BRPI0613863A2

BRPI0613863A2 - composições para tratamento de mastocitose sistêmica

Info

Publication number: BRPI0613863A2
Application number: BRPI0613863-2A
Authority: BR
Inventors: Peter Valent
Original assignee: Peter Valent
Priority date: 2005-07-20
Filing date: 2006-07-19
Publication date: 2011-02-15
Also published as: KR20080039915A; US20090221550A1; CN101267837B; ATE464911T1; ES2343542T3; CA2615598A1; JP2009501767A; KR101351682B1; RU2429848C2; AU2006271652B2; EP1909837B8; CA2615598C; DE602006013826D1; WO2007010014A2; US8076321B2; RU2008105823A; WO2007010014A3; PT1909837E; CN101267837A; EP1909837A2

Abstract

COMPOSIçõES PARA TRATAMENTO DE MASTOCITOSE SISTêMICA. A presente invenção refere-se ao uso da combinação dos inibidores de fosfato de tirosina AMN1O7 e PK0412 para a preparação de um fármaco para o tratamento de uma doença proliferativa relacionada a mastócitos. A presente invenção também se refere a um tratamento de combinação de um inibidor de fosfato de tirosina com um inibidor de TK que seja eficaz contra uma doença proliferativa relacionada a mastócitos, incluindo particularmente mastocitose sistêmica (SM), incluindo SM agressiva (ASM) e leucemia de mastócitos (MCL).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES PARA TRATAMENTO DE MASTOCITOSE SISTÊMICA".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao uso de inibidores da tirosinaquinase para a preparação de um fármaco para o tratamento de mastocitosesistêmica. A presente invenção também se refere a um método de tratamen-to de mastocitose sistêmica.

Antecedentes da Invenção

A mastocitose sistêmica (SM) pode ser classificada em SM indo-lente (pouca ou nenhuma evidência de função de órgão prejudicada), SMagressiva (presença de função de órgão prejudicada), doença de célulashematológicas não-mastócitos associada a SM (SM-AHNMD) e leucemia demastócitos. A apresentação clínica de SM em adultos é heterogênea e incluidoença cutânea (normalmente urticária pigmentosa), sintomas de liberaçãode mediador de mastócito (cefaléia, rubor, vertigem, síncope, anafilaxia eoutros) e lesão direta ou indireta de órgãos (dor óssea por lesões ósseaslíticas, osteoporose ou fraturas ósseas, hepatoesplenomegalia, citopenia porenvolvimento da medula óssea). Além disso, cerca de 20% dos pacientescom SM podem apresentar eosinofilia significativa e, às vezes, isolada(Tefferi e Pardanani 2004).

Em geral, a leucemia de mastócitos é uma doença terminal coma sobrevida medida em meses e, até agora, nenhuma terapia eficaz. A histó-ria natural da SM indolente é muito melhor com uma sobrevida mediana me-dida em décadas e progressão infreqüente para SM agressiva e SM-AHNMD. O resultado da SM-AHNMD é determinado pela AHNMD associadae é significativamente pior do que SM sem AHNMD. Tanto na SM semAHNMD indolente, quanto agressiva, um teor aumentado de mastócitos eeosinófilos de medula óssea, fosfatase alcalina sérica aumentada e hepato-esplenomegalia foram associados a um prognóstico ruim (Tefferi e Pardana-ni 2004). A remissão histológica e clínica completa foi conseguida em paci-entes com SM associada à fusão de genes FIP1L1-PDGFRoc, quando trata-da com Gleevec® (Pardanani 2003a, Pardanani 2003b).Sumário da Invenção

Vários conceitos de tratamento emergentes para neoplasiasmielóides se baseiam em novos fármacos que têm como alvo tirosina quina-ses (TK) críticas ou moléculas de sinalização a jusante. 1-5 A mastocitosesistêmica (SM) é uma neoplasia hematopoiética que se comporta como umadoença mieloproliferativa indolente na maioria dos pacientes, mas que tam-bém pode se apresentar como uma doença agressiva (a SM agressiva éaqui designada como "ASM") ou mesmo como uma leucemia, por exemplo,leucemia de mastócitos (aqui designada como "MCL").6-11 Em pacientescom ASM e MCL, a resposta à terapia convencional é ruim na maioria doscasos, e o prognóstico é grave.6-12 Conseqüentemente, foram feitas inúme-ras tentativas para identificar novos alvos de terapia em mastócitos neoplá-sicos (MC) e para definir novas estratégias de tratamento para esses pacien-tes.9-12

Na maioria dos pacientes com SM, incluindo aqueles que sãodiagnosticados com ASM ou MCL, a mutação no ponto c-KIT somáticoD816V (Asp816Val) é detectável em células (mastócitos) neoplásicas.13"17Essa mutação pontual está associada à fosforilação independente de Iigantee ativação de KIT, e diferenciação autônoma e crescimento de células afeta-das. 17,18 Com base nessa associação com atividade de tirosina quinase(TK) constitutiva, a variante com mutação D816V de KIT é um alvo de tera-pia atraente.9-12,19

Foram feitos inúmeros esforços em anos recentes para identifi-car fármacos adequados que inibissem a atividade de TK do KIT D816V.9-12,19-24 Descobriu-se recentemente que o inibidor de TK imatinib (STI571),que é amplamente usado em hematologia clínica, neutraliza o crescimentode MC neoplásico, exibindo KIT do tipo selvagem (wt) ou a variante com mu-tação F522C de ocorrência rara do KIT.20-23 Além disso, descobriu-se queesse fármaco bloqueia o crescimento de células neoplásicas em pacientesque tenham SM associada à eosinofilia clonal e um gene de fusãoFIP1L1/PDGFRA (SM com leucemia eosinofílica crônica associada, aquichamada de "SM-CEL").24-26 Entretanto, o imatinib foi incapaz de inibir ocrescimento de MC neoplásicos portadores da mutação de c-Κ/Γ D816V20-22, o que indica a clara necessidade de pesquisas adicionais de novos inibi-dores de TK que bloqueiem KIT D816V e, portanto, o crescimento de MCneoplásicos em SM.

Os novos fármacos direcionados a TK PKC412 e AMN107 neu-tralizam a atividade de TK de D816V-KIT e inibem o crescimento de MC hu-manos neoplásicos e células Ba/F3 com expressão induzível por doxiciclinade KIT-D816V, o crescimento de mastócitos neoplásicos primários e o cres-cimento da linhagem MCL humana HMC-1, que é portadora dessa mutaçãoc-KIT. PKC412 se mostra um fármaco superior, com valores de IC50 de 50 -250 nM e sem diferenças observadas entre células HMC-1 exibindo ou semKIT-D816V. Em contraste, AMN107 exibe efeitos mais potentes em célulasHMC-1 KIT-D816V-negativas. Resultados correspondentes são obtidos comcélulas Ba/F3 exibindo KIT do tipo selvagem ou com mutação D816V. Osefeitos inibidores de crescimento de PKC412 e AMN107 em HMC-1 estãoassociados à indução de apoptose e regulação negativa de CD2 e CD63.Verifica-se que PKC412 coopera com AMN107, imatinib e cladribina (isto é,2CdA) na produção da inibição de crescimento em HMC-1. Também se de-monstra que PKC412 tem sinergia com AMN107 e cladribina (2CdA) na pro-dução da inibição de crescimento em 'células HMC-1. Juntos, PKC412 eAMN107 representa novos agentes promissores para a terapia direcionadade SM.

Esta invenção se refere a um tratamento em combinação dePKC412 e AMN107 que é eficaz contra SM, particularmente SM associada àmutação de c-KIT oncogênica D816V. Esta invenção também se refere a umtratamento de combinação de PKC412 e um inibidor de TK que é eficaz con-tra SM, particularmente mastocitose sistêmica (SM) incluindo SM agressiva(ASM) e leucemia de mastócitos (MCL). Em uma modalidade preferida, SM1ASM e MCL estão associadas à mutação c-KIT oncogênica, incluindo parti-cularmente D816V.

Breve Descrição dos Desenhos

As Figuras 1A-D são uma representação dos efeitos de inibido-res de TK sobre a fosforilação de KIT em células neoplásicas. Figuras 1A,B:fosforilação de KIT em células HMC-1.1 (Figura 1A) e células HMC-1.2 (exi-bindo KIT D816V; Figura 1B) após incubação em meio de controle (Contro-le), imatinib STI571 (1 μΜ), PKC412 (1 μΜ), ou AMN107 (1 μΜ) durante 4horas. Figura 1C,D: fosforilação de KIT em células Ton.Kit.wt (Figura 1C) ecélulas Ton.Kit.D816V.27 (Figura 1D) após incubação em meio de controle(Controle), imatinib (isto é, STI571) (1 μΜ), PKC412 (1 μΜ), ou AMN107 (1μΜ) durante 4 horas. Antes da descrição ao fármaco, células Ton.Kit.wt ecélulas Ton.Kit.D816V.27 são mantidas em doxiciclina, , 1 μg/mL durante 24horas para induzir a expressão de KIT. No caso do clone Ton.Kit.wt, as célu-las também são expostas a SCF (100 ng/mL, 4 horas) para induzir a fosfori-lação de KIT (p-KIT). Em todas as células, a imunoprecipitação é conduzidausando-se o mAb anti-KIT SR-1. O Western blotting é feito usando-se mAbanti-fosfo 4G10 para detecção de p-KIT, e mAb anti-KIT 1C1 para detecçãoda proteína KIT total.

As Figuras 2A-D são uma representação gráfica dos efeitos dePKC412, AMN107 e imatinib sobre a proliferação de células HMC-1. Figura2A: Efeitos dependentes do tempo de PKC412 sobre a captação de 3H-timidina em células HMC-1.2. As células HMC-1.2 são incubadas com meiode controle ou PKC412 (300 nM) a 37QC e 5% de C02 por vários períodosde tempo, conforme indicado. Depois da incubação, a captação de 3H-timidina é analisada. Os resultados são expressos como porcentagem docontrole (isto é, a captação de 3H-timidina no meio de controle em cadamomento) e representam a média ± S.D. de triplicatas. Figura 2B-D: Efeitosdependentes da dose de inibidores de TK sobre a captação de 3H-timidinaem células HMC-1. Células HMC-1.1 (·-·) e células HMC-1.2 (■-■) são in-cubadas em meio de controle na ausência (0) ou presença de várias concen-trações de PKC412 (Figura 2B), AMN107 (Figura 2C) ou imatinib (Figura 2D)a 37eC durante 48 horas. Depois da incubação, mede-se a captação de 3H-timidina. Os resultados são expressos como porcentagem do controle (0,100%) e representam a média ± S.D. de pelo menos 3 experimentos inde-pendentes.As Figuras 3A-B são uma representação gráfica dos efeitos dePKC412, AMN107 e imatinib sobre a captação de 3H-timidina em célulasTon.Kit. Figura 3A: Células Ton.Kit.wt são mantidas em meio de controle(barras claras) ou são induzidas para expressar wt KIT ativada por adição dedoxiciclina (1 pg/mL) e SCF (barras escuras). Em ambas as condições, ascélulas são expostas a meio de controle (Co) ou a várias concentrações dePKC412, AMN107 ou imatinib (STI571), conforme indicado, durante 48 ho-ras (37°C, 5% de C02). Depois disso, a captação de 3H-timidina é avaliadaconforme descrito no texto. Os resultados são expressos como porcentagemdo controle (Co) e representam a média ± S.D. de três experimentos inde-pendentes. Figura 3B: Células Ton.Kit.D816V.27 são mantidas em meio decontrole (barras claras) ou são induzidas a expressar KIT D816V por adiçãode doxiciclina (1 pg/mL) (barras escuras) e, então, são expostas a meio decontrole (Co) ou a várias concentrações de PKC412, AMN107 ou imatinib(STI571), conforme indicado, durante 48 horas (37°C, 5% de C02). Depoisdisso, determina-se a captação de 3H-timidina. Os resultados são expressoscomo porcentagem do controle (células expostas a meio de controle, aquidesignadas como "Co") e representam a média ± S.D. de três experimentosindependentes.

A Figura 4 é uma representação gráfica da regulação negativapor PKC412 do crescimento de células (mastócitos) neoplásicas primáriasexibindo D816V. Células neoplásicas primárias de medula óssea expressan-do KIT D816V são isoladas de pacientes com mastocitose sistêmica latente.As células isoladas são incubadas em meio de controle (Co) ou com váriasconcentrações de PKC412, AMN107 e imatinib conforme indicado. O cres-cimento celular é quantificado por medição da captação de 3H-timidina. Osresultados são expressos como porcentagem do controle (em que Co é iguala 100%) e representam a média ± S.D. de triplicatas. Em células bm nor-mais, não se observa nenhum efeito de PKC412 (não mostrado).

As Figuras 5A-F são uma representação gráfica dos efeitos deinibidores de TK sobre a apoptose de células HMC-1. Células HMC-1.1 (Fi-guras 5A,C,E) e células HMC-1.2 (Figuras 5B,D,F) são cultivadas na ausên-cia (Co) ou presença de várias concentrações de PKC412 (Figuras 5A,B),AMN107 (Figuras 5C,D) ou imatinib (Figuras 5E,F), conforme indicado, a37-C durante 24 horas. Depois disso, as porcentagens de células apoptóti-cas são quantificadas por microscopia óptica. Os resultados representam amédia ± S.D. de três experimentos independentes.

As Figuras 6A-D são uma representação do exame por micros-copia eletrônica da apoptose induzida por PKC412 em células HMC-1. Célu-las HMC-1.2 são incubadas com meio de controle (Figura 6A), PKC412, 500nM (Figura 6B) ou PKC412, 900 nM (Figuras 6C,D) a 379C durante 24 horas.

Então, as células são colhidas e analisadas quanto a sinais ultra-estruturaisde apoptose. Enquanto células apoptóticas raramente eram vistas em cultu-ras mantidas com meio de controle (Figura 6A), células HMC-1.2 cultivadasem PKC412 (Figuras 6B-D) freqüentemente apresentaram sinais de apopto-se, incluindo contração celular, ondulação da membrana, vacuolização econdensação da cromatina nuclear.

A Figura 7 é uma representação de células HMC-1.2 expostas ameio de controle (Controle), PKC412 (1 μΜ), AMN107 (1 μΜ) ou imatinib (1μΜ) a 37SC durante 24 horas. Então, as células são examinadas quanto àviabilidade e à apoptose por coloração combinada com iodeto de propídio(Pl)/Vnexina A-FITC.

As Figuras 8A-H são uma representação da apoptose em célu-las HMC-1 avaliadas por ensaio Túnel. Células HMC-1.1 (Figuras 8A-D) ecélulas HCM-1.2 (Figuras 8E-H) são incubadas em meio de controle (Figuras8A,E), PKC412, 1 μΜ (Figuras 8B,F), AMN107, 1 μΜ (Figuras 8C,G) ou ima-tinib, 1 μΜ (Figuras 8D,H) a 37eC durante 24 horas. Depois disso, as célulassão colhidas e submetidas ao ensaio Túnel. Conforme se observa, PKC412produziu apoptose na maioria das células HMC-1.1 e HMC-1.2, ao passoque AMN107 e imatinib mostraram potentes efeitos indutores de apoptoseapenas em células HNC-1.1 (Figuras 8C,D), mas não em células HMC-1.2exibindo KIT D816V (Figuras 8G,H).

As Figuras 9A-B são uma representação gráfica dos efeitos deinibidores de TK sobre a expressão de antígenos de superfície celular emcélulas HMC-1.2. Figura 9A: Células HMC-1.2 são expostas a meio de con-trole (Co, barras claras), PKC412, 1 μΜ (barras escuras), AMN107, 1 μΜ(barras hachuradas) ou imatinib (isto é, STI571), 1 μΜ (barras cinza) a 37QCdurante 24 horas. Os resultados mostram a porcentagem do controle e re-presentam a média ± S.D. de 3 experimentos independentes. Figura 9B: E-feito dependente de dose de PKC412 sobre a expressão de CD63 em célu-las HMC-1.2. As células são incubadas com várias concentrações dePKC412, conforme indicado, a 379C durante 24 horas. Depois disso, as célu-las são colhidas e examinadas quanto à expressão de CD63 por citometriade fluxo. A figura mostra um resultado típico de um experimento. Conformese observa, PKC412 diminuiu de maneira dependente da dose a expressãode CD63.

As Figuras 10A-J são uma representação gráfica dos efeitos si-nérgicos de fármacos sobre o crescimento de células HMC-1. Células HMC-1.1 desprovidas de KIT D816V (Figuras 10A-F) e células HMC-1.2 exibindoKIT D816V (Figuras 10G-J) são incubadas com meio de controle (0) ou vá-rias combinações de fármacos (em razão fixa), conforme indicado, a 37SCdurante 48 horas para determinar efeitos antiproliferativos cooperativos. Fi-guras 10A,C,E,G,I: Depois da incubação com fármacos isolados (Figuras10A: PKC412, ■-■; AMN107, ·-·; Figura 10C: STI571, ■-■; AMN107, ·-·;Figura 10E: STI571, PKC412, ·-·; Figura 10G: PKC412, ■-■; AMN107,·-·; Figura 101: PKC412, ■-■; 2CdA, ·-·) ou combinações de fármacos (A-A), as células são analisadas quanto à captação de 3H-timidina. Os resulta-dos mostram a captação de 3H-timidina como porcentagem do controle(meio de controle, designado como "0" ou como "100%") e representam amédia ± S.D. de triplicatas de um experimento típico (resultados correspon-dentes são obtidos em pelo menos 2 outros experimentos para cada combi-nação de fármacos). As imagens à direita (Figuras 10B,D,F,H,J) mostramvalores de índice de combinação determinados para cada fração afetada, deacordo com o método de Chou e Talalay39 usando o software Calcusyn. Umvalor de índice de combinação (Cl) de 1,0 indica um efeito aditivo, um Clmaior que 1,0 indica antagonismo, e um Cl de menos de 1,0 indica sinergia.As Figuras 11A-D são uma representação dos efeitos de dasati-nib sobre a fosforilação de KIT em células neoplásicas. As Figuras 11 A,Brepresentam a fosforilação com tirosina de KIT em células HMC-1.1 (Figura11 A) e células HMC-1.2 (exibindo KIT D816V) (Figura 11B) depois da incu-bação em meio de controle ou várias concentrações de dasatinib durante 4horas. As Figuras 11C1D representam a fosforilação de KIT em célulasTon.Kit.wt expostas à doxiciclina (Figura 11C) e células Ton.Kit.D816V.27(Figura 11 D) depois da incubação em meio de controle (O) ou dasatinib (10-3- 103 nM) durante 4 horas. Antes da descrição ao fármaco, célulasTon.Kit.wt e células Ton.Kit.D816V.27 foram mantidas em meio de controle(Controle) ou em doxiciclina durante 24 horas para induzir a expressão deKIT. No caso de Ton.Kit.wt, as células também foram expostas a SCF (100ng/mL, 4 horas) para induzir a fosforilação de KIT (p-KIT). Em todas as célu-las, a imunoprecipitação foi conduzida usando-se o mAb anti-KIT 1C1. OWestern blotting foi realizado usando-se o mAb anti-fosfo-tyr 4G10 para de-tecção de p-KIT e o mAb anti-KIT 1C1 para detecção de proteína KIT total(KIT).

As Figuras 12A-F são uma representação dos efeitos de dasati-nib sobre a proliferação de células HMC-1 e o crescimento e formação deaglomerados de células BaF/3. A Figura 12A representa os efeitos depen-dentes do tempo de dasatinib sobre a captação de 3H-timidina em célulasHMC-1.1 (■-■) e células HMC-1.2 (·-·). Células HMC-1.1 foram incubadascom dasatinib a 10 nM, e células HMC-1.2 com dasatinib a 1 μΜ, a 379C e5% de C02 por vários períodos de tempo, conforme indicado. Depois daincubação, mediu-se a captação de 3H-timidina. Os resultados são expres-sos como porcentagem do controle (= a captação de 3H-timidina em célulasmantidas em meio de controle) e representam a média ± S.D. de 3 experi-mentos independentes. A Figura 12B representa efeitos dependentes dadose de dasatinib sobre a captação de 3H-timidina em células HMC-1.1 (■-■) e células HMC-1.2 (·-·). As células foram incubadas em meio de controlena ausência ou presença de várias concentrações de dasatinib a 37SC du-rante 48 horas. Depois da incubação, mediu-se a captação de 3H-timidina.Os resultados são expressos como porcentagem do controle e representama média ± S.D. de 3 experimentos independentes. (Figura 12C) Efeitos dedasatinib sobre o crescimento de células Ton.Kit.wt. As células foram manti-das em meio contendo IL-3 antes da e durante a incubação com dasatinib(·-·) ou foram pré-incubadas com doxiciclina (1 pg/mL) na presença de IL-3durante 24 horas e, então, foram incubadas com várias concentrações dedasatinib em meio contendo doxiciclina e SCF (100 ng/mL) sem IL-3 durante48 horas a 37°C (■-■). Depois da incubação, as células foram colhidas esubmetidas a experimentos de captação de 3H-timidina. Os resultados sãoexpressos como porcentagem do controle e representam a média ± S.D. de3 experimentos independentes. (Figura 12D) Efeitos de dasatinib sobre ocrescimento de células Ton.Kit.D816V. As células foram incubadas em meiode controle (+IL-3) e várias concentrações de dasatinib (conforme indicado)na ausência (·-·) ou presença (■-■) de doxiciclina (1 pg/mL) durante 48 ho-ras (37°C). Depois disso, a viabilidade celular foi determinada pelo teste deexclusão de azul tripano. Os resultados são expressos como porcentagemde células viáveis (calculada a partir da porcentagem de células positivaspara azul tripano) em comparação com o controle (sem dasatinib = 100%) erepresentam a média ± S.D. de 3 experimentos independentes. (Figuras12E.F) Efeitos de dasatinib (Figura 12E) e AMN107 (Figura 12F) sobre aformação de aglomerado induzido por KIT-D816V em célulasTon.Kit.D816V.27. As células foram incubadas sem doxiciclina (Co) ou emdoxiciclina (1 pg/mL) na ausência ou presença de várias concentrações dedasatinib ou AMN107, conforme indicado, durante 24 horas. Depois da incu-bação, os números de aglomerados foram contados sob um microscópioinvertido. Os resultados são expressos como porcentagem de formação deaglomerados em comparação com células mantidas em meio de controle(Co) e doxiciclina (= 100%) e representam a média ± S.D. de 3 experimentosindependentes.

A Figura 13 é uma representação de que dasatinib regula nega-tivamente o crescimento de células neoplásicas primárias em um pacientecom SM positiva para KIT D816V com leucemia associada. Células neoplá-sicas primárias de medula óssea foram isoladas de um paciente com ASMpositiva para KIT D816V associada a AML. As células isoladas foram incu-badas em meio de controle ou em várias concentrações de dasatinib (·-·),PKC412 (■-■), AMN107 (A-A) ou imatinib (▼-▼), conforme indicado. Ocrescimento celular foi quantificado por medição da captação de 3H-timidina.Os resultados são expressos como porcentagem do controle (células manti-das em meio de controle = 100%) e representam a média ± S.D. de triplica-tas. Em células de medula óssea normais, nenhum efeito dos inibidores deTK aplicados foi observado (não mostrado).

As Figuras 14A-C representam que dasatinib induz apoptose emcélulas HMC-1. (Figuras 14A,B) Células HMC-1.1 (Figura 14A) e célulasHMC-1.2 (Figura 14B) foram cultivadas na ausência (Co) ou presença devárias concentrações de dasatinib, conforme indicado, durante 24 horas.Depois disso, as porcentagens de células apoptóticas foram quantificadaspor microscopia óptica. Os resultados representam a média ± S.D. de trêsexperimentos independentes. O asterisco indica ρ < 0,05. (Figura 14C) Oexame por microscopia eletrônica de apoptose induzida por dasatinib emcélulas HMC-1.1 e células HMC-1.2. Células HMC-1 foram incubadas commeio de controle ou dasatinib (1 μΜ) a 37-C durante 24 horas. Então, as cé-lulas foram colhidas e analisadas quanto a sinais ultra-estruturais de apopto-se. Enquanto células apoptóticas raramente eram vistas em culturas manti-das em meio de controle, a maioria das células HMC-1 cultivadas em dasati-nib apresentaram sinais de apoptose incluindo contração celular, ondulaçãoda membrana, vacuolização e condensação da cromatina nuclear. (Figura14D,E) Apoptose induzida por dasatinib em células HMC-1 avaliadas porensaio Túnel. Células HMC-1.1 (Figura 14D) e células HMC-1.2 (Figura 14E)foram incubadas em meio de controle, várias concentrações de dasatinib(conforme indicado) ou PKC412 (100 nM e 1 μΜ), conforme indicado, a 37eCdurante 24 horas. Depois disso, as células foram colhidas e submetidas aensaio Túnel. Conforme se observa, dasatinib produziu apoptose dependen-te da dose em células HMC-1.1 e HMC-1.2.

As Figuras 15A-F representam os efeitos de dasatinib sobre aexpressão de antígenos de superfície celular em células HMC-1. (Figura15A) Células HMC-1.1 e células HMC-1.2 (Figura 15B) foram expostas ameio de controle ou várias concentrações de dasatinib (conforme indicado)ou PKC412 (1 μΜ) a 379C durante 24 horas. Depois da incubação, as célu-las foram examinadas quanto à expressão de vários antígenos CD por cito-metria de fluxo usando mAbs específicos para CD. As Figuras 15C-D mos-tram os níveis de intensidade de fluorescência média (MFI) como porcenta-gem do controle (=100%). Os resultados representam a média ± S.D. de 3experimentos independentes. Asterisco: ρ < 0,05. (Figuras 15E.F) Expressãode CD63 em células HMC-1.1 (Figura 15E) e células HMC-1.2 (Figura 15F)depois da incubação em meio de controle, várias concentrações de dasatinibou PKC412 (1 μΜ) a 379C durante 24 horas. A citometria de fluxo foi efetua-da com o mAb contra CD63 CLB-gran12 (linha cheia). A linha tracejada re-presenta o anticorpo de controle correspondente a isotipo.

As Figuras 16A-D representam efeitos sinérgicos de fármacossobre o crescimento de células HMC-1. Células HMC-1.1 (Figuras 16A-B) ecélulas HMC-1.2 exibindo KIT D816V (Figuras 16C-D) foram incubadas comfármacos isolados ou várias combinações de fármacos (a uma razão fixa) a379C durante 48 horas antes de se determinar a captação de 3H-timidina.(Figura 16A) HMC-1.1 foram incubadas com várias concentrações de dasa-tinib (■-■) ou PKC412 (·-·) ou combinações de ambos os fármacos (A-A).(Figura 16B) HMC-1.1 foram incubadas com várias concentrações de dasa-tinib (·-·) ou imatinib (■-■) ou combinações de ambos os fármacos (A-A).(Figura 16C) Células HMC-1.2 foram incubadas com várias concentraçõesde dasatinib (■-■) ou PKC412 (·-·) ou com combinações de ambos os fár-macos (A-A). (Figura 16D) Células HMC-1.2 foram incubadas com váriasconcentrações de dasatinib (■-■) ou 2CdA (·-·) ou com combinações deambos os fármacos (A-A). Os resultados representam a média ± S.D. detriplicatas de um experimento típico. Conforme avaliado pelo programa Cal-cusyn, as interações dos fármacos (Figuras 16A-D) se mostraram de nature-za sinérgica.

A Figura 17 representa células HMC-1.2 que foram incubadascom meio de controle ou várias concentrações de dasatinib, conforme indi-cado, a 37-C durante 48 horas. Depois disso, mediu-se a captação de 3H-timidina. Os resultados são expressos como porcentagem do controle (célu-las mantidas em meio de controle = 100%) e representam a média ± S.D. detrês experimentos independentes.

Descrição Detalhada

O problema a ser resolvido pela presente invenção é o uso deuma combinação de PKC412 e AMN107 no tratamento de mastocitose sis-têmica, particularmente SM associada à mutação oncogênica de c-KITD816V.

Na maioria dos pacientes com mastocitose sistêmica (SM), in-cluindo SM agressiva e leucemia de mastócitos (MCL), as células neoplási-cas expressam a mutação oncogênica de c-KIT D816V. Essa mutação ativaa tirosina quinase (TK) do receptor de KIT, que, portanto, representa um alvoatrativo para a terapia. Entretanto, a maioria dos inibidores de TK disponí-veis, incluindo STI571 (imatinib; Novartis Pharma AG), são incapazes debloquear a atividade de TK do KIT D816V a concentrações farmacológicas.Apresenta-se provas de que os novos fármacos direcionados a TK PKC412e AMN107 (Novartis) bloqueiam a atividade de TK de KIT com mutaçãoD816V e neutralizam o crescimento de células Ba/F3 com expressão induzi-da por doxiciclina de KIT D816V, assim como o crescimento da linhagemcelular HMC-1 de leucemia de mastócitos humana que expressa essa muta-ção de c-KIT. Descobriu-se que PKC412 é o agente mais potente, com valo-res de IC50 de 50 - 200 nM e sem diferenças observadas entre célulasHMC-1 exibindo ou desprovidas de KIT D816V. Em contraste, AMN107 exi-biu potentes efeitos apenas na ausência de KIT D816V em células HMC-1(IC50 de 5 -10 nM, com comparação com HMC-1 que expressa KIT D816V:IC50 de 1 - 5 μΜ). Resultados correspondentes são obtidos com célulasBa/F3 exibindo a variante de tipo selvagem ou com mutação D816V de KIT.

Subseqüentemente, examina-se o efeito de PKC412 sobre MCneoplásicos primários obtidos da medula óssea de um paciente com SM exi-bindo KIT D816V. Em linha com os dados de linhagem celular, PKC412 ini-biu de maneira dependente da dose a captação de 3H-timidina em MC neo-plásicos (IC50: 50 nM) nesse paciente, ao passo que nenhum efeito signifi-cativo é encontrado com AMN107 (0,1 - 3 μΜ) e imatinib (1 μΜ). Os efeitosinibidores de crescimento de PKC412 e AMN107 em células HMC-1 estãoassociados à inibição de TK de KIT em experimentos de fosfomanchamentoe à indução de apoptose, conforme avaliado por morfologia convencional epor microscopia eletrônica. Além disso, descobriu-se que PKC412 regulanegativamente a expressão de CD2 e CD63 (dois antígenos de superfíciecelular regulados positivamente em SM) em células HMC-1. Em experimen-tos de co-incubação, descobriu-se que PKC412 faz sinergia com AMN107,imatinib e cladribina (2CdA), produzindo inibição do crescimento em célulasHMC-1 portadoras de KIT D816V, assim como em células HMC-1 desprovi-das de KIT D816V. Em resumo, os dados mostram que PKC412 e AMN107isoladamente e em combinação neutralizam o crescimento de mastócitosneoplásicos que expressam a variante com mutação D816V de KIT. Ambosos fármacos podem, portanto, ser considerados como novos agentes pro-missores para terapia direcionado em pacientes com SM agressiva e MCL.

Conseqüentemente, a presente invenção se refere ao uso de N-[(9S, 10R, 11R, 13R)-2,3,10,11,12,13-hexaidro-10-metóxi-9-metil-1 -oxo-9,13-epóxi-1 H,9H-diindol[1,2,3-gh:3',2', 1 '-lm]pirrol[3,4-j][1,7]benzodiazonin-11 -il]-N-metilbenzamida de fórmula (I) (daqui por diante: "PKC412"):

<formula>formula see original document page 14</formula>

em combinação com 4-Metil-3-[[4-(3-piridinil)-2-pirimidinil]amino]-/V-[5-(4-metil-1 H-imidazol-1 -il)-3-(trifluorometil)fenil] benza-mida de fórmula (II) (daqui por diante: "AMN107"):<formula>formula see original document page 15</formula>

ou um sal farmaceuticamente aceitável de qualquer um ou deambos, para o tratamento de mastocitose sistêmica.

As abreviações aqui usadas têm, de preferência, dentro do con-texto desta descrição, os seguintes significados, a menos que indicado de

outra forma: ASM mastocitose sistêmica agressiva bm medula óssea cladribina 2-clorodesoxiadenosina FCS soro de novilho fetal IFNa interferon-alfa IP imunoprecipitação MCL leucemia de mastócitos PBS solução salina tamponada com fosfato PE ficoeritrina rh humano recombinante TA temperatura ambiente SCF fator de célula-tronco SM mastocitose sistêmica SSM mastocitose sistêmica latente TK tirosina quinase Wt tipo selvagem

Os termos genéricos aqui usados têm, de preferência, dentro docontexto desta descrição, os seguintes significados, a menos que indicadode outra forma:

Quando se usa a forma plural para compostos, sais e outros, is-so significa também um composto, sal ou similar.

Quaisquer átomos de carbono assimétricos podem estar presen-tes na configuração (R), (S) ou (R,S), de preferência na configuração (R) ou(S). Os compostos podem, portanto, estar presentes como misturas de isô-meros ou como isômeros puros, de preferência como diastereômeros enan-tiomericamente puros.

A invenção também se refere a possíveis tautômeros dos com-postos da fórmula I e da fórmula II.

Os sais são particularmente os sais farmaceuticamente aceitá-veis de compostos da fórmula I e da fórmula II. Compostos da fórmula I e dafórmula Il podem ser administrados seqüencial ou concomitantemente. Com-postos da fórmula I e da fórmula Il podem ser combinados em uma formula-ção única ou estar em formulações separadas.

Esses sais são formados, por exemplo, como sais de adição deácido, de preferência com ácidos orgânicos ou inorgânicos, a partir de com-postos de fórmula I e/ou fórmula Il com um átomo de nitrogênio básico, par-ticularmente os sais farmaceuticamente aceitáveis. Ácidos inorgânicos ade-quados são, por exemplo, ácidos halogênicos, como ácido clorídrico, ácidosulfúrico ou ácido fosfórico. Ácidos orgânicos adequados são, por exemplo,ácidos carboxílicos, fosfônicos, sulfônicos ou sulfâmicos, por exemplo, ácidoacético, ácido propiônico, ácido õctanóico, ácido decanóico, ácido dodeca-nóico, ácido glicólico, ácido lático, ácido fumárico, ácido succínico, ácido a-dípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azeláico, ácido málico, ácidotartárico, ácido cítrico, âminoácidos, como ácido glutâmico ou ácido aspárti-co, ácido maléico, ácido hidroximaléico, ácido metilmaléico, ácido cicloexa-nocarboxílico, ácido adamantanocarboxílico, ácido benzóico, ácido salicílico,ácido 4-aminossalicílico, ácido ftálico, ácido fenilacético, ácido mandélico,ácido cinâmico, ácido metano- ou etano-sulfônico, ácido 2-hidroxietanossulfônico, ácido etano-1,2-dissulfônico, ácido benzenossulfôni-co, ácido 2-naftalenossulfônico, ácido 1,5-naftaleno-dissulfônico, ácido do-decilsulfúrico, ácido 2-, 3- ou 4-metilbenzenossulfônico, ácido metilsulfúrico,ácido etilsulfúrico, ácido N-cicloexilsulfâmico, ácido N-metil-, N-etil- ou N-propil-sulfâmico ou outros ácidos protônicos orgânicos, como ácido ascórbico.Na presença de radicais negativamente carregados, como car-bóxi ou sulfo, os sais também podem ser formados com bases, por exemplo,sais demetais ou amônio, como sais de metais alcalinos ou metais alcalino-terrosos, por exemplo, sais de sódio, potássio, magnésio ou cálcio, ou saisde amônio com amônia ou aminas orgânicas adequadas, como monoaminasterciárias, por exemplo, trietilamina ou tri(2-hidroxietil)amina, ou bases hete-rocíclicas, por exemplo, N-etil-piperidina ou Ν,Ν'-dimetilpiperazina.

Quando um grupo básico e um grupo ácido estão presentes namesma molécula, um composto da fórmula I e/ou da fórmula Il também podeformar sais internos.

Para fins de isolamento ou purificação, também é possível usarsais farmaceuticamente inaceitáveis, por exemplo, picratos ou percloratos.Para uso terapêutico, apenas sais farmaceuticamente aceitáveis ou compos-tos livres são empregados (quando aplicável, na forma de preparações far-macêuticas), e essas são, portanto, preferidas.

Em vista da íntima relação entre os novos compostos em formalivre e aqueles na forma de seus sais, incluindo aqueles sais que podem serusados como intermediários, por exemplo, na purificação ou identificaçãodos novos compostos, quaisquer referências aos compostos livres acima eabaixo devem ser entendidas como se referindo também aos sais corres-pondentes, quando apropriado e conveniente.

No caso de serem dadas citações de pedidos de patentes oupublicações científicas, a matéria dos produtos finais, as preparações farma-cêuticas e as reivindicações são aqui incorporadas no presente pedido porreferência a essas publicações. Se aparecer qualquer discrepância entredeclarações em uma referência incorporada e a presente descrição, então,devem prevalecer as declarações na presente descrição.

A estrutura dos agentes ativos identificados por números de có-digo, nomes genéricos ou comerciais pode ser tirada da atual edição docompêndio-padrão "The Merck Index" ou de bases de dados, por exemplo,Patentes Internacionais (por exemplo, IMS World Publications). Seu conteú-do correspondente é aqui incorporado por referência.Descobriu-se agora, surpreendentemente, que a combinação deAMN107 e PKC412 possui propriedades terapêuticas que a tornam particu-larmente útil como um inibidor da atividade de tirosina quinase e, particular-mente, para o tratamento e profilaxia de doenças induzidas por KIT-D816Voncogênico, como mastocitose sistêmica.

KIT-D816V, conforme usado acima e abaixo, é a designação doproduto de mutação do gene c-Kit, em que o ácido nucléico que codifica oácido aspártico no resíduo 816 do polipeptídio KIT sofre uma mutação paracodificar uma valina. KIT-D816V também se refere ao produto polipeptídicodo gene C-K77" oncogênico com mutação.

A presente invenção se refere, portanto, ao uso da combinaçãode AMN107 e PKC412 para a preparação de um fármaco para o tratamentode mastocitose sistêmica induzida por mutação oncogênica de c-KIT D816Vou outras doenças associadas à mutação oncogênica de c-KIT D816V oumutações similares que ativem a tirosina quinase.

Mastocitose sistêmica (SM) inclui SM indolente, SM agressiva edoença hematológica de células não-mastócitos associada a SM e leucemiade mastócitos.

O termo "mastocitose", conforme aqui usado, se refere à masto-citose sistêmica, por exemplo, mastocitoma e também a neoplasias de mas-tócitos caninos. A mastocitose é um transtorno mieloproliferativo com limita-das opções de tratamento e, em geral, um prognóstico ruim. A patogêneseda mastocitose foi atribuída à ativação constitutiva do receptor de tirosinaquinase KIT. Em uma grande maioria dos pacientes com mastocitose, a ati-vidade desregulada de tirosina quinase de KIT é devido a uma mutação nocódon 816 da proteína (D816V), que também confere resistência a imatinibou mesilato de imatinib, este último sendo comercializado como Gleevec®nos Estados Unidos ou Glivec® e outros lugares, in vitro e in vivo.

Mastócitos desempenham um importante papel como célulasefetoras primárias nos transtornos alérgicos aqui mencionados. A desgranu-lação mediada por IgE específica para antígeno de mastócitos leva à subse-qüente liberação de mediadores químicos e múltiplas citocinas e à síntesede leucotrieno. Além disso, os mastócitos estão envolvidos na patogêneseda esclerose múltipla.

Neoplasmas de mastócitos ocorrem tanto em seres humanos,quanto rm animais. Em cães, neoplasmas de mastócitos são chamadas demastocitomas, e a doença é comum, representando 7% - 21% dos tumorescaninos. Deve-se fazer uma distinção entre a mastocitose humana, quenormalmente é transitória ou indolente, e a neoplasia de mastócitos canina,que se comporta de maneira imprevisível e é freqüentemente agressiva emetastática. Por exemplo, mastocitomas solitários humanos não metastati-zam freqüentemente; em contraste, 50% dos mastocitomas caninos se com-portam de maneira maligna, conforme estimado por Hottendorf & Nielsen(1969) após uma revisão de 46 relatos publicados de tumores em 938 cães.

O envolvimento do receptor KIT na patogênese da mastocitoseé sugerido pela observação de que várias mutações resultantes em ativaçãoconstitutiva de KIT foram detectadas em inúmeras linhagens de mastócitos.Por exemplo, uma mutação pontual no c-KIT humano, que causa a substitui-ção de Asp816 por Val no domínio fosfotransferase e auto-ativação do re-ceptor, ocorre em uma linhagem de leucemia de mastócitos humana de lon-go prazo (HMC-1) e no códon correspondente em duas linhagens de mastó-citos de roedores. Além disso, essa mutação ativadora foi identificada in situem alguns casos de mastocitose humana. Duas outras mutações ativadorasforam encontradas na região de justaposição de membrana intracelular deKIT, isto é, a substituição Val560Gly na linhagem de mastócitos humanosHMC-1, e uma deleção de sete aminoácidos (Thr573-His579) em uma Iinha-gem de mastócitos de roedores chamada de FMA3.

A presente invenção se refere, mais particularmente, ao uso dacombinação de AMN107 e PKC412 para a preparação de um fármaco parao tratamento de mastocitose sistêmica.

Em outra modalidade, a presente invenção apresenta um méto-do para o tratamento de mastocitose sistêmica, compreendendo a adminis-tração a um mamífero necessitado desse tratamento de uma quantidadeterapeuticamente eficaz da combinação de AMN107 e PKC412 ou sais oupró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

De preferência, a presente invenção apresenta um método parao tratamento de mamíferos, particularmente seres humanos, que sofram demastocitose sistêmica, compreendendo a administração a um mamífero ne-cessitado desse tratamento de uma quantidade inibidora de KIT-D816V dacombinação de AMN107 e PKC412 ou sais farmaceuticamente aceitáveisdos mesmos.

Na presente descrição, o termo "tratamento" inclui tanto trata-mento profilático, quanto preventivo, assim como tratamento curativo ou su-pressor de doença, incluindo o tratamento de pacientes com risco de contraira doença ou com suspeita de terem contraído a doença, assim como pacien-tes doentes. Esse termo também inclui o tratamento para retardar a progres-são da doença.

O termo "curativo", conforme aqui usado, signfica eficácia no tra-tamento de episódios em curso envolvendo mastocitose sistêmica.

O termo "profilático" significa a prevenção do início ou recorrên-cia de doenças envolvendo mastocitose sistêmica.

O termo "retardo da progressão", conforme aqui usado, significaa administração do composto ativo a pacientes que estejam em um pré-estágio ou em uma fase precoce da doença a ser tratada, em que seja diag-nosticada, por exemplo, uma pré-forma da doença correspondente nos paci-entes, ou em que os pacientes estejam em uma condição, por exemplo, du-rante um tratamento médico ou uma condição resultante de um acidente sobo qual seja provável que se desenvolva a doença correspondente.

Essa faixa imprevista de propriedades significa que o uso dacombinação de AMN107 e PKC412 é de interesse particular para a fabrica-ção de um medicamento para o tratamento de mastocitose sistêmica.

Esse efeito pode ser particularmente relevante em termos clíni-cos para pacientes para pacientes com mastocitose sistêmica.

Para demonstrar que a combinação de AMN107 e PKC412 éparticularmente adequada para o tratamento de mastocitose sistêmica comboa margem terapêutica e outras vantagens, podem-se realizar ensaios clí-nicos de maneira conhecida por aqueles versados na técnica.

A dosagem precisa da combinação de AMN107 e PKC412 a serempregada para inibir mastocitose sistêmica depende de vários fatores, in-cluindo o hospedeiro, a natureza e a gravidade da condição que está sendotratada, o modo de administração A combinação de AMN107 e PKC412 po-de ser administrada junto ou independentemente por qualquer via, incluindoa via oral, parenteral, por exemplo, intraperitoneal, intravenosa, intramuscu-lar, subcutânea, intratumoral ou retal ou enteral. De preferência, a combina-ção de AMN107 e PKC412 é administrada por via oral, de preferência a umadosagem diária de 1 - 300 mg/kg de peso corporal ou, para a maioria dosgrandes primatas, uma dosagem diária de 50 - 5.000, de preferência 500 -3.000 mg. Uma dosagem diária oral preferida é de 1 - 75 mg/kg de peso cor-poral ou, para a maioria dos grandes primatas, uma dosagem diária de 10 -2.000 mg, administrada como uma dose única ou dividida em múltiplas do-ses, como uma dosagem duas vezes ao dia.

A dosagem precisa de PKC412 administrada em combinaçãocom AMN107 depende de vários fatores, incluindo o hospedeiro, a naturezae a gravidade da condição que está sendo tratada, o modo de administra-ção. Entretanto, em geral, resultados satisfatórios são conseguidos quandoPKC412 é administrada por via parenteral, por exemplo, intraperitoneal, in-travenosa, intramuscular, subcutânea, intratumoral ou retal ou enteral, porexemplo, oral, de preferência intravenosa ou, de preferência, oral, intraveno-sa a uma dosagem diária de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal, de preferência1 a 5 mg/kg de peso corporal. Em ensaios humanos, uma dose total de 225mg/dia é mais presumivelmente a Dose Máxima Tolerada (MTD). Uma do-sagem diária intravenosa preferida é de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal ou,para a maioria dos grandes primatas, uma dosagem diária de 200 - 300 mg.Uma dosagem intravenosa típica é de 3 a 5 mg/kg, três a cinco vezes porsemana.

Mais preferivelmente, PKC412 é administrada por via oral, porformas de dosagem como microemulsões, géis macios ou dispersões sóli-das em dosagens de até cerca de 250 mg/dia, em particular 225 mg/dia,administrada um, duas ou três vezes ao dia.

Normalmente, administra-se inicialmente uma pequena dose, ea dosagem é gradualmente aumentada até que a dosagem ótima para ohospedeiro sob tratamento seja determinada. O limite superior de dosagemé o imposto pelos efeitos colaterais e pode ser determinado por ensaio parao hospedeiro que está sendo tratado.

Combinações de AMN107 e PKC412 podem ser combinadas,independentemente ou juntos, com um ou mais veículos farmaceuticamenteaceitáveis e, opcionalmente, um ou mais outros adjuvantes farmacêuticosconvencionais e administradas por via enteral, por exemplo oral, na forma decomprimidos, cápsulas, caplets e outras, ou parenteral, por exemplo, intrape-ritoneal ou intravenosa, na forma de soluções ou suspensões injetáveis esté-reis. As composições enterais e parenterais podem ser preparadas por mei-os convencionais.

A combinação de AMN107 e PKC412 pode ser usada isolada-mente ou combinada com pelo menos um outro composto farmaceuticamen-te ativo para uso nessas patologias. Esses compostos ativos podem sercombinados na mesma preparação farmacêutica ou na forma de prepara-ções combinadas em "kit de partes", no sentido de que os parceiros de com-binação possam ser dosados independentemente ou com o uso de diferen-tes combinações fixadas com quantidades distintas dos parceiros de combi-nação, isto é, simultaneamente ou de maneira cronologicamente escalona-da, isto é, em diferentes momentos e com intervalos de tempo iguais ou dife-rentes para qualquer parte do kit de partes. Exemplos não-limitativos decompostos que podem ser citados para uso em combinação com a combi-nação de AMN107 e PKC412 são fármacos quimioterápicos citotóxicos, co-mo citosina arabinosida, daunorrubicina, doxorrubicina, ciclofosfamida, VP-16 ou imatinib e outros. Além disso, a combinação de AMN107 e PKC412poderia ser combinada com outros inibidores de transdução de sinal ou ou-tros fármacos direcionados a oncogenes, com a expectativa de que resulta-ria uma sinergia significativa.

A invenção também se refere à combinação de AMN107 ePKC412 conforme aqui descrita com imatinib para o tratamento da doença econdições aqui descritas. A administração dessa combinação pode ser efe-tuada ao mesmo tempo, por exemplo, na forma de uma composição ou pre-paração farmacêutica combinada fixa ou seqüencialmente ou de maneiraescalonada no tempo. A administração da combinação de AMN107 ePKC412 em uma forma de dosagem conforme aqui descrita e de imatinib emsua forma comercializada de GLEEVEC® nos EUA (GLIVEC® na Europa) ecom as dosagens consideradas para essas formas de dosagem é atualmen-te preferida.

O tratamento de mastocitose sistêmica com a combinação aci-ma pode ser um chamado tratamento de primeira linha, isto é, o tratamentode uma doença recém-diagnosticada, sem nenhuma quimioterapia prece-dente ou similar, ou também pode ser um chamado tratamento de segundalinha, isto é, o tratamento da doença depois de um tratamento precedentecom imatinib ou a combinação de AMN107 e PKC412, dependendo da gra-vidade ou estágio da doença, assim como da condição global do paciente eoutros.

A eficácia da combinação de AMN107 e PKC412 para o trata-mento de mastocitose sistêmica é ilustrada pelos resultados dos exemplos aseguir. Esses exemplos ilustram a invenção, sem, de forma alguma, limitarseu escopo.

Exemplos

Exemplo 1: Estudo Clínico

Avalia-se o efeito do Composto (II) sobre os níveis de transcritode c-KITe o status de mutação de c-kit em células malignas tiradas do san-gue e/ou medula óssea. SM pode resultar de atividade alterada de quinase.SM associada a c-Kit D816V também pode resultar de uma mutação ativa-dora no gene KIT. Q-RT-PCR para transcrito de c-KIT D816V na linha basal,ciclo 1 dia 15, ciclo 1, 2, 3 dia 28 e a cada 3e ciclo subseqüente, término doestudo. Análise de mutação de c-kit: três grupos separados, cada um com asseguintes populações de pacientes: Pontos terminais de SM: taxas de res-posta após 3 meses de terapia.Exemplo 2: Combinação de AMN107 e PKC412

No presente estudo, é demonstrado que os novos inibidores deTK PKC4125 e AMN10727 neutralizam o crescimento de células neoplásicasMC e Ba/F3 humanas que expressam KIT D816V muito eficazmente.PKC412 parece ser o composto mais potente com relação a isso, Também édemonstrado que PKC412 e AMN107 têm sinergia na produção da inibiçãodo crescimento em células HMC-1 expressando ou desprovidas de KITD816V. Esses dados mostram que PKC412 e AMN107 podem ser novosfármacos direcionados promissores para o tratamento de mastocitose.

Materiais e Métodos

Reaqentes

Os inibidores de TK imatinib (STI571), AMN10727 e PKC4125são obtidos da Novartis Pharma AG (Basiléia, Suíça). Soluções de estoquede AMN107 e PKC412 são preparadas por dissolução em sulfóxido de dime-tila (DMSO) (Merck, Darmstadt, Alemanha). Fator de célula-tronco (SCF)humano recombinante (rh) é adquirido na Strathmann Biotech (Hannover,Alemanha), meio RPMI 1640 e soro de novilho fetal (FCS) da PAA Laborato-ries (Pasching, Áustria), L-glutamina e meio de Dulbecco modificado de Is-cove (IMDM) da Gibco Life Technologies (Gaithersburg, MD), 3H-timidina daAmersham (Buckinghamshire, UK) e iodeto de propídio da Sigma (St. Louis,MO). Interferon alfa (IFNa) é obtido da Roche (Basiléia, Suíça), 2-clorodesoxiadenosina (cladribina, aqui designada como "2CdA") da JanssenCilag (Titusville, NJ) e rh interleucina-4 (IL-4) da Peprotech (Rocky Hillf NJ).Os anticorpos monoclonais (mAbs) marcados com ficoeritrina (PE) IVT085(CD2), WM15 (CD13), YB5.B8 (CD117), N6B6.2 (CD164) e 97A6 (CD203c)são adquiridos na Becton Dickinson (San Jose, CA), e o mAb conjugado aPE CLB-gran12 (CD63) da Immunotech (Marselha, França).Células HMC-1 expressando ou desprovidas de c-K77"D816V

A linhagem de mastócitos humanos HMC-128 gerada a partir deum paciente com leucemia de mastócitos foi gentilmente fornecida pelo Dr.J. H. Butterfield (Mayo Clinic, Rochester, MN). Dois subclones de HMC-1 sãousados, a saber, HMC-1.1 portador da mutação de c-KIT V560G, mas não amutação de c-KIT D816V20 e um segundo subclone, HMC-1.2, portador deambas as mutações de c-KIT, isto é, V560G e D816V.20 As células HMC-1são cultivadas em IMDM suplementado com 10% de FCS, L-glutamina eantibióticos a 379C e 5% de C02. As células HMC-1 são novamente des-congeladas a partir de um estoque original a cada 4 a 8 semanas e são se-manalmente submetidas a uma passagem. Como controle de "estabilidadefenotípica", células HMC-1 são periodicamente verificadas quanto a i) a pre-sença de grânulos metacromáticos, ii) expressão de KIT de superfície e iii) oefeito de modulação negativa de IL-4 (100 U/mL, 48 horas) sobre a expres-são de KIT.29 Esses experimentos de controle são feitos antes de cada con-junto de experimentos, e apenas células HMC-1 exibindo todas as caracte-rísticas do clone original29 são usadas.

Células Ba/F3 com expressão induzível de wt c-KIT ou c-KIT D816V

A geração de células Ba/F3 com expressão induzível por doxici-clina de wt c-K77"(Ton.Kit.wt) ou c-KIT D816V é descrita em detalhes em ou-tro lugar.30 Em resumo, células Ba/F3 expressando o transativador tet re-verso31,32 são co-transfectadas com vetor pTRE2 (Clontech, Palo Alto, CA)contendo cDNA de c-KIT D816V (ou cDNA de wt c-KIT, ambos gentilmentefornecidos pelo Dr. J. B. Longley, Universidade de Columbia, Nova Iorque,EUA) e pTK-Hyg (Clontech) por eletroporação. Depois da eletroporação, cé-lulas transfectadas de maneira estável são selecionadas por cultivo em hi-gromicina, e clonadas por diluição limitativa. No presente estudo, o subcloneTon.Kit.D816V.27 é usado em todos os experimentos. Essas célulasTon.Kit.D816V exibem uma baixa taxa de crescimento por descrição à doxi-ciclina.30 Conforme avaliado por Western blotting, imunocitoquímica, PCR eanálise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (R-FLP)16, a expressão de KIT D816V pode ser induzida em célulasTon.Kit.D816V.27 em 12 horas por exposição à doxiciclina (1 pg/mL).30Isolamento de Mastócitos Neoplásicos Primários

MC de medula óssea (bm) primários são obtidos de uma pacien-te mulher (idade de 54) com mastocitose sistêmica latente (SSM), uma sub-variante distinta de SM caracterizada pelo envolvimento de múltiplas linha-gens hematopoiéticas e detecção de c-K/T D816V em células mielóides delinhagem MC e não MC.34-36 Para fins de controle, analisa-se bm obtida deum paciente sofrendo de Iinfoma maligno (sem envolvimento da bm) queforam submetidos a escalonamento. Ambos os pacientes deram seu consen-timento informado antes da punção da bm. O aspirado de bm é obtido dacrista ilíaca posterior e coletada em seringas contendo heparina livre de con-servante. As células são postas em camadas sobre Ficoll para isolar célulasmononucleares (MNC). Verifica-se que as frações de MNC contêm 5% deMC no paciente com SSM e menos de 1% de MC na amostra de controle(bm normal). A viabilidade celular é > 90%. A presença da mutação de c-KITD816V em MNC de bm no paciente com SSM é confirmada por RT-PCR eanálise RFLP efetuada conforme anteriormente descrito. 16

Análise de Fosforilacão de Kit por Western Blotting

Células HMC-1 (106/mL) e células Ba/F3 (106/mL) contendo wtKIT (Ton.Kit.wt) ou KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27) são incubadas comPKC412 (1 μΜ), AMN107 (1 μΜ), imatinib (1 μΜ) ou meio de controle a 37°Cdurante 4 horas. Antes da descrição a fármacos inibidores, as célulasTon.Kit.wt e as células Ton.Kit.D816V.27 são incubadas com doxiciclina (1μg/mL) a 37°C durante 24 horas para induzir a expressão de KIT. No casode células Ton.Kit.wt, a fosforilação de KIT é induzida por adição de rhSCF(100 ng/mL). Imunoprecipitação (IP) e Western blotting são efetuados con-forme anteriormente descrito.32 Em resumo, as células são lavadas a 4°C eressuspendidas em tampão RIPA (1 mL de tampão por 108 células) consis-tindo em 50 mM de Tris, 150 mM de cloreto de sódio (NaCI), 1% de nonidetP40 (NP-40), 0,25% de ácido desoxicólico, 0,1% de dodecil sulfato de sódio(SDS)1 1 mM de ácido etileno-diamina-tetraacético (EDTA), 1 mM de fluoretode sódio (NaF), 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) e 1 mM deortovanadato de sódio (Na3V04). Depois da incubação em tampão RIPAsuplementado com coquetel inibidor de proteinase (Roche) durante 30 minu-tos a 4°C (vigorosamente remoinhado a cada 5 minutos), os Iisados são cen-trifugados para remover partículas insolúveis. Para IP, Iisados de 1 χ 107células são incubados com anticorpo anti-KIT SR137 (gentilmente fornecidopelo Dr. V. Broudy, Universidade de Washington, Seattle1 WA) ou com o an-ticorpo anti-KIT 1C138 (gentilmente fornecido pelo Dr. H.-J. Bühring, Univer-sidade de Tübingen, Alemanha) e contas de proteína G Sepharose (Amer-sham) em tampão IP (50 mM de Tris-CI, pH 7,4, 150 mM de NaCI, 100 mMde NaF e 1% de NP40) a 49C durante uma noite. Então, as contas são lava-das 3 vezes em tampão IP. Lisados e imunoprecipitados são, então, separa-dos sob condições redutoras por eletroforese em SDS-gel de poliacrilamidaa 7,5% e transferidos para uma membrana de nitrocelulose (Protran, Schlei-cher & Schuell, Keene, NH) em tampão contendo 25 mM de Tris, 192 mM deglicina e 20% de metanol a 4°C. As membranas são bloqueadas durante 1hora em 5% de reagente de bloqueio (Roche) e são, então, incubadas comanticorpo anti-KIT 1C1 ou com o anticorpo monoclonal 4G10 (Upstate Biote-chnology, Lake Placid, NY) dirigido contra proteínas fosforiladas com tirosi-na, a 4-C durante uma noite. A reatividade do anticorpo é tornada visível poranticorpo IgG anticamundongo de ovelha e reagente de detecção LumingenPS-3 (ambos da Amersham) e um filme CL-Xposure (Pierce Biotechnology,Rockford, IL).

Medição da Captação de 3H-Timidina

Para determinar os efeitos do fármaco inibidor de crescimento,células HMC-1 e células Ba/F3 contendo wt KIT ativada com SCF(Ton.Kit.wt) ou KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27) são incubadas com váriasconcentrações de PKC412 (100 pM - 10 μΜ), AMN107 (1 nM - 100 μΜ) ouimatinib (3 nM - 300 μΜ) em placas de cultura de 96 cavidades (PTT, Tra-sadingen, Suíça) a 37°C em 5% de C02 durante 48 horas. Em experimentosde curso temporal, células HMC-1 são expostas a PKC412 (300 nM) durantevários períodos de tempo (1, 12, 24, 36 e 48 horas). Em experimentos sele-cionados, células HMC-1 (ambas subclones) são incubadas com várias con-centrações de IFNa (0,1 - 500.000 U/mL) ou 2CdA (0,005 - 10 μg/mL). Cé-lulas primárias (células de bm de um paciente com SSM e células de bm decontrole) são cultivadas na presença ou ausência de inibidores (PKC412, 50-500 nM; AMN107, 100 nM-30 μΜ; imatinib, 1 μΜ) durante 48 horas.

Depois da incubação, 1 μΰϊ de 3H-timidina é adicionado a cadapoço e mantido durante 12 horas (37°C). Então, as células são colhidas emmembranas de filtro (Packard Bioscience, Meriden, CT) em uma coletor Fil-termate 196 (Packard Bioscience). Os filtros são secados ao ar, e a radioati-vidade ligada é contada em um contador β (Top-Count NXT1 Packard Bios-cience).

Em um conjunto separado de experimentos, determina-se os e-feitos de combinações de fármacos (aditivos versus sinérgicos) sobre ocrescimento de MC neoplásicos. Para essa finalidade, células HMC-1 (am-bas subclones) são expostas a várias combinações de fármacos (PKC412,AMN107, imatinib, IFNa, 2CdA) a uma razão fixa de concentrações de fár-macos. Interações de fármacos (aditivas versus sinérgicas) são determina-das por cálculo dos valores de índice de combinação usando um softwarecomercialmente disponível (Calcusyn; Biosoft, Ferguson, MO).39 Todos osexperimentos são realizados em triplicata.

Avaliação de Apoptose por Morfoloqia Convencional e Microscopia Eletrôniça

Os efeitos de inibidores de TK sobre a apoptose em célulasHMC-1 são analisados por exame morfológico, citometria de fluxo e micros-copia eletrônica. Em experimentos típicos, células HMC-1 são incubadascom várias concentrações de PKC412 (500 nM - 1 μΜ), AMN107 (50 nM -10 μΜ), imatinib (50 nM - 10 μΜ) ou meio de controle em placas de culturade 6 cavidades (PTT) em meio IMDM contendo 10% de FCS a 379C durante24 horas. A porcentagem de células apoptóticas é quantificada em prepara-ções de citospin tingidas com Wright-Giemsa. A apoptose é definida de a-cordo com critérios citomorfológicos convencionais (contração celular, con-densação da estrutura da cromatina).40

Para confirmar a apoptose em células HMC-1, a microscopia e-letrônica é realizada conforme descrito41,42 usando-se células HMC-1 (am-bas subclones) expostas a PKC412 (500 nM, 900 nM ou 1 μΜ), AMN107 (1μΜ), imatinib (1 μΜ) ou meio de controle em frascos de cultura de plásticode 25 ml_ (PTT) durante 24 horas. Depois da incubação, as células são la-vadas e fixadas em 2% de paraformaldeído, 2,5% de glutaraldeído e 0,025%de CaCI2 tamponados em 0.1 mol/L de tampão cacodilato de sódio (pH 7,4)à temperatura ambiente (TA) durante 60 minutos. Então, as células são la-vadas três vezes em 0,1 mol/L de tampão cacodilato de sódio, em suspen-são em 2% de ágar e centrifugadas. Os péletes são pós-fixados com 1,3%de 0s04 (tamponados em 0,66 mol/L de colidina) e tingidas "em bloco" em2% de acetato de uranila e tampão de maleato de sódio (pH 4,4) duranteduas horas à TA. Então, os péletes são enxaguados, desidratados em sériede álcool e incrustados em EPON 812. Seções ultrafinas (85 nM) são corta-das e colocadas em grades de ouro. As seções são contrastadas em acetatode uranila e citrato de chumbo e visualizadas em um microscópio eletrônicode transmissão JEOL 1200 EX Il (JEOL, Tóquio, Japão). A presença de cé-lulas apoptóticas é determinada usando-se critérios morfológicos convencio-nais (veja acima).

Avaliação de Apoptose por Ensaio Tunel e Citometria de Fluxo

Para confirmar a apoptose em células HMC-1 expostas aPKC412 (1 μΜ), AMN107 (1 μΜ) ou imatinib (1 μΜ) durante 24 horas, aplica-se um ensaio Tunel (marcação de extremidade de ponta com dTUP-fluresceno mediada por transferase terminal in situ) conforme anteriormentedescrito.43,44 Em resumo, as células são primeiro lavadas em solução sali-na tamponada com fosfato (PBS) e fixadas em formaldeído a 1%, a pH 7,4,a 0-C durante 15 minutos. Então, as células são tratadas com etanol a 70%(gelado) durante uma hora, lavadas em PBS e incubadas em solução dereação de transferase terminal contendo CoCI2, DNA desóxi-nucleotidil-exotransferase e biotin-16-2'-desóxi-uridin-5'-trifosfato (preparado de acordocom as instruções de fabricante Boehringer Mannheim, Alemanha) a 379Cdurante 10 minutos. Depois da incubação, as células são lavadas e, então,incubadas com Estreptavidina FLuoresceina (Boehringer Mannheim) (10μg/mL) a 37eC durante 20 minutos. As células HMC-1 são, então, lavadas eanalisadas com um microscópio de fluorescência Nikon Microphot-FXA (Tó-quio, Japão).

Para a determinação citométrica de fluxo da apoptose e viabili-dade celular, realiza-se um tingimento com anexina V/iodeto de propídiocombinados. Para essa finalidade, as células HMC-1 são expostas aPKC412 (0,5, 1 e 2,5 μΜ), AMN107 (0,5, 1 e 2,5 μΜ), imatinib (0,5, 1 e 2,5μΜ) ou meio de controle a 37-C durante 24 horas. Depois disso, as célulassão lavadas em PBS e, então, são incubadas com anexina V-APC (AlexisBiochemicals, Lausen1 Suíça) em tampão de ligação contendo HEPES (10mM, pH 7,4), NaCI (140 mM) e CaCI2 (2,5 mM). Depois disso, adiciona-seiodeto de propídio (1 pg/mL). As células são, então, lavadas e analisadaspor citometria de fluxo em um FACSCaIibur (Becton Dickinson).

Avaliação da Expressão de Antíqenos de Superfície Ligados à Ativação emCélulas HMC-1

A expressão de antígenos de superfície celular em células HMC-1 portadoras de KIT D816V (células HMC-1.2) é determinada por citometriade fluxo após cultura de curto prazo (durante 24 horas) em meio de controleou meio suplementado com inibidores de TK (PKC412, 1 μΜ; AMN107, 1μΜ; imatinib, 1 μΜ). Em experimentos selecionados, aplicam-se várias con-centrações de PKC412 (50, 100, 250, 500 e 1000 nM). Depois da incubaçãocom fármacos, as células HMC-1 são lavadas e submetidas à citometria defluxo de cor única usando anticorpos conjugados a PE contra antígenos deMC sabidamente superexpressados em MC neoplásicos em SM (em compa-ração com MC normais) e/ou que são expressados em um estágio precoceda mastopoiese (CD2, CD13, CD63, CD117, CD164, CD203c).45-47 A cito-metria de fluxo é realizada em um FACSan (Becton Dickinson) conformeanteriormente descrito.29

Análise Estatística

Para determinar o significado de diferenças entre taxas de proli-feração, apoptose e níveis de expressão em superfície após a descrição decélulas HMC-1 a inibidores, aplica-se o teste t de Student para amostras de-pendentes. Os resultados são considerados estatisticamente significativosquando ρ é < 0,05.Resultados

Efeitos de PKC412 e AMN107 sobre a Atividade de TK KIT com mutaçãoD816V

Conforme avaliado por IP e Western blotting, PKC412 (1 μΜ)diminuiu a fosforilação de KIT em células HMC-1.1 (exibindo a mutação dec-KIT V560G, mas não a mutação de c-KIT D816V), assim como em célulasHMC-1.2 portadoras da mutação V560G, assim como a variante com muta-ção D816V de KIT (Figuras 1A e 1B). O novo inibidor de TK AMN107 (1 μΜ)reduziu fortemente a fosforilação de KIT em células HMC-1.1, mas mostrouapenas um efeito fraco na fosforilação de KIT em células HMC-1.2 a 1 μΜ.Da mesma forma, imatinib (1 μΜ) reduziu a fosforilação de KIT em célulasHMC-1.1, mas não inibiu a fosforilação de KIT em células HMC-1.2 (Figuras1A e 1B). Em uma etapa seguinte, examinam-se os efeitos dos inibidores deTK em células Ba/F3 exibindo wt KIT (Ton.Kit.wt) ou KIT D816V(Ton.Kit.D816V.27) após descrição à doxiciclina. Em células Ton.Kit.wt, KITpareceu ser fosforilada na presença (mas não na ausência) de SCF, ao pas-so que se verificou que KIT era constitutivamente fosforilada em célulasTon.Kit.D816V.27 (Figura 1C). Conforme se observa na Figura 1C, todos os3 inibidores de TK (PKC412, AMN107, imatinib, cada um a 1 μΜ) diminuírama fosforilação de KIT induzida por SCF em células Ton.Kit.wt. Em contraste,apenas PKC412 e, em menor grau, AMN107, diminuíram a fosforilação deKIT independente de SCF em células Ton.Kit.D816V-27. Imatinib (1 μΜ) nãomostrou nenhum efeito detectável na fosforilação de KIT nessas células (Fi-gura 1D). Esses dados mostram que PKC412 é um novo potente inibidor daatividade de TK de wt KIT, KIT V560G e KIT D816V e que AMN107 é umnovo potente inibidor de wt KIT e KIT V560G e um inibidor mais fracos de(auto)fosforilação de KIT D816V.

Efeitos de Inibidores de TK Sobre a Captação de 3H-timidina em CélulasHMC-1

Em experimentos de curso temporal, efeitos inibidores máximosde PKC412, AMN107 e imatinib sobre o crescimento de células HMC-1.1 ecélulas HMC-1.2 são observados após 36 - 48 horas. A Figura 2A mostra oefeito dependente do tempo de PKC412 (300 nM) sobre o crescimento decélulas HMC-1.2. Conforme mostrado nas Figuras 2B e 2C, PKC412 eAMN107 se mostram capazes de neutralizar a captação de 3H-timidina emcélulas HMC-1.1 e células HMC-1.2 de maneira dependente da dose. Demaneira interessante, a IC50 para os efeitos de PKC412 nesses dois sub-clones parecia estar na mesma faixa (50 - 250 nM) (Figura 2B). Em contras-te, os valores de IC50 para os efeitos de AMN107 sobre a proliferação sãosignificativamente mais elevados em células HMC-1.2 (1 - 5 μΜ) em compa-ração com os encontrados em células HMC-1.1 (3-10 nM) (Figura 2C).

Conforme esperado, imatinib só é eficaz a concentrações farmacologica-mente relevantes em células HMC-1.1 (IC50: 10-30 nM), ao passo que ne-nhum efeito antiproliferativo significativo de imatinib em células HMC-1.2 éobservado (Figura 2D), confirmando dados anteriores.20-22 Uma observa-ção interessante é que AMN107 é o composto mais potente (em bases mo·lares), quando se comparam os efeitos inibidores de crescimento dos trêsfármacos em células HMC-1.1 exibindo a mutação de c-KIT V560G (masnão a mutação de c-KIT D816V) (Figuras 2B-D).

Efeitos de Inibidores de TK sobre o Crescimento de Células Ba/F3 Expres-sando wt KIT ou KIT D816V

Conforme mostrado na Figura 3A, todos os 3 inibidores de TKse mostram capazes de neutralizar o crescimento dependente de SCF decélulas Ton.Kit.wt expostas à doxiciclina (expressando KIT) de maneira de-pendente da dose, com valores de IC50 de 3 - 30 nM para PKC412, 30 - 300nM para AMN107 e 3 - 30 nM para imatinib. Em contraste, em célulasTon.Kit.D816V, apenas PKC412 (IC50: 100 - 300 nM) e, em menor grau,AMN107 (IC50: 1-3 μΜ) se mostram capazes de inibir a incorporação de 3H-timidina, ao passo que nenhum efeito significativo é obtido com imatinib nafaixa de dose testada (Figura 3B). Nenhum dos três inibidores usados semostrou capaz de neutralizar o crescimento de células Ton.Kit.wt ou célulasTon.Kit.D816V.27 na ausência de doxiciclina, isto é, na ausência de KIT(Figuras 3A e 3B). Em experimentos de controle adicionais, nem doxiciclina(1 μg/mL) nem os inibidores de TK (imatinib, PKC412, AMN107) mostraramefeitos inibidores de crescimento em células Ba/F3 de controle (não transfec-tadas) (não mostrado).

PKC412 e AMN107 Neutralizam o Crescimento de Células (Mastócitos) Ne-oplásicas Primárias Expressando KIT D816V

Para reconfirmar os efeitos antiproliferativos de PKC412 eAMN107 em mastocitose sistêmica, examina-se a resposta de MC neoplási-cos primários derivados de medula óssea (bm) em um paciente com SM la-tente, uma subvariante especial de SM, que a maioria das células mielóides(MC, assim como células de linhagem não MC) exibem KIT D816V. De fato,embora a pureza de MC seja de apenas 4%, a maioria das células mielóidesnessa amostra exibiu KIT D816V. Nessas células de bem neoplásicas,PKC412 e AMN107 se mostraram capazes de inibir a captação espontâneade 3H-timidina de maneira dependente da dose, ao passo que nenhum efei-to significativo é observado com imatinib (1 μΜ) (Figura 4). Na amostra decontrole (bm normal, sem doença hematológica), PKC412 não mostrou ne-nhum efeito sobre a captação de 3H-timidina (não mostrado).PKC412 e AMN107 Induzem Apoptose em células HMC-1

Para explorar os mecanismos subjacentes aos efeitos inibidoresde crescimento de PKC412 e AMN107 em MC humanos neoplásicos exibin-do ou desprovidos de KIT D816V, analisam-se sinais morfológicos e bioquí-micos de apoptose em células HMC-1.1 e células HMC-1.2 após descriçãoao fármaco. Nesses experimentos, PKC412 se mostra capaz de induzir a-poptose tanto em ambos os subclones de HMC-1 de maneira dependente dadose (Figuras 5A e 5B). AMN107 também se mostra capaz de induzir apop-tose em ambos os subclones de HMC-1 de maneira dependente da dose,mas o efeito desse composto é muito mais pronunciado em células HMC-1.1(Figura 5C) em comparação com os encontrados em células HMC-1.2 (Figu-ra 5D). Da mesma forma, imatinib se mostra capaz de produzir apoptose emcélulas HMC-1.1 (Figura 5E), mas não mostrou nenhum efeito em célulasHMC-1.2 (Figura 5F). Os efeitos indutores de apoptose dos fármacos emcélulas HMC-1 poderiam ser confirmados por microscopia eletrônica. Maisuma vez, todos os três fármacos (cada um a 1 μΜ) se mostram capazes deinduzir apoptose em células HMC-1.1, ao passo que, em células HMC-1.2,apenas PKC412 e, em menor grau, AMN107 se mostram capazes de produ-zir apoptose em células HMC-1.2. A Figura 6 mostra o efeito indutor de a-poptose de PKC412 (1 μΜ, 24 horas) em células HMC-1.2. Conforme se ob-serva, muitas das células HMC-1 expostas a PKC412 (Figuras 6B-D) exibi-ram sinais ultra-estruturais típicos de apoptose, em comparação com célulasmantidas em meio de controle (Figura 6A). Finalmente, são capazes de de-monstrar os efeitos indutores de apoptose de PKC412 e AMN107 em célulasHMC-1 por coloração com anexina V/iodeto de propídio combinados e cito-metria de fluxo (Figura 7), assim como em um ensaio Tunel (Figura 8). Emambos os ensaios, PKC412 (1 μΜ) e, em menor grau, AMN107 (1 μΜ) semostram capazes de induzir apoptose em HMC-1.2, ao passo que imatinibnão mostrou nenhum efeito (Figuras 7 e 8E-H). Em contraste, em célulasHMC-1.1, todos os 3 compostos se mostram capazes de induzir apoptoseconforme avaliado por ensaio Tunel (Figuras 8A-D).

Esses dados fornecem evidências de que os efeitos inibidoresde crescimento de PKC412 e AMN107 em células HMC-1 estão associadosà indução de apoptose.

PKC412 Regula Negativamente a expressão de Antígenos de Superfície

Celular Ligados à Ativação e Relacionados a SM em células HMC-1Vários antígenos de superfície celular que são tipicamente (su-per)expressados em MC neoplásicos em SM podem desempenhar um papelno crescimento, ativação ou distribuição de células neoplásicas.45,46 Algu-mas dessas moléculas podem ser reguladas positivamente diretamente pelavariante com mutação D816V de KIT.30 Conseqüentemente, pergunta-se sePKC412, AMN107 ou imatinib influenciaria a expressão de antígenos de su-perfície celular em células HMC-1.2. Células HMC-1.2 não-estimuladas semostram capazes de expressar LFA-2 (CD2), aminopeptidase-N (CD13),CD63, KIT (CD117), CD164 e E-NPP3 (CD203c) confirmando dados anterio-res.45-47 A incubação de células HMC-1.2 com PKC412 resultou em umadiminuição significativa na expressão de CD2, CD63 e CD164 (p < 0,05) (Fi-gura 9A). Em contraste, nenhum efeito significativo de PKC412 sobre a ex-pressão de CD13 ou CD203c é observado (Figura 9A). No caso de KIT, umaleve diminuição da expressão em células HMC-1.2 é encontrada com a des-crição a PKC412 (assim como com descrição a AMN107 ou imatinib), mas oefeito não é significativo (p > 0,05) (Figura 9A). Os efeitos de PKC412 sobrea expressão de CD2 e CD63 se mostram dependentes da dose. A Figura 9Bmostra os efeitos de várias concentrações de PKC412 sobre a expressão deCD63 em células HMC-1.2. Em contraste com PKC412, nenhum efeito signi-ficativo de AMN107 ou imatinib sobre a expressão de antígenos CD em célu-las HMC-1.2 é observado (Figura 9A).

PKC412 Coopera com outros Fármacos Direcionados e Convencionais naProdução da Inibicão de Crescimento em Células HMC-1

Conforme avaliado por incorporação de 3H-timidina, PKC412 semostra capaz de cooperar com AMN107 na produção da inibição de cresci-mento em células HMC-1.1 e células HMC-1.2 (Figura 10; Tabela 1). No ca-so de células HMC-1.1, a interação de fármacos se mostra claramente si-nérgica, ao passo que, em células HMC-1.2, as interações são aditivas, emvez de sinérgicas (Figura 10; Tabela 1). Além disso, PKC412 e 2CdA, umfármaco usado com sucesso para tratar mastocitose agressiva, se mostramcapazes de inibir o crescimento de células HMC-1.1 de maneira sinérgica, eo mesmo efeito sinérgico é observado com PKC412 e imatinib (Tabela 1).Mais uma vez, entretanto, não se observa nenhum efeito sinérgico claro dePKC412 e 2CdA sobre o crescimento de células HMC-1.2. Da mesma forma,AMN107 e imatinib produziram efeitos inibidores sinérgicos apenas em célu-las HMC-1.1 (Figura 10), mas não em células HMC-1.2 portadoras de KITD816V (Tabela 1). Não se observa nenhum efeito sinérgico ou aditivo sobreo crescimento de células HMC-1, quando se combinam PKC412 e interferon-alfa (IFNa) ou AMN107 e IFNa (Tabela 1). Um resumo das interações dosfármacos é mostrado na Tabela 1.Tabela 1

Interações dos fármacos em células HMC-1.1 e células HMC-1.2

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Conforme mostrado na Tabela 1, os efeitos de várias combina-ções de fármacos sobre o crescimento de células HMC-1.1 (quadradosbrancos no lado superior direito) e células HMC-1.2 (quadrados cinza no la-do inferior esquerdo) são determinados por ensaio de incorporação de 3H-timidina. Cada combinação de fármacos é testada em pelo menos três expe-rimentos independentes. Os fármacos são aplicados a uma razão fixa, e osefeitos resultantes (e o tipo de interação medicamentosa) determinado pelosoftware Calcusyn. Contagem: +, efeito inibidor do crescimento sinérgico;+/-, efeito aditivo; efeito menos que aditivo (antagonista). n.t., não testado.

Discussão

A mutação somática de c-KIT D816V é um defeito de gene queleva à ativação constitutiva do domínio TK do receptor de KIT, que está en-volvido de maneira crítica no crescimento (neoplásico) de MC e, portanto, napatogênese de SM. 13-17 Conseqüentemente, tentativas recentes focaliza-ram na identificação e desenvolvimento de compostos farmacológicos quepudessem inibir a atividade de TK da variante com mutação D816V de KIT e,dessa forma, pudessem inibir o crescimento de MC neoplásicos em pacien-tes com SM.9'12 Foi descrito aqui que o inibidor de TK PKC412 e, em menorgrau, AMN107 inibem a atividade de TK de KIT-D816V, assim como o cres-cimento de MC humanos neoplásicos portadores dessa mutação de c-KITparticular. Além disso, é mostrado que ambos os fármacos cooperam entresi, assim como com outros fármacos direcionados e convencionais na pro-dução da inibição de crescimento em MC neoplásicos.

PKC412 é um novo inibidor relacionado à esteurosporina dePKC e de várias TKs incluindo KDR1 PDGFRA, FLT3 e KIT.5 No presenteestudo, é demonstrado que PKC412 neutraliza o crescimento de MC neo-plásicos humanos e células Ba/F3 que expressam a variante com mutaçãoD816V de KIT. Com relação a células Ba/F3, os dados estão em linha comos resultados de Growney et al.48 De maneira interessante, a faixa de doseeficaz para células Ba/F3 se mostra a mesma que a encontrada em célulasHMC-1.2 portadoras de KIT D816V. Outra observação interessante é que aIC50 para os efeitos de PKC412 nos dois subclones de HMC-1 (expressan-do ou desprovidos de KIT D816V) pareceram estar na mesma faixa. Final-mente, são capazes de confirmar os efeitos inibidores de crescimento dePKC412 para células (mastócitos) neoplásicas humanas primárias que ex-pressam KIT D816V. Como a mutação D816V de c-KIT é detectável na mai-oria de todos os pacientes com SM independentemente do subtipo da doen-ça, 13-17 esses dados são de considerável importância. De fato, PKC412parece ser o primeiro inibidor de TK que confirmadamente neutraliza o cres-cimento de MC humanos portadores de KIT D816V da mesma maneira queMC que expressam KIT wt. Também é digno com relação a isso, que os efei-tos inibidores de PKC412 em células KIT D816V positivas excadem as ativi-dades antiproliferativas de AMN107 e imatinib. Com base nessas observa-ções, PKC412 parece ser um novo fármaco direcionado atraente para serconsiderado para uso em ensaios clínicos em pacientes com SM (agressiva)ou MCL.

Dados recentes sugerem que AMN107 é um inibidor mais poten-te da atividade TK de BCR/ABL.27 Também foi descrito que AMN107 inibe aatividade de TK de KIT do tipo selvagem.27 No presente estudo, foi desco-berto que AMN107 exerce potentes efeitos em células HMC-1 portadoras damutação V560G de c-KIT, mas exibe apenas efeitos fracos em células HMC-1 portadoras tanto de KIT V560G, quanto de KIT D816V. Da mesma forma,AMN107 mostrou apenas efeitos fracos sobre o crescimento de célulasBa/F3 que expressam a variante com mutação D816V de KIT. Esses dadossugerem que a mutação D816V de c-KIT, mas não a mutação de c-KITV560G, confere resistência relativa contra AMN107, embora AMN107 aindaretenha efeitos inibidores em células HMC-1 KIT D816V positivas em com-paração com imatinib. Os impressionantes efeitos antiproliferativos deAMN107 em células V560G positivas também sugerem que esse compostopossa ser um fármaco candidato principal atraente para tumores de célulasestromais gastrointestinais (GISTs), em que mutações no códon 560 de c-KITforam recentemente relatados.49

Inúmeros inibidores farmacológicos direcionados à atividade deTK de moléculas pró-oncogênicas foram recentemente desenvolvidos emhematologia clínica.5,12,19,27 Os efeitos inibidores de crescimento dessesinibidores de TK em células neoplásicas (que expressam o alvo apropriado)normalmente estão associados à perda de atividade de TK e a apoptoseconsecutiva. No presente estudo, são capazes de demonstrar que os efeitosinibidores de crescimento de PKC412 em MC humanos neoplásicos (HMC-1) estão associados à inibição de TK de KIT (com mutação), assim como aapoptose. De fato, são capazes de demonstrar que PKC412 induz apoptoseem células HMC-1.1 (que expressam KIT V560G, mas não KIT D816V), as-sim como em células HMC-1.1 (que expressam KIT V560G e KIT D816V). Oefeito indutor de apoptose de PKC412 é demonstrável por microscopia ópti-ca e eletrônica, assim como por citometria de fluxo e em um ensaio Túnel.Conforme esperado, AMN107 e imatinib mostraram efeitos indutores de a-poptose significativos em células HMC-1.1, mas não exibiram efeitos signifi-cativos em células HMC-1.2.

Inúmeros antígenos de superfície celular são tipicamente (su-per)expressados em MC humanos neoplásicos. Da mesma forma, em con-traste com MC normais, MC neoplásicos em pacientes com SM expressamCD2 e CD25.45,46 Além disso, os níveis de CD63 e CD203c expressadosem MC neoplásicos na SM estão mais elevados em comparação com MCnormais. Em vários casos, como CD63, a variante com mutação D816V deKIT pode levar diretamente a uma expressão aumentada na superfície.30Estão, conseqüentemente, interessados em saber se o direcionamento paraKIT com mutação D816V em células HMC-1 por PKC412 está associado auma diminuição na expressão de antígenos CD de superfície "relacionados aSM". Os resultados dos experimentos mostram que PKC412 regula negati-vamente a expressão de CD2, CD63 e CD164 em células HMC-1.2 exibindoKIT D816V. Também se observa um efeito leve, mas insignificante, dePKC412 (assim como de AMN107) sobre a expressão de KIT. Uma obser-vação interessante é que AMN107 foi incapaz de suprimir a expressão deCD2 e CD63 em células HMC-1.2. Isso provavelmente é devido ao efeitomais fraco desse composto sobre a atividade de TK da KIT D816V, quandocomparado com o efeito de PKC412.

Inúmeros dados recentes sugerem que o tratamento de neopla-sias mielóides com inibidores de TK como agentes únicos pode ser insufici-ente para controlar a doença durante períodos de tempo prolongados. Issofoi documentado para o uso de imatinib em CML (avançada)50,51 e tambémpode se aplicar a pacientes com ASM ou MCL.52 Nestes últimos pacientes,esse é um problema particular, pois a mutação D816V confere uma resistên-cia primária (relativa) de KIT contra imatinib e, em menor grau, resistênciarelativa contra AMN107. Para superar a resistência, inúmeras estratégiasfarmacológicas diferentes podem ser consideradas. Uma possibilidade é a-plicar combinações de fármacos. Conseqüentemente, estão interessados emaprender se PKC412 e AMN107 exibiriam efeitos antiproliferativos sinérgicosem células HMC-1.1 e HMC-1.2. De fato, os dados mostram que PKC412coopera com imatinib e AMN107 na produção da inibição de crescimento emambos os clones de HMC-1. Além disso, PKC412 e 2CdA, um fármaco quefoi descrito como neutralizador do crescimento de MC neoplásicos in vivo empacientes com SM (agressiva), mostraram efeitos inibidores cooperativossobre o crescimento de células HMC-1.1 - e HMC-1.2. Entretanto, de maneirainteressante, verifica-se que as interações dos fármacos só são sinérgicasem células HMC-1.1, mas não em células HMC-1.2. Isso pode ser explicadopelos efeitos relativamente fracos (AMN107) ou ausentes (imatinib) de fár-macos co-aplicados sobre a atividade de TK de KIT e, portanto, sobre ocrescimento de células HMC-1.2 portadoras de D816V, em comparação comos efeitos muito mais pronunciados dos mesmos fármacos em células HMC-1.1. Nenhum efeito cooperativo do fármaco é observado quando se combinaIFNa com AMN107 ou PKC412. Se combinações de fármacos consistindoem PKC412 e outros fármacos (direcionados) serão de valor clínico em pa-cientes com ASM ou MCL permanece desconhecido.

Assim, até agora, apenas poucos agentes com efeitos antiproli-ferativos documentados sobre MC neoplásicos in vivo em pacientes com SMforam apresentados, e nenhum desses fármacos produz remissões comple-tas de longa duração em pacientes com ASM ou MCL. A noção de quePKC412 é o novo inibidor mais potente do crescimento de MC humanos ne-oplásicos portadores da variante com mutação D816V de KIT é particular-mente interessante com relação a isso.

Em resumo, é demonstrado que PKC412 e AMN107 são novosfármacos promissores direcionados a KIT do tipo selvagem e variantes commutação de KIT em SM. Embora cada um dos dois fármacos possa exibirum perfil farmacológico distinto com efeitos únicos sobre variantes com mu-tação de KIT, uma abordagem mais eficaz e promissora pode ser a de com-binar ambos os fármacos entre si ou com o medicamento clinicamente esta-belecido 2CdA para tratar pacientes com ASM ou MCL no futuro.

Exemplo 2: Combinação de Dasatinib e PKC412

Na maioria de todos os pacientes com mastocitose sistêmica(SM) incluindo SM agressiva e leucemia de mastócitos (MCL), as célulasneoplásicas apresentam a variante com mutação D816V de KIT. KIT-D816Vexibe atividade constitutiva de tirosina quinase (TK) e foi implicada no cres-cimento de células malignas. Conseqüentemente, foram feitas várias tentati-vas de identificar fármacos direcionados a KIT-D816V. Descobriu-se que oinibidor de TK dasatinib (BMS-354825) neutraliza a atividade de TK de KITdo tipo selvagem (wt) e KIT-D816V em células Ba/F3 com expressão de KITinduzível por doxiciclina. Além disso, dasatinib se mostra capaz de inibir aformação de aglomerados induzida por KIT D816V e a viabilidade em célulasBa/F3, assim como o crescimento de células HMC-1.1 (KIT-D816V negati-vas) e células HMC-1.2 (KIT-D816V positivas). Os efeitos de dasatinib sãodependentes da dose, com valores de IC50 100 - 1.000 vezes maiores na-quelas portadoras de KIT-D816V, em comparação com células desprovidasde KIT-D816V. Os efeitos inibidores de dasatinib em células HMC-1 se mos-tram associados à apoptose e a uma diminuição na expressão de CD2 eCD63. Além disso, dasatinib se mostra capaz de cooperar com PKC412,AMN107, imatinib e 2CdA na produção de inibção do crescimento. Em célu-las HMC-1.1, todas as interações de fármacos aplicadas se mostraram si-nérgicas. Em contraste, em HMC-1.2, apenas as combinações "dasatinib +PKC412" e "dasatinib + 2CdA" produzem efeitos sinérgicos. Essas combina-ções de fármacos podem, portanto, representar uma interessante aborda-gem farmacológica para o tratamento de SM agressiva ou MCL.

Introdução

Receptores de tirosina quinase, como o receptor de fator decrescimento derivado de plaquetas (PDGFR) ou receptor de fator de célula-tronco (SCFR, KIT), são freqüentemente desregulados e mostram atividadede tirosina quinase (TK) constitutiva em pacientes com neoplasias hemato-poiéticas.1-5 Essas moléculas representam, portanto, alvos atraentes paraterapia com fármacos. De fato, durante os últimos anos, vários conceitos detratamento emergentes se basearam em novos fármacos direcionados a TKcrítica em células mielóides neoplásicas.1-5

A mastocitose sistêmica (SM) é um neoplasma mielóide caracte-rizado por crescimento anormal e acúmulo de mastócitos neoplásicos (MC)em um ou mais órgãos. Variantes indolentes, asism como agressivas de SMforam descritas.6-9 Em pacientes com SM agressiva (ASM) e naqueles queestejam sofrendo da variante leucêmica de SM, isto é, leucemia de mastóci-tos (MCL), a resposta a fármacos convencionais é ruim, e o prognóstico égrave.6-12 Conseqüentemente, inúmeras tentativas foram feitas para identi-ficar novos alvos terapêuticos em MC neoplásicos e para desenvolver osrespectivos conceitos de tratamento.9-12

Na maioria dos pacientes sofrendo de SM, incluindo aquelescom ASM ou MCL, a mutação D816V de KIT é detectável.13-17 Essa muta-ção está associada à fosforilação independente de Iigante de KIT, assimcomo ao crescimento autônomo de células. 17,18 Com base nessa noção, avariante com mutação D816V de KIT foi reconhecida como o principal alvode terapia.9-12,19 Assim, inúmeros esforços foram despendidos para identi-ficar inibidores de TK que neutralizassem a fosforilação de KIT-D816V e ocrescimento de MC neoplásicos.9-12,19-24 Imatinib (STI571), um potenteinibidor de BCR/ABL, foi recentemente descrito como neutralizando o cres-cimento de MC neoplásicos que exibem KIT de tipo selvagem (wt) ou a vari-ante com mutação F522C de ocorrência rara de KIT.20-23 Além disso, essefármaco se mostrou capaz de bloquear o crescimento de células neoplásicasem pacientes que têm leucemia eosinofílica crônica com o gene de fusãoFIP1L1/PDGFRA com ou sem SM coexistente.24-26 Entretanto, foi incapazde inibir o crescimento de MC neoplásicos portadores de KIT D816V.20-22Mais recentemente, outros demonstraram que PKC412 27 neutraliza a ativi-dade de TK de KIT-D816V e, dessa forma, regula negativamente o cresci-mento de MC neoplásicos.28-30 Também foi descrito que o novo inibidor deTK AMN10731 neutraliza o crescimento de células neoplásicas exibindo KIT-D816V a concentrações de fármaco relativamente attas.30,32 Entretanto, amaioria desses compostos pode não produzir remissão completa de longaduração em pacientes com ASM ou MCL, pelo menos como agentes únicos.Além disso, conforme acima mencionado, vários desses fármacos agenteapenas em MC exibindo wt KIT, mas não inibem o crescimento de MC por-tadoras de KIT-D816V. Conseqüentemente, é importante pesquisar maisnovos inibidores de TK direcionados a KIT e examinar efeitos de fármacoscooperativos. Com relação a combinações de fármacos, demonstra-se re-centemente que PKC412 e AMN107 produzem efeitos inibidores de cresci-mento cooperativos em células HMC-1.30 Entretanto, embora essa combi-nação de fármacos produzisse efeitos inibidores sinérgicos em células HMC-1 desprovidas de KIT-D816V, nenhum efeito sinérgico foi observado em cé-lulas HMC-1.2 expressando KIT-D816V.30 Outras combinações de fármacostambém foram incapazes de exercer efeitos inibidores sinérgicos em mastó-citos exibindo KIT-D816V.30

Dasatinib (BMS-354825) é um novo inibidor de src quinases ede vários inibidores de TK incluindo KIT.33,34 Também foi descrito que da-satinib inibe a fosforilação de KIT-D816V e o crescimento de MC neoplási-cos.34,35 No presente estudo, demonstra-se que dasatinib bloqueia váriasdas funções relacionadas à doença dependentes de KIT-D816V em célulasneoplásicas, incluindo a sobrevida e formação de aglomerados, assim comoa expressão de CD2 e CD63. Além disso, os dados mostram que dasatinibtem sinergia com PKC412, assim como com 2CdA na produção da inibiçãode crescimento em células HMC-1.2. Segundo o melhor conhecimento, essaé a primeira combinação de inibidores de TK descrita com ação sinérgica emMC portadores de KIT-D816V. Os dados também sugerem que dasatinibisoladamente ou em combinação com outros medicamentos pode ser umagente promissor para o tratamento de pacientes com ASM ou MCL.

Materiais e Métodos

Reagentes

Dasatinib (BMS-354825)33 foi fornecido pela Bristol-MyersSquibb (New Brunswick, NJ) e imatinib (STI571), AMN107.31 e PKC41227pela Novartis Pharma AG (Basiléia, Suíça). Soluções de estoque de dasati-nib, AMN107 e PKC412 foram preparadas por dissolução em sulfóxido dedimetila (DMSO) (Merck, Darmstadt, Alemanha). Fator de célula-tronco(SCF) humano recombinante (rh) foi adquirido na Strathmann Biotech (Han-nover, Alemanha), meio RPMI 1640 e soro de novilho fetal (FCS) da PAALaboratories (Pasching, Áustria), L-glutamina e meio de Dulbecco modifica-do de Iscove (IMDM) da Gibco Life Technologies (Gaithersburg, MD), 3H-timidina da Amersham (Buckinghamshire, UK), 2-cloro-desoxiadenosina(cladribina = 2CdA) da Sigma (St. Louis, MO) e rh interleukin-4 (IL-4) da Pe-protech (Rocky Hill, NJ). Os anticorpos monoclonais (mAbs) marcados comPE RPA-2.10 (CD2), WM15 (CDÍ3), YB5.B8 (CD117) e N6B6.2 (CD164),assim como MOPC-21 (mlgG1) e G155-178 (mlgG2a) foram adquiridos naBecton Dickinson (San Jose, CA), e o mAb conjugado a PE CLB-gran12(CD63) na Immunotech (Marselha, França). O mAb marcado com PE VIM5(CD87) foi gentilmente fornecido pelo Dr. Otto Majdic (Instituto de Imunologi-a, Universidade de Medicina de Viena, Áustria).

CÉLULAS HMC-1 EXPRESSANDO OU DESPROVIDAS DE KIT D816V

A linhagem de mastócitos humanos HMC-136, gerada a partirde um paciente com MCL, foi gentilmente fornecida pelo Dr. J. H. Butterfield(Mayo Clinic, Rochester, MN). Dois subclones de HMC-1 foram usados, asaber, HMC-1.1 portador da mutação V560G de KIT, mas não KIT D816V.20e um segundo subclone, HMC-1.2, portador de ambas as mutações de KIT,isto é, V560G e D816V.20 As células HMC-1 foram cultivadas em IMDM su-plementado com 10% de FCS, L-glutamina, alfa-tioglicerol (Sigma) e antibió-ticos a 379C e 5% de C02. As células foram novamente descongeladas deum estoque original a cada 4 - 8 semanas e submetidas a passagens sema-nalmente. As células HMC-1 foram periodicamente verificadas quanto a i) apresença de grãnulos metacromáticos, ii) expressão de KIT e iii) o efeito deregulação negativa de IL-4 (100 U/mL, 48 horas) na expressão de KIT.37

Células BA/F3 com Expressão Induzível de wt KIT ou KIT D816V

A geração de células Ba/F3 com expressão induzível por doxici-clina de wt c-KIT (Ton.Kit.wt) ou c-KIT D816V foi anteriormente descri-ta.30,38 Em resumo, células Ba/F3 que expressam um transativador tet re-verso39,40 foram co-transfectadas com vetor pTRE2 (Clontech, Palo Alto,CA) contendo cDNA de KIT D816V (ou cDNA de wt KIT, ambos gentilamenteenviados pelo Dr. J. B. Longley, Universidade de Columbia, Nova Iorque,EUA) e pTK-Hyg (Clontech) por eletroporação. Células transfectadas de ma-neira estável foram selecionadas por cultivo em higromicina e clonadas pordiluição limitativa. Neste estudo, o subclone Ton.Kit.D816V.2738 foi usadoem todos os experimentos. A expressão de KIT-D816V pode ser induzidanessas células (em 12 horas) por exposição à doxiciclina (1 pg/mL).38

Isolamento De Células Neoplásicas Primárias

Células primárias de medula óssea (bm) foram obtidas de umpaciente com ASM KIT D816V positiva e AML associada e de um pacientecom bm normal. As amostras aspiradas de bm foram coletadas em seringascontendo heparina livre de conservante. As células foram postas em cama-das sobre Ficoll para isolar células mononucleares (MNC). A viabilidade dascélulas era > 90% em ambos os casos. No paciente com ASM-AML, verifi-cou-se que MNC isoladas continham > 90% de blastócitos. Ambos os paci-entes deram seu consentimento escrito antes da punção de bm ou doaçãode sangue. O estudo foi aprovado pela comissão revisora institucional local efoi conduzido de acordo com a declaração de Helsinki.

Análise DDa Fosforilacão de KIT por Western Blottina

Células HMC-1 (106/mL) e células Ton.Kit.D816V.27 (106/mL),contendo wt KIT (Ton.Kit.wt) ou KIT D816V (Ton.Kit.D816V.27), foram incu-badas com dasatinib (1 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μΜ), PKC412 (1 μΜ),AMN107 (1 μΜ), imatinib (1 μΜ) ou meio de controle a 37°C durante 4 horas.Antes da descrição a fármacos inibidores, as células Ton.Kit.wt e célulasTon.Kit.D816V.27 foram incubadas com doxiciclina (1 μςΛηΙ-) a 37°C durante24 horas para induzir a expressão de KIT. No caso de células Ton.Kit.wt, afosforilação de KIT foi induzida por adição de rhSCF (100 ng/mL). A imuno-precipitação (IP) e o Western blotting foram realizados conforme descri-to.30,40 Em resumo, as células foram lavadas a 4°C e ressuspendidas emtampão RIPA (1 mL de tampão por 108 células) contendo 50 mM de Tris,150 mM de NaCI, 1% de nonidet P40 (NP-40), 0,25% de ácido desoxicólico,0,1% de dodecil sulfato de sódio (SDS), 1 mM de ácido etileno-diamina-tetraacético (EDTA), 1 mM de NaF, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonila e1 mM de Na3V04. Depois da incubação em tampão RIPA suplementadocom coquetel inibidor de proteinase (Roche) durante 30 minutos a 4°C, oslisados foram centrifugados. Para IP, Iisados de 107 células foram incubadoscom anticorpo anti-KIT 1C1 (gentilmente fornecido pelo Dr. H.-J. Bühring,Universidade de Tübingen, Alemanha)43 e glóbulos de proteína G Sepharo-se (Amersham) em tampão IP (50 mM de Tris-CI, pH 7,4, 150 mM de NaCI,100 mM de NaF e 1% de NP-40) a 49C durante umá noite. As contas foram,então, lavadas 3 vezes em tampão IP. Os Iisados e imunoprecipitados foramseparados sob condições redutoras por eletroforese em SDS-gel de poliacri-lamida a 7,5% e transferidos para uma membrana de nitroceiulose (Protran,Schleicher & Schuell, Keene, NH) em tampão contendo 25 mM de Tris, 192mM de glicina e 20% de metanol a 4°C. As membranas foram bloqueadasdurante 1 hora em reagente de bloqueio a 5% (Roche) e foram, então, incu-badas com anticorpo anti-KIT 1C1 ou com mAb anti-fosfo-proteína 4G10(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY) a 4gC durante uma noite. A reativi-dade de anticorpo foi tornada visível pelo anticorpo IgG anticamundongo deovelha e reagente de detecção Lumingen PS-3 (ambos da Amersham), comfilme CL-Xposure (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

Avaliação dos Efeitos dos Fármacos Sobre o Crescimento e Função de Cé-lulas Ton.Kit.D816V.27

Células Ton.Kit.D816V.27 foram co-incubadas com doxiciclina (1pg/mL) e várias concentrações de dasatinib ou AMN107 a 379C durante 24 -48 horas. A viabilidade celular foi determinada por exclusão com azul tripa-no. A formação de aglomerados foi analisada por microscopia invertida. Es-tudos anteriores haviam mostrado que a expressão de KIT-D816V emTon.Kit.D816V.27 está associada a uma formação significativa de aglomera-dos, e que PKC412, mas não imatinib, regula negativamente a formação deaglomerados em células Ton.Kit.D816V.27.38 No presente estudo, os efeitosde dasatinib (1 pM - 1 μΜ) e AMN107 sobre a formação de aglomerados decélulas Ton.Kit.D816V.27 foram analisados. Para fins de controle, os efeitosde PKC412 e imatinib também foram examinados. A formação de aglomera-dos foi determinada por microscopia óptica (contados como aglomerados porcampo de alta potência = HPF) e expressada como porcentagem do controle(= doxiciclina isoladamente sem fármacos = 100%). Todos os experimentosforam realizados em triplicata.

Medição da Captação de 3H-Timidina

Para determinar os efeitos do fármaco inibidor de crescimento,células HMC-1 foram incubadas com várias concentrações de dasatinib (100fM - 10 μΜ), PKC412 (100 pM - 10 μΜ), AMN107 (1 nM - 100 μΜ) ou imati-nib (3 nM - 300 μΜ) em placas de cultura de 96 cavidades (TPP, Trasadin-gen, Suíça) a 37eC durante 48 horas. Em experimentos de curso temporal,células HMC-1 foram expostas a dasatinib (HMC-1.1: 10 nM; HMC-1.2: 1μΜ) durante 12, 24, 36 ou 48 horas. Em experimentos selecionados, célulasHMC-1 foram incubadas com várias concentrações de 2CdA (0,005-10pg/mL). Células primárias (células de bm de um paciente com ASM-AML;células de bm de controle) foram cultivadas em meio de controle, dasatinib(100 pM - 10 μΜ), PKC412 (100 pM - 10 μΜ), AMN107 (100 pM - 10 μΜ) ouimatinib (100 pM - 10 μΜ) durante 48 horas. Depois da incubação, 1 pCi de3H-timidina foi adicionado (37°C, 12 horas). As células foram, então, colhi-das em membranas de filtro (Packard Bioscience, Meriden, CT) em um cole-tor Filtermate 196 (Packard Bioscience). Os filtros foram secados ao ar, e aradioatividade ligada foi contada em um contador β (Top-Count NXT, Pac-kard Bioscience). Para determinar os efeitos aditivos ou sinérgicos em po-tencial dos fármacos sobre o crescimento das células, células HMC-1 (am-bas subclones) foram expostas a várias combinações de fármacos (dasati-nib, PKC412, AMN107, imatinib, 2CdA) a uma razão fixa de concentraçõesde fármacos. As interações dos fármacos (aditivas, sinérgicas) foram deter-minadas calculando-se os valores de índice de combinação (Cl) com o soft-ware Calcusyn (Calcusyn; Biosoft, Ferguson, MO).44 Um valor de Cl de 1indica um efeito aditivo, ao passo que valores de Cl abaixo de 1 indicam si-nergia dos efeitos dos fármacos. Todos os experimentos foram realizadosem triplicata.

Avaliação de Apoptose por Morfoloqia Convencional e Microscopia Eletrôniça

Os efeitos de inibidores de TK sobre a apoptose foram analisa-dos por exame morfológico, citometria de fluxo e microscopia eletrônica. Emexperimentos típicos, células HMC-1 foram incubadas com várias concentra-ções de dasatinib (1 pM - 1 μΜ) ou meio de controle em placas de cultura de6 cavidades (TPP) em IMDM contendo 10% de FCS a 379C durante 24 ho-ras. A porcentagem de células apoptóticas foi quantificada em preparaçõesde citospin tingidas com Wright-Giemsa. A apoptose foi definida de acordocom critérios citomorfológicos convencionais.45 Para confirmar a apoptoseem células HMC-1, a microscopia eletrônica foi realizada conforme descrito46,47 usando-se células HMC-1 (ambas subclones) expostas a dasatinib (1pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μΜ), PKC412 (1 μΜ) ou meio de controle duran-te 24 horas. Depois da incubação, as células foram lavadas e fixadas em 2%de paraformaldeído, 2,5% de glutaraldeído e 0,025% de CaCI2 tamponadosem 0,1 mol/L de tampão cacodilato de sódio (pH 7,4) durante uma hora. Ascélulas foram, então, lavadas, postas em suspensão em 2% de ágar e centri-fugadas. Os péletes foram pós-fixados com 1,3% de 0s04 (tamponados em0,66 mol/L de colidina) e tingidos "em bloco" em 2% de acetato de uranila etampão maleato de sódio (pH 4,4) durante duas horas. Os péletes foram,então, enxaguados, desidratados em série de álcool e incrustados em EPON812. Seções ultrafinas foram cortadas e colocadas em grades de ouro. Asseções foram contrastadas em acetato de uranila e citrato de chumbo e vi-sualizadas em um microscópio eletrônico de transmissão JEOL 1200 EX Il(JEOL, Tóquio, Japão).

Avaliação de Apoptose por Ensaio Tunel

Para confirmar a apoptose em células HMC-1 após descrição adasatinib (1 pM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1 μΜ) ou PKC412 (100 nM, 1 μΜ),um ensaio Tunel (marcação de extremidade de ponta com dTUP-fluorescente mediada por transferase terminal in situ) foi realizado usando-se"Fluoresceína de Kit de Detecção de Morte Celular In SitLf' (Roche Diagnos-tics, Mannheim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Emresumo, as células foram colocadas em citospins, fixadas em paraformaldeí-do a 4% em PBS a pH 7,4 à TA durante 60 minutos, lavadas e, então, per-meabilizadas em 0,1% de Triton X-100 e 0,1% de citrato de sódio. Depoisdisso, as células foram lavadas e incubadas na solução de reação de trans-ferase terminal contendo CoCI2, desóxi-nucleotidiltransferase terminal edUTP marcado com fluoresceína durante 60 minutos a 37°C. As células fo-ram, então, lavadas e analisadas com um microscópio de fluorescência Ni-kon Eclipse E 800 (Tóquio, Japão).

Avaliação da Expressão de Antígenos de Superfície Ligados ã Ativação emCélulas HMC-1

A expressão de antígenos de superfície celular em células HMC-1 (ambas subclones) foi determinada por citometria de fluxo após a culturaem meio de controle ou meio suplementado com inibidores de TK (dasatinib,1 pM - 5 μΜ; PKC412, 1 μΜ) a 37-C durante 24 horas. Depois da incubaçãocom fármacos, as células foram lavadas e submetidas à citometria de fluxode cor única usando anticorpos conjugados a PE contra vários antígenos dediferenciação de MC, incluindo determinantes conhecidas como expressa-das de maneira aberrante (seletiva) em MC neoplásicos.48-51 Os marcado-res analisados foram CD2, CD13, CD63, CD87, CD117 e CD164. A citome-tria de fluxo foi realizada em um FACScan (Becton Dickinson) conforme des-crito.30,37,51

Análise Estatística

Para determinar o significado de diferenças entre taxas de proli-feração, apoptose e níveis de expressão em superfície após a descrição decélulas HMC-1 a inibidores, aplicou-se o teste t de Student para amostrasdependentes. Os resultados foram considerados estatisticamente significa-dos quando ρ era < 0,05.

Resultados

Efeitos de Dasatinib Sobre a Atividade de Tk de KIT-D816V

Conforme avaliado por IP e Western blotting, dasatinib (1 nM -1μΜ) diminuiu a fosforilação de KIT em células HMC-1.1 (que expressam KIT-V560G, mas não KIT D816V) (Figura 11 A). Em células HMC-1.2 portadorasde ambas as mutações (KIT-V560G e KIT-D816V), dasatinib diminuiu a fos-forilação de KIT a 1 μΜ, mas não neutralizou a fosforilação de KIT a concen-trações mais baixas (Figura 11B). Examina-se, a seguir, os efeitos de dasa-tinib em células Ba/F3 que expressam wt KIT (Ton.Kit.wt) ou KIT D816V(Ton.Kit.D816V.27) após exposição à doxiciclina. Em células Ton.Kit.wt, KITpareceu ser fosforilada na presença de SCF, ao passo que KIT se mostrouconstitutivamente fosforilada em células Ton.Kit.D816V.27. Conforme se ob-serva na Figura 11C, dasatinib (10 nM - 1 μΜ) diminuiu a fosforilação de KITinduzida por SCF em células Ton.Kit.wt. Em contraste, em célulasTon.Kit.D816V.27 (que expressam KIT-D816V após exposição à doxiciclina),dasatinib diminuiu a fosforilação de KIT a 0,1 end 1 μΜ, mas foi incapaz dediminuir a fosforilação de KIT a concentrações mais baixas (Figura 11 D).

Efeitos de Inibidores de Tk Sobre a Captação de 3h-Timidina em CélulasHMC-1

Em experimentos de curso temporal, os efeitos inibidores máxi-mos de dasatinib sobre o crescimento de células HMC-1.1 e células HMC-1.2 foram observados após 36 - 48 horas. A Figura 12A mostra os efeitosdependentes do tempo de dasatinib (10 nM para células HMC-1.1; 1 μΜ pa-ra células HMC-1.2) sobre o crescimento dessas células. Conforme mostra-do na Figura 12B, dasatinib se mostrou capaz de neutralizar a captação de3H-timidina em células HMC-1.1 e células HMC-1.2 de maneira dependenteda dose. De maneira interessante, a IC50 para os efeitos de dasatinib emcélulas HMC-1.2 (200 - 500 nM) foi consideravelmente mais elevada emcomparação com os valores de IC50 obtidos para células HMC-1.1 (1 nM)(Figura 12B; Figura 17). Todavia, dasatinib se mostrou capaz de inibir ocrescimento de células HMC-1.2 muito mais eficazmentemente em basesmolares em comparação com imatinib (testado em paralelo). A Tabela 2mostra um resumo dos valores de IC50 obtidos para os efeitos de inibidoresde TK aplicados em células HMC-1.1 e células HMC-1.2. Com relação aosefeitos de imatinib, AMN107 e PKC412, esses dados confirmaram resultadosanteriores.30

Tabela 2

Efeitos de fármacos direcionados (IC50) sobre a captação deH-timidina em células HMC-1

<table>table see original document page 50</column></row><table>

Efeitos de Inibidores de Tk Sobre o Crescimento de Células Ba/F3 Expres-sando WT KIT ou KIT D816v (Ton.Kit.D816V.27)

Dasatinib se mostrou capaz de neutralizar o crescimento depen-dente de SCF de células Ton.Kit.wt expostas à doxiciclina (que expressamKIT) de maneira dependente da dose (IC50: 1 nM - 10 nM) (Figura 12C). Emcélulas Ton.Kit.D816V.27, dasatinib também se mostrou capaz de inibir ocrescimento e a viabilidade celular (Figura 12D). Dasatinib não neutralizou ocrescimento de células Ton.Kit.wt na ausência de doxiciclina, isto é, na au-sência de KIT (Figura 12C). Da mesma forma, dasatinib não produziu gran-des efeitos inibidores do crescimento em células Ton.Kit.D816V.27 na au-sência de KIT D816V (- doxiciclina) (Figura 12D). Além disso, em experimen-tos de controle adicionais, doxiciclina (1 pg/mL) não mostrou efeitos inibido-res do crescimento em células Ba/F3 não transfectadas (não mostrado).

Efeitos de Dasatinib e Amn107 Sobre a Formação de Aglomerados Depen-dentes de KIT-D816V em Células Ton.Kit.D816V.27

Foi demonstrado anteriormente que KIT-D186V induz não ape-nas a diferenciação de mastócitos, mas também a formação de aglomeradosem células Ba/F3, o que é particularmente interessante, pois a formação deaglomerados de mastócitos é uma achado primário e importante critério dedoença em SM.38 Também foi descrito que PKC412 regula negativamente aformação de aglomerados induzida por doxiciclina/KIT-D816V em célulasTon.Kit.D816V.27.38 No presente estudo, descobriu-se que dasatinib (100nM - 1 μΜ) e, em menor grau, AMN107 (200 nM - 1 μΜ) neutralizam a for-mação de aglomerados dependentes de KIT-D816V em células Ba/F3 demaneira dependente da dose (Figuras 12E e 12F).

Dasatinib Neutraliza o Crescimento de Células Neoplásicas Primárias em umPaciente com SM KIT D816V Positiva com AML Associada

Para confirmar os efeitos medicamentosos antiproliferativos dedasatinib em SM, foram examinadas células neoplásicas primárias em umpaciente com ASM positiva para KIT D816V associada a AML. Nesse paci-ente, dasatinib (IC50: 0,3 - 1,0 nM), assim como PKC412 (IC50: 10-30 nM)se mostraram capazes de inibir o crescimento espontâneo (captação de 3H-timidina) de células leucêmicas de maneira dependente da dose. AMN107também mostrou um efeito inibidor do crescimento (100 - 300 nM), ao passoque imatinib (IC50 > 1,0 μΜ) não neutralizou o crescimento de células neo-plásicas nesse paciente (Figura 13). Na amostra de controle, isto é, em célu-las bm normais, nem dasatinib nem os outros inibidores testados mostraramum efeito sobre a captação de 3H-timidina (não mostrado).

Dasatinib Induz Apoptose em Células HMC-1

Para explorar o mecanismo subjacente ao efeito inibidor decrescimento de dasatinib, foram analisados sinais morfológicos e bioquími-cos de apoptose em células HMC-1 após descrição ao fármaco. Conformeavaliado por microscopia óptica, dasatinib se mostrou capaz de induzir apop-tose (isto é, aumentar o número de células apoptóticas) em ambos os sub-clones de HMC-1 (Figuras 14A e 14B). PKC412 foi aplicado como controle etambém se mostrou capaz de induzir apoptose em ambos os subclones deHMC-1, ao passo que imatinib foi se mostrou capaz de produzir apoptoseem células HMC-1.1, mas não mostrou nenhum efeito em células HMC-1.2(não mostrado). O efeito indutor de apoptose de dasatinib em células HMC-1foi confirmado por microscopia eletrônica. De fato, dasatinib induziu apopto-se tanto em células HMC-1.1, quanto HMC-1.2 a 1 μΜ (Figura 14C). Final-mente, foram capazes de demonstrar o efeito indutor de apoptose de dasati-nib em células HMC-1 em um ensaio Tunel (Figuras 14D e 14E). Nesse en-saio, dasatinib se mostrou capaz de induzir apoptose em células HMC-1.1entre 1 e 1.000 nM e de induzir apoptose em células HMC-1.2 entre 100 e1.000 nM. PKC412 (1 μΜ) foi usado em paralelo como um controle e tam-bém induziu apoptose em ambas as linhagens celulares (Figuras 14D e14E). Em contraste, imatinib (1 μΜ) induziu apoptose apenas em célulasHMC-1.1, mas não mostrou nenhum efeito em células HMC-1.2 (não mos-trado), confirmando dados anteriores.30

Dasatinib Regula Negativamente a Expressão de Antígenos de SuperfícieCelular Ligados à Ativação em Células HMC-1

Vários antígenos de superfície celular, como CD2 ou CD63, sãotipicamente (super)expressados em MC neoplásicos na SM.48-50 De manei-ra interessante, algumas dessas moléculas podem ser expressadas em MCneoplásicos de maneira dependente de KIT D816V38 e/ou expressadas emum estágio precoce do desenvolvimento do mastócito humano.51 Conse-qüentemente, foi investigado se o dasatinib influenciaria a expressão dessesantígenos de superfície em células HMC-1. Células HMC-1.1 não estimula-das se mostraram capazes de expressar CD13, CD63, CD87, CD117 eCD164, e células HMC-1.2 expressaram CD2, CD13, CD63, CD87, CD117 eCD164, confirmando dados anteriores.30,38,50 A incubação de célulasHMC-1.1 com dasatinib resultou em uma diminuição significativa na expres-são de CD13, CD63, CD87 e CD117 (p < 0,05) (Figura 15C). Em célulasHMC-1.2, dasatinib diminuiu significativamente a expressão de CD2, CD63 eCD87 (p < 0,05), mas não levou a uma diminuição significativa na expressãode CD13, CD117 ou CD164 (Figura 15D). Os efeitos de regulação negativado dasatinib em experimentos de citometria de fluxo são exemplificados paraCD63 nas Figura 15E (HMC-1.1) e Figura 15D (HMC-1.2).

Dasatinib Coopera com outros Inibidores de Tk E com 2CDA na Produçãoda Inibição de Crescimento em Células HMC-1

Conforme avaliado por incorporação de 3H-timidina, dasatinibmostrou cooperação com PKC412, AMN107, imatinib e 2CdA para causarinibição do crescimento em células HMC-1 (Tabela 3, Figura 16). Em célulasHMC-1.1, todas as interações dos fármacos testados se mostraram de natu-reza sinérgica (Figuras 16A e 16B). Em contraste, em células HMC-1.2, a-penas as combinações "dasatinib e PKC412" e "dasatinib e 2CdA" produzi-ram uma sinergia clara (Figuras 16C e 16D), ao passo que as outras combi-nações de fármacos mostraram efeitos inibidores do crescimento sinérgico,sobre o crescimento celular (Tabela 3). Conforme mostrado na Tabela 3, osefeitos cooperativos dos fármacos sobre o crescimento de células HMC-1.2(painéis superiores; cinza) e células HMC-1.1 (painéis inferiores; cinza escu-ro) foram determinados medindo-se a captação de 3H-timidina. Efeitos coo-perativos dos fármacos foram calculados pelo software Calcusyn.

Tabela 3

Avaliação dos efeitos sinérgicos de fármacos sobre o crescimen-to de células HMC-1

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Interações dos fármacos: +, efeitos sinérgicos; ±, efeitos aditi-vos; -, efeitos antagonistas.Discussão

Em pacientes com SM, crescimento autônomo independente defator e acúmulo de MC são características comuns a todas as variantes dadoença. A mutação somática de KIT D816V é um defeito relacionado a SMconsiderado como responsável pela ativação constitutiva de KIT e pelo cres-cimento autônomo de células. 13-17 Conseqüentemente, foram feitas tentati-vas recentes de identificar compostos farmacológicos que inibam a atividadede TK de KIT-D816V e, portanto, o crescimento/acúmulo de células neoplá-sicas.9"12 Foi descrito que o novo inibidor de TK dasatinib bloqueia a ativida-de de TK de KIT-D816V, assim como várias funções relacionadas à doençadependentes de KIT D816V em células neoplásicas. Além disso, foi demons-trado que dasatinib tem sinergia com PKC412, assim como com outros fár-macos direcionados e convencionais na produção de inibição do crescimen-to em MC neoplásicos.

Dasatinib, também conhecido como BMS-354825, é um inibidorde TK novo que exerce efeitos profundos sobre várias TK, incluindo B-CR/ABL e KIT, e também apresenta atividade considerável contra várias srcquinases.33-35 Com base em sua atividade "direcionada a TK", o dasatinibfoi recentemente considerado como um agente antineoplásico que pode ini-bir o crescimento de células neoplásicas em várias neoplasias mielóides.33-35 No presente estudo, foi descoberto que dasatinib neutraliza a atividadede TK da oncoproteína KIT-D816V relacionada a SM e inibe in vitro o cres-cimento de MC humanos portadores dessa mutação de KIT, o que confirmapublicações anteriores.34,35 Além disso, foi descoberto que dasatinib neu-traliza a formação de aglomerados dependente de KIT-D816V em célulasBa/F3, assim como a expressão de CD2 e CD63 em células HMC-1.2. Por-tanto, dasatinib bloqueia várias funções relacionadas à doença (SM) e de-pendentes de KIT-D816V em MC neoplásicos. Com relação à inibição decrescimento, uma observação interessante foi de que o efeito de dasatinibsobre wt KIT ou KIT G560V era mais pronunciado em comparação com oobservado com KIT D816V. Uma observação similar foi recentemente feitacom AMN107 e imatinib.30 Entretanto, embora a mutação D816V de KITconfira uma resistência quase completa contra imatinib, os outros dois inibi-dores de TK1 isto é, AMN107 e dasatinib, retêm uma atividade considerávelcontra KIT D816V, com valores de IC50 mais baixos obtidos para dasatinibem comparação com AMN107 em bases molares, o que pode ser explicadopor diferentes interações de alvos de fármacos ou pelo fato de que o dasati-nib não apenas neutraliza a atividade de TK de KIT, mas também vários ou-tros alvos em potencial, como src quinases. Uma observação interessantefoi de que os efeitos inibidores de crescimento de dasatinib em células HMC-1.2 ocorrem a concentrações farmacológicas, confirmando publicações ante-riores.34,35

Na maioria dos casos, os inibidores de TK agem como inibidoresdo crescimento por bloqueio do crescimento celular dependente de TK coma conseqüente apoptose.30,35 Da mesma forma, no caso de dasatinib, fo-ram capazes de mostrar que a inibição de crescimento de células HMC-1está associada à perda de atividade de TK e é acompanhada por sinais deapoptose. Efeitos indutores de apoptose de dasatinib eram demonstráveispor microscopia óptica e eletrônica, assim como em um ensaio Túnel. Con-forme esperado, dasatinib mostrou efeitos indutores de apoptose mais po-tentes em células HMC-1.1 do que em HMC-1.2, o que está em linha comresultados recentemente publicados.35

Uma característica-chave e principal critério da OMS (WHO) naSM é a formação de aglomerados de MC em órgãos viscerais.41,42 Foi de-monstrado recentemente que KIT D816V induz não apenas a diferenciaçãode mastócitos, mas também a formação de aglomerados em célulasBa/F3.38 Assim, a formação de aglomerados de MC pode ser uma etapainicial e importante na patogênese de SM. No presente estudo, foram capa-zes de mostrar que dasatinib e AMN107 neutralizam a formação de aglome-rados induzida por KIT D816V em células Ba/F3. Essa observação apresen-ta provas adicionais da ação específica e eficácia desses fármacos.

Vários antígenos de membrana de superfície celular são tipica-mente (super)expressados em MC neoplásicos.48-50 Da mesma forma, emcontraste com MC normais, MC neoplásicos em SM expressam CD2 eCD25.48-50 Além disso, várias moléculas de superfície celular, como CD63,são superexpressadas em MC neoplásicos em comparação com MC nor-mais.49 Em alguns casos (como CD63), a expressão de moléculas CD podeser dependente de KIT-D816V.38 Conseqüentemente, pergunta-se se o di-recionamento a KIT D816V por dasatinib estaria associado a uma diminuiçãona expressão desses antígenos CD. Os resultados do estudo mostram quedasatinib regula negativamente a expressão de CD2, CD63 e CD87 em célu-las HMC-1.2 (que exibem KIT D816V), ao passo que não foi encontrada ne-nhuma inibição significativa da expressão de CD13, CD117=KIT ou CD164.

Em contraste, em células HMC-1.1, dasatinib também se mostrou capaz deregular negativamente a expressão de CD13 e KIT. Uma explicação paraessa discrepância seria a diferente sensibilidade (IC50) dos dois sublconesde HMC-1 à dasatinib. Uma possibilidade alternativa seria que, em célulasHMC-1.2, CD13 e KIT são, em geral, não suscetíveis à modulação induzidapor fármacos. Essa hipótese seria sustentada pela observação de que CD13e KIT também eram expressadas nos mesmos níveis depois da incubaçãocom PKC412, embora os valores de IC50 para esse composto sejam idênti-cos nos dois subclones de HMC-1.

Inúmeros dados recentes sugerem que o tratamento de neopla-sias mielóides com inibidores de TK como um agente único possa não sersuficiente para controlar a doença durante um período de tempo prolongado.

Isso foi documentado para imatinib e CML avançada51,52 e também podese aplicar a pacientes com ASM ou MCL.29 Assim, em muitos desses paci-entes, encontra-se resistência ao fármaco. Para superar a resistência, inú-meras estratégias farmacológicas podem ser consideradas. Uma abordagemrazoável pode ser aplicada a combinações de fármacos.

Em um estudo anterior, foi descoberto que PKC412, AMN107 e2CdA exibem potentes efeitos cooperativos dos fármacos em células HMC-1.30 Entretanto, embora efeitos sinérgicos fossem observados com a maio-ria das combinações de fármacos èm células HMC-1.1 desprovidas de KITD816V, nenhuma interação sinérgica (mas apenas aditiva) dos fármacos foiobservada em células HMC-1.2 portadoras de KIT D816V. Conseqüente-mente, estavam altamente interessados em aprender se dasatinib, que exibepotentes efeitos em mastócitos portadores de KIT D816V como agente úni-co, produziria efeitos sinérgicos nessas células quando combinado com ou-tros potentes inibidores de KIT D816V. De fato, os resultados mostram quedasatinib e PKC412, assim como dasatinib e 2CdA, um fármaco usado paratratar ASM e MCL54, inibem o crescimento de células HMC-1.2 de maneirasinérgica. Segundo o melhor conhecimento, essa é a primeira combinaçãode inibidores de TK que produz um efeito sinérgico sobre o crescimento deMC neoplásicos portadores de KIT D816V.

Em resumo, foi demonstrado que dasatinib e PKC412 são osfármacos direcionados mais promissores para o tratamento de ASM e MCL.Com base nos dados, parece razoável considerar a aplicação de combina-ções desses fármacos ou combinações entre esses fármacos e 2CdA paramelhorar a terapia de pacientes com ASM ou MCL.

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Claims

1. Método de tratamento ou de prevenção de mastocitose sistê-mica, compreendendo a administração de um composto de fórmula (I):<formula>formula see original document page 68</formula>ou sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a com-binação trata ou previne uma doença proliferativa relacionada a mastócitos,como mastocitose sistêmica.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a doençaproliferativa relacionada a mastócitos é mastocitose sistêmica.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, em que a mastoci-tose sistêmica tem resistência a imatinib.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a mastoci-tose sistêmica está associada à mutação oncogênica KIT-D816V.

5. Uso de um composto de fórmula (I):<formula>formula see original document page 68</formula><formula>formula see original document page 69</formula> ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo para a prepa-ração de uma composição farmacêutica para o tratamento de mastocitosesistêmica.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, para o tratamento demastocitose sistêmica associada à mutação oncogênica KIT-D816V.

7. Método para o tratamento de mamíferos sofrendo de mastoci-tose sistêmica, que compreende a administração a um mamífero necessita-do desse tratamento de uma quantidade inibidora da atividade de KIT de umcomposto de fórmula (I): <formula>formula see original document page 69</formula> em combinação com um composto de fórmula (II): <formula>formula see original document page 69</formula> ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

8. Preparação farmacêutica para o tratamento de mastocitosesistêmica associada a KIT-D816V, compreendendo um composto de fórmula (I):em combinação com um composto de fórmula (II):<formula>formula see original document page 70</formula>ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

9. Método para o tratamento de mamíferos, incluindo o homem,que sofram de mastocitose sistêmica, compreendendo a administração a ummamífero necessitado desse tratamento de um composto de fórmula (I):em combinação com um composto de fórmula (II):<formula>formula see original document page 70</formula>ou sais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

10. Método de tratamento ou de prevenção de mastocitose sis-têmica, compreendendo a administração de um composto de fórmula (I):<formula>formula see original document page 71</formula>em combinação com um inibidor da timidina quinase (TK); ousais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

11. Método de tratamento ou de prevenção de mastocitose sis-têmica, compreendendo a administração de um composto de fórmula (I):<formula>formula see original document page 71</formula>farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que a combinação trata ou pre-vine uma doença proliferativa relacionada a mastócitos.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a doençaproliferativa relacionada a mastócitos é selecionada de mastocitose sistêmi-ca, mastocitose sistêmica agressiva e leucemia de mastócitos.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a doençaproliferativa relacionada a mastócitos tem resistência a imatinib.

14. Método, de acordo com a reivindicação 11, para o tratamen-to de doença proliferativa relacionada a mastócitos associada a KIT do tiposelvagem ou com uma mutação oncogênica KIT G560V ou KIT-D816V.

15. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que o inibidorde TK é selecionado de dasatinib e 2CdA.

16. Uso de um composto de fórmula (I):<formula>formula see original document page 72</formula>em combinação com um inibidor da timidina quinase (TK), ousais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo para a preparação de umacomposição farmacêutica para o tratamento de uma doença proliferativa re-lacionada a mastócitos.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, em que a doençaproliferativa relacionada a mastócitos é selecionada de mastocitose sistêmi-ca, mastocitose sistêmica agressiva e leucemia de mastócitos.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 16, em que a doençaproliferativa relacionada a mastócitos tem resistência a imatinib.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 16, para o tratamento dedoença proliferativa relacionada a mastócitos associada a KIT do tipo selva-gem ou com uma mutação oncogênica KIT G560V ou KIT-D816V.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 16, em que o inibidor deTK é selecionado de dasatinib e 2CdA.

21. Método para o tratamento de mamíferos sofrendo de doençaproliferativa relacionada a mastócitos, que compreende a administração aum mamífero necessitado desse tratamento de uma quantidade inibidora daatividade de KIT de um composto de fórmula (I):<formula>formula see original document page 72</formula>em combinação com um inibidor da timidina quinase (TK), ousais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, em que a doençaproliferativa relacionada a mastócitos é selecionada de mastocitose sistêmi-ca, mastocitose sistêmica agressiva e leucemia de mastócitos.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, em que a doençaproliferativa relacionada a mastócitos tem resistência a imatinib.

24. Método, de acordo com a reivindicação 21, para o tratamen-to de doença proliferativa relacionada a mastócitos associada a KIT do tiposelvagem ou com uma mutação oncogênica KIT G560V ou KIT-D816V.

25. Método, de acordo com a reivindicação 21, em que o inibidorde TK é selecionado de dasatinib e 2CdA.

26. Preparação farmacêutica para o tratamento de doença proli-ferativa relacionada a mastócitos associada a KIT do tipo selvagem ou mu-tante, compreendendo um composto de fórmula (I):<formula>formula see original document page 73</formula>em combinação com um inibidor da timidina quinase (TK), ousais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

27. Método, de acordo com a reivindicação 21, em que a doençaproliferativa relacionada a mastócitos é selecionada de mastocitose sistêmi-ca, mastocitose sistêmica agressiva e leucemia de mastócitos.

28. Método, de acordo com a reivindicação 21, em que a doençaproliferativa relacionada a mastócitos tem resistência a imatinib.

29. Método, de acordo com a reivindicação 21, para o tratamen-to de doença proliferativa relacionada a mastócitos associada a KIT do tiposelvagem ou com uma mutação oncogênica KIT G560V ou KIT-D816V.

30. Método, de acordo com a reivindicação 21, em que o inibidorde TK é selecionado de dasatinib e 2CdA.

31. Método para o tratamento de mamíferos, incluindo o homem,que sofram de doença proliferativa relacionada a mastócitos associada a KITdo tipo selvagem ou com uma mutação oncogênica KIT G560V ou KIT-D816V, que compreende a administração a um mamífero necessitado dessetratamento de um composto de fórmula (I): <formula>formula see original document page 74</formula> em combinação com um inibidor da timidina quinase (TK), ousais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

32. Método para o tratamento de mamíferos, incluindo o homem,que sofram de mastocitose sistêmica, que compreende a administração deum composto de fórmula (I): <formula>formula see original document page 74</formula> em combinação com um inibidor da timidina quinase (TK); ousais farmaceuticamente aceitáveis do mesmo.

33. Método, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, em que adoença proliferativa relacionada a mastócitos é selecionada de mastocitosesistêmica, mastocitose sistêmica agressiva e leucemia de mastócitos.

34. Método, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, em que adoença proliferativa relacionada a mastócitos tem resistência a imatinib.

35. Uso de um composto de fórmula (I) <formula>formula see original document page 74</formula> em combinação com um inibidor da timidina quinase (TK), ou sais farmaceu-ticamente aceitáveis do mesmo para a preparação de uma composição far-macêutica para o tratamento de doença proliferativa relacionada a mastóci-tos associada a KIT do tipo selvagem ou com uma mutação oncogênica KITG560V ou KIT-D816V.

36. Método, de acordo com a reivindicação 31 ou 32, em que oinibidor de TK é selecionado de dasatinib e 2CdA.