTE A 6A ANUIDADE.

B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: NAO APRESENTADA A GUIA DE CUMPRIMENTO DE EXIGENCIA. REFERENTE A 6A ANUIDADE.