BRPI0613133A2 - métodos de manutenção de uma condição de homozigose recessiva de uma planta, métodos de produção de semente a partir de uma planta apresentando gametas femininos e masculinos, métodos de restauração da fertilidade masculina em uma planta macho-estéril, seqüência de nucleotìdeo isolada, cassete de expressão, célula vegetal e planta - Google Patents

métodos de manutenção de uma condição de homozigose recessiva de uma planta, métodos de produção de semente a partir de uma planta apresentando gametas femininos e masculinos, métodos de restauração da fertilidade masculina em uma planta macho-estéril, seqüência de nucleotìdeo isolada, cassete de expressão, célula vegetal e planta Download PDF

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Abstract

MéTODOS DE MANUTENçãO DE UMA CONDIçãO DE HOMOZIGOSE RECESSIVA DE UMA PLANTA, MéTODOS DE PRODUçAO DE SEMENTE A PARTIR DE UMA PLANTA APRESENTANDO GAMETAS FEMININOS E MASCULINOS, MéTODOS DE RESTAURAçãO DA FERTILIDADE MASCULINA EM UMA PLANTA MACHO-ESTéRIL, SEQüêNCIA DE NUCLEOTIDEO ISOLADA, CASSETE DE EXPRESSAO, CéLULA VEGETAL E PLANTA. São descritas sequências de nucleotídeos mediando fertilidade masculina em plantas, com seqúências de molécula de DNA e aminoácidos definidas. Também são identificadas seqúências promotoras e suas regiões essenciais. As seqúências de nucleotídeos são úteis em mediar a fertilidade masculina em plantas. Em tal método, a condição de homozigose recessiva de alelos que causam esterilidade masculina é mantida após se cruzar com uma segunda planta, onde a segunda planta contém uma construção transgênica restauradora contendo uma sequência de nucleotídeo que reverte a condição de homozigose. A sequência restauradora é ligada com uma sequência hemizigota codificando um produto, inibindo a formação ou a função de gametas masculinos. A planta mantenedora produz apenas gametas masculinos viáveis que não apresentam a construção com o transgene restaurador. é também provido aumento da planta mantenedora por auto-fertilização, e seleção de sementes ou plantas que contêm a construção.

Description

MÉTODOS DE MANUTENÇÃO DE UMA CONDIÇÃO DE HOMOZIGOSERECESSIVA DE UMA PLANTA, MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE SEMENTE APARTIR DE UMA PLANTA APRESENTANDO GAMETAS FEMININOS EMASCULINOS, MÉTODOS DE RESTAURAÇÃO DA FERTILIDADE MASCULINAEM UMA PLANTA MACHO-ESTÉRIL, SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEOISOLADA, CASSETE DE EXPRESSÃO, CÉLULA VEGETAL E PLANTA
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
O desenvolvimento de melhoramento de plantas híbridastornou possível avanços em qualidade e quantidade decultivos produzidos. Produção aumentada e combinação decaracterísticas desejáveis, tais como resistência a doençase insetos, tolerância a calor e seca, junto com variaçõesem composição vegetal são todas possíveis devido aprocedimentos de hibridização. Esses procedimentosfreqüentemente confiam fortemente em provir umacontribuição de pólen masculino parental a uma fêmea paraproduzir o híbrido resultante.
Cultivos de campo são cruzados através de técnicas quelevam vantagem dos métodos de polinização de plantas. Umaplanta é autopolinizadora se o pólen de uma flor étransferido à mesma ou a outra flor da mesa planta. Umaplanta é polinizada cruzadamente se o pólen vem de uma florem uma planta diferente.
Em Brassica, a planta é normalmente auto-estéril epode apenas ser polinizada cruzadamente. Em espéciesautopolinizadoras, tais como sojas e algodão, as plantasmasculinas e femininas são anatomicamente justapostas.Durante a polinização natural, os órgãos reprodutivosmasculinos de uma dada flor poliniza os órgãos reprodutivosfemininos da mesma flor.
Plantas de milho (Zea mays L.) apresentam uma situaçãoúnica na qual podem ser cruzadas tanto por técnicas deautopolinização e polinização cruzadas. Milho possuiflores masculinas, localizadas no pendão, e floresfemininas, localizadas na espiga, na mesma planta. Podeser autopolinizada ou polinizada cruzadamente. Polinizaçãonatural ocorre em milho quando o vento sopra o pólen dospendões às sedas que projetam-se do topo das espigasincipientes.
Um método confiável de controlar a fertilidade emplantas seria oferecer a oportunidade para cruzamentovegetal melhorado. Isso é especialmente verdadeiro para odesenvolvimento de híbridos de milho, os quais confiam emalgum tipo de sistema de esterilidade masculina e onde umsistema de esterilidade de fêmea reduziria os custos deprodução.
O desenvolvimento de híbridos de milho requer odesenvolvimento de linhas intercruzadas homozigotas, ocruzamento dessas linhas, e a avaliação dos cruzamentos.Cruzamento pedigree e seleção recorrente são dois dosmétodos de cruzamento usados para desenvolver linhasintercruzadas de populações. Programas de cruzamentocombinam traços desejáveis de duas ou mais linhasintercruzadas ou várias fontes, amplamente baseadas, empools de cruzamento, a partir dos quais, novas linhasintercruzadas são desenvolvidas autopolinizando e porseleção de fenótipos desejados. Uma variedade de milhohíbrido é o cruzamento de duas tais linhas intercruzadas,cada qual pode possuir uma ou mais característicasdesejáveis e outras em falta ou que complementem ao outra.Os novos intercruzados são cruzados com outras linhashíbridas e os híbridos desses cruzamentos são avaliadospara determinar quais possuem potencial comercial. Aprogênie híbrida da primeira geração é designada F1. Nodesenvolvimento de híbridos, apenas as plantas híbridas Fisão procuradas. O híbrido F1 é mais vigoroso do que seuspais intercruzados. Esse vigor de híbrido, ou heterose,pode ser manifestado de vários meios, incluindo crescimentovegetativo aumentado e produção aumentada.
Sementes de milho híbrido podem ser produzidas por umsistema de esterilidade masculina incorporandodescascamento manual. Para produzir sementes híbridas, opendão masculino é removido do parental fêmea intercruzado,o qual pode ser plantado em vários padrões de colunaalternados com o parental masculino intercruzado.Conseqüentemente, provido que exista isolamento suficientede fontes de pólen de milho estrangeiro, as espigas dafêmea intercruzada será fertilizada apenas com pólen domasculino intercruzado. A semente resultante é, portanto,híbrida (Fi) e formará plantas híbridas.A variação ambiental no desenvolvimento vegetal poderesultar em plantas formando pendões após a retirada manualdos pendões da fêmea parental ser completada. Ou, umretirador de pendões pode não remover completamente opendão de um planta intercruzada fêmea. Em qualquerevento, o resultado é que a planta fêmea irá irradiar pólencom sucesso e algumas plantas fêmeas serão autopolinizadas.Isso resultará em sementes da fêmea intercruzada sendocolhidas junto com as sementes híbridas que são normalmenteproduzidas. Sementes de fêmea intercruzada não são tãoquanto produtivas como sementes F1. Além disso, a presençade sementes de fêmea intercruzada pode representar um riscode segurança de germoplasma para a companhia produzindo ohíbrido.
Alternativamente, a fêmea intercruzada pode ter ospendões retirados mecanicamente por máquina. Retirada dependões mecânica é aproximadamente tão confiável como aretirada de pendão manual, mas é mais rápido e custa menos.Contudo, a maioria das máquinas de retirar pendões produzemmais dano às plantas do que a remoção de pendão manual.Assim, nenhuma forma de remoção de pendão é, atualmente,totalmente satisfatória, e uma necessidade continua aexistir para alternativas que reduzam mais os custos deprodução e para eliminar autopolinização da fêmea parentalna produção de sementes híbridas.Um sistema confiável de esterilidade genéticamasculina proveria vantagens. 0 processo laborioso deretirada de pendão pode ser evitado em alguns genótiposusando intercruzados citoplásmicos masculinos estéreis(CMS). Na ausência de um gene restaurados de fertilidade,plantas de um intercruzado CMS são masculinos estéreis comoum resultado de fatores resultando do genoma do citoplasma,ao contrário do nuclear. Assim, essa característica éherdada exclusivamente através da fêmea parental em plantasde milho, já que apenas a fêmea provê o citoplasma dassementes fertilizadas. Plantas CMS são fertilizadas compólen de outro intercruzado que não masculino estéril.Pólen do segundo intercruzado pode ou não contribuir comgenes que fazem a esterilidade masculina em plantashíbridas. Usualmente, sementes de milho normal sem pendãoe sementes produzidas por CMS do mesmo híbrido podem sermisturadas para assegurar que carregamentos de pólenadequado estejam disponíveis para fertilização quando asplantas híbridas são cultivadas e para assegurardiversidade citoplásmica.
Podem existir outra inconveniências para CMS. Uma éuma associação historicamente observada de um varianteespecífico de CMS com susceptibilidade a certas doenças decultivos. Esse problema desencorajou o uso muito difundidodaquele variante CMS para produzir milho híbrido e teve umimpacto negativo no uso de CMS em milho em geral.Um tipo de esterilidade genética é descrito nas U.S.Patents 4.654.465 e 4.727.219 para Brar, et al. Contudo,essa forma de esterilidade genética masculina requermanutenção de múltiplos genes mutantes em localidadesseparadas no genoma e requer um complexo sistema marcadorpara rastrear os genes e fazer uso do sistema conveniente.Patterson também descreveu um sistema gênico detranslocações cromossômicas que podem ser efetivos, mas quesão complicados. (Ver, U.S. Patents No. 3.861.709 e3.710.511.)
Várias outras tentativas foram feitas para melhoraressas inconveniências. Por exemplo, Fabijanski, et al.,desenvolveram diversos métodos de causar esterilidademasculina em plantas (ver EPO 89/3010153.8 no. depublicação 329.308 e PCT application PCT/CA90/00037publicada como WO 90/08828) . Um método inclui entregar àplanta um gene codificando uma substância citotóxicaassociada com um promotor especifico de tecido masculino.Outro envolve um sistema anti-senso, no qual um genecritico para fertilidade é identificado e um anti-senso aogene inserido na planta. Mariani, et al. também apresentamdiversos sistemas anti-senso citotóxicos. Ver EP 89/401,194. Ainda outros sistemas usam genes "repressores" queinibem a expressão de outro] gene critico à esterilidademasculina. PCT/GB90/00102, publicada como WO 90/08829.
Uma melhoria adicional desse sistema é uma descrita emU.S. Patent No. 5.478.369, na qual um método de acarretarem esterilidade masculina controlável é alcançadosilenciando um gene nativo à planta que é critico parafertilidade masculina e substituir o DNA nativo com o genecritico a fertilidade masculina ligado a um promotorinduzido controlando a expressão do gene. A planta é,assim, constitutivamente estéril, tornando-se fértil apenasquando o promotor é induzido e seu gene de fertilidademasculina anexado é expressado.
Em um número de circunstâncias, um traço deesterilidade masculina vegetal é expressado por manutençãode uma condição homozigota recessiva. Dificuldades surgemem manter a condição homozigota, quando um gene transgênicode restauração pode ser usado para manutenção. Porexemplo, uma mutação natural em um gene critico paraesterilidade masculina pode acarretar em um fenótipo deesterilidade masculina para plantas quando esse alelomutante está no estado homozigoto. Essa esterilidade podeser restaurada quando a forma não mutante do gene éintroduzida na planta. Contudo, essa forma de restauraçãoremove a condição homozigota recessiva desejada, restaurafertilidade masculina completa e previne a manutenção delinhas maternais masculinas estéreis puras. Essa questãopode ser evitada onde a produção de pólen contendo o genede restauração eliminada, provendo, assim, uma plantamantenedora produzindo apenas pólen não contendo o gene derestauração, e a progênie retém a condição homozigota. Umexemplo de uma abordagem é apresentado em Dellaporta etal., 6.743.968, no qual uma planta é produzida tendo umconstruto hemizigótico compreendendo um gene que produz umproduto fatal a uma célula, ligado a um promotor especificode pólen, e o gene de restauração. Quando cruzada com aplanta masculina estéril recessiva homozigota, a progênieretém, assim, a condição homozigota recessiva.
Como notado, um aspecto essencial de grande parte dotrabalho corrente com sistemas de esterilidade masculina éa identificação de genes provocando fertilidade masculina.
Tal gene pode ser usando em uma variedade de sistemaspara controlar fertilidade masculina incluindo aqueles aquidescritos. Previamente, um gene de fertilidade masculinafoi identificado em Arabidopsis thaliana e usado paraproduzir uma planta masculina estéril. Aarts, et al. ,"Transposon Tagging of a Male Sterility Gene inArabidopsis", Naturef 363:715-717 (Jun. 24, 1993). U.S.Patent No. 5.478.369 descreve um tal gene causando impactoem fertilidade masculina. Na presente invenção, osinventores provêm novas moléculas de DNA e a seqüência deaminoácidos codificada que são criticas para fertilidademasculina em plantas. Essas podem ser usadas em quaisquerdos sistemas onde o controle de fertilidade é útil,incluindo aqueles descritos acima.
Assim, um objeto da invenção é provir uma seqüência deácidos nucléicos, cuja expressão é critica para fertilidademasculina em plantas.Outro objeto da invenção é provir uma molécula de DNAcodificando uma seqüência de aminoácidos, cuja expressão écritica para fertilidade masculina em plantas.
Ainda, outro objeto da invenção é provir um promotorde tal seqüência de nucleotideos e suas seqüênciasessenciais.
Um objeto adicional da invenção é provir um método deusar tais moléculas de DNA para mediar fertilidademasculina em plantas.
Objetos adicionais da invenção se tornarão aparentesna descrição e reivindicações que se seguem.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Esta invenção é relacionada a seqüências de ácidosnucléicos, e, especificamente, às moléculas de DNA e oaminoácido codificado pelas moléculas de DNA, quê sãocriticas para fertilidade masculina. Um promotor do DNA éidentificado, assim como suas seqüências essenciais. Ainvenção também refere-se ao uso de tais moléculas de DNApara mediar fertilidade em plantas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 é um mapa de lócus do gene Ms26 defertilidade masculina.A Figura 2A é um Southern blot da família ms26-m2::Mu8hibridizada com uma sonda Mu8; A Figura 2B é um Southernblot da família ms26-m2::Mu8 hibridizada com um fragmentoPstI isolado a partir do clone ms26.
A Figura 3. é um gel de análise de Northern Blothibridizado com um com um fragmento PstI isolado a partirdo gene ms26.
A Figura 4A-4D é a seqüência de Ms26 (O DNAc é SEQ IDNO: 1, a proteína é SEQ ID NOS: 2)
Figura 5A-5C é a seqüência genômica Ms26 (tambémreferida como SEQ ID NO: 7).
A Figura 6A-6D é uma comparação da seqüência genômicaMs26 (Resíduos 1051-3326 de SEQ ID NO: 7) com o DNAc deMs26 (SEQ ID NO: 1).
A Figura 7A é um gel de análise Northern mostrandoexpressão em vários tecidos vegetais e a Figura 7B é um gelmostrando estágios de expressão de microesporogênese.
A Figura 8 é o promotor de comprimento total de Ms26(SEQ ID NO: 5)A Figura 9 é um gráfico de barra mostrando atividadede luciferase após deleções de regiões seletas do promotorMs26.
A Figura 10 mostra regiões essenciais do promotor Ms26(SEQ ID NO: 6).
A Figura 11 um gráfico de barra mostrando atividade deluciferase após substituição por rastreamento de ligante desitio de restrição de regiões seletas pequenas (9-10 pb) dofragmento promotor Ms26 essencial.
A Figura 12A e 12B é uma comparação da seqüência denucleotideos (SEQ ID NO: 3) do ortólogo Ms26 de paniculo desorgo e DNAc de Ms26 de milho (Resíduos 201-750 de SEQ IDNO: 1), e a seqüência de proteínas de sorgo (SEQ ID NO: 4)e proteína Ms26 de milho (Resíduos 87-244 de SEQ ID NO:2).
A Figura 13 é uma representação do mapeamento do genede esterilidade masculina ms26.
A Figura 14 mostra uma comparação de seqüência daregião de excisão do alelo ms26-ref (SEQ ID NO: 8) comMs26 do tipo selvagem (SEQ ID NO: 9).
A Figura 15 mostra a seqüência transposon em ms26-ref(SEQ ID NO: 10).A Figura 16 mostra toda a seqüência ms26-ref (SEQ IDNO: 11).
A Figura 17A mostra um alinhamento de seqüência deproteínas traduzidas entre duas regiões de CYP704B1, umgene de P450 (SEQ ID NO: 12) e Ms26 (SEQ ID NO: 13); AFigura 17B mostra a análise de árvore filogenética de genesP450 seletos.
A Figura 18 demonstra a mudança de quadro de domíniode ligação de heme, mostrando o alinhamento de seqüênciatraduzida de regiões do DNAc de Ms26 (SEQ ID NOS: 14 and28-29), as regiões genômicas de éxon 5 em plantas férteis(SEQ ID NOS: 15 e 30-31) e plantas estéreis (SEQ ID NOS:16 e 32-33).
A Figura 19 mostra o DNAc de Ms26 de arroz (SEQ ID NO:17) e proteína (SEQ ID NO: 18).
A Figura 20 mostra alinhamento do promotor Ms26 demilho (Resíduos 650-1089 de SEQ ID NO: 5), sorgo (SEQ IDNO: 19) e arroz(SEQ ID NO: 20).
A Figura 21 mostra alinhamento da proteína Ms26 demilho (SEQ ID NO: 21); proteína Ms26 de arroz (SEQ ID NO:18) e proteína Ms26 de sorgo (SEQ ID NO: 22) junto comuma seqüência consenso .A Figura 22 é um mapa de plasmídio de PHP 18091,contendo gene de fertilidade Ms45 com um gene citotóxicopromotor de pólen e marcador selecionável.
A Figura 23 é um mapa de plasmidio de PHP 24101,contendo o gene de fertilidade Ms26 com um gene citotóxicopromotor de pólen e marcador selecionável.
A Figura 24 mostra uma seqüência da regiãocodificadora de α-amilase 1 de Zea mays.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Todas as referências referidas são aqui incorporadaspor referência.
A menos que definido ao contrário, todos os termostécnicos e científicos aqui usados possuem o mesmosignificado como comumente entendido por alguém deconhecimento ordinário na arte à qual esta invençãopertence. A menos que mencionado ao contrário, as técnicasaí empregadas ou contempladas são metodologias padrão bemconhecidas de alguém de conhecimento ordinário na arte. Osmateriais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas, enão limitantes.
Esterilidade genética masculina resulta de umamutação, supressão, ou outro impacto a um dos genescríticos para uma etapa específica em microesporogênese, otermo aplicado a todo o processo de formulação de pólen.Esses genes podem ser referidos coletivamente como genes defertilidade masculina (ou, alternativamente, genes deesterilidade masculina). Existem várias etapas na viacompleta, onde a função gênica causa impacto nafertilidade. Isso parece aptamente suportado pelafreqüência de esterilidade genética masculina em milho.Novos alelos de mutantes de esterilidade masculina não sãocobertos em materiais que variem de linhagens de elite parapopulações não adaptadas.
Na Patente No. 5,478,369 está descrito um método peloqual o gene Ms45 de esterilidade masculina foi marcado eclonado no cromossomo 9 de milho. Previamente, havia sidodescrito um gene de esterilidade masculina no cromossomo 9,ms2, que nunca tinha sido clonado e seqüenciado. Não éalélico ao gene referido na patente λ369. Ver Albertsen,M. and Phillips, R.L., "Developmental Cytology of 13Genetic Male Sterile Loci in Maize" Canadian Journal ofGenetics & Cytology 23:195-208 (Jan. 1981). O único genede fertilidade clonado antes tinha sido o gene deArabadopsis descrito em Aarts, et al., supra.
São numerosos os exemplos de genes que foramsubseqüentemente descobertos que são críticos parafertilidade masculina, e incluem o gene de ArabidopsisABORTED MICROSPORES (AMS), Sorensen et al., The PlantJournal (2003) 33 (2) :413-423); o gene MSl de Arabidopsis(Wilson et al., The Plant Journal (2001) 39 (2):170-181); ogene NEFl (Ariizumi et al. , The Plant Journal ( 2004)39(2) :170-181); gene AtGPATl de Arabidopsis (Zheng et al. ,The Plant Cell (2003) 15:1872-1887); a mutação dde2-2 deArabdiopsis foi mostrada por ser defeituosa no gene daaleno óxido sintase (Malek et al., Planta (2002)216:187-192); o gene faceless pollen-1 de Arabidopsis (flpl)(Ariizumi et al, Plant Mol. Biol. (2003) 53:107-116); ogene MALE MEIOCYTE DEATHl de Arabidopisis (Yang et al., ThePlant Cell (2003) 15: 1281-1295); o gene dedo de zincotapet um-especifico, TAZl (Kapoor et al., The Plant Cell(2002) 14:2353-2367); e o gene TAPETUM DETERMINANT1 (Lan etal, The Plant Cell (2003) 15:2792-2804).
A tabela abaixo lista um número de mutantes defertilidade masculina ou genes de Zea mays.
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Assim a invenção inclui usar as seqüências aquiapresentadas para causar impacto na fertilidade masculinaem uma planta, isto é, para controlar a fertilidademasculina por manipulação do genoma usando os genes dainvenção. Por meio de exemplo, sem limitação, quaisquerdos métodos descritos infra podem ser usados com aseqüência da invenção, tais como introduzir uma seqüênciamutante em uma planta para causar esterilidade, causarmutação à seqüência nativa, introduzir um anti-senso daseqüência na planta, uso de formações hairpin, ligar comoutras seqüências para controlar sua expressão, ou qualquerum de uma miriade de processos disponíveis a alguémespecialista na arte para causar impacto na fertilidademasculina em uma planta.
O gene Ms26 aqui descrito é localizado no cromossomo 1de milho, e seu alelo dominante é crítico para fertilidademasculina. O mapa de lócus está representado na Figura 1.Isto pode ser usado nos sistemas descritos acima, e outrossistemas causando impacto em fertilidade masculina.
A família de milho co-segregando para esterilidade foinomeada ms*-SBMu200 e foi encontrada tendo um fragmentoEcoRI de aproximadamente 5,5 Kb que hibridizou com umasonda Mu8 (Figura 2A) . Um clone genômico da família foiisolado, o qual continha um transposon Mu8. Uma sondafeita de DNA divisando o transposon foi observada porhibridizar ao mesmo fragmento EcoRI de ~5.5Kb (Figura 2B) .Essa sonda foi usada para isolar clones de DNAc de umabiblioteca de DNAc de pendão. 0 DNAc é 1906 bp, e ainserção Mu ocorreu no éxon 1 do gene. Essa sonda foitambém usada para mapear a mutação em uma população demapeamento RFLP. 0 mutante mapeou o braço curto docromossomo 1, próximo a Ms26. Cruzamentos de alelismoentre ms26-ref e ms*-SBMu200 mostraram que esses foramalélicos, indicando que as mutações ocorreram no mesmogene. 0 alelo ms*-SBMu200 foi renomeado ms26-m2::Mu8.Dois alelos adicionais para o gene Ms26 foram clonados, umcontendo um elemento mutador no Segundo éxon, nomeado ms26-m3::Mu*, e um contendo um transposon desconhecido no quintoéxon do alelo ms26-ref. A Figura 5 (melhor discutidoabaixo) representa a seqüência de nucleotídeos genômica.Padrões de expressão, como determinado por análiseNorthern, mostram especificidade de pendão com expressãopico a cerca do quarteto para estágios liberação dequarteto de microesporogênese.Será evidente a alguém especialista na arte quevariações, mutações, derivações incluindo fragmentosmenores do que a seqüência inteira apresentada podem serusados para reter as propriedades controlando esterilidademasculina do gene. Alguém de conhecimento ordinário naarte pode prontamente avaliar o variante ou fragmento porintrodução em plantas homozigotas para um alelo estável deestéril masculino de Ms26, seguido por observação dodesenvolvimento do tecido masculino da planta.
As seqüências da invenção podem ser isoladas a partirde qualquer planta, incluindo, mas não limitando-se a milho(Zea mays), canola (Brassica napus, Brassica rapa ssp.)ralfafa (Medicago sativa) , arroz (Oryza sativa) , centeio(Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) ,girassol (Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum),soja (Glyeine max), tabaco (Nieotiana tabaeum), milhete(Panieum spp.), batata (Solanum tuberosum), amendoins{Ara chis hypogaea), algodão (Gossypium hirsutum), batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot eseulenta), café(Cofea spp.), coco (Cocos nueifera), abacaxi (Ananaseomosus), árvores citricas (Citrus spp.), cacau (Theobromaeaeao), chá (Camellia sinensis), banana {Musa spp.),abacate (Persea americana), figo (Ficus casica), goiaba(Psidium guajava), manga (Mangifera indica), oliveira (Oleaeuropaea), aveia (Avena sativa), cevada (Hordeum vulgare),verduras, ornamentais, e coniferas. Preferencialmente,plantas incluem milho, soja, girassol, cártamo, canola,trigo, cevada, centeio, alfafa, arroz, algodão e sorgo.
Seqüências de outras plantas podem ser isoladas deacordo com técnicas bem conhecidas baseado em sua homologiade seqüência à região codificadora homóloga das seqüênciascodificadoras aqui relatadas. Nessas técnicas, toda ouparte da seqüência codificadora conhecida é usada como umasonda que hibridiza seletivamente a outras seqüênciaspresentes em uma população de fragmentos de DNA genômicoclonados (i.e. bibliotecas genômicas) de um organismoescolhido. Métodos estão prontamente disponíveis na artepara a hibridização de seqüências de ácidos nucléicos. Umguia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos éencontrado em Tijssen, Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Bioloqy--Hybridization withNucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview ofprincipies of hybridization and the strategy of nucleicacid probe assays", Elsevier, New York (1993); e CurrentProtocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, et al.,Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(1995).
Assim, a invenção inclui, também, aquelas seqüênciasde nucleotídeos que hibridizam seletivamente às seqüênciasde nucleotídeos Ms26 sob condições rigorosas. Referindo-sea uma seqüência que "hibridiza seletivamente" com Ms26, otermo inclui referência a hibridização, sob condições dehibridização rigorosas, de uma seqüência de ácidosnucléicos à seqüência de ácidos nucléicos alvo especificadaem um grau detectavelmente maior do que sua hibridização aácido nucléico não alvo.
Os termos "condições rigorosas" "condições dehibridização rigorosas" inclui referência a condições sobas quais uma sonda irá hibridizar a sua seqüência alvo, emum grau detectavelmente maior do que sua hibridização aoutras seqüências. Condições rigorosas são dependentes deseqüência alvo e irão diferir dependendo da estrutura donucleotideo. Controlando-se o rigor das condições dehibridização e/ou lavagem, seqüências alvo podem seridentificadas, as quais são 100% complementares a uma sonda(sondagem homóloga). Alternativamente, condições de rigorpodem ser ajustadas para permitir alguma falta decorrespondência em seqüências, do forma que graus menoresde similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga).Geralmente, sondas desse tipo estão em uma faixa de cercade 1000 nucleotideos em comprimento a cerca de 250nucleotideos em comprimento.
Um guia extensivo para a hibridização de ácidosnucléicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Bioloqy—Hybridization withNucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview ofprincipies of hybridization and the strategy of nucleicacid probe assays", Elsevier, New York (1993); e CurrentProtocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel, et al.,Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York(1995) . Ver também Sambrook et al. (1989) MolecularCloninq: A Laboratory Manual (2nd ed. Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
Em geral, seqüências que correspondem às seqüências denucleotideos da presente invenção e hibridizam à seqüênciade nucleotideos aqui descrita, serão pelo menos 50%homólogas, 70% homólogas, e até 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% homólogasou mais com a seqüência descrita. Isto é, a similaridadede seqüência entre sonda e alvo pode variar, compartilhandopelo menos cerca de 50%, cerca de 70%, e até cerca de 85%ou mais de similaridade de seqüência.
a especificidade é tipicamente a função de lavagenspós-hibridização, os fatores críticos sendo a força iônicae temperatura da solução de lavagem final. Geralmente,condições de temperatura de lavagem rigorosas sãoselecionadas para serem cerca de 5°C a cerca de 2°C menoresque o ponto de derretimento (Tm) para a seqüênciaespecífica a uma força iônica definida e pH. 0 ponto dederretimento, ou desnaturação, de DNA ocorre sobre umafaixa estreita de temperatura e representa o rompimento dadupla-hélice em suas fitas simples complementares. 0processo é descrito pela temperatura do ponto médio detransição, Tm, que é também chamada de temperatura dederretimento. Fórmulas estão disponíveis na arte para adeterminação de temperaturas de derretimento.Condições de hibridização preferidas para a seqüênciade nucleotideos da invenção incluem hibridização a 42°C em50% (w/v) formamida, 6X SSC, 0,5% (w/v) SDS, 100 (g/ml) de DNAde esperma de salmão. Condições exemplares de lavagem debaixo rigor incluem hibridização a 42°C em uma solução de2X SSC, 0,5% (w/v) SDS por 30 minutos e repetir. Condiçõesexemplares de rigor moderado incluem uma lavagem em 2X SSC,0,5% (w/v) SDS a 50°C por 30 minutos e repetir. Condiçõesexemplares de rigor alto incluem uma lavagem em 0,1X SSC,0,1% (w/v) SDS, a 65°C por 30 minutos a uma hora e repetir.Seqüências que correspondem ao promotor da presenteinvenção podem ser obtidas usando todas as condições acima.Para propósitos de definir a invenção, as condições de altorigor são usadas.
Os seguintes termos são usados para descrever arelação de seqüência entre dois ou mais ácidos nucléicos ounucleotideos: (a) "seqüência referência", (b) "janela decomparação", (c) "identidade de seqüência", e (d)"porcentagem de identidade de seqüência".
(a) Como aqui usado, "seqüência referência" é umaseqüência definida usada como uma base para comparação deseqüências. Uma seqüência referência pode ser um subgrupoou a totalidade de uma seqüência especificada; por exemplo,como um segmento de um DNAc,. ou seqüência gênica, decomprimento total, ou o DNAc, ou seqüência gênica,completo.(b) Como aqui usado, "janela de comparação" fazreferência a um segmento contíguo e específico de umaseqüência de polinucleotídeos, caracterizado pelo fato deque a seqüência de polinucleotídeos na janela de comparaçãopode compreender adições ou deleções (i.e., espaços)comparada à seqüência referência (que não compreendeadições ou deleções) para alinhamento ótimo das duasseqüências. Geralmente, a janela de comparação é de pelomenos 20 nucleotídeos contíguos em comprimento, eopcionalmente pode ser de 30, 40, 50, ou 100 nucleotídeosem comprimento, ou mais longa. Aqueles especialistas naarte entendem que para evitar uma alta similaridade a umaseqüência referência .devido à inclusão de espaços naseqüência de polinucleotídeos uma penalidade por espaço étipicamente introduzida e é subtraída do número decorrespondências.
Métodos de alinhar seqüências para comparação são bemconhecidos na arte. Assim, a determinação de identidade deseqüência percentual entre quaisquer duas seqüências podeser conseguida usando um algoritmo matemático. Exemplosnão limitantes de tais algoritmos matemáticos são oalgoritmo de Myers and Miller (1988) CABIOS 4: 11-17; oalgoritmo de alinhamento local de Smith et al. (1981) Adv.Appl. Math. 2: 4 82; algoritmo de alinhamento global deNeedleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; ométodo de busca por alinhamento local de Pearson and Lipman(1988) Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 2444-2448; o algoritmo deKarlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264, modificado como em in Karlin and Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-5877.
Implementações computacionais desses algoritmosmatemáticos podem ser utilizados para comparação deseqüências para determinar identidade de seqüência. Taisimplementações incluem, mas não são limitadas a: CLUSTALno programa PC/Gene (disponível pela Intelligenetics,Mountain View, Califórnia); o programa ALIGN (Version 2.0)e GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no pacote desoftware GCG Wisconsin Genetics Software Package, Version10 (disponível pela Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, SanDiego, Califórnia, USA). Alinhamentos usando essesprogramas podem ser efetuados usando os parâmetros padrão.
0 programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins et al. (1988)Gene 73: 237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10881-90; Huang et al. (1992) CABIOS 8: 155-65; e Pearson et al.(1994) Meth. Mol. Biol. 24: 307-331. 0 programa ALIGN ébaseado no algoritmo de Myers and Miller (1988) supra. Umatabela de peso de resíduo PAM120, uma penalidade porcomprimento de espaço de 12, e uma penalidade por espaço de4 podem ser usadas no programa ALIGN quando comparandoseqüências de aminoácidos. Os programas BLAST de Altschulet al (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 são baseados noalgoritmo de Karlin and Altschul (1990) supra. BuscasBLAST de nucleotídeos podem ser efetuadas com o programaBLASTNr pontuação = 100, tamanho de palavra = 12, paraobter seqüências de nucleotídeos homólogas a uma seqüênciade nucleotideos codificando uma proteína da invenção.Buscas BLAST de proteínas podem ser efetuadas comprograma BLASTX, pontuação = 50, tamanho de palavra = 3,para obter seqüências de aminoácidos homólogas a umaproteína ou polipeptídeo da invenção. Para obteralinhamentos por GAP para propósitos de comparação, GappedBLAST (em BLAST 2.0) pode ser utilizado como descrito emAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389.Alternativamente, PSI-BLAST (em BLAST 2.0) pode ser usadopara realizar uma busca iterada que detecta relaçõesdistantes entre moléculas. Ver Altschul et al. (1997)supra. Quando utilizando BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST,os parâmetros padrão dos respectivos programas (e.g.,BLASTN para seqüências de nucleotideos, BLASTX paraproteínas) podem ser usados. Verhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov. 0 alinhamento pode serefetuado, também, manualmente por inspeção.
A menos que declarado ao contrário, os valores deidentidade/similaridade de seqüência aqui providos referem-se ao valor obtido usando GAP Version 10 usando osseguintes parâmetros: % identidade e % similaridade parauma seqüência de nucleotideos usando GAP Weight de 50 eLength Weight de 3 e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; %identidade e % similaridade para uma seqüência deaminoácidos usando GAP Weight de 8 e Length Weight de 2; ea matriz de pontuação BLOSUM62 ou qualquer programaequivalente desse. Por " programa equivalente" pretende-sequalquer programa de comparação de seqüências que, paraquaisquer duas seqüências em questão, gere um alinhamentotendo correspondências de nucleotideos ou resíduos deaminoácidos idênticas e uma identidade de seqüênciapercentual idêntica quando comparado ao alinhamentocorrespondente gerado por GAP Version 10.
GAP usa o algoritmo de Needleman and Wunsch (1970) J.Mol. Biol. 48: 443-453, para encontrar o alinhamento deduas seqüências completas que maximiza o número decorrespondências e minimiza o número de espaços. GAPconsidera todos alinhamentos possíveis e posições de espaçopossíveis e cria o alinhamento com o maior número de basescom correspondência e o menor de espaços. Isto permite aprovisão de uma penalidade por criação de espaços e umapenalidade por extensão de espaços em unidades de bases comcorrespondência. GAP deve fazer um saldo de número depenalidade de criação de espaços de correspondências paracada espaço que insere. Se uma penalidade por extensão deespaço maior que zero é escolhida, GAP deve,adicionalmente, fazer um saldo para cada espaço inserido docomprimento do espaço vezes a penalidade por extensão deespaço. Valores padrão de penalidade de criação de espaçose valores de penalidade de extensão de espaços na Versão 10do pacote de software Wisconsin Genetics Software Packagepara seqüências de proteínas são 8 e 2, respectivamente.
Para seqüências de nucleotideos a penalidade padrão paracriação de espaço é de 50, enquanto a penalidade padrão porextensão de espaço é de 3. As penalidades de criação eextensão de espaços podem ser expressas como um númerointeiro selecionado do grupo de números inteirosconsistindo de 0 a 200. Assim, por exemplo, as penalidadesde criação e extensão de espaços podem ser 0, 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65 ou maiores.
GAP apresenta um membro da família de alinhamentosótimos. Podem existir vários membros dessa família, masnenhum outro membro possui uma melhor qualidade. GAPapresenta quatro figuras de mérito para alinhamentos:Quality, Ratio, Identityr e Similarity. A Quality é amétrica maximizada para alinhar as seqüências. Ratio é aquality divida pelo número de bases no segmento mais curto.Percent Identity é a porcentagem dos símbolos que de fatose correspondem. Percent Similarity é o percentual dossímbolos que são similares. Os símbolos que estão atravésdos espaços são ignorados. Uma similaridade é pontuadaquando o valor da matriz de pontuação para um par desímbolos é maior ou igual a 0,50, o limite de similaridade.A matriz de pontuação usada na Versão 10 do pacote desoftware GCG Wisconsin Genetics Software Package é BLOSUM62(ver Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 89:10915) .
(c) Como aqui usado, "identidade de seqüência", ou"identidade", no contexto de duas seqüências de ácidosnucléicos ou polipeptídicas, faz referência aos resíduosnas duas seqüências' que são as mesmas quando alinhadas paracorrespondência máxima sobre uma janela de comparaçãoespecífica. Quando a porcentagem de identidade de seqüênciaé usada em referência a proteínas, é reconhecido queposições de resíduos que não são idênticos, freqüentementediferem por substituições de aminoácidos conservativas,onde os resíduos de aminoácidos são substituídos por outrosresíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares(e.g., carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não mudam aspropriedades funcionais da molécula. Quando seqüênciasdiferem em substituições conservativas, a identidade deseqüência percentual pode ser ajustada para cima paracorrigir a natureza conservativa da substituição.
Seqüências que diferem por tais substituições conservativassão ditas tendo "similaridade de seqüência" ou"similaridade". Meios de fazer esse ajuste são bemconhecidos daqueles especialistas na arte. Tipicamente,isso envolve pontuar uma substituição conservativa como umaparcial, ao invés de uma falta de correspondência completa,aumentando, dessa foram, a porcentagem de identidade deseqüência. Assim, por exemplo, onde um aminoácido idênticorecebe uma pontuação de 1 e uma substituição nãoconservativa recebe uma pontuação de zero, uma substituiçãoconservativa recebe uma pontuação entre zero e 1. Apontuação de substituições conservativas é calculada, e.g.,como implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics,Mountain View, Califórnia).
(d) Como aqui usado, "porcentagem de identidade deseqüência" significa o valor determinado comparando-se duasseqüências otimamente alinhadas por uma janela decomparação, caracterizado pelo fato de que a porção daseqüência de polinucleotideos na janela de comparação podecompreender adições ou deleções (i.e., espaços), secomparada à seqüência referência (que não compreendeadições ou deleções) para alinhamento ótimo das duasseqüências. A porcentagem é calculada determinando-se onúmero de posições nas quais a base de ácido nucléico ouresíduo de aminoácido ocorre em ambas seqüências parapermitir o número de posições com correspondência,dividindo o número de posições com correspondência pelonúmero total de posições na janela de comparação, emultiplicando o resultado por 100 para produzir aporcentagem de identidade de seqüência.
O uso do termo "nucleotídeo" não pretende limitar apresente invenção a nucleotídeos compreendendo DNA.Aqueles de conhecimento ordinário na arte reconhecerão quenucleotídeos podem compreender ribonucleotídeos ecombinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos.Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluemambas moléculas naturalmente ocorrentes e análogossintéticos. Os nucleotídeos da invenção também englobamtodas formas de seqüências incluindo, mas não limitado a,formas de fita simples, formas de fita dupla, haírpins,estruturas stem-and-loop, e similares.
Identidade para a seqüência da presente invençãosignificaria uma seqüência de polinucleotideos tendo pelomenos 65% de identidade de seqüência, maispreferencialmente pelo menos 70% de identidade deseqüência, mais preferencialmente pelo menos 75% deidentidade de seqüência, mais preferencialmente pelo menos80% de identidade, mais preferencialmente pelo menos 85%86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98%, 99% de identidade de seqüência.
Regiões promotoras podem ser prontamente identificadaspor um especialista na arte. O códon de inicio putativocontendo o motivo ATG é identificado e acima do códon deinicio está o promotor provável. Por "promotor" pretende-seuma região reguladora de DNA compreendendo, usualmente, umTATA box capaz de direcionar RNA polimerase II para iniciara síntese de RNA no sítio de iniciação de transcriçãoapropriado para uma seqüência codificadora em particular.
Um promotor pode compreender adicionalmente outrasseqüências de reconhecimento geralmente posicionadas acimaou 5' ao TATA box, referidas como elementos promotoresacima, que influenciam a taxa de iniciação de transcrição.
É reconhecido que tendo identificado as seqüências denucleotídeos para a região promotora aqui descrita, está noestado da arte isolar e identificar elementos reguladoresadicionais na região acima do TATA box da região promotoraem particular aqui identificada. Assim, a região promotoraaqui descrita é geralmente melhor definida compreendendoelementos reguladores acima, tais como aqueles responsáveispor expressão em tecido e temporal da seqüênciacodificadora, intensificadores e similares. Da mesmamaneira, os elementos promotores que permitem a expressãono tecido desejado, tal como tecido masculino, podem seridentificados, isolados, e usados com outros promotoresnúcleo para confirmar a expressão preferencial de tecidomasculino. Por promotor núcleo, quer-se dizer a seqüênciaminima requerida para iniciar a transcrição, tal como aseqüência chamada TATA box que é comum a promotores emgenes codificando proteínas. Assim, o promotor acima deMs26 pode, opcionalmente, ser usado em conjunto com sipróprio ou promotores núcleo de outras fontes. 0 promotorpode ser nativa ou não nativo à célula na qual éencontrado.
A seqüência promotora isolada da presente invençãopode ser modificada para provir uma faixa de níveis deexpressão da seqüência de nucleotídeos heteróloga. Menosdo que toda a região promotora pode ser utilizado e ahabilidade de dirigir expressão preferencial de anteraretida. Contudo, é reconhecido que os níveis de expressãode RNAm podem ser diminuídos com deleções de porções daseqüência promotora. Assim, o promotor pode ser modificadopara ser um promotor fraco ou forte. Geralmente, por"promotor fraco" pretende-se um promotor que dirige aexpressão de uma seqüência codificadora em um nível baixo.
Por "nível baixo" pretende-se níveis de cerca de 1/10.000transcritos a cerca de 1/100.000 transcritos a cerca de1/500.000 transcritos. Em conseqüência, um promotor fortedirige a expressão de uma seqüência codificadora em umnível alto, ou a cerca de 1/10 transcritos a cerca de 1/100transcritos a cerca de 1/1.000 transcritos. Geralmente,pelo menos cerca de 30 nucleotídeos de uma seqüênciapromotora isolada serão usados para dirigir a expressão deuma seqüência de nucleotídeos. É reconhecido que paraaumentar níveis de transcrição, intensificadores podem serutilizados em combinação com as regiões promotoras dainvenção. Intensificadores são seqüências de nucleotídeosque atuam para aumentar a expressão de uma regiãopromotora. Intensificadores são conhecidos na arte eincluem a região intensificadora SV40, o elementointensificador 35S, e similares.
O promotor da presente invenção pode ser isolado daregião 5' de sua região codificadora nativa de região denão tradução 5' (5'UTR). Igualmente, o terminador pode serisolado da região 3' flanqueando seu respectivo códon deparada. 0 termo "isolado" refere-se a material, tal comoum ácido nucléico ou proteína que é substancialmente ouessencialmente livre de componentes que normalmenteacompanham ou interagem com o material, como encontrado emseu ambiente naturalmente ocorrente ou se o material estáem seu ambienta natural, o material foi alterado porintervenção humana deliberada a uma composição e/oucolocado em um lócus em uma célula, que não o lócus nativoao material. Métodos para isolamento de regiões promotorassão bem conhecidos na arte.
"Variantes funcionais" das seqüências reguladoras sãotambém englobados pelas composições da presente invenção.Variantes funcionais incluem, por exemplo, as seqüênciasreguladoras nativas da invenção tendo uma ou maissubstituições de nucleotideo, deleções ou inserções.Variantes funcionais da invenção podem ser criados pormutagênese sitio-direcionada, mutação induzida, ou podemocorrer como variantes alélicos (polimorfismos).
Como aqui usado, um "fragmento funcional" da seqüênciareguladora é uma seqüência de nucleotideos que é umaseqüência reguladora variante formada por uma ou maisdeleções de uma seqüência maior. Por exemplo, a porção 5'de um promotor até o TATA box próximo do sitio de iniciaçãode transcrição pode ser deletada sem abolir atividadespromotoras, como descrito por Opsahl-Sorteberg, H-G. etal., "Identification of a 49-bp fragment of the HvLTP2promoter directing aleruone cell specific expression" Gene341:49-58 (2004). Tais variantes deveriam reter atividadespromotoras, particularmente a habilidade de dirigir aexpressão em tecidos masculinos. A atividade pode sermedida por análise Northern blot, medições de atividade derepórter quando usando fusões transcricionais, e similares.Ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor, N.Y.), aqui incorporado por refência.
Fragmentos funcionais podem ser obtidos por uso deenzimas de restrição para clivar o seqüências denucleotideos de elemento regulador naturalmente ocorrentesaqui descritas; sintetizando uma seqüência de nucleotideosda seqüência de DNA naturalmente ocorrente; ou podem serobtidos através do uso de tecnologia de PCR , ver,particularmente, Mullis et al. (1987) Methods Enzymol.155:335-350, e Erlich, ed. (1989) PCR Technology (StocktonPress, New York).
Seqüências que hibridizam às seqüências reguladoras dapresente invenção estão no escopo da invenção. Seqüênciasque correspondem às seqüências promotoras da presenteinvenção e hibridizam às seqüências promotoras aquidescritas, serão ao menos 50% homólogas, 70% homólogas, eaté 85% 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,96%, 97%, 98%, 99% homólogas ou mais à seqüência descrita.
Fragmentos menores pode ainda conter propriedadesreguladoras do promotor então identificado e análise dedeleção é um método de identificar regiões essenciais.Análise de deleção pode ocorrer a partir de ambasextremidades 5' e 3' da região reguladora. Fragmentospodem ser obtidos por mutagênese sítio-direcionada,mutagênese usando a reação de cadeia de polimerase esimilares. (Ver, Directed Mutagenesis: A Practical
Approach IRL Press (1991)). As deleções 3' podem delineara região essencial e identificar a extremidade 3', de formaque essa região possa, então, ser operacionalmente ligada aum promotor núcleo de escolha. Uma vez que a regiãoessencial é identificada, a transcrição de um gene exógenopode ser controlada pela região essencial mais um promotornúcleo. Por promotor núcleo quer-se dizer a seqüênciachamada de TATA box que é comum a promotores em todos osgenes codificando proteínas. Assim, o promotor acima deMs26 pode ser usado, opcionalmente, em conjunção com sipróprio ou promotores núcleo de outras fontes. O promotorpode ser nativo ou não nativo à célula na qual éencontrado.
O promotor núcleo pode ser qualquer um de promotoresnúcleo conhecidos, tais como o promotor 35S ou 19S de virusde mosaico de couve-flor (U.S. Patent No. 5.352.605),promotor de ubiquitina (U.S. Patent No. 5.510.474) opromotor núcleo IN2 (U.S. Patent No. 5.364.780) ou umpromotor de virus de mosaico de erva-de-São-Pedro (Gruber,et al. "Vectors for Plant Transformation" Methods in PlantMolecular Bioloqy and Biotechnology ) et al. eds, CRC Presspp.89-119 (1993)).
A região reguladora de Ms26 foi identificada comoincluindo a região de 1005 pb acima do TATA box putativo.Ver Figura 8. Ainda, usando os procedimentos delineadosacima, foi determinado que uma região essencial do promotorinclui a região -180 pb acima do TATA box eespecificamente, a região -176 a -44 é particularmenteessencial.
Seqüências promotoras de outras plantas podem serisoladas de acordo com técnicas bem conhecidas baseadas emsua homologia de seqüência à seqüência promotora aquirelatada. Nessas técnicas, toda ou parte da seqüênciapromotora conhecida é usada como uma sonda que hibridizaseletivamente a outras seqüências presentes em umapopulação de fragmentos de DNA genômico clonados (i.e.bibliotecas genômicas) de um organismo escolhido. Métodosestão prontamente disponíveis na arte para a hibridizaçãode seqüências de ácidos nucléicos.
Toda a seqüência promotora, ou porções dessa, pode serusada como uma sonda capaz de hibridizar especificamentecom seqüências promotoras correspondentes. Para alcançarhibridização especifica sob uma variedade de condições,tais sondas incluem seqüências que são únicas e são,preferencialmente, de pelo menos cerca de 10 nucleotideosem comprimento, e mais preferencialmente de pelo menoscerca de 20 nucleotideos em comprimento. Tais sondas podemser usadas para amplificar seqüências promotorascorrespondentes de um um organismo escolhido pelo processobem conhecido de reação de cadeia de polimerase (PCR).Essa técnica pode ser usada para isolar seqüênciaspromotoras adicionais de um organismo desejado, ou como umteste de diagnóstico para determinar a presença daseqüência promotora em um organismo. Exemplos incluemrastreamento de hibridização de bibliotecas de DNA emplacas (tanto placas ou colônias; ver e.g. Innis et al.,eds., (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods andApplications, Academic Press).
Ainda, um promotor da presente invenção pode ser ligadocom seqüências de nucleotideos que não o gene Ms26 paraexpressar outras seqüências de nucleotideos heterólogas. Aseqüência de nucleotideos para o promotor da invenção,assim como fragmentos e variantes dessa, pode ser providaem cassetes de expressão junto com seqüências denucleotideos heterólogas para expressão na planta deinteresse, mais particularmente no tecido masculino daplanta. Tal cassete de expressão é provido com umapluralidade de sítios de restrição para inserção daseqüência de nucleotideos que deve estar sob a regulaçãotranscricional do promotor. Esses cassetes de expressãosão úteis na manipulação genética de qualquer planta paraalcançar uma resposta fenotípica desejada.
Exemplos de outras seqüências de nucleotideos que podemser usadas como o gene exógeno do vetor de expressão com opromotor Ms26, ou outros promotores aqui ensinados ouconhecidos daqueles especialistas na arte, ou unidadescomplementares de outros promotores aqui ensinados ouconhecidos daqueles especialistas na arte, tais comomoléculas anti-senso (RNA anti-senso de calase, RNA anti-senso de barnase e RNA anti-senso de calcone sintase, RNAanti-senso de Ms45), ribozimas e seqüências guia externas,um aptâmero ou nucleotideos de fita simples. A seqüência denucleotideos exógena pode codificar, também, enzimasdegradadoras ou modificadoras de carboidratos, amilases,enzimas desramificadoras e pectinases, tais como o gene dealfa amilase da Figura 24, auxinas, rol B, citotoxinas,toxina de difteria, DAM metilase, avidina, ou pode serselecionada de um sistema regulador procarionte. Por meiode exemplo, Mariani, et al., Nature Vol. 347; pp. 737;(1990), mostraram que a expressão no tapetum tanto de RNase-Tl de Aspergillus oryzae ou uma RNase de Bacillusamyloliquefaciens, designada "barnase," induziu a destruiçãode células do tapetum, resultando em infertilidademasculina. Quaas, et al., Eur. J. Biochem. Vol. 173: pp. 617(1988), descrevem a sintase química da RNase-Tl, enquanto aseqüência de nucleotídeos do gene de barnase é descrita emHartley, J. Molec. Biol.; Vol. 202: pp. 913 (1988). 0 generolB de Agrobacterium rhizogenes codifica uma enzima queinterfere com o metabolismo de auxin catalisando a liberaçãode Índoles livres de indoxil-B-glucosidas. Estruch, et al.,EMBO J. Vol. 11: pp. 3125 (1991) e Spena, et al., Theor.Appl. Genet.; Vol. 84: pp. 520 (1992), mostraram queexpressão específica de antera do gene rolB em tabacoresultou em plantas tendo anteras enrugadas nas quais aprodução de pólen foi severamente diminuída e gene rolB éum exemplo de um gene que é útil para o controle de produçãode pólen. Slightom, et al., J. Biol. Chem. Vol. 261: pp.108 (1985), descrevem a seqüência de nucleotídeos do generolB. Moléculas de DNA codificando o gene de toxina dedifteria podem ser obtidas a partir da American Type CultureCollection (Rockville, MD), ATCC No. 39359 or ATCC No. 67011e ver Fabijanski, et al., E.P. Appl. No. 90902754.2,"Molecular Methods of Hybrid Seed Production" para exemplose métodos de uso. 0 gene de DAM metilase é usado para causaresterilidade nos métodos discutidos em U.S. Patent No.5.689.049 e PCT/US95/15229 Cigan, A.M. and Albertsen, M.C.,"Reversible Nuclear Genetic System for Male Sterility inTransgenic Plants." Ver, também, a discussão de uso do genede avidina para causar esterilidade a U.S. Patent No.5.962.769 "Induction of Male Sterility in Plants byExpressão of High Leveis of Avidin" by Albertsen et al.
A invenção inclui vetores com o gene Ms26. Um vetor épreparado compreendendo Ms26, um promotor que irá dirigir aexpressão do gene na planta e uma região terminadora. Comonotado, o promotor no construto pode ser o promotor nativoou um promotor substituído que irá prover expressão naplanta. O promotor no construto pode ser um promoterinduzido, de forma que expressão da molécula senso ou anti-senso no construto possa ser controlada pela exposição aoindutor. Nesse sentido, quaisquer elementos promotorescompatíveis com plantas podem ser empregados no construto,influenciado pelo resultado de extremidade desejado.Aqueles pode ser promotores de genes vegetais, tais como,por exemplo, o promotor para a subunidade pequena deribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase, ou promotores deplasmídios indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens,tais como promotores de nopalina sintase e octopinasintase, ou promotores virais, tais como promotores 19S e35S de vírus de mosaico de couve-flor (CaMV) ou o promotor35S de vírus de mosaico de erva-de-São-Pedro. Ver Kay etal.r (1987) Science 236:1299 e European patent applicationNo. O 342 926; o promotor de transferência de lipídio decevada, LTP2 (Kalla et al. , Plant J. (1994) 6(6): 849-60);o promotor de ubiquitina (ver, por exemplo US patent5.510.474); e promotor END2 (Linnestad et al. US Patent6.903.205); e o promoter PG47 de poligalacturonase (VerAllen and Lonsdale, Plant J. (1993) 3:261-271; WO 94/01572;US Patent 5.412.085). Ver International application WO91/19806 para uma revisão de promotores vegetaisilustrativos adequadamente empregados na presente invenção.
A faixa de promotores compatíveis com plantasdisponíveis inclui promotores tecido-específicos einduzidos. Um elemento regulador induzido é um que é capazde diretamente, ou indiretamente, ativar a transcrição deuma ou mais seqüências de DNA ou genes em resposta a umindutor. Na ausência de um indutor as seqüências de DNA ougenes não serão transcritas. Tipicamente o fator proteínaque ser se liga especificamente a um elemento reguladorinduzido para ativar a transcrição está presente em umaforma inativa que é, então, diretamente, ou indiretamente,convertida para a forma ativa por um indutor. 0 indutorpode ser um agente químico, tal como uma proteína,metabólito, regulador de crescimento, herbicida ou compostofenólico ou um estresse fisiológico imposto diretamente porcalor, frio, sais, ou elementos tóxicos ou indiretamenteatravés da actina de um agente patógeno ou de doença, talcomo um vírus. Uma célula vegetal contendo um elementoregulador induzido pode ser exposta a um inductoraplicando-se externamente o indutor à célula ou planta, talcomo borrifando, molhando, esquentando ou métodossimilares.
Qualquer promotor induzido pode ser usado na atualinvenção. Ver, Ward et al. Plant Mol. Biol. 22: 361-366(1993). Promotores induzidos exemplares incluem promotoresde receptor de ecdisona, U.S. Patent No. 6.504.082;promotores do sistema ACEl que responde a cobre (Mett etal. PNAS 90: 4567-4571 (1993)); gene In2-1 e In2-2 de milhoque responde a herbicidas defensores de benzenosulfonamida(U.S. Patent No. 5.364.780; Hershey et al., Mol. Gen.Genetics 227: 229-237 (1991) e Gatz et al., Mol. Gen.Genetics 243: 32-38 (1994)); o promoter GST de milho, que éativado por compostos hidrofóbicos eletrofilicos que sãousados como herbicida pré-emergentes; e o promotor PR-Ia detabaco, que é ativado por ácido salicilico. Outrospromotores regulados quimicamente de interesse incluempromotores de resposta a esteróides (ver, por exemplo, opromotor induzido por glucocorticóide em Schena et al.(1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421-10425 e McNelliset al. (1998) Plant J. 14 (2): 247-257) e promotoresinduzidos por tetraciclina e reprimidos por tetraciclina(ver, por exemplo, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet.227:229-237, e U.S. Patent Nos. 5.814.618 e 5.789.156).
Promotores tecido-preferenciais podem ser utilizadospara direcionar a transcrição e/ou expressão intensificadaem um tecido vegetal em particular. Promotores podemexpressar no tecido de interesse, junto com a expressão emoutro tecido vegetal, podem expressar fortemente no tecidode interesse e em um grau bem menor em outro tecido, oupodem expressar altamente preferencialmente no tecido deinteresse. Promotores tecido-preferenciais incluem aquelesdescritos em Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254 (3):337-343Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331-1341Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 525-535Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 513-524Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773-778Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181-196; Orozcoet al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6): 1129-1138; Matsuoka etal. (1993) Proc Na tl. Acad. Sei. USA 90(20): 9586-9590; eGuevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3): 495-505. Em umavanço, os promotores são aqueles que expressam,preferencialmente, para o tecido masculino ou feminino daplanta. A invenção não requer que qualquer promotortecido-preferencial masculino em particular seja usado noprocesso, e qualquer dos vários tais promotores conhecidosde alguém especialista na arte pode ser empregado. 0promotor Ms26 nativo aqui descrito é um exemplo de umpromotor útil. Outro tal promotor é o promoter 5126, quedireciona, preferencialmente, a expressão do gene ao qualestá ligado a tecido masculino das plantas, como descritoem U.S. Patents Nos. 5.837.851 e 5.689.051. Outrosexemplos incluem o promotor Ms45 descrito em US Patent No.6.037.523; promotor SF3 descrito em U.S. Patent No.6.452.069; o promotor BS92-7 descrito em WO 02/063021; umelemento regulador SGB6 descrito em U.S. Patent No.5.470.359; o promotor TA29 (Koltunow et al. (1990)"Different temporal and spatial gene expression patternsoccur during anther development." Plant Cell 2:1201-1224;Goldberg, R. B., Beals, Τ. P. and Sanders, P. M., (1993)"Anther development: basic principies and practicalapplications" Plant Cell 5:1217-1229; e US Patent No.6.399.856); o promotor gênico tipo metalotioneina tipo 2(Charbonnel-Campaa et al., Gene (2000) 254:199-208); e opromotor Bca9 de Brassica (Lee et al., Plant Cell Rep.(2003) 22:268-213).
Promotores preferenciais de gameta masculino incluem opromotor PG47, supra assim como promotor ZM13 (Hamilton etal., Plant Mol. Biol. (1998) 38:663-669); promotores defator de despolimerização de actina (tais como Zmabpl,Zmabp2; ver, por exemplo Lopez et al. Proc. Natl. Acad.Sei. USA (1996) 93: 7415-7420); o promotor do gene petetinatipo metilesterase de milho, ZmC5 ( Wakeley et al. PlantMol. Biol. (1998) 37:187-192); o promotor gênico perfilanteZmprol (Kovar et al. , The Plant Cell (2000) 12:583-598); ogene de ZmPSKl sulfatado pentapeptideo de fitosulfoquina (Lorbiecke et al., Journal of Experimental Botany (2005)56(417): 1805-1819); o promotor da proteína Mpcbp ligantede calmodulina (Reddy et al. J. Biol. Chem. (2000)275 (45) :35457-70) .
Outros componentes do vetor podem ser incluídos,também dependendo do uso pretendido do gene. Exemplosincluem marcadores selecionáveis, seqüências reguladoras oudiretoras, seqüências líder ou estabilizadoras, íntronsetc. Descrições gerais e exemplos de vetores de expressãovegetais e genes repórter podem ser encontrados em Gruber,et al., "Vectors for Plant Transformation" in Method inPlant Molecular Bioloqy and Biotechnology, Glick et al eds;CRC Press pp. 89-119 (1993) . A seleção de um vetor deexpressão apropriado dependerá do hospedeiro e do método deintroduzir o vetor de expressão no hospedeiro. O cassete deexpressão também incluirá no terminal 3' da seqüência denucleotideos de interesse heteróloga, uma região determinação de transcrição e tradução funcional em plantas.
A região de terminação pode ser nativa com a seqüênciapromotora de nucleotideos da presente invenção, pode sernativa com a seqüência de DNA de interesse, ou pode serderivada de outra fonte. Regiões de terminaçãoconvenientes estão disponíveis a partir do plasmídio Ti deA. tumefaciens, tais como as regiões de terminação deoctopina sintase e nopalina sintase. Ver também, Guerineauet al. Mol. Gen. Genet. 262:141-144 (1991); Proudfoot, Cell64:671-674 (1991); Sanfacon et al. Genes Dev. 5:141-149(1991); Mogen et al. Plant Cell 2:1261-1272 (1990); Munroeet al. Gene 91:151-158 (1990); Bailas et al. Nucleic AcidsRes. 17:7891-7903 (1989); Joshi et al. Nucleic Aeid Res.15:9627-9639 (1987).
Os cassetes de expressão podem conter, adicionalmente,seqüências líder 5'. Tais seqüências líder podem atuarpara intensificar a tradução. Líderes de tradução sãoconhecidos na arte e incluem, por meio de exemplo, líderesde picornavírus, líder EMCV (região não codificadora 5' deencefalomiocardite), Elroy-Stein et al. Proe. Nat. Aead.Sei. USA 86:6126-6130 (1989); líderes de potivírus, porexemplo, líder TEV (Vírus Eteh do tabaco), Allison et al.;líder MDMV (Vírus de mosaico de milho anão), Virology154:9-20 (1986); proteína ligante de imunoglobulina humanade cadeia pesada (BiP), Macejak et al. Nature 353:90-94(1991); líder não traduzido de RNAm de capa de proteína devirus de mosaico de alfafa (AMV RNA 4), Jobling et al.Nature 325:622-625 (1987); líder de vírus de mosaico detabaco (TMV), Gallie et al. (1989) Molecular Biology ofRNAr pages 237-256; e líder de vírus clorótico de milho(MCMV) Lommel et al. Virology 81:382-385 (1991) . Vertambém, Della-Cioppa et al. Plant Physiology 84:965-968(1987) . 0 cassette pode conter, também, seqüências queintensificam a tradução e/ou estabilidade de RNAm, taiscomo íntrons.
Nessas instâncias onde é desejável ter o produtoexpressado da seqüência de nucleotídeos heterólogadirecionado a uma organela em particular, particularmente oplastídio, amiloplasto, ou o retículo endoplasmático, ousecretado na superfície das células ou extracelularmente, ocassete de expressão pode compreender, adicionalmente, umaseqüência codificadora para um peptídeo de trânsito. Taispeptídeos de trânsito são bem conhecidos na arte e incluem,mas não são limitados a, o peptídeo de trânsito paraproteína carregadora de acil, a subunidade pequena deRUBISC0, EPSP sintase vegetal, peptídeo de trânsitoBrittle-I de cloroplasto de Zea mays (Nelson et al. Plantphysiol 117 (4) :1235-1252 (1998); Sullivan et al. Plant Cell3(12) : 1337-48; Sullivan et al., Planta (1995) 196 (3) :477-84; Sullivan et al., J. Biol. Chem. (1992) 267 (26) : 18999-9004) e similares. Um especialista na arte irá prontamenteapreciar as várias opções disponíveis para expressar umproduto a para uma organela em particular. Por exemplo, aseqüência de alfa amilase de cevada é freqüentemente usadapara direcionar a expressão para o retículo endoplasmático(Rogers, J. Biol. Cheia. 260:3731-3738 (1985)). 0 uso depeptídeos de trânsito é bem conhecido (e.g., ver U.S.Patents Nos. 5.717.084; 5.728.925).
Em preparando o cassete de expressão, os váriosfragmentos de DNA podem ser manipulados, de forma a proviras seqüências de DNA na orientação correta e, comoapropriado, no quadro de leitura correto. Nesse sentido,adaptadores ou ligantes podem ser empregados para juntar osfragmentos de DNA, ou outras manipulações podem serenvolvidas para provir sítios de restrição convenientes,remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição,ou similares. Para esse propósito, mutagênese in vitro,reparo de primer, restrição, anelamento, re-substituições,e.g., transições e transversões, podem ser envolvidos.
Como aqui notado, a presente invenção provê vetorescapazes de expressar genes de interesse. Em geral, osvetores deveriam ser funcionais em células vegetais.
Algumas vezes, pode ser preferível possuir vetores que sãofuncionais em E. coli ('e.g., produção de proteína paracriar anticorpos, análise de seqüência de DNA, construçãode inserções, obter quantidades de ácidos nucléicos).Vetores e procedimentos para clonagem e expressão em E.coli são discutidos em Sambrook et al. (supra).
O vetor de transformação compreendendo a seqüênciapromotora da presente invenção operacionalmente ligada auma seqüência de nucleotideos heteróloga em um cassete deexpressão, pode conter, também, pelo menos uma seqüência denucleotideos adicional para um gene a ser co-transformadono organismo. Alternativamente, a(s) seqüência(s)adicional (is) pode ser provida em outro vetor detransformação.
Genes repórter podem ser incluídos nos vetores detransformação. Exemplos de genes repórter adequadosconhecidos na arte podem ser encontrados em, por exemplo,Jefferson et al. (1991) in Plant Molecular Biology Manual,ed. Gelvin et al. (Kluwer Academic Publishers), pp. 1-33;DeWet et al. Mol. Cell. Biol. 7:725-737 (1987); Goff et al.EMBO J. 9:2517-2522 (1990); Kain et al. BioTechniques19:650-655 (1995); e Chiu et al. Current Biology 6:325-330(1996).
Genes repórter selecionáveis para seleção de célulastransformadas ou tecidos podem ser incluídos nos vetores detransformação. Esses podem incluir genes que conferemresistência a antibióticos ou resistência a herbicidas.Exemplos de genes marcadores de seleção adequados incluem,mas não são limitados a, genes codificando resistência acloramfenicol, Herrera Estrella et al. EMBO J. 2:987-992(1983); metotrexato, Herrera Estrella et al. Nature303:209-213(1983); Meijer et al. Plant Mol. Biol. 16:807-820 (1991); higromicina, Waldron et al. Plant Mol. Biol.5:103-108 (1985), Zhijian et al. Plant Science 108:219-227(1995); estreptomicina, Jones et al. Mol. Gen. Genet.210:86-91(1987); espectinomicina, Bretagne-Sagnard et al.Transgenic Res. 5:131-137 (1996); bleomicina, Hille et al.Plant Mol. Biol. 7:171-176 (1990); sulfonamida, Guerineauet al. Plant Mol. Biol. 15:127-136(1990); bromoxinil,Stalker et al. Science 242 : 419-423 (1988); glyphosate, Shawet al. Science 233:478-481(1986); e fosfinotricina, DeBlocket al. EMBO J. 6:2513-2518 (1987).
Marcadores pontuáveis ou rastreáveis podem ser tambémempregados, onde a presença da seqüência produz um produtomensurável. Exemplos incluem uma β- glucuronidase, ou geneuidA (GUS), que codifica uma enzima para a qual váriossubstratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, USPatents 5.268.463 e 5.599.670); cloramfenicol acetiltransferase (Jefferson et al. The EMBO Journal vol. 6 No.13 pp. 3901-3907); e fosfatase alcalina. Outros marcadoresrastreáveis incluem os genes antocianina/flavonóide emgeral (Ver discussão em Taylor and Briggs, The Plant Cell(1990)2:115-127) incluindo, por exemplo, um gene iR-lócus,que codifica um produto que regula a produção de pigmentosde antocianina (cor vermelha) em tecidos vegetais(Dellaporta et al., in Chromosome Structure and Function,Kluwer Academic Publishers, Appels and Gustafson eds., pp.263-282 (1988)); os genes que controlam a biossintese depigmentos flavonóides, tais como o gene Cl de milho (Kao etal., Plant Cell (1996) 8: 1171-1179; Scheffler et al. Mol.Gen. Genet. (1994) 242 : 40-48) e C2 de milho (Wienand etal., Mol. Gen. Genet. (1986) 203:202-207); o gene B(Chandler et al., Plant Cell (1989) 1:1175-1183), o gene pl(Grotewold et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA (1991)88:4587-4591; Grotewold et al., Cell (1994) 76:543-553;Sidorenko et al., Plant Mol. Biol. (1999)39:11-19); osgenes de lócus bronze (Ralston et al., Genetics (1988)119:185-197; Nash et al., Plant Cell (1990) 2(11): 1039-1049), dentre outros. Ainda exemplos adicionais demarcadores adequados incluem o gene de proteínafluorescente ciano (CYP) (Bolte et al. (2004) J. CellScience 117: 943-54 and Kato et al. (2002) Plant Physiol129: 913-42), o gene de proteína fluorescente amarela(PhiYFP™ from Evrogen; ver Bolte et al. (2004) J. CellScience 117: 943-54); um gene lux, que codifica umaluciferase, a presença do qual pode ser detectada usando,por exemplo, filme de raio-X, contagem de cintilação,espectrofotometria fluorescente, câmeras de vídeo de baixaluminosidade, câmeras contadoras de fótons ou luminometriade multipoço (Teeri et al. (1989) EMBO J. 8:343); um genede proteína fluorescente verde (GFP) (Sheen et al. , PlantJ. (1995) 8(5):777-84); e DsRed2 onde células vegetaistransformadas com o gene marcador são vermelhas em cor, e,assim, visualmente selecionáveis (Dietrich et al. (2002)Biotechniques 2 (2 ) : 286-293) . Exemplos adicionais incluemum gene p-lactamase (Sutcliffe, Proc. NatΊ. Acad. Sei.U.S.A. (1978) 75:3737), que codifica uma enzima para qualvários substratos cromogênicor são conhecidos (e.g., PADAC,uma cefalosporina cromogênica) ; um gene xylE (Zukowsky etal., Proc. Nat Ί. Acad. Sei. U.S.A. (1983) 80:1101), quecodifica uma catecol dioxigenase que pode convertercatecóis cromogênicos; um gene de α-amilase (Ikuta et al.,Biotech. (1990) 8:241); e um gene de tirosinase (Katz etal., J. Gen. Microbiol. (1983) 129:2703), que codifica umaenzima capaz de oxidar tirosina para DOPA e dopaquinona,que, ao contrário, se condensa para formar o compostomelanina facilmente detectável. Claramente, vários taismarcadores estão disponíveis a alguém especialista na arte.
0 método de transformação/transfecção não é críticopara a atual invenção; vários métodos de transformação outransfecção estão atualmente disponíveis. À medida quemétodos mais novos são disponibilizados para transformarcultivos ou outras células hospedeiras, eles podem serdiretamente aplicados. Conseqüentemente, uma largavariedade de métodos foram desenvolvidos para inserir umaseqüência de DNA no genoma de uma célula hospedeira paraobter a transcrição ou transcrito e tradução da seqüênciapara executar mudanças fenotípicas no organismo. Assim,qualquer método que prove transformação/transfecçãoeficiente pode ser empregado.
Métodos para introduzir vetores de expressão em tecidovegetal disponíveis a alguém especialista na arte sãovariados e dependerão da planta selecionada. Procedimentospara transformar uma ampla variedade de espécies vegetaissão bem conhecidos e descritos através da literatura. Ver,por exemplo, Miki et al, "Procedures for IntroducingForeign DNA into Plants" in Methods in Plant MolecularBiotechnology/ supra; Klein et al, Bio/Technology 10:268(1992); e Weising et al., Ann. Rev. Genet. 22: 421-477(1988). Por exemplo, o construto de DNA pode serintroduzido no DNA genômico da célula vegetal usandotécnicas, tais como distribuição mediada pormicroprojéteis, Klein et al. , Nature 327: 70-73 (1987);eletroporação, Fromm et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. 82:5824 (1985); precipitação de polietileno glicol (PEG),Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984);transferência direta de gene WO 85/01856 e EP No. 0 275069; transformação de protoplasto in vitro, U.S. Patent No.4,684,611; e microinjeção protoplastos de células vegetaisou calo embriogênico, Crossway, Mol. Gen. Genetics 202:179-185 (1985). Co-cultivo de tecido vegetal com Agrobacteriumtumefaciens em outra opção, onde os construtos de DNA sãocolocados em um sistema de vetor binário. Ver e.g., U.S.Patent No. 5.591.616; Ishida et al., "High EfficiencyTransformation of Maize (Zea mays L.) mediated byAgrobaeterium tumefaciens" Nature Bioteehnology 14:745-750(1996). As funções de virulência do hospedeiro deAgrobaeterium tumefaciens irá direcionar a inserção do25 construto no DNA da célula vegetal quando a célula éinfectada pelas bactérias. Ver, por exemplo Horsch et al.,Science 233: 496-498 (1984), e Fraley et al., Proc. Natl.Acad. Sei. 80: 4803 (1983).Métodos padrão para transformação de canola sãodescritos em Moloney et al. "High Efficiency Transformationof Brassica napus using Agrobacterium Vectors" Plant CellReports 8:238-242 (1989). Transformação de milho édescrita por Fromm et al, Bio/Technology 8:833 (1990) eGordon-Kamm et al, supra. Agrobacterium é primariamenteusada em dicotiledôneas, mas certas monocotiledôneas, tasicomo milho, podem ser transformadas por Agrobacterium. Versupra e U.S. Patent No. 5.550.318. Transformação de arrozé descrita por Hiei et al. , "Efficient Transformation ofRice (Oryza sativs L.) Mediated by Agrobacterium andSequence Analysis of the Boundaries of the T-DNA" The PlantJournal 6(2): 271-282 (1994, Christou et al, Trends inBioteehnology 10:239 (1992) e Lee et al, Proe. NatrI Aead.Sei. USA 88:6389 (1991). Trigo pode ser transformado portécnicas similares àquelas usadas para transformar milho ouarroz. Transformação de sorgo é descrita em Casas et al,supra e sorgo por Wan et al, Plant Physieol. 104:37 (1994).Transformação de soja é descrita em um número depublicações, incluindo U.S. Patent No. 5.015.580.
Quando referindo-se a "introdução" da seqüência denucleotideos em uma planta, pretende-se que isso ocorra pormétodos de transformação direta, tais como transformação detecido vegetal por Agrobaeterium, bombardeamento demicroprojétil, eletroporação, ou qualquer um de váriosmétodos conhecidos de alguém especialista na arte; ou, podeocorrer cruzando uma planta tendo a seqüência denucleotideos heteróloga com outra planta, de forma que aprogênie tenha a seqüência de nucleotídeos incorporada emseus genomas. Tais técnicas de cruzamento são bemconhecidas de alguém especialista na arte.
Os métodos de melhoramento vegetal aqui usados são bemconhecidos a alguém especialista na arte. Para umadiscussão de técnicas de melhoramento vegetal, ver Poehlman(1987) Breedinq Field Crops. AVI Publication Co., WestportConn. Várias das plantas que seriam mais preferidas nessemétodo são cruzadas através de técnicas que levam vantagemdo método de polinização da planta.
Métodos de cruzamento reverso podem ser usados paraintroduzir um gene nas plantas. Essa técnica foi usada pordécadas para introduzir traços em uma planta. Um exemplode uma descrição dessa e outras metodologias demelhoramento de plantas que são bem conhecidas pode serencontrado em referências, tais como Plant BreedingMethodology, edit. Neal Jensen, John Wiley & Sons, Inc.(1988). Em um protocolo típico de cruzamento reverso, avariedade original de interesse (pai recorrente) é cruzadaa uma segunda variedade (pai não recorrente) que carrega oúnico gene de interesse a ser transferido. Os descendentesresultantes desse cruzamento são, então, cruzados novamenteao pai recorrente e o processo é repetido até que umaplanta é obtida, caracterizado pelo fato e queessencialmente todas as características morfológicas efisiológicas desejadas do pai recorrente são recuperadas naplanta convertida, além do único gene transferido do painão recorrente.
Em certos avanços da invenção, é desejável manter acondição recessiva homozigota estéril masculina de umaplanta masculina estéril, quando usando uma abordagem derestauração transgênica, enquanto diminuindo o número deplantas, plantios e etapas necessárias para manutenção deplantas com tais traços. A homozigosidade é uma condiçãogenética existente quando alelos idênticos residem nos Iocicorrespondentes em cromossomos homólogos. Aheterozigosidade é uma condição genética existente quandoalelos diferentes residem nos Ioci correspondentes emcromossomos homólogos. Hemizigosidade é uma condiçãogenética existente quando existe apenas uma cópia de umgene gene (ou grupo de genes) sem duplicata no cromossomoirmão. Em um avanço, a condição recessiva homozigotaresulta em conferir na planta um traço de interesse, quepode ser qualquer traço desejado e que resulte do genótiporecessivo, tal como tolerância aumentada a seca ou frio,maturidade precoce, conteúdo de óleo ou proteínamodificado, ou qualquer de uma multitude dos vários traçosde interesse para melhoristas vegetais. Em um avanço, acondição homozigota recessiva confere esterilidademasculina na planta. Quando a seqüência que é o complementofuncional da condição homozigota é introduzida na planta(isto é, uma seqüência que, quando introduzida e expressadana planta tendo a condição homozigota recessiva, restaure acondição do tipo selvagem), fertilidade é restaurada porvirtude de restauração do fenótipo fértil de tipo selvagem.
A manutenção da condição homozigota recessiva éalcançada introduzindo um construto transgênico derestauração em uma planta que é ligado a uma seqüência queinterfere com a função ou formação de gametas masculinos daplanta para criar uma planta mantenedora ou doadora. 0transgene de restauração, na introdução em uma planta que éhomozigota recessiva para o traço genético, restaura afunção genética daquele traço, com a planta produzindoapenas pólen viável contendo uma cópia do alelo recessivo,mas não contém o transgene de restauração. 0 transgene émantido no estado hemizigótico na planta mantenedora. Portransgene, pretende-se qualquer seqüência de ácidosnucléicos que é introduzida no genoma de uma célula portécnicas de engenharia genética. Um transgene pode ser umaseqüência de DNA nativa, ou uma seqüência de DNA heteróloga(i.e., "DNA estrangeiro")· 0 termo seqüência de DNA nativarefere-se a uma seqüência de nucleotideos que énaturalmente encontrada na célula, mas que foi modificadade sua forma original. 0 pólen do mantenedor pode ser usadopara fertilizar plantas que são homozigotas para o traçorecessivo, e a progênie reterá, dessa forma, sua condiçãohomozigota recessiva. A planta mantenedora contendo oconstruto transgênico de restauração é propaganda porautofertilização, com as sementes resultantes usadas paraproduzir mais plantas que são plantas homozigotasrecessivas e conter o construto transgênico de restauração.A planta mantenedora serve como um doador de pólenpara a planta tendo o traço homozigoto recessivo. 0mantenedor é otimamente produzido a partir de uma plantatendo o traço homozigoto recessivo e que também temseqüências de nucleotideos ai introduzidas que restaurariamo traço criado pelos alelos homozigotos recessivos. Ainda,a seqüência de restauração é ligada a seqüências denucleotideos que interferem com a função ou formação degametas masculinos. O gene pode operar, para prevenir aformação de gametas masculinos, por qualquer de umavariedade de modalidades bem conhecidas, e não é limitado auma metodologia particular. Por meio de exemplo, mas nãolimitação, isso pode incluir o uso de genes que expressamum produto citotóxico para gametas masculinos (Ver, porexemplo, 5.792.853; 5.689.049; PCT/EP89/00495) ; inibir aformação de produto de outro gene importante para função ouformação de gameta masculino (Ver, U.S. Patent Nos.5.859,341; 6.297.426); combinar com outro produto gênicopara produzir uma substância prevenindo a formação oufunção de gene (Ver U.S. Patent Nos. 6.162.964;6.013.859;6.281.348; 6.399.856; 6.248.935; 6.750.868; 5.792.853); seranti-senso a ou causar co-supressão de um gene critico parafunção ou formação de gameta masculino (Ver U.S. PatentNos. 6.184.439; 5.728.926; 6.191.343; 5.728.558;5.741.684); interferir com a expressão através do uso deformações hairpin (Smith et al. (2000) Nature 407:319-320;WO 99/53050 e WO 98/53083) ou similares. Váriasseqüências de nucleotideos são conhecidas, as quais inibema formação ou função de pólen e quaisquer seqüências queconseguem esse função serão suficientes. Uma discussão degenes que podem causar impacto no desenvolvimento corretoou função, é incluída em U.S. Patent No. 6.399.856 e incluigenes dominantes negativos, tais como genes de citotoxina,genes de metilase, e genes inibidores de crescimento. Genesdominantes negativos incluem gene de cadeia de toxina A dedifteria (Czako, M. and An, G. (1991) "Expression of DNAcoding for Diptheria toxin Chain A is toxic to plant cells"Plant Physiol. 95 687-692. e Greenfield et al PNAS 80:6853(1983), Palmiter et al Cell 50:435 (1987)); mutantes dedivisão de ciclo celular, tais como CDC em milho(Colasanti, J., Tyers, M. and Sundaresan, V., "Isolationand Characterization of cDNA clones encoding a functionalP34 cdc2 homologue from Zea mays" PNAS 88, 3377-3381(1991)); o gene WT (Farmer, Α. A., Loftus, T. M., Mills, A.A., Sato, Κ. V., Neill, J., Yang, M., Tron, T., Trumpower,B. L. and Stanbridge, E. G. Hum. Mol. Genet. 3, 723-728(1994)); e P68 (Chen, J. J., Pai, J. K., Petryshyn, R.,Kuo, I., Yang, J. M., Throop, M. S., Gehrke, L. and London,I. M. "Eukaryotic translation initiation kinases" PNAS 88,315-319 (1991)).
Exemplos adicionais de genes chamados "citotóxicos"são discutidos acima e podem incluir, mas não estãolimitados a gene pelE de pectato liase, de Erwiniachrysanthermi (Kenn et al J. Bacteroil 168:595 (1986));gene T-urfl3 de genomas mitocondriais de milho cms-T (Braunet al Plant Cell 2:153 (1990); Dewey et al. PNAS 84:5374(1987)); gene de toxina CytA de Bacillus thuringiensisIsraeliensis que causa rompimento de membrana celular(McLean et al J. Bacteriol 169:1017 (1987), U.S. PatentNo. 4.918.006); DNAses, RNAses, (U.S. Patent No.5.633.441); proteases, ou gene expressando RNA anti-senso.
Um gene adequado pode codificar, também, uma proteínaenvolvida em inibir o desenvolvimento de pistil, iteraçõespólen-estigma, crescimento ou fertilização de tubo depólen, ou uma combinação dessas. Além disso, genes quetanto interferem com a acumulação normal de amido em pólenou afetam o balanço osmótico no pólen podem ser tambémadequados.
Em um avanço ilustrativo, o gene de DAM-metilase éusado, discutido supra e em US Patent Nos. 5.792.852 e5.689.049, o produto de expressão do qual catalisametilação de resíduos de adenina no DNA da planta. Adeninasmetiladas afetarão a viabilidade e célula e serãoencontrados apenas nos tecidos nos quais o gene de DAM-metilase é expressado. Em outro avanço, um gene de a-amilase pode ser usado com um promotor preferencial detecido masculino. Durante o período de germinação inicialde sementes de cereais, as células da camada de aleuronairão sintetizar α-amilase, que participa na hidrólise deamido para formar glicose e maltose, de forma a provir osnutrientes necessários para o crescimento do germe (J. C.Rogers and C. Milliman, J. Biol. Chem., 259 (19): 12234-12240, 1984; Rogers, J. C., J. Biol. Chem., 260: 3731-3738,1985) . Em um avanço, o gene de α-amilase usado pode ser ogene de α-amilase-l Zea mays. Young et al. "Cloning of anα-amylase DNAc from aleurone tissue of germinating maizeseed" Plant Physiol. 105(2) 759-760 e GenBank accession No.L25805, GI:426481). Seqüências codificando α-amilase nãosão tipicamente encontrados em células de pólen, e quando aexpressão é direcionada para tecido masculino, o resultadoé a quebra da fonte de energia para os grãos de pólen, erepressão de desenvolvimento de pólen.
Um especialista nessa área prontamente percebe que osmétodos aqui descritos são aplicáveis a qualquer outroscultivos que possuem o potencial de cruzamento sexuado.Por meio de exemplo, mas não limitação, isto pode incluirmilho, soja, sorgo, ou qualquer planta com a capacidade decruzamento sexuado.
Ordinariamente, para produzir mais plantas tendo acondição recessiva, pode-se cruzar a planta recessiva comoutra planta recessiva. Isso pode ser desejável para algunstraços recessivos e pode ser impossível para traçosrecessivos afetando o desenvolvimento reprodutivo.Alternativamente, poder-se-ia cruzar a planta homozigotacom uma segunda planta tendo o gene de restauração, masisso requer cruzamento adicional para segregar o gene derestauração, para novamente alcançar o estado fenotípicorecessivo. Ao invés, em um processo, a condição homozigotarecessiva pode ser mantida, enquanto cruzando-a com aplanta mantenedora. Esse método pode ser usado em qualquersituação na qual é desejado continuar a condição recessiva.Esses resultados em um sistema de custo-benefício que érelativamente fácil de operar para manter uma população deplantas homozigotas recessivas.
Um gene esporofitico é um que opera independentementedos gametas. Quando a condição homozigota recessiva é umaque produz esterilidade masculina prevenindo odesenvolvimento do esporófito masculino, a plantamantenedora, de necessidade, deve conter um construtotransgênico de restauração funcional capaz de complementara mutação e fazer a planta homozigota recessiva capaz deproduzir pólen viável. Ligar esse gene de restauraçãoesporofitico com uma segunda seqüência de nucleotideosfuncional que interfere com a função ou formação dosgametas masculinos da planta resulta em uma plantamantenedora que produz pólen contendo apenas o alelorecessivo do gene esporofitico em seu lócus nativo devido aação da segunda seqüência de nucleotideos em interferir coma formação ou função de pólen. Essa fração de pólen viávelé não transgênica, com respeito ao construto transgênico derestauração.
Ainda em um avanço adicional, um gene marcador, comodiscutido supra, pode ser provido no construto com otransgene de restauração. Por meio de exemplo semlimitação, o uso de um marcador resistente a herbicida, talcomo bar permite eliminar células não possuindo o transgenede restauração. Ainda em outro exemplo, quando usando ummarcador pontuável, tal como marcador fluorescente, talcomo DsRed2, qualquer transmissão inadvertida do transgenepode ser também detectada visualmente, e tais escapeseliminados da progênie. Claramente, várias outrasvariações no construto de restauração estão disponíveis aalguém especialista na arte.
Em um avanço ilustrativo, é provido um método demanter uma condição homozigota recessiva de uma plantaestéril masculina em um lócus genético, no qual é empregadauma primeira seqüência de nucleotídeos que é um genecrítico para fertilidade masculina, uma segunda seqüênciade nucleotídeos que inibe a função ou formação de gametasmasculinos viáveis, uma terceira seqüência de nucleotídeosopcional que é operacionalmente ligada à primeira seqüênciae preferencialmente expressa a seqüência em célulasvegetais masculinas, uma quarta seqüência de nucleotídeosopcional operacionalmente ligada à quarta seqüência denucleotídeos, a quarta seqüência dirigindo a expressão paragametas masculinos, e uma quinta seqüência de nucleotídeosopcional que é um marcador selecionável ou pontuável,permitindo a seleção de células vegetais.
Por exemplo, é desejável produzir plantas femininasestéreis masculinas para uso no processo de produção dehíbridos que são estéreis, como um resultado de seremhomozigotos para uma mutação no gene Ms45; um gene, que écrítico para fertilidade masculina. Tal alelo mutante Ms45é designado como ms45 e uma planta que é homozigota params45 (representada pela notação ms45/ms45) apresenta ofenótipo homozigoto recessivo de esterilidade masculina enão produz pólen funcional. Ver, U.S. Patents Nos.5.478.369; 5.850.014; 6.265.640; e 5.824.524. E ambosprocessos de produção de intercruzados e híbridos, éaltamente desejado manter essa condição homozigotarecessiva. Quando seqüências codificando o gene Ms45 sãointroduzidas em uma planta tendo a condição homozigota, afertilidade masculina resulta. Pelo método da invenção, aplanta que é homozigota recessiva ms45/ms45 pode ter tidointroduzida nela um gene esporofítico Ms45 funcional, e,assim, é fértil masculina. Esse gene pode estar ligado aum gene que opera para render pólen contendo o construtotransgene de restauração não funcional ou prevenir suaformação, ou que produzir um produto letal no pólen, ligadoao promotor direcionando sua expressão para os gametasmasculinos para produzir uma planta que produziu apenaspólen contendo ms45 sem o construto transgênicos derestauração.
Um exemplo é um construto que inclui o gene Ms45,ligado com um promotor 5126, um promotor preferencial detecido masculino (Ver U.S. Patent No. 5.750.868;
5.837.851; e 5.689.051) e ainda ligado ao gene de DAMmetilase citotóxica sob controle do promotor depoligalacturonase, promotor PG47 (Ver U.S. patent No.5.792.853; 5.689.049) em uma condição hemizigótica.
Portanto, a planta resultante produz pólen, mas apenaspólen viável resulta do alelo não contendo o construto derestauração Ms45/DAM metilase e, assim, contém apenas ogene ms45. Isto pode ser, portanto, usado como umpolinizador para fertilizar a planta homozigota recessiva(ms45/ms45), e a progênie produzida continuará a sermasculina estéril como um resultado da manutenção dahomozigosidade para ms45. A progênie não conterá oconstruto transgene de restauração introduzido.
Ainda em outro exemplo de construto de restauração, ogene Ms26 é ligado com um promotor 5126, e ainda ligado aogene de α-amilase de Zea mays sob o controle do promotorPG47 preferencial de tecido masculino. 0 marcadorpontuável usado em um avanço é DS-RED EXPRESS.
Um resultado desejável do processo da invenção é que aplanta tendo a seqüência de nucleotideos restauradora possaser autofertilizada, isto é, pólen da planta transferidopara a flor da mesma planta para conseguir a propagação deplantas restauradoras. (Note que referindo a "autofertilização", inclui a situação onde a planta produzindo opólen é fertilizada com aquele mesmo pólen, e a situaçãoonde duas ou mais plantas idênticas intercruzadas sãoplantadas juntas e pólen da planta idêntica intercruzadapoliniza a planta diferente idêntica intercruzada). 0pólen não terá o construto transgene de restauração, masestará contido em 50% do óvulos (o gameta feminino) . Assementes resultantes da autofertilização podem serplantadas, e seleção feita para as sementes tendo oconstruto transgene de restauração. O processo de seleçãopode ocorrer por qualquer um de vários processosconhecidos; o mais comum onde a seqüência de nucleotideosde restauração é ligada a um gene marcador. 0 marcadorpode ser pontuável ou selecionável, e permite que aquelasplantas produzidas das sementes tendo o gene de restauraçãosejam identificadas.
Em um avanço da invenção, é possível provir que opromotor preferencial de tecido de gameta masculino sejainduzido. Controle adicional é, então, permitido noprocesso, onde assim desejado, provindo-se que a plantatendo as seqüências de nucleotideos de restauração sejaconstitutivamente estéril masculina. Esse tipo de
esterilidade masculina é relatado na U.S. Patent No.5.859.341. Para que a planta se torne fértil, a substânciaindutora deve ser provida, e a planta se tornará fértil.Novamente, quando combinado com o processo da invenção,como descrito supra, o único pólen produzido não conterá asseqüências de nucleotideos de restauração.
Descrição adicional detalhada é provida abaixo poemeio de instrução e ilustração e não pretende limitar oescopo da invenção.
EXEMPLO 1
Identificação de Co-segreqação de ms26-m2::Mu8
Famílias de plantas de uma população mutadora Mutator(Mu) foram identificadas que segregam para plantas queforam, em sua maioria, estéreis masculinas, com nenhuma ouapenas poucas anteras anormais retiradas, nenhuma das quaistinha pólen presente. Esterilidade masculina é esperadapara resultar daquelas instâncias onde um elemento Mu foialeatoriamente integrado em um gene responsável por algumaetapa em microesporogênese, rompendo sua expressão.Plantas de uma família F2 segregando, nas quais a mutaçãomasculina estéril foi designada ms.2 6 *-SBMu2 00, foramcultivadas e classificadas para fertilidade/esterilidademasculina baseada nos critérios acima. Amostras de folhasforam retiradas e DNA subseqüentemente isolado emaproximadamente 20 plantas por classificação fenotípica,que é fertilidade masculina vs. Esterilidade masculina.
Análise Southern foi efetuada para confirmar aassociação de Mu com esterilidade. Análise Southern é umatécnica bem conhecida daqueles especialistas na arte. Esseprocedimento comum envolve isolar o DNA vegetal, cortar comendonucleases de restrição, fracionar o DNA cortado porpeso molecular em um gel de agarose, e transferir paramembranas de náilon para fixar o DNA separado. Essasmembranas são subseqüentemente com um fragmento de sondaque foi radioativamente rotulado com P32P-dCTP, e lavado emuma solução SDS. Southern, E., "Detection of SpecificSequences Among DNA Fragments by Gel Electrophoresis," J.Mol. Biol. 98:503-317 (1975). Plantas de uma família F2ms26*-SBMu200 segregando foram cultivadas e classificadaspara fertilidade/esterilidade masculina. Amostras foliarese subseqüente isolamento de DNA foram conduzidas emaproximadamente 20 plantas por classificação fenotipica.DNA (~7ug) de 5 plantas férteis e 12 plantas estéreis foidigerido com EcoRI e passado por eletroforese através de umgel de agarose a 0,75%. 0 DNA digerido foi transferidopara membrana de náilon via transferência Southern. Amembrana foi hibridizada com um fragmento interno dotransposon Mu8. Auto-radiografia da membrana revelou co-segregação de um fragment EcoRI de aproximadamente 5,6 Kbcom o fenótipo de esterilidade, como mostrado na Figura 1.
Essa banda EcoRI segregou nas plantas férteis sugerindo umacondição selvagem heterozigota para o alelo.
EXEMPLO 2
Construção de Biblioteca, Rastreamento , e Mapeamento
0 processo de rastreamentos de bibliotecas genômicas écomumente conhecido dentre aqueles especialistas na arte eé descrito em Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis T., etal., Molecular Cloninq: A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory, Cold Spring Harbor Lab Press, Plainview,NY (1989). Bibliotecas foram criadas como se segue.
DNA de uma planta estéril foi digerido com EeoRI ecorrido em um gel preparativo. DNA com uma peso molecularentre 5,0 e 6,0 Kb foi excisado do gel, eletroeluido eprecipitado por etanol. Esse DNA foi ligado no vetorLambda Zap (Stratagene™) usando o protocolo do fabricante.
0 DNA ligado foi empacotado em partículas de fago usandoGigapack Gold (Stratagene™). Aproximadamente 500.000 PFUforam colocados em placas e levantados em membranas denitrocelulose. As membranas foram hibridizadas com a sondaMu 8. Um clone puro foi obtido após 3 rodadas derastreamento. A inserção foi excisada do fago como umplasmidio e designada SBMu200-3.1. Um fragmento defronteira PstI desse clone foi isolado e usado pararessondar o blot EcoRI de co-segregação original, comomostrado na Figura 2B. 0 fragmento EcoRI deaproximadamente 5,6 kb é homozigoto em todas as plantasestéreis, o que confirma que o fragmento Mu correto foiisolado. Três das plantas férteis são heterozigotas para abanda EcoRI de 5,5 kb e a banda EcoRI de 4,3 Kb. Duas dasplantas férteis são homozigotas para a banda EeoRI de 4,3kb, presumidamente o alelo do tipo selvagem.
A sonda PstI foi usada para mapear a mutação ms*-SBMu200 em uma população RFLP de mapeamento. 0 mutantemapeou a ramificação curta do cromossomo 1, próximo dolócus estéril masculino, Ms26 (Loukides et al., (1995)Amer. J. Bot 82, 1017-1023) . Para testar se í7ís*-SBMu200foi um alelo de ms26-ref, ms*-SBMu200 e ms26-ref foramcruzados um com o outro usado heterozigoto conhecido como odoador de pólen. A progênie de cruzamento teste segregoupara plantas estéreis masculinas e plantas do tipo selvagemem uma razão de 1:1, indicando alelismo entre ms*-SBMu200 ems26-ref. 0 alelo ms*-SBMu200 foi designado ms26-m2::Mu8.A localização no mapa é mostrada na Figura 13.EXEMPLO 3
Identificação e Clonagem de Alelos ms26 Adicionais
Uma mutação de inserção Mu adicional em Ms26 foiidentificada usando um primer de reação de cadeia depolimerase (PCR) para Mu e um primer especifico de genepara Ms26 e rastreando uma população de famílias Mu Fi.
Análises de seqüência dos produtos de PCR mostraram quetodas três inserções Mu ocorreram no segundo éxon (Figura1). As sementes F2 de uma dessas famílias foram cultivadase examinadas para fertilidade/esterilidade masculina.
Análises de Southern blot dessa família confirmaram a co-segregação da inserção Mu em Ms26 com o fenótipo masculinoestéril e o alelo foi designado ms26-m3::Mu.
O alelo ms26 descrito em Loukides et al.f (1995) Amer.J. Bot 82, 1017-1023 e designado ms26-ref foi tambéminvestigado. Para analisar a mutação em ms26-ref,seqüências genômicas Ms26 foram clonadas a partir deplantas ms26-ref estéreis e férteis. Ms26 foi clonada comoum fragmento EcoRI -4,2 kb e ms26-ref clonada como umfragmento HindII ~6 kb e um fragmento EcoRI -2,3 kb desobreposição a partir da planta estéril. Análise deseqüência revelou a presença de um novo segmento (1.430 pb)no último éxon do alelo ms26-ref apresentado na Figura 1.
Um sítio de duplicação hospedeiro de 8 pb (GCCGGAGC) foiencontrado que flanqueia o elemento inserido e o elementotambém contém uma repetição terminal invertida de 15 pb(TIR) (TAGGGGTGAAAACGG; SEQ ID NO: 23) . A seqüênciatransposon é apresentada na Figura 15 (SEQ ID NO: 10) . Aseqüência genômica ms26-ref em sua totalidade é apresentadana Figura 16, SEQ ID NO: 11. Um variante do alelo ms26-ref foi também encontrado. Análise de seqüência dessealelo, designou ms26'-0406, mostrou ter perdido pelo menoso segmento de 1430 pb encontrado no ultimo éxon do aleloms26-ref, mas deixou uma pegada de 8pb no sitio deinserção. Plantas homozigotas para o alelo ms26'-0406foram estéreis masculinas. Uma comparação do alelo deexcisão, ms26'- 0406 (SEQ ID NO: 8) com a região no geneMs26 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 9) é apresentada naFigura 14.
EXEMPLO 4
Análise de Expressão e Isolamento de DNAc
Análise Northern pode ser usada para detectarexpressão de características gênicas de desenvolvimento deantera em vários estados de microesporogênese. AnáliseNorthern é também uma técnica comumente usada conhecidadaqueles especialistas na arte e é similar a análiseSouthern exceto pelo RNAm, ao invés de DNA, ser isolado ecolocado no gel. O RNA é, então, hibridizado com uma sondarotulada. Potter, E., et al., "Thyrotrotropin ReleasingHormone Exerts Rapid Nuclear Effects to Increase Productionof the Primary Prolactin in RNA Transcript," Proc. Nat.Acad. Sei. USA 78:6662-6666 (1981), Lechelt, et al.,"Isolation & Molecular Analysis of the Plows,"Mol.Gen.Genet^ 219:225-234 (1989). 0 fragmento Pstl doclone SBMu200-3.1 foi usado para sondar um Northern blotcontendo RNA de grão, espiga imatura, plântula e pendão.Um sinal foi visto em RNA de pensão a aproximadamente oestágio quarteto de microesporogênese, como refletido naFigura 3. 0 transcrito é de cerca de 2,3 kb emcomprimento. A mesma sonda foi também usada para rastrearuma biblioteca de DNAc construída a partir de RNAm isoladode anteras de estágio meiótico unicelular tardio. Umclone, designado Ms26-8.1, foi isolado a partir dabiblioteca.
EXEMPLO 5
Análise de Seqüência e Expressão
O clone genômico SBMu200-3.1 e o clone de DNAc Ms26-8.1 foram seqüenciados pelo Loftstrand Labs Limited.Sanger, F., Nicklen, S., Coulson A.R. (1977) "DNAsequencing with chain terminating inhibitors" Proc. Natl.Acad. Sei. USA 7 4:54 63-54 67. As seqüências são relatadasnas Figuras 4 e 5 e a comparação está na Figura 6. Acomparação de DNAc/genômico revela cinco íntrons presentesno clone genômico. A inserção Mu8 ocorre no éxon 1. 0teste de preferência de códon e não aleatoriedade naterceira posição de cada códon foi consistente com o ORFprincipal no DNAc sendo o provável ORF codificante deproteína. Existe um códon putativo de Met de início naposição 1089 no clone genômico. A homologia de DNAc comrespeito ao clone genômico começa no nucleotideo 1094.
Assim, Ms26-8.1 não representa um clone de comprimentototal, e não possui 5 bases até o códon putativo de Met deinicio. Uma busca em base de dados revelou homologiasignificativa para enzimas P450 encontradas em leveduras,plantas e mamíferos. Enzimas P450 foram largamenteestudadas e três domínios característicos de proteínasforam elucidados. A proteína Ms2 6 contém diversos motivosestruturais característicos de P450 eucarionte, incluindo odomínio de ligação heme FxxGxRxCxG (domínio D; SEQ ID NO:24), domínio A A/GGXD/ETT/S (ligação de dioxigênio),domínio B (ligação de esteróide), e domínio C. O motivo deligação de heme altamente conservado foi encontrado em MS26como FQAGPRICLG (SEQ ID NO: 25), 51 aminoácidos a parte doterminal C. O domínio de ligação de dioxigênio AGRDTT (SEQID NO: 26) foi localizado entre os aminoácidos 320-325. 0domínio de ligação de esteróide foi encontrado comoLVYLHACVTETLR (SEQ ID NO: 27), aminoácidos 397-409. Aseqüência homóloga mais significativa detectada na base doGenebank é uma seqüência de proteínas deduzida de arroz(GeneBank accession number 19071651). A segunda seqüênciahomóloga mais alta é um gene putativo P450 de Arabidopsis(CYP704B1) cuja função é também conhecida. A Figura 17Amostra um alinhamento de seqüência entre CYP704B1 (SEQ IDNO: 12) e Ms26 (SEQ ID NO: 13) . Análise de árvorefilogenética de alguns genes P450 revelou que Ms26 é maisproximamente relacionada a P450s envolvidos na ômega-hidroxilação de ácidos graxos encontrados em Arabidopsisthaliana e Vicia sativa (Figura 17B) . Acredita-se que amudança de quadro de tradução causada na mutação de excisãode ms26'-0406 destrua a atividade do domínio de ligação deheme, resultando, assim, em esterilidade. Ver a comparaçãona Figura 18 (Ms26 DNAc em SEQ ID NO: 14; região fértil deéxon 5 em SEQ ID NO: 15 e região estéril de éxon 5 em SEQID NO: 16).
Estudos de expressão adicionais foram feitos usandosonda de DNAc Ms2 6 contra um northern contendo RNAm emestágios discretos de microesporogênese. A Figura 7Amostra uma Northern blot com amostras de RNA de diferentestecidos incluindo raiz (1), folha (2), casca (3), sabugo(4), cravo de espiga (5), seda (6), embrião imaturo (7)embrião maduro (8), e pendão de, planta fértil (9), ms26-m2::Mu8 de planta estéril (10), ms26-ref de planta estéril(11) e planta fértil (12) . Um sinal de hibridização usandoDNAc de Ms2 6 foi detectado apenas em tecidos de pendão. AFigura 7B mostra uma Northern blot contendo RNAm nosestágios discretos de microesporogênese. Sinais dehibridização usando DNAc de Ms26 foram detectados a partirde estágio de meiose 11/ quarteto (4) a estágio unicelulartardio (10), com o sinal máximo sendo observado a partir doestágio unicelular inicial através do unicelular tardio(10).
EXEMPLO 6
Identificação de Promotor e suas Regiões EssenciaisUm TATA box putativo pode ser identificado poranalises de extensão de primer, como descrito por CurrentProtocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. eds;John Wiley and Sons, New York pp.4.8.1 - 4.8.5 (1987).
Regiões reguladoras de genes de antera, tais comopromotores, podem ser identificadas em subclones genômicosusando análise funcional, usualmente verificada pelaobservação de expressão de gene repórter em tecido deantera e um nivel mais baixo ou ausência de expressão degene repórter em tecido que não de antera. A possibilidadedas regiões reguladoras residirem "acima" ou em direção 5'do sitio de inicio de tradução pode ser testada subclonandoum fragmento de DNA que contém a região acima em vetores deexpressão para experimentos de expressão transiente. Éesperado que fragmentos subgenômicos menores possam conteras regiões essenciais para expressão preferencial de tecidomasculino. Por exemplo, as regiões essenciais dospromotores CaMV 19S e 35S foram identificadas em fragmentosrelativamente pequenos derivados de pedaços genômicosmaiores, como descrito em U.S. Pat. No. 5.352.605.
A seleção de um vetor de expressão apropriado com oqual se testa para expressão funcional dependerá dohospedeiro e do método de introduzir o vetor de expressãono hospedeiro, e tais métodos são bem conhecidos paraalguém especialista na arte. Para eucariontes, as regiõesno vetor incluem regiões que controlam a iniciação detranscrição e processamento de controle. Essas regiõesestão operacionalmente ligadas a um gene repórter, tal comoUidA, codificando -glucuronidase (GUS), ou luciferase.Descrições gerais e exemplos de vetores de expressãovegetais e genes repórter podem ser encontrados em Gruber,et al., "Vectors for Plant Transformation" in Methods inPlant Molecular Bioloqy and Biotechnology; Glick, et al.eds; CRC Press; pp. 89-119; (1993) . Vetores de expressãoGUS e cassetes gênicos GUS são comercialmentedisponibilizados pela Clonetech, Palo Alto, CA, enquantovetores de expressão de luciferase e cassetes gênicos deluciferase são comercialmente disponibilizados pela PromegaCorporation, Madison, WI. Plasmidios Ti e outros vetoresde Agrobacterium estão descritos em Ishida, Y., et al. ,Nature Biotechnology; Vol. 14; pp. 745-750; (1996) em U.S.Pat. No. 5.591.616 "Method for Transforming Monocotyledons"(1994).
Vetores de expressão contendo regiões reguladorasputativas localizadas nos fragmentos genômicos podem serintroduzidas em tecidos intactos, tais como anteras deestágio, embriões ou em calo. Métodos de distribuir DNAincluem bombardeamento de microprojétil, injeção de DNA,eletroporação e transferência de gene mediada porAgrobacterium (ver Gruber, et al., "Vectors for PlantTransformation," in Methods in Plant Molecular Bioloqy andBiotechnology, Glick, et al. eds.; CRC Press; (1993); U.SPat. No. 5.591.616; e Ishida, Y., et al. , NatureBiotechnoloqy; Vol. 14; pp. 745-750; (1996)). Métodosgerais de cultivar tecidos vegetais são encontrados emGruber, et al., supra e Glick, supra.
Para o teste de sistema transiente, anteras em estágioisoladas são imediatamente colocadas em meio de cultura dependão (Pareddy, D.R. and J.F. Petelino, Crop Sei. J.; Vol.29; pp. 1564-1566; (1989)) solidificado com 0,5% Phytagel(Sigma, St. Louis) ou outro meio de solidificação. 0 DNAde vetor de expressão é introduzido em 5 horas,preferencialmente por distribuição mediada pormicroprojétil com partículas de 1,2 Dm a 1000 -1100 Psi.Após a distribuição do DNA, as anteras são incubadas a 26°Cno mesmo meio de cultura de pendão por 17 horas e analisadopreparando um homogenado de tecido inteiro e testando paraGUS ou atividade de luciferase (ver Gruber, et al., supra).
Acima do provável códon de início de tradução de Ms26,1088 pb de DNA estavam presentes no clone genômico ms26-m2:: Mu 8. Fusões de tradução via um sítio NcoI construídoforam geradas com genes repórtee codificando luciferaseand D-glucuronidase para testar se esse fragmento de DNAtinha atividade promotora em testes de expressão transientede tecidos vegetais bombardeados. A atividade foidemonstrada em anteras e não em coleóptis, raízes e calos,sugerindo atividade promotora preferencial de antera ouespecífica de antera.
Um TATA box foi observado por inspeção, a cerca de 83-77 pb acima do códon de início de tradução. O clonegenômico ms26-m2::Mu8 assim inclui cerca de 1005 pb acimado possível TATA box. Para genes vegetais típicos, o iníciode transcrição está a 26-36 pb abaixo do TATA box, quedaria o RNAm de Ms26 um líder 5' não traduzido de cerca de48-58 nt. O fragmento subgenômico total ms26-m2::Mu8 de1088 pb, incluindo líder não traduzido, início detranscrição, TATA box e seqüências acima do TATA box, foi ,assim, mostrado por ser suficiente para atividadepromotoras. Ver Figura 8, que é SEQ. ID NO. 5. O TATA boxputativo (TATATCA) é sublinhado. Assim, a presenteinvenção engloba uma molécula de DNA tendo uma seqüência denucleotídeos de SEQ ID NO: 5 (ou aquelas com identidade deseqüência) e tendo a função de uma região reguladorapreferencial de tecido masculino.
Análise de deleção pode ocorrer a partir de ambasextremidades 5' e 3' da região reguladora: fragmentos podemser obtidos por mutagênese sítio direcionada, mutagêneseusando a cadeia de reação de polimerase, e similares(Directed Mutagenesis: A Practical Approach; IRL Press;(1991)) . A extremidade 3' da região reguladorapreferencial de tecido masculino pode ser delineada porproximidade ao TATA box putativo ou por deleções 3' senecessário. A região essencial pode, então, seroperacionalmente ligada a um promotor núcleo de escolha.Uma vez que a região essencial é identificada, atranscrição de um gene exógeno pode ser controlada pelaregião preferencial de tecido masculino de Ms26 mais umpromotor núcleo. O promotor núcleo pode ser qualquer um dospromotores núcleo conhecidos, tais como um promotor 35S ou19S de vírus de mosaico de couve-flor (U.S. Pat. No.5.352.605), Ubiquitina (U.S. Pat. No. 5.510.474), o promotornúcleo IN2 (U.S. Pat. No. 5.364 .780), ou um promotor devírus de mosaico de erva-de-São-Pedro (Gruber, et al.,"Vectors for Plant Transformation" in Methods in PlantMolecular Bioloqy and Biotechnology; Glick, et al. eds.; CRCPress; pp. 89-119; (1993)). Preferencialmente, o promotoré o promotor núcleo de um gene preferencial de tecidomasculino ou o promotor núcleo CaMV 35S. Maispreferencialmente, o promotor é um promotor de um genepreferencial de tecido masculino, e, em particular, opromotor núcleo Ms26.
Análise mutacional adicional, por exemplo porescaneamento de ligante, um método bem conhecido para aarte, pode identificar pequenos segmentos contendoseqüências requeridas para expressão preferencial de antera.Essas mutações podem introduzir modificações defuncionalidade, tais como nos níveis de expressão, nosincronismo de expressão, ou no tecido de expressão.Mutações podem também ser silenciosas e não ter efeitoobservável.
Os procedimentos precedentes foram usados paraidentificar regiões essenciais do promotor Ms26. Apósligar o promotor com o gene marcador de luciferase, análisede deleção foi efetuada nas regiões do promotor acima doTATA box putativo, como representado na Figura 9. 0 eixo-xdo gráfico de barras indica o número de pares de baseimediatamente acima do TATA box putativo retido em umasérie de derivados de deleção iniciando da extremidade 5'do promotor. 0 eixo-y apresenta a atividade de luciferasenormalizada como um percentual da atividade promotora decomprimento total.
Como é evidente a partir do gráfico, aproximadamente176 pb imediatamente acima do TATA box foram suficientes,quando pareadas ao promotor núcleo (TATA box putativoatravés do inicio de transcrição), mais lider 5' nãotraduzido, para expressão transiente em anteras. Emcontraste, atividade de luciferase foi mínima quando comdeleção da extremidade 5' até 91 pb acima do TATA boxputativo. Essas 176 pb acima do TATA box putativo, atravésdo líder não traduzido, podem ser consideradas um promotormínimo, que é melhor representado na Figura 10. O TATA boxestá sublinhado. Deleção no promotor de comprimento totala partir de -176 até -92 relativo ao TATA box, reduziu aatividade para cerca de 1% de tipo selvagem. Deleção de -39 até -8 não reduziu muito a atividade. Portanto, aregião -176 a -44 pb contém uma região essencial e, assim,constituiria um elemento intensificador acima conferindoexpressão em antera no promotor, ao qual nos referimos como"box de antera".
Análise de escaneamento de ligante foi conduzidaatravés do box de antera em incrementos de 9-10 pb. Aslocalidades das substituições de escaneamento de ligantenessa região são mostradas na Figura 10, e os níveis deexpressão dos mutantes relativo à seqüência de tiposelvagem são mostrados na Figura 11. 0 efeito mais drásticoem expressão transiente em anteras foi observado paramutantes LS12 e LS13, na região 52-71 pb acima do TATA boxputativo. Um efeito importante em expressão transiente emanteras foi também observado para mutantes LS06, LS07, LS08e LSlO, na região 82-131 pb acima do TATA box putativo.Seqüências no box de antera requeridas, para níveis dotipo selvagem de expressão transiente em anteras, são,assim, demonstradas na região -52 a -131 relativa ao TATAbox putativo, particularmente a região -52 a -71. Asregiões essenciais são mostradas na SEQ ID NO: 6 (Figura10) e, como comparado à seqüência genômica, SEQ ID NO: 7(Figura 5) são bases 1-1088; 830-962; 830-914; 917-962;875-954; 935-954; e 875-924.
EXEMPLO 7
Comparação de Ms26 de Sorgo, Arroz e Milho
Como notado acima, Ms26 é um gene de fertilidademasculina em milho. Quando está mutado, e feito homozigotorecessivo, esterilidade masculina irá resultar. Umortólogos de Ms26 foi identificado em sorgo. O ortólogosde sorgo do DNAc de Ms26 foi isolado usando os primers degene Ms26 de milho em uma reação de cadeia de polimerasecom DNAc de pendão de sorgo como modelo. O fragmento deDNAc resultante foi seqüenciado por métodos descritos suprae, então, comparados ao DNAc de Ms26 de milho. Comparaçõesde seqüências de nucleotideos são expostas na Figura 12 eapresentam 90% de identidade. Um ortólogo de arroz foitambém identificado e a seqüência codificadora prevista(SEQ ID NO: 17) e proteína (SEQ ID NO: 18) é relatada naFigura 19. Ela tem um intron a menos do que a de Ms26 demilho e sorgo, e as seqüências codificadoras são altamenteconservadas.
A identificação dos promotores de sorgo e arroz foiconseguida. A Figura 20 apresenta um alinhamento dopromotor de Ms26 de milho (SEQ ID NO: 5), sorgo (SEQ ID NO:19) e arroz (SEQ ID NO: 20) . As últimas três bases dopromotor de milho mostradas na figura são o ATG de iniciode tradução.
O alinhamento, como refletido na Figura 21, daproteína Ms26 de milho (SEQ ID NO: 2), proteína Ms26 dearroz (SEQ ID NO: 18) e proteína Ms26 de sorgo (SEQ ID NO:4), e uma seqüência consenso (SEQ ID NO: 21). Acomparação de seqüências de proteínas mostra que a proteínaé altamente conservada entre os ortólogos, com a proteínade arroz compartilhando 92% de similaridade e 86% deidentidade quando comparada ao ortólogo de milho. Aespecificidade de tecido prevista em arroz e sorgo é melhorrefletida em uma comparação da proteína Ms26 na base dedados de EST de sorgo e arroz, derivada de bibliotecas depanículos (flor). Seqüências de sorgo produzindoalinhamentos (GenBank accession numbers BI075441.1;ΒΙ075273.1; ΒΙ246000.1; ΒΙ246162.1; BG948686.1; ΒΙ099541.1e BG948366.1, dentre outros) todas foram seqüências depaniculo imaturo de sorgo, e seqüências mostrandoalinhamento significativo em arroz (GenBank accessionnumbers C73892.1; CR290740.1, dentre outros) foram tambémde paniculo imaturo de arroz.
Como fica evidente acima, seqüências de nucleotideosque mapeiam para a ramificação curta do cromossomo 1 dogenoma de Zea mays, no mesmo sitio do gene Ms26, ms26-m2::Mu8 e seus alelos, são genes críticos para fertilidademasculina em plantas, isto é, são necessários parafertilidade de uma planta, ou, quando mutados a partir daseqüência encontrada em uma planta fértil, causamesterilidade na planta.
EXEMPLO 8
Construção de um vetor de transformação vegetalcompreendendo um marcador selecionável, um gene Ms45 defertilidade masculina e um gene de citotoxina de pólen.
Um construto designado PHP18091, apresentado na Figura22 é feito agrupando-se os seguintes componentes de DNA:
1. O DNA de espinha dorsal de plasmídio pSBll (pSB31sem o fragmento EcoRI carregando os genes 35SGUS e35SBAR, Ishida et al., Nature Biotechnol. (1996)14:745-750). Essa espinha dorsal de DNA contémseqüências de fronteira de T-DNA e a origem dereplicação de pBR322.
O gene 35S:PAT que codifica a enzimafosfinotricina acetiltransferase (PAT) deStreptomyces viridochomagenes (nucleotideos 6-557no número de acesso A02774, Strauch et al. 1988,EP 0275957-A; SEQ ID NO: 22) sob o controletranscricional de promotor 35S (CaMV) de virus demosaico de couve-flor e terminador (nucleotideos6906-7439, e 7439-7632, respectivamente de Francket al. 1980, Cell 21: 285-294; SEQ ID NO: 23 eSEQ ID NO: 24) .
O gene 5126:Ms45 que contém a região codificadorade gene de fertilidade masculina de milho(nucleotideos 1392-3343, número de acessoAF360356, Albertsen et a Am. J. Bot. . (1993)80:16; SEQ ID NO: 25) sob o controle do promotor5126 especifico de antera de milho (nucleotideos985-1490, número de acesso 175204; SEQ ID NO:26).
O gene PG47:DAM que contém o DNA de E. coli(Adenosine-N6) região codificadora demetiltransferase (DAM) (nucleotideos 195-1132,Brooks et al., Nucleic. Acids Res (1983) 11: 837-851; SEQ ID NO: 26) dirigido pelo promotor PG47especifico de pólen de milho (nucleotideos 1-2870,número de acesso X66692, Allen and Lonsdale, PlantJ. (1993)3:261-271; SEQ ID NO: 27). A transcriçãodesse gene é terminada pelo inibidor de proteinasede batata II (PinII) terminador (nucleotideos 2-310, An et al., Plant Cell (1989) 1: 115-122; SEQID NO: 28).
Um fragmento de DNA NcoI de 3,34 kb contendoMs45:Ms45 foi clonado acima do gene 35S:PAT empUC8, criando PHP6641. Um fragmento de DNAHindIII/EcoRI de 4,7 kb contendo Ms45:Ms45-35S:PATde PHP6641 foi clonado em pSBll, criando PHP10890(Cigan et al, Sex. Plant Reprod. (2001)14: 135-142). 0 promotor Ms45 nativo em PHP10890 foisubstituído por um fragmento de HindIII/Ncol de528 bp contendo o promotor 5126 de milho, criandoPHP11943.
Um fragmento de HindIII/Ncol de 2,87 kb contendopromotor PG47 foi ligado com um fragmentoNcoI/HindIII de 0,8 kb contendo a regiãocodificadora DAM, PinII terminador eintensificador 35S que foi de PHP10404 (Unger, etal., Transgenic Res. (2001)10: 409-422), criandoum fragmento de fragmento de HindIII de 3,67 kbcontendo fusão gênica PG4 7:DAM (com ointensificador 35S) . Esse fragmento de HindIII de3,67 kbp foi, então, clonado no sítio HindIII dePHP11943, criando PHP20005. 0 intensificador 35Sem PHP20005 foi removido, criando PHP18071. 0PHP18071 foi introduzido em Agrobacterium linhagemLBA4404 carregando o plasmidio pSBl por pareamentotriparental (Ishida et al., Nature Biotechnol.(1996) 14:745-750). O co-integro de PHP18071 epSBl foi nomeado PHP18091.
EXEMPLO 9
Transformação de milho com o construto transgene derestauração do Exemplo 8.
Uma fêmea estéril masculina que foi homozigota para umalelo de excisão mutante ms45 Ac, ms45'-°>3<òl (ms45) foirepetidamente cruzada com pólen de plantas de milho tipo HiII (Armstrong 1994, In: Freeling and Walbot (eds) . TheMaize Handbook. Springer, New York, pp 663-671) resultandona introdução desse alelo ms45 em germoplasma de milho detransformação por múltiplas gerações. A fonte resultantede material para transformação consistiu de embriõessegregando (1:1 ou 3:1) para ms45 e permitida para ambostransformação diretamente em uma base ms45 homzigota paratestar a complementação genética da mutação ms45 em plantasT0. Transformação mediada por Agrobacterum foi efetuada deacordo com Zhao et al. 1999, (United States Patent number5.981.840). Genotipagem e análise molecular (integração ePTU) de transformantes foram feitas de acordo com Cigan etal., (Sex. Plant. Reprod. (2001)14:135-142 ).Transformantes com integração única e PTU completa foramselecionadas para estudos adicionais.
EXEMPLO 10
Análise de transformantes de milho.
Plantas transgênicas (T0) do Exemplo 9 foram avaliadaspara morfologia de planta inteira e analisadas paratransmissão de transgene através de ambos pólen e célulasovo. Nenhuma diferença morfológica foi observada entre asplantas transgênicas e as plantas não transgênicascontrole, exceto para o grau de fertilidade masculina.Transformantes com integração única e PTU intacta forammasculinas férteis parciais, enquanto plantas controle nãotransgênicas foram completamente masculinas estéreis,indicando que a expressão de gene Ms45 complementou ofenótipo estéril masculino de ms45 homozigoto recessivo.Isso também demonstrou que a expressão do gene DAM causouesterilidade masculina parcial eliminando os grãos de pólencarregando os transgenes. Sem o gene DAM, o transgene Ms45pôde recuperar completamente a mutação ms45 estérilmasculina (Cigan et al., Sex. Plant. Reprod. (2001) 14:135-142) . A função correta de gene DAM foi melhordeterminada por polinizações controladas entre plantastransgênicas T0 e plantas não transgênicas. Grãos de pólende plantas transgênicas T0 foram usados para polinizarplantas controle não transgênicas. Embriões imaturos foramcolhidos de espigas dessas plantas não transgênicas 18 diasapós a polinização e cultivadas tanto em meio MS ou meio MScontendo 3,0 mg/L de bialaphos (Murashige, T. and Skoog, F.A revised médium for rapid growth and bioassays withtobacco tissue cultures. Physiol. Plant (1962) 15: 437-439). 100% dos embriões foram capazes de germinar em meiode controle, enquanto nenhum dos embriões foi capaz degerminar no meio contendo 3 mg/L de bialaphos, indicandoque o construto transgene de restauração não foitransmitido através do pólen para progênie.
Além disso, pólen de plantas não transgênicas foiusado para polinizar as plantas transgênicas mantenedorasT0. Embriões imaturos foram colhidos de espigas dessasplantas transgênicas mantenedoras T0 18 dias após apolinização e cultivadas como acima, em meio controle oumeio contendo 3 mg/L de bialaphos. Todos os embriões foramcapazes de germinar em meio controle, enquanto 50% dosembriões foram capazes de germinar em meio contendobialaphos, indicando que o construto transgene derestauração foi transmitido através do óvulo para aprogênie na freqüência esperada. Os resultados de resgatesde embrião estão sumarizados nas Tabelas 1 e 2.
Tabela 1: Transmissão de Transgene através de pólen
<table>table see original document page 90</column></row><table><table>table see original document page 91</column></row><table>
Tabela 2: Transmissão de Transgene através de células ovo
<table>table see original document page 91</column></row><table>
EXEMPLO 11
Conversão de plantas T0 em diferentes linhasintercruzadas e análise de plantas Tn.
Plantas transgênicas mantenedoras T0 do Exemplo 9 foramconvertidas em diferentes bases intercruzadas através derepetido cruzamento reverso por polinização de linhasintercruzadas, tais como PH09B. Para conseguir isso, pólenproduzido por PH09B, que é a base heterozigota ms45 , foiusado para polinizar as espigas de plantas mantenedoras Tque foram homozigotas para os alelos mutantes ms45.Sementes T1 colhidas dessas plantas T0 segregaram para ambostransgenes e alelos ms45. Plantas Ti que não continham oconstruto transgene de restauração foram eliminadas porseleção por herbicida. Plantas Ti contendo transgenes foramanalisadas para base ms45 e fertilidade masculina de acordocom Cigan et al., {Sex. Plant. Reprod., (2001) 14: 135-142). Em geral, plantas Ti em condição ms45 homozigota quecontinham o construto transgene de restauração apresentaramfertilidade masculina parcial como aquela observada para asplantas T0 parentais, enquanto as plantas Ti em condiçãoms 45 homozigota contendo nenhum transgene foram estéreismasculinas completas. Isso sugeriu que o transgene Ms45continuou a funcionar corretamente em uma base genéticadiferente. Grãos de pólen de planta Ti foram examinadospara viabilidade usando coloração microscópica ehistoquimica. Grãos de pólen em diferentes estágios dedesenvolvimento foram coletados e coloridos com diacetatode fluoresceina (FDA), 4', 6-diamidino-2-fenilindola (DAPI)e brometo de etidio (EB). Cerca de 50% dos grãos de pólendas plantas transgênicas Ti perderam sua viabilidade sejulgado pela ausência de fluorescência após coloração comFDA após a primeira mitose de pólen, enquanto os grãos depólen de plantas controle não transgênicas apresentoucoloração FDA uniforme. Isso foi ainda suportado porestudos de germinação de pólen in vitro. A germinação dosgrãos de pólen das plantas Ti transgênicas foi cerca demetade daquela de plantas controle não transgênicas. Grãosde pólen de planta Ti transgênica foram usados, também,para polinizar plantas não transgênicas para testartransmissão de transgene através de pólen. Por exemplo,nenhum dos 248 embriões de uma planta não transgênicapolinizada por uma planta Ti (20118954) foi capaz degerminar em meio contendo 3 mg/l bialaphos. Essesexperimentos confirmaram, ambos, a função correta dostransgenes Ms45 e DAM em diferentes bases genéticas. Asplantas Ti com performance desejada foram usadas para opróxima repetição de cruzamento reverso usando pólen do paipaterno intercruzado, que foi heterozigoto para o aleloms45 mutante. Esse processo será repetido até a sextageração.
EXEMPLO 12
Transmissão em larga-escala e manutenção deesterilidade masculina ms45 usando o construto do Exemplo
Plantas Ti derivadas de T0 14089277, como descrito noexemplo 9, foram usadas como machos para polinizar tantoplantas do tipo selvagem ou plantas intercruzadas estéreismasculinas ms45/ms45. A progênie T2 de 10.117 descendentesdos cruzamentos com tipo selvagem e progênie T2 de 6688descendentes de cruzamentos ms45/ms45 foram avaliadas paratransmissão de transgene rastreando-se resistência aherbicida. Para ambos tipos de cruzamentos um total de16786 plantas T2 foi encontrado sendo sensitivas aherbicida, produzindo uma freqüência de não transmissão de99,89%. Todas plantas T2 de cruzamentos ms45/ms45 que nãocontinham o transgene, foram completamente estéreismasculinas, indicando que essa linha transgênica podemanter a esterilidade de ms45.
EXEMPLO 13
Construção de um vetor de transformação vegetalcompreendendo um marcador rastreável, um gene Ms26 defertilidade masculina e um gene de citotoxina de pólen.
Um construto designado PHP24101, apresentado na Figura23, é feito agrupando-se os seguintes componentes de DNA:
1. O DNA de espinha dorsal de plasmidio pSBll (pSB31sem o fragmento EcoRI carregando os genes 35SGUS e35SBAR, Ishida et al., Nature Biotechnol. (1996)14:745-750). Essa espinha dorsal de DNA contémseqüências de fronteira de T-DNA e a origem dereplicação de pBR322.
2. O gene PG4 7 PRO: ZM-AAl que contém a regiãocodificadora de alfa-amilase 1 de Zea mays, comorelatado na Figura 24. (SEQ ID NO: 26). Atranscrição desse gene é terminada por terminadorIN2-1 (U.S. Patent No. 5.364.780).
O gene Ms26 (SB200) GENOMIC (SEQ ID NO: 7) quecontém a região codificadora de gene defertilidade masculina.
LTP2:DS-RED2 (ALTl) que contém região codificadorade florescência vermelha (um variante de Discosomasp. proteína fluorescente vermelha (DsRed), daClontech mutada para remover o sítio BstEII,seqüência de códon não modificada) dirigido pelopromotor LTP2, supra.
Um fragmento de DNA EcoRV/Dral de 2,143 kbcontendo LTP2PR0:DS-RED2 (ALTl) de PHP21737 foiclonado abaixo no gene Ms26 GENOMIC em vetor SK,criando SK-Ms26 GEN0MIC-LTP2PR0:DS-RED2 (ALTl).
Um fragmento de DNA EcoRV/Dral de 2,143 kbcontendo LTP2PR0:DS-RED2 (ALTl) de PHP21737 foiclonado abaixo no gene Ms45PRO:Ms45 GENOMIC emvetor SK, criando SK-Ms45-LTP2PRO:DS-RED2 (ALTl) .
Um fragmento de DNA NotI de 5, 429 kb contendo512 6PR0: Ms45 GENOMIC-UBI:MOPAT:PINII em PHP20532foi substituído por um fragmento de DNA NotI de4,318 kb contendo Ms 45-LTP2PRO:DS-RED2 (ALTl) deSK-Ms45-LTP2PRO:DS-RED2 (ALTl), criando PHP22623.8. Um fragmento de DNA NotI de 4,318 kb contendoMs45-LTP2PRO:DS-RED2 (ALTl) em PHP22623 foisubstituído por um fragmento de DNA NotI de 5,960kb contendo Ms26 GEN0MIC-LTP2PR0:DS-RED2(ALTl) deSK-Ms26 GENOMIC-LTP2 PRO:DS-RED2 (ALTl), criandoPHP24014. O PHP24014 foi introduzido emAgrobacterium linhagem LBA4 4 04 carregando oplasmídio pSBl por Eletroforese. Co-íntegro dePHPPHP24014 e pSBl foi nomeado PHP24101.
EXEMPLO 14
Transformação de milho com o construto transgene derestauração do Exemplo13
Uma fêmea masculina estéril que foi homozigota para umalelo de excisão ms26 mutante, (ms26) foi repetidamentecruzada com pólen de plantas de milho tipo Hi II (Armstrong1994, In: Freeling and Walbot (eds). The Maize Handbook.Springer, New York, pp 663-671) resultando na introduçãodesse alelo ms26 em germoplasma de transformação de milhopor múltiplas gerações. A fonte de material resultantepara transformação consistiu de embriões segregando (1:1 ou3:1) para ms26 e permitiu ambos a transformação diretamenteem uma base homozigota ms26 e para testar a complementaçãogenética da mutação ms26 em plantas T0. Transformaçãomediada por Agrobacterum foi efetuada de acordo com Zhao etal. 1999, (United States Patent number 5.981.840).Genotipagem e análise molecular (integração e PTU) detransformantes foram feitas de acordo com Cigan et al.,(Sex. Plant. Reprod. 1(2001) 4:135-142). Transformantes comintegração única e PTU completa foram selecionadas paraestudos adicionais.
EXEMPLO 15
Análise de transformantes de milho.
Plantas transgênicas (T0) do Exemplo 14 foramavaliadas para morfologia de planta inteira e analisadaspara transmissão de transgene através do pólen. Nenhumdiferença morfológica foi observanda entre as plantastransgênicas e as plantas controle não transgênicas excetopelo grau de fertilidade masculina. Transformantes comintegração única e PTU intacta foram masculinas férteisparciais, enquanto que plantas controle não transgênicasforam completamente estéreis masculinas, indicando que aexpressão do gene Ms26 complementou o fenótipo estérilmasculino de ms26 homozigoto recessivo. Isso também sugeriuque a expressão de pólen do gene de alfa amilase (AA)causou esterilidade masculina parcial rompendo a funçãonormal dos grãos de pólen carregando os transgenes.Coloração de pólen de transformantes com iodeto de potássio(Kl), que colore grânulos de amido, mostrou queaproximadamente metade dos grãos de pólen continha amido(grãos negros, não transgênicos) e a outra metade nãocontinha amido (grãos dourados, transgênicos). A funçãocorreta do gene AA foi melhor determinada por polinizaçõescontroladas entre plantas transgênicas T0 e plantas nãotransgênicas. Os grãos Ti resultantes foram avaliados paraum fenótipo de fluorescência vermelha. Os transgenes foramtransmitidos através do pólen, então as sementes Ticonteriam os grãos vermelhos fluorescentes devido àexpressão de RFP na camada da aleurona. Para quartoeventos independentes apresentados na Tabela 3, nenhumaexpressão RFP foi encontrada nas sementes Ti, enquanto quesementes das espigas T0 (sementes T1) continhamaproximadamente 50% de grãos vermelhos fluorescentes.
Tabela 3: Transmissão de transgene através de pólen
<table>table see original document page 98</column></row><table>
Assim, pode ser visto que a invenção alcança todos osseus objetivos.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110> Requerente: PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.
<120> Titulo· MÉTODOS DE MANUTENÇÃO DE UMA CONDIÇÃO DE HOMOZIGOSE RECESSIVA DEUMA PLANTA MÉTODOS DE PRODUÇÃO DE SEMENTE A PARTIR DE UMA PLANTA APRESENTANDOGAMETAS FEMININOS E MASCULINOS, MÉTODOS DE RESTAURAÇÃO DA FERTILIDADE MASCULINAEM UMA PLANTA MACHO-ESTÉRIL, SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO ISOLADA, CASSETE DEEXPRESSÃO, CÉLULA VEGETAL E PLANTA
<130> Referência do documento: 1148CR-PCT
<140> No. do pedido de patente internacional: PCT/US2006/024273<141> Data de depósito do pedido de patente internacional: 22.06.2006
<150> No. do pedido de prioridade: US 11/166.609
<151> Data de depósito do pedido de prioridade: 24.06.2005
<160> Quantidade de SEQ ID Nos.: 36
<170> Software: PatentIn Ver. 3.3
<210> SEQ ID No: 1
<211> Comprimento: 1906
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Zea mays
<220> Características:
<221> Nome/chave: CDS
<222> Localização: (1)..(1638)
<220> Características:
<221> Nome/chave: CDS
<222> Localização: (1642) .. (1767)
<400> Seqüência: 1
gaa ttc ggc acg aggGlu Phe Gly Thr Arg1 5
ttc ttc cca cta gcaPhe Phe Pro Leu Ala20
gtc ctc tca tgg ateVal Leu Ser Trp Ile35
ggc ccg aga tca tggGly Pro Arg Ser Trp50
aac tac cac cgg atgAsn Tyr His Arg Met65
agg aca gtg acc gtcArg Thr Val Thr Val85
gaa gctGlu Ala
ggg cctGly Pro
ctg gtcLeu Val
cca gtcPro Val55
cac gacHis Asp70
gac atgAsp Met
cac ctcHis Leu
cac aagHis Lys25
cag aggGln Arg40
ate ggcIle Gly
tgg cttTrp Leu
ccg ttcPro Phe
acg ccgThr Pro10
tac ateTyr Ile
tgg ageTrp Ser
gca acgAla Thr
gtc gggVal Gly75
act tccThr Ser90
gcg acgAla Thr
gcg ctcAla Leu
ctg aggLeu Arg45
gtg gagVal Glu60
tac ctgTyr Leu
tac accTyr Thr
cca tcgPro Ser15
ctt ctgLeu Leu30
aag cagLys Gln
cag ctgGln Leu
tca cggSer Arg
tac ateTyr Ile95
cca 48Pro
gtt 96Val
aaa 144Lys
agg 192Arg
cac 240His80
gct 288Alagac ccg gtgAsp Pro Val
ccc aag ggaPro Lys Gly115
ggc ate ttcGly Ile Phe130
gcg agt ttcAla Ser Phe145
gtg ttc agaVal Phe Arg
tcc aag geaSer Lys Ala
acg ctg gacThr Leu Asp195
ctg tcg ccaLeu Ser Pro210
gcc aac ateAla Asn Ile225
aag agg ttcLys Arg Phe
aag ctc gtgLys Leu Val
gag ate gtcGlu Ile Val275
gac ate ctgAsp Ile Leu290
ggc ggc ttcGly Gly Phe305
gtg ate gccVal Ile Ala
aat gtc gagAsn Val Glu100
ate gtg tacIle Val Tyr
aac gcc gacAsn Ala Asp
gag ttc gccGlu Phe Ala150
gag tac tccGlu Tyr Ser165
ggc aaa gttGly Lys Val180
tcc ate tgcSer Ile Cys
gat ctc cccAsp Leu Pro
ate ate acgIle Ile Thr230
ttc cac gtcPhe His Val245
gac gag ttcAsp Glu Phe260
gag gtc cggGlu Val Arg
tca cgg ttcSer Arg Phe
ggg gac gatGly Asp Asp310
ggg cgg gacGly Arg Asp325
cat gtc ctcHis Val Leu105
aga tcc tacArg Ser Tyr120
ggc gag ctgGly Glu Leu135
tcc aag aacSer Lys Asn
ctg aag ctgLeu Lys Leu
gtg gac atgVal Asp Met185
aag gtt gggLys Val Gly200
gag aac ageGlu Asn Ser215
ctg cgg ttcLeu Arg Phe
ggg tca gagGly Ser Glu
acc tac ageThr Tyr Ser265
gcc age ggcAla Ser Gly280
ate gag ctgIle Glu Leu295
aag age ctcLys Ser Leu
acg acg gcgThr Thr Ala
aag act aacLys Thr Asn
atg gac gtgMet Asp Val
tgg agg aagTrp Arg Lys140
ctg agg gatLeu Arg Asp155
tcg ggt ataSer Gly Ile170
cag gaa cttGln Glu Leu
ttc ggg gtcPhe Gly Val
ttc gcg cagPhe Ala Gln220
ate gac ccgIle Asp Pro235
gcc ctc ctaAla Leu Leu250
gtg ate cgcVal Ile Arg
aaa cag gagLys Gln Glu
ggc gag gccGly Glu Ala300
cgg gac gtgArg Asp Val315
acg acg ctgThr Thr Leu330
ttc acc aatPhe Thr Asn110
ctc ctc ggtLeu Leu Gly125
cag agg aagGln Arg Lys
ttc age gccPhe Ser Ala
ctg age cagLeu Ser Gln175
tac atg aggTyr Met Arg190
gag ate ggcGlu Ile Gly205
gcg ttc gatAla Phe Asp
ctg tgg cgcLeu Trp Arg
gcg cag ageAla Gln Ser255
cgg agg aagArg Arg Lys270
aag atg aagLys Met Lys285
ggc gac gacGly Asp Asp
gtg ctc aacVal Leu Asn
tcg tgg ttcSer Trp Phe335
tac 336Tyr
gac 384Asp
acg 432Thr
att 480
Ile
160
gea 528Ala
atg 576Met
acg 624Thr
gcc 672Ala
ate 720
Ile
240
ate 768Ile
gcc 816Ala
cac 864His
ggc 912Gly
ttc 9601
Phe
320
acg 1008Thrcac atg gcc atg tcc cac ccg gac gtg gcc gag aag ctg cgc cgc gagHis Met Ala Met Ser His Pro Asp Val Ala Glu Lys Leu Arg Arg Glu340 345 350 1056
ctg tgc gcg ttc gag gcg gag cgc gcg cgc gag gag ggc gtc acg ctc 1104Leu Cys Ala Phe Glu Ala Glu Arg Ala Arg Glu Glu Gly Val Thr Leu355 360 365
gtg ctc tgc ggc ggc gct gac gcc gac gac aag gcg ttc gcc gcc cgc 1152Val Leu Cys Gly Gly Ala Asp Ala Asp Asp Lys Ala Phe Ala Ala Arg370 375 380
gtg gcg cag ttc gcg ggc ctc ctc acc tac gac age ctcggcaagctg
Val Ala Gln Phe Ala Gly Leu Leu Thr Tyr Asp Ser Leu Gly Lys Leu385 390 395 400
gtc tac ctc cac gcc tgc gtc acc gag acg ctc cgc ctg tac ccc gcc
Val Tyr Leu His Ala Cys Val Thr Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala
405 410 415
ccg gag cgg tgg ate aac gag gat ggc gcg ttc cgc aac gcg tcg ccgPro Glu Arg Trp Ile Asn Glu Asp Gly Ala Phe Arg Asn Ala Ser Pro465 470 475 480
cca cga caa ata acg ctc gtg tta caa att tgc atg cat gea tgt aagPro Arg Gln Ile Thr Leu Val Leu Gln Ile Cys Met His Ala Cys Lys560 565 570 575
1200
1248
gtc cct cag gac ccc aag ggg ate ctg gag gac gac gtg ctg ccg gac 1296
Val Pro Gln Asp Pro Lys Gly Ile Leu Glu Asp Asp Val Leu Pro Asp
420 425 430
ggg acg aag gtg agg gcc ggc ggg atg gtg acg tac gtg ccc tac tcg 1344
Gly Thr Lys Val Arg Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro Tyr Ser435 440 445
atg ggg cgg atg gag tac aac tgg ggc ccc gac gcg gcg age ttc cgg 1392
Met Gly Arg Met Glu Tyr Asn Trp Gly Pro Asp Ala Ala Ser Phe Arg450 455 460
1440
ttc aag ttc acg gcg ttc cag gcg ggg ccg agg ate tgc ctg ggc aag 1488
Phe Lys Phe Thr Ala Phe Gln Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Lys485 490 495
gac tcg gcg tac ctg cag atg aag atg gcg ctg gcc ate ctc ttc cgc 1536
Asp Ser Ala Tyr Leu Gln Met Lys Met Ala Leu Ala Ile Leu Phe Arg500 505 510
ttc tac age ttc cgg ctg ctg gag ggg cac ccg gtg cag tac cgc atg 1584
Phe Tyr Ser Phe Arg Leu Leu Glu Gly His Pro Val Gln Tyr Arg Met515 520 525
atg acc ate ctc tcc atg gcg cac ggc ctc aag gtc cgc gtc tet agg 1632
Met Thr Ile Leu Ser Met Ala His Gly Leu Lys Val Arg Val Ser Arg530 535 540
gcc gtc tga tgt cat ggc gat ttg gat atg gat ate gtc ccg ctt aat 1680
Ala Val Cys His Gly Asp Leu Asp Met Asp Ile Val Pro Leu Asn
545 550 555
1728
gga aag cga tgg gtt tca ttg gtg gct tgg ctt aag cct taaaaactcc 1777Gly Lys Arg Trp Val Ser Leu Val Ala Trp Leu Lys Pro580 585
gtcgggtctt gcgaaccacc acatcactag tgttttgtac tctactcctc agtggaagtg 1837
tagtgacagc atacaagttc atcatatata ttatcctctt tcttaaaaaa aaaaaaaaaa 1897
aaactcgag 1906
<210> SEQ ID No: 2<211> Comprimento: 54 6<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 2
Glu Phe Gly Thr Arg Glu Ala His Leu Thr Pro Ala Thr Pro Ser Pro1 5 10 15
Phe Phe Pro Leu Ala Gly Pro His Lys Tyr Ile Ala Leu Leu Leu Val20 25 30
Val Leu Ser Trp Ile Leu Val Gln Arg Trp Ser Leu Arg Lys Gln Lys35 40 45
Gly Pro Arg Ser Trp Pro Val Ile Gly Ala Thr Val Glu Gln Leu Arg50 55 60
Asn Tyr His Arg Met His Asp Trp Leu Val Gly Tyr Leu Ser Arg His65 70 75 80
Arg Thr Val Thr Val Asp Met Pro Phe Thr Ser Tyr Thr Tyr Ile Ala85 90 95
Asp Pro Val Asn Val Glu His Val Leu Lys Thr Asn Phe Thr Asn Tyr100 105 110
Pro Lys Gly Ile Val Tyr Arg Ser Tyr Met Asp Val Leu Leu Gly Asp115 120 125
Gly Ile Phe Asn Ala Asp Gly Glu Leu Trp Arg Lys Gln Arg Lys Thr130 135 140
Ala Ser Phe Glu Phe Ala Ser Lys Asn Leu Arg Asp Phe Ser Ala Ile145 150 155 160
Val Phe Arg Glu Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Gly Ile Leu Ser Gln Ala165 170 175
Ser Lys Ala Gly Lys Val Val Asp Met Gln Glu Leu Tyr Met Arg Met180 185 190
Thr Leu Asp Ser Ile Cys Lys Val Gly Phe Gly Val Glu Ile Gly Thr195 200 205
Leu Ser Pro Asp Leu Pro Glu Asn Ser Phe Ala Gln Ala Phe Asp Ala210 215 220
Ala Asn Ile Ile Ile Thr Leu Arg Phe Ile Asp Pro Leu Trp Arg Ile225 230 235 240Lys Arg Phe Phe His Val Gly Ser Glu Ala Leu Leu Ala Gln Ser Ile245 250 255
Lys Leu Val Asp Glu Phe Thr Tyr Ser Val Ile Arg Arg Arg Lys Ala260 265 270
Glu Ile Val Glu Val Arg Ala Ser Gly Lys Gln Glu Lys Met Lys His275 280 285
Asp Ile Leu Ser Arg Phe Ile Glu Leu Gly Glu Ala Gly Asp Asp Gly290 295 300
Gly Gly Phe Gly Asp Asp Lys Ser Leu Arg Asp Val Val Leu Asn Phe305 310 315 320
Val Ile Ala Gly Arg Asp Thr Thr Ala Thr Thr Leu Ser Trp Phe Thr325 330 335
His Met Ala Met Ser His Pro Asp Val Ala Glu Lys Leu Arg Arg Glu340 345 350
Leu Cys Ala Phe Glu Ala Glu Arg Ala Arg Glu Glu Gly Val Thr Leu355 360 365
Val Leu Cys Gly Gly Ala Asp Ala Asp Asp Lys Ala Phe Ala Ala Arg370 375 380
Val Ala Gln Phe Ala Gly Leu Leu Thr Tyr Asp Ser Leu Gly Lys Leu385 390 395 400
Val Tyr Leu His Ala Cys Val Thr Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala405 410 415
Val Pro Gln Asp Pro Lys Gly Ile Leu Glu Asp Asp Val Leu Pro Asp420 425 430
Gly Thr Lys Val Arg Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro Tyr Ser435 440 445
Met Gly Arg Met Glu Tyr Asn Trp Gly Pro Asp Ala Ala Ser Phe Arg450 455 460
Pro Glu Arg Trp Ile Asn Glu Asp Gly Ala Phe Arg Asn Ala Ser Pro465 470 475 480
Phe Lys Phe Thr Ala Phe Gln Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Lys485 490 495
Asp Ser Ala Tyr Leu Gln Met Lys Met Ala Leu Ala Ile Leu Phe Arg500 505 510
Phe Tyr Ser Phe Arg Leu Leu Glu Gly His Pro Val Gln Tyr Arg Met515 520 525
Met Thr Ile Leu Ser Met Ala His Gly Leu Lys Val Arg Val Ser Arg530 535 540
Ala Val545<210> SEQ ID No: 3<211> Comprimento: 494<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Sorghum sp.
<220> Características:
<221> Nome/chave: modified_base
<222> Localização: (351)
<223> Outras informações: a, c, g, t, desconhecido ou outro
<220> Características:
<221> Nome/chave: modified_base
<222> Localização: (367)
<223> Outras informações: a, c, g, t, desconhecido ou outro
<220> Características:
<221> Nome/chave: modified_base
<222> Localização: (369)
<223> Outras informações: a, c, g, t, desconhecido ou outro
<220> Características:
<221> Nome/chave: modified_base
<222> Localização: (384)
<223> Outras informações: a, c, g, t, desconhecido ou outro
<220> Características:
<221> Nome/chave: modified_base
<222> Localização: (409)
<223> Outras informações: a, c, g, t, desconhecido ou outro
<220> Características:
<221> Nome/chave: modified_base
<222> Localização: (444)
<223> Outras informações: a, c, g, t, desconhecido ou outro
<220> Características:
<221> Nome/chave: modified_base
<222> Localização: (462)
<223> Outras informações: a, c, g, t, desconhecido ou outro
<220> Características:
<221> Nome/chave: modified_base
<222> Localização: (490)
<223> Outras informações: a, c, g, t, desconhecido ou outro
<400> Seqüência: 3
ggaattcggc ttatgccgtt cacttcctac acctacatcg ctgacccggt gaatgtcgag 60
catgtcctca agactaactt caccaattac cccaaggggg acgtgtacag atcctacatg 120
gatgtgctcc tcggtgacgg catattcaac gctgacggcg agctgtggag gaagcagagg 180
aagacggcga gtttcgagtt cgcctccaag aacctgaggg atttcagtgc caatgttttc 240
agagagtact ccctgaagct gtcgggcata ctgagtcagg catccaaggc aggcaaagtt 300
gttgacatgc aggaacttta catgaggatg acactggact cgatctgcaa ngttgggttc 360
ggggtcnana tcggcacgct gtcnccggat ctccccgaga acagcttcnc ccaagcgttc 420
gatgccgcta acatcatcgt cacnctgcgg ttcatccacc cnctgtggcg catccagaag 480ttcttccccn gtca 494
<210> SEQ ID No: 4<211> Comprimento: 158<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Sorghum sp.
<220> Características:<221> Nome/chave: M0D_RES<222> Localização: (113)
<223> Outras informações: Aminoácido variável
<220> Características:<221> Nome/chave: M0D_RES<222> Localização: (119)
<223> Outras informações: Aminoácido variável
<220> Características:<221> Nome/chave: M0D_RES<222> Localização: (133)
<223> Outras informações: Aminoácido variável<400> Seqüência: 4
Met Pro Phe Thr Ser Tyr Thr Tyr Ile Ala Asp Pro Val Asn Val Glu15 10 15
His Val Leu Lys Thr Asn Phe Thr Asn Tyr Pro Lys Gly Asp Val Tyr20 25 30
Arg Ser Tyr Met Asp Val Leu Leu Gly Asp Gly Ile Phe Asn Ala Asp35 40 45
Gly Glu Leu Trp Arg Lys Gln Arg Lys Thr Ala Ser Phe Glu Phe Ala50 55 60
Ser Lys Asn Leu Arg Asp Phe Ser Ala Asn Val Phe Arg Glu Tyr Ser65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Gly Ile Leu Ser Gln Ala Ser Lys Ala Gly Lys Val85 90 95
Val Asp Met Gln Glu Leu Tyr Met Arg Met Thr Leu Asp Ser Ile Cys100 105 110
Xaa Val Gly Phe Gly Val Xaa Ile Gly Thr Leu Ser Pro Asp Leu Pro115 120 125
Glu Asn Ser Phe Xaa Gln Ala Phe Asp Ala Ala Asn Ile Ile Val Thr130 135 140
Leu Arg Phe Ile His Pro Leu Trp Arg Ile Gln Lys Phe Phe145 150 155
<210> SEQ ID No: 5<211> Comprimento: 1092<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 5
gaattccaag cgaggccctt gtagcagaga gtgttgctga tgcagtcggc ggaaatgagt 60
gcgtgctgag agcaacgctg aggggttcca gggatggcaa tggctatggc aatcggctag 120
aggtggagga caaggtggtg aggattggga gggcaaccta tggcaagttg gtgaagaggc 180acgcaatgagttttgatactaatcaatgatgggtgagacgtttcagatcaaagtgaggttcttttcacttaattcctcttcagtttttaacagactttttactggcaactttggttggcaggtcagggactctcgaggttacccaatccaagagcaccat
agatctattcgtcactcctatagtgattatgattaaatatttctttcagtccttaaattttgggttcacacaggatgtacggaacaatgtgtaccaagctcctaattgatgatcacaaaaaccatatgaaggggggtccctgctacatac
gg
agacttacacctttattccttcagcaaatacatccatgaggttcacaagacattatgcttaattgactcattttcacttgacagatttcagatggatcacaataaaaagaaggaacacaatgaaagaaattaaggttggtatacatagca
tggatgccgctggttgggcattcttgtttgagctttatctattttctcagcctttcttttcaagaaaacaaactgtcatgtttcagaactaatacttgttataaaatacaaggctaagcccttaatttggagtagcaatatccatcactt
caacaaattcacttccaatatttgacattttcatgctctctttggtccatctagactagcaattcacttttataggaacactttctggtttccaaagtctgtatcagatatcctacttgtggtcacaccacccaatatatgtagactgga
aacctttagaggctcatgttataatatgtgttgattttgggtaatttttgaactgcatgatgggttcacaaggaatggctggttgagtttgataacagaatctcattttctcgggagttaagattgtctccacctaacaacccttcatca
240300360420480540600660720780840900960102010801092
<210> SEQ ID No: 6<211> Comprimento: 267<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 6
ccccatctca ttttcttggt tggcagatca caaaaaggaa cacaaaggct aagcctccta 60cttgttcggg agttaggtca gggacaccat atgaatgaaa gaaatcttaa tttggggtca 120caccaagatt gtctctctcg aggttggggg gtccctaagg ttggtagtag caatacccaa 180tatatcacct aacaaaccca atccatgcta catacataca tagcatccat cacttgtaga 240ctggaccctt catcaagagc accatgg 267
<210> SEQ ID No: 7<211> Comprimento: 3897<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 7
gaattccaaggcgtgctgagaggtggaggaacgcaatgagttttgatactaatcaatgatgggtgagacgtttcagatcaaagtgaggttcttttcacttaattcctcttcagtttttaacagactttttactggcaactttggttggcaggtcagggactctcgaggttacccaatccaagagcaccatcagggcctcaggtggagcctagcagctgag
cgaggcccttagcaacgctgcaaggtggtgagatctattcgtcactcctatagtgattatgattaaatatttctttcagtccttaaattttgggttcacacaggatgtacggaacaatgtgtaccaagctcctaattgatgatcacaaaaaccatatgaaggggggtccctgctacatacggaggaagctcaagtacatcgaggaagcaggaactaccac
gtagcagagaaggggttccaaggattgggaagacttacacctttattccttcagcaaatacatccatgaggttcacaagacattatgcttaattgactcattttcacttgacagatttcagatggatcacaataaaaagaaggaacacaatgaaagaaattaaggttggtatacatagcacacatcacgcgcgctcctccaaaggcccgacggatgcacg
gtgttgctgagggatggcaagggcaacctatggatgccgctggttgggcattcttgtttgagctttatctattttctcagcctttcttttcaagaaaacaaactgtcatgtttcagaactaatacttgttataaaatacaaggctaagcccttaatttggagtagcaatatccatcacttcggcgacgcctggttgtcctgatcatggccactggcttgt
tgcagtcggctggctatggctggcaagttgcaacaaattcacttccaatatttgacattttcatgctctctttggtccatctagactagcaattcacttttataggaacactttctggtttccaaagtctgtatcagatatcctacttgtggtcacaccacccaatatatgtagactggaatcgccattcctcatggatcagtcatcggtcgggtacctg
ggaaatgagtaatcggctaggtgaagaggcaacctttagaggctcatgttataatatgtgttgattttgggtaatttttgaactgcatgatgggttcacaaggaatggctggttgagtttgataacagaatctcattttctcgggagttaagattgtctccacctaacaacccttcatcattcccactagctggtccagagcaacggtggtcacggcaca
60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140120012601320ggacagtgac cgtcgacatg ccgttcactttcgagcatgt cctcaagact aacttcaccatgatgttcag tcttcggaaa tcagagctgatagggaatcg tgtacagatc ctacatggacgacggcgagc tgtggaggaa gcagaggaagctgagggatt tcagcgccat tgtgttcagaagccaggcat ccaaggcagg caaagttgtgcattgccaac atgagcattt caacctgagattacatgagg atgacgctgg actccatctggctgtcgccg gatctccccg agaacagcttcgtcacgctg cggttcatcg acccgctgtgagaggccctc ctagcgcaga gcatcaagctccggaggaag gccgagatcg tcgaggcccgacatgactgt ttcgattctt cagttcatcgattatatatc cgtgtgactt gtgaggacaatgtcacggtt catcgagcta ggcgaggccgagagcctccg ggacgtggtg ctcaacttcgcgctgtcgtg gttcacgcac atggccatgtgcgagctgtg cgcgttcgag gcggagcgcggcggcggcgc tgacgccgac gacaaggcgttcctcaccta cgacagcctc ggcaagctggtccgcctgta ccccgccgtc cctcaggtgagcacagcatg cagtgagtgg acctgaatgccccaagggga tcctggagga cgacgtgctgatggtgacgt acgtgcccta ctcgatgggggcgagcttcc ggccggagcg gtggatcaacttcaagttca cggcgttcca ggcggggccgctgcagatga agatggcgct ggccatcctcgggcacccgg tgcagtaccg catgatgacccgcgtctcta gggccgtctg atgtcatggcaaaatttgca tgcatgcatg taagggaaagccttaaaaac tccgtcgggt cttgcgaaccctcagtggaa gtgtagtgac agcatacaagcggatgcttc ccgggacctt ttggagaccattctgcggcg aagttttggg ttcagagtctaaggatctga accctgaacc gaaaatggctgtcactcggg atgacgacaa gcccacaagcagacactctc ggacccctcg gcgctccgcgtggcggcacc gcgcccgccc gcctcgtgttgtacaacacc ctcatccgcg gcgccgcgcgctataaatca tggtattgta ctttattttcgtaaacacgt tcaaaattga cacaaatttaagaatgagag acaacccaaa ggttagagat
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<210> SEQ ID No: 8<211> Comprimento: 360<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 8
caggaccccaggcgggatgggacgcggcgagcaacgcgtcaggactcggctccggctgct
aggggatccttgacgtacgtgcttccggccgccgttcaaggtacctgcagggaggggcac
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gtgctgccggatggggcggaagcggtggattccaggcgggcgctggccataccgcatgat
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ggtgagggcc 60ctggggcccc 120ggcgcgttcc 180tgcctgggca 240ttctacagct 300tccatggcgc 360
<210> SEQ ID No: 9<211> Comprimento: 352
<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 9
caggacccca aggggatcct ggaggacgac gtgctgccgg acgggacgaaggcgggatgg tgacgtacgt gccctactcg atggggcgga tggagtacaagacgcggcga gcttccggcc ggagcggtgg atcaacgagg atggcgcgtttcgccgttca agttcacggc gttccaggcg gggccgagga tctgcctggggcgtacctgc agatgaagat ggcgctggcc atcctcttcc gcttctacagctggaggggc acccggtgca gtaccgcatg atgaccatcc tctccatggc
ggtgagggcc 60ctggggcccc 120ccgcaacgcg 180caaggactcg 240cttccggctg 300gc 352
<210> SEQ ID No: 10<211> Comprimento: 1440<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 10
cggagctaggtcgggaccatatacccggattacccggatatctgcaaaatagtttatatgtgtttaaacaatagactttaatctttttatcaatatttttcaccaaataggttctcaaaacccacttattaatatttcacttgttttggtactttgatgaaaattatacgaatccacagggaaatcactctgggaacttgtggtcgaacatccgatcaaaatccgtatcctagggtagga
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ggtagggtaccggatacgggcggattcgggataccgggtataaaatcataagctcgaagaccaaaatcatgtggggacttttaatattggttgtattttgtcatggattttataaaatcccatgtgaaatcatgtggcgacattttggataaagaaattaatatggccacttcttctattagtttcaacactattaaatgttgataaccaatccgtcacttaactatccggctaatatcc
ccgaaacgggtattttttagtcggatacggcccggaattcacttttacatgatctataactaaaataatgaagattatattaacttatttatgattttctttacggggacacaagatgttcattttatgtcttgaggtttcaaactagtgataatgtataatatagtcatttatttccactaatcaataccttattagtaattaatgcattatccgctcgtatccgatccgtccgtatcc
taccggatacattcgggacgagcgagtactgggtacccgtatgaaatcggtttgtagtactctaaatttaccatgtgggagcaattttcgacaacaagaaacaacatataggtgtttcttatcgaagttttatttgaatatatttatgaaaatagcctcaaacaaataatttattgcgtgttcactttacttaatttacttatccgacaagataaatatccgaatccgttgcccgttttc
ggatactgatgatacgggtaacccggtaaatttttcttttatgaagataaatcacatttttatcaaaataacttaggattgtcgacgctaattaataatatccacatataccattctactcaacataattgaatgtttatttttaattatgaaatctatggggaccataaagttacacgtcatttttacgtgcaatttcggtatccgatacggtccctgtttaaatacatacccctagcc
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<210> SEQ ID No: 11<211> Comprimento: 4182<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 11
aactgcatga cttttcactt tgggttcaca aattgactca caagaaaacatgggttcaca aattcctctt caggatgtac ttttcacttg aaactgtcataaggaatggc tcagttttta aggaacaatg tacagatttc atttcagaactggttgagtt tcagactttt tgtaccaagc tgatggatca caatacttgttgataacaga aactggcaac tcctaattga taataaaaag aataaaatacatctcatttt cttggttggc agatcacaaa aaggaacaca aaggctaagcttcgggagtt aggtcaggga caccatatga atgaaagaaa tcttaatttgaagattgtct ctctcgaggt tggggggtcc ctaaggttgg tagtagcaat
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catacatagc atccatcact tgtagactgg 540tcacatcacg ccggcgacgc catcgccatt 600cgcgctcctc ctggttgtcc tctcatggat 660gaaaggcccg agatcatggc cagtcatcgg 720ccggatgcac gactggcttg tcgggtacct 780gccgttcact tcctacacct acatcgctga 840taacttcacc aattacccca aggtaaatga 900atcagagctg aaagctgaat cgaatgtgcc 960cctacatgga cgtgctcctc ggtgacggca 1020agcagaggaa gacggcgagt ttcgagttcg 1080ttgtgttcag agagtactcc ctgaagctgt 1140gcaaagttgt ggacatgcag gtgagatcac 1200tcaacctgag acacgagagc taccttgccg 1260gactccatct gcaaggttgg gttcggggtc 1320gagaacagct tcgcgcaggc gttcgatgcc 1380gacccgctgt ggcgcatcaa gaggttcttc 1440agcatcaagc tcgtggacga gttcacctac 1500gtcgaggtcc gggccagcgg caaacaggag 1560tcagttcatc gtcttggccg ggatggacct 1620tgtgaggaca aattaaaatg ggcagatgaa 1680aggcgaggcc ggcgacgacg gcggcggctt 1740gctcaacttc gtgatcgccg ggcgggacac 1800catggccatg tcccacccgg acgtggccga 1860ggcggagcgc gcgcgcgagg agggcgtcgc 1920cgacaaggcg ttcgccgccc gcgtggcgca 1980cggcaagctg gtctacctcc acgcctgcgt 2040ccctcaggtg agcgcgcccg acacgacctc 2100ccgcagagca cagcatgcag tgagtggacc 2160cgcaggaccc caaggggatc ctggaggacg 2220ccggcgggat ggtgacgtac gtgccctact 2280ccgacgcggc gagcttccgg ccggagctag 2340gtaccggata cggatactga ttcgggacca 2400gattcgggac ggatacgggt aatacccgga 2460gagcgagtac tacccggtaa atacccggat 2520cgggtacccg ttttttcttt ttctgcaaaa 2580tatgaaatcg gatgaagata aagtttatat 2640ctttgtagta catcacattt ttgtttaaac 2700gtctaaattt atatcaaaat aatagacttt 2760tccatgtggg aacttaggat tatcttttta 2820tgcaattttc ggtcgacgct acaatatttt 2880tacaacaaga aattaataat acaccaaata 2940cacaacatat atccacatat agttctcaaa 3000tggtgtttct tccattctac tcccacttat 3060tatcgaagtt tcaacataat taatatttca 3120ttatttgaat agaatgttta tttgttttgg 3180gtatttatga attttaatta tactttgatg 3240aaatagcctc agaaatctat gaaattatac 3300taacaaataa tgggaccata aaatccacag 3360cttattgcgt gagttacacg tgaaatcact 3420cttcacttta ccatttttac gtgggaactt 3480attaatttac ttgcaatttc gtggtcgaac 3540ttatccgaca agtatccgat atccgatcaa 3600ggataaatat ccggtccctg tatccgtatc 3660ccgaatccgt tttaaataca ttagggtagg 3720cgcccgtttt cacccctagc cggagcggtg 3780gtcgccgttc aagttcacgg cgttccaggc 3840ggcgtacctg cagatgaaga tggcgctggc 3900tgctggaggg gcacccggtg cagtaccgca 3960tcaaggtccg cgtctctagg gccgtctgat 4020aatccacgac aaataacgtt cgtgttacaa 4080tgggtttcat tggtggcttg gcttaagcct 4140taaaaactcc gtcgggttct tgcgaaccac cacatcacta ga 4182
<210> SEQ ID No: 12<211> Comprimento: 505<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Arabidopsis thaliana<400> Seqüência: 12
Leu Val Ile Ala Cys Met Val Thr Ser Trp Ile Phe Leu His Arg Trp1 5 10 15
Gly Gln Arg Asn Lys Ser Gly Pro Lys Thr Trp Pro Leu Val Gly Ala20 25 30
Ala Ile Glu Gln Leu Thr Asn Phe Asp Arg Met His Asp Trp Leu Val35 40 45
Glu Tyr Leu Tyr Asn Ser Arg Thr Val Val Val Pro Met Pro Phe Thr50 55 60
Thr Tyr Thr Tyr Ile Ala Asp Pro Ile Asn Val Glu Tyr Val Leu Lys65 70 75 80
Thr Asn Phe Ser Asn Tyr Pro Lys Gly Glu Thr Tyr His Ser Tyr Met85 90 95
Glu Val Leu Leu Gly Asp Gly Ile Phe Asn Ser Asp Gly Glu Leu Trp100 105 110
Arg Lys Gln Arg Lys Thr Ala Ser Phe Glu Phe Ala Ser Lys Asn Leu115 120 125
Arg Asp Phe Ser Thr Val Val Phe Lys Glu Tyr Ser Leu Lys Leu Phe130 135 140
Thr Ile Leu Ser Gln Ala Ser Phe Lys Glu Gln Gln Val Asp Met Gln145 150 155 160
Glu Leu Leu Met Arg Met Thr Leu Asp Ser Ile Cys Lys Val Gly Phe165 170 175
Gly Val Glu Ile Gly Thr Leu Ala Pro Glu Leu Pro Glu Asn His Phe180 185 190
Ala Lys Ala Phe Asp Thr Ala Asn Ile Ile Val Thr Leu Arg Phe Ile195 200 205
Asp Pro Leu Trp Lys Met Lys Lys Phe Leu Asn Ile Gly Ser Glu Ala210 215 220
Leu Leu Gly Lys Ser Ile Lys Val Val Asn Asp Phe Thr Tyr Ser Val225 230 235 240
Ile Arg Arg Arg Lys Ala Glu Leu Leu Glu Ala Gln Val Lys His Asp245 250 255
Ile Leu Ser Arg Phe Ile Glu Ile Ser Asp Asp Pro Asp Ser Lys Glu260 265 270Thr Glu Lys Ser Leu Arg Asp Ile Val Leu Asn Phe Val Ile Ala Gly275 280 285
Arg Asp Thr Thr Ala Thr Thr Leu Thr Trp Ala Ile Tyr Met Ile Met290 295 300
Met Asn Glu Asn Val Ala Glu Lys Leu Tyr Ser Glu Leu Gln Glu Leu305 310 315 320
Glu Lys Glu Ser Ala Glu Ala Thr Asn Thr Ser Leu His Gln Tyr Asp325 330 335
Thr Glu Asp Phe Asn Ser Phe Asn Glu Lys Val Thr Glu Phe Ala Gly340 345 350
Leu Leu Asn Tyr Asp Ser Leu Gly Lys Leu His Tyr Leu His Ala Val355 360 365
Ile Thr Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Val Pro Gln Asp Pro Lys370 375 380
Gly Val Leu Glu Asp Asp Met Leu Pro Asn Gly Thr Lys Val Lys Ala385 390 395 400
Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Met Gly Arg Met Glu Tyr405 410 415
Asn Trp Gly Ser Asp Ala Ala Leu Phe Lys Pro Glu Arg Trp Leu Lys420 425 430
Asp Gly Val Phe Gln Asn Ala Ser Pro Phe Lys Phe Thr Ala Phe Gln435 440 445
Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Lys Asp Ser Ala Tyr Leu Gln Met450 455 460
Lys Met Ala Met Ala Ile Leu Cys Arg Phe Tyr Lys Phe His Leu Val465 470 475 480
Pro Asn His Pro Val Lys Tyr Arg Met Met Thr Ile Leu Ser Met Ala485 490 495
His Gly Leu Lys Val Thr Val Ser Arg500 505
<210> SEQ ID No: 13<211> Comprimento: 518<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 13
Ile Ala Leu Leu Leu Val Val Leu Ser Trp Ile Leu Val Gln Arg Trp1 5 10 15
Ser Leu Arg Lys Gln Lys Gly Pro Arg Ser Trp Pro Val Ile Gly Ala20 25 30
Thr Val Glu Gln Leu Arg Asn Tyr His Arg Met His Asp Trp Leu Val35 40 45Gly Tyr Leu Ser Arg His Arg Thr Val Thr Val Asp Met Pro Phe Thr50 55 60
Ser Tyr Thr Tyr Ile Ala Asp Pro Val Asn Val Glu His Val Leu Lys65 70 75 80
Thr Asn Phe Thr Asn Tyr Pro Lys Gly Ile Val Tyr Arg Ser Tyr Met85 90 95
Asp Val Leu Leu Gly Asp Gly Ile Phe Asn Ala Asp Gly Glu Leu Trp100 105 HO
Arg Lys Gln Arg Lys Thr Ala Ser Phe Glu Phe Ala Ser Lys Asn Leu115 120 125
Arg Asp Phe Ser Ala Ile Val Phe Arg Glu Tyr Ser Leu Lys Leu Ser130 135 140
Gly Ile Leu Ser Gln Ala Ser Lys Ala Gly Lys Val Val Asp Met Gln145 150 155 160
Glu Leu Tyr Met Arg Met Thr Leu Asp Ser Ile Cys Lys Val Gly Phe165 170 175
Gly Val Glu Ile Gly Thr Leu Ser Pro Asp Leu Pro Glu Asn Ser Phe180 185 190
Ala Gln Ala Phe Asp Ala Ala Asn Ile Ile Ile Thr Leu Arg Phe Ile195 200 205
Asp Pro Leu Trp Arg Ile Lys Arg Phe Phe His Val Gly Ser Glu Ala210 215 220
Leu Leu Ala Gln Ser Ile Lys Leu Val Asp Glu Phe Thr Tyr Ser Val225 230 235 240
Ile Arg Arg Arg Lys Ala Glu Ile Val Glu Val Arg Ala Ser Gly Lys245 250 255
Gln Glu Lys Met Lys His Asp Ile Leu Ser Arg Phe Ile Glu Leu Gly260 265 270
Glu Ala Gly Asp Asp Gly Gly Gly Phe Gly Asp Asp Lys Ser Leu Arg275 280 285
Asp Val Val Leu Asn Phe Val Ile Ala Gly Arg Asp Thr Thr Ala Thr290 295 300
Thr Leu Ser Trp Phe Thr His Met Ala Met Ser His Pro Asp Val Ala305 310 315 320
Glu Lys Leu Arg Arg Glu Leu Cys Ala Phe Glu Ala Glu Arg Ala Arg325 330 335
Glu Glu Gly Val Thr Leu Val Leu Cys Gly Gly Ala Asp Ala Asp Asp340 345 350
Lys Ala Phe Ala Ala Arg Val Ala Gln Phe Ala Gly Leu Leu Thr Tyr355 360 365Asp Ser Leu Gly Lys Leu Val Tyr Leu His Ala Cys Val Thr Glu Thr370 375 380
Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Val Pro Gln Asp Pro Lys Gly Ile Leu Glu385 390 395 400
Asp Asp Val Leu Pro Asp Gly Thr Lys Val Arg Ala Gly Gly Met Val405 410 415
Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Met Gly Arg Met Glu Tyr Asn Trp Gly Pro420 425 430
Asp Ala Ala Ser Phe Arg Pro Glu Arg Trp Ile Asn Glu Asp Gly Ala435 440 445
Phe Arg Asn Ala Ser Pro Phe Lys Phe Thr Ala Phe Gln Ala Gly Pro450 455 460
Arg Ile Cys Leu Gly Lys Asp Ser Ala Tyr Leu Gln Met Lys Met Ala465 470 475 480
Leu Ala Ile Leu Phe Arg Phe Tyr Ser Phe Arg Leu Leu Glu Gly His485 490 495
Pro Val Gln Tyr Arg Met Met Thr Ile Leu Ser Met Ala His Gly Leu500 505 510
Lys Val Arg Val Ser Arg515
<210> SEQ ID No: 14<211> Comprimento: 128<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 14
Gln Asp Pro Lys Gly Ile Leu Glu Asp Asp Val Leu Pro Asp Gly Thr1 5 10 15
Lys Val Arg Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Met Gly20 25 30
Arg Met Glu Tyr Asn Trp Gly Pro Asp Ala Ala Ser Phe Arg Pro Glu35 40 45
Arg Trp Ile Asn Glu Asp Gly Ala Phe Arg Asn Ala Ser Pro Phe Lys50 55 60
Phe Thr Ala Phe Gln Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Lys Asp Ser65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Lys Met Ala Leu Ala Ile Leu Phe Arg Phe Tyr85 90 95
Ser Phe Arg Leu Leu Glu Gly His Pro Val Gln Tyr Arg Met Met Thr100 105 110
Ile Leu Ser Met Ala His Gly Leu Lys Val Arg Val Ser Arg Ala Val115 120 125<210> SEQ ID No: 15<211> Comprimento: 128<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 15
Gln Asp Pro Lys Gly Ile Leu Glu Asp Asp Val Leu Pro Asp Gly Thr1 5 10 15
Lys Val Arg Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Met Gly20 25 30
Arg Met Glu Tyr Asn Trp Gly Pro Asp Ala Ala Ser Phe Arg Pro Glu35 40 45
Arg Trp Ile Asn Glu Asp Gly Ala Phe Arg Asn Ala Ser Pro Phe Lys50 55 60
Phe Thr Ala Phe Gln Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Lys Asp Ser65 70 75 80
Ala Tyr Leu Gln Met Lys Met Ala Leu Ala Ile Leu Phe Arg Phe Tyr85 90 95
Ser Phe Arg Leu Leu Glu Gly His Pro Val Gln Tyr Arg Met Met Thr100 105 110
Ile Leu Ser Met Ala His Gly Leu Lys Val Arg Val Ser Arg Ala Val115 120 125
<210> SEQ ID No: 16<211> Comprimento: 87<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 16
Gln Asp Pro Lys Gly Ile Leu Glu Asp Asp Val Leu Pro Asp Gly Thr1 5 10 15
Lys Val Arg Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Met Gly20 25 30
Arg Met Glu Tyr Asn Trp Gly Pro Asp Ala Ala Ser Phe Arg Pro Glu35 40 45
Ala Arg Ser Gly Gly Ser Thr Arg Met Ala Arg Ser Ala Thr Arg Arg50 55 60
Arg Ser Ser Ser Arg Arg Ser Arg Arg Gly Arg Gly Ser Ala Trp Ala65 70 75 80
Arg Thr Arg Arg Thr Cys Arg85
<210> SEQ ID No: 17<211> Comprimento: 1635<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 17
atgaagagccggaatccacatggagcctgacaactgaagaacggtgaccggagcatgtccatggatgtgcaggaagacggttcagggagtgttgtagacatttggggttgttcgacgctgaagttcttgcttcacctacaaagcaagagaggcgacgaggttcgtgatcgatgacgcacccgcgcgcgcgcgcgtggcgccacgcgtgcgatcgtggaggtacgtgccctcggccggagcttcaccgcgtatgaagatggcccgtcaagttccacctccg
ccatggaggaagctcatagcggaaccagaaactaccacagtcgacatgcctgaagaccaatgctcggtgacgagcttcgaactccctgaatgcaggaattagatcgggacccaacatcatacgtcggatcgcgtgatccgagatcaagcaggggcggcagccgggcgtgacggccgtcgcaggagggcgtagttcgcgtctgacggagacacgacgtgctactccatgggggtggctcagtccaggccggcgctcgccataccggatgattctga
agctcatgcatatcttccttagggccaagagatgcatgactttcacctcccttcaccaattggcatattcgtttgcctccgctatcaagcgttcatgagggctgtcacctcgtcacgctgagaggctctcccgccgcaagcgacatactgcttcggggaccacgacggcgcgacaagctccgcgctcgccgctgctgagcgctccgcctcccccgacggcgaggatggagcggcgacggcgccgcggatccctcttccgcgaccatcctc
atgccagtgagttgtcctcttcatggccaatggcttgtcgtacacctacataccccaaggaatgccgacgaagaacttgaattctgagccatgacactgggatctcccggcggttcatcgctcgagcagagctgagatcttcgcggttcagacaagagccacgacgctgtcggcgcgagcgacgccgccgtacgacgcggtacccggcggaccaaggtgctacaactgggggcgcgttcctgcctcggcattctacaccttccatggctc
catcattcttcatggatctttcatcggcgcagtacttgtcttgccgacccgtgaagtgtagcgagatgtggagacttcagaagcatgcaaactcgatctgagaacagcttatcctctgtggcatgaagcttgcaggctcgtcgagctcggtccgcgacgtcgtggttcactggccgcgttgcgaggcgtctggggaagcttgccgcaggagcgccggcgggccccgacgcggaacgcgtcaggactccgctcgacctcgtacggcctcaa
cccagtagcaggtccacaaggacagtggaggaaggacaggggtgaacgtccaggtcttacgaggaagcaacactgtggtgggccggcagacaaggtcgggtgcccaggcagcgtctgaagggttgatgacagccagcggcggaggccggcggtgctcaacgtacatggcgcgaggatgaggttcgcggcgggtgtacctgccccaagggggatggtgacgggcgagcttcgccgttcaagctacctccagcgaggaccacggtccgcgtc
60120180240300360420480540600660720780840900960102010801140120012601320138014401500156016201635
<210> SEQ ID No: 18<211> Comprimento: 544<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 18
Met Lys Ser Pro Met Glu Glu Ala His Ala Met Pro Val Thr Ser Phe1 5 10 15
Phe Pro Val Ala Gly Ile His Lys Leu Ile Ala Ile Phe Leu Val Val20 25 30
Leu Ser Trp Ile Leu Val His Lys Trp Ser Leu Arg Asn Gln Lys Gly35 40 45
Pro Arg Ser Trp Pro Ile Ile Gly Ala Thr Val Glu Gln Leu Lys Asn50 55 60
Tyr His Arg Met His Asp Trp Leu Val Glu Tyr Leu Ser Lys Asp Arg65 70 75 80Thr Val Thr Val Asp Met Pro Phe Thr Ser Tyr Thr Tyr Ile Ala Asp85 90 95
Pro Val Asn Val Glu His Val Leu Lys Thr Asn Phe Thr Asn Tyr Pro100 105 110
Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ser Tyr Met Asp Val Leu Leu Gly Asp Gly115 120 125
Ile Phe Asn Ala Asp Gly Glu Met Trp Arg Lys Gln Arg Lys Thr Ala130 135 140
Ser Phe Glu Phe Ala Ser Lys Asn Leu Arg Asp Phe Ser Thr Val Val145 150 155 160
Phe Arg Glu Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Ser Ile Leu Ser Gln Ala Cys165 170 175
Lys Ala Gly Arg Val Val Asp Met Gln Glu Leu Phe Met Arg Met Thr180 185 190
Leu Asp Ser Ile Cys Lys Val Gly Phe Gly Val Glu Ile Gly Thr Leu195 200 205
Ser Pro Asp Leu Pro Glu Asn Ser Phe Ala Gln Ala Phe Asp Ala Ala210 215 220
Asn Ile Ile Val Thr Leu Arg Phe Ile Asp Pro Leu Trp Arg Leu Lys225 230 235 240
Lys Phe Leu His Val Gly Ser Glu Ala Leu Leu Glu Gln Ser Met Lys245 250 255
Leu Val Asp Asp Phe Thr Tyr Ser Val Ile Arg Arg Arg Lys Ala Glu260 265 270
Ile Leu Gln Ala Arg Ala Ser Gly Lys Gln Glu Lys Ile Lys His Asp275 280 285
Ile Leu Ser Arg Phe Ile Glu Leu Gly Glu Ala Gly Gly Asp Glu Gly290 295 300
Gly Gly Ser Phe Gly Asp Asp Lys Ser Leu Arg Asp Val Val Leu Asn305 310 315 320
Phe Val Ile Ala Gly Arg Asp Thr Thr Ala Thr Thr Leu Ser Trp Phe325 330 335
Thr Tyr Met Ala Met Thr His Pro Ala Val Ala Asp Lys Leu Arg Arg340 345 350
Glu Leu Ala Ala Phe Glu Asp Glu Arg Ala Arg Glu Glu Gly Val Ala355 360 365
Leu Ala Asp Ala Ala Gly Glu Ala Ser Phe Ala Ala Arg Val Ala Gln370 375 380
Phe Ala Ser Leu Leu Ser Tyr Asp Ala Val Gly Lys Leu Val Tyr Leu385 390 395 400His Ala Cys Val Thr Glu Thr Leu Arg Leu Tyr Pro Ala Val Pro Gln405 410 415
Asp Pro Lys Gly Ile Val Glu Asp Asp Val Leu Pro Asp Gly Thr Lys420 425 430
Val Arg Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro Tyr Ser Met Gly Arg435 440 445
Met Glu Tyr Asn Trp Gly Pro Asp Ala Ala Ser Phe Arg Pro Glu Arg450 455 460
Trp Leu Ser Gly Asp Gly Gly Ala Phe Arg Asn Ala Ser Pro Phe Lys465 470 475 480
Phe Thr Ala Phe Gln Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly Lys Asp Ser485 490 495
Ala Tyr Leu Gln Met Lys Met Ala Leu Ala Ile Leu Phe Arg Phe Tyr500 505 510
Thr Phe Asp Leu Val Glu Asp His Pro Val Lys Tyr Arg Met Met Thr515 520 525
Ile Leu Ser Met Ala His Gly Leu Lys Val Arg Val Ser Thr Ser Val530 535 540
<210> SEQ ID No: 19<211> Comprimento: 436<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Sorghum sp .
<400> Seqüência: 19
aacgaatgta tcattgtgcc taaattttta aagaattgtg gacaatttct
gtttcagact ttcagtacca agctgatgga tcacattctg gatccgaagt
aatctggcaa ctcctaattg taataacaat gaataacctg caaatacagt
ctcattttct tggttggcag atcacaaaaa ggaacacaaa ggctaagcgc
gggagttagg tcatggatac catatgaatg aaagaaatct taatttccgg
attgtctctc tcaaggttgg taacagcaat acccaatata tcacctaaca
acactacata cataacatcc atcacttgga gactggaccc ttcatcaagaggaagctcac ctcatg
ggtaggctga 60atgataacat 120ataagagtgg 180caacttgtcc 240tcacaccaag 300aacccagaca 360gcaccatgga 420436
<210> SEQ ID No: 20<211> Comprimento: 450<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Oryza sativa
<400> Seqüência: 20
aagcctggtt tcagttggtg acaatttaac agaattcaga tggatatggt tctgatatta 60
gaaggtggca tacctttagt cgctgcaaac gcttcagtta tctgaacaaa acaacgaact 120
tggctgagca ggggaaaaaa atactgtagc attcattttg tgtttacatg agtaacgatt 180
cttttctagg tggacagatc acaaaaagaa aactaaagct aagatccaac tcctaagggt 240
gttaggttag ggacaccata tgaatgagac aatcttaatt cttggtcaca caaagattgt 300
ctcaaggttg gtagcatcag tgcccaatat atcacctaac tatgccatcc aaaatgctac 360
atagcatctc ttgtagactg aacccttcat gaagagcccc atggaggaag ctcatgcaat 420gccagtgaca tcattcttcc cagtagcagg
<210> SEQ ID No: 21<211> Comprimento: 543<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 21
Met Glu Glu Ala His Leu Thr Pro Ala Thr Pro Ser Pro Phe Phe Pro1 5 10 15
Leu Ala Gly Pro His Lys Tyr Ile Ala Leu Leu Leu Val Val Leu Ser20 25 30
Trp Ile Leu Val Gln Arg Trp Ser Leu Arg Lys Gln Lys Gly Pro Arg35 40 45
Ser Trp Pro Val Ile Gly Ala Thr Val Glu Gln Leu Arg Asn Tyr His50 55 60
Arg Met His Asp Trp Leu Val Gly Tyr Leu Ser Arg His Arg Thr Val65 70 75 80
Thr Val Asp Met Pro Phe Thr Ser Tyr Thr Tyr Ile Ala Asp Pro Val85 90 95
Asn Val Glu His Val Leu Lys Thr Asn Phe Thr Asn Tyr Pro Lys Gly100 105 110
Ile Val Tyr Arg Ser Tyr Met Asp Val Leu Leu Gly Asp Gly Ile Phe115 120 125
Asn Ala Asp Gly Glu Leu Trp Arg Lys Gln Arg Lys Thr Ala Ser Phe130 135 140
Glu Phe Ala Ser Lys Asn Leu Arg Asp Phe Ser Ala Ile Val Phe Arg145 150 155 160
Glu Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Gly Ile Leu Ser Gln Ala Ser Lys Ala165 170 175
Gly Lys Val Val Asp Met Gln Glu Leu Tyr Met Arg Met Thr Leu Asp180 185 190
Ser Ile Cys Lys Val Gly Phe Gly Val Glu Ile Gly Thr Leu Ser Pro195 200 205
Asp Leu Pro Glu Asn Ser Phe Ala Gln Ala Phe Asp Ala Ala Asn Ile210 215 220
Ile Ile Thr Leu Arg Phe Ile Asp Pro Leu Trp Arg Ile Lys Arg Phe225 230 235 240
Phe His Val Gly Ser Glu Ala Leu Leu Ala Gln Ser Ile Lys Leu Val245 250 255
Asp Glu Phe Thr Tyr Ser Val Ile Arg Arg Arg Lys Ala Glu Ile Val260 265 270
450Glu Val Arg Ala Ser Gly Lys Gln Glu275 280
Ser Arg Phe Ile Glu Leu Gly Glu Ala290 295
Gly Asp Asp Lys Ser Leu Arg Asp Val305 310
Gly Arg Asp Thr Thr Ala Thr Thr Leu325
Met Ser His Pro Asp Val Ala Glu Lys340 345
Phe Glu Ala Glu Arg Ala Arg Glu Glu355 360
Gly Gly Ala Asp Ala Asp Asp Lys Ala370 375
Phe Ala Gly Leu Leu Thr Tyr Asp Ser385 390
His Ala Cys Val Thr Glu Thr Leu Arg405
Lys Met Lys His Asp Ile Leu285
Gly Asp Asp Gly Gly Gly Phe300
Val Leu Asn Phe Val Ile Ala315 320
Ser Trp Phe Thr His Met Ala330 335
Leu Arg Arg Glu Leu Cys Ala350
Gly Val Thr Leu Val Leu Cys365
Phe Ala Ala Arg Val Ala Gln380
Leu Gly Lys Leu Val Tyr Leu395 400
Leu Tyr Pro Ala Val Pro Gln410 415
Asp Pro Lys Gly Ile Leu Glu Asp Asp420 425
Val Arg Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr435 440
Met Glu Tyr Asn Trp Gly Pro Asp Ala450 455
Trp Ile Asn Glu Asp Gly Ala Phe Arg465 470
Thr Ala Phe Gln Ala Gly Pro Arg Ile485
Val Leu Pro Asp Gly Thr Lys430
Val Pro Tyr Ser Met Gly Arg445
Ala Ser Phe Arg Pro Glu Arg460
Asn Ala Ser Pro Phe Lys Phe475 480
Cys Leu Gly Lys Asp Ser Ala490 495
Tyr Leu Gln Met Lys Met Ala Leu Ala500 505
Phe Arg Leu Leu Glu Gly His Pro Val515 520
Leu Ser Met Ala His Gly Leu Lys Val530 535
Ile Leu Phe Arg Phe Tyr Ser510
Gln Tyr Arg Met Met Thr Ile525
Arg Val Ser Arg Ala540
Val
<210> SEQ ID No: 22<211> Comprimento: 532<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Sorghum sp.
<400> Seqüência: 22
Met Pro Ala Thr Pro Leu Phe Pro Leu Ala Gly Leu His Lys Tyr Ile1 5 10 15Ala Ile Leu Leu Val Val Leu Ser Trp Ala Leu Val His Arg Trp Ser20 25 30
Leu Arg Lys Gln Lys Gly Pro Arg Ser Trp Pro Val Ile Gly Ala Thr35 40 45
Leu Glu Gln Leu Arg Asn Tyr His Arg Met His Asp Trp Leu Val Gly50 55 60
Tyr Leu Ser Arg His Lys Thr Val Thr Val Asp Met Pro Phe Thr Ser65 70 75 80
Tyr Thr Tyr Ile Ala Asp Pro Val Asn Val Glu His Val Leu Lys Thr85 90 95
Asn Phe Thr Asn Tyr Pro Lys Gly Asp Val Tyr Arg Ser Tyr Met Asp100 105 110
Val Leu Leu Gly Asp Gly Ile Phe Asn Ala Asp Gly Glu Leu Trp Arg115 120 125
Lys Gln Arg Lys Thr Ala Ser Phe Glu Phe Ala Ser Lys Asn Leu Arg130 135 140
Asp Phe Ser Ala Asn Val Phe Arg Glu Tyr Ser Leu Lys Leu Ser Gly145 150 155 160
Ile Leu Ser Gln Ala Ser Lys Ala Gly Lys Val Val Asp Met Gln Glu165 170 175
Leu Tyr Met Arg Met Thr Leu Asp Ser Ile Cys Lys Val Gly Phe Gly180 185 190
Val Glu Ile Gly Thr Leu Ser Pro Asp Leu Pro Glu Asn Ser Phe Ala195 200 205
Gln Ala Phe Asp Ala Ala Asn Ile Ile Val Thr Leu Arg Phe Ile Asp210 215 220
Pro Leu Trp Arg Val Lys Arg Phe Phe His Val Gly Ser Glu Ala Leu225 230 235 240
Leu Ala Gln Ser Ile Lys Leu Val Asp Glu Phe Thr Tyr Ser Val Ile245 250 255
Arg Arg Arg Lys Ala Glu Ile Val Glu Ala Arg Ala Ser Gly Lys Gln260 265 270
Glu Lys Met Lys His Asp Ile Leu Ser Arg Phe Ile Glu Leu Gly Glu275 280 285
Ala Gly Asp Asp Gly Gly Phe Gly Asp Asp Lys Ser Leu Arg Asp Val290 295 300
Val Leu Asn Phe Val Ile Ala Gly Arg Asp Thr Thr Ala Thr Thr Leu305 310 315 320
Ser Trp Phe Thr His Met Ala Met Ser His Pro Asp Val Ala Glu Lys325 330 335Leu Arg Arg Glu Leu Cys Ala Phe Glu Ala Glu Arg Ala Arg Glu Glu340 345 350
Gly Val Ala Val Pro Cys Cys Gly Pro Asp Asp Asp Lys Ala Phe Ala355 360 365
Ala Arg Val Ala Gln Phe Ala Gly Leu Leu Thr Tyr Asp Ser Leu Gly370 375 380
Lys Leu Val Tyr Leu His Ala Cys Val Thr Glu Thr Leu Arg Leu Tyr385 390 395 400
Pro Ala Val Pro Gln Asp Pro Lys Gly Ile Leu Glu Asp Asp Val Leu405 410 415
Pro Asp Gly Thr Lys Val Arg Ala Gly Gly Met Val Thr Tyr Val Pro420 425 430
Tyr Ser Met Gly Arg Met Glu Tyr Asn Trp Gly Pro Asp Ala Ala Ser435 440 445
Phe Arg Pro Glu Arg Trp Ile Asn Glu Glu Gly Ala Phe Arg Asn Ala450 455 460
Ser Pro Phe Lys Phe Thr Ala Phe Gln Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu465 470 475 480
Gly Lys Asp Ser Ala Tyr Leu Gln Met Lys Met Ala Leu Ala Ile Leu485 490 495
Phe Arg Phe Tyr Ser Phe Gln Leu Leu Glu Gly His Pro Val Gln Tyr500 505 510
Arg Met Met Thr Ile Leu Ser Met Ala His Gly Leu Lys Val Arg Val515 520 525
Ser Arg Ala Val530
<210> SEQ ID No: 23<211> Comprimento: 15<212> Tipo: DNA
<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:
<223> Outras informações: Descrição da seqüência artificial: Oligonucleotideosintético
<400> Seqüência: 23taggggtgaa aacgg
<210> SEQ ID No: 24<211> Comprimento: 10<212> Tipo: PRT
<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:
<223> Outras informações: Descrição da seqüência artificial: Peptídeo sintético<220> Características:<221> Nome/chave: MOD_RES<222> Localização: (2)..(3)
<223> Outras informações: Aminoácido variável
<220> Características:<221> Nome/chave: MOD_RES<222> Localização: (5)
<223> Outras informações: Aminoácido variável
<220> Características:<221> Nome/chave: MOD_RES<222> Localização: (7)
<223> Outras informações: Aminoácido variável
<220> Características:<221> Nome/chave: MOD_RES<222> Localização: (9)
<223> Outras informações: Aminoácido variável<400> Seqüência: 24
Phe Xaa Xaa Gly Xaa Arg Xaa Cys Xaa Gly15 10
<210> SEQ ID No: 25<211> Comprimento: 10<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 25
Phe Gln Ala Gly Pro Arg Ile Cys Leu Gly1 5 10
<210> SEQ ID No: 26<211> Comprimento: 1618<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Zea mays
<220> Características:
<221> Nome/chave: CDS
<222> Localização: (108)..(1430)
<400> Seqüência: 26
ggcacgagcc ggcgagccca ctcggcagtc ggcacaacca cacacacctc cacccactct 60
ctgagataag tgaagcatct cgcgcactgt cgcagtcgca gacggag atg atg aag 11
Met Met Lys1
cac tcg age age ttg tgc ttg ctc ttcHis Ser Ser Ser Leu Cys Leu Leu Phe5 10
ctg ctg gcc tgc ggc ctg gtc cag gea
Leu Leu Ala Cys Gly Leu Val Gln Ala
ctc ttg gcg ctc tgc acc acc 164Leu Leu Ala Leu Cys Thr Thr1 5
caa gtc ctc ttc cag ggg ttt 212Gln Val Leu Phe Gln Gly Phe20 25 30 35
aac tgg gag tcg tgc aag cag cag gga ggc tgg tac aac agg ctc aag
Asn Trp Glu Ser Cys Lys Gln Gln Gly Gly Trp Tyr Asn Arg Leu Lys
40 45 50
gcc cag gtc gac gac ate gcc aag gcc ggc gtc acg cac gtc tgg ctg
Ala Gln Val Asp Asp Ile Ala Lys Ala Gly Val Thr His Val Trp Leu
55 60 65
agg tcc gac gcc gtg ggg ttc gac ggc tgg cgc ctc gac ttc gcc aagArg Ser Asp Ala Val Gly Phe Asp Gly Trp Arg Leu Asp Phe Ala Lys200 205 210
ggc tac tcg ccg gcc gtc gcc aga atg tac gtg gag age acg ggg ccgGly Tyr Ser Pro Ala Val Ala Arg Met Tyr Val Glu Ser Thr Gly Pro215 220 225
ccg age ttc gtc gtc gcg gag ata tgg aac tcg ctg age tac age gggPro Ser Phe Val Val Ala Glu Ile Trp Asn Ser Leu Ser Tyr Ser Gly230 235 240
gac ggc aag ccg gcg ccc aac cag gac cag tgc cgg cag gag ctg ctgAsp Gly Lys Pro Ala Pro Asn Gln Asp Gln Cys Arg Gln Glu Leu Leu245 250 255
gac tgg acg cgg gcc gtc ggc ggg ccc gcc atg gcg ttc gac ttc cccAsp Trp Thr Arg Ala Val Gly Gly Pro Ala Met Ala Phe Asp Phe Pro260 265 270 275
260
308
cct cca ccc tcg cac tcc gtc tcg cca caa ggc tac atg cca ggc cgc 356Pro Pro Pro Ser His Ser Val Ser Pro Gln Gly Tyr Met Pro Gly Arg70 75 80
cta tac gac ctg gac gcg tcc aag tac ggc acg gcg gcg gag ctc aag 404Leu Tyr Asp Leu Asp Ala Ser Lys Tyr Gly Thr Ala Ala Glu Leu Lys85 90 95
tcc ctg ata gcg gcg ttc cac ggc agg ggc gtg cag tgc gtg gcg gac 452Ser Leu Ile Ala Ala Phe His Gly Arg Gly Val Gln Cys Val Ala Asp100 105 110 115
ate gtc ate aac cac cgg tgc gcg gaa aag aag gac gcg cgc ggc gtg 500Ile Val Ile Asn His Arg Cys Ala Glu Lys Lys Asp Ala Arg Gly Val120 125 130
tac tgc ate ttc gag ggc ggg act ccc gac gac cgc ctg gac tgg ggc 548Tyr Cys Ile Phe Glu Gly Gly Thr Pro Asp Asp Arg Leu Asp Trp Gly135 140 145
ccc ggg atg ate tgc age gac gac acg cag tac tcg gac ggg acg ggg 596Pro Gly Met Ile Cys Ser Asp Asp Thr Gln Tyr Ser Asp Gly Thr Gly150 155 160
cac cgc gac acg ggc gag ggg ttc gcg gcg gcg ccc gac ate gac cac 644His Arg Asp Thr Gly Glu Gly Phe Ala Ala Ala Pro Asp Ile Asp His165 170 175
ctc aac ccg cgc gtg cag cgg gag ctc tcc gcc tgg ctc aac tgg ctc 692Leu Asn Pro Arg Val Gln Arg Glu Leu Ser Ala Trp Leu Asn Trp Leu180 185 190 195
740
788
836
884
932acc aag ggc ctg ctg cag gcg ggc gtg cag ggg gag ctg tgg cgg ctg
Thr Lys Gly Leu Leu Gln Ala Gly Val Gln Gly Glu Leu Trp Arg Leu
280 285 290
cgc gac age tcc ggc aac gcg gcc ggc ctg ate ggg tgg gcg ccc gag
Arg Asp Ser Ser Gly Asn Ala Ala Gly Leu Ile Gly Trp Ala Pro Glu
295 300 305
aag gcc gtc acc ttc gtc gac aac cat gac acc ggg tcg acg cag aag
Lys Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Ser Thr Gln Lys
310 315 320
ccg gcg ggg cgc cac ctc tageagetea gattgctcag tcttgtgctgPro Ala Gly Arg His Leu440
980
1028
1076
ctc tgg ccg ttc cca tcc gac aag gtc atg cag ggc tac gcc tac ate 1124
Leu Trp Pro Phe Pro Ser Asp Lys Val Met Gln Gly Tyr Ala Tyr Ile
325 330 335
ctc acc cat cca gga gtc ccc tgc att ttc tac gac cac atg ttc gac 1172
Leu Thr His Pro Gly Val Pro Cys Ile Phe Tyr Asp His Met Phe Asp340 345 350 355
tgg aac ctg aag cag gag ata tcc acg ctg tet gcc ate agg gcg cgg 1220
Trp Asn Leu Lys Gln Glu Ile Ser Thr Leu Ser Ala Ile Arg Ala Arg
360 365 370
aac ggc ate cgc gcc ggg age aag ctg cgg ate ctc gtg gcg gac gcg 1268
Asn Gly Ile Arg Ala Gly Ser Lys Leu Arg Ile Leu Val Ala Asp Ala
375 380 385
gac gcg tac gtg gcc gtc gtc gac gag aag gtc atg gtg aag ate ggg 1316
Asp Ala Tyr Val Ala Val Val Asp Glu Lys Val Met Val Lys Ile Gly
390 395 400
aca agg tac ggc gtg age age gtg gtc ccg tcg gat ttc cac ccg gcg 1364
Thr Arg Tyr Gly Val Ser Ser Val Val Pro Ser Asp Phe His Pro Ala
405 410 415
gcg cac ggc aag gac tac tgc gtc tgg gag aaa gcg age ctc cgc gtc 1412
Ala His Gly Lys Asp Tyr Cys Val Trp Glu Lys Ala Ser Leu Arg Val420 425 430 435
1460
cattgcaaac acagcagcac gacactgcat aacgtctttt ccttaatttc ctgaatttta 1520ccttttccta gttcaatttc atatatgtat ttctacatgt acacactatc acaatcagat 1580aaataaacaa gcttggtcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1618
<210> SEQ ID No: 27<211> Comprimento: 13<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 27
Leu Val Tyr Leu His Ala Cys Val Thr Glu Thr Leu Arg1 5 10<210> SEQ ID No: 28<211> Comprimento: 42<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 28
Cys His Gly Asp Leu Asp Met Asp Ile Val Pro Leu Asn Pro Arg Gln1 5 10 15
Ile Thr Leu Val Leu Gln Ile Cys Met His Ala Cys Lys Gly Lys Arg20 25 30
Trp Val Ser Leu Val Ala Trp Leu Lys Pro35 40
<210> SEQ ID No: 29<211> Comprimento: 28<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 29
Lys Leu Arg Arg Val Leu Arg Thr Thr Thr Ser Leu Val Phe Cys Thr15 10 15
Leu Leu Leu Ser Gly Ser Val Val Thr Ala Tyr Lys20 25
<210> SEQ ID No: 30<211> Comprimento: 42<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 30
Cys His Gly Asp Leu Asp Met Asp Ile Val Pro Leu Asn Pro Arg Gln1 5 10 15
Ile Thr Leu Val Leu Gln Ile Cys Met His Ala Cys Lys Gly Lys Arg20 25 30
Trp Val Ser Leu Val Ala Trp Leu Lys Pro35 40
<210> SEQ ID No: 31<211> Comprimento: 14<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 31
Lys Leu Arg Arg Val Leu Arg Thr Thr Thr Ser Leu Val Phe1 5 10<210> SEQ ID No: 32<211> Comprimento: 24<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 32
Arq Trp Arg Trp Pro Ser Ser Cys Ala Ser Thr Ala Ser Gly Cys Trp1 5 10 15
Arg Gly Thr Arg Cys Ser Thr Ala20
<210> SEQ ID No: 33<211> Comprimento: 11<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 33
Pro Ser Ser Pro Trp Arg Thr Lys Gly Glu Phe1 5 10
<210> SEQ ID No: 34<211> Comprimento: 42<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 34
Cys His Gly Asp Leu Asp Met Asp1 5
Ile Thr Leu Val Leu Gln Ile Cys20
Trp Val Ser Leu Val Ala Trp Leu
35 40
Ile Val Pro Leu Asn Pro Arg Gln10 15
Met His Ala Cys Lys Gly Lys Arg25 30
Lys Pro
<210> SEQ ID No: 35<211> Comprimento: 6<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 35
Ala Gly Arg Asp Thr Thr1 5
<210> SEQ ID No: 36<211> Comprimento: 441<212> Tipo: PRT<213> Organismo: Zea mays
<400> Seqüência: 36
Met Met Lys His Ser Ser Ser Leu Cys Leu Leu Phe Leu Leu Ala1 5 10 15
Cys Thr Thr Leu Leu Ala Cys Gly Leu Val Gln Ala Gln Val Leu Phe20 25 30
Gln Gly Phe Asn Trp Glu Ser Cys Lys Gln Gln Gly Gly Trp Tyr Asn35 40 45
Arg Leu Lys Ala Gln Val Asp Asp Ile Ala Lys Ala Gly Val Thr His50 55 60
Val Trp Leu Pro Pro Pro Ser His Ser Val Ser Pro Gln Gly Tyr Met65 70 75 80
Pro Gly Arg Leu Tyr Asp Leu Asp Ala Ser Lys Tyr Gly Thr Ala Ala85 90 95
Glu Leu Lys Ser Leu Ile Ala Ala Phe His Gly Arg Gly Val Gln Cys100 105 110
Val Ala Asp Ile Val Ile Asn His Arg Cys Ala Glu Lys Lys Asp Ala115 120 125
Arg Gly Val Tyr Cys Ile Phe Glu Gly Gly Thr Pro Asp Asp Arg Leu130 135 140
Asp Trp Gly Pro Gly Met Ile Cys Ser Asp Asp Thr Gln Tyr Ser Asp145 150 155 160
Gly Thr Gly His Arg Asp Thr Gly Glu Gly Phe Ala Ala Ala Pro Asp165 170 175
Ile Asp His Leu Asn Pro Arg Val Gln Arg Glu Leu Ser Ala Trp Leu180 185 190
Asn Trp Leu Arg Ser Asp Ala Val Gly Phe Asp Gly Trp Arg Leu Asp195 200 205
Phe Ala Lys Gly Tyr Ser Pro Ala Val Ala Arg Met Tyr Val Glu Ser210 215 220
Thr Gly Pro Pro Ser Phe Val Val Ala Glu Ile Trp Asn Ser Leu Ser225 230 235 240
Tyr Ser Gly Asp Gly Lys Pro Ala Pro Asn Gln Asp Gln Cys Arg Gln245 250 255
Glu Leu Leu Asp Trp Thr Arg Ala Val Gly Gly Pro Ala Met Ala Phe260 265 270
Asp Phe Pro Thr Lys Gly Leu Leu Gln Ala Gly Val Gln Gly Glu Leu275 280 285
Trp Arg Leu Arg Asp Ser Ser Gly Asn Ala Ala Gly Leu Ile Gly Trp
290 295 300
Ala Pro Glu Lys Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Gly Ser
305 310 315 320
Thr Gln Lys Leu Trp Pro Phe Pro Ser Asp Lys Val Met Gln Gly Tyr
325 330 335Ala Tyr Ile Leu Thr His Pro Gly Val Pro Cys Ile Phe Tyr Asp His340 345 350
Met Phe Asp Trp Asn Leu Lys Gln Glu Ile Ser Thr Leu Ser Ala Ile
355 360 365
Arg Ala Arg Asn Gly Ile Arg Ala Gly Ser Lys Leu Arg Ile Leu Val
370 375 380
Ala Asp Ala Asp Ala Tyr Val Ala Val Val Asp Glu Lys Val Met Val
385 390 395 400
Lys Ile Gly Thr Arg Tyr Gly Val Ser Ser Val Val Pro Ser Asp Phe
405 410 415
His Pro Ala Ala His Gly Lys Asp Tyr Cys Val Trp Glu Lys Ala Ser
420 425 430
Leu Arg Val Pro Ala Gly Arg His Leu435 440

Claims (63)

1. Método de manutenção de uma condição de homozigoserecessiva de uma planta macho-estéril, o métodocaracterizado pelo fato de compreender:(a) fornecer uma primeira planta compreendendoalelos homozigotos recessivos do gene Ms26 eé macho estéril;(b) introduzir uma construção em uma segundaplanta, a segunda planta compreendendo osalelos homozigotos recessivos do gene Ms26, aconstrução na condição hemizigota, aconstrução compreendendo:i. uma primeira seqüência de nucleotideocompreendendo a seqüência de nucleotideode Ms26, que quando expressa na primeiraplanta restauraria a fertilidademasculina;ii. uma segunda seqüência de nucleotideo quequando expressa inibe a função ouformação de gametas masculinos viáveisna segunda planta, de modo que osgametas masculinos viáveis sãoproduzidos na segunda planta contendo osalelos recessivos de Ms26 e que nãocontém a construção; e(c) fertilizar a primeira planta com os gametasmasculinos da segunda planta para produziruma progênie que mantém a condição dehomozigose recessiva da primeira planta.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a primeira seqüência de nucleotídeoestá operacionalmente ligada a uma terceira seqüênciade nucleotideo conduzindo preferencialmente aexpressão em células vegetais masculinas.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que a terceira seqüência de nucleotideofunciona apenas na presença de uma substância oucondição indutora.
4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que a terceira seqüência de nucleotideo éselecionada a partir de um grupo consistindo de umaseqüência regulatória em tecido masculino de 5126,Ms26 e Ms45.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência de nucleotideoestá operacionalmente ligada a uma quarta seqüência denucleotideo, a quarta seqüência de nucleotideodirecionando a expressão preferencialmente para osgametas masculinos.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência de nucleotideo éselecionada a partir do grupo consistindo da seqüênciade nucleotideo do gene da DAM metilase, do gene daalfa amilase de Zea mays, e de um gene codificando umacitotoxina.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência estáoperacionalmente ligada a uma quarta seqüência denucleotideo direcionando a expressão para os gametasmasculinos.
8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que a quarta seqüência de nucleotideo éselecionada a partir do grupo consistindo da regiãoregulatória do gene da poligalacturonase 47, do geneZml3, do gene da pectina metiltransferase, do gene daproteína de ligação a calmodulina, do gene do fator dedespolimerização da actina, do gene de profilina, e dogene da fitosulfocina pentapeptídeo sulfatado.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende ainda uma quinta seqüênciade nucleotideo codificando um produto, a expressão daqual é capaz de ser usada para a seleção de célulasvegetais apresentando a construção.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a quinta seqüência de nucleotideo éselecionada a partir de um grupo consistindo de, ogene de fluorescência vermelha, o gene da proteínaciano fluorescente, o gene proteína amarelofluorescente, o gene da luciferase, o gene da proteínaverde fluorescente, o gene pl de antocianina e o geneque codifica a fosfinotricina actiltransferase.
11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a quinta seqüência de nucleotídeoestá operacionalmente ligada com uma regiãoregulatória selecionada a partir do grupo consistindodo gene 47 da poligalacturonase, do gene Zml3, do geneda pectina metiltransferase, do gene da proteína deligação a calmodulina, do gene do fator dedespolimerização da actina, do gene de profilina, e dogene da fitosulfocina pentapeptídeo sulfatado.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende ainda selecionar areferida segunda planta pela identificação de plantasapresentando a referida construção.
13. Método de manutenção de uma condição de homozigoserecessiva de uma primeira planta, quando se cruzar aprimeira planta com uma segunda planta, o métodocaracterizado pelo fato de compreender:(a) fornecer uma primeira planta compreendendoalelos homozigotos recessivos do gene Ms26,cuja expressão resulta em esterilidademasculina;(b) introduzir uma construção em uma segundaplanta, a segunda planta compreendendo osalelos homozigotos recessivos do gene Ms26, aconstrução na condição hemizigotacompreendendo:i. uma primeira seqüência de nucleotideocompreendendo a seqüência de nucleotideode Ms26, que quando expressa na primeiraplanta restauraria a fertilidademasculina;ii. uma segunda seqüência de nucleotideoselecionada a partir do grupoconsistindo de, a seqüência do gene dametilase DAM, gene da alfa amilaze demilho, e o gene que codifica citotoxina;iii. uma terceira seqüência de nucleotideooperacionalmente ligada à primeiraseqüência de nucleotideo, selecionada apartir do grupo consistindo de, a regiãoregulatória de tecido masculino de 5126,Ms26 ou Ms45, direcionando a expressãopreferencialmente para tecido masculinovegetal;iv. uma quarta seqüência de nucleotideooperacionalmente ligada à segundaseqüência de nucleotideo direcionando aexpressão para gametas masculinosvegetais, de forma que tais gametasmasculinos viáveis são produzidos nasegunda planta contendo os alelosrecessivos, e que não contém aconstrução; e(c) fertilizar a primeira planta com os gametasmasculinos da segunda planta para produziruma progênie que é macho estéril e mantém acondição de homozigose recessiva da primeiraplanta.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que compreende ainda uma quinta seqüênciade nucleotideo codificando um produto capaz de serusado para a seleção de células vegetais contendo aconstrução.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a quinta seqüência de nucleotideo éselecionada a partir de um grupo consistindo de, ogene de fluorescência vermelha, o gene da proteínaciano fluorescente, o gene proteína amarelofluorescente, o gene da luciferase, o gene da proteínaverde fluorescente, o gene pl de antocianina e o geneque codifica a fosfinotricina actiltransferase.
16. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a quinta seqüência de nucleotideoestá operacionalmente ligada com uma regiãoregulatória selecionada a partir do grupo consistindode, o gene 47 da de poligalacturonase, o gene Zml3, ogene da pectina metiltransferase, o gene da proteínade ligação a calmodulina, o gene do fator dedespolimerização da actina, o gene de profilina, e ogene da fitosulfocina pentapeptideo sulfatado.
17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a primeira seqüência de nucleotideo éselecionada a partir de um grupo consistindo de:(a) Uma seqüência codificando qualquer uma dasseqüências de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4ou 18;(b) A seqüência de qualquer uma de SEQ ID NO: 1, 3, 7 ou 17;(c) Uma seqüência apresentando pelo menos 90% deidentidade com qualquer uma das seqüênciasprecedentes;(d) Uma seqüência que hibridiza com qualquer umadas seqüências precedentes sob condições deelevada estringência de uma lavagem de SSC 0, lx, SDS 0,1% (p/v) à 65 °C; e(e) Um fragmento de qualquer uma das seqüênciasprecedentes cujo fragmento é uma seqüênciafuncional critica para fertilidade masculinaem uma planta.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que a primeira seqüência de nucleotideoestá operacionalmente ligada à uma terceira seqüênciade nucleotideo direcionando a expressãopreferencialmente para células vegetais masculinas.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que a terceira seqüência de nucleotideofunciona apenas na presença de uma substância oucondição indutora.
20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que a terceira seqüência de nucleotideo éselecionada a partir de um grupo consistindo de umaseqüência regulatória em tecido masculino de 5126,Ms26 e Ms 45.
21. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência de nucleotideoestá operacionalmente ligada à uma quarta seqüência denucleotideo, a quarta seqüência de nucleotideodirecionando a expressão preferencialmente para osgametas masculinos.
22. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência de nucleotideo éselecionada a partir do grupo consistindo da seqüênciade nucleotideo do gene da DAM metilase, do gene daalfa amilase de Zea mays, e de um gene codificando umacitotoxina.
23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência estáoperacionalmente ligada a uma terceira seqüência denucleotideo direcionando a expressão para os gametasmasculinos.
24. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que a quarta seqüência de nucleotideo éselecionada a partir do grupo consistindo da regiãoregulatória do gene da poligalacturonase 47, do geneZml3, do gene da pectina metiltransferase, do gene daproteína de ligação a calmodulina, do gene do fator dedespolimerização da actina, do gene de profilina, e dogene da fitosulfocina pentapeptídeo sulfatado.
25. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que compreende ainda uma quinta seqüênciade nucleotideo codificando um produto capaz de serusado para a seleção de células vegetais contendo aconstrução.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que a quinta seqüência de nucleotideo éselecionada a partir de um grupo consistindo de, ogene de fluorescência vermelha, o gene da proteínaciano fluorescente, o gene proteína amarelofluorescente, o gene da luciferase, o gene da proteínaverde fluorescente, o gene pl de antocianina e o geneque codifica a fosfinotricina actiltransferase.
27. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizadopelo fato de que a quinta seqüência de nucleotideoestá operacionalmente ligada com uma regiãoregulatória selecionada a partir do grupo consistindode, o gene 47 da de poligalacturonase, o gene Zml3, ogene da pectina metiltransferase, o gene da proteínade ligação a calmodulina, o gene do fator dedespolimerização da actina, o gene de profilina, e ogene da fitosulfocina pentapeptídeo sulfatado.
28. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que compreende ainda selecionar areferida segunda planta pela identificação de plantasapresentando a referida construção.
29. Método de produção de semente a partir de uma plantaapresentando gametas femininos e masculinos,caracterizado pelo fato de compreender:(a) introduzir em uma planta macho estérilcompreendendo alelos homozigotos recessivosdo gene Ms26, uma construção na condição dehemizigose compreedendo:i. uma primeira seqüência de nucleotideocompreendendo a seqüência de nucleotideode Ms 2 6;ii. uma segunda seqüência de nucleotideo quequando expressa inibe a função ouformação de gametas masculinos viáveisna planta, de modo que os gametasmasculinos viáveis são produzidos naplanta que não contém a construção;(b) auto fertilizar a planta; e(c) produzir semente que contém a construção.
30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a primeira seqüência de nucleotideoestá operacionalmente ligada à uma terceira seqüênciade nucleotideo direcionando a expressãopreferencialmente para células vegetais masculinas.
31. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência de nucleotideoestá operacionalmente ligada à uma quarta seqüência denucleotideo, a quarta seqüência de nucleotideodirecionando a expressão preferencialmente paragametas masculinos.
32. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que compreende ainda uma quinta seqüênciade nucleotideo codificando um produto capaz de serusado para a seleção de células vegetais contendo aconstrução.
33. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que compreende ainda identificar plantascontendo a referida construção.
34. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizadopelo fato de que a primeira seqüência de nucleotideo éselecionada a partir de um grupo consistindo de:(a) Uma seqüência codificando qualquer uma dasseqüências de aminoácidos de SEQ ID N0:2, 4ou 18;(b) A seqüência de qualquer uma de SEQ ID NO: 1, 3, 7 ou 17;(c) Uma seqüência apresentando pelo menos 90% deidentidade com qualquer uma das seqüênciasprecedentes;(d) Uma seqüência que hibridiza com qualquer umadas seqüências precedentes sob condições deelevada estringência de uma lavagem com SSC 0,lx, SDS 0,1% (p/v) à 65 °C; e(e) Um fragmento de qualquer uma das seqüênciasprecedentes cujo fragmento é uma seqüênciacritica para fertilidade masculina em umaplanta.
35. Método de manutenção de uma condição de homozigoserecessiva de uma planta, o método caracterizado pelofato de compreender:(a) fornecer uma primeira planta compreendendoalelos homozigotos recessivos de um generequerido para a expressão de um fenótipopara uma característica de uma planta;(b) introduzir uma construção em uma segundaplanta, a segunda planta compreendendo osalelos homozigotos recessivos de um generequerido para a expressão de um fenótipopara uma característica de uma planta, aconstrução na condição hemizigota, aconstrução compreendendo:i. uma primeira seqüência de nucleotídeoque quando expressa na primeira plantacomplementa funcionalmente acaracterística vegetal de homozigoserecessiva;ii. uma segunda seqüência de nucleotídeo,cuja expressão inibe a função ouformação de gametas masculinos viáveisna segunda planta, de modo que osgametas masculinos viáveis sãoproduzidos na segunda planta contendo osalelos recessivos e que não contém aconstrução; e(c) fertilizar a primeira planta com os gametasmasculinos da segunda planta para produziruma progênie que mantém a condição dehomozigose recessiva da primeira planta.
36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que a primeira seqüência de nucleotídeoestá operacionalmente ligada à uma terceira seqüênciade nucleotideo direcionando a expressãopreferencialmente para células vegetais masculinas.
37. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência de nucleotideoestá operacionalmente ligada à uma quarta seqüência denucleotideo, a quarta seqüência de nucleotideodirecionando a expressão preferencialmente paragametas masculinos.
38. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que compreende ainda uma quinta seqüênciade nucleotideo codificando um produto capaz de serusado para a seleção de células vegetais contendo aconstrução.
39. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que compreende ainda identificar plantascontendo a referida construção.
40. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que a característica é fertilidademasculina.
41. Método de produção de semente a partir de uma plantaapresentando gametas femininos e masculinos,caracterizado pelo fato de compreender:(a) introduzir uma construção em uma primeiraplanta, a planta compreendendo aleloshomozigotos recessivos de um gene requeridopara a expressão de um fenótipo para umacaracterística de uma planta, a construção nacondição hemizigota compreendendo:i. uma primeira seqüência de nucleotídeo,que quando expressa em uma segundaplanta contendo alelos homozigotosrecessivos de um gene requerido para afertilidade masculina e é macho estéril,restauraria a fertilidade masculina;ii. uma segunda seqüência de nucleotídeooperacionalmente ligada à primeiraseqüência de nucleotídeo que inibe afunção ou formação de gametas masculinosviáveis na planta, de modo que osgametas masculinos viáveis não contendoa primeira seqüência de nucleotídeo sãoproduzidos na planta;(b) auto fertilizar a planta; e(c) produzir semente que contém a construção.
42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que a primeira seqüência de nucleotídeoestá operacionalmente ligada à uma terceira seqüênciade nucleotídeo direcionando a expressãopreferencialmente para células vegetais masculinas.
43. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência de nucleotideoestá operacionalmente ligada à uma quarta seqüência denucleotideo, a quarta seqüência de nucleotideodirecionando a expressão preferencialmente paragametas masculinos.
44. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que compreende ainda uma quinta seqüênciade nucleotideo codificando um produto capaz de serusado para a seleção de células vegetais contendo aconstrução.
45. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que compreende ainda identificar plantascontendo a referida construção.
46. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que a característica é fertilidademasculina.
47. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que a terceira seqüência de nucleotideo éselecionada a partir de um grupo consistindo de:(a) SEQ ID NO:5;(b) SEQ ID NO:6;(c) Bases de 1-1088 de SEQ ID N0:7;(d) Bases de 830-962 de SEQ ID N0:7;(e) Bases de 830-914 de SEQ ID NO:7;(f) Bases de 917-962 de SEQ ID NO:7;(g) Bases de 875-954 de SEQ ID NO:7;(h) Bases de 935-954 de SEQ ID NO:7;(i) Bases de 875-924 de SEQ ID NO:7;(j) SEQ ID NO:19;(k) SEQ ID NO:20; e(1) Um fragmento de qualquer uma das seqüênciasprecedentes, cujo fragmento funcional éessencial para a expressão em tecidomasculino de uma seqüência ligada.
48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência de nucleotideoestá operacionalmente ligada à uma quarta seqüência denucleotideo, a quarta seqüência de nucleotideodirecionando a expressão preferencialmente paragametas masculinos.
49. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência de nucleotideo éselecionada a partir do grupo consistindo da seqüênciade nucleotideo do gene da DAM metilase, do gene daalfa amilase de Zea mays, e de um gene codificando umacitotoxina.
50. Método de acordo com a reivindicação 49, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência estáoperacionalmente ligada a uma quarta seqüência denucleotídeo direcionando a expressão para os gametasmasculinos.
51. Método de acordo com a reivindicação 48, caracterizadopelo fato de que a quarta seqüência de nucleotídeo éselecionada a partir do grupo consistindo da regiãoregulatória do gene da poligalacturonase 47, do geneZml3, do gene da pectina metiltransferase, do gene daproteína de ligação a calmodulina, do gene do fator dedespolimerização da actina, do gene de profilina, e dogene da fitosulfocina pentapeptídeo sulfatado.
52. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizadopelo fato de que compreende ainda uma quinta seqüênciade nucleotídeo codificando um produto capaz de serusado para a seleção de células vegetais contendo aconstrução.
53. Método de acordo com a reivindicação 47, caracterizadopelo fato de que compreende ainda identificar plantascontendo a referida construção.
54. Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizadopelo fato de que a terceira seqüência de nucleotídeo éselecionada a partir de um grupo consistindo de:(a) SEQ ID NO:5;(b) SEQ ID NO:6;(c) Bases de 1-1088 de SEQ ID NO:7;(d) Bases de 830-962 de SEQ ID NO:7;(e) Bases de 830-914 de SEQ ID NO:7;(f) Bases de 917-962 de SEQ ID NO:7;(g) Bases de 875-954 de SEQ ID NO:7;(h) Bases de 935-954 de SEQ ID NO:7;(i) Bases de 875-924 de SEQ ID NO:7;(j) SEQ ID NO:19;(k) SEQ ID NO:20; e(l) Um fragmento de qualquer uma das seqüênciasprecedentes, cujo fragmento funcional éessencial para a expressão em tecidomasculino de uma seqüência ligada, de talforma que gametas viáveis são produzidos naprimeira planta que não contém a construção.
55. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizadopelo fato de que a segunda seqüência de nucleotideoestá operacionalmente ligada à uma quarta seqüência denucleotideo, a quarta seqüência de nucleotideodirecionando a expressão preferencialmente paragametas masculinos.
56. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizadopelo fato de que compreende ainda uma quinta seqüênciade nucleotideo codificando um produto capaz de serusado para a seleção de células vegetais contendo aconstrução.
57. Método de acordo com a reivindicação 54, caracterizadopelo fato de que compreende ainda identificar plantascontendo a referida construção.
58. Método de restauração da fertilidade masculina em umaplanta macho-estéril, caracterizado pelo fato daplanta macho-estéril compreender alelos homozigotosrecessivos de Ms26, o método compreendendo introduzirna referida planta uma seqüência de nucleotideo deMs2 6 que é o complemento funcional da condição dehomozigose recessiva.
59. Método de restauração da fertilidade masculina em umaplanta macho-estéril, caracterizado pelo fato daplanta macho-estéril compreender alelos homozigotosrecessivos de um gene critico para a fertilidademasculina, o método compreendendo introduzir nareferida planta uma seqüência de nucleotideo que é ocomplemento funcional da condição de homozigoserecessiva, no qual a seqüência de nucleotideo éselecionada do grupo consistindo de:(a) Uma seqüência codificando qualquer uma dasseqüências de aminoácidos de SEQ ID NO:2, 4ou 18;(b) A seqüência de qualquer uma de SEQ ID NO: 1, 3, 7 ou 17;(c) Uma seqüência apresentando pelo menos 90% deidentidade com qualquer uma das seqüênciasprecedentes;(d) Uma seqüência que hibridiza com qualquer umadas seqüências precedentes sob condições deelevada estringência de uma lavagem com SSC 0,lx, SDS 0,1% (p/v) à 65 °C; e(e) Um fragmento de qualquer uma das seqüênciasprecedentes cujo fragmento funcional é umaseqüência critica para fertilidade masculinaem uma planta.
60. Seqüência de nucleotideo isolada, caracterizada porcompreender SEQ ID NO:26.
61. Cassete de expressão, caracterizado por compreenderSEQ ID NO:26.
62. Célula vegetal, caracterizada por compreender umaseqüência de nucleotideo heteróloga compreendendo SEQID NO:26.
63. Planta, caracterizada por compreender uma seqüência denucleotideo heteróloga compreendendo SEQ ID NO:26.
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