BRPI0613287A2 - cepa do vìrus da dengue-2 vivo atenuada, composição imunogênica, composição de vacina, ácido nucléico isolado, poliproteìna isolada codificadas pela seq id n .1 ou fragmentos desta e fragmento da poliproteìna - Google Patents

Abstract

CEPA DO VìRUS DA DENGUE-2 VIVO ATENUADA, COMPOSIçãO IMUNOGéNICA, COMPOSIçãO DE VACINA, áCIDO NUCLéICO ISOLADO, POLIPROTEINA ISOLADA CODIFICADAS PELA SEQ ID N 1 OU FRAGMENTOS DESTA E FRAGMENTO DA POLIPROTEINA. A presente invenção se refere a cepas de VDV2 (vírus da dengue sorotipo-2 derivado de células VERO) vivo atenuada que foram obtidas a partir da cepa do vírus da dengue-2 tipo selvagem 16681 pela passagem em células PDK e células VERO. A presente invenção se refere também a uma composição de uma vacina que inclui uma cepa VDV2.

Description

"CEPA DO VÍRUS DA DENGUE-2 VIVO ATENUADA, COMPOSIÇÃOIMUNOGÊNICA, COMPOSIÇÃO DE VACINA, ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO,POLIPROTEÍNA ISOLADA CODIFICADAS PELA SEQ ID N°.1 OUFRAGMENTOS DESTA E FRAGMENTO DA POLIPROTEÍNA"

Campo da Invenção

A presente invenção se refere a novas cepas de VDV2 (vírus dadengue sorotipo-2 derivado de células VERO) vivas atenuadas que sãoderivadas a partir da cepa do vírus da dengue tipo selvagem-2 16681 pelapassagem sobre células PDK e sanitização em células Vero. A presenteinvenção se refere também a uma composição de uma vacina que compreendetal cepa VDV2.

Antecedentes da Invenção

A dengue é uma doença causada por quatro tipos sorológicosvirais estreitamente relacionados, mas antigenicamente distintos, (Gubler,1988; Kautner et al., 1997; Rigau-Pérez et al., 1998; Vaughn et ai, 1997), dogênero Flavivirus (Gubler, 1988). A infecção por um sorotipo do vírus dadengue pode produzir um espectro de doenças clínicas que podem variar deuma síndrome viral não específica a uma severa doença hemorrágica fatal. Operíodo de incubação da febre da dengue (DF), após as picadas de mosquitosdura em média 4 dias (variação de 3-14 dias). DF caracteriza-se por febrebifásica, dor de cabeça, dores em várias partes do corpo, prostração,exantema, Iinfodenopatia e Ieucopenia (Kautner et al., 1997; Rigau-Pérez etal.,1998). O período virulento é o mesmo que o da doença febril (Vaughn et al.,1997). A recuperação da DF é geralmente concluída em 7 a 10 dias, mas aastenia prolongada é comum. A diminuição na contagem de leucócitos eplaquetas é freqüente.

A dengue hemorrágica (DFH) é uma doença febril gravecaracterizada por anormalidades da homeostase e aumento da permeabilidadevascular que pode levar a hipovolemia e hipotensão (Síndrome de Choque pordengue, DSS) muitas vezes complicada por grave hemorragia interna. A taxade mortalidade do caso DFH pode ser tão alta quanto 10%, sem tratamento,mas inferior a 1% na maioria dos centros com experiência terapêutica (WHOTechnical Guide1 1986).

O diagnóstico laboratorial de rotina das infecções por dengue ébaseado no isolamento do vírus e/ou na detecção de anticorpos específicospara o vírus da dengue.

A dengue é a segunda doença infecciosa tropical mais importanteapós malária, com mais da metade da população mundial (2,5 bilhões) vivendonas áreas de risco de epidemia. Há uma estimativa de que 50 a 100 milhões decasos de dengue, 500.000 pacientes hospitalizados com DFH e 25.000 mortespor dengue ocorrem todos os anos. A dengue é endêmica na Ásia, no Pacífico,África, América Latina e Caribe. Mais de 100 países tropicais têm endemias deinfecções virais de dengue, e DFH têm sido documentados em mais de 60destes países (Gubler, 2002; Monath, 1994). Um número de fatores bemdescritos parecem estar envolvidos nas infecções por dengue: crescimentopopulacional, urbanização descontrolada e não planejada e particularmenteassociado com a pobreza, aumento de viagens aéreas, a falta de controleefetiva dos mosquitos, bem como a deterioração das infra-estruturas sanitáriase de saúde pública (Gubler, 2002). A conscientização da dengue pelosviajantes e estrangeiros está aumentando (Shirtcliffe et ai, 1998). A dengueprovou ser uma das principais causas de doença febril nas tropas norte-americanas durante o posicionamento estratégico em áreas tropicais onde adengue é endêmica (DeFraites et ai, 1994).

Os vírus são mantidos em um ciclo que envolve os humanos e oAedes aegypti, um mosquito doméstico, que pica durante o dia e que preferese alimentar nos seres humanos. A infecção no humano é iniciada através dainjeção do vírus durante a alimentação de sangue por um mosquito Aedesaegypti infectado. O vírus na saliva é depositado principalmente nos tecidosextravasculares. O principal tipo celular infectado após inoculação são ascélulas dendríticas, que posteriormente migram para drenagem dos gânglioslinfáticos (Iinfonodos) (Wu e Al., 2000). Após a replicação inicial na pele e adrenagem para os gânglios linfáticos, o vírus aparece no sangue durante a faseaguda febril, geralmente por 3 a 5 dias.

Monócitos e macrófagos estão juntamente com as célulasdendríticas entre os alvos principais do vírus da dengue. A proteção contra areinfecção homotípica é completa e provavelmente por toda a vida, mas aproteção cruzada entre os tipos de dengue dura menos de 12 semanas (Sabin,1952). Conseqüentemente um paciente pode experimentar uma segundainfecção com um sorotipo diferente. Uma segunda infecção por dengue éteoricamente um fator de risco para desenvolver uma doença severa. Noentanto, a DFH é multifatorial, incluindo: a cepa do vírus envolvido, bem comoa idade, o estado imune, e predisposição genética do paciente. Dois fatorestêm um papel importante na ocorrência da DFH: uma rápida replicação viralcom alta viremia (a gravidade da doença está relacionada com o nível daviremia (Vaughn et ai, 2000) e uma importante resposta inflamatória comliberação de altos níveis de mediadores inflamatórios (Rothman e Ennis,1999)).

Não existe um tratamento específico contra a dengue. Otratamento da DF se baseia no repouso na cama, controle da febre e dorescom o uso de analgésicos e antipiréticos, e adequada ingestão de fluidos. Otratamento da DFH necessita da correção da perda de fluidos, substituição dosfatores de coagulação, e infusão de heparina.

As medidas preventivas contam atualmente com o controle dovetor e medidas de proteção pessoal, que são medidas caras e difíceis deserem aplicadas. Nenhuma vacina contra a dengue está atualmente registrada.

Desde os 4 sorotipos da dengue que estão em circulação no mundo e uma vezque existem relatados de que estes estão envolvidos nos casos de DFH1 avacinação deverá idealmente conferir proteção contra todos os 4 sorotipos dovírus da dengue.

Vacinas vivas atenuadas (LAVs)1 que reproduzem a imunidadenatural, têm sido utilizadas para o desenvolvimento de vacinas contra muitasdoenças, incluindo alguns vírus pertencentes ao mesmo gênero da dengue(exemplos de vacinas de Flavivirus vivo atenuadas comercialmente disponíveisincluem vacinas da febre amarela e da encefalite japonesa). As vantagens devacinas de vírus vivos atenuadas estão na sua capacidade de replicação eindução tanto de respostas humorais quanto de respostas imune-celulares.

Além disso, a resposta imune induzida por um conjunto de vírion da vacinacontra os diferentes componentes do vírus (proteínas estruturais e nãoestruturais) reproduz as respostas induzidas pelas infecções naturais.

O projeto da vacina da dengue foi iniciado na Tailândia, no Centrode Desenvolvimento de Vacinas, Instituto de Ciências e Tecnologia para oDesenvolvimento Mahidol University. Vacinas candidatas com vírus vivo-atenuadas foram desenvolvidos com êxito, a uma escala laboratorial, para ovírus da dengue sorotipo 1 (cepa 16007, passagem 13 = LAV1), sorotipo 2(cepa 16681, passagem 53), e sorotipo 4 (cepa 1036, passagem 48) emcélulas primárias de rim de cachorro (PDK), e para o sorotipo 3 (cepa 16562),em células primárias de rim de macaco verde (PGMK) (passagem 30) e célulasfetais de pulmão de macaco Rhesus (FRhL) (passagem 3). Essas vacinasforam testadas como vacinas monovalente (sorotipo único), bivalente (doissorotipos), trivalente (três sorotipos), e tetravalente (todos os quatro sorotipos)em voluntários tailandeses. Essas vacinas demonstraram ser seguras eimunogênicas em crianças e adultos (Gubler, 1997). Estas cepas de LAV 1-4foram descritas na patente EP 1159968, em nome de Mahidol University eforam depositados perante a CNCM (CNCM I-2480; CNCM 1-2481; CNCM I-2482 e CNCM I-2483, respectivamente).

A cepa Den-2 16681 foi recuperada a partir do soro de umpaciente com DFH (dengue Hemorrágica) em Bancoc em 1964 (Halstead et al,1970). O soro virêmico original havia sido passado 4 vezes sobre células BSC-1 (células renais de macaco verde africano) e 5 vezes em células LLC-MK2contínuas (células renais de macaco Rhesus). Em 1977, foi feita umapassagem in vivo do vírus, em macacos susceptíveis (Macaca Mulatta), e, emseguida, novamente em células LLC-MK2- Duas outras passagens emmosquitos (Toxorhynchites amboinensis) foram realizadas em 1980. Aatenuação do vírus foi realizada por passagens a 32 0C em células PDK(células primárias de rim de cachorro). Atenuação das cepas foi verificada, deacordo com vários marcadores in vitro e in vivo. A passagem 50 preenchidacompletamente todos estes critérios de atenuação e foi escolhida comosemente mãe "master seed" para a produção da vacina (1982), na passagem53. A vacina candidata DEN-2 PDK53 foi avaliada em seres humanos,encontrando-se fortemente imunogênica sem sinais e sintomas clínicosinconvenientes (Bhamarapravati et al., 1989).

A seqüência completa da cepa do vírus da dengue-2 vivoatenuada (LAV2), que foi criada por R. Kinney et al. (CDC, Fort Collins) em2001. Diferenças na seqüência entre as cepas de origem DEN-2 cepa 1681(SEQ ID N°.3) e cepa LAV2 (SEQ ID N°.38) estão descritas na Tabela 1.Assim, a comparação genética do vírus tipo- selvagem cepa 16681 e da cepaLAV-2 demonstrou um conjunto de 9 mutações pontuais que podem estarligadas à atenuação da LAV2.

Tabela 1:

Diferenças Na Seqüência DEN-2 16681 E DEN-2 16681/PDK53 (LAV2)<table>table see original document page 7</column></row><table>

Alterações de nucleotídeos que modificam o códon correspondente sãoindicadas em negrito.

A cepa LAV2, que foi inicialmente estabelecida em 1983 foirapidamente identificada como vacina candidata em potencial (Bhamarapravatie Yoksan, 1997).

Entretanto, nesse momento, a transmissão ao homem daEncefalite espongiforme através de culturas de mamíferos não foi encaradocomo um risco e rotineiramente o vírus foi mantido em células primárias de rimde cachorro (PDK). Além disso, esta cepa LAV2 corresponde a uma populaçãoheterogênea. Esta heterogeneidade representa um risco adicional devido auma potencial seleção in vitro ou in vivo de uma das cepas presentes nacomposição.

Descrição Resumida da Invenção

Em face às estas preocupações crescentes, o requerente buscoudesenvolver um processo de sanitização, a fim de se livrar de tais riscos. Pelatransfecção de células Vero com RNA genômico purificadas de LAV2, seguidapor três ciclos de amplificação em células Vero, e duas etapas sucessivas depurificação da placa de vírus, o requerente elaborou um novo vírus sorotipo 2derivado de Vero (VDV2).

Esta nova cepa VDV2, a qual tem sido, portanto, derivadas pelatransferência para células VERO e biológicas clonadas difere da cepa LAV2pela seqüência, homogeneidade de tamanho na placa e sensibilidade atemperatura, mas, sobretudo conserva algumas características fenotípicas egenotípicas do LAV2, como por exemplo: atenuação de manchas, fenótipo depequenas placas, restrição de crescimento a alta temperatura, e foramconservadas as características imunogênicas das cepas LAV2. Estascaracterísticas tornam esta nova cepa uma valiosa vacina candidata àimunização profilática em seres humanos.

Descrição Detalhada da Invenção

Definições

"Vírus da dengue" são vírus de senso positivo, de RNA de fitasimples pertencente ao gênero Flavivirus da família Flaviridae. No caso dadengue sorotipo 2 (DEN-2) cepa 16681, a seqüência completa tem ocomprimento de 10723 nucleotídeos (SEQ ID N°.3). O genoma RNA contémum Cap tipo I no final 5'-, mas necessita de uma cauda poli(A) na extremidade3'-. A organização dos genes é 5'- região não codificadora (NCR), proteínasestruturais (capsídio (C), pré-membrana / membrana (prM/M), envelope (E)) eproteínas não estruturais (NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5) e 3 'NCR.O genoma RNA viral está associado à proteína C para formar o nucleocápside(de simetria icosaedral). Tal como acontece com outros Flavivirus, o genomaDEN viral codifica uma fase de leitura aberta (ORF) ininterrupta, que étraduzido para uma única poliproteína.

Passagens seriais de cepas virulentas (causadoras de doença) dadengue-2 resultam no isolamento do vírus modificado que são "vivosatenuados", ou seja, infecciosos, ainda não capazes de causar doença. Estesvírus modificados são geralmente testados em macacos para avaliar a suaatenuação. No entanto, seres humanos são os únicos primatas queapresentam sinais clínicos da doença. Os vírus que causam de moderado (ouseja, aceitável em termos de fins regulatórios, como apresentam uma relaçãorisco/benefício positiva), a pouco ou nenhum efeito secundário (isto é,manifestações sistêmicas e/ou anormalidades biológicas e/ou reações locais)na maioria dos seres humanos testados, mas que continuam a infectar einduzir uma resposta imunológica são chamados de "vivo atenuado".

O termo "LAV" denota cepas virais vivas atenuadas da dengue.No contexto da presente invenção "LAVs" são cepas de vírus vivos atenuadasinicialmente derivadas da cepa do vírus da dengue sorotipo 2 (DEN-2) 16681por passagens em células primárias de rim de cachorro (PDK). Por exemplo,"LAV2/PDK50" é a cepa atenuada estabelecida após 53 passagens da cepa16681 em células PDK (DEN-2 16681/PDK53). "LAV2/PDK50" é a cepaatenuada estabelecida após 50 passagens da cepa 16681 em células PDK(DEN-2 16681/PDK50). A seqüência de nucleotídeo LAV2/PDK53 é exibida naSEQ ID No. 38.

"VDV2" quer dizer uma LAV obtida pelo processo de sanitizaçãodivulgado no presente pedido. Uma VDV2 é, assim, um clone biológico(homogêneo) do vírus da dengue sorotipo 2 adaptado em células VERO capazde induzir uma resposta imune humoral incluindo neutralização de anticorposem primatas especialmente no ser humano. As cepas VDV2 da presenteinvenção podem ser facilmente reconstruídas iniciando diretamente a partir dasseqüências de VDV2 aqui divulgadas. A indução de uma resposta imunehumoral pode ser facilmente determinada por um teste de ELISA. A presençade anticorpos neutralizantes no soro de uma vacina é avaliada pelos testes deneutralização por redução de placa, conforme descrito na seção 4.1.1.2.2. Umsoro é considerado como positivo para a presença de anticorpos neutralizantesquando o grau de anticorpo neutralizante assim determinado é, pelo menos,superior ou iguala 1:10.

Os termos "mutação" significam quaisquer mudanças detectáveisde material genético, por exemplo, DNA1 RNA, cDNA, ou a qualquer processo,mecanismo, ou resultado de tal mudança. Mutações incluem substituições deum ou mais nucleotídeos. No contexto do atual pedido, mutações identificadasna seqüência genômica ou poliprotéica do vírus da dengue-2 são designadosao abrigo da nomenclatura de Dunnen e Antonarakis (2000). Conforme definidopor Dunnen e Antonarakis com relação a ácidos nucléicos, substituições sãodesignadas por ">", por exemplo, "31 A>G" denota que uma A é alterada parauma G no nucleotídeo 31 da seqüência de referência.

As variações no nível da proteína descrevem a conseqüência damutação e são apresentados como se segue. Códons de parada sãodesignados por X (ex: R97X denota uma mudança de Arg96 a um códon determinação). Substituições de aminoácido são designados por "S9G", o quesignifica que uma Ser na posição 9 é substituída pela Gly.

VÍRUS DA DENGUE SOROTIPO 2 DERIVADAS DE CÉLULAS VERO (VDV2)

A composição da vacina candidata LAV2 da dengue-2anteriormente desenvolvida foi aperfeiçoada por um processo de sanitização.

A vacina da dengue sorotipo 2 derivada de vero (VDV2) divulgadano presente pedido utiliza o vírus DEN-2 16681 atenuado por passagens emsérie por células PDK. O VDV2 contém toda a seqüência genômica dos vírusvivos atenuados DEN-2, e produzem os mesmos sítios que estão ligados aatenuação como a cepa original LAV2, que foram testadas em seres humanos.

A sanitização da vacina candidata LAV2 foi feita através daremoção de proteínas e introduzindo apenas o material genômico viralpurificado nas células Vero. Mais especificamente, a sanitização da cepa foirealizada pela purificação e transfecção do RNA viral nas células Vero. Oprocesso compreende das seguintes etapas:

(a) extração e purificação de RNA viral da cepa LVA2 purificadasda placa; (por exemplo, vírus DEN-2 16681/PDK50)(b) associação vantajosa do RNA purificado com lipídioscatiônicos;

(c) transfecção de células Vero, em particular células Vero LS10;

(d) recuperação dos vírus neo-sintetizados; e

(e) purificação de uma cepa VDV por purificação de placas e,opcionalmente, amplificação em células hospedeiras, especialmente emcélulas Vero.

A tecnologia das células Vero é uma tecnologia bem conhecida,que tem sido utilizada para diferentes produtos comerciais (vacinas injetáveis eorais contra a poliomielite e contra raiva). Na presente invenção células Veroqualificadas foram vantajosamente utilizadas para garantir a ausência dequaisquer riscos potenciais ligados à presença de agentes adventícios. Por"células VERO qualificadas" se entende células ou linhagens celulares para oqual as condições da cultura são conhecidas, e é tal, que as referidas célulassão isentas de quaisquer agentes adventícios. Estes incluem, por exemplo:células VERO LS10 da Sanofi Pasteur.

As cepas VDV assim isoladas são classicamente armazenadasquer sob a forma de uma composição congelada ou sob a forma de um produtoliofilizado. Para esse efeito, a VDV pode ser misturada com um diluenteclássico, uma solução aquosa tamponada composta que compreende decompostos crioprotetores tal como, açúcar, álcool e estabilizadores. O pH antesdo congelamento ou liofilização é vantajosamente estabelecido entre 6 a 9, porexemplo, em torno de 7, como um pH de 7,5 +/- 0,2 conforme determinado porum pHmetro em RT. Antes da utilização, o produto liofilizado é misturado a umsolvente farmacêutico ou excipiente como um NaCI a 4% estéril parareconstituir um composto líquido imunogênico ou vacina.

A variante Glu da LAV2 vacinai, na posição NS3-250, foiselecionada durante a transfecção e clonagem, e posições 5'NC-57 e NS1-53,também identificadas como críticas para a atenuação da LAV2 vacinai, ambospermaneceram conservados na seqüência da VDV2.

No seqüenciamento, a atenuação Loci específicas, dos vírusrecuperados após a transfecção, não revelou qualquer mutação, emcomparação com a SEQ ID N°.38. Os vírus VDV2 biologicamente clonadosexibem um fenótipo de placa homogênea e uma notável estabilidade genéticano que diz respeito à sua cepa de origem LAV2 como esta pode ser deduzidaprincipalmente a partir da conservação da atenuação genotípica.

A cepa VDV2 (passagem 11) foi seqüenciada e, comparada coma cepa do vírus vivo atenuada da dengue sorotipo 2 (LAV2) seqüência (SEQID n° 38). Uma diferença no conjunto de 10 nucleotídeos foi identificada,desencadeando seis substituições de aminoácidos localizada nos peptídeosestruturais M e Env1 e também nos peptídeos não estruturais NS3 e NS5.Nenhum destas diferenças corresponde a posições de atenuação da LAV2.

Tabela 2:

Comparação das seqüências entre as cepas LAV2/PDK53 e VDV2 passagem 11.

<table>table see original document page 12</column></row><table>

Em cinza: diferenças nas proteínas estruturais; negrito: diferenças de proteínasnão estruturais.A presente invenção fornece assim cepas do vírus da dengue-2vivos atenuadas que foram obtidas a partir de vírus DEN-2 16681 tiposelvagem atenuados por passagens seriais em células PDK e, em seguida,pela passagem e sanitização em células VERO. Em particular, as cepasatenuadas da presente invenção que compreendem, pelo menos, as mutaçõesidentificadas de seqüência (não-silenciosa e opcionalmente silenciosa) emrelação à seqüência nucleotídica ou seqüência poliprotéica das cepas DEN-216681 tipo selvagem e LAV2/PDK53.

Conseqüentemente, a presente invenção está relacionada a umacepa do vírus da dengue-2 vivo atenuada isolado, que compreende, ou éconstituída por, uma seqüência da cepa LAV2/PDK53 (SEQ ID N0. 38) em quepelo menos os nucleotídeos nas posições 736, 1619, 4723, 5062, 9191, 10063e 10507, e, opcionalmente, 1638, 2520, 9222 e 10361, estão mutados, com acondição de que os seguintes nucleotídeos não estão mutados: 57, 524, 2055,2579, 4018, 5547, 6599, e 8571. De preferência, as mutações sãosubstituições. De preferência, o nucleotídeo na posição 736 é C, o nucleotídeona posição 1619 é A, o nucleotídeo na posição 4723 é A, o nucleotídeo naposição 5062 é A, o nucleotídeo na posição 9191 é A, o nucleotídeo na posição10063 é A e o nucleotídeo na posição 10507 é G.

O nucleotídeo na posição 5270 pode ser A ou T,preferencialmente é A.

Ainda preferencialmente, a cepa isolada, de acordo com a presenteinvenção contém seqüência SEQ ID N°.38 que compreende pelo menos dasmutações 736 G>C, 1619 G>A, 4723 T>A, 5062 G>C, 9191 G>A, 10063 T>A, e10507 A>G, e opcionalmente as mutações 1638 A>G, 2520 G>A, e/ou 9222 A>G.

Portanto, um vírus da dengue-2 vivo atenuado, de acordo com apresente compreende a seqüência da cepa da dengue-2 16681 tipo selvagem(SEQ ID N°.3) em que a dita seqüência contém, pelo menos, as mutações 57OT1 524 Α>Τ, 736 G>C, 1619 G>A, 2055 OT1 2579 G>A, 4018 C>T, 4723T>A, 5062 G>C, 5547 T>C, 6599 G>C, 8571 OT, 9191 G>A, 10063 T>A, e10507 A>G. De preferência, uma cepa viva atenuada, de acordo com apresente invenção compreende adicionalmente da mutação 1638 A>G, 2520G>A, e/ou 9222 A>G em referência à seqüência de nucleotídeos da cepa16681 tipo selvagem (SEQ ID N°.3).

As cepas do vírus da dengue-2 vivos atenuadas, de acordo coma presente invenção abrange cepas variantes que compreende de umaseqüência SEQ ID N°.38 mutada nas posições 736, 1619, 4723, 5062, 9191,10063, e 10507, conforme acima definido, e que ainda incluem a substituiçãode um ou mais nucleotídeos em determinada posição dos códons que resultaem qualquer alteração no aminoácido codificado nesta posição.

Vantajosamente, as cepas do vírus da dengue-2 vivos atenuadas,de acordo com a presente invenção compreendem uma seqüência que sediferencia por um número limitado de mutações, por exemplo: Não mais que 5,ainda preferencialmente não superior a 2, a partir SEQ ID N0.1.

De preferência, a seqüência genômica do vírus da dengue-2, deacordo com a presente invenção consiste da seqüência de nucleotídeo SEQ IDN0 1.

A presente invenção refere-se também as cepas de vírus dadengue-2 vivo atenuada que podem ser obtidas a partir da cepa VDV2 daseqüência SEQ ID N0.1 por outras passagens em células, em particular emcélulas Vero.

A presente invenção também diz respeito a um ácido nucléicoisolado que compreende, ou é constituído pela seqüência de DNA SEQ ID N0.1ou sua seqüência de RNA equivalente.

Uma "molécula de ácido nucléico" refere-se ao fosfato ésterpolimérico formado por ribonucleosídeos (adenosina, guanosina, uridina oucitidina; "moléculas RNA") ou deoxirribonucleosídeos (deoxiadenosina,deoxiguanosina, deoxitimidina, ou deoxicitidina; "moléculas DNA"), ou qualquerfosfoéster análogo, tais como fosforotioatos e tioésteres, em ambos a forma defita simples, ou uma fita dupla-hélice.

Como utilizado no presente pedido, por seqüência RNA"equivalente" a SEQ ID N°.1 se entende uma seqüência SEQ ID N°.1 em queas deoxitimidinas foram substituídas por uridinas. Como a SEQ ID N0.1constitui a seqüência cDNA VDV2, a seqüência RNA equivalente correspondeassim à fita RNA positiva do VDV2.

A presente invenção refere-se também a poliproteínas daseqüência SEQ ID N°.2 e aos fragmentos desta. A SEQ ID N°.2 é a seqüênciada poliproteína codificada pela SEQ ID N°.1.

Um "fragmento" de uma proteína de referência significa umaseqüência polipeptídica que compreende uma cadeia de aminoácidosconsecutivos na proteína de referência. Um fragmento pode ter o comprimentode, pelo menos, 8, pelo menos 12, pelo menos 20, aminoácidos.

Os ditos fragmentos de poliproteínas da seqüência SEQ ID N°.2compreendem, pelo menos, uma arginina na posição 9 da proteína M (posição214 da SEQ ID n° 2) e/ou um ácido glutâmico 228 da proteína E (posição 508da SEQ ID N0 2), e/ou uma treonina na posição 69 da proteína NS3 (posição1543 da SEQ ID N0 2), e/ou uma histidina na posição 181 da proteína NS3(posição 1656 da SEQ ID N0 2), e/ou uma Iisina na posição 541 da proteínaNS5 (posição 1725 da SEQ ID N0 2), e/ou uma treonina na posição 832 daproteína NS5 (posição 3032 da SEQ ID N°.2).

De acordo com uma realização o fragmento da poliproteínacodificada pela SEQ ID N0.1 é ou compreende a proteína M, e/ou proteína Ee/ou proteína NS3 e/ou proteína NS5.

Composições Imunogênicas ε VacinasA presente invenção também diz respeito a uma composiçãoimunogênica, adequada para ser utilizada como uma vacina, que compreendeuma cepa VDV2, conforme descrita na presente invenção.

As composições imunogênicas, de acordo com a presenteinvenção produzem uma resposta imune-humoral em direção ao vírus dadengue compreendendo na neutralização de anticorpos.

Preferivelmente1 a composição imunogênica é uma vacina.

De acordo com um exemplo de realização, a composiçãoimunogênica é uma composição monovalente, ou seja, produz uma respostaimunológica e/ou confere proteção apenas contra o vírus da dengue-2.

De acordo com outro exemplo de realização, a presente invençãorelaciona-se com uma composição imunogênica multivalente para dengue. Talcomposição imunogênica ou vacina multivalente podem ser obtidas pelacombinação de vacinas para dengue monovalentes individuais. A vacina oucomposição imunogênica pode ainda incluir, pelo menos, um vírus da denguevivo atenuado de outro sorotipo. Em particular, a vacina imunogênica oucomposição pode incluir um VDV2 de acordo com a presente invenção emcombinação com, pelo menos, um vírus da dengue vivo atenuado selecionadodo grupo constituído pelo sorotipo 1, sorotipo 3, e sorotipo 4.

Preferivelmente, a composição imunogênica ou vacina pode ser umacomposição de vacina tetravalente da dengue, ou seja, a composição de umavacina que inclui um VDV2 de acordo com a presente invenção em combinaçãocom uma cepa de vírus da dengue-2 vivo atenuada, uma cepa de vírus da dengue-3 vivo atenuada e uma cepa de vírus da dengue-4 vivo atenuada.

Cepas de vírus vivos atenuadas da dengue-1, dengue-3, dengue-4 foram descritas anteriormente. Pode ser feita referência às vacinas vivasatenuadas, que foram desenvolvidos na Mahidol University pela passagem dosvírus da dengue sorotipo 1 (cepa 16007, passagem 13; LAV1), e sorotipo 4 (cepa1036, passagem 48, LAV4) em células primárias de rim de cachorro (PDK), e para osorotipo 3 (cepa 16562), em células primárias de rim de macaco verde (PGMK)(passagem 30) e células de pulmão fetal de Rhesus (FRhL) (passagem 3) (LAV3).As seqüências de nucleotídeo da LAV1 (SEQ ID N°.40), LAV3 (SEQ ID N°.41), eLAV4 (SEQ ID N°.42) estão demonstradas na lista de seqüência anexa.

Vantajosamente, uma cepa de vírus vivo atenuada da dengue-1pode corresponder a uma cepa VDV1, que foi obtida a partir da cepa LAV1desenvolvida pela Mahidol por um processo de sanitização de acordo com ainvenção. Em especial, uma cepa de vírus da dengue-1 vivo atenuada (VDV1)pode compreender, e vantajosamente consistir da seqüência SEQ ID N°.39.

Composições imunogênicas incluindo vacinas podem ser preparadascomo injetáveis que podem corresponder a soluções líquidas, emulsões oususpensões. Os ingredientes imunogênicos ativos podem ser misturados comexcipientes farmaceuticamente aceitáveis que são compatíveis com estes.

As composições imunogênicas ou vacinas, de acordo com a presenteinvenção podem ser preparadas utilizando qualquer método convencionalconhecido pelos técnicos no assunto. Convencionalmente os antígenos, de acordocom a presente invenção são misturados com um solvente ou excipientefarmaceuticamente aceitável, como a água ou solução salina tamponada comfosfato, agentes umidificantes, material de enchimento, emulsificantesestabilizadores. O excipiente ou diluente serão selecionados em função da formafarmacêutica escolhida, do método e da via de administração e também da práticafarmacêutica. Excipientes ou diluentes adequados e também as exigências emtermos de formulações farmacêuticas, estão descritas em Remington1SPharmaceutical Sciences, que representa um livro de referência neste domínio.

Preferencialmente, a composição imunogênica ou vacinacorresponde a uma composição injetável que inclui uma solução aquosatamponada para manter, por exemplo, o pH (conforme determinado pelo RTcom um pHmetro) entre 6 a 9.

A composição, de acordo com a presente invenção podeadicionalmente conter de um adjuvante, ou seja, uma substância que melhora, ouaumenta, a resposta imune produzida pela cepa VDV2. Qualquer adjuvante oumistura de adjuvantes farmaceuticamente aceitável convencionalmente utilizado nocampo das vacinas humanas podem ser utilizadas para esta finalidade.

As composições imunogênicas ou vacinas, de acordo com a presenteinvenção podem ser administradas por qualquer via convencional normalmenteutilizada no campo das vacinas humanas, tais como a via parenteral (por exemplo,via intradérmica, subcutânea, intramuscular) no contexto da presente invenção ascomposições imunogênicas ou vacinas são composições de preferência injetáveisadministradas por via subcutânea na região deltóide.

Método de Imunização

A presente invenção fornece ainda um método de imunizar umhospedeiro em tal necessidade contra a infecção pelo vírus dengue quecompreende a administração ao hospedeiro de uma quantidade imunoefetiva deuma composição imunogênica ou vacina, de acordo com a presente invenção.

Um "hospedeiro com tal necessidade" denota uma pessoa emsituação de risco de infecção por dengue, ou seja, pessoas que viajam pararegiões em que a infecção pelo vírus da dengue está presente, e também doshabitantes destas regiões.

A via de administração é qualquer via convencional utilizada nocampo da vacinação. A escolha da via administração depende da formulaçãoque é selecionada. De preferência, a composição imunogênica ou vacinacorresponde a uma composição injetável administrada por via subcutânea,vantajosamente na região deltóide.

A quantidade de LAV ou VDV em particular VDV2 nascomposições imunogênicas ou vacinas podem ser convenientementeexpressas em unidade virais formadoras de placas (PFU) ou unidade de dosesinfectantes para 50% em cultura de células (CCID50) e preparadas utilizandotécnicas farmacêuticas convencionais. Por exemplo, a composição, de acordocom a presente invenção pode ser preparada na forma de dosagem contendo10 a 106 CCID50, ou de 103 a 105 CCID50 de LAV ou VDV, por exemplo, 4 ± 0,5logio CCID50 de cepa VDV2 de uma composição monovalente. Quando acomposição é multivalente, para reduzir a possibilidade de interferência viral e,assim, de conseguir um equilíbrio na resposta imune (ou seja, uma respostaimunológica contra todos os sorotipos contidos na composição), asquantidades de cada uma dos diferentes sorotipos de dengue presente nasvacinas administradas podem não ser iguais.

Uma "quantidade imunoefetiva" é uma quantidade que é capaz deinduzir uma resposta imune humoral compreendendo anticorpos neutralizantes nosoro de uma vacina, como avaliado pelo teste de neutralização com redução emplaca, conforme descrito na seção 4.1.1.2.2; um soro é considerado como positivospara a presença de anticorpos neutralizante quando o título do anticorponeutralizante assim determinado é pelo menos, superior ou igual a 1:10.

O volume de administração pode variar, dependendo da via deadministração. Injeções subcutâneas podem variar em termos de volume decerca de 0,1 ml a 1,0 ml, de preferência 0,5 ml.

O tempo ótimo para a administração da composição é cerca deum a três meses antes da primeira exposição ao vírus da dengue. As vacinasda presente invenção podem ser administradas como agentes profiláticos emadultos ou crianças com risco de infecção por dengue. A populaçãodirecionada abrange pessoas que são nativas bem como as não-nativas comrelação ao vírus da dengue. As vacinas da presente invenção podem seradministradas em dose única ou, opcionalmente, a administração podeenvolver o uso de uma dose primária seguida de uma dose de reforço que éadministrada, por exemplo, de 2-6 meses mais tarde, conforme determinadocomo apropriado pelos técnicos no assunto.

A presente invenção poderá ser adicionalmente descrita tendo emvista as seguintes figuras e exemplos.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 é um resumo da história da semente pré-mãe ("prémaster seed") VDV2.

A Figura 2 é um fluxograma que resume o processo de produçãodesenvolvido que dá origem ao Produto Completo (monovalente), dose "prontapara o uso".

A Figura 3 é uma representação diagramática do mapa genômicodo VDV2. A seta acima representa a codificação da seqüência poliprotéica. Assetas abaixo representam a seqüência codificadora de peptídeos maduros. Asbarras verticais simbolizam as variações nucleotídicas entre as cepas dadengue-2 tipo selvagem 16681 e a cepa LAV2. Os asteriscos designam asvariações nucleotídicas entre LAV2 e VDV2.

A Figura 4 mostra a análise do tamanho da placa após 7 dias deincubação a 37 0C para o vírus da dengue-1 LAV2, VDV2, e cepa 16681.

A Figura 5 é uma análise gráfica que mostra o tamanho dadistribuição na placa para o vírus da dengue-2 LAV2, VDV2, e cepa 16681.

A Figura 6 é um resumo do desenho do estudo para a avaliaçãoda segurança do VDV2 monovalente, em adultos saudáveis sem precedentesde tratamento para Flavivirus (Flavivirus-r\a\ve).

Exemplos

Exemplo 1

Sanitização

1.1 Purificação de RNA Vira

O processo de purificação e transfecção de RNA foi realizado daseguinte forma. Uma suspensão de DEN-2/PDK50 foi ressuspendida em 0,5 ml deágua e diluída, a fim de conter, pelo menos, 3 χ 104 e até 3 χ 107 TCID50 ou PFU devírus por mililitro. Uma unidade de benzonase diluída em 0,01 ml de meio de Williamfoi adicionada em 0,5 ml de vírus, a fim de digerir moléculas de DNA ou RNA deorigem celular, e a solução foi incubada durante 2 horas a 4 0C em um agitador. Nofinal da etapa de incubação, 0,65 ml de tampão desnaturante contendo cloreto deguanidina, detergente (SDS), e β mercaptoetanol (tampão RTL- β mercaptoetanol,fornecidos no kit RNeasy Mini Kit, Qiagen Ref. 74104), foram adicionados e proteínasforam extraída uma vez com fenol/clorofórmio (1/1) vol/vol e uma vez com clorofórmiovol/vol, seguido por centrifugação por 5 minutos a 14000 rpm, à temperaturaambiente. Após cada extração, a fase aquosa foi coletada, tendo o cuidado de nãocoletar materiais (precipitado branco), na interface, e transferidos para um tubo deEppendorf de 1 ml limpo. A solução de RNA foi então aplicada em uma colunaQIAgen seguindo as recomendações do fabricante (RNeasy minikit, QIAgen), a fimde eliminar vestígios de solvente, e eluído em 0,06 ml de água livre de nuclease. Apresença de RNA viral foi confirmada por RT-PCR quantitativo, utilizando uma curvapadrão estabelecido com quantidades conhecidas do vírus em TCIDso/ml.

1.2 Transfeccão de Células Vero Com RNA Purificado

A transfecção foi realizada utilizando Iipofectamina (ReagenteLF2000, Life Technologies), uma mistura de lipídios catiônicos que associamosao RNA através de interações de carga e permitindo a transferência decomplexos no citoplasma das células pela fusão com a membrana celular. Aquantidade ótima de reagente LF2000 foi determinada em uma experiênciapreliminar pela incubação de células Vero, plaqueadas 16 a 24 horas antes (0,3- 0,5 χ 106 células por poço em um placa de 6 poços), com doses crescentes (5a 20 pL) de lipofectamina. As células foram então incubadas por 4 a 5 horas a32 0C1 5% CO2, antes de substituir o meio por meio de cultura fresco, semFCS, e a incubação continuou overnight a 32 °C. A toxicidade (célulasredondas, refringência ou células flutuantes, homogeneidade das células emmonocamada) foi verificada regularmente durante 48 horas, sob ummicroscópio invertido. A dose mais elevada de Iipofectamina que não foi tóxicanestas condições foi de 10 pL e foi escolhida para a transfecção de RNA.

Quatro transfecções foram realizadas em paralelo, utilizando 1/4da preparação do RNA purificado (cerca de 2 χ 104 Log eqTCID5o, de acordocom qTR-PCR). Vinte e cinco microlitros da solução de RNA foram diluídas em500 pL de meio OptiMEM (GIBCO) contendo 15 pL de reagente LF2000 (umamistura de lipídios catiônicos que associado ao RNA através interações decargas e permitem a transferência de complexos no citoplasma das células porfusão com a membrana celular). 200 ng de levedura tRNA foram adicionadoscomo transportadora em 2 das 4 reações.

Foi permitido que as 4 misturas de transfecções se precipitassemdurante 10 minutos à temperatura ambiente antes da adição à 6 poços emplacas confluentes de células Vero, e incubação a 36 0C. Após 4 horas amistura de transfecções foi removida e as células foram lavadas uma vez emPBS. Três mililitros de meio pós-transfecção (Williams, GIBCO) foramadicionados, e a incubação foi mantida durante 5 dias a 32 °C. O meio decultura foi então substituído por 3 ml de meio de infecção para dengue(Williams complementada com 10 mM MgSO4).

Um foco de células apresentando efeitos citopáticos típicos(arredondamento e refringência celular), foi detectada no dia 8 após atransfecção em 1 de 2 poços transfectados na presença de tRNA. A liberaçãodo vírus no sobrenadante dessas células foi confirmada por qRT - PCR. Onzedias após a transfecção, os efeitos citopáticos típicos foram detectados apenasneste poço, enquanto o sobrenadante dos outros três poços transfectadospermaneceram negativos.

A solução viral recuperada após a transfecção foi nomeada deTV100 (em vez de 16681 PDK50/Vero-2), e exibiu título de infecção de 5,8logTCID5o/ml após a diluição a Vá, em solução aquosa tamponada contendoagentes crioprotetores (pH = 7,5).

1.3 Caracterização dos Vírus Recuperados Após a Transfeccão

Seqüenciamento de spot de Loci específicos importante paraatenuação foi realizada por R. Kinney (CDC, Fort Collins). Os dados sãoapresentados na Tabela 3.

Tabela 3:

Seqüenciamento Das Posições Específicas De Atenuação Dos VírusTransfectados

<table>table see original document page 23</column></row><table>

O VDV2 manteve as Ioci atenuantes importantes em 5'NC-57 eNS1-53, e Iocus da 16681 tipo-selvagem NS3-250-Glu variante na vacinaPDK53. A mistura NS3-250-Glu/Val na vacina PDK53 mostrou-se estável entrepassagens PDK45 e PDK53, sugerindo que a seleção tenha ocorrido nascélulas Vero. A análise prévia da vacina DEN-2 isolada do soro de um vacinadodemonstrou que esta seleção pode ocorrer também em humanos.

O tamanho das placas foi mensurado nas células Vero.Resumidamente, células Vero foram plaqueadas na cultura a uma densidadede 1.000.000 células/cm2, contendo 4% de FBS. Após a incubação overnight, omeio foi removido e as células foram infectadas com diluições seriaisduplicadas e quintuplicadas do vírus. Após 1,5 horas a 37 °C, 5% CO2, oinóculo foi removido e as células foram incubadas a 37 0C 5% CO2 em meiomínimo de Eagle (MEM), contendo 1,26% de metilcelulose e 10% de FBS.Após 11 dias de incubação, as placas foram fixadas por 20 minutos emacetona a -20 0C e revelada por imuno-coloração com um mAb específico paraFlavivirus, diluído em 2,5 pg/ml. Placas virais foram mensuradas utilizando umsoftware de análise de imagem (Saisam / Microvision).

O VDV2 foi comparado com sementes LAV2 16681/PDK50(Tabela 4) e exibiu placas pequenas semelhante de 1-3 mm de diâmetro.

Tabela 4: Tamanho Das Placas do LAV216681/PDK50 ε VDV2

Etapa Vírus LP/MP SP

Antes da transfecção LAV2 PDK50 0 319

Após a transfecção_VDV2 não clonado 0_183

LP/MP: Número de placas grandes/médias em 6 poços

SP: número de placas pequenas em 6 poços

1.4 Purificação de Placas

Três passagens adicionais de amplificação (P2 a P4) foramrealizadas sobre os vírus recuperados após a transfecção. A clonagembiológica por purificação de placas foi realizada na passagem P3 e P4 do vírus(chamado LST 003 e LST 007, respectivamente).

Resumidamente, células Vero foram plaqueadas em placas de 6poços e infectadas com o vírus em diluições seriadas, a fim de obter entre 1 e 20placas por placas (de cultura). Após 1,5 horas a 37 0C 5% C02, o inoculo foiremovido e as células foram incubadas em 3 ml de meio sólido composto de MEM -10% FCS pré-aquecido a 42 0C e misturado extemporaneamente com 2% deagarose derretida equilibrada a 42 °C. Foi permitido que o meio fosse solidificado àtemperatura ambiente durante 30 minutos; sob a capela de fluxo, e as placas foramincubadas em posição invertida por 10 dias a 32 0C - 5% C02. A segunda camadado mesmo meio suplementado com 0,01% de vermelho neutro foi em seguida,adicionada e placas foram incubadas por mais uma noite a 32 °C. Placas pequenasforam isoladas e colhidas de seis poços sob condições estéreis usando umamicropipeta equipada com uma ponteira de 0,1 ml, e transferida para tubos estéreiscontendo 0,2 ml de MEM - 4% FCS: três passagens P3 (identificados como clones31, 32 e 33) e três da passagem P4 (identificado como clones 71,72 e 73). Asuspensão foi homogeneizada em vortex, diluída serialmente no mesmo meio, eutilizada imediatamente para infectar 6 poços em placas de células Vero. Oprotocolo foi repetido e uma segunda coleta de dois SP foi realizada nos clones 32,33, 71 e 72, e uma SP no clone 31. Cada placa coletada foi diluída em 1 ml demeio, antes da amplificação em células Vero, em frascos T25 cm2. O meio decultura foi colhido no dia 6 após a infecção, diluído com o mesmo volume de umasolução aquosa tamponada contendo agente crioprotetor (pH 7,5) e congelados a -70 °C. Todas estas etapas foram realizadas a 32 °C.

Vírus de placas purificadas foram denominados 311, 321, 322,331, 332, 341, 342, 351, 352, 711, 712, 721 e722, respectivamente.

O títulos de infecção foram determinados em células Vero (videabaixo):

Clone 311: 3.95 LogCCID50/ml

Clone 321: 5.20 LogCCID50/ml Clone 322: 5.45 LogCCID50/ml

Clone 331: 5.55 LogCCID50/ml Clone 332: 4.95 LogCCID50/ml

Clone 341: 2.80 LogCCID50/ml Clone 342: 4.85 LogCCID50/ml

Clone 351: 5.35 LogCCID50/ml Clone 352: 5.50 LogCCID50/ml

Clone 711: 5.45 LogCCID50/ml Clone 712: 5.65 LogCCID5o/ml

Clone 721: 5.30 LogCCID50/ml Clone 722: 5.60 LogCCID50/ml

Uma segunda amplificação em células Vero foi realizada por trêsclonagens: clones 331, 352 e 722.

Os sobrenadantes das culturas foram coletadas no dia 8 após ainfecção, diluído 1/2 com uma solução aquosa tamponada contendo agentecrioprotetor (pH 7,5) e denominado TV331, TV352, TV722.1.5 Caracterização do Vírus Clonado

Após a 1a amplificação, todos os vírus amplificados exibiram omesmo tamanho de placa, fenótipo e título equivalentes a, ou superior a 5logCCID50/ml (exceto os clones 311 e 341 que foram significativamentemenores). O Seqüenciamento das posições específicas de atenuação foirealizado em 6 clones a partir da 1a amplificação (clone 321, 331, 351, 352,711, 721) e os três clones a partir do 2a amplificação, e não revelaram qualquermutação.

Na ausência de qualquer diferença significativa entre os clones, oTV722 foi selecionado e amplificado em células VERO, a fim de gerar umacepa candidata a vacina VDV2.

Tabela 5:

Seqüenciamento De Sítios Específicos De Atenuação Dos Vírus DEN-2.

<table>table see original document page 26</column></row><table>A posição dos nucleotídeos está indicada abaixo cada gene e referidos para aseqüência publicada da cepa DEN-2 16681.

Em conclusão, um número total de 11 passagens foi necessário parase obter o clone biológico de DEN-2 16681/PDK50 adaptada em células VERO.

Outras caracterizações foram realizadas, em seguida, peladeterminação da seqüência e testes fenotípicos da VDV2 passagem 11.

Exemplo 2

Seqüenciamento

A seqüência completa do vírus foi gerada, de acordo com aseguinte estratégia. O RNA genômico foi extraído e purificado. O genomacompleto foi amplificado por 16 reações de RT-PCR sobrepostas. CadaPCR foi concebido de modo que para que as marcações deseqüenciamento fosse adicionada a cada fita de DNA. Isto permitiusimplificar as reações de seqüenciamento, dirigindo todos movidos paraum único par de primers universais de seqüenciamento. Cada produto dePCR foi individualmente seqüenciado em ambas as fitas de DNA. Todos osresultados foram remontados para reconstruir o genoma completo daVDV2.

2.1 Materiais

2.1.1 vírus

Os vírus aos quais estão aqui mencionados são DEN-2 16681;LAV-2/PDK53; VDV2, as seqüências das quais são dadas na lista deseqüência anexa.

O texto completo da seqüência genômica destes vírus é de 10723nucleotídeos de comprimento.

2.1.2 Primers

Todos os primers foram projetados no Seqweb bioinformaticspackage (Accelrys), módulo de desenho de primers (Tabela 6).<table>table see original document page 28</column></row><table>2.2 Métodos

2.2.1 Purificacão do RNA Viral

A partir de experiências anteriores, um mínimo de 1000 DICC5O énecessário para obter uma reação de RT-PCR positiva nas próximas etapas. Istosignifica que um título mínimo de 104 DICCso/mL de vírus é necessário. O RNAgenômico viral foi purificado utilizando o kit QIAamp viral RNA mini (Qiagen)1 deacordo com as recomendações do fabricante. Resumidamente, um volume de 140μ|_ de uma amostra viral bruta foi incubada na presença de uma solução de lise, ecarregado em um kit de coluna. Após a etapa de lavagem, o RNA viral foi purificadoe eluídos em 60 μΙ_ de água estéril livre de nuclease contendo 1 pL de inibidor deRNAse (40 unidades) (RNAse Out, Sigma).

2.2.2 Transcrição Reversa

O RNA viral foi reversamente transcrito em cDNA por umatranscriptase reversa (reverse (T) da ABGene. Novamente, foram aplicadascondições padrão de uso, utilizando 10 pl_ de RNA purificado, em uma volumefinal de reação de 20 pL. A reação foi iniciada por hibridização sem os primers.

Uma reação de RT foi realizada por PCR. A síntese de cDNA foi obtida pelaincubação de 45 minutos a 47°C.

2.2.3 PCR

Todas as reações de PCR foram realizadas com o sistemaExpand High Fidelity PCR (Roche Diagnostics), utilizando todos os 16 pares deprimers (+) e (-) da Tabela 6. As condições de PCR foram as seguintes:

<table>table see original document page 29</column></row><table><table>table see original document page 30</column></row><table>

Todos os produtos do PCR foram controlados pela eletroforese em gel de agarose.

2.2.4 Seqüenciamento

A maior parte das reações de seqüenciamento foi terceirizadapela Genome Express. As extremidades genômicas, ambigüidades, algunscruzamentos inter-PCR, e regiões não seqüenciadas pela Genome Express,por razões técnicas, foram realizados "in-house".

Seqüenciamento da Genome Express: Os produtos de PCR foramenviados a +4 °C, e os resultados do seqüenciamento foram recebidos comoarquivos de seqüências informatizadas. O arquivo texto, cromatogramas dequalidade e arquivos estão disponíveis para cada seqüência. Após o alinhamentoda seqüência, todas as discrepâncias foram verificadas no cromatograma, ecorrigidas se fossem identificados erros no método de cálculo da seqüência.

Seqüenciamento realizado internamente "in-house": As reaçõesde Seqüenciamento foram realizadas no termociclador PTC-200 (MJResearch), com o kit Sequitherm Excel Il LC (Epicentre). Cada produto de PCRfoi seqüenciado em ambas as fitas, de forma independente, em uma únicareação. As reações foram carregadas em um gel de eletroforese deseqüenciamento. A execução e a análise da seqüência foram realizadas noseqüenciador automatizado Gene ReadIR 4200 (Li-Cor).

Reação de Seqüenciamento

<table>table see original document page 30</column></row><table><table>table see original document page 31</column></row><table>

Adição de 3 μL de tampão desnaturante/carregamento.

Desnaturação das amostras 3 minutos a 95 0C e resfriamento emgelo pouco antes do carregamento das amostras.

<table>table see original document page 31</column></row><table>

2.3 Resultados

Todos PCR fragmentos foram seqüenciados de ambas asextremidades usando PCR comum acrescentado a cauda, ou seja, um motivoespecífico, que foi acrescentada no 5' terminal de todos os primers:

Primers 5': M13SEQ-GTTTTCCCAGTCACGAC (SEQ ID N°.36)

Primers 3': M13REV-AACAGCTATGACCATG (SEQ ID N°.37)

M13-SEQ e seqüências REV correspondem aos motivos deprimers universais M13 (New England Biolabs references).

Para o contíguo de montagem, uma rápida análise foi realizada noVector NTi, no módulo ContigExpress (Informax). A seqüência referência dacepa LAV2 foi comparada com todos os resultados de seqüenciamentoindividuais. Em tais condições, todos os resultados poderiam ser alinhados aolugar correto no genoma completo, mesmo quando algumas regiões aindaestavam sem o contíguo de montagem, dando uma rápida visualização de todoo alinhamento genômico.

2.3.1 Montagem da Seqüência Completa de VDV2

A seqüência de alinhamento final foi realizada no módulo Vector NTi1AIignX (Informax). O algoritmo clássico de alinhamento de seqüências múltiplasCIustaIW (Thompson et ai., 1994) foi usado pelo software para construir oalinhamento global. Todos os resultados foram alinhados a seqüência juntamentecom a seqüência referência de LAV2, permitindo assim uma melhor reconstruçãodo genoma. Qualquer discrepância na seqüência em relação à referência exigiuuma confirmação independente sobre outra reação de seqüenciamento. Aseqüência completa de VDV2 é demonstrada na SEQ ID N0.1.

Algumas ambigüidades são freqüentemente encontradas emseqüências únicas, especialmente próximas as extremidades das seqüências.

Isto é algo inerente à má qualidade da reação em ambas as extremidades dequalquer fragmento de PCR. Estas seqüências de má qualidade foramexcluídas do alinhamento, enquanto outras duas reações de seqüenciamentoindependentes eram disponíveis a partir de outros produtos de PCR. Adiscrepância sobre as seqüências de referência não foram levadas em contano alinhamento final quando estas não foram confirmadas por pelo menos duasoutras seqüências independentes de PCR de consenso compatível.Inversamente, qualquer discrepância confirmada em duas seqüênciasindependente foram mantidas no último seqüenciamento.

A Tabela 7 sumariza as características de cada reação deseqüenciamento, indicando o início, fim e a duração. As sobreposições entrePCR adjacentes também estão indicados, assim como as diferenças emrelação à seqüência de referência na última coluna.

Tabela 7 Características Individuais da Reação de Seqüenciamento doVírus da Dengue VDV2<table>table see original document page 33</column></row><table>As duas extremidades do genoma não poderiam serseqüenciadas a partir da amplificação por PCR1 porque a síntese de cDNA e areação de PCR DNA necessitam de oligonucleotídeos complementares para asextremidades do genoma. Durante a etapa de amplificação, estesoligonucleotídeos são incorporadas ao fragmento de PCR. Ó resultado daseqüência é da seqüência de oligonucleotídeo sintético, e não a do própriovírus. O PCR em ambas as extremidades do genoma do vírus não funcionamcorretamente, o que sugere que a seqüência do vírus não foi significativamentediferente da seqüência de oligonucleotídeo (se tivesse sido o caso, aamplificação por PCR deveria ter fracassado ou, pelo menos, deveria ter sidode má qualidade). Não fomos capazes de distinguir as duas extremidades dogenoma de todas as outras amplificações por PCR. Portanto, no genomareconstruído, ambas as extremidades do genoma foram consideradas comoidênticas ás seqüências de oligonucleotídeos (e também idênticas a seqüênciade referência). No 5' terminal, é a seqüência dos nucleotídeos de 1 a 32. No 3'terminal, é a seqüência dos nucleotídeos de 10695 a 10723.

2.3.2 Comparação das Seqüências

Dez diferenças de nucleotídeos foram detectadas com relação àseqüência genômica entre as cepas da LAV2 de origem. A cepa VDV2 vacinaié derivada da LAV2, através da "sanitização " viral e da passagem de célulasde cão para células de macaco.

As diferenças entre LAV2 e VDV2 podem ter várias origens.

Primeiro, as etapas de clonagem podem eleger uma sub-população viral quenão é 100% idêntica à seqüência maior anteriormente detectada na cepaLAV2. Em segundo lugar, LAV2 foi produzida em células PDK, enquanto VDV2foi produzida em células Vero. Essa passagem de células de cão para célulasde macaco induz potencialmente a mudanças virais que refletem a adaptação ànova linhagem celular. Em terceiro lugar, como para todos os vírus RNA1 amenor fidelidade da RNA polimerase viral desencadeia uma maior taxa demutação genômica do que o que a DNA polimerase.

Em termos de seqüências todas 9 posições de nucleotídeos ligadas aatenuação viral da LAV2 estavam conservadas na VDV2 passagem 11.

Além disso, a comparação das seqüências entre a cepa VDV2passagem 9 e passagem 11 demonstrou a ocorrência de duas mutações entreestas passagens, que estão ligadas às diferenças de fenótipo, viremia eimunogenicidade.

Tabela 8:

Comparação Das Seqüências Entre a Cepa LAV2/PDK53 ε As Cepas VDV2Passagem 9 ε 11.

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Negrito: Diferenças entre as seqüências VDV2 passagem 9 e passagem 11

Ao realizar o alinhamento da seqüência entre todos as seqüênciasgenômicas do sorotipo-2 da dengue disponíveis no Genbank, parece que,apenas duas posições são partilhadas por outras cepas da dengue-2 (1638 e2520), ambas em substituições silenciosas de aminoácido. Todas as outrasposições são específicas para as cepas VDV2 passagem 11, que desencadeiauma substituição aminoácido (Tabela 8). Em relação as mudanças deaminoácido, as quatro alterações de peptídeos não-estruturais parecemrelativamente conservadoras, da ponto de vista bioquímico, em que as duasalterações em M e no envelope trazem modificações tanto na carga quanto nahidrofobicidade.

Exemplo 3

Caracterização

O objetivo destes estudos foi avaliar se mudanças nosmarcadores de atenuação ocorreu através das passagens.

O fluxograma mostrado na Figura 2 sumariza o aperfeiçoamentodo processo de manufatura que dá origem ao Produto Completo(monovalente), em dose "pronta para o uso".

Resumidamente, após 2 passagens sucessivas da VDV2passagem 8 em células Vero, as respectivas sementes de trabalho (workingseeds) foram obtidas. Os cultivos finais dos vírus também foram conduzidospor infecção de uma suspensão de células Vero. Os vírus produzidos são emseguida colhidos. O ácido desoxirribonucléico (DNA) foi digerido, de acordocom um tratamento enzimático. As impurezas foram removidas porultrafiltração. Títulos de Infecção foram aumentados por uma etapa deconcentração. Uma solução aquosa tamponada contendo agentes crioprotetor(pH = 7,5) é adicionado e esta mistura é filtrada em coluna de 0,22 pm e entãodiluída na dose desejada dentro da mesma solução. A substância ativa é,então, colocada em frascos de vidro, congeladas à seco, e armazenada antesde ser utilizada.

3.1 Marcadores Fenotípicos

A Tabela 9 apresenta dados de três ensaios fenotípicosrealizados nas cepas DEN-2 16681 wt, DEN-2 16681/PDK53 vacinai, VDV2passagem 9 e VDV2 passagem 11 (última passagem de adaptação): asensibilidade a temperatura (Ts), a curva de crescimento em células demacaco (Vero) e mosquitos (C6/36) e neurovirulência em camundongos recém-nascidos (dados obtidos no CDC). A redução da neurovirulência nocamundongo (redução da mortalidade e maior tempo de sobrevida média(AST)), crescimento limitado a 39 0C e restrição de replicação em células C6/36são atualmente aceitas pela comunidade científica como critérios de atenuaçãodo vírus da dengue. Passagens de vírus adaptados em células Verodemonstram evidente perfil de Ts, e são mais restritas do que as cepasDEN2/PDK53. A passagem de adaptação final foi restringida por cerca de 3Log neste ensaio. A sensibilidade a temperatura também foi confirmada pelacurva de crescimento viral. Em células Vero, níveis de replicação semelhantesforam observados em todos os vírus testados. Em células de mosquitos, ocrescimento de vírus adaptados em células Vero foi nitidamente restringido(aproximadamente 3 Log), em comparação com DEN2- wt, e pouco restrito(cerca de 0,5 Log), em comparação com DEN2-PDK53. Surpreendentemente,a neurovirulência dos vírus Vero-adaptado foi próxima a neurovirulência doDEN2-wt, e significativamente maior que a neurovirulência do DEN2/PDK53vacinai. Estes dados apontam o menor valor preditivo desta afirmação, emrelação a atenuação da cepa (cf. dados clínicos).

Distribuição do tamanho da Placa da cepa VDV2 passagens 9 e11, DEN2/PDK53 e wtDEN2 são comparadas na figura 5. A cepa wt DEN2apresenta um perfil heterogêneo com 95% das placas com um perfil detamanho homogêneo, com uma grande população (81%) de placas <0,6 mm eum menor população (12%) de placas com 1-2 mm. Este perfil é distinto doperfil da DEN2-PDK53 perfil. Destacamos que, na passagem de adaptaçãointermediária, VDV2 P9, exibe um perfil heterogêneo, com uma grandepopulação (70%) de placas com 1-2 mm, e um menor população (25%) dasplacas <0,6 mm. Estes dados demonstram que a cepa VDV2 ainda não estátotalmente adaptada na passagem 9, e que as duas outras passagens foramnecessárias para obtenção de uma população homogênea de replicaçãoestável em células Vero.Tabela 9:

Resumo dos Fenótipos Virais de DEN-2

<table>table see original document page 38</column></row><table>

N= número de animais

Exemplo 4

Imunogenicidade. Viremia. ε Toxicologia em Macacos

Os dados mais sólidos e numerosos que podem ser obtidos emmacacos referem-se a imunogenicidade e viremia. A viremia, em particular, temsido identificada como um dos fatores associados à virulência e a gravidade dadoença nos seres humanos e, assim, constitui um parâmetro importante a serconsiderado. Obviamente, a imunogenicidade é um parâmetro essencial aotestar vacinas.

Inventores estabeleceram os valores mínimo/máximo para viremiae imunogenicidade.

Tabela 10:

Requisitos Mínimos Para as Respostas Induzidas Pelas Vacinas Candidatasda dengue ElW macacos. conforme mensuradas em células vero ou LLC-MK2 Pelo Ensaio em Placas (Sendo Estas Células ConsideradasEquivalentes Neste Tipo De Ensaio)

<table>table see original document page 39</column></row><table>

pfu: Unidades formadoras de placa

PRNT 50: Neutralização com Redução de Placas Título 50 (títulocorrespondente a uma redução de 50% do número de placas)

4.1 Farmacologia Pré-Clínica. Farmacocinética ε Produto do Metabolismoem Animais

4.1.1 Material ε Métodos

4.1.1.1 Experimentosemmacacos

Experimentos em macacos foram efetuados de acordo com asdiretrizes européias relativas à experimentação animal.

As Imunizações foram realizadas em macacos cinomolgos(Macaca fascicularis) originários das Ilhas Maurício (CRP Le Vallon). Osmacacos permaneceram de quarentena durante 6 semanas no biotério daSanofi Pasteur antes da imunização.

Os macacos foram imunizados com as vacinas por viasubcutânea (SC) no braço em um volume de 0,5 ml (vide cada seçãorespectiva). Após anestesia leve com cetamina (Imalgene, Merial), o sangue foicolhido por punção das veias inguinal e safena. Aos dias O e 28, foram colhidosamostras de 5 ml de sangue para avaliar as respostas ao anticorpo enquantoque entre os dias 2 e 10 apenas 1 ml de sangue foi coletado para avaliar aviremia. O sangue foi coletado e mantido no gelo até a separação do soro.Para isso, sangue foi centrifugado durante 20 minutos a 4 °C, e soro retirado earmazenados a -80 0C até os testes no laboratório Rich Kinney. O transportepara os EUA foi realizado em gelo seco.

4.1.1.2 Viremia ε Respostas por Anticorpos Neutralizantes (Teste deNeutralização por Redução de Placas. PRNT)

Todas as análises foram realizadas no laboratório de R. Kinney noCDC1 Fort Collins1 EUA.. As amostras séricas foram transferidas earmazenadas a -80 0C até o momento do ensaio. No instante do primeirodescongelamento, as amostras foram testadas para viremia, e uma diluição de1:5 do soro foi realizada. As diluições de 1:5 do soro foram inativados por 30minutos a 56 0C antes do teste de neutralização do anticorpo.

4.1.1.2.1 Viremia

0,125 ml de soro foi adicionado a 0,125 ml de solvente (meioRPMI) no primeiro poço da placa de 96 poços e diluições seriais de 10 vezesforam feitas, transferindo de 0,025 ml em 0,225 ml do diluente para cadadiluição. Diluições seriadas de 0,2 ml de IO03-IO53 foram plaqueadas em 6poços de placas com células Vero (o vírus foi adsorvido a 37 0C durante 1,5horas, e coberto com 4 ml de agarose sem vermelho neutro, por 6-7 diascobertos adicionalmente com 2 ml de Agarose contendo vermelho neutro, eentão placas foram contadas). O limite de detecção do vírus foi = 10 PFU / ml.Para o controle de estoque vacinas DEN-16681 PDK-53 (LAV2) foramplaqueadas.

4.1.1.2.2 PRNT (Teste de Neutralização por Redução de Placas)

Anticorpos neutralizantes foram quantificados como descritoem Huang et ai. (2000). Resumidamente, 0,2 mL de soro inativado pelocalor, diluído 1:5 foram adicionados ao primeiro poço de placas de 96poços e diluições seriais de 2 vezes foram feitas, transferindo de 0,1 ml em0,1 ml de solvente (meio RPMI) para cada diluição. Isto resultou em umadiluição serial sérica de 1:10 - 1:320. 0,1 ml do vírus DEN (60-160 PFU; ovírus parental DEN1 16681) foi adicionado a cada poço de diluição sérica,com um total de 0,2 ml de mistura soro-vírus. As placas de 96 poços foramincubadas overnight a 4 0C. 0,1 ml de mistura soro-vírus (contendo 30-80PFU da entrada do vírus) foram plaqueadas em 6 poços de placas comcélulas Vero (conforme indicado acima na seção da Viremia) e as placasforam contadas após coloração com vermelho neutro. Múltiplas titulaçõesda entrada viral em testes de concentrações de 2 vezes, 1-vez, e 0,5 vezfornecidos por determinação experimental direta da PFU de entrada, quefoi a base para a determinação do título final de 50% (PRNT50) e 70%(PRNT70) de anticorpo. Um resultado soro negativo deve ter um título deanticorpos neutralizantes <1:10. Soros demonstrando um título deneutralização de 320 foram re-analisados em diluições de 1:80 a 1:2560para a determinação do final título.

4.1.2 Avaliação Do Candidato Monovalente VDV2 na Passagem 9 emMacacos

A purificação/seleção do candidato VDV2 foi realizadaconforme descrito no exemplo 1. Os clones selecionados (com base nasseqüência e marcadores fenotípicos) foram testados após 9 passagens emcultura de células na sanofi-pasteur em macacos cinomolgos machos(Macaca fascicularís, peso médio 3,1 kg), originárias da CRP Le Vallon,Ilhas Maurício.

Após a imunização em DO, a viremia foi seguida do D2 ao D10, ea imunogenicidade medida no DO e D28. Todas as vacinas e vírus, quando naforma líquida, foram mantidos a -70 °C.

LAV2: título: 103·93 DICC50/ml, liofilizado, ressuspendido em 0,5 mlde PBS (contendo Ca2+ e Mg2+; CaCI2 2H20 0,133 g/L.; MgCI2.6H20, 0,1 g/L) eadministrado na totalidade.

Passagem VDV2: DEN2 - TV722 (2 purificações em placas + 1amplificação): Título: 105,6 DICC5o/ml, líquido, diluído em 105'3 pfu/ml em PBS(contendo Ca2+ e Mg2+; CaCI2.2H20 0,133 g/L, MgCI2.6H20, 0,1 g/L);administrado 0,5 ml.

A injeção foi feita por via SC no braço com uma agulha 23G1, auma dose 105 DICC50 para VDV2.

Os resultados estão apresentados na Tabela 11. Titulações nodia 28 foram realizadas em triplicata (PRNT70) ou em duplicata (PRNT50).

A comparação entre VDV2 e LAV2 mostrou nítidas diferençasde viremia, com alta viremia de curta duração para VDV2 em 3/4 macacos,em comparação com LAV2, e imunogenicidade significativas para ambosos tipos (pouco menor para VDV2). Esta viremia pode ser consideradamuito alta para a VDV2 pré-mãe neste nível depois de apenas algumaspassagens em células Vero. No entanto, a DEN-2 tipo selvagem (e tambémoutros tipos) induzem a viremia de longa duração (6 a 7 dias) e intensidade(máxima de 5 Log de unidades formadoras de placas [pfu]) (Monath et ai,2000; Bray et ai, 1996).Tabela 11: Imunogenicidade do VDV2 Passagem 9

<table>table see original document page 43</column></row><table> Vírus Exp#1 Exp#2 Exp#3

DEN- 2 60PFU 54PFU 46PF U

4.1.3 Avaliação Do Candidato Monovalente VDV2 na Passagem 11

Como a imunogenicidade das vacinas haviam sido testadas napassagem 9, um novo experimento foi projetada para testar a passagemmonovalentes após duas passagens adicionais (passagem 10).

Macacos Macaca fascicularís machos, foram utilizados comodescrito anteriormente, originários da C.R.P. Le Vailon, Ilhas Maurício (24macacos, peso médio 3,4 kg).

VDV2 Passagem 11; Lote: Título: 8,07 Iogi0 DICC5o/nriL.

Placebo: PBS com Ca2+ e Mg2+

VDV3: Vacina de cepa da dengue sorotipo 3 derivada de células

VERO, obtidos por sanitização da cepa LAV3 em células Vero.

VDV4: Vacina de cepa da dengue sorotipo 4 derivada de células

VERO, obtidos por sanitização da cepa LAV4 em células Vero.As vacinas foram diluídas em PBS a 1053 DICC50 /ml (contendoCa2+ e Mg2+; CaCI2^H2O 0,133 g/L; MgCl2.6H20, 0,1g/l); 0,5 ml administradopor via SC no braço com uma agulha 23G1, correspondendo a uma dose de105 DICC50.

Viremia e imunogenicidade foram medidos, como é habitual noCDC por R Kinney. Os resultados são apresentados na Tabela 12.

A vacina monovalente VDV2 passagem 11 induziu uma respostaimunitária significativa, enquanto que viremia foi reduzida ou inexistente. Aausência/baixa viremia induzida pela VDV2 deve ser considerando aexperiência anterior, na qual a VDV2 passagem 9 induziu de forma precoceuma alta viremia. Algumas evoluções entre as passagens 9 e 11 suprimiramesta alta viremia enquanto que imunogenicidade foi mantida. A cepa VDV2constitui, portanto, um candidato aceitável.

É de se notar que no mesmo experimento, 4 macacos foramvacinados com uma formulação tetravalente envolvendo a mesma vacinaVDV2 passagem 11; e nenhuma viremia foi detectada para VDV1 e VDV2enquanto que VDV3 e VDV4 induziram a viremia.

Dois outros experimentos envolveram a administração de VDV2,isoladamente ou em combinação com os outros sorotipos.

No primeiro (estudo com tetravalente; 5-log de cada sorotipo),nenhuma viremia foi detectada para VDV2, e VDV1, enquanto altos níveis deviremia foram detectados para VDV3 e VDV4.

No segundo experimento, a cepa VDV2 passagem 11 foiadministrada isoladamente ou dentro de uma combinação tetravalenteincluindo o VDV1. Quando administrado isoladamente, a cepa VDV2 passagem11 induziu uma baixa viremia (pico 40), em apenas 1 de 4 macacos, enquantoque os 3 restantes foram negativos. Quando administrado em uma formulaçãotetravalente, a cepa VDV2 não induziu ou diminuiu consideravelmente aviremia comparado com as cepas VDV3 e VDV4, embora a VDV2 ter sidoadministrada em 4 Log enquanto que as cepas VDV3 e VDV4 foramadministrados em 2 Log. Isto demonstra a maior segurança da cepa VDV2, namedida em que a viremia está relacionada. VDV2 monovalente cumpre assimcom sucesso os critérios inicialmente definidos em macacos.

Tabela 12: Imunogenicidade ε Viremia do vnv2 passagem 11

<table>table see original document page 45</column></row><table>

4.2.1 Testes de Neurovirulência em Macacos

O objetivo deste ensaio foi demonstrar a falta de propriedadesneurotrópicas em macacos (Ph. Eur. 2.6.18) das sementes "seeds" do vírus dadengue-2 atenuado produzidas pela Sanofi Pasteur.

10 macacos cinomolgos das ilhas Maurício foram inoculadas comVDV2 passagem 9 pela via intracerebral (107·10 CCID50ZmL no tálamo de cadahemisfério). No final do ensaio, os macacos foram sacrificados e perfundidoscom solução de formalina. Foram colhidas amostras de tecido do cérebro decada macaco (medula oblongata, ponte e cerebelo, mesencéfalo, tálamoincluindo a parte esquerda e direita, córtex cerebral à esquerda e à direita).Foram feitas seções com uma espessura de 8 μιτι. e coradas pela eosina egalocianina.

Nenhum sinal histopatológico de patogenicidade foi observado nocérebro dos macacos injetados com semente "seecT do vírus da dengueprimária sorotipo-2.

4.2.2 Estudo de Toxicidade de GLP (Boas Práticas Laboratoriais) emMacacos Cinomolgos Após 1 Administração Subcutânea da VDV2 Seguidopor um Período de Observação de 28 Pias

O objetivo deste estudo de GLP foi avaliar as interações entreVDV2 passagem 9 e outras vacinas candidatas da dengue. A 1a etapa doestudo foi avaliar a segurança e imunogenicidade da VDV2 antes daadministração de outra vacina candidata.

Uma dose humana de VDV2 (aproximadamente 104 CCID50 pordose) foi administrada por via subcutânea no Dia O aos macacos cinomolgos (4machos e 4 fêmeas). Um grupo controle de 2 machos e 2 fêmeas recebeu oveículo (4% de NaCI).

A mortalidade, condição clínica, peso corporal e consumoalimentar foram monitorados durante todo o estudo. Temperatura corporal foitomada depois do pré-teste, diariamente, a partir do dia de cada administraçãoe durante 2 dias seguintes. Amostras de sangue foram coletadas paradeterminações clínico-laboratoriais, após o pré-teste e nos Dias 8 e 27.

Não se observaram quaisquer efeitos sobre os sinais clínicos,peso corporal, consumo alimentar, reações dérmicas, temperatura corporal,parâmetros clínicos hematológicos, químicos, ou peso dos órgãos. Nenhumamorte foi relatada durante o estudo.

Em conclusão, a administração subcutânea da VDV2 nosmacacos cinomolgos (Macaca fascicularis), na dose testada não afetouadversamente a saúde dos macacos, como avaliada pelas observaçõesclínicas em vida e pela patologia clínica.

Exemplo 5

Segurança Do VDV2 Monovalente Em Adultos Saudáveis. Flavivirus NaiveCom Idade Entre 18 E 40 Anos

O propósito deste estudo fase 1 é documentar os perfis desegurança, viremia, e imunogenicidade do VDV2 passagem 11 monovalenteem uma concentração de vírus de 104 CCID50 comparado com Stamaril®(usados como grupo controle), em adultos sem precedentes de tratamento paraFlavivirus (naive). Injeções únicas são dadas, dando o seguimento a 6 e 12meses. Por precaução da segurança, são realizadas no estudo inclusõesseqüenciais.

A inclusão no estudo e as vacinações são assim escalonadas; um1° coorte (n = 4 por grupo, η total = 12) foi vacinado. A segurança dos dadoscoletados até o dia 28 foi analisada por um Comitê de Acompanhamento deDados Independente (IDMC) e pela Royal Adelaide Hospital InvestigationalDrugs Subcommittee (IDSC) antes de se tomar a decisão de continuar com avacinação dos indivíduos restantes (n = 8 por grupo, η total = 16). Arepresentação esquemática do desenho do estudo é fornecida na figura 6.

Após a administração da vacina os pacientes são regularmentesubmetidos a vários testes e exames clínicos. Um resumo deste seguimento éindicado na tabela 13 abaixo.

A população incluída é constituída por adultos com idadescompreendidas entre 18 e 40 anos (ou seja, do dia do 18° aniversário àsvésperas do 41° aniversário), no dia da inclusão que não possuem precedentesde tratamento para o Flavivirus (naive) (foram excluídas pessoas apresentandovacinação contra doenças causadas por Flavivirus (por exemplo, febreamarela, encefalite japonesa, dengue); ou com história de infecção porFlavivirus (confirmado clinicamente, sorologicamente ou microbiologicamente)ou que residiram previamente ou viajaram para áreas com elevadaendemicidade de infecção (independentemente da duração), ou tiveramresidência ou viajaram para o norte de Queensland durante 2 semanas oumais).

Tabela 13: Fluxograma De Acompanhamento

<table>table see original document page 48</column></row><table>

V: visita - D: dia

* Tempo de intervalo entre as visitas serão calculados a partir da data devacinação do estudo, que pode ser diferente da data da visita (por exemplo, nocaso que o critério de exclusão temporária é cumprido). V06 e V07 deve serfeita com pelo menos 1 dia de intervalo.

Os produtos testados são:

A vacina avaliada é um produto Iiofilizado em um frasco que éreconstituído extemporaneamente com o solvente fornecido separadamente:

- Ingrediente ativo: 4±0,5 Iogi0 CCID50 de cada vírus da denguemonovalente sorotipo 2 (VDV2 passagem 11) por dose de 0,5 mL;

- Diluente: Solução de NaCI 4% estéril para a reconstituição davacina.

- A vacina reconstituída, ou seja, 0,5 mL de solução de NaCI 4%de VDV2 monovalentes, deve ser usada imediatamente ou ser mantidas entre+2°C e +8°C até o uso.

- A dose de 0,5 mL da vacina é administrada por via subcutâneana região deltóide.

- A vacina controle Stamaril®, é uma vacina contra a febreamarela produzida pela Aventis Pasteur. Stamaril® é apresentado como um póliofilizado, livre de Ieucose aviária, produto estabelecido para ser reconstituídocom um solvente imediatamente antes da utilização. (Ingrediente ativo: vírusvivo atenuado da febre amarela (cepa 17D): Dose letal de 50% emcamundongos > 1.000 (DL50) /Diluente: solução de NaCI 4% estéril).

A vacina controle é administrada por via subcutânea na regiãodeltóide.

Nenhum paciente teve síndrome clinicamente significativarelacionada com a vacinação. Um paciente apresentou febre passageira (<38°C). Um paciente teve uma reação local (induração). Nenhum caso de eventoadverso grave relacionado com a vacina foi observado.

Todos os indivíduos apresentam uma resposta de anticorpos 28dias após a vacinação contra a dengue-2 (título entre 1888 e 6393).Referências

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Centers for Disease Control and prevention

<120> CEPA ATENUADA DO VÍRUS DA DENGUE SOROTIPO 2

<130> BET 06P0277

<150> us 60/691274

<151> 17-06-2005

<160> 42

<170> Patentln version 3.3

<210> 1

<211> 10723

<212> DNA

<213> vírus da Dengue<220>

<221> misc_feature

<222> Cl)··C10723)

<223> VDV2

<220>

<221> CDS

<222> (97) . . (10272)<220>

<221> misc_feature

<222> (10361)..(10361)

<223>

desconhecido

<400> 1 ^

agttgttagt ctacgtggac cgacaaagac agattctttg agggagctaa gctcaatgta

qttctaacag ttttttaatt agagagcaga tctctg atg aat aac caa cgg aaa

* Met Asn Asn Gln Arg Lys

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25 30 35

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Gln Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met Ala Leu Val Ala Phe Leu40 45 50

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ggc atg ate att atg ctg att cca aca gtg atg gcg ttc cat tta acc

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258

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498

546

594

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a 690

738

786

acg tcc acg tgg gta act tat ggg acg tgt acc acc atg ggAsn Ser Thr Ser Thr Trp vai Thr Tyr Gly Thr cys Thr Thr Met Gly185 190 195

gaa cat aga aga gaa aaa aga tca gtg gea ctc gtt cca cat gtg cgaGlu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser vai Ala Leu vai Pro His Val Arg200 205 210

atg gga ctg gag aca cga act gaa aca tgg atg tca tca gaa gag gccMet Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser Ser Glu Gly Ala215 220 225 230

tqg aaa cat gtc cag aga att gaa act tgg ate ttg aga cat cca ggc 834

Trp Lys His Val Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu Arg His Pro Gly* 235 240 245

ttc acc atg atg gea gea ate ctg gea tac acc ata gga acg aca catPhe Thr Met Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile Gly Thr Thr His250 255 260

ttc caa aga gcc ctg att ttc ate tta ctg aca gct gtc act cct tcaPhe Gln Arg Ala Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala Val Thr Pro ser265 270 275

atg aca atg cgt tgc ata gga atg tca aat aga gac ttt gta gaa gagMet Thr Met Arg cys Il e Gly Met ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly280 285 290

gtt tca gga gga age tgg gtt gac ata gtc tta gaa cat gga age tgtvai Ser Gly Gly Ser Trp vai Asp Ile Val Leu Glu His Gly ser Cys295 300 305 310

gtg acg acg atg gea aaa aac aaa cca aca ttg gat ttt gaa ctg atavai Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile315 320 325

aaa aca gaa gcc aaa cag cct gcc acc cta agg aag tac tgt ata gag 1122Lys Thr Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu330 335 340

gea aag cta acc aac aca aca aca gaa tet cgc tgc cca aca caa ggg 1170Ala Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly345 350 355

gaa ccc age cta aat gaa gag cag gac aaa agg ttc gtc tgc aaa cac 1218Glu Pro Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe vai Cys Lys His360 365 370

tcc atg gta gac aga gga tgg gga aat gga tgt gga cta ttt gga aag 1266

882

930

978

1026

1074Ser Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asri Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys

375 380 385 390

gga ggc att gtg acc tgt gct atg ttc aga tgc aaa aag aac atg gaa 1314Gly Gly Xle Val Thr Cys Ala Met Phe Arg Cys Lys Lys Asn Met Glu395 400 405

gga aaa gtt gtg caa cca gaa aac ttg gaa tac acc att gtg ata aca 1362Gly Lys Val vai Gln Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile VaT Ile Thr410 415 420

cct cac tca ggg gaa gag cat gca gtc gga aat gac aca gga aaa catPro His ser Gly Glu Glu His Ala vai Gly Asn Asp Thr Gly Lys His425 430 435

aca ata gtt ate aga gtg caa tat gaa ggg gac ggc tet cca tgc aagThr lie vai Ile Arg vai Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys600 605 610

1410

c aag gaa ate aaa ata aca cca cag agt tcc ate aca gaa gca gaa 1458y Lys Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu440 44 5 450

ttg aca gqt tat ggc act gtc aca atg gag tgc tet cca aga acg gac 1506Leu Thr Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly455 460 465 470

etc gac ttc aat gag atg gtg ttg ctg cag atg gaa aat aaa gct tgg 1554Leu Asp Phe Asn Glu Met vai Leu Leu Gln Met Glu Asn Lys Ala Trp475 480 485

ctg gtg cac agg caa tgg ttc cta gac ctg ccg tta cca tgg ttg ccc 1602Leu vai His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro490 495 500

gga gcg gac aca caa gag tca aat tgg ata cag aag gag aca ttg gtc 1650Gly Ala Asp Thr Gln Glu ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val505 510 515

act ttc aaa aat ccc cat gcg aag aaa cag gat gtt gtt gtt tta gga 1698Thr Phe Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly520 525 530

tcc caa gaa ggg gcc atg cac aca gca ctt aca ggg gcc aca gaa ate 1746ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile535 540 545 550

caa atg tca tca gga aac tta ctc ttc aca gga cat etc aag tgc agg 1794Gln Met ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg555 560 565

ctg aga atg gac aag cta cag ctc aaa gga atg tca tac tet atg tgc 1842Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr ser Met Cys570 575 580

aca gga aag ttt aaa gtt gtg aag gaa ata gca gaa aca caa cat gga 1890Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly585 590 595

1938

ate cct ttt gag ata atg gat ttg gaa aaa aga cat gtc tta ggt cgc 1986Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His vai Leu Gly Arg615 620 625 630

ctg att aca gtc aac cca att gtg aca gaa aaa gat age cca gtc aac 2034Leu lie Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn635 640 645

ata gaa gca gaa cct cca ttt gga gac age tac ate ate ata gga gta 2082Xle Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val650 655 660

gag ccg gga caa ctg aag ctc aac tgg ttt aag aaa gga agt tct ate 2130

Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly ser ser Ile665 670 675

ggc caa atg ttt gag aca aca atg agg ggg gcg aag aga atg gcc att 2178

Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile680 685 690

tta ggt gac aca gcc tgg gat ttt gga tcc ttg gga gga gtg ttt aca 2226

Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly Val Phe Thr695 700 705 710

tct ata gga aag gct ctc cac caa gtc ttt gga gea ate tat gga gct 2274vai Phe Gly Ala Ile Tyr Glv "

ser lie Gly Lys Ala Leu His Gln Val Phe Gly Ala Ile Tyr Gly Ala715 720 725

gcc ttc agt ggg gtt tca tgg act atg aaa ate ctc ata gga gtc att 2322Ala Phe ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Leu Ile Gly Val Ile730 735 740

ate aca tgg ata gga atg aat tca cgc age acc tca ctg tct gtg aca 2370Ile Thr Trp Ile Gly Met Asn Ser Arg Ser Thr ser Leu Ser Val Thr745 750 755

cta gta ttg gtg gga att gtg aca ctg tat ttg gga gtc atg gtg cag 2418Leu Val Leu vai Gly Ile Val Thr Leu Tyr Leu Gly vai Met Val Gln760 765 770

gcc gat agt ggt tgc gtt gtg age tgg aaa aac aaa gaa ctg aaa tgt

Ala Asp ser Gly Cys Val vai ser Trp Lys Asn Lys Glu Leu Lys Cys

775 780 785 790

ggc agt ggg att ttc ate aca gac aac gtg cac aca tgg aca gaa caa

Gly Ser Gly Ile Phe Ile Thr Asp Asn Val His Thr Trp Thr Glu Gln

795 800 805

aaa gcc cat gaa gag gac att tgt gga ate cgc tca gta aca aga ctgLys Ala His Glu Glu Asp Ile Cys Gly Ile Arg Ser Val Thr Arg Leu825 830 835

tct cat aac cag acc ttt ctc att gat ggc ccc gaa aca gea gaa tgcSer His Asn Gln Thr Phe Leu Ile Asp Gly Pro Glu Thr Ala Glu cys905 910 915

2466

2514

tac aaa ttc caa cca gaa tcc cct tca aaa cta gct tca gct ate cag 2562Tyr Lys Phe Gln Pro Glu ser Pro Ser Lys Leu Ala ser Ala Ile Gln810 815 820

2610

gag aat ctg atg tgg aaa caa ata aca cca gaa ttg aat cac att cta 2658

Glu Asn Leu Met Trp Lys Gln Il e Thr Pro Glu Leu Asn His Ile Leu840 845 850

tca gaa aat gag gtg aag tta act att atg aca gga gac ate aaa gga 2706

ser Glu Asn Glu Val Lys Leu Thr Ile Met Thr Gly Asp Ile Lys Gly855 860 865 870

ate atg cag gea gga aaa cga tct ctg cgg cct cag ccc act gag ctg

lie Met Gln Ala Gly Lys Arg ser Leu Arg Pro Gln Pro Thr Glu Leu875 880 885

2754

aag tat tca tgg aaa aca tgg ggc aaa gea aaa atg ctc tct aca gag 2802Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala Lys Met Leu Ser Thr Glu890 895 900

2850

ccc aac aca aat aga gct tgg aat tcg ttg gaa gtt gaa gac tat ggc 2898Pro Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn Ser Leu Glu vai Glu Asp Tyr Gly920 925 930

ttt gga gta ttc acc acc aat ata tgg cta aaa ttg aaa gaa aaa cag 2946Phe Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu Lys Leu Lys Glu Lys Gln935 940 945 950

gat gta ttc tgc gac tca aaa ctc atg tca gcg gcc ata aaa gac aac 2994Asp Val Phe Cys Asp Ser Lys Leu Met Ser Ala Ala Ile Lys Asp Asn955 960 965

aga gcc gtc cat gcc gat atg ggt tat tgg ata gaa agt gca ctc aat 3042Arg Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp lie Glu Ser Ala Leu Asn970 975 980

gac aca tgg aag ata gag aaa gcc tct ttc att gaa gtt aaa aac tgc 3090Asp Thr Trp Lys Ile Glu Lys Ala Ser Phe Ile Glu Val Lys Asn Cys985 990 995

cac tgg cca aaa tca cac acc ctc tgg age aat gga gtg cta gaa 3135

His Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp ser Asn Gly Val Leu Glu1000 1005 1010

agt gag atg ata att cca aag aat ctc gct gga cca gtg tct caa 3180Ser Glu Met Ile Ile Pro Lys Asn Leu Ala Gly Pro Val ser Gln1015 1020 1025

cac aac tat aga cca ggc tac cat aca caa ata aca gga cca tgg 3225

His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln Ile Thr Gly Pro Trp1030 1035 1040

cat cta ggt aag ctt gag atg gac ttt gat ttc tgt gat gga aca 3270His Leu Giy Lys Leu Glu Met Asp Phe Asp Phe Cys Asp Gly Thr1045 1050 1055

aca gtg gta gtg act gag gac tgc gga aat aga gga ccc tct ttg 3315

Thr Val Val vai Thr Glu Asp Cys Gly Asn Arg Gly Pro ser Leu1060 1065 1070

aga aca acc act gcc tct gga aaa ctc ata aca gaa tgg tgc tgc 3360Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile Thr Glu Trp Cys Cys1075 1080 1085

cga tct tgc aca tta cca ccg cta aga tac aga ggt gag gat ggg 3405Arg Ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Arg Gly Glu Asp Gly1090 1095 1100

tgc tgg tac ggg atg gaa ate aga cca ttg aag gag aaa gaa gag 3450Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Leu Lys Glu Lys Glu Glu1105 1110 1115

aat ttg gtc aac tcc ttg gtc aca gct gga cat ggg cag gtc gac 3495Asn Leu vai Asn ser Leu Val Thr Ala Gly His Gly Gln Val Asp1120 1125 1130

aac ttt tca cta gga gtc ttg gga atg gca ttg ttc ctg gag gaa 3540Asn Phe ser Leu Gly Val Leu Gly Met Ala Leu Phe Leu Glu Glu1135 1140 1145

atg ctt agg acc cga gta gga acg aaa cat gca ata cta cta gtt 3585Met Leu Arg Thr Arg Val Gly Thr Lys His Ala Ile Leu Leu Val1150 1155 1160

gca gtt tct ttt gtg aca ttg ate aca ggg aac atg tcc ttt aga 3630Ala Val Ser Phe Val Thr Leu Ile Thr Gly Asn Met ser Phe Arg1165 1170 1175

gac ctg gga aga gtg atg gtt atg gta ggc gcc act atg acg gat 3675ASD Leu Gly Arg vai Met Val Met Val Gly Ala Thr Met Thr Asp1180 1185 1190

gac ata ggt atg ggc gtg act tat ctt gcc cta cta gça gçc ttcAsp Xle Gly Met Gly Val Thr Tyr Leu Ala Leu Leu Ala Ala Phe1195 1200 1205

aaa gtc aga cca act ttt gca gct gga cta ctc ttg aga aag ctgLvs Val Arq Pro Thr Phe Ala Ala Gly Leu Leu Leu Arg Lys Leu1210 1215 1220

acc tcc aag gaa ttg atg atg act act ata gga att gta ctc ctcThr ser Lys Glu Leu Met Met Thr Thr Ile Gly Ile Val Leu Leu1225 1230 1235

tcc cag age acc ata cca gag acc att ctt gag ttg act gat gçgser Gln ser Thr Ile Pro Glu Thr Ile Leu Glu Leu Thr Asp Ala1240 1245 1250

tta gcc tta ggc atg atg gtc ctc aaa atg gtg aga aat atg gaaLeu Ala Leu Gly Met Met Val Leu Lys Met Val Arg Asn Met Glu1255 1260 1265

aag tat caa ttg gca gtg act ate atg gçt ate ttg tgc gtc ccalvs Tvr Gln Leu Ala vai Thr Ile Met Ala Ile Leu Cys vai Proy 1270 1275 1280

aac gca gtg ata tta caa aac gca tgg aaa gtg agt tgc aca ataAsn Ala vai Ile Leu Gln Asn Ala Trp Lys Val ser Cys Thr Ile1285 1290 1295

ttg gca gtg gtg tcc gtt tcc cca ctg ttc tta aca tcc tca cagLeu Ala vai Val ser vai ser Pro Leu Phe Leu Thr Ser ser Gln1300 1305 1310

caa aaa aca gat tgg ata cca tta gca ttg acg ate aaa ggt ctcGln Lys Thr Asp Trp Ile Pro Leu Ala Leu Thr Ile Lys Gly Leu1315 1320 1325

aat cca aca gct att ttt cta aca acc ctc tca aga acc age aagAsn Pro Thr Ala Ile Phe Leu Thr Thr Leu ser Arg Thr ser Lys1330 1335 1340

aaa agg age tgg cca tta aat gag gct ate atg gca gtc ggg atgLvs Arq ser Trp Pro Leu Asn Glu Ala lie Met Ala Val Gly Mety 1345 1350 1355

qtg age att tta gcc agt tet ctc cta aaa aat gat att ccc atgVal ser Ile Leu Ala Ser ser Leu Leu Lys Asn Asp Ile Pro Met1360 1365 1370

aca gga cca tta gtg gct gga ggg ctc ctc act gtg tgc tac gtgThr Gly Pro Leu VaT Ala Gly Gly Leu Leu Thr Val Cys Tyr Val1375 1380 1385

ctc act gga cga tcg gcc gat ttg gaa ctg gag aga gca gçc gatLeu Thr Gly Arg Ser Ala Asp Leu Glu Leu Glu Arg Ala Ala Asp1390 1395 1400

gtc aaa tgg gaa gac cag gca gag ata tca gga age agt cca ateVal Lys Trp Glu Asp Gln Ala Glu lie ser Gly Ser Ser Pro Ile1405 1410 1415

ctg tca ata aca ata tca gaa gat ggt age atg tcg ata aaa aatLeu Ser Ile Thr lie Ser Glu Asp Gly Ser Met Ser Ile Lys Asn1420 1425 1430

gaa gag gaa gaa caa aca ctg acc ata ctc att aga aca gga ttg

3720

3765

3810

3855

3900

3945

3990

4035

4080

4125

4170

4215

4260

4305

4350

4395

4440Glu Glu Glu Glu Gln Thr Leu Thr Ile Leu Ile Arg Thr Gly Leu1435 1440 1445

ctg gtg ate tca gga ctt ttt cct gta tca ata cca ate acg gea 4485Leu Val Ile ser Gly Leu Phe Pro Val ser Ile Pro Ile Thr Ala1450 1455 1460

gea gea tgg tac ctg tgg gaa gtg aag aaa caa cgg gcc gga gta 4530Ala Ala Trp Tyr Leu Trp Glu vai Lys Lys Gln Arg Ala Gly Val1465 1470 1475

ttg tgg gat gtt cct tca ccc cca ccc atg gga aag gçt gaa ctg 4575Leu Trp Asp Val Pro Ser Pro Pro Pro Met Gly Lys Ala Glu Leu1480 1485 1490

gaa gat gga gcc tat aga att aag caa aaa ggg att ctt gga tat 4620Glu Asp Gly Ala Tyr Arg Ile Lys Gln Lys Gly Ile Leu Gly Tyr1495 1500 1505

tcc cag ate gga gcc gga gtt tac aaa gaa gga aca ttc cat aca 4665ser Gln Ile Gly Ala Gly Val Tyr Lys Glu Gly Thr Phe His Thr1510 1515 1520

atg tgg cat gtc aca cgt ggc gct gtt cta atg cat aaa gga aag 4710Met Trp His Val Thr Arg Gly Ala Val Leu Met His Lys Gly Lys1525 1530 1535

agg att gaa cca aca tgg gcg gac gtc aag aaa gac cta ata tca 4755Arg lie Glu Pro Thr Trp Ala Asp Val Lys Lys Asp Leu Ile Ser1540 1545 1550

tat gga gga ggc tgg aag tta gaa gga gaa tgg aag gaa gga gaa 4800Tyr Gly Gly Gly Trp Lys Leu Glu Gly Glu Trp Lys Glu Gly Glu1555 1560 1565

gaa gtc cag gta ttg gea ctg gag cct gga aaa aat cca aga gccGlu Val Gln Val Leu Ala Leu Glu Pro Gly Lys Asn Pro Arg Ala1570 1575 1580

gtc caa acg aaa cct ggt ctt ttc aaa acc aac gcc gga aca ata 4890Val Gln Thr Lys Pro Gly Leu Phe Lys Thr Asn Ala Gly Thr Ile1585 1590 1595

ggt gct gta tet ctg gac ttt tet cct gga acg tca gga tet cca 4935GTy Ala vai Ser Leu Asp Phe ser Pro Gly Thr ser Gly Ser Pro1600 1605 1610

att ate gac aaa aaa gga aaa gtt gtg ggt ctt tat ggt aat gat 4980Ile He Asp Lys Lys Gly Lys vai Val Gly Leu Tyr Gly Asn Gly1615 1620 1625

gtt gtt aca agg agt gga gea tat gtg agt gct ata gcc cag act 5025vai vai Thr Arg ser Gly Ala Tyr Val ser Ala Ile Ala Gln Thr1630 1635 1640

gaa aaa age att gaa gac aac cca gag ate gaa gat cac att ttc 5070Glu Lys ser Ile Glu Asp Asn Pro Glu Ile Glu Asp His Ile Phe1645 1650 1655

cga aag aga aga ctg acc ate atg gac ctc cac cca gga gcg gga 5115Arg Lys Arg Arg Leu Thr Ile Met Asp Leu His Pro Gly Ala Gly1660 1665 1670

aag acg aag aga tac ctt ccg gcc ata gtc aga gaa gct ata aaa 5160Lys Thr Lys Arg Tyr Leu Pro Ala Ile Val Arg Glu Ala lie Lys1675 1680 1685

cgg ggt ttg aga aca tta ate ttg gcc ccc act aga gtt gtg gea 5205

4845Arg Gly Leu Arg Thr Leu Ile Leu Ala Pro Thr Arg Val Val Ala1690 1695 1700

gct gaa atg gag gaa gcc ctt aga gga ctt cca ata aga tac cag 5250Ala Glu Met Glu Glu Ala Leu Arg Gly Leu Pro Ile Arg Tyr Gln1705 1710 1715

acc cca gcc ate aga gct gag cac acc gag cgg gag att gtg gac 5295Thr Pro Ala Xle Arg Ala Glu His Thr Gly Arg Glu Ile VaT Asp1720 1725 1730

cta atg tgt cat gcc aca ttt acc atg agg ctg cta tca cca gtt 5340

Leu Met Cys His Ala Thr Phe Thr Met Arg Leu Leu ser Pro Val1735 1740 1745

aga gtg cca aac tac aac ctg att ate atg gac gaa gcc cat ttc 5385Arg Vai Pro Asn Tyr Asn Leu Ile Ile Met Asp Glu Ala His Phe1750 1755 1760

aca gac cca gea agt ata gea gct aga gga tac ate tca act cga 5430Thr Asp Pro Ala Ser Ile Ala Ala Arg Gly Tyr Ile ser Thr Arg1765 1770 1775

gtg gag atg ggt gag gea gct ggg att ttt atg aca gcc act ccc 5475vai Glu Met Gly Glu Ala Ala Gly Ile Phe Met Thr Ala Thr Pro1780 1785 1790

ccg gga age aga gac cca ttt cct cag age aat gea cca ate ata 5520Pro Gly Ser Arg Asp Pro Phe Pro Gln Ser Asn Ala Pro Ile Ile1795 1800 1805

gat gaa gaa aga gaa ate cct gaa cgc tcg tgg aat tcc gga cat 5565Asp Glu Glu Arg Glu lie Pro Glu Arg ser Trp Asn Ser Gly His1810 1815 1820

gaa tgg gtc acg gat ttt aaa ggg aag act gtt tgg ttc gtt cca 5610Glu Trp Val Thr Asp Phe Lys Gly Lys Thr Val Trp Phe VaT Pro1825 1830 1835

agt ata aaa gea gga aat gat ata gea gct tgc ctg agg aaa aat 5655ser lie Lys Ala Gly Asn Asp Ile Ala Ala Cys Leu Arg Lys Asn1840 1845 1850

gga aag aaa gtg ata caa etc agt agg aag acc ttt gat tet gag 5700Gly Lys Lys Val Ile Gln Leu ser Arg Lys Thr Phe Asp ser Glu1855 1860 1865

tat gtc aag act aga acc aat gat tgg gac ttc gtg gtt aca act 5745Tyr Val Lys Thr Arg Thr Asn Asp Trp Asp Phe Val vai Thr Thr1870 1875 1880

gac att tca gaa atg ggt gcc aat ttc aag gct gag agg gtt ata 5790Asp lie Ser Glu Met Gly Ala Asn Phe Lys Ala Glu Arg Val Ile1885 1890 1895

gac ccc aga cgc tgc atg aaa cca gtc ata cta aca gat ggt gaa 5835Asp Pro Arg Arg Cys Met Lys pro Val Ile Leu Thr Asp Gly Glu1900 1905 1910

gag cgg gtg att ctg gea gga cct atg cca gtg acc cac tet agt

Glu Arg Val Ile Leu Ala Gly Pro Met Pro vai Thr His Ser Ser1915 1920 1925

gea gea caa aga aga ggg aga ata gga aga aat cca aaa aat gag

Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg Ile Gly Arg Asn Pro Lys Asn Glu1930 1935 1940

5880

5925

aat gac cag tac ata tac atg ggg gaa cct ctg gaa aat gat gaa 5970Asn Asp Gln TVr Ile Tyr1945

Met Gly Glu Pro1950

Leu Glu1955

Asn Asp Glu

gac tgt gca cac tgg aaaAsp Cys Ala His Trp Lys1960

gaa gct aaa atgGlu Ala Lys Met1965

ctc ctaLeu Leu1970

gat aac ateAsp Asn Ile

6015

aac acg cca gaa gga ateAsn Thr Pro Glu Gly Ile1975

att cct age atgIle Pro Ser Met1980

ttc gaaPhe Glu1985

cca gag cgtPro Glu Arg

6060

gaa aag gtg gat gcc attGlu Lys Val Asp Ala Ile1990

gat gac gaa tacGly Glu

1995

ASp

Tyr

cgc ttgArg Leu2000

aga gga gaaArg Gly Glu

6105

gca agg aaa acc ttt gtaAla Arg Lys Thr Phe vai2005

gac tta atg agaAsp Leu Met Arg2010

aga ggaArg Giy2015

gac cta ccaAsp Leu Pro

6150

gtc tgg ttg gcc tac agaVal Trp Leu Ala Tyr Arg2020

gtg gca gct gaavai AlaAlaGlu2025

c atey Ile2030

aac tac gcaAsn Tyr Ala

6195

gac aga agg tgg tgt tttAsp Arg Arg Trp Cys Phe2035

gat gga gtc aagAsp Gly Val Lys2040

aac aacAsn Asn2045

caa ate ctaGln Ile Leu

6240

gaa gaa aac gta gaa gttGlu Glu Asn Val Glu Val2050

gaa ate tgg acaGlu Ile Trp Thr2055

aaa gaaLys Glu2060

gag gaa aggGly Glu Arg

6285

aag aaa ttg aaa cec agaLys Lys Leu Lys Pro Arg2065

tgg ttg gat gctTrp Leu Asp Ala2070

agg ateArg Ile2075

tat tet gacTyr Ser Asp

6330

cca ctg gcg cta aaa gaaPro Leu Ala Leu Lys Glu2080

ttt aag gaa tttPhe Lys Glu Phe2085

gca gccAla Ala2090

gga aga aagGly Arg Lys

6375

tet ctg acc ctg aac ctaSer Leu Thr Leu Asn Leu2095

ate aca gaa atgIle Thr Glu Met2100

ggt aggGly Arg2105

ctc cca accLeu Pro Thr

6420

ttc atg act cag aag gcaPhe Met Thr Gln Lys Ala2110

ctg cac acg gct gag gcaLeu His Thr Ala Glu Ala2125

aga gac gca ctgArg Asp Ala Leu2115

ggt gga agg gcgGly Gly Arg Ala2130

gac aacAsp Asn2120

tac aacTyr Asn2135

tta gcaLeu Ala Va

cat gct ctcHis Ala Leu

6465

6510

agt gaa ctg ccg gag accSer Glu Leu Pro Glu Thr2140

ctg gag aca ttgLeu Glu Thr Leu2145

ctt ttaLeu Leu2150

ctg aca cttLeu Thr Leu

6555

ctg gct aca gtc acg ggaLeu Ala Thr vai Thr Gly2155

ate ttt ttaGly Ile Phe Leu2160

ttc ttgPhe Leu2165

atg age gcaMet Ser Ala

6600

a99 ggc ata ggg aag atgArg Gly Ile Gly Lys Met2170

acc ctg gga atgThr Leu Gly Met2175

tgc tgccys cys2180

ata ate acgIle Ile Thr

6645

gct age ate ctc cta tggAla Ser Ile Leu Leu Trp2185

tac gca caa ataTyr Ala Gln Ile2190

cag ccaGln Pro2195

cac tgg ataHis Trp lie

6690

gca gct tca ata ata ctg gag ttt ttt ctc ata gtt ttg ctt att

6735Ala Ala ser Ile Ile Leu Glu Phe Phe Leu Ile Val Leu Leu Ile2200 2205 2210

cca gaa cct gaa aaa cag aga aca ccc caa gac aac caa ctg acc 6780

pro Glu Pro Glu Lys Gln Arg Thr Pro Gln Asp Asn Gln Leu Thr2215 2220 2225

tac gtt gtc ata gcc ate ctc aca gtg gtg gcc gea acc atg gea 6825

Tyr Val Val Πe Ala Ile Leu Thr VaT Val Ala Ala Thr Met Ala2230 2235 2240

aac gag atg ggt ttc cta gaa aaa acg aag aaa gat ctc gga ttg 6870

Asn Glu Met Gly Phe Leu Glu Lys Thr Lys Lys Asp Leu Gly Leu2245 2250 2255

gga age att gea acc cag caa ccc gag age aac ate ctg gac ata 6915

Gly Ser Ile Ala Thr Gln Gln Pro Glu ser Asn Ile Leu Asp Ile2260 2265 2270

gat cta cgt cct gea tca gea tgg acg ctg tat gcc gtg gcc aca 6960

Asp Leu Arg Pro Ala ser Ala Trp Thr Leu Tyr Ala Val Ala Thr2275 2280 2285

aca ttt gtt aca cca atg ttg aga cat age att gaa aat tcc tca 7005

Thr Phe Val Thr Pro Met Leu Arg His ser Ile Glu Asn ser ser2290 2295 2300

gtg aat gtg tcc cta aca gct ata gcc aac caa gcc aca gtg tta 7050

Val Asn VaT Ser Leu Thr Ala Ile Ala Asn Gln Ala Thr VaT Leu2305 2310 2315

atg ggt ctc gqg aaa gga tgg cca ttg tca aag atg gac ate ggaMet GTy Leu GTy Lys GTy Trp Pro Leu Ser Lys Met Asp Ile Gly2320 2325 2330

aga gea gcg gcg ggc ate atg aaa aac cca act gtc gat gga ata

Arg Ala Ala Ala GTy Ile Met Lys Asn Pro Thr Val Asp GTy Ile2380 2385 2390

aca gtg att gac cta gat cca ata cct tat gat cca aag ttt gaa

Thr VaT Il e Asp Leu Asp Pro Ile Pro Tyr Asp Pro Lys Phe Glu2395 2400 2405

7095

gtt ccc ctt ctc gcc att gga tgc tac tca caa gtc aac ccc ata 7140

Val Pro Leu Leu Ala Ile GTy Cys Tyr Ser Gln Val Asn Pro Ile2335 2340 2345

act ctc aca gea gct ctt ttc tta ttg gta gea cat tàt gcc ate 7185

Thr Leu Thr Ala Ala Leu Phe Leu Leu Val Ala His Tyr Ala Ile2350 2355 2360

ata ggg cca gga ctc caa gea aaa gea acc aga gaa gct cag aaa 7230

Ile GTy Pro GTy Leu Gln Ala Lys Ala Thr Arg Glu Ala Gln Lys2365 2370 2375

7275

7320

aag cag ttg gaa caa gta atg ctc cta gtc ctc tgc gtg act caa 7365

Lys Gln Leu GTy Gln Val Met Leu Leu Val Leu Cys VaT Thr Gln2410 2415 2420

gta ttg atg atg agg act aca tgg gct ctg tgt gag gct tta acc 7410

vai Leu Met Met Arg Thr Thr Trp Ala Leu Cys Glu Ala Leu Thr2425 2430 2435

tta gct acc ggg ccc ate tcc aca ttg tgg gaa gga aat cca ggg 7455

Leu Ala Thr GTy Pro Ile Ser Thr Leu Trp Glu GTy Asn Pro GTy2440 2445 2450

agg ttt tgg aac act acc att gcg gtg tca atg gct aac att ttt 7500Ara Phe Trp Asn Thr Thr lie Ala Val Ser Met Ala Asn Ile Phes 2455 2460 2465

aga ggg agt tac ttg gcc gga gct gga ctt etc ttt tet att atgArq GlV sir Tyr Leu Ala Gly Ala Gly Leu Leu Phe Ser Ile Meta 2470 2475 2480

aag aac aca acc aac aca aga agg gga act ggc aac ata gga gagLys Asn Thr Thr Asn Thr Arg Arg Gly Thr Gly Asn Ile Gly Glu2485 2490 2495

acg ctt gga gag aaa tgg aaa age cga ttg aac gea ttg gga aaaThr Leu Gly Glu Lys Trp Lys ser Arg Leu Asn Ala Leu Gly Lys2500 2505 2510

agt gaa ttc cag ate tac aag aaa agt gga ate cag gaa gtg gatser Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Lys Ser Gly Ile Gln Glu Val Asp2515 2520 2525

aga acc tta gea aaa gaa ggc att aaa aga gga gaa acg gac catArq Thr Leu Ala Lys Glu Gly Ile Lys Arg Gly Glu Thr Asp His2530 2535 2540

cac gct gtg tcg cga ggc tca gea aaa ctg aga tgg ttc gtt gagHis Ala Val ser Arg Gly Ser Ala Lys Leu Arg Trp Phe vai Glu2545 2550 2555

aga aac atg gtc aca cca gaa ggg aaa gta gtg gac ctc ggt tgtArg Asn Met Val Thr Pro Glu Gly Lys vai VaT Asp Leu Gly Cys2560 2565 2570

ggc aga gga ggc tgg tca tac tat tgt gga gga cta aag aat gtaGly Arg GTy Gly Trp ser Tyr Tyr Cys Gly Gly Leu Lys Asn vai2575 2580 2585

aga gaa gtc aaa ggc cta aca aaa gga gga cca gga cac gaa gaaArg Glu vai Lys Gly Leu Thr Lys Gly GTy Pro Gly His Glu Glu2590 2595 2600

ccc ate ccc atg tca aca tat ggg tgg aat cta gtg cgt ctt caaPro lie Pro Met Ser Thr Tyr GTy Trp Asn Leu Val Arg Leu Gln2605 2610 2615

agt gga gtt gac gtt ttc ttc ate ccg cca gaa aag tgt gac acaSer GTy Val Asp Val Phe Phe lie Pro Pro Glu Lys Cys Asp Thr2620 2625 2630

tta ttg tgt gac ata ggg gag tca tca cca aat ccc aca gtg gaa 8040Leu Leu cys Asp lie Gly Glu ser ser Pro Asn Pro Thr Val Glu2635 2640 2645

gea gga cga aca ctc aga gtc ctt aac tta gta gaa aat tgg ttgAla Gly Arg Thr Leu Arg Val Leu Asn Leu Val Glu Asn Trp Leu2650 2655 2660

aac aac aac act caa ttt tgc ata aag gtt ctc aac cca tat atgAsn Asn Asn Thr Gln Phe cys Ile Lys Val Leu Asn Pro Tyr Met2665 2670 2675

ccc tca gtc ata gaa aaa atg gaa gea cta caa agg aaa tat ggaPro Ser Val lie Glu Lys Met Glu Ala Leu Gln Arg Lys Tyr Gly2680 2685 2690

gga gcc tta gtg agg aat cca ctc tca cga aac tcc aca cat gagGly Ala Leu VaT Arg Asn Pro Leu Ser Arg Asn Ser Thr His Giu2695 2700 2705

atg tac tgg gta tcc aat gct tcc ggg aac ata gtg tca tca gtg

7545

7590

7635

7680

7725

7770

7815

7860

7905

7950

7995

8085

8130

8175

8220

8265Met Tyr Trp Val Ser Asn Ala ser Gly Asn Ile vai ser Ser Val2710 2715 2720

aac atg att tca agg atg ttg ate aac aga ttt aca atg aga tac 8310

Asn Met lie Ser Arg Met Leu Ile Asn Arg Phe Thr Met Arg Tyr2725 2730 2735

aag aaa gcc act tac gag ccg gat gtt gac ctc gga age gga acc 8355

Lys Lys Ala Thr Tyr Glu Pro Asp Val Asp Leu Gly ser Gly Thr2740 2745 2750

cgt aac ate ggg att gaa agt gag ata cca aac cta gat ata att 8400

Arg Asn Ile Gly Ile Glu ser Glu Ile Pro Asn Leu Asp lie Ile2755 2760 2765

ggg aaa aga ata gaa aaa ata aag caa gag cat gaa aca tca tgg 8445

Gly Lys Arg Ile Glu Lys Ile Lys Gln Glu His Glu Thr Ser Trp2770 2775 2780

cac tat gac caa gac cac cca tac aaa acg tgg gea tac cat ggtHis Tyr Asp Gln Asp His Pro Tyr Lys Thr Trp Ala Tyr His Gly2785 2790 2795

gga gtg gtc agg ctg ctg aca aaa cct tgg gac gtt gtc ccc atg

Gly Val Val Arg Leu Leu Thr Lys Pro Trp Asp Val Val Pro Met2815 2820 2825

gtg aca cag atg gea atg aca gac acg act cca ttt gga caa cag

Val Thr Gln Met Ala Met Thr Asp Thr Thr Pro Phe Gly Gln Gln2830 2835 2840

8490

age tat gaa aca aaa cag act gga tca gea tca tcc atg gtc aac 8535ser Tyr Glu Thr Lys Gln Thr Gly ser Ala ser Ser Met Val Asn2800 2805 2810

8580

8625

cgc gtt ttt aaa gag aaa gtg gac acg aga acc caa gaa ccg aaa 8670Arg Val Phe Lys Glu Lys Val Asp Thr Arg Thr Gln Glu Pro Lys2845 2850 2855

gaa ggc acg aag aaa cta atg aaa ata aca gea gag tgg ctt tgg 8715Glu Giy Thr Lys Lys Leu Met Lys Ile Thr Ala Glu Trp Leu Trp2860 2865 2870

aaa gaa tta ggg aag aaa aag aca ccc agg atg tgc acc aga gaa 8760Lys Glu Leu Gly Lys Lys Lys Thr Pro Arg Met Cys Thr Arg Glu2875 2880 2885

gaa ttc aca aga aag gtg aga age aat gea gcc ttg ggg gcc ata 8805Glu Phe Thr Arg Lys Val Arg Ser Asn Ala Ala Leu Gly Ala Ile2890 2895 2900

ttc act gat gag aac aag tgg aag tcg gea cgt gag gct gtt gaa 8850Phe Thr Asp Glu Asn Lys Trp Lys ser Ala Arg Glu Ala Val Glu2905 2910 2915

gat agt agg ttt tgg gag ctg gtt gac aag gaa agg aat ctc cat 8895Asp Ser Arg Phe Trp Glu Leu Val Asp Lys Glu Arg Asn Leu His2920 2925 2930

ctt gaa gga aag tgt gaa aca tgt gtg tac aac atg atg gga aaa 8940Leu Glu Gly Lys Cys Glu Thr cys Val Tyr Asn Met Met Gly Lys2935 2940 2945

aga gag aag aag cta ggg gaa ttc ggc aag gea aaa ggc age aga 8985Arg Glu Lys Lys Leu Gly Glu Phe Gly Lys Ala Lys Gly ser Arg2950 2955 2960

gcc ata tgg tac atg tgg ctt gga gea cgc ttc tta gag ttt gaa 9030Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala Arg Phe Leu Glu Phe Glu2965 2970 2975

acc cta gga ttc tta aat gaa gat cac tgg ttc tcc aga gag aacAla Leu Gly Phe Leu Asn Glu Asp His Trp Phe Ser Arg Glu Asn2980 2985 2990

tcc ctg agt gga gtg gaa gga gaa ggg ctg cac aag cta gat tacser Leu sér Gly VaT Glu Gly Glu Gly Leu His Lys Leu Gly Tyr2995 3000 3005

att cta aga gac gtg age aag aaa gag gga gga gea atg tat gccIle Leu Arg Asp Val sir Lys Lys Glu Gly Gly Ala Met Tyr Ala3010 3015 3020

gat gac acc gea gga tgg gat aca aaa ate aca cta gaa gac ctaAsp Asp Thr Ala Gly Tfp Asp Thr Lys Ile Thr Leu Glu Asp Leu3025 3030 3035

aaa aat gaa gag atg gta aca aac cac atg gaa gga gaa cac aagLvs Asn Glu Glu Met Val Thr Asn His Met Glu Gly Glu His Lys3040 3045 3050

aaa cta gcc gag gcc att ttc aaa cta açg tac caa aac aag gtgLys Leu Ala GlG Ala Ile Phe Lys Leu Thr Tyr Gln Asn Lys Val7 3055 3060 3065

gtg cgt gtg caa aga cca aca cca aga gac aca gta atg gac atevai Arg vai Gln Arg Pro Thr Pro Arg Gly Thr Val Met Asp Ile3070 3075 3080

ata tcg aga aga gac caa aga ggt agt gga caa gtt ggc acc tatIle ser Arg Arg Asp Gln Arg Gly Ser cly Gln Val Gly Thr Tyr3085 3090 3095

gga ctc aat act ttc acc aat atg gaa gcc caa cta ate aga cagGly Leu Asn Thr Phe Thr Asn Met Glu Ala Gln Leu Ile Arg Gln* 3100 3105 3110

atq qaq gqa gaa gga gtc ttt aaa age att cag cac cta aca ateSet Glu Gly Glu Gly vai Phe Lys ser Ile Gln His Leu Thr Ile3115 3120 3125

aca gaa gaa ate gct gtg caa aac tgg tta gça aga gtg ggg cgc 9525Thr Glu Glu Ile Ala Val Gln Asn Trp Leu Ala Arg Val Gly Arg3130 3135 3140

gaa agg tta tca aga atg gcc ate agt gga gat gat tgt gtt gtgGlu Arg Leu ser Arg Met Ala Ile Ser Gly Asp Asp cys Val Val3145 3150 3155

aaa cct tta gat gac agg ttc gea age gçt tta aca gct cta aatLys Pro Leu Asp Asp Arg Phe Ala ser Ala Leu Thr Ala Leu Asn3160 3165 3170

aac ato qqa aag att agg aaa gac ata caa caa tgg gaa cct tcaAsp Met Gly Lyl Ile Arg Lys Asp Ile Gln Gln Trp Glu Pro Ser3175 3180 3185

aqa aaa tqq aat gat tgg aca caa gtg ccc ttc tgt tca cac catIrg Gly Trp Asn Asp Trp Thr Gln Val Pro Phe çys Ser His Hts3190 3195 3200

ttc cat gag tta ate atg aaa gac ggt cgc gta ctc gtt gtt ccaPhe His Glu Leu He Met Lys Asp Gly Arg vai Leu vai Val Pro3205 3210 3215

tgt aga aac caa gat gaa ctg att ggc aga gcc cga ate tcc caa

9075

9120

9165

9210

9255

9300

9345

9390

9435

9480

9570

9615

9660

9705

9750

9795Cys Arg Asn Gln Asp Glu Leu Ile Gly Arg Ala Arg Ile Ser Gln3220 3225 3230

gga gca gag tgg tct ttg cgg gag acg gcc tgt ttg ggg aag tct 9840Gly Ala Gly Trp ser Leu Arg Glu Thr Ala Cys Leu Gly Lys ser3235 3240 3245

tac gcc caa atg tgg age ttg atg tac ttc cac aga cgc gac ctc 9885Tyr Ala Gln Met Trp Ser Leu Met Tyr Phe His Arg Arg Asp Leu3250 3255 3260

agg ctg gcg gca aat gct att tgc tcg gca gta cca tca cat tgg 9930Arg Leu Ala Ala Asn Ala Ile Cys Ser Ala Val Pro ser His Trp3265 3270 3275

gtt cca aca agt cga aca acc tgg tcc ata cat gct aaa cat gaa 9975Val Pro Thr ser Arg Thr Thr Trp Ser Ile His Ala Lys His Glu3280 3285 3290

tgg atg aca acg gaa gac atg ctg aca gtc tgg aac agg gtq tgg 10020Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Thr Val Trp Asn Arg Val Trp3295 3300 3305

att caa gaa aac cca tgg atg gaa gac aaa act cca gtg gaa aca 10065lie Gln Glu Asn Pro Trp Met Glu Asp Lys Thr Pro VaT Glu Thr3310 3315 3320

tgg gag gaa ate cca tac ttg ggg aaa aga gaa gac caa tgg tgc 10110Trp Glu Glu lie Pro Tyr Leu Gly Lys Arg Glu Asp Gln Trp Cys3325 3330 3335

ggc tca ttg att ggg tta aca age agg gcc acc tgg gca aag aac 10155Gly Ser Leu Ile Gly Leu Thr Ser Arg Ala Thr Trp Ala Lys Asn3340 3345 3350

ate caa gca gca ata aat caa gtt aga tcc ctt ata ggc aat gaa 10200Ile Gln Ala Ala Ile Asn Gln Val Arg Ser Leu Ile Gly Asn Glu3355 3360 3365

gaa tac aca gat tac atg cca tcc atg aaa aga ttc aga aga gaa 10245Glu Tyr Thr Asp Tyr Met Pro Ser Met Lys Arg Phe Arg Arg Glu3370 3375 3380

gag gaa gaa gca gga gtt ctg tgg tag aaagcaaaac taacatgaaa 10292

Glu Glu Glu Ala Gly Val Leu Trp3385 3390

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ccccgtccaa ggacgttaaa agaagtcagg ccatcataaa tgccatagct tgagtaaact 10412

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agctgtacgc atggcgtagt ggactagcgg ttaggggaga cccctccctt acaaatcgca 10532

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gaggagaccc ccccgaaaca aaaaacagca tattgacgct gggaaagacc agagatcctg 10652

ctgtctcctc agcatcattc caggcacaga acgccagaaa atggaatggt gctgttgaat 10712

caacaggttc t 10723

<210> 2

<211> 3391

<212> PRT

<213> vírus da Dengue<400> 2

Met Asn Asn Gln Arg Lys Lys Ala Lys Asn Thr Pro Phe Asn Met Leu1 5 10 15

Lys Arg Glu Arg Asn Arg Val ser Thr Val Gln Gln Leu Thr Lys Arg20 25 30

Phe Ser Leu Gly Met Leu Gln Gly Arg Gly Pro Leu Lys Leu Phe Met35 40 45

Ala Leu Val Ala Phe Leu Arg Phe Leu Thr Ile Pro Pro Thr Ala Gly50 55 60

Ile Leu Lys Arg Trp Gly Thr Ile Lys Lys ser Lys Ala Ile Asn Val65 70 75 80

Leu Arg Gly Phe Arg Lys Glu Ile Gly Arg Met Leu Asn Ile Leu Asn85 90 95

Arg Arg Arg Arg ser Ala Gly Met Ile Ile Met Leu Ile Pro Thr Val100 105 110

Met Ala Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val115 120 125

Ser Arg Gln Glu Lys Gly Lys ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu vai Gly130 135 140

vai Asn Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu145 150 155 160

Asp Thr Ile Thr Tyr Lys Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu165 170 175

Asp Ile Asp cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly180 185 190

Thr cys Thr Thr Met Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg ser Val Ala195 200 205

Leu Val Pro His Val Arg Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp210 215 220

Met Ser ser Glu Gly Ala Trp Lys His Val Gln Arg Ile Glu Thr Trp225 230 235 240

lie Leu Arg His Pro Gly Phe Thr Met Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr245 250 255

Thr Ile Gly Thr Thr His Phe Gln Arg Ala Leu Ile Phe lie Leu Leu260

265

270

Thr Ala Val Thr Pro ser Met Thr Met Arg cys Ile Gly Met Ser Asn275 280 285

Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser Gly Gly ser Trp Val Asp Ile Val290 295 300

Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr305 310 315 320

Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu325 330 335

Arg Lys Tyr cys Ile Glu Ala Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser340 345 350

Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys355 360 365

Arg Phe vai cys Lys His Ser Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly370 375 380

cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly Ile vai Thr cys Ala Met Phe Arg385 390 395 400

cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys Val Val Gln Pro Glu Asn Leu Glu405 410 415

Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly420 425 430

Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser435 440 445

Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu450 455 460

Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln465 470 475 480

Met Glu Asn Lys Ala Trp Leu Val His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu485 490 495

Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala Asp Thr Gln Glu Ser Asn Trp Ile500 505 510

Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln515 520 525

Asp Val vai Val Leu Gly Ser Gln Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu530 535 540

Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr545 550 555 560

Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly565 570 575

Met ser Tyr ser Met Cys Thr Gly Lys Phe Lys Val Val Lys Glu Ile580 585 590

Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly595 600 605

Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys610 615 620

Arg His vai Leu Gly Arg Leu Ile Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu625 630 635 640

Lys Asp Ser Pro Val Asn lie Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser645 650 655

Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe660 665 670

Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly675 680 685

Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser690 695 700

Leu Gly Gly vai Phe Thr ser Ile Gly Lys Ala Leu His Gln Val Phe705 710 715 720

Gly Ala lie Tyr Gly Ala Ala Phe Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys725 730 735

Ile Leu Ile Gly Val Ile lie Thr Trp Ile Gly Met Asn Ser Arg ser740 745 750

Thr Ser Leu ser Val Thr Leu Val Leu Val Gly Ile Val Thr Leu Tyr755 760 765

Leu Gly Val Met Val Gln Ala Asp ser Gly Cys Val Val Ser Trp Lys770 775 780

Asn Lys Glu Leu Lys Cys Gly Ser Gly Ile Phe Ile Thr Asp Asn Val785 790 795 800

His Thr Trp Thr Glu Gln Tyr Lys Phe Gln Pro Glu Ser Pro ser Lys805 810 815

Leu Ala ser Ala Ile Gln Lys Ala His Glu Glu Asp lie Cys Gly Ile820 825 830

Arg ser Val Thr Arg Leu Glu Asn Leu Met Trp Lys Gln Ile Thr Pro835 840 845

Glu Leu Asn His lie Leu ser Glu Asn Glu Val Lys Leu Thr Ile Met850 855 860

Thr Gly Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Arg865 870 875 880

Pro Gln Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys Ala885 890 895

Lys Met Leu ser Thr Glu ser His Asn Gln Thr Phe Leu Ile Asp Gly900 905 910

Pro Glu Thr Ala Glu Cys Pro Asn Thr Asn Arg Ala Trp Asn ser Leu915 920 925

Glu Val Glu Asp Tyr Gly Phe Gly Val Phe Thr Thr Asn Ile Trp Leu930 935 940

Lys Leu Lys Glu Lys Gln Asp Val Phe Cys Asp ser Lys Leu Met Ser945 950 955 960

Ala Ala Ile Lys Asp Asn Arg Ala Val His Ala Asp Met Gly Tyr Trp965 970 975

Ile Glu ser Ala Leu Asn Asp Thr Trp Lys Ile Glu Lys Ala ser Phe980 985 990

Ile Glu vai Lys Asn Cys His Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp ser995 1000 1005

Asn Gly Val Leu Glu ser Glu Met lie Ile Pro Lys Asn Leu Ala1010 1015 1020

Gly Pro Val Ser Gln His Asn Tyr Arg Pro Gly Tyr His Thr Gln1025 1030 1035

Ile Thr Gly Pro Trp His Leu Gly Lys Leu Glu Met Asp Phe Asp1040 1045 1050

Phe Cys Asp Gly Thr Thr Val Val Val Thr Glu Asp Cys Gly Asn1055 1060 1065

Arg Gly Pro Ser Leu Arg Thr Thr Thr Ala Ser Gly Lys Leu Ile1070 1075 1080

Thr Glu Trp cys Cys Arg ser Cys Thr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr

1085 1090 1095

Arg Gly Glu Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg Pro Leu

1100 1105 1110

Lys Glu Lys Glu Glu Asn Leu Val Asn ser Leu Val Thr Ala Gly

1115 1120 1125

His Gly Gln vai Asp Asn Phe Ser Leu Gly Val Leu Gly Met Ala

1130 1135 1140

Leu Phe Leu Glu Glu Met Leu Arg Thr Arg Val Gly Thr Lys His

1145 1150 1155

Ala Ile Leu Leu Val Ala Val Ser Phe Val Thr Leu Ile Thr Gly

1160 1165 1170

Asn Met ser Phe Arg Asp Leu Gly Arg Val Met vai Met Val Gly

1175 1180 1185

Ala Thr Met Thr Asp Asp Ile Gly Met Gly Val Thr Tyr Leu Ala

1190 1195 1200

Leu Leu Ala Ala Phe Lys Val Arg Pro Thr Phe Ala Ala Gly Leu

1205 1210 1215

Leu Leu Arg Lys Leu Thr Ser Lys Glu Leu Met Met Thr Thr Ile

1220 1225 1230

Gly Ile Val Leu Leu Ser Gln Ser Thr lie Pro Glu Thr Ile Leu

1235 1240 1245

Glu Leu Thr Asp Ala Leu Ala Leu Gly Met Met vai Leu Lys Met

1250 1255 1260

vai Arg Asn Met Glu Lys Tyr Gln Leu Ala Val Thr Ile Met Ala

1265 1270 1275

Ile Leu cys Val Pro Asn Ala vai Ile Leu Gln Asn Ala Trp Lys

1280 1285 1290

Val Ser cys Thr Ile Leu Ala vai Val Ser Val Ser Pro Leu Phe

1295 1300 1305

Leu Thr Ser Ser Gln Gln Lys Thr Asp Trp Ile Pro Leu Ala Leu

1310 1315 1320

Thr lie Lys Gly Leu Asn Pro Thr Ala Ile Phe Leu Thr Thr Leu1325 1330 1335

Ser Arg Thr ser Lys Lys Arg ser Trp Pro Leu Asn Glu Ala Ile1340 1345 1350

Met Ala vai Gly Met Val ser Ile Leu Ala Ser ser Leu Leu Lys1355 1360 1365

Asn Asp Ile Pro Met Thr Gly Pro Leu Val Ala Gly Gly Leu Leu1370 1375 1380

Thr Val Cys Tyr Val Leu Thr Gly Arg Ser Ala Asp Leu Glu Leu1385 1390 1395

Glu Arg Ala Ala Asp Val Lys Trp Glu Asp Gln Ala Glu Ile Ser1400 1405 1410

Gly Ser ser Pro Ile Leu ser Ile Thr Ile ser Glu Asp Gly Ser1415 1420 1425

Met ser Ile Lys Asn Glu Glu Glu Glu Gln Thr Leu Thr lie Leu1430 1435 1440

Ile Arg Thr Gly Leu Leu Val lie Ser Gly Leu Phe Pro Val Ser1445 1450 1455

Ile Pro Ile Thr Ala Ala Ala Trp Tyr Leu Trp Glu Val Lys Lys1460 1465 1470

Gln Arg Ala. Gly vai Leu Trp Asp Val Pro Ser Pro Pro Pro Met1475 1480 1485

Gly Lys Ala Glu Leu Glu Asp Gly Ala Tyr Arg Ile Lys Gln Lys1490 1495 1500

Gly Ile Leu Gly Tyr Ser Gln Ile Gly Ala Gly Val Tyr Lys Glu1505 1510 1515

Gly Thr Phe His Thr Met Trp His Val Thr Arg Gly Ala Val Leu1520 1525 1530

Met His Lys Gly Lys Arg lie Glu Pro Thr Trp Ala Asp Val Lys1535 1540 1545

Lys Asp Leu Ile ser Tyr Gly Gly Gly Trp Lys Leu Glu Gly Glu1550 1555 1560

Trp Lys Glu Gly Glu Glu Val Gln Val Leu Ala Leu Glu Pro Gly1565 1570 1575

Lys Asn Pro Arg Ala Val Gln Thr Lys Pro Gly Leu Phe Lys Thr1580 1585 1590

Asn Ala Gly Thr lie Gly Ala vai ser Leu Asp Phe ser Pro Gly1595 1600 1605

Thr ser Gly ser Pro lie Ile Asp Lys Lys Gly Lys Val vai Gly1610 1615 1620

Leu Tyr Gly Asn Gly vai Val Thr Arg Ser Gly Ala Tyr Val Ser1625 1630 1635

Ala Ile Ala Gln Thr Glu Lys Ser Ile Glu Asp Asn Pro Glu lie1640 1645 1650

Glu Asp His Ile Phe Arg Lys Arg Arg Leu Thr Ile Met Asp Leu1655 1660 1665

His Pro Gly Ala Gly Lys Thr Lys Arg Tyr Leu Pro Ala Ile vai1670 1675 1680

Arg Glu Ala He Lys Arg Gly Leu Arg Thr Leu Ile Leu Ala Pro1685 1690 1695

Thr Arg vai vai Ala Ala Glu Met Glu Glu Ala Leu Arg Gly Leu1700 1705 1710

Pro lie Arg Tyr Gln Thr Pro Ala Ile Arg Ala Glu His Thr Gly1715 1720 1725

Arg Glu Ile vai Asp Leu Met cys His Ala Thr Phe Thr Met Arg1730 1735 1740

Leu Leu ser Pro vai Arg Val Pro Asn Tyr Asn Leu He Ile Met1745 1750 1755

Asp Glu Ala His Phe Thr Asp Pro Ala Ser Ile Ala Ala Arg Gly1760 1765 1770

Tvr Ile ser Thr Arg vai Glu Met Gly Glu Ala Ala Gly Ile Phey 1775 1780 1785

Met Thr Ala Thr Pro Pro Gly Ser Arg Asp Pro Phe Pro Gln Ser1790 1795 1800

Asn Ala Pro lie Ile Asp Glu Glu Arg Glu Ile Pro Glu Arg Ser1805 1810 1815

Trp Asn ser Gly His Glu Trp Val Thr Asp Phe Lys Gly Lys ThrK 1820 1825 1830

Val Trp Phe Val Pro Ser Ile Lys Ala Gly Asn Asp Ile Ala Ala18 B 5 1840 1845

Cys Leu Arg Lys Asn Gly Lys Lys Val Ile Gln Leu Ser Arg Lys1850 1855 1860

Thr Phe Asp ser Glu Tyr Val Lys Thr Arg Thr Asn Asp Trp Asp1865 1870 1875

Phe Val Val Thr Thr Asp lie Ser Glu Met Gly Ala Asn Phe Lys1880 1885 1890

Ala Glu Arg vai lie Asp Pro Arg Arg Cys Met Lys Pro Val Ile1895 1900 1905

Leu Thr Asp Gly Glu Glu Arg Val Ile Leu Ala Gly Pro Met Pro1910 1915 1920

Val Thr His ser ser Ala Ala Gln Arg Arg Gly Arg lie Gly Arg1925 1930 1935

Asn Pro Lys Asn Glu Asn Asp Gln Tyr Ile Tyr Met Gly Glu Pro1940 1945 1950

Leu Glu Asn Asp Glu Asp cys Ala His Trp Lys Glu Ala Lys Met1955 1960 1965

Leu Leu Asp Asn lie Asn Thr Pro Glu Gly Ile Ile Pro ser Met1970 1975 1980

Phe Glu Pro Glu Arg Glu Lys Val Asp Ala lie Asp Gly Glu Tyr1985 1990 1995

Arg Leu Arg Gly Glu Ala Arg Lys Thr Phe Val Asp Leu Met Arg2000 2005 2010

Arg Gly Asp Leu Pro vai Trp Leu Ala Tyr Arg Val Ala Ala Glu2015 2020 2025

Gly Ile Asn Tyr Ala Asp Arg Arg Trp Cys Phe Asp Gly Val Lys2030 2035 2040

Asn Asn Gln Ile Leu Glu Glu Asn Val Glu Val Glu Ile Trp Thr2045 2050 2055

Lys Glu Gly Glu Arg Lys Lys Leu Lys Pro Arg Trp Leu Asp Ala2060 2065 2070

Arg Ile Tyr Ser Asp Pro Leu Ala Leu Lys Glu Phe Lys Glu Phe2075 2080 2085

Ala Ala Gly Arg Lys Ser Leu Thr Leu Asn Leu Ile Thr Glu Met2090 2095 2100

Gly Ara Leu Pro Thr Phe Met Thr Gln Lys Ala Arg Asp Ala Leu

2105 2110 2115

ASD Asn Leu Ala Val Leu His Thr Ala Glu Ala Gly Gly Arg Ala

2120 2125 2130

Tyr Asn His Ala Leu ser Glu Leu Pro Glu Thr Leu Glu Thr Leu

2135 2140 2145

Leu Leu Leu Thr Leu Leu Ala Thr Val Thr Gly Gly lie Phe Leu

2150 2155 2160

Phe Leu Met Ser Ala Arg Gly lie Gly Lys Met Thr Leu Gly Met

2165 2170 2175

Cys Cys lie Ile Thr Ala ser Ile Leu Leu Trp Tyr Ala Gln Ile

2180 2185 2190

Gln Pro His Trp Ile Ala Ala Ser Ile Ile Leu Glu Phe Phe Leu

2195 2200 2205

Ile vai Leu Leu Ile Pro Glu Pro Glu Lys Gln Arg Thr Pro Gln

2210 2215 2220

Asp Asn Gln Leu Thr Tyr Val Val Ile Ala Ile Leu Thr Val Vál

2225 2230 2235

Ala Ala Thr Met Ala Asn Glu Met Gly Phe Leu Glu Lys Thr Lys

2240 2245 2250

Lys Asp Leu Gly Leu Gly ser Ile Ala Thr Gln Gln Pro Glu Ser

2255 2260 2265

Asn Ile Leu Asp Ile Asp Leu Arg Pro Ala Ser Ala Trp Thr Leu

2270 2275 2280

Tyr Ala Val Ala Thr Thr Phe Val Thr Pro Met Leu Arg His Ser

2285 2290 2295

Ile Glu Asn Ser Ser Val Asn Val Ser Leu Thr Ala lie Ala Asn

2300 2305 2310

Gln Ala Thr Val Leu Met Gly Leu Gly Lys Gly Trp Pro Leu Ser

2315 2320 2325

Lys Met Asp Ile Gly Val Pro Leu Leu Ala Ile Gly Cys Tyr ser

2330 2335 2340

Gln vai Asn Pro Ile Thr Leu Thr Ala Ala Leu Phe Leu Leu Val2345 2350 2355

Ala His Tyr Ala Ile lie Gly Pro Gly Leu Gln Ala Lys Ala Thr2360 2365 2370

Ara Glu Ala Gln Lys Arg Ala Ala Ala Gly Ile Met Lys Asn ProM 2375 2380 2385

Thr vai Asp Gly Ile Thr Val lie Asp Leu Asp Pro Ile Pro Tyr2390 2395 2400

Asd Pro Lys Phe Glu Lys Gln Leu Gly Gln vai Met Leu Leu vai2405 2410 2415

Leu Cys vai Thr Gln vai Leu Met Met Arg Thr Thr Trp Ala Leu2420 2425 2430

cvs Glu Ala Leu Thr Leu Ala Thr Gly Pro Ile Ser Thr Leu Trp2435 2440 2445

Glu Glv Asn Pro Gly Arg Phe Trp Asn Thr Thr Ile Ala Val ser2450 2455 2460

Met Ala Asn Ile Phe Arg Gly Ser Tyr Leu Ala Gly Ala Gly Leu2465 2470 2475

Leu Phe Ser Ile Met Lys Asn Thr Thr Asn Thr Arg Arg Gly Thr2480 2485 2490

Glv Asn Ile Gly Glu Thr Leu Gly Glu Lys Trp Lys ser Arg Leu2495 2500 2505

Asn Ala Leu Gly Lys ser Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Lys ser Gly2510 2515 2520

Xle Gln Glu Val Asp Arg Thr Leu Ala Lys Glu Gly Ile Lys Arg2525 2530 2535

Gly Glu Thr Asp His His Ala Val ser Arg Gly Ser Ala Lys Leuy 2540 2545 2550

Arq Trp Phe Val Glu Arg Asn Met vai Thr Pro Glu Gly Lys Val2555 2560 2565

vai Asp Leu Gly Cys Gly Arg Gly Gly Trp Ser Tyr Tyr Cys Gly2570 2575 2580

Gly Leu Lys Asn Val Arg Glu Val Lys Gly Leu Thr Lys Gly Gly2585 2590 2595

Pro Gly His Glu Glu Pro lie Pro Met Ser Thr Tyr Gly Trp Asn2600 2605 2610

Leu Val Arg Leu Gln Ser Gly Val Asp Val Phe Phe Ile Pro Pro2615 2620 2625

Glu Lys cys Asp Thr Leu Leu Cys Asp Ile Gly Glu ser Ser Pro2630 2635 2640

Asn Pro Thr vai Glu Ala Gly Arg Thr Leu Arg Val Leu Asn Leu2645 2650 2655

Val Glu Asn Trp Leu Asn Asn Asn Thr Gln Phe Cys Ile Lys Val2660 2665 2670

Leu Asn Pro Tyr Met Pro ser Val lie Glu Lys Met Glu Ala Leu2675 2680 2685

Gln Arg Lys Tyr Gly Gly Ala Leu Val Arg Asn Pro Leu Ser Arg2690 2695 2700

Asn Ser Thr His Glu Met Tyr Trp Val ser Asn Ala ser Gly Asn2705 2710 2715

Ile Val ser ser Val Asn Met lie ser Arg Met Leu Ile Asn Arg2720 2725 2730

Phe Thr Met Arg Tyr Lys Lys Ala Thr Tyr Glu Pro Asp Val Asp2735 2740 2745

Leu Gly ser Gly Thr Arg Asn lie Gly lie Glu ser Glu Ile Pro2750 2755 2760

Asn Leu Asp Ile Ile Gly Lys Arg Ile Glu Lys Ile Lys Gln Glu2765 2770 2775

His Glu Thr ser Trp His Tyr Asp Gln Asp His Pro Tyr Lys Thr2780 2785 2790

Trp Ala Tyr His Gly Ser Tyr Glu Thr Lys Gln Thr Gly Ser Ala2795 2800 2805

ser ser Met Val Asn Gly Val Val Arg Leu Leu Thr Lys Pro Trp2810 2815 2820

Asp Val Val Pro Met Val Thr Gln Met Ala Met Thr Asp Thr Thr2825 2830 2835

Pro Phe Gly Gln Gln Arg Val Phe Lys Glu Lys vai Asp Thr Arg2840 2845 2850

Thr Gln Glu Pro Lys Glu Gly Thr Lys Lys Leu Met Lys Ile Thr2855 2860 2865

Ala Glu Trp Leu Trp Lys Glu Leu Gly Lys Lys Lys Thr Pro Arg2870 2875 2880

Met Cys Thr Arg Glu Glu Phe Thr Arg Lys Val Arg ser Asn Ala2885 2890 2895

Ala Leu Gly Ala Ile Phe Thr Asp Glu Asn Lys Trp Lys ser Ala2900 2905 2910

Arg Glu Ala vai Glu Asp Ser Arg Phe Trp Glu Leu Val Asp Lys2915 2920 2925

Glu Arg Asn Leu His Leu Glu Gly Lys Cys Glu Thr Cys Val Tyr2930 2935 2940

Asn Met Met Gly Lys Arg Glu Lys Lys Leu Gly Glu Phe Gly Lys2945 2950 2955

Ala Lys Gly ser Arg Ala Ile Trp Tyr Met Trp Leu Gly Ala Arg2960 2965 2970

Phe Leu Glu Phe Glu Ala Leu Gly Phe Leu Asn Glu Asp His Trp2975 2980 2985

Phe ser Arg Glu Asn Ser Leu Ser Gly Val Glu Gly Glu Gly Leu2990 2995 3000

His Lys Leu Gly Tyr Ile Leu Arg Asp Val Ser Lys Lys Glu Gly3005 3010 3015

Gly Ala Met Tyr Ala Asp Asp Thr Ala Gly Trp Asp Thr Lys Ile3020 3025 3030

Thr Leu Glu Asp Leu Lys Asn Glu Glu Met Val Thr Asn His Met3035 3040 3045

Glu Gly Glu His Lys Lys Leu Ala Glu Ala Ile Phe Lys Leu Thr3050 3055 3060

Tyr Gln Asn Lys Val Val Arg Val Gln Arg Pro Thr Pro Arg Gly3065 3070 3075

Thr Val Met Asp Ile Ile Ser Arg Arg Asp Gln Arg Gly Ser Gly3080 3085 3090

Gln Val Gly Thr Tyr Gly Leu Asn Thr Phe Thr Asn Met Glu Ala3095 3100 3105

Gln Leu lie Arg Gln Met Glu Gly Glu Gly vai Phe Lys Ser lie3110 3115 3120

Gln His Leu Thr Ile Thr Glu Glu Ile Ala Val Gln Asn Trp Leu3125 3130 3135

Ala Arg Val Gly Arg Glu Arg Leu Ser Arg Met Ala Ile ser Gly3140 3145 3150

Asp Asp cys vai Val Lys Pro Leu Asp Asp Arg Phe Ala Ser Ala3155 3160 3165

Leu Thr Ala Leu Asn Asp Met Gly Lys Ile Arg Lys Asp Ile Gln3170 3175 3180

Gln Trp Glu Pro Ser Arg Gly Trp Asn Asp Trp Thr Gln Val Pro3185 3190 3195

Phe cys ser His His Phe His Glu Leu Ile Met Lys Asp Gly Arg3200 3205 3210

Val Leu Val Val Pro cys Arg Asn Gln Asp Glu Leu Ile Gly Arg3215 3220 3225

Ala Arg Ile ser Gln Gly Ala Gly Trp Ser Leu Arg Glu Thr Ala3230 3235 3240

cys Leu Gly Lys ser Tyr Ala Gln Met Trp ser Leu Met Tyr Phe3245 3250 3255

His Arg Arg Asp Leu Arg Leu Ala Ala Asn Ala Ile Cys Ser Ala3260 3265 3270

Val Pro Ser His Trp Val Pro Thr Ser Arg Thr Thr Trp Ser Ile3275 3280 3285

His Ala Lys His Glu Trp Met Thr Thr Glu Asp Met Leu Thr Val3290 3295 3300

Trp Asn Arg Val Trp Ile Gln Glu Asn Pro Trp Met Glu Asp Lys3305 3310 3315

Thr Pro Val Glu Thr Trp Glu Glu Ile Pro Tyr Leu Gly Lys Arg3320 3325 3330

Glu Asp Gln Trp cys Gly Ser Leu Ile Gly Leu Thr Ser Arg Ala3335 3340 3345

Thr Trp Ala Lys Asn Ile Gln Ala Ala Ile Asn Gln Val Arg Ser3350 3355 3360

Leu Ile Gly Asn Glu Glu Tyr Thr Asp Tyr Met Pro Ser Met Lys3365 3370 3375

Arq Phe Arg Arg Glu Glu Glu Glu Ala Gly Val Leu Trp3380 3385 3390

<210> 3<211> 10723<212> DNA

<213> vírus da Dengue<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(10723)

<223> Wild-type DEN2 strain 16681

agttgttagt ctacgtggac cgacaaagac agattctttg agggagctaa gctcaacgta 60gttctaacag ttttttaatt agagagcaga tctctgatga ataaccaacg gaaaaaggcg 120aaaaacacgc ctttcaatat gctgaaacgc gagagaaacc gcgtgtcgac tgtgcaacag 180ctgacaaaga gattctcact tggaatgctg cagggacgag gaccattaaa actgttcatg 240gccctggtgg cgttccttcg tttcctaaca atcccaccaa cagcagggat attgaagaga 300tggggaacaa ttaaaaaatc aaaagctatt aatgttttga gagggttcag gaaagagatt 360ggaaggatgc tgaacatctt gaataggaga cgcagatctg caggcatgat cattatgctg 420attccaacag tgatggcgtt ccatttaacc acacgtaacg gagaaccaca catgatcgtc 480agcagacaag agaaagggaa aagtcttctg tttaaaacag aggatggcgt gaacatgtgt 540accctcatgg ccatggacct tggtgaattg tgtgaagaca caatcacgta caagtgtccccttctcaggc agaatgagcc agaagacata gactgttggt gcaactctac gtccacgtgggtaacttatg ggacgtgtac caccatggga gaacatagaa gagaaaaaag atcagtggca 720ctcgttccac atgtgggaat gggactggag acacgaactg aaacatggat gtcatcagaa 780ggggcctgga aacatgtcca gagaattgaa acttggatct tgagacatcc aggcttcaccatgatggcag caatcctggc atacaccata ggaacgacac atttccaaag agccctgattttcatcttac tgacagctgt cactccttca atgacaatgc gttgcatagg aatgtcaaatagagactttg tggaaggggt ttcaggagga agctgggttg acatagtctt agaacatgga 1020agctgtgtga cgacgatggc aaaaaacaaa ccaacattgg attttgaact gataaaaaca 1080gaagccaaac agcctgccac cctaaggaag tactgtatag aggcaaagct aaccaacaca 1140acaacagaat ctcgctgccc aacacaaggg gaacccagcc taaatgaaga gcaggacaaa 1200aggttcgtct gcaaacactc catggtagac agaggatggg gaaatggatg tggactattt 1260ggaaagggag gcattgtgac ctgtgctatg ttcagatgca aaaagaacat ggaaggaaaa 1320gttgtgcaac cagaaaactt ggaatacacc attgtgataa cacctcactc aggggaagag 1380catgcagtcg gaaatgacac aggaaaacat ggcaaggaaa tcaaaataac accacagagt 1440tccatcacag aagcagaatt gacaggttat ggcactgtca caatggagtg ctctccaaga 1500

600660

840900960acgggcctcg acttcaatga gatggtgttg ctgcagatgg aaaataaagc ttggctggtg 1560cacaggcaat ggttcctaga cctgccgtta ccatggttgc ccggagcgga cacacaaggg 1620tcaaattgga tacagaaaga gacattggtc actttcaaaa atccccatgc gaagaaacag 1680gatgttgttg ttttaggatc ccaagaaggg gccatgcaca cagcacttac aggggccaca 1740gaaatccaaa tgtcatcagg aaacttactc ttcacaggac atctcaagtg caggctgaga 1800atggacaagc tacagctcaa aggaatgtca tactctatgt gcacaggaaa gtttaaagtt 1860gtgaaggaaa tagcagaaac acaacatgga acaatagtta tcagagtgca atatgaaggg 1920gacggctctc catgcaagat cccttttgag ataatggatt tggaaaaaag acatgtctta 1980ggtcgcctga ttacagtcaa cccaattgtg acagaaaaag atagcccagt caacatagaa 2040gcagaacctc cattcggaga cagctacatc atcataggag tagagccggg acaactgaag 2100ctcaactggt ttaagaaagg aagttctatc ggccaaatgt ttgagacaac aatgaggggg 2160gcgaagagaa tggccatttt aggtgacaca gcctgggatt ttggatcctt gggaggagtg 2220tttacatcta taggaaaggc tctccaccaa gtctttggag caatctatgg agctgccttc 2280agtggggttt catggactat gaaaatcctc ataggagtca ttatcacatg gataggaatg 2340aattcacgca gcacctcact gtctgtgaca ctagtattgg tgggaattgt gacactgtat 2400ttgggagtca tggtgcaggc cgatagtggt tgcgttgtga gctggaaaaa caaagaactg 2460aaatgtggca gtgggatttt catcacagac aacgtgcaca catggacaga acaatacaag 2520ttccaaccag aatccccttc aaaactagct tcagctatcc agaaagccca tgaagagggc 2580atttgtggaa tccgctcagt aacaagactg gagaatctga tgtggaaaca aataacacca 2640gaattgaatc acattctatc agaaaatgag gtgaagttaa ctattatgac aggagacatc 2700aaaggaatca tgcaggcagg aaaacgatct ctgcggcctc agcccactga gctgaagtat 2760tcatggaaaa catggggcaa agcaaaaatg ctctctacag agtctcataa ccagaccttt 2820ctcattgatg gccccgaaac agcagaatgc cccaacacaa atagagcttg gaattcgttg 2880gaagttgaag actatggctt tggagtattc accaccaata tatggctaaa attgaaagaa 2940aaacaggatg tattctgcga ctcaaaactc atgtcagcgg ccataaaaga caacagagcc 3000gtccatgccg atatgggtta ttggatagaa agtgcactca atgacacatg gaagatagag 3060aaagcctctt tcattgaagt taaaaactgc cactggccaa aatcacacac cctctggagc 3120aatggagtgc tagaaagtga gatgataatt ccaaagaatc tcgctggacc agtgtctcaa 3180cacaactata gaccaggcta ccatacacaa ataacaggac catggcatct aggtaagctt 3240gagatggact ttgatttctg tgatggaaca acagtggtag tgactgagga ctgcggaaat 3300agaggaccct ctttgagaac aaccactgcc tctggaaaac tcataacaga atggtgctgc 3360cgatcttgca cattaccacc gctaagatac agaggtgagg atgggtgctg gtacgggatg 3420gaaatcagac cattgaagga gaaagaagag aatttggtca actccttggt cacagctgga 3480catgggcagg tcgacaactt ttcactagga gtcttgggaa tggcattgtt cctggaggaa 3540atgcttagga cccgagtagg aacgaaacat gcaatactac tagttgcagt ttcttttgtg 3600acattgatca cagggaacat gtcctttaga gacctgggaa gagtgatggt tatggtaggc 3660gccactatga cggatgacat aggtatgggc gtgacttatc ttgccctact agcagccttc 3720aaagtcagac caacttttgc agctggacta ctcttgagaa agctgacctc caaggaattg 3780atgatgacta ctataggaat tgtactcctc tcccagagca ccataccaga gaccattctt 3840gagttgactg atgcgttagc cttaggcatg atggtcctca aaatggtgag aaatatggaa 3900aagtatcaat tggcagtgac tatcatggct atcttgtgcg teccaaacgc agtgatatta 3960caaaacgcat ggaaagtgag ttgcacaata ttggcagtgg tgtccgtttc cccactgctc 4020ttaacatcct cacagcaaaa aacagattgg ataccattag cattgacgát caaaggtctc 4080aatccaacag ctatttttct aacaaccctc tcaagaacca gcaagaaaag gagctggcca 4140ttaaatgagg ctatcatggc agtcgggatg gtgagcattt tagccagttc tctcctaaaa 4200aatgatattc ccatgacagg accattagtg gctggagggc tcctcactgt gtgctacgtg 4260ctcactggac gatcggccga tttggaactg gagagagcag ccgatgtcaa atgggaagac 4320caggcagaga tatcaggaag cagtccaatc ctgtcaataa caatatcaga agatggtagc 4380atgtcgataa aaaatgaaga ggaagaacaa acactgacca tactcattag aacaggattg 4440ctggtgatct caggactttt tcctgtatca ataccaatca cggcagcagc atggtacctg 4500tgggaagtga agaaacaacg ggccggagta ttgtgggatg ttccttcacc cccacccatg 4560ggaaaggctg aactggaaga tggagcctat agaattaagc aaaaagggat tcttggatat 4620tcccagatcg gagccggagt ttacaaagaa ggaacattcc atacaatgtg gcatgtcaca 4680cgtggcgctg ttctaatgca taaaggaaag aggattgaac catcatgggc ggacgtcaag 4740aaagacctaa tatcatatgg aggaggctgg aagttagaag gagaatggaa ggaaggagaa 4800gaagtccagg tattggcact ggagcctgga aaaaatccaa gagccgtcca aacgaaacct 4860ggtcttttca aaaccaacgc cggaacaata ggtgctgtat ctctggactt ttctcctgga 4920acgtcaggat ctccaattat cgacaaaaaa ggaaaagttg tgggtcttta tggtaatggt 4980gttgttacaa ggagtggagc atatgtgagt gctatagccc agactgaaaa aagcattgaa 5040gacaacccag agatcgaaga tgacattttc cgaaagagaa gactgaccat catggacctc 5100cacccaggag cgggaaagac gaagagatac cttccggcca tagtcagaga agctataaaa 5160cggggtttga gaacattaat cttggccccc actagagttg tggcagctga aatggaggaa 5220gcccttagag gacttccaat aagataccag accccagcca tcagagctga gcacaccggg 5280cgggagattg tggacctaat gtgtcatgcc acatttacca tgaggctgct atcaccagtt 5340agagtgccaa actacaacct gattatcatg gacgaagccc atttcacaga cccagcaagt 5400atagcagcta gaggatacat ctcaactcga gtggagatgg gtgaggcagc tgggattttt 5460atgacagcca ctcccccggg aagcagagac ccatttcctc agagcaatgc accaatcata 5520gatgaagaaa gagaaatccc tgaacgttcg tggaattccg gacatgaatg ggtcacggat 5580tttaaaggga agactgtttg gttcgttcca agtataaaag caggaaatga tatagcagct 5640

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66006660

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<400> 10

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<400> 11

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<210> 22

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<210> 26

<211> 39

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<213> Seqüência Artificial<220>

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gatcagaaag 3000tggcagatag 3060acattgtgga 3120cctttttcac 3180ttaggcaaat 3240gattgtgacc 3300caatggtgct 3360tggtatggga 3420gtaacggccg 3480tttgtggaag 3540atcactcttt 3600atcatgttgg 3660gcagtgttca 3720agagagacag 3780gaccttatgg 3840cattttgaca 3900atgccattgg 3960cctttgtgca 4020atcctaggag 4080agatcttggc 4140gctcttttaa 4200gcggcttacg 4260cagtgggatg 4320gaagatggct 4380aaactggcac 4440ttatggtaca 4500cccgctgcca 4560ttatttggga 4620tggcatgtaa 4680gctgacgtca 4740gacaaagaag 4800caaacgaaac 4860ttcaaacccg 4920tatggaaatg 4980gagtagttac caaatcaggt gattacgtcaagccagatta tgaagtggat gaggacattttacaccccgg agctggaaag acaaaaagaaaaaggaggct gcgaaccttg attttggctcaggccctacg tggactgcca atccgttatcgaagagagat tgtagacctc atgtgtcatgccagagttcc aaattacaac ctcatagtgagtgtcgcggc tagaggatac atctcgaccatcatgaccgc aacccctccc ggagcgacagaagacatcga gagggaaatt ccggaaaggtactaccaagg gaaaactgtg tggtttgttcattgtttgag aaagtcggga aagaaagttaagtatccaaa aacgaaactc acggactgggtgggggccaa ttttagagct gggagagtgatcctaacaga tgggccagag agagtcatttgcgctgctca gagaagaggg cgaataggaattttctccgg agacccacta aaaaatgatgtgctgcttga caatatctac accccagaaggggaaaaaac ccaagccatt gatggagagtttgtggaatt aatgaggaga ggagaccttcctggcatttc ttacaaagat cgggaatggttagaagaaaa catggaggtt gaaatttggacaagatggtt agatgcacgt gtatacgctgttgctagtgg aaggaagagc ataactctcgcttacctttc ctctagggcc aagctcgcccaaagaggagg gagggcctac caacacgcccttatgcttgt agctttacta ggtgctatgaggaaaggaat agggaaattg tcaatgggtttctgggtagc agaaattcaa ccccagtggatcatggtact gttgataccg gaaccagaaatctacgtcat attgaccatt ctcaccattatgattgaaaa aacaaaaacg gattttgggttcgatgtgga cttgagacca gcttcagcattgactcccat gctgagacac accatagaaa

gtgccataac gcaagccgaa agaattggag 5040

ttcgaaagaa aagattaact ataatggact 5100

ttcttccatc aatagtgaga gaagccttaa 5160

ccacgagagt ggtggcggcc gagatggaag 5220

agaccccagc tgtgaaatca gaacacacag 5280

caaccttcac aacaagactt ttgtcatcaa 5340

tggatgaagc acatttcacc gatccttcta 5400

gggtggaaat gggagaggca gcagccatct 5460

atccctttcc ccagagcaac agcccaatag 5520

catggaacac agggttcgac tggataacag 5580

ccagcataaa agctggaaat gacattgcaa 5640

tccagttgag taggaaaacc tttgatacag 5700

attttgtggt cactacagac atatctgaaa 5760

tagaccctag gagatgcctc aagccagtta 5820

tagcaggtcc tattccagtg actccagcaa 5880

ggaacccagc acaagaagac gaccaatacg 5940

aagatcatgc ccactggaca gaagcaaaga 6000

ggatcattcc aacattgttt ggtccggaaa 6060

ttcgcctcag aggggaacaa aggaagactt 6120

cggtgtggct gagctataag gtagcttctg 6180

gcttcacagg ggaaaggaat aaccaaattt 6240

ctagagaggg agaaaagaaa aagctaaggc 6300

accccatggc tttgaaggat tttaaggagt 6360

acatcctaac agagattgcc agtttgccaa 6420

ttgataacat agtcatgctc cacacaacag 6480

tgaacgaact cccggagtca ctggaaacac 6540

cagcaggtat cttcctgttt ttcatgcaag 6600

tgataaccat tgcggtggct agtggcttgt 6660

tagcggcctc aatcatacta gagttttttc 6720

aacaaaggac cccacaagac aatcaattga 6780

ttggtctcat agcagccaac gagatggggc 6840

tttaccaggt aaaaacagaa accaccatcc 6900

ggacgctcta tgcagtagcc accacawttc 6960

acacgtcggc caacctatct ctagcagcca 7020ttgccaacca ggcggccgtc ctaatggggc ttggaaaagg atggccgctc cacagaatgg 7080

acctcggtgt gccgctgtta gcaatgggat gctattctca agtgaaccca acaactttga 7140

cagcatcctt agtcatgctt tcagtccatt atgcaataat aggtccagga ttgcaggcaa 7200

aagccacaag agaggcccag aaaaggacag ctgctgggat catgaaaaac cccacggtgg 7260

acgggataac agtaatagat ctagaaccaa tatcctatga cccaaaattt gaaaagcaat 7320

tagggcaggt catgctactc gtcttgtgtg ctggacaact actcttgatg agaacaacat 7380

gggctttctg tgaagtcttg actttggcca caggaccaat cttgaccttg tgggagggca 7440

acccgggaag gttttggaac acgaccatag ccgtatccac cgccaacatt ttcaggggaa 7500

gttacctggc gggagctgga ctggcttttt cactcataaa gaatgyacaa acccctagga 7560

ggggaactgg gaccacagga gagacactgg gagagaagtg gaagagacag ctaaactcat 7620

takacagaaa agagtttgaa gagtataaaa gaagtggaat actagaagtg gacaggactg 7680

aagccaagtc tgccctgaaa gatgggtcta aaatcaagca tgcagtatct agagggtcca 7740

gtaagattag atggattgtt gagagaggga tggtaaagcc aaaagggaaa gttgtagatc 7800

ttggctgtgg gagaggagga tggtcttatt acatggcgac gctcaagaac gtgactgaag 7860

tgaaagggta tacaaaagga ggtccaggac atgaagaacc gattcccatg gctacttatg 7920

gctggaattt ggtcaaactc cattcagggg ttgacgtgtt ctacaaaccc acagagcaag 7980

tggacaccct gctctgtgat attggggagt catcttctaa tccaacaata gaggaaggaa 8040

gaacattaag agttttgaag atggtggagc catggctctc ttcaaaacct gaattctgca 8100

tcaaagtcct taacccctac atgccaacag tcatagaaga gctggagaaa ctgcagagaa 8160

aacatggtgg gaaccttgtc agatgcccgc tgtccaggaa ctccacccat gagatgtatt 8220

gggtgtcagg agcgtcggga aacattgtga gctctgtgaa cacaacatca aagatgttgt 8280

tgaacaggtt cacaacaagg cataggaaac ccacttatga gaaggacgta gatcttgggg 8340

caggaacgag aagtgtctcc actgaaacag aaaaaccaga catgacaatt attgggagaa 8400

ggcttcagcg attgcaagag gagcacaaag aaacctggca ttatgatcag gaaaacccat 8460

acagaacctg ggcgtatcat ggaagctatg aagctccttc gacaggctct gcatcctcca 8520

tggtgaacgg ggtagtaaaa ctgctaacaa aaccttggga tgtggttcca atggtgaccc 8580

agttagccat gacagacaca accccttttg ggcaacaaag agtgttcaaa gagaaggtgg 8640

ataccagaac accacaacca aaacccggta cacgaatggt tatgaccacg acagccaatt 8700

ggctgtgggc cctccttggg aagaagaaaa atcccagact gtgcacaagg gaagagttca 8760

tctcaaaagt tagatcaaac gcagccatag gcgcagtctt tcaggaagaa cagggatgga 8820

catcagccag tgaagctgtg aatgacagcc ggttttggga actggttgac aaagaaaggg 8880

ccctacacca ggaagggaaa tgtgaatcgt gtgtctacaa catgatggga aaacgtgaga 8940

aaaagttagg agagtttggc agagccaagg gaagccgagc aatctggtac atgtggctgg 9000

gagcgcggtt tctggaattt gaagccctgg gttttttgaa tgaagatcac tggtttggca 9060gagaaaattc atggagtgga gtggaagggg aaggtctgca cagattggga tatatcctgg 9120aggagataga caagaaggat ggagacctaa tgtatgctga tgacacagca ggctgggaca 9180caagaatcac tgaggatgac cttcaaaatg aagaactgat cacggaacag atggcccccc 9240accacaagat cctagccaaa gccattttca aactaaccta tcaaaacaaa gtggtgaaag 9300tcctcagacc cacaccgaga ggagcggtga tggatatcat atccaggaaa gaccaaagag 9360gtagtggaca agttggaaca tatggtttga acacattcac caacatggaa gttcaactca 9420tccgccaaat ggaagctgaa ggagtcatca cacaagatga catgcagaac ccaaaagggt 9480tgaaagaaag agttgagaaa tggctgaaag agtgtggtgt cgacaggtta aagaggatgg 9540caatcagtgg agacgattgc gtggtgaagc ccctggatga gaggtttggc acttccctcc 9600tcttcttgaa cgacatggga aaggtgagga aagacattcc gcagtgggaa ccatctaagg 9660gatggaaaaa ctggcaagag gttccttttt gctcccacca ctttcacaag atcttcatga 9720aggatggccg ctcactagtt gttccatgta gaaaccagga tgaactgata gggagagcca 9780gaatctcgca gggggctgga tggagcttaa gagaaacagc ctgcctgggc aaagcttacg 9840cccagatgtg gtcgctcatg tacttccaca gaagggatct gcgtttagcc tccatggcca 9900tatgctcagc agttccaacg gaatggtttc caacaagcag aacaacatgg tcaatccacg 9960c-tcatcatca gtggatgacc actgaagata tgctcaaagt gtggaacaga gtgtggatag 10020aagacaaccc taatatgact gacaagactc cagtccattc gtgggaagat ataccttacc 10080tagggaaaag agaggatttg tggtgtggat ccctgattgg actttcttcc agagccacct 10140gggcgaagaa cattcacacg gccataaccc aggtcagaaa cctgatcgga aaagaggaat 10200acgtggatta catgccagta atgaaaagat acagcgctcc ttcagagagt gaaggagttc 10260tgtaattacc aacaacaaac accaaaggct attgaagtca ggccacttgt gccacggctt 10320gagcaaaccg tgctgcctgt agctccgcca ataatgggag gcgtgaaatc cctagggagg 10380ccatgcgcca cggaagctgt acgcgtggca tattggacta gcggttagag gagacccctc 10440ccatcactga caaaacgcag caaaaggggg cccgaagcca ggaggaagct gtactcctgg 10500tggaaggact agaggttaga ggagaccccc ccaacacaaa aacagcatat tgacgctggg 10560aaagaccaga gatcctgctg tctctgcaac atcaatccag gcacagagcg aagcaagatg 10620gattggtgtt gttgatccaa caggttct 10648

Claims (14)

1. CEPA DO VÍRUS DA DENGUE-2 VIVO ATENUADA,caracterizada pelo fato de que compreende a seqüência SEQ ID N0. 38, emque pelo menos os nucleotídeos nas posições 736, 1619, 4723, 5062, 9191,-10063, e 10507 estão mutados, com a condição de que os seguintesnucleotídeos não estão mutados: 57, 524, 2055, 2579, 4018, 5547, 6599, e 8571.

2. CEPA, de acordo com reivindicação 1, caracterizada pelofato de que pelo menos um nucleotídeo é adicionalmente mutado na posiçãoselecionada do grupo que consiste das posições 1638, 2520, 9222, e 10361.

3. CEPA, de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2,caracterizada pelo fato de que a SEQ ID N0. 38 compreende as mutações 736G>C, 1619 G>A, 1638 A>G, 2520 G>A, 4723 T>A, 5062 G>C, 9191 G>A, 9222A>G, 10063 T>A, e 10507 A>G.

4. CEPA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 3,caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma substituiçãode um ou mais nucleotídeos em determinada posição do códon que não resultaem alteração na codificação do aminoácido em tal posição.

5. CEPA, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4,caracterizada pelo fato de que compreende a SEQ ID N0.1.

6. COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, caracterizada pelo fato deque compreende uma cepa do vírus dengue-2 vivo atenuada, conformedescrita em uma das reivindicações 1 a 5, em um veículo farmaceuticamenteaceitável.

7. COMPOSIÇÃO DE VACINA, caracterizada pelo fato de quecompreende uma cepa do vírus dengue-2 vivo atenuada, conforme descritaem uma das reivindicações 1 a 5, em um veículo farmaceuticamente aceitável.

8. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que é uma composição de vacina monovalente.

9. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de que é uma composição de vacina multivalente paradengue.

10. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 9,caracterizada pelo fato de que compreende uma cepa do vírus da dengue-2vivo atenuada que compreende a seqüência SEQ ID N°.39.

11. COMPOSIÇÃO, de acordo com uma das reivindicações 7 a-10, caracterizada pelo fato de que contém de 10 a 105 CCID50 da cepa do vírusda dengue-2 vivo atenuada, conforme descrita em uma das reivindicações 1 a 4.

12. ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, caracterizado pelo fato deque compreende a seqüência de DNA SEQ ID N0 1 ou sua seqüência de RNAequivalente.

13. POLIPROTEÍNA ISOLADA CODIFICADAS PELA SEQ IDN°.1 OU FRAGMENTOS DESTA, caracterizada pelo fato de que compreendepelo menos uma arginina na posição 9 da proteína M, e/ou um ácido glutâmicona posição 228 da proteína E, e/ou uma treonina na posição 69 da proteínaNS3, e/ou uma histidina na posição 181 da proteína NS3, e/ou uma Iisina naposição 541 da proteína NS5, e/ou uma treonina na posição 832 da proteína NS5.

14. FRAGMENTO DA POLIPROTEÍNA, conforme descrita nareivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreendem a proteína M.e/ou proteína E, e/ou proteína NS3 e/ou proteína NS5.