BRPI0613646A2

BRPI0613646A2 - método de produzir koji lìquido tendo atividade realçada de uma enzima, koji lìquido, método de produzir uma preparação de enzima, preparação de enzima, e, método de produzir uma enzima

Info

Publication number: BRPI0613646A2
Application number: BRPI0613646-0A
Authority: BR
Inventors: Toshikazu Sugimoto; Hiroshi Shoji
Original assignee: Asahi Breweries Ltd
Priority date: 2005-07-22
Filing date: 2006-07-20
Publication date: 2012-11-06
Also published as: US20100120119A1; DK1908818T3; CN101218338B; AU2006270826A1; WO2007010979A1; KR101394009B1; CN101218338A; AU2006270826B2; ES2521623T3; RU2008106769A; EP1908818B1; TWI422679B; RU2409659C2; AU2006270826C1; TW200738875A; KR20080036044A; EP1908818A4; EP1908818A1; CA2614457A1

Abstract

MéTODO DE PRODUZIR KOJI LìQUIDO TENDO ATIVIDADE REALçADA DE UMA ENZIMA, KOJI LìQUIDO, MéTODO DE PRODUZIR UMA PREPARAçãO DE ENZIMA, PREPARAçãO DE ENZIMA, E, MéTODO DE PRODUIZR UMA ENZIMA. Divulgado é um processo para produzir um koji líquido tendo uma atividade enzimática elevada otimizando-se a composição de um meio de cultura líquido para o fungo koji. Um processo para produzir um koji líquido tendo uma atividade enzimática melhorada, o processo compreendendo cultivar um fungo koji branco e/ou um fungo koji preto em um meio de cultura líquido contendo um grão tendo a superfície inteira ou parcialmente coberta com um ritidoma como uma matéria-prima de cultura e suplementado com uma fonte de nitrogênio.

Description

"MÉTODO DE PRODUZIR KOJI LÍQUIDO TENDO ATIVIDADE REALÇADA DE UMA ENZIMA, KOJI LÍQUIDO, MÉTODO DE PRODUZIR UMA PREPARAÇÃO DE ENZIMA, PREPARAÇÃO DE ENZIMA, E5 MÉTODO DE PRODUZIR UMA ENZIMA"

Campo Técnico

A presente invenção diz respeito a um método de produzir koji líquido, em particular, um método de produzir koji líquido tendo atividade enzimática melhorada.

Fundamentos da Técnica

Como para o koji usado na produção de bebidas alcoólicas, existem koji sólido, que é cultivado tal que esporos de fungos filamentosos são inoculados à matéria-prima que foi tratada com cozimento e semelhantes, e koji líquido, que é cultivado tal que o meio líquido é preparado adicionando- se matéria-prima e outras fontes de nutriente à água, e depois esporos de fungos koji ou micélios pré cultivados de fungos koji e semelhantes são inoculados a este.

Na produção convencional de alimentos e bebidas fermentadas tais como bebidas alcoólicas incluindo, por exemplo, saquê, shochu, molho de soja, pasta de soja fermentada, saquê doce e semelhantes, o que é chamado koji sólido que é preparado com o método de cultura sólida foi amplamente usado. O método de cultura sólida é o método de cultura em que esporos de fungos koji tais como Aspergillus kawachii, Aspergillus awamori, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae e semelhantes são dispersados na matéria-prima sólida tal como cereais cozidos a vapor para permitir que fungos koji cresçam na superfície sólida.

Por exemplo, para a produção de shochu, o koji sólido tal como Aspergillus kawachii e Aspergillus awamori foram amplamente usados. Entretanto, visto que o método de cultura sólida é um sistema de cultura em que matérias-primas e fungos koji dispersam desigualmente, é difícil uniformizar os fatores tais como temperatura, teor de água, e várias composições de nutriente, e o método de cultura sólida é muito complicado no controle de cultura. Além disso, a produção de koji é freqüentemente conduzida sob condições abertas, e cuidados são necessários em termos de controle de qualidade de modo a impedir a contaminação com outras bactérias. Portanto, o método de cultura sólida é inadequado para a produção em grande escala.

Ao contrário, o método de cultura líquida é acessível ao controle de cultura e controle de qualidade, de modo que ele é adequado para a produção eficiente. Entretanto, devido à razão que, por exemplo, a atividade enzimática é insuficiente para fermentar shochu, o produto de cultura obtido por cultura líquida de fungos koji é raramente usado como koji shochu. O produto de cultura obtido pelo método de cultura líquida pode ser um produto de cultura por si só obtido pelo método de cultura líquida (em seguida, 15 também referido como "koji líquido"), assim como um líquido de cultura, células, e um concentrado destes, ou um produto seco destes.

Além das razões mencionadas acima, uma razão principal do produto de cultura obtido com o método de cultura líquida não sendo usado para produzir alimentos e bebidas fermentadas tais como shochu é que o comportamento dos fungos koji para produzir enzimas tais como amilase e celulase na cultura líquida é conhecida ser muito diferente daquela na cultura sólida, e a produtividade destas também é conhecida ser especialmente deficiente (ver Documentos que Não de Patente 1 e 2).

Na produção das bebidas alcoólicas tais como shochu, o álcool é usualmente gerado por sacarificação e fermentação simultâneas. Portanto, enzimas sacarolíticas de fungos koji, que afetam o fornecimento de glicose aos fungos koji, particularmente glicoamilase e α-amilase estável em ácido são enzimas chave na fermentação alcoólica. Entretanto, é conhecido que a atividade de glicoamilase é muito baixa no produto de cultura obtido com o método de cultura líquida e o comportamento de produção deste também é muito diferente daquele na cultura sólida (ver Documentos que Não de Patente 3 a 6).

Como um método de melhorar a atividade de glicoamilase de fungos koji, foi relatado o métodos de cultivar fungos koji enquanto fornecendo estresses no crescimento de micélios (ver Documento de Patente 1) e o método de adicionar cereais torrados ao fluido de cultura de fungo koji (ver Documento de Patente 2). O método divulgado no Documento de Patente I conduz cultura em membrana porosa ou em agente de imobilização inclusivo tendo espaços de ar para permitir a expressão do novo gene glaB que codifica glicoamilase, para desse modo realçar a atividade enzimática. Conseqüentemente, o método requer controle rigoroso ou dispositivos de cultura específicos, e assim ele não é prático. O método divulgado no Documento de Patente 2 cultiva fungos koji em meio líquido usando cereais torrados como, pelo menos, uma porção da matéria-prima, que requer uma etapa de produção adicional de torrefação de cereais.

Os inventores da presente invenção forneceram uma invenção relacionada a um método de cultivar fungos koji usando meio líquido contendo os sacarídeos que os fungos koji decompõem dificilmente (ver 20 Documento de Patente 3). Por cultura líquida de fungos koji com a invenção, um produto de cultura de fungo koji tendo atividade alta de enzimas glicolíticas tais como glicoamilase, que podem ser usadas para produzir alimentos e bebidas fermentados tais como saquê, pode ser obtido convenientemente e de modo barato.

Por outro lado, recentemente, a análise biológica molecular em α-amilase estável em ácido foi conduzida para os detalhes (ver Documento que Não de Patente 7). A análise tem relatado como segue: Um fungo koji branco tem dois genes amilase diferentes que são respectivamente responsáveis por duas características diferentes, isto é, α-amilase instável em ácido e α-amilase estável em ácido. Os comportamentos de expressão dos genes respectivos são muito diferentes um do outro. Em cultura líquida, a a- amilase instável em ácido é suficientemente produzida, enquanto a α-amilase estável em ácido, uma enzima chave para fermentar shochu é dificilmente produzida.

Para produzir shochu, a preparação é conduzida sob ambientes de pH baixo para impedir que a mistura de shochu putrefaça. A amilase instável em ácido contribui muito pouco para a glicólise na preparação de shochu porque ela é prontamente desativada sob condições de pH baixo. Portanto, é indispensável para a produção de shochu que a α-amilase estável em ácido seja produzida com rendimento alto, o que é considerado contribuir para a glicólise na preparação de shochu, por cultura líquida de fungos koji.

O comportamento de produção de α-amilase estável em ácido em fungos koji de cultura líquida foi investigado em detalhe e relatado. Entretanto, o método usa meio sintético contendo peptona e solução tampão de citrato, e requer um tempo de cultura de 100 horas ou mais, de modo que seria difícil aplicar à preparação de shochu real (ver Documentos que Não de Patente 8 a 10).

Como descrito acima, é considerado no geral que a α-amilase estável em ácido seja a enzima que não pode ser produzida basicamente por cultura líquida, e assim, koji líquido tendo atividade α-amilase estável em ácido alta não foi desenvolvido.

Documento de Patente 1: JP 11-225746 A Documento de Patente 2: JP 2001-321154 A Documento de Patente 3: JP 2003-265165 A

Documento que Não de Patente 1: Iwashita K. et ah Biosci. Biotechnol. Bioche., 62, 1938-1946 (1998)

Documento que Não de Patente 2: Yuichi Yamane et ai.: Journal of the Brewing Society of Japan, 99, 84-92 (2004) Documento que Não de Patente 3: Hata Y. et al: J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537(1997)

Documento que Não de Patente 4: Hata Y. et ah Gene., 207, 127-134 (1998)

Documento que Não de Patente 5: Ishida H. et al: J. Ferment. Bioeng., 86,301-307(1998)

Documento que Não de Patente 6: Ishida H. et al: Curr. Genet., 37, 373-379 (2000)

Documento que Não de Patente 7: Nagamina K. et al: Biosci. Biotechnol. Biochem, 67, 2194-2202 (2003)

Documento que Não de Patente 8: Sudo S et al.: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110(1993)

Documento que Não de Patente 9: Sudo S. et al.: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994)

Documento que Não de Patente 10: Shigetoshi Sudo et al: Journal of the Brewing Society of Japan, 89, 768-774 (1994)

Divulgação da Invenção

Problema que a invenção deve resolver

Os inventores da presente invenção descobriram que koji líquido suficientemente tendo atividade de enzimas tais como glicoamilase, a- amilase estável em ácido e semelhantes, que são necessárias para produzir shochu e semelhantes, podem ser produzidas cultivando-se fungos koji em meio líquido contendo os cereais dos quais a superfície é inteira ou parcialmente coberta com cascas, como matéria-prima de cultura, e já depositada para o pedido de patente (ver, as especificações do Pedido de Patente JP № 2004-350661 e Pedido de Patente JP № 2004-352320).

Entretanto, o comportamento de produção das enzimas exceto glicoamilase e α-amilase estável em ácido nestes métodos permaneceu desconhecido. Um objetivo da presente invenção é desenvolver um método de realçar atividade enzimática de enzimas amilolíticas tais como glicoamilase e α-amilase estável em ácido, e as outras enzimas em koji líquido. Para ser específico, um objetivo da presente invenção é fornecer um método de produzir koji líquido tendo atividade enzimática elevada otimizando-se a composição do meio líquido.

Meios para resolver o problema

Em vista de obter produção mais alta de enzimas em koji líquido, os inventores da presente invenção fizeram estudos extensivos em efeitos de combinação das matérias-primas de cultura acima mencionadas e várias fontes de nutriente, e descobriram que a produtividade da glicoamilase que é uma enzima amilolítica, a celulase que é uma enzima celulolítica, e a carboxipeptidase ácida que é uma enzima proteolítica pode ser melhorada incorporando-se uma fonte de nitrogênio específica no meio líquido e adicionalmente permitindo que a fonte de nitrogênio coexista com pelo menos um de um sulfato e um fosfato, e assim concluíram a invenção.

Isto é, de acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido um método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima, o método compreendendo cultivar fungos koji brancos e/ou fungos koji pretos em meio líquido contendo fonte de nitrogênio usando-se o cereal do qual a superfície é inteira ou parcialmente coberta com cascas como matéria-prima de cultura.

De acordo com um segundo aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com o primeiro aspecto, em que a fonte de nitrogênio compreende um sal de nitrato.

De acordo com um terceiro aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com o primeiro aspecto, em que a fonte de nitrogênio compreende pelo menos uma selecionada do grupo que consiste de células de levedura ou produtos tratados destas, cascas de cereal e farelo de cereal, ou uma mistura destes e um sal de nitrato.

De acordo com um quarto aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com o primeiro aspecto, em que o meio líquido contém o sal de nitrato em uma concentração de 0,05 a 2,0 % (p/vol).

De acordo com um quinto aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com o segundo aspecto, em que o meio líquido contém ainda um sal de fosfato.

De acordo com um sexto aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com o quinto aspecto, em que o meio líquido contém o sal de fosfato em uma concentração de 0,05 a 1,0 % (p/vol).

De acordo com um sétimo aspecto da presente invenção,é fornecido o método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com o quinto aspecto, em que o meio líquido contém ainda um sal de sulfato.

De acordo com um oitavo aspecto da presente invenção,é fornecido o método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com o sétimo aspecto, em que o meio líquido contém o sal de sulfato em uma concentração de 0,01 a 0,5 % (p/vol).

De acordo com um nono aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com o primeiro aspecto, em que a enzima compreende uma ou duas ou mais selecionadas do grupo que consiste de uma enzima amilolítica, uma enzima celulolítica e uma enzima proteolítica.

De acordo com um décimo aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com o primeiro aspecto, em que o cereal compreende arroz, trigo, cevada, trigo sarraceno, milhete japonês, setaria, sorgo Chinês ou milho.

De acordo com um décimo primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido koji líquido obtido pelo método de acordo com qualquer um do primeiro ao décimo aspectos.

De acordo com um décimo segundo aspecto da presente invenção, é fornecido um método de produzir uma preparação de enzima, compreendendo usar o koji líquido de acordo com o décimo primeiro aspecto.

De acordo com um décimo terceiro aspecto da presente invenção, é fornecida uma preparação de enzima obtida pelo método de produção de acordo com o décimo segundo aspecto.

De acordo com um décimo quarto aspecto da presente invenção, é fornecido um método de produzir uma enzima, compreendendo produzir a enzima cultivando-se fungos koji brancos e/ou fungos koji pretos em meio líquido contendo uma fonte de nitrogênio e o cereal do qual a superfície é inteira ou parcialmente coberta com cascas como matéria-prima de cultura.

De acordo com um décimo quinto aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir uma enzima de acordo com o décimo quarto aspecto, em que a fonte de nitrogênio compreende um sal de nitrato.

De acordo com um décimo sexto aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir uma enzima de acordo com o décimo quarto aspecto, em que a fonte de nitrogênio compreende pelo menos uma selecionada do grupo que consiste de células de levedura ou produtos tratados destas, cascas de cereal e farelo de cereal, ou uma mistura destes e um sal de nitrato.

De acordo com um décimo sétimo aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir uma enzima de acordo com o décimo quarto aspecto, em que o meio líquido contém o sal de nitrato em uma concentração de 0,05 a 2,0 % (p/vol).

De acordo com um décimo oitavo aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir uma enzima de acordo com o décimo quinto aspecto, em que o meio líquido contém ainda um sal de fosfato.

De acordo com um décimo nono aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir uma enzima de acordo com o décimo oitavo aspecto, em que o meio líquido contém o sal de fosfato em uma concentração de 0,05 a 1,0 % (p/vol).

De acordo com um vigésimo aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir uma enzima de acordo com o décimo oitavo aspecto, em que o meio líquido contém ainda um sal de sulfato.

De acordo com um vigésimo primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir uma enzima de acordo com o vigésimo aspecto, em que o meio líquido contém o sal de sulfato em uma concentração de 0,01 a 0,5 % (p/vol).

De acordo com um vigésimo segundo aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir uma enzima de acordo com o décimo quarto aspecto, em que a enzima compreende uma ou duas ou mais selecionadas do grupo que consiste de uma enzima amilolítica, uma enzima celulolítica e uma enzima proteolítica.

De acordo com um vigésimo terceiro aspecto da presente invenção, é fornecido o método de produzir uma enzima de acordo com o décimo quarto aspecto, em que o cereal como uma matéria-prima compreende arroz, trigo, cevada, trigo sarraceno, milhete japonês, setaria, painço, sorgo Chinês ou milho.

Efeito da invenção De acordo com a presente invenção, uma substância orgânica específica e/ou uma substância inorgânica como fonte de nitrogênio são adicionadas ao meio líquido contendo o cereal do qual a superfície é inteira ou parcialmente coberta com cascas como matéria-prima de cultura, um sal de sulfato e um sal de fosfato são ainda adicionados a este, e fungos koji são cultivados no meio líquido, não apenas para melhorar notavelmente a produtividade de enzimas amilolíticas em koji líquido, mas também para produzir koji líquido contendo enzimas celulolíticas e enzimas proteolíticas com rendimento alto. Além disso, é considerado que a produtividade das enzimas produzidas pelos fungos koji é no geral melhorada até outras que não as enzimas acima mencionadas.

Quando alimentos e bebidas fermentados tais como shochu são produzidos usando-se o koji líquido produzido de acordo com a presente invenção, boa fermentação é realizada devido à diminuição na viscosidade de mistura por causa da atividade alta de enzimas celulolíticas, por meio das quais o aumento no rendimento de álcool pode ser esperado. Além disso, a produção de aminoácidos é aumentada devido à atividade alta de enzimas proteolíticas, por meio das quais alimentos e bebidas fermentados tendo flavor esplendoroso podem ser produzidos.

Além disso, a cultura líquida pode controlar estritamente quando comparada à cultura sólida, de modo que koji líquido tendo estabilidade de qualidade possa ser produzido em custo baixo.

Além disso, os cereais usados na presente invenção são não polidos ou polidos na medida em que pelo menos cascas permaneceram na superfície. Assim, melhora na disponibilidade da matéria-prima e no rendimento pode ser esperada.

Breve descrição dos desenhos

A FIG. 1 mostra atividades de glicoamilase e α-amilase estável em ácido de produtos de cultura todos obtidos cultivando-se com o meio líquido usando nitrato de potássio como fonte de nitrogênio. Todas as barras pretas representam atividade de glicoamilase (U/ml), e todas as barras brancas representam atividade α-amilase estável em ácido (U/ml).

A FIG. 2 mostra atividades de glicoamilase e α-amilase estável em ácido de produtos de cultura todos obtidos cultivando-se com o meio líquido usando uma substância de nitrogênio inorgânico e um sal inorgânico. Todas as barras pretas representam atividade de glicoamilase (U/ml), e todas as barras brancas representam atividade α-amilase estável em ácido (U/ml).

A FIG. 3 mostra atividades de glicoamilase e α-amilase estável em ácido de produtos de cultura todos obtidos cultivando-se com o meio líquido usando células de levedura ou autolisado de levedura como fonte de nitrogênio. Todas as barras pretas representam atividade de glicoamilase (U/ml), e todas as barras brancas representam atividade α-amilase estável em ácido (U/ml).

A FIG. 4 mostra atividades de glicoamilase e α-amilase estável em ácido de produtos de cultura todos obtidos cultivando-se com o meio líquido usando uma combinação de uma substância de nitrogênio inorgânico, um sal inorgânico, e células de levedura. Todas as barras pretas representam atividade de glicoamilase (U/ml), e todas as barras brancas representam atividade α-amilase estável em ácido (U/ml).

A FIG. 5 mostra atividades de glicoamilase e α-amilase estável em ácido de produtos de cultura todos obtidos cultivando-se com o meio líquido usando uma combinação de farelo de cevada, células de levedura e uma substância de nitrogênio inorgânico como fonte de nitrogênio. Todas as barras pretas representam atividade de glicoamilase (U/ml), e todas as barras brancas representam atividade α-amilase estável em ácido (U/ml).

A FIG. 6 mostra atividades de glicoamilase e α-amilase estável em ácido de produtos de cultura todos obtidos cultivando-se com o meio líquido usando uma combinação de cascas de cevada e células de levedura como fonte de nitrogênio. Todas as barras pretas representam atividade de glicoamilase (U/ml), e todas as barras brancas representam atividade a- amilase estável em ácido (U/ml).

A FIG. 7 mostra atividades de várias enzimas de produtos de cultura de fungo koji cada uma obtida cultivando-se com o meio líquido usando um sal de sulfato, um sal de nitrato e um sal de fosfato. De (A) a (D) mostra respectivamente atividades (U/ml) de glicoamilase (GA)j a-amilase estável em ácido (ASAA), celulase (CEL) e carboxipeptidase ácida (ACP).

Melhores formas de realização para realizar a invenção Em seguida, a presente invenção será descrita em detalhe.

O método de produzir koji líquido de acordo com a presente invenção compreende a etapa de cultivar fungos koji no meio líquido preparado adicionando-se a este matérias-primas tais como cereais e fontes de nitrogênio para produzir koji líquido com atividade enzimática melhorada. Mais especificamente, na presente invenção, fungos koji são cultivados com o meio líquido que contém os cereais dos quais a superfície é inteira ou parcialmente coberta com cascas, e assim, leva tempo para sacarificar amidos nos cereais, a taxa de liberação dos sacarídeos no sistema de cultura é suprimida, por meio da qual a atividade enzimática do koji líquido é realçada. Além disso, várias enzimas são altamente produzidas pelos fungos koji porque o meio líquido contém fontes de nutriente específicas.

Aqui, exemplos da enzima a ser produzida pelos fungos koji compreendem, mas não necessariamente limitam-se a, uma enzima amilolítica tal como glicoamilase e α-amilase, uma enzima celulolítica tal como celulase e β-glicosidase, e uma enzima proteolítica tal como carboxipeptidase ácida e protease ácida.

Na presente invenção, exemplos do cereal a ser usado como a matéria-prima de cultura compreendem cevada, arroz, trigo, trigo sarraceno, milhete japonês, setaria, painço, sorgo Chinês, milho e semelhantes. Cada uma das matérias-primas de cultura precisa ter a forma de que a superfície é inteira ou parcialmente coberta com cascas. Pode ser usado um material não polido ou aquele tendo igual a ou mais da razão de polimento em que ele foi polido de modo que as cascas pelo menos permanecem na superfície de grãos, e arroz bruto, cevada bruta e semelhantes também podem ser usados. No caso de arroz, arroz bruto, arroz com todas as palhas e arroz com parte das palhas

podem ser usados.

Por exemplo, quando o cereal for a cevada, pode ser usado o

material não polido tendo uma razão de polimento de 100 %, ou contanto que a razão de polimento do material não polido seja definida como de 100 %, o material tendo a razão de polimento determinada subtraindo-se a razão de casca da cevada (geralmente 7 a 8 %) da razão de polimento do material não polido, isto é, aquele tendo razão de polimento de não menos do que cerca de92 % a 93 %.

Aqui, o termo "razão de polimento" refere-se à porcentagem

permanecida depois do polimento dos cereais. Por exemplo, o termo "razão de polimento de 90 %" significa que 10 % das cascas ou semelhantes na porção da camada superficial de cereais é raspada. Na presente invenção, além disso, o termo "cevada bruta" compreende aquelas de cevada não polida a cevada polida tendo cascas permanecidas nas superfícies dos grãos, isto é, o material tendo razão de polimento de 90 % ou mais. Além disso, o termo "cascas" refere-se à parte externa que cobre a superfície de uma partícula de

cereal.

Qualquer uma das matérias-primas de cultura mencionadas acima é usada sozinha, ou duas ou mais delas são usadas em combinação para preparar o meio líquido seguinte. Isto é, o cereal como matéria-prima de cultura é misturado com água em combinação com a fonte de nitrogênio descrita aqui abaixo para preparar o meio líquido. Uma razão de mistura do cereal é ajustada na medida em que as enzimas tais como uma enzima amilolítica, uma enzima celulolítica, e uma enzima proteolítica são seletivamente geradas e acumuladas no produto de cultura de fungos koji.

Por exemplo, quando a cevada é usada como matéria-prima de cultura, o meio líquido é preparado adicionando-se 1 a 20 % (p/vol) de cevada bruta à água. Quando a cevada não polida é usada como a cevada bruta, mais preferivelmente, o meio líquido é preparado com a adição de 8 a 10 % (p/vol). Quando cevada polida a 95 % como a cevada bruta é usada como a matéria- prima, mais preferivelmente, o meio líquido é preparado com a adição de 1 a4 % (p/vol).

Além disso, quando o arroz bruto a partir do qual as palhas são

removidas é usado como a matéria-prima de cultura, o meio líquido é preparado adicionando-se 1 a 20 % (p/vol) do arroz bruto à água, preferivelmente 5 à 13 % (p/vol), mais preferivelmente 8 a 10 % (p/vol).

Quando os outros cereais são usados, o meio líquido é preparado na mesma maneira adicionando-se 1 a 20 % (p/vol) dos cereais à água.

Desta maneira, a quantidade de mistura mais adequada varia dependendo dos graus de polimento da matéria-prima a ser usada, cepas de koji a serem usadas, tipos da matéria-prima e semelhantes, deste modo pode ser apropriadamente selecionada com consideração a estes.

Quando a quantidade da matéria-prima de cultura usada excede o valor limite superior, a viscosidade do meio de cultura eleva, e o fornecimento de oxigênio ou ar necessários para cultivar aerobicamente fungos koji torna-se insuficiente para permitir que a cultura progrida desfavoravelmente, e ele não é preferido. Por outro lado, quando a quantidade da matéria-prima usada não satisfaz o valor limite inferior, as enzimas desejáveis não podem ser produzidas com rendimento alto.

Amidos incluídos na matéria-prima de cultura podem ser gelatinizados antes da cultura. Um método de gelatinizar amidos não é particularmente limitado, e pode ser conduzido de acordo com qualquer um dos métodos convencionais compreendendo o método de vaporização e o método de torrefação. Na etapa de esterilizar o meio líquido como descrito mais tarde, se os amidos são aquecidos até a temperatura de gelificação ou mais alta por esterilização em temperaturas altas e pressões altas, a gelatinização de amidos é simultaneamente conduzida por um tal tratamento.

No meio líquido, uma substância orgânica, uma substância inorgânica e semelhantes são incluídas como fonte de nitrogênio além da matéria-prima de cultura mencionada acima. Aquelas fontes de nitrogênio são não particularmente limitadas contanto que fungos koji cresçam e produzam suficientemente as enzimas desejáveis. Exemplos da substância orgânica compreendem células de levedura ou produtos tratados destas (tais como células de levedura decompostas, extratos de levedura e semelhantes), cascas seriadas, farelo de cereal e semelhantes. Um exemplo da substância inorgânica compreende um sal de nitrato.

O sal de nitrato compreende nitrato de potássio, nitrato de sódio e semelhantes, e nitrato de potássio é particularmente preferido.

Qualquer uma das fontes de nitrogênio pode ser usada sozinha, ou duas ou mais das substâncias orgânicas e/ou das substâncias inorgânicas podem ser usadas em combinação.

A quantidade de adição da fonte de nitrogênio não é particularmente limitada contanto que o crescimento dos fungos koji seja promovido, entretanto, 0,1 a 2 % (p/vol), preferivelmente 0,5 a 1,0 % (p/vol) como substância orgânica, e a quantidade de adição do sal de nitrato como substância inorgânica é de 0,05 a 2,0 % (p/vol), preferivelmente 0,1 a 2,0 % (p/vol), mais preferivelmente 0,2 a 1,5 % (p/vol).

A adição da fonte de nitrogênio em uma quantidade que excede o valor limite superior não é preferível porque o crescimento dos fungos koji é inibido. Por outro lado, uma quantidade de adição da fonte de nitrogênio mais baixa do que o valor limite inferior também não é preferível porque a produção de enzima não é promovida.

Exemplos da levedura a ser usada como um tipo da fonte de nitrogênio na presente invenção compreendem levedura de cerveja, levedura de vinho, levedura de uísque, levedura de shochu, levedura de saquê e levedura do pão que são usados nos processos de fabricação de bebida fermentada ou produção de alimento, e as células de levedura dos gêneros Saccharomyces, Candida, Torulopsis, Hanseniaspora, Hansenula, Debaryanzyces, Saccharomycopsis, Saccharomycodes, Pichia, Pachysolen e semelhantes.

As células da levedura propriamente ditas podem ser usadas como fonte de nitrogênio, e também podem ser usadas na forma de células de levedura decompostas ou extrato de levedura. As células de levedura decompostas ou o extrato de levedura podem ser obtidos submetendo-se as células de levedura a tratamentos tais como o método de autólise (Método de solubilizar células utilizando enzimas proteolíticas que originalmente existem nas células de levedura), o método de enzimólise (Método de solubilizar com adição de uma preparação de enzima ou semelhantes derivada de microorganismos ou plantas), o método de extração por água quente (Método de solubilizar imergindo-se as células de levedura em água quente durante um certo período de tempo), o método de decomposição ácida ou alcalina (Método de solubilizar com adição de vários ácidos ou bases alcalinas), o método de esmagamento físico (Método de esmagar com o tratamento de ultra-sonicação e o método de homogeneização por alta pressão, ou por mistura com sólidos tais como pérolas de vidro e agitação), e o método de congelamento-descongelamento (Método de esmagamento por congelamento e descongelamento pelo menos uma vez).

Além disso, farelo de cereal tal como farelo de arroz, que é um subproduto obtido a partir do polimento de cereais, também pode ser usado como fonte de nitrogênio. Uma semente de cereal é composta de uma porção de testa, uma porção do embrião, uma porção do endosperma e palha protegendo esta. O farelo é uma porção composta do embrião e da porção de testa.

Além disso, na presente invenção, cascas de cereal, que é uma porção de testa de cereais, pode ser usada como fonte de nitrogênio, e cascas de cereal do mesmo tipo do cereal usado como matéria-prima de cultura é geralmente usada. Estes farelos de cereal e cascas de cereal podem ser usado em combinação com as outras fontes de nitrogênio. No meio líquido a ser usado na presente invenção, um sal de sulfato e um sal de fosfato podem ser incluídos além da matéria-prima de cultura e das fontes de nitrogênio como descrito acima. Usando-se aqueles sais inorgânicos em combinação, torna-se possível realçar a atividade enzimática de uma enzima amilolítica, uma enzima celulolítica, uma enzima proteolítica e semelhantes.

Exemplos do sal de sulfato compreendem sulfato de magnésio heptaidratado, sulfato de ferro heptaidratado e sulfato de amônio, e sulfato de magnésio heptaidratado é especificamente preferível. Exemplos do sal de fosfato compreendem diidrogeno fosfato de potássio e fosfato de amônio, e diidrogeno fosfato de potássio é especificamente preferível.

Qualquer um daqueles sais inorgânicos pode ser usado sozinho, ou dois ou mais deles podem ser usados em combinação.

Além disso, a concentração dos sais inorgânicos em meio líquido é ajustada na medida em que as enzimas tais como uma enzima amilolítica, uma enzima celulolítica, e uma enzima proteolítica são seletivamente geradas e acumuladas no produto de cultura de fungos koji. Por exemplo, a concentração do sal de sulfato é de 0,01 a 0,5 %, preferivelmente 0,02 a 0,1 %, e a concentração do sal de fosfato é de 0,05 a 1,0 %, preferivelmente 0,1 a 0,5 %, contanto que, cada valor seja em p/vol. Os sais inorgânicos mencionados acima podem ser usados sozinhos, ou dois ou mais deles podem ser usados em combinação.

Ao meio líquido, uma substância orgânica e um sal inorgânico opcionalmente podem ser adicionados outro que não a fonte de nitrogênio e sal inorgânico mencionados acima como fonte de nutriente. Os aditivos não são particularmente limitados contanto que eles sejam as substâncias geralmente usadas para cultivar fungos koji. Exemplos da substância orgânica compreendem farelo de trigo, solução para maceração de milho, uma torta de soja e soja desengordurada. Exemplos do sal inorgânico compreendem compostos solúveis em água tais como um sal de amônio, um sal de potássio, um sal de cálcio, um sal de magnésio e semelhantes. Duas ou mais substâncias orgânicas e/ou sais inorgânicos podem ser usados ao mesmo tempo.

A quantidade de adição deste não é particularmente limitada na medida em que o crescimento dos fungos koji é facilitado. A quantidade de adição da substância orgânica é preferivelmente cerca de 0,1 a 5 % (p/vol) e a quantidade de adição do sal inorgânico é preferivelmente cerca de 0,1 a 1 % (p/vol).

A adição da fonte de nutriente em uma quantidade que excede o valor limite superior não é preferível porque o crescimento dos fungos koji é inibido. Por outro lado, uma quantidade de adição da fonte de nutriente mais baixa do que o valor limite inferior também não é preferível porque a produção de enzima não é promovida.

O meio líquido para fungos koji obtido misturando-se a 25 matéria-prima de cultura mencionada acima e a fonte de nitrogênio com água opcionalmente pode ser submetido a um tratamento de esterilização, e o método de tratamento não é particularmente limitado. Um exemplo do método compreende o método de esterilização em temperatura alta e pressão alta, e neste caso, a esterilização pode ser conduzida a 121° C durante 15 minutos.

O meio líquido esterilizado é resfriado até uma temperatura de cultura e depois fungos koji brancos e/ou fungos koji pretos são inoculados ao meio líquido.

Exemplos dos fungos koji a serem usados na presente invenção preferivelmente compreendem fungos koji capazes de produzir enzimas amilolíticas tais como glicoamilase, α-amilase estável em ácido e a- amilase, enzimas celulolíticas tais como celulase e β-glicosidase, e enzimas proteolíticas tais como carboxipeptidase ácida e protease ácida. Exemplos específicos dos fungos koji compreendem fungos koji brancos tais como Aspergillus kawachii, e fungos koji pretos tais como AspergiUus awamori e Aspergillus niger.

A forma de the fungos koji a ser inoculada ao meio é arbitrária, e qualquer um dos esporos e dos micélios dos fungos koji podem ser usados.

Estes fungos koji podem ser usados para a cultura de cepa única ou para a cultura mista com duas ou mais cepas homólogas ou heterólogas. É permitido o uso da forma dos esporos ou dos micélios obtidos na pré cultura. Entretanto, os micélios são preferivelmente usados porque período de tempo mais curto é necessário para a fase de crescimento logarítmico.

A quantidade dos fungos koji inoculados no meio líquido não é particularmente limitada mas o número dos esporos pode estar na faixa de cerca de 1 x 10^4 a 1 x 10^6 por ml do meio líquido. Para os micélios, cerca de 0,1 a 10 % do líquido de pré cultura é preferivelmente inoculado.

A temperatura de cultura dos fungos koji é preferivelmente de 25 a 45° C, mais preferivelmente 30 a 40° C mas não particularmente limitada na medida em que o crescimento não é prejudicialmente afetado. Se a temperatura de cultura for baixa, eles tendem a ser contaminados com micróbios infecciosos visto que o crescimento dos fungos koji torna-se lento. Assim, o tempo de cultura está apropriadamente na faixa de 24 a 72 horas.

O mecanismo de cultura pode ser qualquer um daqueles capazes de realizar a cultura líquida. Os fungos koji têm que ser cultivados aerobicamente. Assim, a cultura deve ser conduzida sob condições aeróbicas em que oxigênio ou ar podem ser fornecidos no meio. Além disso, é preferível agitar o meio de modo que as matérias-primas, oxigênio, e os fungos koji possam ser uniformemente distribuídos no mecanismo durante a cultura. As condições de agitação e a quantidade de aeração podem ser conduzidas sob quaisquer condições na medida em que um ambiente de cultura aeróbica é mantido e assim pode ser apropriadamente selecionado dependendo do mecanismo de cultura, da viscosidade do meio e semelhantes.

Por cultura com o método de cultura acima, as enzimas tais como uma enzima amilolítica, uma enzima celulolítica, e uma enzima proteolítica e semelhantes podem ser altamente produzidas. Como um resultado, koji líquido tendo a atividade enzimática a ser usada para fermentar shochu é obtido.

O koji líquido de acordo com a presente invenção compreende o fluido de cultura obtido do produto de cultura por separação centrífuga e semelhantes, o concentrado deste, o produto seco deste e semelhantes, assim como o produto de cultura por si só.

Como descrito acima, de acordo com o método de cultura descrito acima, as enzimas tais como uma enzima amilolítica, uma enzima celulolítica, e uma enzima proteolítica podem ser altamente produzidas.

Portanto, o método de produzir uma enzima descrita no décimo-quarto aspecto da presente invenção é o mesmo como o método de produzir koji líquido descrito acima.

O koji líquido obtido pelo método de produção da presente invenção pode ser adequadamente usado em produzir alimentos e bebidas fermentados tais como shochu. O koji líquido pode ser usado ao invés do koji sólido, por exemplo, no caso de fabricação de saquê, no estágio de preparação de levedura ou mistura; no caso de fabricação de shochu, no estágio de preparação da mistura; no caso de fabricação de molho de soja, no estágio de empilhamento; no caso de fabricação de missô, no estágio de preparação; no caso de fabricação de saquê doce, no estágio de preparação; e no caso de fabricação de amazake, no estágio de preparação.

Além disso, uma parte do koji líquido resultante pode ser usada como iniciador para a produção subseqüente de koji líquido. Produzindo-se koji líquido continuamente desta maneira, a produção estável pode ser obtida e a eficiência da produção pode ser melhorada ao mesmo tempo.

Quando alimentos e bebidas fermentados tais como shochu são produzidos usando-se o koji líquido mencionado acima, todas as etapas podem ser conduzidas na fase líquida. Um método de produzir alimentos e bebidas fermentados na fase líquida através das etapas totais, por exemplo, quando shochu é produzido, é que milho, trigo, arroz, batata, cana-de-açúcar e semelhantes como matéria-prima são aquecidos a cerca de 80° C para liqüefazer por dissolução com uma preparação de enzima resistente ao calor, o koji líquido e levedura acima são adicionados a este para deixar a mistura até a fermentação alcoólica, e depois ele é destilado sob pressão normal ou pressão reduzida e semelhantes.

O koji líquido obtido pelo método da presente invenção tem atividade enzimática elevada, de modo que o koji líquido possa ser utilizado para uma preparação de enzima e um produto farmacêutico tal como um agente digestivo. Neste caso, o produto de cultura resultante de fungos koji pode ser concentrado e purificado à extensão desejada de modo a formar em uma formulação com adição a este de um excipiente apropriado, um agente espessante, um adoçante e semelhantes. Além disso, utilizando-se uma região promotora do gene da enzima amilolítica e semelhantes dos fungos koji, uma heteroproteína desejável pode ser altamente produzida no produto de cultura dos fungos koji.

EXEMPLOS

Embora a presente invenção será mais especificamente descrita em seguida com referência aos Exemplos e semelhantes, a presente invenção não é limitada a estes Exemplos e semelhantes.

Exemplo 1

Adição de substância de nitrogênio inorgânico na produção de koji líquido

O efeito quando nitrato de potássio como substância de nitrogênio inorgânico foi adicionado ao meio líquido foi investigado como descrito abaixo.

Inicialmente, três tipos de meios líquidos foram preparados, em que cevada bruta foi adicionada respectivamente à água sem adição (controle), àquele com 0,2 % (p/vol) de nitrato de potássio, e àquele com 0,4 % (p/vol) de nitrato de potássio de modo que a quantidade da cevada bruta fosse ajustada para 2 % (p/vol).

Cada 100 ml dos meios líquidos foi colocado em um frasco cônico abafado de 500 ml e foi submetido à autoclave, e fungos koji brancos (Aspergillus kawachii IF04308) cultivados antecipadamente em meio líquido foram inoculados de modo que a quantidade destes fosse ajustada para 1 % (v/vol) para o meio líquido. Como a cevada bruta, 95 % de cevada Stirling polida fabricada na Austrália foi usada (Isto é basicamente verdadeiro nos exemplos aqui abaixo).

A cultura depois foi conduzida durante 48 horas em uma temperatura de 37°C e uma velocidade de agitação de 100 rpm. Depois da conclusão da cultura, cada um dos produtos de cultura resultantes foi medido quanto à atividade de glicoamilase e atividade α-amilase estável em ácido. As atividades de glicoamilase e α-amilase estável em ácido dos produtos de cultura obtidos da cultura de fungos koji no meio líquido dependendo das quantidades usadas de nitrato de potássio foram mostradas na Tabela 1 e FIG.1.

Para medir a atividade enzimática de glicoamilase, um kit de quantificação parcial de produção de sacarificação (fabricado pela Kikkoman) foi usado. Para medir a atividade enzimática de α-amilase estável em ácido, o método descrito em "Nagamina K. et ai.: Biosci. Biotechnol. Biochemi 67,2194-2202 (2003)" foi levemente modificado. Isto é, α-amilase instável em ácido foi inativada tratando-se o produto de cultura com ácido, e depois atividade α-amilase estável em ácido foi medida com o um kit de medição de α-amilase (fabricado pela Kikkoman). Para ser mais específico, 9 ml de tampão de ácido acético a 100 mM (pH 3) foi adicionado a 1 ml da solução de cultura, o tratamento ácido foi conduzido a 37° C durante 1 hora, e depois medido com o kit de medição de α-amilase (fabricado pela Kikkoman).

Como mostrado na Tabela 1 e FIG. 1, atividades das enzimas glicoamilase e α-amilase estável em ácido foram notavelmente melhoradas tanto no lote adicionado de 0,2 % quanto no lote adicionado de 0,4 % onde os meios líquidos foram cultivados com adição a este do nitrato de potássio como substância de nitrogênio inorgânico, quando comparado àquele no lote de controle de sem adição, etambém o equilíbrio entre a glicoamilase eaa- amilase estável em ácido foi bom.

[Tabela 1]

<table>table see original document page 24</column></row><table> Exemplo 2

Adição de uma pluralidade de substâncias inorgânicas na produção de koji líquido

O efeito quando uma pluralidade de substâncias inorgânicas foram adicionadas foi investigado como descrito abaixo.

Nitrato de potássio ou nitrato de sódio como substância de nitrogênio inorgânico, e diidrogeno fosfato de potássio como sal inorgânico foram adicionados a água nas composições mostradas na Tabela 2. A quantidade de adição do nitrato de sódio foi calculada separada da concentração molar correspondente a 2,0 % de nitrato de potássio, isto é, 20 mM, e foi combinada em 1,7 % de modo que as concentrações iônicas de nitrato tornaram-se as mesmas. Água sem substância de nitrogênio inorgânico nem sal inorgânico foi usada como o controle.

Λ

A água da matéria-prima preparada como descrito acima foi adicionada cevada bruta como matéria-prima de cultura em uma concentração de 2 % (p/vol), e 4 tipos de meios líquidos foram preparados. Cultura líquida dos fungos koji brancos foi conduzida sob as mesmas condições como aquelas no Exemplo 1. Depois disso, atividade de glicoamilase e atividade a- amilase estável em ácido foram determinadas pelo mesmo método como aquele no Exemplo 1. Tabela 2 e FIG. 2 mostram os resultados.

[Tabela 2]

<table>table see original document page 25</column></row><table> Como mostrado na Tabela 2 e FIG. 2, atividades das enzimas

glicoamilase e α-amilase estável em ácido foram melhoradas nos lotes com adição a estes da substância de nitrogênio inorgânico e sal inorgânico quando comparado ao lote de controle de sem adição.

Exemplo 3

Adição de células de levedura ou levedura autolisada na produção de koji líquido

Koji líquido foi produzido usando-se meio líquido para que células de levedura ou levedura autolisada (isto é, extrato de levedura) sejam adicionadas.

(1) Preparação de células de levedura ou levedura autolisada para serem adicionadas

Levedura de cerveja recuperadas de uma etapa de preparar cerveja foi tratada sob as condições seguintes, para desse modo obter células de levedura de cerveja e leveduras autolisadas (1) e (2) para serem usadas na produção de koji líquido.

Células de levedura: As células de levedura de cerveja obtidas desidratando-se levedura de cerveja a cerca de um teor de água de 70 % por meio de centrifugação a 5,000 χ g durante 15 minutos.

Levedura autolisada (1): A levedura autolisada obtida colocando-se em suspensão células de levedura de cerveja em uma quantidade igual de água e tratando a mistura a 52° C durante 18 horas.

Levedura autolisada (2): A levedura autolisada obtida colocando-se em suspensão células de levedura de cerveja em uma quantidade igual de 1 % de ácido láctico e tratando a mistura a 52° C durante 18 horas.

(2) Preparação de koji líquido usando-se meio líquido para que levedura seja adicionada

Cada uma das células de levedura e leveduras autolisadas (1) e (2) que foram preparadas como descrito acima foi adicionada a água de modo a ter concentrações de 0,20 %, 0,50 % e 1 % (v/vol), respectivamente, para desse modo preparar a água da matéria-prima. Cevada bruta como matéria- prima de cultura foi adicionada a cada um do líquido da matéria-prima de modo a ter uma concentração de 2 % (p/vol), por meio do qual preparando meio líquido. Cultura líquida dos fungos koji brancos foi conduzida sob as mesmas condições como aquelas no Exemplo 1. Depois disso, atividade de glicoamilase e atividade α-amilase estável em ácido foram determinadas de acordo com o mesmo método como aquele no Exemplo 1.

Como o controle, meio líquido (isto é, lote N- 1) foi preparado adicionando-se apenas cevada bruta a água em uma concentração de apenas 2 % (p/vol), e fungos koji brancos depois foram inoculados a este da mesma maneira como aquela no Exemplo 1 para conduzir cultura líquida. Atividade de glicoamilase e atividade α-amilase estável em ácido do koji líquido resultante foram determinadas da mesma maneira. Tabela 3 e FIG. 3 mostram os resultados.

[Tabela 3]

<table>table see original document page 27</column></row><table> *: unidade é v/vol

(3) Resultados

Como mostrado na Tabela 3 e FIG. 3, tanto a atividade de glicoamilase quanto a atividade α-amilase estável em ácido foram melhoradas em todos os lotes experimentais para que células de levedura por si só fossem adicionadas e nos lotes experimentais para que levedura autolisada fosse adicionada, quando comparada àquela no lote de controle (isto é, lote N- 1) sem adição. Em particular, lote experimental N- 7 mostrou um bom resultado. Além disso, a cada lote experimental, a atividade de glicoamilase e a atividade α-amilase estável em ácido foram melhoradas em proporção à quantidade de adição das células de levedura ou levedura autolisada.

Exemplo 4 Adição em combinação de substância de nitrogênio inorgânico e/ou sal inorgânico com células de levedura

Nitrato de potássio, diidrogeno de fosfato de potássio, e células de levedura foram combinados da maneira como mostrado na Tabela 4, e foram adicionados à água para preparar água da matéria-prima. As células de levedura usadas foram células de levedura de cerveja por si só (isto é, as células de levedura preparadas no Exemplo 3) obtidas desidratando-se a levedura de cerveja recuperada de uma etapa de preparar cerveja a um teor de água de cerca de 70 % por meio de centrifugação. Como o controle (isto é, lote Ne 1), água da matéria-prima sem adição foi

usada.

Cevada bruta foi adicionada à água da matéria-prima preparada

com as combinações mostradas na Tabela 4 em uma concentração de 2 % (p/vol). Fungos koji brancos foram inoculados ao meio líquido da mesma maneira como aqueles no Exemplo 1 para conduzir cultura líquida. Atividade de glicoamilase e atividade α-amilase estável em ácido naquele meio líquido foram determinadas, respectivamente. Tabela 4 e FIG. 4 mostram os resultados. [Tabela 4]

<table>table see original document page 28</column></row><table> <table>table see original document page 29</column></row><table>

Como mostrado na Tabela 4 e FIG. 4, tanto a atividade de glicoamilase quanto a atividade α-amilase estável em ácido foram extremamente altas em todos os lotes experimentais, quando comparado àqueles no lote de controle (isto é, lote Na 1) sem adição. Em particular, em lotes experimentais N2 15 a N~ 18, atividades de ambas as enzimas foram extremamente altas. A partir dos resultados, foi considerado que o uso combinado da substância de nitrogênio inorgânico e/ou o sal inorgânico com as células de levedura melhorou o equilíbrio de nutrição no meio líquido, desse modo os fungos vivamente filamentosos produziram as enzimas.

Exemplo 5

Combinação de farelo de cevada, células de levedura, e substância inorgânica

Farelo de cevada e células de levedura, nitrato de potássio e diidrogeno de fosfato de potássio foram combinados na maneira como mostrado na Tabela 5, e adicionados à água para preparar água da matéria- prima para o meio líquido. O farelo de cevada usado foi o único recuperado de uma etapa de perolização para 70 % de cevada polida (Stirling, fabricada na Austrália), e conteve cascas de cevada e farelo. As células de levedura usadas foram células de levedura de cerveja por si só (isto é, as células de levedura preparadas no Exemplo 3) obtidas desidratando-se levedura de cerveja recuperada de uma etapa de preparar cerveja a um teor de água de cerca de 70 % por meio de centrifugação. Como o controle, água da matéria- prima sem adição foi usada.

Cevada bruta foi adicionada à água da matéria-prima preparado com as combinações como mostrado na Tabela 5 em uma concentração de 2 % (p/vol). Fungos koji brancos foram inoculados ao meio líquido da mesma maneira como aqueles no Exemplo 1 para conduzir cultura líquida. Atividade de glicoamilase e atividade α-amilase estável em ácido naquele meio líquido foram determinadas, respectivamente, da mesma maneira. Tabela 5 e FIG. 5 mostram os resultados.

[Tabela 5)

<table>table see original document page 30</column></row><table>

o: um lote experimental ao qual 0,2 % (p/vol) de nitrato de

potássio e 0,3 % (p/vol) de diidrogeno de fosfato de potássio foram adicionados.

Como mostrado na Tabela 5 e FIG. 5, tanto a atividade de glicoamilase quanto a atividade α-amilase estável em ácido foram extremamente altas em todos os lotes experimentais, quando comparado àqueles no lote de controle (isto é, lote Nfi 1) sem adição. Em particular, em lote experimental N2 4, as atividades de ambas as enzimas foram extremamente altas, e o equilíbrio foi bom. A partir dos resultados, foi considerado que o uso combinado do farelo de cevada com as células de levedura melhorou o equilíbrio de nutrição no meio líquido, desse modo os fungos vivamente filamentosos produziram as enzimas.

Deve ser observado que o uso combinado do farelo de cevada ou células de levedura com a substância de nitrogênio inorgânico e sal inorgânico (isto é, lotes N- 8 e N- 9) mostrou bom resultado.

Exemplo 6

Adição em combinação de cascas de cevada e células de levedura

Nitrato de potássio, diidrogeno de fosfato de potássio, cascas de cevada, e células de levedura foram combinados em uma maneira como mostrado na Tabela 6, e adicionados à água bruta para preparar água da matéria-prima para o meio líquido. As cascas de cevada usadas foram aquelas obtidas peneirando-se farelo de cevada obtido de uma etapa de perolização para 70 % de cevada polida com uma peneira de malha de 2 mm, e depois recuperando apenas cascas de cevada. Além disso, a levedura comprimida usada foi células de levedura de cerveja por si só (isto é, as células de levedura preparadas no Exemplo 3) obtidas desidratando-se a levedura de cerveja recuperada de uma etapa de preparar cerveja a um teor de água de cerca de 70 % por meio de centrifugação. Como o controle, água bruta sem adição (isto é, lote N- 1) foi usada.

Cevada bruta foi adicionada à água da matéria-prima preparado com as combinações como mostrado na Tabela 6 em uma concentração de 2 % (p/vol). Fungos koji brancos foram inoculados ao meio líquido da mesma maneira como aqueles no Exemplo 1 para conduzir cultura líquida. Atividade de glicoamilase e atividade α-amilase estável em ácido naquele meio líquido foram determinadas, respectivamente. Tabela 6 e FIG. 6 mostram os resultados.

[Tabela 6]

<table>table see original document page 31</column></row><table> Como mostrado na Tabela 6 e FIG. 6, tanto a atividade de glicoamilase quanto a atividade α-amilase estável em ácido foram extremamente altas em todos os lotes experimentais, quando comparado àqueles no lote de controle (isto é, lote Nfi 1) sem adição. Em particular, em lotes experimentais Nfi 6 a N2 9, as atividades de ambas as enzimas foram extremamente altas, e o equilíbrio foi bom. A partir dos resultados, foi considerado que o uso combinado das cascas de cevada com as células de levedura melhorou o equilíbrio de nutrição no meio líquido, desse modo os fungos vivamente filamentosos produziram as enzimas.

Exemplo 7

Efeito de adicionar sal de sulfato em produção de koji líquido Koji líquido foi produzido pelo método descrito abaixo, e a atividade enzimática deste foi determinada.

.1. Método de pré cultura .8 g de 65 % de cevada polida (Stirling, fabricada na Austrália) e 100 ml de água foram enchidos em um frasco cônico abafado de 500 ml e submetido à autoclave a 121° C durante 15 minutos. Depois de ser esfriado, fungos koji brancos (Aspergillus kawachii NBRC4308) foram inoculados a 1 χ 106/ml no meio de pré cultura e cultivados agitando-se a 37° C e 100 rpm durante 24 horas. O meio foi definido como meio de pré cultura.

.2. Método de cultura principal

.100 ml de meio líquido foi preparado respectivamente como cinco lotes experimentais, cada um contendo 2,0 % (p/vol) de 98% de cevada polida (cevada bruta, Stirling, fabricada na Austrália), 0,2 % (p/vol) de nitrato de potássio, 0,3 % (p/vol) de diidrogeno de fosfato de potássio, 0,1 % (p/vol) de sulfato de magnésio heptaidratado, e 0,082 % (p/vol) de cloreto de magnésio hexaidratado na razão de composição como mostrado na Tabela 7. Estes cinco meios líquidos foram respectivamente enchido em um frasco cônico abafado de 500 ml e submetido à autoclaves a 121° C durante 15 minutos para esterilizar.

Depois de ser esfriado, 1 ml do líquido de pré cultura foi inoculado ao meio da cultura principal, e o conjunto foi cultivado agitando-se a 37° C e 100 rpm durante 48 horas. Observe que a quantidade de adição de cloreto de magnésio hexaidratado foi calculada da concentração molar correspondente a OjI % de sulfato de magnésio heptaidratado, isto é, 8,12 mM, de modo que as concentrações de magnésio dos meios em cada lote experimental tornam-se iguais.

[Tabela 7]

<table>table see original document page 33</column></row><table>

3. Método de determinar atividade enzimática

Depois da conclusão da cultura, atividades de glicoamilase (GA) e α-amilase estável em ácido (ASAA) que foram enzimas amilolíticas foram determinadas.

A atividade de glicoamilase (GA) foi determinada usando-se um kit de quantificação parcial de produção de sacarificação (fabricado pela Kikkoman).

Para determinar a atividade α-amilase estável em ácido (ASAA), o método descrito em Sudo S. et ah J. Ferment. Bioeng.,76, 105 - 110 (1993), SudoS. et ah J. Ferment. Bioeng., 77, 483 - 489 (1994), e Shigetoshi Sudo et ah Journal of the Brewing Society of Japan, 89, 768 - 774(1994) foi levemente modificado. Isto é, a atividade α-amilase instável em ácido foi inativada tratando-se o produto de cultura com ácido, e depois a atividade α-amilase estável em ácido foi medida com o kit de medição de a- amilase (fabricado pela Kikkoman). Para ser mais específico, 9 ml de uma solução tampão de ácido acético de 100 mM (pH 3) foi adicionada a 1 ml de solução de cultura, e tratamento ácido foi conduzido a 37° C durante 1 hora, e depois medido com o kit de medição de α-amilase (fabricado pela Kikkoman).

Ao mesmo tempo, atividade de celulase (CEL) que é uma enzima celulolítica e atividade de carboxipeptidase ácida (ACP) que é um de enzimas proteolíticas foram determinadas.

A atividade celulase (CEL) foi medida pelo método de quantificar uma quantidade do sacarídeo reduzido, que é gerado hidrolisando- se carboximetil celulose (CMC) como um substrato, com o método de ácido dinitrossalicílico (DNS). Para ser mais específico, 1 ml da solução de cultura foi adicionado a 1 ml de 1 % de solução de substrato CMC (viscosidadeR baixa produzida pela Sigma-Aldrich foi dissolvida em uma solução tampão de ácido acético de 100 mM (pH 5)), e o conjunto foi submetido à reação enzimática a 40° C precisamente durante 10 minutos. Depois disso, à mistura foi adicionado 4 ml do reagente DNS contendo 0,75 % de ácido dinitrossalicílico, 1,2 % de hidróxido de sódio, 22,5 % de tartrato de sódio e potássio tetraidratado e 0,3 % de lactose monoidratada, e o conjunto foi bem misturado, para desse modo concluir a reação. De modo a quantificar a quantidade de sacarídeo reduzido na solução concluída de reação, a solução concluída de reação foi aquecida em um banho de água em ebulição precisamente durante 15 minutos. Subseqüentemente, depois da solução ser esfriada até a temperatura ambiente, absorbância a 540 nm foi determinada, para desse modo quantificar a quantidade do sacarídeo reduzido correspondente à glicose. Uma unidade de atividade celulase (CEL) foi representada pela quantidade de enzima necessária para produzir sacarídeo reduzido correspondente a 1 μmol de glicose por minuto.

A atividade carboxipeptidase ácida (ACP) foi determinada usando-se um kit de medição de carboxipeptidase ácida (fabricado pela Kikkoman).

FIG. 7 mostra os resultados da determinação. 4. Resultados

Como mostrado na FIG. 7A, a atividade de glicoamilase foi significantemente melhorada em lote experimental 2 que é o lote ao qual sulfato de magnésio foi adicionado. Além disso, como mostrado nas FIGS. 7C e 7D, atividades de celulase e carboxipeptidase ácida também foram melhoradas em lote experimental 2 que é o lote ao qual sulfato de magnésio foi adicionado. Por outro lado, a atividade não foi melhorada em lote experimental 3 ao qual cloreto de magnésio, que é um tipo dos mesmos sais de magnésio foi adicionado, desse modo foi sugerido que um radical sulfato servisse como uma razão principal para estes efeitos vantajosos na produtividade da enzima.

Além disso, os efeitos vantajosos na produtividade da enzima não foram observados em lotes experimentais 4 e 5 aos quais sulfato de magnésio foi adicionado mas nenhum nitrato de potássio nem diidrogeno de fosfato de potássio. Conseqüentemente, foi descoberto que a produtividade da enzima foi notavelmente melhorada quando sais de nitrato, sais de fosfato e sais de sulfato foram incorporados ao mesmo tempo.

Como descrito acima, quando fungos koji são cultivados usando-se meio líquido a que são adicionados os cereais dos quais superfície é coberta com cascas (por exemplo, cevada bruta), sais de nitrato, sais de fosfato e sais de sulfato, pode haver koji líquido produzido contendo celulase com rendimento alto que é uma enzima celulolítica e carboxipeptidase ácida que é uma enzima proteolítica além de enzimas necessárias para produzir shochu e semelhantes tais como glicoamilase e α-amilase estável em ácido.

Devido ao rendimento alto das enzimas celulolíticas, diminuição na viscosidade de mistura ou aumento no rendimento de álcool durante a produção de shochu podem ser esperados, e se componentes de aminoácido na mistura de shochu forem aumentados devido ao rendimento alto das enzimas proteolíticas, shochu com flavor esplendoroso pode ser produzido.

Além disso, de acordo com o método da presente invenção, é esperado que as enzimas produzidas por fungos koji, tais como as enzimas amilolíticas, enzimas celulolíticas e enzimas proteolíticas outras do que aquelas determinadas aqui, são no geral produzidas com rendimento alto.

Aplicabilidade industrial

De acordo com a presente invenção, é possível que não apenas a produtividade de enzimas amilolíticas em koji líquido seja significantemente melhorada, mas koji líquido contendo enzimas celulolíticas e enzimas proteolíticas com rendimento alto, seja produzido. Além disso, cultura líquida pode estritamente controlar quando comparada à cultura sólida, desse modo koji líquido tendo estabilidade de qualidade pode ser eficientemente produzido a baixo custo.

Usando-se o koji líquido produzido de acordo com a presente invenção para produzir alimentos e bebidas fermentados tais como shochu, rendimentos de álcool e quantidades de produção de aminoácido podem ser aumentadas, por meio do qual alimentos e bebidas fermentados cada um tendo flavor esplendoroso podem eficientemente ser produzidos.

Além do mais, os cereais usados na presente invenção são não polidos ou polidos a uma extensão em que pelo menos cascas permanecem na superfície. Assim, melhora em disponibilidade da matéria-prima e em rendimento pode ser esperada.

Claims

1. Método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar fungos koji brancos e/ou fungos koji pretos em meio líquido contendo uma fonte de nitrogênio usando-se o cereal do qual a superfície é inteira ou parcialmente coberta com cascas, como matéria-prima de cultura.

2. Método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de nitrogênio compreende um sal de nitrato.

3. Método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a fonte de nitrogênio compreende pelo menos uma selecionada do grupo que consiste de células de levedura ou produtos tratados destas, cascas de cereal e farelo de cereal, ou uma mistura destes e um sal de nitrato.

4. Método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio líquido contém o sal de nitrato em uma concentração de 0,05 a 2,0 % (p/vol).

5. Método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o meio líquido contém ainda um sal de fosfato.

6. Método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio líquido contém o sal de fosfato em uma concentração de 0,05 a 1,0 % (p/vol).

7. Método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o meio líquido contém ainda um sal de sulfato.

8. Método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o meio líquido contém o sal de sulfato em uma concentração de 0,01 a 0,5 % (p/vol).

9. Método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a enzima compreende uma ou duas ou mais selecionadas do grupo que consiste de uma enzima amilolítica, uma enzima celulolítica e uma enzima proteolítica.

10. Método de produzir koji líquido tendo atividade realçada de uma enzima de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o cereal compreende arroz, trigo, cevada, trigo sarraceno, milhete japonês, setaria, painço, sorgo Chinês ou milho.

11. Koji líquido, caracterizado pelo fato de que é obtido pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 10.

12. Método de produzir uma preparação de enzima, caracterizado pelo fato de que compreende usar o koji líquido como definido na reivindicação 11.

13. Preparação de enzima, caracterizada pelo fato de que é obtida pelo método de produção como definido na reivindicação 12.

14. Método de produzir uma enzima, caracterizado pelo fato de que compreende produzir a enzima cultivando-se fungos koji brancos e/ou fungos koji pretos em meio líquido contendo uma fonte de nitrogênio e o cereal do qual a superfície é inteira ou parcialmente coberta com cascas como matéria-prima de cultura.

15. Método de produzir uma enzima de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a fonte de nitrogênio compreende um sal de nitrato.

16. Método de produzir uma enzima de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a fonte de nitrogênio compreende pelo menos uma selecionada do grupo que consiste de células de levedura, produtos tratados deste, cascas de cereal e farelo de cereal, ou uma mistura destes e um sal de nitrato.

17. Método de produzir uma enzima de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o meio líquido contém o sal de nitrato em uma concentração de 0,05 a 2,0 % (p/vol).

18. Método de produzir uma enzima de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o meio líquido contém um sal de fosfato.

19. Método de produzir uma enzima de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o meio líquido contém o sal de fosfato em uma concentração de 0,05 a 1,0 % (p/vol).

20. Método de produzir uma enzima de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o meio líquido contém ainda um sal de sulfato.

21. Método de produzir uma enzima de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o meio líquido contém o sal de sulfato em uma concentração de 0,01 a 0,5 % (p/vol).

22. Método de produzir uma enzima de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a enzima compreende uma ou duas ou mais selecionadas do grupo que consiste de uma enzima amilolítica, uma enzima celulolítica e uma enzima proteolítica.

23. Método de produzir uma enzima de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o cereal como matéria-prima compreende arroz, trigo, cevada, trigo sarraceno, milhete japonês, setaria, painço, sorgo Chinês ou milho.