BRPI0613332A2

BRPI0613332A2 - isoformes de fator estimulante de colÈnia granulocìtica humana

Info

Publication number: BRPI0613332A2
Application number: BRPI0613332-0A
Authority: BR
Inventors: Hyng Kon Koh
Original assignee: Cj Cheiljedang Corp
Priority date: 2005-06-13
Filing date: 2006-06-13
Publication date: 2011-01-04
Also published as: US20100143288A1; JP2008543304A; CN101198357A; EP1896081A4; WO2006135176A1; EP1896081A1; US8088899B2; KR100694994B1; KR20060129889A

Abstract

ISOFORMES DE FATOR ESTIMULANTE DE COLÈNIA GRANULOCìTICA HUMANA. A presente invenção refere-se a uma nova proteína fisiologicamente ativa, que é um isoforme de fator estimulante de colónia granulocítica humana, construída com o fim de aumentar o tempo de vida "in vivo" do fator estimulante de colónia granulocítica humana. O isoforme de fator estimulante de colónia granulocítica humana compreende um polipéptido e um polietilenoglicol (PEG) ligados de maneira a formar um polímero não protéico. Uma posição específica do polipéptido é selecionada de tal sorte que o polietileno pode ser ligado àquela posição sem afetar adversamente a atividade da proteína. O aminoácido da posição é modificado com cisteina e o polietilenoglicol é ligado à posição modificada. Um composto farmacêutico compreendendo os isoformes, os genes codificadores dos isoformes, e um primer destinado a modificar a sequência do aminoácido também são revelados.

Description

"ISOFORMES DE FATOR ESTIMULANTE DE COLÔNIA GRANULOCÍTICAHUMANA"

Campo técnico

A presente invenção refere-se a um novo isoforme de fator estimulante de colôniagranulocítica humana capaz de prolongar a vida "in vivo" do fator estimulante de colôniagranulocítica humana (rhG-CSF). Mais particularmente, a presente invenção refere-se a umisoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humana obtido a partir da ligaçãocovalente do polietilenoglicol como uma região não protéica para um isoforme de fatorestimulante de colônia granulocítica humana contendo cisteína adicionada ao N-terminal ouao C-terminal.

Histórico da arte

O fator estimulante de colônia granulocítica humana tem como principal funçãobiológica estimular leocócitos específicos, conhecidos como granulócitos neutrofílicos ouneutrófilos, para o seu crescimento e desenvolvimento "in vivo" (Welte et al., PNAS, 82,1526-1530, 1985: Souza et al Science, 232, 61-65, 1986). Tais granulócitos neutrofílicosfuncionam para proteger uma espécie biológica contra infecções por microorganismosquando despejados na corrente sangüínea.

A seqüência de aminoácidos do fator estimulante de colônia granulocítica humana foirelatada por Nagata et al. (Nature, 319, 415-418, 1986). O fator estimulante de colôniagranulocítica humana é uma proteína capaz de formar um complexo com um receptor a umataxa de 2:2 pela dimerização do receptor (Horan et al., Biochemistry, 35, 4886-96, 1996).

Aritomi et al. apresentaram o raio-X da estrutura de domínio BN-BC do fatorestimulante de colônia granulocítica humana com um receptor (Nature, 401, 713-717, 1999).Foi reportado por Aritomi et al. que os aminoácidos do fator estimulante de colôniagranulocítica humana existentes nas regiões de contato ou nas regiões adjacentes quando oreceptor se liga ao fator estimulante de colônia granulocítica humana, incluem G4, P5, A6,S7, S8, L9, PIO, Qll5 S12, L15, K16, E19, Q20, L108, D109, Dl 12, Tl 15, Tl 16, Ql 19,E122, E123 e L124.

Alguns isoformes de fator estimulante de colônia granulocítica humana obtidosatravés de técnicas de engenharia protéica foram revelados (USP5581476, USP5214132,USP5362853, USP4904584). Rudehall-Olsen et al., relatou que Lys48, Val48, Leu49 ePhel44, presentes na seqüência de aminoácidos do fator estimulante de colônia granulocíticahumana, participam na ligação com um receptor do fator estimulante de colônia granulocíticahumana. Além disso, Rayton et al., relatou que GIu46, Leu49 e Phe 144 estão em contatocom um domínio tipo imunoglobulina (domínio tipo Ig) do receptor do fator estimulante decolônia granulocítica humana, ao passo que Lys40 e Val49 encontram-se fora do domínio.Portanto, não se sabe com certeza se Lys40 e Val49 estão em contato com o receptor (J. Biol.Chem., 2001, 276, 36779-36787). Ademais, Rayton et al., demonstraram que o Glul9 dofator estimulante de colônia granulocítica humana interage com o Arg288 do receptor,servindo assim para transferir os sinais do fator estimulante de colônia granulocítica humana(J. Biol. Chem., 1999, 274, 17445-17451).

Tem-se sugerido a introdução adicional de pelo menos uma cadeia de açúcarartificialmente na proteína do fator estimulante de colônia granulocítica humana através deum método de engenharia genética (USP5218092). Esta introdução da cadeia de açúcar éefetuada através de um método de troca, removendo-se e adicionando-se aminoácidos naseqüência de aminoácidos de um polipéptido.

Adicionalmente, muitos estudos incluindo a ligação de polietileno ao fatorestimulante de colônia granulocítica humana foram relatados ÇSatake-Ishikawa et al., CellStructure and Function, 17, 157-160, 1992; USP5824778, USP5824784, W096/11953,W095/21629 e W094/20069).A remoção "in vivo" de um polipéptido ou de polímero é feita pela remoção (oulimpeza) e pela degradação de proteínas mediada por receptores nos rins, baço e fígado. Talremoção é obtida pela ação de uma protease específica a um substrato, ou não. Em geral, aremoção de proteínas "in vivo" depende do tamanho da proteína (um tamanho que permitaevitar a filtração glomerular ), carga da molécula de proteína, ligação da cadeia de açúcar,receptor da proteína na superfície da célula, e similares.

Particularmente a remoção de proteínas nos rins depende das propriedades físicas daproteína ou polímero, tais como tamanho (diâmetro molecular), simetria, forma/rigidez oucarga, ou similares.

A degradação mediada pelo receptor de uma proteína ocorre quando a proteína perdesua função ao ligar-se com um receptor. Num primeiro momento, os leucócitos sãoinsuficientes e a ligação com um receptor na superfície das células-tronco hematopoiéticasprimordiais resulta na diferenciação e crescimento em leucócitos. Entretanto, quando onúmero de leucócitos aumenta para um determinado nível, o fator estimulante de colôniagranulocítica humana é removido pelo receptor presente na superfície dos leucócitos a fim deprevenir diferenciação e crescimento excessivos causados pelo fator estimulante de colôniagranulocítica humana. A relação das células-tronco hematopoiéticas primordiais para o fatorestimulante de colônia granulocítica humana na superfície dos leucócitos é deaproximadamente 1:50.

A remoção de proteína causada pelo receptor presente na superfície de leucócitos éfeita pela introdução nas células de um polipéptido ligado a receptor, e pela degradaçãolisossomal de proteína na presença de proteases presentes em endossomas. A degradação deproteínas pela ligação de um receptor ao fator estimulante de colônia granulocítica humana édescrita em detalhes por Saker e Roufenburger (Mol. Pharmacol., 2003, 63, 147-158) e Saker(Nature biotech. 2002, 20, 908-913).A fim de aumentar a meia-vida de uma proteína no sangue, é necessário diminuir aremoção da proteína nos rins e a degradação da proteína pela ligação de um receptor. Epossível diminuir a remoção das proteínas nos rins e aumentar a meia-vida "in vivo" pelaligação de um polímero capaz de aumentar o tamanho molecular aparente para aproteína.

Além disso, a adesão de um polímero a uma proteína pode interromper proteases deforma efetiva, prevenindo assim funções de proteases não específicas.

Dentre tais polímeros, o polietilenoglicol (PEG) é um dos polímeros largamenteempregado no preparo de produtos terapêuticos à base de proteínas. As modificações desuperfície de uma molécula de proteína causada pela ligação de uma droga protéica a umpolímero sintético pode aumentar a solubilidade da droga em água ou solventes orgânicos.

Assim, é possível aumentar a biocompatibilidade da droga a fim de reduzir aimunoreatividade, melhorando a estabilidade "in vivo", e retardando sua passagem pelosistema intestinal, rins, baço e fígado. A passagem de pequenas moléculas de proteínas se dápela filtragem no sistema intestinal ou rins. Portanto, quando um PEG com grande pesomolecular é ligado a estas pequenas moléculas de proteínas, é possível deter a referidapassagem (Knauf, M. J. et al, J. Hiol Chem. 263:15064, 1988). A introdução de um PEGnuma droga protéica pode aumentar a estabilidade da molécula de proteína numa solução.

Adicionalmente, é possível prevenir a absorção de uma proteína não específica protegendo-seas características intrínsecas da superfície de uma proteína de forma efetiva. Nesse sentido,tem-se tentado aumentar a meia-vida "in vivo" de uma proteína a fim de aumentar asolvabilidade da proteína e reduzir sua imunoreatividade "in vivo" pela ligação de um PEG aum peptídeo biologicamente ativo, ou proteína. A patente USP 4,179,337 relatou osresultados destas tentativas pela primeira vez. Embora a ligação de um PEG a uma proteínareduza muitos efeitos colaterais graças às vantagens citadas, a proteína ligada ao PEGapresenta, de forma indesejável, uma significativa redução de atividade "in vivo" porque ossítios ativos da proteína são bloqueados pelo PEG.

O PEG, largamente utilizado até a presente data, adere à superfície da proteínaformando uma ligação covalente com pelo menos um resíduo de lisina livre. Se um sítiopresente na superfície da proteína e diretamente relacionado com a atividade da proteínaestiver ligado ao PEG, a atividade da proteína diminui. Ademais, uma vez que a ligação entreo PEG e os resíduos de lisina se dá aleatoriamente, vários tipos de proteínas conjugadasligadas a PEGs estarão presentes na forma de uma mistura, de tal sorte que a separação deuma conjugação de proteínas em estado puro se torna difícil. A patente EP 0401384 porexemplo, revela um material e um método destinados à produção de um PEG com a adiçãode fator estimulante de colônia granulocítica (G-CSF). A patente EP 0335423 revela umpolipéptido modificado com fator estimulante de colônia granulocítica humana. Todavia, deacordo com o estado da técnica, a molécula de PEG não pode ser ligada a um resíduoespecífico previsível, mas pode ser ligada a qualquer grupo reativo presente na proteína, taiscomo o resíduo de lisina ou o N-terminal, de maneira não específica, resultando na formaçãode um produto não homogêneo. A fim de ligar uma região específica da proteína com o PEG,a patente USP 5,766,897 e WO 00/42175 revela um método de ligação de hormônio decrescimento humano com um PEG, no qual permite-se que o PEG reaja seletivamente comcisteína utilizando PEG-maleimida para evitar que o PEG reaja com a região ativa dohormônio de crescimento humano. É necessário que um resíduo de cisteína livre que nãoparticipe em ligação de bissulfeto esteja presente no hormônio de crescimento humano parapermitir o uso do referido tipo de PEG. Entretanto, todos os quatro resíduos de cisteínapresentes no hormônio de crescimento humano participam na ligação de bissulfeto. Assimsendo, de acordo com o estado da técnica, a pegilação é feita com hormônio de crescimentohumano derivativo, no qual o resíduo de cisteína é introduzido artificialmente. Ademais, aspatentes USP 6,555,660 e USP 6,753,165, a patente publicada US 2005/0058621 e KR2002-0079778 revelam mutações de cisteína em várias posições na seqüência do aminoácido defator estimulante de colônia granulocítica humana.

Por outro lado, Bowen et al. demonstraram que o peso molecular do polietileno nopolietileno modificado do fator estimulante de colônia granulocítica humana está relacionadocom o tempo de vida da droga. Testes in vitro demonstraram que a eficácia de uma drogaprotéica apresenta relação inversa com o peso molecular do polietileno ligado à proteína.

Todavia, a atividade in vitro aumenta à medida que o peso molecular aumenta. Supõe-se queo polímero de uma proteína fisiologicamente ativa tenha baixa afinidade na degradaçãomediada por receptor, apresentando por isso uma meia-vida prolongada. Por isso, emboraestes polímeros de fator estimulante de colônia granulocítica humana tenham a capacidade derecuperar neutrófilos in vivo, eles apresentam menor atividade do que o fator estimulante decolônia granulocítica humana não polimerizado em termos de atividade in vitro.

Recentemente um fator estimulante de colônia granulocítica humana modificadoincluindo PEG 20kDa ligado ao N-terminal foi desenvolvido e comercializado (Neulasta). OPEG polimerizado de fator estimulante de colônia granulocítica humana apresenta uma meia-vida prolongada, o que permite reduzir a freqüência da administração.

São exemplos de fatores estimulantes de colônia granulocítica humanacomercialmente disponíveis a filgrastima derivada da E.coli (nome comercial: Gran eNeupogen), a lenograstima (nome comercial: Neutroginand Granocyte) produzida em célulasanimais, tais como células do Ovário de Hamster Chinês (CHO), e nartograstima deriva daE. coli (nome comercial: Neu-up), nas quais ocorrem mutações em regiões do N-terminal emcinco seqüências de aminoácidos a fim de aumentar a eficácia da proteína de fatorestimulante de colônia granulocítica humana.

ApresentaçãoProblema técnico

De acordo com o estado da técnica, isoformes de fator estimulante de colôniagranulocítica humana apresentam problemas na medida em que os aminoácidos comseqüências modificadas de isoformes de fator estimulante de colônia granulocítica humanaapresentam uma baixa atividade, ou insuficiente meia-vida in vivo, ou ainda produtos nãohomogêneos são gerados mediante a ligação do PEG do fator estimulante de colôniagranulocítica humana.

Solução técnica

Portanto, a presente invenção foi criada em vista dos problemas acima citados. E umobjetivo da presente invenção proporcionar um isoforme de fator estimulante de colôniagranulocítica humana com excelente atividade e com meia-vida significativamenteaumentada pela ligação do PEG ao aminoácido com seqüência modificada do fatorestimulante de colônia granulocítica humana, onde a seqüência do aminoácido é modificadapela substituição de, ou pela adição de cisteína num sítio específico para facilitar a ligação doPEG ao fator estimulante de colônia granulocítica humana, sendo então o sítio modificadoparcialmente ligado ao PEG. De acordo com o estado da técnica, isoformes de fatorestimulante de colônia granulocítica humana têm sido geralmente produzidos pelamodificação da seqüência no polipéptido e fazendo-se a pegilação na posição de umaminoácido apropriado num sítio específico a fim de aumentar a atividade in vivo ou o tempode vida. Entretanto, os criadores da presente invenção verificaram que um novo isoforme defator estimulante de colônia granulocítica humana com maior atividade in vivo ou tempo devida, comparado com os isoformes disponíveis no estado da técnica, pode ser obtidoadicionando-se aminoácidos aos dois terminais do polipéptido do fator estimulante de colôniagranulocítica humana e fazendo-se a pegilação nos mesmos sítios da adição. A presenteinvenção baseia-se nesta constatação.Um dos aspectos da presente invenção consiste em proporcionar um isoforme de fatorestimulante de colônia granulocítica humana com pelo menos um aminoácido adicionadoantes do Thr no N-terminal do fator estimulante de colônia granulocítica humanarepresentado pela Seqüência No. 1 ou depois do Pro no C-terminal, onde pelo menos um dosaminoácidos adicionados ao fator estimulante de colônia granulocítica humana é cisteína, epelo menos uma cisteína é ligada ao PEG.

É de conhecimento dos peritos na arte que o N-terminal na Seqüência No. 1 podeincluir Met. Nesse caso, a cisteína pode ser adicionada entre o Met e a treonina noN-terminal. O referido isoforme também encontra-se incluído no escopo da presenteinvenção.

Mais particularmente, aminoácidos 1-12 podem ser adicionados a cada terminal daseqüência. Preferivelmente, uma cisteína é adicionada. Mais preferivelmente, a cisteína é175C, adicionada ao C-terminal.

De acordo com uma configuração preferível da presente invenção, o PEG écovalentemente ligado à cisteína adicionada ao fator estimulante de colônia granulocíticahumana. Preferivelmente, o PEG tem peso molecular entre 20kDa e 40kDa. Maispreferivelmente, o PEG é ramificado.

De acordo com outra configuração preferível da presente invenção, pelo menos umaminoácido no fator estimulante de colônia granulocítica humana é substituído por outroaminoácido antes que o PEG seja ligado ao fator estimulante de colônia granulocíticahumana.

Outro aspecto da presente invenção consiste em proporcionar um compostofarmacêutico compreendendo o referido isoforme de fator estimulante de colôniagranulocítica humana, bem como proporcionar um catalisador farmaceuticamenteaceitável.Ainda outro aspecto da presente invenção consiste em proporcionar genescodificando uma proteína do referido isoforme de fator estimulante de colônia granulocíticahumana com cisteína adicionada ao N-terminal ou ao C-terminal.

Um outro aspecto da presente invenção consiste em proporcionar umoligodeoxinucleotídeo usado como primer para modificar a seqüência do aminoácido do fatorestimulante de colônia granulocítica humana no dito isoforme de fator estimulante de colôniagranulocítica humana. Preferivelmente, o primer é o oligodeoxinucleotídeo representado porqualquer uma das Seqüências de Nos. 2-7.

Efeitos vantajosos

O isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humana de acordo com ascaracterísticas da presente invenção apresenta uma atividade in vivo ou um tempo de vidasignificativamente aumentado, permitindo assim uma redução na freqüência daadministração.

Descrição dos desenhos

Os objetos a seguir apresentados, características e vantagens da presente invençãoficarão mais evidentes a partir da descrição detalhada que se segue, juntamente com asfiguras apresentadas onde;

A FIG. 1 ilustra a seqüência genética e a seqüência protéica do fator estimulante de colôniagranulocítica humana;

A FIG. 2 ilustra a seqüência do aminoácido de um isoforme de fator estimulante de colôniagranulocítica humana, aminoácido modificado no sítio do N-terminal;

A FIG. 3 ilustra a seqüência do aminoácido de um isoforme de fator estimulante de colôniagranulocítica humana, aminoácido modificado no sítio do C-terminal;

A FIG. 4 ilustra a seqüência do aminoácido de um isoforme de fator estimulante de colôniagranulocítica humana, aminoácido modificado na parte central do polipéptido;A FIG. 5 ilustra a estrutura de um vetor plasmídeo expressando um isoforme de fatorestimulante de colônia granulocítica humana; e

A FIG. 6 é um gráfico mostrando o tempo de vida in vivo de isoformes de fator estimulantede colônia granulocítica humana aplicados em ratos.

Melhor modo

Serão demonstradas agora em detalhes as configurações preferíveis da presenteinvenção.

A FIG. 1 ilustra a seqüência genética e a seqüência protéica do fator estimulante decolônia granulocítica humana. A seqüência de aminoácido No. 1 é igual à seqüência deaminoácido representada na FIG. 1, exceção feita ao Met na posição -1.

A FIG 2 ilustra a seqüência do aminoácido de um isoforme de fator estimulante decolônia granulocítica humana, aminoácido modificado no sítio do N-terminal. AA representaaminoácidos, e η é o número de aminoácidos. N é um indecomposto variando de 1 a 12. Osaminoácidos incluem pelo menos uma cisteína.

A FIG. 3 ilustra a seqüência do aminoácido de um isoforme de fator estimulante decolônia granulocítica humana, aminoácido modificado no sítio do C-terminal. AA representaaminoácidos, e η é o número de aminoácidos. N é um indecomposto variando de 1 a 12. Osaminoácidos incluem pelo menos uma cisteína.

A FIG. 4 ilustra a seqüência do aminoácido de um isoforme de fator estimulante decolônia granulocítica humana, aminoácido modificado na parte compreendendo a cadeia deaçúcar. Aqui, a 133-treonina é substituída por cisteína, e o polietilenoglicol (PEG) écovalentemente ligado à mesma cisteína. Este é um isoforme conhecido no estado da técnica(patente coreana publicada No. 2002-0079778).

A FIG. 5 ilustra a estrutura de um vetor plasmídeo expressando um isoforme de fatorestimulante de colônia granulocítica humana. Na função de promotor, utiliza-se o PR de umbacteriofage lambda. Para obter a expressão em E. coli, largamente usada em laboratórios, ovetor plasmídeo inclui genes cl 857 capazes de induzir a dita expressão no vetor plasmídeo.

A FIG. 6 é um gráfico mostrando o tempo de vida in vivo de isoformes de fatorestimulante de colônia granulocítica humana aplicados em ratos. Um catalisador PBS éutilizado como controle, e as amostras de teste incluem: T133C20kDa (Br) (isoforme G-CSFobtido pela substituição de 133-Thr por cisteína e PEG ramificado com 20kDacovalentemente ligado à mesma cisteína de acordo com a patente coreana publicada No.2002-0079778); Neulasta comercialmente disponível (Amgene Co.) com PEG 20kDa ligadoao N-terminal; N+20kDa (Br) (isoforme G-CSF obtido pela adição de cisteína entre atreonina e a metionina do N-terminal (—1C) do G-CSF, e PEG ramificado com 20kDacovalentemente à mesma cisteína); 175C20kDa (Br) (isoforme G-CSF obtido pela adição decisteína depois do 174-Pro do C-terminal do G-CSF e PEG ramificado com 20kDacovalentemente ligado à mesma cisteína); e 175C40kDa (Br) (isoforme G-CSF obtido pelaadição de cisteína depois do 174-Pro do C-terminal do G-CSF e PEG ramificado com 40kDacovalentemente ligado à mesma cisteína). Cada isoforme é diluído com PBS, e administradoem ratos através de veias da cauda numa dosagem de \00μg/ kg com base no peso do corpomedido no dia da administração. A administração é feita apenas uma vez no dia do teste.

Os criadores da presente invenção estudaram a estrutura da proteína do fatorestimulante de colônia granulocítica humana e o efeito de aminoácidos que formam o fatorestimulante de colônia granulocítica humana sobre a sua atividade. Tratamos da estrutura dofator estimulante de colônia granulocítica humana, da informação sobre o efeito deaminoácidos que formam o fator estimulante de colônia granulocítica humana sobre a suaatividade, e dos resultados da previsão na estrutura da proteína secundária GOR4 usada paradeterminar o efeito da modificação de aminoácidos sobre a estrutura da proteína (programaGOR na Previsão da Estrutura Secundária, http:us.expasy.org).Conforme utilizado neste relatório descritivo, o termo "isoformes de fator estimulantede colônia granulocítica humana" inclui análogos, variantes, mutantes, conjugações, esimilares, que mantém a atividade nativa do fator estimulante de colônia granulocíticahumana, ainda que eles sofram a modificação de um resíduo de aminoácido em outro resíduode aminoácido na seqüência original do aminoácido do fator estimulante de colôniagranulocítica humana.

Códigos mnemônicos de três letras ou de uma única letra para aminoácidos serão aquiutilizados conforme definido a seguir, de acordo com os padrões biológicos:

Ala (A): alanina; Asx (B): asparagina ou ácido aspártico; Cys (C): cisteína; Asp (D):ácido aspártico; Glu (E): ácido glutâmico; Phe (F): fenilalanina; Gly (G): glicina; His (H):histidina; Ile (I): isoleucina; Ls (K): lisina; Leu (L): leucina; Met (M): metionina; Asn (N):asparagina; Pro (P): prolina; Gln (Q): glutamina; Arg (R): arginina; Ser (S): serina; Thr (T):treonina; Val (V): valina; Trp (W): triptofano; Tyr (Y): tirosina; Glx (Z): glutamina ou ácidoglutâmico.

Conforme acima descrito, "(letra única para um aminoácido) (posição do aminoácido)(letra única para outro aminoácido)" significa que o aminoácido anterior na correspondenteposição do aminoácido é substituído pelo último aminoácido. Por exemplo, T133C significaque a treonina, o 133° aminoácido na seqüência do fator estimulante de colônia granulocíticahumana natural, é substituído por cisteína.

Assim, o primer usado para induzir a modificação de um aminoácido num sítioespecífico é representado pela expressão (letra única para um aminoácido) (posição doaminoácido) (letra única para outro aminoácido) 1 ou 2, onde o sufixo 1 representa o primerpara um molde de filamento único progredindo na direção de 5'—* 3' para um molde defilamento duplo, ao passo que o sufixo 2 representa o primer para um molde de filamentoúnico progredindo na direção de 3'—»· 5'.Os genes do fator estimulante de colônia granulocítica humana obtido através doprocesso acima descrito podem ser modificados na posição de pelo menos um códon.

Conforme aqui utilizado, o termo "modificação" refere-se à mudança na seqüência doaminoácido do fator estimulante de colônia granulocítica humana causada pela substituiçãoou adição de pelo menos um códon na codificação dos genes do fator estimulante de colôniagranulocítica humana. Mais especificamente, tal modificação inclui: adição de cisteína antesda treonina, o primeiro aminoácido na seqüência do aminoácido do fator estimulante decolônia granulocítica humana; adição de cisteína depois da prolina do C-terminal da mesmaseqüência de aminoácido; modificação da seqüência no meio da seqüência do polipéptido,além da modificação nos sítios terminais; ou similar.

Por exemplo, T133C significa a substituição da treonina, o 133° aminoácido naseqüência do fator estimulante de colônia granulocítica humana natural, por cisteína. Deacordo com uma configuração da presente invenção, um oligonucleotídeo sintético incluindoum códon que codifica a modificação de um aminoácido alvo no fator estimulante de colôniagranulocítica humana, é construído. Em geral, um oligonucleotídeo com um comprimentocorrespondente a cerca de 27-36 nucleotídeos é utilizado. Embora oligonucleotídeos maiscurtos possam ser usados, o oligonucleotídeo deve apresentar preferivelmente de 12-15nucleotídeos complementares ao molde nos dois lados do nucleotídeo que codifica amodificação. Tais oligonucleotídeos podem ser suficientemente hibridizados com o DNAmolde. Um oligonucleotídeo sintético usado na modificação do aminoácido, de acordo com apresente invenção, está demonstrado na Tabela 1 a seguir. O oligonucleotídeo pode serpreparado por método conhecido pelos peritos na arte.

De acordo com uma configuração preferível da presente invenção, o DNA doisoforme do fator estimulante de colônia granulocítica humana, cujo aminoácido foimodificado, é construído. Nesse caso, a reação em cadeia da polimerase (PCR) é executadacom o uso de DNA do fator estimulante de colônia granulocítica humana (Tabela 1) comoum molde e um oligonucleotídeo sintético codificando a modificação como um primer. Se omolde com duplo filamento for separado na etapa de aquecimento da PCR, um primercomplementar é hibridizado com cada molde de filamento único. O DNA polimerase permiteque os nucleotídeos complementares ao molde sejam ligados continuamente a partir degrupos -OH do primer que codifica a modificação na direção de 5'—► 3'. Como resultado, osegundo filamento inclui o primer que codifica a modificação, de tal sorte que os genesresultantes codificam a modificação alvo. O segundo filamento funciona como um DNAmolde durante repetidas etapas de replicação, de forma que os genes codificando amodificação podem ser amplificados continuamente.

A seguir, a modificação no meio da seqüência do polipéptido do fator estimulante decolônia granulocítica humana será detalhada com relação ao T133C tomado como exemplo.T133C refere-se à substituição de treonina, o 133° aminoácido na seqüência do fatorestimulante de colônia granulocítica humana natural, por cisteína. Para obter C133C,executa-se a PCR com o uso de DNA do fator estimulante de colônia granulocítica humananatural (FIG. 1) como um molde e introduz-se cada par de primers formados por N-terminaiscom C133C2 e T133C1 com C-terminais. Procedendo-se desta forma, dois fragmentos deDNA contendo um códon modificado correspondente a cisteína que substitui treonina, o 133°aminoácido, podem ser obtidos. A seguir, executa-se nova PCR introduzindo-se os doisfragmentos de DNA e utilizando-se pares de primers N-terminais e C-terminais. Destaforma, é possível obter genes modificados do isoforme T133C do fator estimulante decolônia granulocítica humana, onde a treonina é substituída por cisteína na 133a posição doaminoácido.

De acordo com outro exemplo da presente invenção, efetua-se a adição deaminoácido no N-terninal e no C-terminal. A construção de fator estimulante de colôniagranulocítica humana com pelo menos um aminoácido modificado pode ser feita noN-terminal e no C-terminal. Tal modificação inclui a seqüência de Met -(AA)n-Thr- noN-terminal (ver FIG. 2) e a seqüência de -Gln-Pro-(AA)n no C-terminal (ver FIG. 3).Neste caso AA representa qualquer aminoácido, podendo ser um aminoácido com baixo pesomolecular e desprovido de função específica, tal como a glicina, a serina ou a alanina. Pelomenos um AA inclui cisteína. O sufixo η representa o número de aminoácidos e varia de 1 a12. São necessários cerca de 12 aminoácidos para o reconhecimento in vivo do fatorestimulante de colônia granulocítica humana modificado ao qual os aminoácidos sãoadicionados, como uma proteína heterogênea seguida pela produção de um anticorpo. Poresse motivo o número máximo de aminoácidos é limitado a 12.

Conseqüentemente, a fim de construir genes de fator estimulante de colôniagranulocítica humana contendo aminoácidos adicionais, o N-terminal tem uma seqüência deaminoácidos de Met-(AA)n-Thr- e inclui a seqüência de DNA base ATG-(NNN)n-ACT-,enquanto o C-terminal tem a seqüência de aminoácido -GIn-Pro-(AA)n- e inclui aseqüência de DNA base -CAG-CCG-(NNN)n-TAA. Neste caso, NNN representa aseqüência de DNA base que codifica o aminoácido correspondente.

Em seguida, os genes de fator estimulante de colônia granulocítica humana contendopelo menos um aminoácido modificado são construídos com o uso de primer incluindo aseqüência de DNA base obtida conforme acima descrito e genes de fator estimulante decolônia granulocítica humana de acordo com a FIG. 1.

Por exemplo, se uma glicina e uma cisteína forem adicionadas ao N-terminal, aseqüência do aminoácido no N-terminal pode incluir a seqüência Met-(Gly-Cys-)Thr~. Oprimer aqui utilizado pode ser desenhado de forma a conter a seqüênciaGTAATAAATA-ATG-(GGT-TGT-)ACT- A Seguir, genes de fator estimulante decolônia granulocítica humana com a seqüência Met-(Gly-Cys-)Thr- pode ser construída apartir do primer acima, utilizando-se o molde dos genes de fator estimulante de colôniagranulocítica humana conforme indicado na FIG. 1 e o C-terminal conforme indicado naTabela 1.

Os genes de fator estimulante de colônia granulocítica humana obtidos da formaacima indicada são sujeitos à PCR utilizando-se primers N-terminal e C-terminal.

De acordo com outra configuração da presente invenção, é possível adicionar umaminoácido ao N-terminal ou ao C-terminal e substituir ao menos um aminoácidoposicionado no meio da seqüência do polipéptido do fator estimulante de colôniagranulocítica humana por outro aminoácido, antes que o polietileno seja a ele ligado. Porexemplo, -1C/T133C inclui a adição de cisteína ao N-terminal e a substituição da treonina, o133° aminoácido do polipéptido do fator estimulante de colônia granulocítica humana, porcisteína. Para obter -1C/T133C, executa-se a PCR utilizando-se DNA preformado comisoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humana -IC como molde eintroduzindo-se pares de primers N-terminal com T122C2 e C-terminal com T133C1. Destaforma, dois fragmentos de DNA contendo códon modificado correspondente a cisteína quesubstitui treonina, o 133° aminoácido, podem ser obtidos. A seguir, executa-se nova PCRintroduzindo-se os dois fragmentos de DNA e utilizando-se pares de primers N-terminal eC-terminal. Dessa forma, é possível obter genes modificados de isoforme de fatorestimulante de colônia granulocítica humana -1C/T133C, nos quais treonina é substituídapor cisteína na posição do 133° aminoácido, e cisteína é adicionada antes da treonina doN-terminal. A construção de isoformes numa posição outra que a 133 pode ser feita atravésdo uso de primer do DNA correspondente da mesma forma que o isoforme -1C/T133C.

A modificação de aminoácido no meio da seqüência do polipéptido do isoforme comaminoácido adicionado incluindo pelo menos uma cisteína no N-terminal ou no C-terminalpode ser feita num sítio conhecido pelos peritos na arte. Por exemplo, métodos para substituirpelo menos um aminoácido no meio da seqüência do polipéptido de fator estimulante decolônia granulocítica humana por outro aminoácido são revelados na publicação da patentecoreana No. 0248111 (N-terminal polietilenoglicol -ligado G-CSF ou análogos, epreparação), patentes coreanas publicadas Nos. 2002-0007297 (conjugados de G-CSF),2002-0079778 (conjugados de G-CSF) e 2004-0084884 (conjugados de G-CSF), patentesamericanas Nos. US 5214132 (derivativos polipéptidos de fator estimulante de colôniagranulocítica humana) e 5416195 (derivativos polipéptidos de fator estimulante de colôniagranulocítica humana), patentes americanas publicadas Nos. 2003-0158375 (conjugados epolipéptidos de G-CSF), 2004-0214287 e 2005-0058621. Mais particularmente, de acordocom as patente USP 5214132, USP 5416195 e US 2004-0214287, os aminoácidos dasposições 1, 3, 4, 5 e 17 do fator estimulante de colônia granulocítica humana são substituídospor Ala, Thr, Tyr, Arg e Ser, respectivamente, ou cisteína, sendo o aminoácido da posição17 substituído por alanina ou serina.

O conteúdo dos pedidos e patentes acima referidas foram aqui incorporadas comoreferência. Da mesma forma, métodos de produção de isoformes de fator estimulante decolônia granulocítica humana, métodos de pegilação, e similares, disponíveis no estado datécnica, estão aqui incorporados como referência.

A seqüência de DNA que codifica isoformes de fator estimulante de colôniagranulocítica humana de acordo com a presente invenção pode ser sintetizada através demétodo convencional bem conhecido pelos peritos na arte, como por exemplo, utilizando-seum sintetizador de DNA automático (oferecido pela Biosearch, Applied Biosystem™, etc.).

Outro aspecto da presente invenção consiste em proporcionar um vetor de expressãorecombinante incluindo a seqüência de DNA codificando isoforme de fator estimulante decolônia granulocítica humana e uma célula hospedeira transformada ou transfectada com odito vetor de expressão.Conforme aqui utilizado, o termo "polipéptido" pode ser intercambiado com ostermos "proteína" ou "proteína fisiologicamente ativa".

Conforme também aqui utilizado, o termo "isoforme" significa uma proteínafisiologicamente ativa com a mesma função primordial da proteína fisiologicamente ativa,porém modificada por meio de engenharia genética ou por outros meios. O termo"modificação" refere-se a substituição, adição ou perda numa seqüência de aminoácido,incluindo substituição por cisteína ou adição de cisteína para realizar a ligação compolietilenoglicol (PEG). Adicionalmente, tal modificação também inclui uma ligaçãocovalente formada entre cisteína e PEG por reação química.

Conforme aqui utilizado, o termo "tempo de vida in vivo" é definido da seguinteforma: uma proteína fisiologicamente ativa perde sua função quando administrada emhumanos ou animais porque a quantidade total de atividade da proteína fisiologicamenteativa diminui devido à remoção da protease mediada e da remoção nos rins. Portanto, o termo"tempo de vida in vivo" significa o tempo de retenção de uma proteína durante o qual aproteína pode executar sua função in vivo, e é representado pela meia-vida in vivo daproteína fisiologicamente ativa.

Conforme aqui utilizado, o termo "vetor" refere-se à molécula de DNA como umcatalisador capaz de inserir genes externos de maneira estável numa célula hospedeira. Paraque o vetor seja útil, é preciso que o dito vetor permita a replicação, para que tenha um meioatravés do qual ele possa ser introduzido na célula hospedeira, e para que ele tenha meios dedetectar a si mesmo. Além disso, o termo "vetor de expressão recombinante" refere-se a umamolécula cíclica de DNA formada por um vetor operativamente ligado a genes externos detal sorte que os ditos genes externos podem ser expressos na célula hospedeira.

Um vetor de DNA contendo fator estimulante de colônia granulocítica humana, podeser produzido como um vetor de expressão recombinante. Durante a construção de um vetorde expressão recombinante, a fim de aumentar o nível de expressão de genes transfectadosnuma célula hospedeira, os genes correspondentes devem ser ligados operativamente a umaseqüência reguladora de expressão de tradução e transcrição que funciona numa célulahospedeira selecionada, de forma bastante conhecida na arte. Preferivelmente, a seqüênciareguladora de expressão e os genes correspondentes estão incluídos num único vetor deexpressão que inclui ainda um marcador de seleção bacterial e uma origem dereplicação.

Um vetor apropriado incluindo não apenas os genes que codificam isoformes de fatorestimulante de colônia granulocítica humana mas também os elementos acima citados (i.e.seqüência reguladora), pode ser construído através da utilização de técnica básica de DNArecombinante. A fim de formar o vetor desejado, fragmentos de DNA individualmenteseparados devem ser ligados uns aos outros. Assim, cada fragmento de DNA é primeiramenteclivado utilizando-se enzimas de restrição, e depois os fragmentos de DNA são ligados unsaos outros em ordem e orientação específicas.

O DNA pode ser clivado com o uso de uma enzima de restrição específica num bufferapropriado. Em geral, cerca de 0,2~l/yg de um plasmídeo ou fragmento de DNA é usado emcerca de 20 μ£ de uma solução de buffer juntamente com cerca de 1-2 unidades da enzimade restrição correspondente. O buffer apropriado, a concentração de DNA, o tempo de reaçãoe a temperatura da reação serão determinados pelo produtor da enzima de restrição.

Geralmente, a reação é feita a 37° C por cerca de 1-2 horas. Entretanto, algumas enzimasrequerem uma temperatura mais alta. Após a reação, as enzimas e outras impurezas sãoretiradas extraindo-se a solução de digestão com uma mistura de fenol e clorofórmio. O DNApode ser precipitado com etanol para recupera-lo da camada aquosa. Nesse momento,terminais de fragmentos do DNA a serem ligados uns aos outros, devem ser compatíveisentre si a fim de ligar os ditos fragmentos de DNA, de tal sorte que um vetor funcional possaser formado.

Os fragmentos clivados de DNA são classificados e selecionados com base no seutamanho através de eletroforese. A eletroforese do DNA pode ser feita através de uma matrizde agarose ou poliacrilamida. A seleção da matriz depende do tamanho do DNA a serseparado. Após a eletroforese, o DNA é extraído da matriz por eletroeluição, ou é extraídodiretamente da matriz. Quando uma matriz de agarose de baixo derretimento é usada, aagarose deve ser derretida antes da extração do DNA.

Os fragmentos de DNA a serem ligados uns aos outros devem ser adicionados a umasolução numa quantidade equimolar. A solução contém ATP, buffer de ligase, e cerca de 10unidades de ligase, tal como ligaseT4 por 0,5//g de DNA. Para ligar os fragmentos de DNA aum vetor, o vetor deve ser primeiro clivado por uma enzima de restrição apropriada paraformar um vetor linear. O dito vetor linear pode ser usado depois de tratado com fosfatasealcalina ou hidrólise intestinal bovina. O referido tratamento com hidrólise previne a auto-ligação do vetor. O vetor de expressão recombinante construído da forma acima descrita éusado na transformação ou transfecção de uma célula hospedeira.

Polinucleotídeos podem ser introduzidos na célula hospedeira de acordo com métodosconhecidos e disponíveis em manuais de laboratório tais como [.Davis et al, Basic Methodsin Molecular Biology (1986)] e [Sambrook, J., et al. (1989) "Molecular Cloning" ALaboratory Manual, 2nd edition]. Métodos preferíveis para introduzir polinucleotídeos numacélula hospedeira incluem transformação de cloreto de cálcio, eletroporação, ou similares.

De acordo com a presente invenção, células hospedeiras são incubadas num meionutritivo adequado à produção de polipéptidos através de técnica conhecida na arte. Porexemplo, células hospedeiras podem ser incubadas em dispositivo de fermentação industrialou de laboratório utilizando-se frasco de incubação para agitar/fermentar em pequena ougrande escala com um meio apropriado e sob condições que permitam a expressão e/ou asecreção de polipéptidos. A incubação é feita num meio nutritivo adequado contendo umafonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e sais inorgânicos através de técnica conhecida naarte. O dito meio é normalmente bem conhecido pelos peritos na arte e comercialmentedisponível. Por outro lado, um meio preparado diretamente em laboratório também pode serutilizado. Se os polipéptidos forem diretamente secretados no meio nutritivo, os ditospolipéptidos podem ser igualmente separados diretamente do meio. Se os polipéptidos nãoforem secretados no meio nutritivo, não poderão ser separados do lisato celular.

A separação de polipéptidos pode ser feita de maneira convencional. Por exemplo,polipéptidos podem ser separados do meio através de método convencional de separação porcentrifugação, filtragem, extração, secagem por pulverização, evaporação ou precipitação.Além disso, a purificação de polipéptidos pode ser feita através de inúmeros métodos

conhecidos pelos peritos na arte, incluindo a cromatografia (cromatografia de troca iônica,cromatografia de afinidade, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de exclusão portamanho), eletroforese, separação de solubilidade fracional (precipitação com sulfato deamônia), SDS-PAGE ou extração.

Em seguida, o isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humanapurificado conforme acima descrito, é submetido a pegilação de forma já detalhadaanteriormente.

Segmentos não protéicos adequados usados na pegilação de acordo com a presenteinvenção incluem polietilenoglicol (PEG), sendo preferível o PEG ramificado. Outrosexemplos de tais segmentos não protéicos incluem, mas não se limitam a: pelo menos ummaterial selecionado dentre um grupo composto por polímeros solúveis em água tais como opolipropilenoglicol (PPG), polioxietileno (POE), politrimetilenoglicol, ácido polilático e seusderivados, ácido poliacrílico e seus derivados, poli (aminoácido), poli (vinilálcool),poliuretano, polifosfazeno, poli (L-lisina), óxido de polialquileno (PAO), polissacarídeo ousimilar, e polímeros não imunes tais como dextran, polivinilpirrolidona, polivinilálcool(PVA), poliacrilamido, ou similares. O polímero biocompatível usado na preparação dospolímeros derivativos de acordo com a presente invenção tem preferivelmente pesomolecular entre cerca de 2.000 -100.000, mais preferivelmente entre 20.000 ~ 40.000.

A fim de formar uma ligação entre o polímero biocompatível e o fator estimulante decolônia granulocítica humana (G-CSF) através do grupo thiol de G-CSF, o polímerobiocompatível deve ser ativado. Para esta finalidade, o polímero biocompatível pode serligado com um grupo funcional reativo. O termo "grupo polímero reativo" significa umgrupo ou um moiety capaz de ativar um polímero biocompatível de tal sorte que ele possaligado com um material biologicamente ativo. Para formar a ligação entre o polímerobiocompatível e o material biologicamente ativo, um dos grupos terminais do polímerobiocompatível é convertido em grupo funcional reativo. Este processo será aqui denominado"ativação". Por exemplo, para formar uma ligação entre poli (óxido de alquileno) e umaproteína biologicamente ativa, um dos grupos terminais hidroxil pode ser convertido emgrupo reativo, tal como o carbonato. Assim, o poli (óxido de alquileno) ativado pode serobtido.

O grupo reativo que pode ser usado para ativar um polímero com segmento nãoprotéico biocompatível de acordo com a presente invenção é selecionado de um grupocomposto por maleimida, acetamida, amido pentenóico, amido butenóico, isocianeto,isotiocianeto, cloreto cianúrico, 1-4 benzoquinona, bissulfeto, ou similares.

A ligação de polietilenoglicol (PEG) a uma proteína através de um grupo thiol daproteína pode ser feita utilizando-se método conhecido pelos peritos na arte.

Por exemplo, PEG-maleimida é utilizada para permitir que grupos thiol sejamligados com ligações duplas ativadas por reação de Michael [.Ishii et ai, Biophys J. 1986,50:75-80], Adicionalmente, como é de conhecimento geral dos que atuam no campo daQuímica de Proteínas, um reagente de PEG-iodoacetamida pode ser utilizado. Este últimométodo é vantajoso na medida em que um derivado estável de cisteína PEG-ligada, isto é,carboximetil-cisteína, pode ser obtido mediante uma hidrólise ácida forte, onde o derivadopode ser identificado e determinado por análise padrão de aminoácido [Gard FRN .Carboxymethylation, Method Enzymol 1972; B25: 424-49], Além dos métodos acima, ummétodo para produzir bissulfeto simétrico estável com o uso de PEG-bissulfeto orto-pirimidil[Woghiren et al., Bioconjugate Chem 1993, 50:75-80]; um método de reação e ativação doPEG, sulfosuccinimidilo 4-(N-metil-maleimida) cicloexano-l-carboxilato PEG-ativadocom grupo thiol de cisteína para formar uma ligação covalente [patente USP 5,166,322]; ummétodo de reação e ativação do PEG , maleimida—6~aminocapróico PEG-ativado 4000 comIL-2 mutante contendo uma cisteína substituinte num sítio específico para ser conjugado comum resíduo de cisteína [patente USP 5,206,344]; e um método para modificar grupos thiol deuma proteína utilizando-se ácido gama maleimida butírico e ácido beta maleimida propiônicolRich et al., J. Méd. Chem. 18, 1004, 1975], podem ser utilizados.

O método de pegilação apresentados nos exemplos a seguir descritos foram levados aefeito através da utilização de mPEG 20.000-maleimida, mPEG 20.000-maleimidaramificada e mPEG 40.000—maleimida ramificada disponibilizados por NOF na razão molar20:1 para fator estimulante de colônia granulocítica humana. A reação de pegilação é feitacom buffer fosfato 0,1 M (pH 7-8) em temperatura ambiente pelo período de 2 horas,mexendo-se.

Catalisadores farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizadores devem sernão tóxicos aos objetos e devem ser compatíveis com outros constituintes do preparadofarmacêutico sob a correspondente dosagem de administração e concentração. Por exemplo,o preparado farmacêutico não deve conter materiais sabidamente prejudiciais aospolipéptidos, tais como os oxidantes dentre outros.

Catalisadores apropriados incluem: buffers tais como o ácido fosfórico, ácido cítrico eoutros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo o ácido ascórbico; polipéptidos de baixopeso molecular; proteínas tais como albumina de plasma sangüíneo, gelatina e imunoglobina;polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, argininaou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carbohidratos incluindo glicose, manoseou dextrina; fatores chelates tais como EDTA; íons metais tais como o zinco, cobalto oucobre; álccois de açúcar tais como o manitol ou sorbitol; counterions formadores de sais taiscomo o sódio; e/ou surfactantes não iônicos tais como o Tween, o Pluronic oupolietilenoglicol (PEG).

Um isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humana com cadeia deligação sacarídea deve ser esterilizado antes de ser administrado para fins de tratamento. Areferida esterilização pode ser facilmente realizada através de filtragem por membranaesterilizada.

De maneira geral, um composto de isoforme terapêutico de fator estimulante decolônia granulocítica humana com cadeia de ligação sacarídea é armazenado num recipienteequipado com via de acesso esterilizada, como por exemplo uma bolsa para injeçãointravenosa ou ampola com septo através do qual uma agulha de injeção subcutânea possa serintroduzida.

O isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humana de acordo com apresente invenção pode ser administrado diretamente em animais através de vias apropriadas,inclusive por vias de administração parenteral, localmente ou sistematicamente. Uma via deadministração em particular, será determinada pelo histórico do paciente, levando-se emconta possíveis efeitos colaterais reconhecidos ou esperados mediante a administração doisoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humana. Vias de administraçãoparenteral específicas incluem as vias subcutânea, intramuscular, intravenosa, intraarterial eintraperitoneal. Mais preferivelmente, a administração deve ser efetuada por infusão contínua(mini-bomba) ou injeção, como por exemplo injeção intravenosa ou subcutânea. Uma via deadministração preferível do isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humana éa subcutânea.

O isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humana de acordo com apresente invenção pode ser administrado no paciente em quantidade terapeuticamente efetiva.

0 termo "quantidade terapeuticamente efetiva" refere-se a uma quantidade suficiente paraobter um efeito de tratamento desejado, utilizando-se um modo de administraçãodeterminado e uma condição determinada. O composto terapêutico de fator estimulante decolônia granulocítica humana deve ser formulado e administrado de acordo com uma práticamédica preferível, levando-se em conta a condição específica a ser tratada, as condiçõesclínicas do paciente (em especial, os efeitos colaterais mediante a administração isolada dofator estimulante de colônia granulocítica humana), sítios de fornecimento do isoforme defator estimulante de colônia granulocítica humana, modos de administração, periodicidade deadministração, além de outros fatores conhecidos pelos peritos na arte. A quantidadeterapeuticamente efetiva do isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humana édeterminada levando-se em consideração os fatores acima citados. De maneira geral, a dosediária do isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humana varia entre cerca de//g/kg a 100 //g/kg.

Referências detalhadas serão feitas agora com relação às configurações preferíveis dapresente invenção. É importante não perder de vista que os exemplos detalhados a seguirapresentam caráter meramente ilustrativo, não limitando o escopo da presenteinvenção.<Exemplo 1> Construção de Isoformes de Fator Estimulante de ColôniaGranulocítica Humana

Para construir isoformes de fator estimulante de colônia granulocítica humana natural,genes de fator estimulante de colônia granulocítica humana foram sintetizados como ummolde. Os genes sintetizados neste exemplo apresentam uma seqüência base conformedemonstrado na Tabela 1 abaixo, e a seqüência do DNA e a seqüência do aminoácido dofator estimulante de colônia granulocítica humana, usadas como molde, estão ilustradas na

FIG.l. Na Tabela 1, N-terminal -175C corresponde à seqüência Nos. 2-7, respectivamente.

[Tabela 1]

<table>table see original document page 27</column></row><table>

1. Construção de Isoforme -IC de Fator Estimulante de Colônia GranulocíticaHumana

A reação em cadeia da polimerase (PCR) foi executada para construir isoforme -ICcom o uso de DNA de fator estimulante de colônia granulocítica humana natural como ummolde, e pares de primers formados por primer -IC e primer C-terminal. O fragmento deDNA amplificado foi ainda submetido a PCR com o uso de primer N-terminal e primerC-terminal, de tal sorte que os sítios de clivagem (Xba e BamH I) para a enzima de restriçãopuderam ser introduzidos, sendo então introduzidos num vetor de expressão. Dessa forma, foipossível obter genes de um isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humanacontendo cisteína adicionada antes da treonina do N-terminal.

A seqüência do aminoácido do N-terminal foi metionina-cisteína-treonina-prolina-leucina-glicina.

2. Construção de Isoforme T133C de Fator Estimulante de Colônia GranulocíticaHumana

O T133C foi construído a fim de fornecer um controle como um isoforme conhecidoou para promover modificação do aminoácido no meio da seqüência do polipéptido do fatorestimulante de colônia granulocítica humana. O T133C, contendo cisteína substituindotreonina, o 133° aminoácido do fator estimulante de colônia granulocítica humana natural, foiobtido pela PCR utilizando-se DNA do fator estimulante de colônia granulocítica humananatural como um molde, e pares de primers formados por primer N-terminal com T133C2 eT133C1 com primer C-terminal. Como resultado, foi possível obter dois fragmentos deDNA modificados com um códon correspondente a cisteína substituindo treonina, o 133°aminoácido. Os dois fragmentos de DNA foram ainda submetidos a PCR utilizando-se paresde primers formados por primer N-terminal e primer C-terminal para obter genesmodificados de T133C, um isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humanacontendo cisteína substituindo treonina na posição do 133° aminoácido. A introdução numvetor de expressão foi feita da mesma forma acima descrita para "Construção de Isoforme-IC de Fator Estimulante de Colônia Granulocítica Humana".

3. Construção de Isoforme -1C/T133C de Fator Estimulante de Colônia GranulocíticaHumana

O -1C/T133C foi construído a fim de promover a adição de aminoácido aoN-terminal e a modificação do aminoácido no meio da seqüência do polipéptido do fatorestimulante de colônia granulocítica humana. Para construir o -1C/T133C, treonina, o 133°aminoácido do isoforme do fator estimulante de colônia granulocítica humana preformado,foi substituída por cisteína.

Para isso, a PCR foi feita com o uso de DNA do isoforme -IC do fator estimulante decolônia granulocítica humana preformado como um molde, e pares de primers formados porprimer N-terminal com T133C2 e T133C1 com primer C-terminal.

Como resultado, foi possível obter dois fragmentos de DNA modificados com umcódon correspondente a cisteína substituindo treonina, o 133° aminoácido.

Os dois fragmentos de DNA foram ainda submetidos a reação em cadeia dapolimerase (PCR) com o uso de pares de primers formados por primer N-terminal eC-terminal para obter genes modificados de -1C/T133C, um isoforme de fator estimulantede colônia granulocítica humana contendo cisteína substituindo treonina na posição do 133°aminoácido.

A introdução num vetor de expressão foi feita da mesma forma acima descrita para"Construção de Isoforme -IC de Fator Estimulante de Colônia Granulocítica Humana".

4. Construção de Isoforme 175C de Fator Estimulante de Colônia GranulocíticaHumana

Para construir o 175C, a PCR foi feita utilizando-se DNA de fator estimulante decolônia granulocítica humana natural como um molde, e pares de primers formados porprimer N-terminal e primer 175C. O fragmento de DNA amplificado foi ainda submetido aPCR com o uso de primer N-terminal e primer C-terminal, de tal sorte que os sítios declivagem (Xba I e BanH I) para a enzima de restrição puderam ser introduzidos, sendo entãointroduzidos num vetor de expressão.

Dessa forma, foi possível obter genes de um isoforme de fator estimulante de colôniagranulocítica humana contendo cisteína adicionada ao N-terminal. A introdução num vetorde expressão foi feita da mesma forma acima descrita para "Construção de Isoforme — IC deFator Estimulante de Colônia Granulocítica Humana".

A seqüência do aminoácido do C-terminal foi alanina - glutamina - prolina -cisteína.

5. Construção de Isoforme 175C/T133C de Fator Estimulante de ColôniaGranulocítica Humana

Para construir o 175C/T133C, treonina, o 133° aminoácido do isoforme -IC do fatorestimulante de colônia granulocítica humana preformado, foi substituída por cisteína. Paraisso, a PCR foi feita com o uso de DNA do isoforme 175C do fator estimulante de colôniagranulocítica humana preformado como um molde, e pares de primers formados por primerN-terminal com T133C2 e T133C1 com primer C-terminal.

Os dois fragmentos de DNA foram ainda submetidos a PCR com o uso de pares deprimers formados por primer N-terminal e C-terminal para obter genes modificados de175C/T133C, um isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humana contendocisteína substituindo treonina na posição do 133° aminoácido.

A introdução num vetor de expressão foi feita da mesma forma acima descritapara "Construção de Isoforme -IC de Fator Estimulante de Colônia GranulocíticaHumana".

Os genes dos isoformes do fator estimulante de colônia granulocítica humanaconstruídos da forma acima descrita foram introduzidos num vetor de expressão a serexpresso por um promotor lambda PR.

Os elementos constitutivos do referido vetor de expressão são indicados abaixo naTabela 2.[Tabela 2]

<table>table see original document page 31</column></row><table>

<Exemplo 2> Expressão e Purificação de Isoformes de Fator Estimulante de ColôniaGranu locítica Humana

A transformação de plasmídeos vetores contendo genes de isoformes de fatorestimulante de colônia granulocítica humana em E. coli foi levada a efeito com a finalidadede construir "strains" produtores de proteínas de fator estimulante de colônia granulocíticahumana.

Para levar a efeito a dita transformação, aplicou-se o método que utiliza cloreto decálcio, que é bem conhecido pelos peritos na arte. Como célula hospedeira, foi usada a E. coilatualmente disponível (HB101, NM strain series, etc.).

A E.coil transformada foi inoculada em 5ml de meio Luria Broth (LB) num tubo de15ml, e foi incubada (cultura) de um dia para o outro numa incubadora a 30°C. A cultura decélulas-semente foi inoculada em 500ml de meio Luria Broth (LB) num frasco triangular de3.000ml, sendo incubada a 30°C. Quando a absorção a 600nm atingiu 0,8-1,2, a incubadorafoi aquecida até 42°C e as células forma incubadas por mais 4 horas para induzir a expressãodos isoformes de fator estimulante de colônia granulocítica humana.

Completada a cultura, a solução de cultura foi submetida a separação centrífuga paraa coleta das células, as quais foram lavadas com água destilada. As células lavadas foramUsadas em microfluidizador (disponibilizado pela Microfluidics Co.) sob 12.000 psi porquatro vezes, e corpos de inclusão foram recuperados por separação centrífuga, sendolavados por três vezes com água destilada.

Os corpos de inclusão foram cuidadosamente suspensos e dissolvidos em IOml deuréia 8M, glicina 50mM (pH 11,0) em temperatura ambiente por um período de pelo menos 5horas, e então a suspensão foi submetida a separação centrífuga a 10.000 rpm por 30minutos. Em seguida, o líquido supernatant foi coletado para se obter uma solução deproteína isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica humana. Foram adicionadosglicina e água destilada à solução de proteína para controlar a concentração de glicina e aconcentração de uréia em 50mM e 2M respectivamente. A solução de proteína resultante foititulada para pH 9,0 e submetida a refolding de proteína de um dia para o outro a umatemperatura de 4°C.

Completado o refolding de proteína, a solução foi ajustada para pH 4,0, diluída comágua destilada por três vezes ou mais, e carregada numa coluna com IOml de CM SefaroseFF (disponibilizada por Amersham Biosciences), que havia sido previamente equilibradacom HCl 2mM numa quantidade equivalente a pelo menos três vezes o volume da coluna.Completado o carregamento, a coluna foi equilibrada com HCl 2mM numa quantidadeequivalente a três vezes o volume da coluna, e lavada com buffer acetato de sódio 50mM(pH5,4) numa quantidade equivalente a pelo menos três vezes o volume da coluna. Então, osisoformes de fator estimulante de colônia granulocítica humana foram eluídos com bufferacetato de sódio 50mM (pH 5,4) contendo cloreto de sódio 35mM numa quantidadeequivalente a pelo menos doze vezes o volume da coluna, e divididos em frações de 5ml. Asfrações foram coletadas após a análise por HPLC.

Os isoformes de fator estimulante de colônia granulocítica humana purificados porCM Sefarose FF foram concentrados com o uso de uma unidade de filtro Centricon Plus-80com peso molecular de lO.OOODa a 3.000 rpm por 25 minutos para obter proteínaconcentrada contendo uma concentração final de cerca de 5mg/ml.

A proteína concentrada foi carregada numa coluna com 300ml de Sephacryl S-IOO(disponibilizado por Amersham Biosciences), que havia sido previamente equilibrado combuffer acetato de sódio IOmM (pH 5,4) numa quantidade equivalente a pelo menos três vezeso volume da coluna. A solução de buffer foi eluída na razão de 1 ml/min para remover osmultímeros dos isoformes de fator estimulante de colônia granulocítica humana contidos nasolução de proteína, e para separar monômeros purificados, os quais, por sua vez, foramusados na reação de adição de polietilenoglicol (PEG) subseqüente.

<Exemplo 3> Ligação de Polietilenoglicol (PEG) a Isoformes de Fator Estimulantede Colônia Granulocítica Humana

1. Preparação de isoforme mPEG (20.000) -maleimida-G-CSF ramificado

IOmg de cada um dos isoformes de fator estimulante de colônia granulocítica humanade acordo com o Exemplo 2 foram introduzidos em buffer fosfato 0,1 M (pH 7,0-8,0), e200mg de Mpeg (20.000)-maleimida ramificado (disponibilizado por NOF) foramadicionados. A reação foi levada a efeito em temperatura ambiente por 2 horas, mexendo-se.A mistura da reação foi resfriada reduzindo-se o pH para 3,0 com solução HCl IN.

2. Preparação de isoforme mPEG (40.000) -maleimida-G-CSF ramificado

IOmg de cada um dos isoformes de fator estimulante de colônia granulocítica humanade acordo com o Exemplo 2 foram introduzidos em buffer fosfato 0,1 M (pH 7,0-8,0), e400mg de Mpeg (40.000)-maleimida ramificado (disponibilizado por NOF) foramadicionados. A reação foi levada a efeito em temperatura ambiente por um período de 2horas, mexendo-se. A mistura da reação foi resfriada reduzindo-se o pH para 3,0 com soluçãoHCl IN.

<Exemplo 4> Purificação de Polímero de Isoforme de Fator Estimulante de ColôniaGranulocítica Humana com Polietilenoglicol (PEG)

O polímero PEG-G-CSF obtido no exemplo 4 foi purificado da seguinte maneira.

1. Cromatografia em CM Sepharose FF

Completada a reação, cada polímero mPEG-G-CSF foi titulado para pH 3,0, diluídocom água destilada pelo menos 10 vezes, e carregado numa coluna com IOml de CMSepharose FF (disponibilizado por Amersham Bioscience), que havia sido previamenteequilibrado com HCl 2mM numa quantidade equivalente a pelo menos três vezes o volumeda coluna. Depois de carregada, a coluna foi equilibrada com HCl 2mM numa quantidadeequivalente a pelo menos três vezes o volume da coluna, e lavada com buffer acetato desódio 50mM (pH 5,0) numa quantidade equivalente a pelo menos três vezes o voluma dacoluna. Nos casos do isoforme mPEG (20.000) -maleimida-G-CSF e do isoforme mPEG(20.000) -maleimida-G-CSF ramificado, os polímeros mPEG-G-CSF foram eluídos combuffer acetato de sódio 50mM (pH 5,4) contendo cloreto de sódio 40mM numa quantidadeequivalente a pelo menos doze vezes o volume da coluna. No caso do isoforme mPEG(40.000) -maleimida-G-CSF, o polímero mPEG-G-CSF foi eluído com buffer acetato desódio 5OmM (pH 5,4) contendo cloreto de sódio 20mM numa quantidade equivalente a pelomenos doze vezes o volume da coluna. A solução eluída foi dividida em frações de 5ml ecada fração foi coletada após a análise por HPLC.

2. Cromatografia de Permeação em Gel

Os polímeros mPEG-G-CSF purificados com CM Sepharose FF foram concentradoscom o uso de uma unidade de filtro Centricon Plus-80 com peso molecular de lO.OOODa a3.000 rpm por 25 minutos para obter proteína concentrada contendo uma concentração finalde cerca de 5mg/ml.

A proteína concentrada foi carregada numa coluna com 300ml de Sephacryl S-100(disponibilizado por Amersham Biosciences), que havia sido previamente equilibrado combuffer acetato de sódio IOmM (pH 5,4) numa quantidade equivalente a pelo menos três vezeso volume da coluna. A solução de buffer foi eluída na razão de 1 ml/min para remover ospolímeros mPEG-G-CSF contidos na solução de proteína. As proteínas foram eluídas emsérie, na seguinte ordem; multímero G-CSF, PEG-G-CSF, dímero G-CSF e manômeroG-CSF.

<Exemplo 5> Avaliação de Atividade e Tempo de Vida In Vivo de PolímerosmPEG-G-CSF em Ratos

Os polímeros mPEG-G-CSF preparados e purificados de acordo com os Exemplos 4e 5 foram avaliados para atividade e tempo de vida in vivo em ratos com 8 semanas de idade(ratos SD, machos, cinco ratos por amostragem de teste). As amostras de teste incluem: PBScomo catalisador; G-CSF T133C20kDa (Br) preparado e purificado de acordo com osexemplos 1 a 4 (o isoforme G-CSF obtido pela substituição de 133-Thr por cisteína e PEGramificado com 20kDa covalentemente ligado à mesma cisteína de acordo com a patentecoreana publicada No. 2002-0079778); Neulasta comercialmente disponível (Amgene Co.)com PEG 20kDa ligado ao N-terminal; e os isoformes de acordo com a presente invençãopreparados e purificados de acordo com os exemplos 1 a 4, ou seja, N+20kDa (Br) (isoformeG-CSF obtido pela adição de cisteína entre a treonina e a metionina do N-terminal (-1C) doG-CSF, e PEG ramificado com 20kDa covalentemente à mesma cisteína); 175C20kDa (Br)(isoforme G-CSF obtido pela adição de cisteína depois do 174-Pro do C-terminal doG-CSF e PEG ramificado com 20kDa covalentemente ligado à mesma cisteína); e175C40kDa (Br) (isoforme G-CSF obtido pela adição de cisteína depois do 174-Pro doC-terminal do G-CSF e PEG ramificado com 40kDa covalentemente ligado à mesmacisteína). Cada isoforme foi diluído, com PBS, e administrado em ratos através de veiasda cauda numa dosagem de 100pgl kg com base no peso do corpo medido no diada administração. A administração é feita apenas uma vez no dia doteste.

A fim de obter amostras analíticas, 200/^ de sangue foram coletados de veias dascaudas num tempo predeterminado, dependendo da constituição do grupo de teste. Nosintervalos, a amostragem de sangue foi feita antes da administração. A amostragem paraanálise PD/PK foi efetuada 7, 24, 48 e 72 horas após a administração. Neutrófilos foramcontados em cada amostra de sangue para determinar a atividade in vivo.

Adicionalmente, cada amostra de sangue foi introduzida num tubo de anticoagulanteEDTA e submetida a separação centrífuga para separar plasma sangüíneo. A concentração deG-CSF no plasma foi medida com o uso de kit G-CSF ELISA humano (Quantokine, R&DSystems). Cada amostra foi diluída em série para a zona linear, permitindo detectar aconcentração no kit. A medição foi feita duas vezes por amostra. Os resultados sãoapresentados na Tabela 3 a seguir.

Como é possível verificar na Tabela 3, os isoformes de fator estimulante de colôniagranulocítica humana ligados ao polietilenoglicol (PEG) contendo cisteína adicionada aoN-terminal ou C-terminal de acordo com a presente invenção, apresentam atividade in vivoe tempo de vida in vivo aumentados. Em particular, N+20kDa (Br) e 175C+20kDa (Br)apresentam um significativo aumento na atividade 24 horas após a administração,comparados com o controle. Adicionalmente, 175C+40kDa (Br) apresenta um aumento naatividade 24 horas após a administração, com aspecto similar na produção de neutrófilos, emcomparação com o controle. Entretanto, 175C+40kDa (Br) pode manter sua atividade até 72horas após a administração. Em particular, 175C+40kDa (Br) apresenta uma melhorasignificativa no tempo de vida, ao passo que 175+20kDa (Br) e N+20kDa (Br) apresentamuma melhora significativa na atividade.

[Tabela 3]

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[Aplicação Industrial]

Como pode ser observado, isoformes de fator estimulante de colônia granulocíticahumana de acordo com a presente invenção, proporcionam um aumento significativo notempo de vida in vivo, podendo ser utilizados para tratar e prevenir várias doençasrelacionadas ao fator estimulante de colônia granulocítica humana.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com base no que se consideraatualmente como sendo a configuração mais prática e preferível, a invenção não é limitadapela referida configuração e pelos desenhos apresentados. Ao contrário, é possívelcontemplar inúmeras modificações e variações dentro do espírito e do escopo dasreivindicações apensas.

Claims

1. - Um isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica, incluindo pelo menosum aminoácido adicionado antes do Thr do N-terminal ou depois do Pro do C-terminalem fator estimulante de colônia granulocítica humana representado pela seqüênciade aminoácidos No.l, onde pelo menos um dos aminoácidos adicionados é cisteína, e opolietilenoglicol é ligado a pelo menos uma das cisteínasadicionadas.

2. - O isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica de acordo com a reivindicação 1,onde 1-12 aminoácidos são adicionados a cada terminal de fator estimulante de colôniagranulocítica humana.

3. - O isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica de acordo com a reivindicação 1,onde um resíduo de cisteína é adicionado ao fator estimulante de colônia granulocíticahumana.

4. - O isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica de acordo com a reivindicação 3,onde o polietilenoglicol é um polietilenoglicol ramificado e apresenta um peso molecular de 20 kDa~40kDa.

5. - O isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica de acordo com a reivindicação 4,onde a cisteína é 175C adicionada ao C-terminal.

6. - O isoforme de fator estimulante de colônia granulocítica de acordo com a reivindicação 1,onde pelo menos um aminoácido do fator estimulante de colônia granulocítica humana ésubstituído por outro aminoácido antes que o polietilenoglicol seja a eleligado.

7. - Um composto farmacêutico compreendendo um isoforme de fator estimulante de colôniagranulocítica humana conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, ecatalisadores farmaceuticamente aceitáveis.

8.- Proteínas codificadoras de genes do isoforme de fator estimulante de colônia granulocíticahumana contendo cisteínas adicionadas ao N-terminal ou ao C-terminal, conforme definidoem qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.

9.- Um oligodeoxinucleotídeo como primer para modificar a seqüência de aminoácidos dofator estimulante de colônia granulocítica humana dentro do isoforme de fator estimulante decolônia granulocítica humana, conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.

10.- Um oligodeoxinucleotídeo de acordo com a reivindicação 9, onde o primer é umoligodeoxinucleotídeo representado por qualquer uma das seqüências Nos. 2 a 7.