BRPI0613227A2 - uma composição para cicatrização de ferida e uso desta - Google Patents
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Abstract
UMA COMPOSIçAO PARA CICATRIZAçãO DE FERIDA E USO DESTA A invenção se refere a um método para tratamento de cicatrização de ferida, compreendendo a administração, a um paciente em necessidade deste tratamento, de uma quantidade efetiva de um polipeptídeo compreendendo uma sequência deaminoácido ou uma variante conservativa desta tendo domínio tipo EGF de trombomodulina. A invenção também se refere a uma composição para uso na aceleração de cicatrização de ferida, compreendendo um polipeptídeo compreendendo uma seqúência de aminoácido ou uma variante conservativa desta tendo domínio tipo EGF de trombomodulina.
Description
"UMA COMPOSIÇÃO PARA CICATRIZAÇÃO DE FERIDA E USODESTA".
HISTÓRICO DA INVENÇÃO
Campo da Invenção
A invenção se refere a um método e uma composiçãopara uso na aceleração de cicatrização de ferida.
Angiogênese e Trombomodulina
Embora várias moléculas sejam conhecidas natécnica como agentes terapêuticos úteis para o tratamento dedoenças e distúrbios tendo como um sintoma destes coagulaçãoanormal em vasos sangüíneos críticos, existe uma necessidade natécnica de composições e métodos que sejam úteis para o tratamentodestas doenças, assim como para o tratamento de doenças edistúrbios que têm como sintomas atividade angiogênicaanormalmente elevada ou anormalmente baixa. Estas doenças econdições incluem as seguintes: doenças e condiçõescardiovasculares tais como hipotensão, hipertensão eaterosclerose; condições trombóticas tais como AVC, ataquecardíaco e sondas pós-angioplastia; distúrbios angiogênicos;doenças e condições respiratórias tais como fibrose pulmonar easma; doenças e distúrbios relacionados com invasão de célula detumor, angiogênese e metástase; distúrbios de cicatrização deferida e coagulação, e distúrbios reprodutivos tais como contraçãouterina prematura e impotência.
Na atualidade, uma série de biomoléculas, queinduzem ou promovem angiogênese em tecidos, foi identificada. Asmais proeminentes destas são: fatores de crescimento tais comofator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator decrescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento epidérmico(EFG), fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs) efatores de crescimento de transformação (TGFs). A ausência datrombomodulina reguladora de coagulação sangüínea causamortalidade embriônica em camundongos antes do desenvolvimento deum sistema cardiovascular funcional. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA.1995; 92:850-854; e J. P. Cooke et al, Circulation 105 (2002)2133) . As abordagens atuais direcionadas para promoção deangiogênese no campo relacionado podem ser resumidas em trêscategorias principais: (i) provisão de fatores de crescimentoangiogênicos usando plataformas poliméricas sintéticas e naturais;(ii) provisão de plasmídeos contendo DNA que codifica proteínasangiogênicas; e (iii) provisão combinada de moléculas angiogênicase transplante de células endoteliais.
De acordo com as técnicas relacionados, um outrorelatório (Shi CS et al. , Evidence of Human Thrombomodulin domainas a Novel Angiogenic Factor. Circulation. 5 de abril de 2005;111 (13) :1627-36) propôs a carga de sistemas de aplicação commoléculas de trombomodulina recombinante humana ao invés defatores de crescimento. É proposto que a trombomodulinarecombinante humana carregada pode ser liberada sob condiçõesfisiológicas, promovendo, desta maneira, angiogênese rápida elocalizada.
Trombomodulina é uma glicoproteína de membrana decélula endotelial anticoagulante. Proteínas de trombomodulinarecombinante, TMD2 (contendo seis estruturas tipo EGF) e TMD23(contendo TMD2 e um domínio rico em serina-treonina), exibematividade mitogênica.O estudo anterior (Shi SC et al. , Evidence ofHuman Thrombomodulin domain as a Novel Angiogenic Factor.Circulation. 5 de abril de 2005; 111 (13) :1627-36) revelou osefeitos angiogênicos novos do domínio recombinante usando modelosin vitro e in vivo. Foi mostrado que TMD23 possui atividade maiselevada do que TMD2 na estimulação de síntese de DNA em célulasendoteliais de veia umbilical humana (HUVECs) cultivadas.Adicionalmente, TMD23 estimulou a motilidade quimiotática e aformação de tubo tipo capilar em HUVECs, um efeito mediado atravésda fosforilação de cinase regulada por sinal extracelular M ecinase de proteína ativada por mitógeno p3 8 e a via da sintase defosfatidilinositol-3 cinase/Akt/óxido nítrico endotelial. TMD23também estimulou a expressão de célula endotelial de ativadores dematriz metaloproteinases e plasminogênio, que mediaram proteóliseextracelular conduzindo a invasão e migração de célula endotelialdurante angiogênese. Além do mais, implantes contendo TMD23 emcórnea de rato induziram o crescimento de novos vasos sangüíneosdo limbo. Usando o ensaio de angiogênese de murino, TMD23 nãoapenas induziu neovascularização co-injetada com Matrigel eheparina, mas também aumentou a angiogênese em células A2058 demelanoma contendo Matrigel em camundongos nude. Concluindo, oTMD23 de domínio de trombomodulina recombinante aumentou aresposta angiogênica in vitro e in vivo.
Cicatrização de ferida
O processo de cicatrização de ferida tem 3 fases.
Elas são: a fase inflamatória, a fase proliferativa, e a fase dematuração.
A fase inflamatória é caracterizada porhemostasia e inflamação. Colágeno exposto durante a formação dalesão ativa a cascata de coagulação (tanto as vias intrínsecascomo as extrínsecas), iniciando a fase inflamatória. Apósocorrência dos danos ao tecido, as membranas da célula,danificadas pela formação da lesão, liberam tromboxano A2 eprostaglandina 2-alfa, vasoconstritores potentes. Esta respostainicial ajuda a limitar hemorragia. Após um curto período, ocorrevasodilatação capilar secundária à liberação de histamina local, eas células de inflamação são capazes de migrar para o leito daferida.
Plaquetas, a primeira célula de resposta, liberamúltiplas quimiocinas, incluindo fator de crescimento epidérmico(EGF), fibronectina, fibrinogênio, histamina, fator de crescimentoderivado de plaquetas (PDGF), serotonina, e fator von Willebrand.Estes fatores ajudam a estabilizar a ferida através da formação decoágulo. Estes mediadores agem para controlar sangramento elimitar a extensão do ferimento. A desgranulação de plaquetatambém ativa a cascata de complemento, especificamente C5a, que éum quimioatrativo potente para neutrófilos.
A fase inf lamatória continua, e mais células deresposta imunológica migram para a ferida. A segunda célula deresposta a migrar para a ferida, o neutrófilo, é responsável pelalimpeza de fragmentos de tecido, opsonização mediada porcomplemento de bactérias, e destruição de bactérias via mecanismosde erupção oxidativa (isto é, formação de superóxido e peróxido dehidrogênio). Os neutrófilos matam bactérias e descontaminam aferida de restos estranhos.
As próximas células presentes na ferida são osleucócitos e os macrófagos (monócitos). 0 macrófago, referido aquicomo o harmonizador, é essencial para cicatrização de ferida.Numerosas enzimas e citocinas são secretadas pelo macrófago. Estasincluem colagenases, que retiram os restos da ferida;
interleucinas e fator de necrose de tumor (TNF), que estimulamfibroblastos (produzem colágeno) e promovem angiogênese; e fatorde crescimento de transformação (TGF), que estimula ceratinócitos.Esta etapa marca a transição para o processo de reconstrução detecido, isto é, a fase proliferativa.
O segundo estágio de cicatrização de ferida é afase proliferativa. Epitelialização, angiogênese, formação detecido de granulação, e deposição de colágeno são as etapasprincipais nesta porção anabólica de cicatrização de ferida.Epitelialização ocorre prematuramente no reparo da lesão. Se amembrana de base permanece intacta, as células epiteliais migrampara cima no padrão normal. Isto é equivalente a uma queimadura depele de primeiro grau. As células progenitoras epiteliaispermanecem intactas embaixo da ferida, e as camadas normais deepiderme são recuperadas em 2-3 dias. Se a membrana de base foidestruída, similar a uma queimadura de segundo ou terceiro grau,então a ferida é re-epitelializada a partir de células normais naperiferia e de apêndices de pele, se intactas (por exemplo,folículos de cabelo, glândulas de suor).
Angiogênese, estimulada por TNF-alfa, é marcadapor migração de célula endotelial e formação de capilar. Os novoscapilares provêem nutrientes para a ferida e ajudam a manter oleito de tecido de granulação. A migração de capilares no leito daferida é crítico para cicatrização apropriada da ferida. A fase degranulação e deposição de tecido requer nutrientes supridos peloscapilares, e a falha na ocorrência disto resulta em uma feridacronicamente não cicatrizada. Mecanismos para modificar aangiogênese estão sob estudo e têm potencial significativo paramelhorar o processo de cicatrização.
A parte final da fase proliferativa é a formaçãode tecido de granulação. Fibroblastos diferenciam e produzemsubstância de fundo e, então, colágeno. A substância de fundo édepositada no leito da ferida; colágeno é, então, depositadoconforme a ferida passa pela fase final de reparo. Muitascitocinas diferentes estão envolvidas na fase proliferativa dereparo de ferida. As etapas e o mecanismo exato de controle nãoforam elucidados. Algumas das citocinas incluem PDGF, fator decrescimento tipo insulina (IGF), e EGF. Todos estes sãonecessários para a formação de colágeno.
A fase final de cicatrização de ferida é a fasede maturação. A ferida sofre contração, resultando, em últimainstância, em uma quantidade menor de tecido de cicatriz aparente.O processo inteiro é uma massa contínua dinâmica com umasobreposição de cada fase e remodelação contínua. A ferida atingesua resistência máxima em um ano, com uma resistência à tração queé 30% da pele normal. A deposição de colágeno continua por umperíodo prolongado, mas a rede aumenta em platôs de deposição decolágeno após 21 dias.
Atualmente, citocinas possuem um papel limitadona prática clínica. 0 único produto comercial atualmentedisponível que provou ser eficaz em estudos duplo-cegos,randomizados, é PDGF, disponível como PDGF-BB humano recombinante.Em estudos múltiplos, PDGF-BB humano recombinante demonstroureduzir o tempo de cicatrização e melhorar a incidência decicatrização completa da ferida em úlceras de estágio III e IV.Muitas outras citocinas atualmente sob estudo in vitro incluemTGF-beta, EGF, e IGF-I.
Cicatrização apropriada de ferida envolve umainteração complexa de células e citocinas trabalhando em conjunto.Nos últimos anos, mais mediadores químicos integrais a esteprocesso foram identificados. As etapas seqüenciais e processosespecíficos não foram totalmente diferenciados. Ao examinar oprocesso de cicatrização de feridas, é necessário identificar asetapas principais e conhecer os mediadores importantes.
Queimadura e Cicatrização de Ferida
Queimadura é um ferimento resultante de exposiçãoao calor, eletricidade, radiação (por exemplo, queimadura do sol ecirurgia a laser), ou produtos químicos cáusticos.
Três graus de queimaduras são comumentereconhecidos. Em queimaduras de primeiro grau, a camada externa dapele, denominada epiderme, se torna vermelha, sensível ao toque, efreqüentemente inchada. Atenção médica não é necessária, mas aaplicação de um ungüento pode aliviar a dor. Queimaduras desegundo grau são caracterizadas pela destruição variável daepiderme e pela formação de bolhas; terminações nervosas podem serexpostas. Os casos mais sérios devem ser observados por um médicoe deve se tomar cuidado para evitar infecção. Terapia local incluia aplicação de um produto químico tal como nitrato de prata paraproduzir uma crosta macia, reduzir a ameaça de infecção, e aliviara dor. Queimaduras de terceiro grau envolvem a destruição daespessura total da pele e do tecido conectivo subjacente. Noscasos mais graves, ossos subjacentes são também parcialmentequeimados. A área superficial envolvida é mais significativa que aprofundidade da queimadura. 0 choque deve ser evitado ou contra-atacado; transfusão sangüínea pode ser exigida para repor fluidoscorporais perdidos. A invasão de várias bactérias deve ser evitadaou curada pela administração de antibióticos e outrosmedicamentos. Morfina pode ser empregada para aliviar a dor.Tratamento de longa duração pode incluir transplante de enxertosde pele natural ou artificial.
Diabetes Mellitus e Cicatrização de Ferida
O diabetes mellitus é um grupo de doençasmetabólicas caracterizadas por altos níveis de açúcar no sangue(glicose), que resultam de defeitos na secreção de insulina, ouação de insulina, ou ambos. Diabetes mellitus, comumente referidacomo diabetes, significa "urina doce". Níveis elevados de glicoseno sangue (hiperglicemia) conduzem a derramamento de glicose naurina, e assim o termo urina doce. Normalmente, níveis de glicoseno sangue são estritamente controlados pela insulina, um hormônioproduzido pelo pâncreas. A insulina diminui o nível de glicose nosangue. Quando a glicose no sangue se eleva (por exemplo, após aingestão de alimento), a insulina é liberada do pâncreas paranormalizar o nível de glicose. Em pacientes com diabetes mellitus,a ausência ou produção insuficiente de insulina causahiperglicemia. Diabetes mellitus é uma condição médica crônica,significando que pode se estender pela vida toda.
O diabetes pode conduzir a várias complicações,incluindo doenças cardíacas e vasculares, cegueira, insuficiênciarenal e úlceras nos pés.
Pessoas com diabetes se encontram sob risco deferimentos nos pés devido à dormência causada por danos aos nervos(neuropatia diabética) e baixo fluxo sangüíneo para as pernas epés. 0 ferimento mais grave é uma úlcera no pé. Úlceras diabéticasno pé apresentam um alto risco de se tornarem infectadas, ealgumas vezes elas não podem ser curadas. Úlceras nos pés nãocuráveis são uma causa freqüente de amputação em pessoas comdiabetes.
A FDA liberou um produto de gel (becaplermina, ouRegranex Gel) que é usado como um tratamento para úlcerasdiabéticas no pé. Este produto contém fator de crescimentoderivado de plaqueta geneticamente modificado, uma das proteínasque o corpo produz para encorajar o crescimento de tecido novo.
Estudos clínicos do produto indicaram que a probabilidade defechamento completo da úlcera, após até 20 semanas de tratamento,foi maior quando becaplermina foi usada.
Um outro produto que ajuda no fechamento deferidas de úlceras de cicatrização lenta em pacientes com diabetesé um substituto de pele denominado DERMAGRAFT®. Este é compostopor células humanas conhecidas como fibroblastos que são colocadosem um material de malha dissolúvel. Quando o material de malha écolocado na úlcera, ele gradualmente é absorvido e as célulashumanas crescem e substituem o tecido danificado na úlcera.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção se refere a um método para tratamentode cicatrização de ferida, compreendendo a administração, a umpaciente em necessidade deste tratamento, de uma quantidadeefetiva de um polipeptídeo compreendendo uma seqüência deaminoácido ou uma variante conservativa desta tendo domínio tipoEGF de trombomodulina. A invenção também se refere a umacomposição a ser usada na aceleração da cicatrização de ferida,compreendendo um polipeptídeo compreendendo uma seqüência deaminoácido ou uma variante conservativa desta tendo domínio tipoEGF de trombomodulina.
Outros objetivos e características da presenteinvenção se tornarão aparentes a partir da descrição detalhada aseguir considerada em conjunto com os desenhos em anexo. Deve serentendido, entretanto, que os desenhos são designados unicamentepara fins ilustrativos e não como uma definição dos limites dainvenção, para os quais deve se fazer referência às reivindicaçõesem anexo. Deve ser entendido, ainda, que os desenhos não sãonecessariamente feitos em escala e que, a menos que indicado ocontrário, eles objetivam meramente ilustrar conceitualmente asestruturas e procedimentos descritos aqui.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Nos desenhos:
A Figura 1 mostra o efeito de TMD23 em migraçãode célula epitelial HaCaT.
A Figura 2 é um período de tempo para ofechamento de ferida em camundongos CD-I tratados com DMAp ou CGS-21680 (na forma de solução) por aplicação tópica. Substância deteste e veículo foram, cada um, administrados topicamente uma vezao dia durante 10 dias consecutivos. CGS-21680 (10μg/camundongo)como um controle positivo foi administrado topicamente no mesmoperíodo de tempo. O fechamento da ferida (%) e o tempo defechamento de metade da ferida (CT50) foram determinados e ANOVAde uma via, seguido por teste de Dunnett, foi aplicada paracomparação entre os grupos tratados e seus grupos de veículocorrespondentes nos dias 3, 5, 7, 9 e 11.
A Figura 3 é um período de tempo de fechamento daferida em camundongos CD-I tratados com DMAc ou Regranex (na formade gel) por aplicação tópica. Substâncias de teste foram, cadauma, administradas topicamente uma vez ao dia durante 10 diasconsecutivos. 0 fechamento da ferida (%) e o tempo de fechamentode metade da ferida (CT50) foram determinados e ANOVA de uma via,seguido pelo teste de Dunnett, foram aplicados para comparaçãoentre os grupos tratados e seus veículos correspondentes nos dias3, 5, 7, 9 e 11.
A Figura 4 é um período de tempo de fechamento deferida em camundongos diabéticos (Lepr db) tratados com DMAp ouCGS-21680 (na forma de solução) por aplicação tópica. Substânciade teste e veículo foram, cada um, administrados topicamente umavez ao dia durante 14 dias consecutivos. CGS-21680(10μg/camundongo) como um controle positivo foi administradotopicamente no mesmo período. 0 fechamento da ferida (%) e o tempode fechamento de metade da ferida (CT50) foram determinados eANOVA de uma via, seguido pelo teste de Dunnett, foram aplicadospara comparação entre os grupos tratados e seus veículoscorrespondentes nos dias 3, 5, 7, 9, 11, 13 e 15.
A Figura 5 é um período de tempo de fechamento daferida em camundongos diabéticos (Lepr db) tratados com DMAc ouRegranex (na forma de gel) por aplicação tópica. Substâncias deteste foram, cada um, administradas topicamente uma vez ao diadurante 14 dias consecutivos. 0 fechamento da ferida (%) e o tempode fechamento de metade da ferida (CT50) foram determinados eANOVA de uma via, seguido pelo teste de Dunnett, foram aplicadospara comparação entre os grupos tratados e seus veículoscorrespondentes nos dias 3, 5, 7, 8, 11, 13 e 15.
A Figura 6 mostra que TMD23 reduz a taxa deevaporação da abertura da ferida.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Trombomodulina é uma glicoproteínaanticoagulante, de membrana de célula endotelial. Um domínio detrombomodulina recombinante contendo seis estruturas tipo fator decrescimento epidérmico e domínio rico em serina-treonina exibeatividade mitogênica.
No relatório anterior (pedido N2: US 11/149.378)foi demonstrado que TMD23 poderia induzir migração e proliferaçãode célula endotelial (HUVEC).
Na presente invenção, foi revelado que TMD23poderia, efetivamente, aumentar a migração de ceratinócitos(HaCaT), o tipo de célula principal na epiderme e o anticorpocontra TMD23 poderiam, especificamente, inibir migração deceratinócito. Portanto, foi demonstrado pela a primeira vez queTMD23 poderia aumentar o processo de cicatrização de ferida pelaestimulação de migração de ceratinócito.
Além do mais, os experimentos com animaismostraram que TMD23 poderia aumentar a migração e extensão daepiderme na área da ferida, portanto acelerando o fechamento daferida. Por outro lado, a taxa de evaporação de água a partir daabertura da ferida foi efetivamente reduzida também.Concluindo, TM pode, efetivamente, aumentar ataxa de cicatrização de feridas.
A presente invenção se refere a um método paratratamento de cicatrização de ferida, compreendendo aadministração, a um paciente em necessidade deste tratamento, deuma quantidade efetiva de um polipeptídeo compreendendo umaseqüência de aminoácido ou uma variante conservativa desta tendodomínio tipo EGF de trombomodulina. Na configuração preferida, opolipeptídeo compreende adicionalmente um polipeptídeo ligadooperacionalmente, compreendendo uma seqüência de aminoácido ou umavariante conservativa de domínio rico em serina-treonina detrombomodulina.
O método da invenção pode ser aplicado paraacelerar cicatrização de feridas, onde a ferida é selecionada dogrupo consistindo de incisões, lacerações, abrasões, feridas deperfuração, bolhas, rasgos na pele, locais de doação ou enxerto,acnes, contusões, hematoma, lesões por esmagamento e ferimentoscausados por abrasão dérmica ou remoção a laser.
O método da invenção pode ser usado em pacientescom diabetes mellitus. Em uma configuração preferida, o pacientesofre de úlceras de diabetes.
O método da invenção pode, também, ser aplicadoquando a ferida é uma queimadura resultante de fogo, calor,radiação, eletricidade ou cirurgia dermatológica.
O método pode ser aplicado à cirurgiareconstrutora.
Em uma configuração preferida, o método éaplicado a um produto para aplicação à pele selecionado do grupoconsistindo de formulação de gel, creme, pasta, loção,pulverização, suspensão, solução, pomada de dispersão, hidrogel eungüento. Em uma configuração mais preferida, o produto deaplicação na pele é administrado ao paciente em necessidade destetratamento por aplicação à pele, por injeção ou eletroporação.
A presente invenção também se refere a um métodopara tratamento de cicatrização de ferida, compreendendo aadministração, a um paciente em necessidade deste tratamento, deuma quantidade efetiva de plasmídeo consistindo de DNA codificandoum polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoãcido ou umavariante conservativa desta tendo domínio tipo EGF detrombomodulina. Em uma configuração preferida, a administração éfeita por meios de vacina de plasmídeo. Em uma configuração maispreferida, a administração é feita por via intravenosa (iv) ,subcutânea (sc), intraperitoneal (ip), ou intramuscular (im).
A presente invenção se refere ainda a umacomposição para uso na aceleração de cicatrização de ferida,compreendendo um polipeptídeo compreendendo uma seqüência deaminoácido ou uma variante conservativa desta tendo domínio tipoEGF de trombomodulina. Na configuração preferida, o polipeptídeocompreende ainda um polipeptídeo operacionalmente ligadocompreendendo uma seqüência de aminoácido ou uma varianteconservativa de domínio rico em serina-treonina de trombomodulina.
A composição da invenção pode ser aplicada naaceleração de cicatrização de ferida, onde a ferida é selecionadado grupo consistindo de incisões, lacerações, abrasões, feridas deperfuração, bolhas, rasgos da pele, locais de doador ou enxerto,acnes, contusões, hematoma, lesões por esmagamento e ferimentoscausados por abrasão dérmica ou remoção a laser.
A composição da invenção pode ser usada empacientes com diabetes mellitus. Em uma configuração preferida, opaciente sofre de úlceras diabéticas.
A composição da invenção pode também ser aplicadaquando a ferida é uma queimadura resultante de fogo, calor,radiação, eletricidade ou cirurgia dermatológica.
Em uma configuração preferida, a composição podeser aplicada à cirurgia reconstrutora.
Em uma configuração preferida, o método éaplicado a um produto para aplicação à pele selecionado do grupoconsistindo de formulação de gel, creme, pasta, loção,pulverização, suspensão, solução, pomada de dispersão, hidrogel eungüento. Em uma configuração mais preferida, o produto paraaplicação à pele é administrado ao paciente em necessidade destetratamento por aplicação na pele, injeção ou eletroporação.
DEFINIÇÃO DE TERMOS
As definições a seguir são oferecidas para finsilustrativos e não limitativos, de modo a auxiliar na compreensãoda discussão que se segue.
De acordo com a presente invenção, podem serempregadas biologia molecular, microbiologia, e técnicas de DNArecombinante convencionais do conhecimento de pessoasespecializadas na técnica. Estas técnicas são explicadas em suatotalidade na literatura.
"Feridas" podem ser caracterizadas como feridasabertas e feridas fechadas. Feridas abertas podem serclassificadas em uma série de tipos diferentes, incluindo incisões(causadas por um objeto limpo, de borda afiada tal como uma facaou uma lâmina), lacerações (feridas grosseiras, irregularescausadas por forças de esmagamento ou dilaceração), abrasões ouescoriações (uma ferida superficial na qual as camadassuperficiais da pele são raspadas, freqüentemente causadas por umaqueda com deslizamento sobre uma superfície áspera), e ferimentosde perfuração (causadas por um objeto que perfura a pele, tal comoum prego ou uma agulha). Feridas fechadas possuem bem menoscategorias, mas são tão perigosas como feridas abertas. Estas sãocontusões ou pancadas (causadas por trauma de força obtusa quedanificam tecidos sob a pele), hematoma (causado por danos a umvaso sangüíneo, que por sua vez faz que sangue se acumule sob apele) e ferimentos por esmagamento (causados por uma quantidadegrande ou extrema de força aplicada durante um período de tempolongo).
O processo de "cicatrização da ferida" possui 3fases. Elas são: a fase inflamatória, a fase proliferativa, e afase de maturação.
A fase inflamatória é caracterizada porhemostasia e inflamação. Colágeno exposto durante a formação daferida ativa a cascata de coagulação (tanto as vias intrínsecascomo as extrínsecas), iniciando a fase inflamatória. Após ocorrerferimento do tecido, as membranas de célula, danificadas pelaformação da ferida, liberam tromboxano A2 e prostaglandina 2-alfa,vasoconstritores potentes. Esta resposta inicial ajuda a limitarhemorragia. Após um período curto, vasodilatação capilar ocorre emseqüência à liberação local de histamina, e as células deinflamação são capazes de migrar para o leito da ferida. A faseinflamatória continua, e mais células de resposta imunológicamigram para a ferida. A segunda célula de resposta a migrar para aferida, o neutrófilo, é responsável pela limpeza de restos,opsonização mediada por complemento de bactérias, e destruição debactérias via mecanismos de queima oxidativa (isto é, formação desuperóxido e peróxido de hidrogênio). Os neutrófilos matambactérias e descontaminam a ferida de restos estranhos.
O segundo estágio de cicatrização da ferida é afase proliferativa. Epitelialização, angiogênese, formação detecido de granulação, e deposição de colágeno são as etapasprincipais nesta porção anabólica de cicatrização de ferida. Aepitelialização ocorre cedo no reparo da ferida. Se a membrana debase permanecer intacta, as células epiteliais migram para cima nopadrão normal. Isto é equivalente a uma queimadura de primeirograu. As células progenitoras epiteliais permanecem intactasabaixo da ferida, e as camadas normais de epiderme são recuperadasem 2-3 dias. Se a membrana de base foi destruída, similar a umaqueimadura de segundo ou terceiro grau, então a ferida é re-epitelializada a partir de células normais na periferia e a partirde apêndices de pele, se intactos (por exemplo, folículos decabelo, glândulas sudoríferas). A parte final da faseproliferativa é a formação de tecido de granulação. Fibroblastosdiferenciam e produzem substância de fundo e então colágeno. Asubstância de fundo é depositada no leito da ferida; colágeno é,então, depositado conforme a ferida passa pela fase final dereparo. Muitas citocinas diferentes estão envolvidas na faseproliferativa de reparo de ferida. As etapas e o mecanismo exatode controle não foram elucidados. Algumas das citocinas incluemPDGF, fator de crescimento tipo insulina (IGF) , e EGF. Todas sãonecessárias para a formação de colágeno.
A fase final de cicatrização de ferida é a fasede maturação. A ferida sofre contração, resultando em últimainstância em uma quantidade menor de tecido de cicatriz aparente.O processo inteiro é um processo contínuo dinâmico com umasobreposição de cada fase e remodelação contínua. A ferida atingea resistência máxima dentro de um ano, com uma resistência àtração que é 30% da pele normal. A deposição de colágeno continuadurante um período prolongado, mas a rede aumenta nos platôs dedeposição de colágeno após 21 dias.
"Angiogênese" é geralmente considerada como sendoamplamente regulada por fatores de crescimento e outros ligantes.A angiogênese, e o desenvolvimento e regeneração simultâneos detecido, dependem dos processos estritamente controlados deproliferação, migração, diferenciação e sobrevivência de célulaendotelial. Ambos os ligantes estimuladores e inibidores pareceminteragir, diretamente ou indiretamente, com receptores celularesdurante estes processos. A angiogênese começa com a erosão damembrana de base por enzimas liberadas por células endoteliais eleucócitos. As células endoteliais, que alinham o lúmen de vasossangüíneos, então se projetam através da membrana de base.Estimuladores angiogênicos induzem células endoteliais a migrarematravés da membrana de base erodida. As células migrantes formam,então, um "broto" a partir do vaso sangüíneo mãe, onde as célulasendoteliais sofrem mitose e proliferam. Os brotos endoteliais secombinam entre si para formar alças capilares, criando o novo vasosangüíneo.Conforme aqui utilizado , o termo "queimadura" éo ferimento resultante de exposição ao calor, eletricidade,radiação (por exemplo, queimadura de sol e cirurgia a laser), ouprodutos químicos cáusticos.
"Diabetes mellitus" é um grupo de doençasmetabólicas caracterizadas por altos níveis de açúcar no sangue(glicose) , que resultam de defeitos na secreção ou ação deinsulina,, ou de ambos. Diabetes mellitus, comumente referida comodiabetes, significa "urina doce". Níveis elevados de glicose nosangue (hiperglicemia) conduzem a derramamento de glicose naurina, assim o termo urina doce. Normalmente, níveis de glicose nosangue são rigorosamente controlados pela insulina, um hormônioproduzido pelo pâncreas. A insulina diminui o nível de glicose nosangue. Quando a glicose no sangue se eleva (por exemplo, apósingestão de alimento), a insulina é liberada do pâncreas paranormalizar o nível de glicose. Em pacientes com diabetes mellitus,a ausência ou produção insuficiente de insulina causahiperglicemia. Diabetes mellitus é uma condição médica crônica,significando que ela pode se estender por toda a vida.
Diabetes pode, algumas vezes, conduzir aneuropatia periférica que, especificamente quando combinada comvasos sangüíneos danificados, pode conduzir a úlceras nos pés, epossivelmente progredindo para necrose, infecção e gangrena,algumas vezes exigindo a amputação do membro.
Um "ácido nucléico" ou "seqüência de nucleotídeo"se refere à forma polimérica de éster de fosfato deribonucleosídeos (adenosina, guanosina, uridina ou citidina;"moléculas de RNA") ou desoxirribonucleosídeos (desoxiadenosina,desoxiguanosina, desoxitimidina, ou desoxicitidina; "moléculas deDNA") tanto na forma de fita única como em uma hélice de fitadupla. Hélices de DNA-DNA, DNA-RNA e RNA-RNA de fita dupla sãopossíveis. O termo ácido nucléico, e em especial, moléculas de DNAou RNA, se refere apenas às estruturas primária e secundária damolécula, e não limita esta a quaisquer formas terciárias ouquaternárias específicas. Dessa maneira, este termo inclui DNA defita dupla encontrado, entre outros, em moléculas de DNA linearesou circulares (por exemplo, fragmentos de restrição) , plasmídeos,e cromossomos. Na discussão da estrutura de moléculas de DNA defita dupla específicas, seqüências podem ser descrita aqui deacordo com a convenção normal de prover apenas a seqüência nadireção 5' para 3'' ao longo da fita não transcrita de DNA (istoé, a fita tendo uma seqüência homóloga à mRNA) . Um "DNArecombinante" é uma molécula de DNA que sofreu uma manipulaçãobiológica molecular.
"Ligado operacionalmente", quando se referindo asegmentos de DNA, indica que os segmentos são arranjados de modoque eles funcionam em conjunto, por exemplo, o processo detranscrição ocorre por meio de ligação de polimerase de RNA aosegmento promotor e prosseguindo com a transcrição através dosegmento de codificação até a polimerase parar quando ela encontraum segmento de término de transcrição.
Conforme aqui utilizado, o termo "fragmento deácido nucléico" objetiva indicar qualquer molécula de ácidonucléico de cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou origem de RNA. 0termo "fragmento" visa indicar um segmento de ácido nucléico quepode ser de fita única ou dupla, e que pode ser baseado em umaseqüência de nucleotídeo de ocorrência natural completa ou parcialcodificando um polipeptídeo de interesse. 0 fragmento pode,opcionalmente, conter outros segmentos de ácido nucléico.
O fragmento de ácido nucléico da invençãocodificando o polipeptídeo da invenção pode, adequadamente, ser deorigem genômica ou cDNA, por exemplo obtido pela preparação de umabiblioteca genômica ou cDNA e exploração de seqüências de DNAcodificando todo ou parte do polipeptídeo por hibridização usandosondas de oligonucleotídeos sintéticas de acordo com técnicaspadrão.
Os polipeptídeos podem ser detectados usandométodos conhecidos na técnica que são específicos para ospolipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso deanticorpos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimentode um substrato de enzima. Por exemplo, uma análise de enzima podeser usada para determinar a atividade do polipeptídeo.
Os polipeptídeos da presente invenção podem serpurificados por uma variedade de procedimentos conhecidos natécnica, incluindo, entre outros, a cromatografia (por exemplo,troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização, eexclusão por tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo,foco isoelétrico preparativo (IEF)), solubilidade diferencial (porexemplo, precipitação de sulfato de amônio), ou extração.
Conforme aqui utilizado, o termo "vacinas deplasmídeo" é definido como preparações purificadas de DNA deplasmídeo designadas de forma a conterem um gene ou genes para oantígeno da vacina pretendida, assim como genes incorporados noconstruto para permitir a produção em um sistema hospedeiroadequado.
EXEMPLOS
Os exemplos abaixo são não limitativos e sãomeramente representativos de vários aspectos e características dapresente invenção.
Exemplo 1: Efeito de TMD23 na migração de célulaepitelial HaCaT
O efeito de TMD23 na migração de células HaCaTfoi avaliado usando a câmara de Boyden com filtros depolicarbonato de 6,5 mm de diâmetro (8-μπι de tamanho de poro). Asuperfície inferior do filtro foi revestida com colágeno tipo IV.TMD23 (100 ng/ml) ou TMD23 (100 ng/ml) mais anticorpo anti-TM (1^g/ml) foi adicionado no DMEM nos poços inferiores. A suspensão decélula (50 μΐϋ) contendo 1 χ IO4 células foi carregada em cada poçosuperior. O número das células que migraram através da membrana emoito horas foi contado sob microscópio após serem fixadas commetanol e manchadas com GIEMSA a 10%. Conforme mostrado na Figura1, TMD23 induziu de forma expressiva a migração quimiotática emcélulas HaCaT.
Exemplo 2: Materiais
DMAp foi 100 μg da proteína purificada TMD23recombinante (SEQ ID N2 1) em 20 μΐ de solução CMC/PBS a 0,5%. 0CMC (carboximetilcelulose) / PBS (Solução salina de fosfatotamponada) a um pH de 7,4 foi usado como o veículo na forma desolução para DMAp e CGS-21680. Cloridrato de (2-p-[2-carboxietil] fenetilamino-5'-N-etilcarboxamidoadenosina) CGS-21680era um ativador de proteína G e foi adquirido da sigma-Aldrich.Gel DMAc era 100 μ9 da proteína purificada TMD23recombinante (SEQ ID N2 1) em 20 mg de gel base. O gel base foiusado como um controle negativo de gel DMAc e gel Regranex. O gelbase era composto de carboximetilcelulose de sódio, cloreto desódio, triidrato de acetato de sódio, ácido acético glacial, metilparaben, propil paraben, cloridrato de m_Cresol 1-lisina, álcoolbenzílico, metilcloroisotiazolina, metilisotiazolinina, copolímerode acriloildimetiltaurato de amônio/VP e água para injeção. GelRegranex foi adquirido da Johnson & Johnson.
Para os produtos químicos usados nos exemplos,solução de formalina neutra tamponada a 10% (Shiyak Kogyo, Japão),carboximetilcelulose (Sigma-Aldrich, EUA), cloridrato de GCS-21680(Tocris, EUA), hexobarbital (Sigma-Aldrich, EUA), solução salinatamponada de fosfato (PBS pH 7,4, Sigma-Aldrich, EUA) e cloreto desódio (Wako, Japão) foram usados.
Quanto aos equipamentos usados nos exemplos,gaiola para animal (Allentown, EUA), Image - ProPlus (MediaCybernetics, Versão 4.5.29), pipeta (Gilson, Alemanha) eperfurador afiado, diâmetro interno de 12 mm (Sinter, R. 0. C.)foram usados.
Exemplo 3: Animais
Camundongos derivados de CD-I machos {Cri.)pesando 24 ± 2 g foram providos pela BioLasco Taiwan (sob Licençado Charles River Laboratories Technology). A alocação de espaçopara 10 animais era de 29 χ 18 χ 13 cm. Todos os animais forammantidos em um ambiente de temperatura (22° a 24°C) e umidade (50%- 60%) controladas com ciclos de luz/escuridão de 12 horas porpelo menos uma semana no MDS Pharma Services - Taiwan Laboratoryantes do uso. Acesso livre a ração de laboratório padrão paracamundongos [MF-18 (Oriental Yeast Co., Ltd., Japão)] e água ROfoi provido. Todos os aspectos deste trabalho incluindoalojamento, experimentação e descarte dos animais foram executadosde acordo com o Guia para Cuidado e Uso de Animais de Laboratório(National Academy Press, Washington, D. C., 1996).
Camundongos machos (NIDDM) com diabetes mellitusnão dependentes de insulina (C57BLKS/J-m+/+Lepr db) , pesando 50 ±5 g (9 semanas de idade), providos pelo Instituto para ReproduçãoAnimal (IAR, Japão), foram usados. Estes animais exibemhiperinsulinemia, hiperglicemia e atrofia de ilhota. Os animaisforam alojados em prateleiras com Gaiolas VentiladasIndividualmente (IVC Racks, 36 sistemas Mini Isoladores) sobcondição Livre de Patógeno Específico (SPF) durante todo oexperimento. Cada gaiola APEC (em cm, 26,7 de comprimento χ 20,7de largura χ 14,0 de altura) foi esterilizada por autoclave econtinham 7 camundongos, e os animais foram, então, mantidos em umambiente higiênico sob temperatura (22° a 24°C) e umidade (50%-60%) controladas com ciclos de luz/escuridão de 12 horas. Foipermitido aos animais acesso livre à ração de laboratórioesterilizada e água destilada esterilizada adlibitum. Todos osaspectos deste trabalho, isto é, alojamento, experimentação edescarte de animais, são executados de acordo com o Guia paraCuidado e Uso de Animais de Laboratório (National Academy Press,Washington, D. C., 1996).
Exemplo 4: TMD23 acelera o fechamento de feridaem camundongos
Grupos de 5 camundongos machos derivados de CD-I(Cri.), cada um pesando 24 ± 2 g foram usados. Durante o períodode teste, os animais foram usados sozinhos em gaiolas individuais.Sob anestesia com hexobarbital (90 mg/kg, IP), o ombro e a regiãodas costas de cada animal tiveram a pelagem raspada. Uma punçãoafiada (Dl de 12 mm) foi aplicada para remover a pele incluindopanniculus carnosus e tecidos aderentes. DMAc, Regranex e gel deBAse a 20 mg/camundongo e DMAp a 100 μg/camundongo, assim como oveículo (0,5% CMC/PBS pH 7,4, 20 μΐ/camundongo) e CGS-21680 a 10μg/camundongo como o controle positivo foram, cada um,administrados topicamente (TOP) imediatamente após o ferimentocutâneo uma vez ao dia durante 10 dias consecutivos. A área daferida, traçada em folhas plásticas transparentes foi medida pelouso de um Image - ProPlus (Media Cybernetics, Versão 4.5.29) nosdias 1, 3, 5, 7, 9ell. 0 percentual de fechamento da ferida (%)foi calculado, e o tempo de fechamento de metade da ferida (CT50)foi analisado por regressão linear usando Graph-Prism (GraphSoftware EUA). ANOVA de uma via seguida pelo teste de Dunnet foramaplicados para comparação entre os grupos tratados e seus gruposde veículo correspondentes em cada ponto avaliado (timepoint) demedição. Diferenças são consideradas estatisticamentesignificativas a P<0,05. CGS-21680 (10 μg/camundongo χ 10) como opadrão positivo exibiu aumento significativo (P<0,05) nofechamento de ferida (nos dias 3, 5, 7, 9 e 11) com CT50 diminuídaem relação aos valores de controle de veículo correspondentes. Osresultados são resumidos na Figura 2 (na fase de solução), Figura3 (na fase de gel) e Tabela 1 abaixo:<table>table see original document page 27</column></row><table>
O fechamento da ferida (%) e o tempo defechamento de metade da ferida (CT50) foram determinados e ANOVAde uma via pelo teste de Dunnett foram usados paracomparação entre o grupo tratado e seus grupos de veículocorrespondentes.
* P<0,05, vs. controle de veículo.
Tabela 1: 0 efeito de artigos de teste nofechamento de ferida e tempo de fechamento de metade da ferida emc amundongo s CD-1.
É concluído que DMAp (100 μ9/σβπηΗΗΐοη9θ)demonstrou um efeito mais persistente na cicatrização de feridadurante todo o estudo com uma redução significativa no valor CT50;DMAc e Regranex tenderam a promover cicatrização de ferida, porémsem efeito significativo na CT50; o gel de base não apresentouqualquer efeito no modelo de ferida cutânea dos camundongos.
Exemplo 5: TMD23 acelera fechamento de ferida emcamundongos com diabetes
Grupos de 5 camundongos machos C57BLKS/J-M+/+Leprdb pesando 50 ± 5 g foram usados. Durante o período de teste, osanimais foram alojados sozinhos em prateleiras de GaiolasVentiladas Individualmente (IVC Racks, 3 6 Sistemas MiniIsoladores). Sob anestesia de hexobarbital (90 mg/kg, IP) , o ombroe a região das costas de cada animal tiveram a pelagem raspada.Uma punção afiada (Dl de 12 mm) foi aplicada para remover a peleincluindo panniculus carnosus e tecidos aderentes. A área daferida, traçada em folhas plásticas transparentes foi medida nosdias 1, 3, 5, 7, 9 e 11, 13 e 15 pelo uso de um analisador deimagem (ProPlus, Media Cybernetics, Versão 4.5.29). As substânciasde teste na forma de solução ou gel e veículo, controle positivoCGS-21680 ou Regranex foram, cada uma, aplicadas topicamenteiniciando no dia 1, imediatamente após a formação da ferida, umavez ao dia durante um total de 14 dias consecutivos. Foram usadassubstâncias de teste DMAp (100 μg/camundongo), veículo (0,5%CMC/PBS pH 7,4) e CGS-21680 (10 μg/camundongo) na forma de soluçãoe volume de dosagem a 20 μΐ/camundongo. Enquanto isso, DMAc,Regranex e gel Base (como grupo de controle de veículo) estão naforma de gel e foram administrados a 2 0 mg/camundongo. O tempo defechamento de metade da ferida (CT50) foi determinado porregressão linear usando Graph-Pad Prism (Graph Pad Software EUA) eANOVA de uma via seguida pelo teste de Dunnet foram aplicados paracomparação entre os grupos tratados e grupos de veículo em cadaponto avaliado de medição. As diferenças são consideradasestatisticamente significativas no nível de P<0,05. CGS-21680 (10μg/camundongo χ 14) e Regranex (20 mg/camundongo χ 14) como asubstância de padrão positivo exibiram aumento significativo(P<0,05) no percentual de fechamento de ferida (nos dias 3, 5, 7,9, 11, 13 e 15) e diminuição significativa no CT50 em relação aosvalores de controle de veículo correspondentes. Os resultados sãoresumidos na Figura 4 (na fase de solução) , Figura 5 (na fase degel) e Tabela 2 abaixo:
Tabela 2: 0 efeito dos artigos de teste nofechamento de ferida e tempo de fechamento de metade da ferida emCamundongos Lepr db
<table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table>
O fechamento da ferida (%) e o tempo defechamento de metade da ferida (CTso) foram determinados e ANOVA deuma via seguida pelo teste de Dunnett foram usados para comparaçãoentre o grupo tratado e seus grupos de veículo correspondentes.
* P<0,05, vs. controle de veículo.
Conclui-se que DMAp (100 μg/camundongo), DMAC eRegranex (cada um 20 mg/camundongo), e CGS-21680 (10μg/camundongo) demonstraram efeito crescente persistente nacicatrização da ferida durante todo o estudo com uma reduçãosignificativa no valor CT50. Na fase inicial, Veículo de gel basepareceu ter um atraso pequeno na cicatrização da ferida secomparado com veículo de 0,5% CMC/PBS pH 7,4.
Exemplo 6: TMD23 reduz a taxa de evaporação daabertura da ferida
Para medir a taxa de epitelialização, a taxa deevaporação de água da área da ferida foi medida usando o TM210Tewameter (COURAGE + KHAZAKA Electronic Co., Colônia, Alemanha).Nível menor de taxa de evaporação é representativo de nível maiorde epitelialização ou ceratinização. Os resultados (Figura 6)mostraram que TMD23 poderia, efetivamente, aumentar a taxa deepitelialização da ferida.
Alguém com especialização na técnica, observaprontamente que a presente invenção está bem adaptada paraexecutar os objetivos e obter os resultados e vantagensmencionados, assim como aquelas inerentes a eles. As linhas decélula, animais, processos e métodos para produzir estes sãorepresentativos de configurações preferidas, são exemplificativos,e não objetivam limitar o escopo da invenção. Modificações à estae outros usos ocorrerão àqueles especializados na técnica. Estasmodificações são abrangidas dentro do espírito da invenção e sãodefinidas pelo escopo das reivindicações.
Ficará imediatamente aparente a uma pessoaespecializada na técnica que várias substituições e modificaçõespodem ser feitas à invenção apresentada aqui sem se afastar doescopo e espírito da invenção.
Todas as patentes e publicações mencionadas naespecificação são indicativas dos níveis daqueles comespecialização ordinária na técnica à qual a invenção pertence.Todas as patentes e publicações são incorporadas aqui porreferência na mesma extensão como se cada publicação individualtivesse sido específica e individualmente indicada comoincorporada por referência.
A invenção ilustrativamente descrita aqui podeser, adequadamente, praticada na ausência de qualquer elemento ouelementos, limitação ou limitações, que não sejam especificamenterevelados aqui. Os termos e expressões que foram empregados sãousados como termos de descrição e não de limitação, e não existe aintenção de que no uso destes termos e expressão sejam excluídosquaisquer equivalentes das características mostradas e descritasou de porções destas, mas é reconhecido que várias modificaçõessão possíveis dentro do escopo da invenção reivindicada. Dessamaneira, deve ser entendido que embora a presente invenção tenhasido especificamente revelada pelas configurações preferidas ecaracterísticas opcionais, modificação e variação dos conceitosaqui revelados podem ser utilizadas por aqueles especializados natécnica, e que estas modificações e variações são consideradasinclusas no escopo desta invenção conforme definido pelasreivindicações em anexo.
Outras configurações são apresentadas dentro dasreivindicações a seguir.
Claims (21)
1. Método para tratamento de cicatrização deferida, caracterizado pelo fato de que compreende a administração,a um paciente em necessidade deste tratamento, de uma quantidadeefetiva de um polipeptídeo compreendendo uma seqüência deaminoácido ou uma variante conservativa desta tendo domínio tipoEGF de trombomodulina.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ainda umpolipeptídeo operacionalmente ligado compreendendo uma seqüênciade aminoácido ou uma variante conservativa de domínio rico emserina-treonina de trombomodulina.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a ferida é selecionada do grupoconsistindo de incisões, lacerações, abrasões, feridas porperfuração, bolhas, rasgos na pele, locais de doação ou enxerto,acnes, contusões, hematoma, lesões por esmagamento e lesõescausadas por abrasão dérmica ou remoção a laser.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é usado em pacientes com diabetesmellitus.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o paciente sofre de úlceras dediabetes.
6. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a ferida é uma queimaduraresultante de fogo, calor, radiação, eletricidade ou cirurgiadermatológica.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que pode ser aplicado à cirurgiareconstrutora.
8. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que é aplicado a produto para aplicaçãoà pele, selecionado do grupo consistindo de formulação de gel,creme, pasta, loção, pulverização, suspensão, solução, pomada dedispersão, hidrogel e ungüento.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que o produto de aplicação à pele éadministrado ao paciente em necessidade deste tratamento pelaaplicação na pele, injeção ou eletroporação.
10. Método para tratamento de cicatrização deferida, caracterizado pelo fato de que compreende a administração,a um paciente em necessidade deste tratamento, de uma quantidadeefetiva de plasmídeo consistindo de DNA codificando umpolipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido ou umavariante conservativa desta, tendo domínio tipo EGF detrombomodulina.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que a administração é feita por meio devacina de plasmídeo.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que a administração é feita por viaintravenosa (iv), subcutânea (sc), intraperitoneal (ip), ouintramuscular (im).
13. Composição, para uso na cicatrização deferida, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeocompreendendo uma seqüência de aminoácido ou uma varianteconservativa desta tendo domínio tipo EGF de trombomodulina.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo compreende ainda umpolipeptídeo operacionalmente ligado compreendendo uma seqüênciade aminoácido ou uma variante conservativa desta de domínio ricoem serina-treonina de trombomodulina.
15. Composição, de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que a ferida é selecionada do grupoconsistindo de incisões, lacerações, abrasões, feridas deperfuração, bolhas, rasgos na pele, locais de doação ou enxerto,acnes, contusões, hematoma, lesões por esmagamento e lesõescausadas por abrasão dérmica ou remoção a laser.
16. Composição, de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que é usada em pacientes com diabetesmellitus.
17. Composição, de acordo com a reivindicação 16,caracterizada pelo fato de que o paciente sofre de úlceras dediabetes.
18. Composição, de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que a ferida é uma queimaduraresultante de fogo, calor, radiação, eletricidade ou cirurgiadermatológica.
19. Composição, de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que pode ser aplicada à cirurgiareconstrutora.
20. Composição, de acordo com a reivindicação 13,caracterizada pelo fato de que é aplicada a um produto paraaplicação à pele, selecionado do grupo consistindo formulação degel, creme, pasta, loção, pulverização, suspensão, solução, pomadade dispersão, hidrogel e ungüento.
21. Composição, de acordo com a reivindicação 20,caracterizada pelo fato de que o produto de aplicação à pele éadministrado ao paciente em necessidade deste tratamento pelaaplicação à pele, injeção ou eletroporação.
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