BRPI0613004A2 - expandase mutante, polinucleotÍdeo, vetor ou cassete de expressço, cÉlula hospedeira, mÉtodo de produzir uma expandase mutante e mÉtodo de produzir um composto á-lactÂmico de interesse - Google Patents
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Abstract
EXPANDASE MUTANTE, POLINUCLEOTIDEO, VETOR OU CASSETE DE EXPRESSÂO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUZIR UMA EXPANDASE MUTANTE E METODO DE PRODUZIR UM COMPOSTO <225>-LACTÂMICO DE INTERESSE A presente invenção se relaciona a uma expandase mutante que é uma variante de um polipeptídeo modelo com atividade expandase onde a expandase mutante possui uma atividade expandase aumentada em, pelo menos, 2,5 vezes in vítro para adipil-6-APA em comparação com um polipeptídeo modelo com atividade expandase.
Description
EXPANDASE MUTANTE, POLINUCLEOTIDEO, VETOR OU CASSETE DEEXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUZIR UMAEXPANDASE MUTANTE E MÉTODO DE PRODUZIR UM COMPOSTO β-LACTÂMICO DE INTERESSE
A presente invenção se relaciona a enzimas expandadesmutantes, polinucleotídeos codificando tais enzimas, amicroorganismos transformados com os referidospolinucleotídeos codificando tais enzimas expandasesmutantes e com a utilização de tais enzimas expandasesmutantes ou tais microorganismos na expansão do anel deácido 5-carboxipentanoil-6-aminopenicilânico (adipil-6-ΑΡΑ= ad-6-ΑΡΑ).
Antibióticos beta-lactâmicosconstituem o grupo maisimportante de compostos antibióticos com uma longa históriade utilização clínica. Dentro deste grupo, os proeminentessão as penicilinas e as cefalosporinas. Penicilinas sãonaturalmente produzidas por diversos fungos filamentosostais como Penicillium (por exemplo, P. chrysogenum) .Cefalosporinas são naturalmente produzidas por diversosmicroorganismos tais como Acremonium (por exemplo, A.chrysogenum) e Streptomyces (por exemplo, Streptomycesclavuligerus).
Como um resultado de técnicas clássicas demelhoramento de linhagem, os níveis de produção dosantibióticos em P. chrysogenum e A. chrysogenum melhoraramnotavelmente ao longo das décadas passadas. Com o crescenteconhecimento das vias biossintéticas levando a penicilinase cefalosporinas e o advento da tecnologia do DNArecombinante, novas ferramentas para o melhoramento daslinhagens de produção se tornaram disponíveis.A maioria das enzimas envolvidas na biossíntese de β-lactamas foi identificada e seus genes correspondentesforam clonados, como pode ser encontrado em Ingolia eQueener, Med Res Ver (1989) 9:245-264 (rota de biossíntesee enzimas) e Aharonowitz, Cohen e Martin, Ann Ver Microbiol(1992) 46:461-495 (clonagem gênica).
As primeiras duas etapas na biossíntese de penicilinaem P. chrysogenum são a condensação de três aminoácidosácido L-5-amino-5-carboxipentanóico (ácido L-a-aminoadípico) (A) , L-cisteína (C) e L-valina (V) notripeptídeo LLD-ACV, seguido por ciclagem deste tripeptídeopara formar isopenicilina N. Este composto contém aestrutura β-lactâmica típica.
O terceiro passo envolve a substituição da cadeialateral hidrofílica do ácido L-5-amino-5-carboxipentanóicopela cadeia lateral pela ação da enzima aciltransferase(AT).
Na EP-A-044 818 O foi descrita que a reação desubstituição enzimática mediada por AT é realizada dentrode uma organela celular, o microcorpo. A observação quequantidades substanciais de deacetoxicefalosporina C (DAOC)pode ser formada por transformantes P. chrysogenum não-precursores expressando deacetoxicefalosporina C sintase(EC 1.14.20.1 - DAOCS, daqui em diante indicado comoexpandase) implica na presença de quantidades significantesde penicilina Ν, o substrato natural para expandase, em P.chrysogenum (Alvi et al. , J. Antibiot (1995) 48:338-340).Entretanto, as cadeias laterais D-a-amino-adipil de DAOCnão podem ser facilmente removidas.
Cefalosporinas são muito mais caras do quepenicilinas. Uma razão é que algumas cefalosporinas (porexemplo, cefalexina) são feitas a partir de penicilinas porum número de conversões químicas. Outra razão é que, atéentão, apenas cefalosporinas com uma cadeia lateral D-a-amino-adipil podiam ser fermentadas. Cefalosporinas C,certamente o material inicial mais importante nesserespeito, é muito solúvel em água em qualquer pH, destamaneira implicando em processos de isolamento longos ecustosos utilizando tecnologia de coluna cara e de difícilmanejo. A Cefalosporina C obtida nesta maneira era para serconvertida em cefalosporinas utilizadas terapeuticamentepor um número de conversões químicas e enzimáticas.
Os métodos atualmente preferidos na indústria parapreparar o intermediário ácido 7-amino-deacetoxicefaloporânico (7-ADCA) envolve etapas químicascomplexas levando a expansão e derivação de penicilina G.Uma das etapas químicas necessárias para produzir 7-ADCAenvolve a expansão de estrutura do anel de penicilina com 5membros para uma estrutura de anel de cefalosporina com 6membros (veja, por exemplo, EUA 4,003,894). Esteprocessamento químico complexo é tanto caro e nocivo para oambiente.
Conseqüentemente, há um grande desejo de substituirtais processos químicos com reações enzimáticas tais comocatálise enzimática, preferencialmente durante fermentação.Uma chave para a substituição do processo de expansãoquímica por um processo biológico é a enzima central na viabiossintética da cefalosporina, expandase.
A enzima expandase da bactéria Streptomycesclavuligerus (S. clavuligerus) foi descoberta comorealizando, em alguns casos, expansões do anel depenicilina. Quando introduzida em P. chrysogenum, esta podeconverter a estrutura do anel de penicilina na estrutura doanel de cef alosporina, como descrito em Cantwell et al. ,Proc R Soc Lond B (1992) 248:283-289. A enzima expandasefoi bem caracterizada (EP-A- 0366354) tanto bioquímica efuncionalmente, assim como foi o seu gene correspondente.Tanto mapas físicos do gene cefE (o gene codificando aenzima expandase de S. clavuligerus - EP-A-0341892),seqüência de DNA e estudos de transformação em P.chrysogenum com cefE foram descritos. A seqüência de DNA ede aminoácido da enzima expandase de S. clavuligerus estãorepresentadas na SEQ ID NO 1.
Outra fonte de uma enzima expandase é a bactériaNocardia lactamdurans (N. Iactamdurans, formalmente S.Iactamdurans). Tanto as propriedades bioquímicas da enzimae da seqüência de DNA o gene codificando a enzima foramdescritas - veja Cortes et al. , J Gen Microbiol (1987)133:3165-3174 e Coque et al., Mol Gen Genet (1993) 236:453-458, respectivamente.
Recentemente, novos genes expandase (cefE) e enzimasforam encontrados em Streptomyces jumonjinensis,Streptomyees ambofaeiens e Streptomyees ehartreuses - vejaHsu et al. (2004), Appl. and Environm. Microbiol. 70, 6257-6263. Tabela 1 sumariza as identidades de seqüência deaminoácido de diversas expandases e mostra que asidentidades de seqüência variam de 67 a 85%, dependendo dafonte da enzima.
Tabela 1: Identidades de seqüência de aminoácido dediversas expandases (dados tirados de Hsu et al.).<table>table see original document page 6</column></row><table>
Na biossíntese das cefalosporinas nas célulasprocarióticas, a deacetoxicefalosporina-C ésubseqüentemente convertida a deacetil-cefalosporina-C pelaenzima deacetilcefalosporina C sintase também chamada dedeacetoxicefalosporina-C hidroxilase ou hidrolase (EC1.14.11.26 - DACS). Genes codificando tais hidroxilases sãonomeados genes cefE (por exemplo, veja Hsu et al. ) . Asexpandases encontradas em células eucarióticas, porexemplo, Acremonium chrysogenum podem catalisar a conversãodireta de penicilina N para deacetoxicefalosporina-C devidoà presença de tanto atividade expandase como hidrolase, apartir de agora chamado cefEF (veja Hsu et al.) .
Como definido aqui, o termo expandase se relaciona aenzimas expandases (EC 1.14.20.1, codificadas por genescefE) assim como expandases também processadas em adição aatividade hidrolase (EC 1.14.20.1 + EC 1.14.11.26codificadas por genes cefEF).
Uma vez que a enzima expandase catalisa a expansão doanel tiazolidina de 5 membros da penicilina N ao aneldihidrotiazina de 6 membros do DAOC, esta enzima pode ser,é claro, um candidato local lógico para substituir o anelde expansão dos processos químicos. Infelizmente, a enzimatrabalha no intermediário da penicilina N na viabiossintética da cefalosporina, mas não ou muitoineficientemente nas penicilinas prontamente disponíveisnão caras como as produzidas por P. chrysogenum, comopenicilina V ou penicilina G. A penicilina N não estádisponível comercialmente e mesmo quando expandida, suacadeia lateral D-a-amino-adipil não pode ser facilmenteremovida por acilases de penicilina.
Foi reportado que a enzima expandase é capaz deexpandir penicilinas com cadeias laterais particulares noderivado 7-ADCA correspondente. Esta característica daexpandase foi explorada na tecnologia como divulgada na EP-A-0532341, W095/04148 e W095/04149. Nestas divulgações aconversão química in vitro da penicilina G para 7-ADCA foisubstituída pela conversão in vivo de certos derivadosácido 6-aminopenicilânico (6-ΑΡΑ) em linhagens Penicilliumchrysogenum transformadas com um gene expandase.
Mais particularmente, EP-A-0532341 ensina a utilizaçãoin vivo da enzima expandase em P. chrysogenum, emcombinação com uma cadeia lateral adipil (daqui em diantereferida como adipil) como um estoque de comida, a qual éum substrato para a enzima aciltransf erase em P.chrysogenum. Isto leva a formação de adipil-6-ΑΡΑ, o qualestá convertido por uma enzima expandase introduzida nalinhagem de P. chrysogenum para produzir adipil-7-ADCA.Finalmente, a remoção da cadeia lateral adipil estádescrita, produzindo 7-ADCA Omo um produto final. Alémdisso, EP-A-540210 ensina a produção similar de adipil-7-ADAC e adipil-7-ACA.
Como uma abordagem alternativa, expansão de penicilinaG utilizando P. chrysogenum transformada com cefE foiproposta na EP0828850. Além disso, com o objetivo demelhorar a expansão de penicilina G a utilização do genecefE mutante de S. clavuligerus foi descrita. EUA5,919,680, WO 98/02551, WO 99/33994, WO 01/85951 e EP134 8759 todas divulgam genes cefE mutantes alegadamentecodificando para enzimas possuindo uma atividade expandasemais alta sobre penicilina G.
No entanto, estas expandases mutantes continuam nãofornecendo um processo comercialmente atraente para aprodução de cefalosporinas.
Por conseguinte, há uma necessidade de melhoramentoadicional do processo onde cefalosporinas são preparadas apartir da expansão de adipil-APA. Este processo écaracterizado por uma remoção eficiente do material dacadeia lateral a partir do material do núcleo dacefalosporina. Uma etapa para melhorar ainda mais esteprocesso é melhoramento da atividade de expandase sobreadipil-6-ΑΡΑ.
Em um primeiro aspecto, a invenção fornece umaexpandase mutante que é uma variante de um polipeptídeomodelo com atividade expandase. Preferencialmente, ainvenção fornece uma expandase mutante, onde a expandasemutante possui uma atividade expandase in vitro, pelomenos, 2,5 vezes aumentada para adipil-6-ΑΡΑ em comparaçãocom um polipeptídeo modelo com atividade expandase. Adeterminação da atividade expandase in vitro para adipil-6-APA está descrita em detalhe nos Materiais e Métodos. Maispreferencialmente, na atividade expandase in vitro paraadipil-6-ΑΡΑ da expandase mutante é melhorada em, pelomenos, 3 vezes, mais preferencialmente em, pelo menos, 4vezes, mais preferencialmente em, pelo menos, 5 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 6 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 7 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 8 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 9 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 10 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 11 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 12 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 13 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 14 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 15 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 16 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 17 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 18 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 19 vezes, maispreferencialmente em, pelo menos, 20 vezes. Esta invençãotambém fornece uma expandase mutante a qual estápreferencialmente sendo modificada, pelo menos, em umaposição de aminoácido selecionada a partir do grupoconsistindo das posições 2, 59, 73, 89, 90, 99, 101, 105,113, 155, 170, 177, 209, 213, 217, 244, 249, 251, 277, 278,280, 281, 293, 300, 306, 307 e 311 utilizando a numeraçãoda posição da seqüência de aminoácido da enzima expandasecodificada pelo gene cefE de Strptomyces clavuligerus. Aseqüência do gene cefE de Strptomyces clavuligerus assimcomo a seqüência de aminoácido codificada pelo referidogene cefE estão descritas na SEQ ID NO: 1. Maispreferencialmente, a expandase mutante é modificada, pelomenos, em uma posição de aminoácido selecionada a partir dogrupo consistindo das posições 2, 59, 89, 90, 99, 105, 113,170, 177, 209, 213, 217, 249, 251, 277, 278, 280 e 293.
Mais preferencialmente, a expandase mutante é modificada,pelo menos, em uma posição de aminoácido selecionada apartir do grupo consistindo das posições 2, 89, 90, 99,105, 177, 251, 278, 280 e 293.
Com "expandase alterada ou mutante" no contexto dapresente invenção é significado que qualquer enzimapossuindo atividade expandase, a qual não tenha sido obtidaa partir de uma fonte natural e da qual a seqüência deaminoácido difere a partir da seqüência de aminoácidocompleta da enzima expandase natural.
Mais preferencialmente, a invenção fornece umaexpandase mutante onde a expandase mutante possui umaatividade expandase in vifcro, pelo menos, 2,5 vezesaumentada para adipil-6 - APA em comparação com umpolipeptídeo modelo com atividade expandase, mais preferencialmente, pelo menos, 3 vezes, mais preferencialmente, pelo menos, 4 vezes, mais preferencialmente, pelo menos, 5 vezes, mais preferencialmente, pelo menos, 6 vezes, maispreferencialmente, pelo menos, 7 vezes, mais preferencialmente, pelo menos, 8 vezes, mais preferencialmente, pelo menos, 9 vezes, mais preferencialmente, pelo menos, 10 vezes, mais preferencialmente, pelo menos, 11 vezes, mais preferencialmente, pelo menos, 12 vezes, maispreferencialmente, pelo menos, 13 vezes, maispreferencialmente, pelo menos, 14 vezes, maispreferencialmente, pelo menos, 15 vezes, maispreferencialmente, pelo menos, 16 vezes, maispreferencialmente, pelo menos, 17 vezes, maispreferencialmente, pelo menos, 18 vezes, maispreferencialmente, pelo menos, 19 vezes, maispreferencialmente, pelo menos, 20 vezes e onde a expandasemutante está preferencialmente sendo modificada em, pelomenos uma posição de aminoácido selecionada a partir dogrupo consistindo das posições 2, 59, 73, 89, 90, 99, 101,105, 113, 155, 170, 177, 209, 213, 217, 244, 249, 251, 277,278, 280, 281, 293, 300, 306, 307 e 311 utilizando anumeração da posição da seqüência de aminoácido da enzimaexpandase codificada pelo gene cefE de Strptomycesclavuligerus. Mais preferencialmente, a expandase mutante émodificada, pelo menos, em uma posição de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo das posições 2,59, 89, 90, 99, 105, 113, 170, 177, 209, 213, 217, 249,251, 278, 280 e 293. Mais preferencialmente, a expandasemutante é modificada, pelo menos, em uma posição deaminoácido selecionada a partir do grupo consistindo dasposições 2, 89, 90, 99, 105, 177, 251, 278, 280 e 293.
A atividade da expandase pode ser mensurada sobdiversas condições. A concentração do substrato (porexemplo, adipil-6-ΑΡΑ) no ensaio de atividade determina sea atividade da expandase é mensurada sob condições onde oVmáx determina a atividade (no caso da concentração dosubstrato ser muito mais alta, por exemplo, 5-20 vezes, doque o Km da expandase para o seu substrato) ou sobcondições onde em adiçao o Km é determinante da. atividadeda expandase (o caso da concentração do substrato seraproximadamente igual ao ou (muito) abaixo - por exemplo,<0,05 - 0,02 vezes - do que o Km da expandase para o seusubstrato). O fator melhoramento das expandases mutantespode ser mensurado sob estas várias condições.
A modificação em uma posição de aminoácido podecompreender uma substituição por outro aminoácido,selecionado a partir do grupo consistindo de 20 L-aminoácidos que ocorrem na Natureza - veja Tabela 2.Alternativamente, a modificação da posição do aminoácidopode compreender uma deleção do aminoácido na referidaposição. Além disso, a modificação em uma posição deaminoácido pode compreender uma substituição de um ou maisaminoácidos no lado C-terminal ou N-terminal do referidoaminoácido.
Tabela 2
<table>table see original document page 12</column></row><table><table>table see original document page 13</column></row><table>
O peptídeo modelo com atividade expandase comoutilizado na presente invenção é selecionado a partir dogrupo consistindo de um polipeptideo com atividadeexpandase, preferencialmente possuindo uma seqüência deaminoácido de acordo com a SEQ ID NO: 1 e polipeptídeos comatividade expandase possuindo uma seqüência de aminoácidocom uma porcentagem de identidade com uma porcentagem deidentidade de, pelo menos, 70%, mais preferencialmente,pelo menos, 75%, mais preferencialmente, pelo menos, 80%,mais preferencialmente, pelo menos, 85%, maispreferencialmente, pelo menos, 90%, mais preferencialmente,pelo menos, 95%, tal como as enzimas expandases que estãosumarizadas na Tabela 1.
A presente invenção preferencialmente forneceexpandases mutantes que possuem modificações pelo menos em1 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de 2, 59, 73, 89, 90, 99, 101, 105, 113,155, 170, 177, 209, 213, 217, 244, 249, 251, 277, 278, 280,281, 293, 300 e 311.
1 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de 2, 59, 89, 90, 99, 105, 113, 170, 177,209, 213, 217, 249, 251, 278, 280 e 293.• 1 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de 2, 89, 90, 99, 105, 177, 251, 278, 280e 293.
• 2 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de 2, 89, 277, 281 e 300, maispreferencialmente nas posições 2+281 ou 89+281 ou 277+300.
• 3 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de 2, 89, 281, 293 e 311, maispreferencialmente nas posições 2+89+281 ou 89+281+311 ou89+281+293.
• 4 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de 2, 73, 89, 90, 217, 244, 277, 280,281, 306, 307 e 311, mais preferencialmente nas posições2+277+280+281 ou 2+281+307+311 OU 73+89+281+311 ou89+217+281+311 ou 89+244+281+311 ou 89+281+307+311 OU277+281+306+311 OU 89+281+306+311 OU 90+281+3 06+311.
• 5 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de 2, 73, 89, 90, 155, 213, 249, 278,281, 293, 300, 306, 307 e 311, mais preferencialmente nasposições 2+89+281+306+311 ou 2+155+281+306+311 ou73+89+213+281+311 OU 89+78+218+307+311, 89+281+293+300+311ou 89+249+281+307+311.
• 6 posições de aminoácidos selecionadas do grupoconsistindo de 90+105+113+281+306+311.
• 7 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de 2, 73, 89, 105, 113, 155, 170, 177,251, 277, 280, 281, 293, 300, 306, 307 e 311, maispreferencialmente 73+89+281+293+300+307+311 ou105+113+155+177+281+306+311 ou 155+177+277+280+281+306+311.
• 8 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de 2, 89, 90, 99, 105, 113, 155, 177,277, 281, 307 e 311, mais preferencialmente nas2+90+99+105+113+281+306+311 ou2+90+105+113+155+177+277+281.
• 9 posições de aminoácidos selecionadas do grupoconsistindo de 2+90+105+113+155+177+281+306+311.
• 10 posições de aminoácidos selecionadas do grupoconsistindo de 2, 59, 90, 101, 105, 113, 155, 177, 209,277, 281, 307 e 311 mais preferencialmente nas2+90+105+113+155+177+277+281+3 06+311.
• 11 posições de aminoácidos selecionadas do grupoconsistindo de 2, 90, 105, 113, 155, 177, 277, 281, 293,307, 311.
A invenção, além disso, fornece expandases mutantes comodefinido anteriormente aqui que são variantes da expandasede Streptomyces clavuligerus, a expandase mutante estandomodificada nas posições de aminoácido selecionadas a partirdo grupo consistindo das posições D2, S59, M73, T89, N90,M99, Y101, T105, G113, C155, H170, P177, G209, T213, Y217,H244, R249, L277, E280, C281, T293, G300, R306, R307 e A311onde a letra precedente do número denota o respectivoaminoácido (código de uma letra) e o número subseqüente daposição da seqüência de aminoácido da enzima expandase deStreptomyces clavuligerus a qual está descrita na SEQ IDNO: 1.
Expandases mutantes preferidas que são variantes daexpandase de Streptomyces clavuligerus possuem modificaçõesem, pelo menos,
• 1 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de D2, S59, M73, T89, N90, M99, T105,G113, C155, Η170, Ρ177, G209, Τ213, Υ217, Η244, R249, D251,L277, Α27 8, Ε280, C281, Τ293, G300, R306, R307 e Α311.
• 1 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de D2, S59, T89, N90, M99, T105, G113,H170, P177, G209, T213, Y217, R249, D251, A278, E280 eT293.
• 1 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de D2, T89, N90, M99, T105, P177, D251,A27 8, E280 e T293.
2 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de D2, T89, L277, C281 e G300.
• 3 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de D2, T89, C281, T293 e Ali.
• 4 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de D2, M73, T89, N90, Y217, H244, L277,E280, C281, R306, R307 e A311.
• 5 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de D2, M73, T89, N90, C155, T213, R249,A27 8, C281, T293, R306, R307 e A311.
6 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de N90+T105+G113+C281+R306+A311.
• 7 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de D2, M73, T89, T105, G113, C155, H170,P177, D251, L277, E280, C281, T293, G300, R306, R307 eA311.
• 8 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de D2, T89, N90, M99, T105, G113, C155,P177, L277, C281, R306, R307 e A311.
• 9 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo deD2+N90+T105+G113+C155+P177+C281+R306+A311.
• 10 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de D2, S59, N90, T105, G113, T105, G113,C155, P177, G2 09, L277, C281, R306, R307, A311.
· 11 ou mais posições de aminoácidos selecionadas dogrupo consistindo de D2, N90, T105, G113, C155, P177, L277,C2 81, R3 06, R307 e A311.
Modificações preferidas nas respectivas posições naexpandase de Streptomyces clavuligerus são as seguintes(utilizando o código de uma letra para aminoácidos)
• D na posição 2 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por aminoácidos hidrofílicos Υ, Ν, H, D, Q, E,K, R, S, ou T, preferencialmente por Y7 N, Q, ou H. Maispreferidas são as substituições D2Y, D2N e D2H.
· M na posição 7 3 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por A, V, I, L, N, Q, Η, K ou R,preferencialmente por N, Q, H, L ou I. Mais preferidas sãoas substituições M73H e M73I.
• T na posição 8 9 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por K, R, A, C, Ρ, V, I, L ou M,preferencialmente por A, V, I, L, R ou K. Maispreferencialmente A V ou K. Mais preferida é a substituiçãoT89K.
• N na posição 90 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por H, R, Κ, N, Q, W, S, C, T ou Y,preferencialmente por K, R, N, S, W. Mais preferidas são assubstituições N90W e N90S.
• M na posição 99 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por A, R, K, Q, Ε, N, D, S ou T,preferencialmente por K, Q, E ou T. Mais preferida é asubstituição M99T.
• T na posição 105 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por A, V, I, L, R, Κ, H, Q ou N,preferencialmente por V, I, L, R ou K. Mais preferidas sãoas substituições T105I e T105K.
• G na posição 113 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por A, P, Q, K, R, E, D ou N, maispreferencialmente por A, D, E, Q, K ou R. Mais preferida éa substituição G113D.
C na posição 155 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por A, N, S, Τ, V, W, mais preferencialmentepor A, S, Τ, V ou W. Mais preferida é a substituição C155W.
• P na posição 177 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por Κ, E, L, A, V, Τ, I, mais preferencialmentepor L, A, V, Τ, I. Mais preferidas são as substituiçõesP177L e P177I.
• T na posição 213 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por Q, G, A, V, I, R, S, mais preferencialmentepor G, A, V, I, S. Mais preferida é a substituição T213A.
Y na posição 217 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por A, V, Η, Ρ, Τ, N ou Q, maispreferencialmente por A, Ρ, N, Q ou H. Mais preferida é asubstituição Y217H.
• H na posição 244 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por N, Q, K ou R, mais preferencialmente K ouR Mais preferida é a substituição H244R.
• R na posição 24 9 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por G, S, Τ, N, D, Q, Ε, K, R H ou C, maispreferencialmente G, S, D, N ou C. Mais preferida é asubstituição R249C.• D na posição 251 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por G.
• L na posição 277 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por E, A, Q, K, R, H ou T, maispreferencialmente Q, Ε, K, R, Η, T. Mais preferidas são assubstituições L277Q, L277T e L277K.
• E na posição 28 0 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por G, A, Q, K, R ou H, mais preferencialmenteG, Q ou R. Mais preferida é a substituição E280G.
· C na posição 281 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por Y, S, L, W, A, S, T ou H, maispreferencialmente A, S, Tf W, H ou Y. Mais preferida é asubstituição C281Y.
• T na posição 293 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por S, D, Ν, K ou R, mais preferencialmente S,K ou R. Mais preferida é a substituição T293K.
• G na posição 300 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por A, S, Τ, N, D, Q, Ε, K, R, H ou L, maispreferencialmente A, S, Τ, K, R, H ou L. Mais preferidassão as substituições G300S, G300K e G300L.
• R na posição 306 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por H ou uma deleção.
• R na posição 3 07 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por Τ, K,A, S, V, G, D, N, Q, E, R1 Η, I ou umadeleção, mais preferencialmente S, Τ, K, R, Η, I ou umadeleção. Mais preferidas são as substituições R307T, R307Ie R307deleção.
• A na posição 311 de acordo com a SEQ ID NO 1substituído por D.
Expandases altamente preferidas são as expandasesmutantes que estão sumarizadas nas Tabelas 3 e 4 .preferencialmente, as expandases mutantes fornecidas pelapresente invenção possuem uma melhora na atividadeexpandase de, pelo menos, 2,5 vezes em adipil-6-ΑΡΑ comodefinido antes. Alternativamente, as expandases mutantesfornecidas pela presente invenção possuem uma melhora naatividade expandase em Pen-G de, pelo menos, 1,5 vezes emcomparação com um polipeptídeo modelo com atividadeexpandase, mais preferencialmente de, pelo menos, 3 vezes,mais preferencialmente de, pelo menos, 4 vezes, maispreferencialmente de, pelo menos, 5 vezes, maispreferencialmente de, pelo menos, 6 vezes, maispreferencialmente de, pelo menos, 7 vezes, maispreferencialmente de, pelo menos, 8 vezes. Expandasesmutantes com uma atividade melhorada em Pen-G podem serutilizadas vantajosamente em um processo para a produção defenilacetil-7-ADCA como descrito mais abaixo.Preferencialmente, as expandases mutantes fornecidas pelapresente invenção possuem uma expandase melhorada em ambosadipil-6-ΑΡΑ assim como Pen-G como definido anteriormenteaqui.
A presente invenção também fornece expandases mutantescom uma atividade expandase diminuída ou mesmo ausente comiso-penicilina N (iPN). Preferencialmente a atividadeexpandase com tanto adipil-6-ΑΡΑ ou Pen-G não é afetada,mas mais preferencialmente a atividade expandase com tantoadipil-6-ΑΡΑ ou Pen-G ou ambas é melhorada como definidoanteriormente aqui. A vantagem destas expandases mutantesmais preferidas é que a diminuição ou mesmo ausência daatividade expandase com iso-penicilina N (iPN) resulta emmenos subprodutos em um processo de fermentação produzindoadipil-7-ADCA ou fenilacetil-7-ADCA.
Expandases mutantes preferidas possuem uma atividadeexpandase diminuída ou mesmo ausente com iso-penicilina N(iPN) como um substrato opcionalmente combinado com umaatividade expandase melhorada em ad-6-ΑΡΑ como um substratoe foi modificado na posição 89 de acordo com a numeração deaminoácido da SEQ ID No 1 onde o aminoácido de ocorrêncianatural foi substituído, preferencialmente por umaminoácido positivamente carregado tal como lisina,arginina ou histidina; mais preferencialmente sendo lisina.
Uma expandase mutante altamente preferida éselecionada a partir de um grupo consistindo de H401, H402,H4 03, H501, H502, H503, H504, H505, H506, H507, H508, H601,H602, H603, H604, H605, H606, H607, H608, H609, H650, H651,H652, H653, H654, H655, H656, H657, H658, H659, H660, H661,H662, G601, G602, G603, G604, G605, G606, G607, G608, G609,G610, G611, G613, G614, H701, H702, H703, H704, H705, H706(veja Tabelas 3 e 4).
Em um segundo aspecto, a invenção fornece umpolinucleotídeo codificando a expandase mutante da presenteinvenção. 0 polipeptídeo codificando a expandase mutante deacordo com a presente invenção pode ser qualquerpolinucleotídeo que codifique a própria seqüência deaminoácido de acordo com a invenção. Alternativamente, opolinucleotídeo da invenção pode compreender uma seqüênciacodificante na qual a utilização do códon para diversosaminoácidos desvia da utilização do códon em S.clavuligerus. Por exemplo, a utilização do códon pode seradaptada para a utilização do códon de uma célulahospedeira particular, a qual será ou foi transformada como fragmento de DNA codificando a expandase alterada.
Em um terceiro aspecto, a invenção fornece um vetor deexpressão ou cassete de expressão compreendendo opolinucleotideo da invenção como definido anteriormenteaqui.
Em um- quarto aspecto, a invenção fornece uma célulahospedeira transformada, transformada com o polinucleotideoda invenção ou o cassete de expressão da invenção. A célulahospedeira transformada pode ser utilizada para a produçãoda expandase mutante da invenção ou a célula hospedeirapode ser utilizada para a produção de um composto beta-lactâmico de interesse.
Células hospedeiras para a produção de expandasemutante da invenção são preferencialmente célulashospedeiras as quais são conhecidas na arte para produçãoeficiente de sua proteína ou enzima, tanto extracelular ouintracelularmente, por exemplo, microorganismos tais comofungo, levedura e bactéria. Exemplos de células hospedeiraspreferidas compreendem, mas não se limitam a, os seguintesgêneros: Aspergillus (por exemplo, A. niger, A. oryzea) ,Penicillium (por exemplo, P. emersonii, P. ehrysogenum) ,Saccaromyces (por exemplo, S. cerevisiae), Kluyveromyces(por exemplo, K. laetis), Baeillus (por exemplo, B.subtilis, B. Iieheniformis, B. amyloliquefaeiens).Eseheriehia (E. eoli), Streptomyees (por exemplo, S.elavuligerus).
Células hospedeiras para produção de um composto beta-lactâmico de interesse são preferencialmente célulashospedeiras que são conhecidas na arte para produçãoeficiente de seu composto beta-lactâmico. Exemplos decélulas hospedeiras preferidas compreendem, mas não selimitam a, aos seguintes gêneros: Penicillium (por exemplo,P. ehrysogenum) , Acremonium (por exemplo, A. chrysogenum) ,Streptomyces (por exemplo, S. elavuligerus) , Nocardia (porexemplo, N. lactamdurans) , Lysobacter (por exemplo, L.Iactamgenus) e espécies Flavobaeterium.
Em um quinto aspecto, a invenção fornece um processopara a produção da expandase mutante da invençãocompreendendo cultivo de célula hospedeira transformada deacordo com a invenção sob condições que contribuem para aprodução da expandase mutante e, opcionalmente, recuperandoa expandase mutante. A expandase mutante recuperada podeser utilizada vantajosamente em um processo in vitro paraproduzir uma cefalosporina desejada a partir de umapenicilina correspondente, por exemplo, a expandase mutanterecuperada pode ser utilizada em um processo para produzirfenilacetil-7-ADCA a partir de Pen-G ou adipil-7-ADCA apartir de adipil-6-ΑΡΑ.
Em um sexto aspecto, a invenção fornece um processopara a produção de um composto beta-lactâmico de interessecompreendendo cultivo da célula hospedeira transformada deacordo com a invenção compreendendo cultivo de célulahospedeira transformada de acordo com a invenção sobcondições que contribuem para a produção do composto beta-lactâmico de interesse e, opcionalmente, recuperando ocomposto beta-lactâmico. Compostos beta-lactam preferidospertencem ao grupo de cefalosporinas tais como fenilacetil-7-ADCA, adipil-7-ADCA, adipil-7-ADAC e adipil-7-ACA. Em umamodalidade preferida, a invenção fornece um processo para aprodução de fenilacetil-7-ADCA ou adipil-7-ADCA por cultivode uma linhagem de Penicillium chrysogenum selecionada, quefoi transformada com uma seqüência polinucleotidica dainvenção que codifica uma expandase mutante da invenção.
Uma expandase mutante altamente preferida é selecionada apartir do grupo consistindo de H401, H402, H403, H501,H502, H503, H504, H505, H506, H507, H508, H601, H602, H603,H604, H605, H606, H607, H608, H609, H650, H651, H652, H653,H654, H655, H656, H657, H658, H659, H660, H661, H662, G601,G602, G603, G604, G605, G606, G607, G608, G609, G610, G611,G613, G614, H701, H702, H703, H704, H705, H706 (vejaTabelas 3 e 4) . Para a produção de fenilacetil-7-ADCA, umaexpandase mutante é selecionada que possua um alto fator demelhora em Pen-G como um substrato. Para a produção deadipil-7-ADCA, uma expandase mutante é selecionada quepossua um fator de melhora em ad-6-ΑΡΑ como um substrato.
Em outra modalidade preferida, a invenção fornece umprocesso para a produção de 7-ADCA compreendendo o processopara a produção de fenilacetil-7-ADCA ou adipil-7-ADCA comodescrito aqui antes, seguida de, após purificação adicionaldos referidos derivados de 7-ADCA, uma etapa do processo naqual no qual a cadeia lateral fenilacetil ou adipil defenilacetil-7-ADCA e adipil-7-ADCA respectivamente éretirada por clivagem então gerando 7-ADCA e o ácidoliberado das cadeias laterais. A referida clivagem pode serobtida por meios químicos ou, mais preferencialmente,enzimaticamente utilizando uma enzima acilase. Acilasesapropriadas para a clivagem da cadeia lateral adipil sãoobteníveis a partir de diversas espécies de Pseudomonastais como Pseudomonas SY-77 ou Pseudomonas SE-83. Acilasesapropriadas para a clivagem das cadeias lateraisfenilacetil são as acilases penicilinas a partir daEscherichia coli ou Alcaligenes feacalis.
Em um sétimo aspecto, a invenção fornece para aprodução de uma cefalosporina a partir da penicilinacorrespondente onde a expansão do anel tiazolidina de 5membros da penicilina para o anel dihidrotiazina de 6membros da cefalosporina ocorre em um processo in vitro,catalisado por uma expandase mutante da invenção. Em umprocesso preferido, adipil-6-ΑΡΑ é expandido a adipil-7-ADCA correspondente por uma mutante expandase da invenção,preferencialmente uma expandase mutante que possui um fatorde melhora alto adipil-6-ΑΡΑ como um substrato. Em outroprocesso preferido, Pen-G é expandido a fenilacetil-7-ADCAcorrespondente por uma expandase mutante da invenção,preferencialmente uma expandase mutante que possui um fatorde melhora alto adipil-6-ΑΡΑ como um substrato. O processopode ser seguido por, após purificação opcional dosreferidos derivados 7-ADCA, uma etapa do processo na qualas cadeias laterais de adipil-7-ADCA e fenilacetil-7-ADCAsão retiradas por clivagem gerando 7-ADCA e os ácidos dascadeias laterais liberados - vide supra. O produto finaldesejado 7-ADCA pode ser recuperado de acordo com métodosconhecidos na arte envolvendo clivagem química ouenzimática da cadeia lateral de adipil-7-ADCA oufenilacetil-7-ADCA e opcionalmente o 7-ADCA resultante podeser posteriormente purificado e/ou cristalizado.
Em um oitavo aspecto, a invenção fornece um métodopara obter as expandases mutantes da invenção onde oprocesso compreende as seguintes etapas:1. Mutagênese de um gene clonado codificando umpolipeptídeo modelo com atividade expandase então obtendouma coleção de genes mutagenizados codificando asexpandases mutantes;
2. Expressão da coleção de genes mutagenizadoscodificando as expandases mutantes em um hospedeiroapropriado e varredura da coleção de expandases mutantespara uma atividade melhorada com um substrato apropriado;
3. Opcionalmente repetindo as etapas 1 e 2 vezes oudiversas vezes utilizando tanto o gene codificando opolipeptídeo modelo com atividade expandase ou um ou maisdos genes mutagenizados codificando expandases mutantes comuma atividade expandase no substrato apropriado.
Clonagem dos genes codificando um polipeptídeo modelocom atividade expandase pode ser realizada de acordo commétodos conhecidos na arte.
Polipeptídeos modelo preferidos com atividadeexpandase são selecionados a partir do grupo consistindo deum polipeptídeo com atividade expandase obtenível a partirde Streptomyces clavuligerus, preferencialmente possuindouma seqüência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: Iepolipeptídeos com atividade expandase possuindo umaseqüência de aminoácidos com uma porcentagem de identidadecom SEQ ID NO: 1 de, pelo menos, 70%, preferencialmente,pelo menos, 75%, mais preferencialmente, pelo menos, 80%,mais preferencialmente, pelo menos, 85%, maispreferencialmente, pelo menos, 90%, mais preferencialmente,pelo menos, 95%, tal como as enzimas expandase que estãosumarizadas na Tabela 1.
Quaisquer técnicas de mutagênese podem ser aplicadas squais resultam em mutações sobre o gene completo. Técnicasapropriadas são PCR (Reação em Cadeia da Polimerase)susceptível à erro (EP) e/ou pela utilização de PCR dePrimer de Mutação saturada (sMPP) exatamente de acordo comWOO3/010183.
Materiais e Métodos
1. Geral
• Oligonucleotídeos foram sintetizados pela Invitrogen(Carlsbad CA, EUA).
· Seqüenciamento de DNA foi realizado pela SEQLAB(Gõttingen, Alemanha) ou pela Baseclear (Leiden, Holanda).
• Enzimas de restrição foram compradas da Invitrogen.
• Os ensaios de proteína foram realizados de acordo com ométodo descrito por Bradford, Μ. M. (1976) Anal. Biochem.72:284-54.
• Células competentes eletromax Escherichia coli DHlOBforam obtidas da Invitrogen. 0 protocolo foi entregue pelofabricante.
• Eletroforese SDS-PAGE foi realizada no sistema fornecidopela Invitrogen. Géis NuPAGE Novex Bis-Tris (Invitrogen).
Protocolo SimplyBlue SafeStain Microwave.
• Para criar um vetor de expressão CefE, o marcadorseletivo ampicilina em pBAD/Myc-His (comercialmentedisponível a partir da Invitrogen™) é substituído pelomarcador seletivo zeozina. Adicionalmente, a proteínaligante de maltose está fusionada ao gene da expandase tiposelvagem de S. clavuligerus e ligado atrás do promotor pBADresultando no vetor pBAD-MH-Zeo-MBP-ScEwt. O CefE do tiposelvagem é trocado pela biblioteca de mutantes susceptíveisà erros.2. Varredura primária em placas de microtitulação (MTP)Crescimento e Indução
A biblioteca de expandase de E. coli está plaqueada emplacas com meio Luria-Bertani (LB) com Agar com baixaconcentração de sal + 25 pg/mL de Zeocina e incubadadurante a noite a 37°C. Placas de titulação (MTP) com 150pL de meio LB com baixa concentração de sal e 25 pg/mL deZeocina são inoculadas a partir das placas e incubadas por36 hrs a 250C e 550 rpm.
A partir do MTP, 5 pL são inoculados em placa de poçosprofundos com 1 mL de meio 2*TY (triptona e extrato delevedura) + 50 pg/mL de Zeocina + arabinose. À culturaremanescente no MTP, 100 pL de glicerol 50% são adicionadose congelados a -800C como estoque glicerol.
A placa de poços profundos é incubada por 3 0 hrs a250C e 550 rpm. As culturas das placas de poços profundossão centrifugadas a 2750 rpm (Heraeus multifuge 4 kr.) por10 min. o sobrenadante é descartado e o precipitado écongelado a -20°C.
Extrato livre de célula (CFE)
Os precipitados congelados obtidos na secção anteriorsão ressuspensos em 200 pL de tampão de extração (50 mMTris/HCl pH= 7,5; 5 mM DTT; 0,1 mg/mL DNAse; 5 mM MgSO4H2)e 0,5 mg/mL de lisozima). Para ressuspender precipitados,as placas são agitadas. As placas são incubadas por 30minutos à temperatura ambiente e centrifugadas por 10minutos a 2750 rpm.
3. Varredura secundária em frascos de agitaçãoCrescimento e Indução
Colônias selecionadas são inoculadas a partir da placaem 10 mL de LB baixo sal + Zeocina 25 pg/mL e incubadasdurante a noite a 37 °C, 280 rpm. A cultura crescida éinoculada em 100 mL de LB baixo sal com 25 pg/mL de Zeocinaa uma densidade ótica de (600 nm) entre 0,010 e 0,050(Biochrom Ultraspec 2000). Após crescimento a 37°C, 280rpm, as células são recuperadas a uma densidade ótica a 600nm entre 0,4-0,6. Após isso, arabinose é adicionada(concentração final de 0,2%) e induzidas durante a noite a27 °C a 220 rpm. As culturas são centrifugadas, osobrenadante é descartado e o precipitado é congelado a - 20°C.
Clonagem dos vetores de expressão E. coli
O produto de fusão é ligado no vetor pBAD/MH MBP-ScEwtzeo-zeo por uma digestão EcoRI/SalI. Isto substitui o geneselvagem da expandase pelos genes da biblioteca. Paraprevenir números significativos de construções selvagens,as construções ligadas foram digeridas com SmaI.Construção das bibliotecas
Transformação de E. coli com a mistura da ligaçãoproduziu bibliotecas de aproximadamente 12.000-13.000colônias. Para testar a qualidade das bibliotecas, umconjunto aleatório de colônias foi selecionado e asconstruções foram digeridas com enzimas de restrição. Istomostrou que aproximadamente 28% da biblioteca revelou umpadrão aberrante. Depois, análises de seqüência foramrealizadas em 10 clones regulares para determinarfreqüências de mutação. Seqüências mostraram que tantosaturação e mutações de susceptibilidade ao erro estavampresentes em um nível satisfatório.
4 Ensaio da ExpandaseUm total de 3 00 pL de uma mistura de reaçãoconsistindo de 50 mM de Tris/HCl pH 7,5; 1 mM de DTT; 2,7mM de Ascorbato; 0,05 mM de ATP; 24 mM de a-cetoglutarato;0,06 mM de FeSO4.7H20; 4 mM de ácido adipil-6-amino-penicialiânico (ad-6-ADCA) foram adicionados a 75 μ L deCFE e incubados a 290C pelo tempo desejado. Adicionando 6 0μ L de ácido malêico com 10 g/L de EDTA parou a reação. Aformação de ácido adipil-7-amino-desacetoxi-cefalosporínico(ad-7-ADCA) foi detectada utilizando 1H-NMR. Sob estascondições, a atividade expandase é medida próxima dascondições Vmáx desde que o Km da enzima de S. clavuligeruspara ad-6-ΑΡΑ seja ca 0,4 mM. Alternativamente, o ensaiopode ser realizado utilizando 0,4 mM de ad-6-ΑΡΑ (~KM daenzima de S. clavuligerus para ad-6-ΑΡΑ).
A adipi 1 -6-APA foi obtida a partir de 6-APA e ácidoadípico catalisado pela glutaril acilase (EC 3.5.1.11).
Alternativamente, adipil-6-ΑΡΑ pode ser obtida pelo cultivode, por exemplo, uma linhagem apropriada de Penicilliumchrysogenum na presença de ácido adípico como precursor.
EXEMPLOS
Exemplo 1
Ia geração de expandases melhoradas (séries H400).
A primeira geração de biblioteca de expandase foiconstruída pela realização de PCR (Reação em Cadeia daPolimerase) de susceptibilidade de erro (EP) no gene CefEde Streptomyces clavuligerus (SEQ ID No. 1). Após varreduradesta biblioteca por conversão melhorada de ad-6-ΑΡΑ em ad-7-APA, 3 genes mutantes diferentes foram selecionados. Osmutantes exibiam uma atividade de expansão ad-6-ΑΡΑmelhorada maior do que 2,5 vezes (H4 01, H4 02, H4 03: vejaTabela 3).
Exemplo 2
2 a geração de expandases melhoradas (séries H500).
A segunda geração de biblioteca de expandase foiconstruída pela utilização de PCR de Primer de Mutaçãosaturada (sMPP) exatamente de acordo com a WO 03/010183. Osgenes mutantes selecionados a partir da primeira geração(H401, H402 e H403) foram utilizados como moldes para aconstrução da biblioteca de 2a geração.
0 sMPP foi realizado pela utilização da Taqpolimerase, então introduzindo mutações adicionais(aleatórias) e aumentando a variação na biblioteca. Primersdesenhados anelaram nas posições de mutação e foramsaturados nas mutações encontradas nos sítios da expandase
de Ia geração. Adicionalmente, um oligonucleotídeo àmontante e à jusante universal foi desenhado no qual umsítio NdeI e NsiI foram introduzidos respectivamente. Istofacilita a clonagem no vetor de expressão Penicillium parateste das expandases mutantes in vivo.
A biblioteca foi crescida e expressão da expandase foiinduzida como descrito na secção de material e métodos. Aformação de ad-7-ADCA foi determinada utilizando NMR comodescrito na secção de material e métodos.
Aproximadamente 150 expandases mutantes melhoradasforam selecionadas e retestadas para sua atividadeexpandase ad-6-ΑΡΑ. Baseado nos resultados deste reteste,17 mutantes foram selecionados para testes finais nosfrascos de agitação.
No total, 15 dos 17 pontos selecionados mostraram umaatividade expandase significativamente melhorada com ad-6-APA como um substrato. Para excluir a seleção de falsospositivos de mutantes de expressão, níveis de proteínaforam quantificados em SDS-PAGE. Isto confirmou que aatividade melhorada não foi devido à expressão mais forteda expandase em E. coli, mas que a melhora pode seratribuída a uma atividade específica melhorada da expandasemutante.
No total, 8 expandases mutantes foram identificadas asquais exibiam um fator de melhora em sua expandase ad-6-ΑΡΑacima de 4,5 vezes (comparadas com a expandase selvagem deS. clavuligerus - SEQ ID NO 1.). estes mutantes foramdesignados H501 - H508 (veja Tabela 3).
Exemplo 3
3a geração de expandases melhoradas (séries H600).
Os 8 mutantes obtidos na 2a geração Exemplo 2 (H5 01 -H508) foram utilizados como moldes para a construção dabiblioteca de expandase de 3a geração. Esta biblioteca foiconstruída da mesma maneira que a biblioteca de expandasede 2a geração. Adicionalmente, a seqüência sinal SKA no C-terminal das expandases foi modificada para SKD, causando aexpressão de expandase somente no citoplasma quandoexpressa em Penicillium.
A varredura desta biblioteca produziu 22 genesexpandase mutantes diferentes que estavamsignificativamente melhorados entre 5 vezes e 11 vezescomparados a expandase de S. clavuligerus (Tabela 3, sériesH600).
Varredura da mesma biblioteca por uma segunda vezutilizando Pen-G a 7 mM como um substrato produziu 13expandases mutantes adicionais (G601-G611 e G613-G614; vejaTabela 3).
Exemplo 4
4 a geração de expandases melhoradas (séries H700) .
Dez mutantes obtidos na 3a geração Exemplo 3 (G606,G612, H602, H606, H650, H651, H653, H655, H658, H661) foramutilizados como moldes para a construção da biblioteca deexpandase de 4a geração. Esta biblioteca foi construída damesma maneira que a biblioteca de expandase de 3a geração.
A varredura desta biblioteca produziu 6 genes deexpandase mutantes diferentes que estavamsignificativamente melhorados (mais de 20 vezes) quandotestados para sua atividade expandase em ad-6-ΑΡΑ aconcentração de 0,4 mM (Tabela 4, H701-H706).
Exemplo 5
Atividade das expandases mutantes melhoradas com iso-penicilina N (iPN) e Penicilina-G (Pen-G) como umsubstrato.
A atividade de diversas expandases mutantes foi medidautilizando iPN e Pen-G como um substrato. O ensaio com iPNcomo um substrato foi realizado como descrito na seçãomateriais e métodos exceto que ad-6-ΑΡΑ foi substituídapela mesma concentração de iPN (4 mM) . O ensaio com Pen-Gcomo um substrato foi realizado como descrito na seçãomaterial e métodos exceto que ad-6-ΑΡΑ foi substituído por7 mM de Pen-G. tabela 3 sumariza as atividades dos diversosmutantes expandase para iPN e Pen-G.
Enquanto a maioria das expandases mutantes testadasexibiram uma melhora de 5 vezes de sua atividade expandasecom iPN, mutantes que carregam a mutação T89K perdemvirtualmente toda atividade contra iPN.A atividade contra Pen-G de diversas expandasesmutantes testadas foi tanto a mesma da expandase selvagem(fator de melhoramento é 1) ou melhoramento acima de 8vezes. 0 dado também mostra que não há correlação entre osfatores de melhora para um mutante único com ad-6-ΑΡΑ ePen-G como um substrato. A taxa entre os fatores de melhorarespectivos para ad-6-ΑΡΑ e Pen-G variam desde 0,1 (porexemplo, H654) até 1,2 (por exemplo, H503).
Tabela 3. Expandases mutantes e suas atividades expandasecontra ad-6-ΑΡΑ, Pen-G e iPN. Cada mutante estáidentificado pelo seu código; as mutações foramintroduzidas na expandase modelo de S. clavuligerus (SEQ IDNO 1) . A atividade expandase está expressa como fator demelhora comparado com a expandase modelo de S. clavuligerus(atividade expandase = 1 por definição) de acordo comensaios de expandase in vitro descritos nos Materiais eMétodos e Exemplo 4.
<table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table>
Tabela 3 mostra que 46 expandases mutantes foram obtidas asquais possuem fatores de melhora na faixa de 1,5 a 10,6vezes.
Tabela 4
<table>table see original document page 37</column></row><table>LISTAGEM DE SEQUENCIA
<110> DSM IP Assets B.V.
<120> EXPANDASES MUTANTES
<130> 24867WO
<160> 1
<170> PatentIn na versão 3.1
<210> 1
<211> 936
15 <212 > DNA
<213> Streptomyces clavuligerus
<220>
20 <221> exon
<222> (1) . . (933)<223 >
<4 0 0 > 1
25 atg gac acg acg gtg ccc acc ttc age ctg gcc gaa ctc cag cag ggc 48
Met Asp Thr Thr Val Pro Thr Phe Ser Leu Ala Glu Leu Gln Gln Gly15 10 15
ctg cac cag gac gag ttc cgc agg tgt ctg agg gac aag ggc ctc ttc 96
3 0 Leu His Gln Asp Glu Phe Arg Arg Cys Leu Arg Asp Lys Gly Leu Phe20 25 30
tat ctg acg gac tgc ggt ctg acc gac acc gag ctg aag tcg gcc aag 144
Tyr Leu Thr Asp Cys Gly Leu Thr Asp Thr Glu Leu Lys Ser Ala Lys35 35 40 45
gac ate gtc ate gac ttc ttc gag cac ggc age gag gcg gag aag cgc 192
Asp Ile Val Ile Asp Phe Phe Glu His Gly Ser Glu Ala Glu Lys Arg50 55 60
40
gcc gtc acc tcg ccc gtc ccc acc atg cgc cgc ggc ttc acc ggg ctg 240
Ala Val Thr Ser Pro Val Pro Thr Met Arg Arg Gly Phe Thr Gly Leu65 70 75 80
45 gag tcg gag age acc gcc cag ate acc aat acc ggc age tac tcc gac 288
Glu Ser Glu Ser Thr Ala Gln Ile Thr Asn Thr Gly Ser Tyr Ser Asp85 90 95
tac tcg atg tgc tac tcg atg ggc acc gcg gac aac ctc ttc ccg tcc 336
50 Tyr Ser Met Cys Tyr Ser Met Gly Thr Ala Asp Asn Leu Phe Pro Ser100 105 110
ggt gac ttc gag cgg ate tgg acc cag tac ttc gac cgc cag tac acc 3 84
Gly Asp Phe Glu Arg Ile Trp Thr Gln Tyr Phe Asp Arg Gln Tyr Thr55 115 120 125
gcc tcc cgc gcg gtc gcc cgg gag gtc ctg cgg gcg acc ggg acc gag 432
Ala Ser Arg Ala Val Ala Arg Glu Val Leu Arg Ala Thr Gly Thr Glu130 135 140
60
ccc gac ggc ggg gtc gag gcc ttc ctc gac tgc gag ccg ctg ctg cgg 480Pro Asp Gly Gly Val Glu Ala Phe Leu Asp Cys Glu Pro Leu Leu Arg145 150 155 160
ttc cgc tac ttc ccg cag gtc ccc gag cac cgc age gcc gag gag cag 528
Phe Arg Tyr Phe Pro Gln Val Pro Glu His Arg Ser Ala Glu Glu Gln
165 170 175
ccc ctg cgg atg gcg ccg cac tac gac ctg tcg atg gtc acc ctc ate 576
Pro Leu Arg Met Ala Pro His Tyr Asp Leu Ser Met Val Thr Leu Ile180 185 190
cag cag aca ccc tgc gcc aac ggc ttc gtc age ctc cag gcc gag gtc 624
Gln Gln Thr Pro Cys Ala Asn Gly Phe Val Ser Leu Gln Ala Glu Val
195 200 205
ggc ggc gcg ttc acg gac ctg ccc tac cgt ccg gac gcc gtc ctc gtc 672
Gly Gly Ala Phe Thr Asp Leu Pro Tyr Arg Pro Asp Ala Val Leu Val210 215 220
ttc tgc ggc gcc ate gcg acc ctg gtg acc ggc ggc cag gtc aag gcc 720
Phe Cys Gly Ala Ile Ala Thr Leu Val Thr Gly Gly Gln Val Lys Ala225 230 235 240
ccc cgg cac cat gtc gcg gcc ccc cgc agg gac cag ata gcg ggc age 768
Pro Arg His His Val Ala Ala Pro Arg Arg Asp Gln Ile Ala Gly Ser
245 250 255
age cgc acc tcc agt gtg ttc ttc ctc cgt ccc aac gcg gac ttc acc 816
Ser Arg Thr Ser Ser Val Phe Phe Leu Arg Pro Asn Ala Asp Phe Thr260 265 270
ttc tcc gtc ccg ctg gcg cgc gag tgc ggc ttc gat gtc age ctg gac 864
Phe Ser Val Pro Leu Ala Arg Glu Cys Gly Phe Asp Val Ser Leu Asp275 280 285
ggc gag acc gcc acg ttc cag gat tgg ate ggg ggc aac tac gtg aac 912
Gly Glu Thr Ala Thr Phe Gln Asp Trp Ile Gly Gly Asn Tyr Val Asn290 295 300
ate cgc cgc aca tcc aag gea tga 936
Ile Arg Arg Thr Ser Lys Ala305 310
Claims (23)
1. Expandase mutante caracterizada pelo fato de ser umavariante de um polipeptideo modelo com atividade expandaseonde a expandase mutante possui uma atividade expandase invitro melhorada, pelo menos, 2,5 vezes contra adipil-6-ΑΡΑem comparação com um polipeptideo modelo com atividadeexpandase.
2. Expandase mutante caracterizada pelo fato de ser umavariante de um polipeptideo modelo com atividade expandaseonde a expandase mutante foi modificada em, pelo menos, umaposição de aminoácido selecionada a partir do grupoconsistindo das posições 2, 59, 73, 89, 90, 99, 101, 105,-113, 155, 170, 177, 209, 213, 217, 244, 249, 251, 277, 278,-280, 281, 293, 300, 306, 307 e 311 utilizando a numeraçãoda posição da seqüência de aminoácido da enzima expandasecodificada pelo gene cefE de Streptomyces clavuligerus (SEQID NO: 1).
3. Expandase mutante, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada pelo fato da expandase mutante ter sidomodificada em, pelo menos, uma posição de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo das posições 2,-59, 89, 90, 99, 105, 113, 170, 177, 209, 213, 217, 249,-251, 278, 280 e 293, mais preferencialmente a partir dogrupo consistindo das posições 2, 89, 90, 99, 105, 177,-251, 278, 280 e 293.
4. Expandase mutante, de acordo com a reivindicação 3,caracterizada pelo fato de ter sido modificada em, pelomenos, uma posição de aminoácido selecionada a partir dogrupo como definido na reivindicação 2 ou a qual foimodificada em uma posição de aminoácido selecionada apartir de qualquer um dos grupos como definidos nareivindicação 3.
5. Expandase mutante, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizada pelo fato decompreender, pelo menos, 2 ou mais posições de aminoácidoselecionadas a partir do grupo consistindo das posições - 2, 89, 277, 281 e 300, mais preferencialmente nas posições- 2+281 ou 89+281 ou 277+300.
6. Expandase mutante, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizada pelo fato decompreender, pelo menos, 3 ou mais posições de aminoácidoselecionadas a partir do grupo consistindo das posições 2,- 89, 281, 293 e 311, mais preferencialmente nas posições- 2+89+281 ou 89+281+311 ou 89+281+293.
7. Expandase mutante, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizada pelo fatode compreender, pelo menos, 4 ou mais posições deaminoácido selecionadas a partir do grupo consistindo dasposições 2, 73, 89, 90, 217, 244, 277, 281, 306, 307 e 311,mais preferencialmente nas posições 2+277+280+281 ou- 2+281+306+311 ou 73+89+281+311 ou 89+217+281+311 ou- 89+244+281+311 ou 89+281+307+311 ou 277+281+306+311 ou- 89+281+306+311 ou 90+281+306+311.
8. Expandase mutante, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizada pelofato de compreender, pelo menos, 5 ou mais posições deaminoácido selecionadas a partir do grupo consistindo dasposições 2, 73, 89, 155, 213, 249, 281, 293, 300, 306 e 311, mais preferencialmente nas posições 2+89+281+306+311ou 2+155+281+306+311 ou 73+89+213+281+311 ou-89+281+293+300+311 ou 89+249+281+306+311.
9. Expandase mutante, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizada pelofato de compreender, pelo menos, 6 posições de aminoácidoselecionadas a partir do grupo consistindo das posições-90+105+113+281+3 06+311.
10. Expandase mutante, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizadapelo fato de compreender, pelo menos, 7 ou mais posições deaminoácido selecionadas a partir do grupo consistindo dasposições 73, 89, 105, 113, 155, 177, 277, 280, 281, 293,-300, 306, 307 e 311, mais preferencialmente-73+89+281+293+300+307+311 ou 105+113+155+177+281+306+311 ou-5+177+277+28 0+281+3 06+311.
11. Expandase mutante, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10,caracterizada pelo fato de compreender, pelo menos, 8 oumais posições de aminoácido selecionadas a partir do grupoconsistindo das posições 2, 90, 99, 105, 113, 155, 177,-277, 281, 306 e 311, mais preferencialmente nas-2+90+99+105+113+281+306+311 ou-2+90+105+113+155+177+27 7+281.
12. Expandase mutante, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11,caracterizada pelo fato de compreender, pelo menos, 9posições de aminoácido selecionadas a partir do grupoconsistindo das posições 2+90+105+113+155+177+281+306+311.
13. Expandase mutante, de acordo com reivindicação 1,caracterizada pelo fato de compreender, pelo menos, 10posições de aminoácido selecionadas a partir do grupoconsistindo das posições 2+90+105+113+155+177+281+306+311.
14. Expandase mutante, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2, 3 e 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13,caracterizada pelo fato de possuir uma atividade expandasein vitro contra adipil-6-ΑΡΑ, pelo menos, 2,5 vezesmelhorada em comparação com um polipeptídeo modelo comatividade expandase.
15. Expandase mutante, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou-14, caracterizada pelo fato da expandase mutante ser umavariante da expandase de S. clavuligerus codificada pelogene cefE como descrito na SEQ ID No. 1.
16. Expandase mutante, de acordo com reivindicação 15,caracterizada pelo fato da expandase mutante ter sidomodificada em, pelo menos, uma posição de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo das posições D2,-S59, M73, T89, N90, M99, Y101, T105, G113, C155, H170,-P177, G2 09, T213, Y217, H244, R249, D251, L277, A278, E280,-C281, T293, G3 00, R306, R307 e A311, mais-preferencialmente, pelo menos, uma posição de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo das posições 2,-59, 89, 90, 99, 105, 113, 170, 177, 209, 213, 217, 249,-251, 278, 280 e 293, mais preferencialmente a partir dogrupo consistindo das posições 2, 89, 90, 99, 105, 177,-251, 278, 280 e 293.
17. Polinucleotldeo caracterizado pelo fato de codificara expandase mutante de qualquer uma das reivindicações 1,-2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16.
18. Vetor ou cassete de expressão caracterizado pelofato de compreender o polinucleotídeo da reivindicação 17.
19. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de sertransformada com o polinucleotideo da reivindicação 17 oucom o vetor ou cassete da reivindicação 18.
20. Método de produzir uma expandase mutante dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15 ou 16 caracterizado pelo fato de compreender cultivode uma célula hospedeira da reivindicação 19 sob condiçõesque contribuam para a produção da expandase mutante e,opcionalmente, recuperando o polipeptídeo.
21. Método de produzir um COMPOSTO β-LACTÂMICO deinteresse caracterizado pelo fato de compreender cultivo deuma célula hospedeira da reivindicação 2 0 sob condições quecontribuam para a produção do COMPOSTO β-LACTÂMICOa e,opcionalmente, recuperando o COMPOSTO β-LACTÂMICOa.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de adicionalmente compreender N-deacilação do COMPOSTO β-LACTÂMICOa para produzir umCOMPOSTO β-LACTÂMICOa N-deacilado.
23. Método de obter a expandase mutante de qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,-13, 14, 15 ou 16 caracterizado pelo fato do métodocompreender as seguintes etapas:- mutagênese de um gene clonado codificando um polipeptídeomodelo com atividade expandase, preferencialmente cefEcodificando a expandase a partir de S. clavuligerus, entãoobtendo uma coleção de genes mutagenizados codificando asexpandases mutantes.- expressão da coleção de genes mutagenizados codificandoas expandases mutantes em um hospedeiro apropriado evarredura da coleção de expandases mutantes para umaatividade melhorada com um substrato apropriado,preferencialmente ad-6-ΑΡΑ;- opcionalmente repetindo etapas 1 e 2 ou diversas vezesutilizando, desse modo, mutagênese do gene codificando opolipeptídeo modelo com atividade expandase e/ou um ou maisgenes mutagenizados codificando expandases mutantes com umaatividade melhorada sobre o substrato apropriado.
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