BRPI0613694A2 - métodos de determinação da farmacocinética de terapias de objetivo - Google Patents

Abstract

MéTODOS DE DETERMINAçãO DA FARMACOCINéTICA DE TERAPIAS DE OBJETIVO. A presente invenção refere-se a métodos para a determinação da farmacocinética de terapias objetivadas utilizando técnicas de detecção de massa.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS DEDETERMINAÇÃO DA FARMACOCINÉTICA DE TERAPIAS DE OBJETIVO".

PEDIDOS RELACIONADOS.

É reivindicada prioridade do Pedido Provisório de Patente US N960/695.419, arquivado em 1 de julho de 2005, que é aqui incorporado pelareferência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO.

A presente invenção refere-se geralmente aos métodos de de-terminação das propriedades farmacocinéticas das terapias dirigidas (porexemplo, imunoconjugados) pela utilização de técnicas de sensibilidade àmassa.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO.

As macromoléculas sintéticas e naturais se tornaram terapiasestabelecidas no tratamento do câncer. Os anticorpos provaram sua eficáciaclínica quando administrados como um anticorpo livre ou não-conjugado, oucomo um conjugado anticorpo/fármaco. Dê acordo com uma última aborda-gem, um agente terapêutico é ligado a um anticorpo com especificidade deligação para uma população definida de células-alvo. Os agentes terapêuti-cos que foram conjugados aos anticorpos monoclonais incluem citotoxinas,modificadores de resposta biológica, enzimas (por exemplo, ribonucleases),proteínas e peptídios de indução de apoptose e radioisótopos.

A liberação de fármaco mediado por anticorpo para as célulasde tumor aumenta a eficácia do fármaco minimizando sua absorção em teci-dos normais. Veja, por exemplo, Reff et al. (2002) Câncer Control 9:152-66;Sievers (2000) Câncer Chemother. Phamacol. 46 Suppl:S18-22; Goldenberg(2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39:195-201. MYLOTARG® (gemtuzumabde ozogamicina) é uma imunoterapia dirigida comercialmente disponível quetrabalha de acordo com esse princípio e que está aprovada para o tratamen-to da leucemia mieloide aguda em pacientes idosos. Veja Sievers et al.,(1999) Blood 93: 3678-3684. Nesse caso, a molécula alvo é um anticorpoanti-CD33 monoclonal que é conjugado à caliqueamicina. Os Exemplos adi-cionais incluem o ibritumomab tiuxetan (ZEVALIN®) e o tositumomab(BEXXAR®), que são os anticorpos anti-CD20 radiorrotulados. Veja Dillman,Clin. Exp. Med., 2006, 6(1):1-12.

Independente do progresso no desenvolvimento de novas tera-pias dirigidas por anticorpo, as características fisiológica que conferem umnível terapêutico favorável na clínica ainda não são bem compreendidas. Osensaios bioquímicos simples (por exemplo, a afinidade do anticorpo por seuantígeno) não predizem necessariamente a eficácia. Veja Graff & Wittrup,Câncer Res., 2003, 63(6):1288-1296. Os parâmetros biológicos in vivo talcomo a meia-vida de circulação, as taxas da distribuição nos tecidos e a taxade degradação do conjugado podem ser mais úteis na comparação do po-tencial de eficácia terapêutica destas moléculas. Entretanto, as experiênciaspré-clínicas projetadas para avaliar estes parâmetros são difíceis de realizarporque requerem tipicamente um grande número de experimentos animais eradiorrotulação de conjugado.

Para abordar a necessidade de métodos de predição da eficáciaclínica, a presente invenção fornece ensaios de ressonância do plasmôniopara a caracterização farmacocinética das terapias dirigidas seguindo suaadministração a um paciente. Os ensaios aqui descritos detectam precisa-mente e com reprodutividade quantidades de moléculas alvo e de conjuga-dos molécula alvo/fármaco em um único e mínimo volume de amostra. Ba-seado nesta determinação, a meia-vida de circulação dos conjugados molé-cula alvo/fármaco, as taxas da degradação conjugado e a estabilidade doligante podem ser monitoradas em um paciente.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO.

A presente invenção fornece métodos de determinação de umaquantidade de moléculas alvo e uma quantidade de conjugados moléculaalvo/fármaco em uma amostra. Em uma modalidade representativa da pre-sente invenção, o método compreende as etapas de: (a) fornecer um supor-te sólido compreendendo uma superfície na qual um alvo é imobilizado; (b)fornecer uma amostra compreendendo diversos conjugados molécula al-vo/fármaco; (c) contactar a amostra com o alvo imobilizado na superfície dosuporte sólido; (d) detectar a formação na superfície do suporte sólido de umprimeiro complexo de ligação (i) da molécula alvo e (ii) o alvo na superfíciedo suporte sólido, em que a formação do primeiro complexo de ligação cau-sa uma primeira alteração mensurável na propriedade da massa do suportesólido indicando uma quantidade de moléculas alvo na amostra; (e) contac-tar o primeiro complexo de ligação com um agente de ligação do fármacoque se liga especificamente com o fármaco do conjugado molécula al-vo/fármaco; e (f) detectar a formação na superfície do suporte sólido de umsegundo complexo de ligação (i) do agente de ligação do fármaco com (ii) oprimeiro complexo de ligação, em que a formação do segundo complexo deligação causa uma segunda alteração mensurável na propriedade da massado suporte sólido indicando uma quantidade de conjugados molécula al-vo/fármaco na amostra.

Os métodos de determinação de uma quantidade de conjugadosmolécula alvo/fármaco em uma amostra podem também compreender asetapas de: (a) fornecer um suporte sólido compreendendo uma superfície naqual um primeiro complexo de ligação é imobilizado, em que o complexo deligação compreende (i) um alvo e (ii) um conjugado molécula alvo/fármacoligados ao alvo; (b) contactar um agente de ligação do fármaco que liga es-pecificamente o fármaco do conjugado molécula alvo/fármaco com o primei-ro complexo de ligação imobilizado na superfície do suporte sólido; e (c) de-tectar a formação de um segundo complexo de ligação (i) do agente de liga-ção do fármaco com (ii) o primeiro complexo de ligação na superfície do su-porte sólido, em que a formação do complexo causa uma alteração mensu-rável na propriedade da massa do suporte sólido indicando uma quantidadedo conjugado molécula alvo/fármaco na amostra.

Em um outro aspecto de acordo com a presente invenção, sãofornecidos os métodos de determinação de uma quantidade média de su-primento do fármaco por molécula alvo. Por exemplo, um método de deter-minação do suprimento do fármaco de conjugados molécula alvo/fármacoem uma amostra pode compreender as etapas de: (a) fornecer um suportesólido em que são ligados os conjugados molécula alvo/fármaco de umaamostra; (b) determinar uma quantidade de fármaco na amostra medindouma alteração na propriedade da massa de um suporte sólido quando daligação de um agente de ligação do fármaco, que liga especificamente ofármaco do conjugado molécula alvo/fármaco, com os conjugados moléculaalvo/fármaco na superfície do suporte sólido; e (c) calcular uma quantidademédia de fármaco por conjugados molécula alvo/fármaco dividindo a quanti-dade do fármaco de (b) por uma quantidade de moléculas alvo na amostra.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS.

A Figura 1 mostra um sensograma de um método de detecçãopor sanduíche. Na primeira fase da curva (entre as setas 1 e 2), a amostrado conjugado de anticorpo/caliqueamicina foi corrido sobre um excesso deantígeno imobilizado. Uma segunda fase (entre as setas 3 e 4) foi iniciadaadicionando um anticorpo anticaliqueamicina. A Resposta 1 indica a adiçãode massa proporcional à concentração do anticorpo na amostra, e a Respos-ta 2 é proporcional à quantidade de caliqueamicina no conjugado de anticor-po/caliqueamicina. O termo RU, são unidades de ressonância; e os círculoscinzentos, são períodos de lavagem.

As Figuras 2A-2B mostram a correlação entre a quantidade deanticorpo ou de conjugado de anticorpo/fármaco e a concentração de amos-tras padrão. A Figura 2A é um sensograma mostrando unidades de resso-nância em função do tempo para cada uma das concentrações indicadas(ng/ml) de hP67.6-AcBut-CalichDMH. A Figura 2B é um gráfico de linha mos-trando unidades de ressonância em função da concentração do anticorpo dehP67.6-AcBut-CalichDMH + de anticaliqueamicina (círculo cheio preto),hP67.6-ÁcBut-CalichDMH (círculo cheio cinzento), e anticorpo anticaliquea-micina (círculo vazio).

As Figuras 3A-3C mostram as concentrações no plasma dahP67.6-AcBut-CalichDMH determinada usando um método de detecção porsanduíche tal como descrito nos Exemplos 3 e 4. Cada animal recebeu o con-jugado de anticorpo/fármaco para uma dose total de 3 pg de caliqueamicina. Éindicada a dose de conjugado anticorpo/fármaco expressa em mg/kg. As linhascontínuas representam animais veículos de tumor de Ramos positivo para oCD22; as linhas pontilhadas representam camundongos livres de tumor.A Figura 3A mostra a Resposta 1, isto é, a ligação da hP67.6 eda hP67.6-AcBut-CalichDMH, com o antígeno CD33 imobilizado em um chipCM5.

A Figura 3B mostra a Resposta 2, isto é, a ligação do anticali-queamicina ao hP67.6-acBut-CalichDMH já ligado ao CD33 imobilizado emum chip CM5. As cinéticas da hP67.6-AcBut-CalichDMH no plasma são simi-lares nos animais veículos de tumor e em animais livres de tumor.

A Figura 3C mostra a proporção da Resposta 2 em relação àResposta 1. A concentração decrescente do conjugado de anticorpo/fármacocomo uma fração da concentração da porção de anticorpo do conjugado an-ticorpo/fármaco indica a liberação preferencial do conjugado versus um anti-corpo não-conjugado.

A Figura 4 é um gráfico de linha mostrando unidades de resso-nância em função da concentração de G5/44-AcBut-CalichDMH (ozogamici-na do inotuzumab) + anticorpo anticaliqueamicina (círculo cheio preto),G5/44-AcBut-CalichDMH (círculo cheio cinzento), e anticorpo anticaliquea-micina (círculo vazio).

As Figuras 5A-5C mostram as concentrações no plasma daG5/44-AcBut-CalichDMH determinadas usando um método de detecção desanduíche tal como descrito nos Exemplos 3 e 5. O anticorpo G5/44 anti-CD22 foi suprido com 72 pg de caliqueamicina por mg de anticorpo e cadaanimal recebeu o conjugado anticorpo/fármaco para uma dose total de 3 pgde caliqueamicina. As linhas contínuas representam animais sofrendo detumor de Ramos positivo para o CD22; as linhas pontilhadas representamcamundongos livres de tumor.

A Figura 5A mostra a Resposta 1, isto é, a ligação da G5/44 eda G5/44-AcBut-CalichDMH com o antígeno CD22 imobilizado em um chipCM5.

A Figura 5B mostra a Resposta 2, isto é, a ligação do anticali-queamicina com a G5/44-acBut-CalichDMH já ligada ao CD22 imobilizadoem um chip CM5. A presença do tumor de Ramos positivo para o CD22 (li-nhas contínuas) diminuiu a concentração média do anticorpo G5/44 e doconjugado 65/44-AcBUt-CaliChDMH no plasma.

A Figura 5C mostra a relação da Resposta 2 relativo à Resposta1. A concentração decrescente do conjugado de anticorpo/fármaco comouma fração da concentração da porção do anticorpo do conjugado de anti-corpo/fármaco indica a liberação preferencial do conjugado contra anticorponão-conjugado. A remoção do caliqueamicina do anticorpo não foi influenci-ada pela presença do tumor de CD22-positive Ramos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO.

A presente invenção fornece métodos de caracterização de a-mostras compreendendo composições para uma terapia dirigida, isto é, umamolécula alvo conjugada diretamente ou indiretamente a um fármaco. Asamostras que contêm conjugados molécula alvo/fármaco podem incluir al-gumas proporções de partes constituintes (isto é, molécula alvo não-conjugada e fármaco livre), por exemplo, em conseqüência de conjugaçãoincompleta, da degradação do conjugado, etc. Em geral, a molécula alvonão-conjugada e o fármaco livre, individualmente, possuem eficácia limitadae podem contribuir para a toxicidade ao paciente. Conseqüentemente, é im-portante a monitoração da progressão em pacientes que recebem terapiasdirigidas, suprimento de fármaco e a concentração de conjugados moléculaalvo/fármaco (em vez das partes constituintes). Os métodos descritos forne-cem tal determinação, que pode ser usada para avaliar parâmetros farmaco-cinéticos de um conjugado molécula alvo/fármaco, tais como a absorção, adistribuição, o metabolismo e a excreção após a administração a um paciente.

Em comparação aos métodos anteriores, a presente descriçãodescreve o uso de uma técnica sensível à massa para detectar os conjuga-dos molécula alvo/fármaco, em que tais conjugados são lábeis. A concentra-ção de conjugados molécula alvo/fármaco pode ser determinada precisa-mente no soro e/ou no local do alvo para avaliar a meia-vida na circulação, aestabilidade do ligante, e uma quantidade do fármaco que é liberada no localao qual foi dirigida. Uma única, amostra de pequeno volume pode ser usadapara executar seqüencialmente etapas de múltipla detecção em uma mesmaamostra, que permite o cálculo do suprimento do fármaco no conjugado mo-lécula alvo/fármaco.

I. Conjugados Molécula alvo/Fármaco.

As moléculas alvo que podem ser usadas nos métodos descritosincluem qualquer molécula que mostre uma ligação específica a um alvo. Aligação específica se refere a uma afinidade entre duas moléculas que resul-ta na ligação preferencial em uma amostra heterogênea. A ligação é caracte-rizada geralmente por uma afinidade de pelo menos aproximadamente de10'7 M ou mais elevada, tal como de pelo menos aproximadamente 10'8 Mou mais elevada, ou de pelo menos aproximadamente 10"9 M ou mais eleva-da, ou de pelo menos aproximadamente 10"11 M ou mais elevada, ou de pelomenos aproximadamente 10'12 M ou mais elevada.

Moléculas alvo incluem também qualquer molécula que, depoisda administração a um paciente, se liga seletivamente às células que ex-pressam o alvo. O termo "alvo" se refere ao movimento e/ou ao acúmulopreferencial in vivo de uma molécula em um local do alvo (por exemplo, célu-las ou tecidos) em comparação com um local de controle. Um local do alvocompreende as células que expressam um alvo, isto é, um local pretendidopara o acúmulo da molécula alvo ou do conjugado molécula alvo/fármaco.

Um local de controle compreende células em que falta substancialmente aexpressão do alvo e que conseqüentemente faltam substancialmente a liga-ção e/ou o acúmulo de uma molécula alvo administrada ou de conjugadosmolécula alvo/fármaco. A ligação seletiva se refere geralmente a uma locali-zação preferencial de um conjugado molécula alvo/fármaco de tal modo queuma quantidade de moléculas alvo em um local do alvo é aproximadamente2 vezes maior do que uma quantidade de moléculas alvo em um local decontrole, ou aproximadamente 5 vezes maior, ou aproximadamente 10 vezesmaior ou ainda mais.

Moléculas alvo representativas incluem anticorpos, proteínas,peptídios, miméticos de peptídio, ácidos nucléicos de peptídio (PNAs), oligo-nucleotídios, ligantes, lecitinas, e todas as outras moléculas que se ligamespecificamente e/ou seletivamente a um alvo.Os alvos ligados por moléculas alvo estão associados geralmen-te com um estado doentio, um estado suscetível da doença, ou uma condi-ção que necessite de tratamento. Os alvos representativos incluem antíge-nos, haptenos, proteínas, peptídios, receptores, oligonucleotídios, carboidra-tos, e todas as outras moléculas expressadas em níveis elevados por célulasde um local do alvo. Um alvo está preferivelmente presente na superfíciecelular ou de outro modo acessível para as moléculas alvo. Um local do alvopode estar localizado, em um local tal como um tumor sólido, ou não estarlocalizado como em doenças malignas do sangue. Por exemplo, um local doalvo pode compreender as células que expressam os antígenos associadoscom tumor (TAA), os antígenos expressados em outras células malignas,nas células imunes que contribuem para a inflamação, na alergia, na autoi-munidade, etc.

Em um aspecto de acordo com a presente invenção, a moléculaalvo é um anticorpo e a invenção se refere a caracterizar as amostras com-preendendo imunoconjugados, isto é, conjugados de anticorpo/fármaco. Aporção do anticorpo de um conjugado de anticorpo/fármaco pode compreen-der qualquer tipo de anticorpo, incluindo, por exemplo, os anticorpos que têma estrutura tetramérica (por exemplo, similar aos anticorpos naturais), ou aqualquer outra estrutura possuindo de pelo menos uma região variável decadeia leve da imunoglobulina ou de pelo menos uma região de cadeia pe-sada da imunoglobulina, ou fragmentos das mesmas, ligados a antígenos(por exemplo, Fab, Fab modificado, Fab', F(ab')2 ou fragmentos de Fv). Osmétodos descritos podem também ser usados para caracterizar os conjuga-dos preparados usando anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados, di-acorpos, anticorpos de cadeia simples, anticorpos tetravalentes, e/ou anti-corpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos).

Para a preparação de terapias direcionadas anticâncer, os antí-genos associados a tumor foram identificados por se ligarem especificamen-te às células de câncer dos tumores sólidos, tais como do carcinoma depulmão escamoso/adenomatoso (carcinoma das células não-pequenas dopulmão), do carcinoma invasivo do seio, do carcinoma colo-retal, do carci-noma gástrico, do carcinoma cervical escamoso, do adenocarcinoma endo-metrial invasivo, do carcinoma invasivo do pâncreas, do carcinoma ovariano,do carcinoma vesical escamoso, e do coriocarcinoma. Os antígenos para aterapia dirigida de doenças malignas hematológicas podem também ser al-vos úteis do fármaco, por exemplo, para o tratamento dos Iinfomas e dasleucemias, tais como incluindo, mas não-limitado aos Iinfomas de grau infe-rior/folicular não de Hodgkin (NHL), NHL pouco linfocitária (SL), NHL de grauintermediário/folicular, NHL difuso de grau intermediário, NHL imunoblásticode grau elevado, NHL linfoblástico de grau elevado, NHL de célula pequenanão-clivada de grau elevado, NHL de doença disseminada e a macroglobuli-nemia de Waldenstrom, leucemia leucocitária crônica, leucemia mielogenosaaguda, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocitária crônica, leucemiamielogenosa crônica, leucemia linfoblástica, leucemia linfocitária, leucemiamonocítica, leucemia mielogenosa, e leucemia promielocítica.

Os anticorpos representativos que podem ser usados prepararconjugados de anticorpo/fármaco para a terapia dirigida incluem os anticor-pos anti-5T4, anticorpos anti-CD19, anticorpos anti-CD20 (por exemplo, Rl-TUXAN®, ZEVALI N®, BEXXAR®), anticorpos anti-CD22, anticorpos anti-CD33 (por exemplo, MYLOTARG®), anticorpos Y anti-Lewis (por exemplo,Hu3S193, Mthu3S193, AGmthu3S193), anticorpos anti-HER-2 (por exemplo,HERCEPTIN® (trastuzumab), MDX-210, OMNITARG® (pertuzumab, rhuMAb2C4)), anticorpos anti-CD52 (por exemplo, CAMPATH®), anticorpos anti-EGFR (por exemplo, ERBITUX® (cetuximab), ABX-EGF (panitumumab)),anticorpos anti-VEGF (por exemplo, AVASTIN® (bevacizumab)), anticorposcomplexos anti-DNA/histona (por exemplo, ch-TNT-1/b) anticorpos anti-CEA(por exemplo, CEA-Cide, YMB-1003), hLM609, anti-CD47 (por exemplo,6H9), anticorpos anti-VEGFR2 (ou receptor contendo o domínio de inserçãoda quinase, KDR) (por exemplo, IMC-1C11), anticorpos Ep-CAM (por exem-plo, ING-1), anticorpos anti-FAP (por exemplo, sibrotuzumab), anticorposanti-DR4 (por exemplo, TRAIL-R), anticorpos anti-receptor da progesterona(por exemplo, 2C5), anticorpos anti-CA19.9 (por exemplo, GIVAREX®), eanticorpos do antifibrina (por exemplo, MH-1).Tal como aqui utilizado, o termo "um fármaco se refere a" se re-fere a qualquer substância que possua atividade biológica ou detectável, porexemplo, os agentes terapêuticos, agentes de ligação, etc, bem como ospró-fármacos, que são metabolizados em um agente ativo in vivo. O termofármaco inclui também derivados do fármaco, em que um fármaco foi funcio-nalizado para permitir a conjugação com uma molécula alvo.

O fármaco pode ser ligado à molécula alvo diretamente ou indi-retamente, mas a ligação é tal que é compatível com a preservação do efeitoterapêutico da porção fármaco. O ligante pode ser estável ou hidrolisável, equalquer técnica apropriada para ligar o fármaco ao anticorpo pode ser usa-da. Por exemplo, as hidrazidas e outros nucleófilos podem conjugados aosaldeídos gerados pela oxidação dos carboidratos que ocorrem naturalmentenos anticorpos. Os conjugados contendo hidrazona podem ser feitos pelaintrodução de grupos carbonila que fornecem as propriedades desejadas deliberação do fármaco. Os conjugados podem também ser feitos com um li-gante possuindo um dissulfeto em uma extremidade, em uma cadeia alquilano meio, e um derivado da hidrazina na outra extremidade. Outros Iigantesrepresentativos são os ligantes reativos ao tiol tais como ésteres, amidas,aceto/acetais e Iigantes sensíveis ao pH, tais como cis-aconitatos, que pos-suem um ácido carboxílico justaposto a uma ligação amida. Os Iigantes po-dem também incluir agentes solubilizantes tais como o PEG para limitar aagressão dos conjugados molécula alvo/fármaco. Os ligantes peptídios tam-bém podem ser usados.

Os fármacos representativos incluem agentes anticâncer, taiscomo agentes citotóxicos, agentes quimioterapêuticos, agentes imunomodu-ladores, agentes antiangiogênico, agentes antiproliferativos, agentes pró-apoptóticos, enzimas e proteínas bioativas. Um fármaco também pode com-preender um ácido nucléico terapêutico, tal como um gene codificando umagente imunomodulador, um agente antiangiogênico, um agente antiprolife-rativo ou um agente pro-apoptótico. Estes descriptores do fármaco não sãomutuamente exclusivos, e assim um agente terapêutico pode ser descritousando um ou mais dos termos acima descritos. Os agentes terapêuticospodem ser preparados como sais, ácidos ou derivados farmaceuticamenteaceitáveis de quaisquer das formas acima. Além disso, os conjugados po-dem ser feitos usando veículos secundários como um agente citotóxico, talcomo lipossomas ou polímeros, por exemplo.

O termo agente citotóxico se refere geralmente a um agente queinibe ou impede o funcionamento das células e/ou que resulta na destruiçãodas células. Os agentes citotóxicos representativos incluem os antibióticos,os inibidores da polimerização da tubulina, agentes alquilantes que ligamcom e rompem o DNA, e os agentes que quebram a síntese da proteína ou ofuncionamento de proteínas celulares essenciais tais como as proteínas qui-nase, fosfatases, topoisomerases, enzimas, e ceclinas. Por exemplo, os a-gentes citotóxicos incluem, mas não estão limitados a, doxorrubicina, dau-norrubicina, idarrubicina, aclarrubicina, zorrubicina, mitoxantrona, epirrubici-na, carrubicina, nogalamicina, menogaril, pitarrubicina, valrubicina, cytarabi-na, gemcitabina, trifluridina, ancitabina, enocitabina, azocitidina, doxifluridina,pentostatin, broxuridina, capecitabina, cladribina, decitabina, floxuridina, flu-darabina, gougerotin, puromicina, tegafur, tiazofurina, adriamicina, cisplatina,carboplatina, ciclofosfamida, dacarbazina, vinblastina, vincristina, mitoxan-trona, bleomicina, mecloretamina, prednisona, procarbazina, metotrexato,fluorouracilas, etoposídio, taxol, análogos do taxol, platinas tais como cis-platinas e carbo-platinas, mitomicina, tiotepa, taxanos, vincristina, daunorru-bicina, epirrubicina, actinomicina, autramicina, azoserinas, bleomicinas, ta-moxifen, idarubicina, dolastatinas/auristatinas, hemiasterlinas, esperamicinase maitansinóides.

Em aspectos particulares da presente invenção, os conjugadosmolécula alvo/fármaco caracterizados usando os métodos aqui descritoscompreendem uma porção de um fármaco antobiótico tal como uma cali-queamicina, chamada também de complexo LL-E33288, por exemplo, a ga-ma-caliqueamicina ou um derivado menos potente, a N-acetil gama-caliqueamicina. Veja Patente US N9 4.970.198. Exemplos adicionais das ca-liqueamicinas apropriadas para o uso em candidatos molécula alvo/fármacosão descritos nas Patentes US N9 4.671.958; 5.053.394; 5.037.651;5.079.233; e 5.108.912; que são aqui incorporados em suas totalidades. Osanálogos do dissulfeto de caliqueamicina podem também ser usados, porexemplo, os análogos descritos nas Patentes US N9 5.606.040 e 5.770.710,que são cada uma aqui incorporadas em suas totalidades. As técnicas re-presentativas para a preparação de conjugados anticorpo/caliqueamicina talcomo determinado no Exemplo 1, são descritos na Patente US N95.712.374; 5.714.586; 5.773.001; e 5.877.296; na Publicação de Patente USN9 2004-0082764-A1 e 2006-0002942-A1; e na Publicação PCT Ne WP2005/089809; que são cada uma aqui incorporadas em suas totalidades.

Os agentes imunomoduladores que podem ser usados parapreparar conjugados molécula alvo/fármaco incluem os anti-hormônios queobstruem a ação de hormônio em tumores e os agentes imunossupressoresque evitam a produção da citoquina, sub-regulam a expressão do auto-antígeno ou os antígenos mascarados MHC. Os representantes anti-hormônios incluem os anti-estrogênios que incluem, por exemplo, tamoxife-no, raloxifeno, 4(5)-imidazóis que inibem a aromatase, 4-hidroxitamoxifeno,trioxifeno, queoxifeno, LY 117018, onapnstona e toremifeno; e antiandrogê-nios tais como a flutamida, a nilutamida, a bicalutamida, o Ieuprolidio e a go-serelina; e agentes antiadrenais. Os agentes imunossupressores representa-tivos incluem as 2-amino-6-aril-5-pirimidinas substituídas, a azotioprina, aciclofosfamida, a bromocriptina, o danazol, a dapsona, o glutaraldeído, anti-corpos antiidiotípicos para antígenos MHC e fragmentos MHC, ciclosporinaA, esteróides tais como glicocorticoesteróides, citoquina ou antagonistas dosreceptores da citoquina (por exemplo, anticorpos anti-interferon, anticorposanti-IL10, anticorpos anti-TNFa, anticorpos anti-IL2), estreptoquinase, TGF3,rapamicina, receptor da célula Tf fragmentos do receptor da célula T, e anti-corpos do receptor da célula T.

Os agentes antiangiogênicos representativos incluem inibidoresda formação de vasos sangüíneos, por exemplo, inibidores do farnesiltrans-ferase, inibidores da COX-2, inibidores de VEGF, inibidores do bFGF, inibi-dores da esteróide sulfatase (por exemplo, bis-sulfamato de 2-metoxioestradiol (2-MeOE2bisMATE)), interleucina-24, trombospondina, pro-teínas da metalospondina, interferons da classe l, interleucina 12, protamina,angiostatina, laminina, endostatina, e fragmentos da prolactina.

Os agentes antiproliferativos e os agentes pro-apoptóticos inclu-em ativadores da PPAR-gama (por exemplo, ciclopentenona prostaglandinas(cyPGs)), retinóides, triterpinóides (por exemplo, cicloartano, lupano, ursano,oleanano, friedelano, damarano, cucurbitacina e triterpenóides do limonói-de), inibidores do receptor da EGF (por exemplo, HER4), rampamicina,CALCITRIOL® (1,25-diidroxicolecalciferol (vitamina D)), inibidores da aroma-tase (FEMARA® (Ietrozona)), inibidores da telomerase, quelantes do ferro(por exemplo, 3-aminopiridina-2-carboxaldeído da tiosemicarbazona (Triapi-ne)), apoptina (proteína viral 3 - VP3 do vírus da anemia da galinha), inibido-res da Bcl-2 e da bcl-X(L), TNF-alfa, Iigante FAS, Iigante de indução da a-poptose relacionado com a TNF (TRAIL/Apo2L), ativadores da sinalizaçãoda TNF-alpha/do Iigante FAS/do Iigante de indução da apoptose relacionadocom a TNF (TRAIL/Apo2L), e inibidores de sinalização da via da sobrevivên-cia da PI3K-Akt (por exemplo, UCN-01 e geldanamicina).

Os agentes quimioterapêuticos representativos incluem agentesde alquilação tais como a tiotepa e a ciclosfosfamida; sulfonatos de alquilatais como bussulfan, improssulfan e pipossulfan; aziidinas tais como a ben-zodopa, a carboquona, a meturedopa, e a uredopa; etileniminas e metilame-Iaminas incluindo a altretamina, a trietilenomelamina, a trietilenofosforamida,a trietilenotiofosforamida e a trimetilolomelamina; mostardas do nitrogêniotais como a clorambucil, a clornafazina, a colofosfarnida, estramustina, ifos-famida, mequioretamina, cloridrato do óxido de mequioretamina, melfalan,novembiquina, fenésterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda da uracila;nitrosouréias tais como o carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina,nimustina, ranimustina; antibióticos tais como aclacinomisinas, actinomicina,autramicina, azasserina, bleomicinas, cactinomicina, caliqueamicinas, cara-bicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorru-bicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorrubicina, epirrubicina,esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico,nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelami-cina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex,zinostatina, zorrubicina; antimetabólitos tais como o metotrexato e a 5-fluorouracila (5-FU); análogos do ácido fólico tais como a denopterina, meto-trexato, pteropterina, trimetrexato; análogos da purina tais como o fludarabi-na, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos da pirimidina tais co-mo a ancitabina, azacitidina, 6-azouridina, carmofur, citarabina, didesoxiuri-dina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-EU; androgênios tais como acalusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testo-lactona; antiadrenais como a aminoglutatimida, mitotano, trilostano; reabas-tecedor de ácido fólico tal como o ácido frolínico; aceglatona; glicosídio daaldofosfarnida; ácido aminolevulínico; amsacrina; bestrabucil; bisantreno;edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato do elip-tínio; etoglucídio; nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinan; lonidamina; mitogua-zona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarrubi-cina; ácido podofilínico; 2-etilidrazida; procarbazina; razoxano; sizofirano;espirogermânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2'-triclorotrietilamina;uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipo-bromano; gacitosina; arabinosídio (Ara-C); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides,por exemplo paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncologia de Prince-ton, Nova Jersey) e doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer de An-tony, França); clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; meto-trexato; análogos da platina tais como a cisplatina e a carboplatina; vinblasti-na; platina; etoposídio (VP-16); ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vin-cristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposídio; daunomicina; aini-nopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inibidor da topoisomerase RFS2000; difluorometilornitina (DMFO); ácido retinóico; esperamicinas; e capeci-tabina.

Os agentes terapêuticos adicionais que podem ser conjugados amoléculas alvo e que podem ser caracterizados usando os métodos aquidescritos incluem agentes fotossensibilizantes (Publicação de Patente US N52002/0197262 e Patente US N9 5.952.329) para a terapia fotodinâmica; par-tículas magnéticas para termoterapia (Publicação de Patente US Ns2003/0032995); agentes de ligação, tais como peptídios, ligantes, Iigantes deaderência célular, etc, e pró-fármacos tais como os pró-fármacos contendofosfato, pró-fármacos contendo tiofosfato, pró-fármacos contendo sulfato,pró-fármacos contendo peptídio, pró-fármacos contendo β-lactama, pró-fármacos contendo fenoxiacetamida substituída ou pró-fármacos contendofenilacetamida substituída, o 5-fluorocitosina e outros pró-fármacos da 5-fluorouridina que podem ser convertidas ao fármaco livre citotóxica mais ativa.

II. Farmacocinéticas dos conjugados molécula alvo/fármaco.

A presente invenção fornece métodos de determinar o supri-mento do fármaco de uma molécula alvo, por exemplo, determinar se a rea-ção de conjugação conseguiu um nível de suprimento do fármaco compre-endendo uma dose eficaz, isto é, uma quantidade suficiente de conjugadomolécula alvo/fármaco para promover uma resposta biológica desejada, epara manter a consistência batelada-por-batelada de conjugados moléculaalvo/fármaco comercialmente produzidos. Para avaliar a liberação do fárma-co ou a estabilidade dos conjugados molécula alvo/fármaco, o suprimento dofármaco também pode ser avaliado depois da administração a um paciente,por exemplo, usando uma amostra de sangue do paciente.

Tal como aqui descrito, uma quantidade de conjugados molécu-la alvo/fármaco pode ser calculada a partir das determinações separadas de(i) uma quantidade de moléculas alvo e de (ii) uma quantidade de conjuga-dos molécula alvo/fármaco na mesma amostra. As etapas (i) e (ii) são maiscompletamente descritas abaixo sob os subtítulos ILA e ILB, respectivamen-te. Veja também a Figura 1. Resumidamente, o método inclui uma medidade duas respostas consecutivas. Uma primeira resposta determina o númerode unidades de ressonância após ter contatado uma amostra que contenhaos conjugados molécula alvo/fármaco sobre um dispositivo sensível à mas-sa, tal como um chip BIACORE®, com o alvo imobilizado reconhecido pelamolécula alvo do conjugado. Esta resposta é proporcional à soma da molé-cula alvo livre (não-conjugada) e conjugada na amostra. Uma segunda res-posta é obtida depois que seqüencialmente se contactar um agente de liga-ção do fármaco com as moléculas alvo livres (não-conjugadas) e conjugadaspresas ao alvo imobilizado no mesmo dispositivo sensível à massa. Estasegunda resposta é proporcional à quantidade do fármaco presente na a-mostra na forma de conjugado molécula alvo/fármaco.

De acordo com os métodos descritos, qualquer técnica adequa-da de detecção de massa pode ser usada. As tecnologias representativasconhecidas na técnica incluem métodos piezoelétricos, óticos, termo-óticos,da superfície da onda acústica (SERRA), bem como métodos eletroquími-cos, tais como métodos potenciométrico, voltamétrico, condutimétrico, ampe-rimétrico e da capacitância.

Os métodos óticos que podem ser usados incluem métodos pa-ra detectar a concentração de massa superficial (ou o índice de retração),tais como métodos óticos de reflexão, incluindo métodos internos e externosde reflexão, por exemplo, elipsometria e espectroscopia de onda evanescen-te (EWS), esse último método incluindo a ressonância do plasmônio da su-perfície (SPR), refratometria angular de Brewster, refratometria angular críti-ca, reflexão total frustrada (FTR), elipsometria de onda evanescente, refle-xão interna total dispersada (STIR), sensores óticos da guia da onda, ondaevanescente baseada em imagem, tal como a imagem de resolução do ân-guio crítico, imagem de resolução do ângulo de Brewster, imagem de resolu-ção do ângulo de SPR, etc., assim como os métodos baseados na fluores-cência evanescente (TIRF) e na fosforescência.

Por exemplo, para se estimar a constante de equilíbrio de umamolécula alvo em uma amostra, a seguinte técnica de detecção de massapode ser usada. Primeiramente, uma série de concentrações (por exemplo,O, 100 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, e 1000 ng/ml) da moléculaalvo é preparada e injetada seqüencialmente em um biossensor possuindoum chip sensor operacionalmente associado ao mesmo, sendo que o ditochip sensor possui uma referência da superfície de detecção e de pelo me-nos uma referência da superfície de detecção com alvo imobilizado. Sãomedidas as respostas relativas dos níveis de ligações no estado de equilíbriopara cada concentração da molécula alvo. Devido às contribuições de volu-me do índice de retração dos aditivos solventes no tampão de corrida dobiossensor, pode ser calculado um fator de correção (através de procedi-mentos conhecidos de calibração) a ser aplicado para produzir respostasrelativas corrigidas. As respostas relativas corrigidas para cada concentra-ção de molécula alvo são avaliadas então matematicamente tal como é a-preciado por aqueles versados na técnica de estimativa da constante de e-quilíbrio da molécula alvo.

Em um aspecto particular da presente invenção, a técnica dedetecção de massa é a ressonância do plasmônio da superfície, que podeser executada usando um equipamento da BIACORE® (Biacore AB da Upsá-lia, Suécia). O aparelho e o fundamento teórico estão descritos em Johnsonet al., BioTechniques, 1991, 11:620-627. Esta técnica envolve a imobilizaçãode um primeiro associador de ligação de um par Iigante a um chip sensor,fazer o contacto do chip sensor com uma amostra contendo um segundoassociador de ligação do par ligante, e medindo então uma alteração resul-tante nas características óticas de superfície do chip sensor.

Em geral, um suporte sólido compreende um revestimento ma-triz de hidrogel ligado à parte superior da superfície do suporte sólido, emque o revestimento matriz de hidrogel possui diversos grupos funcionais.Para uso com um instrumento de BIACORE®, o suporte sólido está preferi-velmente na forma de um chip sensor, em que o chip sensor tem um elétronmetálico livre interposto entre a matriz do hidrogel e a superfície superior. Osmetais com elétrons livres adequados para essa finalidade incluem o cobre,a prata, o alumínio e o ouro.

Em um aspecto particular da presente invenção, o método podecompreender as etapas de: (a) fornecer um suporte sólido compreendendouma superfície na qual um alvo é imobilizado; (b) fornecer uma amostracompreendendo diversos conjugados molécula alvo/fármaco; (c) contactar aamostra com o alvo imobilizado na superfície do suporte sólido; (d) detectara formação na superfície do suporte sólido de um primeiro complexo de liga-ção da (i) molécula alvo e (ii) alvo na superfície do suporte sólido, no qual aformação do primeiro complexo de ligação causa uma primeira alteraçãomensurável na propriedade da massa do suporte sólido indicando umaquantidade de moléculas alvo na amostra; (e) contactar o primeiro complexode ligação com um anticorpo antifármaco ou antifragmento de ligação dofármaco; e (f) detectar a formação na superfície do suporte sólido de um se-gundo complexo de ligação do (i) anticorpo antifármaco ou antifragmento deligação do fármaco com o (ii) primeiro complexo de ligação, no qual a forma-ção do segundo complexo de ligação causa uma segunda alteração mensu-rável na propriedade da massa do suporte sólido indicando uma quantidadede conjugados molécula alvo/fármaco na amostra.

Em um outro aspecto de acordo com a presente invenção, ummétodo de determinação de uma quantidade média de suprimento do fárma-co através de um anticorpo em uma amostra de conjugados molécula al-vo/fármaco pode compreender as etapas de: (a) fornecer um suporte sólidoem que os conjugados molécula alvo/fármaco de uma amostra estão Iiga-dos; (b) determinar a quantidade de fármaco na amostra medindo uma alte-ração na propriedade da massa de um suporte sólido quando da ligação deum anticorpo antifármaco, ou antifragmento de ligação do fármaco, aos con-jugados molécula alvo/fármaco presos na superfície do suporte sólido; e (c)calcular uma quantidade média de fármaco por conjugados molécula al-vo/fármaco dividindo a quantidade do fármaco em (d) pela quantidade demoléculas alvo na amostra. Quando considerado como uma função do tem-po durante a administração a um paciente, este método é útil para avaliar aestabilidade da meia-vida circulante de um conjugado molécula alvo/fármacocom o ligante.

Usando os métodos descritos, os conjugados molécula al-vo/fármaco foram detectados em amostras de soro em um nível de 100 a1.000 η g/m I de molécula alvo. Tal como descritos nos Exemplos 4 e 5, osvalores do PK dos conjugados molécula alvo/fármaco foram, de forma re-produzida, determinados em amostras individuais. A presença de um tumorexpressando um alvo reduziu a meia-vida circulante de um conjugado molé-cula alvo/fármaco com especificidade para o alvo, mas não teve nenhumefeito no meia-vida circulante de um conjugado molécula alvo/fármaco pos-suindo especificidade diferente. Compare as Figuras 5B e 3B, respectiva-mente. A redução da meia-vida circulante pode ser atribuída à retenção doconjugado molécula alvo/fármaco na presença de um alvo adequado.

IIA. Métodos de determinação de uma Quantidade de Moléculas alvo emuma Amostra Compreendendo os Conjugados Molécula alvo/Fármaco.

A presente invenção fornece métodos para a determinação deuma quantidade de moléculas alvo em uma amostra compreendendo diver-sos conjugados molécula alvo/fármaco. Em um aspecto particular da presen-te invenção, o método compreende as etapas de (a) fornecer um suportesólido compreendendo uma superfície na qual um alvo é imobilizado; (b) for-necer uma amostra compreendendo diversos conjugados molécula al-vo/fármaco; (c) contactar a amostra com o alvo imobilizado na superfície dosuporte sólido; e (d) detectar a formação de um complexo de ligação das (i)moléculas alvo na amostra com (ii) o alvo na superfície do suporte sólido, emque a formação do complexo de ligação causa uma alteração mensurável napropriedade da massa do suporte sólido.

As amostras representativas que podem ser usadas de acordocom os métodos descritos incluem a preparação de conjugados de moléculaalvo/fármaco, isto é, uma amostra compreendendo uma reação de conjuga-ção entre uma molécula alvo e um fármaco, que pode incluir uma moléculaalvo conjugada, molécula alvo não-conjugada e o fármaco livre. Como amos-tras obtidas de um paciente após a administração de anticorpos ao pacientetambém podem ser usados, por exemplo, o sangue, o soro, ou amostras deurine. A amostra pode compreender um volume líquido mínimo, tal comomenos do que aproximadamente 100 μl, ou menos do que aproximadamente50 μl, ou menos do que aproximadamente 25 μl, ou menos do que aproxi-madamente 10 μl, ou menos do que aproximadamente 5 μl. Maiores volu-mes de amostra podem ser usados aumentar a sensibilidade. Uma amostratambém pode compreender um extrato líquido preparado de uma amostra detecido, tal como um tumor. Por exemplo, uma amostra pode ser preparadade um carcinoma escamoso/adenomatoso de pulmão (carcinoma do pulmãoda célula não pequena), do carcinoma invasivo do seio, do carcinoma colo-retal, do carcinoma gástrico, do carcinoma cervical escamoso, do adenocar-cinoma endometrial invasivo, do carcinoma invasivo do pâncreas, do carci-noma ovariano, do carcinoma vesical escamoso, do coriocarcinoma, ou dosoutros carcinomas dos brônquios, dos seios, do cólon, do reto, do estômago,do colo do útero, do endométrio, do pâncreas, do ovário, do córion, e da ve-sícula seminal.

MB. Métodos de determinação de uma Quantidade de fármaco em uma A-mostra Compreendendo Conjugados de Molécula alvo/Fármaco.

Para determinação de uma quantidade de fármaco em uma a-mostra, conjugados molécula alvo/fármaco são ligados a um chip de detec-ção de massa, e um agente de ligação do fármaco que se liga especifica-mente à porção do fármaco do conjugado molécula alvo/fármaco é usadopara detectar os conjugados. Um agente de ligação do fármaco pode com-preender um anticorpo antifármaco ou antifragmento de ligação do fármaco.Os agentes de ligações representativos adicionais incluem proteínas, peptí-dios, miméticos do peptídio, ácidos nucléicos do peptídio (PNAs), ligantes,ou qualquer outra molécula que seja capaz de se ligar especificamente auma porção do fármaco tal como descrito aqui.

Por exemplo, o método pode compreender as etapas de (a) for-necer um suporte sólido compreendendo uma superfície em que um primeirocomplexo de ligação é imobilizado, em que o complexo de ligação compre-ende (i) um alvo tal como aqui descrito e (ii) um conjugado molécula al-vo/fármaco ligado ao alvo; (b) contactar um anticorpo antifármaco ou anti-fragmento de ligação do fármaco com o primeiro complexo de ligação imobi-lizado na superfície do suporte sólido; e (c) detectar a formação de um se-gundo complexo de ligação do (i) anticorpo antifármaco ou antifragmento deligação do fármaco e do (ii) primeiro complexo de ligação na superfície dosuporte sólido, em que a formação do complexo causa uma alteração men-surável na propriedade da massa do suporte sólido indicando uma quantida-de de conjugados da molécula alvo/fármaco, na amostra.

Alternativamente, o método pode compreender as etapas de (a)fornecer um suporte sólido compreendendo uma superfície em que um anti-corpo antifármaco ou antifragmento de ligação do fármaco é imobilizado; (b)contactar uma amostra compreendendo conjugados molécula alvo/fármacocom o anticorpo antifármaco ou ou antifragmento de ligação do fármaco i-mobilizado na superfície do suporte sólido; e (c) detectar uma alteraçãomensurável na propriedade de massa do suporte sólido indicando umaquantidade de conjugados molécula alvo/fármaco, na amostra.

Um anticorpo que é usado para detectar a porção do fármaco doconjugado molécula alvo/fármaco pode ser qualquer anticorpo mostrandouma ligação específica, isto é, se ligando preferivelmente ao fármaco quan-do o fármaco é apresentada em uma amostra que contem outros antígenos.O anticorpo pode ser policlonal ou monoclonal. Os anticorpos antifármacopossuindo baixas falhas nas taxas fornecem a maior sensibilidade. Quandose estiver usando os anticorpos antifármaco possuindo moderadas falhasnas taxas, as correções para o ruído de fundo podem ser usadas para quan-tificar os conjugados molécula alvo/fármaco com sensibilidade reduzida.

Os métodos para preparar e caracterizar os anticorpos antifár-maco são bem-conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, Harlow & Lane,Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1988. Astécnicas adicionais e os reagentes úteis para gerar e selecionar uma biblio-teca da exposição de anticorpos podem ser encontrados, por exemplo, naPatente US Ne 5.223.409, e nos Pedidos Internacionais de Publicação dePatente PCT N9. WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690, e WO 90/02809.

Resumidamente, um anticorpo policlonal é preparado imunizan-do um animal com um antígeno compreendendo um fármaco tal como aquidescrita, e coletando o anti-soro daquele animal imunizado. Uma ampla vari-edade de espécies animais pode ser usada para a produção dos anti-soros,por exemplo, coelhos, camundongos, camundongos, hamster, porcos-da-índia, cabras, e cavalos.

Como é bem-conhecido na técnica, o antígeno pode ser ligadocom um veículo, tal como uma hemocianina de molusco ciclídeo (KLH) ealbuminas do soro (por exemplo, BSA), para melhorar a imunogenicidade.As técnicas para conjugar um antígeno a um polipeptídio do veículo sãobem-conhecidas na técnica e incluem o glutaraldeído, o éster m-maleimidobencoil-N-hidroxissuccinimida, a carbodiimida e a benzidina bis-biazotada. A imunogenicidade de um antígeno também pode ser realçadapelo uso de adjuvantes, por exemplo, do adjuvante completo de Freund, deadjuvantes incompletos de Freund, e do adjuvante hidróxido de alumínio.

A quantidade de imunógeno usada para a produção de anticor-pos policlonais varia dependendo da natureza do antígeno, do animal usadopara imunização e da via de administração (por exemplo, subcutânea, intra-muscular, intradérmica, intravenosa ou intraperitoneal). A produção de anti-corpos policlonais é monitorada nas amostras de sangue do animal imuniza-do em vários pontos depois da imunização. Quando é obtido um título dese-jado de anticorpo, o animal imunizado é sangrado e o soro é isolado e arma-zenado.

Um anticorpo monoclonal antifármaco para uso nos métodosaqui descritos pode rapidamente ser preparado com o uso de técnicas bem-conhecidas tais como aquelas exemplificadas na Patente US Ne 4.196.265.Por exemplo, os camundongos ou camundongos são imunizados com umfármaco por um período suficiente para obter uma resposta imune, e as célu-las esplênicas do animal imunizado são então fundidas com as células imor-tais do mieloma. As células fundidas são separadas da mistura de célulasprogenitoras não-fundidas, por exemplo, pela adição novamente de agentesque obstruem a síntese do nucleotídio aos meios de cultura (por exemplo,aminopterina, metotrexato e azoserina). Os hibridomas individuais são culti-vados e os sobrenadantes são testados para a reatividade com o antígenodo fármaco. Os clones selecionados podem ser propagados indefinidamentecomo uma fonte de anticorpo monoclonal.

Como forma de um exemplo específico, para produzir um anti-corpo da antifármaco tal como descrito aqui, os camundongos são injetadosintraperitonialmente com aproximadamente de 1 a 200 pg de um antígenocompreendendo um fármaco de um conjugado molécula alvo/fármaco. Ascélulas do linfócito B são estimuladas a crescer injetando-se o fármaco emassociação com um adjuvante tal como o adjuvante de Freund completo.Conforme seja necessário, camundongos são ativados pela injeção comuma segunda dose do fármaco misturado com o adjuvante de Freund in-completo. Algumas semanas após a segunda injeção, os camundongos sãocauda sangrada e o soro é titulado por imunoprecipitação. As etapas de ati-vação e de titulação são repetidas até que seja conseguido um título ade-quado. O baço do camundongo é removido, os linfócitos do baço são isola-dos, e as células do mieloma são combinadas com os linfócitos do baço sobcondições apropriadas para a fusão celular. As condições da fusão incluem,por exemplo, a presença do polietileno glicol. As células fundidas são sepa-radas das células não-fundidas do mieloma pelo cultivo em um meio de se-leção tal como oo meio HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Os hibri-domas resultantes são selecionados para a produção de anticorpos antifár-maco. Os clones selecionados são cultivados em volumes elevados para seconseguir quantidades adequadas de anticorpos. Os anticorpos podem serpurificados por cromatografia de afinidade ou por outros métodos, tal como éconhecido na técnica.

EXEMPLOS.

Os seguintes exemplos foram incluídos para ilustrar modalida-des da presente invenção. Determinados aspectos desses exemplos sãodescritos em termos das técnicas e dos procedimentos encontrados ou con-templados pelos atuais co-inventores para trabalhar bem na prática da pre-sente invenção. Estes exemplos ilustram práticas padrão dos laboratóriosdos co-inventores. À luz da presente descrição e a nível geral da habilidadena técnica, aqueles que são versados apreciarão que os seguintes exemplospossuem a intenção de serem somente exemplificações e que as diversasalterações, modificações, e alterações podem ser empregadas sem se fugirdo alcance da presente invenção.

Exemplo 1.

Preparação dos Conjugados Anticorpo/Caliqueamicina.

A gemtuzumab ozogamicina e a inotuzumab ozogamicina sãoconjugados da caliqueamicina dos anticorpos anti-CD33 e anti-CD22,hP67.6 e G5/44, respectivamente. A gemtuzumab ozogamicina é o nomegenérico para o fármaco comercial MYLOTARG® e também é referida comohP67.6-AcBut-CalichDMH. O conjugado anti-CD22/caliqueamicina, inotuzu-mab ozogamicina, também conhecido como G5/44-acBut-CalichDMH, estáatualmente na fase I dos testes clínicos. Para obter estes conjugados, ohP67.6 e o G5/44 foram ligados a N-acetil gama calíqueamicina dimetil hi-drazida com o Iigante ácido lábil (ácido 4(4'-acetilfenóxi)butanóico) (AcBut).Os anticorpos foram supridos em uma densidade de aproximadamente 35pg de calíqueamicina por mg de hP67.6 e aproximadamente 73 pg de cali-queamicina por mg de G5/44. Os conjugados anti-Lewis Y/caliqueamicina eanti-5T4/caliqueamicina foram similarmente preparados e usados nos ensai-os descritos.Exemplo 2.

Administração dos Conjugados Anticorpo/Caliaueamicina.

A linhagem da célula Ramos (CRL-1923) foi obtida da coleçãoda cultura do tipo americano (ATCC). Ramos é uma linhagem celular CD22+,CD33" derivada da célula-B do Iinfoma humano. As células foram mantidasem culturas de suspensão em RPM11640 suplementadas com HEPES 10mM, piruvato de sódio 1 mM, glicose 0,2 % (p/v), penicilina G sódio 100U/ml, sulfato de estreptomicina 100 pg/ml e 10% (v/v) de soro bovino fetal.

Os camundongos pelados Balb/c com idades de 16 semanas(Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts) foram irradiadoscom 400 rad de raios gama. As células Ramos (107/200 μΙ) foram injetadasno flanco direito de cada camundongo. Após 8 dias, 10 camundongos comum tumor do tamanho de aproximadamente 0,5 cm3 (± s=0,16) foram sele-cionados. Quatro grupos do tratamento foram criados: (1) os camundongosportadores de tumor tratados com hP67.6-AcBut-CalichDMH, (2) os camun-dongos livres de tumor tratados com hP67.6-AcBut-CalichDMH, (3) os ca-mundongos portadores de tumor tratados com o G5/44-AcBut-CalichDMH, e(4) os camundongos livres de tumor tratados com o G5/44-AcBut-CalichDMH. Dois dias antes da administração dos conjugados anticor-po/caliqueamicina, uma amostra do sangue de 5 μΙ foi retirada de cada ca-mundongo. Uma única dose de 150 μΙ do conjugado anticor-po/caliqueamicina (3 pd de caliqueamicina por camundongo) foi injetada naveia lateral da cauda. Amostras de sangue de exatamente 5 μΙ foram retira-das em 24, 48, 72, e 96 horas depois disso. Para obter a reprodutividade deamostragens de pequenos volumes, os camundongos foram mantidos sobuma lâmpada do aquecimento até que as veias da cauda se tornaram visí-veis. A cauda foi desinfetada com álcool isopropílico a 70%, e a veia lateralda cauda foi perfurada com uma agulha. A gota do sangue resultante foi as-pirada então com um capilar montado em um micropipetador (Drummond ofBroomall, Pensilvânia) pré-ajustado para um volume de aspiração de 5 μΙ.Esta amostra de sangue foi transferida imediatamente para um tubo de en-saio contendo 195 μΙ da seguinte mistura: 0,01 M HEPES (pH 7,4); 0,15 MNaCI, EDTA a 3 mM, 0,005% tensoativo P20 (tampão de HBS-EP, disponí-veis pela Biacore de Upsália, Suécia).

Exemplo 3.

Ensaio Tipo Sanduíche para Detecção da Ressonância do Plasmônio.

Um ensaio tipo sanduíche para detecção da ressonância doplasmônio foi desenvolvido para determinar em uma amostra do soro (1)uma quantidade de moléculas alvo e de conjugados molécula alvo/fármacoem uma amostra, e (2) uma quantidade de fármaco presente nos conjuga-dos de molécula alvo/fármaco da mesma amostra. O princípio deste métodoé ilustrado na Figura 1. O ensaio permite uma avaliação da liberação dosconjugados molécula alvo/fármaco. O método não-discrimina entre uma re-dução do fármaco em todas as moléculas conjugadas e a geração de umafração de anticorpo não-conjugado.

As análises descritas aqui foram executadas em um equipamen-to da BIACORE® (Biacore International AB da Upsália, Suécia) usando con-jugados de anticorpo/caliqueamicina. O sistema de detecção deste equipa-mento se baseia na medida das alterações do índice de refração causadaspela interação das macromoléculas em chips bio-sensores. Veja por exem-plo, Johns et al., J. ImunoL Methods, 1993,160(2): 191-198; Karlson et al., J.ImunoL Methods, 1991, 145(1-2):229-240.Os antígenos foram imobilizados na superfície de um chip bio-sensor CM5 em uma densidade de 4.000 a 9.000 unidades de ressonân-cia/célula de fluxo. O chip foi ativado pelo reagente de acoplamento 1 -etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida-HCI/N-hidroxissuccinimida em uma taxade fluxo de 5 μΙ/minuto por 6 minutos, seguidos pela adição dos antígenos.Os antígenos de Lewis-BSA foram supridos contactando o chip com 50pg/ml de proteína em uma solução de 10 mM de acetato de sódio (pH 4,0 a4,5) em uma taxa de fluxo de 5 μΙ/minuto por 6 minutos. Os CD33 ouCD22Fc foram ligados covalentemente aos chips CM5 pelo contato do chipcom 0,1 mg/ml de proteína em uma solução a 10 mM de acetato de sódio(pH 5) em uma taxa de fluxo de 2 μΙ por o minuto por 30 minutos. O chip foientão lavado com HBS-EP contendo 300 mM NaCI.

Depois da imobilização do antígeno em um chip CM5, as curvasde calibração foram estabelecidas para cada antígeno. Como um resultadorepresentativo, as Figuras 2A-2B mostram a correlação entre a concentraçãode amostras padrão e o número de unidades de ressonância quando da li-gação do conjugado anti-CD33/caliqueamicina hP67.6-acBut-CalichDMH.Um coeficiente de correlação de aproximadamente 1,0 permite a determina-ção exata da quantidade total de anticorpo e da quantidade de caliqueamici-na ligada ao anticorpo. Usando as curvas de calibração, foi determinada aconcentração da porção anticorpo de um conjugado de anticorpo/fármaco nosoro.

Depois disso pelo contato do chip com um anticorpo anticalique-amicina, a quantidade de caliqueamicina presente na amostra do soro foitambém determinada. Tal como demonstrado pela ausência de uma segun-da resposta na Figura 2B, o anticorpo não-conjugado nas mesmas concen-trações não reage ao anticorpo anticaliqueamicina. Este resultado fornece aevidência para a especificidade da segunda resposta para a presença dacaliqueamicina no anticorpo.

A resposta após a ligação do conjugado ao CD33 por si próprio(hP67.6-AcBut-CalichDMH) bem como seguido por uma resposta secundária(hP67.6-AcBut-CalichDMH + anticaliqueamicina) foi linear (^=0,9996 er2=O,9994, respectivamente) para uma faixa de concentração de conjugadoentre 0 e 500 ng/ml. A diferença dessas respostas (isto é, as unidades deressonância atribuíveis à ligação do anticaliqueamicina) também é linear(r2=O,9947) dentro desta faixa. Os coeficientes da regressão por mínimosquadrados dessas funções foram maiores do que 0,99 quando foi usadauma faixa da concentração de 0 a 1000 ng/ml. A interpolação usando umaequação quadrática de unidades de ressonância traçada em função da con-centração permite a determinação exata da concentração do conjugado anti-corpo/fármaco em uma amostra contendo entre 0 e 1000 ng/ml do conjuga-do de anticorpo/fármaco. Uma estratégia similar foi usada para estabeleceras curvas de calibração que descrevem (1) a relação entre as unidades deressonância e a concentração de anticorpo G5/44 anti-CD22 e 65/44-AcBUt-CaliChDMH (ver Figura 4); e (2) a relação entre as unidades de ressonânciae a concentração do anticorpo G193 anti-Lewis Y e CMD193, um conjugadocom a caliqueamicina do mesmo. Essas relações foram também melhordescritas (r2>0,99) por uma equação quadrática para uma faixa da concen-tração entre 0 e 1000 ng/ml.

Exemplo 4.

Propriedades Farmacocinética dos Conjugados de Anti-CD33/Caliaueamicina.

As propriedades farmacocinética da hP67.6-AcBut-CalichDMHforam determinadas em camundongos portadores de tumor e livres de tu-mor. Cinco animais foram usados para cada grupo. Os camundongos porta-dores de tumor tiveram um peso corporal médio de 19 g (desvio padrão = 1g) e tiveram tumores Ramos xenoenxertados com um volume médio de 528mm3 (desvio padrão 102 mm3). Os camundongos livres de tumor teveram umpeso corporal médio de 20 g (desvio padrão = 1 g).

A Figura 3A mostra a concentração de hP67.6-AcBut-CalichDMH no plasma de camundongos pelados em vários pontos de tempoque se seguiram à injeção intravenosa de uma única dose do conjugado deanticorpo/fármaco. Uma dose de caliqueamicina de 3 pg foi administrada acada camundongo. A dose de anticorpo é indicada como de pg/kg de massacorporal. A concentração do conjugado de anticorpo/fármaco no plasma foicalculada pela correção para um hematócrito normal de 45%, e supôs-seque nenhum conjugado de anticorpo/fármaco estivesse ligado à fração celu-lar. Uma dose de caliqueamicina de 3 ug, que foi fornecida como 86 ug deconjugado do anticorpo/fármaco possuindo 35 pg de caliqueamicina por mgde anticorpo, é administrada em um volume do sangue de 1,5 ml (volumeaproximado do sangue de um camundongo de 20 g). Conseqüentemente,teoricamente se anteciparia 105 ug/ml como uma concentração máxima.Baseado em um volume de amostra do sangue de 5 μl, a concentração ex-perimental determinada do conjugado de anticorpo/fármaco após 20 minutosfoi de aproximadamente 80 ug/ml.

As quantidades de conjugado anticorpo/fármaco que foram ad-ministradas a cada camundongo variaram dependendo da massa real docorpo do animal. Dentro de uma faixa de 4,1 a 4,5 mg de conjugado anticor-po/fármaco por quilograma, a dose administrada não foi diretamente propor-cional à concentração máxima do conjugado no plasma. Além disso, os da-dos não indicaram que a variação da dose foi responsável por variações nameia-vida em circulação. Uma meia-vida excepcionalmente elevada na cir-culação foi observada em um único camundongo que recebeu uma dose de5 mg do conjugado anticorpo/fármaco por quilograma.

A quantidade de hP67.6 conjugada à caliqueamicina tem umameia-vida mais curta na circulação do que o anticorpo não-conjugado. Isto éilustrado na Figura 3C, mostrando uma concentração consistentemente de-crescente da caliqueamicina conjugada (Resposta 2) como uma fração doanticorpo-anticorpo-porção de hP67.6-AcBut-CalichDMH (Resposta 1). A areprodutibilidade da redução da caliqueamicina total ligada ao anticorpo nãofoi influenciada pela presença do tumor Ramos CD22+.

Exemplo 5.

Propriedades Farmacocinéticas dos Conjugados Anti-CD22/Caliaueamicina.

As propriedades farmacocinéticas do G5/44-AcBut-CalichDMHforam determinadas em camundongos portadores de tumor e em camun-dongos livres de tumor. Três camundongos portadores de tumor tiveram umpeso corporal médio de 19 g (desvio padrão = 1 g) e tiveram tumores Ramosxenoenxertados com um volume médio de 1276 mm3 (desvio padrão 398mm3). Seis camundongos livres de tumor tiveram um peso corporal médio de20 g (desvio padrão = 1 g). A administração de conjugados anti-CD22/caliqueamicina e o ensaio de ressonância do plasmônio da superfíciefoi realizado tal como descrito nos Exemplos 2, 3, e 4.

As curvas de calibração que descrevem a relação entre unida-des de ressonância e a concentração do anticorpo G5/44 e do conjugado deG5/44-AcBut-CalichDMH são mostradas na Figura 4. A relação foi melhordescrita (r>0,99) por uma equação quadrática para uma faixa da concentra-ção entre 0 e 1.000 ng/ml. Ver a Figura 4. Tal como para o hP67.6 não-conjugado, não foi observada uma resposta para a caliqueamicina livre como G5/44 não-conjugado.

A Figura 5A mostra uma concentração decrescente da porçãoanticorpo da G5/44-acBut-CalichDMH no plasma de camundongos portado-res de tumor e não-portadores de tumor. As concentrações da porção deanticorpo da G5/44-AcBut-CalichDMH (Figura 5A) e a quantidade de cali-queamicina ligada a G5/44 (Figura 5B) declinaram mais rapidamente emcamundongos portadores de tumor. Isto foi refletido pela diminuição dameia-vida circulante da G5/44-acBut-CalichDMH. Ver a Tabela I. A presençade um tumor que expressasse o alvo CD22 aumentou a remoção do conju-gado do plasma. O declínio da concentração da caliqueamicina em funçãodo tempo foi idêntico nos camundongos portadores de tumor e não-portadores de tumor (Figura 5C), indicando que a presença do tumor nãoinfluenciou na liberação da caliqueamicina da porção anticorpo do conjugado.Tabela I

<table>table see original document page 31</column></row><table>

AB = porção do anticorpo,

CM = caliqueamicina ligada ao anticorpo,

2T = meia-vida do plasma (h),

AUC = área sob a curva (h*Mg/ml),

CL = eliminação (ml/min/kg),

Vss = distribuição volumétrica (ml/kg).

Claims (26)

1. Método de determinação de uma quantidade de uma moléculaalvo e uma quantidade de um conjugado molécula alvo/fármaco em umaamostra, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:a) o fornecimento de um suporte sólido compreendendo umasuperfície na qual um alvo é imobilizado;b) o fornecimento de uma amostra compreendendo diversosconjugados molécula alvo/fármaco;c) o contato da mostra com o alvo imobilizado na superfície dosuporte sólido;d) detecção da formação na superfície do suporte sólido em umprimeiro complexo de ligação da (i) molécula alvo e (ii) o alvo na superfíciedo suporte sólido, em que a formação de um primeiro complexo de ligaçãocausa uma primeira alteração mensurável na propriedade da massa do su-porte sólido indicando uma quantidade da molécula alvo no mesmo;e) o contato do primeiro complexo de ligação com um agente deligação do fármaco que se liga especificamente com o fármaco do conjugadomolécula alvo/fármaco; ef) detecção da formação na superfície do suporte sólido de umsegundo complexo de ligação do (i) agente de ligação do fármaco e (ii) oprimeiro complexo de ligação, em que a formação do segundo complexo deligação causa uma segunda alteração no mensurável na propriedade damassa do suporte sólido indicando uma quantidade do conjugado moléculaalvo/fármaco no mesmo.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o alvo é expressado nas células de câncer ou em células envol-vendo uma resposta autoimune.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelofato de que o alvo expressado nas células de câncer é 5T4, CD19, CD20,CD22, CD33, Lewis Y1 HER-2, receptor Fg do tipo I para a imunoglobulina G(Fc gama RI), CD52, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR),fator do crescimento endotelial vascular (VEGF), complexo DNA/histona,antígeno carcinoembriônico (CEA)1 CD47, VEGFR2 (receptor 2 do fator decrescimento endotelial vascular ou receptor contendo o domínio de inserçãoda quinase, KDR), molécula de adesão da célula epitelial (Ep-CAM)1 proteí-na de reativação do fibroblasto (FAP)1 receptor de rastro I (DR4), receptor daprogesterona, antígeno oncofetal CA19.9, ou fibrina.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a molécula alvo é um anticorpo.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o fármaco é a caliqueamicina.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que o agente de ligação do fármaco é um anticorpo.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a amostra compreende um volume de aproximadamente 5 μΙ oumenos.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de que a amostra é uma amostra de sangue.

9. Método de determinação de uma quantidade de um conjuga-do molécula alvo/fármaco em uma amostra, caracterizado pelo fato de quecompreende as etapas de:a) fornecimento de um suporte sólido compreendendo uma su-perfície na qual um primeiro complexo de ligação é imobilizado, em que ocomplexo de ligação compreende (i) um alvo e (ii) um conjugado moléculaalvo/fármaco ligado ao alvo;b) contatar um agente de ligação do fármaco que liga especifi-camente o fármaco do conjugado molécula alvo/fármaco com o primeirocomplexo de ligação imobilizado na superfície do suporte sólido; ec) detecção da formação de um segundo complexo de ligaçãodo (i) agente de ligação do fármaco e o (ii) primeiro complexo de ligação nasuperfície do suporte sólido, em que a formação do complexo causa umaalteração mensurável na propriedade da massa do suporte sólido indicandouma quantidade do conjugado molécula alvo/fármaco na amostra.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que o alvo é expressado nas células de câncer ou em células envol-vendo uma resposta autoimune.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que o alvo expressado nas células de câncer é 5T4, CD19, CD20,CD22, CD33, Lewis Y, HER-2, receptor Fg do tipo I para a imunoglobulina G(Fc gama RI), CD52, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)1fator do crescimento endotelial vascular (VEGF)1 complexo DNA/histona,antígeno carcinoembriônico (CEA)1 CD47, VEGFR2 (receptor 2 do fator decrescimento endotelial vascular ou receptor contendo o domínio de inserçãoda quinase, KDR), molécula de adesão da célula epitelial (Ep-CAM), proteí-na de reativação do fibroblasto (FAP)1 receptor de rastro I (DR4), receptor daprogesterona, antígeno oncofetal CA19.9, ou fibrina.

12. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que a molécula alvo é um anticorpo.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que o fármaco é a caliqueamicina.

14. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que o agente de ligação do fármaco é um anticorpo.

15. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que a amostra compreende um volume de aproximadamente 5 μΙ oumenos.

16. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que a amostra é uma amostra de sangue.

17. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelofato de que a quantidade da molécula alvo na mostra é determinada pelamedição de uma alteração na propriedade da massa de um suporte sólidoquando da ligação dos conjugados molécula alvo/fármaco a um alvo imobili-zado na superfície do suporte sólido.

18. Método de determinação de uma quantidade média do fár-maco carregado por molécula alvo em uma amostra de conjugados moléculaalvo/fármaco, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:a) fornecimento de um suporte sólido no qual os conjugados mo-lécula alvo/fármaco de uma amostra são ligados;b) determinação de uma quantidade do fármaco em uma amos-tra pela medição de uma alteração na propriedade da massa de um suportesólido, quando da ligação de um agente de ligação do fármaco que especifi-camente liga o fármaco do conjugado molécula alvo/fármaco com os conju-gados molécula alvo/fármaco na superfície do suporte sólido e;c) cálculo da quantidade média do fármaco em um conjugadomolécula alvo/fármaco pela divisão da quantidade do fármaco no item (b) poruma quantidade da molécula alvo na mostra.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pe-lo fato de que o alvo é expressado nas células de câncer ou em células en-volvendo uma resposta autoimune.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pe-lo fato de que o alvo expressado nas células de câncer é 5T4, CD19, CD20,CD22, CD33, Lewis Y, HER-2, receptor Fg do tipo I para a imunoglobulina G(Fc gama RI), CD52, receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR),fator do crescimento endotelial vascular (VEGF), complexo DNA/histona,antígeno carcinoembriônico (CEA), CD47, VEGFR2 (receptor 2 do fator decrescimento endotelial vascular ou receptor contendo o domínio de inserçãoda quinase, KDR), molécula de adesão da célula eritelial (Ep-CAM), proteínade reativação do fibroblasto (FAP), receptor de rastro I (DR4), receptor daprogesterona, antígeno oncofetal CA19.9, ou fibrina.

21. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pe-lo fato de que a molécula alvo é um anticorpo.

22. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pe-lo fato de que o fármaco é a caliqueamicina.

23. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pe-lo fato de que o agente de ligação do fármaco é um anticorpo.

24. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pe-lo fato de que a amostra compreende um volume de aproximadamente 5 μΙou menos.

25. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pe-lo fato de que a amostra é uma amostra de sangue.

26. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pe-lo fato de que a quantidade da molécula alvo na mostra é determinada pelamedição de uma alteração na propriedade da massa de um suporte sólidoquando da ligação dos conjugados molécula alvo/fármaco a um alvo imobili-zado na superfície do suporte sólido.