BRPI0614222A2

BRPI0614222A2 - proteìnas ligantes de il-6

Info

Publication number: BRPI0614222A2
Application number: BRPI0614222-2A
Authority: BR
Inventors: Alice Bakker; Amy N Duguay; Qiang Liu; Joshua Silverman; Kevin Moore
Original assignee: Amgen Mountain View Inc
Priority date: 2005-07-13
Filing date: 2006-07-12
Publication date: 2011-03-15
Also published as: CA2614186A1; WO2007009069A3; TW200745159A; CN101273053A; US8603782B2; JP2009501517A; AR054165A1; EA200800301A1; EP1902066A4; AU2006268111A1; WO2007009069A2; ZA200801389B; WO2007009069A8; US20080281076A1; IL188671A0; AU2006268111A8; KR20080042070A; US7786262B2; US20080003611A1; MX2008000230A

Abstract

PROTEINAS LIGANTES DE IL-6. Polipeptídeos que compreendem domínios monoméricos que se ligam a IL-6, ou porções destes, são fornecidos.

Description

"PROTEÍNAS LIGANTES IL-6"

Interleucina-6 (IL-6) desempenha um papel central na regulação daresposta imune e inflamação. IL-6 possui uma variedade de atividades biológicasque agem de modo endócrino, autócrino e parácrino sobre uma diversidade decélulas alvo. As principais fontes de IL-6 são os monócitos. Os fibroblastos e ascélulas endoteliais junto com as células T e as células B1 queratinócitos, célulasmesangiais, e várias células tumorais produzem IL-6. Sua síntese é induzida porIL-1, IL-2, TNF-p e interferons. IL-6 é inibida por IL-4, IL-10 e IL-13. Assim, IL-6cumpre uma importante função na regulação imunológica e inflamação bem comodoenças auto-imunes.

IL-6 tem a habilidade de estimular os estágios finais de maturação dolinfócito B, onde os linfócitos B se diferenciam em células plasmáticas eimunoglobulinas secretadas (Ig). Adicionalmente, IL-6 induz o crescimento decélulas Tea diferenciação das células T citotóxicas através do aumento daexpressão do receptor de IL-2 e produção de IL-2. IL°-6 sinergiza com outrascitocinas para dar suporte à maturação das células estâmicas da medula óssea, éum ativador neutrófilo e estimula a produção de plaquetas a partir dosmegacariócitos. Também é um indutor potente de macrófago terminal ediferenciação osteoclástica. IL-6 também compartilha várias atividades com 11-1 eTNF1 incluindo a indução de pirexia e a produção de proteínas da fase aguda taiscomo soro amilóide A, CRP, alfa 1 antitripsina, fibrinogênio, e haptoglobulina.

IL-6 media vários efeitos únicos antiinflamatórios. Onde ambas IL-1 eTNF-a induzem a síntese uma da outra, bem como IL.-6, e IL-6 interrompe estacascata de regulação positiva inflamatória e inibe a síntese de IL-1 e TNF-a. IL-6também é importante como fator de crescimento celular e possui uma função ativaem glomerulonefrite proliferativa mesangial.

O receptor de IL-6 (IL-6R) pertence à superfamília de receptores decitocina tipo I e consiste de duas cadeias, IL-6R (glicoproteína de 80kDa) e gp130.IL-6R é um componente de ligação Iigante específico enquanto gp130 é umcomponente receptor compartilhado responsável para transmissão de sinaisintracelulares de citocinas relacionadas a IL-6 tais como fator de inibição deleucemia (FIL), fator neurotrópico ciliar, oncostatina M1 e IL-11.

Quando ligada ao receptor, IL-6 conduz a dimerização de gp130, queresulta na ativação de gp13o associado a quinas JAK1 e subseqüentemente afosforilação da tirosina de gp130. Enquanto gp130 é expresso, IL-6R é maisrestringido. Tanto IL-6R e gp130 possuem formas solúveis. O complexo de IL-6 eIL-6R solúvel podem agir sobre as células que expressam apenas gp130. Este épotencialmente um importante mecanismo pró-inflamatório para receptoressolúveis.

Breve Resumo da Invenção

A presente invenção fornece um polipeptídeo que compreende umdomínio monomérico que se liga a (por exemplo, se liga seletivamente) IL-6. Emalgumas realizações, o polipeptídeo compreende um domínio monomérico que seliga a IL-6, em que o domínio monomérico é um domínio monomérico de classe Areceptor de LDL que compreende uma das seguintes seqüências:

CXXXQFQCXSG[W,Y]C[I,L,F]XXXW[V,L]CDGXNDCEDXSDEXXC(SEQ ID NO:2)

ou

CX[A,P]X[E,Q]FXCXXGQC[I,L]PXXXXCDGX[D,N]DCXDXSDEXXC(SEQ ID NO:3),

Onde X é qualquer aminoácido e os aminoácidos entre colchetesindicam aminoácidos alternativos numa posição específica.

Em algumas realizações, o polipeptídeo compreendeCXXXQFQCXSG[W,Y]C[I,L,F]XXXW[V,L]CDGXNDCEDXSDEXXC (SEQ ID NO:2).

Em algumas realizações, o polipeptídeo compreendeCX[A, P]X[E ,Q] FXCXXGQCfI, LjPXXXXC DGX[D, N] DCXDXS DEXXC (SEQ IDNO:3).

Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende pelo menos ume não mais do que seis domínios monoméricos que se ligam a IL-6.

Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende pelo menosdois e não mais do que seis domínios monoméricos que se ligam a IL-6.

Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende pelo menosdois domínios monoméricos que se ligam a IL-6. Em algumas realizações, opolipeptídeo compreende um primeiro domínio monomérico com especificidade deligação para IL-6 e um segundo domínio monomérico com especificidade deligação para IL-6; em que: o primeiro domínio monomérico compreendeCXXXQFQCXSG[W,Y]C[I,L,F]XXXW[V,L]CDGXNDCEDXSDEXXC (SEQ ID NO:2);e o segundo domínio monomérico compreendeCX[A, P]X[E ,Q] FXCXXGQC[I, L]PXXXXCDGX[D, N] DCXDXS DEXXC (SEQ IDNO:3).

Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende:CX[A,P]X[E,Q]FXCXXGQC[l,L]PXXXXCDGX[D,N]DCXDXSDEXXCXnCXXXQFQCX SG[W,Y]C[I,L,F]XXXW[V,L]CDGXNDCEDXSDEXXC (SEQ ID NO:4), em que nestá entre 0 e 100. Em algumas realizações, n é 3-15,1-20, 0-30, ou 0-50.

Em algumas realizações, o polipeptídio compreende qualquer umadas seqüências seguintes (SEQ ID NOS.: 5-13):

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT; ou

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT; ou

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCRADEFQCGSGRCVPADWLCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT; ou

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTQHT; ou

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCQANEFTCSSGNCLSPALLCDGVDDCGDNSDETYCASPAPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDDCVDSSDEASCQPPT; ou

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEADCAAPT; ou

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGSGYCLSQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCAD

NSDEEDCTEHT; ou

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCESDQFQCDSGHCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDGEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCEPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT; ou

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCGAS

QFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLSA

DWLCDGVNDCADNSDEEGCPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDG

SDETNCPART.

Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende qualquer umadas seqüências seguintes (SEQ ID NOS: 14-22):

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVND

CADNSDEE DCTEHT;

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCI

SQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVND

CADNSDEEDCTEHT;CRADEFQCGSGRCVPADWLCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSD EEDCTEHT;

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSD EEDCTQHT;

CQANEFTCSSGNCLSPALLCDGVDDCGDNSDETYCASPAPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDDCVDSSDEASCQPPT;

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEADCAAPT;

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGSGYCLSQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSD EEDCTEHT;

CESDQFQCDSGHCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSD EEDCTEHT; ou

CGASQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLSADWLCDGVNDCADNSDEEGCPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSDETNCPART.

Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende uma dasseqüências trimérica, dimérica ou monomérica Iigante de IL-6 aqui mostradas.

Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende três domíniosmonoméricos que se ligam a IL-6.

Em algumas realizações, o polipeptídeo ainda compreende umdomínio monomérico que possui uma especificidade de ligação para um fatorsangüíneo, aumentando deste modo, a meia vida do polipeptídeo no soro quandoo polipeptídeo é injetado num animal comparado a meia vida no soro de umpolipeptídeo em que falta o domínio monomérico Iigante do fator sangüíneo. Emalgumas realizações, o fator sangüíneo é soro albumina, uma imunoglobulina, ouum eritrócito.

Em algumas realizações, o domínio monomérico que possui umaespecificidade de ligação por um fator sangüíneo se liga a imunoglobulina (IgG) e odomínio monomérico que possui uma especificidade de ligação por um fatorsangüíneo é um domínio monomérico de classe A receptor de LDLcompreendendo uma seqüência selecionado a partir das seguintes:CXSSGRCIPXXWVCDGXXDCRDXSDE (SEQ ID NO: 23), eCXSSGRCIPXXWLCDGXXDCRDXSDE (SEQ ID NO: 24), em que X é qualqueraminoácido.

Em algumas realizações, o domínio monomérico que possui umaespecificidade de ligação por um fator sangüíneo se liga a imunoglobulina (IgG) e odomínio monomérico que possui uma especificidade de ligação por um fatorsangüíneo é um domínio monomérico de classe A receptor de LDLcompreendendo a seguinte seqüência:

[EQ]FXCRX[ST]XRC[IV]XXXW[ILV]CDGXXDCXD[DN]SDE (SEQ ID NO:25), emque X é qualquer aminoácido e os aminoácidos entre colchetes são aminoácidosalternativos numa única posição.

Em algumas realizações, o domínio monomérico que possui umaespecificidade de ligação por um fator sangüíneo compreendeCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENC (SEQ ID NO:26).

Em algumas realizações, o domínio monomérico está entre 35 a 45aminoácidos. Em algumas realizações, o monômero compreende uma seqüênciade aminoácidos em que: pelo menos 10% dos aminoácidos na seqüência sãocisteína; e/ou pelo menos 25% dos aminoácidos são aminoácidos de ocorrêncianão natural.

A presente invenção também fornece métodos para identificar umpolipeptídeo que se liga a (por exemplo, se liga seletivamente) IL-6. Em algumasrealizações, o método compreende vasculhar uma biblioteca de polipeptídios comafinidade por IL-6; e selecionar um polipeptídeo que compreende pelo menos umdomínio monomérico que se liga a IL-6, em que o domínio monomérico: é umdomínio monomérico de ocorrência não natural; compreende pelo menos umaponte dissulfeto; e se liga a um íon.

Em algumas realizações, o polipeptídeo selecionado compreende umdomínio monomérico de domínio A receptor de LDL compreendendo pelo menosum de:

Família de motivo 1 (SEQ ID NO.: 27):

CX[AS][DN]EFXCXXGXC[ILV]XXAXXCDGV[DN]DCXDNSDEXXC[AST]XX[AST]

Família de motivo 2 (SEQ ID NO: 28):

CXXXQFXC[DN]NGXCVPXXWXCDG[DE][DN]DCXD[DN]SDEXXCXXP[AST]

Família de motivo 3 (SEQ ID NO: 29):

CXXXQFQCXSG[W,Y]C[I,L,F]XXXW[V,L]CDGXNDCEDXSDEXXCFamília de motivo 4 (SEQ ID NO: 30):

CXXX[EQ]FXCXXGXC[ILV]XXXXXCDGX[DN]DCXDXSDEXX(XX)CFamília de motivo 5 (SEQ ID NO: 31):

CX[A,P]X[E,Q]FXCXXGQC[I,L]PXXXXCDGX[D,N]DCXDXSDEXXCFamília de motivo 6 (SEQ ID NO: 32):

CXXX[EQ]FXCX(X)SXXC[ILV]XX[DN]W[ILV]CDGVNDCXDXSDEXGCXXXT

Família de motivo 7 motif (SEQ ID NO:33):

CL[AS]X[EQ]FXCXNGXCIP[KQR]XWVCDGDNDC[ILV]DXSDE(P)XXCX[EKQ]XT.

Em algumas realizações, o domínio monomérico compreende umaseqüência de aminoácidos em que pelo menos 10% dos aminoácidos naseqüência são cisteína; e/ou pelo menos 25% dos aminoácidos são aminoácidosde ocorrência não natural.

Em algumas realizações, o método ainda compreende ligar o domíniomonomérico no polipeptídeo selecionado a um segundo domínio monomérico paraformar uma biblioteca de multímeros, cada multímero compreendendo pelo menosdois domínios monoméricos; vasculhar a biblioteca de multímeros quanto àhabilidade em se ligar a IL-6; e selecionar um multímero que se ligue a IL-6.

Em algumas realizações, o método ainda compreende ligar o domíniomonomérico no polipeptídeo selecionado a um segundo domínio monomérico paraformar uma biblioteca de multímeros, cada multímero compreendendo pelo menosdois domínios monoméricos; vasculhar a biblioteca de multímeros quanto àhabilidade em se ligar a uma molécula alvo outra que não IL-6; e selecionar ummultímero que se liga a molécula alvo.

Em algumas realizações, o método ainda compreende uma etapa demodificar pelo menos um domínio monomérico, fornecendo deste modo, umabiblioteca que compreende domínios monoméricos mutados.

Em algumas realizações, a biblioteca de domínios monoméricos éexpressa como uma tela de fagos, tela de ribossomos ou tela de superfícies decélulas.

Em algumas realizações, o polipeptídeo compreende pelo menos doisdomínios monoméricos e os domínios monoméricos são unidos por um ligante. Emalgumas realizações, o ligante é um peptídeo ligante. Em algumas realizações, oligante tem entre 4 a 12 aminoácidos de comprimento.

A presente invenção também fornece polinucleotídios que codificamum polipeptídeo que compreende um domínio monomérico que se liga a (porexemplo, se liga seletivamente) IL-6, em que o domínio monomérico: é um domíniomonomérico de ocorrência não natural que consiste de 30 a 50 aminoácidos; ecompreende pelo menos uma ponte dissulfeto.

Em algumas realizações, o polinucleotídio codifica um polipeptídeoque compreende uma das seguintes seqüências:Família de motivo 1 (SEQ ID NO: 27):

CX[AS][DN]EFXCXXGXC[ILV]XXAXXCDGV[DN]DCXDNSDEXXC[AS

T]XX[AST]

Família de motivo 2 (SEQ ID NO: 28):

CXXXQFXC[DN]NGXCVPXXWXCDG[DE][DN]DCXD[DN]SDEXXCXX

P[AST]

Família de motivo 3 (SEQ ID NO: 29):

CXXXQFQCXSGfW.YlCtl.L.FJXXXWfV.LJCDGXNDCEDXSDEXXCFamília de motivo 4 (SEQ ID NO: 30):

CX[A,P]X[E,Q]FXCXXGQC[I,L] PXXXXCDGX [D, N]DCXDXSDEXXC

Família de motivo 6 (SEQ ID NO: 32):

CXXX[EQ]FXCX(X)SXXC[ILV]XX[DN]W[ILV]CDGVNDCXDXSDEXGC

XXXT

Família de motivo 7 (SEQ ID NO: 33):

CL[AS]X[EQ]FXCXNGXCIP[KQR]XWVCDGDNDC[ILV]DXSDE(P)XX

CX[EKQ]XT.

Em algumas realizações, os polinucleotídios codificam umpolipeptídeo que compreende uma das seguintes seqüências (SEQ ID NOS: 5-13)CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT; ou

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGSGYCLSQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT; ou

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCESDQFQCDSGHCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT; ou

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCGASQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLSADWLCDGVNDCADNSDEEGCPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSDETNCPART.

Em algumas realizações, os polinucleotídios codificam umpolipeptídeo que compreende uma das seguintes seqüências (SEQ ID NOS:14-22):CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEE DCTEHT;

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT;

CRADEFQCGSGRCVPADWLCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSD EEDCTEHT;

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSD EADCAAPT;

CGASQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLSADWLCDGVNDCADNSDEEGGPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSDETNCPART.

Em algumas realizações, o polinucleotídio que codifica um domíniomonomérico com especificidade de ligação por IL-6 é otimizado para uso comocódon de uma célula (por exemplo, um célula, bacteriana, vegetal ou de mamífero).Por exemplo,

ATGAAACACTCTGGTGGTTCGTGTCACCCTACCGGCCAATTTAGATGCCGCAGTAGCGGCAGATGCGTTTCACCGACCTGGGTTTGCGACGGCGATAATGATTGTGGGGACAACTCGGATGAAGAAAACTGTAGCGCGCCAGCATCTGAACCGCCGGGTTCCCTGTGTCTGCCGGACCAGTTCCGGTGCGGCAACGGCCAATGCATTCCACTGGACTGGGTTTGCGACGGCGTTAATGATTGTCCGGACGACTCGGATGAAGAAGGCTGTCCACCGCGTACGTGTGCGCCGAGCCAGTTCCAGTGCGGCAGCG G CTACTGC ATTTCACAG CG CTG G GTTTG CG ACG GCG AAAATG ATTGTG AGGACGGCTCGGATGAAGCAAACTGTGCAGGCTCCGTACCTACGTGTCCGTCGGACGAGTTCCGGTGCAGAAACGGCCGCTGCATTCCACGGGCCTGGCGTTGCGACGGCGTAAATGATTGTGCGGACAACTCGGATGAAGAAGACTGTACAGAGCATACGTCATTGCAGTAG (SEQ ID NO: 34) codifica o trímero Iigante de IL-6MKHSGGSCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEE DCTEHTSLQ* (SEQ ID NO: 35). Contudo,ATGAAACACTCTGGTGGTAGCTGTCACCCTACCGGCCAATTTCGTTGCCGCAGTAGCGGCCGTTGCGTTTCACCGACCTGGGTTTGCGACGGCGATAATGATTGTGGCGACAACAGCGATGAAGAAAACTGTAGCGCGCCAGCATCTGAACCGCCGGGTTCCCTGTGTCTGCCGGACCAGTTCCGTTGCGGCAACGGCCAATGCATTCCACTGGACTGGGTTTGCGACGGCGTTAATGATTGTCCGGACGACTCGGATGAAGAAGGCTGTCCACCGCGTACGTGTGCGCCGAGCCAGTTCCAGTGCGGCAGCGGCTACTGCATTAGCCAGCGCTGGGTTTGCGACGGCGAAAATGATTGTGAGGACGGCTCGGATGAAGCAAACTGTGCAGGCTCCGTACCTACGTGTCCGTCGGACGAGTTCCGCTGCCGTAACGGCCGCTGCATTCCACGTGCCTGGCGCTGCGACGGCGTAAATGATTGTGCGGACAACAGCGATGAAGAAGACTGTACCGAGCATACGTCATTGCAGTAA (SEQ ID NO: 36) é um polinucleotídio que também codificaMKHSGGSCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEE DCTEHTSLQ* (SEQ ID NO: 35), mas foi códon otimizado paraexpressão em bactérias.

Definições

Sem de outro modo indicado, as definições que se seguemsuplantam aquelas do estado da arte.

Como aqui utilizado, o uso de parênteses numa seqüência de motivoindica que aquelas posições dentro dos parênteses podem estar presentes ouausentes (por exemplo, "[eqk]") indica que a posição é ausente ou que E, K ou Qpodem estar naquela posição). Quando mais de um "x" é usado entre parênteses(por exemplo, "(xx)"), cada x representa uma possível posição. Assim, "(xx)" indicaque zero, um ou dois aminoácidos podem estar naquelas posições, onde cadaaminoácido é independentemente selecionado entre qualquer aminoácido.

Os termos "domínio monomérico" ou "monômero" são utilizados demodo intercambiável e aqui se referem a uma região discreta encontrada numaproteína ou polipeptídio. Um domínio monomérico forma uma estruturatridimensional nativa em solução na ausência de seqüências de aminoácidosnativas. Domínios monoméricos da invenção freqüentemente se ligarão a umamolécula alvo. Por exemplo, um polipeptídeo que forma uma estruturatridimensional que se liga a uma molécula alvo é um domínio monomérico. Comoaqui usado, o termo "domínio monomérico" não engloba a região determinante decomplementariedade (RDC) de um anticorpo.

O termo "loop" se refere aquela porção de um domínio monoméricoque fica tipicamente exposto ao ambiente na montagem da estrutura da proteínado domínio monomérico, e que está envolvida na ligação da molécula alvo. Apresente invenção fornece três tipos de Ioops que são identificados porcaracterísticas específicas, tais como potencial para ponte dissulfeto, cruzamentoentre estruturas secundárias de proteína, e uma seqüência de Ioop fator B definida.

Como aqui usado, o termo "seqüência de Ioop cisteína definida" serefere a uma subseqüência de uma seqüência que codifica o domínio monoméricode ocorrência natural que está ligado a cada terminal por um resíduo de cisteínaque é conservada com relação a pelo menos um outro domínio monomérico deocorrência natural da mesma família de seqüências de Ioop cisteína definidas sãoidentificadas pelo alinhamento de múltiplas seqüências dos domínios monoméricosde ocorrência natural, seguido de análise de seqüência para identificar os resíduosde cisteína conservados. A seqüência entre cada par consecutivo de resíduos decisteína conservados é uma seqüência de Ioop cisteína definida. A seqüência deIoop cisteína definida não inclui os resíduos de cisteína adjacentes em cadaterminal. Domínios monoméricos que possuem seqüências de Ioop cisteínadefinidas incluem os domínios A receptores de LDL1 domínios tipo EGF1 domíniossushi, domínios tipo 1 de fibronectina, e similares. Assim, por exemplo, no casodos domínios A de receptores de LDL representados pela seqüência consenso,CX6CX4CX6CX5CX8C (SEQ ID NO: 37), em que X6, X4, X5, e X8 cada umrepresenta uma seqüência de Ioop cisteína definida que compreende o número deaminoácidos designado.

O termo "seqüência de Ioop fator B definida" se refere a umasubseqüência de pelo menos três resíduos de aminoácidos de uma seqüênciacodificadora de domínio monomérico em que os fatores B para os carbonos alfa noloop fator B definido estão entre os 25% mais altos de fatores B de carbono alfa nodomínio monomérico inteiro. Tipicamente o fator B do carbono alfa médio para asubseqüência é de pelo menos cerca de 65. Como aqui usado, o termo "fator B"(ou "fator temperatura" ou "fator Debye-Waller") é derivado dos dados deespalhamento de raio-X. O fator B é um fator que pode ser aplicado ao termo doespalhamento de raio-X para cada átomo, ou para grupos de átomos, quedescreve o grau ao qual a densidade de elétrons é espalhada pelos fatoresempregados na prática da presente invenção pode ser tanto isotrópico ouanisotrópico. O termo "fator B de carbono alfa médio" se refere a:

<formula>formula see original document page 15</formula>

onde n corresponde ao número de resíduos no Ioop e é pelo menos 3, e fator- Bcdé o fator-B para o carbono alfa do resíduo de aminoácido i do loop.

O termo "multímero" é usado aqui para indicar um polipeptídeo quecompreende pelo menos dois domínios monoméricos. Os domínios monoméricosseparados num multímero podem ser unidos por um ligante. Um multímero étambém conhecido como uma proteína de mosaico combinatório ou uma proteínade mosaico recombinantee.

O termo "família" e "classe de família" são usadosintercambiavelmente para indicar proteínas que são agrupadas por similaridadesnas suas seqüências de aminoácidos. Estas seqüências similares são geralmenteconservadas devido a sua importância para a função da proteína e/ou amanutenção da estrutura tridimensional da proteína. Exemplos de tais famíliasincluem a família do domínio-A do receptor de LDL1 a família tipo EGF, e similares.Adicionalmente, seqüências relacionadas que se ligam a mesma molécula alvopodem ser divididas em famílias com base nos motivos comuns da seqüência.

O termo "ligante", também é aqui referido como uma "molécula alvo",engloba uma ampla variedade de substâncias e moléculas, que vai de moléculassimples a alvos complexos. Moléculas alvo podem ser proteínas, ácidos nucléicos,lipídios, carboidratos ou qualquer outra molécula capaz de reconhecimento por umdomínio do polipeptídeo. Por exemplo, uma molécula alvo pode incluir umcomposto químico (isto é, composto não biológico tal como, por exemplo, umamolécula orgânica, uma molécula inorgânica, ou uma molécula que tenha tantoátomos orgânicos e inorgânicos, mas excluindo polinucleotídios e proteínas), umamistura de compostos químicos, uma rede de compostos espacialmentelocalizados, uma macromolécula biológica, uma biblioteca de visualização depeptídeos de bacteriófagos, uma biblioteca de visualização de peptídeos depolissomos, um extrato obtido a partir de materiais biológicos tais como bactéria,plantas, fungos ou animal (por exemplo, mamífero) células ou tecido, uma proteína,uma toxina, um hormônio peptídico, uma célula, um vírus, ou similares. Outrasmoléculas alvo incluem, por exemplo, uma célula inteira, um tecido inteiro, umamistura de proteínas relacionadas ou não relacionadas, por exemplo, uma misturade vírus ou cepas de bactérias ou similares. Moléculas alvo podem também serdefinidas pela inclusão em ensaios de varredura aqui descritos ou pelo aumento ouinibição de uma interação de proteína específica (isto é, um agente queseletivamente inibe uma interação Iigante entre dois polipeptídeospredeterminados).

O termo "ligante" aqui usado também indica uma porção ou grupo deporções que se unem ou se conectam a dois ou mais domínios monoméricosseparados discretos. O ligante permite que os domínios monoméricos separadosdiscretos permaneçam separados quando unidos num multímero. A porção liganteé tipicamente uma porção linear. Ligantes adequados incluem polipeptídios, ácidospolinucléicos, ácidos nucléicos peptídicos e similares. Ligantes adequados tambémincluem opcionalmente porções alquileno substituído que possuem um ou maisátomos oxigênio incorporados no esqueleto de carbono. Tipicamente, o pesomolecular do ligante é menor do que cerca de 2000 daltons. Mais tipicamente, opeso molecular do ligante é menor do que cerca de 1500 daltons e usualmente émenor do que cerca de 1000 daltons. O ligante pode ser pequeno o suficiente parapermitir que os domínios monoméricos separados discretos cooperem, porexemplo, onde cada domínio monomérico separado discreto num multímero se ligaa mesma molécula alvo através dos sítios de ligação separados. Exemplos deligantes incluem um polinucleotídio que codifica um polipeptídeo, ou umpolipeptídeo de aminoácidos ou outras porções de ocorrência não natural. Oligante pode ser uma porção de uma seqüência nativa, uma variação desta, ouuma seqüência sintética. Ligantes podem compreender, por exemplo, aminoácidosde ocorrência não natural, ou uma combinação de ambos.

O termo "separado" é aqui usado para indicar uma propriedade deuma porção que é independente e permanece independente mesmo quandocomplexada com outras porções, incluindo, por exemplo, outros domíniosmonoméricos. Um domínio monomérico é um domínio separado numa proteínaporque este possui uma propriedade independente que pode ser reconhecida eseparada da proteína. Por exemplo, a habilidade do ligante do domínio-A se ligarao LDLR é uma propriedade independente. Outros exemplos de separado incluemos domínios monoméricos separados num multímero que permanece com osdomínios independentes separados mesmo quando complexados ou unidos nomultímero por um ligante. Um outro exemplo de uma propriedade separada é osítio de ligação separado num multímero para um ligante.

Como aqui usado, "evolução dirigida" se refere a um processo peloqual polinucleotídios variantes são gerados, expressos e selecionados para umaatividade (por exemplo, um polipeptídeo com atividade ligante) num processorecursivo. Um ou mais candidatos na seleção são escolhidos e o processo é entãorepetido utilizando polinucleotídios que codificam os candidatos selecionados paragerar novos variantes. Evolução dirigida envolve pelo menos dois turnos degeração de variação e pode incluir 3, 4, 5, 10, 20 ou mais turnos de geração devariação e seleção. A variação pode ser gerada por qualquer método conhecidopor aqueles versados na arte, incluindo, por exemplo, PCR sujeito a erro,recombinação gênica, mutagênese química e similares.

O termo "recombinar" é aqui usado para indicar recombinação entreseqüências não idênticas. Em algumas realizações, a recombinação pode incluircruzamento através de recombinação homóloga ou via recombinação nãohomóloga, tal como via sistemas cre/lox e/ou flp/frt. A recombinação pode serrealizada pelo uso de uma variedade de formatos diferentes, incluindo, porexemplo, formatos de recombinação in vitro e in vivo, em formatos derecombinação em silício, formatos de recombinação que utiliza tanto molde de fitadupla quando de fita simples, formatos de recombinação com base em primers,formatos de recombinação com base em fragmentação de ácido nucléico, eformatos de recombinação mediada por oligonucleotídio, todos os quais sãobaseados na recombinação de eventos entre seqüências não idênticas e sãodescritos em mais detalhes ou referenciados abaixo, bem como outros formatos derecombinação baseados similarmente. O termo "randômico" como aqui usado serefere a uma seqüência polinucleotídica ou uma seqüência de aminoácidocomposta por dois ou mais aminoácidos e construída por um processo randômicoou estocástico. A seqüência polinucleotídica ou seqüência de aminoácidosrandômica pode incluir estrutura ou motivos estruturais, que podem compreender

seqüências não variáveis.

O termo "pseudorandômico" como aqui usado se refere a um conjuntode seqüências, polinucleotídio ou polipeptídeo, que apresentam limitadavariabilidade, tal que o grau de variabilidade de resíduo em algumas posições élimitado, mas qualquer posição pseudorandômica é permitida pelo menos emalguns graus de variação do resíduo.

O termo "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são aqui usadosintercambiavelmente para se referir a uma seqüência de aminoácidos de dois oumais aminoácidos.

O termo "aminoácido" se refere a aminoácidos sintéticos e deocorrência natural, bem como, análogos de aminoácido e miméticos de aminoácidoque funcionam de maneira similar aos aminoácidos de ocorrência natural.Naturalmente aminoácidos de ocorrência natural são aqueles codificados pelocódigo genético, bem como aqueles aminoácidos que são modificados mais tarde,por exemplo, hidroxiprolina, y-carboxiglutamato e o-fosfoserina. Análogos deaminoácidos se referem a compostos que possuem a mesma estrutura químicabásica dos aminoácidos de ocorrência natural, isto é, um carbono que está ligado aum hidrogênio, um grupo carboxila, um grupo amino e um grupo R, por exemplo,homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfônio. Taisanálogos têm seus grupos R modificados (por exemplo, norleucina) ou esqueletospeptídicos modificados, mas mantém a mesma estrutura química básica que oaminoácido de ocorrência natural. "Miméticos de aminoácido" se refere acompostos químicos que tem uma estrutura que é diferente da estrutura químicageral de um aminoácido, mas que funciona de maneira similar a um aminoácido deocorrência natural.

"Substituição conservativa de aminoácido" se refere a troca entreresíduos que possuem cadeias laterais similares. Por exemplo, um grupo deaminoácidos que possuem cadeias laterais alifáticas são glicina, alanina, valina,leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos que possuem cadeias lateraishidroxi-alifáticas são serina e treonina; um grupo de aminoácidos que possuemcadeias laterais contendo amida são asparagina e glutamina; um grupo deaminoácidos que possuem cadeias laterais aromáticas são fenilalanina, tirosina etriptofano; um grupo de aminoácidos que possuem cadeias laterais básicas sãolisina, arginina e histidina; um grupo de aminoácidos que possuem cadeias lateraisque contém enxofre são cisteína e metionina. Grupos de substituição conservativade aminoácidos incluem: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, Iisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina.

A frase "seqüência de ácido nucléico" se refere a um polímero de fitadupla ou simples de bases desoxirribonucleotídicas ou ribonucleotídicas lidas daextremidade 5' para 3' ou um análogo deste.

O termo "codificar" se refere a uma seqüência polinucleotídica quecodifica um ou mais aminoácidos. O termo não requer um códon de iniciação deinterrupção. Uma seqüência de aminoácido pode ser codificada por qualquer umadas seis diferentes fitas de leitura providas por uma seqüência polinucleotídica.

O termo "promotor" se refere a regiões ou seqüências localizadas amontante e/ou a jusante do início da transcrição que estão envolvidas noreconhecimento e ligação da RNA polimerase e outras proteínas para iniciar atranscrição.

Um "vetor" se refere a um polinucleotídeo, que quando independentedo cromossomo hospedeiro, é capaz de replicar-se num organismo hospedeiro.Exemplos de vetores incluem plasmídeos. Vetores tipicamente têm uma origem dereplicação. Vetores podem compreender, por exemplo, seqüências iniciadoras eterminadoras de transcrição e transdução, e promotores úteis para regulação daexpressão do ácido nucléico em particular.

O termo "recombinantee" quando usado com referência, por exemplo,a uma célula, ou ácido nucléico, proteína, ou vetor, indica que a célula, ácidonucléico, proteína, ou vetor foi modificado pela introdução de um ácido nucléico ouproteína heteróloga ou a alteração de um ácido nucléico ou proteína nativa, ou quea célula é derivada de uma célula já modificada. Assim, por exemplo, célulasrecombinantees expressam genes nativos que não são encontrados na formanativa (não recombinada) da célula ou expressam genes nativos que de outromodo anormalmente expressos, sub-expressos ou não expressos.

A frase "se liga especificamente (ou seletivamente)" a umpolipeptídeo, quando se refere a um monômero ou multímero, se refere a umareação de ligação que pode ser determinante da presença do polipeptídeo numapopulação heterogênea de proteínas (por exemplo, uma célula ou tecido lisado) eoutros biológicos. Assim, sob condições ou ensaios padrões utilizou-se em ensaiosde ligação de anticorpo, o monômero específico ou multímero que se liga a umamolécula alvo em particular acima do nível basal (por exemplo, 2X, 5X, 10X oumais acima do nível basal) e não se liga numa quantidade significativa a outrasmoléculas presentes na amostra.

Os termos "idêntico" ou "identidade" percentual, no contexto de doisou mais ácidos nucléicos ou seqüências polipeptídicas, se refere a dois ou maisácidos nucléicos ou seqüências polipeptídicas que tem uma porcentagemespecífica de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são a mesma {isto é,60% de identidade, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95% deidentidade numa região específica ou, quando não especificado na seqüênciainteira), quando comparado e alinhado para um máximo de correspondênciaatravés de uma janela de comparação, ou região designada como medidautilizando um dos seguintes algoritmos de comparação de sequencias ou peloalinhamento banal e inspeção visual. Opcionalmente, a identidade ou identidadesubstancial existe numa região que é pelo menos cerca de 50 nucleotídeos decomprimento, ou se não especificado, todo o comprimento da seqüência. Apresente invenção fornece polipeptídeos que compreendem as seqüências Iigantesde IL-6, onde as seqüências Iigantes de IL-6 são substancialmente idênticas (porexemplo, pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntica) a pelomenos uma das seqüências de ligação de IL-6 como aqui fornecido, incluindo masnão limitado a, qualquer uma das SEQ ID NOS: 27-33.Um polinucleotídeo ou seqüência de aminoácido é "heteróloga a" umasegunda seqüência se as duas seqüências não estão unidas da mesma maneiracomo encontrado nas seqüências de ocorrência natural. Por exemplo, um promotoroperacionalmente unido a uma seqüência codificadora heteróloga se refere a umaseqüência codificadora que é diferente de qualquer alelo variante de ocorrêncianatural. O termo "ligante heterólogo", quando usado em referência a um multímero,indica que o multímero compreende um ligante e um monômero que não foiencontrado na mesma relação um com o outro na natureza (por exemplo, estesformam uma proteína de fusão de ocorrência não natural).

Um "aminoácido de ocorrência não natural" numa seqüência deproteína se refere a qualquer aminoácido diferente do aminoácido que ocorre naposição correspondente num alinhamento com um polipeptídeo de ocorrêncianatural com a mais baixa probabilidade de menor valor onde a janela decomparação é o comprimento do domínio monomérico pesquisado e quandocomparado a uma seqüência de ocorrência natural na base de dados não-redundante" ("nr") do "Genbank" utilizando o BLAST 2.0 como aqui descrito.

"Porcentagem de identidade de seqüência" é determinada porcomparação de duas seqüências otimamente alinhadas numa janela decomparação, em que a porção da seqüência de polinucleotídeo na janela decomparação pode compreender adições ou eliminações (isto é, buracos) quandocomparado com a seqüência de referência (que não compreende adições oueliminações) para o ótimo alinhamento das duas seqüências. A porcentagem écalculada pela determinação do número de posições em que os resíduos de basede ácido nucléico ou aminoácido idênticos ocorrem em ambas seqüências paraproduzir o número de posições compatíveis, dividindo o número de posiçõescompatíveis pelo número total de posições na janela de comparação emultiplicando o resultado por 100 para fornecer a porcentagem de identidade daseqüência.

O termo "idêntico" ou porcentagem de "identidade", no contexto dedois ou mais ácidos nucléicos ou seqüências polipeptídicas, se refere a duas oumais seqüências ou subseqüências que são as mesmas ou tem uma porcentagemespecífica de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos,quando comparado e alinhado para um máximo de correspondência numa janeade comparação, ou região designada como medida utilizando uma dos seguintesalgoritmos de comparação de seqüência ou pelo alinhamento manual e inspeçãovisual. Tais seqüências são então ditas serem "substancialmente idênticas". Apresente invenção fornece polipeptídeos que se ligam a IL-6 e que compreendemuma seqüência substancialmente idêntica a qualquer uma das seqüências comcomprimento total aqui descrito. Esta definição também se refere ao complementode uma seqüência de teste. Opcionalmente, a identidade existe sobre uma regiãoque é pelo menos cerca de 50 aminoácidos ou nucleotídeos em comprimento, oumais preferencialmente sobre uma região que tem cerca de 75-100 aminoácidosou nucleotídeos de comprimento.

Por comparação de seqüência, tipicamente uma seqüência age comouma seqüência de referencia, a qual as seqüências de teste são comparadas.Quando se usa um algoritmo de comparação de seqüência, as seqüências de testee de referência são introduzidas num computador, subseqüências coordenadassão designadas, se necessário, e os parâmetros do programa de algoritmo deseqüência são designados. Parâmetros de programa padrões podem ser usados,ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação deseqüência então calcula a porcentagem de identidade das seqüências para asseqüências de teste em relação à seqüência de referência, com base nosparâmetros do programa.

Uma "janela de comparação", como aqui usado, inclui referência a umsegmento de qualquer número de posições contíguas, selecionados do grupo queconsiste de 20 a 600, freqüentemente de cerca de 50 a cerca de 200, maisfreqüentemente cerca de 100 a cerca de 150 em que um seqüência pode sercomparada a uma seqüência de referência de mesmo número de posiçõescontíguas após as duas seqüências terem sido otimamente alinhadas. Os métodosde alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos no estadoda arte. Alinhamentos ótimos de seqüências para comparação podem serconduzidos, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman(1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, por algoritmo de alinhamento de homologia deNeedleman e Wunsch (1970) I. Mol. Biol. 48:443, pela pesquisa pelo método dasimilaridade de Pearson e Lipman (1988) Proc. Nat'! Acad. Sei. USA 85:2444, pelaimplementação computadorizada destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA eTFASTA no software "Wisconsin Genetics", do "Genetics Computer Group", 575Science Dr., Madison, Wl), ou pelo alinhamento manual e inspeção visual {ver, porexemplo, Ausubel et ai, Current Protocols in Molecular Biology (suplemento de1995)}.

Um exemplo de um algoritmo útil é o algoritmo BLAST 2.0, que édescrito por Altschul et al. (1980) J. Mol. Bioi 215:403-410, respectivamente. Osoftware para realizar as análises do BLAST é disponibilizado ao público peloCentro Nacional de Informação em Biotecnologia (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Este algoritmo envolve primeiro identificar pares de seqüência de estatística alta(HSPs) pela identificação de palavras curtas ou comprimento W numa seqüênciade pesquisa, que tanto combina ou satisfaz alguma estatística T limitepositivamente valorada quando alinhada com uma palavra de mesmo comprimentonuma seqüência de uma base de dados. T é referido como o limite estatístico dapalavra vizinha (Altschul et al, supra). Estas palavras vizinhas alvo iniciais agemcomo sementes para se iniciar as buscas para encontrar as HSPs mais longasque as contém. As palavras alvo são estendidas em ambas as direções junto comcada seqüência tanto quanto a estatística de alinhamento cumulativa possa seraumentada. Estatísticas cumulativas são calculadas utilizando, para seqüênciasnucleotídicas, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par deresíduos que combinam; sempre >0) e N (pontuação de penalidade para resíduosque não combinam; sempre <0). Para seqüências de aminoácidos, uma matriz depontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão das palavrasalvo em cada direção é interrompida quando: as pontuações de alinhamentocumulativas caem de uma quantidade X a partir do valor máximo alcançado; apontuação cumulativa vai a zero ou menos, devido ao acúmulo de um ou maisalinhamento de resíduo de pontuação negativa; ou o final de ambas seqüências éalcançado. Os parâmetros do algoritmo BLAST W, T e X determinam àsensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (paraseqüências nucleotídicas) utiliza como padrões um comprimento da palavra (W) de11, uma expectativa (E) ou 10, M=5, N=4' e uma comparação de ambas as fitas.Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTP utiliza como padrões umcumprimento de palavra de 3 e uma expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuaçãoBLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915)alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, e uma comparação deambas as fitas.

O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística desimilaridade entre duas seqüências {ver, por exemplo, Karlin e Altschul (1993)Proc. Nati Acad. Sei. USA 90: 5873-5787}. Uma medida de similaridade fornecidapelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N))1 que fornece umaindicação de probabilidade para qual uma combinação entre duas seqüências denucleotídeos ou aminoácidos ocorreria por modificação. Por exemplo, um ácidonucléico é encontrado similar a uma seqüência de referência se a menorprobabilidade de soma numa comparação do ácido nucléico de teste com o ácidonucléico de referência for menor do que cerca de 0,2, mais preferivelmente menordo que cerca de 0,01, e ainda mais preferível menor do que cerca de 0,001.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 ilustra esquematicamente o alinhamento parcial daseqüência de aminoácidos a partir de uma variedade de domínios-A da classereceptores de LDL (SEQ ID NOS: 38-50) para demonstrar as cisteínasconservadas. A conectividade das cisteínas nas três pontes dissulfeto do domíniodobrado é ilustrado esquematicamente na seqüência consenso (SEQ ID NO: 51).Resíduos cujas cadeias laterais contribuem para a ligação de cálcio sãodesignados com um asterisco na seqüência consenso.

A figura 2, painel A ilustra esquematicamente um exemplo de umdomínio-A. O painel A ilustra esquematicamente os aminoácidos conservados numdomínio-A (SEQ ID NO: 52) de cerca de 40 aminoácidos de comprimento. Osresíduos de cisteína conservados são indicados por C, e os aminoácidosnegativamente carregados conservados são indicados por um círculo com um sinalde menos ("-"). Os círculos com um "H" indicam um resíduo hidrofóbicoconservado. O painel B esquematicamente ilustra dois domínios-A dobradosconectados com um ligante. O painel B também indica dois sítios de ligação decálcio, os círculos escuros com Ca+2, e as três pontes dissulfeto dentro de cadadomínio-A dobrado por um total de 6 pontes dissulfeto.

A figura 3 indica alguns dos Iigantes reconhecidos pelos membros deocorrência natural da família dos receptores de LDL1 que incluem inibidores,proteases, complexos de proteases, complexos carreadores de vitamina, proteínasenvolvidas no metabolismo de lipoproteína, Iigantes não humanos, antibióticos,vírus e outros.

A figura 4 esquematicamente ilustra um esquema geral para aidentificação de domínios monoméricos que se ligam a um ligante, isolamento dosdomínios monoméricos selecionados, criação de multímeros dos domíniosmonoméricos selecionados pela união dos domínios monoméricos selecionadosem várias combinações e varredura dos multímeros para identificar os multímerosque compreendem mais do que um monômero que se liga a um ligante.

A figura 5 é uma representação esquemática de uma outra estratégiade seleção (seleção guiada). Um domínio monomérico com propriedades deligação apropriadas é identificado a partir de uma biblioteca de domíniosmonoméricos. O domínio monomérico identificado é então ligado aos domíniosmonoméricos a partir de uma outra biblioteca de domínios monoméricos paraformar uma biblioteca de multímeros. A biblioteca de multímeros é pesquisada paraidentificar um par de domínios monoméricos que se liga simultaneamente ao alvo.Este processo pode então ser repetido até as propriedades ótimas de ligação serobtidas no multímero.

A figura 6 descreve um alinhamento de domínios-A (SEQ ID NOS: 53-269). No topo da figura, pequenas letras (a-q) indicam resíduos conservados.

A figura 7 ilustra várias possíveis conformações anticorpo-monômeroou multímero. Em algumas realizações, o monômero ou multímero substitui ofragmento Fab do anticorpo.

A figura 8 descreve uma possível conformação de um multímero dainvenção que compreende pelo menos um domínio monomérico que se liga a umamolécula de extensão de meia vida e outros domínios monoméricos se ligam a umou opcionalmente dois ou mais moléculas alvo. Na figura, dois domíniosmonoméricos se ligam a duas primeiras moléculas alvo. Opcionalmente, os doisdomínios monoméricos podem se ligar a diferentes sítios numa primeira moléculaalvo (não descrito).

A figura 9 mostra possíveis estruturas de polipeptídios da invençãoque evitam a interação de IL-6/IL-6R.

A figura 10 ilustra o soro de meia vida em macacos de monômerosque se ligam a IgG.

Descrição Detalhada da Invenção

I. Introdução

A presente invenção fornece proteínas de ocorrência não natural quese ligam a IL-6. Geralmente, as proteínas da presente invenção compreendem umdomínio que se liga a IL-6. Estes domínios podem ser prontamente identificadosutilizando uma variedade de polipeptídios de estrutura para gerar uma pluralidadede variantes de polipeptídios e então selecionar uma variante que se liga a IL-6. Apresente invenção deste modo, também fornece para a seleção uma proteína quese liga a IL-6. Proteínas que se ligam a IL-6 são úteis, por exemplo, para trse ligamaento, por exemplo, doenças auto-imunes e inflamatórias, câncer, doençasmetabólicas/endócrinas, doenças cardiovasculares, e doenças neurológicas. Ospolipeptídios da invenção são também úteis para detectar e quantificar IL-6. Aseqüência de aminoácidos de IL-6 é conhecida e é mostrada na SEQ ID NO: 1.

IL-6 funciona liganteo-se ao receptor de IL-6 (IL-6R).Consequentemente, em algumas realizações, os polipeptídios da invençãocompreendem pelo menos um domínio monomérico que inibe a ligação de IL-6 aoseu receptor, isto é, que age como um antagonista para evitar que IL-6 se liguee/ou ative IL-6R.

Enquanto a presente invenção fornece polipeptídios quecompreendem domínios únicos, multímeros dos domínios podem também sersintetizados e usados. Em algumas realizações, todos os domínios dos multímerosse ligam a IL-6. Em algumas destas realizações, cada um dos domínios sãoidênticos e se ligam a mesma porção (isto é, "epitopo") de IL-6. Noutrasrealizações, pelo menos alguns dos domínios no multímero se liga a diferentesporções de IL-6. Ainda em outras realizações, pelo menos alguns dos domínios dopolipeptídio se ligam a uma molécula ou moléculas outras que não IL-6 (porexemplo, um fator sangüíneo tal como soro albumina, imunoglobulina, oueritrócitos).

II. Monômeros

Domínios monoméricos podem ser cadeias polipeptídicas dequalquer tamanho. Em algumas realizações, os domínios monoméricosapresentam cerca de 25 a cerca de 500, cerca de 30 a cerca de 200, cerca de 30 acerca de 100, cerca de 35 a cerca de 50, cerca de 35 a cerca de 100, cerca de 90a cerca de 200, cerca de 30 a cerca de 250, cerca de 30 a cerca de 60, cerca de 9a cerca de 150, cerca de 100 a cerca de 150, cerca de 25 a cerca de 50, cerca de30 a cerca de 150 aminoácidos. Similarmente, um domínio monomérico dapresente invenção pode compreende, por exemplo, de cerca de 30 a cerca de 200,cerca de 25 a cerca de 180, cerca de 40 a cerca de 150, cerca de 50 a cerca de130, ou de cerca de 75 a cerca de 125 aminoácidos. Domínios monoméricospodem tipicamente manter uma conformação estável em solução, e sãofreqüentemente estável com o calor, por exemplo, estáveis a 95°C por pelo menos10 minutos sem perder a afinidade de ligação. Algumas vezes, os domíniosmonoméricos podem se dobrar independentemente em uma conformação estável.

Numa realização, a conformação estável é estabilizada por íons (por exemplo, talcomo íons metálicos ou cálcio). A conformação estável pode opcionalmentecontém pontes dissulfeto (por exemplo, pelo menos uma, duas ou três ou maispontes dissulfetos). As pontes dissulfetos podem opcionalmente ser formadasentre dois resíduos de cisteína. Em algumas realizações, domínios monoméricos,ou variantes de domínio monomérico são substancialmente idênticos asseqüências exemplificadas.

A. Ligantes de IL-6

Em alguns aspectos, a invenção fornece domíniosmonoméricos que se ligam a (por exemplo, se ligam seletivamente) um polipeptídioIL-6 ou uma porção deste. Um porção de um polipeptídio pode ser, por exemplo,pelo menos 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100 ou mais aminoácidos contíguos dopolipeptídio. Em algumas realizações, os monômeros da invenção se ligarão a IL-6com uma afinidade mais forte do que 10"3 M (por exemplo, 10"4 M, etc.). Emalgumas realizações, a afinidade é mais forte do que 10"4 Μ, 10"5 Μ, 10"6 Μ, 10"7 M,ou 10-8M.

Um grande número de seqüências Iigantes de IL-6 queapresentam um domínio-A estrutural foi gerado. Como descrito em detalhes nosexemplos, sete famílias (isto é, famílias 1-7, ou "Fam 1-7") de domíniosmonoméricos que se ligam a IL-6 foram identificados. Os motivos consensogerados com base nestas famílias indicam resíduos de aminoácidos comuns entreos ligantes de IL-6. Aqueles versados na arte apreciarão que posições onde nãohouve consenso (marcado com um "X") pode ser qualquer aminoácido. Emalgumas realizações, os aminoácidos nas posições "X" serão selecionados a partirde aminoácidos nas posições análogas de um dos Iigantes de IL-6 exemplificadostanto a partir da mesma família quanto de uma família diferente.

A família 1 possui o seguinte motivo consenso (SEQ ID NO: 27):

CX[AS][DN]EFXCXXGXC[ILV]XXAXXCDGV[DN]DCXDNSDEXXC[AST]XX[AST]

Seqüências de exemplo compreendendo o motivo da família 1 de IL-6são mostrados nos exemplos. Referências aos monômeros ou multímeros deligantes de IL-6 englobam cada uma das seqüências da Família 1 exemplificadasnos exemplos.A família 2 tem o seguinte motivo consenso (SEQ ID NO: 28):CXXXQFXC[DN]NGXCVPXXWXCDG[DE] [DN] 00Χϋ[0Ν]80ΕΧΧ0ΧΧΡ[Α8η

Seqüências de exemplo compreendendo o motivo da família 2 de IL-6são mostrados nos exemplos. Referências aos monômeros ou multímeros Iigantesde IL-6 englobam cada uma das seqüências da Família 1 exemplificadas nosexemplos.

A família 3 apresenta o seguinte motivo consenso (SEQ ID N0.29):CXXXQFQCXSG [W, Y] C [I, L, F]XXXW[V,L]CDGXNDCEDXSDEXXC

Seqüências de exemplo compreendendo o motivo da família 3 de IL-6são mostrados nos exemplos. Referências aos monômeros ou multímeros Iigantesde IL-6 englobam cada uma das seqüências da Família 3 exemplificadas nosexemplos.

A família 4 apresenta o seguinte motivo consenso (SEQ ID N0:30):CXXX[EQ]FXGXXGXC[ILV]XXXXXCDGX[DN]DCXDXSDEXX(XX)C

Seqüências de exemplo compreendendo o motivo da família 4 de IL-6 são mostrados nos exemplos. Referências aos monômeros ou multímerosIigantes de IL-6 englobam cada uma das seqüências da Família 4 exemplificadasnos exemplos.

A família 5 apresenta o seguinte motivo consenso (SEQ ID NO:31):CX [A, Ρ] X [E, Q] FXCXXGQC [I, L] PXXXXCDGX [D, N] DCXDXSDEXXC

Seqüências de exemplo compreendendo o motivo da família 5 de IL-6 são mostrados nos exemplos. Referências aos monômeros ou multímerosIigantes de IL-6 englobam cada uma das seqüências da Família 5 exemplificadasnos exemplos.

A família 6 apresenta o seguinte motivo consenso (SEQ ID NO:32):

CXXX[EQ]FXCX(X)SXXC[ILV]XX[DN]W[ILV]CDGVNDCXDXSDEXGCXXXT

Seqüências de exemplo compreendendo o motivo da família 6 de IL-6 são mostrados nos exemplos. Referências aos monômeros ou multímerosIigantes de IL-6 englobam cada uma das seqüências da Família 6 exemplificadasnos exemplos.A família 7 apresenta o seguinte motivo consenso (SEQ ID NO:33):

CL[AS]X[EQ]FXCXNGXCIP[KQR]XWVCDGDNDC[ILV]DXSDE(P)XXCX[EKQ]XT

Seqüências de exemplo compreendendo o motivo da família 7 de IL-6são mostrados nos exemplos. Referências aos monômeros ou multímeros Iigantesde IL-6 englobam cada uma das seqüências da Família 7 exemplificadas nosexemplos.

Como aqui descrito, os domínios monoméricos podem ser ligadospara formar multímeros que se ligam ao mesmo alvo. A presente invenção fornecepolipeptídios que compreendem tanto homo- (isto é, pelo menos dois monômerosidênticos) e hetero- (isto é, monômeros diferentes que se ligam ao mesmo alvo)multímeros. Dímeros e trímeros de exemplo são mostrados nos exemplos.

Vários motivos de família de trímeros de IL-6 foram identificados combase na similaridade entre as seqüências. Ver exemplo 7. Os motivos consensogerados com base nestas famílias indicam resíduos de aminoácidos comuns entreos trímeros de IL-6. As pessoas versadas na arte apreciarão que as posições ondenão há consenso (marcadas com um "X") podem ser qualquer aminoácido. Emalgumas realizações, o aminoácido nas posições "X" será selecionado a partir deaminoácidos na posição análoga de um dos Iigantes de IL-6 exemplificados tanto apartir da mesma família quanto uma família diferente.

Trímeros Iigantes de IL-6 de exemplo incluem os seguintes (SEQID NOS: 270-278):

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT;

CRADEFQCGSGRCVPADWLCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT;CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCL

PQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTQHT;

CQANEFTCSSGNCLSPALLCDGVDDCGDNSDETYCASPAPTCLPSQFQ 'CGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDG EDDCVDSSDEASCQPPT;

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGSGYCLSQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT;

CESDQFQCDSGHCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGV NDCADNSDEEDCTEHT; e

B. Ligantes IgG e Soro de Extensão de Meia Vida

A invenção ainda fornece domínios monoméricos que se ligam a (porexemplo, se ligam seletivamente) um fator sangüíneo (por exemplo, soro albumina,imunoglobulina ou eritrócitos). Em algumas realizações, os monômeros dainvenção se ligarão a um fator de sangüíneo com uma afinidade menor do que 10"M (sito é, se liga mais forte do que uma afinidade de 10"3 M). Em algumasrealizações, a afinidade é menor do que 10"4 Μ, 10"5 Μ, 10"6 M, KT7 M ou KT8 M.

Em algumas realizações, os domínios monoméricos se ligam a umpolipeptídio de imunoglobulina ou uma porção desta.

Duas famílias (isto é, famílias 2 e 3 de domínio A de IgG) de domíniosmonoméricos que se ligam a imunoglobulina foram identificadas.

A família 2 de IgG apresenta o seguinte motivo consenso (SEQ IDNO: 279): [EQ]FXCRXCTXRC[IV]XXXW[ILV]CDGXXDCXD[DN]SDE

Seqüências de exemplo que compreendem o motivo da família 2 deIgG são mostradas nos exemplos. Referências aos monômeros ou multímerosligantes de IgG englobam cada seqüência da família 2 exemplificada nosexemplos.

A família 3 de IgG apresenta ambos os seguintes motivos consenso(SEQ ID NOS: 280 e 281):

CXSSGRCIPXXWVCDGXXDCRDXSDE; ouCXSSGRCIPXXWLCDGXXDCRDXSDE

Seqüências de exemplo que compreendem o motivo da família 3 deIgG são mostradas nos exemplos. Referências aos monômeros ou multímerosligantes de IgG englobam cada seqüência da família 3 exemplificada nosexemplos.

Domínios monoméricos que se ligam a células vermelhas do sangue(CVS) ou soro albumina (CSA) são descritos na patente US 2005/0048512, eincluem, por exemplo, SEQ ID NOS: 282-285:

CVSA CRSSQFQCNDSRICIPGRWRCDGDNDCQDGSDETGCGDSHILPFSTPGPST

CVSB CPAGEFPCKNGQCLPVTWLCDGVNDCLDGSDEKGCGRPGPGATSAPAA

CVS11 CPPDEFPCKNGQCIPQDWLCDGVNDCLDGSDEKDCGRPGPGATSAPAA

CSA-A8 CGAGQFPCKNGHCLPLNLLCDGVNDCEDNSDEPSELCKALT

A presente invenção fornece um método para estender a meia vidano soro de uma proteína, incluindo, por exemplo, um multímero da invenção ouuma proteína de interesse num animal. A proteína de interesse pode ser qualquerproteína terapêutica, profilática, ou de outra funcionalidade desejável. Este métodocompreende primeiro fornecer um domínio monomérico que tenha sido identificadocomo uma proteína Iigante que se liga especificamente a um extensor da meia vidatal como uma molécula ou célula carreadora sangüínea, tal como soro albumina(por exemplo, soro albumina humana), IgG, células vermelhas do sangue, etc. Omonômero Iigante extensor da meia vida é então covalentemente ligado a um outrodomínio monomérico que apresenta uma afinidade de ligação pela proteína deinteresse (por exemplo, IL-6 ou um alvo diferente). Esta formação de complexoresulta na extensão da meia vida que protege o multímero e/ou as proteínasligadas da degradação proteolítica e/ou outra remoção do multímero e/ou dasproteínas e deste modo estendem a meia vida da proteína e/ou multímero. Umavariação deste uso da invenção inclui o monômero Iigante extensor da meia vidacovalentemente ligado a proteína de interesse. A proteína de interesse pode incluirum domínio monomérico, um multímero de domínios monoméricos, ou uma drogasintética. Alternativamente, os monômeros que se ligam tanto a imunoglobulinas oueritrócitos poderiam ser gerados utilizando o método acima e poderiam ser usadospara a extensão da meia vida.

Os multímeros Iigantes extensores da meia vida são tipicamentemultímeros de pelo menos dois domínios, domínios quiméricos, ou domíniosmutagenizados (isto é, um que se liga a IL-6 e um que se liga a molécula ou célulacarreadora sangüínea). Domínios adequados incluem todos aqueles descritos aqui,que são ainda pesquisados e selecionados quanto à ligação com um extensor dameia vida. Os multímeros Iigantes extensores de meia vida são gerados de acordocom os métodos para produzir multímeros aqui descritos, utilizando, por exemplo,domínios monoméricos previamente pesquisados quanto à atividade Iiganteextensora da meia vida. A meia vida no soro de uma molécula pode ser estendidapara ser, por exemplo, por pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 80,90, 100, 150, 200, 250, 400, 500 ou mais horas.

O domínio monomérico de meia vida estendida pode ser ligado aoterminal N-, C- de ambas as moléculas alvo (por exemplo, Iigante de IL-6) -domínio monomérico ligante.

Seqüências de exemplos de polipeptídios que se ligam a IL-6 e IgGincluem as seguintes (SEQ ID NOS: 286-339):

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCT

EHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCRADEFQCGSGRC

VPADWLCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDC

EDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEH

T

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCLPDQFRCGNGQ

CIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGEND

CEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCT

QHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCQANEFTCSSGN

CLSPALLCDGVDDCGDNSDETYCASPAPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGEN

DCEDSSDEANCAGSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDDCVDSSDEASC

QPPT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCLPDQFRCGNGQGIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGEND

CEDGSDEA

NCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEADCAAPT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCLPDQFRCGNGQ

CIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGSGYCLSQRWVCDGEND

CEDGSDEA

NCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCESDQFQCDSGH

CVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGEND

CEDGSDEA

NCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCGASQFQCGSGY

CISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLSADWLCDGVndcadnsd

eegcppptclpdqfqcgsgyclpqawvcdgendcedgsdetncpart

chptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeenckprtclpdqfrcgng

qcipldwvcdgvndcpddsdeegcpprtcapsqfqcgsgycisqrwvcdgend

cedgsdea

ncagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedctehtchptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeenckprtclpdqfrcgngqcipldwvcdgvndcadnsdetgcptrtclpsqfqcgsgycisqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedcte

ht

chptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeenckprtcradefqcgsg

rcvpadwlcdgvndcadnsdetgcptrtclpsqfqcgsgycisqrwvcdgen

dcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedct

eht

chptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeenckprtclpdqfrcgng

qcipldwvcdgvndceddsdeescpprtclpdqfqcgsgyclpqrwvcdgen

dcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedct

qht

chptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeenckprtcqaneftcssgnclspallcdgvddcgdnsdetycaspaptclpsqfqcgsgycisqrwvcdgendcedssdeancagsvptcqpgeftcesgrclplrwlcdgeddcvdssdeasc

qppt

chptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeenckprtclpdqfrcgng

qcipldwvcdgvndceddsdeescpprtclpdqfqcgsgyclpqrwvcdgen

dcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeadc

aapt

chptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeenckprtclpdqfrcgng

qcipldwvcdgvndceddsdeescpphtclpdqfqcgsgyclsqrwvcdgen

dcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedct

ehtCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCKPRTCESDQFQCDSGHCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEE

DCTEHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCKPRTCGASQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLSADWLCDGVNDCADNSDEEGCPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSDETNCP

ART

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNS

DEEDCTEHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDE

EDCTEHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCRADEF

QCGSGRCVPADWLCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWV

CDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNS

DEEDCTEHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDE

EDCTQHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCQANEFT

CSSGNCLSPALLCDGVDDCGDNSDETYCASPAPTCLPSQFQCGSGYCISQRWV

CDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDDCVDSSD

EASCQPPT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSD

EADCAAPT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCLPDQFR

CGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGSGYCLSQRWVC

DGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSD

EEDCTEHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCESDQF

QCDSGHCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWV

CDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNS

DEEDCTEHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCGASQ

FQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLSA

DWLCDGVNDCADNSDEEGCPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCED

GSDETNCPART

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCAD

NSDEEDCTEHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPD

QFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRW

VCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCPRAWRCDGVNDCADNS

DEEDCTEHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCRAD

EFQCGSGRCVPADWLCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQR

WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCAD

NSDEEDCTEHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCAD

NSDEEDCTQHTchptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeencsapaseppgslcqaneftcssgnclspallcdgvddcgdnsdetycaspaptclpsqfqcgsgycisqrwvcdgendcedssdeancagsvptcqpgeftcesgrclplrwlcdgeddcvdssdeascqppt

chptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeencsapaseppgslclpdqfrcgngqcipldwvcdgvndceddsdeescpprtclpdqfqcgsgyclpqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeadcaapt

chptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeencsapaseppgslclpdqfrcgngqcipldwvcdgvndceddsdeescpphtclpdqfqcgsgyclsqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedcteht

chptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeencsapaseppgslcesdqfqcdsghcvplnwvcdgvndcvdgsdeagcpprtclpgqfqcgsgycisqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedcteht

chptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeencsapaseppgslcgas

qfqcgsgycisqrwvcdgendcedssdeancagsvptclpsefqcrdskiclsadwlcdgvndcadnsdeegcppptclpdqfqcgsgyclpqawvcdgendcedgsdetncpart

clpdqfrcgngqcipldwvcdgvndcpddsdeegcpprtcapsqfqcgsgycisqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedctehtclssefqcqssgrciplawvcdgdndcrddsdeksckprclpdqfrcgngqcipldwvcdgvndcadnsdetgcptrtclpsqfqcgsgycisqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedctehtclssefqcqssgrciplawvcdgdndcrddsdeksckprcradefqcgsgrcvpadwlcdgvndcadnsdetgcptrtclpsqfqcgsgycisqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedctehtclssefqcqssgrciplawvcdgdndcrddsdeksckprt

clpdqfrcgngqcipldwvcdgvndceddsdeescpprtclpdqfqcgsgyclpqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgv

ndcadnsdeedctqhtclssefqcqssgrciplawvcdgdndcrddsdeksckprt

cqaneftcssgnclspallcdgvddcgdnsdetycaspaptclpsqfqcgsgycisqrwvcdgendcedssdeancagsvptcqpgeftcesgrclplrwlcdged

dcvdssdeascqpptclssefqcqssgrciplawvcdgdndcrddsdeksckprt

clpdqfrcgngqcipldwvcdgvndceddsdeescpprtclpdqfqcgsgyc

lpqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgv

ndcadnsdeadcaaptclssefqcqssgrciplawvcdgdndcrddsdekscicprt

clpdqfrcgngqcipldwvcdgvndceddsdeescpphtclpdqfqcgsgyc

lsqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgv

ndcadnsdeedctehtclssefqcqssgrciplawvcdgdndcrddsdeksckprt

cesdqfqcdsghcvplnwvcdgvndcvdgsdeagcpprtclpgqfqcgsgycisqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedctehtclssefqcqssgrciplawvcdgdndcrddsdeksckprt

cgasqfqcgsgycisqrwvcdgendcedssdeancagsvptclpsefqcrdsk

iclsadwlcdgvndcadnsdeegcppptclpdqfqcgsgyclpqawvcdgend

cedgsdetncpartclssefqcqssgrcplawvcdgdndcrddsdeksckprt

clpdqfrcgngqcipldwvcdgvndcpddsdeegcpprtcapsqfqcgsgyci

sqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvnd

cadnsdeedctehtchptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeencsapaseppgsl

clpdqfrcgngqcipldwvcdgvndcadnsdetgcptrtclpsqfqcgsgycisqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedctehtchptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeencsapaseppgsl

cradefqcgsgrcvpadwlcdgvndcadnsdetgcptrtclpsqfqcgsgy

cisqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedctehtchptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeencsapaseppgsl

clpdqfrcgngqcipldwvcdgvndceddsdeescpprtclpdqfqcgsgyclpqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedctqhtchptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeencsapaseppgsl

cqaneftcssgnclspallcdgvddcgdnsdetycaspaptclpsqfqcgsgy

cisqrwvcdgendcedssdeancagsvptcqpgeftcesgrclplrwlcdged

dcvdssdeascqpptchptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeencsapaseppgsl

clpdqfrcgngqcipldwvcdgvndceddsdeescpprtclpdqfqcgsgyclpqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeadcaaptchptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeencsapaseppgsl

clpdqfrcgngqcipldwvcdgvndceddsdeescpphtclpdqfqcgsgyc

lsqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedctehtchptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeencsapaseppgsl

cesdqfqcdsghcvplnwvcdgvndcvdgsdeagcpprtclpgqfqcgsgycisqrwvcdgendcedgsdeancagsvptcpsdefrcrngrciprawrcdgvndcadnsdeedctehtchptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeencsapaseppgsl

cgasqfqcgsgycisqrwvcdgendcedssdeancagsvptclpsefqcrdskiclsadwlcdgvndcadnsdeegcppptclpdqfqcgsgyclpqawvcdgendcedgsdetncpartchptgqfrcrssgrcvsptwvcdgdndcgdnsdeenCSAPASEPPGSL

C. Discussão dos Domínios Monoméricos

Domínios monoméricos que são particularmente adequados parauso na prática da presente invenção são domínios ricos em cisteína quecompreende pontes dissulfeto. Domínios ricos em cisteína empregados na práticada presente invenção tipicamente não formam uma hélice a, uma folha P1 ou umaestrutura P-cilíndrica. Tipicamente, as pontes dissulfetos promovem o dobramentodo domínio numa estrutura tridimensional. Freqüentemente, os domínios ricos emcisteína apresentam pelo menos duas pontes dissulfeto, mais tipicamente pelomenos três pontes dissulfeto. Em algumas realizações, pelo menos 5, 10, 15 ou20% dos aminoácidos num domínio monomérico são cisteínas.

Domínios podem ter qualquer número de características. Porexemplo, em algumas realizações, os domínios apresentam baixa ou nenhumaimunogenicidade num animal (por exemplo, um humano). Domínios podemapresentar um tamanho pequeno. Em algumas realizações, os domínios sãosuficientemente pequenos para penetrar na pele ou outros tecidos. Domíniospodem apresentar uma faixa de meias vidas ou estabilidade in vivo.

Domínios monoméricos ilustrativos adequados para uso na práticada presente invenção incluem, por exemplo, um domínio tipo EGF, um domínioRringle, um domínio de fibronectina tipo I, um domínio de fibronectina tipo II, umdomínio de fibronectina tipo III, um domínio PAN1 um domínio Gla, um domínioSRCR, um domínio inibidor Kunitz/tripsina pancreática bovina, um domínio inibidorde serina protease tipo Kazal, um domínio trevo (tipo-P), um domínio de fatorWillebrand tipo C, uma domínio tipo anafilatoxina, um domínio CUB, umarepetição de tiroglobulina tipo I, um domínio classe A de receptor de LDL, umdomínio sushi, um domínio de ligação, um domínio MAM, um domínio de fatorWillebrand tipo A, um domínio de somatomedina B, um domínio de centro dequatro dissulfetos tipo WAP, um domínio F5/8 tipo C, um domínio de hemopexina,um domínio SH2, um domínio SH3, um domínio EGF tipo laminina, um domínioC2, e outros domínios conhecidos por aqueles versados na arte, bem comoderivados e/ou variantes destes.

Em algumas realizações, domínios monoméricos adequados (porexemplo, domínios com a habilidade de dobrar independentemente ou comalguma ajuda limitada) pode ser selecionados a partir de domínios de famílias deproteínas que contém estruturas tridimensionais p-sanduíche ou P-cilíndrica comodefinido pelas ferramentas de análise computacional de seqüência como aferramenta de busca de arquitetura modular simples (SMART), ver Shultz eí al,SMART: a web-based tool for the study of genetically mobile domains, (2000)M, TlPin Acids Research 28(1 ):231-234 ou CATH {ver Pearl eí al, Assigninggenomic sequences to CATH, (2000) Niicleic Acids Research 28(1 ):277-282}.

Numa outra realização, os domínios monoméricos da presenteinvenção incluem domínios outros que não um domínio de fibronectina tipo III, umdomínio naticalina e um domínio tipo Ig a partir de CTLA-4. Alguns aspectosdestes domínios são descritos no documento WOO 1/64942 intitulada "Proteinscaffolds for antibody mimics and other binding proteins" por Lipovsek et al,publicado em 07/09/2001, WO 99/16873 intitulado "Anticalins" por Beste et al,publicado em 8/04/1999 e WO 00/60070 intitulado "A polypeptide structure for useas a scaffold" por Desmet, et al., publicado em 12/10/2000.

Como descrito acima, domínios monoméricos são opcionalmentericos em cisteína. Domínios monoméricos ricos em cisteína adequados incluem,por exemplo, o domínio classe A receptor de LDL ("Domínio A") ou o domínioEGF. Os domínios monoméricos também podem ter um grupo de resíduosnegativamente carregados.

Outras características de domínios monoméricos podem incluir acapacidade de se ligar à Iigantes ou a capacidade de ligar um íon (p. ex„ ligaçãode Ca+2 pelo domínio-A de receptor de LDL). Os domínios monoméricos que seligam a íons para manter a sua estrutura secundária incluem, p. ex„ domínio A,domínio de EGF, Mão EF (p. ex„ tal como os encontrados no presente emcalmodulina e troponina C), domínio de Caderina1 Iecitina tipo-C, domínio de C2,Anexina, Gla-domínio, domínio Trombospondina tipo 3, todos dos quais ligamcálcio, e dedos de zinco (p. ex„ tipo C2H2 tipo C3HC4 (dedo de ANEL), domíniode ligação de zinco, dedo de PHD, dedo de zinco GATA, dedo de zinco FYVE,dedo de zinco de B-caixa), que ligam zinco. Sem pretender limitar a invenção,acredita-se que a ligação do íon fornece a estabilidade da estrutura secundáriaenquanto fornece flexibilidade suficiente para permitir numerosas conformaçõesdependendo da seqüência primária.

Como aqui descrito, domínios monoméricos podem ser selecionadospara a capacidade de se ligar a alvos outros que não o alvo que um domíniohomólogo de ocorrência natural pode ligar. Assim, em algumas realizações, ainvenção fornece domínios monoméricos (e multímeros que compreendem taismonômeros) que não se ligam ao alvo ou a classe ou família de proteínas alvo queum domínio substancialmente idêntico de ocorrência natural pode se ligar.

As características de um domínio monomérico podem incluir acapacidade de dobrar-se independentemente e a capacidade de formar umaestrutura estável. Assim, a estrutura do domínio monomérico muitas vezes éconservada, embora a seqüência polinucleotídica que codifica o monômero nãoprecise ser conservada. Por exemplo, a estrutura de domínio-A é conservada entreos membros da família do domínio-A, enquanto a seqüência de ácido nucléico dodomínio-A não é. Assim, por exemplo, um domínio monomérico é classificadocomo um domínio-A pelos seus resíduos de cisteína e suas afinidades por cálcio,não necessariamente por sua seqüência de ácido nucléico. Ver, as figuras 1 e 2.

Especificamente, os domínios-A (às vezes chamados "repetições dotipo complemento" ou " domínios classe A ou tipo receptor de LDL") contêmaproximadamente 30-50 ou 30-65 aminoácidos. Em algumas realizações, osdomínios compreendem aproximadamente 35-45 aminoácidos e em alguns casosaproximadamente 35-40 aminoácidos. Dentro de 30-50 aminoácidos, háaproximadamente 6 resíduos de cisteína. Das seis cisteínas, as pontes dissulfetotipicamente são encontradas entre as cisteínas seguintes: C1 e C3, C2 e C5, C4 eC6. Os resíduos de cisteína do domínio são dissulfeto ligados para formar umaporção compacta, estável, funcionalmente independente. Ver, figura 3. Gruposdessas repetições compõem um domínio de ligação de Iigante1 e agrupamentodiferencial pode conferir especificidade com relação à ligação do ligante.

Seqüências de domínio A de exemplo e seqüências consenso sãorepresentadas nas figuras 1 e 2. Uma seqüência consenso típica útil paraidentificar domínios A é a seguinte: C-[VILMA]-X(5)C-[DNH]-X(3)-[DENQHT]-C-X(3,4r[STADE]-[DEH]-[DE]-X(i;5)-C (SEQ ID NO: 340), onde os resíduos entre colchetesindicam resíduos possíveis em uma posição. " Xw" indica o número de resíduos.Esses resíduos podem ser qualquer resíduo aminoácido. Parênteses contendodois números refere-se à faixa de aminoácidos que podem ocupar aquela posição(p. ex.,"[DEl-X(Il5)-C" significa que os aminoácidos DE são seguidos por 1, 2, 3, 4,ou 5 resíduos, seguidos por C). Esta seqüência consenso apenas representa aporção de um domínio A que começa na terceira cisteína. Um segundo consenso écomo se segue: C-X{3-i5rC-X(4-i5)-C-X(^^

X(2.8)C (SEQ ID NO: 341). O segundo consenso prediz resíduos de aminoácidosque geram todos os seis resíduos cisteína. Em algumas realizações, variantes dodomínio A compreendem seqüências substancialmente idênticas a qualquer umadas seqüências acima descritas. Observe que a referência a "domínio classe A dereceptor de LDL", para o propósito desta invenção, não é pretendido indicar aorigem ou propriedades de ligação do domínio.

Exemplos adicionais de domínios A incluem a seguinte seqüência:CaX3-i5CbX3.i5CcX6.7Cd(D,N)X4CeX4.6DEX2.8Cf (SEQ ID NO: 342) em que C écisteína, Xn-m representa entre η e m o número de aminoácidosindependentemente selecionados, e (D,N) indicam que a posição pode ser D ou N;e em que Oa-Cc, Cb-Ce e Cd-Cfformam pontes dissulfeto.

Até agora, pelo menos 190 domínios-A humanos de ocorrêncianatural são identificados baseados em seqüências de cDNA. Ver, p. ex., a figura 6.As proteínas de exemplo que contém domínios-A de ocorrência natural incluem, p.ex., componentes de complemento (p. ex., C6, C7, C8, C9, e fator I), as serinasproteases (p. ex., enteropeptidase, matriptase, e corina), proteínas transmembrana(p. ex., ST7, LRP3, LRP5 e LRP6) e receptores endócitos (p. ex., receptor sortilina-relacionado, receptor de LDL1 VLDLR1 LRP1, LRP2, e ApoER2). Domínios A evariantes de domínio-A podem ser prontamente empregados na prática dapresente invenção como domínios monoméricos e variantes destes. Maiordescrição de domínios A pode ser encontrada nas seguintes publicações ereferências aqui citadas: Howell e Hertz1 A família genética de receptor de LDL:funções de sinalização durante o desenvolvimento, (2001) Current Opinion inNeurobioloqv 11:74-81; Herz (2001), supra; Krieger11 Ό melhor" dos colesteróis,"pior" dos colesteróis: um conto de dois receptores, (1998) PNAS 95: 4077-4080;Goldstein e Brown1 O Quarteto de Colesterol1 (2001) Science. 292: 1310-1312; e,Moestrup e Verroust1 "Megalin-and Cubilin-mediated Endocytosis of Protein-BoundVitamins, Lipids, and Hormones in Polarized Epithelia", (2001) Ann. Ver. Nutr.21:407-28.

Um número de outros tipos de domínio também podem ser usadospara gerar domínios monoméricos Iigantes de IL-6.

Exemplos de domínios monoméricos de EGF incluem a seqüência: oCaX3.i4CbX3.rCcX4.i6CdXi.2CeX8-23Cf (SEQ ID NO: 343) em que C é cisteína, Xtvmrepresenta entre η e m o número de aminoácidos independentementeselecionados; e em que Ca-Cci Cb-Ce e Cd-Cfformam pontes dissulfeto.

Cada um dos domínios descritos abaixo emprega motivos deexemplos (isto é, estruturais). Certas posições são marcadas com x, indicando quequalquer aminoácido pode ocupar a posição. Essas posições podem incluir umnúmero de possibilidades de aminoácidos diferentes, por meio destes levando auma diversidade de seqüências e assim afinidade por moléculas alvo diferentes. Ouso de colchetes em motivos indica aminoácidos possíveis alternativos numaposição (p. ex., "[ekq]" indica que E1 o K ou Q pode estar naquela posição). Comoaqui usado, o uso de parênteses em um motivo de seqüência indica que aquelasposições dentro dos parênteses podem estar presentes ou ausentes (p. ex.,"([ekq])" indica que a posição está ausente ou E1 K1 ou Q pode estar naquelaposição). Quando mais de um "x" é usado entre parênteses (p. ex., "xx"), cada χrepresenta uma posição possível. Assim "xx" indica que zero, um ou dois(6) Ci[nst][aegiklqrstv][adenpqrst]C2[adetgs]xgx[ikqrstv]x[aqrst]x[almrtv]xC3xxxxxxx(XXXXXXX)C4XXXXXXXXX(XX)C5XXXXC6

Em algumas realizações, as variantes de domínio de trombospondinatipo 1 compreendem seqüências substancialmente idênticas a qualquer uma dasseqüências acima descritas.

Até agora, pelo menos 1677 domínios de trombospondina deocorrência natural identificados com base em seqüências de cDNA. Proteínas deexemplo que contém os domínios de trombospondina de ocorrência naturalincluem, p. ex., proteína da via complementar (p. ex., properdina, C6, C7, C8A,C8B, e C9), proteínas de matriz extracelular (p. ex., mindina, F-espondina, SCO-espondina), proteína 2 superficial de circumsporozóito, e proteínas TRAP deplasmódio. Os domínios de Trombospondina tipo 1 são ainda descritos em, p. ex.,Roszmusz et al, BBRC 296:156 (2002); Higgins et al., J. Immunol. 155:5777-85(1995); Schultz-Cherry et al, J. Biol. Chem. 270:7304-7310 (1995); Schultz- Cherryet al, J. Biol. Chem. 269:26783-8 (1994); Bork1 FEBS Lett 327:125-30 (1993); eLeung-Hagesteijn et al, Cell 71:289-99 (1992).

Outro domínio monomérico de exemplo adequado para o uso naprática da presente invenção é o domínio de trevo. Os domínios monoméricos detrevo são tipicamente aproximadamente 30-50 ou 30-65 aminoácidos. Em algumasrealizações, os domínios compreendem aproximadamente 35-55 aminoácidos eem alguns casos aproximadamente 45 aminoácidos. Dentro dos 35-55aminoácidos, há tipicamente aproximadamente 6 resíduos de cisteína. Das seiscisteínas, as pontes dissulfeto tipicamente são encontradas entre as cisteínasseguintes: C1 e C5, C2 e C4, C3 e C6.

Até agora, pelo menos 149 domínios de trevo de ocorrência naturalidentificados com base em seqüências de cDNA. Proteínas de exemplo quecontém domínios de trevo de ocorrência natural incluem, p. ex., proteína pS2(TFF1)i peptídio espasmolítico SP (TFF2), fator de trevo intestinal (TFF3),surcease-isomaltase intestinal, e proteínas que pode estar implicadas na defesacontra infecções microbiais protegendo o epitélio (p. ex., Xenopus xPI, xP4,mucinas tegumentares Α.1 e C.1. Os domínios de trevo são além destes descritosem, p. ex„ Sands e Podolsky, Annu. Ver. Physiol. 58:253-273 (1996); Carr et al.,PNAS USA 91:2206-2210 (1994); DeA et al, PNAS USA 91:1084-1088 (1994);Hoffman et al, Trends Biochem. Sei. 18:239-243 (1993).

As seqüências de domínio de trevo de exemplo e as seqüênciasconsenso são como se segue (SEQ ID NOS: 350-355):

(1) C1(xx) xxxxxxxxxC2xx(x)xxxxxxxC3XxxxC4C5xxxxx(x)xxxxxC6

(2) Ci(xx)xxxxxxRxxC2xx(x)xxxxxxxC3xxxxC4C5xxxxx(x)xxxxxC6

(3) Ci(xx)xxxpxxRxnC2gx(x)pxitxxxC3XxxgC4C5fdxxx(x)xxxpwC6f

(4) Ci(xx)xxx[Pvae]xxRx[ndpm]C2[Gaiy][ypfst]([de]x)[pskq]x[lvap][Tsa]xx[qedk]C3XX[krln][Gnk]C4C5[Fwy][Dnrs][sdpnte]xx(x)xxx[pki][Weash]C6[Fy]

(5) Ci(xx)xxx[Pvae]xxRx[ndpm]C2[Gaiy][ypfst]([de]x)[pskq]x[lvap][Tsa]xx[keqd]C3XX[krln][Gnk]C4C5[a][Dnrs][sdpnte]xx(x)xxx[pki][Weash]C6[Fy]

(6) Ci([dnps])[adiklnprstv][dfilmv][adenprst][adelprv][ehklnqrs][adegknsv][kqr][fiklqrtv][dnpqs]C2[agiy][flpsvy][dknpqs][adfghlp][aipv][st][aegkpqrs][adegkpqs][deiknqt]C3[adeflmqrt][adegknqs][gn]C4C5[wyfh][deinrs][adgnpst][aefgqlrstw][giknsvmq]([afmprstv][degklns][afiqstv][iknpv]w)C6

Outro domínio monomérico de exemplo adequado para uso napresente invenção é o domínio de tiroglobulina. Os domínios monoméricos detiroglobulina são tipicamente aproximadamente 30-85 ou 30-80 aminoácidos. Emalgumas realizações, os domínios compreendem aproximadamente 35-75aminoácidos e em alguns casos aproximadamente 65 aminoácidos. Dentro de 35-75 aminoácidos, há tipicamente aproximadamente 6 resíduos de cisteína. Das seiscisteínas, as pontes dissulfeto tipicamente são encontradas entre as cisteínasseguintes: C1 e C2, C3 e C4, C5 e C6.

Até agora pelo menos 251 domínios de tiroglobulina de ocorrêncianatural foram identificados com base em seqüências de cDNA. A seção N-terminalde Tg contém 10 repetições de um domínio de aproximadamente 65 aminoácidosque é conhecido como as repetições tipo 1 de Tg PUBMED:3595599,PUBMED:8797845. As proteínas de exemplo de ocorrência natural que contémdomínios de tiroglobulina incluem p. ex., a classe Il de HLA associada à cadeiainvariável, proteínas marcadoras de carcinoma pancreática humana, nidogene(entactina), proteínas Iigantes de fator de crescimento tipo insulina (IGFBP)1saxifilina, inibidor de proteinase cisteína de ova de salmão (Oncorhynchus keta), eequistatina. A Tyr-1 e os domínios relacionados pertencem à família de inibidoresde proteinase 131 MEROPS, clã IX. Os domínios de tiroglobulina são, além destes,descritos em, p. ex., Molina et al, Eur. J. Biochem. 240:125-133 (1996); Guncar etal, EMBO J 18:793-803 (1999); Chong e Speicher1 DW 276:5804-5813 (2001).

As seqüências de domínio de tiroglobulina de exemplo e asseqüências consenso são como se segue (SEQ ID NOS: 356-360):

(1) C1 xxxxxxxxxxxxxxx(xxxxxxxxxx)xxxxxxxxxxxC2xxxxxxxxxxC3x(x)x(xxx)xxxxc4xc5xxxx(x)xxxxxxxxxxxxxx(xx)xc6

(2) θιχχχχχχχχχχχχχχχ(χχχχχχχχχχ)χχχχχχχΥχΡχ°2χχχ6χχχχχ0°3χ(χ)χ(χχχ)χχχxC4WC5Vxxx(x)GxxxxGxxxxxxxx(xx)xC6

(3) c1xxxxxxxxxxxxxxx(xxxxxxxxxx)xxxxxxxyxpxc2xxxGxyxxxqc3x(x)s(xxx)xx9xC4wc5Vdxx(x)GxxxxGxxxxxgxx(xx)xC6

(4)Ci[qerl]xxxxxxxxxxxxxx(xxxxxxxxxx)xxxxxxx[YfhP]xPxC2xxxGx[Yf]xx[vkr|]QC3x(x[sa]xxx)xx[Gsa]xC4[Wyf]C5V[Dna]xx(x)Gxxxx^g]xxxxxgxx(xx)xC6

Outro domínio monomérico de exemplo que pode ser usado napresente invenção é um domínio laminina-EGF. Os domínios de Laminina-EGF sãotipicamente aproximadamente 30-85 ou 30-80 aminoácidos. Em algumasrealizações, os domínios compreendem aproximadamente 45-65 aminoácidos eem alguns casos aproximadamente 50 aminoácidos. Dentro dos 45-65aminoácidos, há tipicamente aproximadamente 8 resíduos de cisteína queinteragem para formar 4 pontes dissulfeto. As Iamininas são um componente nãocolagenoso principal de base de membranas que mediam a adesão celular, amigração de crescimento, e a diferenciação. Elas são compostas de cadeiasdistintas, mas relacionadas, alfa, beta, e gama. As três cadeias formam umamolécula cruciforme que se compõem de um braço longo e três braços globularescurtos. O braço longo consiste de uma estrutura enrolada formada pelas trêscadeias e com ligações cruzadas através das pontes dissulfeto intercadeia.

Exemplos de seqüências de domínio e seqüências consenso deIaminina de EGF são como se segue (SEQ ID NOS: 361-363):(1)

C1XC2XXXXXX(XXX)XXC3XXX(XXXXXX)XXXXC4XC5XXXXXXXXC6XXC7XXXXXXX(XXXXX)XXXXXC8

(2) Cixc2xxxxxx(xxx)xxC3xxx(xxxxxx)xxgxC4xC5xxxxxGxxC6xxC7xxxxxxx(xxxxx)xxxxxCa

(3) CixC2[ndh]xxxxx(xxx)xxC3Xxx(xxxxxx)xxgxC4xC5XXXxxGxxC6[denq]xC7xx[gn][yfht]xxx(xxxxx)xxxxxC8

Em algumas realizações, o domínio monomérico é um domíniomonomérico de Corte/LNR, um domínio monomérico de DSL1 um domíniomonomérico Anato1 um domínio monomérico "beta integrin", e um domíniomonomérico Ca-EGF.

Em algumas realizações, o domínio monomérico Ca-EGFcompreende a seqüência seguinte (SEQ ID NO: 364): DxdEClXx(xx)xxxxC2x(xx)xxxxxC3xNxxGxfxC4x(xxx)xC5xxgxxxxxxx(xxxxx)xxxC6·

Em algumas realizações, o domínio monomérico de Corte/LNR,compreende a seqüência seguinte (SEQ ID NO: 365): ClXx(xx)xxxC2xxxxxnGxC3xxxC4 nxxxC5xxDGxDC6.

Em algumas realizações, o domínio monomérico DSL compreende aseqüência seguinte:

CixxxYygxxC2xxfC3XxxxdxxxhxxC4xxxGxxxC5XxGWxGxxCe (SEQ ID NO: 366).

O domínio monomérico Anato compreende a seqüência seguinte(SEQ ID NO: 366): CiC2xdgxxxxx(x)xxxxC3exrxxxxxx(xx) xxC4xxxfxxC5C6 (SEQ IDNO: 367).

Em algumas realizações, o domínio monomérico beta integrincompreende a seqüência seguinte (SEQ ID NO: 368):CiXxC2xxxxpxC3xwC4xxxxfxxx(gx)xxxxRC5dxxxxLxxxgC6; e "x" é qualqueraminoácido.aminoácidos podem estar naquelas posições, onde cada aminoácido éindependentemente selecionado entre qualquer aminoácido. α representa umaminoácido aromático/hidrofóbico tal como, p. ex„ W, Y, F, ou L; β representa umaminoácido hidrofóbico como, p. ex., V, I, L, A, M1 ou F; χ representa umaminoácido polar menor tal como, p. ex., G, A, S, ou Τ; δ representa umaminoácido carregado tal como, p. ex., K, R, E, Q, ou D; ε representa umaminoácido pequeno como, p. ex.; V, A, S, ou Τ; φ representa um aminoácidonegativamente carregado como, p. ex., D, E, ou N.

Domínios adequados incluem, p. ex. os domínios de trombospondinatipo 1, domínios de trevo, e domínios de tiroglobulina.

Os domínios de Trombospondina tipo 1 ("TSPI") contémaproximadamente 30-50 ou 30-65 aminoácidos. Em algumas realizações, osdomínios compreendem aproximadamente 35-55 aminoácidos e em alguns casosaproximadamente 50 aminoácidos. Dentro de 35-55 aminoácidos, há tipicamenteaproximadamente 4 a aproximadamente 6 resíduos de cisteína. Das seis cisteínas,as pontes dissulfeto tipicamente são encontradas entre as cisteínas seguintes: C1e C5, C2 e C6, C3 e C4. Os resíduos de cisteína do domínio são dissulfeto ligadaspara formar uma porção compacta, estável, funcionalmente independente quecompreende folhas beta torcidas. Os grupos dessas repetições compõem umdomínio de ligação de ligante, e o agrupamento diferencial pode conferirespecificidade com relação à ligação de ligante.

As seqüências de exemplos de seqüências de domínio TSP1 eseqüências consenso são como se segue (SEQ ID NOS: 344-349):

(1) (xxxxxx) C ι χχχ02ΧΧΧχχ(χ)χχχχχ^3Χχχχ(χχχ)χχχχχ^4χχχχχχ(χ)χχχ05(χ) xxxxC6;

(2) (WXXWXX)C1XXXC2XXXXX(X)XXXXXC3XXXX(XXX)XXXXXC4XXXXXX(X)XXXC5(X) xxxxC6;

(3) (wxxWxx)C1 sxtC2xxGxx(x)xxxxxC3xxxx(Pxx)xxxxxC4XXXXXx(x)xxxC5(x) xxxxCe

(4) (WxxWxx)Ci[Stnd][Vkaq][Tspl]C2Xx[Gq]xx(x)x[Re]x[Rktvm]x[C3vldr]xxxx([Pq]xx)xxxxx[C4ldae]xxxxxx(x)xxxC5(x)xxxxC6; e

(5) (WxxWxx)Ci[Stnd][Vkaq]ITspl]C2Xx[Gq]xx(x)x[Re]x[Rktvm]x[C3vldr]xxxx ([Pq]xx)xxxxx[C4ldae]xxxxxx(x)xxxC5(x)xxxxC6; eEm algumas realizações, C1-C5, C2-C4 e C3-C6 do domíniomonomérico de Corte/LNR forma pontes dissulfeto; e CrC5, C2-C4 e C3-C6 dodomínio monomérico de DSL forma pontes dissulfeto.

Em algumas realizações, domínio monomérico de Ca-EGFcompreende a seqüência seguinte:

D[p][Dn]EC1xx(xx)xxxxC2[pdg](dx)xxxxxC3xNxxG[sgt][a]xC4x(xxx)xC5xx[Gsn][as]xxxxxx(xxxxx)xxxC6 (SEQ ID NO: 369).

Em algumas realizações, o domínio monomérico Corte/LNR,compreende a seqüência seguinte:

C1xx(x[Pa])xxxC2x^s]xxxM[Gk]xC3[nd]x^sa]C4^s]xx[aeg]C5x[a]DGxDC6 (SEQ IDNO: 370).

CiXXx[a][ah][Gsna]xxC2xx[a]C3x[pae]xx[Da]xx[xl][Hrgk][ak]xC4[dnsg]xxGxxxC5xxG[a]xGxxC6 (SEQ ID NO: 371).

Em algumas realizações, o domínio monomérico Anato compreende aseqüência seguinte:

CiC2x[Dhtl][Ga]xxxx[plant](xx)xxxxC3[esqdat]x[Rlps]xxxxxx([gepa]x)xxC4xx[avipt][Fqvy]xxC5C6 (SEQ ID NO: 372).

Em algumas realizações, a domínio monomérico beta integrincompreende a seqüência seguinte:

CiXxC2[p]xx[ghds][Pk]xC3[X][a]C4xxxx[a]xxx([Gr]xx)x[X]xRC5[Dnae]xxxxL[pk]xx[Gn]

C6 (SEQ ID NO: 373); α ser selecionado de : w, y, f, e I; β é selecionado de : v, i, I,a, m, e f; χ é selecionado de : g, a, s, e t; δ é selecionado de : k, r, e, q, e d; ε éselecionado de : v, a, s, e t; e φ é selecionado de : d, e, e n.

Em algumas realizações, domínio monomérico Ca-EGF compreendea seqüência seguinte:

D[vilf][Dn]EC1xx(xx)xxxxC2[pdg](dx)xxxxxC3xNxxG[sgt][fy]xC4x(xxx)xC5xx[Gsn][a]xxxxxx(xxxxx)xxxC6 (SEQ ID NO:374).

C1xx(x[yiflv])xxxC2x[dens]xxx[Nde][Gk]xC3[nd]x[densa]C4[Nsde]xx[aeg]C5x[wyf]DGxDC6 (SEQ ID NO:375).

C1xxx[Ywf][Yfh][Gasn]xxC2xx[Fy]C3x[pae]xx[Da]xx[glast][Hrgk][ykfw]xC4[dsgn]xxGxxxC5xxG[Wlfy]xGxxC6 (SEQ ID NO:376).

C1C2x[adehlt]gxxxxxxxx(x)[derst]C3Xxxxxxxxx(xx[aersv])C4xx[apvt][frnq][eklqrtv][adehqrsk](x)C5C6 (SEQ ID NO:377).

Em algumas realizações, o domínio monomérico beta integrincompreende a seqüência seguinte:

C1[aegkqrst][kreqd]C2[il][aelqrv][vilas][dghs][kp]xC3[gast][wy]C4xxxx[fi]xxxx(xxxx[vilar]r)C5[and][dilrt][iklpqirv][adeps][aenq] I [iklqv]x[adknr][gn]C6 (SEQ ID NO:378).

Os Polinucleotédios que codificam os domínios monoméricos sãotipicamente empregados para fazer domínios monoméricos via expressão. Osácidos nucléicos que codificam domínios monoméricos podem ser derivados devárias fontes diferentes. Bibliotecas de domínios monoméricos podem serpreparadas pela expressão de uma pluralidade de ácidos nucléicos diferentes quecodificam domínios monoméricos de ocorrência natural, domínios monoméricosalterados (isto é, variantes de domínios monoméricos), ou combinações destes.Por exemplo, bibliotecas podem ser projetadas nas quais uma estrutura deaminoácidos permanecem constantes (p. ex., um domínio A receptor de LDL,domínio de EGF) enquanto a intervenção de aminoácidos na estrutura compreendeaminoácidos gerados randomicamente.

A invenção fornece métodos para identificar domínios monoméricosque se ligam a um Iigante selecionado ou desejado ou a uma mistura de ligantes.Em algumas realizações, domínios monoméricos são identificados ou selecionadospara uma propriedade desejada (p. ex., afinidade de ligação) e logo os domíniosmonoméricos são formados em multímeros. Ver1 p. ex., a figura 4. Para aquelasrealizações, qualquer método que resulta na seleção de domínios com umapropriedade desejada (p. ex., uma propriedade Iigante específica) pode ser usado.

Por exemplo, os métodos podem compreender o fornecimento de uma pluralidadede ácidos nucléicos diferentes, cada ácido nucléico codificando um domíniomonomérico; tradução da pluralidade de ácidos nucléicos diferentes, fornecendodeste modo, uma pluralidade de domínios monoméricos diferentes; pesquisar apluralidade de domínios monoméricos diferentes quanto a ligação ao Iigantedesejado ou uma mistura de ligantes; e, identificar os membros da pluralidade dedomínios monoméricos diferentes que se ligam ao Iigante desejado ou a mistura deligantes.

Os domínios monoméricos podem ser de ocorrência natural oualterados (variantes não naturais). O termo "de ocorrência natural" é usada aquipara indicar que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, osdomínios monoméricos naturais podem incluir domínios monoméricos humanos ouopcionalmente, domínios derivados de espécies ou fontes diferentes, p. ex.,mamíferos, primatas, roedores, peixes, pássaros, répteis, plantas, etc. Os domíniosmonoméricos de ocorrência natural podem ser obtidos por um número de métodos,p. ex., por amplificação por PCR do ADNDNA genômico ou cDNA.

Os domínios monoméricos da presente invenção podem ser domíniosde ocorrência natural ou variantes de ocorrência não natural. As bibliotecas dedomínios monoméricos empregadas na prática da presente invenção podem contero domínio monomérico de ocorrência natural, as variantes de domíniosmonoméricos de ocorrência não natural, ou combinação destes.

As variantes de domínio monomérico podem incluir domíniosancestrais, domínios quiméricos, domínios randômicos, domínios modificados, eassim pòr diante. Por exemplo, os domínios ancestrais podem ser baseados naanálise filogenética. Os domínios quiméricos são domínios nos quais uma ouvárias regiões são substituídas por regiões correspondentes de outros domínios damesma família. Por exemplo, os domínios quiméricos podem ser construídos pelacombinação de seqüências de Ioop de múltiplos domínios relacionados da mesmafamília para formar novos domínios com imunogenicidade potencialmentediminuída. Aqueles versados na arte reconhecerão o benefício de imunológico dese construir monômeros de domínio de ligação modificados combinando regiões deIoop de vários domínios relacionados da mesma família antes que criar seqüênciasaminoácidos randômicas. Por exemplo, construindo variantes de domínioscombinando seqüências de Ioop ou mesmo seqüências de Ioop múltiplas deocorrência natural em domínios de classe A de receptor de LDL humanos, osdomínios resultantes podem conter novas propriedades ligantes, mas podem nãoconter nenhuma seqüência de proteína imunogênica porque todos os Ioopsexpostos são da origem humana. A combinação das seqüências de aminoácidosdo Ioop no contexto endógeno pode ser aplicada a todas as construções demonômero da invenção. Assim a presente invenção fornece um método para geraruma biblioteca de domínios monoméricos quiméricos derivados de uma proteínahumana, o método compreendendo: fornecer seqüências de Ioop correspondentesa pelo menos um Ioop de cada uma de pelo menos duas variantes diferentes deocorrência natural de uma proteína humana, em que as seqüências de Ioop sãoseqüências de polipeptídio ou polinucleotídio; e combinar covalentementeseqüências de Ioop para gerar uma biblioteca de pelo menos duas seqüênciasquiméricas diferentes, em que cada seqüência quimérica codifica um domíniomonomérico quimérico que tem pelo menos dois loops. Tipicamente, o domínioquimérico tem pelo menos quatro loops, e normalmente pelo menos seis loops.

Como descrito acima, a presente invenção fornece três tipos de loops que sãoidentificados por características específicas, como, potencial de formação de pontedissulfeto, que lança uma ponte entre estruturas secundárias de proteína, edinâmica molecular (isto é, flexibilidade). Os três tipos de seqüências de Ioop sãouma seqüência de Ioop cisteína-definida, uma seqüência de Ioop definida pelaestrutura, e uma seqüência de Ioop definida pelo fator-B.

Os domínios randômicos são domínios nos quais uma ou váriasregiões são tornadas randômicas. A randomização pode ser baseada narandomização completa, ou opcionalmente, randomização parcial baseada nadistribuição natural da diversidade de seqüências.

A presente invenção também fornece ácidos nucléicosrecombinantees que codificam um ou vários polipeptídios que compreendem umou uma pluralidade de domínios monoméricos que se ligam a IL-6. Por exemplo, opolipeptídio pode ser selecionado para compreender um domínio de ocorrêncianão natural do grupo composto de : um domínio tipo-EGF, domínio-Kringle, umdomínio de fibronectina tipo I, um domínio de fibronectina tipo II, um domínio defibronectina tipo III, um domínio PAN, um domínio Gla, um domínio SRCR, umdomínio Kunitz/inibidor de tripsina pancreática bovina, um domínio de inibidor deprotease serina tipo-Kazal, um domínio trevo (tipo-P), um domínio de fator vonWillebrand tipo C, um domínio tipo-anafilatoxina, um domínio CUB, uma repetiçãode tiroglobulina tipo I, domínio de receptor classe A de LDL, um domínio de Sushi,um domínio de ligação, um domínio de trombospondina tipo I, um domínio tipoimunoglobulina, um domínio de Iecitina tipo-C, um domínio MAM, um domínio defator von Willebrand tipo C, um domínio somatomedina B, um domínio de núcleode quatro dissulfetos tipo-WAP, um domínio de F5/8 tipo-C, um domíniohemopexina, um domínio SH2, um domínio SH3, um domínio tipo-laminina Tipo-EGF, um domínio C2 e variantes de um ou mais destes. Em outra realização, opolipeptídio de ocorrência natural codifica um domínio monomérico encontrado nobanco de dados Pfam e/ou o banco de dados SMART.

Todas as composições da presente invenção, inclusive ascomposições produzidas pelos métodos da presente invenção, p. ex., domíniosmonoméricos e/ou imuno-domínios, bem como multímeros e bibliotecas destespodem ser opcionalmente ligadas a uma matriz de um material de afinidade. Osexemplos do material de afinidade incluem pérolas, uma coluna, um suporte sólido,uma microrede, outras porções de suportes de reagente, e similares.

III. MULTÍMEROS

Os métodos para gerar multímeros são uma característica dapresente invenção. Os multímeros compreendem pelo menos dois domíniosmonoméricos. Por exemplo, multímeros da invenção podem compreender de 2 aaproximadamente 10 domínios monoméricos, de 2 e aproximadamente 8 domíniosmonoméricos, de aproximadamente 3 e aproximadamente 10 domíniosmonoméricos, aproximadamente 7 domínios monoméricos, aproximadamente 6domínios monoméricos, aproximadamente 5 domínios monoméricos, ouaproximadamente 4 domínios monoméricos. Em algumas realizações, o multímerocompreende 3 ou no mínimo 3 domínios monoméricos. Em algumas realizações,os multímeros têm não mais do que 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8 domínios monoméricos.

Em vista da variedade possível de tamanhos de domínio monomérico, osmultímeros da invenção podem ser, p. ex., menores que 100 kD, menores do que90kD, menores do que 80kD, menores do que 70kD, menores do que 60kD,menores do que 50kd, menores do que 40kD, menores do que 30kD, menores doque 25kD, menores do que 20kD, menores do que 15kD, menores do que 10kD oupodem ser menores ou maiores. Em alguns casos, os domínios monoméricosforam pré-selecionados por se ligarem à molécula alvo de interesse (p. ex., IL-6).

Em algumas realizações, os multímeros da invenção se ligarão a IL-6 (ou, p. ex.,um fator sangüíneo como HSA ou IgG) com uma afinidade menor que 10"3 M (istoé, se liga mais forte do que uma afinidade de 10"3 M). Em algumas realizações, aafinidade é menor que 10"4M, 10'5M, 10"6M, 10"7M, 10"8M, 10"9M,ou 10"10M. Emalgumas realizações, a afinidade de um multímero será mais forte (menos) do quea soma de afinidades dos respectivos domínios monoméricos no multímero.

Em algumas realizações, cada domínio monomérico especificamentese liga a uma molécula alvo (p. ex., IL-6). Em algumas dessas realizações, cadamonômero se liga a uma posição diferente (análogo a um epitopo) em umamolécula alvo. Domínios monoméricos múltiplos que se ligam à mesma moléculaalvo resultam em um efeito de avidez que resulta na afinidade melhorada domultímero da molécula alvo em comparação com a afinidade de cada monômeroindividual. Em algumas realizações, o multímero tem uma avidez de pelo menosaproximadamente 1,5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, ou 1000 vezes a avidezde um domínio monomérico sozinho. Em algumas realizações, pelo menos um,dois, três, quatro ou mais (p. ex., todos) monômeros de um multímero que se ligama um íon tal como cálcio ou outro íon. Os multímeros podem compreender váriascombinações de domínios monoméricos. Por exemplo, em um multímero único, osdomínios monoméricos selecionados podem ser idênticos ou diferentes. Além domais, os domínios monoméricos selecionados podem compreender váriosdomínios monoméricos diferentes da mesma família de domínio monomérico, ouvários domínios monoméricos de famílias de domínios diferentes, ouopcionalmente, uma combinação de ambos. Por exemplo, os domíniosmonoméricos podem ser selecionados de Famílias 1-7 de domínios monoméricosde ligantes de IL-6. Em algumas realizações, pelo menos um dos domíniosmonoméricos é selecionado da Família 3 e/ou 5 dos domínios monoméricos queligam IL-6. Exemplos de dímeros e trímeros de Iigantes de IL-6 (compreendidos dedois ou três, respectivamente, monômeros Iigantes de IL-6) são enumerados nosexemplos.

Os multímeros que são gerados na prática da presente invençãopodem ser algum dos seguintes:

(1) Um homo-multímero (um multímero do mesmo domínio, isto é, A1-A1-A1-A1);

(2) Um hetero-multímero de domínios diferentes da mesma classe de domínios, p.ex., A1-A2-A3-A4. Por exemplo, hetero-multímeros incluem multímeros onde A1,A2, A3 e A4 são diferentesvariantes de ocorrência não natural de um determinado domínio de classe A dereceptor de LDL, ou onde alguns de A1, A2, A3, e A4 é variantes de ocorrêncianatural de um domínio de classe A de receptor de LDL.

(3) Um hetero-multímero de domínios de classes de domínios monoméricosdiferentes, p. ex., A1-B2-A2-B1. Por exemplo, onde A1 e A2 são dois domíniosmonoméricos diferentes (também de ocorrência natural ou de ocorrência nãonatural) a paritir de receptores de classe A, e B1 e B2 de LDL são dois domíniosmonoméricos diferentes (tanto de ocorrência natural quanto de ocorrência nãonatural) de domínio de classe tipo-EGF.

Em outra realização, o multímero compreende domínios monoméricoscom especificidades por moléculas alvo diferentes (p. ex., um fator sangüíneocomo soro albumina, imunoglobulina, ou eritrócitos). Por exemplo, em algumasrealizações, os multímeros da invenção compreende 1,2, 3, ou mais domíniosmonoméricos que se ligam a IL-6 e pelo menos um domínio monomérico que seliga a uma segunda molécula alvo. As moléculas alvo de exemplo incluem, p. ex.,uma molécula de soro que estende a meia-vida no soro do multímero (p. ex., umaimunoglobulina ou soro albumina). Moléculas de exemplo que estendem a meia-vida no soro de um multímero incluem, p. ex., as células vermelhas do sangue (istoé, eritrócitos), IgG, e soro albumina tal como HSA. Um multímero de exemploincluirá, p. ex., um domínio monomérico da família 3 e/ou família 5 dos domíniosmonoméricos Iigantes de IL-6 (e opcionalmente 2, 3,4, ou mais domínios Iigantesde IL-6) e domínio monomérico da família 2 ou 3 dos domínios monoméricosligantes de imunoglobulina.

As bibliotecas de multímero empregadas na prática da presenteinvenção podem conter homo-multímeros, hetero-mu Itirners de domíniosmonoméricos diferentes (natural ou não natural) da mesma classe de monômeros,ou hetero-multímeros de domínios monoméricos (natural ou não natural) declasses de monômeros diferentes, ou combinações destes.

Os domínios monoméricos, como aqui descrito, também sãoprontamente empregados num heteromultímero contendo imuno-domínio (isto é,um multímero que tem pelo menos um imuno-domínio variante e uma variante dedomínio monomérico). Assim, multímeros da presente invenção podem ter pelomenos um imuno-domínio como um minicorpo, um anticorpo de domínio único, umfragmento variável de cadeia única (ScFv), ou um fragmento Fab; e pelo menos umdomínio monomérico, como, por exemplo, um domínio tipo-EGF, um domínio-Kringle, um domínio de fibronectina tipo I, um domínio de fibronectina tipo II, umdomínio de fibronectina tipo III, um domínio de PAN, um domínio Gla, um domínioSRCR, um domínio inibidor Kunitz/tripsina pancreática bovina, um domínio inibidorde serina protease tipo Kazal, um domínio trevo (tipo-P), um domínio de fator vonWillebrand tipo C, um domínio tipo anafilatoxina, um domínio CUB, uma repetiçãode tiroglobulina tipo I, um domínio classe A de receptor de LDL1 um domínio sushi,um domínio de ligação, um domínio de trombospondina tipo I, um domínio tipoimunoglobulina, um domínio de Iecitina tipo-C, um domínio MAM, um domínio defator von Willebrand tipo A, um domínio de somatomedina B, um domínio de centrode quatro dissulfetos tipo WAP, um domínio F5/8 tipo C1 um domínio dehemopexina, um domínio SH2, um domínio SH3, um domínio tipo-EGF tipo-laminina, um domínio C2, ou variantes destes.

Os domínios não precisam ser selecionados antes dos domíniosserem ligados para formar multímeros. Por outro lado, os domínios podem serselecionados pela capacidade de se ligarem a uma molécula alvo antes de seligarem em multímeros. Assim, por exemplo, um multímero pode compreender doisdomínios que se ligam a uma molécula alvo e um terceiro domínio que se liga auma segunda molécula alvo.

Os multímeros da presente invenção podem ter as qualidadesseguintes: multivalentes, multiespecíficos, cadeia única, termoestável, meia-vidae/ou de prateleira extensa. Além destes, pelo menos um, mais de um ou todos osdomínios monoméricos podem se ligar a um íon (p. ex„ um íon metálico ou um íonde cálcio), pelo menos um, mais de um ou todos os domínios monoméricos podemser derivados dos domínios A de receptor de LDL e/ou domínios tipo-EGF, pelomenos um, mais de um ou todos os domínios monoméricos podem ser deocorrência não natural, e/ou pelo menos um, mais de um ou todos os domíniosmonoméricos podem compreender 1,2, 3, ou 4 pontes dissulfeto por domíniomonomérico . Em algumas realizações, os multímeros compreendem pelo menosdois (ou pelo menos três) domínios monoméricos, em que pelo menos um domíniomonomérico é um domínio monomérico de ocorrência não natural e os domíniosmonoméricos se ligam ao cálcio. Em algumas realizações, os multímeroscompreendem pelo menos 4 domínios monoméricos, em que pelo menos umdomínio monomérico é de ocorrência não natural, e em que:

a. cada domínio monomérico está entre 30-100 aminoácidos e cadaum dos domínios monoméricos compreendem pelo menos uma ligação dissulfeto;ou

b. cada domínio monomérico está entre 30-100 aminoácidos e éderivado de uma proteína extracelular; ou

c. cada domínio monomérico está entre 30-100 aminoácidos e se ligaa um proteína alvo.

Em algumas realizações, os multímeros compreendem pelo menos 4domínios monoméricos, em que pelo menos um domínio monomérico é deocorrência não natural, e em que:

a. cada domínio monomérico está entre 35-100 aminoácidos; ou

b. cada domínio compreende pelo menos uma ponte dissulfeto e éderivado de uma proteína humana e/ou uma proteína extracelular.

Em algumas realizações, os multímeros compreendem pelo menosdois domínios monoméricos, em que pelo menos um domínio monomérico é deocorrência não natural, e onde cada domínio é:

a. 25-50 aminoácidos de comprimento e compreendem pelo menosuma ponte dissulfeto; ou

b. 25-50 aminoácidos de comprimento e são derivados de umaproteína extracelular; ou

c. 25-50 aminoácidos e se ligam a um proteína alvo; ou

d. 35-50 aminoácidos de comprimento.

Em algumas realizações, os multímeros compreendem pelo menosdois domínios monoméricos, em que pelo menos um domínio monomérico é deocorrência não natural e:

a. cada domínio monomérico compreende pelo menos uma pontedissulfeto; ou

b. pelo menos um domínio monomérico é derivado de uma proteínaextracelular; ou

c. pelo menos um domínio monomérico se liga a uma proteína alvo.

Os domínios monoméricos e/ou multímeros identificados podem teratividade biológica, que é pretendida para incluir pelo menos afinidade Iiganteespecífica por um Iigante selecionado ou desejado, e, em alguns exemplos, incluiráalém destes a capacidade de bloquear a ligação de outros compostos, estimular ouinibir vias metabólicas, atuar como um sinal ou mensageiro, estimular ou inibir aatividade celular, e assim por diante. Noutras realizações, os domíniosmonoméricos da invenção se ligam a IL-6R, o receptor de IL-6. Em algumasrealizações, esses domínios monoméricos bloqueiam a ligação de IL-6 ao IL-6R ouativam o receptor de IL-6.

Um Iigante único pode ser usado, ou opcionalmente vários Iigantespodem ser usados para selecionar os domínios monoméricos e/ou multímeros. Umdomínio monomérico da presente invenção pode se ligar a um Iigante único ouvários ligantes. Um multímero da presente invenção pode ter múltiplos sítios deligação discretos de um Iigante único, ou opcionalmente, pode ter múltiplos sítiosde ligação de vário ligantes.

Em algumas realizações, os multímeros da invenção se ligam aomesmo ou outro multímeros para formar agregados. A agregação pode sermediada, por exemplo, pela presença de domínios hidrofóbicos em dois domíniosmonoméricos, resultando na formação de interações não covalentes entre doisdomínios monoméricos. Alternativamente, a agregação pode ser facilitada por umou vários domínios monoméricos em um multímero que tem especificidade deligação por um domínio monomérico em outro multímero. Os agregados tambémpodem formar-se devido à presença de peptídios de afinidade nos domíniosmonoméricos ou multímeros. Os agregados podem conter mais domínios deligação a moléculas alvo do que um multímero único.

Os multímeros com afinidade tanto por um alvo de superfície decélula como por um segundo alvo (p. ex., IL-6) podem prover efeitos de avidezaumentados. Em alguns casos, a fluidez da membrana pode ser mais flexível doque as proteínas de ligação na otimização (pela auto-reunião) do espaçamento eda valência das interações. Em alguns casos, o multímeros se ligarão a dois alvosdiferentes, cada um em uma célula diferente ou um em uma célula e o outro emuma molécula com múltiplos sítios de ligação.Em algumas realizações, os monômeros ou multímeros da presenteinvenção são ligados a outro polipeptídio para formar uma proteína de fusão.Qualquer polipeptídio no estado da arte pode ser usado como um parceiro defusão, embora possa ser útil se o parceiro de fusão formar multímeros. Porexemplo, os monômeros ou multímeros da invenção, por exemplo, podem serfundidos às seguintes posições ou as combinações das posições de um anticorpo:

1. Na extremidade N-terminal dos domínios VH1 e/ou VL1,opcionalmente somente após o peptídio líder e antes dos domínios iniciarem(região de armação 1);

2. Na extremidade N-terminal do CH1 ou domínio CL1, substituindo odomínio VH1 ou VL1;

3. Na extremidade N-terminal da cadeia pesada, opcionalmentedepois do domínio CH1 e antes dos resíduos de cisteína na dobradiça (Fc-fusão);

4. Na extremidade N-terminal do domínio CH3;

5. Na extremidade C-terminal do domínio CH3, opcionalmente ligadoao último resíduo de aminoácido via um Iigante curto;

6. Na extremidade C-terminal do domínio CH2, substituindo o domínioCH3;

7. Na extremidade C-terminal do domínio CL1 ou CHI, opcionalmentedepois da cisteína que forma o dissulfeto intercadeia; ou

8. Na extremidade C-terminal do domínio VH1 ou VL1. Ver, p. ex.,figura 7.

Em algumas realizações, um ou mais monômeros ou domíniosmultímeros da invenção estão ligados a uma molécula (p. ex., uma proteína, ácidonucléico, pequena molécula orgânica, etc.) útil como um fármaco. Proteínasfarmacêuticas de exemplo incluem, p. ex., citocinas, anticorpos, quimiocinas,fatores de crescimento, interleucinas (p. ex., IL-6), proteína superficial da célula,domínios extracelulares, receptores de superfície celulares, citotoxinas, etc.Exemplos de pequenas moléculas farmacêuticas incluem toxinas ou agentesterapêuticos. Em algumas realizações, um metal pode estar ligado aospolipeptídios da invenção. Isto pode ser útil, p. ex., como um agente de contraste,p. ex., para MRI.

Em algumas realizações, o monômero ou multímeros sãoselecionados para se ligarem a uma proteína alvo tecido- ou doença-específico. Asproteínas tecido-específicas são proteínas que são expressas exclusivamente, oua um nível significativamente mais alto, em um ou vários determinados tecidos emcomparação com outros tecidos em um animal.

Em algumas realizações, os monômeros ou multímeros que se ligamà proteína alvo são ligados à proteína farmacêutica ou pequena molécula tal que ocomplexo resultante ou a fusão sejam direcionados para o tecido específico oucélulas relacionadas à doença onde a proteína alvo (p. ex., IL-6) é expressa. Osmonômeros ou multímeros de uso em tais complexos ou fusões podem serinicialmente selecionados para se ligarem à proteína alvo e posteriormenteselecionados por seleção negativa contra outras células ou tecido (p. ex., paraevitar ser direcionado ao tutano do osso ou outros tecidos que estabelecem o limitemais baixo da toxicidade da droga) onde é desejado que a ligação seja reduzida oueliminada em outras células não-alvo ou tecidos. Mantendo os fármacos longe dostecidos sensíveis, a janela terapêutica é aumentada para que uma dose mais altapossa ser administrada seguramente. Numa outra alternativa, lavagem in vivo podeser executada em animais injetando-se uma biblioteca de monômeros oumultímeros em um animal e logo isolando os monômeros ou multímeros que seligam a um determinado tecido ou célula do interesse.

A proteína de fusão descrita acima também pode incluir um peptídioIigante entre a proteína farmacêutica e o monômero ou multímeros. Umaseqüência de peptídio Iigante pode ser empregada para separar, por exemplo, oscomponentes de polipeptídicos de uma distância suficiente para assegurar quecada polipeptídio se dobre nas suas estruturas secundárias e terciárias. A proteínade fusão pode ser geralmente preparada usando técnicas padrão, inclusive aconjugação química. A proteína de fusão também pode ser expressa como umaproteína recombinante em um sistema de expressão por técnicas padrão.Os multímeros ou domínios monoméricos da invenção podem serproduzidos segundo qualquer método conhecido na arte. Em algumas realizações,E. coli compreendendo um plasmídio que codifica os polipeptídios sob controle detranscrição de um promotor indutível é usada para expressar a proteína. Apóscoletar as bactérias, estas podem ser Iisadas por sonicação ou homogeneização eclarificado por centrifugação. Os polipeptídios podem ser purificados usandoeluição em Ni-NTA agarose (se 6xHis (SEQ ID N0.379) marcado) ou eluição emDEAE sefarose (se não marcado) e reestruturados por diálise. As proteínasdesnaturadas podem ser neutralizadas bloqueando-se as sulfidrilas livres com oácido iodoacético. Eluição em Q sefarose, fluxo por butil sefarose, eluição em SPsefarose, eluição em DEAE sefarose, e/ou eluição em CM sefarose podem serusados para purificar os polipeptídios. Etapas equivalentes de purificação por trocade ânion e/ou cátion também podem ser empregadas.

Em algumas realizações, os monômeros ou multímeros sãopurificados usando Iise por calor, tipicamente seguido por um esfriamento rápidopara prevenir que a maior parte de proteína de renature. Devido à termoestabilidade da proteína da invenção, a proteína desejada não será desnaturadapor calor e por isso permitirá um passo de purificação que resulta em alta pureza.Em algumas realizações, um processo de aquecimento de fluxo contínuo parapurificar os monômeros ou multímeros de culturas de célula bacterianas é usado.Por exemplo, uma suspensão de células passando por uma serpentina de aço inoxsubmersa num banho-maria numa determinada temperatura que pode resultar nalise das bactérias (p. ex., aproximadamente 65-100°C). O efluente Iisado édirecionado para um banho de refrigeração para obter o esfriamento rápido eprevenir a renaturação das proteínas de desnaturadas de E. coli. As proteínas deE. coli desnaturam e evita-se a sua renaturação, mas o monômero ou multímerosnão desnaturam nessas condições devido à excepcional estabilidade da suaestrutura. O tempo de aquecimento é controlado ajustando a taxa de fluxo e ocomprimento da serpentina. Esta técnica produz proteínas ativas com altorendimento e pureza excepcionalmente alta (p. ex., > 80 %) em comparação comaproximações alternativas e é receptiva à produção em grande escala do materialclínico.

Em algumas realizações, após a manufatura dos monômeros oumultímeros da invenção, os polipeptídios são armazenados em uma solução quecompreende ácido iodoacético para prevenir a troca das ligações dissulfeto. Emalgumas realizações, 0,1-100 mM (p. ex., 1-10 mM) de ácido iodoacético estãoincluídos nas soluções do armazenamento. Se desejado, o ácido iodoacético podeser retirado antes de ser administrado a um indivíduo.

Em algumas realizações, o polipeptídio que compreende ummonômero ou multímero da invenção é ligado a si próprio (C-terminal à N-terminal), p. ex., para estabilidade de proteína.

IV. LIGANTES

Os domínios monoméricos podem ser unidos por um Iigante paraformar um multímero. Por exemplo, um Iigante pode ser posicionado entre cadadomínio monomérico discreto separado em um multímero.

A junção dos domínios monoméricos selecionados via um Iigantepode sér realizada usando várias técnicas conhecidas na arte. Por exemplo, amontagem combinatória de polinucleotídios que codificam domínios monoméricosselecionados pode ser realizada pela digestão de restrição e religação, a base dePCR, reações de sobreposição de "auto-priming", ou outros métodosrecombinantes. O Iigante pode ser se ligado a um monômero antes do monômeroser identificado por sua capacidade de se ligar a um multímero alvo ou após omonômero ser selecionado quanto a sua capacidade de se ligar a um multímeroalvo.

O ligante pode ser de ocorrência natural, sintético ou umacombinação de ambos. Por exemplo, o Iigante sintético pode ser um Iiganterandômico, p. ex., tanto em seqüência como em tamanho. Em um aspecto, oligante randômico pode compreender uma seqüência totalmente randômica, ouopcionalmente, o Iigante randômico pode ser baseado em seqüências Iigantenaturais. O Iigante pode compreender, por exemplo, uma porção não-polipeptídica,um polinucleotídio, um polipeptídio ou similares.

Um ligante pode ser rígido, ou flexível, ou uma combinação deambos. A flexibilidade do Iigante pode ser uma função da composição tanto doligante quanto dos domínios monoméricos com que o Iigante interage. O Iiganteune dois domínios monoméricos selecionados, e mantém os domíniosmonoméricos como domínios monoméricos discretos separados. O Iigante podepermitir que os domínios monoméricos discretos separados cooperem aindamantendo suas propriedades separadas tal como múltiplos sítios de ligaçãoseparados para o mesmo Iigante em um multímero, ou p. ex., múltiplos sítios deligação separados de Iigantes diferente em um multímero.

A escolha de um Iigante adequado para um caso específico onde doisou mais domínios monoméricos (isto é cadeias de polipeptídios) devem ser unidaspode depender de vários parâmetros inclusive, p. ex. a natureza dos domíniosmonoméricos, a estrutura e natureza do alvo ao qual o multímero polipeptídicodeve se ligar e/ou a estabilidade do peptídio Iigante frente a proteólise e oxidação.

A presente invenção fornece métodos para otimizar a seleção doligante uma vez que os variantes/domínios monoméricos desejados foramidentificados. Geralmente, as bibliotecas de multímeros que apresentam umacomposição que é fixada quanto à composição dos domínios monoméricos, masvariável na composição do Iigante e comprimento, pode ser prontamentepreparada e pesquisada como descrito acima.

Uma discussão mais detalhada de Iigantes pode ser encontrada, p.ex., no documento de patente US No. 2005/0048512.

V. IDENTIFICAÇÃO DE MONÔMEROS OU MULTÍMEROS COMAFINIDADE PARA UMA MOLÉCULA ALVO

Aqueles versados na arte podem identificar prontamente domíniosmonoméricos com uma propriedade desejada (p. ex., afinidade de ligação). Paraaquelas realizações, qualquer método que resulta na seleção de domínios comuma propriedade desejada (p. ex., uma propriedade Iigante específica) pode serusado. Por exemplo, os métodos podem compreender o fornecimento de umapluralidade de ácidos nucléicos diferentes, cada ácido nucléico codificando umdomínio monomérico; tradução da pluralidade de ácidos nucléicos diferentes, pormeio destes fornecendo uma pluralidade de domínios monoméricos diferentes;pesquisa da pluralidade de domínios monoméricos diferentes quanto à ligação aoIigante desejado ou uma mistura de ligantes; e, identificação dos membros dapluralidade de domínios monoméricos diferentes que se ligam ao Iigante desejadoou a mistura de ligantes.

Além disso, qualquer método de mutagênese, como mutagênese sítiodirigida e mutagênese aleatória (p. ex., mutagênese química) pode ser usado paraproduzir domínios monoméricos, p. ex., para uma biblioteca de domíniomonomérico. Em algumas realizações, PCR sujeito a erros é empregado para criarvariantes. Os métodos adicionais incluem o alinhamento de uma pluralidade dedomínios monoméricos de ocorrência natural alinhando os aminoácidosconservados na pluralidade de domínios monoméricos de ocorrência natural; e,projetando domínio monomérico de ocorrência não natural mantendo osaminoácidos conservados e inserções, eliminações ou alterações de aminoácidosem volta dos aminoácidos conservados para gerar o domínio monomérico deocorrência não natural. Em uma realização, os aminoácidos conservadoscompreendem cisteínas. Em outra realização, a etapa de inserção usaaminoácidos randômicos, ou opcionalmente, a etapa de inserção usa porções dedomínios monoméricos de ocorrência natural. As porções podem codificar demaneira ideal Ioops de domínios da mesma família. Os aminoácidos são inseridosou trocados utilizando oligonucleotídios sintéticos, ou transferência, ou porrecombinação a base de enzimas de restrição. Os domínios quiméricos humanosda presente invenção são úteis nas aplicações terapêuticas onde mínimaimunogenicidade é desejada. A presente invenção fornece métodos para gerarbibliotecas de domínios quiméricos humanos. As bibliotecas de domíniomonomérico quimérico humano podem ser construídas combinando seqüências deIoop de variantes diferentes de um domínio monomérico humano, como descritoacima. As seqüências de Ioop que são combinadas podem ser Ioops definidos pelaseqüência, Ioops definidos pela estrutura, Ioops definidos pelo fator-B, ou umacombinação de quaisquer dois ou mais destes.

Alternativamente, uma biblioteca de domínio quimérico humano podeser gerada modificando os domínios monoméricos humanos de ocorrência naturalao nível dos aminoácidos, comparando com o nível de loop. Em algumasrealizações, para minimizar o potencial de imunogenicidade, apenas aquelesresíduos de ocorrência natural em seqüências de proteína da mesma família dedomínios monoméricos humanos são utilizados para criar as seqüênciasquiméricas. Isto pode ser realizado fornecendo um alinhamento de seqüência depelo menos dois domínios monoméricos humanos da mesma família de domíniosmonoméricos, identificando os resíduos de aminoácidos nas posiçõescorrespondentes nas seqüências de domínio monomérico humano que sediferenciam entre os domínios monoméricos humanos, gerando dois ou maisdomínios monoméricos quiméricos humanos, em que cada seqüência de domíniomonomérico quimérico humano se compõe de resíduos de aminoácidos quecorrespondem em tipo e posição aos resíduos de dois ou mais domíniosmonoméricos humanos da mesma família de domínios monoméricos. Asbibliotecas de domínios monoméricos quiméricos humanos podem ser empregadaspara identificar domínios monoméricos quiméricos humanos que se ligam a umalvo de interesse por: pesquisa da biblioteca de domínios monoméricos quiméricoshumanos quanto a ligação a uma molécula alvo, e identificar um domíniomonomérico quimérico humano que se liga à molécula alvo. As seqüências dedomínio monomérico humano de ocorrência natural adequadas empregadas naetapa de alinhamento de seqüência inicial incluem aquelas que correspondem aalgum dos domínios monoméricos de ocorrência natural aqui descritos.

Os domínios de bibliotecas de variantes de monômero humanos dapresente invenção (se gerado por Ioops variados ou resíduos de aminoácidossimples) podem ser preparadas por métodos conhecidos por aqueles versados naarte. Os métodos especialmente adequados para gerar essas bibliotecas são oformato de consórcio da divisão e o formato de síntese trinucleotídica comodescrito na WO 01/23401.

Em algumas realizações, domínios monoméricos da invenção sãopesquisados quanto ao potencial de imunogenicidade por:fornecimento de uma seqüência de proteína candidata;

comparação da seqüência de proteína candidata com um banco dedados de seqüências de proteína humanas; identificação das porções daseqüência de proteína candidata que corresponde as porções de seqüências deproteínas humanas do banco de dados; e

determinação da extensão de correspondência entre a seqüência deproteína candidata e as seqüências de proteínas humanas do banco de dados.

Em geral, quanto maior a extensão da correspondência entre aseqüência de proteína candidata e uma ou várias das seqüências de proteínashumanas do banco de dados, mais baixo o potencial de imunogenicidade éprevisto comparando com uma proteína candidata que tem pouca correspondênciacom alguma das seqüências de proteínas humanas do banco de dados. Um bancode dados de seqüências de proteínas humanas que é adequado para o uso naprática do método da invenção para pesquisar a proteína candidata pode serencontrado em ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi na World Wide Web (além do mais,o Web site seguinte pode ser usado para procurar combinações curtas, quaseexatas:

cbi.nhn.nih.gov/blast/Blast.cgi?CMD=Web&LAYOUT=TwoWindows&AUTO_FORMAT=Semiauto&ALIGNMENTS=50&ALIGNMENT_VIEW=Pairwise&CLIENT=web&DSE LIGABASE=nr&DESCRIPTIONS=100&EN TREZ_QUERY

(none)&EXPECT=1000&FORMAT_OBJECT=Alignment&FORMAT_TYPE=HTML&NCBI_GI=on&PAGE=Nucleotídios&PROGRAM=blastn&SERVICE=plain&SET_DEFAULTS.x=29&SET_DEFAULTS.y=6&SHOW_OVERVIEW=on&WORD_SIZE=7&END_OF_HTTPGET=Yes&SHOW_LINKOUT=yes na World Wide Web). Ométodo é especialmente útil na determinação se uma seqüência de cruzamentoem uma proteína quimérica, como, por exemplo, domínio monomérico quimérico,provavelmente causará um evento imunogênico. Se a seqüência de cruzamentocorresponder a uma porção de uma seqüência encontrada no banco de dados deseqüências de proteína humanas, acreditam-lhe que a seqüência de cruzamento émenos provável de causar um evento imunogênico.

A informação pertinente às porções de seqüências de proteínashumanas do banco de dados pode ser usada para projetar uma biblioteca deproteína da proteína quimérica parecida a um ser humana. Tal biblioteca pode sergerada usando informação que pertence "a seqüências de cruzamento" queexistem na proteína humana de ocorrência natural. O termo "seqüência decruzamento" refere-se neste lugar a uma seqüência que é encontrada em suatotalidade em pelo menos uma proteína humana de ocorrência natural, na qual asporções da seqüência são encontradas em duas ou mais proteína de ocorrêncianatural. Assim, a recombinação de duas ou mais proteína última de ocorrêncianatural geraria uma proteína quimérica na qual a porção quimérica da seqüênciade fato corresponde a uma seqüência encontrada em outra proteína de ocorrêncianatural. A seqüência de cruzamento contém uma ligação quimérica de duasposições de resíduos de aminoácidos consecutivas nas quais a primeira posiçãoaminoácido é ocupada por um resíduo ácido amino idêntico em tipo e posiçãoencontrada em uma seqüência de proteína humana primeira e segunda deocorrência natural, mas não um terço que naturalmente ocorre seqüência deproteína humana. A segunda posição aminoácido é ocupada por um resíduo ácidoamino idêntico em tipo e posição encontrada dentro de um segundo e terço quenaturalmente ocorre seqüência de proteína humana, mas não a seqüência deproteína humana primeira de ocorrência natural. Em outras palavras, a seqüênciade proteína humana "segunda" de ocorrência natural corresponde à proteínahumana de ocorrência natural na qual a seqüência de cruzamento aparece em suatotalidade, como descrito em cima.

Em algumas realizações, uma biblioteca da proteína quiméricaparecida a um ser humana é gerada por: a identificação de seqüências de proteínahumanas de um banco de dados que correspondem à proteína da mesma famíliade proteína; alinhamento das seqüências de proteína humanas da mesma famíliade proteína a uma seqüência de proteína de referência; identificação de um jogode subseqüências derivou de seqüências de proteína humanas diferentes damesma família, em que cada subseqüência compartilha uma região da identidadecom pelo menos uma outra subseqüência conseguida de uma seqüência deproteína humana diferente de ocorrência natural; identificando uma ligaçãoquimérica de um primeiro, um segundo, e uma terceira subseqüência, em que cadasubseqüência é conseguida de uma seqüência de proteína humana diferente deocorrência natural, e em que a ligação quimérica compreende duas posições deresíduos de aminoácidos consecutivas nas quais a primeira posição aminoácido éocupada por um resíduo ácido amino comum à seqüência de proteína humanaprimeira e segunda de ocorrência natural, mas não a seqüência de proteínahumana terceira de ocorrência natural, e a segunda posição aminoácido é ocupadapor um resíduo ácido amino comum à seqüência de proteína humana segunda eterceira de ocorrência natural, e geração de moléculas de proteína quiméricasparecidas a um ser humanas cada correspondência na seqüência a duas ou maissubseqüências do jogo de subseqüências, e cada um que compreende uma demais das ligações quiméricas identificadas.

Assim, por exemplo, se a primeira seqüência de proteína humana deocorrência natural for, ALFABETO, e o segundo são, B-C-D-E1 e o terceiro é, D-E-F, então a ligação quimérica é C-D. Alternativamente, se a primeira seqüência deproteína humana de ocorrência natural é D-E-F-G, e o segundo é B-C-D-E-F, e oterceiro é A-B-C-D, então a ligação quimérica é D-E. As moléculas de proteínaquiméricas parecidas a um ser humanas podem ser geradas de vários modos. Porexemplo, oligonucleotídios seqüências compreendem que codificam as ligaçõesquiméricas pode ser recombinado com oligonucleotídios que corresponde naseqüência a duas ou mais subseqüências do acima mencionado - jogo descrito desubseqüências para gerar uma proteína quimérica parecida a um ser humana, ebibliotecas destes. A seqüência de referência usada para alinhar a proteínahumana de ocorrência natural é uma seqüência da mesma família de proteínahumana de ocorrência natural, ou uma quimera ou outra variante da proteína nafamília.

Os ácidos nucléicos que codificam os fragmentos dos domíniosmonoméricos de ocorrência natural também podem ser mistos e/ou recombinados(p. ex., usando quimicamente ou fragmentos enzimaticamente-produzidos) paragerar de corpo inteiro, modificou domínios monoméricos. Os fragmentos e odomínio monomérico também podem ser recombinados manipulando ácidosnucléicos que codificam domínios ou fragmentos destes. Por exemplo, ligando umconstruto ácido nucléico que codifica os fragmentos do domínio monomérico podeser usado para gerar um domínio monomérico alterado.

Os domínios monoméricos alterados também podem ser geradosfornecendo uma coleção de oligonucleotídios sintético (p. ex., ficando sobrepostooligonucleotídios) codificação conservado, casual, pseudocasual, ou umaseqüência definida de seqüências de peptídio que então são inseridas por Iigationem um sítio predeterminado em um polinucleotídio codificação de um domíniomonomérico . Semelhantemente a diversidade de seqüência de um ou váriosdomínios monoméricos pode ser extensa transformando o domínio (s) monômerocom mutagênese dirigido pelo sítio, a mutação casual, mutação pseudocasual,definiu a mutação kernal, a mutação codon-fundada, e assim por diante. Asmoléculas ácidas nucléicas resultantes podem ser propagadas em um anfitrião declonagem e amplificação. Em algumas realizações, os ácidos nucléicos são mistos.

A presente invenção também fornece um método para recombinaruma pluralidade de ácidos nucléicos que codificam domínios monoméricos eprotegem a biblioteca resultante de domínios monoméricos que se ligam a aoligante desejado ou a mistura de Iigantes ou o parecido. O domínio monoméricoselecionado ácidos nucléicos também pode ser costas cruzado arrastando os péscom seqüências polinucleotídio que codificam seqüências neutrais (isto é, tendoefeito funcional insubstancial na se ligadura), como por exemplo, por atravessandoatrás com o tipo selvagem ou seqüência de ocorrência natural substancialmenteidêntica a uma seqüência selecionada para produzir domínios monoméricosfuncionais parecidos a um natural. Geralmente, durante a seleção que atravessaatrás, subseqüente é aplicado para conservar a propriedade, p. ex., se Iiganteo aoligante.

Em algumas realizações, a biblioteca monômero está preparadaarrastando os pés. Em tal caso, domínios monoméricos são isolados e mistos pararecombinar combinatóriamente as seqüências ácidas nucléicas que codificam osdomínios monoméricos (a recombinação pode ocorrer entre ou dentro de domíniosmonoméricos, ou ambos). O primeiro passo implica a identificação de um domíniomonomérico que tem a propriedade desejada, p. ex., afinidade de certo ligante.Mantendo os aminoácidos conservados durante a recombinação, as seqüênciasácidas nucléicas que codificam os domínios monoméricos podem serrecombinadas, ou recombinadas e juntadas em multímeros.

Uma vantagem significante da presente invenção é que Iigantesconhecido, ou Iigantes desconhecido pode ser usado para selecionar os domíniosmonoméricos e/ou multímeros. Nenhuma informação prévia quanto à estruturaligante deve isolar os domínios monoméricos do interesse ou o multímeros dointeresse. Os domínios monoméricos e/ou multímeros identificado podem teratividade biológica, que é pretendida para incluir a afinidade ligante pelo menosespecífica de um ligante selecionado ou desejado, e, em alguns exemplos, incluiráalém destes a capacidade de bloquear a se ligadura de outros compostos,estimular ou inibir vias metabólicos, atuar como um sinal ou mensageiro, estimularou inibir a atividade celular, e assim por diante. Os domínios monoméricos podemser gerados para funcionar como Iigantes para receptores onde o ligante natural doreceptor ainda não foi identificado (receptores órfãos). Esses o órfão Iigantes podeser criado para bloquear ou ativar o receptor ao qual eles se ligam.

Um ligante único pode ser usado, ou opcionalmente vários Iigantespode ser usado para selecionar os domínios monoméricos e/ou multímeros. Umdomínio monomérico da presente invenção pode se ligar um ligante único ou várioligantes. Um multímero da presente invenção pode ter múltiplos sítios de ligaçãodiscretos de um ligante único, ou opcionalmente, pode ter múltiplos sítios deligação de vário ligantes.Em algumas realizações, o multímeros ou monômero s sãoprotegidos para a capacidade de se ligar a uma proteína de multímeros (2, 3, oumais) de espécies diferentes. Por exemplo, o ser humano e o primata orthologousproteína podem ser protegidos, por meio destes gerando polipeptídios que se ligama proteína (p. ex„ IL-6, IgG ou outra extensão de meia-vida de soro ou outraproteína) tanto de um ser humano como de um primaz, por meio destes levandoem conta a tranqüilidade da análise da toxicologia em primazes do uso em sereshumanos.

[212] A invenção também inclui composições que são produzidas pormétodos da presente invenção. Por exemplo, a presente invenção inclui domíniosmonoméricos selecionados ou identificados de uma biblioteca e/ou bibliotecas quecompreendem domínios monoméricos produzidos pelos métodos da presenteinvenção.

[213] A presente invenção também fornece bibliotecas de domíniosmonoméricos e bibliotecas de ácidos nucléicos que codificam domíniosmonoméricos. As bibliotecas podem incluir, p. ex„ aproximadamente 100, 250, 500ou mais ácidos nucléicos que codificam domínios monoméricos, ou a bibliotecapode incluir, p. ex„ aproximadamente 100, 250, 500 ou mais polipeptídios quecodificam domínios monoméricos. As bibliotecas podem incluir domíniosmonoméricos que contêm a mesma armação de cisteína, p. ex„ domínios-A oudomínios tipo-EGF.

Em algumas realizações, as variantes são geradas recombinandoduas ou mais seqüências diferentes da mesma família de domínios monoméricos(p. ex„ o receptor LDL classificam um domínio). Alternativamente, dois ou maisdomínios monoméricos diferentes de famílias diferentes podem ser combinadospara formar um multímero. Em algumas realizações, os multímeros são formadosde monômero s ou variantes monômero de pelo menos uma das classes defamília seguintes: um domínio Tipo-EGF, Domínio-Kringle, um domínio defibronectina tipo I, um domínio de fibronectina tipo II, um domínio de fibronectinatipo III, um domínio de PANELA, um domínio Gla, um domínio SRCR, um domíniode Nervo Inibidor trypsin pancreático Kunitz/Bovine, um Kazal-tipo serine domíniode nervo inibidor de procaçoada, um Trevo (P-tipo) domínio, um von Willebrandtipo de fator C domínio, um domínio Anaphylatoxin-parecido, um domínio deFILHOTE, um tipo de tiroglobulina que repito, Receptor de LDL classifica umdomínio, um domínio de Sushi, um domínio de Ligação, um Trombospondina tipo Idomínio, um domínio tipo imunoglobulina, um Tipo-C Iecitina domínio, um domínioMAM, um um domínio de fator von Willebrand tipo C, um Somatomedin B domínio,um WAP-tipo quatro domínio de núcleo de dissulfeto, um F5/8 tipo o domínio C, umdomínio Hemopexin, um domínio SH2, um domínio SH3, um Tipo-Iaminina Tipo-EGF domínio, um domínio C2 e derivados destes. Em outra realização, o domíniomonomérico e o domínio monomérico diferente podem incluir um ou váriosdomínios encontradas no banco de dados Pfam e/ou o banco de dadosINTELIGENTE. As bibliotecas produzidas pelos métodos em cima, um ou várioscélula (s) que compreende um ou vários membros da biblioteca, e uma ou váriasexposições que compreendem um ou vários membros da biblioteca também estãoincluídas na presente invenção.

Opcionalmente, um jogo de dados de cadeias de caráter ácidasnucléicas que codificam domínios monoméricos pode ser gerado p. ex„ misturandouma primeira cadeia de caráter que codifica um domínio monomérico , com um ouvários cadeia de caráter que codifica um domínio monomérico diferente, por meiodestes produzindo um jogo de dados de cadeias de caráter de ácidos nucléicasque codificam domínios monoméricos, inclusive os descritos neste lugar. Em outrarealização, o domínio monomérico e o domínio monomérico diferente podemincluir um ou vários domínios encontradas no banco de dados Pfam e/ou o bancode dados INTELIGENTE. Os métodos podem compreender além destes a inserçãoda primeira cadeia de caráter que codifica o domínio monomérico e uma ou váriasegunda cadeia de caráter que codifica o domínio monomérico diferente em umcomputador e gera uma cadeia (s) de caráter multímero ou biblioteca (s), destes nocomputador.

As bibliotecas podem ser protegidas para uma propriedade desejadacomo a se ligadura de um Iigante desejado ou mistura de ligantes. Por exemplo, osmembros da biblioteca de domínios monoméricos podem ser expostos epreprotegidos para se ligar a um Iigante conhecido ou desconhecido ou umamistura de ligantes. As seqüências de domínio monomérico então podem sermutageneizados (p. ex., recombinado, quimicamente alterado, etc.) ou de outramaneira alterado e os novos domínios monoméricos pode ser protegido novamentepara se ligar ao Iigante ou a mistura de ligantes com uma afinidade melhorada. Osdomínios monoméricos selecionados podem ser combinados ou juntados paraformar multímeros, que então pode ser protegido para uma afinidade melhorada ouavidez ou especificidade alterada do Iigante ou a mistura de ligantes. Aespecificidade alterada pode significar que a especificidade é alargada, p. ex., a seligadura de múltiplos vírus relacionados, ou opcionalmente, a especificidadealterada pode significar que a especificidade é estreitada, p. ex., Iigante dentro deuma região específica de um ligante. Aqueles da habilidade na arte reconhecerãoque há um número de métodos disponíveis para calcular a avidez. Ver, p. ex.,Mammen e al, Angew Chem Int. Editor 37:2754-2794 (1998); Muller et al„ Anal.Biochem. 261:149-158 (1998).

VI. SELEÇÃO DE DOMÍNIOS MONOMÉRICOS QUE SE LIGAM A IL-

As telas preliminares podem ser conduzidas protegendo para agentescapazes da se ligadura a IL-6, como pelo menos alguns agentes tão identificadossão moduladores IL-6 prováveis (p. ex., antagonistas ou agonists). Os ensaios deligação normalmente implicam contse ligar com uma proteína IL-6 (ou umfragmento destes) com um ou vários agentes de experiência (isto é, monômero sou multímeros da invenção) e permitir tempo suficiente da proteína e testamagentes a fonn um complexo de ligação. Qualquer complexo de ligação formadopode ser descoberto usando alguma de um número de técnicas analíticasestabelecidas. A proteína que se liga ensaios inclui, mas não é limitada a,immunohistochemical ensaios de ligação, fluxo cytometry ou outros ensaios. Aproteína IL-6 utilizada em tais ensaios pode ser naturalmente expressa, clonada ousintetizada. Os métodos semelhantes podem ser usados para identificar domíniosmonoméricos ou multímeros que se ligam a IgG.

Os métodos de proteção da invenção podem ser executados comoem vitro ou ensaios baseados na célula. A célula baseou-se os ensaios podem serexecutados em qualquer célula na qual IL-6 é expresso. Os ensaios baseados nacélula podem implicar células inteiras ou frações de célula que contêm um receptorIL-6 para proteger para se ligadura de agente ou modulação da atividade de IL-6pelo agente. Os tipos de célula de exemplos que podem ser usados segundo osmétodos da invenção incluem, p. ex., qualquer célula mamífera, bem como célulasfungosas, inclusive levedura, e células bacterianas. As células podem ser célulasprimárias ou células de tumor ou outros tipos de linhas de célula imortais.Naturalmente, IL-6 pode ser expresso em células que não contêm endógenamenteIL-6. Além destes, uma versão se ligada pela membrana de IL-6 talvezexogenously expresso na superfície de células, levando em conta fluxo cytometryou outra se ligadura, proteção, ou métodos de seleção.

Os ensaios de atividade de IL-6 também podem ser usados paraidentificar um modulador (antagonista ou agonist) de IL-6. ai essas realizações, umou vários agentes de experiência são contse ligados a uma célula que exprime IL-6ou ao qual exogenous IL-6 foi acrescentado, e logo testado para uma atividade deIL-6. As atividades IL-6 de exemplos incluem proliferação de célula, respostasinflamatórias ou diferenciação. Ver, p. ex., Naka, T. e al, Artrite Res. 4:S233-S242(2002). Em outras realizações, os eventos rio abaixo moleculares também podemser controlados para determinar a atividade sinalizadora. Por exemplo, atransdução de sinal de IL-6 é mediada principalmente por duas vias: o JAK-STAT(família de Janus tirosina quinase - Transformador de Sinal e Ativador daTranscrição) via e o Ras proteína mitogênio-ativada quinase via cuja ativação podeser facilmente controlada usando conjuntos comercialmente disponíveis e métodosconhecidos àqueles experimentados na arte. Ver, p. ex., Ver, p. ex., Naka, T. e al,Artrite Res. 4:S233-S242 (2002).

Em algumas realizações, os ensaios de atividade também sãousados para confirmar que identificou o antagonista monômero s ou multímeros(isto é, que previnem se ligar de IL-6 a IL-6R) a falta a atividade de agonista (isto é,que eles não ativam IL-6R a ausência de IL-6 ou outro agonista).

Os agentes que são inicialmente identificados por algum dos métodosde varredura precedentes podem ser além destes testados para validar a atividadeevidente. Tais estudos podem ser conduzidos com modelos dos animaisadequados. O formato básico de tais métodos implica a administração de umcomposto principal identificado durante uma tela inicial a um animal que serve deum modelo de seres humanos e logo determinação se IL-6 for de fato moduladoe/ou a doença ou a condição é melhorada. Os modelos dos animais utilizados emestudos de validação geralmente são os mamíferos de qualquer espécie. Osexemplos específicos de animais adequados incluem, mas não são limitados a,primazes, ratos e ratos.

A seleção de domínios monoméricos que se ligam a IL-6 de umabiblioteca de domínios pode ser realizada por vários procedimentos. Por exemplo,um método de identificar domínios monoméricos que têm uma propriedadedesejada (p. ex., se Iiganteo IL-6 ou IgG) implica a tradução de uma pluralidade deácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio monomérico ,protegendo os polipeptídios codificados pela pluralidade de ácidos nucléicos, eidentificando aqueles domínios monoméricos que, p. ex., se ligam a a um Iigantedesejado ou a mistura de ligantes, por meio destes produzindo um domíniomonomérico selecionado. Os domínios monoméricos expressos por cada um dosácidos nucléicos podem ser testados para a sua capacidade de se ligar ao ligantepor métodos conhecidos na arte (isto é arrasar, afinidade chromatography, análisede FACS).

Como acima mencionado, a seleção de domínios monoméricos podeser baseada na se ligadura a um Iigante como IL-6, ou fragmento destes ou outramolécula alvo (p. ex., lipídio, carboidrato, ácido nucléico e assim por diante).Outras moléculas podem estar opcionalmente incluídas nos métodos junto com oalvo, p. ex., íons como Ca+2.Quando um domínio monomérico da invenção é selecionadobaseado na sua capacidade de se ligar a um ligante, a base de seleção podeincluir a seleção baseada em uma tarifa de destesciação lenta, que é normalmenteprofética da alta afinidade. A valência do ligante também pode ser variada paracontrolar a afinidade ligante média de domínios monoméricos selecionados. Oligante pode ser se ligado a uma superfície ou substrato em densidades variadas,como pela inclusão de um composto de concorrente, pela diluição, ou por outrométodo conhecido àqueles na arte. A alta densidade (a valência) de ligantepredeterminado pode ser usada para enriquecer para domínios monoméricos quetêm a afinidade relativamente baixa, ao passo que uma densidade baixa (valência)pode enriquecer preferencialmente para a afinidade mais alta domínios monoméricos.

Vários vetores de exposição de reportagem ou os sistemas podemser usados para exprimir ácidos nucléicos que codificam os domínios monoméricose/ou multímeros da presente invenção e testar para uma atividade desejada. Porexemplo, um sistema de exposição de fago é um sistema no qual os domíniosmonoméricos são expressos como proteína de fusão na superfície de fago(Pharmacia, Milwaukee Wis.). A exposição de Fago pode implicar a apresentaçãode uma seqüência de polipeptídio que codifica domínios monoméricos nasuperfície de um bacteriófago filamentoso, tipicamente como uma fusão com umaproteína de capa de bacteriófago.

Geralmente nesses métodos, cada partícula fago ou célula serve deum membro de biblioteca individual que expõe uma espécie única do polipeptídioexposto além do fago natural ou seqüências de proteína de célula. Os ácidosnucléicos são clonados no ADN fago em um sítio que resulta na transcrição deuma proteína de fusão, uma porção da qual é codificada pela pluralidade dosácidos nucléicos. O fago conter uma molécula ácida nucléica sofre a réplica e atranscrição na célula. A seqüência de líder da proteína de fusão dirige o transporteda proteína de fusão à ponta da partícula fago. Assim, a proteína de fusão que éparcialmente codificada pelo ácido nucléico é exposta na partícula fago dedetenção e seleção pelos métodos descritos em cima e em baixo. Por exemplo, abiblioteca fago pode ser incubada com um Iigante predeterminado como IL-6 ou umfragmento destes, para que as partículas fago que apresentam uma seqüência deproteína de fusão que se liga ao Iigante possam ser diferencialmente partilhadasdaqueles que não apresentam seqüências de polipeptídio que se ligam a ao Iigantepredeterminado. Por exemplo, a separação pode ser fornecida imobilizando oligante predeterminado. As partículas fago (isto é, membros de biblioteca) que sãose ligados ao Iigante imobilizado então são recuperadas e duplicadas paraamplificar a subpopulação fago selecionada de um círculo subseqüente deenriquecimento de afinidade e réplica fago. Depois de vários círculos deenriquecimento de afinidade e réplica fago, os membros de biblioteca fago que sãoassim selecionados são isolados e a seqüência nucleotídio que codifica aseqüência de polipeptídio exposta é determinada, por meio destes identificando aseqüência (s) de polipeptídios que se ligam a ao Iigante predeterminado. Taismétodos são além destes descritos na publicação de patente de PORCENTAGEMNúmeros 91/17271, 91/18980, e 91/19818 e 93/08278.

Os exemplos de outros sistemas de exposição incluem exposições deribosome, exposição nucleotídio-ligada (ver, p. ex., Patente dos Estados UnidosNúmero 6.281.344; 6.194.550, 6.207.446, 6.214.553, e 6.258.558), polium poucode exposição, a célula alisa exposições e assim por diante. As exposições desuperfície de célula incluem várias células, p. ex., E. coli, levedura e/ou célulasmamíferas. Quando uma célula é usada como uma exposição, ácidos nucléicos, p.ex., obtido pela amplificação PCR seguida por digestão, é introduzida na célula etraduzida. Opcionalmente, os polipeptídios que codificam os domíniosmonoméricos ou o multímeros da presente invenção podem ser introduzidos, p.ex., pela injeção, na célula.

O monômero e as bibliotecas multímero da invenção podem serprotegidos para uma propriedade desejada como a se ligadura de um Iigantedesejado (p. ex., IL-6) ou a mistura de ligantes. Por exemplo, os membros dabiblioteca de domínios monoméricos podem ser expostos e preprotegidos para seligar a um Iigante conhecido ou desconhecido ou uma mistura de ligantes. Asseqüências de domínio monomérico então podem ser mutagenized (p. ex.,recombinado, quimicamente alterado, etc.) ou de outra maneira alterado e osnovos domínios monoméricos pode ser protegido novamente para se ligar aoIigante ou a mistura de ligantes com uma afinidade melhorada. Os domíniosmonoméricos selecionados podem ser combinados ou juntados para formarmultímeros, que então pode ser protegido para uma afinidade melhorada ou avidezou especificidade alterada do Iigante ou a mistura de ligantes. A especificidadealterada pode significar que a especificidade é alargada, p. ex., a se ligadura dosmúltiplos relacionou ligantes, ou opcionalmente, a especificidade alterada podesignificar que a especificidade é estreitada, p. ex., se Iigante dentro de uma regiãoespecífica de um ligante. Aqueles da habilidade na arte reconhecerão que há umnúmero de métodos disponíveis para calcular a avidez. Ver, p. ex., Mammen et al.,Angew Chem Int. Editor 37:2754-2794 (1998); Muller e al, Anal. Biochem. 261:149-158 (1998).

Aqueles da habilidade na arte reconhecerão que os passos de gerarvariação e proteger para uma propriedade desejada podem ser repetidos (isto é,executados recursivamente) otimizar resultados. Por exemplo, em uma bibliotecade exposição de fago ou outro como formato, uma primeira proteção de umabiblioteca pode ser executada na severidade relativamente mais baixa, por meiodestes selecionou tão muitas partículas associadas com uma molécula alvoenquanto possível. As partículas selecionadas então podem ser isoladas e opolinucleotídios a codificação do monômero ou multímero pode ser isolada daspartículas. As variações adicionais então podem ser geradas dessas seqüências eposteriormente protegidas na afinidade mais alta.

Todas as composições da presente invenção, p. ex., domíniosmonoméricos bem como multímeros e bibliotecas destes podem ser opcionalmenteligadas a uma matriz de um material de afinidade. Os exemplos do material deafinidade incluem pérolas, uma coluna, um suporte sólido, uma microrede, outrosporções de colchetes do reagente, e assim por diante.Quando multímeros capaz de se ligar alvos relativamente grandessão desejados, eles podem ser gerados por um método de seleção "que anda".Este método é executado fornecendo uma biblioteca de domínios monoméricos eprotegendo a biblioteca de domínios monoméricos da afinidade a uma primeiramolécula alvo. Uma vez que pelo menos um monômero que se liga ao alvo éidentificado, que o monômero é covalentemente ligado a uma nova biblioteca oucada membro restante da biblioteca original de domínios monoméricos. Esta novabiblioteca de multímeros (dímeros) então é protegida para multímeros que se ligama ao alvo com uma afinidade aumentada, e um multímero que se liga ao alvo comuma afinidade aumentada pode ser identificado. "A marcha" monômero o métodode seleção fornece um modo de reunir um multímero que é composto demonômero s que pode atuar adicionalmente ou até sinergisticamente um com outrodado as restrições do comprimento ligante. Esta técnica que anda é muito útilselecionando para e reunindo multímeros que são capazes de se ligar a grandeproteína alvo com a alta afinidade. O método que anda pode ser repetido paraacrescentar mais monômero s que por meio destes resulta em um multímerocompreensão 2, 3, 4, 5, 6,7, 8 ou mais monômero s ligados em conjunto.

Em algumas realizações, o multímero selecionado compreende maisde dois domínios. Tal multímeros pode ser gerado em um passo moda, p. ex.,onde a adição de cada novo domínio é testada individualmente e o efeito dosdomínios é testado de uma maneira seqüente. Ver, p. ex., a figura 5. Em umarealização alternativa, os domínios são ligados para formar multímeros quecompreendem mais de dois domínios e selecionados para se ligarem semconhecimento prévio de como multímeros menores, ou alternativamente, comocada domínio, se liga.

Os métodos da presente invenção também incluem métodos dedesenvolver monômero s ou multímeros. A recombinação de Mra-domínio pode serintroduzida em monômero s através do monômero inteiro ou tomando as porçõesdo monômero s diferente para formar novas unidades recombinadas. Arecombinação de interdomínio (p. ex., recombinando monômero s diferente em ouentre multímeros) ou a recombinação de módulos (p. ex., múltiplo monômero sdentro de um multímero) podem ser realizadas. A recombinação de inter-bibliotecatambém é contemplada.

Os métodos para desenvolver monômero s ou multímeros podemcompreender, p. ex., algum ou todo o dos passos seguintes: fornecimento de umapluralidade de ácidos nucléicos diferentes, onde cada ácido nucléico que codificaum domínio monomérico ; tradução da pluralidade de ácidos nucléicos diferentes,que fornece uma pluralidade de domínios monoméricos diferentes; protegendo apluralidade de domínios monoméricos diferentes para se ligar do Iigante desejado(p. ex., IL-6) ou a mistura de ligantes; identificação dos membros da pluralidade dedomínios monoméricos diferentes que se ligam a o Iigante desejado ou a misturade ligantes, que fornece domínios monoméricos selecionados; junção dosdomínios monoméricos selecionados com pelo menos um Iigante para gerar pelomenos um multímero, em que pelo menos um multímero compreende pelo menosdois dos domínios monoméricos selecionados e pelo menos um ligante; e,protegendo pelo menos um multímero de uma afinidade melhorada ou avidez ouespecificidade alterada do ligante desejado ou mistura de ligantes comparandocom os domínios monoméricos selecionados.

A variação pode ser introduzida em monômero s ou em multímeros.

Um exemplo de melhorar monômero s inclui a recombinação de intra-domínio naqual dois ou mais (p. ex., três, quatro, cinco, ou mais) as porções do monômerosão amplificadas separadamente em condições de introduzir a variação (porexemplo arrastando os pés ou outro método de recombinação) em os produtos deamplificação resultantes, por meio destes sintetizando uma biblioteca de variantesde porções diferentes do monômero . Localizando os 5' fins dos primeres meios"em um meio" ou 'sobreposição' seqüência que ambos dos fragmentos PCR têmem comum, o lado "esquerdo" resultante e bibliotecas de lado "direitas" talvezcombinadas pela sobreposição PCR para gerar variantes novas do consórciooriginal de monômero s. Essas novas variantes então podem ser protegidas parapropriedades desejadas, p. ex., arrasadas contra um alvo ou protegidas para umefeito funcional. O primer (es) "meio" pode ser selecionado para corresponder aqualquer segmento do monômero, e será tipicamente baseado no andaime ou umou vários o consenso amino ácidos dentro do monômero (p. ex., cisteínas como osencontradas em domínios A).

Semelhantemente o multímeros pode ser criado introduzindo variaçãoao nível monômero e logo recombinando-se monômero bibliotecas de variantes.

Em uma maiores escala, multímeros (único ou porções) com propriedadesdesejadas pode ser recombinado para formar multímeros mais longo. Em algunscasos a variação é introduzida (tipicamente sinteticamente) no monômero s ou noIigantes para formar bibliotecas. Isto talvez realizou, p. ex., com dois multímerosdiferentes que se ligam a a dois alvos diferentes,' por meio destesconseqüentemente selecionando um multímero com uma porção que se liga a umalvo e uma porção que se liga um segundo alvo.

A variação adicional pode ser introduzida inserindo Iigantes decomprimento diferente e composição entre domínios. Isto leva em conta a seleçãode ótimo Iigantes entre domínios. Em algumas realizações, o ótimo comprimento ea composição de Iigantes levarão em conta a ótima se ligadura de domínios. Emalgumas realizações, os domínios com uma determinada afinidade (s) Iigante sãoligados via Iigantes diferente e ótimos Iigantes são selecionados em um ensaio deligação. Por exemplo, os domínios são selecionados para propriedades Iigantesdesejadas e logo formados em uma biblioteca que compreende vário ligantes. Abiblioteca então pode ser protegida para identificar ótimo ligantes.Alternativamente, multímero bibliotecas pode ser formado onde o efeito do domínioou Iigante na se ligadura de molécula alvo não é conhecido.

Os métodos da presente invenção também incluem a geração de umou vários selecionou multímeros fornecendo uma pluralidade de domíniosmonoméricos. A pluralidade de domínios monoméricos é protegida para se ligar deum Iigante desejado ou a mistura de ligantes. Os membros da pluralidade dedomínios que se ligam a o Iigante desejado ou a mistura de ligantes sãoidentificados, por meio destes provendo domínios com uma afinidade desejada. Osdomínios identificados são juntados com pelo menos um Iigante para gerar omultímeros, em que cada multímero compreende pelo menos dois dos domíniosselecionados e pelo menos um ligante; e, os multímeros são protegidos para umaafinidade melhorada ou avidez ou especificidade alterada do ligante desejado ou amistura de Iigantes comparando com os domínios selecionados, por meio destesidentificando um ou vários selecionou multímeros.

As bibliotecas de Multímero podem ser geradas, em algumasrealizações, combinando duas ou mais bibliotecas ou monômero s ou multímerosem uma aproximação recombinase-fundada, onde cada membro de bibliotecacompreende como sítio de recombinação (p. ex„ um sítio de oxigênio líquido). Ummaiores consórcio de membros de biblioteca molecularmente diversos em princípioabriga mais variantes com propriedades desejadas, como afinidades Iigantes peloalvo mais altas e atividades funcionais. Quando as bibliotecas são construídas emvetores de fago, que podem ser transformados em E. coli, o tamanho de biblioteca(109-1010) é limitado pela eficiência de transformação de E. coli. ao sistema desítio de recombinase/recombinação (p. ex„ o sistema Cre-loxP) e na recombinaçãovivo podem ser explorados para gerar bibliotecas que não são limitadas notamanho pela eficiência de transformação de E. coli.

Por exemplo, o sistema Cre-IoxP pode ser usado para gerarbibliotecas dimer com 1010,1011,1012,1013, ou maior diversidade. Em algumasrealizações, E. coli como um anfitrião de uma biblioteca monômero ingênua e umfilamentous fago que transporta uma segunda biblioteca monômero ingênua éusado. O tamanho de biblioteca neste caso é limitado só pelo número de infectivefago (transporte de uma biblioteca) e o número de infectible E. coli células(transportando outra biblioteca). Por exemplo, infeccionando 1012 E. coli células(1L em OD600=1) com> 1012 fago podem produzir não menos que 1012combinações dimer.

A seleção de multímeros pode ser realizada usando várias técnicasinclusive os acima mencionados para identificar domínios monoméricos. Outrosmétodos de seleção incluem, p. ex., uma seleção baseada em uma afinidademelhorada ou avidez ou especificidade alterada do Iigante em comparação comdomínios monoméricos selecionados. Por exemplo, uma seleção pode serbaseada na se ligadura seletiva a tipos de célula específicos, ou a um jogo decélulas relacionadas ou tipos de proteína (p. ex., vírus diferente serotypes). Aotimização da propriedade selecionada para, p. ex., a avidez de um ligante, entãopode ser realizada recombinando os domínios, bem como manipulando amino aseqüência ácida dos domínios monoméricos individuais ou o domínio ligante ou aseqüência nucleotídio que codifica tais domínios, como mencionado na presenteinvenção.

Um método para identificar multímeros pode ser realizado expondo omultímeros. Como com os domínios monoméricos, os multímeros sãoopcionalmente expressos ou expostos em vários sistemas de exposição, p. ex.,fago exposição, ribosome exposição, polium pouco de exposição, exposiçãonucleotídio-ligada (ver, p. ex., Patente dos Estados Unidos Número 6.281.344;6.194.550, 6.207.446, 6.214.553, e 6.258.558) e/ou célula alisam a exposição,como descrito em cima. As exposições de superfície de célula podem incluir masnão são limitadas a E. coli, levedura ou células mamíferas. Além do mais, asbibliotecas de exposição de multímeros com múltiplos sítios de ligação podem serarrasadas para avidez ou afinidade ou especificidade alterada de um ligante ou demúltiplo ligantes.

O Monômero s ou multímeros podem ser protegidos para o alvoatividade ligante em células de levedura que usam um ensaio de proteção de doishíbridos. Neste tipo da tela o monômero ou a biblioteca multímero a ser protegidasão clonados em um vetor que dirige a formação de uma proteína de fusão entrecada monômero ou multímero da biblioteca e uma levedura transcriptionalactivator fragmento (isto é, Gal4). As seqüências que codificam a proteína "alvo"são clonadas em um vetor que resulta na produção de uma proteína de fusão entreo alvo e o resto da proteína Gal4 (o ADN domínio de ligação). Um terço plasmídiocontém um gene de repórter rio abaixo da seqüência de ADN do Gal4 sítio deligação. Um monômero que pode se ligar à proteína alvo traz com ele o domíniode ativação Gal4, assim reconstituindo uma proteína Gal4 funcional. Esta proteínaGal4 funcional se ligada ao sítio de ligação rio acima do gene de repórter resulta naexpressão do gene de repórter e a seleção do monômero ou multímero como umalvo proteína ligante, (ver Chien et.al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. (Os EUA)88:9578; Campos S. e Canção O. (1989) Natureza 340: 245) a Utilização de umsistema de dois híbridos da proteção de biblioteca é além destes descrita em n.5.811.238 Evidente dos Estados Unidos (ver também S.C. de Prse liga e CaceS.W. (1993) Mol Biol. Representante. 17:155; Durfee et al. (1993) Genes Devei.7:555; Yang et al. (1992) Ciência 257:680; Luban et al. (1993) Célula 73:1067;Resistente et al. (1992) Genes Devei. 6:801; Bartel et al. (1993) Biotechniques14:920; e Vojtek et al. (1993) Célula 74:205). Outro sistema de proteção útil paraexecutar a presente invenção é o sistema de proteção interativo E.coWBCCP(Germino et al. (1993) Proc. Nat. Acad. Sei. (U.S.A.) 90:993; Guarente L. (1993)Proc. Nat. Acad. Sei. (U.S.A). 90:1639).

Outras variações incluem o uso de múltiplos compostos de ligação, talque os domínios monoméricos, multímeros ou as bibliotecas dessas moléculaspodem ser simultaneamente protegidos para uma multiplicidade de Iigantes oucompostos que têm a especificidade ligante diferente. Múltiplo predeterminouligantes ou os compostos podem ser concomitantly protegido em uma bibliotecaúnica, ou proteção seqüente contra um número de domínios monoméricos oumultímeros. Em uma variação, múltiplo Iigantes ou os compostos, cada umcodificado em uma conta separada (ou o subconjunto de pérolas), podem sermistos e incubados com domínios monoméricos, multímeros ou bibliotecas dessasmoléculas em condições ligantes adequados. A coleção de pérolas,compreendendo múltiplo ligantes ou compostos, então pode ser usada para isolar,pela seleção de afinidade, selecionou domínios monoméricos, selecionou membrosde biblioteca ou multímeros. Geralmente, a afinidade subseqüente que protegecírculos pode incluir a mesma mistura de pérolas, subconjuntos destes, ou pérolasque contêm só um ou dois Iigantes individuais ou compostos. Esta aproximaçãopermite a proteção eficiente, e é compatível com automação de laboratório,processamento de lote, e alta quantidade trse ligada que protege métodos.

Em outra realização, o multímeros pode ser simultaneamenteprotegido para a capacidade de se ligar múltiplo ligantes, em que cada Iigantecompreende uma etiqueta diferente. Por exemplo, cada Iigante pode ser etiquetadocom uma etiqueta fluorescente diferente, contse ligada simultaneamente com ummultímero ou biblioteca multímero. Os Multímeros com a afinidade desejada entãosão identificados (p. ex., por FACS que classifica) baseado na presença dasetiquetas ligadas às etiquetas desejadas.

As bibliotecas de domínios monoméricos ou de multímeros (enviadona discussão seguinte da conveniência como "agentes de afinidade") podem serprotegidas (isto é, arrasadas) simultaneamente contra múltiplo ligantes em umnúmero de formatos diferentes. Por exemplo, múltiplo ligantes pode ser protegidoem uma mistura simples, em uma tabela, exposta em uma célula ou tecido (p. ex-uma célula ou o tecido fornecem moléculas numerosas que podem ser ligadaspelos domínios monoméricos ou multímeros da invenção), e/ou imobilizou. Asbibliotecas de agentes de afinidade podem ser opcionalmente expostas emlevedura ou sistemas de exposição de fago. Semelhantemente se desejado, oligantes (p. ex., codificado em uma biblioteca cDNA) pode ser exposto em umalevedura ou sistema de exposição de fago.

Inicialmente, a biblioteca de agente de afinidade é arrasada contramúltiplo ligantes. Opcionalmente, "os golpes" resultantes são arrasados contra oligantes um ou vários tempos para enriquecer a população resultante de agentesde afinidade.

Se desejado, a identidade dos agentes de afinidade individuais e/ouligantes pode ser determinada. Em algumas realizações, os agentes de afinidadesão expostos em fago. Os agentes de afinidade identificaram como se Iiganteo natela inicial são divididos em uma primeira e segunda porção. A primeira porção éinfeccionada em bactérias, resultando em placas ornamentais ou em colôniasbacterianas, dependendo do tipo de fago usado. Os fago expressos sãoimobilizados e logo tentados com ligantes exposto em fago selecionado comodescrito em baixo.

A segunda porção é ligada a pérolas ou de outra maneira imobilizadae uma biblioteca de exposição de fago que contém pelo menos alguns Iigantes namistura original é contse ligada à segunda porção imobilizada. Os Fago que seligam a à segunda porção estão posteriormente eluted e contse ligados ao fagoimobilizado descrito no parágrafo em cima. As interações de Fago-fago sãodescobertas (p. ex., usando um anticorpo monoclônico específico para a Iigante-expressão fago) e o fago resultante o polinucleotídios pode ser isolado.

Em algumas realizações, a identidade de um par de agente-ligante deafinidade é determinada. Por exemplo, quando tanto o agente de afinidade como oligante são expostos em um fago ou levedura, o ADN do par pode ser isolado eseqüenciado. Em algumas realizações, os polinucleotídios específicos para oligante e agente de afinidade são amplificados. Amplificação os primeres de cadareação podem incluir 5' seqüências que são complementares tal que os produtosde amplificação resultantes são fundidos, por meio destes formando um híbridopolinucleotídio compreensão de um polinucleotídio que codifica pelo menos umaporção do agente de afinidade e pelo menos uma porção do ligante. O híbridoresultante pode ser usado para tentar o agente de afinidade ou ligante (p. ex.,cDNA-codificado) polinucleotídio bibliotecas para identificar tanto agente deafinidade como ligante.

O acima mencionado - os métodos descritos podem ser prontamentecombinados "com a marcha" para gerar simultaneamente e identificar múltiplosmultímeros, cada um dos quais se ligam a a um ligante em uma mistura deligantes. Nessas realizações, uma primeira biblioteca de agentes de afinidade(domínios monoméricos ou multímeros) é arrasada contra múltiplo ligantes e osagentes de afinidade elute'd são ligados ao primeiro ou uma segunda biblioteca deagentes de afinidade para formar uma biblioteca de agentes de afinidademultímeroic (p. ex., compreendendo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais monômero ), quesão posteriormente arrasados contra múltiplo ligantes. Este método pode serrepetido para continuar gerando maioress agentes de afinidade multímeroic.Aumento do número de domínios monoméricos pode resultar em afinidadeaumentada e avidez de um determinado alvo. Por exemplo, os inventoresencontraram que trímeros de domínios monoméricos que se ligam a CD28 têmuma afinidade mais alta do que reguladores para iluminação, que à sua vez têmuma afinidade mais alta do que a CD28-se ligadura única domínios monoméricossozinhos. Naturalmente, em cada etapa, arrasar é opcionalmente repetido paraenriquecer para pastas para guardar papeis significantes. Em alguns casos, amarcha será facilitada inserindo sítios de recombinação (p. ex„ sítios de oxigêniolíquido) nos fins de monômero s e recombinação monômero bibliotecas por umevento recombinase-mediado.

O multímeros selecionado dos acima mencionados métodos pode seralém destes manipulado, p. ex„ recombinando-se ou misturando o multímerosselecionado (a recombinação pode ocorrer entre ou dentro de multímeros ouambos), transformando o multímeros selecionado, e assim por diante. Isto resultaem multímeros alterado que então pode ser protegido e selecionado para membrosque têm uma propriedade realçada em comparação com o multímero selecionado,por meio destes produzindo selecionado alterou multímeros.

Em vista da descrição neste lugar, é claro que o processo seguintepode ser seguido. Naturalmente ou de ocorrência não natural domíniosmonoméricos pode ser recombinada ou as variantes podem ser formadas.Opcionalmente os domínios inicialmente ou depois são selecionados para aquelasseqüências que com menor probabilidade serão imunogênico no anfitrião para oqual eles são destinados. Opcionalmente, uma biblioteca fago que compreende osdomínios recombinados é arrasada para uma afinidade desejada. Os domíniosmonoméricos ou multímeros expresso pelo fago podem ser protegidos para IC50de um alvo. O Hetero-ou homo-meric multímeros podem ser selecionados. Ospolipeptídios selecionados podem ser selecionados para a sua afinidade aqualquer alvo, inclusive, p. ex., hetero-ou alvos de homo-multímeroic.

Os ligantes, multímeros ou multímeros selecionado produzido pelosmétodos indicados em cima e em baixo são as características da presenteinvenção. Fornecem a bibliotecas que compreendem multímeros, por exemplo,uma biblioteca que compreende aproximadamente 100.250, 500 ou mais membrosproduzidos pelos métodos da presente invenção ou selecionado pelos métodos dapresente invenção. Em algumas realizações, uma ou vária célula que compreendemembros das bibliotecas, também estão incluídos. As bibliotecas dos polipeptídiosrecombinante são também uma característica da presente invenção, p. ex., umabiblioteca que compreende aproximadamente 100.250, 500 ou mais recombinantediferentes polypetides.

As composições da presente invenção podem ser ligadas a umamatriz de um material de afinidade, p. ex., os polipeptídios recombinante. Osexemplos do material de afinidade incluem, p. ex., pérolas, uma coluna, um suportesólido, e/ou o parecido.

VII. MÉTODOS DE TRSE LIGAM AENTO TERAPÊUTICOS EPROFILÁTICOS

A presente invenção também inclui métodos de terapeuticamente ouprophylactically trato de uma doença ou desordem administrando em vivo ouexceto vivo um ou vários ácidos nucléicos ou os polipeptídios da invenção descritaem cima (ou composições que compreendem um excipiente farmacêuticamenteaceitável e um ou vários tais ácidos nucléicos ou polipeptídios) a um sujeito,inclusive, p. ex., um mamífero, inclusive um ser humano, primaz, rato, porco, vaca,cabra, coelho, rato, porco de Guiné, hamster, cavalo, ovelhas; ou um vertebradonão-mamífero como um pássaro (p. ex., um frango ou pato), peixe, ouinvertebrado.

Os antagonistas de IL-6, inclusive polipeptídios que compreendemIigantes de IL-6 domínios monoméricos ou multímeros da invenção são úteis notrse Iigamento de um número de doenças humanas. Os domínios Ligantes de IL-6de exemplos incluem as seqüências específicas reveladas neste lugar, inclusive,mas não limitados a:

Família 1 motivo (SEQ ID NO:27):

CX [COMO] [DN] EFXCXXGXC [ILV] XXAXXCDGV [DN]DCXDNSDEXXC [AST] XX [AST]

Família 2 motivo (SEQ ID NO:28):

CXXXQFXC [DN] NGXCVPXXWXCDG [DE] [DN] DCXD [DN]

SDEXXCXXP [AST]

Família 3 motivo (SEQ ID NO:29):

CXXXQFQCXSG [W, Y] C [EU, L, F] XXXW [V, L]

CDGXNDCEDXSDEXXC

Família 4 motivo (SEQ ID N0:30):

CXXX [EQ] FXCXXGXC [ILV] XXXXXCDGX [DN] DCXDXSDEXX(XX) C

Família 5 motivo (SEQ ID NO:31):

CX [A, Ρ] X [E, Q] FXCXXGQC [EU, L] PXXXXCDGX [D, N]

DCXDXSDEXXC

Família 6 motivo (SEQ ID NO:32):

CXXX [EQ] FXCX (X) SXXC [ILV] XX [DN] W [ILV]

CDGVNDCXDXSDEXGCXXXT

Família 7 motivo (SEQ ID NO:33):

CL [COMO] X [EQ] FXCXNGXCIP [KQR] XWVCDGDNDC [ILV]

DXSDE (P) XXCX [EKQ] XT.

As doenças humanas de exemplos para as quais o antagonismo deIL-6 é melhorador incluem, p. ex.:

Doenças autoimunes e inflamatórias (como psoríase, psoriatic artrite,artrite reumatóide, artrite reumatóide juvenil, a Doença de Still, a Doença de Crohn,colite ulcerativa, Lupus Sistêmico Erythematosus, Nefrite de Lupus, MúltiplaEsclerose, Osteoarthritis, a Doença de Castleman, sepsia e Guillan BarreSíndrome),

Cancro (como, Múltiplo Myeloma1 Carcinoma de Célula Renal, Cancrode Peito, Outros tumores sólidos (dois pontos, pancreáticos, gástricos, etc.),Linfoma, Leucemia)

Doenças metabólicas/endócrinas (como Tipo Il Diabete (resistênciade insulina); Osteoporosis; o Dyslipidemias (aumenta a alta Iipoproteina dedensidade, HDL1 como a parte de prevenção e/ou trato artherosclerosis, doença deartéria coronária, etc.), Anti-envelhecimento, desordens de fígado (p. ex„ fibrose defígado));

Doença cardiovascular (como Doença de Artéria Coronária);Doença pulmonar (como Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica,

Fibrose Pulmonar Intersticial, Asma); e

Doenças neurológicas (como a Doença de Parkinson, a Doença deAlzheimer1 Múltipla Esclerose, Golpe).

Em alguns aspectos, um monômero ou multímero da invenção éadministrado a um indivíduo com pelo menos uma outra molécula usada para trseIigamento de um dos acima mencionados - doenças enumeradas. Outra moléculapode estar preparada em uma formulação com o monômero ou multímero ou seradministrada simultaneamente ou antes ou depois do monômero ou multímero éadministrado.

Em algumas realizações, um polipeptídio que compreende ummonômero ou multímero da invenção que se liga IL-6 é usado para aumentar altoslipídios de densidade (HDLs) em um indivíduo. O indivíduo pode ser aquele quetem uma história de família da doença de coração ou de outra maneira é em perigode efeitos de saúde doentes de alto colesterol, altos níveis LDL ou baixo níveis deHDL. O IL-6 é um mediador importante do metabolismo de lipídio. Isto éevidenciado pelo fato que os níveis de colesterol sobem no rato de nocaute IL-6,mas em IL-6 transgenic ratos os níveis de colesterol baixam. Os anticorpos de serhumano anti-IL-6 causam que o nível de colesterol total, nível de LDL1 e níveltriglyceride suba significativamente (P = <0.001). O HDL sobe significativamentetambém (P = <.001). O LDL sobe 12-23 % na maneira dependente da dose com oanticorpo anti-IL-6R humanizado (MRA). O HDL sobe -26 % de maneiradependente da dose com o mesmo anti-IL-6R anticorpo. Ver, p. ex., Nishimoto e al,o Jornal de Rheumatology (2003); Nishimoto e al, Artrite & Reumatismo (2004).

Em algumas realizações, um polipeptídio que compreende ummonômero ou multímero da invenção que se liga IL-6 é administrado nacombinação com uma droga que reduz níveis LDL. Statins1 as resinas(cholestyramine, colestipol, colesevalam) e ácido nicotinic são os exemplos dasdrogas que reduz níveis LDL. Statins de exemplos incluem, mas não são limitadosa, atorvastatin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, rosuvastatin, e simvastatin.

Em um aspecto da invenção, em exceto métodos vivo, uma ou váriascélulas ou uma população de células de interesse do sujeito {p. ex., células detumor, amostra de tecido de tumor, células de órgão, células sangüíneo, células dapele, pulmão, coração, músculo, cérebro, mucosae, fígado, intestino, baço,estômago, sistema linfático, cerviz, vagina, próstse liga, boca, língua, etc.) sãoobtidos ou retirados do sujeito e contse ligados com um montante de um domíniomonomérico selecionado e/ou multímero da invenção que é eficaz emprophylactically ou terapeuticamente trato da doença, desordem, ou outracondição. As células contligadas então são devolvidas ou entregues ao sujeito aosítio do qual eles foram obtidos ou a outro sítio {p. ex., inclusive os definidos emcima) do interesse no sujeito a ser trse ligado. Se desejado, as células contligadaspodem ser enxertadas para um tecido, órgão, ou sítio de sistema (inclusive todosdescrito em cima) do interesse na utilização sujeita técnicas de enxerto padrão ebem conhecidas ou, p. ex., entregaram ao sangue ou sistema de Iinfa que usaentrega padrão ou técnicas de transfusão.

A invenção também provê em métodos vivo nos quais uma ou váriascélulas ou uma população de células do interesse do sujeito são contligadasdiretamente ou indiretamente com um montante de um domínio monoméricoselecionado e/ou multímero da invenção eficaz em prophylactically outerapeuticamente trato da doença, desordem, ou outra condição. Em formatos decontato/administração diretos, o domínio monomérico selecionado e/ou multímeroé tipicamente administrado ou transferido diretamente às células a ser trligadas ouao sítio de tecido do interesse {p. ex., células de tumor, amostra de tecido detumor, células de órgão, células sangüíneo, células da pele, pulmão, coração,músculo, cérebro, mucosae, fígado, intestino, baço, estômago, sistema linfático,cerviz, vagina, próstse liga, boca, língua, etc.) por algum de vários formatos,inclusive administração atual, injeção {p. ex., usando uma agulha ou seringa), ouvacina ou entrega de arma genética, empurrando em um tecido, órgão, ou sítio depele. O domínio monomérico selecionado e/ou multímero podem ser entregues,por exemplo, intramuscularmente, intradermally, subdermally, subcutaneamente,oralmente, intraperitoneally, intrathecally, intravenosamente, ou colocados dentrode uma cavidade do corpo (inclusive, p. ex., durante a cirurgia), ou por inalação ouadministração vaginal ou retal. A entrega de exemplo inclui, p. ex., entrega oral(buccal ou compreensão/entrega intestinal), em casa injeção (p. ex., formulado emaproximadamente um 1.4 volume ml ou menos), transdermalcompreensão/entrega, subcutaneamente implantable bomba,compreensão/entrega pulmonar (sistêmico ou não-sistêmico),compreensão/entrega de barreira cerebral do sangue, e/ou compreensão/entreganasal.

As aproximações de desenho para a entrega oral incluem, p. ex.,inclusive no monômero ou multímero uma afinidade Iigante de transportadores depeptídio mucosal como PepTI, PepT2, HPT1, FAMÍLIA DO ALFABETO; adição deum domínio de deslocação (PE38 ou PE40 de Pseudomonas exotoxin A) aomonômero ou multímero; ou inclusive uma afinidade Iigante de transportadores debarreira cerebrais pelo sangue como receptor Transferrin.

Quatro mecanismos primários para a entrega transepitelial são:Transcelular: pela célula por difusão: pela maior parte usado porpequenas moléculas.

Paracelular: em volta das células por ligações desmossomas/tight:pela maior parte usado porpeptídios hidrofílicos

Transcytosis: pelas células dentro de vesículas por pinocytosisA transportadora - ou Mediado no transportador, para moléculas quese ligam a ao transportador/transportadora

Em outra aproximação, o monômero ou multímero é projetado parase ligar a receptores na superfície de célula ou dentro de vesículas que sãoativamente transportadas através da célula ao soro, transportando a droga aolongo. Tais receptores são chamados Transportadores. Tal receptor é aimunoglobulina neonse ligai receptor de Fc (FcRn) que pode ser usado para aentrega pulmonar e intestinal ao soro. Outro receptor é o receptor Transferrin, quepode transportar através da barreira cerebral pelo sangue no fluido cerebrospinal.Alternativamente, o monômero ou multímero são projetados para se ligar aoneonse ligai Fc o receptor do transporte pulmonar e intestinal. Este método podeimplicar a engenharia do produto de droga final de pH lançamento sensível.

Em vista do acima mencionado, várias estratégias são possíveis. OMonômero s ou multímeros que se ligam a transportadores conhecidos (p. ex„pepTli Hp-Mi pepT2, família de ALFABETO, TAP1, TAP2, MDR) podem seridentificados. Outras pastas para guardar papeis úteis podem ser identificadasidentificando monômero s ou multímeros que se ligam a a células Caco2 (p. ex.,usando uma compreensão que bloqueia ensaio que usa compreensão de 14C-Cephalexin por células Caco2). Ver, p. ex., Blanchette, J., e ai Biomedicina eFarmacoterapia 58:142-151 (2004); Baixo, S.C., e a Reprodução ai Humana -promove o acesso 7 de Abril de 2005; Sotavento1 V./. Instituto de Cancro de Natl,Monografias 29 (2001); Rubas, W., et al. J. Pharm. Sei. 85:165-169 (1996); Yang,C.Y., etal. Pesquisa Farmacêutica 16:1331-1343 (1999); Dietrich, C.G., et al.Estripe 52:1788-1799 (2003); Cleland, J.L., et al. Opinião Atual em Biotecnologia12:212-219 (2001); Nielsen, C.U. e Brodin, Β. A Droga Atual Visa 4:373-388(2004); Kunta, J.R., etal. Metabolismo de Droga Atual 5:109-124 (2004).

Em outra aproximação, uma biblioteca fago de multímeros pode seraplicada à cavidade oral de um mamífero e fago ou o ADN do fago pode serrecuperado no soro do animal para enriquecer para seqüências que são bonsagentes de entrega. Os domínios naturais ou os peptídios que são conhecidos seroralmente transportados também podem ser fundidos a monômero s ou multímerosda invenção. Em ainda outra alternativa, fago domínios expostos são selecionadospara a resistência ao fluido de corpo apropriado (nasal, intestinal, etc.) ou apurificado proimportuna.

Em formatos de contato/administração indiretos vivo, o domíniomonomérico selecionado e/ou multímero é tipicamente administrado ou transferidoindiretamente às células a ser trligadas ou ao sítio de tecido do interesse, inclusiveos descritos em cima (como, p. ex., esfole células, sistemas de órgão, sistemalinfático, ou sistema de célula sangüíneo, etc.) Contse Iiganteo ou administrando opolipeptídio da invenção diretamente a uma ou várias células ou a população decélulas das quais o trse ligam aento pode ser facilitado. Por exemplo, as células detumor dentro do corpo do sujeito podem ser trligadas contse Iiganteo com ascélulas do sangue ou sistema linfático, pele, ou um órgão com um montantesuficiente do domínio monomérico selecionado e/ou multímero tal que a entrega dodomínio monomérico selecionado e/ou multímero ao sítio do interesse {p. ex.,tecido, órgão, ou células de interesse ou sangue ou sistema linfático dentro docorpo) ocorre e resultados de trse ligam aento profiláticos ou terapêuticos eficazes.Tal contato, a administração, ou a transferência são tipicamente feitos usando umaou várias das vias ou os modos da administração descrita em cima.

Em outro aspecto, a invenção provê exceto métodos vivo em queuma ou várias células do interesse ou uma população de células do interesse dosujeito {p. ex., células de tumor, amostra de tecido de tumor, células de órgão,células sangüíneo, células da pele, pulmão, coração, músculo, cérebro, mucosae,fígado, intestino, baço, estômago, sistema linfático, cerviz, vagina, próstse liga,boca, língua, etc.) são obtidos ou retirados do sujeito e transformados contseIiganteo disse uma ou várias células ou a população de células com um construtode polinucleotídio que compreende uma seqüência ácida nucléica da invenção quecodifica um polipeptídio biologicamente ativo do interesse {p. ex., um domíniomonomérico selecionado e/ou multímero) que é eficaz em prophylactically outerapeuticamente trato da doença, desordem, ou outra condição. Uma ou váriascélulas ou a população de células são contligadas com um montante suficiente doconstruto de polinucleotídio e um promotor que controla a expressão da seqüênciaácida nucléica dita tal que a compreensão do construto de polinucleotídio (epromotor) na célula (s) ocorre e a expressão suficiente do alvo a seqüência ácidanucléica dos resultados de invenção para produzir um montante do polipeptídiobiologicamente ativo, codificando um domínio monomérico selecionado e/oumultímero, eficaz a prophylactically ou terapeuticamente trse ligam a a doença,desordem, ou condição. O construto de polinucleotídio pode incluir uma seqüênciade promotor (p. ex„ seqüência de promotor de CMV) que controla a expressão daseqüência ácida nucléica da invenção e/ou, se desejado, uma ou váriasseqüências nucleotídio adicionais que codificam pelo menos um ou vários de outropolipeptídio da invenção, um citocina, adjuvant, ou co-stimulatory molécula, ououtro polipeptídio do interesse.

Depois de transfection, as células transformadas são devolvidas,entregues, ou transferidas ao sujeito ao sítio de tecido ou sistema do qual elesforam obtidos ou a outro sítio (p. ex„ células de rumor, amostra de tecido de tumor,células de órgão, células sangüíneo, células da pele, pulmão, coração, músculo,cérebro, mucosae, fígado, intestino, baço, estômago, sistema linfático, cerviz,vagina, próstse liga, boca, língua, etc.) ser trse ligado no sujeito. Se desejado, ascélulas podem ser enxertadas para um tecido, pele, órgão, ou sistema de corpo dointeresse na utilização sujeita técnicas de enxerto padrão e bem conhecidas ouentregues ao sangue ou sistema linfático que usa entrega padrão ou técnicas detransfusão. Tal entrega, a administração, ou a transferência de célulastransformadas são tipicamente feitas usando uma ou várias das vias ou os modosda administração descrita em cima. A expressão do alvo o ácido nucléico ocorrenaturalmente ou pode ser induzido (como descrito no maior detalhe em baixo) eum montante do polipeptídio codificado é expresso suficiente e eficaz de trse ligara doença ou condição no sistema de tecido ou o sítio.

Em outro aspecto, a invenção provê em métodos vivo nos quais umaou várias células do interesse ou uma população de células do sujeito (p. ex.,inclusive aquelas células e sistemas de células e submete descrito em cima) sãotransformados no corpo do sujeito contse Iiganteo com a célula (s) ou a populaçãode células (com ou administrando ou transferindo para a célula (s) ou a populaçãode células que usam uma ou várias das vias ou os modos da administraçãodescrita em cima) um construto de polinucleotídio que compreende uma seqüênciaácida nucléica da invenção que codifica um polipeptídio biologicamente ativo dointeresse (p. ex., um domínio monomérico selecionado e/ou multimero) que eeficaz em prophylactically ou terapeuticamente trato da doença, desordem, ououtra condição.

O construto de polinucleotídio pode ser diretamente administrado outransferido à célula (s) que sofre da doença ou desordem (p. ex., pelo contatodireto que usa uma ou várias das vias ou os modos da administração descrita emcima). Alternativamente, o construto de polinucleotídio pode ser indiretamenteadministrado ou transferido à célula (s) que sofre da doença ou desordem pelacélula (s) não-doente primeira que contse liga diretamente ou outras célulasdoentes que usam uma ou várias das vias ou os modos da administração descritaem cima com um montante suficiente do construto de polinucleotídio quecompreende a seqüência ácida nucléica codificação do polipeptídio biologicamenteativo, e um promotor que controla a expressão da seqüência ácida nucléica, tal quea compreensão do construto de polinucleotídio (e promotor) na célula (s) ocorre e aexpressão suficiente da seqüência ácida nucléica dos resultados de invenção paraproduzir um montante do polipeptídio biologicamente ativo eficaz a prophylacticallyou terapeuticamente trse ligar a doença ou desordem, e pelo qual o construto depolinucleotídio ou o polipeptídio expresso resultante são transferidos naturalmenteou automaticamente do sítio de entrega inicial, sistema, tecido ou órgão do corpodo sujeito ao sítio doente, tecido, órgão ou sistema do corpo do sujeito (p. ex., via osangue ou sistema linfático). A expressão do alvo o ácido nucléico ocorrenaturalmente ou pode ser induzido (como descrito no maior detalhe em baixo) talque um montante do polipeptídio expresso é suficiente e eficaz trse ligar a doençaou condição no sistema de tecido ou o sítio. O construto de polinucleotídio podeincluir uma seqüência de promotor (p. ex., seqüência de promotor de CMV) quecontrola a expressão da seqüência ácida nucléica e/ou, se desejado, uma ouvárias seqüências nucleotídio adicionais que codificam pelo menos um ou váriosde outro polipeptídio da invenção, um citocina, adjuvante, ou molécula co-estimulatório, ou outro polipeptídio do interesse.

[274] Em cada um do em vivo e exceto métodos de trse Iigamentovivo como descrito em cima, uma composição que compreende um excipientee e opolipeptídio ou o ácido nucléico da invenção pode ser administrada ou entregue.Em um aspecto, uma composição que compreende um excipientefarmacêuticamente aceitável e um polipeptídio ou o ácido nucléico da invenção éadministrada ou entregue ao sujeito como descrito em cima em um montanteeficaz de se ligar a doença ou desordem.

[275] Em outro aspecto, em cada um em vivo e exceto o método dese ligar in vivo descrito acima, o montante de polinucleotídio administrado à célula(s) ou sujeito pode ser um montante tal que a compreensão de polinucleotídio ditoem uma ou várias células do sujeito ocorre e a expressão suficiente de resultadosde seqüência ácidos nucléicos ditos para produzir um montante de um polipeptídiobiologicamente ativo eficaz de realçar uma resposta imune no sujeito, inclusiveuma resposta imune induzida por um immunogene (p. ex., antígeno), oi outroaspecto, para cada tal método, o montante do polipeptídio administrado a célula (s)ou sujeito pode ser um montante suficiente para realçar uma resposta imune nosujeito, inclusive isto induzido por um immunogene (p. ex., antígeno).

[276] Em ainda outro aspecto, em um em vivo ou no método de seligar in vivo no qual um polinucleotídio constroem (ou composição que compreendeum construto de polinucleotídio) é usado para entregar um polipeptídiofisiologicamente ativo a um sujeito, a expressão do construto de polinucleotídiopode ser induzida usando um indutível em - e expressão fora do genesistema. Os exemplos de tal em - e sistemas de expressão fora dogene incluem o Tet-em ™ Sistema de Expressão Genético e Tet-de ™ Sistema deExpressão Genético (ver, p. ex., Catálogo de Clontech 2000, pg. 110-111 para umadescrição detalhada de cada tal sistema), respectivamente. Outro controlável ouindutível em - e sistemas de expressão fora do gene são conhecidos àqueles dahabilidade ordinária na arte. Com tal sistema, a expressão do alvo nucléico doconstruto de polinucleotídio pode ser regulada em uma maneira de se ligar,reversível, e quantitativa. A expressão genética do alvo o ácido nucléico pode serinduzido, por exemplo, depois das células transinfectadas estáveis que contêm oconstruto de polinucleotídio que compreende o alvo ácido nucléico é entregue outransferida a ou feita para se ligar com o sítio de tecido, órgão ou sistema dointeresse. Tais sistemas são de determinado benefício em métodos de se ligar eformatos nos quais é vantajoso atrasar ou controlar precisamente a expressão doalvo ácido nucléico (p. ex. Permitir o tempo da realização da cirurgia e/ou curandodepois da cirurgia; permitir o tempo do construto de polinucleotídio quecompreende o alvo ácido nucléico conseguir o sítio, células, sistema, ou tecido aser ligado; permitir tempo do enxerto que contém células transformadas com oconstruto para ficar incorporado no tecido ou órgão para ou no qual foi entrançadoou se ligado, etc.).

VIII. USOS DE MULTÍMERO ADICIONAIS

As aplicações potenciais de multímeros da presente invenção sãodiversas e incluem qualquer uso onde um agente de afinidade é desejado.

Em alguns casos, um par de monômero s ou multímeros éselecionado para se ligar ao mesmo alvo (isto é, para o uso em ensaios baseadosno sanduíche). Para selecionar um monômero combinado ou par multímero, doismonômero s diferentes ou multímeros tipicamente são capazes de se ligar aproteína alvo simultaneamente. Uma aproximação de identificar tais pares implicao seguinte:

imobilizar do fago ou mistura de proteína que foi anteriormenteselecionada para se ligar oproteína alvo

se ligar com a proteína alvo ao fago imobilizado ou proteína elavagem;

se ligar com o fago ou mistura de proteína ao alvo amarrado elavagem; e

eluir o fago amarrado ou proteína sem eluir o fago imobilizadoouproteína.Um uso do multímeros ou os domínios monoméricos da invençãodevem substituir anticorpos ou outros agentes de afinidade na detenção ou outrosensaios baseados na afinidade. Assim, em algumas realizações, os domíniosmonoméricos ou multímeros são selecionados contra a capacidade de se ligarcomponentes outros do que um alvo em uma mistura. A aproximação geral podeincluir a execução a seleção de afinidade em condições que estreitamente separecem com as condições do ensaio, inclusive imitar a composição de umaamostra durante o ensaio. Assim, um passo da seleção pode incluir se ligar comum domínio monomérico ou multímero a uma mistura não inclusive o alvo Iigante eselecionar contra qualquer domínio monomérico ou multímeros que se ligam a àmistura. Assim, as misturas (ausentando-se o alvo ligante, que pode ser esvaziadousando um anticorpo, domínio monomérico ou multímero) representação daamostra em um ensaio (soro, sangue, tecido, células, urina, esperma, etc.) podemser usadas como um agente de bloqueio. Tal subtração é útil, p. ex., criar aproteína farmacêutica que se liga ao seu alvo mas não a outra proteína de soro ounão-visa tecidos.

[280] Por exemplo, a invenção pode ser usada na aplicação para criarantagonistas, onde os domínios monoméricos selecionados ou multímerosbloqueiam a interação entre duas proteína, p. ex., IL-6 e IL-6R. Em algumasrealizações, o monômero s pode ser identificado o que previne esta interação como ligante IL-6 ou IL-6R. Ver, p. ex., a figura 9. Opcionalmente, a invenção podegerar agonists. Por exemplo, multímeros se ligadura de duas proteína diferente, p.ex., enzima e substrato, pode realçar a função de proteína, inclusive, por exemplo,atividade enzimática e/ou conversão de substrato.

Em algumas realizações, os domínios monoméricos são usados paraa inibição ligante, ligante despejo ou estimulação ligante. Ligantes possível nessesmétodos, inclua, p. ex., IL-6.

Se a inibição de ligante que se liga a um receptor for desejada, umdomínio monomérico é selecionado que se liga ao ligante (p. ex., IL-6) em umaporção do ligante que contse liga com o receptor do ligante, ou isto se liga aoreceptor em uma porção do receptor que se liga contatos o ligante, por meiodestes prevenindo a interação de ligante-receptor. Os domínios monoméricospodem ser opcionalmente ligados a uma exoferta de meia-vida, se desejado.

O despejo de Ligante refere-se à modulação da meia-vida de umligante solúvel em fluido corpóreo. Os anticorpos contra citocinas tipicamenteprevinem o despejo do citocina eu porque a meia-vida de soro do anticorpo é muitomais longa do que a meia-vida de soro de citocina (2-3 semanas contra algumashoras). Isto causa um grande aumento na concentração do citocina no soro, nestecaso de IL-6 informou-se que este aumento fosse de 700 pregas (perua Zaanen, etal. J. Clin. Investir. 98,1441-1448 (1996)). A maior parte dos IL-6 são se ligados aoanticorpo e por isso inativo. Contudo, os níveis IL-6 aumentados podem emalgumas circunstâncias criar questões de segurança desde então em algumascircunstâncias (como em compartimentos com um pH baixo ou alto pH), e emcertos tecidos (como um filtro que previne a penetração Ab mas não IL-6) o

O IL-6 pode separar-se do anticorpo e o alto nível de IL-6 ativo podeficar um assunto de segurança sério.

Uma aproximação alternativa seria usar um nervo inibidor com umameia-vida de soro mais curta do que anticorpos, para que o aumento naconcentração de IL-6 total seja menos pronunciado. O monômero s e multímerosda presente invenção têm o soro humano porção das vidas das 60-180 horas(determinado por alométrico que escala de dados de macaco), muito menos doque a meia-vida de 2-3 semanas de muitos anticorpos.

Assim, em algumas realizações, IL-6 é inibido de tal modo que ocomplexo IL-6-inibidor é bastante pequeno para ser compensado pelo rim. O rimestá um filtro de tamanho molecular com um se Iigalho em volta 45-50kD, deixar deapenas moléculas menores passam. Se o tamanho do complexo de citocina-nervo-inibidor puder ser guardado no despejo de rim 35-40kD, eficiente é esperado.Desde que a maior parte de citocinas estão em volta 18-20kD no tamanho, o nervoinibidor deveria menos de 15-20 kD. O 18kD IL-6 trímero multímeros da invençãoencontram esta exigência, mas proteína de andaime baseada em Ig-domínios, quesão de 3 pregas maiores, geralmente não encontre esta exigência.

Em outra alternativa, multímeros da invenção podem ser projetadoque, quando não se ligado à sua molécula alvo (p. ex., IL-6), têm um hidrodinâmicoAlimenta o raio de uma proteína globular que não será compensada pelo rim (p.ex., maior do que 45kD, 50kD, 55kD), mas, quando se ligado à sua molécula alvo(p. ex., IL-6), têm um hidrodinâmico Alimenta o raio de uma proteína globular queserá compensada pelo rim (p. ex., menos do que 55kD, 50kD, 45kD ou 40kD). Talmultímeros compreenderá geralmente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou maisdomínios monoméricos tal que os multímeros, quando não se ligado à moléculaalvo, se formam um significativamente maiores Alimenta o raio do que quando seligado à molécula alvo. Tal multímeros pode ser prontamente selecionado por, porexemplo, determinando o coeficiente de sedimentação de 1) uma proteína globulardemasiado grande para compensar o rim e 2) uma proteína globular bastantepequena para compensar o rim e logo selecionando multímeros que têm umcoeficiente de sedimentação semelhante a 1) a ausência da molécula alvo mas istotem um coeficiente de sedimentação semelhante a 2) na presença da moléculaalvo.

Alternativamente, como discutido em outro lugar neste lugar, ummultímero a compreensão de um primeiro domínio monomérico que se liga a umaexoferta de meia-vida e um segundo monômero o domínio que se liga a umaporção do ligante que não se liga ao receptor do Iigante pode ser usada paraaumentar a meia-vida do ligante.

Em outra realização, um multímero a compreensão de um primeirodomínio monomérico que se liga ao ligante e um segundo monômero o domínioque se liga ao receptor pode ser usada para aumentar a afinidade eficaz do ligantedo receptor.

Em outra realização, multímeros compreendendo pelo menos doismonômero s que se ligam a a receptores são usados para trazer dois receptoresna proximidade por amba a se ligadura do multímero, por meio destes ativando osreceptores.Os novos exemplos de usos potenciais da invenção incluem domíniosmonoméricos, e multímeros destes, que é capaz da se ligadura de droga (p. ex., seIiganteo radionucleotídios para apontamento, se ligadura farmacêutica da meia-vida extensão de drogas, se ligadura de substância controlada de trse ligam aentode dose excessiva e terapia de inclinação), modulação de função imune (p. ex.,imunogenicidade bloqueio se Iiganteo tais receptores como CTLA-4,imunogenicidade aumento se Iiganteo tais receptores como CD80, ou ativação decomplemento pela se ligadura de tipo de Fe), e se especializou a entrega (p. ex.,lançamento lento pela rachadura ligante, electrotransport domínios, dimerizationdomínios, ou se ligadura específica: os domínios de entrada de célula, osreceptores de despejo como FcR, os receptores de entrega orais como plgR dotransporte de trans-mucosal, e o sangue-cérebro transferem receptores comotransferrinR).

Em novas realizações, o monômero s ou multímeros pode ser ligadoa uma etiqueta detectável (p. ex., Cy3, Cy5, etc.) ou ligado a um produto genéticode repórter (p. ex., GATO, luciferase, rábano bravo peroxidase, phosphotasealcalino, GFP, etc.).

IX. MANIPULAÇÃO ADICIONAL DE DOMÍNIOS MONOMÉRICOSE/OU MULTÍMERO ÁCIDOS NUCLÉICOS E POLIPEPTÍDIOS

Como acima mencionado, o polipeptídio da presente invenção podeser alterado. As descrições de vária diversidade que gera procedimentos paragerar seqüências ácidas nucléicas modificadas ou alteradas que codificam essespolipeptídios são descritas neste lugar e as referências citadas nisso.

Outro aspecto da presente invenção inclui a clonagem e a expressãode domínios monoméricos, selecionou domínios monoméricos, multímeros e/ouselecionou multímeros codificação de ácidos nucléicos. Assim, multímero domíniospode ser sintetizado como uma proteína única que usa sistemas de expressão bemconhecidos na arte. Os textos gerais que descrevem técnicas biológicasmoleculares úteis neste lugar, inclusive o uso de vetores, promotores e muitosoutros tópicos relevantes para a expressão de ácidos nucléicos como domíniosmonoméricos, selecionaram domínios monoméricos, multímeros e/ou selecionarammultímeros, incluir Berger e Kimmel, Guia a Técnicas de Clonagem Moleculares,Métodos em volume EnzymoIofiV 152 Academic Press1 Incf o São Diego1 Califórnia(Berger); Sambrook et al., Clonagem Molecular - um Manual de Laboratório (2oeditor) Volume 1-3, a Primavera Fria Abriga Laboratório, Porto de Primavera Frio,Nova York, 1989 ("Sambrook") e Protocolos Atuais na Biologia Molecular, F.M.Ausubel et al., editores., Protocolos Atuais, uma joint-venture entre GreenePublishing Associates, Inc and John Wiley & Sons, Inc, (complementado até 1999)("Ausubel")). Os exemplos das técnicas suficientes dirigir as pessoas da habilidadepor em métodos de amplificação vitro, úteis em identificação, isolação e clonardomínios monoméricos e multímeros codificação de ácidos nucléicos, inclusive areação de cadeia polymerase (PCR) a reação de cadeia Iigase (LCR), amplificaçãode Q-replicase e outro ARN polymerase técnicas mediadas {p. ex., NASBA), sãoencontradas em Berger, Sambrook, e Ausubel, bem como Mullis e al, (1987) n.4.683.202 Evidente dos Estados Unidos; o PCR Protocoliza uma Guia a Métodos eAplicações (editores de lnnis.) Academic Press Inc o São Diego, Califórnia (1990)(lnnis); Arnheim & Levinson (Outubro 1,1990) C&EN 36-47; o Jornal deNIHResearch (1991) 3, 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Liderança de Natl.. Sei. OsEUA 86,1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. Os EUA 87, 1874; Lomellet al. (1989) J. Clin. Chem 35,1826; Landegren e al, (1988) Ciência 241,1077-1080;ímpeto de Se Iigaque de Perua (1990) Biotecnologia 8,291-294; Wu e Wallace,(1989) Gene 4, 560; Barringer et al. (1990) Gene 89, 117, e Sooknanan e Malek(1995) Biotecnologia 13: 563-564. Os métodos melhorados da clonagem em ácidosnucléicos amplificados de vitro são descritos em Wallace e al, os Estados UnidosApropriados. N. 5.426.039. Os métodos melhorados de amplificar grandes ácidosnucléicos por PCR são resumidos em Cheng et al. (1994) Natureza 369: 684-685 eas referências nisso, nas quais PCR amplicons de até 40 KB são gerados. Uma dahabilidade apreciará que essencialmente qualquer ARN pode ser convertido emum ADN encalhado duplo adequado para digestão de restrição, expansão de PCRe sequencing que usa reverso transcriptase e um polymerase. Ver, Ausubel,Sambrook e Berger, todo o supra. [294] a presente invenção também se relacionaà introdução de vetores da invenção em células de anfitrião, e a produção dedomínios monoméricos, selecionou domínios monoméricos, multímeros e/ouselecionou multímeros da invenção por técnicas recombinante. As células deanfitrião são geneticamente projetadas (isto é, transformadas, transformadas outransfected) com os vetores desta invenção, que pode ser, por exemplo, um vetorque se clona ou um vetor de expressão. O vetor pode ser, por exemplo, na formade um plasmídio, uma partícula viral, um fago, etc. As células de anfitriãoprojetadas podem ser cultas em meios de comunicação nutritivos convencionaismodificados como apropriado para ativar promotores, selecionando transformants,ou amplificando o domínio monomérico , selecionaram o domínio monomérico ,multímero e/ou selecionaram o gene (s) multímero do interesse. As condições decultura, como temperatura, pH e assim por diante, são os anteriormente usadoscom a célula de anfitrião selecionada para a expressão, é será evidente àquelesexperimentados na arte e nas referências citadas neste lugar, inclusive, p. ex.,Freshney (1994) Cultura de Células dos Animais, um Manual da Técnica Básica,terceira edição, Wiley-Liss, Nova York e as referências citadas nisso.

Como acima mencionado, os polipeptídios da invenção tambémpodem ser produzidos em células não-dos animais como fábricas, levedura,fungos, bactérias e assim por diante. De fato, como observado em todas as partes,fago exposição é uma técnica especialmente relevante para produzir taispolipeptídios. Além de Sambrook, Berger e Ausubel, os detalhes quanto à culturade célula podem ser encontradas em Payne et al. (1992) Célula de Fábrica eCultura de Tecido em Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc Nova York, NOVAYORK; Gamborg e Phillips (editores) (1995) Célula de Fábrica, Tecido e Cultura deÓrgão; Métodos Fundamentais Manual de Laboratório de Springer, Springer-Verlag(Berlim o Heidelberg Nova York) e Atlas e Parques (editores) o Manual de Meiosde Comunicação Microbiológicos (1993) Prensa de CRC1 Boca Raton, FL.

A presente invenção também inclui alterações de domíniosmonoméricos, immuno-domínios e/ou multímeros para melhorar propriedadesfarmacológicas, reduzir imunogenicidade, ou facilitar o transporte do multímeroe/ou domínio monomérico em uma célula ou tecido (p. ex., pela barreira cerebralpelo sangue, ou pela pele). Esses tipos de alterações incluem várias modificações(p. ex., a adição dos grupos de açúcar ou glycosylation), a adição do PINO, aadição de domínios de proteína que se ligam a certa proteína (p. ex., HSA ou outraproteína de soro), a adição de fragmentos de proteína ou seqüências quetransmitem o movimento ou o transporte em, fora de e por uma célula. Oscomponentes adicionais também podem ser acrescentados a um multímero e/oudomínio monomérico para manipular as propriedades do multímero e/ou domíniomonomérico . Vários componentes também podem ser acrescentados inclusive, p.ex., um domínio que se liga um receptor conhecido (p. ex. Um domínio de proteínade Fc-região que se liga um receptor Fc), uma toxina (s) ou parte de uma toxina,um prodomínio que pode ser opcionalmente rachado de ativar o multímero oudomínio monomérico , uma molécula de repórter (p. ex., proteína fluorescenteverde), um componente que se ligam a uma molécula de repórter (como umradionuclide da radioterapia, biotin ou avidin) ou uma combinação de modificações.

X. MODELOS DOS ANIMAIS

Outro aspecto da invenção é o desenvolvimento de modelos dosanimais não-humanos específicos em que testar o imunogenicidade do monômeroou domínios multímero. O método de produzir tal modelo dos animais não-humanocompreende: a introdução em pelo menos algumas células de um animal de não-ser humano de recipiente, vetores que compreendem genes que codificam umapluralidade da proteína humana da mesma família de proteína, em que os genessão cada um o operably ligou a um promotor que é funcional em pelo menosalgumas células nas quais os vetores são introduzidos tal que um animal não-humano geneticamente modificado é obtido que pode exprimir a pluralidade daproteína humana da mesma família de proteína.

Os animais não-humanos adequados empregados na prática dapresente invenção incluem todos os animais vertebrados, exceto seres humanos(p. ex., rato, rato, coelho, ovelhas, e assim por diante). Tipicamente, a pluralidadede membros de uma família de proteína inclui pelo menos dois membros daquelafamília, e normalmente pelo menos dez membros de família. Em algumasrealizações, a pluralidade inclui todos os membros conhecidos da família deproteína. Os genes de exemplos que podem ser usados incluem os que codificamdomínios monoméricos, como, por exemplo, os membros da família de A-domíniode classe de receptor LDL, a família de domínio EGF-parecida, bem como outrasfamílias de domínio descritas neste lugar.

Os modelos dos animais não-humanos da presente invenção podemser usados para proteger para imunogenicidade de um monômero ou domíniomultímero que é derivado da mesma família de proteína expressa pelo modelo dosanimais não-humano. A presente invenção inclui o modelo dos animais não-humano feito conforme o método descrito em cima, bem como animais não-humanos transgenic cujo somático e células de germe contêm e exprimemmoléculas de ADN que codificam uma pluralidade da proteína humana da mesmafamília de proteína (como os domínios monoméricos descritos neste lugar), em queas moléculas de ADN foram introduzidas no animal não-humano transgenic emuma etapa embrionária, e em que as moléculas de ADN são cada operably ligadoa um promotor em pelo menos algumas células nas quais as moléculas de ADNforam introduzidas.

Um exemplo de um modelo de rato útil para proteger Α-domínio declasse de receptor LDL derivou proteína Iigante é descrito como se segue. Osgrupos genéticos que codificam o ser humano de tipo selvagem Α-domínio declasse de receptor de LDL monômero s são amplificados de células humanas queusam PCR. Quase todos de 200 Domínios-A diferentes podem ser amplificadoscom só três reações de amplificação PCR separadas de aproximadamente 7 KBcada um. Esses fragmentos então são usados para gerar ratos transgenic segundoo método descrito em cima. Os ratos transgenic reconhecerão os Domínios-Ahumanos como "mesmo, assim imitando o "selfhess" de um ser humano quanto aDomínios-A. O indivíduo A-domain-derived monômero s ou multímeros sãotestados nesses ratos injetando A-domain-derived monômero s ou multímeros nosratos, logo analisando a resposta imune (ou a falta da resposta) gerado. Os ratossão testados para determinar se eles têm desenvolvido uma resposta de anti-ser-humano de rato (MAHR). O Monômero s e multímeros que não resultam nageração de um MAHR provavelmente serão non-imunogênico quando administradoa seres humanos.

Historicamente, o teste de MAHR em ratos transgenic é usado paratestar a proteína individual em ratos que são transgenic daquela proteína única. Aocontrário o acima mencionado método descrito fornece um modelo dos animaisnão-humano que reconhece uma família inteira de proteína humana como"mesmo", e isto pode ser usado para avaliar um enorme número da proteína devariantes que cada um é capaz de atividades Iigantes vastamente variadas e usos.

XI. CONJUNTOS

Os conjuntos que compreendem os componentes necessários nosmétodos (tipicamente em uma forma não misturada) e componentes de conjunto(materiais de embalagem, instruções para usar os componentes e/ou os métodos,um ou vários containeres (tubos de reação, as colunas, etc.)) para manter oscomponentes são uma característica da presente invenção. Os conjuntos dapresente invenção podem conter uma biblioteca multímero, ou tipo único demonômero ou multímero, p. ex„ polipeptídios que compreendem o IL-6 e/ou IgGdomínios de ligação descritos neste lugar. Os conjuntos também podem incluirreagentes adequados para promover a se ligadura de molécula alvo, como buffersou reagentes que facilitam a detenção, inclusive moléculas detectably-etiquetadas.Os padrões para calibrar um Iigante que se liga a um domínio monomérico ou oparecido, também podem estar incluídos nos conjuntos da invenção.

[303] A presente invenção também fornece ensaios de ligaçãocomercialmente valiosos e conjuntos para praticar os ensaios. Em alguns ensaiosda invenção, um ou vários Iigante são empregados para descobrir a se ligadura deum domínio monomérico , immuno-domínios e/ou multímero. Tais ensaios sãobaseados em qualquer método conhecido na arte, p. ex„ fluxo cytometry,microscopia fluorescente, plasmon ressonância, e assim por diante, descobrir a seligadura de um Iigante (s) ao domínio monomérico e/ou multímero.

Os conjuntos baseados no ensaio também são fornecidos. Osconjuntos tipicamente incluem um container, e um ou vários ligante. Os conjuntosopcionalmente compreendem direções para executar os ensaios, reagentes dedetenção adicionais, buffers, ou instruções do uso de algum desses componentes,ou o parecido. Alternativamente, os conjuntos podem incluir células, vetores, (p.ex., vetores de expressão, vetores de substância segreda que compreendem umpolipeptídio da invenção), para a expressão de um domínio monomérico e/ou ummultímero da invenção.

Em um novo aspecto, a presente invenção provê o uso de qualquercomposição, domínio monomérico, immuno-domínio, multímero, célula, cultura decélula, aparelho, componente de aparelho ou conjunto neste lugar, para a práticade qualquer método ou ensaio neste lugar, e/ou para o uso de qualquer aparelhoou conjunto para praticar qualquer ensaio ou método neste lugar e/ou para o usode células, culturas de célula, composições ou outras características neste lugarcomo uma formulação terapêutica. A manufatura de todos os componentes nestelugar como formulações terapêuticas dos trse ligam aentos descritos neste lugartambém é fornecida.

XII. SISTEMAS INTEGRADOS

A presente invenção fornece computadores, o computador meios decomunicação legíveis e sistemas integrados que compreendem cadeias de carátercorrespondente a domínios monoméricos, selecionou domínios monoméricos,multímeros e/ou selecionou multímeros e ácidos nucléicos que codificam taispolipeptídios. Essas seqüências podem ser manipuladas por em métodos derecombinação silico, ou por alinhamento de seqüência padrão ou software deprocessamento do texto.

Por exemplo, os tipos diferentes da semelhança e as consideraçõesde vária severidade e comprimento de cadeia de caráter podem ser descobertos ereconhecidos nos sistemas integrados neste lugar. Por exemplo, muitos métodosde determinação de homologia foram projetados para a análise comparativa deseqüências de biopolymers, para o período que entrega processamento do texto, epara a recuperação de dados de vários bancos de dados. Com uma compreensãodo hélice duplo interações de complemento aos pares entre 4 nucleobasesprincipais em polinucleotídios natural, os modelos que simulam o recozimento decadeias de polinucleotídio homólogas complementares também podem ser usadoscomo uma fundação do alinhamento de seqüência ou outras operaçõestipicamente executadas nas cadeias de caráter correspondente às seqüênciasneste lugar {p. ex., manipulações de processamento de textos, construção defiguras que compreendem seqüência ou cadeias de caráter de subseqüência,tabelas de produção, etc.). Um exemplo de um pacote de software com GOs paracalcular semelhança de seqüência é RAJADA, que pode ser adaptada à presenteinvenção introduzindo cadeias de caráter correspondente às seqüências nestelugar.

A RAJADA é descrita em Altschul e al, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. O software para executar análises de RAJADA é publicamente disponível peloCentro Nacional da Informação sobre Biotecnologia (disponível em World WideWeb em ncbi.nlm.nih.gov). Este algoritmo implica altos pares de seqüência demarcação primeiro identificam (HSPs) identificando as palavras curtas docomprimento W na seqüência de pergunta, (que combine ou satisfaça algumaconta liminar positivamente avaliada T quando alinhado com uma palavra domesmo comprimento em uma seqüência de banco de dados. O T menciona-secomo o limiar de conta de palavra de vizinhança (Altschul et al., supra). Essapalavra de vizinhança inicial bate no ato como sementes para iniciar pesquisaspara encontrar HSPs mais longo contê-los. Os golpes de palavra então sãoextensos em ambas as direções ao longo de cada seqüência para pelo que a contade alinhamento cumulativa possa ser aumentada. Grande número cumulativo sãocalculados usando, para seqüências nucleotídio, os parâmetros M (conta derecompensa de um par de combinar com resíduos; sempre> 0) e N (conta de multapara não combinar mal resíduos; sempre <0). Para seqüências de ácido demunição, uma matriz de marcação é usada para calcular a conta cumulativa.Extensão dos golpes de palavra em cada direção é parada quando: a conta dealinhamento cumulativa cai pela quantidade X do valor realizado do seu máximo; aconta cumulativa vai ao zero ou em baixo, devido à acumulação de um ou váriosalinhamentos de resíduo marcam de maneira negativa; ou o fim de qualquerseqüência é derivado. Os parâmetros de algoritmo de RAJADA W, T1 e Xdeterminam a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLASTN(para seqüências nucleotídio) usa como defaults um wordlength (W) de 11, umaexpectativa (E) de 10, um se Iigalho de 100, M=5, N =-4, e uma comparação deambas as praias. Para seqüências aminoácidos, os usos de programa BLASTPcomo defaults um wordlength (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e o BLOSUM62marcando matriz (ver Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. Os EUA89:10915).

Um exemplo adicional de um algoritmo de alinhamento de seqüênciaútil é PILEUP. PILEUP cria múltiplo alinhamento de seqüência de um grupo deseqüências relacionadas que usam alinhamentos progressivos, aos pares. Eletambém pode traçar uma árvore mostrando as relações se agrupam usadas paracriar o alinhamento. PILEUP usa uma simplificação do método de alinhamentoprogressivo de Feng & Doolittle1 (1987) J. Mol. Evol. 35:351-360. O método usadoé semelhante ao método descrito por Higgins & Agudo, (1989) CABIOS 5:151-153.O programa pode aliar-se, p. ex., até 300 seqüências de um comprimento máximode 5.000 cartas. Múltiplo procedimento de alinhamento começa com o alinhamentoaos pares das duas seqüências mais semelhantes, produzindo um grupo de duasseqüências alinhadas. Este grupo então pode ser alinhado à seguinte seqüênciamais relacionada ou o grupo de seqüências alinhadas. Dois grupos de seqüênciaspodem ser alinhados por uma extensão simples do alinhamento aos pares de duasseqüências individuais. O alinhamento final é realizado por uma série dealinhamentos progressivos, aos pares. O programa também pode ser usado paratraçar um dendogram ou a representação de árvore de relações se agrupam. Oprograma é dirigido indicando seqüências específicas e o seu ácido amino oucoordenadas de nucleotídio de regiões da comparação de seqüência. Por exemplo,para determinar aminoácidos conservados em uma família de domínio monoméricoou comparar as seqüências de domínios monoméricos em uma família, aseqüência da invenção, ou codificação de ácidos nucléicos, é alinhada parafornecer a informação sobre função da estrutura.

Em um aspecto, o sistema de computador é usado para executar "emsilico" a recombinação de seqüência ou o arrastar dos pés de cadeias de carátercorrespondente aos domínios monoméricos. Vários tais métodos são estabelecidosadiante "em Métodos para Fazer Cadeias de Caráter, Polinucleotídios & osPolipeptídios Que Desejaram Características" por Selifonov e Stemmer, Fevereiroarquivado 5,1999 (USSN 60/118854) e "Métodos para Fazer Cadeias de Caráter,Polinucleotídios & Polipeptídios Que Desejaram Características" por Selifonov eStemmer, arquivaram o Outubro 12,1999 (USSN 09/416,375). Em poucaspalavras, os operadores genéticos são usados em algoritmos genéticos paramodificar-se dado seqüências, p. ex., imitando eventos genéticos como mutação,recombinação, morte e assim por diante. A análise multidimensional para otimizarseqüências pode ser também ser executado no sistema de computador, p. ex.,como descrito em 'a 375 aplicação.

Um sistema digital também pode instruir um sintetizadoroligonucleotídio para sintetizar oligonucleotídios, p. ex., usado para reconstruçãogenética ou recombinação, ou encomendar oligonucleotídios de fontes comerciais(p. ex., imprimindo formas de ordem apropriadas ou Iiganteo a uma forma deordem na Internet).

O sistema digital também pode incluir elementos de produção decontrolar a síntese ácida nucléica {p. ex., baseado sobre uma seqüência ou umalinhamento de um recombinante, p. ex., recombinado, domínio monomérico comoneste lugar), isto é, um sistema integrado da invenção opcionalmente inclui umsintetizador oligonucleotídio ou um controlador de síntese oligonucleotídio. Osistema pode incluir outras operações que ocorrem rio abaixo de um alinhamentoou outra operação executou a utilização de uma cadeia de caráter correspondentea uma seqüência neste lugar, p. ex., como observado em cima com referência aensaios.

EXEMPLOS

O exemplo seguinte é oferecido para ilustrar, mas não limitar ainvenção reclamada.

Exemplo 1

Este exemplo descreve a seleção de domínios monoméricos e acriação de multímeros.

Os materiais iniciais para identificar domínios monoméricos e criarmultímeros dos domínios monoméricos selecionados e procedimentos podem serderivados de alguma de várias seqüências humanas e/ou não-humanas. Porexemplo, para produzir um domínio monomérico selecionado com a se ligaduraespecífica de um Iigante desejado ou a mistura de ligantes, um ou vários o gene (s)de domínio monomérico é selecionado de uma família de domínios monoméricosque se ligam a a certo ligante. As seqüências ácidas nucléicas que codificam umou vários gene de domínio monomérico pode ser obtido pela amplificação PCR doADN genomic ou cDNA, ou opcionalmente, pode ser produzido sinteticamenteusando ficando sobreposto oligonucleotídios.

O mais comumente, essas seqüências então são clonadas em umformato de exposição de superfície de célula (isto é, bacteriano, levedura, oumamífero (COS) exposição de superfície de célula; exposição de fago) paraexpressão e proteção. As seqüências recombinante são transfected (transformadoou transformado) na célula de anfitrião apropriada onde eles são expressos eexpostos na superfície de célula. Por exemplo, as células podem ser sujadas comum etiquetado (p. ex„ fluorescentemente etiquetadas), ligante desejado. As célulasmanchadas são classificadas pelo fluxo cytometry, e os domínios monoméricosselecionados que codificam genes são recuperados (p. ex„ por isolação plasmídio,PCR ou expansão e clonando) das células positivas. O processo de sujar eclassificação pode ser repetido múltiplos tempos (p. ex., usando as concentraçõesprogressivamente diminuem do ligante desejado até que um nível desejado doenriquecimento seja obtido). Alternativamente, qualquer método de detenção ouproteção conhecido na arte que pode ser usada para identificar células que seligam a o Iigante desejado ou a mistura de Iigantes pode ser empregado.

O domínio monomérico selecionado que codifica genes recuperou-sedo ligante desejado ou a mistura de Iigantes as células Iigantes podem seropcionalmente recombinadas segundo o algum dos métodos descritos neste lugarou nas referências citadas. As seqüências recombinante produzidas neste círculoda diversificação então são protegidas pelo mesmo ou um método diferente paraidentificar genes recombinante com a afinidade melhorada do desejado ou visarligante. O processo de seleção e diversificação é opcionalmente repetido até queuma afinidade desejada seja obtida.

O domínio monomérico selecionado os ácidos nucléicos selecionadospelos métodos podem ser juntados em conjunto via uma seqüência ligante paracriar multímeros, p. ex„ pela reunião combinatória da codificação de seqüênciasácida nucléica selecionou domínios monoméricos pelo ADN ligation, ouopcionalmente, PCR-fundado, reações de sobreposição de auto-escorvamento. Asseqüências ácidas nucléicas que codificam o multímeros então são clonadas emum formato de exposição de superfície de célula (isto é, bacteriano, levedura, oumamífero (ALFACE DE CÓS) exposição de superfície de célula; exposição defago) para expressão e proteção. As seqüências recombinante são transfected(transformado ou transformado) na célula de anfitrião apropriada onde eles sãoexpressos e expostos na superfície de célula. Por exemplo, as células podem sersujadas com um etiquetado, p. ex„ fluorescentemente etiquetadas, desejadasligante ou a mistura de ligantes. As células manchadas são classificadas pelo fluxocytometry, e o multímeros selecionado que a codificação de genes é recuperada(p. ex. Por PCR ou expansão e clonando) das células positivas. As célulaspositivas incluem multímeros com uma avidez melhorada ou afinidade ouespecificidade alterada ao ligante desejado ou a mistura de ligantes emcomparação com o domínio (s) monômero selecionado. O processo de sujar eclassificação pode ser repetido múltiplos tempos (p. ex„ usando progressivamenteredução as concentrações do ligante desejado ou a mistura de ligantes até umnível desejado do enriquecimento são obtidas). Alternativamente, qualquer métodode detenção ou proteção conhecido na arte que pode ser usada para identificarcélulas que se ligam a o Iigante desejado ou a mistura de Iigantes pode serempregado. [319] o multímero selecionado a codificação de genes recuperou-se doIigante desejado ou mistura de Iigantes as células Iigantes podem seropcionalmente recombinadas segundo o algum dos métodos descritos neste lugarou nas referências citadas. As seqüências recombinante produzidas neste círculoda diversificação então são protegidas pelo mesmo ou um método diferente paraidentificar genes recombinante com avidez melhorada ou afinidade ouespecificidade alterada do desejado ou visar ligante. O processo de seleção ediversificação é opcionalmente repetido até uma avidez desejada ou afinidade ouespecificidade alterada é obtido.

Exemplo 2

Este exemplo descreve na recombinação de intra-proteína vivo paragerar bibliotecas da maior diversidade.

Um monômero-codificação plasmídio vetor (vetor pCK-derivado; vejaabaixo), flanqueado de orthologous IoxP sítios, foi recombinado em uma maneiraCre-dependente com um vetor de fago via os seus sítios IoxP compatíveis. Osrecombinante fago vetores foram descobertos por PCR utilização de primeresespecíficos para o construto de recombinante. O ADN sequencing indicou que oproduto recombinante correto foi gerado.

Reagentes e procedimentos experimentais

PCK-cre-lox-Monômero -IoxP. Este vetor tem duas característicasespecialmente relevantes. Primeiro, ele transporta o gene cre, codificando o ADNespecífico pelo sítio recombinase Cre, no controle de Piac. O Cre foi PCR-amplificado de p705-cre (de GeneBridges) com primeres cre-específicos queincorporaram Xbal (5') e Sfil (3') nos fins do produto PCR. Este produto foi digeridocom Xbal e Sfil e clonou-se nos sítios idênticos de pCK, uma oferta, o derivado deCmR de pCK110919-HC-Bla (pACYC em), produzindo pCK-cre.

A segunda característica é o ingênuo uma biblioteca de domínioflanqueada de dois orthologous IoxP sítios./oxP (o tipo selvagem) e/oxP (FÁ), queé necessitada para a recombinação de ADN específica pelo sítio cse Iigalisada porCre. Ver, p. ex„ Siegel, R.W., e ai. Cartas de FEBS 505:467-473 (2001). Essessítios raramente recombinam-se com o outro, os sítios de IoxP foram incorporadosem pCK-cre em seqüência. 5 '-phosphorylated oligonucleotídios IoxP (K) e IoxP(Krc)1 transportando IoxP (TELEFONIA SEM FIO) e EcoRI e ressaltos HmDIII-compatíveis para permitir Iigation a EcoRI digerido e pCK .ffznDIll-digerido,estiveram hybridized em conjunto e Iigated a pCK-cre em um padrão Iigationreação (T4 ligase; durante a noite em 16C).

O plasmídio resultante foi digerido com EcoRI e Sphl e Iigated aohybridized, 5 '-phosphorylated oligos IoxP (L) e IoxP (L_rc), que transportam o IoxP(FÁ) e EcoRI e> ressaltos SpM-compatíveis. Para preparar-se para a construçãode biblioteca, uma purificação ampla (MAXI de Qiagen preparatório) do pCK-cre-lox-P (telefonia sem fio)-loxP (FÁ) foi executada segundo o protocolo do Qiagen. Oplasmídio Qiagen-purificado foi submetido ao declive CsCI centrifugação para anova purificação. Este construto então foi digerido com Sphl e Bglll e Iigated adigerido ingênuo uma inserção de biblioteca de domínio, que foi obtida via umaPCR-amplificação de uma preexistência um consórcio de biblioteca de domínio.Pelo desenho, os sítios IoxP e monômero são em armação, que gera monômero scom/axP-encoded ligantes. Esta biblioteca foi utilizada no no procedimento derecombinação vivo como detalhado em baixo.

Vetor de fUSE5HA-Monômero -lox-lox. O vetor é um derivado defUSE5 do laboratório de George Smith (a Universidade de Missouri). Foiposteriormente modificado para transportar um Al etiqueta de ensaios deimmunodetection. os sítios de IoxP foram incorporados em fUSE5HA emseqüência. 5 '-phosphorylated oligonucleotídios IoxP (I) e IoxP (I) _rc,transportando IoxP (TELEFONIA SEM FIO), cadeia da parada codons e Xmal e)ressaltos de S/zl-compatible, estiveram hybridized em conjunto e Iigated a Xmal-e5/il-digested ÍUSE5HA em um padrão Iigation reação (Nova Inglaterra Biolabs T4ligase; durante a noite em 16C).O vetor de fago resultante foi depois digerido com Xmal e Sphl eIigated ao hybridized oligos IoxP (J) e IoxP (J) _rc, que transportam o/oxP (FÁ) eressaltos compatíveis com Xmal e Sphl. Este construto foi digerido com Xmal/Sfil elogo Iigated para pré-cortar (Xmal/SfiT) ingênuo uma inserção de biblioteca dedomínio (produto de PCR). A parada codons é localizada entre os sítios IoxP1prevenindo a expressão da brânquia e conseqüentemente, a produção de fagocontagioso.

O vetor/biblioteca Iigated foi posteriormente transformado em um E.coli anfitrião que carrega um Λ ///-expressingplasmídio que permite o resgate dofUSE5HA-Monômero -Iox-Iox fago, como detalhado em baixo.

pCK-glIl. Este plasmídio transporta a brânquia no controle do seupromotor nativo. Foi construído PCR-amplificando brânquia e o seu promotor doajudante VCSM13 fago (Strse ligagene) com primeres glllPromoter_EcoRI eglllPromoter_HinDIII. Este produto foi digerido com EcoKI e HinDIII e clonou-se nosmesmos sítios de pCKI 10919-HC-Bla. Como a brânquia é abaixo do controle doseu próprio promotor, a expressão de brânquia é presumivelmente constitutiva.pCK-g/l/was transformado em E. coli a CE 100 (Epicentro).

Em procedimento de recombinação vivo. No sumário, o procedimentoimplica os passos-chave seguintes: Produção de a) de infective (isto é resgate) de f(biblioteca de JSE5HA-Monômero -Iox-Iox com um E. coli anfitrião que exprimebrânquia de um plasmídio; b) Clonagem de 2a biblioteca (pCK) e transformaçãoem F + TGI E. coli; Infecção de c) da cultura que transporta a 2a biblioteca com ofUSE5HA-Monômero -Iox-Iox resgse ligado fago biblioteca.

a. Resgate de vetor de fago. As células de Electrocompetent quetransportam pCK-g /// estiveram preparadas por um protocolo padrão. Essascélulas tiveram uma freqüência de transformação de 4 χ 108/u.g ADN e foramelectroporated com Iigations amplo (~5 p, g ADN de vetor) do vetor de fUSE5HA-Iox-Iox e o ingênuo uma inserção de biblioteca de domínio. Depois deelectroporations individual (100 ng DNA/electroporation) com ~ 70 \xL cells/cuvette,930 W L aquecem-se os meios de comunicação SOC foram acrescentados, epermitiu-se que as células se recuperassem com a sacudidela em 37C durante 1hora. Depois, o tetracycline foi acrescentado a uma concentração final de 0.2 j-jg/mL, e as células foram sacudidas para ~ 45 minutos em 37C. Uma parte alíquotadesta cultura foi retirada, de 10 pregas em série diluído e chapeado paradeterminar o tamanho de biblioteca resultante (1.8 χ 107). A cultura restante foidiluída em 2 χ 500 mL 2xYT (com 20 jag/mL chloramphenicol e 20 pg/mLtetracycline para selecionar para pCK-glII e o vetor fLJSE5HA-fundado,respectivamente) e cultivada noturna em 30C.

Fago resgse ligados foram colhidos usando um protocolo deprecipitação de PEG/NaCI padrão. O titer foi aproximadamente 1 χ 1012transdução units/mL.

b. Clonagem da 2a biblioteca e transformação em um E. coli anfitrião.

O ligated pCK/ingênuo uma biblioteca de domínio é electroporated em um Fbacteriano + anfitrião, com um tamanho de biblioteca esperado deaproximadamente 108. Depois de um período de recuperação horário em 37C coma sacudidela, as células electroporated são diluídas a ODgoo ~ 0.05 em 2xYT(mais 20 ug/mL chloramphenicol) e cultivadas aos meados de fase de Iog em 37Cantes da infecção por fCJSEHA-Monômero -lox-lox.

c. Infecção da cultura que transporta a 2a biblioteca com o fUSE5HA-Monômero -Iox-Iox resgse ligado fago biblioteca. Para maximizar a geração derecombinantes, uma alta tarifa de infecção (> 50 %) de E.coli dentro de uma culturaé desejável. O infectivity de E. coli depende em número de fatores, inclusive aexpressão do F pilus e condições de crescimento. Os E. coli contextos TGI(transportando um F') e K91 (uma tensão de Hfr) foram anfitriões do sistema derecombinação.

Oligonucleotídios

IoxP (K) (SEQ ID N0.380)

[P-

5'agcttseligaacttcgtseligagaaaggtseligatacgaagttseligagatctcgtgctgcatgcggtgcg]IoxP (K_rc) (SEQ ID NO:381)[Ρ-5'aattcgcaccgcatgcagcacgagatctseligaacttcgtseligatacctttctse

Iigacgaagttse ligaagct]

IoxP (L) (SEQIDNO:382)

[p-5* se Iigaacttcgtse Iigagese Iigaeattse ligaegaagttategag]IoxP (L_re) (SEQ ID NO:383)

[p-5' etegse Iigaacttegtse Iigaatgtatgetse ligacgaagttatg]IoxP (I) (SEQIDNO:384) [P^ecgggagcagggcatgctaagtgagtaseIigaagtgagtaase Iigaaettegtse Iigatacetttetse ligaegaagttategtetg]IoxP (I) _re (SEQ ID NO:385)

[Ρ-5'aegseligaaettcgtseligagaaaggtseligatacgaagttatttactcacttattactcacttagcatgccctgcte]

IoxP (J) (SEQIDNO:386)[5' ccgggaccagtggcctctggggcese Iigaaettegtse Iigagese Iigaeattse

ligacgaagttatg]

IoxP (J) _rc (SEQ ID NO:387)

[^cseligaaettcgtseligaatgtatgctseligacgaagttatggccccagaggccactggtc]

gl11Promoter_EcoRI (SEQ ID NO:388)[5' atggcgaattctcattgtcggcgcaactatglllPromoter_HinDIII (SEQ ID NO:389)[5' gse ligaagctttcattaagaetccttattaegcag]

Exemplo 3

<table>table see original document page 122</column></row><table>

A tabela em baixo (SEQ ID NÚMER0S:3 91-420) descreve para cadaposição que aminoácidos são codificados na biblioteca baseada sobre adiversidade natural de cálcio humano que se liga domínios de EGF:

A biblioteca de seqüências de ADN1 E3, codificando monômero iccálcio que se liga domínios de EGF1 foi criada pela reunião PCR como descrito emStemmer et al„ Gene 164:49-53 (1995). Os oligonucleotídios usados nesta reaçãoPCR estão em dois grupos, 1 e 2. Eles são:

Grupo 1 (SEQ id nos:421-426):

5'.Aaaaggcctcgagggcctgggtggcaatggt-S'Si-Cctgaaccaccacakhkaccgyksnbgcacggayycgrcrmacattcatyaayatctdyaccattgccaccc-3'

5--Cctgaaccaccacakntgscgyygykmhsgcacggayycgrcrmacattcatyaayatctdyaccattgccaccc-3'

5'-cctgaaccaccacakhkaccgyksnbgcaarbaybcgvahycwskbyacattcatyaayatctdyaccattgccaccc-3'

5'-cctgaaccaccacakntgscgyygykmhsgcaarbaybcgvahycwskbyacattcatyaayatctdyaccattgccaccc-3'

6.5'-tgaattttctgtatgaggttttgctaaac aactttcaacagtttcg g cccca gaggccctggagccacctgaaccaccaca-3'

Grupo 2 (SEQ ID NC)S:427-430):

5'-acggtgcctacccgtatgatgttccggatt atgccccgggtggcaatggt-3'

5'-cctgaaccaccacaghktdbaccgghawagcctkscrsgcashbacakykawagcyacccdstrwatytwbaccattgccaccc-3'

5'-cctgaaccaccacakbykbtkcygkycbsabycngcdbawagcctkbgbkgcashbacakykawagcyacccdstrwatytwbaccattgCCACCC-3'

5'.Aaaaggccccagaggcccctgaaccaccaca-S'onde r=a/g, y=c/t, m=a/c, k=g/t, s=c/g, W=azt1 b=c/g/t,d=a/g/t, h=a/cvt,V=A/C/G, andN=A/C/G/T.

Depois do PCRs separado do Grupo 1 e 2 oligonucleotídios, o Grupo1 fragmentos PCR foram digeridos com Bpml e grupo 2 fragmentos PCR foramdigeridos com BsrDI. Os produtos de digestão foram purificados usando colunasQiagen Qiaquick e logo Iigated em conjunto. O ADN Iigated então foi amplificadoem um PCR utilização de dois primeres. Esses são:

5 '.Aaaaggcctcgagggcctgggtggcaatggt-s' (seq idno:431) 5aaaaggccccagaggcccctgaaccaccaca-3' (seq id no:432)

Os produtos PCR foram purificados com colunas Qiagen Qiaquick edigeridos com Sfil. O produto digerido foi purificado com colunas Qiagen Qiaquick.Os fragmentos de DNA foram ligados nos sítios de restrição Sfil do vetor deexposição de fago fuse5-HA (G4S)4, um derivado de fuseõ que transporta um emarmação HA-epitopo e um glicina, serina Iigante flexível. A mistura Iigation foielectroporated em TransforMax ™ a CE 100™ células de £. colielectrocompetente. Células de E. coli transformadas foram cultivadas por toda anoite a 37°C em 2xYT meio que contém 20 pg/ml tetracycline. A bibliotecaresultante conteve 2X109 clones independentes. As partículas de Fago forampurificadas do meio de cultura pela PRECIPITAÇÃO DO PINO. O titer do fago foi1.3X1012/ml. As seqüências de 24 clones individuais foram determinadas e essesforam compatíveis com o desenho de biblioteca.

Exemplo 4

Este exemplo descreve a construção de uma biblioteca monômeroEGF-fundada.

A recombinação pode ser usada para a otimização de intradomínio.Por exemplo uma reação de sobreposição de PCR pode ser usada que recombinadois ou mais segmentos de um domínio único um quanto a outro. Cada um podeusar dois, três, quatro, cinco ou mais reações de sobreposição de fragmento domesmo modo que ilustrado. Este processo de recombinação tem muitasaplicações. Uma aplicação deve recombinar um grande consórcio de centenas declones anteriormente selecionados sem informação sobre seqüência. Todo que énecessário para cada sobreposição para trabalhar é uma região conhecida daseqüência relativamente constante que existe na mesma posição em cada um dosclones (aproximação de sítio fixada). Para domínios A, tipicamente esses clonesteriam sido derivados de uma biblioteca na qual 20-25 aminoácidos distribuídos porcima dos cinco segmentos de inter-cisteína foram tornados randômicas. O métodode recombinação de intra-domínio também pode ser executado em um consórciode domínios monoméricos relacionados à seqüência pela recombinação de DNApadrão (p. ex„ Stemmer1 Natureza 370:389-391 (1994)) baseado em fragmentaçãocasual e remontagem baseada na homologia de seqüência de DNA1 que nãonecessita um sítio de sobreposição fixo em todos dos clones que devem serrecombinados.

Outra aplicação deste processo deve criar múltiplo separado, ingênuo(significação não arrasado) bibliotecas em cada uma das quais só um dos Ioopsintercisteína é tornado randômicas, tornar randômicas um Ioop diferente em cadabiblioteca. Depois de arrasar dessas bibliotecas separadamente contra o alvo, osclones selecionados então são recombinados. De cada biblioteca arrasada só osegmento randômicas é amplificado por PCR e múltiplos segmentos randômicosentão são combinados em um domínio único, criando uma biblioteca mista que éarrasada e/ou protegida para a potência aumentada. Este processo também podeser usado para misturar um pequeno número de clones da seqüência conhecida.

Qualquer seqüência comum pode ser usada como pontos decruzamento. Para domínios A ou outro monômero s que cisteína-contém, osresíduos eysteine são lugares lógicos de cruzamento. Contudo, há outros modosde determinar ótimos sítios de cruzamento, como modelagem de computador.Alternativamente, os resíduos com a entropia mais alta, ou a menor parte denúmero de contatos intramoleculares, também podem ser bons sítios decruzamentos.

Um método de exemplo de gerar bibliotecas compreendidas daproteína com Ioops inter-cisteína randômicos é apresentado em baixo. Nesteexemplo, em contraste com o Ioop separado, aproximação de biblioteca separadadescrita em cima, múltiplos Ioops intercisteína são tornados randômicassimultaneamente na mesma biblioteca.

Um domínio a biblioteca de NNK que codifica um domínio de proteínade 39-45 aminoácidos que têm o modelo seguinte foi construída:

01 .χ (4,6)-Ei-F-RrC2-A-X (2 (4) -Gi-R2-C3-l-P-SrS2-W-V-C4-Di-G2-E2-D2-D3-C5-G3-D4-G4-S3-D5-E3-X (4) 6)-C6 (SEQ ID NOS:433-459);

onde,

C1-C6: cisteínas;

X (n): seqüência de η amino ácidos com qualquer resíduo em cadaposição;

E1-E3: glutamina;

F: fenilalanina;

R1-R2: arginina;

A: alanina;

G1-G4: glicina;

I: isoleucina;

P: prolina;

S1-S3: serina;

W: triptofano;

V: valina;

D1-D5: ácido aspártico

C1-C3, C2-C5 & C4-C6 formam dissulfetos.

A biblioteca foi construída criando uma biblioteca de seqüências deDNA, contendo tirosina os codons (BILRAM) ou a variável não-conservou codons(NNK)1 pela reunião PCR como descrito em Stemmer e al, Gene 164:49-53 (1995).Em comparação com o andaime de Α-domínio nativo e o desenho que foi usadopara construir a biblioteca Al (descrito anteriormente) esta aproximação: 1) guardamais dos resíduos existentes no lugar em vez de tornar randômicas esses resíduospotencialmente críticos, e 2) insere uma cadeia de aminoácidos do comprimentovariável dos 20 aminoácidos (NNK codon), tal que o número médio de resíduosinter-cisteína é extenso além destes do natural um domínio ou a biblioteca de Al. Atarifa de resíduos tirosina foi aumentada pela inclusão tirosina codons nooligonucleotídios, porque se considerou que tirosinas era sobrerepresentado noanticorpo sítios de ligação, presumivelmente por causa do grande número decontatos diferentes que o tirosina pode fazer. Os oligonucleotídios usados nestareação PCR são (SEQ ID NOS:460-486):

onde R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, \N=ATT, B=C/G/T, D=PJGfT1 BKA/C/T,V=A/C/G, e N=A/C/G/T

A biblioteca foi construída embora um círculo inicial de 10 ciclos daamplificação PCR que usa uma mistura de 4 porções de oligonucleotídios, cadaconsórcio que contém 400 pmols do DNA. Junte 1 conteve oligonucleotídios 1-9,juntar 2 conteve 10-17, juntar 3 conteve só 18 e o consórcio 4 conteve 19-27. Abiblioteca totalmente reunida foi obtida por uns 8 ciclos adicionais de PCR que usaconsórcio 1 e 4. Os fragmentos de biblioteca foram digeridos com Xmal e Sfil. Osfragmentos de DNA foram ligado nos sítios de restrição correspondentes do vetorde exposição de fago FUSE5-AI, um derivado de fuseõ que transporta um emarmação AI-EPITOPE. A mistura Iigation foi electroporated em TransforMax ™ aCE 100™ células de E. coli eIectrocompetentes que resultam em uma biblioteca de2X109 clones individuais. E. transformados coli células foram cultivados noturnosem 37°C em 2xYT meio que contém 20 Q, g/ml tetracycline. As partículas de Fagoforam purificadas do meio de cultura pela PRECIPITAÇÃO DO PINO e um titer de1.1X1 OI3/ml foi determinado. As seqüências de 24 clones foram determinadas eforam compatíveis com as expectativas do desenho de biblioteca.

Exemplo 5

Este exemplo descreve a otimização de multímeros otimizandomonômero s e/ou Iigantes para se ligar a um alvo.

Uma aproximação para otimizar multímero que se liga a alvos implicaa otimização de monômero s, multímeros e ligantes. Primeiro uma biblioteca demonômero s é arrasada para se ligar ao alvo (p. ex„ IL-6). Contudo, algunsmonômero s podem se ligar em posições no alvo que estão longe um de outro, talque os domínios que se ligam a a esses sítios não podem ser unidos por umpeptídio ligante. É, por isso, útil criar e proteger uma grande biblioteca de homo-ouheterotrímeros desses monômero s antes da otimização do monômero s. Essasbibliotecas trimer podem ser protegidas, p. ex., em fago (típico para heterotrímeroscriado de um grande consórcio de monômero s) ou fizeram e analisaramseparadamente (p. ex., para homotrímeros). Por este método, o melhor trimer éidentificado. Os ensaios podem incluir ensaios de ligação a um alvo ou agonist oua determinação de potência de antagonista do multímero na proteína funcional - ouensaios baseados na célula.

O domínio (s) monômero ic do melhor trimer único então é otimizadocomo um segundo passo. Os Homomultímeros são os mais fáceis otimizar, desdeque só uma seqüência de domínio existe, embora heteromultímeros também possaser sintetizado. Para homomultímeros, um aumento na se ligadura pelo multímeroem comparação com o monômero é um efeito de avidez.

Depois da otimização da própria seqüência de domínio (p. ex.,recombinando-se ou randomização NNK) e fago arrasar, os monômero smelhorados são usados para construir um dimer com uma biblioteca ligante. Asbibliotecas de Ligante podem ser formadas, p. ex., de Iigantes com umacomposição NNK e/ou comprimento de seqüência variável.

Depois de arrasar desta biblioteca ligante, os melhores clones (p. ex.,determinado pela potência na inibição ou outro ensaio funcional) são convertidosem multímeros composto de múltiplo (p. ex., dois, três, quatro, cinco, seis, sete,oito, etc.) domínios otimizados pela seqüência e comprimento - e Iigantesotimizado pela seqüência.

Exemplo 6

Este exemplo descreve uma análise estrutural de domínios A.Como com praticamente toda a proteína, só uma pequena fração dasuperfície total de um A-domínio participa na se ligadura de um alvo único.Baseado na estrutura de solução do domínio, as posições de resíduo adjacentespodem ser identificadas que provavelmente serão capazes de cooperar na seligadura a um alvo dado. Neste lugar, tais grupos de resíduos adjacentesmencionam-se como categorias estruturais. Como um exemplo, quatro taiscategorias foram identificadas pelo exame da estrutura de A-domínio, indicou oTopo, Fundo, Loop 1, e Loop 2. Projetando bibliotecas que só permitem adiversidade dentro de uma categoria dada, o espaço de seqüência teóricopermitido por uma biblioteca pode ser significativamente reduzido, levando emconta a melhor cobertura do espaço teórico pela biblioteca física. Além destes, emcaso da não-sobreposição a categorias como as categorias de Fundo e Topo, asseqüências de meio-domínio selecionadas contra alvos diferentes podem sercombinadas em uma seqüência única que seria capaz de se ligar simultaneamenteou alternativamente aos alvos selecionados. Em qualquer caso, criando sítios deligação que ocupam só meio domínio leva em conta a criação de moléculas quesão porção como grande e teriam porção do número de imunogênico epitopes,reduzindo o risco de imunogenicidade.

Classificação Estrutural de Posições de A-domínio

Uma seqüência de A-domínio canônica (SEQ ID N0.487) é mostradaem baixo com posições de alta diversidade representadas como um X. As posiçõesque pertencem ao Topo, Fundo, Loop 1, ou a Loop 2 categorias são indicadas comuma estrela.

<table>table see original document page 129</column></row><table><table>table see original document page 130</column></row><table> Exemplo 7

Este exemplo descreve a proteção de monômero s ou multímeros quese ligam a IL-6 humana.

As bibliotecas de Fago foram arrasadas por vários círculos qualquerno suporte sólido (p. ex. Nunc Maxisorp chapas) ou na solução (p. ex. DynalStreptavidin). A produção fago junta com à freqüência mais alta de clones de fagoindividuais que se ligam a a IL-6 e alta diversidade de seqüência (b) entre osclones de fago de ligação e positivos foram escolhidos para a proteção de proteína.

I. Volta 1 (chapas de Maxisorp ou Pérolas de Dynal) 1. Revestimentoalvo

A. Revestimento de chapas: Seis poços/biblioteca foram diretamentecobertos de IL-6 (0.5 [ag/well) utilização de 100 |iL/well de 5 ser humano |ig/mL 11-6 (R & Sistemas D; transportadora gratuita) diluído em TBS [pH 7.5J/2 mM CaCI2.

Usando uma forma de biotinylated do ser humano IL-6, as chapas foram pré-cobertas de streptavidin de 1 hora na temperatura de sala com a sacudidela. Alémdo mais, um controle negativo bem/biblioteca foi coberto de TBS [pH 7.5]/2 mMCaCI2 só. Depois que o pré-revestimento foi completo, IL-6 (+ biotin) foiacrescentado e as chapas foram incubadas para 1.5 hora na temperatura de salacom a sacudidela.

B. Pérolas de Coatins: 20 uL Dynal streptavidin (M 280; Dynal ASA)foram incubados com 5 jiig biotinylated IL-6, em 500 \xL TBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2e giraram na temperatura de sala de 1 hora em tubos Eppendorf. Como umcontrole negativo, 20 Dynal jllL streptavidin sem alvo foram incubados em 500 uLde TBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2 e giraram na temperatura de sala de 1 hora. Observeque Dynal cobre de pérolas foram lavados pelo menos duas vezes com TBS [pH7.5]/2 mM CaCI2 antes do alvo que acrescenta, e as pérolas foram cobertas agranel.

2. Bloqueio

A. Bloqueio de Chapas: o Revestimento de solução foi retirado e ospoços foram lavados um tempo com 200 uL/welI de TBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2. 250ul/well de BSA de 1 % (gratuito pela procaçoada) em TBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2 foiacrescentado e incubou para 1 hora na temperatura de sala com a sacudidela. Osreagentes alternativos (p. ex. caseínico ou leite) podem ser usados para obloqueio.

B. Bloqueio de Pérolas: o Revestimento de solução foi retirado e aspérolas foram lavadas duas vezes com TBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2. 500 BSA de 1 %ul (gratuitos pela procaçoada) foram acrescentados em TBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2e giraram para 1 hora na temperatura de sala. Como observado em cima, osreagentes de bloqueio alternativos podem ser usados.

3. Lavagens

A. Lave Chapas: os Poços foram lavados três vezes com 200 uJL/welIde TBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2 para retirar o alvo excessivo.

B. Lave Pérolas: as Pérolas foram lavadas três vezes com 1000 uL deTBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2 para retirar o alvo excessivo. Permitiu-se que pérolas sereunissem em um magneto de alguns minutos depois que cada um se lavam paraevitar a perda de conta.

4. Adição de Fago

A. Adição de fase a Chapas: aproximadamente 1000 equivalentes debiblioteca (domínio de Al biblioteca fago ingênua) foram acrescentados no buffer deadição fago (leite seco sem gordura de 1 % / BSA de 0.2 %, ou outro agente debloqueio apropriado (gratuito pela procaçoada), em TBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2) eincubaram na temperatura de sala de 2 hora com a sacudidela. Em círculos 2-3,100 total uL de fago colhido foi acrescentado a 7 poços (6 alvo + 1 controlenegativo) diluído no buffer de adição fago.B. Adição de fase a Pérolas: aproximadamente 1000 equivalentes debiblioteca (domínio de Al biblioteca fago ingênua) foram acrescentados em 500leite seco sem gordura de 1 % jlxl + 100 (al BSA de 1 % (gratuito pela procaçoada)em TBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2 e incubou com a rotação na temperatura de sala de2 hora. Em círculos 2-3,100 total pL de fago colhido foram acrescentados apérolas.

5. Lavagem

A. Lavagem de Chapas: as chapas foram lavadas oito para dozevezes com 200 fzl/well de TBS [pH 7.5J/2 mM % de CaCI2/0.1 Tween-20 durante operíodo de 10 minuto.

B. Lavagem de Pérolas-. As pérolas foram lavadas 8-12 vezes com800 ul de TBS [pH 7.5]/2 mM % de CaCI2/0.1 Tween-20 durante o período de 30 -45 minuto. A reinterrupção de conta foi facilitada pela distribuição lavam o bufferdiretamente para pérolas colecionadas ou por pipetting de cima para baixo (nãopor vortexing). Alternativamente, um aparelho de Martim-pescador (ThermoLabSystems) ou equivalente pode ser usado para a lavagem de conta.

As condições para Estrito lavam-se (opções)

a. 800 [íL de TBS [pH 7.5]/2 mM % de CaCI2/0.1 Tween-20 em 37°C;

b. 800 pL de TBS [450 mMJVaa1 pH7.5]/2mMCaCI2/0.1 % Tween-20em temperatura de sala;

c. As pérolas foram lavadas normalmente 6-8 vezes, então 1 \xg deIL-6 não etiquetado foi acrescentado para 1 hora na temperatura de sala ou 37°C.Fago que permaneceu se ligado depois que isto lava-se foram conservados paraeluição/infection;

d. % de leite/0.2 de 1 % BSA/with ou sem uréia de 1 m / 37°C (altaseveridade).

6. Competição (opcional):

A. Competição em Chapas: os Fago foram incubados com 100pIVwelI de 20 ug/mL (2 jLig/welI) de slL-6R mais 7.5 ug gpl30 em TBS [pH 7.5] /CaCI2 de 2 mm de 1 hora na temperatura de sala com a sacudidela. slL-6R/gpl30os eluates foram conservados para a infecção de BIueKan K91 E. coll

B. Competição em Pérolas: os Fago foram incubados com 20 \xg deSIL-6R e 75 ug de gpl30 em 500 uL TBS [pH 7.5] / CaCI2 de 2 mm de 1 hora natemperatura de sala com a sacudidela. slL-6R/gpl30 os eluates foram conservadospara a infecção de BIueKan K91 E. coli.

7. Fago Eluição

A. Eluição de de Chapas: 100 pL/wellof lOmg/mLtripsinina TBS [pH7.5] / CaCI2 de 2 mm foi acrescentado, e as chapas foram incubadas em 37°Cpara 30 minutos com a sacudidela.

B. Eluição de de Pérolas. 100 uL 10 me/ml trvosin TBS franco> H7.5V CaCk de 2 mm foi acrescentado a pérolas, que então foram incubadas em37°C (em uma tortura de Eppendorf) para 30 minutos com a sacudidela.

C. Alternativa eluição/infection: 200 uL da fase do Iog BIueKan K91 E.coli células em ODgoo ~ 0.5 foram acrescentados a cada um bem (para chapas)ou a pérolas aspiradas. Permitiu-se que a infecção procedesse para 30 minutos em37°C sem sacudidela. Depois, 200 volumes \xL foram juntados e acrescentaram a~ 3 mL de 2xYT/0.2 |a.g/mL tetracycline e sacudido para 15 minutos em 37°C.

8. Infecção: (mesmo para Protocolo de Conta e Chapa)

Um volume apropriado da fase do Iog BIueKan K91 E. coli (em2xYT/40 Hg/mL kanamycin) foi cultivado a OD6OO ~ 0.5 - 0.6. Quando a culturaconseguiu OD6OO, foi colocado no gelo antes do uso, embora o tempo no gelofosse geralmente minimizado.

A. Em um 50 tubo cônico estéril mL, eluted os fago foram mistos com5 fase do Iog mL BIueKan K91 E. coli cultura e incubaram em 37°C para 25minutos sem sacudidela. Os tubos cônicos estéreis foram cobertos com a fita deAirPore (Qiagen) para facilitar a aeração.

B. O Tetracycline foi acrescentado a uma concentração final de 0.2|ag/mL e sacudido para 15 minutos em 37°C.

C. Uns 10 |a, L parte alíquota foi escolhido para titering e em sériediluiu-se de 10 pregas (10 "1 para 10" 6) em 2xYT, chapeado em 8 lugares deIjL/dilution em 2xYT/20 Q.g/ml tetracycline chapas e incubou durante a noite em30°C ou 37°C. O volume restante dos 10 "2-10" 4 diluições foi chapeado para obtercolônias únicas de fago subseqüente ELIS Como.

D. Infeccionado 5 culturas mL foram diluídas ~10-prega em 50 mL2xYT/20 |ag/mL tetracycline e incubadas com a sacudidela em 30°C durante anoite à saturação.

9. Fago de entrada de Titering foi usado no círculo atual de arrasar(mesmo para a Chapa e Protocolo de Conta)

A. diluições seriais de 100 pregas (10 "4 para 10" 10) de fago colhidoforam feitos em 2xYT.

B. 100 uL/welI de uma fase do Iog BIueKan K91 E. coli cultura emOD6OO 0.5-0.6 foram acrescentados a 6 poços de uns 96 - bem chapa depolipropileno.

C. 10 \xL de fago diluído foram acrescentados aos poços que contêm100 u. L de BIueKan K91 E. coli.

D. As misturas de Fago/cell foram incubadas em 37°C para 25minutos sem sacudidela, e as chapas foram cobertas com a fita de AirPore(Qiagen) para levar em conta a aeração.

E. O Tetracycline foi acrescentado a uma concentração final de 0.2|j.g/mL e a chapa foi sacudida para 15 minutos em 37°C.

F. 8 u. L de cada diluição (10 "4 para 10" 10) foi chapeado para umseco 2xYTágar-ágar / 20 (ag/mL tetracycline chapa.

G. As chapas foram incubadas em 3 0°C ou 3 7°C durante a noite.10. Ceifa fago (mesmo para Protocolos de Conta e Chapa)

A. As culturas noturnas foram centrifugadas em 7000 revoluções porminuto em 50 tubos mL disponíveis de 25 minutos a células de pílula.

B. Um procedimento de fago-precipitação de PEG/NaCI padrão foiexecutado acrescentando 1/5 o volume de um % de PINO/15 de 20 % estoque deNaCI à cultura supernse ligant. Foi misto bem por repetidamente invertendo eincubando no gelo de 45 minutos a 1 hora.C. A cultura foi centrifugada em 7000 revoluções por minuto de 40minutos à pílula fago e o supernse Iigant foi descartado.

D. A pílula fago foi resuspensa em 1 mL TBS [pH 7.5] / CaCI2 de 2mm, transferiu para um tubo Eppendorf e centrifugou em revoluções por minuto de13 KB de pelo menos 2 minutos à pílula o material insolúvel.

E. O Supernse Iigant foi transferido a um tubo fresco e o volume 1/5de PEG/NaCI foi acrescentado, misto e incubou no gelo de ~ 5 minuto.

F. A mistura então foi centrifugada em 13000 revoluções por minutode pelo menos 2 minutos, e o supernse Iigant foi retirado. Os fago peletizados,purificados foram resuspensos em até 1 mL TBS [pH 7.5] / CaCI2 de 2 mm efornecidos em 4°C.

II. Ao redor 2 e ao redor de 3 arrasar

As 2as e 3as condições arrasam redondas estiveram geralmente omesmo como em 1 Redondo descrito em cima, exceto o alvo coberto (isto é. IL-6)o montante foi reduzido 2-a de 4 pregas para cada um círculo subseqüente, e aschapas (ou pérolas) foram lavadas 2-4 vezes adicionais em cada um círculosubseqüente de arrasar.

III. Recombinação de intra-domínio opcional

As seqüências de monômero em fago porções de fago selecionadosda exposição foram recombinadas no procedimento seguinte. Este processo gerouo híbrido monômero s derivado de porçãos variadas do começo monômero coleçãoem um consórcio (s) dado. Para Al-domain-based fago bibliotecas, os pares deprimer SHF1 (ATTATGCCCCGGGTCTGGAGGCGTC; SEQ IDNO:488)/SHBoverlap (CGCCGTCGCAA; SEQ ID NO:489) e SHFoverIap(TTGCGACGGCG; SEQ ID N0:490)/B3 (TCGGCCCCAGAGGCCTGCAATG; oSEQ ID NO:491) foram usados para PCR-amplificar as duas porçãos domonômero s. As 2 porçãos foram fundidas em conjunto com LA Taq polymerase(Takara). Depois, o híbrido fundido que codifica seqüências foi amplificado porprimeres SHF2 (CCGGATTATGCCCCGGGTCTGGA; SEQ ID NO:492) e SHB4(AACAGTTTCGGCCCCAGAGGCCTGC; SEQ ID NO:493). Os produtos PCRPurificados foram digeridos por Sfil (NEB) e ligado com o ÍQSE5HA Sfil-digeridofago vetor para gerar bibliotecas monômero recombinadas. As bibliotecasrecombinadas foram arrasadas pelo menos mais dois círculos contra IL-6 eprotegidas como descrito em baixo. Os dados da caraterização de monômero srecombinado estão em Tabelas 1 e 2.

IV. Análise de arrasar com produção (mesmo para chapa e protocolosde conta)

Fase ELISAs: para cada produção "fago juntam" para ser analisado(tipicamente Círculos 2, 3 e 4, se aplicável), os clones independentes foraminoculados em 1 mL (2xYT7 20 (.ig/mL tetracycline) culturas cultivadas noCoadjuvante 96 - bem polipropileno chapas profundas bem. As dicas inoculamforam deixadas em, e as chapas foram sacudidas durante a noite em 37°C. Ascélulas foram peletizadas por centrifugação em 3600 revoluções por minuto de 15minuto. A cultura supernse Iigants foi conservada e ELISAs foram executadoscomo descrito em baixo.

O Non-biotinylated IL-6 (0.1 |ig/well) foi diretamente coberto paraNunc Maxisorp chapas. Contudo, biotinylated IL-6, 96 - bem Nunc Maxisorp chapasdeve ser primeiro coberto de 50 uL/welI de 50 u.g/mL (2.5 |ig/well) de streptavidin,diluído em TBS [pH 7.5] / CaCI2 de 2 mm. A chapa foi incubada em 37°C para 1hora com a sacudidela. As chapas foram lavadas três vezes com 200 uL/welI deTBS [pH 7.5] / CaCI2 de 2 mm. Os poços foram bloqueados com 200 |iL/well deBSA de 1 % (fração V) e a chapa coberta foi incubada em RT de 1 hora com asacudidela. A chapa foi lavada três vezes com TBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2. Depois,os 96 - bem chapa de Maxisorp foram cobertos de 100 uL/welI de 1 [ig/mL (0.1Ag/well) biotinylated IL-6 diluído em TBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2 ou 100 buffer deuL/welI só (controle negativo). A chapa foi incubada em RT de 1 hora com asacudidela. As chapas foram lavadas três vezes com TBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2.

Depois, 30 uL de cada fago supernse Iigant são acrescentados a poços napresença de 70 uL do % de Leite/0.2 de 1 % BSA / [pH 7.5]/2 mM % de CaCI2/0.02Tween-20. As chapas cobertas foram incubadas em RT de 1.5 hora com asacudidela.

As chapas foram lavadas quatro vezes com TBS [pH 7.5]/2 mM % deCaCI2/0.02 Tween-20. Depois, 100 pL/welI (de X-M13-HRP o anticorpomonoclônico (Amersham Pharmacia), diluído 1:5000 em TBS [pH 7.5]/2 mM CaCI2+ Tween-20 de 0.02 %, foi acrescentado. As chapas foram incubadas em 4°C para1 hora com a sacudidela. As chapas foram lavadas três vezes com TBS frio [pH7.5]/2 mM % de CaCI2/0.02 Tween-20. 100 uL/welI de mistura TMB/H202 (Furam),diluído 1:1, foi acrescentado para o desenvolvimento ELISA.

Permitiu-se que as reações virassem azul até que os sinais de OD650mais fortes conseguissem ~ 1.0. A reação foi parada com 100 [aL/welI 2N H2S04,e poços positivos modificados em cores de azul a amarelo. Uma vez que a reaçãofoi parada, foi lido em OD450 em um leitor de chapa ELISA que usa software deSoftMaxPro.

As porções de fago ELISA-positivos de Fago foram escolhidos parasubclonar-se em um vetor de expressão se eles tiveram a uma alta freqüência declones de fago individuais que se ligaram a hlL-6 e alta diversidade de seqüência(b) entre os clones de fago de ligação e positivos. As porções que encontramesses critérios foram escolhidos para a proteção de proteína no processodelineado em baixo. Para subclonar o monômero ou seqüências multímero de umconsórcio de fago dado no vetor de expressão, pEve, aproximadamente 108-1010fago foram amplificados por 25 ciclos de PCR como se segue:

Receita de PCR0.5 - 1 |jL fago purificado5 pL Tampão 10X8 pL 2.5 mm dNTPs

5 ml de 10 pM VS-para primer (5-atcatctggccggtccggcctacccgtatgatgttccgga-3s; seq idno:494)

5 pL 10 pM EveNut primer (5

^aaaaggccccagaggccttctgcaatgac-S'; seq id no:495)26 pL H200.5 pL LA Taq polimerase (1 unidade) (Takara)

Ciclos: 25 X [94oC/10sec.,-45°C/30sec,-72°C/30sec]

Os produtos de PCR foram dirigidos em 3 % agarose gel da análise.O monômero ou o produto multímero (aproximadamente 200 bp) foram purificadoscom uma coluna de volta de QIAquick (Qiagen)1 digerido com Sfi eu (NEB),purificado novamente com uma coluna QIAquick e logo ligado usando DNA de T4Ligase (NEB) ao Sfi digeri o vetor, pEve. O Iigation foi transformado emelectrocompetent BL21 (DE3) E. coli e chapeado para 2xYT chapas que contêmkanamycin em 40 |ig/mL. Depois do crescimento noturno, aproximadamente 6000clones individuais foram inoculados em 2xYT/kanamycin e cultivados noturnos. Oscontroles positivos e negativos também estiveram incluídos nas chapas.

V. Proteção de milhares de proteína monômero em 1 célula mLIisados

A Produção de Proteína de 1 mL aqueceu Iysates (Dia 1): os clonesindividuais foram inoculados em poços de uns 96 - bem Apresentam ComoCoadjuvante a chapa profunda bem que contém 500 |iL/well de 2xyt/40 u.g/mLkanamycin. As culturas foram cultivadas noturnas (as dicas inoculam foramdeixadas em poços) enquanto sacudido em 300 revoluções por minuto em 37°C.Este processo permitiu proteger de milhares do indivíduo, monômerosparcialmente purificado ao nível de célula-lysate.

(Dia 2) 100 \xL da cultura noturna foram inoculados em novos 96 -bem Apresentam Como Coadjuvante a chapa profunda bem que contém 1 mL/welIde 2xyt/40 u.g/mL kanamycin + CaCI2 de 1 mm. (A cultura noturna restante foiarquivada pela adição da concentração de glicerol final de 25 % e logo fornecidaem-80°c do uso posterior.) as Chapas foram cobertas com a Fita de AirPore(Qiagen) e as culturas foram cultivadas com a sacudidela em 375 revoluções porminuto em 37°C até que um OD6OO de ~ 0.8 a 1.0 fosse derivado. Uma vez que oODgoo desejado foi derivado, as culturas foram induzidas com 1 mm IPTG de 3hora sacudindo em 375 revoluções por minuto em 37°C. As chapas que contêmculturas induzidas então foram centrifugadas para 15 minutos em 3600 revoluçõespor minuto em 4°C a células de pílula. O Supernse Iigant foi retirado e descartado,e a pílula de célula restante foi resuspensa em 100 jllL de TBS [pH 7.5]/l mMCaCI2. As células resuspensas foram transferidas dos 96 - chapa bem profundabem a uns 96 - bem polipropileno chapa de PCR e aqueceram-se para 5 minutosem 65°C em uma máquina PCR. As células de Heated/lisadas então foramcentrifugadas para 15 minutos em 3600 revoluções por minuto em 4°C. Depoiscentrifugação, a produção de proteína foi completa, e proteína os Iysates estiveramprontos para a caraterização em uma tela primária via a se ligadura de ELISA e/oucompetição ensaios de AIphaScreen.

Proteína de IL-6 ELISA: 96 - bem as chapas de Maxisorp foramcobertas de 100 uL/welI de 1 [ig/mL (0.1 (ag/well) IL-6 (R&D sistemas) diluído emTBS [pH 7.5]/1 mM CaCI2, e a chapa foi incubada em 4°C durante a noite outemperatura de sala (RT) de 1.5 hora com a sacudidela. Os poços foramesvaziados e logo bloqueados com 200 uL/welI de BSA de 1 % (fração V)/TBS[pH7.5]/l mM CaCI2. A chapa coberta foi incubada em RT de 1 hora com asacudidela. A chapa foi lavada três vezes com TBS [pH 7.5]/l mM CaCI2. Aproteína de 1 mL Iysate preparações foi acrescentada aos poços como umaconcentração de ponto única diluída 1:10 em TBS [pH 7.5]/l mM caCI2/BSA/de 0.1% Tween-20 de 0.02 % a um volume final de 100 uL por bem. As chapas cobertasforam incubadas em RT de 1.5 hora com a sacudidela. A chapa foi lavada trêsvezes com TBS [pH 7.5J/1 mM caCI2/Tween-20 de 0.02 %. 100 uL / bem doanticorpo de detenção anti-HA-HRP (Roche) diluído 1:2000 em TBS [pH 7.5J/1 mMcaCI2/BSA/de 0.1 % Tween-20 de 0.02 % foram acrescentados. As chapascobertas foram incubadas em RT de 1 hora com a sacudidela. A chapa foi lavadatrês vezes com TBS [pH 7.5]/1 mM caCI2/Tween-20 de 0.02 %. 100 \xL / bem deTMB/H2S04 mistura diluída 1:1 foram acrescentados. Permitiu-se que a corvirasse azul até que OD650 dos sinais mais fortes conseguisse ~ 1.0. A reação foiparada com 100 uL/welI de 2N H2S04. Uma vez parado, a chapa foi lida no leitorde chapa ELISA em OD450.

AIphaScreen IL-6/Fc-biotinylated (bilhões) de IL-6 ensaio decompetição homogêneo: os componentes de ensaio de Alt foram diluídos noTampão de AIphaScreen: HEPES de 40 mm [pH 7.4] w/NaOH, I mM CaCI2, 0.1 %BSA (w/v), Tween-20 de 0.05 %, NaCI de 100 mm. Três adições foram feitas a umbranco, 3 84 - pois, reduzir-volume, Greiner microtiter chapa de ensaio sem tempode incubação entre adições. Primeiro, os monômero s ou ser humanorecombinante não etiquetado IL-6 (rhlL-6, R&D Sistemas) (como controle positivo)foram acrescentados à chapa em 4 uL/well. O Monômero s de 1 mL aqueceu-se aspreparações Iysate foram acrescentadas aos poços em um single a concentração(não diluído [isto é 1:4 final analisam a diluição] ou até um 1:100 diluição [1:400diluição de ensaio final]). Como um controle positivo, em vez da proteínamonômero , 4pL/well de rhlL-6 não etiquetado foi acrescentado à chapa como umacurva de concentração de doze pontos que começa com 400 nM (isto é 100concentração de ensaio final nM) e logo 1:4 diluições seriais depois destes com oponto último como tampão só. Em segundo lugar, 2 uL/well de bn-rhlL-6 em 1 nM(isto é 0.25 concentração de ensaio final nM) foram acrescentados à chapa.Observe que o resto do ensaio foi feito na luz subjugada ou verde filtrada como aspérolas de AIphaScreen são leves sensível. Em terceiro lugar, 2 uL/well de umamistura de IL-6R em 28 nM (7 concentração final nM) e gpl30/Fc em 1.6 nM (0.4concentração final nM) e AIphaScreen Streptavidin "pérolas de doador" e Proteína"um aceitante cobre de pérolas" (PerkinEImer) ambos diluíram-se a 40 pg/mL (istoé, 10) j, g/ml_ concentração de ensaio final) foi acrescentado à chapa. A chapa deensaio então foi coberta com topseal e girada abaixo para 30 segundos a 800revoluções por minuto. A chapa então foi incubada durante a noite na escuridão natemperatura de sala e ler no dia seguinte no leitor de Chapa de Fusão(PerkinEImer).

VI. Multímeroization e recombinação de fago monômero sselecionado da exposição

Os Monômero s que foram subclonados em pEve (pEve/monômero )foram multirnerized na maneira seguinte, os pEve/monômero plasmídios(individualmente ou em porções) foram digeridos com BsrDI ou com Bpml (NEB). OBsrDI de-1.1 KBs e-2.9 fragmentos Bpml foram isolados de 1 % agarose géis epurificados com Qiagen QIAquick colunas de volta. Os porções de cada um dosdois fragmentos foram ligado que usa DNA de T4 Iigase (NEB); posteriormente, oIigation foi purificado com um Qiagen QIAquick coluna de volta. Usando osprimeres CONTRA - para e EveNut descrito no fago seção que se subclona emcima, o multímero codificação de seqüências foi PCR-amplificado do ligation. Osprodutos PCR foram purificados e digeridos com Sfil (NEB), seguidos por ligationcom pEve e a transformação de BL21 (DE3) E. coli. Este método criou dímeroscompreendido de combinações diferentes do começo monômero s. Este métodotambém pode ser usado para gerar outro multímeros, como trímeros. Fazendotrímeros, os porções de pEve/dímeros (p. ex. no acima mencionado exemplo) epEve/monômero s (a coleção inicial) são os materiais iniciais. Eles sãoprocessados como em cima. Um procedimento de biologia molecular semelhante aisto descrito em baixo para fazer "bibliotecas andam" também foi usado para gerarmultímeros. Em todos os casos, a proteína foi expressa, purificada e protegidacomo em cima.

As bibliotecas adicionais, as "bibliotecas andam trligadas como,"foram geradas por Iigating fago monômero s selecionado da exposição (isto éselecionadas monômero s) com o cheio representação de uma bibliotecamonômero ingênua. Essas bibliotecas foram construídas na maneira seguinte. OPCR foi usado para amplificar em duas reações separadas: a) as seqüências decodificação do monômero s selecionado com pETF(ACCCGTATGATGTTCCGGATTA; SEQ ID n. 496)/pETB2r(GATGTATTCGGCCCCAGA GGCCTGCAATGAC; SEQ ID N0.497); e b) asseqüências de codificação de monômero s ingênuo em uma biblioteca monômerocom 21newl (GAAATTCACCTCGAAAGCAA; SEQ ID NO:498)/23(ATGGGTTCCTATTGGGCT; SEQ ID NO:499). -200 produtos bp foram isoladosde 3 % agarose gel e purificados com Qiagen QIAquick colunas de volta. Cadaproduto da e (b) em cima foi digerido com BsrDI ou com Bpml (NEB) em reaçõesseparadas. Monômero s Bpml-digeridos têm um ressalto que pode ser ligado amonômero s BsrDI-digerido. Os produtos de digestão purificados foram ligado um aou outro que usa DNA de T4 Iigase (NEB). O Ligation de monômero s ingênuoBsrDI-cortar com Bpml-cortar selecionou monômero s gera uma marcha dimerbiblioteca compreendida do N-terminal monômero s ingênuo fundido ao C-terminalselecionou monômero s. O Ligation de monômero s ingênuo Bpml-cortar comBsrDI-cortar selecionou monômero s gera uma marcha dimer bibliotecacompreendida do C-terminal monômero s ingênuo fundido ao N-terminalselecionou monômero s. Os primeres pETF/pETB2r foram usados para PCR-amplificar o ligado dimer codificação de seqüências do ligation, e os produtospurificados foram digeridos com Sfil seguido por Xmal. Os produtos digeridos foramligado ao vetor de fago ÍUSE5HA para a geração de um dimer de exposição defago "biblioteca que anda", tipicamente com 108-109 membros únicos. Um trimer(ou maiores multímero) "biblioteca que anda" pode ser gerado de uma maneirasemelhante, exceto que os materiais iniciais são dímeros (ou maiores) emonômero s ingênuo. As bibliotecas andam foram arrasadas contra IL-6 eprotegidas como descrito em cima.

VII. Caraterização de monômero s purificado em se ligadura eensaios de competição

Uma vez que a proteína foi caracterizada na proteína aquecida Iysatenível, os melhores monômero s foram escolhidos para a nova caraterização. Asculturas de maiores escala de clones individuais estiveram preparadas e osmonômero s, que carregam um 6xHis (SEQ ID NO:379) etiqueta, foram purificadosvia a resina Ni-NTA. Esses monômero s purificado do níquel foram analisados nase ligadura de ELISAs e o ensaio de competição AIphaScreen. Os dados deseqüência de proteína e os dados bioquímicos da caraterização de monômero spurificado estão em Tabelas 1 e 2.

Purificação de Proteína 500 Culturas mL de NiNTA: (Dia 1) tubo decultura de InalõmL que contém 3 mL de 2xYT + 40 |a.g/mL kanamycin, o "golpeprimário apropriado bem" o estoque de glicerol arquivado foi inoculado. A culturafoi sacudida durante a noite em 300 revoluções por minuto em 37°C.(Dia 2) 2 mL da cultura noturna foi inoculado em 1 L Erlenmeyerfrasco de sacudidela que contém 500 mL de 2xYT + 40 u.g/mL kanamycin. Asculturas foram cultivadas com a sacudidela em 375 revoluções por minuto em 37°Caté que um ODgoo de aproximadamente 0.8-1.0 fosse derivado. Uma vez OD6OOdesejado foi derivado, as culturas foram induzidas com a concentração final de 1mm de IPTG de 3 hora sacudindo em 375 revoluções por minuto. Depois de 3indução de hora, 500 cultura mL foi transferida a clean/autoclaved Sorvall tubo ecentrifugada para 8 minutos em 8000 revoluções por minuto em 4°C a células depílula.

Uma vez que as células foram peletizadas, o supernse Iigant foiretirado e descartado, e 20 mL do tampão de sonicação (mM de sacarose/20 de 10% Tris [pH 7.5]/150 mM mM de NaCI/0.2 CaCI2) foram acrescentados a cada tubo.A pílula foi resuspensa no tampão de sonicação com 10 mL serological pipeta atéque não houvesse nenhuma moita visível, e logo as células resuspensas (~ 30 mL)foram transferidas em 35 mL Oakridge Tubos e sonicated de 8 minutos em ~ 16produção de poder. Depois sonicação, os Tubos Oakridge quentes que contêmsonicated células foram colocados em um banho de gelo/de água de ~ 10 minutospara esfriar. Uma vez esfriado, os tubos foram centrifugados para 30 minutos em18.000 revoluções por minuto em 4°C à pílula Iisadas células.

Enquanto os tubos que contêm Iisadas células eram centrifugados, aresina de NiNTA (Qiagen) foi lavada com a água Milli-Q para retirar o etanol. 3 mLde 1:1 diluíram-se a resina/proteína NiNTA foi usada (isto é de fato 1.5 mL daresina/proteína foram usados). 3 mL da resina/água misturam cada um foiacrescentado a apropriadamente etiquetado (com a proteína ID) limpam 50 tubo degorro de parafuso de mL. Depois sonicated células foram peletizados, a proteínasupernse Iigant foi retirada e acrescentou a 50 tubo mL que contém os 1.5 mL daresina NiNTA lavada. A proteína foi permitida se ligam a à resina NiNTAbalançando-se suavemente para 0.5 hora RT. Depois da incubação com a resinaNiNTA, 50 tubos mL com NiNTA se ligado à proteína foram centrifugados para 10minutos em -1500 revoluções por minuto. O Supernse Iigant foi suavementeesvaziado e descartado.

Resina de NiNTA + a proteína se ligada foi transferida aapropriadamente etiquetado 15 colunas Clontech mL acrescentando que 1 mL deNiNTA Lava o Tampão (20 mM Tris [pH 7.5], NaCI de 200 mm, CaCI2 de 0.1 mm,20 mM imidazole) a 50 tubo mL que contém resina, girando para resuspender, logopipetting a mistura em uma coluna que foi montada em uma cópia de vácuo.Resina de NiNTA + a proteína se ligada foi lavada com pelo menos 10 volumes decoluna (15 mL) de NiNTA lavam o tampão. 15 colunas mL que contêm resina deNiNTA + a proteína se ligada e lavada foi transferida a uns 15 tubos de coleção degorro de parafuso de mL limpos e 4 mL de Ni Eluição tampão (20 mM Tris [pH 7.5],NaCI de 200 mm, mM de CaCI2,200 de 0.1 mm imidazole) foi acrescentado a cadacoluna a elute de proteína em 15 tubo de coleção mL. Então foi permitido a elutepela gravidade.

A proteína de Eluted foi transferida para Escorregar-Iyzer cassete(aproprie-se do se Iigalho MW — para monômero s usado 3.5 se Iigalho kDa e paradímeros e trímeros usou 10 se Iigalho kDa) a utilização de 18.5 agulha de medida e5 seringa mL para carregar cassete. O escorregão-lyzers que contém elutedproteína foi colocado no tampão de diálise noturno que contém redox reagentes(20 mM Tris [pH 7.5], NaCI de 100 mm, mM de CaCI2,1 de 1 mm 2-mercaptoethanol, 0.25 mM 2-hydroxyethyldissulfeto).

(Dia 3) as cassetes de Escorregão-lyzer que contêm durante a noitedialyzed proteína foram transferidas no tampão de diálise sem redox (20 mM Tris[pH 7.5], NaCI de 100 mm, CaCk de 1 mm). Depois de 3 diálise de hora, ascassetes de Escorregão-lyzer foram transferidas em TBS/fresco CaCI2 sem redoxde outra 3 hora. Depois da 2a modificação de diálise, a proteína foi retirada decassetes de Escorregão-lyzer que usam 18.5 agulha de medida e 5 seringa mL, ea proteína foi transferida filtrando utilização de 0.2 filtro de seringa de mícron em 15tubo de polipropileno mL apropriadamente etiquetado. Os anti-IL-6 NiNTA proteínapurificada, que foi selecionada como "os melhores nervos inibidores" em ensaiosde competição AIphaScreen ou "melhores pastas para guardar papeis" em uma seligadura ELISA, foram além destes purificados pela troca de ânion Q-Sepharosepara retirar contaminantes. Purificação de Q-Sepharose: 1 mL da Resina de Fluxorápido Q-Sepharose (Amersham Biosciences) foi acrescentado a 15 colunaClontech mL. Resina com 15 volumes de coluna (ou 15 mL) de 20 mm Tris [pH7.5], NaCI de 50 mm, CaCI2 de 1 mm foi equilibrated. 2 mL (~ 5 mgs) da proteínaNiNTA-purificada filtrada foram acrescentados à resina e permitiu-se que aproteína se ligasse à resina pela gravidade. Fluxo - por na primeira coluna de 96 -bem a chapa foi reunida. As colunas carregadas com a proteína foram transferidasa 15 tubo de coleção mL e a proteína de resina / a proteína amarrada foramlavadas com 10 volumes de coluna (ou 10 mL) de 20 mm Tris [pH 7.5], NaCI de 50mm, CaCI2 de 1 mm. Uma vez lavado, o declive de NaCI eluição da proteína foicomeçado. A concentração de NaCI foi variada no declive como se segue: 100mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 500 mM, e finalmenteNaCI de 1 m, a uma base de 20 mm Tris [pH 7.5], CaCI2 de 1 mm. As fraçõesforam reunidas em 96 - chapa de polipropileno bem profunda bem 2 mL/fraction,em 1 incrementos de mL. As frações que contêm proteína foram testadas porBradford e analisadas pela PÁGINA SDS. As frações foram testadas na se ligadurade ELISAs e ensaios de competição como descrito em cima com a modificaçãoseguinte. A proteína de 500 mL NiNTA preparações purificadas ou NiNTA + aspreparações purificadas de Q-sepharose foi acrescentada à chapa como umacurva de concentração de doze pontos que começa com um 1:5 a 1:100 primeiradiluição e logo 1:4 diluições seriais depois destes com o ponto último como tampãoapenas IL-6 que se liga monômero s & dímeros

O seguinte fornece um sumário do IL-6 que se liga monômero sidentificado, agrupado pela homologia de seqüência. Há 7 famílias, em que osmembros da mesma família relacionaram seqüências.

A informação pode ser resumida como se segue. As seqüências entreparênteses ("Q") indicam a alternativa amino ácidos em uma posição única. Asseqüências de consenso em baixo incluem marcas de pergunta ("?") • Essesindicam posições que podem estar presentes ou ausentes.Família 1 motivo (SEQ ID NO:27):

CX[AS][DN]EFXCXXGXC[ILV]XXAXXCDGV[DN]DCXDNSDEXXC[AST]XX[AST]

Família 2 motivo (SEQ ID NO:28):

CXXXQFXC[DN]NGXCVPXXWXCDG[DE][DN]DCXD[DN]SDEXXCXXP[AST]

Família 3 motivo (SEQ ID NO:29):

CXXXQFQCXSG[W,Y]C[EU,L,P]XXXW[V,L]CDGXNDCEDXSDEXXCFamília 4 motivo (SEQ ID N0:30):

CXXX[EQ]FXCXXGXC[ILV]XXXXXCDGX[DN]DCXDXSDEXX(XX)CFamília 5 motivo (SEQ ID NO:31):

CX[A,P]X[E,Q]FXCXXGQC[EU,L]PXXXXCDGX[D,N]DCXDXSDEXXCFamília 6 motivo (SEQ ID NO:32):

CXXX[EQ]FXCX(X)SXXC[ILV]XX[DN]W[ILV]CDGVNDCXDXSDEXGCXXXT

Família 7 motivo (SEQ ID NO:33):

CL[AS]X[EQ]FXCXNGXCIP[KQR]XWVCDGDNDC[ILV]DXSDE(P)XXCX[EKQ]XT

Os detalhes de cada família de Iigantes de IL-6 seguem. Oespaçamento (ou arremetidas ("-") é só para alvos de alinhamento. Cada linharepresenta um domínio monomérico contíguo.<table>table see original document page 147</column></row><table>Fam3 (SEQ ID NOS:535-554)pontos combinações esperado motivo (SEQ ID NOS:555-562)

-23 c...qf[kqr]c..g.c[filmv]...w[ilv]cdg..dced.sde[ast][dn] c......

.25 c...qf[kqr]c.sg.c[filmv].[kqr] .w[ilv]cdg..dced.sde[ast]1 [dn]c......

-27 c. . . qfqc. sg [fwy] c [ilv] . [kqr] . w[ilv] cdg [de] . dced. sde [ast]1 [dn]c......

29 C. . .qfqc.sg[fwy]c[ilv].[kqr].w[ilv]cdg[de]ndced.sde[ast]1 [dn]c......

-34 c...qf[kqr]c.sg.c[filmv].q.wvcdg[ekq].dced.sdeancags

CLPSQFQCGSGWCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSQFRCGSGCCFSQRWVCDGKNDCEDSSDEANCAGSLPTCGASQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCLPDQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCLPDQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCLPDQFQCGSGYCLSQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCLPDQ FQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPT

am4 (SEQ ID NOS:563-576)

CLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSDETN..CPARTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGVDDCEDSSDEKG..CTPHTCLSDQFQCGSGHCLPASWRCDGEDDCADSSDETS..CTASEPTCPSSQ FQC S S GWCIPEDWRCDGVPDCGDGS DEAS DHCAPSQFQCGSGYCIPLTWVRDGVDDCEDGSDEED..CSQDPEFHKVCLPNQFTCDSGNCVPQALGCDGDNDCEDNSDESPALCAAPAHTCLPNEFTCDSGNCVPQALGCDGDNDCEDNSDESPALCAAPAHTCAPNQFQCGSGYCVPAAWVCDGENDCEDNSDESSALCQERTCLPDQFPCENGKCLPVNLVCDGDDDCPDGSDESEV.CAGAVRTCPSSQFRCNNGHCLSVTLVCDGDNDCEDDSDETG..CEGSGHTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDDCVDSSDEAS..CQPPTCLSGEFTCENGNCLSLSLVCDGEDDCEDGSDEAS..CPPPTCPPDEFQCNSGSCLSQPLLCDGEDDCGDGSDEES..CIAAEHTCQPGQFRCNNGHCLSQPLVCDGVPDCEDGSDEAS..CSAPASEPPGSL

pontos combinações esperado motivo (SEQ ID NOS:577-579)

994 15 IO'12 c. . . [eq] f .c. .g.c[ilv]......dg..dc.d.sde.............

1011 14 IO'14 c. . . [eq] f .c. .g.c[ilv].....cdg. .dc.d. sde.............

007 1?

1 IV^ r.. . . rp.rrl f . r.. .n.rTÍ Iwl<table>table see original document page 149</column></row><table>combinações esperado motivo (SEQ ID NOS:623-626)

cl[as].[eq]f.c.ng..ip[kqr].wvcdgdndc[ilv]d.sde.?..c.[ekq].t S

cl[as].[eq]f.c.ng.cip [kqr].wvcdgdndc[ilv]d.sde.?..c.[ekql.t |_jg

cl[as].[eq]f.c.ng..ipqtwvcdgdndcldgsde.?v.ca[elcq]rtclanqfkcdngr.ipqtwvcdgdndcldgsde.?v.ca[ekq]rt ant

es

de IL-6 dímeros incluiu o seguinte (SEQ ID NOS:627-781). Os Dímeros não sãoorganizados pela família.

CLPNQFQCRSGQCIPRPWVCDGDNDCGDDSDEANCKAPVHTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CGRTEPT

CLSSEFTCGNGNCIPRPWVCDGDNDCVDDSDEKGCPEPTCLPSQFQCGSGYCIS

QRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CLSSQFQCSNGNCIPAAWLCDSDNDCGDDSDETSCPAPTCPSSQFQCSSGWCIPEDWRCDGVPDCGDGSDEASDH CGDSHILPFSTPGPST

CLASEFQCRNGSCIPLQWLCDGDNDCGDDSDEENCATTERTCLPSQFQCGSGY

CISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CLSSEFTCGNGNCIPRPWVCDGDNDCVDDSDEKGCPEPTCPSSQFQCSSGWCIPEDWRCDGVPDCGDGSDEASDH CGDSHILPFSTPGPST

CGASQFQCHNTSICIPRPFVCDGDNDCGDDSDEADCKTSGHTCLPSQFQCGSGY

CISQRWVCDGENDCEDSSDEA NCAGSVPT

CLSSEFTCGNGNCIPRPWVCDGDNDCVDDSDEKGCPEPTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGVDDCEDSSDEKGCT PHT

CPSSQFQCGSGYCISPAWVCDGVNDCEDGSDEKSCAPHTCLPDQFQCGSGYCL

PQAWVCDGENDCEDGSDETNCP ARTE

CAPSQFTCGNGNCVPRPWLCDGDNDCEDDSDETSCPPHTCLPDQFQCGSGYCL

PQAWVCDGENDCEDGSDETNCP ARTE

CAPSQFTCGNGNCVPRPWLCDGDNDCEDDSDETSCPXHTCLPDQFQCGSGYCL

PQAWVCDGENDCEDGSDETNCP ARTE

CLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCRPGQFQCGSGYCIPRPWRCDGDNDCEDDSDEKG CARSEPT

1319 11 IO"29

1258 10 IO-30

1286 9 IO'36

1299 8 IO"41CLPSQFQCRNGRCIPLPWLCDGDNDCEDDSDETNCTPRTCAPSQFQCGSGYCIP

LTWVCDGVDDCEDGSDEEDCE TAAPT

CLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCRASQFQCGSGY

CIPRPWLCDGVNDCEDGSDEAD CQTRT

CVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPDQFQCGSGY

CLPQAWVCDGENDCEDGSDETN CPART

CLPSQFQCRNGRCIPLPWLCDGDNDCEDDSDETNCTPRTCAPNQFQCGSGYCV

PAAWVCDGENDCEDNSDESSAL CQERT

CAPSQFTCGNGNCIPRPWLCDGDNDCEDDSDETSCPXPTCLPDQFQCGSGYCL

PQAWVCDGENDCEDGSDETNCP ARTE

CLSSEFTCGNGNCIPRPWVCDGDNDCVDDSDEKGCPEPTCVPSQFQCGSGYCI

SQRWVCDGENDCEDSSDEANCA 5 GSVPT

CAPNQFQCGSGYCVPAAWVCDGENDCEDNSDESSALCQERTCLPSQFQCGSG

YCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CGANEFQCGSGYCLPVGWVCDGENDCEDNSDEKGCPPHTCLPNQFQCRNGRC

IPLPWLCDGDNDCEDDSDATNCT PRT

CAPNQFQCGSGYCVPAAWVCDGENDCEDNSDESSALCQERTCVPSQFQCGSG

YCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGVDDCEDSSDEANCAGSVPTCLPDQFQCGSG

YCLPQAWVCDGENDCEDGSDETN CPART

CAPSQFQCGSGYCIPLTWVCDGVDDCEDGSDEEDCETAAPTCLPSQFQCGSGY

CISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CLPSQFQCRNGRCIPLPWLCDGDNDCEDDSDETNCTPRTCLPSQFQCGSGYCIS

QRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CAPSQFTCGNGNCVPRPWLCDGDNDCEDDSDETSCPPHTCAPNQFQCGSGYCVPAAWVCDGENDCEDNSDESSAL CQERT

CLPSEFQCHSTSICVPRQWLCDGDNDCGDDSDEKGCETHTCVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANC AGSVPT

CPPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSDETNCPARTCLSSEFTCGNGNCI

PRPWVCDGDNDCVDDSDEKGCP EPTCAPSQFTCGNGNCVPRPWLCDGDNDCEDDSDETSCPPHTCAPSQFQCGSGYCI

PLTWVCDGVDDCEDGSDEEDCETAAPT

CLPSQFQCRNGRCIPLPWLCDGDNDCEDDSDETNCTPRTCLPDQFQCGSGYCL

PQAWVCDGENDCEDGSDETNCP ARTE

CLSSEFTCGNGNCIPRPWVCDGDNDCVDDSDEKGCPEPTCLPDQFQCGSGYCL

PQRWVCDGVDDCEDSSDEKGCT PHT

CAPSQFQCGSGYCIPLTWVCDGVDDCEDGSDEEDCETAAPTCLPDQFQCGSGY

CLPQAWVCDGENDCEDGSDETN CPART

CAPNQFQCGSGYCVPAAWVCDGENDCEDNSDESSALCQERTCLSSQFQCDNGNCVPQQWVCDGDNDCLDDSDETS CSAPASEPPGSL

CLSSEFTCGHGICIPRPWVCDRDNDCMYHSHEISCPEPTCLPDQFQCGSVYCLPE

RLVCDCLNDCEDSSDEAXCA GSXPT

CLPSQFQCRNGRCIPLPWLCDGDNDCEDDSDETNCTPRTCVPSQFQCGSGYCIS

QRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCGWWGSSEFRC

ATYPHGRCIPSSXVCDGEDDCGD GSDEHEVFCGGGG

CAPSQFQCGSGYCIPLTWVCDGVDDCEDGSDEEDCETAAPTCLPSEFQCHSTSICVPRQWLCDGDNDCGDDSDEK GCETHT

CVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLSSEFTCGNGN

CIPRPWVCDGDNDCVDDSDEKG CPEPT

CLPSEFQCHSTSICVPRQWLCDGDHDCGDDSDEKGCETHTCLASQFTCRNGNCIPEPWVCDGDNDCVDDSDEESC PPHT

CEADQFQCGSGYCLPRHWVCDGDNDCEDDSDETDCGRPGPGATSAPAVSGGS

GGSGGSCGS

CRASQFQCGSGYCIPRPWLCDGVNDCEDGSDEADCQTRTCVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CAPNQFQCGSGYCVPAAWVCDGENDCEDNSDESLAHCQAHTCVSSEFRCSSGQCIPPPWRCDGVDDCDNASDEAG CTPPT

CQPGQFPCGSGSCVSERLLCDGVDDCADGSDEAGCPPRTCVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSXEANCA GSVPTCHSE

LIGAQFECSSGQCISLDWLCDGVNDCADGSDESQHCPPRTCVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAXSVPT

CEASQFPCRNSERCVPPHLLCDGVNDCADGSDEIGCPPHTCVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANC AGSVPT

CPSNQFQCRNNGTCIPLPWLCDGVDDCGDDSDETSCTEPTCVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANC AGSVPT

CQSSEFTCSSGRCLSAGWLCDGVNDCRDDSDEESCTAPVPTCVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CQPGQFQCHDYGRCVSQNWLCDGDPDCLDSSDEANCQPPTCVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANC AGSVPT

CPAGQFQCRTGRCIPLALLCDGENDCQDGSDEAGCPTPTCVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CGAGEFPCDNGRCVPAALLCDGDDDCGDNSDEKDCAQPTCVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CRSSEFRCDSGHCLPLPWVCDGDDDCEDGSDEAQDCEPRTCVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANC AGSVPT

CRSNQFQCGSGYCIPVKWLCDGENDCEDGSDESLAHCQAHTCVASQFRCDNGRCLSEPLGCDGVNDCPDNSDEED CTTAEHT

CRADQCQCNSGHCLSRNLRCDGEDDCDNASDEKSCSQDPEFHKVCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGVDDCEDSSD EKGCTPHT

CLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCRSSQFQCGNGRCISVHWVCDGDDDCEDSSDESS AHCKPRT

CPSNEFRCNNGHCIPRAWRCDGDNDCGDSSDETDCTQRTCRSNQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPTCPADEFPCKNGKCLPLPWVCDGDNDCDNASDETDCTSELIGAPTCRSNQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPTCGSDEFLCNNGKCIPPTWGCDGVNDCQDNSDEAPALCPPPTCRSNQFQCGSGYCIPQRWVCDGVDDCEDSSDEKG CTPHT

CAPNQFQCGSGYCVPAAWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCRSGQFQCGSGYCISQRWXCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCRPSQFPCSNGQCVPQTWVCDGVNDCQDDSDETD CSAPASEPPGSL

CLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCRPSEYPCGNGRCVPQPLRCDGVNDCEDSSDEAN CTPHT

CRSNQFQCGSXYCÍPVKWLCDGENDCEDGSDEADCAGSVPTCRPDQFPCDNGN

CIPGPWGCDGVNDCLDSSDETD CTPPT

CPSSQFKCNNGSCVPQDWLCDGVNDCVDGSDEPAVCQQRTCRASQFQCGSGYCIPRPWLCDGVNDCEDGSDEADC QTRA

CASGEFRCGNGRCVPQRWLCDGVPDCEDNSDETDCQPPTCRASQFQCGSGYCIPRPWLCDGVDDCEDSSDEKGCT PHT

CLPSQFQCGSGYCIPQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCQSSEFPCSSGHCLPLALGCDGEDDCDNASDEES CEPRT

CRASQFQCGSGYCIPRPWLCDGVNDCEDSSDEANCAGSVPTCQPSQFRCRSGH

CISGALGCDGEPDCGDGSDETG CRASAHT

CLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCQPDQFRCGSGPLRSTALACDGXKXLSGQLGXKK AVEPPDRT

CLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCQAGEFRCGNGRCLPPDWRCDGVDDCGDGSXEAS CKTPT

CQSDEFTCRDSNKCVSRDWLCDGEDDCPDGSDETSCAGSERTCPSSQFQCSSGWCIPEDWRCDGVPDCGDGSDEA SCPPHT

CVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCPSNEFPCESGHCVPLTWRCDGEDDCPDSSDEAN CGRPGPGATSVPAA

CRSNQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSDETNCPARTCPSGQFRCDNGKCLSEAWVCDGVDDCRDGSXESEHC NOMEADO

CRSNQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCPSGQFQCRGTGKCIPQPWVCDGDNDCQDDSDEK DCSAPASEPPGSL

CLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCPSGEFRCGNGSCLPAGWVCDGVDDCVDGSDEKG CQTPT

CVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGXNDCDNASDEED CTEHT

CVPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEED CTEHT

CRSNQFQCGSGYCIPVKWLCDGENDCEDSSDEESCPXRTCPPSEFRCKGSGKCVPQHWLCDGVNDCEDDSDEKSC PPPT

CRSNQFQCGSGYCIPVKWLCDGENDCEDSSDEESCPARTCPPSEFRCKGSGKCVPQHWLCDGVNDCEDDSDEKSC PPPT

CLSSEFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCPADEFRCSSGRCVPATWLCDGVDDCEDSSXESL ETCTPHT

CRSNQFQCGSGYCIPVKWLCDGENDCEDGSDEADCQTRTCLSSEFQCSNGQCVSQRLLCDXVDDCLDDSDEEDCS APASEPPGSL

CQANQFRCNNGRCLSPAWLCDGVDDCPNGSDEEGCPPHTCLSSEFQCGSXYCISQRWVCDXENDCEDSSDEANCA GSVPT

CESGEFTCGSGQCLPATWRCDGDNDCADDSDETNCPQPTCLSSEFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CPPGQFRCRSGNCLPQTWVCDGDDDCEDDSDESPALCSQDPEFHKVCLPSQFQCGSVYCISQRWVRDGXNDCEDS SDEANCAGSVPT

CQSGQFPCGNGNCIPRPLRCDGVDDCPDGSDEPPECPQPTCLPSQFQCGSGYCISRRWVCDGENDCEDSSDEKGC TPHT

CQPDEFTCHDKNRCISLALLCDGVNDCEDDSDEEGCAPRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDXENDCEDSSDEANC AGSVPT

CVSSQFKCSNGRCLPLGWLCDGVDDCADGSDEKNCPPPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDXENDCEDSSDEADCA GSVPX

CVPNQFPCGNGHCLPRDWLCDGVNDCGDSSDESPAHCTEPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSXXAN CAGSVPT

CRAGQFRCSSGHCLPRRLLCDGEDDCVDGSDETGCTQRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEKGCT PHT

CQPNQFRCSNGRCVPLNLLCDGVPDCEDGSDEEGCPPRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CRSSQFRCSSGQCVSLGWVCDGVNDCPDSSDETGCPKRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CHAIAQFGCKSGRCLSLGLLCDGVDDCADGSDEAGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANC AGSVPT

CPPSQFTCSNGNCLSPTLLCDGVNDCVDDSDETSCAASVHTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CLADQFKCHNTNICIPGRLGCDGDPDCEDDSDEKGCPPHTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANC AGSVPT

CPPGEFPCSSGHCLSQALRCDGVPDCEDDSDETGCPPPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CGANEFTCGNGRCLSPTWLCDGDDDCGDNSDEASCGGTAPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CLPNEFPCGSGHCIPQAWVCDGENDCQDSSDEAPAHCAAPVPACLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDE ANCAGSVPT

CPPSQFKCSNGRCLPVQLLCDGVPDCPDGSDETGCPPPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CLASQFRCGNGSCLSQTLLCDGVNDCDNASDEVSCPPPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEESCTGPGHTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CPPGEFQCNSGHCLPGTWGCDGEDDCPDGSDESQDCAPPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANC AGSVPT

CPSSEFKCNNGQCLPVRWLCDGVNDCLDSSDEASCAARTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CHPPSQFRCSNGQCLPLTWRCDGVNDCGDNSDEEDCPERTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANC AGSVPT

CLANEFRCSSGQCIPARWLCDGVNDCVDDSDEKDCPARTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CLPGQFRCHSTDTCLPESWVCDGVNDCADDSDEASCPPHTCLPSQFQCGSGYC!SQRWVCDGENDCEDSSDEANC AGSVPT

CLSSQFRCDSGRCISQDWLCDGVNDCQDGSDESLAICPPHTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CPAGQFTCGSGKCVSGGLLCDGDNDCQDGSDEAGCATRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CAPDQFKCGNGNCLPLPWVCDGDNDCGDNSDEANCPQHTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CAPSQFRCESGQCLPANWRCDGENDCQDGSDESPAICEGTAPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDE ANCAGSVPT

CPSNQFTCRSGSCLSLAWLCDGVNDCPDNSDEADCAERTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPTCPSSEFPCHGNSRCIPLTWLCDGDNDCGDDSDEKNCEAAGPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEA NCAGSVPTCQPSQFRCGNGHCLPPTLVCDGENDCRDNSDETSCSELIGAVRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPTCRADEFRCSSGHCIPAPWGCDGVNDCEDGSDEAGCPARTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CAANEFRCRSTNTCIPQQWLCDGVNDCQDDSDEKSCRTPAPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEA NCAGSVPT

CAPSQFPCSSNDICVPRRWRCDGVDDCGDSSDEASCGTSVRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEA NCAGSVPTCLPDQFPCSNGRCLPPTWVCDGENDCQDGSDEADCTEPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CLPNQFRCRNGQCLPQNWLCDGVNDCGDSSDETNCEPHTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CQPSQFQCNNGHCLSVRWLCDGVDDCQDGSDETDCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CRSNEFTCSSGSCXPLAWVCDGVNDCLDDSDEAGCPAPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CLSGEFKCNSGHCIPGPWLCDGDDDCPDGSDETDCGSPGPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPTCPADQFRCSNGRCIPRTWVCDGVDDCGDGSDESPLCESAAHTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEA NCAGSVPT

CVPSQFQCRNNGICIPQNWHCDGVPDCEDSSDEESCGTTVHTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEA NCAGSVPTCLPSEFPCDSGQCLPLAWLCDGVDDCRDSSDESLEICPKHTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CPPGEFKCNSGNCVSPTWGCDGVDDCGDDSDEASAICEAPEHTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDE ANCAGSVPT

CPPGQFPCSNGRCVPQRLRCDGDPDCEDNSDEAGCATPEPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CVANEFRCGNGHCVPLAWLCDGVPDCVDDSDETSCQARTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPA

CQPGEFRCRNGRCLPLAWLCDGVDDCVDGSDETNCAARTCLPSQFQCGSGYCIPQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPTCGASEFRCDSGHCISPDWRCDGDNDCVDGSDEKSCEQRTCLPSQFQCGSGYCFSQRWVCDGENDCEDGSDEANCA GSVPT

CRADEFTCNNGRCVPQTWVCDGDPDCEDSSDEKGCTASVHTCLPSQFQCGSGYXISXXXVCXXENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCGNGRCLPLRLLCDGDDDCGDNSDEPL ATCETSAPT (

CRSNQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPGQFRCNSGQCLPLQWACDGVDDCDNASDEAS CEPPT

CAAGQFQCHSTSRCVSLRWVCDGEDDCRDGSDEEGCTTAVPTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGVDDCEDSSDEK GCTPHTCPPSQFPCNSGNCVSAAWVCDGVDDCGDDSDESLAICPTSTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGVDDCEDSSDEKG CTPHT

CRASEFRCRSYERCISPRWVCDGVNDCGDNSDETGCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGVDDCEDSSDEKGC TPHT

CPLDQFTCGNGSCLPANLLCDGVNDCEDNSDEAGCPTRTCLPDQFQCGSGYCL PQRWVCDGVDDCEDSSDEKGCT PHMCPAGQFPCDSGRCVPQPWRCDGVNDCEDGSDEAPATCPEHTCLPDQFQCGSG

YCLPQAWVLRXRKXLXGQLGXSK TVQAPYLTCRPSQFQCQNSSRCIPLGWRCDGDNDCEDGSDEKDCTSELIGARTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSDET NCPARTCLANQFRCGNGRCVSPSWLCDGVDDCGDDSDEASCAAAEPTCLPDQFQCGSG

YCLPQAWVCDGDNDCEDGSDETN CPART

CRPNQFPCGNGHCLPGRWLCDGDDDCPDGSDEEGWPPPTCLPDQFQCGSGYC

LPQRWVCDGVDDCEDSSDEKGCT PHT

CPANEFTCDNGHCLPPSLLXDGENDCGDDSDETSCAAPGPTCLPSQFQCGSGY

CISQRWVCDXENDCEDSSXEAN CAGSVPT

CRSSQFTCNSGSXLPGHLVCDGVDDCEDNSDEENCAGPGRTCLSSEFQCGSGY

CISQRWVCDXENDCEDSSNEAN CAGSVPT

CQANEFTCSSGNCLSPALLXDGVDDCGDNSDETNCASPAPTCLPSQFQCGSGY

CISQRWVCDGENDCEDSSDEAN CAGSVPT

CEAGEFRCRNGSCIPEAWGCDGVNDYLDNSDETNCPAHTCLSSEFQCGSGYCIS

QRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CPSGQFRCDNGHCLSPPLLXDGVNDCGDDSDETGCTQRTCLPSQFQCGSGYCI

SQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CPPSEFRCHSTNTCLSPTLLXDGDNDCGDGSDEASCPQRTCLPSQFQCGSGYCI

SQRWVCDGENDCEDSSDEANC AGSVPT

CVPDEFPCNSGQCVSLAWLCXGVNDCRDGSDEAPYWEPPTCLPSQFQCGSGY

CISQRWVCDGENDCEDSSDEANC AGSVPT

CASNEFPCSNGNCIPGPLRCDGVNDCEDNSDESPLWPLHTCLPSQFQCGSGYCI

SQRWVCDGENDCEDSSDEANC AGSVPT

CQSDQFQCNSGSCIPPPWRXDGVDDCRDSSDEEGCPPRTCLPSQFQCGSGYCI

SQRWFCDXENDCEDSSXEANCA GSVPT

CEANQFPCNSGSCIPPRWLXDGVDDCGDNSDEENCTRPTCLPSQFQCGSAYCIS

QRWVCDGENDGEDSSDEANCA GSVPT

CLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCGGSEFTCGNGRCLPQHWFCDGENDCLDDSDEAG CPAPTCASDQFQCNGSRKCISQSWLCDGVNDCPDSSDEKSCPPHTCGANEFQCGSGYCLPRPWVCDGEDDCEDGSDESLA HCQAHT

CPANQFRCGNGSCLSANWLCDGVNDCLDNSDEKNCGGAGHTCGANEFQCGSG

YCLPRPWVCDGEDDCEDGSDESL AHCQAHT

CPSGQFRCGSGRCIPQHWRCDGDDDCRDGSDEASCAPPTCAPSQFQCGSGYCI

SQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CQPFDEFECRNGSCIPLPWRCDGVNDCLDDSDEEDCTGSAPTCAPSQFQCGSGYCIPQRWVCDGVDDCEDSSDEK GCTPHT

CHPPNKFGCSNGRCVSPALLCDGVDDCQDNSDEKGCPPHTCAPNQFQCGSGYCVPAAWVCDGENDCEDSSDEKGC TPHT

CLPGQFRCNSGRCVPWLVCDGVDDCADDSDEAGCPPPTCAPNQFQCGSGYCV

PAAWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPT

CAPGQFPCGNGQCLPLHWVCDGVNDCGDNSDEAGCPPHTCAPNQFQCGSGYCVPAAWVCDGENDCEDNSDESSAL CQERT

CPPNQFPCGSGQCLPQPLVCDGDDDCGDGSDELQLCEQPTCAPNQFQCGSGYCVPAAWVCDGENDCEDNSDESSA LCQERT

CRSNQFQCGSGYCIPVKWLCDGENDCVDGSDEESCPARTCAPDEFRCDSGRCVPRTLGXATGDDDCEGRARMKKT VERPNPT

CRANQFQCGSGYCIPRPWLCDGENDCEDGSDETNCPARTCAANEFTCGNGHCL

PPTWACDGVNDCQDGSDEASCQ TPT<table>table see original document page 161</column></row><table><table>table see original document page 162</column></row><table><table>table see original document page 163</column></row><table><table>table see original document page 164</column></row><table><table>table see original document page 165</column></row><table><table>table see original document page 166</column></row><table><table>table see original document page 167</column></row><table>Os seguintes (SEQ ID NOS:286-339) representam seqüênciasque compreendem trímeros que se ligam a IL-6 (cada monômero no trimerse liga IL-6) ligado a um IgG que se liga monmer domínio. Incluído são 9trímeros com um de dois domínios anti-lgG na N-terminal, separada por umde dois Iigantes (9x2x2 = 36 tetramers). Também enumerado são 9 trímeroscom um de dois domínios anti-lgG na C-terminal, embora nenhumadiversidade Iigante fosse investigada para esses construtos (9x2 = 18tetrâmeros).

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCLPDQFRCGNGQCIPLD

WVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCE

DGSDEAN

CAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCLPDQFRCGN

GQCIPLD

WVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCE

DGSDEA

NCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCRADEFQCGS

GRCVPAD

WLCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCE

DGSDEAN

GQCIPLD

WVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDC

EDGSDEA

NCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTQHTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCQANEFTCSS

GNCLSPALLCDGVDDCGDNSDETYCASPAPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDC

EDSSDE

ANCAGSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDDCVDSSDEASCQPPTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCLPDQFRCGN

GQCIPLD

WVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEA

NCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEADCAAPTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCLPDQFRCGN

GQCIPLD

WVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGSGYCLSQRWVCDGENDCEDGSDEA

NCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCESDQFQCDS

GHCVPLN

WVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCE

DGSDEA

NCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCGASQFQCGS

GYCISQR

WVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLSADWLCDGVND

CDNASD

EEGCPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSDETNCPARTCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCKPRTCLPDQFRC

GNGQCIPL

DWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEA

NCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCKPRTCLPDQFRC

GNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDE

ANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHTCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCKPRTCRADEFQC

GSGRCVP

ADWLCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGEND

CEDGSDE

ANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCICPRTCLPDQFR

CGNGQCIPL

DWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDE

ANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTQHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCKPRTCQANEFTC

SSGNCLSP

ALLCDGVDDCGDNSDETYCASPAPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSD

EANCAGSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDDCVDSSDEASCQPPTCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCKPRTCLPDQFRC

GNGQCIPL

DWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDE

ANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEADCAAPT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCKPRTCLPDQFRC

GNGQCIPL

DWVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGSGYCLSQRWVCDGEND

CEDGSDE

ANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCKPRTCESDQFQC

DSGHCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGEND

CEDGSD

EANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCKPRTCGASQFQC

GSGYCIS

QRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLSADWLCDGWDCDNA

SDEEGCPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSDETNCPARTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGN

GQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCE

DGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDC

TEHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGN

GQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCE

DGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCRA

DEFQCGS

GRCVPADWLCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCE

DGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDC

TEHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGN

GQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTQHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCQANEFTCSSG

NCLSPALLCDGVDDCGDNSDETYCASPAPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCE

DSSDEANCAGSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDDCVDSSDEASCQPPT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGN

GQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCE

DGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEADCAAPT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLGLPDQFRCGN

GQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGSGYCLSQRWVCDGENDCE

DGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCESDQFQCDSG

HCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCE

DGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCSAPASEPPGSLCGASQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLSADWLCDGVNDCDNASDEEGCPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSDETN

CPART

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCG

NGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDC

EDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCG

NGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDC

EDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCRADEFQCG

SGRCVPADWLCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDC

EDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCG

NGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDC

EDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTQHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCQANEFTCS

SGNCLSPALLCDGVDDCGDNSDETYCASPAPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDDCVDSSDEAS

CQPPT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLC

LPDQFRCG

NGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWV

CDGENDC

EDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEAD

CAAPT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLC

LPDQFRCG

NGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGSGYCLSQRWV

CDGENDC

EDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEED

CTEHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLC

ESDQFQCD

SGHCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWV

CDGEND

CEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEE

DCTEHT

CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLC

GASQFQCG

SGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLSAD

WLCDGVN

DCDNASDEEGCPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSDETN

CPART

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGS

GYCISQRW

VCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDC

DNASDEEDCTEHTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGS

GYCISQR

WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVND

CDNASD

EEDCTEHTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCRADEFQCGSGRCVPADWLCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGS

GYCISQR

WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVND

CDNASD

EEDCTEHTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCLPDQFRCGNGQCffLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSG

YCLPQR

WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVND

CDNASD

EEDCTQHTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCQANEFTCSSGNCLSPALLCDGVDDCGDNSDETYCASPAPTCLPSQFQCG

SGYCISQR

WVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDD

CVDSSDE

ASCQPPTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGS

GYCLPQR

WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVND

CDNASD

EADCAAPTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGS

GYCLSQR

WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVND

CDNASDEEDCTEHTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRTCESDQFQCDSGHCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGS

GYCISQR

WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASD

EEDCTEHTCLSSEFQCQSSGRCffLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRT

CGASQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQC

RDSKICLS

ADWLCDGVNDCDNASDEEGCPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSD

ETNCPARTCLSSEFQCQSSGRCIPLAWVCDGDNDCRDDSDEKSCKPRT

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGS

GYCISQRW

VCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEE

DCTEHTCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSL

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQR

WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASD

EEDCTEHTCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSL

CRADEFQCGSGRCVPADWLCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQR

WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASD

EEDCTEHTCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSL

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQR

WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVND

CDNASD

EEDCTQHTCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPA

SEPPGSL

CQANEFTCSSGNCLSPALLCDGVDDCGDNSDETYCASPAPTCLPSQFQCG

SGYCISQR

WVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDD

CVDSSDE

ASCQPPTCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSL

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGS

GYCLPQR

WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVND

CDNASD

EADCAAPTCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPA

SEPPGSL

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGS

GYCLSQR

WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVND

CDNASD

EEDCTEHTCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPA

SEPPGSL

CESDQFQCDSGHCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGS

GYCISQR

WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASD

EEDCTEHTCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSL

CGASQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLS

ADWLCDGVNDCDNASDEEGCPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGEND

CEDGSD

ETNCPARTCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSL

Exemplo 8

Este exemplo descreve experimentos que demonstram ainibição de IL-6-proliferação de célula induzida por Ligantes de IL-6 trímeros.

TF-1, dependente de GeneraI-Motors-CSF linha de célulaerythroleukemia humana, foi comprado de ATCC (CRL-2003). O IL-6 é umstimulator potente da proliferação de célula TF-1. O uso de células TF-1 paradeterminar a eficácia de IL-6, IL-6R, e/ou nervos inibidores gpl30 é bemestabelecido na arte.

As células de TF-1 foram mantidas no meio de crescimento(RPMI1640 complementado com 50 uM 2 - MIM1 antibiótico-antimycotic), FBSde 10 % e 5 ng/ml hGM-CSF (Leukine). Antes do ensaio, as células de TF-1foram lavadas e culto durante a noite no meio de crescimento mais FBS de 1% e Leukine. As células de TF-1 então foram lavadas três vezes com o meiode crescimento mais FBS de 1 %, sem Leukine antes do ensaio.

As diluições seriais de anticorpos monoclônicos anti-IL-6 (Seclonam 6708-111, R&D Sistemas, e Clonam MQ2-13A5, eBioscience) ou umanti-IL-6 trimer além destes compreendendo um IgG domínio de ligação na N-terminal (que em outros experimentos foi mostrado para não afetar u-6 que seliga) estiveram preparadas no meio de crescimento mais FBS de 1 % eincubadas com uma concentração fixa de rhlL-6 (0.2 ng/ml de R&D Sistemas)para 45 minutos em uma incubadora umedecida em 37°C conter C02 de 5 %.

As células de TF-1 (Ixl04/well) foram cultas na presença ou aausência do anti-IL-6 inhibitors-hlL-6 a mistura em uns 96 - chapa de fundobem chse liga (Becton Dickinson) em um volume final de 200 ul/well de 40hora em uma incubadora umedecida em 37°C, C02 de 5 %. As células forametiquetadas com o pulso com 1 uCi/welI [de 3o]-Thymidine (AmershamBiosciences) durante a 16 hora final da cultura. As chapas foram colhidascom uma ceifeira de célula semi-automática (Tomtec, lnc) e [a 3a] realização-Thymidine foi medida usando um Balcão da microbeta (Wallac-Perkin Elmer).

Os resultados são expressos como média cpm de poços triplos.Os experimentos de controle determinaram 0.2 ng/mL como oEC50 de rhlL-6 da estimulação da proliferação de célula TF-1.

O anti-IL-6 trimer inibiu a proliferação de célula TF-1 induzidapor 0.2 ng/mL IL-6 a 50 % do máximo em uma concentração de 0.8picomolar.

Este ensaio fornece um meio de proteger monômero s oumultímeros da atividade anti-IL-6 em um em vitro bioassay utilização decélulas humanas. Determinando valores de IC50 de multímeros testado oumonômero s, as ótimas moléculas podem ser identificadas e colocadas combase na sua atividade biológica.

Exemplo 9

Este exemplo descreve experimentos que demonstrammonômero se ligadura a uma linha de célula humana IL-6-expressing.

Os monômeros foram construídos para incluir uma influenzahemagluttinin (Al) epitope etiqueta. Isto permite ao monômero ser usadocomo um fluxo primário cytometry agente de detenção, com um de maneirafluorescente marcado anticorpo ANTIAI secundário que é usado como oagente de detenção secundário.

As células de rim embrionárias humanas de 293 PÉS(Invitrogen) foram transitoriamente transfected com uma fusão CD23-IL-6 novetor de pDisplay (Invitrogen), resultando na expressão de superfície decélula de IL-6.

9 trímeros foram testados para a capacidade de se ligar293FT/CD23-IL-6 células. As células de 293 PÉS de Untransfected, bemcomo Jurkat, HuT78, ArentAR1 U266-BL, Raji, RPMI8226, e linhas de célulaDaudi, foram usadas como controles negativos.

Para determinar a se ligadura de monômero , 2.5X105 ascélulas foram sujadas com 10 uM IL-6 trimer em 100 ul FACS sujandotampão (SERVIÇO PÚBLICO DE RADIODIFUSÃO pH 7.4, soro de bezerrofetal de 5 %, sódio de 0.01 % azide) no gelo de 30 minuto. As células foramlavadas uma vez com 4 FACS frios como gelo ml que sujam tampão, logoresuspenderam em 100 ul FACS sujando tampão mais 0.2 ug FITC-conjugados anticorpo ANTIAI monoclônico (Santa Cruz Biotecnologia) eincubaram no gelo de 30 minuto. As células foram lavadas uma vez com 4FACS frios como gelo ml que sujam tampão, logo resuspenderam em 200 ulFACS sujando tampão e analisaram a utilização de um Fluxo de FACSCaIiburCytometer (BD Biosciences). Os dados foram reunidos e analisaram autilização CeIIQuest Pro (BD Biosciences). A fluorescência avara geométricafoi determinada para cada linha de célula mais IL-6 trimer, e normalizadacontra a fluorescência avara geométrica daquela linha de célula mais FITC-conjugado anticorpo ANTIAI monoclônico sozinho.

O anti-IL-6 trimer mostrou a se ligadura significante só a293FT/CD23-IL-6 células, sem se ligadura descoberto para alguma de outraslinhas de célula testadas.

Este ensaio fornece um meio de proteger monômero s oumultímeros de IL-6 especificidade ligante. A especificidade de IL-6 por cimade outra proteína superficial pela célula pode ser um fator importante nodesenvolvimento de um terapêutico, e pode ser usada para proteger eselecionar para ótimas moléculas.

Exemplo 10

Este exemplo descreve experimentos projetados para medir oem vitro afinidade ligante de anti-IL-6 monômero s.

Os experimentos foram executados em um Biacore 1000máquina SPR. O tampão corrente de todos os experimentos foi HBS-P(Biacore) com a adição de CaCI2 de 1 mm.-200 RUs do ser humano IL-6 foram conjugados a um flowcellde um pedaço CM5 que usa união de NHS/EDC e ethanolamine que bloqueiasegundo protocolos do fabricante.

As diluições seriais da 11-6 se ligadura trimer usado no Exemplo9 foram preparadas no tampão corrente, e injetadas por cima do IL-6-conjugated flowcell. O sinal resultar de curso por cima de uma mofa uniu-seflowcell foi subtraído dos dados a minimize efeitos de turno de volume. Osdados foram analisados usando o software BiaEvaIuation (Biacore)1 usandoum 1:1 Langmuir que se liga modelo.

Independente ajusta-se dos dados a um 1:1 se Iiganteo osvalores produzidos de modelo do kon = 1.95xlOV, koff = 4.93x10 '4MV, Kd =2.53x10" 10 M.

Este ensaio fornece um meio de proteger monômero s oumultímeros de IL-6 afinidade ligante. A afinidade a IL-6 pode ser usada comoum indicador da atividade biológica potencial, e usada para proteger eselecionar para ótimas moléculas.

Exemplo 11

Este exemplo descreve experimentos projetados para mostrarna atividade vivo de anti-IL-6 trímeros em ratos.

8 semana velhos ratos de CD-I femininos foi usada para todosos experimentos.

A Ótima dose de IL-6 (600 ng/mouse em 100 SERVIÇOPÚBLICO DE RADIODIFUSÃO ul, soro de rato de 1 %, intraperitonealinjeção) e tempo para sacrificar injeção de IL-6 seguinte (6 horas) foipredeterminada por titulação de dose e medição do soro amyloid (SAA) nosoro colhido de ratos sacrificados pela punctura intracardíaca.

O SAA foi medido por ELISA conforme as instruções dofabricante (Biosource). Todos os experimentos incluíram três ratos por grupode trse ligam aento, com medições de SAA duplicadas que são feitas paracada rato.As doses de Trimer estiveram preparadas em 20 mm Tris,pH7.6, NaCI de 260 mm, CaCI2 de 1 mm, com cada dose que tem um volumede 200 ul por rato. Todas as preparações monômero contiveram a menos de4 UE/mg endotoxin como medido pelo LAL endpoint método (Sócios doBacalhau de Cabo).

Doses de Trimer, controle anticorpos monoclônicos (anti-IL-6 ourato IgGI1 500 ug por rato em 200 ul) ou veículo sozinho foram injetados via aveia de rabo. Uma hora depois, 600 ng IL-6, 200 ng IL-1, ou veículo sozinho(SERVIÇO PÚBLICO DE RADIODIFUSÃO, soro de rato de 1 %) foraminjetados intraperitoneally. Seis horas depois desta segunda injeção os ratosforam sacrificadas, e soro colhido. O soro foi congelado para embarque earmazenamento antes da análise.

O anti-IL-6 trimer completamente abrogou a indução de proteínade fase aguda pelo ser humano IL-6. Ao contrário o anti-IL-6 trimer nãomostrou afetam na indução de proteína de fase aguda pelo ser humano IL-1,indicando que o efeito inibitivo é específico. Também se considerou que oefeito inibitivo de anti-IL-6 trimer era dependente da dose. Esses resultadosindicam que anti-IL-6 trimer pode inibir especificamente as funções biológicasde IL-6 em um na colocação de vivo.

Exemplo 12

Este exemplo descreve a geração de se ligadura de IL-6adicional seqüências baseadas em um andaime de domínio.

As seqüências seguintes foram identificadas como se ligadurade IL-6 como medido por ELISA que se liga a IL-6 e também por atividadebiológica no ensaio de célula TF1 (SEQ ID NOS:855-928):

CESDQFQCDSGHCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAG

SVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHTCLPDQFRCGNGQCMPLDWVCDGWDCPDDSDEEGCPPRTCAQSKFQCGS

GYCISQRWVCDGEYDCEDGSDEANCADSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRGWRCDGVNDCADSSDEEDCTENP

CLSVQFRCGNGQC1PLDWVCDGVKDCPDDSDEEGCPPWTCAPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGESDCEDGSDEANCAG

SVPTCPSDEFRCRNGRCIPRGWLCDGVNDCDNASDEEDCTDNTCLPDQFRCGNGQC1PLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGWC1STRWVCDGENDCEDGSDEANCPG

TVPTCPSDEFRCKNGRCVPRSWCCDGVNDCDNASDEEDCTDPT

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVSDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSG

YCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLPDQFRCGNGQC1PLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSGEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLPDQFRCGNGQC1PLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSDEFRCRNGCCIPRAWRCDGVNDCTDNSDEGDCTEHT

CLSDQFRCGNGDCIRLDWVCDGVNDCTDDSDEEGCPQRSCAPSQFQCGS

GYCISQGWVCDGENDCEDGSDEANCAG

CVPTCRSDEFRCRNGRCIPLAWRCDGVNDCVDNSDEEDCPEHTCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCADXSDEXXCPTRTCXPSQFQCGXXYC1SQRWVCDGEXDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CPSDKFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAG

SVPTCPSDEFRCRNGQC1PLDWVCDGVNDCPDDSDEEDCTEHT

CPSDEFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAG

SVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHTCPSDEFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEXGCPPRTCAPSQFQCGSGYC1SQRWVCDGXNDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCXNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEXXCTEHTCPPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVHDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYC1SQRWVCDGENDCEDGSDEANCAG

SVPTCPWNEFRCRNGRCIPWSWRCDGVNDCDNASDEEECTEHT

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETSCPTRTCLPSQFQCGSG

YC1SQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLPDQFRCGNGQCTPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGS

GYCIPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAG

SVPTCPSGEFQCSNGRCIPWAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEPP

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCPPSQFQCGS

GYCITERWVCDGENDCEDGSDEANCAG

SVPTCSSDEFRCRAGTC1PRAWCCDGVKDCDNASDEEDCTENT

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLPDEFQCGNGQCISLDWVCDGVNDCPDDSDEXGCPPSSCPPNQFQCGS

GYCISQRWVCDGXNDCEDGSXEANCAG

SVPACPSDEFRCRDGRCIPRAWLCDGINDCDNASDEEDCTEHT

CLAHQFLCGNGQCLPLDWVCDGVTDCPDDSDEVGCPPRTCAPSHFQCGS

GYCISQSWVCDGEYDCEDGSDEASCAGS

VPSCPSDEFQCRNGRCIPRPWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CQANEFTCSSGNCLSPALLCDGVDDCGDNSDEAYCASPAPTCLPSQFQCG

SGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA

GSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDDCVDSSDEASCQPPT

CQANEFTCSSGNCLSPALLCDGVDDCGDNSDEAYCASPAPTCLPSQFQCG

SGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA

GSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDDCVDSSDEASCQPPT

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSDEFRCRNGRCIPRGWRCDGVNDCADTSDEEDCKEHC

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLPDQFRCGNGKCIPLDWVCDGVNDCPDASDEEGCPPRTCGPSQFQCGS

GYCISQGWVCDGEIDCEDSSDEANCAGS

VPTCPSDQFQCSNGRCIPRAWHCDGINDCEDNSDEEDCTEHT

CLPGQFRCANGQCIPLEWVCDGDNDCPDDSDEDGCPPRTCGPSQFKCGS

GYCISESWVCDGEYDCEDGSDEATCVGS

VPTCPWDEFRCRSGRCISRAWRCDGVNDCDNASDEEACTDHT

CLSDQFRCGEGQCIPLDWVCDGVSDCGDDSDEEGCPPSTCAPSQFQCGS

GYCISQNWVCDGENDCEDGSDEANCAG

CVPTCPADEFRCRDGRCIPRAWRCDGVNDCGDKSDEEDCTENT

CRPDQFRCGNGHCIPLDWVCDGVNDCTDDSDEGGCPQRSCAPRQFQCGS

GYCISQRWVCDGEYDCEDGSDEANCTG

SVAACPYDEFRCINGRCIPRSWCCDGVNDCDNASDEADCPEHTCLPDEFRCGNGHCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPQTCAPSQFQCGSGFCISQRWVCDGEQDCVDGSDESNCAD

SVPTCPSDEFRCKNGRCIPLVWRCDGVNDCSDNSDEEDCKVHSCRRDQFRCGNGQCISVDWVCDGVNDCPDESDEEGCPPRTCTPSQFMCGSXYCISQRWVCDGEYDCEDGSDXXNCAGSVPTCPKDXFQCRNGRCIPRAWGCDXX

XXX XXFPGXX RXXXXXXXXXXXXYDCLDXSDEXXCPARTCXXSQFQCGSG

YCISQRWVCDGEYDCEDGSDXXNXXXXX

XTCXSXEFRCXXGRCIPRSWRCDGVNDCDNASDEXDCTGHS

CLPGQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPNQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCVG

SVTTCPSDEFRCRNGRCIPRVWRCDGEDDCDNASDEEDCTECTCLXYXFLCVNGQC1XWXCXXXXXLXXXXXXKXLXXXYLCXXXXXXRXRLLHXXXLG LXXXKXLXXXLGXN KLCW PXTXXS

XXXVXVQXXXLXPXCXAXRXXXXLXGXLXXXXXXRTHFXAXXXXXPXXXXPXXXPL

CXPDQFRCXXGQCIPLDWVCDGVNDCPDNSDEKXCPPRTCXPSQFQCXSGYCISQXWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPXCPSDEFXCRNGLCIPRAWRCDGVNDCXDNSDEEXCTEHT

CLPNQFRCRNGQCIPLDWVCDGINDCPDESDEEGCPPRTCAPSQFQCGSG

YCISRRWVCDGEIDCDDGSDEANCAGSV

PACPSDEFRCSNCRCIPRAWRCDGVNDCSDNSDEEDCTGHT

CLPAQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSG

YCISQRWVCDGENDCXDGSDXXNCAGS

VXTCPSDXFRCXNIGRCIPRAWRCXGXNXCGGQL

XXSDQFLCXXGXCIPLXWVCDGIHDXXXXXEXXRXXXXXXXXXXXXXRXRXXLXXXXXXQ RQXXXXXRXXXXKXXS FXTX

XPXXXFXXQXXXLXXXXXXXXRXXXXCEQLEXKQXXSAXXFAKGXXGPQAPPPPPPPX

CLQDQFRCGDGQCIPLEWVCDGVDDCADHSDEEGCPPRTCSPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCPGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVSDCDNASDEEDCTEET

CLPDQFRCGNGECIPLDWVCDGVKDCPDDSDEEGCPPPTCAPGQFQCGS

GYCISKRWVCDGENDCEDGSDEANCEGS

VPACPSDEFRCGNGRCIPRDWRCDGVHDCEDNSDEEXCTEHN

CLPDQFRCSNGHCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEGGCPPRTCAPSQFQCGS

GFCISQRWVCDGEHDCEDGSDEANCAVS

IPTCPPDDFRCRNGRCIPRAWCCDGVNDCDNASDEEGCREHT

CPPKQFRCGNGQCIPLDWICDGVNDCTDDSDEEGCPPRSCAPGQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCPCS

VPTCPSDEFRCRNGPCIPRAWRCDGVNDCDNASDEDDCTGHT

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSDEFRCRNGRCIPRHWCCDGVSDCPDNSDEEDCKDHT

CESDQFQCDSGHCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAG

SVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLPYQFRCRNGRCIPLDWLCDGVNDCPDDSDEEGCPALTCAPSQFQCGSG

YCISQRWVCDGEIDCEDGSDEANCAGSE

PTCPSDEFRCXNGRCIPRAWCCDGVNDCVDNSDEEDCAPHT

CRPDQFRCDNGHCIQLDWVCDGVNDCQDDSDEDGCPPRTCAQSQFQCGS

GYCISQSWVCDGENDCEDGSDEANCAG

SVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGINDCEDHSDEEDCKAHT

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAG

SVPTCPSEEFRCRNGXCXXRAWXCDGVNDCXDNSDEEXCTEHP

CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLSSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGS

VPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CLPDQFRCGNGQCIPLDWACDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGS

GYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHTCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHTCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAG

SVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHTCLPDQFRCGNGRCIPLDWVCDGVNDCQDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQGWVCDGENDCEDGSDEANCAGPVPTCAADEFRCRNGRC1PRAWRCDGVNDCDNASDEEACTEHT

C P RTS SAAS E LIGANAIHGPGFSE

LIGAILIGPDDSDEDGCPPRTCSPNQFQCGSGYCISQRWVCDGE1DCEDGSDEANCAGSVP

KCPSDAFRCRNGRCIPRAWRCDG1NDCVDNSDEEECREHTCPRTSSAASE LIGANAIHGPGFSE

LIGAILICPDDSDEDGCPPRTCSPNQFQCGSGYCISQRWVCDGEIDCEDGSDEANCAGSVP KCPSDAFRCRNGRCIPRAWRCDGINDCVDNSDEEECREHTCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHT

CPPEQFRCGTGKCIPMDWVCDGVKDCPDDSDEEGCPPRTCAPHQFQCGSGFCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAG

SVPTCPSNEFRCRNGRCIPCSWHCDGVNDCDNASDEEDCTPHPCVPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEAHCAG

SVPTCPADEFRCRNGGCIPLAWRCDGVNDCDNASDEEDCTDDTCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHTCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCiSQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCITRAWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHTCLPGQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPNQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCVG

SVTTCPSDEFRCRNGRCIPRVWRCDGEDDCDNASDEEDCTECT

CPSPVPVRQRPLRSTGLGLRRRQCLSDDSDEEGCPARTCGPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCTSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVKDCDNASDEEPCKEHQCLPDQFRCDNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEQGCPPRSCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGEYDCEDGSDEANCAG

SAPTCPSEEFRCRNGRCIPNAWCCDGLNDCSDNSDEEDCAEHPCLPDQFRCGNGQC1PLDWICDGLIDCPDESDEEGCPPRTCEPSQFQCGSGFCISQGWVCDGEIDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRSGRCIPRAWRCDGISDCADGSDEEDCTEDTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEVGCPPRTCAPSQFQCGSGWCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCA

GSVPTCPSDEFRCRSGRC1PRAWRCDGVSDCADGSDEEDCTEDTCLRDQFRCGNGQC1PLDWACDGINDCPDDSDEGGCPPRMCAPSQFQCGSGYCIPLGWVCDGENDCEDGSDEANCAGSEPTCPSGEFRCRNGRCIPRAWLCDGVNDCDNASDEEDCTGHT

CLPDMFRCGTRQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRSWCCDGVNDCDNASDEEDCTEHTCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCDNASDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCADS

VPTCPSYEFRCRNGRCIPRTWRCDGVNDCDNASDEEDCTEHP

CLANQFKCDNGRC1PQTWVCDGDNDCLDGSDEPVHCAKRTCPSSQFQCS

SGWCISQRWVCDGENDCEDNSDEANCA

GSVPTCGPGQFPCNDSDRCLSVPRLCDGDDDCGDDSDEASCQPPTCLPDQFRCGNGQCMPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCEPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEATCA

GSVPQCPSDEFRCRTGRCIPQAWRCDGVNDCVDNSDEECCKEHTCLANQFKCDNGRCIPQTWVCDGDNDCLDGSDEPVHCAKRTCPSSQFQCSSGWCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCA GSVPTCVSDQFRCGNGQCLPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPLTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGEYDCEDGSDEANCAG

SVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWCCDGINDCTDNSDEEDCTEYTCPRTSSAASE LIGANAIHGPGFSE

LIGAILICPDDSDEDGCPPRTCSPNQFQCGSGYCISQRWVCDGEIDCEDGSDEANCAGSVP KCPSDAFRCRNGRCIPRAWRCDG1NDCVDNSDEEECREHTCLPDRFRCGNGQGMPMDWVCDGVNDCPDDSDERGCPPRTCAQSQFQCGSGYCISESWVCDGENDCEDGSDEANCA

GSVPTCPSDEFRCSNGRCIPRSWLCDGVNDCSDNSDEEDCAEHP

Enquanto a invenção precedente foi descrita em algum detalhealvos de claridade e compreensão, será claro a um experimentado na arte deuma leitura desta revelação que várias modificações em forma e detalhepodem ser feitas sem partir do alcance verdadeiro da invenção. Por exemplo,todas as técnicas, os métodos, as composições, o aparelho e os sistemasdescritos em cima podem ser usados em várias combinações. Todas aspublicações, as patentes, as aplicações evidentes, ou outros documentoscitados nesta aplicação são incorporados pela referência no seu conjunto detodos os alvos à mesma extensão como se cada publicação individual,evidente, patenteie a aplicação, ou outro documento foi individualmenteindicado para ser incorporado pela referência de todos os alvos. Asaplicações de PORCENTAGEM PCTYUS02/13257 e PCT/US03/35664 ePublicação Evidente dos Estados Unidos n. 2005/0089932 são com istoincorporadas pela referência no seu conjunto.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

SEQ ID NO:1 - IL-6 processou seqüência aminoácidoAPVPPGEDSKDVAAPHRQPLTSSERIDKQIRYILDGISALRICETCNKSNMCESSKEALAENNLNLPICMAEKDGCFQSGFNEETCLVKIITGLLEFEVYLEYLQNRFESSEEQARAVQMSTKVLIQFLQKKAKNLDAITTPDPTTNASLLTKLQAQNQWLQDMTTHLILRSFKE FLQSSLRALRQM.

Claims

1. Polipeptídeo que compreende um domínio monomérico que seletivamentese liga a IL-6, onde o domínio monomérico é um monômero classe A receptor deLDL, CARACTERIZADO por compreender uma das seguintes seqüências (SEQID Nos: 1 e 2):CXXXQFQCXSG[WrY] C [I, L,F]XXXW[V, L] CDGXNDCEDXSDEXXCouCX [ A, P]X [E, Q] FXCXXGQC [I, L] PXXXXCDGX [D, N] DCXDXSDEXXConde X é qualquer aminoácido e os aminoácidos entre colchetes indicamaminoácidos alternativos numa posição específica.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelopolipeptídeo compreender CXXXQFQCXSG[W,Y]C[I,L,F]XXXW[V,L]CDGXNDCEDXSDEXXC (SEQ ID N o.: 1).

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelopolipeptídeo compreender CX[A,P]X[E,Q]FXCXXGQC[I,L]PXXXXCDGX[D,N]DCXDXSDEXXC (SEQ ID No.: 2).

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelopolipeptídeo compreender pelo menos um e não mais do que seis domíniosmonoméricos que seletivamente ligam IL-6.

5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelopolipeptídeo compreender pelo menos dois domínios monoméricos que seletivamenteligam IL-6.

6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelopolipeptídeo compreender um primeiro domínio monomérico especificidade deligação seletiva para IL-6 e um segundo domínio monomérico com especificidade deligação seletiva para IL-6; o primeiro domínio monomérico compreendendo:CXXXQFQCXSG[W, Y]C [I, L, F] XXXWfV, L] CDGXNDCEDXSDEXXC (SEQID No.: l);eo segundo domínio monomérico compreendendo:CX [ A, Ρ] X [Ε, Q] FXCXXGQC [I, L] PXXXXCDGX [D, N]DCXDXSDEXXC(SEQID No.: 2).

7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelopolipeptídeo compreender um primeiro domínio monomérico especificidade deligação seletiva para IL-6 e um segundo domínio monomérico com especificidade deligação seletiva para IL-6; o primeiro domínio monomérico compreendendo:CX[A,P]X[E,Q]FXCXXGQC[I,L]PXXXXCDGX[D,N]DCXDXSDEXXCXnCXXXQFQCXSG [W,Y] C [I,L,F] XXXW [V,L] CDGXNDCEDXSDEXXC,onde η está entre is 0 e 100 (SEQ ID No.: 3).

8. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelopolipeptídeo compreender qualquer uma das seqüências (SEQ ID Nos.: 5-13):CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT; ouCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT; ouCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCRADEFQCGSGRCVPADWLCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT; ouCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDCADNSDEEDCTQHT; ouCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCQANEFTCSSGNCLSPALLCDGVDDCGDNSDETYCASPAPTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDGEDDCVDSSDEASCQPPT; ouCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQR WVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRA WRCDGVNDCADNSDEADCAAPT; ouCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGSGYCLSQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRA WRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT; ouCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCESDQFQCDSGHCVPLNWVCDGVNDCVDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRA WRCDGVNDCADNSDEEDCTEHT; ouCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENCSAPASEPPGSLCGASQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLSADWLCDGVNDCADNSDEEGCPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGENDCEDGSDETNCPART.

9. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelopolipeptídeo compreender qualquer uma das seqüências (SEQ ID Nos.: 14-22):CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCPDDSDEEGCPPRTCAPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGVNDC ADNSDEEDCTEHT;CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGV NDCADNSDEEDCTEHT;CRADEFQCGSGRCVPADWLCDGVNDCADNSDETGCPTRTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGV NDCADNSDEEDCTEHT;CLPDQFRCGNGQCffLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRA WRCDGV NDCADNSDEEDCTQHT;CQANEFTCSSGNCLSPALLCDGVDDCGDNSDETYCASP APTCLPSQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCQPGEFTCESGRCLPLRWLCDG EDDCVDSSDEASCQPPT;CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPRTCLPDQFQCGSGYCLPQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRA WRCDGV NDCADNSDEADCAAPT;CLPDQFRCGNGQCIPLDWVCDGVNDCEDDSDEESCPPHTCLPDQFQCGSGYCLSQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRC1PRA WRCDGV NDCADNSDEEDCTEHT;CESDQFQCDSGHC VPLNWVCDGVNDC VDGSDEAGCPPRTCLPGQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDGSDEANCAGSVPTCPSDEFRCRNGRCIPRAWRCDGV NDCADNSDEEDCTEHT; ouCGASQFQCGSGYCISQRWVCDGENDCEDSSDEANCAGSVPTCLPSEFQCRDSKICLSADWLCDGVNDCADNSDEEGCPPPTCLPDQFQCGSGYCLPQAWVCDGE NDCEDGSDETNCPART.

10. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelopolipeptídeo compreender três domínios monoméricos que ligam seletivamente IL-6.

11. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelopolipeptídeo ainda compreender um domínio monomérico que tem umaespecificidade de ligação seletiva para um fator sangüíneo, aumentando deste modoa meia vida no soro do polipeptídeo quando o polipeptídeo é injetado num animalcomparado a meia vida no soro de um polipeptídeo em que não há o domíniomonomérico de ligação do fator sangüíneo.

12. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADOpelo fator sangüíneo ser soro albumina, uma imunoglobulina ou um eritrócito.

13. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADOpelo domínio monomérico que tem uma especificidade de ligação seletiva para umfator sangüíneo se ligar a imunoglobulina (IgG) e o domínio monomérico que temuma especificidade de ligação para um fator sangüíneo ser um domínio monoméricoclasse A receptor de LDL que compreende uma seqüência selecionada a partir dasseguintes (SEQ ID Nos.: 23 e 24):CXSSGRCIPXXWVCDGXXDCRDXSDE, eCXSSGRCIPXXWLCDGXXDCRDXSDE, onde X é qualquer aminoácido.

14. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADOpelo domínio monomérico que tem uma especificidade de ligação seletiva para umfator sangüíneo se ligar a imunoglobulina (IgG) e o domínio monomérico que temuma especificidade de ligação para um fator sangüíneo ser um domínio monoméricoclasse A receptor de LDL que compreende a seguinte seqüência (SEQ ID No.: 25):[EQ]FXCRX[ST]XRC[IV]XXXW[ILV]CDGXXDCXD[DN]SDE, onde X équalquer aminoácido e os aminoácidos entre colchetes são aminoácidos alternativospara uma única posição.

15. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADOpelo domínio monomérico que tem uma especificidade de ligação seletiva para umfator sangüíneo compreender:CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDNDCGDNSDEENC (SEQ ID No.: 26).

16. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelodomínio monomérico ter entre 35 a 45 aminoácidos.

17. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelomonômero compreender uma seqüência de aminoácidos em que:pelo menos 10% dos aminoácidos da seqüência são cisteína e/oupelo menos 25% dos aminoácidos são aminoácidos de ocorrência não natural.

18. Polinucleotídeo, CARACTERIZADO por codificar o polipeptídeo dareivindicação 1.