BRPI0613849A2 - polipeptìdeo e sais ou ésteres farmaceuticamente aceitáveis, composição farmacêutica e uso do polipeptìdeo - Google Patents
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Abstract
POLIPEPTIDEO E SAIS ou éSTERES FARMACEUTICAMENTE ACEITAVEIS, COMPOSIçAO FARMACEUTICA E USO DO POLIPEPTIDEO. presente invenção refere-se a um fragmento do polipeptídeo Exendin-4, que tem uma atividade hipoglicêmica, e pode ser utilizado para o tratamento do diabetes mielitus do tipo II. A seqúência do polipeptídeo descrita aqui é HGEGTX~1~TSDLSKQX~2~EEEAVX~3~LFIEWKKNGX~4~PX~ 5~, onde X~1~ representa Phe ou Tyr, X~2~ representa Met, Ile ou Leu, X~3~ representa Lys, X~4~ representa Gly ou uma deleção, X~5~ representa Arg ou uma deleção. Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao método para preparo do fragmento do polipeptídeo Exendin-4.
Description
"POLIPEPTÍDEO E SAIS OU ESTERES FARMACEUTICAMENTEACEITÁVEIS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DOPOLIPEPTÍDEO".
Campo da invenção
A presente invenção refere-se a um fragmento depolipeptídeo Exendin 4 truncado, o qual tem uma atividadehiperglicêmica, e pode ser utilizado para o tratamento dodiabetes mielitus do tipo II.
Histórico da técnica
Devido a uma estrutura dietética moderna e ao estilo devida, a população de pacientes diabéticos aumenta ano aano em muitos países do mundo. Atualmente, existem 50milhões de pacientes na China, 60 milhões na índia, 18milhões nos Estados Unidos e 6 milhões no Japão,respectivamente.
Existem dois tipos principais de diabetes: diabetesinsulina dependente (diabetes tipo I) e diabetes não-insulina dependente (diabetes tipo II). Estes casos com odiabetes do tipo II contam mais de 90 por cento daquelescom a doença. Os pacientes cc<tv diabetes do tipo II temvários sintomas, tais como secreção de insulinainsuficiente depois das refeições (pós-prandial) , tempode demora para secreção de insulina, altos níveis deaçúcar no sangue e muitos outros. 0 aceptor de insulinaperiférica em pacientes obesos com diabéticos do tipo IImostram uma diminuição sensível na insulina, resultandoassim em um elevado nível de açúcar no sangue com um altonível de insulina no sangue e um alto nível dehemoglobina (HbAlc) maior que 8% (a faixa dos não-diabéticos é de 4-6%). Como um resultado, as complicaçõesdiabéticas, tais como doenças cardíacas e falha renal,etc., ocorrem. Assim, a chave para tratar efetivamente odiabete do tipo II é diminuir o nível de açúcar nosangue.
Atualmente, os fármacos utilizados para tratar o diabetesfalham em seis amplas categorias: incluindo os não-secretagogos de insulina, tais como sulfonil-uréia eMeglitinldeos; e os não-secretagogos de insulina, taiscomo insulina, inibidores alfa-glicosidase, biguanidas etiazolinedionas. Entretanto, como mostrado em umrelatório da linha de pesquisa em 100 pacientes comdiabetes do tipo II, realizada pelo "UK ProspectiveDiabetes Study (UKPDS)", durante seis anos, nenhuma dasseis classes de fármacos mencionadas acima são eficazespara os pacientes diabéticos do tipo II. Todos elesapresentaram falhas na prevenção de células beta dopâncreas a partir da incessante deterioração e tiveramfalha na diminuição do nível de HbAlc, prevenircomplicações diabéticas, tais como doenças cardíacas efalha renal. Portanto, é necessário desenvolver novosfármacos para a terapia do diabetes do tipo II.
Em 1995, foi concedida a patente U.S. No. 5,424,286 parao Exendín-4. 0 Exendin-4 foi isolado a partir da salivado monstro Gila (Helode Suspectum) que vive no sudoestedos Estados Unidos. Este polipeptídeo tem 39 aminoácidospossui 40% de identidade com o polipeptídeo 1 do tipoglucagon (GLP-I) ao nível da seqüência de aminoácido.Foi relatado que o Exendin-4, um análogo de GLP-1, se liaao receptor de GLP-I. 0 Exendin-4 estimula a síntese dapro-insulina e a secreção da insulina, diminuindo,portanto, o nível de açúcar do sangue. 0 Exendin-4continua a agir até o açúcar no sangue retornar ao nívelnormal. 0 Exendin-4 é seguro e eficaz porque evita oestupor e o choque devido à hipoglicemia. 0 Exendin-4diminui o nível de HbAlc, aumenta a quantidade de célulabeta, melhora a sensibilidade dos receptores de insulinanos pacientes com o diabetes do tipo II, e inibe asecreção de glucagons, etc.. 0 Exendin-4 comercialmentedisponível denominado de "Byetta" foi aprovado para omercado pelo FDA em Abril de 2005. (Referência ao:Diabetes (1997), 46, 433-439; Ibid (1995), 44, 1249-1258;Ibid (2002), 51, 2796-2803; Ibid (1994), 53, 2397-2403;Diabetes Care (2002), 25, 330-336; Ibid (2000), 23, 64-69; Ibid (2004), 2, 2623-2635; Jama (2002), 287, 373-379;Ν. Engl. J. Me., (2202), 346, 393-436; Lanced (1998),352, 837-853; Diabetes Endocrinology (2005), 146 (4),2069-2070; J. Clin. Endocrinology Metab. (2004), 89,3469-3473).
Foram feitos esforços para modificar o polipeptídeoExendin-4 por muitos pesquisadores, dirigidos à obtençãode um número maior de variantes que fossem mais eficazese convenientes para preparar e que provessem maisalternativas para o Exendin-4. Um polipeptídeo Exendin-4truncado foi anunciado no pedido CN1227567 A, o qual écompreendido por 3 0 resíduos de aminoácidos com Arg ouTyr no C-terminal. A companhia Lilly nos Estados Unidosdesenvolveu uma série de análogos GLP-1, capazes detratar o diabetes seguramente por um longo período(Referência ao WO 02047716 A) . Entretanto, estes exemplosmencionados acima são bastante limitados uma vez que elesforam apenas avaliados in vitro por sua capacidade de seligar ao receptor GLP-1, pela quantidade de secreção deinsulina das ilhotas das células tumorais e pelaquantidade produzida de AMP cíclico (cAMP) (Referência a:J. Biol. Chem., (1997), 272, 21201-21206; RegulatoryPeptides (2003), 114, 153-158; Trend in PharmacologicalSei. (2003), 24, 377-383; WO 03011892 A).
De modo a contornar as desvantagens da tecnologiaexistente, os inventores empenharam-se na busca por umnovo fragmento de polipeptídeo Exendin-4 truncado no C-terminal com Pro em seu C-terminal. Foi notável que opolipeptídeo com esta estrutura encurta a cadeia dopeptídeo em cerca de 1A e facilita a produção, mas provêuma nova alternativa para o tratamento do diabetes. Alémdisso, o Exendin-4 pode resistir efetivamente àcarboxipeptidase, e manter sua atividade hipoglicêmicapor um longo período.
Descrição detalhada da invenção
Em um aspecto, a presente descrição provê um fragmento depolipeptídeo Exendin-4 e sais ou ésteresfarmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, os quais têm aseqüência representada pela fórmula (I):
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onde:
X1 representa Phe ou Tyr;X2 representa Met, Ile ou Leu;X3 representa Lys;
X4 representa Gly ou uma deleção; e
X5 representa Arg ou uma deleção.
A fórmula (I), onde o resíduo de aminoácido (Xi) dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 no 6° sítio épreferível Tyr. Com relação a pesquisa farmacocinética, oPhe em molecular é substituído por Tyr, facilitando amarcaçao com I.
A fórmula (I) , onde o resíduo de aminoácido (X2) dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 no 14° sítio éalternativo ao Met, Ile ou Leu, é preferivelmente Met.A fórmula (I) , onde o resíduo de aminoácido (X4) dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 no 30° sítio épreferivelmente uma deleção.
Preferivelmente, o fragmento do polipeptídeo é: Xi sendoTyr, X2 sendo Met, X3 sendo Lys, X4 sendo uma deleção, X5sendo Arg ou uma deleção.
Na presente invenção, o termo "fragmento de polipeptídeoExendin-4 apresentado" refere-se ao polipeptídeo Exendin-4 truncado cuja seqüência é mostrada na fórmula (I). Napresente invenção, este polipeptídeo é denominadosimplesmente de "E4(f)", "fragmento de polipeptídeo" ou"polipeptídeo apresentado".
0 fragmento de polipeptídeo representado pela fórmula(I), onde o grupo amino N-terminal, o grupo carboxila C-terminal e os grupos de cadeia-lateral do aminoácido sãotanto não-modifiçado quanto modificado sem afetar,basicamente, a atividade do presente polipeptídeo, talcomo a formação dos ésteres "farmaceuticamenteaceitáveis". A modificação dos grupos de cadeia-lateraldo aminoácido inclui, mas não está limitada a, acilaçãodo grupo ε-amino da lisina, de-acilação do N-alquil daarginina, histidina ou lisina. A modificação dos gruposamino N-terminal inclui, mas não se limita a, desaminaçãoe modificação da alquila de cadeia N curta, dialquila decadeia N curta, e da N-acila. A modificação dos gruposcarboxila C-terminais inclui, mas não se limita a, amida,alquil amida de cadeia curta, dialquil amida e alquiléster de cadeia curta. Preferivelmente, os gruposterminais são protegidos através do grupo protetorconhecido pelos técnicos no assunto, tais como, acetila,tifluoroacetila, N-(9-fluorenila) metoxicarboila (Fmoc),tert-butoxicarbonila (Boc), aliloxicarbonila (Alloc),alquila C1.6l alquenila C2-8, aralquila C7-9, etc..
Preferivelmente, o fragmento do polipeptídeo representadopela fórmula (I) na presente invenção, onde o grupo aminoN-terminal, o grupo carboxila C-terminal e os gruposaminoácidos de cadeia lateral não são modificados, ouseja, o grupo N-terminal ainda é α-amido (-NH2) da His,no N-terminal, e o grupo C-terminal ainda é carboxila(-COOOH) de Pro no C-terminal. Também preferivelmente, ogrupo carboxila C-terminal de Pro é amidado, ou seja, -CONH2.
Na presente invenção, as denotações para o polipeptídeo,aminoácidos e grupos químicos são bem conhecidas natécnica. A abreviação para os aminoácidos estádemonstrada na tabela 1. Na presente invenção, geralmenteos aminoácidos referem-se aos ácidos L-amino se nãohouver outra definição específica.
TABELA 1: Os aminoácidos e seus abreviações
<table>table see original document page 6</column></row><table><table>table see original document page 7</column></row><table>
O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" referem-seaos sais de compostos pequenos ácidos ou básicoscombinados aos polipeptídeo. Os sais formados geralmentemelhoram a solubilidade do polipeptídeo e não têmbasicamente efeito na atividade do polipeptídeo. Porexemplo, os ácidos incluem ácido clorídrico, ácidofosfórico, ácido sulfúrico, ácido acético, ácidosuccínico, ácido maléico, ácido cítrico, etc., os quaispodem geralmente, formar sais com o polipeptídeo dapresente invenção. As bases incluem hidróxidos de metalalcalino ou metais alcalinos terrosos, amônio, carbonato,etc., os quais podem, geralmente, formar sais com opolipeptídeo da presente invenção.
O efeito dos níveis hipoglicêmicos do polipeptídeo napresente invenção é validado com os métodos de rotina datécnica, tais como os experimentos de biologia celuLar,os experimentos com animais, etc.. Nas configurações dapresente invenção, de modo a contornar as limitações dosexperimentos in vitro é empregado, preferivelmente,modelo animal com diabetes em experimentos sobre o efeitodos níveis hipoglicêmicos, tais como camundongosdiabéticos do tipo II db/db, ratos Goto-Kokizaki (GK) dotipo II, camundongos KK com diabetes, camundongos comdiabetes induzida por aloxano. Estes experimentos animaisindicam o fragmento polipeptídeo Exendin-4 representadopela fórmula (I) na presente invenção, teve um efeitocontínuo na sustentação da atividade hipoglicêmica e podeser utilizado para o tratamento do diabetes.
Consequentemente, em um outro aspecto, da presenteinvenção provê as composições farmacêuticas do fragmentopolipeptídeo Exendin-4 representados pela fórmula (I), oqual pode ser utilizado para tratamento do diabetes,especialmente para o tratamento do diabetes do tipo II.As composições farmacêuticas incluem um ou mais tipos defragmentos de polipeptídeo Exendin-4 na presenteinvenção, preferivelmente, apenas um fragmento dopolipeptídeo Exendin-4. Esta composição farmacêuticainclui um ou mais tipos de excipientes ou veículosescassos farmaceuticamente aceitáveis. Preferivelmente,estas composições farmacêuticas providas como forma dedosagem farmacêutica única, tais como, tablete, película,pílulas, cápsulas (incluindo formas de liberação-sustentada e formas de liberação-controlada), pó,grânulos, tinturas, xaropes, emulsões, solução oususpensão de injeção estéril, spray aerossol ou líquido,gotas, injeção, dispositivo de injeção automático esupositório. Em uma configuração, pode ser administradooralmente como um tablete ou cápsula, o ingrediente ativoacima mencionado pode ser combinado com um veículofarmaceuticamente aceitável e um veículo inerte não-tóxico, tal como etanol, glicerol, água sozinha ou umacombinação. As patentes anteriores WO 2004035754 Al e WO2004036186 Al, anunciaram, respectivamente, uma forma dedosagem que é aplicável para controlar a liberação daforma de dosagem do fragmento do polipeptídeo Exendin-4,preferivelmente esta forma de dosagem é recomendada parao polipeptídeo ativo representado pela fórmula (I) napresente invenção (A descrição de ambas as publicaçõesinternacionais WO 200435754 Al e WO 2004036186 Al sãoincorporados aqui por referência em sua íntegra).
A presente invenção também provê a aplicação doscompostos ou composições farmacêuticos mencionados acimana preparação do fármaco para a terapia do diabetes,preferivelmente utilizado para a terapia do diabetes dotipo II. As composições farmacêuticas na presenteinvenção são administradas através de rotas deadministração de fármacos que são bem conhecidas pelostécnicos no assunto, tais como liberação oral,administração retal, administração sublingual, fármaco deliberação pulmonar, fármaco de liberação transdermica,iontoforese, administração vaginal e liberaçãointranasal. Preferivelmente, as composições farmacêuticasna presente invenção são administradas através de injeçãoparenteral, tais como administração subcutânea,administração intramuscular e administração intravenosa,
0 fármaco na presente invenção pode ajustar a insulina emanter, consequentemente, o derradeiro nível de açúcar dosangue a nível normal. A dosagem de administração podeser variada através da forma de dosagem, do efeito daduração esperado e dos objetivos da terapia. A dosagemclínica pode ser convenientemente determinada através domédico de acordo com a situação atual (por exemplo, oestado de saúde do paciente e o peso do corpo, etc.) .
Para os adultos normais, as faixas de dosagem deadministração são de 0,1 μg a 100 μg por dia,preferivelmente, faixas de 1 μg a 2 0 μg ou,preferivelmente, faixas de 5 μ9 a 10 μ9· A dosagem podetambém ser determinada com referência à dosagem deadministração do fármaco do polipeptídeo Exendin-4comercialmente disponível.
A presente invenção também prove um método para produzirquimicamente o polipeptídeo sintético. O método químicopara o polipeptídeo sintético é familiar aos técnicos noassunto. O esquema detalhado pode ser realizado de acordocom o método descrito na literatura a seguir, tal comométodo de síntese em fase sólida do polipeptídeorelacionado à "Solid Phase Peptide Synthesis", 2nd Ed.,por J.M. Steward e J.D. Young, Pierce Chemical Company,Rockford, Illinois (1984) , e "Hormonal Proteins andPeptides", por J. Meienhofer, Volume II, Academic Press,New Yorkm (1973). 0 método de síntese por fase líquida dopeptídeo refere-se a "The Peptides", por E. Schroder e K.Lubke, Volume I, Academic Press, New York (1965) . Asdescrições de todas as referências são incorporadas aquipor referência em sua íntegra. Em uma configuração, apresente invenção emprega, preferivelmente, um método desíntese em fase sólida para o polipeptídeo.Em um outro aspecto, a presente invenção provê umaseqüência de ácido nucléico do fragmento do polipeptídeoExendin-4 (f) utilizando um códon que usa bia em E. coli.
Por exemplo, se a seqüência de ácido nucléico dopolipeptídeo da presente invenção for expressa em E.coli, o produto de expressão é, preferivelmente,otimizado através do códon utilizando indutores em E. coli.
A presente invenção também provê um método de engenhariagenética para produção do polipeptídeo acima mencionado.
Este método inclui: a) a fermentação da célula hospedeiraexpressando o polipeptídeo da presente invenção; e b)extração e purificação do produto expresso. Este métodoinclui, ainda, os processos de clivagem do produtoexpresso. O nível de expressão dos polipeptídeos com umpeso molecular médio (2 0-60 resíduos de aminoácidos) éusualmente baixo e fácil de ser degradado. Deste modo,uma abordagem está ligada ao gene do polipeptídeo alvopara carregar o gene da proteína, e a proteína alvo éexpressa como proteína de fusão. Após isto, a proteínaalvo pode ser obtida pela clivagem, extração epurificação a partir da proteína de fusão usando tanto ummétodo químico quanto enzimático. A desvantagem destemétodo é que o rendimento da proteína é baixo e oprocedimento é complicado. Uma outra pesquisa é baseadana seqüência de aminoácidos do polipeptídeo, cópiasmúltiplas do gene alvo são ligadas um após o outro edirecionadas através de um promotor apropriado. Aproteína-alvo ligada uma após a outra pode ser preparadapor clivagem. Esta pesquisa teve sucesso em muitos casospráticos da preparação do polipeptídeo, tal como insulinahumana (Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 1984, 81, 4627-4631), calcitonina (JP62-226998), GLP-I (WO 95/17510). Avantagem desta pesquisa é que o rendimento da proteína deexpressão é muito alto. Preferivelmente, o polipeptídeoda presente invenção é expresso usando os métodos dosgenes múltiplos ligados um após o outro como descritoacima. Os polipeptídeos ligados são clivados usandométodos de rotina da técnica. Por exemplo, após aproteção dos resíduos Lys com o anidrido citracônico, ospolipeptídeos multiméricos são clivados no sítio Arg comtripsina, seguido pela remoção do grupo do ácidocitracônico através do tratamento ácido (Referência ao:J.D. Baxter, et al., "Nature", 1980, 285 - 456-461; JP62-226998). Em uma configuração preferida, como mostrada nafigura 1, o método descrito acima inclui: a) fermentaçãodas células bacterianas expressando os polipeptídeos dapresente invenção; b) coleta das células bacterianas; c)Iise celular; d) extração dos polipeptídeos multiméricos;e) re-dobra do polipeptídeo preparado; f) clivagem; e g)purificação dos polipeptídeos finais usando cromatografialíquida de alta-pressão (HPCL).
Os polipeptídeos alvos (com 20-60 resíduos deaminoácidos) expressos pelas técnicas de engenhariagenética podem ser obtidos apenas se eles forem ligadosao uma proteína transportadora. 0 rendimento da proteínaalvo é muito baixo porque a estrutura molecular daproteína de fusão contém apenas um polipeptídeo alvomolecular, que conta apenas com cerca de 10% da proteínade fusão. Além disso, muitas outras proteínas não-alvosão também obtidas após a clivagem da proteína de fusão,o que torna isto muito difícil para purificar ospolipeptídeos alvos. Na presente invenção, os genespolipeptídeos múltiplos são ligados um após o outro, asproteínas de fusão expressas são apenas compreendidaspelos peptídeos alvos. 0 polipeptídeo clivado é apenasuma forma simples e o rendimento é 10 vezes maior do queo método formal, que torna o procedimento de purificaçãosignificativamente fácil. Na presente invenção, o sítioX3 apresenta como Lys, a proteína de fusão apenas clivadanos sítios intermoleculares (sítio Arg) abrangendo aintegridade de E4(f).
Os resíduos Pro no C-terminal em E4(f) são resistentesnovamente às carboxipeptidase Ae B, que abrangerão aestabilidade do molecular.
Ao contrário, como um intermediário de E4 (f), o resíduoArg em E4 (f) é rapidamente removido através dacarboxipeptidase B no sangue, e E4 (f)Arg é hidrolisadapara formar E4(f), ambos E4(f) e E4(f)Arg são eficazes.
Os exemplos a seguir são oferecidos para ilustrar apresente invenção e não foram construídos em nenhumaforma limitativa do escopo desta invenção.
Adicionalmente, a descrição de todas as referências éincorporada aqui por referência em sua íntegra. Apresente invenção será mais claramente entendida a partirde uma consideração das configurações a seguir, tomadasem conjunto com os desenhos que acompanham a presenteinvenção. Portanto, deve ser entendido que asconfigurações a seguir são oferecidas para ilustrar apresente invenção e não devem ser tomadas de forma algumacomo limitativas do escopo de proteção da presenteinvenção. De acordo com a presente invenção, váriasmodificações da presente solução, em adição àquelas aquidescritas, se tornarão aparentes aos técnicos do assunto.Em adição, a descrição de todas as referências éincorporada aqui por referência em sua íntegra.
Breve descrição dos desenhos
A figura 1 representa um fluxograma da preparação dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 usando um método deengenharia genética;
A figura 2 representa a comparação da atividadehipoglicêmica sustentada do fragmento do polipeptídeoExendin-4, tendo a seqüência de SEQ.ID.N0:2, com Exendin-4 ;
A figura 3 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO:2, em camundongo diabético do tipo II db/db;A figura 4 representa a atividade hipoglicêmica pós-prandial do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 daseqüência de SEQ.ID.N0:2, em ratos diabéticos do tipo IIGoto-Kokizaki. A curva 1 indica o grupo controle. A curva2 indica o grupo de administração;
A figura 5 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptideo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO:2, em camundongos com diabetes induzida poraloxano;
A figura 6 representa a secreção de insulina estimuladaatravés do fragmento do polipeptideo Exendin-4 tendo aseqüência de SEQ.ID.N0:2. A curva 1 indica o grupo deadministração. A curva 2 indica o grupo branco decontrole;
A figura 7 representa a comparação da atividadehipoglicêmica sustentada pelo fragmento do polipeptideoExendin-4 tendo a seqüência de SEQ.ID.N0:1, com Exendin-4;
A figura 8 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptideo Exendin-4 tendo a seqüênciaSEQ.ID.NO:1, em camundongos diabéticos do tipo II db/db;
A figura 9 representa a atividade hipoglicêmica pós-prandial, do fragmento do polipeptideo Exendin-4 tendo aseqüência SEQ.ID.NOrl em ratos Goto-Kokizaki diabéticosdo tipo II. A curva 1 indica o grupo controle. A curva 2indica o grupo de administração;
A figura 10 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptideo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO:1, em camundongos com diabetes induzida poraloxano;
A figura 11 representa a secreção de insulina estimuladaatravés do fragmento do polipeptideo Exendin-4 tendo aseqüência de SEQ.ID.N0:1. A curva 1 indica o grupo deadministração. A curva 2 indica o grupo branco decontrole;
A figura 12 representa a comparação da atividadehipoglicêmica sustentada pelo fragmento do polipeptideo
Exendin-4 tendo a seqüência de SEQ.ID.N0:3, com Exendin-4;
A figura 13 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüênciaSEQ.ID.NO:3, em camundongos diabéticos do tipo II db/db;A figura 14 representa a atividade hipoglicêmica após asrefeições (pós-prandial), do fragmento do polipeptídeoExendin-4 tendo a seqüência SEQ.ID.N0:3 em ratos Goto-Kokizaki diabéticos do tipo II. A curva 1 indica o grupocontrole. A curva 2 indica o grupo de administração;A figura 15 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO:3, em camundongos com diabetes induzida poraloxano;
A figura 16 representa a secreção de insulina estimuladaatravés do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência de SEQ.ID.N0:3. A curva 1 indica o grupo deadministração. A curva 2 indica o grupo branco decontrole;
A figura 17 representa a comparação da atividadehipoglicêmica sustentada pelo fragmento do polipeptídeoExendin-4 tendo a seqüência de SEQ.ID.N0:4, com Exendin-4 ;
A figura 18 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüênciaSEQ.ID.NO:4, em camundongos diabéticos do tipo II db/db;A figura 19 representa a atividade hipoglicêmica pós-prandial, do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência SEQ.ID.N0:4, em ratos Goto-Kokizaki diabéticosdo tipo II. A curva 1 indica o grupo controle. A curva 2indica o grupo de administração;
A figura 20 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO.:4, em camundongos com diabetes induzida poraloxano;
A figura 21 representa a secreção de insulina estimuladaatravés do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência de SEQ.ID.N0:4. A curva 1 indica o grupo deadministração. A curva 2 indica o grupo branco decontrole;A figura 22 representa a comparação da atividadehipoglicêmica sustentada pelo fragmento do polipeptídeoExendin-4 tendo a seqüência de SEQ.ID.N0:5, com Exendin-4;
A figura 23 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüênciaSEQ.ID.NO:5, em camundongos diabéticos do tipo II db/db;
A figura 24 representa a atividade hipoglicêmica pós-prandial, do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência SEQ.ID.N0:5, em ratos Goto-Kokizaki diabéticosdo tipo II. A curva 1 indica o grupo controle. A curva 2indica o grupo de administração;
A figura 25 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO.:5, em camundongos com diabetes induzida poraloxano;
A figura 26 representa a secreção de insulina estimuladaatravés do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência de SEQ.ID.N0:5. A curva 1 indica o grupo deadministração. A curva 2 indica o grupo branco decontrole;
A figura 27 representa a comparação . da atividadehipoglicêmica sustentada pelo fragmento do polipeptídeoExendin-4 tendo a seqüência de SEQ.ID.N0:6, com Exendin-4 ;
A figura 28 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüênciaSEQ.ID.NO:6, em camundongos diabéticos do tipo II db/db;
A figura 29 representa a atividade hipoglicêmica pós-prandial, do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência SEQ.ID.N0:6, em ratos Goto-Kokizaki diabéticosdo tipo II. A curva 1 indica o grupo controle. A curva 2indica o grupo de administração;
A figura 3 0 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO.:6, em camundongos com diabetes induzida poraloxano;A figura 31 representa a secreção de insulina estimuladaatravés do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência de SEQ.ID.N0:6. A curva 1 indica o grupo deadministração. A curva 2 indica o grupo branco decontrole;
A figura 32 representa a comparação da atividadehipoglicêmica sustentada pelo fragmento do polipeptídeoExendin-4 tendo a seqüência de SEQ.ID.N0:7, com Exendin-4;
A figura 33 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüênciaSEQ.ID.NO:7, em camundongos diabéticos do tipo II db/db;
A figura 34 representa a atividade hipoglicêmica pós-prandial, do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência SEQ.ID.N0:7, em ratos Goto-Kokizaki diabéticosdo tipo II. A curva 1 indica o grupo controle. A curva 2indica o grupo de administração;
A figura 35 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO.:7, em camundongos com diabetes induzida poraloxano;
A figura 36 representa a secreção de insulina estimuladaatravés do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência de SEQ.ID.N0:7. A curva 1 indica o grupo deadministração. A curva 2 indica o grupo branco decontrole;
A figura 3 7 representa a comparação da atividadehipoglicêmica sustentada pelo fragmento do polipeptídeoExendin-4 tendo a seqüência de SEQ.ID.N0:8, com Exendin-4;
A figura 3 8 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüênciaSEQ.ID.NO:8, em camundongos diabéticos do tipo II db/db;
A figura 39 representa a atividade hipoglicêmica pós-prandial, do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência SEQ.ID.N0:8, em ratos Goto-Kokizaki diabéticosdo tipo II. A curva 1 indica o grupo controle. A curva 2indica o grupo de administração;
A figura 4 0 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO.:8, em camundongos com diabetes induzida poraloxano;
A figura 41 representa a secreção de insulina estimuladaatravés do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência de SEQ.ID.N0:8. A curva 1 indica o grupo deadministração. A curva 2 indica o grupo branco decontrole;
A figura 42 representa a comparação da atividadehipoglicêmica sustentada pelo fragmento do polipeptídeoExendin-4 tendo a seqüência de SEQ.ID.N0:9, com Exendin-4;
A figura 43 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüênciaSEQ.ID.NO:9, em camundongos diabéticos do tipo II db/db;A figura 44 representa a atividade hipoglicêmica pós-prandial, do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência SEQ.ID.N0:9, em ratos Goto-Kokizaki diabéticosdo tipo II. A curva 1 indica o grupo controle. A curva 2indica o grupo de administração;
A figura 45 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO.:9, em camundongos com diabetes induzida poraloxano;
A figura 46 representa a secreção de insulina estimuladaatravés do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência de SEQ.ID.N0:9. A curva 1 indica o grupo deadministração. A curva 2 indica o grupo branco decontrole;
A figura 4 7 representa a comparação da atividadehipoglicêmica sustentada pelo fragmento do polipeptídeoExendin-4 tendo a seqüência de SEQ.ID.NO:10, com Exendin-4;A figura 48 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüênciaSEQ.ID.NO.:10, em camundongos diabéticos do tipo IIdb/db;
A figura 49 representa a atividade hipoglicêmica pós-prandial, do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência SEQ.ID.NO.:10, em ratos Goto-Kokizakidiabéticos do tipo II. A curva 1 indica o grupo controle.A curva 2 indica o grupo de administração;
A figura 50 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO.:10, em camundongos com diabetes induzida poraloxano;
A figura 51 representa a secreção de insulina estimuladaatravés do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência de SEQ.ID.NO.:10. A curva 1 indica o grupo deadministração. A curva 2 indica o grupo branco decontrole;
A figura 52 representa a comparação da atividadehipoglicêmica sustentada pelo fragmento do polipeptídeoExendin-4 tendo a seqüência de SEQ.ID.NO.:11, comExendin-4;
A figura 53 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüênciaSEQ.ID.NO.:11, em camundongos diabéticos do tipo IIdb/db;
A figura 54 representa a atividade hipoglicêmica pós-prandial, do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência SEQ.ID.NO.:11, em ratos Goto-Kokizakidiabéticos do tipo II. A curva 1 indica o grupo controle.A curva 2 indica o grupo de administração;
A figura 55 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO.:11, em camundongos com diabetes induzida poraloxano;
A figura 56 representa a secreção de insulina estimuladaatravés do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência de SEQ. ID .NO. : 11. A curva 1 indica o grupo deadministração. A curva 2 indica o grupo branco decontrole;
A figura 57 representa a comparação da atividadehipoglicêmica sustentada pelo fragmento do polipeptídeoExendin-4 tendo a seqüência de SEQ.ID.NO.:12, comExendin-4;
A figura 58 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüênciaSEQ.ID.NO.:12, em camundongos diabéticos do tipo IIdb/db;
A figura 59 representa a atividade hipoglicêmica pós-prandial, do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência SEQ.ID.NO.:12, em ratos Goto-Kokizakidiabéticos do tipo II. A curva 1 indica o grupo controle.A curva 2 indica o grupo de administração;
A figura 60 representa a atividade hipoglicêmica dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO. :12 , em camundongos com diabetes induzida poraloxano; e
A figura 61 representa a secreção de insulina estimuladaatravés do fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo aseqüência de SEQ. ID. NO. : 12 . A curva 1 indica o grupo deadministração. A curva 2 indica o grupo branco de controle.
EXEMPLOS
Exemplo 1:
Método de síntese em fase sólida das variantes dopolipeptídeo Exendin-4.
Os polipeptídeos são sintetizados através da metodologiade síntese de peptídeo em fase sólida usando osintetizador múltiplo de peptídeos, completamenteautomático SyRo II. N-(9-fluorenila)metoxicarbonila(Fmoc) é utilizado para proteger o α-amido do aminoácido.
Outros grupos protetores também são utilizados paraproteger as cadeias laterais do aminoácido, tais comotert-butila para Asp, Glu, Ser e Thr; Tritila (Trt) paraAsn, Gln e His; tert-butoxicarbonila(Boc) para Lys e Trp;2,2,5,7,8,5-pentametil-croman-6-sulfonila (Pmc) para Arg.Através do uso de N,N'-diisopropilcarbodiimida/1-hidroxibenzotriazol como reagente de ativação, os ácidosamino protegidos são conjugados um a um, 4 0 minutos paracada reação de conjugação. Em presença de 15% deetanoditiol/dimetil sulfida/anisol(1:1:1, v/v/v), opolipeptideo reage com 85% de ácido trifluoroacético emtemperatura ambiente durante 12 0 minutos, e então éclivado a partir das resinas e é desprotegidosimultaneamente. Após ser precipitado através do éteranidro, o precipitado é lavado com éter anidro muitasvezes de modo a remover o mercaptano completamente. Entãoos polipeptídeos são precipitados com água/tert-butilálcool (1:1), e liofilizado para obter os polipeptídeosbrutos. Os polipeptídeos brutos são purificados atravésde HPLC de fase reversa em uma graduação de 3 7-42% deacetonitrila/O,9% de ácido trifIuoraacetico (TFA), dentrode 30 minutos. A solução eluída é concentrada eliofilizada. A pureza do produto final sólido branco émaior do que 97%.
As variantes do polipeptideo Exendin-4 de fase sólidatendo as seqüências de SEQ.ID.N0:1, SEQ.ID.N0:2,SEQ.ID.NO:3, SEQ.ID.N0:4, SEQ.ID.N0:5, SEQ.ID.N0:6,SEQ.ID.NO:7, SEQ.ID.N0:8, SEQ.ID.N0:9, SEQ.ID.NO:10 ,SEQ.ID.NO:11 e SEQ.ID.NO:12, foram preparados,
respectivamente, de acordo com o método como mencionadono Exemplo 1.
Exemplo 2:
Procedimento de produção das variantes do polipeptideoExendin-4 através de bio-engenharia.
1) Síntese química de quatro fragmentos de gene (ShanghaiBiocolor Bioscience & Technology Company, China)
(1) SEQ.ID.NO:17,
(2) SEQ.ID.NO:18,
(3) SEQ.ID.NO:19,
(4) SEQ.ID.NO:20,2) Ligações dos fragmentos gênicos:
0 μΐ de água foi adicionado aos quatro genessintetizados (A26Onm = 2), marcado como (1), (2), (3) e(4), respectivamente, remoção de 2 μΐ de (1) e (4) paraum micro-tubo e agitação, então remoção de 2 μΐ de (2) e(3) para um outro micro-tubo e agitação. 1 μΐ de umtampão de polinucleotídeo quinase 10 χ T4, 1 μΐ de ATP(0,1 mol/L) e 1 μΐ de polinucleotídeo quinase T4 foramadicionados em ambos os micro-tubos, mantidos a 37°Cdurante 30 minutos, então mantidos em banho a 95°C,durante 5 minutos, resfriada a temperatura ambiente,agitados os componentes a partir dos dois micro-tubos e,então adicionados 2 μΐ de 10 χ tampão ligase, 1 μΐ de ATP(0,1 mol/L) e 2 μΐ de T4 ligase, mantido os micro-tubos a16°C durante 2 horas, os fragmentos ligados foram entãopurificados com um kit de fração de DNA (Shangai BiocolorBioscience & Technology Company, China; Promega Company,USA), após digeridas com EcoRI e SalI, o fragmento foientão analisado por eletroforese.
3) Clonagem:
Adicionar 1 μg do plasmídeo pUC18 (Shangai BiocolorBioscience & Technology Company, China) em um tubo limpo.Adicionar 1 μΐ de um tampão de enzima de restrição IOx.Adicionar 1 μΐ das enzimas EcoRI e SalI respectivamente.
Incubar a 370C durante 3 0 minutos. Extrair comfenol:clorofórmio. Centrifugar o micro-tubo para separaras fases. Remover o sobrenadante para um tubo limpo.
Extrair com clorofórmio novamente. Remover o clorofórmioatravés de centrifugação. Precipitar o DNA com 60% deisopropanol. Centrifugar o tubo para coletar o DNA, entãosecar as pelotas e armazenar o DNA até o uso. Misturar ofragmento de DNA digerido com EcoRI e SalI preparado naetapa (2) com as mesmas enzimas de digestão do plasmídeodescritas acima. Adicionar 1 μΐ do tampão de ligação IOx,1 μΐ de ATP e 2 μΐ de ligase T4. Incubar a 16°C por 12horas. A preparação das células competentes da cepa de E.coli JM 109 foi feita pelo uso de métodos de rotina. Amistura de reação-ligação descrita acima foi utilizadapara a transformação. As colônias positivas dostransformantes foram picadas e então o plasmídeo foiextraído.
4) Ligação:
O vetor contendo os genes do polipeptídeo variante daetapa (3) foi duplamente digerido com BglII e SalI, eesta variante dos fragmentos de DNA contendo opolipeptídeo foi então extraída. Também, o vetor da etapa(3) foi duplamente digerido com BamHI e SalI, o vetorcontendo os dois genes do polipeptídeo variante foiobtido por ligação dos dois fragmentos de DNA Contendo opolipeptídeo variante. Este vetor resultante foi aindadigerido com BglII e SalI, e um fragmento contendo doisgenes foi obtido, este fragmento foi ligado ao vetorcontendo os dois genes que foi previamente digerido comBamHI e SalI, que faz a formação do vetor contendo quatrogenes. De outro modo, oito, seis ou trinta e dois vetorescontendo os genes podem ser obtidos por este método.
5) Transformação:
Misturar o plasmídeo contendo o polipeptídeo variante coma célula competente de E. coli JM 109. Manter em geloseco durante 30 minutos. Choque térmico nas célulasdurante 2 minutos em um banho-maria a exatamente 42°C.
Transferir para o gelo seco. Cultura de transformação emplaca em placas LB contendo 1% de agarose e 50 μο/ml deampicilina. Crescimento das culturas com agitaçãovigorosa a 37°C durante a noite. Adicionar 0,3 ml de 50%de glicerol a 0,7 ml da cultura durante a noite, misturartotalmente e armazenar a -180C até o uso.
6.) Procedimento de produção para os polipeptídeosvariantes através do método de fermentação (Fluxogramamostrado na figura 1).
Primeiramente, preparar 1000 ml de meio de cultura LB (10g de Bacto-triptona, 5g de extrato de levedura-Bacto, 5 gde NaCl) e autoclavar a 120°C durante 3 0 minutos.Resfriar a temperatura ambiente antes de adicionar aampicilina (concentração final de 100 ng/ml). Inocular 1ml da cultura celular em tubos de estoque com glicerolpreparado na etapa (5) . Crescer a cultura com agitaçãovigorosa a 37°C durante a noite. Colher a cultura celularatravés de centrifugação a 5,000 rpm. Após o congelamentoa -35°C, degelar a cultura celular e adicionar 6M decloreto de guanidina. Homogeneizar as amostras e extrairo polipeptídeo ligado, coletar o sobrenadante através decentrifugação a 18,000 rpm. Remover o sobrenadante paraum novo tubo, e adicionar o tampão de diálise (IOmM detampão fosfato, pH 7,2; 0,1% de mercaptoetanol) parareligar o polipeptídeo. Isolar os peptídeos ligadosatravés de centrifugação. Então clivar o polipeptídeoligado de acordo com o método descrito por J.D. Baxter etal., ("Nature", 1980, 285, 456-461). Dissolver ospolipeptídeos ligados em água, adicionar Na2CO3 em pH8,5. Adicionar anidrido citracônico para dissolver oscorpos de inclusão completamente em pH 8,5. Agitar eincubar o tubo a temperatura ambiente durante 2 horas.
Adicionar tripsina e carboxipeptidase B. Após incubação a37°JC durante 2 horas, o polipeptídeo ligado é obtido.
Adicionar 3N de ácido clorídrico para ajustar o valor dopH a 3, agitar durante 4 horas, desproteger o grupoprotetor do ácido citracônico para resultar em umpolipeptídeo Exendin-4 final purificado tendo a seqüênciaSEQ.ID.NO.:2 da presente invenção. 0 término da reaçãopode ser monitorado por HPLC.
0 fragmento do polipeptídeo Exendin-4 tendo as seqüênciasde SEQ.ID.NO.:1, SEQ.ID.NO.:3, SEQ.ID.NO.:4,SEQ.ID.NO. :5, SEQ.ID.NO. :6, SEQ.ID.NO. :7, SEQ.ID.NO. :8,SEQ.ID.NO. : 9, SEQ.ID.NO. :10 , SEQ.ID.NO. :11 eSEQ.ID.NO.:12 foram preparadas, respectivamente, atravésdo mesmo método como mencionado no exemplo 2.
Os números de seqüências SEQ.ID. dos polipeptídeosvariantes e dos fragmentos de gene correspondentes sãocomo a seguir:
0 fragmento de gene correspondente do polipeptídeo tendoa seqüência de SEQ.ID.NO.:1: (1) SEQ.ID.NO.:13; (2)SEQ.ID.NO.:14; (3) SEQ.ID.NO.:15; (4) SEQ.ID.NO.:16.
O fragmento de gene correspondente do polipeptídeo tendoa seqüência de SEQ.ID.NO.:3: (1) SEQ.ID.NO.:21; (2)SEQ.ID.NO.:22; (3) SEQ.ID.NO.:23; (4) SEQ.ID.NO.:24.
0 fragmento de gene correspondente do polipeptídeo tendoa seqüência de SEQ.ID.NO.:4: (1) SEQ.ID.NO.:25; (2)SEQ.ID.NO.:26; (3) SEQ.ID.NO.:27; (4) SEQ.ID.NO.:28.
0 fragmento de gene correspondente do polipeptídeo tendoa seqüência de SEQ.ID.NO.:5: (1) SEQ.ID.NO.:29; (2)SEQ.ID.NO. :3 0; (3) SEQ.ID.NO. :31; (4) SEQ.ID.NO. :32.
0 fragmento de gene correspondente do polipeptídeo tendoa seqüência de SEQ.ID.NO.:6: (1) SEQ.ID.NO.:33; (2)SEQ.ID.NO.:34; (3) SEQ.ID.NO.:35; (4) SEQ.ID.NO.:36.
0 fragmento de gene correspondente do polipeptídeo tendoa seqüência de SEQ.ID.NO.:7: (1) SEQ.ID.NO.:37; (2)SEQ.ID.NO. :3 8; (3) SEQ.ID.NO. :39; (4) SEQ.ID.NO. :40.
0 fragmento de gene correspondente do polipeptídeo tendoa seqüência de SEQ.ID.NO.:8: (1) SEQ.ID.NO.:41; (2)SEQ.ID.NO.:42; (3) SEQ.ID.NO.:43.; (4) SEQ.ID.NO.:44.
0 fragmento de gene correspondente do polipeptídeo tendoa seqüência de SEQ.ID.NO.:9: (1) SEQ.ID.NO.:45; (2)SEQ.ID.NO.:46; (3) SEQ.ID.NO.:47; (4) SEQ.ID.NO.:48.
0 fragmento de gene correspondente do polipeptídeo tendoa seqüência de SEQ . ID .NO . : 10 : (1) SEQ . ID .NO . : 49 ; (2)SEQ.ID.NO.:50; (3) SEQ.ID.NO.:51; (4) SEQ.ID.NO.:52.
0 fragmento de gene correspondente do polipeptídeo tendoa seqüência de SEQ.ID.NO.:11: (1) SEQ.ID.NO.:53; (2)SEQ. ID.NO. :54; (3) SEQ . ID . NO . : 55 ; (4) SEQ . ID . NO . : 56 .
0 fragmento de gene correspondente do polipeptídeo tendoa seqüência de SEQ.ID.NO.:12: (1) SEQ.ID.NO.:57; (2)SEQ.ID.NO.:58; (3) SEQ.ID.NO.:59; (4) SEQ.ID.NO.:60.
Exemplo 3:
Ensaio da atividade hipoglicêmica sustentável dofragmento do polipeptídeo Exendin-4.
Camundongos KK diabéticos do tipo II (fornecidos peloShanghai Laboratory Animal Center, Academia de CiênciasChinesa) com 50g de peso corpóreo foram submetidos a umacorrida por duas horas, e foram divididos em quatrogrupos. Dois grupos foram injetados com 2 μg do Exendin-4, os outros dois grupos foram injetados com 2μg dofragmento do polipeptídeo Exendin-4 apresentado nainvenção. 2 0 micro-litros de amostras de sangue foramobtidas dos animais em corrida em períodos de tempo de 0;0,5; 1; 2; 3; 4; 5 e 6 horas, respectivamente, após aadministração da substância de teste. A atividadehipoglicêmica sustentada foi analisada através do uso deum kit de ensaio para açúcar no sangue (fornecido peloInstituto Shanghai de Produtos Biológicos, China). Osresultados correspondentes dos fragmentos do polipeptídeoExendin-4 tendo as seqüências de SEQ.ID.NO.:1;SEQ.ID.NO:2; SEQ.ID.N0:3; SEQ.ID.N0:4; SEQ.ID.N0:5;SEQ.ID.NO:6; SEQ.ID.N0:7; SEQ.ID.NO:8; SEQ.ID.N0:9;SEQ.ID.NO:10; SEQ.ID.NO:11; e SEQ.ID.N0:12 estão mostradonas figuras 7; figura 2, figura 12, figura 17, figura 22,figura 27, figura 32, figura 37, figura 42, figura 47,figura 52 e figura 57, respectivamente.
Exemplo 4:
Ensaio da atividade hipoglicêmica do fragmento dopolipeptídeo Exendin-4 em camundongos db/db diabéticos dotipo II.
0 camundongo db/db diabético do tipo II (fornecido peloShanghai Laboratory Animal Center, Academia de CiênciasChinesa e Yangzhou Universidade, China) com 50g de pesocorpóreo foram submetidos a uma corrida por duas horas,os animais de teste foram administrados através deinjeção subcutânea do fragmento do polipeptídeo Exendin-4em uma dose de 2μg. 2 0 μΐ de amostras de sangue foramobtidas a partir dos animais em corrida em períodos detempo de 0; 0,5; 1 e 2 horas, respectivamente, após aadministração da substância de teste. A atividadehipoglicêmica sustentada foi analisada através do uso deum kit de ensaio para açúcar no sangue (fornecido peloInstituto Shanghai de Produtos Biológicos, China). Osresultados correspondentes dos fragmentos do polipeptídeoExendin-4 tendo as seqüências de SEQ.ID.NO.:1;
SEQ.ID.NO:2; SEQ.ID.N0:3; SEQ.ID.N0:4; SEQ.ID.N0:5;SEQ.ID.NO:6; SEQ.ID.N0:7; SEQ.ID.N0:8; SEQ.ID.N0:9;SEQ.ID.NO:10; SEQ.ID.NO:11; e SEQ.ID.N0:12 estão mostradonas figuras 8; figura 3, figura 13, figura 18, figura 23,figura 28, figura 33, figura 38, figura 43, figura 48,figura 53 e figura 58, respectivamente.
Exemplo 5:
Atividade hipoglicêmica pós-prandial do fragmento dopolipeptídeo Exendin-4 em ratos Goto-Kokizaki diabéticosdo tipo II.
Ratos Goto-Kokizaki diabéticos do tipo II com cinco mesesde idade (peso corpóreo de 470 g) (fornecido peloShanghai Laboratory Animal Center, Academia de CiênciasChinesa) foram tomados para o procedimento operatório.
Após submeter os animais a uma corrida de 2 horas, osanimais de teste foram administrados através de injeçãointra-peritoneal de 2 0% de glicose em uma dose de 1 ml eforam administrados com injeção subcutânea do fragmentodo polipeptídeo Exendin-4 em uma dose de 5 μ9· 0 grupocontrole recebeu apenas glicose. 20 micro-litros deamostra de sangue foram obtidas a partir dos animais emcorrida em períodos de tempo de 0; 0,5; 1 e 2,respectivamente, após a administração da substância deteste. A atividade hipoglicêmica sustentada foideterminada pelo uso de um kit de ensaio para açúcar nosangue (fornecido pelo Instituto Shanghai de ProdutosBiológicos, China). Os resultados correspondentes estãomostrados na figura 4. A curva 1 indica o grupo controle.
A curva 2 indica o grupo de administração.
Os resultados correspondentes dos fragmentos dopolipeptídeo Exendin-4 tendo as seqüências SEQ.ID.NO.:1;SEQ.ID.NO:2; SEQ.ID.N0:3; SEQ.ID.N0:4; SEQ.ID.N0:5;SEQ.ID.NO:6; SEQ.ID.N0:7; SEQ.ID.N0:8; SEQ.ID.N0:9;SEQ.ID.NO:10; SEQ.ID.NO:11; e SEQ.ID.N0:12 estãomostrados nas figuras 9; figura 4, figura 14, figura 19,figura 24, figura 29, figura 34, figura 39, figura 44,figura 49, figura 54 e figura 59, respectivamente.
Exemplo 6:
Atividade hipoglicêmica do fragmento do polipeptídeoExendin-4 em camundongos com o diabetes induzido poraloxano.
Camundongos com oito semanas de idade (20 g de pesocorpóreo) foram tomados em procedimento operatório. Osdiabetes experimentais em camundongos foram induzidos por(16mg/ml) 0,1 ml de aloxano através de injeção via veiado rabo. Os animais foram divididos em cinco grupos. 48horas mais tarde, 2 μg do fragmento do polipeptídeoExendin-4 foram injetados. 20 micro-litros de amostra desangue foram obtidos a partir dos animais em corrida emperíodos de tempo de 0; 0,5; 1 e 2, respectivamente, apósa administração da substância de teste. A atividadehipoglicêmica foi determinada pelo uso de um kit deensaio para açúcar no sangue (fornecido pelo InstitutoShanghai de Produtos Biológicos, China). A atividadehipoglicêmica significante foi observada em todos oscinco grupos de camundongos diabéticos.
Os resultados correspondentes dos fragmentos dopolipeptídeo Exendin-4 tendo as seqüências SEQ.ID.NO.:1;SEQ.ID.NO:2; SEQ.ID.N0:3; SEQ.ID.N0:4; SEQ.ID.N0:5;SEQ.ID.NO:6; SEQ.ID.N0:7; SEQ.ID.N0:8; SEQ.ID.N0:9;SEQ.ID.NO:10; SEQ.ID.NO:11; e SEQ.ID.N0:12 estãomostrados nas figuras 10; figura 5, figura 15, figura 20,figura 25, figura 30, figura 35, figura 40, figura 45,figura 50, figura 55 e figura 50, respectivamente.
Exemplo 7:
Estímulo da secreção de insulina pelo fragmento dopolipeptídeo Exendin-4.
Ratos Goto-Kokizaki com diabetes II, com seis meses deidade (4 70 g de peso corpóreo) foram tomados emprocedimento pós-operatório. Os animais de teste foramadministrados através de injeção subcutânea dopolipeptideo Exendin-4 em uma dose de 5 μg/ enquanto osanimais do grupo controle apenas conseguiram uma soluçãosalina fisiológica. 2 0 μΐ de amostra de sangue foramobtidas a partir de animais em corrida em períodos detempo de 0; 3; 5;; 10; 15; 30; e 45 minutos,respectivamente, após a administração da substância deteste. A secreção da insulina estimulada pelo fragmentodo polipeptideo Exendin-4 foi determinada pelo uso de umkit ELISA (Dianostic Systemlab Inc., USA). Os resultadosestão mostrados na figura 6. Os animais do grupo de testerecuperaram a secreção de insulina na primeira fase, osquais foram administrados através de injeção subcutâneado polipeptideo Exendin-4 tendo a seqüência deSEQ.ID.NO.:2.
Os resultados correspondentes dos fragmentos dopolipeptideo Exendin-4 tendo as seqüências SEQ.ID.NO.:1;SEQ.ID.NO:2; SEQ.ID.N0:3; SEQ.ID.N0:4; SEQ.ID.NO:5;SEQ.ID.NO:6; SEQ.ID.N0:7; SEQ.ID.N0:8; SEQ.ID.N0:9;SEQ.ID.NO:10; SEQ.ID.NO:11; e SEQ.ID.N0:12 estãomostrados nas figuras 11; figura 6, figura 16, figura 21,figura 26, figura 31, figura 36, figura 41, figura 46,figura 51, figura 56 e figura 61, respectivamente.
Exemplo 8:
Variantes do polipeptideo Exendin-4 em fase sólida tendoas seqüências de SEQ.ID.NO.: 61, SEQ.ID.NO.: 62,SEQ.ID.NO.: 63, SEQ.ID.NO.: 64, SEQ.ID.NO.: 65,SEQ.ID.NO.: 66, SEQ.ID.NO.: 67, SEQ.ID.NO.: 68,SEQ.ID.NO.: 69, SEQ.ID.NO.: 70, SEQ.ID.NO.: 71, eSEQ.ID.NO.: 72, foram preparadas, respectivamente, deacordo com o mesmo método como mencionado no Exemplo 1.
De acordo com os métodos mencionados nos exemplos 3, 4,5, 6, 7, o ensaio da atividade hipoglicêmica sustentada,o ensaio da atividade hipoglicêmica em camundongos db/dbdiabéticos do tipo II; o ensaio da atividadehipoglicêmica pós-prandial em ratos Goto-Kokizakidiabéticos do tipo II, o ensaio da atividadehipoblicêmica induzida por aloxano em camundongosdiabético e o ensaio do estímulo da secreção de insulinaforam realizados utilizando os fragmentos do polipeptídeoExendin-4 (SEQ.ID.NO: 61; SEQ.ID.NO: 62; SEQ.ID.NO.: 63,SEQ.ID.NO.: 64, SEQ.ID.NO.: 65, SEQ.ID.NO.: 66,SEQ.ID.NO.: 67, SEQ.ID.NO.: 68, SEQ.ID.NO.: 69,SEQ.ID.NO.: 70, SEQ.ID.NO.: 71, e SEQ.ID.NO.: 72). Aatividade hipoglicêmica significante foi observada comtodos os fragmentos do polipeptídeo acima mencionados.
0 açúcar no sangue dos camundongos KK diabéticos do tipoII, os camundongos db/db diabéticos do tipo II, e oscamundongos com diabetes induzida por aloxano foramsustentavelmente reduzida em 35-50% dentro de 6 horas, em50%~60% dentro de 4 horas e em 30%~40% dentro de 2 horasrespectivamente, pelo uso dos fragmentos do polipeptídeoExendin-4 (SEQ.ID.NO:61, SEQ.ID.NO:62, SEQ.ID.NO.: 63,SEQ.ID.NO.: 64, SEQ.ID.NO.: 65, SEQ.ID.NO.: 66,SEQ.ID.NO.: 67, SEQ.ID.NO.: 68, SEQ.ID.NO.: 69,SEQ.ID.NO.: 70, SEQ.ID.NO.: 71, e SEQ.ID.NO.: 72). 0açúcar no sangue dos ratos Goto-Kokizaki em corrida comdiabetes do tipo II foi reduzido em 10% a 20%sustentavelmente dentro de duas horas através do uso dosfragmentos dos polipeptídeos Exendin-4 (SEQ.ID.NO:61,SEQ.ID.NO:62, SEQ.ID.NO.: 63, SEQ.ID.NO.: 64, SEQ.ID.NO.:65, SEQ.ID.NO.: 66, SEQ.ID.NO.: 67, SEQ.ID.NO.: 68,SEQ.ID.NO.: 69, SEQ.ID.NO.: 70, SEQ.ID.NO.: 71, eSEQ.ID.NO.: 72). A secreção da insulina dos grupos deteste os quais foram administrados através de injeção dosfragmentos do polipeptídeos Exendin-4 (SEQ.ID.NO:61,SEQ.ID.NO:62, SEQ.ID.NO.: 63, SEQ.ID.NO.: 64, SEQ.ID.NO.:65, SEQ.ID.NO.: 66, SEQ.ID.NO.: 67, SEQ.ID.NO.: 68,SEQ.ID.NO.: 69, SEQ.ID.NO.: 70, SEQ.ID.NO.: 71, eSEQ.ID.NO.: 72) foram recuperados.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Changzhou Pharmaceutical FactoryMA, XiaopengWANG, BingXI, Shaoqi
<12 0 > "POLIPEPTÍDEO E SAIS OU ESTERES FARMACEUTICAMENTEACEITÁVEIS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA E USO DO POLIPEPTÍDEO".
<13O > PCT06009
<150> CN2 00510040823.8<151> 2005-06-29
<160> 72
<170> PatentIn version 3.3
<210 > 1
<211> 32
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<400> 1
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Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Arg20 25 30
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<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 2
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Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Arg20 25 30
<210 ><211><212 >
3
31PRT<213 > Artificial
<220>
<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<400 > 3
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asn Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Pro Arg20 25 30
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<212 > PRT
<213 > Artificial
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<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<400> 4
His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Asn Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu15 10 15
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<212 > PRT
<213 > Artificial
<2 2 0 >
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<213 > Artificial
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<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4
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<213 > Artificial
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<213 > Artificial
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<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 8
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<213 > Artificial
<22 O >
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<212 > DNA
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<22 3> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
<400> 13
aattccagat ctatgcgtca cggcgaaggc accttcacca gcgatctgag caaacag 57<210> 14
<211> 66
<212 > DNA
<213 > Artificial
66
<22 O >
<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
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atggaagaag aagcggttaa actgttcatc gaatggctga aaaacggcgg cccgcgtgga 60tcctag
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<212 > DNA
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 15
tcgactagga tccacgcggg ccgccgtttt tcagccattc gatgaacagt ttaaccgctt 60cttct 65
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<211> 58
<212 > DNA
<213 > Artificial
<22 0>
<22 3> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 16
tccatctgtt tgctcagatc gctggtgaag gtgccttcgc cgtgacgcat agatctgg
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<212 > DNA
<213 > Artificial
<220>
<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 17
aattccagat ctatgcgtca cggcgaaggc acctacacca gcgatctgag caaacag
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<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
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atggaagaag aagcggttaa actgttcatc gaatggctga aaaacggcgg cccgcgtgga 60tcctag 66
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<211> 65
<212 > DNA <213 > Artificial <220> <223 > Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 19 tcgactagga tccacgcggg cttct ccgccgtttt tcagccattc gatgaacagt<210> 20 <211> 58 <212 > DNA <213 > Artificial <22 0 > <2 2 3 > Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 20 tccatctgtt tgctcagatc gctggtgtag gtgccttcgc cgtgacgcat<210> 21 <211> 57 <212 > DNA <213 > Artificial <22 0 > <223 > Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 21 aattccagat ctatgcgtca cggcgaaggc accttcacca gcgatctgag<210 > 22 <211 > 63 <212 > DNA <213 > Artificial
65
58
57
<22 0 ><223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
<400> 22
atggaagaag aagcggttaa actgttcatc gaatggctga aaaacggccc gcgtggatcc 60tag 63
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<212 > DNA
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<220>
<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
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<212 > DNA
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<22 3> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
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aattccagat ctatgcgtca cggcgaaggc acctacacca gcgatctgag caaacag 57
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<2 2 0 >
<22 3> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
<4 0 0 > 26atggaagaag aagcggttaa actgttcatc gaatggctga aaaacggccc gcgtggatcc 60
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<22 3> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
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tcgactagga tccacgcggg ccgtttttca gccattcgat gaacagttta accgcttctt 60ct 62
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tccatctgtt tgctcagatc gctggtgtag gtgccttcgc cgtgacgcat agatctgg
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<212 > DNA
<213 > Artificial
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<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<400> 29
aattccagat ctatgcgtca cggcgaaggc accttcacca gcgatctgag caaacag
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atcgaagaag aagcggttaa actgttcatc gaatggctga aaaacggcgg cccgcgtgga 60tcctag 66<210 > 31
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<212 > DNA
<213 > Artificial
<22 0 >
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<212> DNA
<213 > Artificial
<220>
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tcgatctgtt tgctcagatc gctggtgaag gtgccttcgc cgtgacgcat agatctgg
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<211> 57
<212 > DNA
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<220>
<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 33
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<210 > 34
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<212 > DNA
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<220>
<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 34
atcgaagaag aagcggttaa actgttcatc gaatggctga aaaacggcgg cccgcgtgga 60tcctag 66
<210 ><211 ><212 >
3565DNA<213 > Artificial
<220>
<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 35
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<210 > 36
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<212 > DNA
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<2 2 0 >
<22 3> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
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<212 > DNA
<213 > Artificial
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<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 38
atcgaagaag aagcggttaa actgttcatc gaatggctga aaaacggccc gcgtggatcc 60tag 63
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<211> 62
<212 > DNA
<213 > Artificial
<2 2 0 ><223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<400> 39
tcgactagga tccacgcggg ccgtttttca gccattcgat gaacagttta accgcttctt 60
<210> 40
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<212 > DNA
<213 > Artificial
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<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
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tcgatctgtt tgctcagatc gctggtgaag gtgccttcgc cgtgacgcat agatctgg 58
<210 > 41
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<212 > DNA
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<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 41
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<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<400> 42
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<213 > Artificial
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<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
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<212 > DNA
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<22 O >
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<212 > DNA
<213 > Artificial
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<213 > Artificial
<22 0 >
<22 3> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 50
ctggaagaag aagcggttaa actgttcatc gaatggctga aaaacggcgg cccgcgtgga 60tcctag 66
<210> 51
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<212 > DNA
<213 > Artificial
<220>
<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 51
tcgactagga tccacgcggg ccgccgtttt tcagccattc gatgaacagt ttaaccgctt 60cttct 65
<210> 52
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<212> DNA
<213 > Artificial<220>
<22 3> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
<4 0 0 > 52
tccagctgtt tgctcagatc gctggtgtag gtgccttcgc cgtgacgcat agatctgg 58
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<211> 57
<212 > DNA
<213 > Artificial
<220>
<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
<4 0 0 > 53
aattccagat ctatgcgtca cggcgaaggc accttcacca gcgatctgag caaacag 57
<210 > 54
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<220>
<223> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
<4 0 0 > 54
ctggaagaag aagcggttaa actgttcatc gaatggctga aaaacggccc gcgtggatcc 60tag 63
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<212 > DNA
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<22 3> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4
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<22 3> Fragmento do gene do polipeptídeo Exendin 4<4 O O > 56
tccagctgtt tgctcagatc gctggtgaag gtgccttcgc cgtgacgcat agatctgg 58
<210 > 57<211> 57<212 > DNA<213 > Artificial<22 0 > <223 > Fragmento<4 0 0 > 57
aattccagat ctatgcgtca cggcgaaggc acctacacca gcgatctgag caaacag 57
<210 > 58<211> 63<212 > DNA<213 > Artificial<220> <223 > Fragmento do<400> 58ctggaagaag aagcggttaa tag <210 > 59<211> 62<212 > DNA<213 > Artificial<220> <223 > Fragmento do<400> 59
63
tcgactagga tccacgcggg ccgtttttca gccattcgat gaacagttta accgcttctt 60
62
Ct <210> 60<211 > 58<212 > DNA<213 > Artificial<22 0 > <223 > Fragmento<4 0 0 > 60
tccagctgtt tgctcagatc gctggtgtag gtgccttcgc cgtgacgcat agatctgg 58<210 > 61
<211> 31
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 O >
<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 61
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asn Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu15 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro20 25 30
<210 > 62
<211> 31
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 62
His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Asn Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu15 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro20 25 30
<210> 63
<211> 30
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<400> 63
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asn Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu15 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Pro20 25 30
<210 > 64
<211> 30
<212 > PRT
<213 > Artificial
<22 0 >
<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<4 O O > 64
His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Ser1 5
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu20
Asn Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu
10 15
Trp Leu Lys Asn Gly Pro25 30
<210 > 65
<211> 31
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 65
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asn Leu Ser Lys Gln Ile Glu Glu15 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro20 25 30
<210> 66
<211> 31
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 66
His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Asn Leu Ser Lys Gln Ile Glu Glu15 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro20 25 30
<210> 67
<211> 30
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 67
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asn Leu Ser Lys Gln Ile Glu Glu15 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Pro20 25 30
<210 > 68<211> 30
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<400> 68
His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Asn Leu Ser Lys Gln Ile Glu Glu15 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Pro20 25 30
<210> 69
<211> 31
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 69
His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asn Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu15 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro20 25 30
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<211> 31
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<400> 70
His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Asn Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu1 5 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro20 25 30
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<211> 30
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<22 3> Fragmento de polipeptídeo Exendin 4<4 0 0 > 71His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asn Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu15 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Pro20 25 30
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<211> 30
<212 > PRT
<213 > Artificial
<220>
<223> Fragmento de polipeptideo Exendin 4<4 0 0 > 72
His Gly Glu Gly Thr Tyr Thr Ser Asn Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu15 10 15
Glu Ala Val Lys Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Pro20 25 30
Claims (10)
1. Polipeptídeo e sais ou ésteres farmaceuticamenteaceitáveis do mesmo, caracterizado pelo fato decompreender a seqüência representada pela fórmula (I):HGEGTXiTSDLSKQX2EEEAVX3LF I EWKKNGX4 PX5 (Donde :Xi representa Phe ou Tyr7-X2 representa Met, Ile ou Leu;X3 representa Lys;X4 representa Gly ou uma deleção; eX5 representa Arg ou uma deleção.
2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de Xi ser Tyr.
3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de X2 ser Met.
4. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de X4 ser uma deleção.
5. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de X1 ser Tyr, X2 ser Met, X3 serLyx, X4 ser uma deleção e, X5 ser Arg ou uma deleção.
6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato deconter um ou muitos tipos dos polipeptídeos definidos nasreivindicações de 1 a 5.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6,caracterizada pelo fato de conter ainda, um excipiente ouum veículo redutor farmaceuticamente aceitável.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7,caracterizada pelo fato de o citado veículo ser um oumais do grupo selecionado de etanol, glicerol e água.
9. Uso do polipeptídeo, conforme definido em qualquer umadas reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de opolipeptídeo serem utilizados para preparar umacomposição para tratar diabetes mellitus.
10. Uso, de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de o diabete mellitus estar relacionado aodiabetes mellitus tipo II.
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