BRPI0614040A2

BRPI0614040A2 - anticorpos neutralizadores anti-b7rp1 humanos

Info

Publication number: BRPI0614040A2
Application number: BRPI0614040-8A
Authority: BR
Inventors: Gerald Siu; Wenyan Shen; Steven Kiyoshi Yoshinaga; Haichun Huang
Original assignee: Amgen Inc; Medarex Inc
Priority date: 2005-07-18
Filing date: 2006-07-18
Publication date: 2011-03-09
Also published as: SG164369A1; KR20130023356A; UA102667C2; US20110104757A1; IL218893A0; SG196835A1; CA2614972A1; IL218892A0; EA021669B1; EA200800355A1; KR20080049014A; IL218890A0; BRPI0614040B1; WO2007011941A2; KR20100101016A; IL218888A0; EP2397497A3; EP1915398B1; EP2397499A2; EP1915398A2

Abstract

ANTICORPOS NEUTRALIZADORES ANTI-B7RP1 HUMANOS. A presente invenção refere-se a anticorpos que interagem com ou se ligam a proteína-1 relacionada a 67 humana (B7RP1) e anticorpos que se ligam a e neutralizam a função de B7RP1. A invenção também refere-se a composições farmacêuticas dos ditos anticorpos e métodos para neutralizar a função de B7RP1 e, particularmente, para o tratamento de distúrbios imunes (por exemplo, resposta imune inapropriada), por administração de uma quantidade farmaceuticamente eficaz de anticorpos anti-B7RP1. Também refere-se a métodos de detecção da quantidade de B7RP1 em uma amostra usando anticorpos anti-B7RP1.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS NEUTRALIZADORES ANTI-B7RP1 HUMANOS".

Este pedido reivindica a prioridade do pedido de patente provisó-ria norte-americana nQ de série 60/700.265, depositado em 18 de julho de2005, cuja descrição é explicitamente aqui incorporada por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais huma-nos que se ligam à proteína-1 relacionada a B7 (B7RP1). Também se des-crevem composições e métodos para o tratamento de doenças e distúrbiosrelacionados a imunossupressão e ativação imune.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Células T iniciam a resposta imune, medeiam funções efetorasespecíficas para antígenos e regulam a atividade de outros leucócitos porsecreção de citocinas. Para a geração de uma resposta imune de linfócitos T(células T) apropriada, dois sinais têm de ser fornecidos à célula T pelas cé-lulas apresentadoras de antígenos (APC). O antígeno tem de ser apresenta-do ao receptor de célula T (TCR) mediante um complexo de histocompatibi-Iidade maior (MHC), em um evento que determina especificidade. As célulasT só podem reconhecer o antígeno apresentado em uma APC. Além do re-ceptor de antígeno, uma ativação de células T apropriada também requer ainteração de outras moléculas de superfície celular tanto na célula T, quantona APC. Essas moléculas, chamadas de moléculas co-estimuladoras, con-sistem em um receptor na célula responsiva e um Iigante presente na célulaindutora. Esse sinal co-estimulador independente de antígeno tem de serfornecido por engajamento de membros da família B7 na APC com seus re-ceptores em células T. Uma resposta imune produtiva leva à proliferação,diferenciação, expansão clonal e função efetora. Na ausência do segundosinal co-estimulador, as células T sofrem de um estado de não responsivida-de específicas para antígenos de longa duração, chamado de anergia. Expe-rimentos clínicos em fase Il demonstraram que o bloqueio de uma via co-estimuladora é eficaz no tratamento de psoríase (Abrams et al., 2000, J ExpMed. 192: 681-94; Abrams et al., 1999, J. Clin. Invest. 103: 1243-52) e artritereumatóide (Kremer et al., 2003, New England Journal of Medicine 349:1907-15), indicando que essa estratégia geral é um bom alvo para terapiaimunomoduladora.

Uma molécula B17 co-estimuladora particular, a proteína-1 rela-cionada a B7 (B7RP1), é uma proteína transmembrana do tipo 1 com umaseqüência de sinal e domínio extracelular na terminação amino, um domínioextracelular compreendendo duas alças Ig1 um domínio transmembrana eum domínio intracelular carbóxi terminal (Publicação de Pedido PCT ns WO00/46240). B7RP1 se liga preferencialmente a ICOS (que significa "co-estimulador induzível"; Yoshinga et al., 2000, Int. Immun. 12: 1439-1447)expressado na superfície celular de células T. ICOS desempenha um impor-tante papel na produção tanto de citocinas do tipo 1, quanto do tipo 2 porcélulas T ativadas (Coyle et al., 2000, Immunity 13: 95-105).

B7RP1 é o único Iigante expressado constitutivamente em APCs(Yoshinaga et al., 1999, Nature 402: 827-32), ao passo que ICOS é expres-sado apenas em células T ativadas (McAdam et al., 2000, Journal of Immu-nology 165: 5035-40). A sinalização dependente de B7RP1 é requerida paraa ativação da célula T efetora (isto é, completamente ativada), assim comosua maturação a partir de seu precursor virgem (Dong et al., 2003, Journal ofAutoimmunity. 21: 255-60; Coyle et al., 2000, Immunity. 13: 95-105). Conse-qüentemente, a interação B7RP1/ICOS é requerida para respostas imunesde recordação dependentes de células T apropriadas (Dong et al., 2003,Journal of Autoimmunity. 21: 255-60).

As atuais tentativas de interferir com a via de células T co-estimuladora focalizaram principalmente em polipeptídios co-estimuladoresque bloqueiem apenas a ativação de células T, mas não focalizou na ativa-ção e maturação. Conseqüentemente, essas terapias proporcionam umainibição geral da função de células T. Em contraste, o bloqueio da interaçãoB7RP1/ICOS em um ambiente clínico é altamente desejável, porque propor-cionaria um perfil de efeitos colaterais mais limitado do que terapias de co-estimulação que bloqueiam apenas a ativação de células T virgens.

SUMÁRIO DA INVENÇÃOA invenção apresenta anticorpos monoclonais que se ligam àproteína-1 relacionada a B7 (B7RP1). Em uma modalidade, os anticorposmonoclonais são anticorpos monoclonais humanos que neutralizam as ativi-dades biológicas de B7RP1 e são particularmente úteis para inibir parcial oucompletamente a atividade co-estimuladora imune de B7RP1. Também sãoapresentadas pela invenção células, particularmente células de hibridoma,que produzem os anticorpos monoclonais da invenção. Em aspectos particu-lares,os anticorpos da invenção se ligam especificamente à região H ou D deB7RP1, conforme aqui descrito.

A invenção também apresenta proteínas de fusão compreen-dendo a seqüência de uma região Fc de anticorpo e uma ou mais seqüên-cias identificadas como SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 40. Essas moléculaspodem ser preparadas usando-se métodos descritos, por exemplo, no Pedi-do de Patente Internacional, Publicação ne WO 00/24782, que é aqui incor-porada por referência. Essas moléculas podem ser expressadas, por exem-plo, em células de mamíferos (por exemplo, células de ovário de hamsterchinês) ou células bacterianas (por exemplo, células de E. coli).

Em certos aspectos, a invenção apresenta anticorpos compre-endendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesadacompreende uma região constante de cadeia pesada selecionada das regi-ões constantes de cadeia pesada de IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA e IgEou quaisquer de suas variações alélicas (conforme discutido em Kabat et al.,1991, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,Quinta Edição, Departamento Norte-americano de Saúde e Serviços Huma-nos, Publicação NIH n9 91/3242), aqui incorporado por referência, e a regiãovariável da cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos con-forme descrita na qualquer uma das SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 14, ou seufragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologicamentefuncional. Um anticorpo da invenção compreende uma seqüência de amino-ácidos da região constante de cadeia pesada de lgG2, conforme descrita naSEQ ID NO: 41, ou seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antígenoou imunologicamente funcional, ou uma seqüência de aminoácidos da regiãoconstante de cadeia pesada de IgGI, conforme descrita na SEQ ID NO: 42,ou seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologica-mente funcional. Em certas modalidades, os anticorpos são anticorpos mo-noclonais, anticorpos humanos ou, de preferência, anticorpos monoclonaishumanos.

Em certos aspectos, a invenção apresenta anticorpos compre-endendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia leve com-preende uma região constante com uma seqüência de aminoácidos confor-me descrita na SEQ ID NO: 43 ou seu fragmento de imunoglobulina de Iiga-ção a antígeno ou imunologicamente funcional, e a região variável de cadeialeve compreende uma seqüência de aminoácidos conforme descrita na SEQID NO: 1 a SEQ ID NO: 6, ou seu fragmento de imunoglobulina de ligação aantígeno ou imunologicamente funcional. Em certas modalidades, os anti-corpos são anticorpos monoclonais, anticorpos humanos ou, de preferência,anticorpos monoclonais humanos.

Em certos aspectos, os anticorpos da invenção compreendemuma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeialeve compreende uma seqüência de aminoácidos conforme descrita na SEQID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, ou seu fragmento de imunoglobulina de ligação aantígeno ou imunologicamente funcional. Em outros aspectos, a região vari-ável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos conformedescrita na SEQ ID NO: 1, ou seu fragmento de imunoglobulina de ligação aantígeno ou imunologicamente funcional.

Em outros aspectos, os anticorpos da invenção compreendemuma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável da cadeiapesada compreende uma seqüência de aminoácidos conforme descrita naSEQ ID NO: 9, ou seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ouimunologicamente funcional. Em outros aspectos, a região variável de ca-deia leve compreende uma seqüência de aminoácidos conforme descrita naSEQ ID NO: 2, ou seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ouimunologicamente funcional.

Em aspectos adicionais, a cadeia pesada compreende pelo me-nos uma região determinante de complementaridade (CDR) com uma se-qüência de aminoácidos conforme descrita em qualquer uma de SEQ ID NO:27 a SEQ ID NO: 40, ou seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antí-geno ou imunologicamente funcional. Em ainda outros aspectos, a cadeialeve compreende pelo menos uma CDR com uma seqüência de aminoáci-dos conforme descrita em qualquer uma de SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO:26, ou seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologi-camente funcional.

A invenção também apresenta anticorpos que se ligam especifi-camente a B7RP1, em que a cadeia pesada compreende uma região variá-vel compreendendo uma seqüência de aminoácidos conforme descrita naSEQ ID NO: 7 ou SEQ ID NO: 8, ou seu fragmento de imunoglobulina deligação a antígeno ou imunologicamente funcional, e a cadeia leve compre-ende uma região variável compreendendo uma seqüência de aminoácidosconforme descrita na SEQ ID NO: 1, ou seu fragmento de imunoglobulina deligação a antígeno ou imunologicamente funcional.

Além disso, a invenção apresenta anticorpos que se ligam espe-cificamente a B7RP1, em que a cadeia pesada compreende uma região va-riável compreendendo uma seqüência de aminoácidos conforme descrita naSEQ ID NO: 9, ou seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ouimunologicamente funcional, e a cadeia leve compreende uma região variá-vel compreendendo uma seqüência de aminoácidos conforme descrita emSEQ ID NO: 2, ou seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ouimunologicamente funcional.

Em certos aspectos, a invenção também apresenta anticorposcompreendendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeiapesada compreende uma região variável de cadeia pesada, e em que a re-gião variável de cadeia pesada compreende uma seqüência que tenha pelomenos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%,pelo menos cerca de 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% oupelo menos cerca de 99% de identidade com a seqüência de aminoácidosconforme descrita na SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 14, e em que a cadeialeve compreende uma região variável de cadeia leve, e em que a região va-riável de cadeia leve compreende uma seqüência que tenha pelo menoscerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos cerca de 99% de i-dentidade com a seqüência de aminoácidos conforme descrita na SEQ IDNO: 1 a SEQ ID NO: 6, e em que o anticorpo se liga especificamente aB7RP1.

A invenção também apresenta anticorpos que se ligam especifi-camente a B7RP1, em que a cadeia pesada compreende uma seqüência deaminoácidos conforme descrita na SEQ ID NO: 44 ou SEQ ID NO: 46, ouseu fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologicamen-te funcional, e a cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidosconforme descrita na SEQ ID NO: 45, ou seu fragmento de imunoglobulinade ligação a antígeno ou imunologicamente funcional.

A invenção também apresenta anticorpos que se ligam especifi-camente a B7RP1, em que a cadeia pesada compreende uma seqüência deaminoácidos conforme descrita na SEQ ID NO: 47, ou seu fragmento de i-munoglobulina de ligação a antígeno ou imunologicamente funcional, e acadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos conforme descritana SEQ ID NO: 48, ou seu fragmento de imunoglobulina de ligação a antíge-no ou imunologicamente funcional.

Em certos aspectos, a invenção apresenta anticorpos compre-endendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a cadeia pesadacompreende uma região variável de cadeia pesada, e em que a região vari-ável de cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR com uma se-qüência que tenha pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%,pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a se-qüência de aminoácidos conforme descrita na SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO:40, e em que a cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve,e em que a região variável de cadeia leve compreende pelo menos umaCDR com uma seqüência que tenha pelo menos cerca de 80%, pelo menoscerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,97%, 98% ou pelo menos cerca de 99% de identidade com a seqüência deaminoácidos conforme descrita na SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 26, e emque o anticorpo se liga especificamente a B7RP1.

A invenção também apresenta anticorpos de cadeia única, anti-corpos Fv de cadeia única, anticorpos F(ab), anticorpos F(ab)' e anticorpos(Fab1)2.

Em aspectos particulares, a invenção apresenta uma cadeia levecompreendendo uma seqüência de aminoácidos conforme descrita na SEQID NO: 15 a SEQ ID NO: 26, ou seu fragmento de imunoglobulina de ligaçãoa antígeno ou imunologicamente funcional.

Além disso, a invenção apresenta uma cadeia pesada compre-endendo uma seqüência de aminoácidos conforme descrita em qualqueruma de SEQ ID NO: 27 a SEQ ID NO: 40, ou seu fragmento de imunoglobu-Iina de ligação a antígeno ou imunologicamente funcional.

A invenção também refere-se a anticorpos humanos isoladosque se ligam especificamente a B7RP1, em que o anticorpo compreende: (a)regiões de armação de cadeia pesada humanas, uma região de CDR1 decadeia pesada humana, uma região de CDR1 de cadeia pesada humana euma região de CDR3 de cadeia pesada humana; e (b) regiões de armaçãode cadeia leve humanas, uma região de CDR1 de cadeia leve humana, umaregião de CDR1 de cadeia leve humana e uma região de CDR3 de cadeialeve humana. Em certos aspectos, a região de CDR1 de cadeia pesada hu-mana pode ser a região de CDR1 de cadeia pesada conforme mostrada emqualquer uma das SEQ ID NO: 27, 30 ou 35, e a região de CDR1 de cadeialeve humana pode ser a região de CDR1 de cadeia leve mostrada em qual-quer uma das SEQ ID NO: 15, 18 ou 24. Em outros aspectos, a região deCDR2 de cadeia pesada humana pode ser a região de CDR2 de cadeia pe-sada conforme mostrada em qualquer uma das SEQ ID NO: 28, 31, 33, 36ou 39, e a região de CDR2 de cadeia leve humana pode ser a região deCDR2 de cadeia leve mostrada em qualquer uma das SEQ ID NO: 16, 19 ou21. Em ainda outros aspectos, a região de CDR3 de cadeia pesada humanapode ser a região de CDR3 de cadeia pesada conforme mostrada em qual-quer uma das SEQ ID NO: 29, 32, 34, 37, 38 ou 40, e a região de CDR3 decadeia leve humana pode ser a região de CDR3 de cadeia leve mostrada emqualquer uma das SEQ ID NO: 17, 20, 22, 23, 25 ou 26.

Os anticorpos da invenção se caracterizam pela capacidade dese ligarem especificamente a B7RP1. Além disso, os anticorpos da invençãotêm a capacidade de antagonizar pelo menos uma atividade in vitro e/ou invivo associada a polipeptídios B7RP1. A invenção apresenta anticorpos hu-manos anti-B7RP1 humano isolados com alta afinidade de ligação para poli-peptídios B7RP1, em que os anticorpos se ligam a um polipeptídio B7RP1humano e se dissociam do polipeptídio B7RP1 humano com uma constantede dissociação (K0) de cerca de 10"6 Μ, 10"7 Μ, IO-8 Μ, 10'9 Μ, IO-10 Μ, 10"11Μ, 10"12 M, ou menos, conforme determinado usando-se KinExA, ou que ini-bem a sobrevivência induzida por B7RP1 em um ensaio de neutralização invitro com uma EC50 de cerca de 10"6 Μ, 10"7 Μ, 10"8 Μ, 10"9 Μ, 10"10 Μ, 10'11Μ, 10'12 M, ou menos.

A invenção também apresenta anticorpos humanos isolados ouseus fragmentos de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologica-mente funcionais que se ligam especificamente a B7RP1, em que os anti-corpos ou fragmentos compreendem uma região variável de cadeia pesadacompreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada, em que:

a) a CDR1 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoáci-dos conforme descrita em SEQ ID NO: 27, a CDR2 de cadeia pesada temuma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 28, e aCDR3 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos conforme des-crita em SEQ ID NO: 29;

b) a CDR1 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoáci-dos conforme descrita em SEQ ID NO: 30, a CDR2 de cadeia pesada temuma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 31, e aCDR3 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos conforme des-crita em SEQ ID NO: 32;

c) a CDR1 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoáci-dos conforme descrita em SEQ ID NO: 27, a CDR2 de cadeia pesada temuma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 33, e aCDR3 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos conforme des-crita em SEQ ID NO: 34;

d) a CDR1 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoáci-dos conforme descrita em SEQ ID NO: 35, a CDR2 de cadeia pesada temuma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 36, e aCDR3 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos conforme des-crita em SEQ ID NO: 37;

e) a CDR1 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoáci-dos conforme descrita em SEQ ID NO: 27, a CDR2 de cadeia pesada temuma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 33, e aCDR3 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos conforme des-crita em SEQ ID NO: 38; ou

f) a CDR1 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidosconforme descrita em SEQ ID NO: 35, a CDR2 de cadeia pesada tem umaseqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 39, e a CDR3de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos conforme descrita emSEQ ID NO: 40.

A invenção também apresenta anticorpos humanos isolados ouseus fragmentos de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologica-mente funcionais que se ligam especificamente a B7RP1, em que os anti-corpos ou fragmentos compreendem uma região variável de cadeia levecompreendendo uma CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve, em que:

a) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidosconforme descrita em SEQ ID NO: 15, a CDR2 de cadeia leve tem uma se-qüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 16, e a CDR3 decadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQID NO: 17;

b) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidosconforme descrita em SEQ ID NO: 18, a CDR2 de cadeia leve tem uma se-qüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 19, e a CDR3 decadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQID NO: 20;

c) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidosconforme descrita em SEQ ID NO: 15, a CDR2 de cadeia leve tem uma se-qüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 21, e a CDR3 decadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQID NO: 22;

d) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidosconforme descrita em SEQ ID NO: 18, a CDR2 de cadeia leve tem uma se-qüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 19, e a CDR3 decadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQID NO: 23;

e) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidosconforme descrita em SEQ ID NO: 24, a CDR2 de cadeia leve tem uma se-qüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 16, e a CDR3 decadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQID NO: 25; ou

f) a CDR1 de cadeia leve tem uma seqüência de aminoácidosconforme descrita em SEQ ID NO: 24, a CDR2 de cadeia leve tem uma se-qüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 16, e a CDR3 decadeia leve tem uma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQID NO: 26.

A invenção também apresenta anticorpos que competem com aligação dos anticorpos aqui descritos a B7RP1. Em certos aspectos, um an-ticorpo competitivo da invenção compete com a ligação de um anticorpo quecompreende qualquer uma das SEQ ID NO: 1 - 40 a B7RP1 humano.

Também são parte da invenção seqüências polinucleotídicasque codifiquem anticorpos humanos anti-B7RP1 humano, vetores compre-endendo as seqüências polinucleotídicas que codificam anticorpos humanosanti-B7RP1 humano, células hospedeiras transformadas com vetores incor-porando polinucleotídeos que codificam anticorpos humanos anti-B7RP1humano, formulações compreendendo anticorpos humanos anti-B7RP1 hu-mano e métodos para sua preparação e uso.

A invenção também apresenta métodos para detectar B7RP1em uma amostra biológica, compreendendo a etapa de contato da amostracom um anticorpo da invenção ou seu fragmento de ligação a antígeno. Umanticorpo anti-B7RP1 da invenção pode ser empregado em qualquer métodode ensaio conhecido, como ensaios de ligação competitiva, ensaios interca-lados diretos e indiretos, ensaios de imunoprecipitação e ensaios imunos-sorventes ligados a enzima (ELISA) (vide, Sola, 1987, Monoclonal Antibodi-es: A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press, Inc.) para a detecçãoe quantificação de B7RP1. Os anticorpos podem ser ligar a B7RP1 com umaafinidade que seja apropriada para o método de ensaio que é empregado.

Além disso, a invenção apresenta métodos para o tratamento deuma doença associada à produção aumentada de B7RP1, sensibilidade au-mentada a B7RP1 e/ou doenças relacionadas ao controle de respostas decélulas T, compreendendo a etapa de administração de uma quantidadefarmaceuticamente eficaz de uma composição farmacêutica compreendendopelo menos um anticorpo da invenção ou seu fragmento de imunoglobulinade ligação a antígeno ou imunologicamente funcional a uma indivíduo ne-cessitado.

As modalidades da invenção ficarão evidentes com a seguintedescrição detalhada e reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A figura 1A representa a seqüência de região variável de anti-corpo 16H (SEQ ID NO: 7) e a seqüência de região variável 16H de Iinha-gem germinativa (16Hg) correspondente (SEQ ID NO: 8).

A figura 1B apresenta resultados de ensaios de co-estimulaçãousando anti-CD3 e proteína de fusão hB7RP1-Fc, demonstrando que 16Hgretém suas atividades biológicas em comparação com 16H.

A figura 2 mostra os resultados do ensaio de ligação Biacore®com anticorpos 16H, 16Hg e 5D.

A figura 3 mostra os resultados do ensaio de ligação KinExAcom anticorpo 5D.A figura 4 mostra os resultados do ensaio de ligação KinExAcom anticorpo 2H.

A figura 5 mostra os resultados do ensaio de ligação KinExAcom anticorpo 2H de linhagem germinativa (2Hg).

A figura 6 apresenta os resultados de ensaios de ensaios decompetição por ligação que mostram que o anticorpo 16H compete com I-COS-Fc pela ligação com B7RP-1, analisado por citometria de fluxo.

A figura 7 apresenta um resumo de uma análise de polimorfismode nucleotídeos únicos (SNP) de B7RP-1.

A figura 8 apresenta um resumo da análise de um conjunto deanticorpos monoclonais anti-B7RP-1 humano em ensaios de competiçãoELISA. Os valores mostrados estão em IC5oS para inibição de ligação deuma proteína de fusão ICOS-Fc.

A figura 9A mostra a coloração fluorescente do domínio extrace-Iular (ECD) de B7RP1 com anticorpos 16H, 5D e ICOS marcados.

A figura 9B mostra uma eficácia de ligação similar de anticorpos16H e 5D a uma variante SNP de B7RP1.

A figura 9C apresenta os resultados de ensaios de co-estimulação com anticorpos 16H e 5D e variantes SNP.

A figura 10A mostra um ensaio de co-estimulação em placa comanticorpos monoclonais 1B7v2 em comparação com inúmeros anticorposmonoclonais B7RP-1 antimurino diferentes.

As figuras 10B, 10C e 10D mostram os resultados de experimen-tos de desafio com antígenos, analisados para IgM (figura 10B), lgG2a (figu-ra 10C) e IgGI (figura 10D) séricas específicas para o antígeno.

A figura 11 apresenta resultados de ELISA demonstrando que osníveis séricos de IL-5 são reprimidos por anticorpos 1B7v2.

A figura 12A mostra que anticorpos 16H podem se ligar a B7RP1de macaco Cynomolgus (painel direito) e B7RP1 humano (painel esquerdo).

A figura 12B mostra que os anticorpos 16H, 16Hg e 5D podeminibir a ativação de células T dependente de B7RP1/IC0S de macaco Cy-nomolgus.A figura 13A apresenta os valores de títulos de macacos Cynomol-gus individuais e médio do grupo no dia 53 e dia 57 após o desafio secundáriocom toxóide tetânico no dia 42 em animais tratados com anticorpos 16H.

A figura 13B apresenta os valores de títulos de macacos Cyno-molgus individuais e médio do grupo no dia 53 e dia 57 após o desafio secun-dário com toxóide tetânico no dia 42 em animais tratados com anticorpos 5D.

DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES

Os cabeçalhos de seções aqui usados são apenas para fins or-ganizacionais e não devem ser tomados como Iimitativos da matéria descri-ta. Todas as referências citadas neste pedido são expressamente aqui in-corporadas por referência para qualquer finalidade.

Definições

Técnicas convencionais podem ser usadas para DNA recombi-nante, síntese de oligonucleotídeos e cultura de tecido e transformação (porexemplo, eletroporação, lipofecção). Reações enzimáticas e técnicas de pu-rificação podem ser efetuadas de acordo com as especificações do fabrican-te ou conforme comumente realizado na técnica ou conforme aqui descrito.As técnicas e procedimentos precedentes podem ser geralmente efetuadosde acordo com métodos bem-conhecidos na técnica e conforme descritosem várias referências gerais e mais específicas que sejam citadas e discuti-das no presente relatório. Vide, por exemplo, Sambrook et al., 2001, MOLE-CULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3à ed., Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., que é aqui incorporado por refe-rência para qualquer finalidade. A menos que sejam dadas definições espe-cíficas, a nomenclatura utilizada com relação a, e os procedimentos e técni-cas laboratoriais de química analítica, química orgânica sintética e químicamédica e farmacêutica aqui descritas são aquelas bem-conhecidas e comu-mente usadas na técnica. Da mesma forma, podem-se usar técnicas con-vencionais para sínteses químicas, análises químicas, preparação, formula-ção e distribuição farmacêutica, e tratamento de pacientes.

Conforme utilizados de acordo com a presente descrição, os se-guintes termos, a menos que indicado de outra forma, devem ser entendidoscomo possuindo os seguintes significados. As expressões "propriedade bio-lógica", "característica biológica" e o termo "atividade" com referência a umanticorpo da presente invenção são aqui usados de maneira intercambiávele incluem, mas não se limitam a, afinidade e especificidade de epítopo (porexemplo, anticorpo humano anti-B7RP1 humano que se ligam a B7RP1 hu-mano), capacidade de antagonizar a atividade do polipeptídio-alvo (por e-xemplo, atividade de B7RP1), a estabilidade in vivo do anticorpo e as propri-edades imunogênicas do anticorpo. Outras propriedades ou característicasbiológicas identificáveis de um anticorpo reconhecidas na técnica incluem,por exemplo, reatividade cruzada (isto é, com homólogos não humanos deB7RP1, ou com outras proteínas ou tecidos, geralmente) e capacidade depreservar altos níveis de expressão de proteína em células de mamíferos.

As propriedades ou características acima mencionadas podem ser observa-das ou medidas usando-se técnicas reconhecidas na técnica, incluindo, masnão limitadas a, ELISA, ELISA competitivo, análise de ressonância de plas-mon de superfície, ensaios de neutralização in vitro e in vivo (por exemplo,Exemplo 2) e imunohistoquímica com seções de tecido de diferentes fontes,incluindo seres humanos, primatas ou qualquer outra fonte apropriada. Ativi-dades e propriedades biológicas particulares de anticorpos humanos anti-B7RP1 humano são descritas em maiores detalhes nos Exemplos abaixo.

O termo "polinucleotídeo isolado", conforme aqui usado, significaum polinucleotídeo de DNA genômico, cDNA, RNA ou de origem sintética oude alguma combinação deles, em que, em virtude de sua origem, o polinu-cleotídeo isolado (1) não esteja associado a todo ou a uma parte de um poli-nucleotídeo com o qual o polinucleotídeo isolado seja encontrado na nature-za, (2) esteja ligado a um polinucleotídeo ao qual não esteja ligado na natu-reza, ou (3) não ocorra na natureza como parte de uma seqüência maior.

O termo "polinucleotídeo", conforme aqui citado, significa polí-meros de ácido nucléico de fita simples ou fita dupla de pelo menos 10 nu-cleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, os nucleotídeos quecompõem o polinucleotídeo podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonu-cleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. As di-tas modificações incluem modificações de bases, como bromuridina, modifi-cações da ribose, como arabinosida e 2\3'-didesoxirribose, e modificaçõesde ligações internucleotídicas, como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosse-lenoato, fosforodisselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato e fosforoami-dato. O termo "polinucleotídeo" inclui especificamente formas de fita simplese dupla de DNA ou RNA.

O termo "oligonucleotídeo" aqui citado inclui nucleotídeos de o-corrência natural e modificados, ligados entre si por ligações oligonucleotídi-cas de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural. Os oligonucleotí-deos são um subconjunto de polinucleotídeos compreendendo membros quesejam em geral de fita simples e tenham um comprimento de 200 nucleotí-deos ou menos. Em certas modalidades, os oligonucleotídeos têm 10 a 60nucleotídeos de comprimento. Em certas modalidades, os oligonucleotídeostêm 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 a 40 nucleotídeos de comprimento.

Os oligonucleotídeos podem ser de fita simples ou de fita dupla, por exem-plo, para uso na construção de um mutante genético. Oligonucleotídeos dainvenção podem ser oligonucleotídeos em sentido ou anti-sentido com refe-rência a uma seqüência codificadora de proteína.

O termo "nucleotídeos de ocorrência natural" inclui desoxirribo-nucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo "nucleotídeos modificados" incluinucleotídeos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e dimilares.O termo "ligações oligonucleotídicas" inclui ligações oligonucleotídicas comofosforotioato, fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosforo-anilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato e similares. Vide, por exemplo,LaPIanche et al., 1986, Nucl. Acids Res., 14: 9081; Stec et al., 1984, J. Am.Chem. Soc., 106: 6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16: 3209; Zon etal., 1991, Anti-Cancer Drug Design, 6: 539; Zon et al., 1991, OLIGONUCLE-OTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, pp. 87-108 (F.Eckstein, Ed.), Oxford University Press; Stec et al., patente norte-americanans 5.151.510; Uhlmann e Peyman, 1990, Chemical Reviews, 90: 543, cujasdescrições são aqui incorporadas por referência para qualquer finalidade.Um oligonucleotídeo pode incluir um marcador detectável para permitir adetecção do oligonucleotídeo ou sua hibridização.

O termo "proteína isolada" aqui citado significa que a presenteproteína (1) é livre de pelo menos algumas outras proteínas com as quaisseria encontrada na natureza, (2) é essencialmente livre de outras proteínasda mesma fonte, por exemplo, da mesma espécie, (3) é expressada por umacélula de uma espécie diferente, (4) foi separada de pelo menos 50 por cen-to dos polinucleotídeos, lipídios, carboidratos ou outros materiais com osquais esteja associada na natureza, (5) não está associada- (por interaçãocovalente ou não covalente) com partes de uma proteína com a qual a "pro-teína isolada" esteja associada na natureza, (6) está operacionalmente as-sociada (por interação covalente ou não covalente) com um polipeptídio como qual não esteja associado na natureza, ou (7) não ocorre na natureza. Es-sa proteína isolada pode ser codificada por DNA genômico, cDNA, mRNA ououtro RNA1 de origem sintética, ou qualquer de suas combinações. Em umamodalidade, a proteína isolada é substancialmente livre de proteínas ou po-lipeptídios ou outros contaminantes que sejam encontrados em seu ambien-te natural que interfiram com seu uso (terapêutico, diagnóstico, profilático, depesquisa ou outro).

Um anticorpo "isolado" é um que tenha sido identificado e sepa-rado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Compo-nentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interferemcom usos diagnósticos ou terapêuticos do anticorpo e podem incluir enzi-mas, hormônios e outras substâncias proteináceas e não proteináceas. Emcertas modalidades, o anticorpo é purificado (1) a mais de 95% ou mais de99% em peso de anticorpo, conforme determinado pelo método de Lowry,(2) a um grau suficiente para se obterem pelo menos 15 resíduos da se-qüência de aminoácidos N-terminal ou interna com o uso de um seqüencia-dor de copo giratório, ou (3) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob con-dições redutoras ou não redutoras usando-se coloração azul de Coomassieou prata. O anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células re-combinantes, pois pelo menos um componente do ambiente natural do anti-corpo não estará presente.Os termos "polipeptídio" ou "proteína" significam moléculas coma seqüência de proteínas nativas, isto é, proteínas produzidas por células deocorrência natural e especificamente não recombinantes, ou células geneti-camente manipuladas ou recombinantes, e podem compreender moléculascom a seqüência de aminoácidos da proteína nativa ou moléculas com dele-ções de, adições a e/ou substituições de um ou mais aminoácidos da se-qüência nativa. Os termos "polipeptídio" e "proteína" englobam especificamen-te anticorpos anti-B7RP1, ou seqüências que tenham deleções de, adições ae/ou substituições de um ou mais aminoácidos de um anticorpo anti-B7RP1.

O termo "fragmento polipeptídico" refere-se a um polipeptídioque tenha uma deleção amino terminal, uma deleção carboxila terminal e/ouuma deleção interna. Em certas modalidades, os fragmentos têm pelo me-nos 5 a cerca de 500 aminoácidos de comprimento. Deve-se notar que, emcertas modalidades, os fragmentos têm pelo menos 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50,70, 100, 110, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ou 450 aminoácidos de compri-mento. Fragmentos polipeptídicos particularmente úteis incluem domíniosfuncionais, incluindo domínios de ligação, particularmente de ligação a antí-geno, particularmente em que o antígeno é um epítopo de B7RP1 humano.No caso de um anticorpo anti-B7RP1, fragmentos utilizáveis incluem, masnão se limitam a, uma região de CDR, um domínio variável de cadeia pesa-da ou leve, uma parte de uma cadeia de anticorpo ou apenas sua região va-riável incluindo duas CDRs e similares.

O termo "agente de ligação específica" refere-se a uma moléculade ocorrência natural ou não natural que se ligue especificamente a um alvo.Exemplos de agentes de ligação específicos incluem, mas não se limitam a,proteínas, peptídios, ácidos nucléicos, carboidratos e lipídios. Em certas mo-dalidades, um agente de ligação específico é um anticorpo.

O termo "agente de ligação específica a B7RP1" refere-se a umagente de ligação específica que se ligue especificamente a qualquer partede B7RP1. Em certas modalidades, um agente de ligação específica aB7RP1 é um anticorpo que se ligue especificamente a B7RP1.

A título de exemplo, um anticorpo "se liga especificamente" a umalvo, se o anticorpo, quando marcado, puder sofrer competição pelo seu alvopelo anticorpo não marcado correspondente.

O termo "fragmento de imunoglobulina imunologicamente fun-cional", conforme aqui usado, refere-se a um fragmento polipeptídico quecontenha pelo menos as CDRs das cadeias pesada e leve da imunoglobuli-na. Um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional da inven-ção é capaz de se ligar a um antígeno. Em certas modalidades, o antígeno éum Iigante que se liga especificamente a um receptor. Nessas modalidades,a ligação de um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcionalda invenção impede a ligação do Iigante a seu receptor, interrompendo aresposta biológica resultante da ligação do Iigante ao receptor. Em uma mo-dalidade, um fragmento de imunoglobulina imunologicamente funcional dainvenção se liga especificamente a B7RP1. De preferência, o fragmento seliga especificamente a B7RP1 humano.

O termo "de ocorrência natural" ou "nativo", conforme aqui usadoe aplicado a um objeto, refere-se ao fato de que o objeto pode ser encontra-do na natureza. Por exemplo, uma seqüência polipeptídica ou polinucleotídi-ca que esteja presente em um organismo (incluindo vírus) que possa serisolado de uma fonte na natureza e que não tenha sido intencionalmentemodificado pelo homem é de ocorrência natural. O termo "de ocorrência nãonatural" ou "não nativo", conforme aqui usado, refere-se a um material quenão seja encontrado na natureza ou que tenha sido estruturalmente modifi-cado ou sintetizado pelo homem. Por exemplo, "de ocorrência não natural"pode se referir a uma variante, como uma variante de polinucleotídeo quepossa ser produzida usando-se técnicas de mutagênese conhecidas na téc-nica ou uma variante de polipeptídio produzida por essa variante de polinu-cleotídeo. Essas variantes incluem, por exemplo, aquelas produzidas porsubstituições, deleções ou adições de nucleotídeos que possam envolver umou mais nucleotídeos. Variantes polinucleotídicas podem ser alteradas emregiões codificadoras ou não codificadoras ou em ambas. Alterações nasregiões codificadoras podem produzir substituições, deleções ou adições deaminoácidos conservadoras. Particularmente entre estas estão substitui-ções, adições, deleções e substituições conservadoras silenciosas, que nãoalterem as propriedades e atividades de um anticorpo para B7RP1 da inven-ção. Aqueles versados na técnica podem determinar prontamente como ge-rar essa variante usando métodos bem-conhecidos na técnica.

O termo "operacionalmente ligado" significa que os componen-tes aos quais o termo se aplica estão em uma relação que os permita reali-zar suas funções inerentes sob condições adequadas. Por exemplo, umaseqüência de controle "operacionalmente ligada" a uma seqüência codifica-dora de proteína está ligada a ela de modo que a expressão da seqüênciacodificadora de proteína seja conseguida sob condições compatíveis com aatividade transcricional das seqüências de controle.

O termo "seqüência de controle", conforme aqui usado, refere-sea seqüências polinucleotídicas que possam efetuar a expressão, processa-mento ou localização intracelular de seqüências codificadoras às quais este-jam operacionalmente ligadas. A natureza dessas seqüências de controlepode depender do organismo hospedeiro. Em modalidades particulares, se-qüências de controle para procariotas podem incluir um promotor, um sítiode ligação ribossomal e uma seqüência de término de transcrição. Em outrasmodalidades particulares, seqüências de controle para eucariotas podemincluir promotores compreendendo um ou uma pluralidade de sítios de reco-nhecimento para fatores de transcrição, seqüências intensificadoras detranscrição, seqüências de término de transcrição e seqüências de poliadeni-lação. Em certas modalidades, "seqüências de controle" podem incluir se-qüências líderes e/ou seqüências de parceiro de fusão.

O termo "vetor" inclui uma molécula de ácido nucléico capaz detransportar para dentro de uma célula outro ácido nucléico ao qual tenhasido ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídio", que refere-se a uma alça deDNA de fita dupla circular à qual segmentos de DNA adicionais possam serligadas. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adi-cionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes dereplicação autônoma em uma células hospedeira na qual sejam introduzidos(por exemplo, vetores bacterianos com uma origem bacteriana de replicaçãoe vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetoresnão epissomais de mamíferos) podem ser integrados no genoma de umacélula hospedeira por introdução na célula hospedeira e, dessa forma, sãoreplicados juntamente com o genoma do hospedeiro. Além disso, certos ve-tores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estejamoperacionalmente ligados. Esses vetores são aqui chamados de "vetores deexpressão recombinante" (ou simplesmente "vetores de expressão"). Emgeral, vetores de expressão utilizáveis na prática de técnicas de DNA re-combinante freqüentemente estão na forma de plasmídios. No presente rela-tório, "plasmídio" e "vetor" podem ser usados de maneira intercambiável,pois o plasmídio é a forma de vetor mais comumente usada. Entretanto, ainvenção se destina a incluir essas outras formas de vetores de expressão,como vetores virais (por exemplo, retrovírus de replicação defeituosa, ade-novírus e vírus adenoassociados), que sirvam a funções equivalentes.

A expressão "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente"célula hospedeira") inclui uma célula na qual um vetor de expressão recom-binante tenha sido introduzido. Aqueles versados na técnica devem entenderque esses termos pretendem se referir não apenas à célula sujeita particular,mas também à descendência dessa célula. Como certas modificações po-dem ocorrer em gerações sucessivas devido a mutação ou influências ambi-entais, essa descendência pode não ser, de fato, idêntica à célula original,mas ainda está incluída dentro do âmbito do termo "células hospedeira",conforme aqui usado. Uma ampla variedade de sistemas de expressão hos-pedeiros pode ser usada para expressar os anticorpos da presente inven-ção, incluindo sistemas de expressão bacteriana, em levedura, de baculoví-rus e mamíferos (assim como sistemas de expressão de descrição em fago).

Um exemplo de um vetor de expressão bacteriana adequado é o pUC19.Para expressar um anticorpo de maneira recombinante, uma célula hospe-deira é transfectada com um ou mais vetores de expressão recombinanteportadores de fragmentos de DNA que codifiquem as cadeias leve e pesadade imunoglobulina do anticorpo, de modo que as cadeias leve e pesada se-jam expressadas na célula hospedeira e possam ser secretadas no meio emque as células hospedeiras são cultivadas, os anticorpos podendo ser recu-perados desse meio. Metodologias de DNA recombinante padronizadas sãousadas para se obterem genes de cadeia leve e pesada de anticorpo, incor-porar esses genes em vetores de expressão recombinante e introduzir osvetores em células hospedeiras, como aquelas descritas em Sambrook etal., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold SpringHarbor Laboratories, Ausubel, F. M. et al. (Eds.), CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates (1989) e na pa-tente norte-americana n9 4.816.397, de Boss et al.

O termo "transdução" é usado para se referir à transferência degenes de uma bactéria para outra, normalmente por um fago. "Transdução"também refere-se à aquisição e transferência de seqüências celulares euca-rióticas por retrovírus.

O termo "transfecção" é usado para se referir à captação deDNA estranho ou exógeno por uma célula, e uma célula foi "transfectada"quando o DNA exógeno tiver sido introduzido dentro da membrana celular.Inúmeras técnicas de transfecção são bem-conhecidas na técnica e são aquiapresentadas. Vide, por exemplo, Graham et al., 1973, Virology 52: 456;Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANU-AL, Cold Spring Harbor Laboratories; Davis et al., 1986, BASIC METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY, Elsevier; e Chu et al., 1981, Gene 13: 197. Es-sas técnicas podem ser usadas para introduzir uma ou mais frações de DNAexógeno em células hospedeiras adequadas.

O termo "transformação", conforme aqui usado, refere-se a umaalteração nas características genéticas de uma célula, e uma célula foi trans-formada quando tiver sido modificada para conter um novo DNA. Por exem-plo, uma célula é transformada quando é geneticamente modificada a partirde seu estado nativo. Após a transfecção ou transdução, o DNA transforma-dor pode se recombinar com o DNA da célula por integração física em umcromossomo da célula, ou pode ser mantido transitoriamente como um ele-mento epissomal sem ser replicado, ou pode se replicar independentementecomo um plasmídio. Considera-se que uma célula foi transformada de ma-neira estável, quando o DNA é replicado com a divisão da célula.

O termo "antígeno" refere-se a uma molécula ou parte de umamolécula capaz de ser ligada por um agente de ligação seletiva, como umanticorpo, e, além disso, capaz de ser usada em um animal para produziranticorpos capazes de ligação a um epítopo desse antígeno. Um antígenopode ter um ou mais epítopos.

Em certas modalidades, variantes de anticorpos incluem varian-tes de glicosilação, em que o número e/ou tipo de sítios de glicosilação foialterado em comparação com as seqüências de aminoácidos do polipeptídiode origem. Em certas modalidades, variantes de proteínas compreendem umnúmero maior ou menor de sítios de glicosilação ligados a N do que a prote-ína nativa. Um sítio de glicosilação ligado a N se caracteriza pela seqüência:Asn-Xaa-Ser ou Asn-Xaa-Thr, em que o resíduo de aminoácido designadopor Xaa pode ser qualquer resíduo de aminoácido, exceto prolina. A substi-tuição de resíduos de aminoácidos para criar essa seqüência fornece umnovo sítio em potencial para a adição de uma cadeia de carboidrato ligada aN. Alternativamente, substituições que eliminem essa seqüência removerãouma cadeia de carboidrato ligada a N existente. Também se apresenta umrearranjo de cadeias de carboidratos ligadas a N, em que um ou mais sítiosde glicosilação ligados a N (tipicamente aqueles que sejam de ocorrêncianatural) são eliminados, e um ou mais novos sítios ligados a N são criados.Variantes de anticorpos adicionais incluem variantes de cisteína, em que umou mais resíduos de cisteína são deletados ou substituídos por outro amino-ácido (por exemplo, serina), em comparação com a seqüência de aminoáci-dos de origem. Variantes de cisteína podem ser úteis quando os anticorpostêm de ser redobrados em uma conformação biologicamente ativa, comodepois do isolamento de corpúsculos de inclusão insolúveis. Variantes decisteína em geral têm menos resíduos cisteína do que a proteína nativa e,tipicamente, têm um número par para minimizar interações resultantes decisteínas não pareadas.

Em modalidades adicionais, variantes de anticorpos podem in-cluir anticorpos compreendendo um fragmento Fc modificado ou uma regiãoconstante de cadeia pesada modificada. Um fragmento Fc, que significa"fragmento que se cristaliza", ou uma região constante de cadeia pesadapode ser modificada por mutação para conferir a um anticorpo característi-cas de ligação alteradas. Vide, por exemplo, Burton e Woof1 1992, Advancesin Immunology 51: 1-84; Ravetch e Bolland, 2001, Annu. Rev. Immunol. 19:275-90; Shields et al., 2001, Journal of Biol. Chem. 276: 6591-6604; Telle-man e Junghans, 2000, Immunology 100: 245-251; Medesan et al., 1998,Eur. J. Immunol. 28: 2092-2100; todos aqui incorporados por referência).

Essas mutações podem incluir substituições, adições, deleções ou quaisquerde suas combinações e são tipicamente produzidas por mutagênese direcio-nada a sítio usando um ou mais oligonucleotídeos mutagênicos, de acordocom métodos aqui descritos, assim como de acordo com métodos conheci-dos na técnica (vide, por exemplo, Sambrook et al., MOLECULAR CLO-NING: A LABORATORY MANUAL, 3ã ed., 2001, Cold Spring Harbor, N.Y., eBerger e Kimmel, METHODS IN ENZYMOLOGY, Volume 152, Guide to Mo-lecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Inc., San Diego, CA.,que são aqui incorporados por referência).

De acordo com certas modalidades, as substituições de aminoá-cidos podem (1) reduzir a suscetibilidade a proteólise, (2) reduzir a suscetibi-Iidade à oxidação, (3) alterar a afinidade de ligação e/ou (4) conferir ou modi-ficar outras propriedades físico-químicas ou funcionais nesses polipeptídios.

De acordo com certas modalidades, substituições únicas ou múltiplas deaminoácidos (em certas modalidades, substituições de aminoácidos conser-vadoras) podem ser feitas na seqüência de ocorrência natural (em certasmodalidades, na parte do polipeptídio fora do(s) domínio(s) formador(es) decontatos intermoleculares). Em certas modalidades, uma substituição de a-minoácido conservadora tipicamente não altera substancialmente as carac-terísticas estruturais da seqüência de origem (por exemplo, um aminoácidosubstituto devem romper ou tender a romper a estrutura secundária que ca-racteriza uma seqüência de origem, como uma hélice). Exemplos de estrutu-ras secundárias e terciárias de polipeptídios reconhecidas na técnica sãodescritas em PROTEINS, STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES(Creighton, Ed.), 1984, W. Η. Freeman and Company1 New York; INTRO-DUCTION TO PROTEIN STRUCTURE (C. Branden e J. Tooze, eds.), 1991,Garland Publishing, New York, N.Y.; e Thornton et al., 1991, Nature 354:105, todos aqui incorporados por referência.

"Anticorpo" ou "peptídio(s) de anticorpo" refere-se a um anticor-po intacto, ou seu fragmento de ligação, que compete com o anticorpo intac-to para ligação específica. Em certas modalidades, os fragmentos de ligaçãosão produzidos por técnicas de DNA recombinante. Em modalidades adicio-nais, os fragmentos de ligação são produzidos por clivagem enzimática ouquímica de anticorpos intactos. Os fragmentos de ligação incluem, mas nãose limitam a, F(ab), F(ab'), F(ab')2. Fv e anticorpos de cadeia única.

A invenção apresenta anticorpos que compreendem uma cadeiapesada e uma cadeia leve, em que as cadeias pesada e leve formam juntasuma estrutura de ligação a antígeno capaz de se ligar especificamente ab7rp1. Uma cadeia pesada de comprimento total inclui um domínio de regi-ão variável, VH, e três domínios de região constante, Ch1, Ch2 e Ch3. O do-mínio Vh está na terminação amino do polipeptídio, e o domínio Ch3 está naterminação carboxila. O termo "cadeia pesada", conforme aqui usado, en-globa uma cadeia pesada de comprimento total e seus fragmentos. Umacadeia leve de comprimento total inclui um domínio de região variável, VL, eum domínio de região constante, Cl- Como a cadeia pesada, o domínio deregião variável da cadeia leve está na terminação amino do polipeptídio. Otermo "cadeia leve", conforme aqui usado, engloba uma cadeia leve decomprimento total e seus fragmentos. Um fragmento F(ab) é composto poruma cadeia leve e as regiões Ch1 e variável de uma cadeia pesada. Umacadeia pesada de uma molécula F(ab) não pode formar uma ligação dissul-feto com outra molécula de cadeia pesada. Um fragmento F(ab') contémuma cadeia leve e uma cadeia pesada que contém mais da região constan-te, entre os domínios Ch1 e Ch2, de modo que uma ligação dissulfeto inter-cadeias possa se formar entre duas cadeias pesadas para formar uma mo-lécula F(ab')2. A região Fv compreende as regiões variáveis tanto da cadeiapesada, quanto da leve, mas não tem as regiões constantes. Anticorpos decadeia única são moléculas Fv em que as regiões variáveis de cadeia pesa-da e leve foram conectadas por um Iigante flexível para formar uma únicacadeia polipeptídica, que forma uma região de ligação a antígeno. Anticor-pos de cadeia única são discutidos em detalhes na Publicação de Pedido dePatente Internacional nQ WO 88/01649 e nas patentes norte-americanas ne4.946.778 e 5.260.203.

Um anticorpo bivalente diferente de um anticorpo "multiespecífi-co" ou "multifuncional", em certas modalidades, é entendido como compre-endendo sítios de ligação com especificidade antigênica idêntica.

Na avaliação da ligação e especificidade de anticorpo de acordocom a invenção, um anticorpo inibe substancialmente a adesão de um Iigan-te a um receptor, quando um excesso de anticorpo reduz a quantidade deIigante ligado ao receptor em pelo menos cerca de 20%, 40%, 60%, 80%,85% ou mais (conforme medido, inter alia, com o uso de um ensaio de Iiga-ção competitiva invitro).

"Anticorpo neutralizador" significa uma molécula de anticorpoque seja capaz de bloquear ou reduzir substancialmente uma função efetorade um antígeno-alvo ao qual se liga. Portanto, um anticorpo anti-B7RP1"neutralizador" é capaz de bloquear ou reduzir substancialmente uma funçãoefetora, como ligação a receptor e/ou geração de uma resposta celular, deB7RP1. "Reduzir substancialmente" pretende significar pelo menos cerca de60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cer-ca de 80%, pelo menos cerca de 85% ou pelo menos cerca de 90% de redu-ção de uma função efetora do antígeno-alvo (por exemplo, B7RP1 humano).

O termo "epítopo" inclui qualquer sítio em um antígeno que sejacapaz de se ligar especificamente a uma imunoglobulina ou receptor de cé-lula T. Em certas modalidades, determinantes de epítopos incluem agrupa-mentos de moléculas de superfície quimicamente ativos, como aminoácidos,cadeias colaterais de açúcares, grupos fosforila ou grupos sulfonila, e, emcertas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionaisespecíficas e/ou características de carga específicas. Um epítopo é uma re-gião de um antígeno que seja ligada por um anticorpo. Em certas modalida-des, diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antígeno, quandoreconhece preferencialmente seu antígeno-alvo em uma mistura complexade proteínas e/ou macromoléculas. Em certas modalidades, diz-se que umanticorpo se liga especificamente a um antígeno, quando a constante de dis-sociáção em equilíbrio é de cerca de 10"6 Μ, 10"7 Μ, 10"8 Μ, 10"9 Μ, 10"10 M,IO"11 M, ou menos de cerca de 10"12 M.

Um anticorpo se liga "essencialmente ao mesmo epítopo" comoum anticorpo de referência, quando os dois anticorpos reconhecem epítoposidênticos ou estericamente superpostos. Os métodos mais amplamente usa-dos e rápidos para determinar se dois anticorpos se ligam a epítopos idênti-cos ou estericamente superpostos são ensaios de competição, que podemser configurados em todos os inúmeros diferentes formatos, usando antíge-no marcado ou anticorpo marcado. Normalmente, o antígeno é imobilizadoem um substrato, e a capacidade de anticorpos não marcados de bloquea-rem a ligação de anticorpos marcados é medida usando-se isótopos radioa-tivos ou marcadores enzimáticos.

O termo "agente" é aqui usado para designar um composto quí-mico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ouum extrato preparado a partir de materiais biológicos.

Conforme aqui usado, os termos "marcador" ou "marcado" refe-re-sem à incorporação de um marcador detectável, por exemplo, por incor-poração de um aminoácido radiomarcado ou fixação a um polipeptídio defrações biotina que possam ser detectadas por avidina marcada (por exem-plo, estreptavidina compreendendo um marcador detectável, como um mar-cador fluorescente, um marcador quimioluminescente ou uma atividade en-zimática que possa ser detectada por métodos ópticos ou colorimétricos).

Em certas modalidades, o marcador também pode ser terapêutico. Váriosmétodos de marcação de polipeptídios e glicoproteínas são conhecidos natécnica e podem ser vantajosamente usados nos métodos aqui apresenta-dos. Exemplos de marcadores para polipeptídios incluem, mas não se limi-tam a, radioisótopos ou radionuclídeos, como 3H, 14C1 15N, 35S, 90Y1 99mTc,111In, 125I e 131I, marcadores fluorescentes (por exemplo, isotiocianato de flu-oresceína ou FITC, rodamina ou fósforos lantanídeos), marcadores enzimá-ticos (por exemplo, peroxidase de rábano, β-galactosidase, luciferase, fosfa-tase alcalina), marcadores quimioluminescentes, marcadores haptênicos,como grupos biotinila, e epítopos polipeptídicos predeterminados reconheci-dos por um repórter secundário (por exemplo, seqüências de par de zíper deleucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação ametais ou etiquetas de epítopos). Em certas modalidades, os marcadoressão fixados por braços espaçadores (como (CH2)n, em que η < cerca de 20)de vários comprimentos, para reduzir o bloqueio estérico em potencial.

O termo "amostra biológica", conforme aqui usado, inclui, masnão se limita a, qualquer quantidade de uma substância de um ser vivo ouser anteriormente vivo. Esses seres vivos incluem, mas não se limitam a,seres humanos, camundongos, macacos, ratos, coelhos e outros animais.Essas substâncias incluem, mas não se limitam a, sangue, soro, urina, célu-las, órgãos, tecidos, ossos, medula óssea, Iinfonodos e pele.

O termo "agentes farmacêutico ou fármaco", conforme aqui usa-do, refere-se a um composto químico ou composição capaz de induzir umefeita terapêutico desejado, quando apropriadamente administrado a umpaciente. A expressão "quantidade farmaceuticamente eficaz", com referèn-cia a uma composição farmacêutica compreendendo um ou uma pluralidadedos anticorpos da invenção, deve ser entendida como significando, de acor-do com a invenção, uma quantidade da dita composição farmacêutica queseja capaz de abolir, em um paciente, a diminuição no limiar de sensibilidadea estímulos externos, com o retorno desse limiar de sensibilidade a um nívelcomparável como observado em sujeitos saudáveis.

Um "distúrbio" é qualquer condição que se beneficie do trata-mento de acordo com a presente invenção. "Distúrbio" e "condição" são aquiusados de maneira intercambiável e incluem distúrbios crônicos e agudos dosistema imune ou doenças do sistema imune associadas a uma respostaimune inapropriada, incluindo aquelas condições patológicas que predispo-nham o mamífero ao distúrbio em questão. Inúmeras condições e distúrbiosque se beneficiariam do tratamento de acordo com a presente invenção sãodescritos, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional nePCT/US00/01871 (Publicação ne WO 00/46240), cuja descrição é incorpora-da por referência em sua inteireza.

Os termos "doença do sistema imune" e "condição do sistemaimune" englobam qualquer condição médica ou distúrbio associado a níveisaumentados de B7RP1, sensibilidade aumentada a B7RP1 ou doenças me-diadas por células T1 incluindo, mas não limitadas a, doença auto-imune,sobrevivência a enxerto, transplante de medula óssea e órgãos, alossensibi-lização devida a transfusões sangüíneas, síndrome do choque tóxico, doen-ças mediadas por células B dependentes de células T, doenças inflamatóriascrônicas associadas à disfunção crônica de células imunes, distúrbios Iinfo-proliferativos (como mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstom ecrioglobulinemias) e câncer. Exemplos não Iimitativos de doenças auto-imunes incluem lúpus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide, púrpuratrombocitopênica imune (ITP), esclerose múltipla, diabetes e psoríase. E-xemplos não Iimitativos de doenças inflamatórias crônicas incluem doençainflamatória do intestino (como doença de Crohn e colite ulcerativa), doençade Grave, tireoidite de Hashimoto e diabetes melito.

Os termos "doença do sistema imune" e "condição do sistemaimune" também englobam qualquer condição clínica que seja melhoradapela inibição da produção de anticorpos, como reações de hipersensibilida-de. Reações de hipersensibilidade podem ser causadas, por exemplo, porfebre do feno, alergias, asma, atopia e edema agudo.

Exemplos não Iimitativos de doenças que causam reações dehipersensibilidade mediadas por anticorpos incluem lúpus eritematoso sis-têmico, artrite (como artrite reumatóide, artrite reativa, artrite psoríaca), ne-fropatias (como glomerulonefrite, nefropatias membranosas, mesangiocapi-lares, segmentares focais, necrotizantes focais, em crescente e proliferati-vas, como tubulopatias), distúrbios cutâneos (como pênfigo e penfigóide,eritema nodoso), endocrinopatias (como tireoidite, doença de Grave, doençade Hashimoto, diabetes melito dependente de insulina), várias pneumopatias(como alveolite extrínseca), várias vasculopatias, doença celíaca, doençascom produção aberrante de IgA1 muitas anemias e trombocitopenias, sín-drome de Guillain-Barre e miastenia gravis.

Conforme aqui usados, os termos "quantidade eficaz" e "quanti-dade terapeuticamente eficaz", quando usados com referência a uma com-posição de veículo ou farmacêutica compreendendo um ou mais anticorposhumanos anti-B7RP1 humano, refere-sem a uma quantidade ou dosagemsuficiente para produzir um resultado desejado (isto é, quando para terapiacom o veículo anticorpos humanos anti-B7RP1 humano da presente inven-ção, o resultado desejado é a modulação desejada de respostas de célulasT, por exemplo) ou para sustentar uma diminuição observável no nível deuma ou mais atividades biológicas de B7RP1. Mais especificamente, umaquantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade do(s) anticorpo(s)humano(s) anti-B7RP1 humano suficiente para inibir, durante algum períodode tempo, um ou mais dos processos patológicos clinicamente definidos as-sociados à condição em questão, por exemplo, distúrbios e doenças imunes,em um sujeito tratado in vivo com o agente. Na presente invenção, uma"quantidade eficaz" de um anticorpo anti-B7RP1 pode modular as respostasde células T em um paciente. Nos métodos da presente invenção, o termo"controlar" e suas variantes gramaticais são usados para se referirem à pre-venção, inibição parcial ou completa, redução, retardo ou alentecimento deum evento indesejável, por exemplo, uma resposta imune. A quantidade efi-caz pode variar dependendo do veículo ou anticorpo(s) humano(s) anti-B7RP1 humano selecionado(s) e também é dependente de vários fatores econdições relacionadas ao sujeito a ser tratado e à gravidade do distúrbio.

Por exemplo, se o veículo ou anticorpo(s) humano(s) anti-B7RP1 humanotiver de ser administrado in vivo fatores como a idade, peso e saúde do pa-ciente, assim como curvas de resposta a dose e dados de toxicidade obtidosem trabalho pré-clínico com animais estariam entre aqueles considerados.Se o agente tiver de ser contatado com as células in vitro, também se proje-tariam vários estudos pré-clínicos in vitro para avaliar parâmetros como cap-tação, meia-vida, dose, toxicidade e outros. A determinação de uma quanti-dade eficaz ou quantidade terapeuticamente eficaz para um dado agenteestá dentro da capacidade daqueles versados na técnica.

Conforme aqui usados, os termos "proteína-1 relacionada a B7"e "B7RP1" são definidos como todas as espécies de mamíferos da seqüên-cia nativa B7RP1, que é descrita na Publicação de Pedido de Patente Inter-nacional n- WO 00/46240, que é aqui incorporada por referência.

Conforme aqui usado, "substancialmente puro" ou "substancial-mente purificado" significa um composto ou espécie que seja a espécie pre-dominante presente (isto é, em bases molares, é mais abundante que qual-quer outra espécie individual na composição). Em certas modalidades, umafração substancialmente purificada é uma composição em que a espéciecompreenda pelo menos cerca de 50 por cento (em bases molares) de todasas espécies macromoleculares presentes. Em certas modalidades, umacomposição substancialmente pura compreenderá mais de cerca de 80%,85%, 90%, 95% ou 99% de todas as espécies macromoleculares presentesna composição. Em certas modalidades, a espécie é purificada até ficar es-sencialmente homogênea (espécies contaminantes não podem ser detecta-das na composição por métodos de detecção convencionais), em que acomposição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular.

O termo "paciente" inclui sujeitos humanos e animais.

"Tratamento" ou "tratar" refere-se tanto a tratamento terapêutico,quanto profilático ou medidas preventivas. Aqueles necessitados de trata-mento incluem aqueles já como distúrbio, assim como aqueles propensos ater o distúrbio ou aqueles em que o distúrbio deva ser prevenido.

A menos que requerido de outra forma pelo contexto, termossingulares devem incluir plurais, e termos plurais devem incluir o singular.

De acordo com certas modalidades da invenção, anticorpos di-recionados a B7RP1 podem ser usados para tratar distúrbios do sistemaimune e doenças do sistema imune, incluindo, mas não limitados a, aquelesacima mencionados.

Em um aspecto da invenção, apresentam-se anticorpos mono-clonais completamente humanos gerados contra e com especificidade bioló-gica e imunológica para ligação a B7RP1. Em outro aspecto, a invenção a-presenta ácidos nucléicos compreendendo seqüências de nucleotídeos quecodificam seqüências de aminoácidos para moléculas de imunoglobulina decadeia pesada e leve, particularmente seqüências correspondendo a suasregiões variáveis. Modalidades particulares desse aspecto da invenção sãoseqüências correspondendo a regiões determinantes de complementaridade(CDRs), especificamente de CDR1 a CDR3, das cadeias pesadas e levesapresentadas pela invenção. Em ainda outro aspecto, a invenção apresentacélulas de hibridoma e linhagens celulares que expressam as moléculas deimunoglobulina e anticorpos, como anticorpos monoclonais da invenção. Ainvenção também apresenta preparações biológica e imunologicamente puri-ficadas de anticorpos, como anticorpos monoclonais gerados contra e comespecificidade biológica e imunológica para ligação a B7RP1 humano.

A capacidade de clonar e reconstruir Ioci humanos com tamanhode megabases em cromossomos artificiais de levedura (YACs) e de introdu-zi-los na linhagem germinativa de camundongo proporciona uma abordagemvantajosa para elucidar os componentes funcionais de Ioci muito grandes ougrosseiramente mapeados, assim como gerar modelos úteis de doença hu-mana. Além disso, a utilização dessa tecnologia para substituição de Ioci decamundongo por seus equivalentes humanos fornece insights únicos na ex-pressão e regulação de produtos de genes humanos durante o desenvolvi-mento, sua comunicação com outros sistemas e seu envolvimento na indu-ção e progressão de doenças.

Uma importante aplicação prática dessa estratégia é a "humani-zação" do sistema imune humoral de camundongo. A introdução de Ioci deimunoglobulina (Ig) humana em camundongos, em que os genes de Ig en-dógenos tenham sido inativados, oferece a oportunidade de estudar meca-nismos subjacentes à expressão e montagem programadas de anticorpos,assim como seu papel no desenvolvimento de células B. Além disso, essaestratégia proporciona uma fonte para a produção de anticorpos monoclo-nais completamente humanos (MAbs).

O termo "anticorpo humano" inclui anticorpos com regiões variá-veis e constantes substancialmente correspondentes a seqüências de imu-noglobulina de linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, anti-corpos humanos são produzidos em mamíferos não humanos, incluindo,mas não limitados a, roedores, como camundongos e ratos, e lagomorfos,como coelhos. Em certas modalidades, os anticorpos humanos são produzi-dos em células de hibridoma. Em certas modalidades, os anticorpos huma-nos são produzidos de maneira recombinante.

O termo "recombinante" com referência a um anticorpo incluianticorpos que sejam preparados, expressados, criados ou isolados pormeios recombinantes. Exemplos representativos incluem anticorpos expres-sados usando-se um vetor de expressão recombinante transfectado em umacélula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória deanticorpos humanos recombinantes, anticorpos isolados de um animal (porexemplo, um camundongo) que seja transgênico para genes de imunoglobu-Iinas humanas (vide, por exemplo, Taylor et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295); ou anticorpos preparados, expressados, criados ou isolados porqualquer meio que envolva a junção de seqüências de genes de imunoglo-bulinas humanas a outras seqüências de DNA. Esses anticorpos humanosrecombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de seqüênciasde imunoglobulinas de linhagem germinativa humanas.

Anticorpos humanos têm pelo menos três vantagens com rela-ção a anticorpos não humanos e quiméricos para uso em terapia humana:

1) porque a parte efetora do anticorpo é humana, pode interagirmelhor com outras partes do sistema imune humano (por exemplo, destruircélulas alvo mais eficientemente por citotoxicidade dependente de comple-mento (CDC) ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC));

2) o sistema imune humano não deve reconhecer o anticorpohumano como estranho, e, conseqüentemente, a resposta de anticorpo con-tra esse anticorpo injetado deve ser menor do que contra um anticorpo nãohumano totalmente estranho ou um anticorpo quimérico parcialmente estranho;

3) relatou-se que anticorpos não humanos injetados têm umameia-vida na circulação humana muito mais curta do que a meia-vida de an-ticorpos humanos. Anticorpos humanos injetados terão uma meia-vida es-sencialmente idêntica à de anticorpos humanos de ocorrência natural, permi-tindo que sejam dadas doses menores e menos freqüentes.

Assim, espera-se que anticorpos completamente humanos mi-nimizem as respostas imunogênicas e alérgicas intrínsecas a MAbs de ca-mundongos ou derivados de camundongos, e, dessa forma, aumentem aeficácia e segurança dos anticorpos administrados. Anticorpos completa-mente humanos da invenção, portanto, podem ser usados no tratamento dedoenças e distúrbios associados à resposta imune inapropriada, seu trata-mento requerendo administração repetida de anticorpos. Assim, uma vanta-gem particular dos anticorpos anti-B7RP1 da invenção é que os anticorpossão completamente humanos e podem ser administrados a pacientes demaneira não aguda, minimizando, ao mesmo tempo, reações adversas co-rri umente associadas a anticorpos anticamundongo humanos ou outros anti-corpos não completamente humanos anteriormente descritos de espéciesnão humanas.

Aqueles versados na técnica podem manipular cepas de ca-mundongos deficientes na produção de anticorpos de camundongos comgrandes fragmentos dos Ioci de Ig humana, de modo que esses camundon-gos produzam anticorpos humanos na ausência de anticorpos de camun-dongo. Grandes fragmentos de Ig humana podem preservar a grande diver-sidade de gene variável, assim como a regulação apropriada da produção eexpressão do anticorpo. Mediante exploração da maquinaria celular do ca-mundongo para diversificação e seleção de anticorpos e a falta de tolerânciaimunológica a proteínas humanas, o repertório de anticorpos humanos re-produzidos nessas cepas de camundongos fornece anticorpos de alta afini-dade contra qualquer antígeno de interesse, incluindo antígenos humanos.

Usando-se tecnologia de hibridoma, MAbs humanos específicos para antí-genos com a especificidade desejada podem ser produzidos e selecionados.

Animais transgênicos (por exemplo, camundongos) também po-dem ser usados para produzir anticorpos humanos na ausência de produçãode imunoglobulina endógena. Por exemplo, a transferência do arranjo degene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana nesses camun-dongos mutantes de linhagem germinativa resultará na produção de anticor-pos humanos com um desafio antigênico (vide, por exemplo, Jakobovits etal., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 2551-2555; Jakobovits et al., 1993,Nature 362: 255-258; Bruggemann et al., 1993, Year in Immun. 7: 33, 1994,Nature 148: 1547-1553) e, 1996, Nature Biotechnology 14: 826; Gross et al.,2000, Nature 404: 995-999; e patentes norte-americanas ns 5.877.397,5.874.299, 5.814.318, 5.789.650, 5.770.429, 5.661.016, 5.633.425,5.625.126, 5.569.825 e 5.545.806 (todos aqui incorporados por referênciaem sua inteireza para. todas as finalidades)). Anticorpos humanos tambémpodem ser produzidos em bibliotecas de descrição de fago (Hoogenboom eWinter, 1992, J. Mol. Biol. 227: 381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222:581). As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. também são disponíveis pa-ra a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., 1985,MONOCLONAL ANTIBODIES AND CÂNCER THERAPY, Alan R. Liss, p.77; e Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147: 86-95).

Anticorpos humanos recombinantes também podem ser subme-tidos à mutagênese in vitro (ou, quando se usa um animal transgênico paraseqüências de Ig humana, mutagênese •somática in vivo) e, portanto, as se-qüências de aminoácidos das regiões Vh e Vl dos anticorpos recombinantessão seqüências que, embora derivadas daquelas relacionadas a seqüênciasde Vh e Vl de linhagem germinativa humana, podem não existir naturalmentedentro do repertório de linhagem germinativa de anticorpos humanos in vivo.

Em certas modalidades, aqueles versados na técnica podemusar regiões constantes de espécies diferentes da humana, juntamente coma(s) região(ões) varíável(eis) humana(s) nesses camundongos para produziranticorpos quiméricos.

Um anticorpo biespecífico ou bifuncional é tipicamente um anti-corpo híbrido artificial com dois pares de cadeia pesada/cadeia leve diferen-tes e dois sítios de ligação diferentes. Anticorpos biespecíficos podem serproduzidos por vários métodos, incluindo, mas não limitados a, fusão de hi-bridomas ou ligação de fragmentos F(ab'). Vide, por exemplo, Songsivilai eLachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321; Kostelny et al., 1992, J.lmmunol. 148: 1547-1553.

A invenção apresenta anticorpos que se ligam a B7RP1 huma-no. Esses anticorpos podem ser produzidos por imunização com B7RP1 decomprimento total ou seus fragmentos. Os anticorpos da invenção podemser policlonais ou monoclonais e/ou podem ser anticorpos recombinantes.

Em modalidades preferidas, os anticorpos da invenção são anticorpos hu-manos preparados, por exemplo, por imunização de animais transgênicoscapazes de produzir anticorpos humanos (vide, por exemplo, Pedido de Pa-tente Internacional, Publicação ne WO 93/12227).

As regiões determinantes de complementaridade (CDRs) dasregiões variáveis de cadeia leve e cadeia pesada de anticorpos anti-B7RP1da invenção podem ser enxertadas em regiões de armação (FRs) da mesmaespécie ou de outras. Em certas modalidades, as CDRs das regiões variá-veis de cadeia leve e cadeia pesada do anticorpo anti-B7RP1 podem serenxertadas em FRs humanas de consenso. Para criar FRs humanas de con-senso, FRs de várias seqüências de aminoácidos de cadeia pesada ou ca-deia leve humana são alinhadas para identificar uma seqüência de aminoá-cidos de consensor. As FRs da cadeia pesada ou cadeia leve do anticorpoanti-B7RP1 podem ser substituídas por FRs de uma cadeia pesada ou ca-deia leve diferente. Aminoácidos raros nas FRs das cadeias pesada e levedo anticorpor anti-B7RP1 tipicamente não são substituídos, ao passo que orestante dos aminoácidos da FR podem ser substituídos. Aminoácidos rarossão aminoácidos específicos que estão em posições em que normalmentenão são encontrados em FRs. As regiões variáveis enxertadas de anticorposanti-B7RP1 da invenção podem ser usadas com uma região constante queseja diferente da região constante do anticorpo anti-B7RP1. Alternativamen-te, as regiões variáveis enxertadas são parte de um anticorpo Fv de cadeiaúnica. A enxertia de CDR é descrita, por exemplo, nas patentes norte-americanas n9 6.180.370, 5.693.762, 5.693.761, 5.585.089 e 5.530.101, quesão aqui incorporadas por referência para qualquer finalidade.

Anticorpos da invenção podem ser preparados usando-se ca-mundongos transgênicos que tenham uma parte substancial do lócus produ-tos de anticorpo humano inserida em células produtoras de anticorpos doscamundongos e que sejam adicionalmente manipulados para serem defici-entes na produção de anticorpos endógenos, murinos. Esses camundongossão capazes de produzir moléculas de imunoglobulinas humanas e anticor-pos e não produzem ou produzem quantidades substancialmente reduzidasde moléculas de imunoglobulinas e anticorpos murídeos. As tecnologias uti-lizadas para se conseguir esse resultados são apresentadas nas patentes,pedidos e referências apresentadas no presente relatório. Em certas modali-dades, aqueles versados na técnica podem empregar métodos como osdescritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional ne WO98/24893, que é aqui incorporada por referência para qualquer finalidade.Vide também Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15: 146-156, que é aquiincorporado por referência para qualquer finalidade.

Os anticorpos monoclonais (mAbs) da invenção podem ser pro-duzidos por várias técnicas, incluindo metodologia de anticorpos monoclo-nais convencional, por exemplo, a técnica padrão de hibridização de célulassomáticas de Kohler e Milstein (1975, Nature 256: 495). Outras técnicas paraa produção de anticorpos monoclonais podem ser empregadas, por exem-plo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.

Um sistema animal exemplificativo para a preparação de hibri-domas é o camundongo. A produção de hibridoma no camundongo é conhe-cida na técnica, e protocolos de imunização e técnicas para isolamento deesplenócitos imunizados para fusão também são conhecidas na técnica.Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e procedimen-tos de fusão também são conhecidos.

Em uma certa modalidade, anticorpos monoclonais humanosdirigidos contra B7RP1 podem ser gerados usando-se camundongos trans-gênicos portadores de partes do sistema imune humano, em vez do sistemado camundongo. Esses camundongos transgênicos, aqui chamados de ca-mundongos "HuMab", contêm um minolócus de gene de imunoglobulina hu-mana que codifica seqüências de imunoglobulina de cadeia pesada (μ e γ) ede cadeia leve κ humanas não rearranjadas, juntamente com mutações-alvoque inativam os Ioci de cadeias μ e κ endógenas (Lonberg et al., 1994, Natu-re 368: 856-859). Portanto, os camundongos exibem expressão reduzida deIgM ou κ de camundongo em resposta à imunização, os transgenes de ca-deia pesada e cadeia leve humanas introduzidos sofrem comutação de clas-se e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgG κ humanosde alta afinidade (Lonberg et al,, supra; Lonberg e Huszar, 1995, lntern. Rev.Immunol. 13: 65-93; Harding e Lonberg, 1995, Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 764:536-546). A preparação de camundongos HuMab é descrita em detalhes emTaylor et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295; Chen et al., 1993, In-ternational Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al., 1994, J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., 1994, Nature 368: 856-859; Lonberg, .1994,Handbook of Exp. Pharmacology 113: 49-101; Taylor et al., 1994, Internatio-nal Immunology 6: 579-591; Lonberg e Huszar, 1995, Intern. Rev. Immunol.13: 65-93; Harding e Lonberg, 1995, Ann. Ν. Y. Acad. Sei. 764: 536-546; Fi-shwild et al., 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851, cujos conteúdos sãoaqui incorporados por referência em sua inteireza. Vide também as patentesnorte-americanas ne 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.789.650,5.877.397, 5.661.016, 5.814.318, 5.874.299 e 5.770.429, todas de Lonberg eKay, assim como a patente norte-americana ng 5.545.807, de Surani et al.;as Publicações de Pedidos de Patentes Internacionais n9 WO 93/1227, pu-blicado em 24 de junho de 1993; WO 92/22646, publicado em 23 de dezem-bro de 1992; e WO 92/03918, publicado em 19 de março de 1992, cujasdescrição são aqui incorporadas por referência em sua inteireza. Alternati-vamente, as cepas de camundongos transgênicos descritas nos Exemplosabaixo podem ser usadas para gerar anticorpos anti-B7RP1 humanos.

A presente invenção apresenta anticorpos monoclonais huma-nos que são específicos para e neutralizam polipeptídios B7RP1 humanosbioativos. Também se apresentam seqüências de aminoácidos de cadeiapesada e leve anticorpos que são altamente específicos para e neutralizampolipeptídios B7RP1 quando se ligam a eles. Essa elevada especificidadepermite que os anticorpos humanos anti-B7RP1 humano e anticorpos mono-clonais humanos com especificidade similar sejam uma imunoterapia eficazpara doenças associadas a B7RP1.

Em um aspecto, a invenção apresenta anticorpos humanos iso-lados que se ligam ao mesmo ou essencialmente ao mesmo epítopo que oanticorpo 16H aqui apresentado.

Em um aspecto, a invenção apresenta anticorpos humanos iso-lados compreendendo pelo menos uma das seqüências de aminoácidosmostradas nas SEQ ID NO: 1 - 40 ou 44 - 58 que se liguem a um epítopode polipeptídio B7RP1 com alta afinidade e tenham a capacidade de anta-gonizar a atividade do polipeptídio B7RP1. Esses anticorpos podem se ligarao mesmo ou essencialmente ao mesmo epítopo que os anticorpos anti-B7RP1 mostrados nos Exemplos aqui.

Em certas modalidades, os anticorpos isolados se ligam ao poli-peptídio B7RP1 com uma constante de dissociação (Kd) de cerca de 10"6 M,10"7 Μ, 10"8 Μ, 10"9 Μ, 10'10 Μ, 10"11 M ou menos e inibem a sobrevivênciainduzida por B7RP1 em um ensaio de neutralização in vitro com uma EC50de cerca de 10"6 Μ, 10"7 Μ, 10"8 Μ, 10"9 M ou menos. Apresentam-se aquiexemplos de anticorpos humanos anti-B7RP1 humano que atendem aoscritérios de ligação e neutralização acima mencionados.

Em certas modalidades, anticorpos humanos anti-B7RP1 huma-no da invenção são aqui chamados de 16H, 16Hg (linhagem germinativá),5D, 2H, 2Hg (linhagem germinativa), 15H, 41H e 43H. O anticorpo 16H com-preende seqüências polipeptídicas de Vl e Vh conforme mostradas na SEQID NO: 7 e SEQ ID NO: 1, respectivamente. O anticorpo 16Hg compreendeseqüências polipeptídicas de cadeia leve variável (Vl) e de cadeia pesadavariável (Vh) conforme mostradas na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 8, respec-tivamente. O anticorpo 5D compreende seqüências polipeptídicas de Vl e Vhconforme mostradas em SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO: 9, respectivamente. Oanticorpo 2H compreende seqüências polipeptídicas de Vl e Vh conformemostradas em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 10, respectivamente. O anticor-po 2Hg compreende seqüências polipeptídicas de Vl e Vh conforme mostra-das em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 11, respectivamente. O anticorpo 15Hcompreende seqüências polipeptídicas de Vl e Vh conforme mostradas emSEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 12, respectivamente. O anticorpo 41H compre-ende seqüências polipeptídicas de Vl e Vh conforme mostradas em SEQ IDNO: 5 e SEQ ID NO: 13, respectivamente. O anticorpo 43H compreende se-qüências polipeptídicas de Vl e Vh conforme mostradas em SEQ ID NO: 6 eSEQ ID NO: 14, respectivamente. As propriedades dos anticorpos humanosanti-B7RP1 humano da presente invenção são especificamente apresenta-das nos Exemplos. É particularmente notável a alta afinidade pelo polipeptí-dio B7RP1 e a alta capacidade de antagonizar a atividade do polipeptídioB7RP1 aqui demonstrada.

A constante de dissociação (K0) de um anticorpo humano anti-B7RP1 humano pode ser determinada por ressonância de plasmon de su-perfície, conforme geralmente descrito nos Exemplos abaixo. Geralmente, aanálise de ressonância de plasmon de superfície mede interações de ligaçãoem tempo real entre o Iigante (polipeptídio B7RP1 recombinante imobilizadoem uma matriz de biossensor) e o analito (anticorpos em solução) por res-sonância de plasmon de superfície (SPR) usando-se o sistema BlAcore®(Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). A análise de plasmon de superfícietambém pode ser efetuada por imobilização do analito (anticorpos em umamatriz de biossensor) e apresentação do Iigante (V recombinante em solu-ção). A constante de dissociação (K0) de um anticorpo humano anti-B7RP1humano também pode ser determinada usando-se metodologia KinExA. Emcertas modalidades da invenção, os anticorpos se ligam a B7RP1 com umaKd de aproximadamente 10"5 Μ, 10"6 Μ, 10"7 Μ, 10"8 Μ, 10'9 Μ, 10"10 Μ, 10"11M ou 10"12 Μ. O termo "Kd", conforme aqui usado, pretende se referir à cons-tante de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular. Parafins da presente invenção, a Kd foi determinada conforme mostrado nos E-xemplos abaixo.

Em certas modalidades, os anticorpos da invenção são do isoti-po IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4. Os anticorpos podem ser do isotipo lgG2 ouIgGI. Em outras modalidades, os anticorpos da invenção podem ser do iso-tipo IgM, IgA, IgE ou IgD. Em certas modalidades da invenção, os anticorposcompreendem uma cadeia leve kappa humana e uma cadeia pesada deIgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4 humana. A expressão de anticorpos da invençãocompreendendo uma região constante de cadeia pesada de IgGI ou lgG2 édescrita nos Exemplos abaixo. Em modalidades particulares, as regiões va-riáveis dos anticorpos estão ligadas a uma região constante diferente da re-gião constante para o isotipo IgGI, lgG2, lgG3 ou lgG4. Em certas modali-dades, os anticorpos da invenção foram clonados para expressão em célulasde mamíferos.

Em certas modalidades, modificações conservadoras nas cadei-as pesadas e cadeias leves de anticorpos anti-B7RP1 (e modificações cor-respondentes nos nucleotídeos codificadores) produzirão anticorpos anti-B7RP1 com características funcionais e químicas similares às dos anticor-pos anti-B7RP1 aqui apresentados. Em contraste, modificações substanciaisnas características funcionais e/ou químicas de anticorpos anti-B7RP1 po-dem ser realizadas por seleção de substituições na seqüência de aminoáci-dos das cadeias pesadas e leves que difiram significativamente em seu efei-to sobre a manutenção (a) da estrutura do arcabouço molecular na área dasubstituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou helicoidal,(b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) da maiorparte da cadeia colateral.

Por exemplo, uma "substituição de aminoácido conservadora"pode envolver uma substituição de um resíduo de aminoácido nativo por umresíduo não nativo, de modo que haja pouco ou nenhum efeito sobre a pola-ridade ou carga do resíduo de aminoácido nessa posição. Além disso, qual-quer resíduo nativo o polipeptídio também pode ser substituído por alanina,conforme foi anteriormente descrito para "mutagênese de varredura de ala-nina".

Substituições de aminoácidos (conservadoras ou não conserva-doras) podem ser determinadas por aqueles versados na técnica no momen-to em que se desejam essas substituições. Em certas modalidades, as subs-tituições de aminoácidos podem ser usadas para identificar aqueles resíduosde aminoácidos de um anticorpo anti-B7RP1 que estejam envolvidas na es-pecificidade e/ou afinidade de ligação do anticorpo por B7RP1 (por exemplo,resíduos que estejam envolvidos na ligação do anticorpo a um epítopo parti-cular), como resíduos de aminoácidos nas regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3das cadeias leves ou pesadas, conforme aqui descrito. Essas substituiçõesde aminoácidos podem aumentar ou diminuir a afinidade dos anticorpos anti-B7RP1 aqui descritos.

Pequenas alterações em uma seqüência de aminoácidos, comodeleção, adição ou substituição de um, ou de poucos ou mesmo de váriosaminoácidos pode levar a uma forma alélica da proteína original que tenhampropriedades substancialmente idênticas. Conseqüentemente, além dos an-ticorpos especificamente descritos aqui, outros anticorpos "substancialmentehomólogos" podem ser prontamente projetados e fabricados utilizando-sevárias técnicas de DNA recombinante bem-conhecidas por aqueles versadosna técnica. Em geral, modificações dos genes podem ser prontamente reali-zadas por várias técnicas bem-conhecidas, como mutagênese direcionada asítio. Conseqüentemente, a presente invenção considera anticorpos huma-nos an.ti-B7R.P1 "variantes" ou "mutantes" com características substancial-mente similares aos anticorpos humanos anti-B7RP1 aqui apresentados (vi-de, por exemplo, WO 00/56772, que é aqui incorporado por referência). As-sim, o termo "variante" ou "mutante" com referência a um anticorpo humanoanti-B7RP1 significa qualquer molécula de ligação (molécula X) (i) em queas regiões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia pesada ou as re-giões hipervariáveis CDR1, CDR2 e CDR3 da cadeia leve tomadas como umtodo são pelo menos cerca de 80% homólogas, pelo menos cerca de 90%homólogas ou pelo menos cerca de 95% homólogas às regiões hipervariá-veis mostradas nas SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 26 ou SEQ ID NO: 27 aSEQ ID NO: 40, respectivamente, e (ii) em que a variante ou mutante é ca-paz de inibir a atividade de B7RP1 humano na mesma medida que um anti-corpo humano anti-B7RP1 de referência com regiões de arcabouço idênticasàs da molécula X. Esses anticorpos podem ser ligar a B7RP1 humano ou aB7RP1 de camundongo ou a ambos. A seqüência de B7RP1 de camundon-go é descrita no WO 00/46240, que é incorporado por referência.

Ordinariamente, uma variante de anticorpo humano anti-B7RP1terá CDRs de cadeia leve e/ou pesada, quando tomadas como um todo, quetenham pelo menos cerca de 80% de identidade de seqüência de aminoáci-dos, pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüência, pelo menos cer-ca de 90% de identidade de seqüência, pelo menos cerca de 91 % de identi-dadè de seqüência, pelo menos cerca de 92% de identidade de seqüência,pelo menos cerca de 93% de identidade de seqüência, pelo menos cerca de94% de identidade de seqüência, pelo menos cerca de 95% de identidadede seqüência, pelo menos cerca de 96% de identidade de seqüência, pelomenos cerca de 97% de identidade de seqüência, pelo menos cerca de 98%de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 99% de identidade deseqüência de aminoácidos com a seqüência de aminoácidos conforme mos-trada nas SEQ ID NO: 15 a SEQ ID NO: 26 e/ou SEQ ID NO: 27 a SEQ IDNO: 40, respectivamente. Esses anticorpos podem se ligar a B7RP1 humanoou a B7RP1 de camundongo ou a ambos.

Uma variante de anticorpo humano anti-B7RP1 terá uma regiãovariável de cadeia leve, quando tomada como um todo, que tenha pelo me-nos cerca de 80% de identidade de seqüência de aminoácidos, pelo menoscerca de 81% de identidade de seqüência, pelo menos cerca de 82% de i-dentidade de seqüência, pelo menos cerca de 83% de identidade de se-qüência, pelo menos cerca de 84% de identidade de seqüência, pelo menoscerca dé 85% de identidade de seqüência, pelo menos cerca de 86% de i-dentidade de seqüência, pelo menos cerca de 87% de identidade de se-qüência, pelo menos cerca de 88% de identidade de seqüência, pelo menoscerca de 89% de identidade de seqüência, pelo menos cerca de 90% de i-dentidade de seqüência, pelo menos cerca de 91% de identidade de se-qüência, pelo menos cerca de 92% de identidade de seqüência, pelo menoscerca de 93% de identidade de seqüência, pelo menos cerca de 94% de i-dentidade de seqüência, pelo menos cerca de 95% de identidade de se-qüência, pelo menos cerca de 96% de identidade de seqüência, pelo menoscerca de 97% de identidade de seqüência, pelo menos cerca de 98% de i-dentidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de se-qüência de aminoácidos com a seqüência de aminoácidos conforme mostra-da nas SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 6, e/ou uma região variável de cadeiapesada, quando tomada como um todo, que tenha pelo menos cerca de 70%de identidade de seqüência de aminoácidos, pelo menos cerca de 75% deidentidade de seqüência, pelo menos cerca de 80% de identidade de se-qüência, pelo menos cerca de 81% de identidade de seqüência, pelo menoscerca de 82% de identidade de seqüência, pelo menos cerca de 83% de i-dentidade de seqüência, pelo menos cerca de 84% de identidade de se-qüência, pelo menos cerca de 85% de identidade de seqüência, pelo menoscerca de 86% de identidade de seqüência, pelo menos cerca de 87% de i-dentidade de seqüência, pelo menos cerca de 88% de identidade de se-qüência, pelo menos cerca de 89% de identidade de seqüência, pelo menoscerca de 90% de identidade de seqüência, pelo menos cerca de 91% de i-dentidade de seqüência, pelo menos cerca de 92% de identidade de se-qüência, pelo menos cerca de 93% de identidade de seqüência, pelo menoscerca de 94% de identidade de seqüência, pelo menos cerca de 95% de i-dentidade de seqüência, pelo menos cerca de 96% de identidade de se-qüência, pelo menos cerca de 97% de identidade de seqüência, pelo menoscerca de 98% de identidade de seqüência, ou pelo menos cerca de 99% deidentidade de seqüência de aminoácidos com a seqüência de aminoácidosconforme mostrada nas SEQ ID NO: 7 a SEQ ID NO: 14. Esses anticorpospodem se ligar a B7RP1 humano e/ou a B7RP1 de camundongo.

Conforme será percebido por aqueles versados na técnica, mui-tos dos resíduos de contato com CDR em potencial são passíveis de substi-tuição por outros aminoácidos e ainda permitem que o anticorpo retenhauma afinidade substancial pelo antígeno. Da mesma forma, muitos dos resí-duos de arcabouço não em contato com as CDRs nas cadeias pesadas eleves podem acomodar substituições de aminoácidos das posições corres-pondentes de outros anticorpos humanos, sem perda significativa de afini-dade ou não imunogenicidade do anticorpo humano. A seleção de váriosaminoácidos alternativos pode ser usada para produzir versões dos anticor-pos anti-B7RP1 apresentado e seus fragmentos que tenham combinaçõesvariáveis de afinidade, especificidade, não imunogenicidade, facilidade defabricação e outras propriedades desejáveis.

Uma "variante" com referência a um polinucleotídeo pretende sereferir a uma molécula de ácido nucléico com pelo menos 75% de identidadede seqüência de ácido nucléico com uma seqüência polinucleotídica da pre-sente invenção. Ordinariamente, uma variante de polinucleotídeo terá pelomenos cerca de 75%. de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 80% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 81% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 82% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 83% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 84% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 85% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 86% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 87% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 88% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 89% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 90% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 91% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 92% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 93% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 94% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 95% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 96% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 97% de ident dade de seqüência de ácido nucléico, pelomenos cerca de 98% de identidade de seqüência de ácido nucléico, ou pelomenos cerca de 99% de identidade de seqüência de ácido nucléico comuma nova seqüência de ácido nucléico aqui apresentada.

Em modalidades alternativas, anticorpos da invenção podem serexpressados em linhagens celulares diferentes das linhagens celulares dehibridoma. Nessas modalidades, seqüências que codifiquem anticorpos par-ticulares podem ser usadas para transformação de uma célula hospedeirade mamífero adequada. De acordo com essas modalidades, a transforma-ção pode ser conseguida usando-se qualquer método conhecido para a in-trodução de polinucleotídeos em uma célula hospedeira, incluindo, por e-xemplo, acondicionamento do polinucleotídeo em um vírus (ou em um vetorviral) e transdução de uma célula hospedeira com o vírus (ou vetor) ou porprocedimentos de transfecção conhecidos na técnica, conforme exemplifica-do pelas patentes norte-americanas n9 4.399.216, 4.912.040, 4.740.461 e4.959.455 (todas aqui incorporadas por referência para qualquer finalidade).Geralmente, o procedimento de transformação usado pode depender dohospedeiro a ser transformado. Métodos para introduzir polinucleotídeos he-terólogos em células de mamíferos são bem-conhecidos na técnica e inclu-em, mas não se limitam a, transfecção mediada por dextrano, precipitaçãode fosfato de cálcio, transfecção mediada por polibreno, fusão de protoplas-tos, eletroporação, encapsulação do(s) polinucleotídeo(s) em Iipossomos emicroinjeção direta do DNA em núcleos.

Uma molécula de ácido nucléico que codifique a seqüência deaminoácidos de uma região constante de cadeia pesada, uma região variá-vel de cadeia pesada, uma região constante de cadeia leve ou uma regiãovariável de cadeia leve de um anticorpo anti-B7RP1 da invenção é inseridaem um vetor de expressão apropriado usando-se técnicas de ligação padro-nizadas. Em uma modalidade, a região constante de cadeia pesada ou decadeia leve do anticorpo anti-B7RP1 é anexada à terminação C da regiãovariável apropriada e é ligada em um vetor de expressão. O vetor é tipica-mente selecionado para ser funcional na célula hospedeira particular empre-gada (isto é, o vetor é compatível com a maquinaria da célula hospedeira, demodo que a amplificação do gene e/ou a expressão do gene possam ocor-rer). Para uma revisão dos vetores de expressão, vide METHODS INENZYMOLOGY 185 (Goeddel, ed.), 1990, Academic Press.

Tipicamente, os vetores de expressão usados em qualquer umadas células hospedeiras conterá seqüências para manutenção de plasmídioe para clonagem e expressão de seqüências de nucleotídeos exógenas. Es-sas seqüências coletivamente chamadas de "seqüências de flanço", em cer-tas modalidades, tipicamente incluirão uma ou mais das seguintes seqüên-cias de nucleotídeos: um promotor, uma ou mais seqüências intensificado-ras, uma origem de replicação, uma seqüência de término de transcrição,uma seqüência de íntron completa contendo um sítio de junção doador e umreceptor, uma seqüência que codifique uma seqüência líder para secreçãode polipeptídio, um sítio de ligação a ribossomo, uma seqüência de poliade-nilação, uma região de polielo para inserção do ácido nucléico que codifica opolipeptídio a ser expressado e um elemento marcador selecionável. Cadauma dessas seqüências é discutida abaixo.

Opcionalmente, o vetor pode conter uma seqüência codificadorade "etiqueta", isto é, uma molécula oligonucleotídica localizada na extremi-dade 5' ou 3' da seqüência codificadora do polipeptídio do anticorpo anti-B7RP1; a seqüência oligonucleotídica codifica poliHis (como hexaHis) ououtra "etiqueta", como FLAG, HA (vírus da hemaglutinina influenza), ou myc,para a qual existam anticorpos comercialmente disponíveis. Essa etiqueta étipicamente fusionada ao polipeptídio pela expressão do polipeptídio e podeservir de meio de purificação por afinidade ou detecção do anticorpo anti-B7RP1 da célula hospedeira. A purificação por afinidade pode ser realizada,por exemplo, por cromatografia em coluna usando-se anticorpos contra aetiqueta como uma matriz de afinidade. Opcionalmente, a etiqueta pode sersubseqüentemente removida do polipeptídio do anticorpo anti-B7RP1 porvários meios, como usando certas peptidases para clivagem.

Seqüências de flanco podem ser homólogas (isto é, da mesmaespécie e/ou cepa como célula hospedeira), heterólogas (isto é, de uma es-pécie diferente da espécie ou cepa da célula hospedeira), híbridas (isto é,uma combinação de seqüências de flanco de mais de uma fonte), sintéticasou nativas. Assim, a fonte de uma seqüência de flanco pode ser qualquerorganismo procariótico ou eucariótico, qualquer organismo vertebrado ouinvertebrado, ou qualquer planta, contanto que a seqüência de flanco sejafuncional na e possa ser ativada pela maquinaria da célula hospedeira.

Seqüências de flanco utilizáveis nos vetores desta invenção po-dem ser obtidas por qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica.Tipicamente, seqüências de flanco aqui utilizáveis terão sido previamenteidentificadas por mapeamento e/ou por digestão com endonuclease de res-trição e podem ser, portanto, isoladas da fonte de tecido apropriada usando-se as endonucleases de restrição apropriadas. Em alguns casos, a seqüên-cia de nucleotídeos completa de uma seqüência de flanco pode ser conheci-da. Aqui, a seqüência de flanco pode ser sintetizada usando-se os métodosaqui descritos para síntese ou clonagem de ácidos nucléicos.

Se toda ou apenas uma parte da seqüência de flanco for conhe-cida, pode ser obtida usando-se reação em cadeia de polimerase (PCR)e/ou por triagem de uma biblioteca genômica com uma sonda adequada,como um oligonucleotídeo e/ou fragmento de seqüência de flanco da mesmaespécie ou de outra. Se a seqüência de flanco não for conhecida, um frag-mento de DNA contendo uma seqüência de flanco pode ser isolado de umpedaço maior do DNA que pode conter, por exemplo, uma seqüência codifi-cadora ou mesmo outro gene ou genes. O isolamento pode ser realizado pordigestão com endonuclease de restrição para produzir o fragmento de DNAapropriado, seguido por isolamento usando-se purificação em gel de agaro-se, cromatografia em coluna Qiagen® (Chatsworth, CA) ou outros métodosconhecidos por aqueles versados na técnica. A seleção de enzimas adequa-das para atingir essa finalidade será prontamente aparente para aquelesversados na técnica.

Uma origem de replicação é tipicamente uma parte daquelesvetores de expressão procarióticos comprados comercialmente, e a origemajuda na amplificação do vetor em uma célula hospedeira. Se o vetor de es-colha não contiver um sítio de origem de replicação, pode ser sintetizadoquimicamente com base em uma seqüência conhecida e ligado no vetor. Porexemplo, a origem de replicação do plasmídio pBR322 (New England Bio-labs, Beverly, MA) é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas,e várias origens virais (por exemplo, SV40, polioma, adenovírus, vírus daestomatite vesicular (VSV) ou papilomavírus, como HPB ou BPV) são utilizá-veis para vetores de clonagem em células de mamíferos. Geralmente, ocomponente de origem de replicação não é necessário para vetores de ex-pressão em mamíferos (por exemplo, a origem SV40 freqüentemente só éusada porque também contém o promotor precoce do vírus).

Uma seqüência de término de transcrição está tipicamente loca-lizada de 3' à extremidade de uma região codificadora de polipeptídio e ser-ve para terminar a transcrição. Normalmente, uma seqüência de término detranscrição em células procarióticas é um fragmento rico em G-C seguidopor uma seqüência poli-T. Embora a seqüência seja facilmente clonada deuma biblioteca ou mesmo comprada comercialmente como parte de um ve-tor, também pode ser prontamente sintetizada usando-se métodos para sín-tese de ácidos nucléicos, como aqueles aqui descritos.

Um gene marcador selecionável codifica uma proteína necessá-ria para a sobrevivência e o crescimento de uma célula hospedeira cultivadaem um meio de cultura seletiva. Genes marcadores de seleção típicos codi-ficam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas,por exemplo, ampicilina, tetraciclina ou canamicina para células hospedeirasprocarióticas; (b) complementam deficiências auxotróficas da célula; ou (c)suprem nutrientes críticos não disponíveis em meios complexos ou defini-dos. Marcadores selecionáveis exemplificativos são o gene da resistência acanamicina, o gene de resistência a ampicilina e o gene de resistência a te-traciclina. Vantajosamente, um gene de resistência a neomicina também po-de ser usado para seleção tanto em células hospedeiras procarióticas, quan-to eucarióticas.

Outros genes selecionáveis podem ser usados para amplificar ogene que será expresso. A amplificação é o processo pelo qual os genesque são requeridos para a produção de uma proteína crítica para ou cresci-mento ou sobrevivência da célula são reiterados em tandem dentro dos cro-mossomos de gerações sucessivas de células recombinantes. Exemplos demarcadores selecionáveis adequados para células de mamíferos incluem osgenes da diidrofolato redutase (DHFR) e da timidina quinase sem promotor.

Transformantes de células de mamíferos são colocados sob pressão de se-leção na qual apenas os transformantes estejam unicamente adaptados parasobreviver em virtude do gene selecionável presente no vetor. A pressão deseleção é imposta por cultivo das células transformadas sob condições emque a concentração do agente de seleção no meio seja sucessivamente au-mentada, levando, dessa forma, à amplificação tanto do gene selecionável,quanto do DNA que codifica outro gene, como um anticorpo que se ligue aopolipeptídio B7RP1. Como resultado, quantidades aumentadas de um poli-peptídio, como um anticorpo anti-B7RP1, são sintetizadas a partir do DNAamplificado.

Um sítio de ligação a ribossomo normalmente é necessário parainício da tradução de mRNA e se caracteriza por uma seqüência de Shine-Dalgarno (procariotos) ou uma seqüência de Kozak (eucariotos). O elementoestá tipicamente localizado em 3' com relação ao promotor e 5' com relaçãoà seqüência codificadora do polipeptídio a ser expresso.

Em alguns casos, como quando se deseja a glicosilação em umsistema de expressão em célula hospedeira eucariótica, podem-se manipu-lar as várias pré- ou pró-seqüências para melhorar a glicosilação ou o ren-dimento. Por exemplo, pode-se alterar o sítio de clivagem de peptidase deum peptídio de sinal particular ou adicionar pró-seqüências que tambémpossam afetar a glicosilação. O produto de proteína final pode ter, na posi-ção -1 (com relação ao primeiro aminoácido da proteína madura) um oumais aminoácidos adicionais incidentes à expressão, que podem não ter si-do totalmente removidos. Por exemplo, o produto de proteína final pode terum ou dois resíduos de aminoácidos encontrados no sítio de clivagem depeptidase ligados à terminação amino. Alternativamente, o uso de algunssítios de clivagem com enzima pode resultar em uma forma ligeiramentetruncada do polipeptídio desejado, se a enzima cortar nessa área dentro dopolipeptídio maduro.

Vetores de expressão e clonagem da invenção tipicamente con-têm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está ope-racionalmente ligado à molécula que codifica o anticorpo anti-B7RP1. Ospromotores são seqüências não transcritas localizadas a montante (isto é,5') do códon de partida de um gene estrutural (em geral até cerca de 100 a1.000 pb) que controla a transcrição do gene estrutural. Os promotores sãoconvencionalmente agrupados em uma de duas classes: promotores induzi-veis e promotores constitutivos. Promotores induzíveis iniciam níveis aumen-tados de transcrição do DNA sob seu controle em resposta a alguma altera-ção nas condições de cultura, como a presença ou ausência de um nutrienteou uma mudança de temperatura. Promotores constitutivos, por outro lado,transcrevem uniformemente genes aos quais estejam operacionalmente li-gados, isto é, com pouco ou nenhum controle sobre a expressão do gene.

Um grande número de promotores, reconhecidos por várias células hospe-deiras em potencial, são bem-conhecidos. Um promotor adequado está ope-racionalmente ligado ao DNA que codifica a cadeia pesada ou cadeia leveque compõe um anticorpo anti-B7RP1 da invenção por remoção do promotordo DNA de fonte mediante digestão com enzima de restrição e inserção daseqüência promotora desejada no vetor.

Promotores adequados para uso com hospedeiros de leveduratambém são bem-conhecidos na técnica. Intensificadores de levedura sãovantajosamente usados com promotores de levedura. Promotores adequa-dos para uso com células hospedeiras de mamíferos são bem-conhecidos eincluem, mas não se limitam a, aqueles obtidos dos genomas de vírus, comovírus de polioma, vírus da varíola de aves, adenovírus (como Adenovírus 2),vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, retroví-rus, vírus da hepatite B e Vírus Símio 40 (SV40). Outros promotores de ma-míferos adequados incluem promotores de mamíferos heterólogos, por e-xemplo, promotores do choque térmico e o promotor da actina.

Promotores adicionais que podem ser de interesse incluem, masnão se limitam a: promotor precoce de SV40 (Bernoist e Chambon, 1981,Nature 290: 304-10); promotor de CMV (Thomsen et al., 1984, Proc. Natl.Acad. Sei. USA 81: 659-663); o promotor contido na repetição terminal longa3' do vírus de sarcome Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-97); pro-motor da timidina quinase de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad.Sic. USA 78: 1444-45); seqüências promotora e reguladora do gene da me-talotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); e promotores procarióti-cos, como o promotor da beta-lactamase (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc.Natl. Acad. Sci USA, 75: 3727-31); ou o promotor TAC (DeBoer et al., 1983,Proc. Natl. Acad. Sic. USA, 80: 21-25). Também são de interesse as seguin-tes regiões de controle de transcrição de animais, que exibem especificidadede tecido e foram utilizadas em animais transgêncios: a região de controledo gene da elastase I, que é ativa em células acinares pancreáticas (Swift etal., 1984, Cell 38: 639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 50: 399-409 (1986); MacDonaId1 1987, Hepatology 7: 425-515);a região de controle do gene da insulina, que é ativa em células beta pan-creáticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-22); a região de controle do geneda imunoglobulina, que é ativa em células linfóides (Grosschedl et al., 1984,Cell 38: 647-58; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-38; Alexander et al.,1987, Mol. Cell. Biol., 7: 1436-44); a região de controle do vírus mamário decamundongo, que é ativa em células testiculares, de mama, linfóides e mas-tócitos (Leder et al., 1986, Cell 45: 485-95); a região de controle do gene daalbumina, que é ativa no fígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devei. 1:268-76); a região de controle do gene da alfa-feto-proteína, que é ativa nofígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-48; Hammer et al.,1987, Science 235: 53-58); a região de controle do gene da 1-antitripsina,que é ativa no fígado (Kelsey et al., 1987, Genes and Devei. 1: 161-71); aregião de controle do gene da betaglobina, que é ativa em células mielóides(Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-40; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); a região de controle do gene da proteína básica da mielina, que é ativaem células oligodendrocíticas no cérebro (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-12); a região de controle do gene da cadeia leve 2 da miosina, que éativa em músculos esqueléticos (Sani, 1985, Nature 314: 283-86); e a regiãode controle do gene do hormônio Iiberador gonadotrópico, que é ativa nohipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-78).

Uma seqüência intensificadora pode ser inserida no vetor paraaumentar a transcrição de DNA que codifica a cadeia leve ou pesada quecompõe o anticorpo anti-B7RP1 da invenção por eucariotos superiores. Osintensificadores são elementos de ação eis do DNA, normalmente de cercade 10 - 300 pb de comprimento, que agem sobre o promotor para aumentara transcrição. Os intensificadores são relativamente independentes da orien-tação e posição, tendo sido encontrado tanto em posições 5', quanto 3' comrelação à unidade de transcrição. São conhecidas várias seqüências intensi-ficadoras disponíveis de genes de mamíferos (por exemplo, globina, elasta-se, albumina, alfa-feto-proteína e insulina). Tipicamente, entretanto, usa-seum intensificador de um vírus. O intensificador de SV40, o intensificador dopromotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma e intensifi-cadores de adenovírus conhecidos na técnica são elementos intensificado-res exemplificativos para a ativação de promotores eucarióticos. Embora o in-tensificador possa estar posicionado no vetor em 5' ou 3' com relação à se-qüência codificadora, está tipicamente localizado em um sítio a 5' do promotor.

Vetores de expressão da invenção podem ser construídos a par-tir de um vetor de partida, como um vetor comercialmente disponível. Essesvetores podem ou não conter todas as seqüências de flanco desejadas.Quando uma ou mais das seqüências de flanco aqui descritas não estão jápresentes no vetor, elas podem ser individualmente obtidas e ligadas no ve-tor. Métodos usados para obtenção de cada seqüência de flanco são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica.

Depois que o vetor tiver sido construído, e uma molécula de áci-do nucléico que codifica uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou uma ca-deia leve e uma cadeia pesada que compõem um anticorpo anti-B7RP1 tiversido inserida no sítio apropriado do vetor, o vetor completo pode ser inseridoem uma célula hospedeira adequada para amplificação e/ou expressão depolipeptídio. A transformação de um vetor de expressão para um anticorpoanti-B7RP1 em uma célula hospedeira selecionada pode ser realizada pormétodos bem-conhecidos, incluindo transfecção, infecção, co-precipitaçãocom fosfato de cálcio, eletroporação, microinjeção, lipofecção, transfecçãomediada por DEAE-dextrano ou outras técnicas conhecidas. O método sele-cionado será, em parte, função do tipo de célula hospedeira a ser usada.Esses métodos e outros métodos adequados são bem-conhecidos por aque-les versados na técnica e são apresentados, por exemplo, em Sambrook etal., supra.

Uma célula hospedeira, quando cultivada sob condições apro-priadas, sintetiza um anticorpo anti-B7RP1 que pode ser subseqüentementecoletado do meio de cultura (se a célula hospedeira secretá-lo no meio) oudiretamente da célula hospedeira que o produz (se não for secretado). A se-leção de uma célula hospedeira apropriada dependerá de vários fatores,como níveis de expressão desejados, modificações do polipeptídio que se-jam desejáveis ou necessárias para atividade (como glicosilação ou fosfori-lação) e facilidade de dobramento em uma molécula biologicamente ativa.

Linhagens celulares de mamíferos disponíveis como hospedei-ros para expressão são bem-conhecidas na técnica e incluem, mas não selimitam a, linhagens celulares imortalizadas disponíveis na Coleção Ameri-cana de Cultura de Tipo (ATCC), incluindo, mas não limitadas a, células deovário de hamster chinês. (CHO), células HeLa, células de rim de hamsterrecém-nascido (BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcino-ma hepatocelular humano (por exemplo, Hep G2), e inúmeras outras Iinha-gens celulares. Em certas modalidades, as linhagens celulares podem serselecionadas mediante determinação de quais linhagens celulares têm ele-vados níveis de expressão e produzem constitutivamente anticorpos compropriedades de ligação a B7RP1. Em outra modalidade, uma linhagem ce-lular da linhagem de células B que não produz seu próprio anticorpo, masque tem a capacidade de produzir e secretar um anticorpo heterólogo podeser selecionada.

Anticorpos da invenção são utilizáveis para a detecção deB7RP1 em amostras biológicas e identificação de células ou tecidos queproduzam a proteína B7RP1. Anticorpos da invenção que se ligam especifi-camente a B7RP1 podem ser utilizados no tratamento de doenças mediadaspor B7RP1. Os ditos anticorpos podem ser usados em ensaios de ligaçãopara detectar B7RP1 e para inibir B7RP1 de formar um complexo com re-ceptores de B7RP1. Os ditos anticorpos que se ligam a B7RP1 e bloqueiama interação com outros compostos de ligação podem ter uso terapêutico namodulação de doenças mediadas por B7RP1. Em certas modalidades, osanticorpos contra B7RP1 podem bloquear a ligação de B7RP1 a seu recep-tor, o que pode resultar no rompimento da cascata de transdução de sinalinduzida por B7RP1.

A presente invenção também refere-se ao uso de um ou maisanticorpos da presente invenção na fabricação de um medicamento para otratamento de um distúrbio ou condição causada pela expressão aumentadade B7RP1 ou sensibilidade aumentada a B7RP1 em um paciente, comoqualquer um dos distúrbios ou condições aqui apresentados.

Em certas modalidades, a invenção apresenta composições far-macêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de umou de uma pluralidade dos anticorpos da invenção juntamente com um dilu-ente, veículo, solubilizador, emulsificador, conservante e/ou adjuvante far-maceuticamente aceitável. Materiais de formulação aceitáveis são não tóxi-cos para receptores às dosagens e concentrações empregadas. Em modali-dades preferidas, apresentam-se composições farmacêuticas compreenden-do uma quantidade terapeuticamente eficaz de anticorpos anti-B7RP1.

Em certas modalidades, materiais de formulação aceitáveis sãonão tóxicos para receptores às dosagens e concentrações empregadas.

Em certas modalidades, a composição farmacêutica pode contermateriais de formulação para modificar, manter ou preservar, por exemplo, opH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonieidade, odor, esterilidade,estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração dacomposição. Nessas modalidades, materiais de formulação adequados in-cluem, mas não se limitam a, aminoácidos (como glicina, glutamina, aspara-gina, arginina ou lisina); antimicrobianos; antioxidantes (como ácido ascórbi-co, sulfito de sódio ou hidrogeniossulfito de sódio); tampões (como borato,bicarbonato, Tris-HCI, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos); agentesde volume (como manitol ou glicina); agentes quelantes (como ácido etileno-diamina tetraacético (EDTA)); agentes de formação de complexo (como ca-feína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monossacarídeos; dissacarídeos; e outros carboidra-tos (como glicose, manose ou dextrinas); proteínas (como albumina sérica,gelatina ou imunoglobulinas); agentes corantes, de sabor e diluição; agentesemulsificantes; polímeros hidrofílicos (como polivinilpirrolidona); polipeptídiosde baixo peso molecular; contra-íons formadores de sal (como sódio); con-servantes (como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, ti-merosal, álcool fenetílico, metilparaben, propilparaben, clorexidina, ácidosórbico ou peróxido de hidrogênio); solventes (como glicerina, propileno gli-col ou polietileno glicol); álcoois de açúcares (como manitol ou sorbitol); a-gentes de suspensão; tensoativos ou agentes umectantes (como Pluronics,PEG1 ésteres de sorbitano, polissorbatos, como polissorbato 20, polissorbato80, Triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes de aumentoda estabilidade (como sacarose ou sorbitol); agentes de aumento da tonici-dade (como haletos de metais alcalinos, por exemplo, cloreto de sódio oupotássio, manitol sorbitol); veículos de distribuição; diluentes; excipientese/ou adjuvantes farmacêuticos. Vide REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES, 18â Edição (A. R. Gennaro1 ed.), 1990, Mack Publishing Company.

Em certas modalidades, a composição farmacêutica ótima serádeterminada por aqueles versados na técnica dependendo, por exemplo, davia de administração desejada, formato de distribuição e dosagem desejada.Vide, por exemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra.

Em certas modalidades, essas composições podem influenciar o estado físi-co, estabilidade, taxa de liberação in vivo e taxa de depuração in vivo dosanticorpos da invenção.

Em certas modalidades, o .veículo ou carreador primário em umacomposição farmacêutica pode ser de natureza aquosa ou não aquosa. Porexemplo, um veículo ou carreador adequado pode ser água para injeção,solução salina fisiológica ou fluido cérebro-espinhal artificial, possivelmentesuplementado com outros materiais comuns em composições para adminis-tração parenteral. Solução salina tamponada neutra ou solução salina mistu-rada com albumina sérica são veículos exemplificativos adicionais. Em cer-tas modalidades, as composições farmacêuticas da presente invenção com-preendem tampão Tris de pH de cerca de 7,0 - 8,5, ou tampão acetato depH de cerca de 4,0 - 5,5, e também podem incluir sorbitol, sacarose, Tween-20 e/ou um substituto adequados para eles. Em certas modalidades da in-venção, composições de anticorpo anti-B7RP1 podem ser preparadas paraarmazenamento por misturação da composição selecionada, com o graudesejado de pureza, com agentes de formulação opcionais (REMINGTON'SPHARMACEUTICAL SCIENCES, supra), na forma de uma torta Iiofilizada ousolução aquosa. Além disso, em certas modalidades, o produto de anticorpoanti-B7RP1 pode ser formulado como um Iiofilizado usando-se excipientesapropriados, como sacarose.

As composições farmacêuticas da invenção podem ser selecio-nadas para distribuição parenteral. Alternativamente, as composições podemser selecionadas para inalação ou para distribuição através do trato digesti-vo, como por via oral. A preparação dessas composições farmaceuticamenteaceitáveis está dentro dos conhecimentos daqueles versados na técnica.

Os componentes de formulação estão presentes em concentra-ções que sejam aceitáveis para o sítio de administração. Em certas modali-dades, usam-se tampões para manter a composição em pH fisiológico ou pHligeiramente menor, tipicamente dentro de uma faixa de pH de cerca de 5 acerca de 8.

Quando se considera a administração parenteral, as composi-ções terapêuticas para uso nesta invenção podem ser fornecidas na formade uma solução aquosa aceitável para via parenteral e livre de pirógenos,compreendendo o anticorpo anti-B7RP1 desejado em um veículo farmaceu-ticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para injeção pa-renteral é água destilada estéril, em que o anticorpo anti-B7RP1 seja formu-lado como uma solução isotônica estéril, apropriadamente preservada. Emcertas modalidades, a preparação pode envolver a formulação da moléculadesejada com um agente, como microesferas injetáveis, partículas bioerodí-veis, compostos poliméricos (como ácido polilático ou ácido poliglicólico),glóbulos ou lipossomos, que possa proporcionar uma liberação controladaou prolongada do produto, que pode ser distribuído mediante injeção de de-pósito. Em certas modalidades, também se pode usar ácido hialurônico, quetem o efeito de promover uma duração prolongada na circulação. Em certasmodalidades, podem-se usar dispositivos implantáveis de distribuição defármacos para introduzir a molécula de anticorpo desejada.Composições farmacêuticas da invenção podem ser formuladaspara inalação. Em certas modalidades, anticorpos anti-B7RP1 são vantajo-samente formulados como um pó seco inalável. Em certas modalidades, so-luções de inalação de anticorpo anti-B7RP1 também podem ser formuladascom um propelente para distribuição por aerossol. Em certas modalidades,as soluções podem ser nebulizadas. A administração pulmonar e métodosde formulação para ele são adicionalmente descritos nos Pedido de PatenteInternacional ne PCT/US94/001875, que é incorporada por referência e des-creve a distribuição pulmonar de proteínas quimicamente modificadas.

Também se considera que as formulações possam ser adminis-tradas por via oral. Anticorpos anti-B7RP1 que sejam administrados dessamaneira podem ser formulados com ou sem os veículos comumente usadosna combinação de formas de dosagem sólidas, como comprimidos e cápsu-las. Em certas modalidades, pode-se projetar uma cápsula para liberar aparte ativa da formulação no ponto do trato gastrointestinal em que a biodis-ponibilidade seja maximizada, e a degradação pré-sistêmica seja minimiza-da. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorção do anti-corpo anti-B7RP1. Diluentes, sabores, ceras de baixo ponto de fusão, óleosvegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração decomprimidos e aglutinantes também podem ser empregados.

Apresenta-se uma composição farmacêutica da invenção quecompreende uma quantidade eficaz de um ou uma pluralidade de anticorposanti-B7RP1 em mistura com excipientes não tóxicos que sejam adequadospara fabricação de comprimidos. Pela dissolução dos comprimidos em águaestéril, ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas emforma de dose unitária. Excipientes adequados incluem, mas não se limitama, diluentes inertes, como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato desódio, lactose ou fosfato de cálcio; ou agentes de ligação, como amido, gela-tina ou goma-arábica; ou agentes lubrificantes, como estearato de magnésio,ácido esteárico ou talco.

Composições farmacêuticas adicionais serão evidentes para a-queles versados na técnica, incluindo formulações envolvendo anticorposanti-B7RP1 em formulações de distribuição prolongada ou controlada. Téc-nicas para a formulação de vários outros meios de distribuição prolongadaou controlada, como veículos de lipossomos, micropartículas bioerodíveis ouglóbulos porosos e injeções de depósito, também são conhecidas por aque-Ies versados na técnica. Vide, por exemplo, Pedido de Patente Internacionalns PCT/US93/00829, que é incorporado por referência e descreve a libera-ção controlada de micropartículas poliméricas porosas para a distribuição decomposições farmacêuticas. Preparações de liberação prolongada podemincluir matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos modelados,por exemplo, películas ou microcápsulas. Matrizes de liberação prolongadapodem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactidas (conforme descrito na paten-te norte-americana ns 3.773.919 e na Publicação de Pedido de Patente Eu-ropéia ne EP 058481, que são aqui incorporados por referência), copolíme-ros de ácido L-glutâmico e gama etil-L-glutamato (Sidman et al., 1983, Bio-polymers 22: 547-556), poli(metacrilato de 2-hidroxietila) (Lahger et al., 1981,J. Biomed; Mater. Res. 15: 167-277) e Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), acetato de etileno vinila (Langer et al., supra) ou ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico (Publicação de Pedido de Patente Européia ns EP 133.988).

Composições de liberação prolongada também podem incluir lipossomos,que podem ser preparados por qualquer um dos vários métodos conhecidosna técnica. Vide, por exemplo, Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 82: 3688-3692; Publicações de Pedidos de Patentes Européias ne EP036.676, EP 088.046 e EP 143.949, aqui incorporadas por referência.

Composições farmacêuticas usadas para administração in vivosão tipicamente fornecidas como preparações estéreis. A esterilização podeser realizada por filtração através de membranas de filtração estéril. Quandoa composição é liofilizada, a esterilização usando esse método pode serconduzida antes ou depois da liofilização e reconstituição. Composições pa-ra administração parenteral podem ser armazenadas em forma liofilizada ouem solução. Composições parenterais em geral são colocadas em um reci-piente com um orifício de acesso estéril, por exemplo, uma bolsa ou frascode solução intravenosa com uma rolha perfurável por uma agulha de injeçãohipodérmica.

Uma vez que a composição farmacêutica tenha sido formulada,pode ser armazenada em frascos estéreis como uma solução, suspensão,gel, emulsão, sólido ou como um pó desidratado ou liofilizado. Essas formu-lações podem ser armazenadas em forma pronta para o uso ou em uma forma(por exemplo, liofilizada), que seja reconstituída antes da administração.

A invenção também apresenta kits para a produção de uma uni-dade de administração de dose única. Os kits da invenção podem contertanto um primeiro recipiente com uma proteína seca, quanto um segundorecipiente com uma formulação aquosa. Em certas modalidades da inven-ção, apresentam-se kits contendo seringas pré-enchidas dé câmara única oumúltiplas (por exemplo, seringas para líquidos e liosseringas).

A quantidade eficaz de uma composição farmacêutica contendoanticorpo anti-B7RP1 a ser empregada terapeuticamente dependerá, porexemplo, do contexto e objetivos terapêuticos. Aqueles versados na técnicaperceberão que os níveis de dosagem apropriados para tratamento variarãodependendo, em parte, da molécula distribuída, da indicação para a qual oanticorpo anti-B7RP1 está sendo usado, da via de administração e do tama-nho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho do órgão) e/ou condição(idade e saúde geral) do paciente. Em certas modalidades, o clínico podetitular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito tera-pêutico ótimo. A dosagem típica pode variar de cerca de 0,1 pg/kg até cercade 30 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. Em cer-tas modalidades, a dosagem pode variar de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 30mg/kg; de 1 μ g/kg até cerca de 30 mg/kg; ou de 5 μ g/kg até cerca de 30 mg/kg.

A freqüência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacoci-néticos do anticorpo anti-B7RP1 particular na formulação usada. Tipicamen-te, o clínico administra a composição até que se atinja uma dosagem queconsiga o efeito desejado. A composição pode, conseqüentemente, ser ad-ministrada como uma dose única, como duas ou mais doses (que podem ounão conter a mesma quantidade da molécula desejada) durante o tempo, oucomo uma infusão contínua mediante um dispositivo de implante ou cateter.Rotineiramente, aqueles versados na técnica refinam ainda mais a dosagemapropriada, o que está dentro do âmbito de tarefas rotineiramente efetuadaspor eles. Dosagens apropriadas podem ser determinadas mediante uso dedados de dose-resposta. Em certas modalidades, os anticorpos da invençãopodem ser administrados a pacientes durante todo um período de tempoprolongado. A administração crônica de um anticorpo da invenção minimizaa resposta imune adversa ou alérgica comumente associada a anticorposque sejam gerados contra um antígeno humano em um animal não humano,por exemplo, um anticorpo não completamente humano produzido em umaespécie não humana.

A via de administração da composição farmacêutica está de a-cordo com métodos conhecidos, por exemplo, oral, mediante injeção porvias intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracebre-broventricular, intramuscular, intra-ocular, intra-arterial, intraportal ou intrale-sional; por sistemas de liberação prolongada ou por dispositivos de implante.Em certas modalidades, as composições podem ser administradas por inje-ção de bolo ou continuamente por injeção, ou por dispositivo de implante.

A composição também pode ser administrada localmente medi-ante implante de uma membrana, esponja ou outro material apropriado noqual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encapsulada. Em certasmodalidades, quando se usa um dispositivo de implante, o dispositivo podeser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado, e a distribuição damolécula desejada pode ser por difusão, bolo de liberação controlada notempo ou administração contínua.

Também pode ser desejável usar composições farmacêuticas deanticorpo anti-B7RP1 de acordo com a invenção ex vivo. Nesses casos, cé-lulas, tecidos ou órgãos que tenham sido removidos do pacientes são descri-tos a composições farmacêuticas de anticorpo anti-B7RP1, após o que ascélulas, tecidos e/ou órgãos são subseqüentemente implantados de volta nopaciente.

Em particular, anticorpos anti-B7RP1 podem ser distribuídos porimplante de certas células que tenham sido geneticamente manipuladas,usando-se métodos como os aqui descritos, para expressar e secretar o po-lipeptídio. Em certas modalidades, essas células podem ser células animaisou humanas, e podem ser autólogas, heterólogas ou xenogênicas. Em cer-tas modalidades, as células podem ser imortalizadas. Em outras modalida-des, para diminuir as chances de uma resposta imunológica, as células po-dem ser encapsuladas para evitar infiltração de tecidos em volta. Em moda-lidades adicionais, os materiais de encapsulação são tipicamente envoltóriosou membranas poliméricas biocompatíveis e semipermeáveis que permitama liberação do(s) produto(s) de proteína, mas impeçam a destruição das cé-lulas pelo sistema imune do paciente ou por outros fatores prejudiciais dostecidos em volta.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir, incluindo os experimentos conduzidos eresultados conseguidos, são apresentados apenas para fins ilustrativos enão devem ser tomados como Iimitativos da invenção.

Exemplo 1

Produção de Anticorpos Monoclonais Humanos Contra Proteína-1 Relacionada a B7 (B7RP1)

Antígeno

B7RP-1 humano recombinante purificado (hB7RP-1), preparadoconforme descrito na Publicação de Pedido de Patente Internacional ne WO00/46240, que é aqui incorporada por referência, ou células CHO transfecta-das para expressar hB7RP-1 foram usados como antígeno. B7RP-1 humanomaduro tem a seqüência de aminoácidos dos resíduos X a 302 na seqüênciamostrada no WO 00/46240 como SEQ ID NO: 17, em que X pode ser 19, 20,21,22, 24 ou 28.

Camundongos HuMab Transqênicos

Anticorpos monoclonais completamente humanos contra B7RP-1 foram preparados usando-se as cepas HCo7 e HCo12 de camundongostransgênicos HuMab, ambas expressando genes de anticorpo humano. Emambas essas cepas de camundongos, o gene da cadeia leve kapa de ca-mundongo endógeno foi homozigoticamente rompido conforme descrito emChen et al. (1993) EMBO J. 12: 811-820, e o gene da cadeia pesada de ca-mundongo endógeno foi homozigoticamente rompido conforme descrito noExemplo 1 da Publicação PCT WO 01/09187. Cada uma dessas cepas decamundongos é portadora de um transgene de cadeia leve kapa humana,KCo5, conforme descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. A cepa HCo7 é portadora do transgene de cadeia pesada humanaHCo7, conforme descrito nas patentes norte-americanas ns 5.545.806,5.625.825 e 5.545.807. A cepa HCo12 é portadora do transgene de cadeiapesada humana HCo12, conforme descrito no Exemplo 2 da PublicaçãoPCT WO 01/09187.

Imunizações de HuMab

Para gerar anticorpos monoclonais completamente humanoscontra B7RP-1, camundongos HuMab da cepa HCo7 ou HCo12 foram imu-nizados com B7RP-1 recombinante purificado ou células CHO transfectadaspara expressar B7RP-1. Esquemas de imunização gerais para camundon-gos HuMab são descritos em Lonberg et al. (1994) Nature (368(6474): 856-859; Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, e PublicaçãoPCT WO 98/24884. Os camundongos tinham 6 - 16 semanas de idadequando da primeira infusão de antígeno. Uma preparação recombinante pu-rificada de antígeno B7RP-1 (50 pg) ou uma preparação de células CHOtransfectadas (3,5 χ 106 - 1 χ 107 células) foi usada para imunizar os ca-mundongos HuMab por via intraperitoneal.

Os camundongos transgênicos foram imunizados duas vezescom antígeno purificado em adjuvante de Freund completo por via intraperi-toneal, seguido por 2-4 semanas de imunizações IP (até um total de 8 i-munizações) com o antígeno purificado em adjuvante de Freund incompleto.A imunização com células CHO transfectadas para expressar B7RP-1 foi amesma, exceto que o adjuvante de Freund completo e o adjuvante de Fre-und incompleto não foram usados com as células. A resposta imune foi mo-nitorizada por sangramentos retroorbitais. O plasma foi triado por ELISA(conforme descrito abaixo), e os camundongos com títulos suficientes deimunoglobulina humana anti-B7RP-1 foram usados para fusões. Os camun-dongos receberam um reforço por via intravenosa com o antígeno 3 e 2 diasantes do sacrifício e remoção do baço. Tipicamente, foram realizadas 10 -20 fusões para cada antígeno. Um total de 28 camundongos das cepas decamundongos HCo7 e HCo12 foram imunizados com B7RP-1.

Seleção de Camundongos HuMab Produtores de Anticorpos Anti-B7RP-1

Para selecionar camundongos HuMab produtores de anticorposque se ligam a B7RP-1, soros de camundongos imunizados foram testadospor ELISA conforme descrito por Fishwild et al. (1996). Resumidamente, asplacas de microtitulação foram revestidas com B7RP-1 recombinante purifi-cado a 1 - 2 pg/mL em PBS, 50 pL/cavidade foram incubados a 49C duranteuma noite, então, bloqueados com 200 pL/cavidade de soro de galinha a 5%em PBS/Tween (0,05%). Diluições de plasma de camundongos imunizadoscom B7RP-1 foram adicionadas a cada cavidade e incubadas durante 1 - 2horas a temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e,então, incubadas com um anticorpo policlonal Fc de cabra anti-lgG humanaconjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) durante 1 hora a tem-peratura ambiente. Depois da lavagem, as placas foram desenvolvidas comsubstrato ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml_) e analisadas por um espectro-fotômetro a OD 415 - 495. Os camundongos que desenvolveram os títulosmais elevados de anticorpos anti-B7RP-1 foram usados para fusões. As fu-sões foram realizadas conforme descrito abaixo, e os sobrenadantes de hi-bridomas foram testados quanto à atividade anti-B7RP-1 por ELISA.

Geração de Hibridomas Produtores de Anticorpos Monoclonais HumanosContra B7RP-1

Os esplenócitos de camundongo, isolados dos camundongosHuMab, foram fusionados com PEG a uma linhagem celular de mieloma decamundongo com base em protocolos padronizados. Os hibridomas resul-tantes foram, então, triados quanto à produção de anticorpos específicospara o antígeno. Suspensões de células únicas de linfócitos esplênicos decamundongos imunizados foram fusionadas a um quarto do número de célu-las de mieloma de camundongo não secretoras SP2/0 (ATCC, CRL 1581)com 50% de PEG (Sigma). As células foram plaqueadas a aproximadamente1 χ 105/cavidade em placas de microtitulação de fundo plano, seguido poruma incubação de cerca de duas semanas em meio seletivo contendo 10%de soro bovino fetal, 10% de meio condicionado P388D1 (ATCC, CRL TIB-63), 3 - 5% de Origen (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com altaglicose, L-glutamina e piruvato de sódio) mais 5 mM de HEPES, 0,055 mMde 2-mercaptoetanol, 50 mg/mL de gentamicina e 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Após 1 - 2 semanas, as células foram cultivadas em meio no qual oHAT foi substituído por HT. Cavidades individuais foram, então, tríadas porELISA (descrito acima) quanto a anticorpos IgG monoclonais anti-B7RP-1humanos. Uma vez ocorrido um amplo crescimento do hibridoma, o meio foimonitorizado normalmente após 10-14 dias. Os hibridomas secretores deanticorpos foram replaqueados, novamente triados e, caso ainda positivospara IgG humana, os anticorpos monoclonais anti-B7RP-1 foram subclona-dos pelo menos duas vezes por diluição limitativa. Os subclones estáveisforam, então, cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anti-corpo em meio de cultura de tecido para caracterização adicional.

Exemplo 2

Clonagem das Cadeias Pesada e Leve do Anticorpo Anti-B7RP1

O hibridoma que expressa o anticorpo monoclonal de ligação aB7RP1 16H foi usado como uma fonte para isolar RNA total usando reagen-te TRIzol® (Invitrogen). Um oliglonucleotídeo 5' RACE (amplificação rápidade extremidades de cDNA) (5'- CGA CUG GAG CAC GAG GAC ACU GACAUG GAC UGA AGG AGU AGA AA -3'; SEQ ID NO: 69) foi ligado ao RNAusando-se os componentes e o protocolo do kit GeneRacer® (Invitrogen). Aprimeira fita de cDNA foi sintetizada usando-se um primer aleatório com umadaptador de extensão (5'- GGC CGG ATA GGC CTC CAN NNN NNT -3')(SEQ ID NO: 59), e um ensaio preparatório 5' RACE (amplificação rápida deextremidades de cDNA) foi efetuado usando-se o kit GeneRacer® (Invitro-gen) de acordo com as instruções do fabricante. Para a preparação de cDNAcodificador de cadeia leve completo, o primer direto foi o primer aninhado deGeneRacer®, e o primer reverso foi (5'- GGG GTC AGG CTG GAA CTGAGG -3') (SEQ ID NO: 60). Para a preparação de cDNA que codifica a regi-ão variável da cadeia pesada, o primer direto foi o primer aninhado de Ge-neRacer®, e o primer reverso foi (5'- TGA GGA CGC TGA CCA CAC G -3')(SEQ ID NO: 61). Os produtos de RACE foram clonados em pCR4-T0P0(Invitrogen), e as seqüências foram determinadas. As seqüências de con-senso foram usadas para projetar primers para amplificação por PCR de ca-deia de anticorpo de comprimento total.

Para a preparação de cDNA que codifica cadeia leve kapa deanti-B7RP1 16H, o primer de PCR 5' codificava a terminação amino da se-qüência de sinal, um sítio de enzima de restrição Xbal e uma seqüência Ko-zak otimizada (5'- CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAGGGT CCT CGC TCA GCT CCT GGG -3') (SEQ ID NO: 62). O primer 3' codi-ficava a terminação carboxila e o códon de término, assim como um sítio derestrição Sall (5'- CTT GTC GAC TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCTC -3') (SEQ ID NO: 63). O fragmento de produto de PCR resultante foi purifi-cado, digerido com Xbal e Sall e, então, isolado em gel e ligado no vetor deexpressão em mamíferos pDSRa20 (vide o Pedido Internacional, Publicaçãon9 WO 90/14363, que é aqui incorporado por referência para qualquer finali-dade. pDSRa20 foi produzido alterando-se o nucleotídeo 2.563 em pDS-Ra19 de uma "guanosina" para uma "adenosina" por mutagênese direciona-da a sítio).

Para a preparação de cDNA que codifica cadeia pesada de anti-B7RP1 16H, o primer de PCR 5' codificava a terminação amino da seqüên-cia de sinal, um sítio de enzima de restrição Xbal e uma seqüência Kozakotimizada (5'- ACA ACA AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA GTT GGGGCT GAA CTG G -3') (SEQ ID NO: 64). O primer 3' codificava a extremida-de carboxila da região variável, incluindo um sítio BsmBI de fita em sentidode ocorrência natural (5'- GTG GAG GCA CTA GAG ACG GTG ACC AGGATT CC -3') (SEQ ID NO: 65). O produto resultante foi purificado, digeridocom Xbal e BsmBI, isolado em gel e ligado no vetor pDSRa20 contendo aregião constante de IgGI humana e também no vetor pDSRa20 contendo aregião constante de lgG2 humana. Todas as regiões variáveis de cadeia pe-sada de anti-B7RP1 derivadas de hibridoma, a despeito da região constantenativa associada, foram clonadas conforme descrito acima em ambos osvetores pDSRa20 contendo as regiões constantes de IgGI humana e lgG2humana.

Exemplo 3

Expressão de Anticorpos Anti-B7RP1 em Células de Ovário de HamsterChinês (CHO)

A expressão estável do mAb anti-B7RP1 16H foi conseguida porco-transfecção de plasmídios cadeia pesada de 16H/pDSRa19 lgG2 B7RP1-kapa/pDSRa19 em células de ovário de hamster chinês (CHO) deficientesem diidrofolato redutase (DHFR") livres de soro e adaptadas, usando-se ummétodo de fosfato de cálcio (a seqüência de cadeia pesada de 16H de com-primento total é mostrada na SEQ ID NO: 44; a seqüência da cadeia kapa de16H é mostrada na SEQ ID NO: 45). As células transfectadas foram selecio-nadas em meio contendo soro dialisado, mas não contendo hipoxantina-timidina, para assegurar o crescimento de células que expressem a enzimaDHFR. Os clones transfectados foram triados usando-se ensaios como ELI-SA para detectar a expressão de mAb anti-B7RP1 16H no meio condiciona-do. Os clones de expressão mais elevada foram submetidos a concentraçõescrescentes de metotrexato (MTX) para amplificação de DHFR. Clones amplifi-cados com MTX foram triados usando-se ensaios como ELISA para detectar aexpressão mais elevada de mAb anti-B7RP1 16H no meio condicionado. Osclones de expressão mais elevada foram submetidos a subclonagem para seobter uma população homogênea e a criação de bancos de células.

Outros anticorpos anti-B7RP1 recombinantes da invenção po-dem ser gerados em células de ovário de hamster chinês deficientes emDHFR usando-se o mesmo protocolo acima descrito para o anticorpo mono-clonal anti-B7RP1. As seqüências de DNA que codificam a cadeia pesadaou a cadeia leve completa de cada anticorpo anti-B7RP1 são clonadas emvetores de expressão. Células CHOd são co-transfectadas com um vetor deexpressão capaz de expressar uma cadeia pesada completa e um vetor deexpressão que expresse a cadeia leve completa do anticorpo anti-B7RP1apropriado. Por exemplo, para gerar um anticorpo anti-B7RP1 5D, as célulassão co-transfectadas com um vetor capaz de expressar uma cadeia pesadacompleta compreendendo a seqüência de aminoácidos descrita na SEQ IDNO: 47, e um vetor capaz de expressar a cadeia leve completa compreen-dendo a seqüência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 48. A Tabela 2resume cadeias leves completas exemplificativas e cadeias pesadas com-pletas exemplificativas para anticorpos anti-B7RP1 com regiões constantesde cadeia pesada de IgG humana. Aqueles versados na técnica reconhece-rão que a IgGI ou lgG2 poderiam se substituir (isto é, quando se relacionaIgGI na tabela, lgG2 poderia estar presente e vice-versa). Alternativamente,qualquer imunoglobulina (por exemplo, IgM, IgA, IgE ou IgH) poderia ser u-sada para gerar anticorpos da invenção.

Tabela 2

<table>table see original document page 68</column></row><table>Exemplo 4

Produção de Anticorpo Anti-B7RP1

O anticorpo anti-B7RP1 é produzido por expressão em uma li-nhagem clonal de células CHO. Para cada operação de produção, as célulasde um único frasco são descongeladas em meio de cultura celular livre desoro. As células são cultivadas inicialmente em um frasco T1 seguido porfrascos rotativos e, então, cultivadas em reatores de aço inoxidável de esca-la crescente até um biorreator de 2.000 L. A produção é realizada em umbiorreator de 2.000 L usando-se uma cultura de bateladas alimentada, emque uma alimentação nutriente contendo componentes de meio concentra-dos é adicionada para manter o crescimento das células e a viabilidade dacultura. A produção dura aproximadamente duas semanas, durante as quaiso anticorpo anti-B7RP1 é constitutivamente produzido pelas células e secre-tado no meio de cultura celular.

O reator de produção é controlado a um pH, temperatura e nívelde oxigênio dissolvido predeterminados: o pH é controlado por adição de gásdióxido de carbono e carbonato de sódio; o oxigênio dissolvido é controladopor fluxos dos gases ar, nitrogênio e oxigênio.

Ao término da produção, o caldo de células é alimentado a umacentrífuga de pilha de discos, e o sobrenadante da cultura é separado dascélulas. O concentrado é adicionalmente clarificado através de um filtro deprofundidade, seguido por um filtro de 0,2 pm. O meio condicionado clarifi-cado é, então, concentrado por ultrafiltração de fluxo tangencial. O meiocondicionado é concentrado 15 a 30 vezes. O meio condicionado concentra-do resultante é, então, processado mediante purificação ou congelado parapurificação em uma data posterior.

Exemplo 5

Linhagem Germinativa de mAb 16H

O alinhamento de seqüências do anticorpo 16H com seqüênciasde linhagem germinativa humana mostrou que a seqüência de arcabouço naregião variável do anticorpo 16H era mais idênticas às seqüências de linha-gem germinativa Vh 3-07 e JH4, com apenas três aminoácidos de diferença(figura 1A). A seqüência de arcabouço para a região VK do anticorpo 16H semostrou idêntica à seqüência da linhagem germinativa VK1-L15. É teorica-mente possível que hipermutações somáticas sejam reconhecidas como es-tranhas pela resposta imune de um paciente; caso em que o paciente gera-ria uma resposta anti-idiotipo que pudesse neutralizar a terapêutica. Parareduzir essa possibilidade, as três alterações de aminoácidos na região dearcabouço VH foram convertidas de volta às seqüências de linhagem germi-nativa Vh 3-07 e JH4 (figura 1A). Como os segmentos de gene de Vh e Jh dalinhagem germinativa estão presentes em todos os genomas humanos, aversão de linhagem germinativa de 16H provavelmente não será reconheci-da como estranha pela resposta imune de um paciente dosado. Bioensaiosde co-estimulação em placa foram conduzidos para determinar se os anti-corpos de linhagem germinativa podiam induzir proliferação de células Tcom uma IC50 similar a IC50 de anticorpos não de linhagem germinativa. Osensaios de co-estimulação foram conduzidos conforme descrito abaixo, u-sando-se anti-CD3, e a proteína de fusão hB7RP-1-Fc confirmou que esseanticorpo de linhagem germinativa, chamado de 16H linhagem germinativaou 16Hg, retinha suas atividades biológicas (figura 1B).

Exemplo 6

Medição da Afinidade de Anticorpos Monoclonais por Biacore® e KinExA

Três anticorpos (5D e_16H, preparados conforme descrito noExemplo 1, e 16H linhagem germinativa, preparado conforme descrito noExemplo 5) foram purificados e submetidos a análise de afinidade de liga-ção. B7RP1-Fc foi imobilizado a alta densidade em um chip sensor CM5,usando-se química de acoplamento de amina padrão. Uma concentraçãofixa de mAb foi, então, incubada com concentrações variáveis de B7RP-1 ouB7RP1-Fc durante pelo menos oito horas a temperatura ambiente, parapermitir que atingissem o equilíbrio. As amostras foram, então, injetadas so-bre a superfície de B7RP1-Fc, e o sinal de ligação observado representava oanticorpo livre restante em solução no equilíbrio. Com o uso de duas con-centrações de anticorpos diferentes (0,2 nM e 1 nM), a K0 da interação entreum mAb particular e o Iigante foi calculada a partir de análise de regressãonão linear das curvas de competição, usando-se um modelo de ligação ho-mogênea em um sítio de curva dupla (Adamczyk et al., 1999, BioconjugateChem. 10: 1032-37; Adamczyk et al., 2000, Methods 20: 319-28). Conformemostrado na figura 2 e na Tabela 3, os mAbs 16H, 16Hg e 5D se ligaramtodos às proteínas solúveis B7RP-1 e B7RP-1-Fc com elevadas afinidades.

Além disso, os resultados indicaram que o 16H (não linhagem germinativa) e16Hg (linhagem germinativa) reagiram de maneira similar, demonstrandoque a linhagem germinativa não afetou significativamente a ligação entre oanticorpo e o ligante.

Tabela 3

<table>table see original document page 71</column></row><table>

A ligação dos anticorpos 5D, 2H e 2H linhagem germinativatambém foi testada usando-se tecnologia KinExA (ensaio de exclusão cinéti-ca). Nesse ensaio, hB7RP-1 foi acoplado a glóbulos de agarose. Os glóbulosforam usados para criar uma coluna de glóbulos. Amostras contendo anti-corpo a uma concentração fixa, que se deixou que chegassem ao equilíbriocom concentrações variáveis de hB7RP-1, foram, então, passados pela co-luna de glóbulos."Anticorpo que não formou complexo com o ligante se ligouaos glóbulos revestidos.

Um anticorpo secundário anti-Fc humano etiquetado fluorescen-te foi usado para detectar o anticorpo de teste ligado. O sinal obtido foi pro-porcional ao anticorpo livre em solução a uma dada concentração de ligante.

Usando-se duas concentrações de anticorpos diferentes, a K0 da interaçãofoi calculada a partir da análise de regressão não linear das curvas de com-petição, usando-se um modelo de ligação homogênea em um sítio de curvadupla (Adamczyk et al., 1999, Bioconjugate Chem. 10: 1032-37; Adamczyket al., 2000, Methods 20: 319-28). As figuras 3, 4 e 5 mostram os ajustes decurva dupla para os anticorpos 5D, 2H e 2H (linhagem germinativa). Usando-se essa técnica, observou-se uma diferença de aproximadamente 10 vezesnas KdS para os anticorpos 5D e 2H.

Os resultados dos ensaios Biacore® e KinExA demonstraramque o anticorpo 5D tem maior afinidade por hB7RP-1 do que 2H ou 16H. Damesma forma, a versão de linhagem germinativa do anticorpo 2H não mos-tra uma diferença significativa com relação ao construto não linhagem ger-minativa.

Exemplo 7

Características Funcionais de Anticorpos Anti-B7RP1

As características funcionais de anticorpos contra B7RP-1 dainvenção foram avaliadas usando-se ensaios de ligação-competição, ensai-os de co-estimulação in vitro e ensaios de toxóide tetânico in vitro.

Estudos de Ligação-Competicão

Estudos de ligação-competição foram conduzidos com os mAbs16H para demonstrar que podem competir com a ligação de ICOS a B7RP-1. Células CHO transfectadas com um gene que codifica o B7RP-1 humanode comprimento total foram primeiro incubadas com quantidades decrescen-tes de mAb 16H não marcado e subseqüentemente tingidas com uma prote-ína de fusão ICOS-Fc marcada de maneira fluorescente. As células foram,então, analisadas usando-se citometria de fluxo. Conforme mostrado na figu-ra 6, ICOS-Fc tingiu as células CHO transfectadas com B7RP-1; 0,4 pg/mL.. de mAb 16H não afetaram a ligação com ICOS-Fc. Entretanto, 6 e 25 pg/mLde 16H competiram eficientemente com a ligação a ICOS-Fc, indicando quemAb 16H de fato competia com ICOS pela ligação a B7RP-1.

Ensaios de Co-estimulacão

Placas de cultura celular (Falcon, Cat. Ns 353077, fundo em U)foram revestidas com 1 pg/mL de anticorpos anti-CD3 humano (PharMingenCat. Ns 555336) e 10 pg/mL de IgG anti-humana (específica para Fc, Sigma,Cat. N9 13391). Os anticorpos anti-CD3 e imunoglobulina anti-humana emsolução salina tamponada com fosfato (PBS) foram adicionados a cada ca-vidade (100 pL/cavidade). As placas revestidas foram incubadas a 4BC du-rante uma noite ou a temperatura ambiente durante 2 horas. As placas fo-ram, então, lavadas com PBS duas vezes. Depois da lavagem, 1 pg/mL deB7-2Fc humano (R&D System, Cat. N2 141-B2) ou 5 pg/mL de hB7RP1Fc,ambos diluídos em PBS1 foram adicionados a cada cavidade (100 μΙ_ porcavidade). As placas foram, então, incubadas a temperatura ambiente du-rante 3 horas e lavadas duas vezes com PBS depois disso. Células T huma-nas purificadas (1 χ 105 por cavidade) em 200 μΐ_ de volume de meio (RPMI1640 suplementado com 10% de soro de novilho fetal (FCS), penicilina-estreptomicina-L-glutamina (PSG)1 β-mercaptoetanol (2-ME), aspartato deN-acetila (NAA) e piruvato de Na) e incubadas a 37SC, 5% de CO2 durante48 horas. Adicionou-se 3H timidina (ICN Cat. ne 2404205) a 1 pCi/cavidade,e as cavidades foram incubadas durante uma noite a 37QC, 5% de CO2. Ascélulas foram, então, colhidas e contadas.

Placas de cultura celular (Falcon, Cat. N9 353077, fundo em U)foram revestidas com 1 pg/mL de anti-CD3 humano como acima. CélulasCHO transfectadas com hB7RP1 (irradiadas a 5000RAD ) foram adicionadasa 2 χ 104 por cavidade, seguido por células T humanas purificadas a 1 χ 105por cavidade em 200 μΙ_ de volume. As placas foram incubadas a 37QC, 5%de CO2, durante 48 horas como acima. Adicionou-se 3H timidina a 1pCi/cavidade. As células foram incubadas durante uma noite, colhidas e con-tadas como acima.

Ensaios de Toxóide Tetãnico

PBMC foram purificadas de sangue humano usando-se um gra-diente de Ficoll-Paque (Amersham Biosciences) da seguinte maneira. Osangue foi diluído a 1:2 com PBS, o sangue diluído foi colocado em camadasobre o Ficoll (1/3 de Ficoll a temp. ambiente + 2/3 de sangue diluído), cen-trifugado a 2.500 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente, a camadasuperior (plasma e plaquetas) foi aspirada, e a camada de células mononu-cleares foi transferida para um tubo de 50 ml_ fresco. As PBMC foram lava-das com PBS (3xo volume da camada de células mononucleares) e centri-fugadas durante 10 minutos a 1.300 rpm a temperatura ambiente e lavadascomo acima. As PBMC foram ressuspendidas em meio (RPMI 1640 + 10%de FBS termicamente inativado + 1X PSG + 1X NEAA + 55 μΜ de 2-ME), eas células foram contadas.As PBMC foram adicionadas a cavidades de uma placa de fundoredondo de 96 cavidades a 100 μί de PBMC/cavidade (3 χ 106/mL). Adicio-nou-se toxóide tetânico (20 pg/mL; Universidade de Massachusetts) parauma concentração final de 5 pg/mL. As células foram incubadas durante 3dias a 37eC; 100 μΙ_ de sobrenadante foram coletados e incubados durantemais 6 a 8 horas na presença de 1 pCi/cavidade de 3H timidina (MP Biome-dicals). As células foram, então, colhidas e contadas.

A Tabela 4 resume as características funcionais de certos anti-corpos da invenção, conforme determinadas usando-se os ensaios acimadescritos.

Tabela 4

<table>table see original document page 74</column></row><table>

*Valores de EC50/KD em pM

Exemplo 8

Mapeamento de Epítopo

Conduziram-se estudos para identificar a região em B7RP-1 àqual se ligam os anticorpos monoclonais 16H/16Hg e 5D. Para isso, desen-volveu-se um novo ensaio de ligação de Classificador de Células Ativado porFluorescência (FACS). O domínio extracelular humano (ECD) de B7RP1(SEQ ID NO: 66), assim como formas truncadas de B7RP-1 contendo a Ig1(do tipo IgV; SEQ ID NO: 67) ou a Ig2 (do tipo IgC; SEQ ID NO: 68) foram ex-pressados como N-terminais, em fusões em quadro com avidina de galinha.SEQ ID NO: 66 (ECD):

DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQTGNDIGERDKITENP

SEQ ID NO: 67 (do tipo IgV):

DTQEKEVRAMVGSDVELSCACPEGSRFDLNDVYVYWQTSESKTVVTYHIPQNSSLENVDSRYRNRALMSPAGMLRGDFSLRLFNVTPQDEQKFHCLVLSQSLGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFT

SEQ ID NO:68 (do tipo IgC):

LGFQEVLSVEVTLHVAANFSVPVVSAPHSPSQDELTFTCTSINGYPRPNVYWINKTDNSLLDQALQNDTVFLNMRGLYDVVSVLRIARTPSVNIGCCIENVLLQQNLTVGSQTGNDIGERDKITENP

Vetores de expressão contendo genes que codifiquem essasproteínas de fusão foram individualmente transfectados de maneira transitó-ria em células 293T, e os meios condicionados dessas linhagens celularesforam usados como fonte da proteína de fusão. A etiqueta de avidina foi u-sada para capturar as proteínas de fusão B7RP1 da solução usando-se umglóbulo revestido com biotina. As proteínas de fusão foram incubadas commAbs 16H ou 5D marcados de maneira fluorescente ou com uma proteínade fusão ICSO-Fc marcada de maneira fluorescente, e incubadas com gló-bulos revestidos com biotina. Os glóbulos foram recuperados e analisadosusando-se citometria de fluxo em um Becton-Dickinson Bioscience FACScan(BD, Franklin Lakes, NJ). Conforme mostrado na figura 9A, a coloração fluo-rescente dos glóbulos foi detectada com os regantes 16H, 5D e ICOS, quan-do o ECD completo de B7RP-1 foi fixado, indicando que todos esses trêsreagéntes podiam se ligar ao ECD de B7RP-1. Da mesma forma, todos ostrês reagentes se ligaram à proteína de fusão com avidina contendo apenaso domínio Igl, indicando que tanto o mAb ICSO, quanto o anti-B7RP-1 debloqueio podiam se ligar a essa região. Em contraste, nem o mAb ICOS nemo anti-B7RP-1 podiam se ligar à proteína de fusão contendo apenas o domí-nio Ig2 proximal à membrana. Assim, as regiões de ligação de ICOS, 16H e5D a B7RP-1 estavam localizadas no domínio Ig1.Os anticorpos gerados conforme descrito acima no Exemplo 1 etestados quanto à ligação usando o ensaio de ligação a fusão com avidinapodiam ser divididos em duas classes de epítopos, H e D, conforme mostra-do na Tabela 5. Dos 100 anticorpos inicialmente selecionados com base emsua capacidade de se ligarem a B7RP1, 15 foram incapazes de se ligar noensaio de ligação a fusão com avidina, mais provavelmente por causa dadegradação.

Tabela 5

<table>table see original document page 76</column></row><table>

Exemplo 9

Identificação de SNP e Análise Funcional

Uma variante de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) prin-cipal foi identificada em B7RP-1, que está presente na população com umafreqüência de alelo de 28,4% (figura 7). A variante foi identificada dentro daseqüência codificadora de proteína madura. Uma busca no banco de dadosdo Centro Nacional de Informação em Biotecnologia (NBCI) revelou umasegunda variante de SNP em potencial; a segunda variante foi identificadaem uma análise individual de 1,5 (três cromossomos). A primeira variante deSNP (V1281) estava localizada no primeiro domínio do tipo IgV, ao passoque a variante de SNP do NCBI (L221F) estava localizada no segundo do-mínio do tipo IgC.

Conforme acima descrito, tanto o anticorpo monoclonal 16H,quanto o 5D se ligam ao primeiro domínio do tipo IgV, portanto é improvávelque a última variante L221F afete a ligação ou função do mAb 16H ou 5D.Todavia, para determinar se qualquer uma dessas variantes de SNP afeta aligação e/ou função de 16H ou 5D, conduziram-se dois experimentos dife-rentes. No primeiro conjunto de experimentos, proteínas de fusão com avidi-na foram construídas com as duas variantes de SNP e testadas quanto àligação a anticorpos 16H ou 5D no ensaio de citometria de fluxo acima des-crito. Esses mAbs representativos das classes de epítopos H e D se ligaramàs variantes de SNP com eficácia similar a de B7RP-1 do tipo selvagem (fi-gura 9B). Esses dados sugerem que anticorpos tanto das classes de epítopoH, quanto D se ligam a variantes SNP de B7RP-1.

Na segunda abordagem, proteínas de fusão com Fc foram cons-truídas usando-se a seqüência de variante SNP de B7RP-1 e comparadasquanto a capacidade dessas proteínas de estimularem células T no ensaiode co-estimulação em placa (figura 9C). Tanto os anticorpos 16H, quanto 5Dinibiram a co-estimulação mediada pelas proteínas de fusão com Fc de vari-ante de SNP1 com EC50S similares à proteína de fusão do tipo selvagem.Tomados juntos, esses dados indicam que as duas variantes SNP de B7RP-1 em potencial foram reconhecidas pelos anticorpos da invenção. Assim, osanticorpos da invenção podem se ligar a alvos em pacientes contendo essasvariantes de SNP.

Exemplo 10

Modelos de Eficácia Animal In vivo

A capacidade de anticorpos contra B7RP-1 de inibirem a respos-ta imune foi analisada usando-se um anticorpo monoclonal anti-B7RP-1 mu-rídeo de rato muridizado (1B7v2), e desafiando-se camundongos BALB/ccom hemocianina de lapa (KLH).

Geração do anticorpo monoclonal anti-B7RP-1 murídeo de rato muridizado1B7v2

Uma linhagem de célula de ovário de hamster chinês que super-expressava B7RP-1 murídeo de comprimento total foi injetada em ratos co-mo uma imunização primária e, subseqüentemente, com uma proteína defusão B7RP1-Fc murídea para reforçar a resposta imune. Os baços foramcolhidos 3 ou 4 dias após o reforço intravenoso, e as células B esplênicasforam fusionadas com a linhagem de mieloma de rato Y3-Ag1.2.3 (ATCCCRL-1631). As células foram, então, selecionadas em meio suplementadocom hipoxantina-aminopterina-timidina (HAT) durante 2 semanas e subse-qüentemente subclonadas em célula única por diluição limitativa. Esses pro-cedimentos são descritos em "Practical Immunology, 2nd ed." Leslie Hudsone Frank C. Hay; Blackwell Scientific Publications 1980.

Os genes que codificam a imunoglobulina 1B7 foram clonadosda linhagem celular 1B7 usando-se procedimentos padronizados (Sambrooket al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3â ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). A troca deisotipo dos mAbs anti-huB7RP1 humanos foi realizada por clonagem dosfragmentos de região variável contendo extremidades coesivas de sítios derestrição Xbal e BsmBI no vetor pDSRa com a região constante IgGI ouhulgG2 humana que também tinha extremidades Xbal e BsmBI. Para o anti-muB7RP1 de rato 1B7, a quimera foi formada por um processo de PCR desuperposição em três etapas. A região variável de rato foi amplificada porPCR com um primer 3' que continha parte, -25 - 35 nucleotídeos, da regiãoconstante murídea. A região constante murídea foi amplificada com um pri-mer 5' que continha parte, -25 - 35 nucleotídeos, da região variável de rato.

Os dois fragmentos foram, então, usados como molde, e os primers de regi-ão variável de rato 5' (contendo Xbal) e a região constante 3' murídea (con-tendo Sall) foram usados para gerar uma cadeia leve ou cadeia pesadacompleta. Os produtos de PCR de cadeia leve ou cadeia pesada foram, en-tão, digeridos com Xbal e Sall e clonados em pDSRa19. Um total de 25 pgde DNA Iinearizado (12,5 pg de pDC323B LC + 12,5 pg de pDC324 HC) foitransfectado em células CS-9 usando-se eletroporação e seleção em meiosuplementado com DHFR.

Para testar a eficácia do mAb 1B7v2, conduziram-se ensaios deco-estimulação em placa com esse mAb. Os resultados foram comparadoscom outros mAbs anti-B7RP-1 murídeo (figura 10A). Conforme acima discu-tido, 1B7 é o mAb produzido por hibridoma original; foram testadas duaspreparações diferentes (marcadas como 1,33 e 7,4). 5E1 e 11G10 foramoutros anti-mB7RP-1 monoclonais gerados nas fusões acima descritas. Fi-nalmente, HK5.3 era um anti-mB7RP-1 comercialmente disponível (Ebiosci-encesns 16-5985-85).O mAb 1 B7v2 bloqueou a ativação de células T nesse ensaio demaneira igual a ou melhor do que os outros mAbs e, portanto, foi seleciona-do como terapêutica substituta para estudos adicionais.

Desafio com Antíqeno em Camundonaos

A hemocianina de lapa (KLH) foi comprada na Pierce Biotechno-Iogy (Rockford, Illinois). A solução de dosagem ne 1 (KLH a 5 mg/kg em 1mg/camundongo de alume) foi preparada com partes iguais de 2x alume(500 mg de alume mais 50 ml_ de PBS (solução salina tamponada com fos-fato)) e 2x KLH (2,0 mL de dH20 (livre de RNAse) misturados com 20 mg deKLH liofilizado, levados a 20 mL com 1x PBS). A solução de dosagem ne 2(KLH a 1 mg/kg em 1 mg/camundongo de alume) foi preparada com 1 parte de2x KLH misturada com 4 partes de 1 χ solução salina tamponada com fosfato.

Camundongos BALB/c fêmeas foram preparados com 1 mg/kgde KLH/alume e reimunizados no dia 21 com 5 mg/kg de KLH apenas, intro-duzidos por injeção intraperitoneal. Os camundongos foram tratados por in-jeção intraperitoneal com 1 B7v.2, o anticorpo de controle de isotipo (anti-AGP3 PB) ou veículo (PBS) apenas, começando-se no dia 1 (um dia antes daimunização com KLH/alume), em um volume final de 200 μί a cada 5 dias.

Os camundongos foram sangrados a cada 7 dias retroorbital-mente (aproximadamente 200 pL) para se obterem aproximadamente 50 -100 pL de soro para análise de IgM (figura 10B), lgG2a (figura 10C) e IgGI(figura 10D) sérica específica para o antígeno. Tanto os camundongos decontrole de isotipo, quanto os tratados com veículo mostraram respostasimunes primárias e secundárias significativas. A resposta de IgM não foi afe-tada pelo tratamento, ao passo que o bloqueio de B7RP-1-ICOS com 1B7v2diminuiu tanto as respostas primárias, quanto secundárias de lgG2a e IgGlde maneira estatisticamente significativa.

IL-5 é uma citocina liberada por células T em resposta à estimu-lação com antígeno, que induz a diferenciação e função de células B. Comose acredita que a interação B7RP-1/ICOS seja crítica para a função de célu-las B dependente de células T, a medição dos níveis séricos de IL-5 foi usa-da para determinar se a interdição do eixo B7RP-1/ICOS estava, de fato,afetando a função de células T. Como esperado, o bloqueio de B7RP-1 tam-bém inibiu os níveis séricos de IL-5 induzidos por antígeno. Os soros foramcolhidos dos camundongos do experimento de desafio com antígeno acimadelineado 24 horas após o desafio com antígeno no dia 21, e os níveis séri-cos de IL-5 foram determinados por ELISA. Conforme mostrado na figura 11,níveis elevados de IL-5 foram detectados nos camundongos de teste tãocedo quanto 9 horas após o desafio; os níveis começaram a declinar em 48horas e retornaram à linha basal em 72 horas. O tratamento dos camundon-gos com mAb 1B7v2 levou a uma repressão estatisticamente significativados níveis de IL-5 no período de 24 horas.

Exemplo 11

Ligação a B7RP-1 de Macaco Cvnomolgus

Para determinar se os mAbs anti-hB7RP-1 também se ligavam aB7RP-1 de macaco Cynomolgus, conduziram-se experimentos de coloraçãocom citometria de fluxo com o mAb 16H e células B purificadas de macacosCynomolgus e seres humanos. Conforme mostrado na figura 12A, a adiçãode 16H marcado de maneira fluorescente a células B de Cynomolgus levouao fingimento, indicando que 16H estava, de fato, se ligando a B7RP-1 deCynomolgus (painel direito). Como esperado, 16H também tingiu células Bhumanas (painel esquerdo). Além disso, 16H, 16Hg e 5D foram testados emensaios de co-estimulação em placa usando-se células T de Cynomolgus,B7RP-1-Fc de Cynomolgus e mAb anti-CD3. Conforme mostrado na figura12B, todos os três mAbs inibiram a ativação de células T de Cynomolgusdependente de B7RP-1, indicando que esses mAbs bloqueiam funcional-mente a interação ICSO-B7RP-1 de Cynomolgus.

Exemplo 12

Respostas a Antígeno Dependentes de Células T no Macaco CvnomolousApós Administração dos Anticorpos Anti-B7RP-1

Conduziu-se um estudo em macaco Cynomolgus com dois anti-corpos monoclonais anti-B7RP-1, 16H e 5D, para avaliar a capacidade des-ses anticorpos de inibirem uma resposta a antígeno por células B dependen-te de células T, conforme determinado pelos níveis séricos de anticorpo es-pecífico para o antígeno. Resumidamente, as respostas de anticorpos anti-hemocianina de lapa (KLH) e antitoxóide tetênico foram examinadas após odesafio com antígeno na presença de anticorpos contra B7RP-1 no macacoCynomolgus.

O Artigo de Teste 1 era 16H, e o Artigo de Teste 2 era 5D. OArtigo de Controle era o veículo para o anticorpo contra B7RP-1 (0,01% deacetato de sódio, pH 5,0, 5% de sorbitol, 0,004% de Tween 20). A hemocia-nina de lapa (KLH) foi comprada na Pierce Biotechnology (Rockford, Illinois).

A KLH foi preparada por reconstituição com água estéril parafornecer uma solução de estoque a 10 mg/mL. A solução de estoque foi dilu-ída com água estéril para fornecer uma solução de dosagem a 1 mg/mL. Otoxóide tetânico usado para esses experimentos foi o Toxóide Tetânico Su-per-Tet® w/HavIogen®, comprado na Intervet® Inc. (Milsboro, Delaware). Onível de dose para esses experimentos foi de 75 Ul (0,5 mL de 150 UI/mL).

A Tabela 6 mostra a distribuição de grupos de tratamento dos 28macacos Cynomolgus.

Tabela 6

<table>table see original document page 81</column></row><table>

As doses de artigo de teste foram administradas mediante inje-ção intravenosa a todos os animais nos Dias 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43 e 50. Osanimais escalados para necropsia nos Grupos 1 - 4 (1/sexo/grupo) recebe-ram uma dose adicional no Dia 57. A avaliação da resposta imune foi condu-zida em todos os animais mediante imunização com os antígenos KLH etoxóide tetânico, seguida por amostragem de sangue quanto a imunoglobuli-nas específicas para o antígeno (IgM e IgG).Valores de título estavam presentes após a administração primá-ria tanto do antígeno KLH, quanto do de tétano. Para KLH, os valores detítulo primários variaram de 0 a 900 tanto para IgM1 quanto para IgG. Comoo desafio primário com KLH foi administrado antes da administração do arti-go de teste, não se avaliou nenhum efeito dos anticorpos contra B7RP-1.Para o toxóide tetânico, os valores de título primários variaram de 0 a 50 pa-ra IgM1 e de 0 a 4.050 para IgG. Não houve nenhuma diferença na respostaprimária ao toxóide tetânico entre os grupos de anticorpo contra B7RP-1 e ogrupo de controle.

Como esperado, os valores de título para IgG estavam aumen-tados após a administração secundária tanto do antígeno KLH, quanto do detétano, quando comparados com os valores de título primários. Para KLH, osvalores de título secundários variaram de 0 a 300 para IgM, e de 0 a 8.100para IgG. Entretanto, não houve nenhuma evidência de inibição da respostasecundária a KLH atribuída à administração dos anticorpos contra B7RP-1.

Para o toxóide tetânico, os valores de título secundários estavamabaixo de 50 para IgM e variavam de 1.350 a 36.450 para IgG. Os resulta-dos para valores médios de animais individuais e grupos são apresentadosna figura 13A (anticorpo 16H) e figura 13B (anticorpo 5D), para os Dias 53 e57 após o desafio secundário com toxóide tetânico no Dia 42.

No Dia 53, o número de animais que atingiram resposta de picoera de 3A1 Va e Va aos níveis de dose de 0,1, 1 e 8 mg/kg de 16H, respectiva-mente, e de Va, Va e Va aos níveis de dose de 0,1, 1 e 8 mg/kg de 5D, respec-tivamente, em comparação com 2/4 dos animais de controle. Assim, em ge-ral, o número de animais que atingiram um elevado título no Dia 53 era re-duzido nos animais tratados com anticorpo contra B7RP-1. No Dia 57, osvalores de título estavam mantidos nos animais de controle, ao passo que osvalores de título para vários dos animais tratados com anticorpo contraB7RP-1 declinaram dos valores do Dia 53. O número de animais com eleva-dos títulos no Dia 57 era de 0/4, 0/4 e Va aos níveis de dose de 0,1, 1 e 8mg/kg de 16H, respectivamente, e de 0/4, 0/4 e 0/4 aos níveis de dose de0,1, 1 e 8 mg/kg de 5D, respectivamente, em comparação com 2/4 dos ani-mais de controle.

Esses resultados demonstraram que os dois anticorpos contraB7RP-1 16H e 5D inibiram a resposta a antígenos de células B dependentede células T em macacos Cynomolgus, conforme determinado pelos níveisséricos de anticorpos específicos para toxóide tetânico. Além disso, a pre-sença de anticorpos contra B7RP-1 era importante para o bloqueio da inte-ração B7RP-1-ICOS durante a resposta primária, para se detectar um efeitoapós o desafio secundário.

Esses resultados e os resultados do Exemplo 10 demonstraramque tanto a terapêutica substituta, quanto os candidatos terapêuticos blo-quearam respostas imunes dependentes de células T e B em sistemas demodelo murídeo e de macaco, o que indica que o bloqueio desse eixo co-estimulador pode ser eficaz no tratamento de doenças mediadas por célulasB, como lúpus eritematoso sistêmico (SLE), asma e artrite reumatóide (RA).

Deve-se entender que a descrição precedente enfatiza certasmodalidades específicas da invenção, e que todas as modificações ou alter-nativas equivalentes a elas estão dentro do espírito e âmbito da invenção,conforme descrita nas reivindicações anexas.Listagem de Seqüência

<110> Siur JerryShen, DavidYoshinaga, SteveHuang, Haichun

<120> ANTICORPOS NEUTRALIZADORES ANTI-B7RP1 HUMANOS<130> 04-833

<160> 76

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiene

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Aia Ser Val Giy1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cya Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys AXa Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Arg85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 2<211> 107<212> PRT<213> Homo<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly15 10 ISGlu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Asn Trp Pro Trp85 90 95 .

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 3

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp20 ·' 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45

Tyr Thr Ala-Ser Ser Leu GIn Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 4<211> 108<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 ~ =50 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Ala85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cya Gln Gln Tyr Asn Thr Tyr Pro Arg85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105

<210> 6

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45

Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Tyr Ile Lys Gln Asp Gly Asn Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60

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Ala Arg Glu Gly Ile Leu Trp Phe Gly Asp Leu Pro Thr Phe Trp Gly100 105 110

Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 8

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

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Ala Arg Glu Gly Ile Leu Trp Phe Gly Asp Leu Pro Thr Phe Trp Gly100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120<210> 9

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Tbr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp Leu Asn Ile Met Val Trp Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 10

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens.

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 .30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Tyr Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp Gly Ile Leu Trp Phe Gly Asp Ile Pro Thr Tyr Trp Gly100 105 110

Gln Gly Ile Leu Val Thr Vàl Ser Ser115 120

<210> 11

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leii Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu, Glu Trp Val35 40 45

Ala Tyr Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp Gly Ile Leu Trp Phe Gly Asp Ile Pro Thr Tyr Trp Gly100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 12

<211> 120

<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Met Tyr Tyr Cys Ala85 90 95

Lys Ser Gly Val Pro Leu Leu Trp Phe Gly Glu Phe Tyr Trp Gly Gln100 105 110

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<210> 13<211> 121<212> PRT<213> Homo<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val.35 40 45

Ala Tyr Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tisn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cya85 90 95

Ala Arg Asp Gly Ile Leu Trp Phe Gly Asp Leu Pro Thr Tyr Trp Gly100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 14

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ser Ala Ile Gly Ala Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60

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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95

Arg Val Val Val Val Val Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser115

<210> 15<211> 11<212> PRT<213> Homo<400> 15

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<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

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<213> Homo sapiens

<400> 17

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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<211> 7

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<213> Homo sapiens

<400> 19

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<211> 9

<212> PRT

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<210> 21

<211> 7

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<213> Homo sapiens<400> 21

Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser1 5

<210> 22

<211> 9

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<213> Homo sapiens

<400> 22

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<211> 10<2i2> PRT<213> Homo<400> 23Gln Gln Arg 1 <210> 24<211> 11<212> PRT<213> Homo^ » Γ* Λν rt Λ

10

Arg Ala Ser Gln Gly Xle Ser Ser Trp Leu Ala1 5 10

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<211> 9

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<213> Homo sapiens

<400> 25

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<211> 9

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Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr1 5<210> 27

<211> 5

<212> PRT

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<400> 27

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<210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Hosto sapiens <400> 28 Tyr Ile Lys Gln Asp Gly Asn Glu Lys Tyr1 5 10

15

Gly

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<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

Glu Gly Ile Leu Trp Phe Gly Asp Leu Pro Thr Phe15 10

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<211> 5

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<213> Homo sapiens

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Ser Tyr Gly Met His1 5

<210> 31

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Glu

1 5 10 15

Gly<210> 32

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

Asp Leu Asn Ile Met Val Trp Gly Ile Phe Asp Tyr1 5 10

<210> 33 <211> Π <212> PBT <213> Homo sapiens<400> 33 Tyr Ile Lys Gln Asp1 5Gly <210> 34 <211> 12 <212> PRT

10 15

<213> Homo sapiens<400> 34

Asp Gly Ile Leu Trp Phe Gly Aep Ile Pro Thr Tyr15 10

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> Ηοιαο sapiens

<4 00> 35

Ser Tyr Ala Met His1 5

<210> 36<211> 16<212> PRT<213> Homo<4 00> 36

Ala Ile Gly Thr Gly Gly Giy Thv Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly1 5 10 15<210> 37<211> 11<212> PM<213> Homo<400> 37Gly Val Pro 1 <210> 38<2Ü> 12<212> PRT<213> H orno<40Q> 38Asp Gly Ile 1 <210> 39<211> 16<212> PRT<213> Homo<400> 39Ala lie Gly 1 <210> 40<211> 10<212> PRT<213> Homo<400> 40Val Val Val 1 <210> 41<211> 326<212> PRT<213> Homo<400> 41

ίο

10

10 15

10

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Prd Cys Ser Arg1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lye Val Asp Lys85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp215 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp180 185 190

Leu Aan Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro195 200 205

Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile245 250 255

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys275 280 285Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys325

<210> 42

<211> 330

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 42

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp145 150 155 160

Tyr Val

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly210 215 220

Gln Pro Ara Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu225 230 235 240

Leu Thx Lya Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu. Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys325 330

<210> 43

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 43

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu15 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln35 40 45Ser Gly Asti Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys100 105

<210> 44

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 44

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Tyr Xle Lys Gln Asp Gly Asn Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ile Leu Trp Phe Gly Asp Leu Pro Thr Phe Trp Gly100 105 110

GJLn Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val180 185 190

Pxo Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His195 200 205

Lys Fro Ser Asn Thr Lys Val Aap Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys210 215 220

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser290 295 300

Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lye Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr lie325 330 335

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser385 390 395 400Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440 445

<210> 45

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ssr Giy50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glη Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Arg85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lya His Lys Val Tyr180 185 ISO

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys210

<210> 46

<211> 4 47

<212> PRT

<213> Horoo sapiens

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Tyr Ile Lys Gln Asp Gly Asn Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Aen Ser Leu Tyr65 70 75 60

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ile Leu Trp Phe Gly Asp Leu Pro Thr Phe Trp Gly100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val145 150 155 160Ser Trp Asn Ser GXy Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cya Asn Val Asp His

195 200 205

Lye Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys210 215 220

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ihr Leu Met Ile Ser Arg Thr245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser290 295 300

Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile325 330 335

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Zle Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn370 375 380

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440 445

<210> 47<211> 451<212> PRT<213> Homo<400> 47

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Vai Xle Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp Leu Asn Ile Met Val Trp Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro AlaVal Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys210 215 220

Aep Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Het

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser435 440 445

Pro Gly Lys4SD

<210> 48

<211> 214

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 48

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Asn Asn Trp Pro Trp85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys210

<210> 49

<211> 433

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 49

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu1 5 10 15

GIn Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lye Ala Asp Tyr Glu65 70 75 ' 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Vel Thr His Gln Gly Leu Ser Ser85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ala Ser Thr hys Gly100 105 110

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser115 120 125

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val130 135 140

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe145 150 155 160

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val165 170 175

Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val180 185 190

Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys195 200 205

Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro210 215 220

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Iie Ser225 230 235 240

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp245 250 255

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn260 265 270

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val

Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu290 295 300

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys305 310 315 320

Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr325 330 335

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr340 345 350

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu355 360 365

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu370 375 380

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys385 390 395 400Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu405 410 415

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly420 425 430

Lys

<210> 50

<211> 214

<21Z> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 50

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15

Asp Axg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Trp20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile35 40 45

[■yr Thr Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Axg Phe Ser Gly50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys210

<210> 51

<211> 447

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Tyr Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp Gly Ile Leu Trp Phe Gly Asp Ile Pro Thr Tyr Trp Gly100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr TVla130 135 140Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val180 185 190

Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys210 215 220

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Xle Ser Arg Thr245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu260 265 270

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser290 295 300

Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile325 330 335

Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440 445

<210> 52

<211> 444

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ser Ala Ile Gly Ala Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr. Tyr Cys Ala85 90 95

Arg Val Val Val Val Val Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115" 120 125

Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly130 135 ' 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn145 150 155 160Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser180 185 190

Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe225 230 235 240

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Xle Ser Arg Thr Pro Glu Val245 250 255

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe260 265 270

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro275 280 285

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr290 295 300

Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val305 310 315 320

Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr325 330 335

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg340 345 350

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<212> PRT

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<400> 54

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165

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180

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195

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210

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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser115 120 125

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Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440 445<210> 73

<211> 451

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 73

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Tyr Xle Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp Gly Ile Leu Trp Phe Gly Asp Ile Pro Thr Tyr Trp Gly100 105 110

Gln Gly Ile Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His195 200 205

Lys Pro Ser Asn

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Xle325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser435 440 445

Pro Gly Lys450<210> 74

<211> 451

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 74

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Tro Val35 40 45

Ala Tyr Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp Gly Ile Leu Trp Phe Gly Asp Ile Pro Thr Tyr Trp Gly100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His195 200 205Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser435 440 445

Pro Gly Lys<210> 75

<211> 448

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 75

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ser Ala Ile Gly Ala Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala85 90 95

Arg Val Val Val Val Val Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser195 200 205Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440 445<210> 76<211> 451<212> PRT<213> Homo<400> 76

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45

Ala Tyr Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Asp Gly Ile Leu Trp Phe Gly Asp Leu Pro Thr Tyr Trp Gly100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His195 200 205

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu GIr. Tyr Asn Ser Thr Tyr290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser435 440 445

Pro Gly Lys450

Claims

1. Anticorpo isolado que se liga especificamente a B7RP1, emque o anticorpo compreende uma cadeia pesada com uma região variávelde cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a região variável de cadeiapesada compreende uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos80% de identidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos apresen-tada em qualquer uma das SEQ ID NO: 7 - 14, ou fragmento de imunoglo-bulina de ligação a antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

2. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que oanticorpo se liga especificamente a B7RP1 humano, mas não a B7RP1 decamundongo.

3. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 1, em que oanticorpo se liga especificamente a B7RP1 humano e a B7RP1 de camun-dongo.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que a regiãovariável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos con-forme apresentada nas SEQ ID NO: 7 - 14, ou fragmento de imunoglobulinade ligação a antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que a cadeiapesada compreende uma CDR1 de cadeia pesada humana que tenha umaseqüência de aminoácidos conforme apresentada nas SEQ ID NO: 27, 30 ou 35, ou fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologica-mente funcional da mesma.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que a cadeiapesada compreende uma CDR3 de cadeia pesada humana que tenha umaseqüência de aminoácidos conforme apresentada nas SEQ ID NO: 29, 32, - 34, 37, 38 ou 40, ou fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ouimunologicamente funcional da mesma.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, em que a cadeiapesada compreende uma CDR2 de cadeia pesada humana que tem umaseqüência de aminoácidos conforme apresentada nas SEQ ID NO: 28, 31,- 33, 36 ou 39, ou fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imu-nologicamente funcional da mesma.

8. Anticorpo isolado que se liga especificamente a B7RP1, com-preendendo:a) uma cadeia pesada com uma região variável de cadeia pesa-da compreendendo uma seqüência de aminoácidos conforme apresentadana SEQ ID NO: 7, fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ouimunologicamente funcional da mesma, e uma cadeia leve com uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos con-forme apresentada na SEQ ID NO: 1, ou fragmento de imunoglobulina deligação a antígeno ou imunologicamente funcional da mesma;b) uma cadeia pesada com uma região variável de cadeia pesa-da compreendendo uma seqüência de aminoácidos conforme apresentadana SEQ ID NO: 8, fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ouimunologicamente funcional da mesma, e uma cadeia leve com uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos con-forme apresentada na SEQ ID NO: 1, ou fragmento de imunoglobulina deligação a antígeno ou imunologicamente funcional da mesma;c) uma cadeia pesada com uma região variável de cadeia pesa-da compreendendo uma seqüência de aminoácidos conforme apresentadana SEQ ID NO: 9, fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ouimunologicamente funcional da mesma, e uma cadeia leve com uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos con-forme apresentada na SEQ ID NO: 2, ou seu fragmento de imunoglobulinade ligação a antígeno ou imunologicamente funcional da mesma;d) uma cadeia pesada com uma região variável de cadeia pesa-da compreendendo uma seqüência de aminoácidos conforme apresentadana SEQ ID NO: 10, fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ouimunologicamente funcional da mesma, e uma cadeia leve com uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos con-forme apresentada na SEQ ID NO: 3, ou fragmento de imunoglobulina deligação a antígeno ou imunologicamente funcional da mesma;e) uma cadeia pesada com uma região variável de cadeia pesa-da compreendendo uma seqüência de aminoácidos conforme apresentadana SEQ ID NO: 11, fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ouimunologicamente funcional da mesma, e uma cadeia leve com uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos con-forme apresentada na SEQ ID NO: 3, ou fragmento de imunoglobulina deligação a antígeno ou imunologicamente funcional da mesma;f) uma seqüência de aminoácidos conforme apresentada naSEQ ID NO: 12, fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imu-nologicamente funcional da mesma, e uma cadeia leve com uma região va-riável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos con-forme apresentada na SEQ ID NO: 4, ou seu fragmento de imunoglobulinade ligação a antígeno ou imunologicamente funcional da mesma;g) uma cadeia pesada com uma região variável de cadeia pesa-da compreendendo uma seqüência de aminoácidos conforme apresentadana SEQ ID NO: 13, fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ouimunologicamente funcional da mesma, e uma cadeia leve com uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos con-forme apresentada na SEQ ID NO: 5, ou fragmento de imunoglobulina deligação a antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; ouh) uma cadeia pesada com uma região variável de cadeia pesa-da compreendendo uma seqüência de aminoácidos conforme apresentadana SEQ ID NO: 14, fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ouimunologicamente funcional da mesma, e uma cadeia leve com uma regiãovariável de cadeia leve compreendendo uma seqüência de aminoácidos con-forme apresentada na SEQ ID NO: 6, ou fragmento de imunoglobulina deligação a antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

9. Anticorpo isolado que se liga especificamente a B7RP1, emque o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve comuma região variável de cadeia leve, em que a região variável de cadeia levecompreende uma seqüência de aminoácidos que tenha pelo menos 80% deidentidade de seqüência com a seqüência de aminoácidos apresentada emqualquer uma das SEQ ID NO: 1 - 6, ou fragmento de ligação a antígeno ouimunologicamente funcionai da mesma.

10. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 9, em queo anticorpo se liga especificamente a B7RP1 humano, mas não a B7RP1 decamundongo.

11. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 9, em que oanticorpo se liga especificamente a B7RP1 humano e a B7RP1 de camundongo.

12. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9, em que a regiãovariável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos quetenha pelo menos 90% de identidade de seqüência com a seqüência de a-minoácidos apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 1 - 6, ou frag-mento de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologicamente fun-cional da mesma.

13. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9, em que a cadeiapesada compreende uma CDR1 de cadeia pesada humana que tenha umaseqüência de aminoácidos conforme apresentada nas SEQ ID NO: 15, 18 ou-24, ou fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologica-mente funcional da mesma.

14. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9, em que a cadeiapesada compreende uma CDR3 de cadeia pesada humana que tenha umaseqüência de aminoácidos conforme apresentada nas SEQ ID NO: 17, 20,-22, 23, 25 ou 26, ou fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ouimunologicamente funcional da mesma.

15. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9, em que a cadeiapesada compreende uma CDR2 de cadeia pesada humana que tenha umaseqüência de aminoácidos conforme apresentada nas SEQ ID NO: 16, 19 ou-21, ou fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologica-mente funcional da mesma.

16. Anticorpo isolado que se liga especificamente a B7RP1,compreendendo:a) a CDR1 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoáci-dos conforme descrita em SEQ ID NO: 27, a CDR2 de cadeia pesada temuma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 28, e aCDR3 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos conforme des-crita em SEQ ID NO: 29;b) a CDR1 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoáci-dos conforme descrita em SEQ ID NO: 30, a CDR2 de cadeia pesada temuma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 31, e aCDR3 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos conforme des-crita em SEQ ID NO: 32;c) a CDR1 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoáci-dos conforme descrita em SEQ ID NO: 27, a CDR2 de cadeia pesada temuma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 33, e aCDR3 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos conforme des-crita em SEQ ID NO: 34;d) a CDR1 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoáci-dos conforme descrita em SEQ ID NO: 35, a CDR2 de cadeia pesada temuma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 37;e) a CDR1 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoáci-dos conforme descrita em SEQ ID NO: 27, a CDR2 de cadeia pesada temuma seqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 33, e aCDR3 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos conforme des-crita em SEQ ID NO: 38; ouf) a CDR1 de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidosconforme descrita em SEQ ID NO: 35, a CDR2 de cadeia pesada tem umaseqüência de aminoácidos conforme descrita em SEQ ID NO: 39, e a CDR3de cadeia pesada tem uma seqüência de aminoácidos conforme descrita emSEQ ID NO: 40.

17. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 16, em quea cadeia pesada e a cadeia leve estão conectadas por um Iigante flexívelpara formar um anticorpo de cadeia única.

18. Anticorpos, de acordo com a reivindicação 17, que é um an-ticorpo Fv de cadeia única.

19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 16, que éum anticorpo Fab.

20. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 16, que éum anticorpo Fab'.

21. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 16, que éum anticorpo (Fab')2.

22. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 16, em queo anticorpo é um anticorpo completamente humano.

23. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, 9 ou 16, em queo anticorpo inibe a atividade de B7RP1.

24. Método de tratamento de uma doença auto-imune ou respos-ta inflamatória em um paciente, compreendendo a administração ao pacientede uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo isolado quese ligue especificamente a B7RP1, em que o anticorpo compreende umaseqüência de aminoácidos conforme apresentada em qualquer uma dasSEQ ID NO: 1 - 40, 44 - 58 ou 70 - 76, ou fragmento de imunoglobulina deligação a antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, em que a doençaauto-imune é artrite reumatóide ou lúpus eritematoso sistêmico.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24, em que a respos-ta inflamatória é asma.

27. Método de tratamento de um paciente compreendendo aadministração ao paciente de uma quantidade farmaceuticamente eficaz deum anticorpo humano isolado que se ligue especificamente a B7RP1, emque o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácidos conforme a-presentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 1 - 40, 44 - 58 ou 70 - 76,ou fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologicamentefuncional da mesma.

28. Método de tratamento de um paciente com asma, artritereumatóide ou lúpus eritematoso sistêmico, o método compreendendo aadministração ao paciente de uma quantidade farmaceuticamente eficaz deum anticorpo humano isolado que se ligue especificamente a B7RP1, emque o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácidos conforme a-presentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 1 - 40, 44 - 58 ou 70 - 76,ou fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologicamentefuncional da mesma.

29. Composição farmacêutica, compreendendo um veículo far-maceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de umanticorpo isolado que se ligue especificamente a B7RP1, em que o anticorpocompreende uma seqüência de aminoácidos conforme apresentada emqualquer uma das SEQ ID NO: 1 - 40, 44 - 58 ou 70 - 76, ou fragmento deimunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologicamente funcional damesma.

30. Método de tratamento de uma doença auto-imune ou respos-ta inflamatória em um paciente, compreendendo a administração ao pacientede uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 29.

31. Método para a detecção de B7RP1 em uma amostra biológi-ca, compreendendo:a) o contato da amostra com o anticorpo como definido na reivindi-cação 1, 9 ou 16, sob condições que permitam a ligação do anticorpo a B7RP1; eb) a medição do nível de anticorpo ligado na amostra.

32. Molécula de ácido nucléico que codifica o anticorpo comodefinido na reivindicação 1, 9 ou 16.

33. Célula hospedeira compreendendo o ácido nucléico comodefinido na reivindicação 32.

34. Linhagem celular isolada que produz um anticorpo como de-finido em qualquer uma das reivindicações 1, 9 ou 16.

35. Seqüência selecionada das SEQ ID NOS: 15 - 40, e em queo agente de ligação específica pode se ligar a B7RP1.

36. Composição farmacêutica compreendendo um veículo far-maceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz do a-gente de ligação como definido na reivindicação 35.

37. Método de tratamento de uma doença auto-imune ou respos-ta inflamatória em um paciente, compreendendo a administração ao pacientede uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 36.

38. Agente de ligação, de acordo com a reivindicação 35, que éuma proteína.

39. Molécula de ácido nucléico que codifica o agente de ligaçãocomo definido na reivindicação 35.

40. Célula hospedeira compreendendo o ácido nucléico comodefinido na reivindicação 39.

41. Linhagem celular isolada que produz um agente de ligaçãocomo definido na reivindicação 35.

42. Método de tratamento de uma doença auto-imune ou respos-ta inflamatória em um paciente, compreendendo a administração ao pacientede uma quantidade farmaceuticamente eficaz do agente de ligação comodefinido na reivindicação 35.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, em que a doençaauto-imune é artrite reumatóide ou lúpus eritematoso sistêmico.

44. Método, de acordo com a reivindicação 42, em que a respos-ta inflamatória é asma.

45. Método para a detecção de B7RP1 em uma amostra biológi-ca, compreendendo:a) o contato da amostra com o agente de ligação como definido nareivindicação 35, sob condições que permitam a ligação do anticorpo a B7RP1; eb) a medição do nível de anticorpo ligado na amostra.

46. Molécula de ácido nucléico isolada compreendendo uma se-qüência de nucleotídeos que codifique um peptídio com aminoácidos con-forme apresentados em qualquer uma das SEQ ID NO: 1-39.

47. Anticorpo isolado que se liga especificamente a:a) a região D de B7RP1, ou fragmento de imunoglobulina de li-gação a antígeno ou imunologicamente funcional da mesma; oub) a região H de B7RP1, ou fragmento de imunoglobulina de li-gação a antígeno ou imunologicamente funcional da mesma.

48. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 47, em que a ca-deia pesada e a cadeia leve estão conectadas por um Iigante flexível paraformar um anticorpo de cadeia única.

49. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 48, que é um anti-corpo Fv de cadeia única.

50. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 47, que é um anti-corpo Fab.

51. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 47, que é um anti-corpo Fab'.

52. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 47, que é um anti-corpo (Fab')2·

53. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 47, em que o anti-corpo é um anticorpo completamente humano.

54. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 47, em que o anti-corpo inibe a atividade de B7RP1.

55. Método de tratamento de uma doença auto-imune ou respos-ta inflamatória em um paciente, compreendendo a administração ao pacientede uma quantidade farmaceuticamente eficaz do anticorpo como definido nareivindicação 54.

56. Método, de acordo com a reivindicação 55, em que a doençaauto-imune é artrite reumatóide ou lúpus eritematoso sistêmico.

57. Método, de acordo com a reivindicação 55, em que a respos-ta inflamatória é asma.

58. Composição farmacêutica compreendendo um veículo far-maceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz do an-ticorpo de acordo com a reivindicação 55.

59. Método de tratamento de uma doença auto-imune ou respos-ta inflamatória em um paciente, compreendendo â administração ao pacientede uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 58.

60. Método para a detecção de B7RP1 em uma amostra biológi-ca, compreendendo:a) o contato da amostra com o anticorpo como definido na reivindi-cação 47, sob condições que permitam a ligação do anticorpo a B7RP1; eb) a medição do nível de anticorpo ligado na amostra.

61. Molécula de ácido nucléico que codifica o anticorpo comodefinido na reivindicação 47.

62. Célula hospedeira compreendendo o ácido nucléico comodefinido na reivindicação 61.

63. Linhagem celular isolada que produz um anticorpo como de-finido na reivindicação 47.

64. Compreende qualquer uma das SEQ ID NO: 1 - 40.

65. Molécula de ácido nucléico que codifica o anticorpo de acor-do com a reivindicação 64.

66. Célula hospedeira compreendendo o ácido nucléico comodefinido na reivindicação 65.

67. Linhagem celular isolada que produz um anticorpo de acordocom a reivindicação 64.

68. Anticorpo humano isolado que se liga especificamente aB7RP1, em que o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácidosconforme apresentada em qualquer uma das SEQ ID NO: 44 - 58 ou 70 --76, ou fragmento de imunoglobulina de ligação a antígeno ou imunologica-mente funcional da mesma.

69. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 68, em que a ca-deia pesada e a cadeia leve estão conectadas por um Iigante flexível paraformar um anticorpo de cadeia única.

70. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 69, que é um anti-corpo Fv de cadeia única.

71. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 68, que é um anti-corpo Fab.

72. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 68, que é um anti-corpo Fab'.

73. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 68, que é um anti-corpo (Fab')2.

74. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 68, em que o anti-corpo é um anticorpo completamente humano.

75. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 68, em que o anti-corpo inibe a atividade de B7RP1.

76. Método de tratamento de uma doença auto-imune ou respos-ta inflamatória em um paciente, compreendendo a administração ao pacientede uma quantidade farmaceuticamente eficaz do anticorpo como definido nareivindicação 75.

77. Método, de acordo com a reivindicação 76, em que a doençaauto-imune é artrite reumatóide ou lúpus eritematoso sistêmico.

78. Método, de acordo com a reivindicação 76, em que a respos-ta inflamatória é asma.

79. Composição farmacêutica compreendendo um veículo far-maceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz do an-ticorpo como definido na reivindicação 75.

80. Método de tratamento de uma condição causada por expres-são aumentada de B7RP1 ou sensibilidade aumentada a B7RP1 em um pa-ciente, compreendendo a administração ao paciente de uma composiçãofarmacêutica como definida na reivindicação 79.

81. Método para a detecção de B7RP1 em uma amostra biológi-ca, compreendendo:a) o contato da amostra com o anticorpo de acordo com a reivin-dicação 68, sob condições que permitam a ligação do anticorpo a B7RP1; eb) a medição do nível de anticorpo ligado na amostra.

82. Molécula de ácido nucléico que codifica o anticorpo comodefinido na reivindicação 68.

83. Célula hospedeira compreendendo o ácido nucléico comodefinido na reivindicação 82.

84. Linhagem celular isolada que produz um anticorpo como de-finido na reivindicação 68.

85. Molécula de ácido nucléico isolada que codifica um polipep-tídio com uma seqüência de aminoácidos conforme apresentada em qual-quer uma das SEQ ID NO: 1 - 40, 44 - 58 ou 70 - 76.

86. Célula hospedeira compreendendo o ácido nucléico comodefinido na reivindicação 85.

87. Linhagem celular isolada que produz um polipeptídio comodefinido na reivindicação 85.