BRPI0614265A2 - uso de uma vacina do vìrus da febre amarela e de uma vacina de flavivìrus quimérico e kit contendo referidas vacinas - Google Patents
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Abstract
USO DE UMA VACINA DO VìRUS DA FEBRE AMARELA E DE UMA VACINA DE FLAVIVIRUS QUIMéRICO E KIT CONTENDO REFERIDAS VACINAS. A presente invenção refere-se a métodos e kits para uso em vacinação contra infecção pelo vírus do dengue.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE UMAVACINA DO VÍRUS DA FEBRE AMARELA E DE UMA VACINA DE FLA-VIVÍRUS QUIMÉRICO E KIT CONTENDO REFERIDAS VACINAS".
Antecedentes da Invenção
A presente invenção refere-se à vacinação contra infecção pelovírus do dengue.
O dengue, uma doença causada por quatro espécies distintas devírus do dengue (chamados sorotipos 1-4), é a doença de origem em vetormais importante da humanidade. Aproximadamente 100 milhões de pessoassão infectadas pelos vírus do dengue anualmente em regiões tropicais esubtropicais do mundo (Halstead, "Epidemiology of Dengue and DengueHemorrhagic Fever", CABI Publ., Nova York, pp. 23-44, 1997; Gubler, "Den-gue and Dengue Hemorrhagic Fever", CABI Publ., Nova York, PP. 1-22,1997). Uma forma severa e potencialmente letal de doença causada por in-fecção do vírus do dengue, febre hemorrágica do dengue (DHF), está au-mentando em distribuição e incidência geográficas. Esses fatos estimularamesforços intensivos para formular vacinas do dengue seguras e eficazes,mas, apesar de muitos esforços, se estendendo por mais de 50 anos, ne-nhuma vacina comercialmente disponível contra dengue foi desenvolvida. Odesenvolvimento de uma vacina contra dengue é então considerado ser umaalta prioridade pela Organização Mundial de Saúde (Chambers e outros,Vaccine 15:1494-1502, 1997).
A patogênese de DHF direciona a criação de vacinas do dengue.A DHF é uma doença imunopatológica, que acontece principalmente em in-divíduos que tiveram uma infecção anterior com um sorotipo do dengue eentão são expostos a um segundo sorotipo diferente (heterólogo). Infecçãocom qualquer um dos quatro sorotipos de dengue provê imunidade durávelpara aquele sorotipo homólogo, com base em anticorpos de neutralização.No entanto, imunidade para outros sorotipos do dengue heterólogos seguin-do infecção com um sorotipo do dengue é de duração curta, se acontecer(Sabin, Am. J. Trop. Med. Hyg. 1:30-50, 1952). Tipicamente, após algumassemanas ou meses, apenas anticorpos de ligação e não-neutralização parasorotipos heterólogos estão presentes. Esses anticorpos de ligação masnão-neutralização podem acentuar infecção subsequente com um sorotipodo vírus do dengue heterólogo, aumentando o risco de doença severa (Ro-thman e outros, Virology 257:1-6, 1999).
Dada a imunopatogênese de DHF1 uma vacina bem-sucedidacontra dengue deve ser segura e induzir respostas de anticorpo de neutrali-zação cruzada, de longa duração, contra todos os 4 sorotipos do vírus dodengue simultaneamente, de modo que títulos não caiam para níveis quepoderiam deixar um indivíduo não-protegido contra infecção futura. Histori-camente, esforços empíricos em desenvolver candidatos à vacina atenuada,viva, demonstraram que é difícil atingir um equilíbrio entre atenuação sufici-ente (segurança) e imunogenicidade dos vírus de vacina candidata. Temsido também difícil combinar cepas de vacina representando todos os quatrosorotipos em uma mistura tetravalente eficaz e um programa de dose múlti-pla foi necessário para atingir soroconversão contra todos os sorotipos, como efeito indesejado de provisão de lacunas no programa de imunização ondeos indivíduos poderiam ser sensibilizados para casos imunopatológicos. Naverdade, tentativas em imunizar com misturas de vacinas do dengue vivas,monovalentes, demonstraram interações significantes entre as quatro cepasde vírus e resultaram em efeitos de interferência viral (revisto em Saluzzo,Adv. Virus Res. 61:420-444, 2003).
Vacinas baseadas em flavivírus quimérico geneticamente enge-nheirado contra vírus do dengue foram desenvolvidas, onde duas seqüên-cias (isto é, seqüências codificando as proteínas de pré-membrana (prM) eenvelope (E)) de sorotipo do dengue 1, 2, 3 ou 4 são inseridas em um cloneinfeccioso de comprimento completo de vírus da febre amarela 17D, no lugardas seqüências codificando as proteínas do vírus da febre amarela corres-pondentes (vide, por exemplo, Guirakhoo e outros, J. Virol. 75:7290-7304,2001; Guirakhoo e outros, Virology 298:146-159, 2002). Esses vírus são al-tamente eficazes na indução de respostas imunes quando injetados em ma-cacos. No entanto, dados preliminares mostraram também alguns efeitos deinterferência viral em seres humanos, que podem limitar a imunização contratodos os quatro sorotipos após uma dose da vacina do dengue.
Os presente inventores encontraram um método novo e segurode imunização contra doenças do dengue, que permitem a indução de umaresposta de anticorpo de neutralização cruzada, de longa duração, contrasorotipos 1-4 do dengue, enquanto evitando a necessidade de um programade vacinação do dengue multidose e o risco potencial associado com umaresposta imune desequilibrada primária. O método da presente invenção,que usa um regime de imunização compreendendo a administração de umaprimeira vacina de febre amarela seguido pela administração de uma vacinado dengue baseada em flavivírus quimérico, permite a indução de uma res-posta imune de neutralização cruzada contra vírus do dengue, que apresen-ta a vantagem de aparecer logo (dentro de 30 dias) após a administração davacina do dengue, sendo de longa duração e sendo reativa cruzada contraos quatro sorotipos. Ainda, o método da presente invenção apresenta o be-nefício adicional de indução de uma resposta imunoprotetora contra febreamarela.
Price e outros (Am. J. Epid. 88:392-397, 1968) descreveram an-teriormente um método para imunização para flavivírus seqüencial compre-endendo uma série de três imunizações com vírus do dengue tipo 2 e doisheterólogos (febre amarela e encefalite Japonesa). Ainda, diferente da pre-sente invenção, a seqüência de febre amarela seguido por dengue 2, sem aadição de imunização para JE, falhou em conferir imunidade protetora cru-zada.
Scott e outros (J. Infect. Dis. 148:1055-1060, 1983) mostraramque indivíduos que foram anteriormente imunizados com vacina da febreamarela e subseqüentemente inoculados com uma do tipo 2 do dengue ate-nuada, viva, tinham respostas imunes realçadas ao tipo 2 do dengue, queeram também mais duráveis (durando 3 anos) do que em indivíduos semimunidade para febre amarela anterior. A resposta realçada poderia ser de-vido ao aumento (ligação, não-neutralização) de anticorpos elicitados paravírus do tipo 2 do dengue pela vacinação para febre amarela precedente(Eckels e outros, J. Immunol 135(6):4201-4203, 1985). No entanto, Scott eoutros não mostraram que as vacinas para febre amarela seguidas pelas dodengue 2 elicitaram uma resposta imune de longa duração para os outrostrês sorotipos do dengue (tipo 1, 3 ou 4). Diferente da presente invenção, aseqüência de febre amarela seguida por dengue tipo 2 não foi mostrada eli-citar uma resposta ampla pelo teste de neutralização, que é o único testeque prevê imunidade protetora.
Em um trabalho recente, Kanesa-thasan e outros (Am. J. Trop.Med. Hyg. 69 (Supl. 6):32-38, 2003) detectaram respostas heterólogas refor-çadas e títulos de anticorpo antidengue em indivíduos remotamente vacina-dos com YF seguindo vacinação com vacinas do dengue atenuadas. Essasrespostas de anticorpo de curto prazo (até dia 30) foram demonstradas comensaios de anticorpo incluindo neutralização, mas os autores concluíram queevidência para proteção contra infecção por dengue subsequente era incon-clusiva. Diferente da presente invenção, os autores não puderam demonstrarconclusivamente o momento ou administração anterior de vacinação paraYF, respostas de anticorpo de neutralização amplas de longo prazo ou pro-ver evidência para respostas de célula T reativa cruzada para dengue.
Os presentes inventores demonstraram pela primeira vez queindução de imunidade de neutralização cruzada contra sorotipos do denguemúltiplos em humanos pode na verdade ser conferida através da administra-ção seqüencial de vírus quiméricos da febre amarela e do dengue.
Sumário da Invenção
A presente invenção provê um método de indução de uma res-posta imune de neutralização cruzada, de longa duração, para vírus do den-gue em um paciente compreendendo administrar ao paciente:
(i) uma dose de uma vacina do vírus da febre amarela,
(ii) uma dose de uma vacina de flavivírus quimérico compreendendo pelomenos um flavivírus quimérico compreendendo uma estrutura principaldo vírus da febre amarela onde a seqüência codificando proteína enve-lope do vírus da febre amarela foi substituída com uma seqüência codi-ficando a proteína envelope de um vírus do dengue, onde a vacina deflavivírus quimérico é administrada pelo menos 30 dias e até 10 anosapós administração da vacina da febre amarela. Em um exemplo, a se-qüência envelope do dengue é uma seqüência embaralhada.
De acordo com uma modalidade, o flavivírus quimérico compre-ende uma estrutura principal de vírus da febre amarela onde as seqüênciascodificando as proteínas de membrana e envelope do vírus da febre amarelaforam substituídas com seqüências codificando as proteínas de membrana eenvelope de um vírus do dengue. Em um exemplo, uma ou ambas dessasseqüências do dengue são seqüências embaralhadas.
De acordo com uma modalidade particular, a vacina de flavivírusquimérico é administrada ao paciente 30, 60 ou 90 dias após administraçãoda vacina da febre amarela.
De acordo com uma modalidade particular, o flavivírus quiméricousado na vacina do dengue da invenção é composto de uma estrutura prin-cipal do vírus da febre amarela 17D (YF17D).
De acordo com outra modalidade, a vacina do vírus da febreamarela usada no método da invenção compreende uma cepa YF17D.
De acordo com outra modalidade, a vacina de flavivírus quiméri-co usada no método da invenção compreende um flavivírus quimérico com-preendendo uma estrutura principal de vírus da febre amarela onde as se-quências codificando as proteínas de membrana e envelope do vírus da fe-bre amarela foram substituídas com seqüências codificando as proteínas demembrana e envelope de um vírus do dengue sorotipo 1.
De acordo com outra modalidade, a vacina de flavivírus quiméri-co usada no método da invenção compreende um flavivírus quimérico com-preendendo uma estrutura principal de vírus da febre amarela onde as se-qüências codificando as proteínas de membrana e envelope do vírus da fe-bre amarela foram substituídas com seqüências codificando as proteínas demembrana e envelope de um vírus do dengue sorotipo 2.
De acordo com outra modalidade, a vacina de flavivírus quiméri-co usada no método da invenção compreende um flavivírus quimérico com-preendendo uma estrutura principal de vírus da febre amarela onde as se-qüências codificando as proteínas de membrana e envelope do vírus da fe-bre amarela foram substituídas com seqüências codificando as proteínas demembrana e envelope de um vírus do dengue sorotipo 3.
De acordo com outra modalidade, a vacina de flavivírus quiméri-co usada no método da invenção compreende um flavivírus quimérico com-preendendo uma estrutura principal de vírus da febre amarela onde as se-qüências codificando as proteínas de membrana e envelope do vírus da fe-bre amarela foram substituídas com seqüências codificando as proteínas demembrana e envelope de um vírus do dengue sorotipo 4.
De acordo com uma modalidade particular, a vacina de flavivírusquimérico usada no método da invenção é uma vacina monovalente ou umavacina tetravalente.
De acordo com outra modalidade, o método da invenção com-preende ainda a administração de uma dose de reforço da vacina de flaviví-rus quimérico acima definida 6 meses a 10 anos após a primeira dose davacina de flavivírus quimérico.
De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere-se aum kit compreendendo:
(i) uma vacina do vírus da febre amarela, e
(ii) uma vacina de flavivírus quimérico compreendendo pelo menos umflavivírus quimérico compreendendo uma estrutura do vírus da febreamarela onde a seqüência codificando a proteína envelope do vírus dafebre amarela foi substituída com a seqüência codificando a proteínaenvelope de um vírus do dengue. Em um exemplo, a seqüência enve-lope do dengue é uma seqüência embaralhada.
De acordo com uma modalidade, o flavivírus quimérico compre-ende uma estrutura principal de vírus da febre amarela onde a seqüênciacodificando as proteínas e membrana e envelope do vírus da febre amarelafoi substituída com seqüências codificando as proteínas de membrana e en-velope de um vírus do dengue. Em um exemplo, ou uma ou ambas dessasseqüências do dengue são seqüências embaralhadas.
De acordo com uma modalidade do kit da presente invenção, avacina do vírus da febre amarela compreende uma cepa de YF17D, ondeYF17D compreende várias subcepas usadas para vacinação contra febreamarela (incluindo 17D-204, 17D-213 e 17DD).
De acordo com outra modalidade, o flavivírus quimérico é com-posto de uma estrutura principal de vírus YF17D.
De acordo com outra modalidade do kit da invenção, a vacina deflavivírus quimérico compreende um flavivírus quimérico compreendendouma estrutura principal de vírus YF17D onde a seqüência codificando asproteínas de membrana e envelope do vírus da febre amarela foi substituídacom seqüências codificando as proteínas e membrana e envelope de umvírus do dengue sorotipo 1.
De acordo com outra modalidade do kit da invenção, a vacina deflavivírus quimérico compreende um flavivírus quimérico compreendendouma estrutura principal de vírus YF17D onde a seqüência codificando asproteínas de membrana e envelope do vírus da febre amarela foi substituídacom seqüências codificando as proteínas e membrana e envelope de umvírus do dengue sorotipo 2.
De acordo com outra modalidade do kit da invenção, a vacina deflavivírus quimérico compreende um flavivírus quimérico compreendendouma estrutura principal de vírus YF17D onde a seqüência codificando asproteínas de membrana e envelope do vírus da febre amarela foi substituídacom seqüências codificando as proteínas e membrana e envelope de umvírus do dengue sorotipo 3.
De acordo com outra modalidade do kit da invenção, a vacina deflavivírus quimérico compreende um flavivírus quimérico compreendendouma estrutura principal de vírus YF17D onde a seqüência codificando asproteínas de membrana e envelope do vírus da febre amarela foi substituídacom seqüências codificando as proteínas e membrana e envelope de umvírus do dengue sorotipo 4.
De acordo com outra modalidade o kit conforme definido acimacompreende ainda pelo menos uma dose de reforço de uma vacina de flavi-vírus quimérico conforme acima definido.
De acordo com outra modalidade, a invenção refere-se ao usodos vírus mencionados acima e em outro ponto aqui na prevenção e trata-mento de infecção pelo vírus do dengue, bem como ao uso desses vírus napreparação de medicamentos para este propósito.
Definições
Por "resposta imune de neutralização cruzada" se quer dizeruma resposta imune específica compreendendo anticorpos de neutralizaçãocontra sorotipos do dengue diferentes múltiplos (até 4). Indução de uma res-posta imune de neutralização cruzada pode ser facilmente determinada atra-vés de um ensaio de neutralização de redução de placa de referência(PRNT50). Por exemplo, indução de uma resposta imune de neutralizaçãocruzada pode ser determinada através de um dos ensaios PRNT50 conformedescrito no Exemplo 1. Uma amostra de soro é considerada ser positiva paraa presença de anticorpos de neutralização cruzada quando o título do anti-corpo de neutralização então determinado é pelo menos superior ou igual a1:10 em pelo menos um desses ensaios.
Por "resposta imune de duração longa" se quer dizer uma res-posta imune de neutralização cruzada positiva conforme acima definido quepode ser detectada em soro humano pelo menos 6 meses, vantajosamente,pelo menos 12 meses após a administração de uma vacina de flavivírusquimérico conforme definido abaixo.
Por "paciente" se quer dizer indivíduos naive para febre amarelaincluindo adultos e crianças.
Por indivíduos que "naive para febre amarela" se quer dizer indi-víduos sem nenhuma vacinação documentada contra febre amarela pormais de 10 anos e/ou nenhuma infecção por vírus da febre amarela certifi-cada por mais de 10 anos.
Por "indivíduos imunes contra febre amarela" se quer dizer, den-tro da estrutura da presente invenção, indivíduos com uma vacinação docu-mentada contra febre amarela e/ou com uma infecção pelo vírus da febreamarela certificada que tenham acontecido 10 anos atrás ou menos, por e-xemplo, 5 anos ou menos, por exemplo, 4, 3, 2 ou 1 atrás, ou até mesmo 6,5, 4, 3 ou 2 meses atrás e em alguns casos mais de 30 dias atrás.Por "flavivírus quimérico" se quer dizer um flavivírus quiméricocomposto de estrutura principal do vírus da febre amarela onde a seqüênciacodificando a proteína envelope do vírus da febre amarela foi substituídacom a seqüência codificando a proteína envelope de um vírus do dengue.
Vantajosamente, um flavivírus quimérico é composto de uma estrutura prin-cipal do vírus da febre amarela onde as seqüências codificando as proteínasde membrana e envelope do vírus da febre amarela foram substituídas coma seqüência codificando as proteínas de membrana e envelope de um vírusdo dengue. A estrutura principal da febre amarela pode ser vantajosamentede uma cepa de vacina, tal como YF17D ou YF17DD. Esses flavivírus qui-méricos são definidos em mais detalhes abaixo e são chamados YF/dengue-N, com N identificando o sorotipo do dengue.
Por "vacina de flavivírus quimérico" se quer dizer uma composi-ção imunogênica compreendendo uma quantidade imunoeficaz de pelo me-nos um flavivírus quimérico conforme acima definido e um excipiente farma-ceuticamente aceitável.
A vacina de flavivírus quimérico é dita ser "monovalente" quandoa vacina compreende um flavivírus quimérico expressando proteína(s) de umsorotipo do dengue. Exemplos de vacinas monovalentse são vacinas com-preendendo YF/dengue-1, YF/dengue-2, YF/dengue-3 ou YF/dengue-, van-tajosamente YF/dengue-2.
A vacina de flavivírus quimérico é dita ser "bivalente" quando avacina compreende flavivírus quimérico(s) expressando proteína(s) de doissorotipos do dengue diferentes. Exemplos de vacinas bivalentes são vacinascompreendendo YF/dengue-2 e YF/dengue-4 ou YF/dengue-2 e YF/dengue-3 ou YF/dengue-2 e YF/dengue-1.
A vacina de flavivírus quimérico é dita ser "trivalente" quando avacina compreende flavivírus quimérico(s) expressando proteína(s) de trêssorotipos do dengue diferentes. Exemplos de vacinas trivalentes são vacinascompreendendo YF/dengue-2, YF/dengue-1 e YF/dengue-4 ou YF/dengue-2,YF/dengue-3 e YF/dengue-4.
A vacina de flavivírus quimérico é dita ser "tetravalente" quandoa vacina compreende flavivírus quimérico(s) expressando proteínas de qua-tro sorotipos do dengue diferentes. Um exemplo de uma vacina tetravalenteé uma vacina que inclui YF/dengue-1, YF/dengue-2, YF/dengue-3 eYF/dengue-4.
Por "quantidade imunoeficaz de um flavivírus quimérico" se querdizer uma quantidade de flavivírus quimérico capaz de induzir, após adminis-tração em um indivíduo imune contra febre amarela, uma resposta imune deneutralização cruzada conforme acima definido. Tipicamente, uma quantida-de imunoeficaz de um flavivírus quimérico é compreendida entre 102 e 107,por exemplo, entre 103 e 106, tal como uma quantidade de 104, 105 ou 106,unidadés infecciosas (por exemplo, unidades de formação de plaqueta oudoses infecciosas de cultura de tecido) por sorotipo, por dose.
Uma vantagem central do método da presente invenção é a ha-bilidade em induzir anticorpos de neutralização contra quatro sorotipos dodengue rápida e simultaneamente, deste modo protegendo contra febre dodengue e então evitando os riscos potenciais associados de desenvolverfebre hemorrágica do dengue em exposição natural subsequente à infecçãopor dengue. Anticorpos de neutralização direcionados contra a proteína en-velope do dengue são considerados o mediador principal de imunidade pro-tetora contra infecção, deste modo, a demonstração de anticorpos de neutra-lização é considerada como um substituto relevante de uma imunidade deneutralização em pacientes.
Outras características e vantagens da invenção ficarão aparen-tes a partir da descrição detalhada , reivindicações e desenhos que seguem.
Breve Descrição dos Desenhos
A Figura 1 é um gráfico mostrando respostas de IFNy à vacina(estudo Dia 31 menos Dia 1). As duas doses de ChimeriVax®-Den2 deramrespostas de célula T equivalentes. A resposta não foi inibida em indivíduosanteriormente vacinados com vacina do vírus da febre amarela.
Descrição Detalhada
A invenção provê um método para indução em um paciente deimunidade de neutralização cruzada, de longa duração, para todos os quatrosorotipos do dengue (1-4) usando um procedimento de duas etapas, sim-ples. A população-alvo é então composta especialmente dos pacientes sobrisco de infecção por dengue que seguem: viajantes estrangeiros, expatria-dos e pessoal militar, bem como habitanes de regiões onde dengue é endê-mica. Neste método, um paciente é primeiro imunizado com uma dose (depreferência uma dose, mas possivelmente mais de uma dose (por exemplo,2ou 3 doses)) de uma vacina do vírus da febre amarela (por exemplo, umavacina atenuada viva, comercialmente disponível; vide abaixo). Após umintervalo de tempo apropriado de pelo menos 30 dias, que permite em parti-cular quiescência da resposta imune inata induzida pela vacina do vírus dafebre amarela, a segunda etapa do método é realizada, a qual envolve ad-ministração de uma dose de uma vacina de flavivírus quimérico compreen-dendo um ou mais vírus quiméricos atenuados, vivos, cada um compreen-dendo uma estrutura principal do vírus da febre amarela onde uma ou maisseqüências codificando proteínas estruturais (por exemplo, proteínas de pré-membrana e envelope) foram substituídas com as seqüências codificando asproteínas correspondentes de um vírus do dengue (por exemplo, dengue 1,2, 3 ou 4). Os presentes inventores mostraram que esta seqüência de imuni-zação elicita títulos de anticorpo de neutralização altos contra todos os qua-tro sorotipos do dengue. Esses anticorpos persistiram em níveis altos duran-te 6 meses e até mesmo 12 meses após a administração da vacina do den-gue, indicando que imunidade contra dengue ampla é de longa duração.Uma vez que o agente de imunização inicial/agente iniciador (vacina da fe-bre amarela) é incapaz de sensibilizar o indivíduo para DHF, não havia peri-go de que a inoculação inicial, primeira, deixasse o indivíduo vulnerável aesta doença se a segunda injeção fosse retardada ou não dada. Esses re-sultados foram inesperados, uma vez que infecção seqüencial com dois so-rotipos do vírus do dengue, que são muito mais intimamente relacionadosum com o outro com base na seqüência de genoma e relações antigênicasdo que a febre amarela está relacionada com o dengue, não induz proteçãosólida ou respostas de anticorpo de neutralização cruzada amplas contrainfecção com os dois sorotipos do dengue restantes. Demonstração adicio-nal da natureza inesperada do método de vacinação seqüencial da invençãofoi provida através de um exame da resposta de anticorpo de febre amarelaseguindo a segunda etapa (inoculação do vírus do dengue quimérico). Ométodo da invenção é descrito mais, como segue.
Vacinas do Vírus da Febre Amarela
Conforme é mencionado acima, a primeira etapa do método dainvenção envolve administração ao paciente de uma dose de uma vacina dovírus da febre amarela. Exemplos de tais vacinas que podem ser usadas nainvenção incluem vacinas atenuadas, vivas, tal como aquelas derivadas dacepa YF17D, que foi originalmente obtida através da atenuação da cepa A-sibi do tipo selvagem (Smithburn e outros, "Yellow Fever Vacinnation", WorldHealth Organization, p. 238, 1956; Freestone, em Plotkin e outros (Eds.),Vaccines, 2a edição, W.B. Saunders, Filadélfia, E.U.A., 1995). Um exemplode uma cepa YF17D a partir da qual vacinas que podem ser usadas na in-venção podem ser derivadas é YF17D-204 (YF-VAX®, Sanofi-Pasteur,Swiftwater, PA, USA; Stamaril®, Sanofi-Pasteur, Marcy-L'Etoile, França; A-RILVAX®, Chiron, Speke, Liverpool, UK; FLAMIVUN®, Berna Biotech, Bem,Suíça/ YF17D-204 França (X15067, X15062); YF17D-204, 234 US (Rice eoutros, Science 229:726-733, 1985)), enquanto outros exemplos de tais ce-pas que podem ser usados são a cepa intimamente relacionada YF17DD(No. de Acesso no GenBank U17066), cepas YF17D-213 (No. de Acesso noGenBank U17067) e vírus da febre amarela 17DD descritas por Galler e ou-tros, Vaccines 16(9/10): 1024:1028, 1998. Em adição a essas cepas, quais-quer outras cepas de vacina do vírus da febre amarela verificadas ser acei-tavelmente atenuadas em humanos, tal como pacientes humanos, podemser usadas na invenção.
As vacinas do vírus da febre amarela usadas na invenção po-dem ser obtidas de fontes comerciais (vide acima) ou podem ser preparadasusando métodos que são bem conhecidos na técnica. Em um exemplo detais métodos, embriões de galinha são inoculados com vírus em um nível depassagem fixo, e então vírus isolado de sobrenadantes de homogenatoscentrifugados é seco com congelamento. Em outros métodos, a cepa da fe-bre amarela é cultivada em fibroblastos de embrião de galinha culturados(vide, por exemplo, Freire e outros, Vaccine 23(19):2501-2512, 2005) ou ou-tras células culturadas para fabricação de vacinas virais tal como célulasVero. As vacinas do vírus da febre amarela são geralmente armazenadasem forma Iiofilizada antes do uso. Quando necessárias para administração,as vacinas são reconstituídas em uma solução aquosa (tipicamente, cercade 0,5 mL), tal como solução de cloreto de sódio a 0,4%, e então são admi-nistradas através de injeção subcutânea em, por exemplo, músculo deltoide.Outros modos de administração determinados como sendo apropriados poraqueles de habilidade na técnica (por exemplo, injeção intramuscular ou in-tradermal ou administração percutânea usando métodos que aplicam vírusàs camadas superficiais da pele) podem ser também usados. A vacina podeser administrada em dosagens variando de a partir de, por exemplo, 2-5 (porexemplo, 3 ou 4) Iog10 unidades de formação de placa (PFU) por dose. To-das as vacinas comercializadas são usadas de acordo com as recomenda-ções do fabricante. Em uma modalidade, a primeira etapa do método da in-venção consiste na administração de uma dose de Stamaril® ou de uma do-se de YF-VAX®.
O método da presente invenção pode ser também adaptado pa-ra ser usado com pacientes imunes contra febre amarela. Em tal caso, o mé-todo apenas compreende a segunda etapa envolvendo a administração deuma dose de uma vacina de flavivírus quimérico conforme definido abaixo. Odito método está também incluído no escopo da presente invenção.
Vacina de Flavivírus Quimérico
A segunda etapa do método de imunização de acordo com ainvenção compreende administração de uma dose de uma vacina de flaviví-rus quimérico conforme acima definido. Por questão de clareza, na descriçãoque segue, a invenção é apenas definida em relação ao uso de flavivírusquiméricos onde o flavivírus quimérico é composto de uma estrutura princi-pai de vírus da febre amarela onde as seqüências codificando as proteínasde membrana e envelope do vírus da febre amarela foram substituídas comas seqüências codificando as proteínas de membrana e envelope de um ví-rus do dengue. A invenção também inclui o uso de outras quimeras, tal comoquimeras onde apenas uma proteína (por exemplo, a proteína envelope) deuma cepa da vacina para febre amarela foi substituída, ou quimeras ondetodas as três proteínas estruturais foram substituídas.
Vírus quiméricos que podem ser usados na presente invençãoincluem aqueles baseados na cepa da vacina da febre amarela humana,YF17D (por exemplo, TF17D-204, UF17D-213 ou YF17DD), conforme acimadescrito. Nesses vírus, a proteínas de pré-membrana e envelope do vírus dafebre amarela são substituídas com proteínas de pré-membrana e envelopede um vírus do dengue (sorotipo 1, 2, 3 ou 4). Em uma modalidade da pre-sente invenção, os vírus quiméricos são compostos de uma estrutura princi-pal de YF17D-204 onde as seqüências codificando proteínas de pré-membrana e envelope do vírus da febre amarela são substituídss com a se-qüência codificando as proteínas de pré-membrana e envelope de sorotipo1, 2, 3 e/ou 4 do dengue do tipo selvagem, por exemplo, com as seqüênciascodificando as proteína de pré-membrana e envelope do vírus do dengue 1PUO-359, vírus do dengue 2 PUO-218, vírus do dengue 3 PaH-881/88 ouvírus do dengue 4 1228. Detalhes da construção desses construtos de vírusquimérico e relacionados são providos, por exemplo, nas publicações queseguem: WO 98/37911; WO 01/39802; Chambers e outros, J. Virol. 73:3095-3101, 1999; WO 03/103571/ WO 2004/045529; Patente U.S. N0 6.695.281;Patente U.S. N0 6.184.024; Patente U.S. N0 6.675.936; Patente U.S. N06.497.884; Guirakhoo e outros, J. Virology 75:7290-7304, 2001; Guirakhoo eoutros, Virology 298:146-159, 2002; e Caufour e outros, Virus Res. 79(1-2): 1-14, 2001. Como um exemplo específico de um flavivírus quimérico quepode ser usado na invenção, foi feita uma lista dos flavivírus quiméricos queseguem, que foram depositados com a American Type Culture Collection(ATCC) em Manassas, Virgínia, E.U.A. sob os termos do Tratado de Buda-peste e concedida uma data de depósito de 6 de janeiro de 1998: ChimericYellow Fever 17D/Dengue Type 2 Virus (YF/DEN-2; Número de acessoATCC ATCC VR-2593).
Os flavivírus quiméricos usados nos métodos da invenção po-dem, opcionalmente, incluir mutações de atenuação em seqüências do vírusdo dengue. Por exemplo, as seqüências do dengue podem incluir uma dele-ção ou substituição de aminoácido envelope 204 (sorotipos do dengue 1, 2 e4) ou 202 (sorotipo do dengue 3), que é Iisina no vírus do tipo selvagem. Emum exemplo de tal substituição, a Iisina nesta posição é substituída com ar-ginina. Em outros exemplos, um ou mais outros aminoácidos na região deaminoácidos 200-208 (ou combinações desses aminoácidos) são mutados,com exemplos específicos incluindo o que segue: posição 202 (K) de den-gue-1; posição 202 (E) de dengue-2; posição 200 de dengue-3 (K); e posi-ção 200 (K), 202 (K) e 203 (K) de dengue-4. Esses resíduos podem sersubstituídos com, por exemplo, arginina. Essas mutações são descritas emdetalhes no WO 03/103571, cujo conteúdo é aqui incorporado a título de re-ferência.
Em adição às quimeras descritas acima, outras quimeras quecontêm proteínas estruturais incluindo epítopos de mais de um sorotipo dovírus do dengue (2, 3 ou 4) podem ser usadas na invenção. Em um exemplo,quimeras podem ser feitas usando tecnologia de embaralhamento, que en-volve ciclos de fragmentação, reunião e seleção de seqüências que estãosendo embaralhadas (vide, por exemplo, Locher e outros, DNA Cell Biol.24(4):256-263, 2005). Deste modo, no presente caso, seqüências codifican-do proteínas envelope e de pré-membrana de um subconjunto desejado desorotipos do dengue (ou todos os sorotipos do dengue) podem ser proces-sadas deste modo para gerar seqüências de envelope e/ou pré-membranaembaralhadas, que são então usadas para substituir as seqüências corres-pondentes de estrutura principal do vírus da febre amarela conforme aquidescrito (por exemplo, UF17D). Tal embaralhamento quimérico YF/Den1-4(supondo seqüências embaralhadas incluindo epítopos de todos os quatrosorotipos) pode ser produzido através de, por exemplo, transfecção de célu-las Vero com transcritos de DNA quiméricos e recuperação de vírus vivo apartir do sobrenadante conforme descrito anteriormente (Guirakhoo e outros,J. Virol. 75(16):7290-7304, 2001) e mencionado em um outro ponto aqui.Essas quimeras embaralhadas podem ser usadas na invenção em regimesde vacinação envolvendo administração das quimeras embaralhadas se-guindo vacinação contra febre amarela (por exemplo, YF17D), ou em qual-quer um dos métodos de combinação descritos em outro ponto aqui.
Os vírus quiméricos descritos acima podem ser feitos usandométodos-padrão na técnica. Por exemplo, uma molécula de RNA correspon-dendo ao genoma de um vírus pode ser introduzida em células primárias,embriões de galinha ou linhagens de célula diploide, dos quais vírus da pro-gênie (ou cujos sobrenadantes) podem ser então purificados. Outros méto-dos que podem ser usados para produzir os vírus empregam células hetero-ploides, tal como células Vero (Yasumura e outros, Nihon Rinsho 21:1201-1215, 1963). Em um exemplo de tais métodos, uma molécula de ácido nu-cléico (por exemplo, uma molécula de RNA) correspondendo ao genoma deum vírus é introduzida nas células heteroploides, vírus é coletado do meioonde as células foram culturadas, o vírus coletado é tratado com uma nucle-ase (por exemplo, uma endonuclease que degrada ambos DNA e RNA, talcomo Benzonase®; Patente U.S. N0 5.173.418), o vírus tratado com nuclea-se é concentrado (por exemplo, através do uso de ultrafiltragem usando umfiltro tendo um corte de peso molecular de, por exemplo, 500 kDa), e o vírusconcentrado é formulado para os propósitos de vacinação. Detalhes destemétodo são providos no WO 03/060088 A2, que é aqui incorporado a títulode referência. Ainda, métodos para produção de vírus quiméricos são descri-tos nos documentos citados acima em referência à construção de construtosde vírus quimérico.
Formulação dos vírus quiméricos usados nos métodos da inven-ção pode ser realizada usando métodos que são padrão na técnica. Váriassoluções farmaceuticamente aceitáveis para uso em preparação de vacinasão bem conhecidas e podem ser prontamente adaptadas para uso na pre-sente invenção por aqueles de habilidade na técnica (vide, por exemplo,Remington's Pharmaceutical Sciences (18a edição), Ed. A. Gennaro, 1990,Mack Publishing Co., Easton, PA). Em dois exemplos específicos, os vírussão formulados em Minimum Essential Médium Earle's Salt (MEME) conten-do 7,5% de Iactose e 2,5% de albumina de soro humano ou MEME contendo10% de sorbitol. No entanto, os flavivírus quiméricos podem ser simplesmen-te diluídos em uma solução fisiologicamente aceitável, tal como solução sali-na estéril ou solução salina tamponada estéril. Em outro exemplo, os víruspodem ser administrados e formulados, por exemplo, da mesma maneiraque a vacina da febre amarela 17D, por exemplo, como uma suspensão cla-rificada de tecido de embrião de galinha infectado ou um fluido coletado deculturas de célula infectadas com um vírus quimérico.
As vacinas de flavivírus quiméricos da invenção são classica-mente armazenadas ou na forma de uma composição líquida congelada ouna forma de um produto liofilizado. Para este propósito, o flavivírus quiméricopode ser misturado com um diluente classicamente uma solução aquosatamponada compreendendo compostos crioprotetores tal como álcool deaçúcar e estabilizador. Antes do uso, o produto liofilizado é misturado comum diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável tal como uma solu-ção de NaCI a 4% estéril para reconstituir uma vacina de flavivírus quiméricoinjetável líquida.
No método da invenção, a vacina de flavivírus quimérico podeser uma vacina monovalente, uma bivalente, uma trivalente ou uma tetrava-lente.
De acordo com uma modalidade, a vacina de flavivírus quiméri-co é uma vacina monovalente onde o vírus quimérico é composto de umaestrutura principal de YF17D-204 onde a seqüência codificando proteínas depré-membrana e envelope do vírus da febre amarela é substituída com asseqüências codificando as proteínas de pré-membrana e envelope do vírusdo dengue 2 PUO-218.
De acordo com outra modalidade, a vacina de flavivírus quiméri-co é uma vacina tetravalente, isto é, uma vacina compreendendo vírus qui-méricos(s) expressando antígeno(s) dos 4 sorotipos do vírus do dengue (1 a4). Em uma modalidade particular, esta vacina tetravalente inclui vantajosa-mente quatro flavivírus quiméricos compostos respectivamente de uma es-trutura principal de YF17D-204 onde as seqüências codificando proteínas depré-membrana e envelope do vírus da febre amarela são substituídas comseqüências codificando as proteínas de pré-membrana e envelope do vírusdo dengue 1 PUO-359 (YF/dengue1), vírus do dengue 2 PUO-218(UF/dengue2), vírus do dengue 3 PaH-881/88 (YF/dengue3) ou vírus dodengue 4 1228 (YF/dengue4). Esta vacina tetravalente específica é chama-da no Exemplo 2 abaixo ChimeriVax®-DEN tetravalente.
Exemplos de vacinas de flavivírus quiméricos tetravalentes a-propriados para serem usados no método da invenção são também descri-tos em detalhes no WO 03/101397, cujo conteúdo é aqui incorporado a títulode referência. Vacinas multivalentes podem ser obtidas através da combina-ção de vacinas do dengue monovalentes individuais.
Os vírus quiméricos da invenção podem ser administradosusando métodos que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, osvírus podem ser formulados como soluções aquosas estéreis contendoentre 102 e 107, por exemplo, contendo entre 103 e 106, tal como 104, 105ou 106 unidades infecciosas (por exemplo, unidades de formação de placaou doses infecciosas de cultura de tecido) por sorotipo em um volume dedose de 0,1 a 1,0 ml_, a serem administradas através de, por exemplo, viasubcutânea, intramuscular ou intradermal. Em uma modalidade, a vacinade flavivírus quimérico é uma vacina monovalente, bivalente, trivalente outetravalente compreendendo vantajosamente 105 pfu por sorotipo, por do-se e é administrada subcutaneamente. Ainda, devido ao fato de que osflavivírus podem ser capazes de infectar o hospedeiro humano via viasmucosais, tal como a via oral (Gresikova e outros, "Tick-borne Encephali-tis", Em The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (Ed.), CRCPress, Boca Raton, Floria, 1988, Volume IV, 177-203), uma administraçãoatravés de vias mucosais (por exemplo, oral) poderia ser também com-preendida.
Opcionalmente, adjuvantes que são conhecidos daqueles versa-dos na técnica podem ser usados na administração dos vírus usados na in-venção. Adjuvantes que podem ser usados para realçar a imunogenicidadedos flavivírus quiméricos incluem, por exemplo, agonistas e antagonistas dereceptor tipo fo//(TLRs).Métodos de Imunização
Como acima mencionado, a invenção geralmente envolve admi-nistração de uma cepa de vacina da febre amarela (por exemplo, uma cepaYF17D, como é acima mencionado), seguido pela administração de um oumais flavivírus quiméricos, em cada um dos quais as proteínas de pré-membrana ou envelope do vírus da febre amarela foram substituídas com asproteínas correspondentes de um vírus do dengue (sorotipo 1, 2, 3 ou 4). Avacina do vírus da febre amarela é administrada usando métodos-padrão(por exemplo, através de injeção subcutânea, intramuscular ou intradermal,ou através de administração percutânea empregando um dispositivo queaplica o vírus à pele superficial), em quantidades variando de a partir de, porexemplo, 2-5 (por exemplo 3 ou 4) Iog10 unidades de formação de placa(PFU) por dose, que tipicamente está em um volume de cerca de 0,5 mLpara injeção subcutânea, 0,1 mL para injeção intradermal ou 0,002-0,02 mLpara administração percutânea.
Para permitir um tempo suficiente para quiescência da respostaimune inata induzida pela vacina da febre amarela, a vacina de flavivírusquimérico é administrada pelo menos entre 30 dias e 10 anos, em particularentre 30 dias e 5 anos, tal como entre 30 dias e 1 a 3 anos, vantajosamente,30, 60 ou 90 dias, após a vacina da febre amarela, usando métodos-padrãoe em quantidades variando de a partir de 102 e 107, por exemplo, de a partirde 103 e 106, tal como 104, 105 ou 106 unidades infecciosas (expressas comopfu ou doses de infecção de cultura de tecido) por sorotipo por dose. Ainda,no caso de administração de formulações bí-, tri- ou tetravalentes (vide abai-xo), em geral, as quantidades de cada quimera em tal vacina são equivalen-tes, embora uso de quantidades diferentes de cada quimera esteja tambémincluído na invenção.
Os métodos da invenção podem então envolver, por exemplo,administração de uma vacina do vírus da febre amarela no Dia 0 e adminis-tração de uma quimera YF/dengue-1, YF/dengue-2, YF/dengue-3, e/ouYF/dengue-4 no Dia 30 (ou em um momento posterior, conforme acimamencionado). A quimera pode ser administrada como uma vacina monova-lente (isto é, uma vacina incluindo apenas um dos vírus quiméricos que se-guem: YF/dengue-1, YF/dengue-2, YF/dengue-3 e/ou YF/dengue-4, umaformulação bivalente (por exemplo, uma vacina incluindo duas das quimeraslistadas acima, por exemplo, incluindo vantajosamente YF/dengue-2 eYF/dengue-4 ou YF/dengue-2 e YF/dengue-3 ou YF/dengue-2 e YF/dengue-1), uma vacina trivalente (por exemplo, uma vacina incluindo três das quime-ras listadas acima, vantajosamente, uma vacina compreendendoYF/dengue-2, YF/dengue-1 e YF/dengue-4 ou YF/dengue-2, YF-dengue-3 eYF/dengue-4) ou uma vacina tetravalente.
O método da invenção leva a uma soroconversão (isto é, indu-ção de uma resposta imune neutralizante) para quatro sorotipos do dengueapós apenas uma dose da vacina de flavivírus quimérico. Embora doses a-dicionais da vacina de flavivírus quiméricos não sejam necessárias para a-tingir a soroconversão e resposta imune neutralizante cruzada, de longa du-ração, administração de doses de reforço da vacina de flavivírus quimérico écompreendida na presente invenção. A(s) dose(s) de reforço da vacina qui-mérica da invenção pode(m) ser necessária(s) para sustentar a respostaimune de neutralização cruzada por um período de tempo mais longo e po-de(m) ser administrada(s) entre 6 meses e 5 a 10 anos após a primeira doseda vacina do dengue quimérica, por exemplo, 6 meses, 1 ano, 2 anos, 3 a-nos, 4 anos ou 5 anos, ou até mesmo 10 anos após a primeira dose da vaci-na de flavivírus quimérico. A vacina de flavivírus quimérico de reforço podeser diferente da ou vantajosamente idêntica à primeira vacina de flavivírusquimérico administrada. A descrição dada acima em relação à vacina de fla-vivírus quimérico a ser administrada no método da invenção aplica mutatismutandis ao reforço da vacina de flavivírus quimérico. O reforço pode entãoser uma vacina monovalente, bivalente, trivalente ou tetravalente, com rela-ção aos sorotipos do dengue presentes na vacina. Deste modo, um exemplode um método da invenção pode envolver administração de uma dose deuma vacina para febre amarela, seguido por uma dose de uma vacina deflavivírus quimérico monovalente (dengue 1, 2, 3 ou 4, vantajosamente, den-gue 2), que é então seguida pela administração de (i) uma vacina de flaviví-rus quimérico monovalente do mesmo sorotipo ou um diferente que a quime-ra inicialmente administrada (vantajosamente do sorotipo 4), (ii) uma vacinade flavivírus quimérico bivalente, que pode ou não incluir o mesmo sorotipoque a quimera inicial (por exemplo, vantajosamente dengue 1 e 2 seguidopor dengue 3 e 4), (iii) uma vacina de flavivírus quimérico trivalente, que po-de ou não incluir o mesmo sorotipo que a quimera inicial ou (iv) uma vacinade flavivírus quimérico tetravalente. A vacina de flavivírus quimérico de re-forço é vantajosamente idêntica à primeira vacina de flavivírus quiméricocom relação à sua composição antigênica.
A invenção então refere-se também a uma composição para in-dução em um paciente de uma resposta imune de neutralização cruzada, delonga duração, ao vírus do dengue incluindo (i) uma vacina do vírus da febreamarela e (ii) uma vacina de flavivírus quimérico para uma administraçãoseqüencial, onde a vacina da febre amarela quimérica é administrada pelomenos 30 dias e até 10 anos após administração da vacina do vírus da febreamarela.
A invenção também inclui kits que incluem uma vacina do vírusda febre amarela e/ou uma ou mais vacina(s) de flavivírus quimérico, con-forme aqui descrito. Os kits da invenção podem também incluir instruçõespara uso dos kits nos métodos de vacinação descritos aqui. Essas instru-ções podem incluir, por exemplo, indicações de quais quantidades de vacinaadministrar e/ou informação de quando as vacinas devem ser administradas.
Todas as publicações e pedidos de patente citados neste relató-rio são aqui incorporados a título de referência como se cada publicação oupedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indica-do estar incorporado a título de referência.
A invenção é baseada, em parte, nos resultados experimentaisdescritos nos Exemplos que seguem.
EXEMPLOS
Nos Exemplos mostrados abaixo, experimentos e estudos clíni-cos são descritos, os quais mostram os efeitos de imunidade anterior ao ví-rus da febre amarela sobre vacinação subsequente com uma vacinaYF/dengue-2 quimérica (Exemplo 1) ou uma vacina tetravalente (YF/dengue-1, YF/dengue-2, YF-dengue-3 e YF/dengue-4) (Exemplo 2). Esses estudosincluem análise de anticorpos de neutralização, soroconversão, viremia erespostas de célula T.
Exemplo 1: ChimeriVax®-Den2
Vacina comercial YF17D (YF-VAX®) foi comprada da Aventis-Pasteur, Swiftwater, PA. ChimeriVax®-DEN2 é uma vírus geneticamente en-genheirado, atenuado, vivo, onde as seqüências codificando duas proteínasestruturais (prM e E) ou vírus da vacina YF17D são substituídos com as se-qüências correspondentes do vírus DEN2 (cepa PUO-218 isolada de umcaso de febre do dengue clássico, Bangkok, Tailândia). A construção genéti-ca de um genoma viral quimérico é realizada usando ácido desoxirribonu-cléico clonado circular (cDNA). cDNA de comprimento completo é transcritopara ácido ribonucléico (RNA) e o RNA usado para transfectar culturas decélula, que produzem vírus vivo (Guirakhoo e outros, J. Virol. 75:7290-7304,2001).
O vírus da vacina foi produzido de acordo com a Good Manufac-turing Practice (cGMP) atual. O vírus cresce em células Vero (rim de macacoverde Africano) de bancos de célula que foram testados quanto a agentesacidentais, de acordo com as orientações da Food and Drug Administration(FDA) para produtos derivados da cultura de célula de mamífero. Fluido so-brenadante de culturas de célula Vero contendo vírus de vacina é coletado,clarificado de restos celulares através de filtragem e tratado com uma nucle-ase (Benzonase®) para digerir moléculas de ácido nucléico derivadas de cé-lula hospedeiro. O vírus bruto tratado com nuclease é então concentradoatravés de filtragem e purificado através de diafiltragem. A vacina é formula-da com Albumina de Soro Humano (HSA) USP (2,5%) e Iactose USP (7,5%).A vacina foi mostrada ser estéril e livre de micoplasma, retrovírus [da Pro-duct Enhanced Reverse Transcriptase (PERT)] e vírus acidentais através detestes in vitro e in vivo. O frasco final de vacina foi testado quanto à esterili-dade, potência, identidade, pH, aparência, osmolaridade, HSA, lactose, en-dotoxina, segurança (segurança geral modificada em camundongos e por-quinhos-da-índia) e neurovirulência de camundongo.
Estudos pré-clínicos em macacos mostraram que ChimeriVax®-DNE2 é altamente imunogênica e bem tolerada após inoculação de dosesvariando de a partir de 2 a 5 Iog10 PFU (Guirakhoo e outros, J. ViroL74(12):5477-5485, 2000). Uma viremia de grau baixo aconteceu durante aprimeira semana após vacinação em macacos, similar àquela induzida pelavacina da febre amarela 17D. Uma injeção subcutânea única de vacina 2Iogio PFU (a dose mínima testada) induziu anticorpos de neutralização após15-30 dias, que protegeu contra provocação com vírus DEN2 do tipo selvagem.
Estudo Clínico com Vacina ChimericVax®-DEN2 Monovalente
Um estudo de paciente ambulatorial de centro único, duplo-cego,aleatorizado, foi realizado. Após avaliação, indivíduos naíve para febre ama-rela (YF) qualificados foram aleatorizados para uma vacinação única comdose baixa ou alta de ChimeriVax®-DEN2 (3,0 ou 5,0 Iog10 de unidades deformação de placa) ou YF-VAX®. Havia também um componente aberto on-de resposta de anticorpo à vacinação com ChimeriVax®-DEN de dose alta foiavaliada em indivíduos imunes com YF. Os indivíduos foram acompanhadosnos Dias 1-11, 21 e 31 quanto à resposta de anticorpo e avaliações de segu-rança, e a durabilidade de reposta de anticorpo foi avaliada em 6 e 12 mesespós-vacinação.
Após avaliação, 42 indivíduos naíve para YF qualificados foramaleatorizados igualmente em 3 grupos (dose alta ou baixa de ChimeriVax®-DEN2 ou YF-VAX®). No dia, 1,14 indivíduos receberam uma vacinação sub-cutânea única (SC) com ChimeriVax®-DEN2 (dose alta ou baixa) ou YF-VAX®. 14 indivíduos adicionais que eram imunes para YF (da vacina para YFfeita 6 meses a 5 anos antes da administração da vacina do dengue quimé-rica) receberam alta dose de ChimeriVax®-DEN2. Os indivíduos retornarampara a clínica nos Dias 2-11, 21 e 31. Avaliações de segurança foram reali-zadas em pontos de tempo especificados durante os Dias 1-31. Respostasde anticorpo a cepas de vacina homólogas e cepas do tipo selvagem deDEN2, e anticorpos de neutralização para YF17D e cepas protótipo de DEN-14, foram medidas nos Dias 1 (pré-vacinação) e 31. O estudo era não-cegoapós o término do período de tratamento, e os indivíduos foram avaliadosem 6 e 12 meses pós-vacinação quanto à durabilidade da resposta de anti-corpo.
A proporção de indivíduos que desenvolveram anticorpos deneutralização em um nível >1:10 a cepas diferentes representando os quatrosorotipos do dengue foi determinada. O efeito de imunização anterior comYF sobre a taxa de soroconversão de DEN2 nos grupos YF-imune e YF-naíve recebendo dose alta de ChimeriVax®-DEN2 foi analisado. Os títulos deanticorpo de neutralização médios geométricos em cada grupo de tratamen-to e para todos os quatro sorotipos do dengue foram medidos em vários in-tervalos de tempo após vacinação, até 12 meses.Viremia
Circulação de vírus no corpo (viremia) é uma medida de replica-ção das vacinas atenuadas, vivas, usadas no estudo. A viremia foi ensaiadaatravés de um ensaio em placa in células Vero. O número de indivíduos quedesenvolveram viremia nos 11 dias após vacinação é mostrado pelo dia devisita na Tabela 1. Mais indivíduos YF-naíve vacinados com ChimeriVax®-DEN2 do que YF-VAX® desenvolveram viremia em um ou mais dias de es-tudo: 8 (57%) no grupo de ChimeriVax®-DEN2 5,0 Iog10 e 9 (64%) no grupoChimeriVax®-DEN2 3,0 Iogi0 PFU, comparado com 2 (14%) no grupo YF-VAX®. Números ligeiramente maiores de indivíduos YF-imunes, comparadocom indivíduos YF-naíve, desenvolveram viremia seguindo vacinação comChimeriVax®-DEN2 5,0 Iogi0 PFU (11/14 [79%] em indivíduos YF-imune vs.8/14 [57%] em indivíduos YF-naíve), mas a diferença não foi estatisticamen-te significante (p=0,4724). Mais indivíduos desenvolveram viremia entre osdias 5-7. As medições de viremia quantitativas (pico médio, duração da mé-dia, AUC) foram também maiores no grupo YF-imune, mas novamente asdiferenças não foram estatisticamente significantes e importantemente ne-nhum impacto no perfil de segurança foi observado.Tabela 1: Medições de sumário de viremia
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a PFU=Unidades de formação de placa, medidas em culturas de célula VerobÁrea sob a curva
cComparação em par de ChimeriVax®-DEN2 5,0 Iog10 em indivíduos PFYYF-naíve versus imunes
Anticorpos de Neutralização
Três cepas do tipo selvagem diferentes do dengue tipo 2 (16681,JAH e PR-159), bem como a cepa da vacina homóloga (ChimeriVax®-DEN2), foram usadas em testes de neutralização. Cepas do tipo selvagemde sorotipos do dengue heterólogos 1 (16007), 3 (16562) e 4 (1036) foramtambém usadas para medir a extensão da resposta de anticorpo de neutrali-zação. A proporção de indivíduos soroconvertendo (demonstrando um títulode anticorpo de neutralização pelo menos superior ou igual a 1:10 entre Dia1 e Dia 30) foi determinada. Ainda, os títulos de anticorpo de neutralizaçãomédios geométricos foram medidos.
O Teste de Neutralização de Redução de Placa (PRNT50) usa-do para CVD2, PR-159 e JAH compreende as etapas que seguem:Soro inativado com calor foi serialmente diluído duas vezes emisturado com um volume igual de vírus para atingir 30/50 pfu/poço. As mis-turas de soro-vírus foram incubadas a 4°C por 18 +/- horas, então adiciona-das a monocamadas de célula Vero em placas de cultura de 12 poços. Apósuma incubação de 60 +/- 10 minutos, as monocamadas foram revestidascom 0,84% de carboximetilcelulose em meio de crescimento. As placas fo-ram então incubadas a 37°C sob CO2 a 5% por 3-5 dias.
As monocamadas foram fixadas com 7,4% de formalina, entãobloqueadas e permeabilizadas com 2,5% de leite em pó sem gordura emPBS-Tween20 mais 0,5% de Triton X-100. Anticorpo primário antidengue 2(3H5, 1:5000) foi incubado 60 +/- 10 minutos, seguido por fosfatase alcalinaIgG anti-camundongo de cabra (1:500). Após 60 +/- 10 minutos de incuba-ção, substrato, BCIP-NBT contendo Ievamisol a 0,36 mM, foi adicionado. Areação foi parada após tingimento suficiente ter ocorrido.
As placas foram contadas e títulos de PRNT50 foram determina-dos. Títulos de PRNT50 foram definidos como a primeira diluição de soro on-de a contagem de placa é igual a ou menos do que 50% da contagem deplaca de controle negativo. Um soro é considerado ser positivo para a pre-sença de anticorpos de neutralização quando o título de anticorpo de neutra-lização então determinado for pelo menos superior ou igual a 1:10.
Para as outras cepas, o ensaio PRNT50 foi realizada em outrolaboratório de acordo com o protocolo que segue descrito por Russell e ou-tros (J. Immunol. 99:285-290, 1967). Contagem de placa foi determinadausando a técnica de revestimento único de ensaio de placa LLC-MK2. Sorossão congelados, diluídos e inativados com calor através de incubação a56°C por 30 minutos. Diluições de 4 vezes, seriais, de soro são feitas (1:5,1:10, 1:40, 1:160 e 1:640). Um volume igual de vírus do dengue diluído paraconter cerca de 40-60 pfu é adicionado a cada tubo de diluição de soro. Se-guindo incubação a 37°C por 60 minutos, 0,2 mL é removido de cada tubo einoculado em poços em triplicata de LLC-MK2 confluente em uma placa de 6poços. Cada poço é incubado a 37°C por 90 minutos e as monocamadassão então revestidas com 4 mL de Carbóxi Metil Celulose a 1%/Meio Modifi-cado da Earle. As placas são incubadas por 7 dias a 37°C sob CO2 a 5%. Asplacas são então contadas, e o PRNT50 é determinado usando papel Iog-probit. A redução percentual de placas em cada nível de diluição é posta emgráfico para determinar o título de redução de 50%: pontos de redução deplaca entre 15% e 85% são usados. Os resultados são expressos como re-cíproca da diluição. Um soro é considerado ser positivo quanto à presençade anticorpos de neutralização quando o título dos anticorpos de neutraliza-ção então determinado é pelo menos superior ou igual a 1:10.
Resposta 30 Dias Após Vacinação
No Dia 31, taxas de soroconversão eram altas contra vírus dotipo 2 do dengue em todos os grupos vacinados com ChimeriVax®-DEN2.Taxas de soroconversão baixas para sorotipos de DEN heterólogos 1, 3 e 4foram observadas em indivíduos YH-naives inoculados com ChimeriVax®-DEN2 em dose alta ou baixa. Taxas de soroconversão para DEN1 eram23% e 23% nos grupos de dose 5,0 e 3,0 Iogi0 PFU, respectivamente (Tabe-la 2); para DEN3 15% e 23%, respectivamente; e para DEN4 0% e 0%, res-pectivamente. Em contraste, 100% de indivíduos YF-imune inoculados comChimeriVax®-DEN2 soroconverteram para todos os sorotipos DEN heterólogos.
Vacina ChimeriVax®-DEN2 induziu títulos de anticorpo de neu-tralização cruzada muito baixos para os sorotipos heterólogos 1, 3 e 4 emindivíduos YF-naive (Tabela 3). Títulos de anticorpo de neutralização médiosgeométricos contra sorotipos do dengue heterólogos no Dia 31 foram signifi-cantemente maiores em indivíduos YF-imunes vacinados com ChimeriVax®-DEN2 do que indivíduos YF-naive. Para DEN1, títulos de anticorpo médiosgeométricos em indivíduos YF-imunes e indivíduos YF-naive vacinados oucom ChimeriVax®-DEN2 5,0 ou 3,0 Iogi0 PFU foram 79 vs, 10 e 12, respecti-vamente (p<0,0001). Similarmente, para DEN3, os títulos foram 73 vs. 13 e12 (p<0,0001) (Tabela 3). Nenhum dos indivíduos YF-naive soroconverterampara DEN4. O título de anticorpo de neutralização médio geométrico paraDEN4 em indivíduos YF-imunes foi 57.Tabela 2: Taxa de soroconversão (%) pelo grupo de tratamento, dia 31
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Tabela 3: Título de anticorpo médio geométrico pelo grupo de tratamento,dia 31
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Resposta 6 meses após vacinação
Resposta em 6 meses após vacinação é dada nas Tabelas 4 e5, abaixo. Em 6 meses, taxas de soropositividade baixas para sorotipos deDEN heterólogos 1,3 e 4 foram observadas em indivíduos YF-naive inocula-dos com ChimeriVax®-DEN2 em dose alta ou baixa. Taxas de soroconver-são para DEN1 foram 23% e 31% nos grupos de dose de 5,0 e 3,0 Iogi0PFU, respectivamente (Tabela 4); para DEN3 15% e 23%, respectivamente;e para DEN4 8% e 8%, respectivamente. Em contraste, 100% de indivíduosYF-imunes inoculados com ChimeriVax®-DEN2 eram soropositivos paraDEN 1 a 3, e 64% para DEN4.
A vacina ChimeriVax®-DEN2 induziu títulos de anticorpo de neu-tralização de reatividade cruzada baixos para os sorotipos heterólogos 1, 3 e4 em indivíduos YF-naive (Tabela 5). Títulos de anticorpo de neutralizaçãomédios geométricos contra sorotipos do dengue heterólogos em 6 mesesforam maiores em indivíduos YF-imunes vacinados com ChimeriVax®-DEN2do que em indivíduos YF-naive. Para DEN1, os títulos de anticorpo médiosquiméricos em indivíduos YF-imunes e indivíduos YF-naive vacinados oucom 5,0 ou 3,0 Iog10 PFU de ChimeriVax®-DEN2, eram 285 vs. <10 e 14,respectivamente. Similarmente, para DEN3, os títulos eram 268 vs. <10 e<10 (Tabela 5).
Tabela 4: Proporção de soropositivo (%) por grupo de tratamento, 6 meses
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Tabela 5: Título de anticorpo médio geométrico por grupo de tratamento, 6meses
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Resposta 1 ano após vacinação
Em 12 meses, taxas de soropositividade eram mais altas contravírus do dengue tipo 2 no grupo YF-imune vacinado com ChimeriVax®-DEN2. Isto era particularmente evidente quando as cepas DEN2 PF-159 eJAH foram consideradas. Essas suas cepas são das Américas e pertencema dois grupos variantes distintos (Américas I e II, respectivamente).
Taxas de soropositividade baixas para sorotipos de DEN heteró-logos 1, 3 e 4 foram observadas em indivíduos YF-naíves inoculados comChimeriVax®-DEN2 em dose alta ou baixa. Taxas de soroconversão paraDEN1 eram 23% e 31% nos grupos de dose de 5,0 e 3,0 Iog10 PFU1 respec-tivamente (Tabela 6); para DEN3 8% e 23%, respectivamente; e para DEN48% e 9%, respectivamente. Em contraste, 100% dos indivíduosYF-imunesinoculados com ChimeriVax®-DEN2 eram soropositivos para DEN 1 e 3, e29% para DEN4.
A vacina ChimeriVax®-DEN2 induziu títulos de anticorpo de neu-tralização reativa cruzada para as cepas DEN2 JaH e PR-159 e para soroti-pos heterólogos 1, 3 e 4 em indivíduos YF-naíve (Tabela 7). Títulos de anti-corpo de neutralização médios geométricos contra sorotipos do dengue he-terólogos em 12 meses foram significantemente maiores em indivíduos YF-imunes vacinados com ChimeriVax®-DEN2 do que em indivíduos YF-naíve.Para DEN1, títulos de anticorpo médios geométricos em indivíduos YF-imunes e indivíduos YF-naíve vacinados ou com 5,0 ou 3,0 IogIO PFU deChimeriVax®-DEN2, foram 89 vs. 10 e 13, respectivamente (p<0,0001). Simi-larmente, para DEN3, títulos foram 72 vs. <10 e <10 (p<0,0001) (Tabela 7).
Tabela 6: Proporção de soropositivo (%) por grupo de tratamento, 12 meses
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Tabela 7: Título de anticorpo médio geométrico por grupo de tratamento, 12meses
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Resposta de Anticorpo da Febre Amarela
Surpreendentemente, dos 14 indivíduos YF-imunes que foraminoculados com ChimeriVax®-DEN2, apenas 2 (14%) tiveram um reforço emanticorpo YF. Então, enquanto imunidade YF preexistente reforçou a respos-ta a sorotipos 1-4 do dengue após vacinação com ChimeriVax®-DEN2, a re-cíproca não era verdadeira (isto é, ChimeriVax®-DEN2 não reforçou anticor-po para vírus da febre amarela). Este resultado é inesperado, uma vez que omecanismo que baseia a resposta de anticorpo ampliada para dengue empacientes imunes para febre amarela que receberam ChimeriVax®-DEN2(epítopos compartilhados entre proteínas envelope da febre amarela e dodengue) teria sido esperado resultar em um reforço em anticorpos de febreamarela seguindo ChimeriVax®-D2. Os resultados ilustram a imprevisibilida-de de respostas imunes protetoras cruzadas a flavivírus e enfatizam a inova-ção da presente invenção.
Respostas de Célula T
Respostas de célula T foram avaliadas através da produção deIFNy em resposta a antígeno viral em sobrenadantes de cultura. Indivíduosforam avaliados com Iisato de célula viral inativada, que foi mostrado gerarrespostas de célula T CD4+ primariamente para a vacina, mas algumas cé-lulas CD8+ são também produzidas (Mangada e outros, J. Immunol. Me-thods, 284:89-97, 2004).
Materiais e Procedimentos Experimentais
A resposta de célula T foi avaliada nos Dias 1 e 32 através damedição da produção de IFNy por PBMC estimulada em cultura com antíge-no de vírus inativado. Sangue integral foi coletado nos Dias 1 e 31 em tubosde preparação de célula Vacutainer (CPT, BDBiosciences) e enviado paraAcambis, Inc. para isolamento e criopreservação de PBMC. As células foramlavadas em RPMI 1640, criopreservadas em soro AB humano inativado comcalor (SeraCare, Oceanside CA) contendo DMSO a 10%, armazenadas emnitrogênio líquido e descongeladas imediatamente antes do teste. Para me-dição da produção de IFNy, PBMC foram culturadas em placas de fundoplano de 96 poços a 1,5 x 105 células por poço por 7 dias a 37°C com 3 an-tígenos de célula de vírus inativado com glutaraldeído diferentes: (1) vírusChimeriVax®-DEN2 (crescido em células Vero), (2) vírus do dengue 2 cepaPU0218 (vírus do dengue tipo 2 selvagem em células C6/36) e (3) vírus YF(crescido em células Vero). Controles consistiam em células Vero e/ouC6/36 falso-infectadas inativadas. Antígeno viral inativado ou antígeno decélula de controle foi adicionado em uma concentração de 1:100 (15). PBMCforam também estimuladas com 1 pg/ml de ConA como um controle positivode ensaio. Produção de IFNy foi determinada através de ELISA usando so-brenadantes de cultura coletados no Dia 7.
ELISAde IFNvSobrenadantes de cultura foram analisados quanto ao teor deIFNy através de um ensaio ELISA indireto (OptEIA® human IFNy Kit, BDBi-oscience-Pharmingen, N0 Cat. 555142) de acordo com as instruções do fa-bricante.
Produção de Ctocina IFNv
Produção de citocina IFNy foi comparada no Dia 1e no Dia 31 doestudo (antes da vacinação e no Dia 30 após vacinação) através de teste daresposta a antígenos de vírus inativado. A vacina administrada (Chimeric-Vax®-DEN2), a origem do vírus do dengue tipo 2 selvagem (PU0218) e ovírus controle administrado (YF-VAX®) foram testados. ChimeriVax®-DEN2que cresceu em células Vero tinha muito pouco informação (background) noDia 0, enquanto o vírus do dengue-2 crescido em células C6/36 produziurespostas em alguns dos indivíduos. Não obstante, ambos antígenos au-mentaram a produção de IFNy em cada um dos quatro grupos de vacina. AYF-VAX® não era muito imunogênica em nenhum dos indivíduos, mas elamostrou um aumento no Dia 31 com relação ao Dia 1, especialmente nosindivíduos vacinados para YF.
Comparações entre grupo de vacinação foram feitas usando adiferença entre valores no Dia 31 e Dia 1 (Figura 1). Todos os grupos res-ponderam a cada um dos antígenos inativados. Os indivíduos que recebe-ram 103 ou 105 PFU de vacina ChimeriVax®-DEN2 tinham níveis de IFNyequivalentes. No ensaio ELISA IFNy1 indivíduos vacinados com Chimeri-Vax®-DEN2 tinham respostas ligeiramente maiores do que indivíduos vaci-nados para YF (não significante) (Figura 1).
Os indivíduos que eram pré-imunes YF tinham um aumento nonúmero de respondedores e um aumento no nível de IFNy médio (Figura 1).A Tabela 8 sumariza os resultados mostrando o número de respondedorescomo uma fração do total. Cerca de 65% dos indivíduos vacinados comChimeriVax®-DEN2 e YF tinham uma resposta IFNy positiva para a vacinaadministrada como antígeno de teste, enquanto aproximadamente 90% deindivíduos pré-imunes vacinados com ChimeriVax®-DEN2 tinham uma res-posta positiva (Tabela 8).Tabela 8: Número de indivíduos que responderam à vacina com base emresposta de IFNy
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Resposta positiva definida como um informação (background) de 5 vezes ou> 50 pg/ml no Dia 30 se o Dia 1 for menor do que 10 pg/ml (abaixo da sensi-bilidade).
Os resultados deste estudo mostram que aproximadamente 65%dos indivíduos vacinados com ChimeriVax®-DEN2 e YF tinham uma respos-ta de célula T positiva à vacina administrada como antígeno de teste, en-quanto -90% de indivíduos pré-imunes YF vacinados com ChimeriVax®-DEN2 tinham respostas positivas (definido por uma resposta IFNy). Produ-ção de IFNy foi a maior em resposta ao vírus da vacina ChimeriVax®-DEN2.
As respostas de célula T neste teste clínico estavam de acordocom as respostas de anticorpo de neutralização, pelo fato de que ambasdoses de vacina estimularam respostas imunes de célula T similares, e imu-nidade anterior para vírus da febre amarela não inibiu a resposta de célula Tpara ChimeriVax®-DEN2. As respostas de IFNy foram virtualmente as mes-mas para as 2 doses de ChimeriVax®-DEN2 (103 e 105 pfu). A resposta deIFNy para ChimeriVax®-DEN2 não foi diminuída pela vacinação anterior comvírus da febre amarela e números ainda mais altos de respondedores foramvistos, sugerindo uma tendência para imunidade de célula T realçada emindivíduos pré-imunes YF.
O antígeno inativado usado no ensaio identificou os respondedo-res mais fortes, mas não determinou as proteínas especificas contra asquais a resposta imune foi gerada. Visto que um antígeno de dengue inativofoi usado, é provável que respostas CD4+ primariamente sejam medidas.
Exemplo 2: Vacina do Dengue Tetravalente
Plano de Estudo e MétodosNeste exemplo, foi avaliada em indivíduos humanos a respostaimune à imunização seqüencial com vacina da febre amarela 17D seguidopela administração de uma mistura de quatro (4) vírus da febre amarelaquiméricos que compreendiam cada um proteínas de membrana e envelopede sorotipos do dengue que são diferentes um do outro (tetravalente Chime-riVax®-DEN). O primeiro estágio do estudo foi para avaliar a segurança, tole-rabilidade e imunogenicidade da vacina ChimeriVax®-DEN tetravalente con-tendo sorotipos DEN 1, 2, 3 e 4 em comparação com uma vacina da febreamarela (YF) (YF-VAX®) e um placebo. O segundo estágio do teste avaliou asegurança e imunogenicidade de administração seqüencial de YF-VAX®/ChimeriVax®-DEN tetravalente versus duas doses de ChimeriVax®"DEN tetravalente dadas em um intervalo de 5-9 meses.
O estudo consistia em um período de avaliação de 3 a 21 diasantes da primeira vacinação, um período de tratamento duplo-cego após aprimeira vacinação de 1 mês e um segundo período de avaliação do dia 3 ao21, antes de um período de tratamento aberto de 30 dias começando 5 a 9meses após a primeira vacinação. Uma visita de acompanhamento em 12meses foi planejada.
No primeiro estágio do estudo, 3 grupos de 33 indivíduos mascu-linos e femininos adultos saudáveis receberam uma vacinação de Chimeri-Vax®-DEN tetravalente (grupo 1), YF-VAX® (grupo 2) ou placebo (YF-VAX®diluente - grupo 3), para um total de 99 indivíduos.
Antes da condução de quaisquer procedimentos relacionados aoestudo, os indivíduos deram consentimento informado escrito. Durante a a-valiação, a qualificação foi avaliada através de uma história médica, um e-xame físico, sinais vitais, química clínica, hematologia e sorologia (incluindogravidez no soro em indivíduos femininos) e amostra da urina para urinálise.No Dia 1, indivíduos receberam uma vacinação subcutânea duplo-cega naárea deltoide e então foram à clínica nos dias 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 e21 para entrevista AE e coleta de amostra de sangue para viremia. Ainda,nos Dias 5, 9, 11 e 15, os indivíduos proveram uma amostra de sangue paraavaliações de laboratório clínicas. Nos Dias 11 e 31, e em 5-9 meses, osindivíduos proveram uma amostra de sangue para análise de anticorpo.
Nos meses 5 a 9, qualificação continuada foi avaliada e umahistória médica por um tempo determinado foi registrada. Indivíduos qualifi-cados receberam uma segunda vacinação (vacina ChimeriVax®-DEN tetra-valente) subcutaneamente na área deltoide. Os indivíduos compareceram naclínica 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20 dias depois para entrevista AE ecoleta de amostra de sangue para viremia. Amostras de sangue para testesde anticorpo foram obtidas 10 e 30 dias após esta segunda vacinação.
Todos os indivíduos retornaram à clínica 12 meses depois davacinação inicial (3-7 meses após a segunda vacinação) para testes de anti-corpo. O plano do estudo é mostrado nas Tabelas 9 e 10.
Tabela 9: Tratamentos a serem administrados no Dia 1
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Tabela 10. Tratamentos a serem administrados em 5 a 9 meses
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A dose de ChimeriVax®-DEN Tetravalente precisa por sorotipo édeterminada através do ensaio TCID50 como sendo 3,7/ 3,1/ 3,8/ 3,2 TCID50para sorotipos 1, 2, 3 e 4 respectivamente.
Os critérios para avaliação de respostas imunes foram comosegue:
O ponto final primário para imunogenicidade é a taxa de soro-conversão para sorotipos do dengue 1-4 no Dia 31, usando teste de neutrali-zação de redução de placa 50% de diluição de soro, vírus constante, reali-zado conforme descrito no Exemplo 1. Esta análise define as taxas de soro-conversão para todos os quatro sorotipos do dengue e para cada sorotipoindividual. Indivíduos que são soronegativos na linha de base (<1:10) vãorequerer um titulo de PRNT50 >1:10 para satisfazer os critérios para soro-co n versão.
Pontos finais secundários incluíram a análise de título de anti-corpo de neutralização médio geométrico para cada sorotipo do dengue etaxa de soroconversão 5 a 9 meses após a primeira vacinação e 12 mesesapós a primeira vacinação (isto é, 3-7 meses após a segunda vacinação, dereforço). Essas respostas sorológicas são comparadas com indivíduos quereceberam (a) uma dose única de ChimeriVax®-DEN tetravalente; (b) duasdoses de ChimeriVax®"DEN tetravalente ou (c) uma dose de vacina da febreamarela 17D (YF-VAX®) seguido por 1 dose de ChimeriVax®-DEN tetrava-lente administrada 5-9 meses depois.
Resultados
O objetivo do estudo era avaliar a extensão da resposta imuneem todo os 4 sorotipos do dengue seguindo regimes de imunização diferen-tes. O objetivo de imunização de indivíduos humanos contra doença do vírusdo dengue é atingir uma resposta de anticorpo de neutralização cruzadamais ampla possível. As respostas imunes de todos os indivíduos (que eramnáive para dengue e febre amarela na linha de base) 30 dias após a segun-da dose de medicação de estudo são mostradas na Tabela 11 (resultadoscontra cepas do tipo selvagem).
54 indivíduos (que eram naive para dengue e febre amarela nalinha de base) receberam uma dose única de ChimeriVax®-DEN tetravalenteno Dia 1 ou placebo no Dia 1 seguido por uma dose única de ChimeriVax®-DEN tetravalente em 5-9 meses. As respostas de anticorpo de neutralização30 dias após receberem a vacina ativa nesses grupos são combinadas e sãomostradas na coluna à direita mais distante da Tabela 11. Uma minoria dosindivíduos que receberam uma inoculação única de ChimeriVax®-DEN tetra-valente teve uma resposta imune reativa cruzada para sorotipo do dengue 3ou 4. Apenas 43% e 17% dos indivíduos recebendo uma dose de Chimeri-Vax®"DEN tetravalente desenvolveram anticorpos de neutralização para pelomenos sorotipo 3 ou 4 do dengue, respectivamente.
27 indivíduos (que eram naive para dengue e febre amarela nalinha de base) receberam 2 doses de ChimeriVax®-DEN tetravalente no Dia1 e em 5-9 meses (Grupo 1). As respostas de anticorpo de neutralização sãomostradas na Tabela 11. A extensão da resposta de anticorpo de neutraliza-ção no Grupo 1 era maior do que em indivíduos que receberam apenas umadose de ChimeriVax®-DEN tetravalente. 55,6% e 40,7% de indivíduos quereceberam duas doses de ChimeriVax®-DEN tetravalente desenvolveramanticorpos de neutralização para sorotipo do dengue 3 ou 4, respectivamente.
26 indivíduos (que eram naíve para dengue e febre amarela nalinha de base) receberam vacina para febre amarela (YF-VAX®) no Dia 1seguido por uma dose de ChimeriVax®-DEN tetravalente em 5-9 meses(Grupo 2). As respostas de anticorpo de neutralização no Grupo 2 são mos-tradas na Tabela 11. A extensão da reposta de anticorpo de neutralização noGrupo 2 era maior do que aquela em indivíduos que receberam ou uma dosede ChimeriVax®-DEN tetravalente ou duas doses de ChimeriVax®"DEN tetra-valente separadas por 5-9 meses. 92% e 65% dos indivíduos recebendo i-munização seqüencial com vacina da febre amarela e vacina ChimeriVax®-DEN tetravalente desenvolveram anticorpos de neutralização para pelo me-nos sorotipo 3 ou 4 do dengue, respectivamente.
Os resultados mostram claramente que um regime de imuniza-ção seqüencial onde vacina da febre amarela é dada antes de uma vacinaChimeriVax®-DEN tetravalente resulta em uma resposta imune superior aodengue com reatividade cruzada ampla em todos os sorotipos do dengue,que pode ser conseguida com uma ou duas doses de vacina ChimeriVax®-DEN tetravalente testada sozinha.
Embora a invenção acima tenha sido descrita em alguns deta-lhes a título de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de compre-ensão, será prontamente aparente àqueles versados na técnica à luz dosensinamentos da presente invenção que certas mudanças e modificaçõespodem ser feitas nela sem se afastar do espírito ou escopo das reivindica-ções apensas. Todas as referências citadas acima são incorporadas aqui atítulo de referência.
Tabela 11: Período de Tratamento Aberto
Resposta de Anticorpo Antes da Vacinação e em 10 e 30 Dias após a Se-gunda Vacinação (administrada 5-9 meses após a dose primária) ContraPelo menos Um Sorotipo. Pelo Menos Dois Sorotipos, Pelo menos Três So-rotipos e para os Quatro Sorotipos de Cepas de Dengue (tipos 1-4), peloGrupo de Tratamento
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[1] Dia 0 é o dia quando a segunda vacinação foi administrada em 5-9 me-ses. O anticorpo medido neste ponto de tempo é o resultado da primeira va-cinação 5-9 meses antes.
[2] Título de anticorpo de neutralização > 10
Claims (24)
1. Uso de uma vacina do vírus da febre amarela e de uma vaci-na de flavivírus quimérico compreendendo pelo menos um flavivírus quiméri-co compreendendo uma estrutura principal do vírus da febre amarela onde aseqüência codificando a proteína envelope do vírus da febre amarela foisubstituída com uma seqüência codificando a proteína envelope de um vírusda dengue, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma combi-nação/kit para a indução de uma resposta imune de neutralização cruzada,de longa duração, para o vírus da dengue.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que o flavivírus quimérico compreende uma estrutura principal do vírus dafebre amarela na qual as seqüências codificando as proteínas de membranae envelope do vírus da febre amarela foram substituídas com as seqüênciascodificando as proteínas de membrana e envelope de um vírus do dengue.
3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelofato de que as proteínas envelope do dengue e/ou de membrana do denguesão proteínas embaralhadas.
4. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que a vacina de flavivírus quimérico é administrada ao paciente 30, 60 ou 90 dias após administração da vacina da febre amarela.
5. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que o flavivírus quimérico é composto de uma estrutura principal de vírusYF17D.
6. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que a vacina do vírus da febre amarela compreende uma cepa de vacinaYF17D 17D-204, 17D-213ou 17DD.
7. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que o flavivírus quimérico compreende uma estrutura principal do vírus dafebre amarela na qual as seqüências codificando as proteínas de membranae envelope do vírus da febre amarela foram substituídas com as seqüênciascodificando as proteínas de membrana e envelope de um vírus sorotipo 1 dodengue.
8. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que o flavivírus quimérico compreende uma estrutura principal do vírus dafebre amarela na qual as seqüências codificando as proteínas de membranae envelope do vírus da febre amarela foram substituídas com as seqüênciascodificando as proteínas de membrana e envelope de um vírus sorotipo 2 dodengue.
9. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que o flavivírus quimérico compreende uma estrutura principal do vírus dafebre amarela na qual as seqüências codificando as proteínas de membranae envelope do vírus da febre amarela foram substituídas com a seqüênciacodificando as proteínas de membrana e envelope de um vírus sorotipo 3 dodengue.
10. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que o flavivírus quimérico compreende uma estrutura principal do vírus dafebre amarela na qual as seqüências codificando as proteínas de membranae envelope do vírus da febre amarela foram substituídas com a seqüênciacodificando as proteínas de membrana e envelope de um vírus sorotipo 4 dodengue.
11. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que a vacina de flavivírus quimérico é uma vacina monovalente.
12. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que a vacina de flavivírus quimérico é uma vacina tetravalente.
13. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fatode que compreende ainda administração de uma dose de reforço de umavacina de flavivírus quimérico, como definido na reivindicação 1, 6 meses a 10 anos após a primeira dose da vacina de flavivírus quimérico.
14. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende:(i) uma vacina do vírus da febre amarela, e(ii) uma vacina de flavivírus quimérico compreendendo pelo menos umflavivírus quimérico compreendendo uma estrutura principal do vírus dafebre amarela onde a seqüência codificando a proteína envelope do ví-rus da febre amarela foi substituída com a seqüência codificando a pro-teína envelope de um vírus do dengue.
15. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fatode que o flavivírus quimérico compreende uma estrutura principal de vírus dafebre amarela na qual as seqüências codificando as proteínas de membranae envelope do vírus da febre amarela foram substituídas com as seqüênciascodificando as proteínas de membrana e envelope de um vírus do dengue.
16. Kit de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizadopelo fato de que as proteínas envelope do dengue e/ou de membrana dodengue são proteínas "embaralhadas".
17. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fatode que a vacina do vírus da febre amarela compreende uma cepa YF17D.
18. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fatode que o flavivírus quimérico é composto de uma estrutura principal do vírusYF17D.
19. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fatode que a vacina de flavivírus quimérico compreende um flavivírus quiméricocompreendendo uma estrutura principal do vírus da febre amarela na qual asseqüências codificando as proteínas de membrana e envelope do vírus dafebre amarela foram substituídas com as seqüências codificando as proteí-nas de membrana e envelope de um vírus sorotipo 1 do dengue.
20. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fatode que a vacina de flavivírus quimérico compreende um flavivírus quiméricocompreendendo uma estrutura principal do virus da febre amarela na qual asseqüências codificando as proteínas de membrana e envelope do vírus dafebre amarela foram substituídas com as seqüências codificando as proteí-nas de membrana e envelope de um vírus sorotipo 2 do dengue.
21. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fatode que a vacina de flavivírus quimérico compreende um flavivírus quiméricocompreendendo uma estrutura principal do vírus da febre amarela na qual asseqüências codificando as proteínas de membrana e envelope do vírus dafebre amarela foram substituídas com as seqüências codificando as proteí-nas de membrana e envelope de um vírus sorotipo 3 do dengue.
22. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fatode que a vacina de flavivírus quimérico compreende um flavivírus quiméricocompreendendo uma estrutura principal do vírus da febre amarela na qual asseqüências codificando as proteínas de membrana e envelope do vírus dafebre amarela foram substituídas com as seqüências codificando as proteí-nas de membrana e envelope de um vírus sorotipo 4 do dengue.
23. Kit de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fatode que compreende ainda pelo menos uma dose de reforço de uma vacinade flavivírus quimérico.
24. Uso de (i) uma dose de uma vacina do vírus da febre amare-la e (ii) uma dose de uma vacina de flavivírus quimérico compreendendo pe-lo menos um flavivírus quimérico compreendendo uma estrutura principal dovírus da febre amarela na qual as seqüências codificando a proteína envelo-pe do vírus da febre amarela foram substituídas com seqüências codificandoa proteína envelope de um vírus do dengue, caracterizado pelo fato de que éem indução de resposta imune de neutralização cruzada, de longa duração,para o vírus do dengue em um paciente, na qual a vacina de flavivírus qui-mérico é administrada pelo menos 30 dias e até 10 anos após a administra-ção da vacina da febre amarela.
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