BRPI0613234A2 - sistema que inclui nanopartìculas para a libertação de moléculas biologicamente ativas, composição farmacêutica, composição cosmética, vacina, procedimento para obtenção de um sistema para a libertação controlada de molécula biologicamente ativa, procedimento para a obtenção de nanopartìculas e utilização de um sistema - Google Patents

Abstract

SISTEMA QUE INCLUI NANOPARTìCULAS PARA A LIBERTAçãO DE MOLéCULAS BIOLOGICANENTE ATIVAS, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, COMPOSIçãO COSMéTICA, VACINA, PROCEDIMENTO PARA A OBTENçãO DE UM SISTEMA PARA A LIBERTAçAO CONTROLADA DE MOLéCULA BIOLOGICAMENTE ATIVA, PROCEDIMENTO PARA A OBTENçãO DE NANOPARTìCULAS E UTILIZAçAO DE UM SISTEMA. A presente invenção refere-se a um sistema que inclui nanopartículas para a libertação de moléculas biologicamente ativas, nas quais as nanopartículas incluem a) pelo menos 40% em peso de quitosano ou um derivado do mesmo e b) menos de 60% em peso de uma ciclodextrina ou um derivado da mesma, em que ambos os componentes a) e b) se encontram misturados, sem que exista uma união covalente entre eles. Este sistema permite uma eficaz associação de moléculas biologicamente ativas, assim como a sua posterior libertação num meio biológico adequado.

Description

SISTEMA QUE INCLUI NANOPARTÍCULAS PARA A LIBERTAÇÃODE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA,COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, VACINA, PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DEUM SISTEMA PARA A LIBERTAÇÃO CONTROLADA DE MOLÉCULABIOLOGICAMENTE ATIVA, PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DENANOPARTÍCULAS E UTILIZAÇÃO DE UM SISTEMAÂMBITO DA INVENÇÃO

A presente invenção dirige-se a sistemasnanoparticulados para a libertação de moléculasbiologicamente ativas. Em concreto dirige-se a sistemasnanoparticulados, constituídos por uma mistura do polímeroquitosano e uma ciclodextrina aos quais se pode ligar umamolécula biologicamente ativa, assim como a procedimentospara a sua obtenção.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As nanopartículas poliméricas estão a ser objeto deespecial atenção devido ao seu interesse para melhorar aestabilidade e promover o transporte e libertação controladade fármacos em determinadas regiões do organismo, superandoos problemas associados à limitada permeabilidade dasbarreiras epiteliais. Entre os polímeros biodegradáveis, oquitosano tem recebido uma grande atenção nos últimos anosdevido às suas propriedades como muco-adesivo (C.-M. Lehr, J.A. Bouwstra, Ε. H. Schacht, and H. Ê. Junginger, Int. J.Pharm., 1992, 78, 43-48) e promotor da absorção (P.Artursson, T. Lindmark, S. S. Davis, and L. Illum, Pharw.Res., 1994, 11, 1358-1361). Além disso, estudos científicos,consideram o quitosano como um material com um aceitávelperfil toxicológico (S. B. Rao and C. P. Sharma, J. Biomed.Mater. Res., 1997, 34, 21-28), que foi aprovado pela FDA comoaditivo em alimentação animal (J. D. McCurdy, Advances inChitin and Chitosan, Elsevier Applied Science, London, 1992,pp. 757-7 64). 0 quitosano [a(l-4) 2-amino 2-deoxy-p-D-Glucano] é um polissacarídeo de origem natural proveniente dadeacetilação da quitina. De facto, na prática, os quitosanosutilizados como suplemento alimentar ou para aplicaçõesmédicas são polímeros aleatórios de monómeros acetilados enão-acetilados.

As nanopartícuias de quitosano foram amplamenteestudadas como veículos para a administração transmucosa deum grande número de moléculas terapêuticas (A. M. de Campos,Y. Diebold, E. L. Carvalho, A. Sanchez, and M. J. Alonso,Pharm. Res., 2004, 21, 803-810; R. Fernandeζ-Urrusuno, Ρ.Calvo, C. Remunhán-López, J. L. Vila-Jato, and M. J. Alonso,Pharm. Res., 1999, 16, 1576-1581; A. Prokov, E. Kozlov, G.W. Newman, and M. J. Newman, Biotechnology andbioengineering, 2002, 78, 459-466; A. Vila, A. Sanchez,K. Janes, I. Behrens, T. Kissel, J. L. Vila-Jato, and M. J.Alonso, Eur. J. Pharm. Biopharm., 2004, 57, 123-131). Umacaracterística notável destes sistemas de partículas é a suacapacidade para melhorar as características de absorção demoléculas com uma baixa permeabilidade (R. Fernandez-Urrusuno, P. Calvo, C. Remunhán-López, J. L. Vila-Jato, andM. J. Alonso, Pharm. Res., 1999, 16, 1576-1581; A. Vila, A.Sanchez, K. Janes, I. Behrens, T. Kissel, J. L. Vila-Jato,and M. J. Alonso, Eur. J. Pharm. Biopharm. , 2004, 57, 123-131) . Assim, as nanopartícuias de quitosano mostraram sercapazes de associar com eficácia fármacos hidrófilos, estessistemas apresentam habitualmente limitações para aassociação de fármacos hidrófobos e, em particular, daquelesque têm uma baixa solubilidade aquosa. Neste momento, nãoapenas se recolheu uma referência de utilização denanopartículas de quitosano como um fármaco de muito baixasolubilidade (A. M. De Campos, A. Sanchez, and M. J. Alonso,Int. J. Pharm., 2001, 224, 159-168), como, neste estudo, foinecessária a utilização de um método de preparação que requera utilização de solventes orgânicos.

Por seu lado, as ciclodextrinas são conhecidas comoagentes complexantes de moléculas pouco solúveis e comoveículos para a administração de princípios activos. Entreelas as ciclodextrinas modificadas quimicamente sãoactualmente as mais utilizadas em tecnologia farmacêuticadevido à sua maior versatilidade química. Assim, por exemplo,a substituição dos hidroxilos por grupos metilo,hidroxipropil ou carboximetil confere às moléculas uma maiorhidrossolubilidade e melhora as características detoxicidade. Outras ciclodextrinas permitem dar aos complexosuma solubilidade reduzida (utilizada para a formulação desistemas de libertação prolongada) ou uma solubilidadedependente da temperatura.

Recentemente, foram reveladas outras utilidadespotenciais das ciclodextrinas como excipientes farmacêuticos.

Assim, a complexação em ciclodextrinas mostrou ser capaz dereduzir a cinética de degradação de certos fármacos labiais,ou a tendência para a formação de agregados inactivos depeptídeos como a insulina. Além disso, foi demonstrado quecertas ciclodextrinas apresentam a capacidade de promover aabsorção de fármacos devido a produzirem ligeiras alteraçõesdas estruturas nas membranas celulares por complexação dosseus lipídios.

Existem diversos documentos que descrevem a utilizaçãoconjunta de ciclodextrinas e quitosano como polímero emsolução, geles ou como matrizes macroscópicas sólidas(US2002150616, US5476654, US5330764, US6677346, US6497901,US584 9327). 0 pedido de patente americana US2002150616 propõeuma mistura que consiste num fármaco pouco solúvel, umaciclodextrina e um polímero hidrófilo. A EP0730869, descrevesistemas de libertação de fármacos compostos também pormisturas de polímeros e ciclodextrinas.Os documentos US5843347, US5840341 e US5639473 descrevemcomposições de polímero em solução, em partículasmacroscópicas ou micropartículas. Os métodos descritos para aformação de partículas como a extrusão (US5843347) ou aformação de emulsões de água em óleo (US5639473) não permitemobter partículas de tamanho inferior a vários microns.

A W09961062 faz referência à preparação demicropartículas poliméricas com ciclodextrinas, onde asciclodextrinas têm a função de proteger o fármaco contrapossíveis interações desfavoráveis com a matriz do polímero.

A patente US6630169, descreve a formação de microestructurascomo veículos de vacinas por vias transmucosas.

A patente US5639473 refere-se à modificação através dereticulação com grupos bissulfureto de polímeros hidrófilos(como o quitosano) ou oligossacarídeos (como asciclodextrinas). O método proposto, dá lugar a sistemas compartículas entre 0,1 e 20 microns segundo a descrição da ditainvenção.

A W003 02716 9 descreve a formação de derivados depolímeros hidrófilos com ciclodextrinas unidas de formacovalente e a sua utilidade para a formação de sistemasfarmacêuticos (incluindo micro- e nanopartícuias).

Na patente US619757 é descrito um método de preparaçãoque inclui a reticulação em emulsão dos poli- ouoligossacarídeos componentes da matriz para dar lugar auniões tipo éter entre estas moléculas.

As patentes US5700459 e US6649192 descrevem métodos paraa formação de nanopartícuias de quitosano para aplicaçõesfarmacêuticas. Em ambas as patentes, as nanopartícuias sãoformadas pela interação de um poli-catião (como o quitosano)com um poli-anião (como o tripolifosfato). A US5700459menciona a possível utilização de umas ciclodextrinas(aminociclodextrinas) como material de substituição de outropotencial poli-catião como o quitosano.

A W09704747 propõe a encapsulamento de fármacos oucomplexos fármaco-ciclodextrinas em matrizes de hidrogelnanométricas que podem ser posteriormente recobertas porliposomas e/ou adjuvantes da mucoadesão. O método propostoexige a precipitação do polímero de uma fase orgânica em umafase aquosa, e os fármacos com ciclodextrina sãoacrescentados na fase aquosa onde se precipita o polímero, enão em conjunto com este. Este factor no procedimento, podedar lugar a encapsulações pouco eficientes de certosfármacos.

Convém salientar que as técnicas de microencapsulamentodestinadas ã formação de micropartículas diferem geralmentedas nanotecnologias aplicadas à formação de nanopartículas. AW09804244 descreve a formação de nanopartículas de quitosano.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Os inventores descobriram que um sistema constituído pornanopartículas de quitosano e uma ciclodextrina, permite umaeficaz associação de moléculas biologicamente ativas, assimcomo a sua posterior libertação num meio biológico adequado.

Estas nanopartículas apresentam uma capacidade melhorada deencapsular ou associar fármacos hidrófobos relativamente àsnanopartículas de quitosano sem ciclodextrina. Além disso, asciclodextrinas conferem características novas ao sistemananoparticulado como seja uma melhor proteção da moléculabiologicamente ativa associada assim como um maior poderpromotor da absorção especialmente para as moléculas poucopermeáveis. Assim, através de estudos in vivo foi possívelevidenciar a capacidade que apresenta o sistema da invençãopara transportar fármacos pouco permeáveis através dasbarreiras epiteliais, através da interação com a mucosanasal, atravessando, além disso, o epitélio nasal.

Uma característica adicional apresentada pelasnanopartícuias presentes no sistema da invenção é sua elevadaestabilidade em meios de cultivo celulares e, o que é maissignificativo, em fluidos intestinais simulados, onde foipossível demostrar que as nanopartículas não alteram as suaspropriedades fisico-químicas pelo menos durante quatro horas.

Esta propriedade faz com que estes sistemas sejam adequadospara utilização por diferentes vias de administração e,particularmente, para a sua administração por via oral,permitindo libertar o fármaco no meio biológico adequado.

Deste modo, através de estudos de libertação com diferentesfármacos, foi possível demostrar que as nanopartículaspermitem libertar o princípio activo a uma velocidade graduale controlada.

Por outro lado, a possibilidade de incorporar e libertarmacro moléculas baseadas em ácidos nucleícos, como plasmídeosde ADN, permitiu observar através de estudo in vitro acapacidade das nanopartículas para transfectar culturascelulares de uma forma muito eficaz, o que permite que osistema da invenção seja potencialmente adequado parautilização em terapia genética.

Assim, um objectivo da presente invenção é dirigido a umsistema que inclui nanopartículas para a libertação de umamolécula biologicamente ativa, no qual as nanopartículasincluem a) pelo menos cerca de 4 0% em peso de quitosano ou deum derivado do mesmo e b) menos de 60% em peso de umaciclodextrina ou de um derivado da mesma, em que ambos oscomponentes a) e b) estão misturados sem que existam uniõescovalentes.

Opcionalmente, as nanopartículas podem incluir, alémdisso, um agente reticulante iônico que permite a gelificaçãodo quitosano sob a forma de estruturas nanométricas.

Um segundo aspecto da presente invenção refere-se a umsistema nanoparticulado como o definido previamente que, alémdisso, inclui uma molécula biologicamente ativa.

Em outro aspecto a invenção dirige-se a uma composiçãofarmacêutica que inclui um sistema nanoparticulado como odefinido acima e uma molécula biologicamente ativa capaz deprevenir, paliar ou curar doenças. Deste modo, retidos nananoestrutura podem encontrar-se peptídeos, proteínas oupolisacarídios que não são considerados moléculas biológicasativas "per se" mas que podem contribuir para a eficácia dosistema de administração.

Outro aspecto da invenção constitui uma vacina queinclui um sistema nanoparticulado como o definido previamentee um antígeno. No seu aspecto preferencial, a composição ouvacina destina-se à administração por via mucosa.

Outro aspecto da invenção dirige-se a uma composiçãocosmética que inclui um sistema nanoparticulado como odefinido anteriormente.

Outro aspecto da invenção constitui um procedimento paraobtenção de um sistema para a libertação de uma moléculabiologicamente ativa tal como definido, e que inclui:

a. preparação de uma solução de quitosano ou deum derivado do mesmo em meio aquoso ou em umamistura de água com um solvente polar;

b. preparação de uma solução de uma ciclodextrinaou de um derivado da mesma em meio aquoso ou em umamistura de água com um solvente polar e,opcionalmente, um agente reticulante,· e

c. mistura, sob agitação, das soluções das etapasa) e b) de modo que se obtenham espontaneamente asnanopartículas de quitosano-ciclodextrina.ou opcionalmente:

a. preparação de uma solução de quitosano ou deum derivado do mesmo e uma ciclodextrina ou de umderivado da mesma em meio aquoso ou em uma misturade água com um solvente polar;

b. preparação de uma solução do agentereticulante em meio aquoso ou em uma mistura de águacom um solvente polar;

c. mistura, sob agitação, das soluções das etapasa) e b) de modo que se obtenham espontaneamente asnanopartículas de quitosano-ciclodextrina.

A molécula biologicamente ativa pode serincorporada diretamente nas soluções das etapas a) ou b), nãoobstante, em uma variante do procedimento a molécula ativapode ser previamente dissolvida antes da sua adição às fasesa) ou b) em meio aquoso ou em uma mistura de água e umsolvente polar.

Um último aspecto da invenção dirige-se àutilização de um sistema tal como descrito anteriormente paraa elaboração de um medicamento para terapia genética.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS

Figura 1: Imagens de TEM de formulações de quitosano-(hidroxipropil-p-ciclodextrina). Formulações preparadas com25 mM hidroxipropil-p-ciclodextrina e 2 mg/mL detripolifosfato (imagem da esquerda) ou 1,25 mg/mL (imagem dadireita).

Figura 2: Imagem de SEM de formulações de quitosano-(hidroxipropil-p-ciclodextrina). Formulação preparada apartir de 25 mM de ciclodextrina e 2 mg/mL de tripolifosfato.

Figura 3: Estabilidade das nanopartículas de quitosano eciclodextrina em HBSS com pH 6,4 a 37°C (média±D.E., n=3).

CS: quitosano; SBE-CD: sulfobutileter-ciclodextrina; CM-CD:carboximetil-ciclodextrina; TPP: tripolofosfato sódico; HBSS:solução salgada compensada de Hanks.

Figura 4: Estabilidade de nanopartículas de quitosano eciclodextrina em fluido intestinal simulado, a pH=6.8 a 37°C(média+D.E., n=3) . (□) CS/CM-CD/TPP=4/5.5/0; (·) CS/CM-CD/TPP= 4/4.5/0.25. CS:quitosano; SBE-CD: sulfobutileter-β-ciclodextrina; CM-CD: carboximetil-p-ciclodextrina; TPP:tripolofosfato sódico.

Figura 5: Estabilidade de nanopartículas de quitosano ecarboximetil-p-ciclodextrina em fluido intestinal simuladocom pH 6,8 e 37°C (média±D.E., n=3). (□) CS/CM-CD/TPP=4/3/0.5; (·) CS/CM-CD/TPP= 4/1.5/0.75. CS:quitosano;CM-CD: carboximetil-p-ciclodextrina; TPP: tripolofosfatosódico.

Figura 6: Perfil de libertação dos fármacos triclosano efurosemida a partir de formulações de quitosano-(hidroxipropilciclodextrina). Formulações: TRIC HPaCD(formulação de triclosano com hidroxipropil-a-ciclodextrina) ,TRIC HPpCD (formulação de triclosano com hidroxipropil-β-ciclodextrina), FUR HPaCD (formulação de furosemida comhidroxipropil-a-ciclodextrina), FUR HPpCD (formulação defurosemida com hidroxipropil- β -ciclodextrina) (Médias ±Desv. Est., n=3).

Figura 7: Gel de agarose de nanopartículas quitosano-sulfobutilciclodextrina. Linhas: (1) marcador de pesomolecular, (2) ADN em solução, (3) nanopartículas sem ADN,(4) nanopartículas com ADN, (5) nanopartículas com ADNdegradadas com quitosanasa. Tempo de incubação 3 0 minutos.

Figura 8: Imagens de fluorescência de células transfectadascom 1 ug de plasmídio pGFP em nanopartículas de quitosano-sulfobutilciclodextrina. Níveis de transfecção obtidos às 48 h.

Figura 9: Estabilidade das nanopartículas de quitosanomarcado com fluoresceína-ciclodextrina em trealose (5%). (♦)FI-CS/SBE-CD 4/4; (□) FI-CS/CM-CD 4/6. FI-CS:quitosanomarcado com fluoresceína; SBE-CD: sulfobutileter-β-ciclodextrina; CM-CD: carboximetil-p-ciclodextrina; TPP:tripolofosfato sódico.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O sistema da presente invenção incluinanopartícuias que se encontram dispersas num meio aquoso,onde as ditas nanopartícuias têm uma estrutura que incluiquitosano e ciclodextrina, na qual se pode incorporar umamolécula biologicamente ativa. A dita estrutura mantém-seunida pelas interações eletrostáticas entre ambos oscomponentes, sem que existam uniões covalentes entre eles.

Opcionalmente as nanopartículas podem incluir, alémdisso, um agente reticulante iônico que permite a reticulaçãodo quitosano por gelificação ionotrópica favorecendo aformação espontânea das nanopartículas.

Pela designação "nanopartícuia" entende-se umaestrutura formada pela interação eletrostática entre oquitosano e a ciclodextrina, onde a dita estrutura se podeencontrar, além disso, reticulada quando se adiciona aosistema um sal polianiônico que actua como agentereticulante. A interação eletrostática resultante entre osdiferentes componentes das nanopartículas e, opcionalmente, areticulação do quitosano pela adição de um agentereticulante, gera entidades físicas características,independentes e observáveis, cujo tamanho médio é inferior a1 μπι, ou seja, um tamanho médio compreendido entre 1 e 999 nm.

Por "tamanho médio" entende-se o diâmetro médio dapopulação de nanopartículas que inclui o quitosano e aciclodextrina, que se movem em conjunto no meio aquoso. 0tamanho médio destes sistemas pode ser medido porprocedimentos standard conhecidos dos especialistas namatéria, e que se descrevem, como exemplo, na parteexperimental mais abaixo.

As nanopartículas descritas na presente invençãocaracterizam-se por apresentarem um tamanho médio daspartículas inferior a 1 μπι, tendo preferencialmente umtamanho médio compreendido entre 1 e 999 nm, e aindapreferencialmente entre 10 e 800 nm. 0 tamanho médio daspartículas é influenciado principalmente pela proporção dequitosano em relação à ciclodextrina, pelo nível dedesacetilação do quitosano e também pelas condições deformação das partículas (concentração de quitosano,concentração da deciclodextrina, concentração do agentereticulante, quando é o caso, e pela relação entre eles).

Por outro lado, as nanopartícuias podem apresentaruma carga eléctrica (medida pelo potencial Z, utilizando CLKcomo meio de diluição) cuja magnitude pode variar desde 0 mVaté + 60 mV, dependendo das variáveis mencionadas. A cargapositiva das nanopartículas pode ter interesse para favorecera interação das mesmas com as superfícies biológicas, e emparticular com as superfícies mucosas que estão carregadasnegativamente. Não obstante, a carga neutra pode resultarmais adequada para a sua administração por via intravenosa.

0 sistema que inclui nanopartículas para alibertação de uma molécula biologicamente ativa que foidefinido mais acima tem um conteúdo de quitosano na misturasuperior a 40 % em peso, preferencialmente deverá estarcompreendido entre pelo menos 40% e 95,5% em peso. Por seulado, o conteúdo de ciclodextrina na mistura é inferior a 60%em peso, preferencialmente deverá estar compreendido entre0,5% e menos de 60% em peso.

Quitosano

O quitosano é um polímero de origem naturalderivado da quitina (poli-N-acetil-D-glucosamina), no qualuma parte importante dos grupos acetilo dos N foi eliminadapor hidrólise. O nível de desacetilação deve estarpreferencialmente num intervalo compreendido entre 30 e 95%,ainda mais preferencialmente entre 50 e 95%, o que indica quecerca de 5% a 50% dos grupos amino estão acetilados.

Apresenta, assim, uma estrutura aminopolisacarídica e umcarácter catiônico. Inclui a repetição de unidadesmonoméricas de fórmula (I):

<formula>formula see original document page 13</formula>

em que η é um número inteiro, e além disso m unidades em queo grupo amino está acetilado. A soma de n+m representa o graude polimerização, ou seja, o número de unidades monoméricasna cadeia de quitosano.

O quitosano utilizado para a obtenção dasnanocápsulas da presente invenção tem um peso molecularcompreendido entre 1 e 2 000 kDa, preferencialmente entre 5 e500 kDa, e ainda mais preferencialmente entre 5 e 2 00 kDa.

Exemplos de quitosanos comerciais que se podem utilizar são oUPG 113, UP CL 213 e UP CL113 que podem ser adquiridos àNovaMatrix, Drammen, Noruega.

O número de unidades monoméricas que se incluem noquitosano utilizado na obtenção das nanopartículas estáincluído entre 5 e 5000 monómeros, particularmente entre 3 0 e600 monómeros, preferencialmente entre 60 e 600 monómeros.

Como alternativa ao quitosano pode utilizar-setambém um derivado do mesmo, entendendo-se um quitosano noqual foi modificado um ou mais grupos hidróxilos e/ou um oumais grupos amino, com o fim de aumentar a solubilidade doquitosano ou incrementar o carácter adesivo do mesmo. Estesderivados incluem, entre outros, quitosanos acetilados,alquilados ou sulforados, derivados tiolados, tal comodescrito em Roberts, Chitin Chemistry, Macmillan, 1992, 166.

De forma preferencial quando se utiliza um derivadoseleciona-se entre O-alquiloéteres, O-acilésteres,trimetilquitosano, quitosanos modificados compolietilenglicol, etc. Outros derivados possíveis são ossais, tais como os citratos, nitratos, lactatos, fosfatos,glutamatos, etc. Em qualquer caso, o especialista na matériasabe identificar as modificações que se podem dar sobre oquitosano sem afectar a estabilidade e viabilidade comercialda formulação final.

Ciclodextrina

As ciclodextrinas consistem estruturalmente em 6, 7ou 8 unidades de D-glucopiranosil unidas por ligaçõesglicosídicas a(l-4), denominadas α β ou γ, respectivamente. Aconfiguração tridimensional mais estável destesoligosacãridos é um toroide no qual se apresentam os gruposhidroxilos primários e secundários voltados para o solvente.

Nesta conformação, a cavidade formada dentro deste toroideapresenta uma elevada hidrofobia, responsável juntamente comforças de Van der Waals e pontes de hidrogênio pela formaçãode complexos de inclusão entre as ciclodextrinas e osfármacos.

Por derivado da ciclodextrina entende-se umaciclodextrina ou mistura destas nas quais o/os hidrogénio/sde uma parte ou de todos os grupos hidróxilos das posições 2-3- e 6- de glucose está/estão subtituído(s) por outro(s)grupo(s) funcional(ais) tal/tais como um grupodihidroxialquil, um resíduo sacarídeo, um grupohidroxialquil, um grupo sulforado, um grupo sulfoalquil, umgrupo alquilo, um grupo alcanoílo, um grupo acetilo ou umgrupo benzoílo.As ciclodextrinas ou os seus derivados utilizadosna presente invenção podem estar disponíveis comercialmenteou podem ser sintetizadas por um método conhecido per se.

Exemplos de ciclodextrina e dos seus derivados incluemciclodextrinas naturais (alfa, beta ou gama)hidroxipropilciclodextrinas, carboximetilciclodextrinas,sulfobutilciclodextrinas, aminociclodextrina,dimetilciclodextrina, ciclodextrina fosfato,hydroxietilciclodextrina, acetil-ciclodextrina,etilciclodextrinas, trimetilciclodextrinas,carboxietilciclodextrina, glucosilcilcodextrina, 6-0-a-maltosilciclodeextrinas, butil-ciclodextrinas, ciclodextrinasulfatadas, N,N-dietilaminoetiIciclodextrina, tert-butilsililciclodextrinas, silil ((6-0-tert-butildimetil)-2,3,-di-O-acetil)- ciclodextrinas, succinil-(2-hidroxipropil)-ciclodextrinas, succinil-ciclodextrinas,sulfopropil-ciclodextrinas, policiclodextrinas. Em umarealização particular da presente invenção a ciclodextrina éa hidroxipropil-a-ciclodextrina, hidroxipropil-β-ciclodextrina, sulfobutiletil^-ciclodextrina ou misturas dasmesmas. Qualquer delas pode ser utilizada nos sistemas dainvenção.

0 grau de substituição médio (GS) refere-se à médiaem número de hidroxilos substituídos por unidade deciclodextrina, enquanto que o grau de substituição molar (SM)se refere ao número de grupos hidroxilos por unidade deanidroglucose. Na presente invenção as ciclodextrinasutilizadas apresentam um grau de substituição médio queoscila entre 4,2 e 7 embora também seja possível a aplicaçãode ciclodextrinas cujo GS está fora destes limites.

0 sistema de nanopartículas da invençãocaracteriza-se por se ter formado por precipitação espontâneadas nanopartículas após a mistura de uma fase policatiônica,que inclui o quitosano, e opcionalmente a ciclodextrina, comuma fase polianiônica, que pode ser formada por umaciclodextrina ou por um agente reticulante ou por umacombinação de ambos. É significativo que ambas as fases sejamaquosas, evitando ou minimizando assim a utilização desolventes orgânicos na preparação dos sistemas da invenção.

0 agente reticulante é um sal aniônico que permitea reticulação do quitosano, favorecendo a formação espontâneadas nanopartículas. Na presente invenção, o agentereticulante é um sal de polifosfato, sendo preferível autilização de tripolifosfato sódico (TPP).

Quando a ciclodextrina é aniónica, esta podeconstituir por si só a fase polianiônica e não é necessária apresença de TPP, já que as nanopartículas se formam porinteração eletrostática entre as ciclodextrinas carregadasnegativamente e o quitosano carregado positivamente. Nãoobstante, a adição de TPP além da ciclodextrina aniónica,pode, em alguns casos, mudar a densidade de reticulação efavorecer a estabilidade das nanopartículas. Por outro lado,no caso de ciclodextrinas que não têm carga aniónica (semcarga ou com carga positiva), torna-se necessário incorporaro TPP na fase polianiônica para reticular o quitosano epermitir a formação das nanopartículas.

As nanopartículas de quitosano-ciclodextrina sãosistemas que têm uma elevada capacidade de associação demoléculas bioativas. Esta capacidade de associação depende dotipo de molécula incorporada assim como dos parâmetros daformulação assinalados. Na presente invenção este tipo denanopartículas está particularmente dirigido a associarmoléculas ativas hidrofóbicas e moléculas ativas,hidrofóbicas e hidrofílicas, pouco permeáveis. Por isso, umsegundo aspecto da presente invenção é constituído por umsistema nanoparticulado como o definido anteriormente quealém disso inclui uma molécula biologicamente ativa.

0 termo "molécula biologicamente ativa" refere-se aqualquer substância que seja utilizada no tratamento,curativo, prevenção ou diagnóstico de uma doença ou que éutilizada para melhorar o bem-estar físico e mental de sereshumanos e animais. Estas moléculas biologicamente ativaspodem incluir desde fármacos de baixo peso molecular atémoléculas do tipo de polissacarídeos, proteínas, peptídeos,lipídios e moléculas baseadas em ácidos nucleícos ecombinações das mesmas.

Em uma realização particular, as moléculasbiologicamente ativas são os fármacos de classe II(hidrossolúveis não permeáveis), de classe III (hidrofóbicospermeáveis) e preferencialmente de classe IV (hidrofóbicosnão permeáveis) segundo a definição da FDA.

Entre as moléculas biologicamente ativas que sepodem utilizar com o sistema da invenção podemos citar entreoutras as seguintes moléculas de classe II: Danazol ;Ketoconazol; ácido mefenámico; Nisoldipina; Nifedipina;Nicardipina; Felodipina, Atovaquona, Griseofulvina,Troglitazona, Glibenclamida, Carbamazepina; de classe III:Aciclovir; Neomicina B; Captopril; Enalaprilato; Alendronato,Atenolol, Cimetidina, Ranitidina; de Classe IV: Clorotiazida;Furosemida; Tobramicina, Cefuroxima, Itraconazol,Ciclosporina.

Em uma realização preferencial, a moléculabiologicamente ativa é o triclosano. Em outra realizaçãopreferencial a molécula biologicamente ativa é a furosemida.

Em outra realização particular, as moléculasbiologicamente ativas são macromoléculas de tipo peptídico,polisacarídico, proteico ou baseadas em ácidos nucleícos(oligonucleotídios, ADN, siRNA).

Em uma realização preferencial a moléculabiologicamente ativa é a insulina. Em outra realizaçãopreferencial, a molécula biologicamente ativa é a heparina.

Em outra realização preferencial a molécula biologicamenteativa é o ADN.

Outro aspecto da presente invenção constitui umavacina que inclui o sistema nanoparticulado previamentedefinido e um antigeno. A administração de um antígeno pelosistema constituído pelas nanopartículas permite obter umaresposta de imunização. A vacina pode incluir uma proteína,um polissacarídeo ou ainda pode ser uma vacina de ADN.

Estritamente falando, uma vacina de ADN é uma molécula de ADNque codifica a expressão de um antígeno que dará lugar a umaresposta de imunização.

A associação da molécula biologicamente ativa podeocorrer por processos combinados que incluem interações nãocovalentes entre a molécula ativa e o polímero ou aassociação da molécula ativa a uma ciclodextrina formando umcomplexo de inclusão e a interação não covalente destecomplexo com a matriz polimérica.

Com o fim de obter uma adequada incorporação damolécula biologicamente ativa nas nanopartículas dequitosano, utilizando a aproximação complexação moléculaativa-ciclodextrina, é necessário primeiro dissolver umaquantidade razoável de molécula ativa devido à suacomplexação com a ciclodextrina e, posteriormente, encapsularuma quantidade suficiente de complexo na estrutura dasnanopartículas.

Outro objeto da presente invenção constitui umacomposição farmacêutica que inclui o sistema nanoparticuladoanteriormente definido e uma molécula biologicamente ativacapaz de prevenir, paliar ou curar doenças.

Exemplos de composições farmacêuticas incluemqualquer composição líquida (suspensão de nanopartículas) ousólida (nanopartículas liofilizadas ou atomizadas formando umpó que se pode utilizar para preparar granulados, comprimidosou cápsulas) para administração tanto por via oral, bucal,sublingual, ou ainda sob forma líquida ou semi-sólida para aadministração por via tópica, transdérmica, ocular, nasal,vaginal ou ainda intravenosa. No caso das vias nãointravenosas o contacto das nanopartículas com a pele oumucosas poderá ser melhorado dotando as partículas de umaimportante carga positiva, o que favorecerá a sua interaçãocom as citadas superfícies carregadas negativamente. No casodas vias intravenosas, mais em concreto para a administraçãointravenosa, estes sistemas oferecem a possibilidade demodular a distribuição in vivo dos fármacos ou moléculas quepodem levar associadas.

Num aspecto preferencial a composição farmacêuticaé administrada por via mucosa. A carga positiva apresentadapela mistura quitosano-ciclodextrina proporciona uma melhorabsorção dos fármacos sobre a superfície da mucosa através dasua interação com a mucosa e as superfícies das célulasepiteliais que estão carregadas negativamente.

A proporção de ingrediente activo incorporado nasnanopartículas pode ser de até 4 0% em peso relativamente aopeso total do sistema. Não obstante, a proporção adequadadependerá em cada caso do ingrediente activo que vai serincorporado, da indicação a que está dirigido e da eficiênciade libertação.

Os sistemas nanoparticulados da presente invençãotambém podem incorporar moléculas cosmeticamente ativas quenão têm efeitos terapêuticos mas que dão lugar a composiçõescosméticas. Estas composições cosméticas incluem qualquercomposição líquida (suspensão de nanopartículas) ou emulsãopara administração por via tópica. Entre as moléculascosmeticamente ativas que podem ser incorporadas àsnanopartículas cabe citar agentes anti-acne, anti-fúngicos,antioxidantes, desodorizantes, anti-transpiração, anti-caspa,branqueadores da pele, bronzeadores, absorventes de luz UV,enzimas, biocidas cosméticos, entre outros.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a umprocedimento para a preparação de nanopartículas dequitosano-ciclodextrina como as acima definidas, que inclui:

a) preparação de uma solução de quitosano ou deum derivado do mesmo em meio aquoso ou em umamistura de água com um solvente polar;

b) preparação de uma solução de ciclodextrina oude um derivado da mesma em meio aquoso ou em umamistura de água com um solvente polar e,opcionalmente, um agente reticulante; e

c) mistura, sob agitação, das soluções das etapasa) e b) de modo a que se obtenham espontaneamenteas nanopartículas de quitosano-ciclodextrina,ou opcionalmente:

a. preparação de uma solução de quitosano ou deum derivado do mesmo e uma ciclodextrina ou umderivado da mesma em meio aquoso ou em uma misturade água com um solvente polar;

b. preparação de uma solução do agentereticulante em meio aquoso ou em uma mistura deágua com um solvente polar;

c. mistura, sob agitação, das soluções das etapasa) e b) de modo a que se obtenham espontaneamenteas nanopartículas de quitosano-ciclodextrina.

Como solventes polares podem utilizar-se solventesnão tóxicos, entre outros, acetonitrilo, álcoois e acetona.Deste modo, o meio aquoso utilizado pode conter sais dediversas naturezas.

Em uma variante do procedimento a relação em massaquitosano/ ciclodextrina/ agente reticulante resultante estácompreendida entre 4/4/1 e 4/80/1. Não obstante, também épossível utilizar relações mais elevadas de quitosano emrelação à ciclodextrina ou em relação ao agente reticulante,dependendo do tipo de ciclodextrina utilizado. Assim, paraciclodextrinas neutras (como a HPpCD), a presença daciclodextrina não parece afectar o processo de formação dasnanopartículas.

A molécula biologicamente ativa pode serincorporada diretamente nas soluções das etapas a) ou b), demodo a que se obtenham espontaneamente as nanopartículas dequitosano-ciclodextrina contendo a molécula biologicamenteativa. Não obstante, em uma variante do procedimento, amolécula pode dissolver-se em uma etapa anterior em uma faseaquosa ou em uma mistura de fase aquosa e solvente polar,sendo em seguida incorporada às fases a) ou b) antes dapreparação das partículas (etapa c)). No entanto, parafármacos com baixa solubilidade, conseguem-se concentraçõessuperiores se a dissolução da molécula ativa for feita nafase com a ciclodextrina.

0 procedimento de elaboração das nanopartículas dequitosano-ciclodextrina pode incluir, além disso, uma etapaadicional, na qual as ditas nanopartículas são Iiofilizadas.

De um ponto de vista farmacêutico é importante poder dispordas nanopartículas sob a forma liofilizada já que assim semelhora a sua estabilidade durante o período de armazenamentoe se reduz o volume do produto que é necessário manipular. Asnanopartículas de quitosano-ciclodextrina podem serliofilizadas em presença de um crio-protetor, tal como aglucose, sacarose ou trealose, com uma concentração queoscila entre 1 e 5% em peso. Deste modo, as nanopartículas dainvenção apresentam a vantagem adicional de que o tamanho daspartículas antes e depois da liofilização não ésignificativamente afetado. Quer dizer, as nanopartículasapresentam a vantagem de poderem ser liofilizadas e novamentesuspensas sem sofrer qualquer alteração das suascaracterísticas físicas.

O sistema da presente invenção demonstrou ser umveículo altamente eficaz para interagir com células epiteliaise promover a transfecção de um polinucleotídio em uma célula.

As nanopartículas incluídas no sistema podem incorporar nacélula material genético tal como uma molécula baseada emácidos nucleícos, um oligonucleotídio, siARN ou umpolinucleotídio, preferencialmente um plasmídio de ADN quecodifica uma proteína com interesse, o que permite que osistema seja potencialmente adequado para a sua utilização emterapia genética. Em uma realização particular, o plasmídio deADN é o pEGFP.

Estudos in vitro permitiram observar a libertação doplasmídio de AND de uma forma muito eficaz, alcançandoimportantes níveis de transfecção celular. Em conseqüência,outro aspecto da invenção refere-se à utilização do sistemananoparticulado da invenção na preparação de um medicamentopara terapia genética. Num aspecto particular, inclui umpolinucleotídio que inclui um gene capaz de se expressarfuncionalmente nas células do paciente a ser tratado.

Neste sentido, alguns exemplos de doenças que podemser tratadas utilizando o sistema da invenção são adegeneração macular com anti-sentidos contra a VEGF,epidermolisis bulbosa e a fibrose quística. Também podeutilizar-se para curar feridas com esquemas de transformaçãotransitória.

Finalmente, devido à sua alta capacidade detransfecção, o sistema e as composições da invenção, quecontêm polinucleotídios sintéticos ou naturais, permitem asua utilização para a transfecção de células diana,preferencialmente células de mamífero neoplásticas ou"normais", assim como de células mãe ou linhas celulares.

Deste modo, são uma ferramenta útil para a manipulaçãogenética de células. Neste sentido, a invenção também sedirige à utilização do sistema da invenção para a manipulaçãogenética de células. Preferivelmente, utiliza-se para alibertação de ácidos nucleícos in vitro ou ex vivo. Essalibertação dirige-se a células diana que incluem: célulaseucariotas, tais como células de mamíferos e linhascelulares, e podem conduzir à transfecção ou transformaçãocelular in vitro ou ex vivo. Por isso, a invenção também serelaciona com um kit para a transfecção de célulaseucariotas, que inclui o sistema da invenção e diluentesadequados e/ou tampões para lavagem celular.

Descrevem-se abaixo alguns exemplos ilustrativos dainvenção que, não obstante, não devem ser considerados comolimitativos da mesma.

EXEMPLOS

As propriedades físico-químicas das formulações comcomposição diferente e com diferentes relações de polímerosforam caracterizadas utilizando as técnicas de espectroscopiade correlação fotónica (PCS) e anemometria Iaser-Doppler. Amorfologia das nanopartículas foi estudada através demicroscopia eletrônica de transmissão (TEM) e microscopiaeletrônica de varrimento (SEM). A composição dasnanopartículas preparadas foi estudada utilizando técnicas deanálise elementar. Este estudo evidenciou a presença demisturas quitosano-ciclodextrina nas matrizes dasnanopartículas.

Exemplo 1.

Avaliação das características das nanopartículas dequitosano-ciclodextrina em função do tipo de quitosano e daconcentração de TTP.Foram preparadas soluções (3 mL) de hidroxipropil-β-ciclodextrina (HPPCD) com concentração fixa (6,29 mM) comdiferentes quitosanos (CS) (0,2% p/p). Estas soluções foramincubadas durante 24 h sob agitação magnética e,posteriormente, foram filtradas por um filtro de 0.45 μτη ereticuladas pela adição de diversos volumes de tripolifosfatocom concentrações de 1,25 mg/mL ou 2 mg/mL de forma que semanteve sempre uma relação de massa quitosano/ tripolifosfatode 4:1. As nanoparticulas foram isoladas por centrifugação a1600Oxg e novamente suspensas em água. O tamanho dasnanoparticulas foi determinado por espectroscopia decorrelação fotónica (PCS). Os resultados relativos ao tamanhomédio e ao índice de poli-dispersão das nanoparticulas emfunção do peso molecular do quitosano utilizado e daconcentração de tripolifosfato utilizado como reticulante,são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1: Efeito do tamanho molecular do quitosano (CS Mw),da presença de ΗΡβΟΏ e da concentração do agente reticulantetripolifosfato (TPP) no tamanho médio e na poli-dispersão dasnanoparticulas (Média ±desv.est., n=3).

<table>table see original document page 24</column></row><table>

Exemplo 2.

Avaliação das características de nanoparticulas de quitosano-ciclodextrina em função do tipo e concentração daciclodextrina (concentração de TTP = 2 mg/mL).

Foram preparadas soluções (3 mL) de quitosano, emconcreto o cloro-hidrato de quitosano (Protasan ClllO) a 0,2%(p/p) com diferentes quantidades dehidroxipropilciclodextrina (a- ou β-) (Oa 25 mM). Assoluções foram incubadas durante 24 h sob agitação magnéticae, posteriormente, foram filtradas através de um filtro comporos de 0,45 ym e reticuladas pela adição de 0,75 mL detripolifosfato com uma concentração de 2 mg/mL. Asnanopartícuias foram isoladas por centrifugação a 1600Oxg enovamente suspensas em água. O tamanho das partículasresultantes e a sua poli-dispersão foram caracterizados pelaespectroscopia de correlação fotónica (PCS), o potencial zetaatravés da anemometria laser doppler e o rendimento deprodução pesando o resíduo seco da amostra de nanopartículasisoladas. O resultado é mostrado na Tabela 2.

A Figura 1 (imagem da esquerda) e a Figura 2 mostram amorfologia das partículas preparadas a partir de 25 mM deHPpCD analisadas por e TEM e SEM respectivamente, confirmandoa formação de nanopartículas esféricas.

Tabela 2: Efeito do tipo e concentração dahidroxipropilciclodextrina nas características dasnanopartículas quitosano-ciclodextrina (tamanho, poli-dispersão, potencial .zeta e rendimento de produção) (Médias ±desv. est., n=3).

<table>table see original document page 25</column></row><table>Exemplo 3.

Avaliação das características das nanopartículas dequitosano-ciclodextrina em função do tipo e concentração deciclodextrina (concentração de TTP = 1,25 mg/mL).

Foram feitas soluções (3 mL) de quitosano (Protasan ClllO) a0,2% (p/p) com diferentes quantidades dehidroxipropilciclodextrina (a- ou β-) (0 a 25 mM). Assoluções foram incubadas durante 24 horas sob agitaçãomagnética e, posteriormente, as soluções foram filtradasatravés de um filtro com poros de 0,45 μπι e reticuladas pelaadição de 1,2 mL de tripolifosfato com concentrações de 1,25mg/mL. As nanopartículas foram isoladas por centrifugação a1600Oxg e novamente suspensas em água. O tamanho daspartículas resultantes e a sua poli-dispersão foicaracterizado através da espectroscopia de correlaçãofotónica (PCS), o potencial zeta através da anemometria laserdoppler e o rendimento de produção pesando o resíduo seco daamostra de nanopartículas isoladas. Os resultados sãomostrados na Tabela 3.

A Figura 1 (imagem da direita) mostra a morfologia de algumaspartículas preparadas a partir de 25 mM de HPpCD analisadasatravés de TEM.

Tabela 3: Efeito do tipo e concentração dahidroxipropilciclodextrina nas características denanopartículas quitosano-ciclodextrina (tamanho, poli-dispersão, potencial zeta e rendimento de produção) (Médias ±Est. Desv., n=3).

<table>table see original document page 26</column></row><table><table>table see original document page 27</column></row><table>

Os resultados obtidos nos exemplos 2 e 3 demonstramque a inclusão das ciclodextrinas influencia o tamanho dasnanoparticulas resultantes mas sem fazer variar em demasiadoo seu valor. No que se refere ao potencial Z, asnanoparticulas preparadas em presença de ciclodextrinas,apresentam valores muito similares. Destes dados deduz-se queas ciclodextrinas não interferem no processo de formação dasnanoparticulas e que não estão necessariamente associadas aelas.

Por outro lado, o rendimento de produção aumentanotavelmente ao aumentar a concentração de ciclodextrina.

Exemplo 4.

Estabilidade de nanoparticulas de quitosano e ciclodextrinaem culturas celulares.

Foram preparadas nanoparticulas de quitosano comdois tipos de ciclodextrina através da mistura de uma soluçãoaquosa de sulfobutileter-p-ciclodextrina (SBE-CD) ou decarboximetil-p-ciclodextrina (CM-CD) com uma solução aquosade quitosano (CS) sob agitação magnética na presença doagente reticulante TPP de forma a que a relação entre osvários componentes seja:

CS/SBE-CD/TPP: (4/3/0.25)CS/CM-CD)/TPP: (4/4/0.25)

A seguir, as nanoparticulas foram isoladas porcentrifugação e posteriormente foram incubadas em uma soluçãosalgada de Hanks (HBSS) a 37°C. Esta solução tamponada (quecontém sais inorgânicos e glucose) é provavelmente a maisutilizada em experiências com culturas celulares dado quepermite manter as células a pH fisiológico e pressãoosmótica, preservando-as assim num estado viável durantecurtos períodos de tempo sem facilitar o seu crescimento. Osestudos de estabilidade foram levados a cabo através damedição da mudança de tamanho das nanopartículas.

Como mostrado na Figura 3, as nanopartículas dequitosano e ciclodextrina mostraram ser estáveis sobcondições experimentais.

Exemplo 5.

Estabilidade de nanopartículas de quitosano e ciclodextrinaem fluido intestinal simulado.

Foram separadas nanopartículas de quitosano ecarboximetil-P-CD como descrito no exemplo 4 por gelificaçãoiónica, em presença e ausência de TPP. A estabilidade destasnanopartículas foi avaliada num fluido intestinal simuladocom pH=6,6 e 37 °C. Este meio reproduz as condições dointestino delgado mas pode também refletir a estabilidade dasnanopartículas sobre a mucosa nasal. As nanopartículasmostraram uma estabilidade durante mais de 4 horas, tal comose mostra na Figura 4, pelo que se configuram como sistemasadequados para diferentes vias de administração.

Exemplo 6.

Avaliação da capacidade de encapsulamento da insulina emnanopartículas de quitosano e ciclodextrina.

Foram preparadas nanopartículas de quitosano ecarboximetil-p-CD tal como descrito no exemplo 4 ou 5utilizando diferentes concentrações de ciclodextrina e de TPPe, em alguns casos, incorporando às soluções aquosas iniciaisuma concentração de insulina a 0,24%. Posteriormente asnanopartículas foram isoladas por centrifugação. A Tabela 4mostra as características físico-químicas das nanopartículascarregadas ou não com insulina.

Tabela 4: Características físico-químicas das nanopartículasCS/CM-CD/TPP carregadas ou não com insulina. (*)nanopartículas carregadas com insulina<table>table see original document page 29</column></row><table>

Como se pode ver, o tamanho das nanopartí cuiascarregadas oscila entre 430 e 635 nm, sendo esse tamanho atéduas vezes superior ao verificado quando as nanoparticulasnão estão carregadas com insulina.

Por outro lado, a Tabela 5 mostra a capacidade de carga dainsulina nas nanoparticulas. Pode observar-se que a insulinapode incorporar-se de forma muito eficiente às nanoparticulasapresentando eficiências de associação superiores a 85%.

Tabela 5: Eficácia no encapsulamento de insulina nasnanoparticulas CS/CM-CD/TPP (concentração de insulina 0.24%).

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Deste modo foi avaliada a estabilidade das nanoparticulas deCS/CM-CD/TPP carregadas com insulina no fluido intestinalsimulado com pH 6,8 e 37°C como descrito no exemplo 5. Otamanho das nanopartículas não aumentou relativamente aotamanho inicial nas duas primeiras horas (Figura 5).

Exemplo 7.

Avaliação da solubilidade da triclosana, da eficácia deencapsulamento e da sua carga em nanopartículas em função dotipo e concentração de ciclodextrina.

Foram obtidas nanopartículas de quitosano-ciclodextrina de acordo com o método exposto no exemplo 2,apenas acrescentando às dissoluções iniciais uma quantidadede fármaco triclosano suficiente para sobresaturar a solução.

O fármaco não dissolvido pela mistura ciclodextrina-polímero,foi removido no processo de filtragem (através de 0,45 μιη)que é feito antes da reticulação do polímero por cruzamentoionotrópico (ver exemplo 2). A tabela 6 mostra a solubilidadealcançada para o triclosano nas soluções iniciais utilizadaspara a formação das partículas, a eficácia do encapsulamentodo triclosano nas nanopartículas e a carga de triclosanoalcançada nestas nanopartículas. O triclosano foi medidoutilizando um método espectro-fotométrico (λ=280 nm).

A eficácia de encapsulamento (EE) refere-se àpercentagem de fármaco que está agarrado no sistemaquitosano-ciclodextrina relativamente à quantidade de fármacoadicionado no processo de preparação das nanopartículas. Acarga do fármaco é determinada indiretamente a partir docálculo do fármaco não encapsulado que permanece dissolvidono meio de suspensão das nanopartículas. A diferença entreeste valor e o conteúdo teórico do fármaco considera-se comosendo a quantidade de fármaco carregado nas nanopartículas. Apercentagem de carga do fármaco que aparece na tabela é apercentagem referida à quantidade de fármaco encapsulado em100 mg de nanopartícula.

Tabela 6: Efeito do tipo e concentração da ciclodextrinautilizada na solubilização do triclosano, eficácia doencapsulamento resultante (EE) e a sua carga nasnanopartículas finais. (Média ± Desv. Est., n=3).

<table>table see original document page 29</column></row><table>

Exemplo 8.

Avaliação da solubilidade da furosemida, da eficácia doencapsulamento e da sua carga em nanopartículas em função dotipo e concentração de ciclodextrina.

Foram preparadas nanopartículas de quitosano-ciclodextrina de acordo com o método exposto no exemplo 3,mas acrescentando às soluções iniciais uma quantidade dofármaco furosemida suficiente para sobresaturar a solução. Ofármaco não dissolvido pela mistura ciclodextrina-polímero,foi eliminado no processo de filtragem (através de 0,45 pm)levado a cabo antes da reticulação do polímero (ver exemplo3). A Tabela 7 mostra a solubilidade obtida para a furosemidanas soluções iniciais utilizadas para a formação daspartículas, a eficácia de encapsulamento da furosemida nasnanopartículas e a carga de furosemida obtida nestasnanopartículas. A furosemida foi medida utilizando um métodoespectrofotométrico (λ=230 nm) . Para a determinação daquantidade de furosemida encapsulada, determinou-se aquantidade de triclosano não sobrenadante das partículas apóso seu isolamento (quantidade não associada) e calculou-se adiferença.

Tabela 7: O efeito do tipo e concentração da ciclodextrinautilizada na solubilização da furosemida, a eficácia deencapsulamento resultante (EE) e a sua carga nasnanopartículas finais. (Média ± Desv. Est., n=3).

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Exemplo 9.

Libertação do fármaco triclosano ou furosemida dasnanopartículas de quitosano-ciclodextrina.

Foram preparadas nanopartículas de quitosano-ciclodextrina com triclosano e furosemida. Para a realizaçãoda formulação com triclosano, seguiu-se o processo descritono exemplo 7 (formulações com 25 mM de HPCD α ou β) e para aformulação da furosemida, o método descrito no exemplo 8(formulações com 25 mM de HPCD α ou β) . As nanopartículasforam isoladas e novamente suspensas num tampão acetato (pH6,0, baixa força iónica). As nanopartículas foram incubadasneste meio com agitação horizontal (100 rpm) a 37°C. Adiversos intervalos (0,5, 1,5 e 4,5 h), foram recolhidasamostras dos meios de incubação, isolou-se o fármaco emsolução (centrifugação a 200000xg durante 30 min) e foi feitoo cálculo por métodos espectrofotométricos tal como estádescrito nos exemplos 7 e 8. O perfil de cessão do fármacodas formulações preparadas é mostrado na Figura 6.

Exemplo 10.

Avaliação da solubilidade de triclosano, da eficácia deencapsulamento e da sua carga em nanopartículas em função dotipo e concentração de ciclodextrina.

Foram preparadas soluções em uma mistura de 80% deágua e 20% de etanol (3 mL) de quitosano (Protasan ClllO,0,2%), HPpCD (0, 1,28 e 2,56 mM) e triclosano em quantidadesuficiente para sobresaturar a solução. Estas soluções foramincubadas durante 24 h sob agitação magnética e,posteriormente, filtradas através de um filtro de 0,45 μπ\ ereticuladas pela adição de 1,2 mL de tripolifosfatodissolvido em uma mistura de 80% de água e 20% de etanol comuma concentração de 1,25 mg/mL. As nanopartículas foramisoladas através de centrifugação a 16000xg e novamentesuspensas em água. 0 tamanho das partículas resultantes e asua poli-dispersão foi caracterizado através daespectroscopia de correlação fotónica (PCS). A quantidade defármaco encapsulado foi determinada através da degradação deuma alíquota das nanopartículas novamente suspensas com aenzima quitosanasa (Chitosanase-RD, Pias Co, Japón), o seuvalor foi determinado através da espectrofotometria (λ=2 80nm). Os resultados são mostrados na Tabela 8.

Tabela 8: 0 efeito da concentração da ciclodextrina utilizadana solubilização do triclosano na fase utilizada para apreparação das nanopartículas, a eficácia de encapsulamentoresultante das nanopartículas (EE) e a sua carga final nasnanopartículas. (Média ± Desv. Est., n=3).

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do tipo de ciclodextrina.Foram preparadas soluções de: (A) metil-β-ciclodextrina (Με-β-CD) (7,4 mM) , tripolifosfato (1,25 rag/mL)e um plasmídio codificante da proteína fluorescente verde(pGFP) (0,5 mg/mL) ; e (B) sulfobutil-β-ciclodextrina (0,18mM) (SB-β-Οϋ) e um plasmídio codificante da proteínafluorescente verde (pGFP) (0,5 mg/mL). Ambas as soluçõesforam incubadas durante um período de 1 hora sob agitação. Umvolume de 0,24 mL das soluções A ou B foi adicionado a 1,2 mLde quitosano 0,1% (p/p) sob agitação magnética formandonanopartículas. O tamanho e poli-dispersão das partículasresultantes foi caracterizado através da espectroscopia decorrelação fotónica (PCS). Os resultados são mostrados naTabela 9.

Tabela 9: 0 efeito do tipo de ciclodextrina no tamanho epoli-dispersão de nanopartículas de quitosano-ciclodextrinacom ou sem ADN plasmídico. (Média ± Desv. Est., n=3).

*Expressa como gama de valores.

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Com a formulação de nanopartículas de quitosano-sulfobutilciclodextrina com ADN foi preparado um gel deelectroforese em agarose antes do seu isolamento. Comocontroles foi incluído plasmídio em solução, a formulação semplasmídio e a formulação com plasmídio degradado comquitosanasa (Chitosanase-RD, Pias Co, Japón). Os resultadossão mostrados na Figura 7.

Exemplo 12.

Estudo in vitro da eficácia de transfecção de culturascelulares.

Foi preparada uma formulação de nanopartículas comoa descrita no exemplo 11. A formulação foi isolada porcentrifugação (16000xg, 30 min) e foi novamente suspensa emuma solução tampão com pH 6,0 com baixa força iónica. Umaquantidade da formulação contendo 1 ou 2 μς de ADN foiincubada com culturas celulares. Os resultados de transfecçãocelular obtida são mostrados na Figura 8. A imagem defluorescência mostra as colônias celulares que apresentam aproteína fluorescente verde como conseqüência da transfecçãopelo sistema nanopartícula-pGFP. 0 plasmídio sem veículo nãomostrou a capacidade para transfectar as células, o que querdizer que não se observaram colônias celulares fluorescentes.

Exemplo 13.

Efeito do tipo de ciclodextrina e da relação de massa entrequitosano, ciclodextrina e tripolifosfato na composição finaldos sistemas nanoparticulados.

Foram preparadas nanopartículas de quitosano-HPpCDe de quitosano- SBpCD como nos exemplos 3 e 11respectivamente. Foram utilizadas quantidades diferentes dasciclodextrinas nas soluções iniciais utilizadas para apreparação das nanopartículas. A composição real dasnanopartículas (% quitosano, % ciclodextrina, % contra-iões)após o seu isolamento foi determinada através de técnicas deanálise elementar (considerando as relações Nitrogénio-Carbono ou Nitrogênio-sulfureto). 0 grau de humidade nasamostras foi determinado por análise termo-gravimétrica.

Tabela 10: 0 efeito do tipo de ciclodextrina e da relação demassa entre quitosano (CS), ciclodextrina (CD) etripolifosfato (TPP) na composição final dos sistemaspreparados (% de peso seco). (Média ± Desv. Est., n=3).*Aproximadamente zero.<table>table see original document page 36</column></row><table>

Exemplo 14.

Estudo do transporte de nanopartículas de quitosano-ciclodextrina através da mucosa nasal de ratos.

Com a finalidade de avaliar o potencial dossistemas nanoparticulados da invenção como veículos para aadministração de fármacos foi analisada a capacidade dasditas nanopartículas para atravessar o epitélio nasal. Esteestudo foi feito com duas formulações específicas dequitosano/sulfobutiletil-p-ciclodextrina (CS/SBE-P-CD) equitosano/carboximetil-P-ciclodextrina (CS/CM-p-CD)utilizando diferentes proporções dos componentes. 0 quitosanofoi previamente marcado com fluoresceína (FI-CS). O processode marcação foi feito por reação de carbodimida com EDAC quepermitiu a união covalente do marcador fluorescente com asmoléculas de quitosano tal como se descrevem em Pharm. Res. ,2004, 21, 803-10. A Tabela 11 mostra as característicasfísico-químicas das nanopartículas avaliadas marcadas comfluoresceína.

Tabela 11. Características físico-químicas das nanopartículasavaliadas marcadas com fluoresceína.

<table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table>

Uma suspensão destas nanopartículas (em relação àsquais se avaliou previamente a sua estabilidade num meio detransporte de trealose a 5% p/p, Figura 9), foi administradapor forma intra nasal a ratos totalmente despertos. Decorridoum tempo pré-estabelecido (especificamente 10 minutos após aadministração) os ratos foram sacrificados por deslocaçãocervical e a mucosa nasal foi fixada com paraformaldeído, foifeita a sua excisão e posteriormente foi feita a suaobservação com um microscópio confocal (CLSM, Zeiss 501,Jena, Alemanha) a 488 nm. As imagens observadas evidenciaramque estas nanopartículas apresentavam uma interaçãoimportante com a mucosa nasal.

Claims (31)

1. SISTEMA QUE INCLUI NANOPARTÍCULAS PARA A LIBERTAÇÃODE MOLÉCULAS BIOLOGICAMENTE ATIVAS, caracterizado pelo fatode que as nanopartículas incluem a) pelo menos 4 0% em peso dequitosano ou um derivado do mesmo e b) menos de 60% em pesode uma ciclodextrina ou um derivado da mesma, em que ambos oscomponentes a) e b) se encontram misturados, sem que existauma união covalente entre eles.

2. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelas nanopartículas incluirem além desses umsal aniônico capaz de reticular ionicamente o quitosano sob aforma de estruturas nanométricas.

3. SISTEMA, de acordo com as reivindicaçõe 1 e 2,caracterizado pela proporção de quitosano ou de um derivadodo mesmo estar compreendida entre pelo menos 40% e 95,5% empeso.

4. SISTEMA, de acordo com as reivindicações 1 a 3,caracterizado pela proporção de ciclodextrina ou de umderivado da mesma estar compreendido entre 0,5% e menos de-60% em peso.

5. SISTEMA, de acordo com as reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo grau de polimerização do quitosano ou onúmero de unidades monoméricas que incluem o quitosano ou umderivado do mesmo estar compreendido entre 5 e 5000,preferencialmente entre 30 e 600.

6. SISTEMA, de acordo com as reivindicações 1 a 5,caracterizado pelo quitosano ou um seu derivado ter um pesomolecular compreendido entre 1 e 2000 kDa, preferencialmenteentre 5 e 500 kDa, mais preferencialmente entre 5 e 200 kDa.

7. SISTEMA, de acordo com as reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo quitosano ou um seu derivado ter um graude não-acetilação compreendido entre 30% e 95%,preferencialmente entre 50% e 95%.

8. SISTEMA, de acordo com as reivindicações 1 a 7,caracterizado pela ciclodextrina ser selecionada de entreciclodextrinas naturais (alfa, beta ou gama),hidroxipropilciclodextrinas, carboximetilciclodextrinas,sulfobutilciclodextrinas, aminociclodextrina,dimetilciclodextrina, ciclodextrina fosfato,hidroxietilciclodextrina, acetil-ciclodextrina,etilciclodextrinas, trimetilciclodextrinas,carboxietilciclodextrina, glucosilcilcodextrina, 6-0-a-maltosilciclodeextrinas, butil-ciclodextrinas, ciclodextrinasulfatadas, N,N-dietilaminoetilciclodextrina, tert-butilsililciclodextrinas, Silil [ (6-0-tert-butildimetil)-2,3,-di-O-acetil)- ciclodextrinas, Succinil-(2-hidroxipropil)-ciclodextrinas, Succinil-ciclodextrinas, Sulfopropil-ciclodextrinas, policiclodextrinas.

9. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pela ciclodextrina ser o hidroxipropil-a-ciclodextrina, hidroxipropil-p-ciclodextrina, sulfobutiletil-β-ciclodextrina ou misturas das mesmas.

10. SISTEMA, de acordo com as reivindicações 1 a 9,caracterizado pela ciclodextrina apresentar um grau desubstituição médio entre 4,2 e 7.

11. SISTEMA, de acordo com as reivindicações 1 a 10,carcterizado por incluir além disso, uma moléculabiologicamente ativa selecionada do grupo composto porfármacos de baixo peso molecular, polissacarídeos, proteínas,peptldeos, lipídios, oligonucleotídios, ácidos nucleícos ecombinações das mesmas.

12. SISTEMA, de acordo com as reivindicações 1 a 11,caracterizado pela molécula biologicamente ativa ser umfármaco de classe II, III ou IV segundo as definições doSistema de Classificação Biofarmacêutico adotado pela a FDA,preferencialmente é um fármaco de classe IV.

13. SISTEMA, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo agente reticulante ser um sal depolifosfato, preferencialmente tripolifosfato sódico.

14. SISTEMA, de acordo com as reivindicações 1 a 13,caracterizado pelo tamanho médio das nanopartículas estarcompreendido entre 1 e 999 nm, preferencialmente entre 100 e-800 nm.

15. SISTEMA, de acordo com as reivindicações 1 a 14,caracterizadopela carga eléctrica (potencial Z) estarcompreendida entre 0 e +60 mV medida em ImM KCl.

16. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por incluirum sistema como definido em qualquer das reivindicações de 1a 15 e uma molécula biologicamente ativa capaz de prevenir,paliar ou curar doenças.

17. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 16,caracterizado pela administração ser por via oral, bucal,sublingual, tópica, transdérmica, ocular, nasal, vaginal ouintravenosa.

18. COMPOSIÇÃO, de acordo com as reivindicações 16 e-17, caracterizado pela molécula biologicamente ativa seselecionar de entre os polissacarídeos, proteínas, peptídeos,lipídios, moléculas baseadas em ácidos nucleícos ecombinações das mesmas.

19. COMPOSIÇÃO, de acordo com as reivindicações 16 a-18, caracterizado pela molécula biologicamente ativa ser umfármaco de classe II, III ou IV segundo as definições doSistema de Classificação Biofarmacêutica adotado pela FDA.

20. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer dasreivindicações 16 a 18, caracterizado pela moléculabiologicamente ativa ser o triclosano, a furosemida, ainsulina, a heparina ou moléculas compostas de ácidosnucleícos.

21. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, caracterizada por incluir umsistema como definido em qualquer das reivindicações 1 a 10 ede 13 a 15 e uma molécula cosmeticamente ativa.

22. COMPOSIÇÃO COSMÉTICA, de acordo com a reivindicação-21, caracterizado pela molécula cosmeticamente ativa serselecionada de entre agentes anti-acne, anti-fúngicos,antioxidantes, desodorizantes, anti-transpiração, anti-caspa,branqueadores da pele, bronzeadores, absorventes de luz UV,enzimas e biocidas cosméticos.

23. VACINA, caracteizada por incluir um sistema para alibertação de uma molécula biologicamente ativa, de acordocom qualquer das reivindicações de 1 a 15 e um anti-genético.

24. VACINA, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo anti-genético ser selecionado de entreproteínas, polissacarídeos e moléculas de ADN.

25. PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DE UM SISTEMA PARA ALIBERTAÇÃO CONTROLADA DE MOLÉCULA BIOLOGICAMENTE ATIVA,segundo qualquer das reivindicações 1 a 15, caracteizado pelofato de que inclui:a) preparação de uma solução de quitosano ou um derivado domesmo em meio aquoso ou em uma mistura de água com umsolvente polar;b) preparação de uma solução de ciclodextrina ou um derivadoda mesma em meio aquoso ou em uma mistura de água com umsolvente polar e, opcionalmente, um agente reticulante,· ec) mistura, sob agitação, das soluções das etapas a) e b) demodo a que se obtenham espontaneamente as nanopartículasde quitosano-ciclodextrina,ou opcionalmente:a) preparação de uma solução do quitosano ou umderivado do mesmo e uma ciclodextrina ou umderivado da mesma em meio aquoso ou em umamistura de água com um solvente polar;b) preparação de uma solução do agentereticulante em meio aquoso ou em uma misturade água com um solvente polar;c) mistura, sob agitação, das soluções dasetapas a) e b) de modo a que se obtenhamespontaneamente as nanoparticulas dequitosano-ciclodextrina.

26. PROCEDIMENTO PARA A OBTENÇÃO DE NANOPARTICULAS,segundo a reivindicação 25, caracterizado pelo agentereticulante ser um tripolifosfato, preferencialmente otripolifosfato sódico.

27. PROCEDIMENTO, de acordo com qualquer dasreivindicações 25 e 26, caracterizado pela moléculabiologicamente ativa ser previamente dissolvida nas etapas a)ou b) ou em outra fase aquosa ou orgânica que se adiciona aa) ou b).

28. PROCEDIMENTO, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pela molécula biologicamente ativa serselecionada de entre polissacarídeo, proteínas, peptídeos,lipidios, moléculas baseadas em ácidos nucleícos ecombinações das mesmas.

29. PROCEDIMENTO, de acordo com as reivindicações 25 e-28, caracterizado pela molécula biologicamente ativa ser umfármaco de classe II, III ou IV segundo a (oBiopharmaceutical Classification System) FDA,preferencialmente um fármaco de classe IV.

30. PROCEDIMENTO, de acordo com as reivindicações 28 e-29, caracterizado pela molécula biologicamente ativa ser otriclosano, a furosemida, a insulina, a heparina ouplasmídios de ADN.

31. UTILIZAÇÃO DE UM SISTEMA, segundo as'reivindicações-1 a 15, caracterizado pelo fato de ser na preparação de ummedicamento para terapia genética.