BRPI0614294A2 - métodos para efetuar a evolução seletiva de proteìnas in vivo - Google Patents
métodos para efetuar a evolução seletiva de proteìnas in vivo Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0614294A2 BRPI0614294A2 BRPI0614294-0A BRPI0614294A BRPI0614294A2 BR PI0614294 A2 BRPI0614294 A2 BR PI0614294A2 BR PI0614294 A BRPI0614294 A BR PI0614294A BR PI0614294 A2 BRPI0614294 A2 BR PI0614294A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- protein
- nucleic acid
- expression
- cell
- variants
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 title abstract description 11
- 238000002818 protein evolution Methods 0.000 title description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 55
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 80
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 74
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 63
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 63
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 63
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 40
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 35
- 101710188306 Protein Y Proteins 0.000 claims description 29
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 16
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 claims description 15
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 14
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 12
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 6
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 6
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 4
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 101100505879 Arabidopsis thaliana GSTF9 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims 2
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 11
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 11
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 8
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 5
- KLSJWNVTNUYHDU-UHFFFAOYSA-N Amitrole Chemical compound NC1=NC=NN1 KLSJWNVTNUYHDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010002459 HIV Integrase Proteins 0.000 description 2
- 101710173438 Late L2 mu core protein Proteins 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- -1 for example Chemical class 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000001086 yeast two-hybrid system Methods 0.000 description 2
- 101710154825 Aminoglycoside 3'-phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000003746 Insulin Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010001127 Insulin Receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 101100285000 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066717 Q beta Replicase Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101150023114 RNA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 101710086987 X protein Proteins 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000002820 assay format Methods 0.000 description 1
- 238000002819 bacterial display Methods 0.000 description 1
- 101150049515 bla gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000002824 mRNA display Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000010399 three-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1055—Protein x Protein interaction, e.g. two hybrid selection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B10/00—Directed molecular evolution of macromolecules, e.g. RNA, DNA or proteins
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
MéTODOS PARA EFETUAR A EVOLUçãO SELETIVA DE PROTEìNAS IN VIVO. A presente invenção refere-se a métodos para produção de variantes de proteínas que têm propriedades aperfeiçoadas em comparação com a proteína inicial, as variantes sendo obtidas com o auxílio de um método de evolução in vivo.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA EFETUAR A EVOLUÇÃO SELETIVA DE PROTEÍNAS IN VIVO".
Descrição
A presente invenção refere-se a métodos para produção de vari-antes de proteínas que têm propriedades aperfeiçoadas pela comparaçãocom a proteína inicial, as variantes sendo obtidas com o auxílio de um méto-do de evolução in vivo.
Antecedentes da invenção
A importância aumentada da biotecnologia nos setores médicos,da indústria química e agronômicos significa que existe uma demanda au-mentada para proteínas otimamente adaptadas para sua proposta particularde uso. Estas proteínas são inicialmente isoladas principalmente a partir doambiente, a maioria dentro da estrutura das assim denominados triagensmetagenômicas. Aumentadamente1 elas são subseqüentemente adaptadaspor vários métodos às condições de uso planejadas "artificiais".
Desse modo, por exemplo, existem necessidades de enzimasque sejam mais termicamente estáveis do que suas variantes naturais, te-nham uma especificidade de substrato diferente, ou mostrem atividadesmais altas. As proteínas farmacêuticas, por exemplo, são pretendidas paraterem meias-vidas mais longas de modo a capacitar o uso de doses meno-res, ou inibir, via a alta afinidade e ligação específica às moléculas-alvo, tra-jetórias metabólicas associadas à doença, ou rotas de infecção.
Técnica anterior
Esta adaptação ocorre, em parte, pelas aproximações de dese-nho de proteína racionais. Contudo, as presentes possibilidades para conclu-ir a estrutura de uma proteína a partir de sua função desejada - o fenótipo -e para inferir a seqüência primária correspondente a partir da estrutura tridi-mensional da proteína, são muito limitadas. De modo a, não obstante, alcan-çar um aumento na função de uma proteína, as aproximações usadas nopresente são parcialmente evolutivas, e são resumidas pelo termo "evoluçãodireta" (Buskirk et al., 2003 "In vivo evolution of an RNA-based transcriptionalactivator". Chem. Biol. 10:533-540; de Crécy-Laragd et al., 2001, "Long termadaptation of a microbial population to a permanent metabolic constraint:overcoming thymineless death by experimental evolution of Escherichia coli",BMC Biotechnology 1:10; Fields and Song, 1989, "A novel genetic system todeteet protein-protein interaetions", Nature, 340: 245-246; Long-MeGie et al.,1999, "Rapid in vivo evolution of a β-lactamase using phagemids". Biotech-nol. Bioeng. 68:121-125; Rohde et al., 1995, "The mutant distribution of RNAspecies replicated by Q beta replicase", J. Mol. Biol. 249:754-762).
Métodos de evolução direcionada para duração são baseados,de acordo com a técnica anterior atual, substancialmente na geração de umgrande número de variantes (progenia) da proteína a serem aperfeiçoadas,eseleção destas para derivados aperfeiçoados. Neste caso, o número de mu-tantes investigados pode, em alguns casos, ser muito grande, mas é usual-mente abaixo de 1011. Considerando-se uma proteína de somente 100 ami-noácidos, na teoria 20100 = 10130 variantes diferentes destes existem. Umabiblioteca com uma dimensão de 1011 conseqüentemente cobre somenteuma fração muito pequena das variantes possíveis. A possibilidade de des-cobrir-se a melhor variante teoricamente em tal biblioteca é aproximadamen-te zero.
O princípio da evolução com suas três precondições - replica-ção, mutação e seleção - é capaz, dentro de um dado sistema, de propor-cionar evolução direta de estruturas simples a altamente adaptadas. Estemodelo da assim denominada "blind watchmaker" faz com que complexida-de seja criada sem uma entrada de desenho e sem conhecimento necessá-rio de dados estruturais.
De modo a abrigar um grande número de variantes para afinida-de máxima para uma molécula-alvo, um grande número de protocolos já foidesenvolvido (por exemplo, levedura de dois híbridos, exibição bacterial,fago exibição, exibição ribossomal, exibição de mRNA). A triagem para ou-tras propriedades, tais como, por exemplo, atividade enzimática, requer, namaior parte, formatos de ensaio que permitem a investigação de somenteum número relativamente pequeno de variantes (<106).
É comum a estes métodos que eles sejam confinados a geraçãode uma biblioteca (= mutação) e subseqüente seleção desta. Embora umareplicacão (= próxima geração de mutantes do "vencedor" da seleção queocorreu por último) seja possível manualmente com estes protocolos, ela éapenas tão complicada quanto à etapa precedente. As aproximações cor-respondentes, portanto, se extendem geralmente somente sobre uma a duasgerações. Por esta razão, os protocolos mencionados não são aproximaçõesevolutivas no sentido verdadeiro, mas, ao contrário, são seleções exclusivasde reuniões disponíveis de variantes.
Conseqüentemente, o potencial para adaptação gradual sobremuitas gerações não pode ser utilizado, mas esta seria a precondição ne-cessária para identificação em algumas circunstâncias da variante mais ativaa partir de um número astronomicamente grande de possibilidades.
O documento WO 2004/108926 descreve métodos para evolu-ção de ácidos nucléicos e proteínas. Este método é baseado na utilização daalta taxa de mutação e adaptabilidade de vírus de RNA1 especialmente obacteriófago Phi. Um gene de β-lactamase foi inserido no genoma do bacte-riófago Phi6 para formar um fago recombinante. Este fago recombinantePhi6 foi propagado nas células bacteriais com anulação de lysis, uma pres-são de seleção sendo exercida pela adição de ampicilina e um antibióticoadicional. Foi verificado que as células bacteriais que sobreviveram conti-nham moléculas de RNA de fago que continham um gene de β-lactamasemodificado no nível de ácido nucléico comparado com o gene de β-Iactamase originalmente introduzido. A pressão de seleção tinha, desse mo-do, conduzido a seleção de gene de β-lactamase. Menção é, do mesmo mo-do, feita de possibilidades adicionais para evolução de, por exemplo, proteí-nas regulatórias ou RNAs ou moléculas tendo propriedades de ligação espe-cíficas. Contudo, a possibilidade de evolução de quaisquer proteínas dese-jadas que são completamente independentes em termos de sua função apartir da expressão do respectivo gene de seção não é descrita. Em adição,o documento WO 2004/108926 considera uma etapa de seleção/triagem. Arevelação concernente à evolução de moléculas tendo propriedades de liga-ção particulares em particular requer uma triagem após cada geração deevolução, de modo que o sistema descrito não pode ser deixado completa-mente por si próprio.
O objetivo da presente invenção foi, portanto, criar um sistemaque proporcione um método de evolução in vivo que não dependa de méto-dos de triagem elaborados.
Este objetivo é alcançado por um método para produção de va-riantes Y' de uma proteína Y, onde a variante Y' da proteína Y são caracteri-zadas por propriedades de ligação modificadas para uma molécula-alvo X,compreendendo as etapas:
(a) provisão de uma célula compreendendo
(a1) um primeiro ácido nucléico que codifica para uma proteínaY a ser variada,
(a2) um segundo ácido nucléico que codifica para a molécula-alvo X, e
(a3) um terceiro ácido nucléico que codifica para um marcadorde evolução sob o controle de uma seqüência de controle de expressão quepode ser modulada,
onde a expressão do marcador de evolução é modulada pelaligação de Y e/ou Y' a X,
(b) cultivo da célula sob condições que
(b1) capacita formação de variantes Y' da proteína Y e
(b2) permite seleção para aquelas células que exibem um ex-pressão, modulada por comparação com a célula de (a), do marcador deevolução, e
(c) identificação e, onde apropriado, isolamento daquelas célulasque exibem uma expressão modulada do marcador de evolução, e
(d) onde identificação apropriada e/ou caracterização de varian-tes Y' da proteína Y nas células de (c).
Esta invenção envolve sistemas autônomos que, por um lado,permitem seleção de uma dada biblioteca de variante no laboratório, e, si-multaneamente, incluem um mecanismo de replicação. A seleção, neste ca-so, é para ser implementada somente - como na evolução natural, via repli-cação preferida de variantes melhores adaptadas. Em adição, os sistemasde replicação usados são designados de modo que permitem uma taxa demutação adequada durante as replicações. O número de variantes, teorica-mente testadas desse modo, de uma construção inicial, é calculado a partirdo número de progenia de um vencedor de uma geração para a energia donúmero total de gerações em um experimento (por exemplo, 10 progeniaspor geração com 400 gerações = 10400 variantes possíveis). Embora sejaimpossível para cada uma destas 10400 variantes individuais explicitamenteestarem presentes fisicamente em um experimento, o próprio sistema procu-ra uma "trajetória", dentro de um terreno virtual complexo, que sempre con-duz ao máximo absoluto. Somente as variantes ao longo da trajetória existi-ram durante o experimento; todos os pontos (variantes) do terreno são teori-- camente possíveis.
O método da invenção é, desse modo, baseado no princípio queuma proteína Y que é para ser envolvida, e que, para a proposta da presenteinvenção, é referida como "proteína Y a ser variada", é codificada por umácido nucléico que conduz a expressão in vivo para as variantes Y' destaproteína, a formação de variantes ocorrendo no nível de ácido nucléico, porexemplo, através da replicação do ácido nucléico que codifica para Y, atra-vés de polimerases com uma taxa de erro particular (por exemplo, porqueelas não têm função de correção).
Estas variantes Y' podem, em seguida, serem selecionadas porvárias propriedades, tais como, por exemplo, para a propriedade de ligaçãoa uma proteína adicional particular com afinidade mais alta. Se estas propri-edades de ligação de afinidade mais alta das variantes Y' da proteína Y sãoadequadas para ativação e/ou aumento de expressão de um gene de mar-cador de evolução, na aplicação de pressão de seleção é possível que aevolução ocorra autonomamente, porque as únicas células que sobrevivem ouse propagam, ou se propagam mais rapidamente, são aquelas que expressamvariantes da proteína Y tendo as propriedades aperfeiçoadas desejadas.
Em princípio, qualquer tipo de células é adequado para um sis-tema deste tipo, possibilidades sendo células procarióticas ou eucarióticas.O tipo de célula depende de onde apropriada no sistema de seleção a serescolhido, o técnico no assunto sendo capaz de selecionar células adequa-das para o sistema de seleção particular. É possível usar células bacteriais,células de levedura, células de planta e células de vertebrados, especial-mente células de mamíferos, preferivelmente células humanas. A seleção dacélula depende do sistema de evolução particular, e pode ser selecionadapelo próprio versado.
Conforme já mencionado acima, o método da invenção incluidois grupos de processos, a saber, por um lado, replicação e mutação, e,por outro lado, seleção. Os métodos e sistemas para ambos estes grupos deprocessos foram descritos na técnica anterior.
De modo que uma proteína Y seja variada para envolver as vari-antes Y' tendo propriedades aperfeiçoadas, é inicialmente necessário pro-porcionar a possibilidade de desenvolvimento de tais variantes em um ambi-ente in vivo, isto é, por exemplo, em uma célula. Isto pode ocorrer, por e-xemplo, no nível de ácido nucléico. Por exemplo, é possível empregar poli-merases de DNA ou polimerases de RNA que exibem uma certa taxa de er-ro, de modo que ácidos nucléicos que sofrem mutação ocorrem durante re-plicação e/ou transcrição do ácido nucléico que codifica para a proteína Y e,em seguida, conduzem, por exemplo, devido a mutações de ponto, anula-ções ou inserções, no nível de proteína para variantes Y' da proteína Y a servariada.
Estas polimerases responsáveis pela replicação e mutação, istoé, polimerases dependentes de DNA e dependentes de RNA, e polimerasesdependentes de RNA podem, dependendo da concretização escolhida dométodo da invenção, ou já estarem presentes na célula, ou elas podem tam-bém serem providas separadamente, por exemplo, elas podem ser codifica-das por um ácido nucléico adicional, por exemplo, um plasmídeo.
O primeiro ácido nucléico que codifica para a proteína Y a servariada está, de acordo com a invenção, em uma forma que pode ser repli-cado no nível de ácido nucléico por polimerases na célula. Em uma concretiza-ção preferida, o primeiro ácido nucléico está na forma de um replicon de RNA.Para a proposta da presente invenção, "replicon" significa, emparticular, um ácido nucléico que é replicado por uma polimerase de RNAdependente de RNA1 especificamente uma assim denominada replicase. Umreplicon pode, desse modo, ou ser um RNA, ou ainda um replicon pode serDNA que codifica após um primeiro ciclo de transcrição para um replicon deRNA. O replicon de RNA é preferivelmente selecionado a partir de seqüên-cias de RNA lineares, genomas de organismos baseados em RNA, plasmí-deos de RNA, vírus de RNA, tais como, por exemplo, bacteriófagos de RNAe análogos de RNA. As replicases adequadas, de acordo com a invenção,são preferivelmente selecionadas de polimerases de RNA dependentes deRNA, tais como, por exemplo, replicases Οβ, Phi6, Phi8, Phi9, Phi10, Phi11,Phil 3 e Phi14, e similares (vide, por exemplo, WO 2004/108926 e as publi-cações de Makajev et al. abaixo mencionadas).
As replicases são muito menos precisas do que as polimerasesde DNA porque elas não têm função de correção. Sua taxa de erro é umamutação por 103 a 104 bases sintetizadas. Em adição a taxa alta de erro,contudo, as replicases, especialmente replicases Οβ, são altamente especí-ficas de substrato e podem, desse modo, ser "calibradas" para RNAs alvoespecíficos. As replicases conhecidas na técnica anterior são, por exemplo,replicases Οβ ou replicases Phi. As replicases Phi e seu potencial evolucio-nal foram descritas na técnica anterior, especialmente por Makajev et al,. emJournal of Virology, 2004, volume 78, NQ 4, páginas 2114-2120, EMBO Jour-nal, 2000, volume 19, Nq 1, páginas 124-133, e Virus Research, 2004, 101,45-55, e no pedido de patente internacional WO 2004/108926. Referido pe-dido de patente descreve um sistema no qual um genoma modificado dobacteriófago Phi6 é usado como replicon, e a replicase Phi6 viral é usadacomo replicases. O sistema descrito aqui é efetuado em células de E. coli.Um sistema deste tipo é também adequado para a presente invenção.
O segundo ácido nucléico codifica para uma molécula-alvo. Amolécula-alvo X é preferivelmente uma proteína, mas pode também ser ou-tro produto de gene obtido pela expressão do segundo ácido nucléico, talcomo, por exemplo, um mRNA ou derivados de ácido nucléico destes. A mo-lécula-alvo X é escolhida para a proposta da presente invenção de tal modoque a proteína Y e suas variantes Y' se ligam a esta molécula-alvo X, e aligação de X e Y, ou X e Y', pode modular a expressão do marcador de evo-lução. O ácido nucléico que codifica para a molécula-alvo X pode ser providoem qualquer forma adequada, na forma de um plasmídeo que é adequadopara transfecção ou transformação de células. Este plasmídeo é, desse mo-do, preferivelmente equipado com um marcador de seleção. A molécula-alvoX pode, para a proposta da presente invenção, ser escolhida completamenteirrestritamente, e é, desse modo, possível selecionar qualquer molécula-alvoque age como par de ligações para a proteína Y a ser variada que é procurada.
De modo a efetuar a evolução direcionada de acordo com a in-venção, é necessário exercer uma certa pressão de seleção nos sistemas decélula selecionados. Por esta razão, o terceiro ácido nucléico codifica paraum marcador de evolução sob o controle de uma seqüência de controle deexpressão que pode ser modulada, com a expressão do marcador de evolu-ção sendo modulado pela ligação da proteína Y ou suas variantes Y' parauma molécula-alvo X. O terceiro ácido nucléico é preferivelmente provido naforma de um plasmídeo, mas pode ser em qualquer forma adequada paraintrodução em uma célula. A seqüência de controle de expressão que podeser modulada preferivelmente inclui pelo menos um promotor e, particular-mente preferivelmente, seqüências adicionais, por exemplo, intensificadorese similares, especialmente seqüências de ativação à montante, tais como,por exemplo, seqüências de ativação no DNA que permite a ligação de mo·duladores de transcrição, especialmente a ligação de ativadores de transcri-ção, onde a ligação destes moduladores de transcrição tem uma influênciana expressão do gene correspondente que é controlado pela seqüência decontrole de expressão que pode ser modulada.
O marcador de evolução é, para a proposta da invenção, umgene que torna possível selecionar aquelas células que expressam o marca-dor de evolução. Nas células procarióticas, em princípio, todo gene de resis-tência a antibiótico é adequado. Alguns exemplos são, por exemplo, genesde resistência à ampicilina, tais como, o gene bla que codifica β-lactamase.Adicionalmente, tais genes de resistência são aqueles que codificam, porexemplo, para aminoglicoside 3'-fosfotransferase {nptIII), que medeia resis-tência a kanamacin e G418, e cloranfenicol acetiltransferase (caí). O marca-dor de evolução preferido para um sistema procariótico é cat.
Os marcadores de evolução que podem ser usados em sistemade levedura são os seguintes genes, por exemplo, hiS3, frpl, ura3 ou Ieu2.Adequado nessa conexão em sistemas procariótico e de levedura é, por e-xemplo, o gene de seleção hi£3 que serve como mediador de prototrofia dehistidina, e cujo efeito de dose pode ser ajustado, via a concentração de 3-amino-triazol no meio. Genes de resistência similares podem ser usadoscomo marcadores de evolução em outros casos também, tais como, preferi-velmente, células de mamíferos.
A expressão do marcador de evolução permite seleção, por e-xemplo, de tal modo que somente células a serem selecionadas são aquelasque se propagam mais rapidamente do que aquelas nas quais o marcadorde evolução é expresso não tão bem ou não no todo (onde o marcador deevolução é um gene de resistência), ou células que expressam o marcadorde expressão não tão bem ou não no todo (se o marcador de evolução é umgene que é desvantajoso para a célula).
Desse modo, a taxa de crescimento de uma célula está direta-mente relacionada à expressão do gene de seleção.
Uma possibilidade adicional é também usar marcadores de sele-ção convencionais como marcadores de evolução. Estes marcadores de e-volução podem, por exemplo, codificarem para genes de resistência de anti-biótico, ou similares.
Uma modificação adicional do sistema de seleção consiste nouso como marcador de evolução de um gene que codifica para uma proteínaque é expressa na superfície da célula. É então possível para células queexpressam esta proteína, devido à ligação da proteína expressa a um par deligações correspondente que é acoplado a uma matriz sólida, estarem liga-das a esta matriz sólida. Isto então torna possível selecionar as células queexpressam o marcador de evolução a partir de outras células que não sãocapazes de se ligarem à matriz sólida.
O marcador de evolução está sob o controle de uma seqüênciade controle de expressão que pode ser modulada. Adequados para estaproposta são todos os tipos de promotores, intensificadores e seqüênciasativadoras similares que podem ser ativadas em trans e/ou em eis. Em umaconcretização preferida, a seqüência de controle de expressão é uma se-qüência que inclui uma seqüência que requer a ligação de uma proteína pa-ra ativação. Um exemplo é uma seqüência de ativação à montante (UAS).
O princípio do sistema de dois híbridos é preferivelmente usadopara tal modulação do marcador de evolução. Este sistema é bem-conhecido no estado da técnica, e é usado para detectar interações de pro-teína-proteína. O sistema de dois híbridos é baseado em um complexo deduas proteínas de fusão, onde uma proteína de fusão tem um domínio deligação para a seqüência de ativação (UAS) localizada na seqüência de con-trole de expressão, fundida a ou acoplada a uma proteína X. O segundocomplexo de proteína compreende uma proteína Y a ser investigada e umdomínio de ativador que interage com a polimerase responsável pela trans-crição. Somente quando a ligação ocorre entre XeY pode a seqüência decontrole de expressão ser ativada e o gene controlado desse modo, isto é, ogene de seleção, ser expresso.
É claro a um técnico no assunto que este sistema de dois paresde ligação X e Y ou Y' pode ser usado muito bem para o método da presenteinvenção. Uma grande vantagem do sistema de dois híbridos de levedura é,contudo, que ele é adequado somente para detecção de interações de prote-ína-proteína entre duas proteínas conhecidas, ou para triagem de variantesde proteína previamente geradas. O sistema de dois híbridos conhecido noestado da técnica não exibe etapa de evolução de proteína.
O método da invenção, por contraste, permite a geração de vari-antes Y' da proteína Y no sistema provido, isto é, dentro de uma célula, au-tomaticamente. É, desse modo, possível, permitir desenvolvimento das pro-teínas X a serem variadas de seu próprio acordo em uma direção particularque pode ser controlada pela capacidade de ligação das variantes Y' à mo-lécula-alvo Χ.
Se existem geradas no sistema variantes de Y que têm uma afi-nidade mais alta para X, ou, em contraste, para Y de fato tem uma afinidadepara X, a expressão do gene de seleção permite sobrevivência e propaga-ção mais rápida e, desse modo, seleção daquelas células tendo uma varian-te Y' da proteína de variação com propriedades aperfeiçoadas.
No sistema de dois híbridos de levedura bem-conhecido, a se-qüência de controle de expressão é ativada pelo uso da proteína Ga14 quetem um domínio de ligação para uma seqüência de ativação a montante, eum domínio de ativação que interage com a polimerase. É possível separarestes dois domínios da proteína Ga14 e proporcionar cada domínio em cadacaso com uma molécula adicional, ou como proteína de fusão, ou para aco-plar em outro modo, em cujo caso a interação entre as moléculas adicionais,por exemplo, X e Y ou Y', torna possível trazer os dois domínios de Ga14 emproximidade espacial com um outro novamente, capacitando modulação daseqüência de controle de expressão.
Os segundo e terceiro ácidos nucléicos podem estar presentesou como ácidos nucléicos separados, por exemplo, na forma de plasmídeos,ou eles podem também estar presentes no mesmo plasmídeo. O primeiroácido nucléico deve, conforme já mencionado acima, ser um ácido nucléicoreplicável, preferivelmente um replicon de RNA que pode ser replicado porreplicases de RNA. Contudo, é também possível proporcionar o primeiro á-cido nucléico na forma de um plasmídeo, ou de outra forma de um ácido nu-cléico transfectável ou transformável, em que este ácido nucléico pode codi-ficar para um primeiro ácido nucléico correspondentemente replicável.
É possível para a proposta da presente invenção usar o sistemade dois híbridos de levedura bem-conhecido, ou um sistema equivalente,onde a interação, isto é, a ligação da proteína Y e/ou variantes Y' da proteí-na Y a uma molécula-alvo, torna possível modular a seqüência de controlede expressão que pode ser modulada, e, desse modo, modular a expressãodo marcador de evolução.
Desse modo, existe preferivelmente o uso de dois moduladoresde expressão, onde a interação dos dois moduladores de expressão um como outro, ou diretamente ou indiretamente, via X e Y ou Y', é necessária paramodulação da seqüência de controle de expressão do marcador de evolução.
Em uma concretização preferida, a proteína Y a ser variada, queé codificada pelo primeiro ácido nucléico, em particular, um replicon de RNA,é acoplada a, ou o primeiro, ou o segundo modulador de expressão. Isto en-volve ou uma proteína de fusão entre Yeo primeiro modulador de expres-são, ou uma proteína de fusão entre Yeo segundo modulador de expres-são, ou a proteína Y é acoplada em outro modo, por exemplo, via ligação debiotin-streptavidin, a um dos dois moduladores de expressão.
A molécula-alvo X pode ser uma proteína, ou mesmo outra mo-lécula, por exemplo, um ácido nucléico. É importante que X, ou seja acopla-do a um modulador de expressão, ou forme com a última uma proteína defusão, ou represente o modulador de expressão apropriado.
Em uma concretização, por exemplo, o primeiro (ou alternativa-mente o segundo) modulador de expressão é uma molécula que se liga auma seqüência de ativação à montante (UAS). O segundo (ou alternativa-mente o primeiro) modulador de expressão modula a expressão através daligação à polimerase correspondente, com modulação de expressão ocor-rendo somente se existe interação simultaneamente do primeiro (ou alterna-tivamente do segundo) ativador de expressão com a UAS, e interação dosegundo (ou alternativamente do primeiro) ativador de expressão com a po-limerase. Acopladas ou fundidas a este modulador de expressão estão, emcada caso, as moléculas X e Y ou Y', com a interação entre X e Y, ou entreXe Y', tornando possível, desse modo, que os dois moduladores de expres-são sejam capazes de modular a expressão.
É preferido na presente invenção ativar a seqüência de controlede expressão que pode ser modulada, pelo que o marcador de evolução éexpresso e, desse modo, a célula é provida com uma vantagem de cresci-mento. Contudo, é também possível usar um sistema no qual a modulação éuma inibição.
Em uma concretização preferida que faz uso do sistema de doishíbridos, a proteína X e a proteína Y são providas, em cada caso, como pro-teínas de fusão com o domínio de ligação de DNA (preferivelmente comoX/domínio de ligação) e com o domínio do ativador (preferivelmente Y/domí-nio de ativador). Contudo, é também possível ao invés de proteínas de fusãopara as unidades desejadas serem acopladas juntas via moléculas adicio-nais, por exemplo, via articuladores, ou ligações de streptavidin/biotin, ousimilares.
Ao invés do sistema de dois híbridos convencionais, é tambémpossível usar sistemas de três híbridos, ou complexos de proteína com maissubunidades podem ser usados.
É, além disso, possível pelo sistema de um híbrido envolver pro-teínas Y que se liga a uma dada seqüência de DNA.
O procedimento experimental em uma concretização preferidada invenção ocorre inicialmente, via transformação do primeiro ácido nucléi-co em uma cepa de levedura ou E. coli que já compreende os dois outrosácidos nucléicos. A mistura de transformação é, em seguida, desenvolvidasob condições de seleção de marcador de evolução na cultura líquida, moni-torando-se continuamente a taxa de crescimento da cultura. Antes da culturaentrar na fase logarítmica, uma alíquota desta é transferida em meio fresco,e crescimento adicional é observado. A transferência pode também ocorrerautomaticamente, ou via uma adição contínua de meio e remoção de cultura.
Um ponto final do processo de evolução é alcançado quandonenhum aumento adicional na taxa de crescimento é observado apesar dapressão de seleção ser elevada. O isolamento e seqüenciamento da(s) se-qüência(s) de replicon de colônias simples identificam candidatos potenciaisque são subseqüentemente investigados individualmente para as afinidadesde seus produtos de gene. É, do mesmo modo, possível tratar a totalidadede todas as variantes presentes dentro do sistema no ponto final como bibli-oteca de gene, e identificar as variantes que são melhores, por sua vez, viaum ensaio de seleção (por exemplo, mostrador de fago).
A Figura 1 mostra uma representação diagramática de uma con-cretização preferida do sistema de evolução autônomo in vivo, que é descritoem detalhe abaixo.
A presente invenção refere-se adicionalmente a uma célulacompreendendo
(i) um primeiro ácido nucléico que codifica para uma proteína Y aser variada,
(ii) um segundo ácido nucléico que codifica para a molécula-alvoX, onde Y é capaz de se ligar à molécula-alvo X,
(iii) um terceiro ácido nucléico que codifica para um marcador deevolução sob o controle de uma seqüência de controle de expressão quepode ser modulada,
e onde a célula é capaz de permitir a formação de variantes Y' da proteína Y,
onde as variantes Y' da proteína Y são caracterizadas por pro-priedades de ligação modificadas para a molécula-alvo X.
A célula pode ser transformada ou transfectada com os ácidosnucléicos apropriados, sendo possível usar métodos convencionais que sãobem-conhecidos ao técnico no assunto para a transformação e transfecção.
A presente invenção refere-se adicionalmente a um kit para efe-tuar o método da invenção, isto é, para desenvolver variantes Y' de qualquerproteína Y, onde as variantes Y' da proteína Y são caracterizadas por pro-priedades de ligação modificadas para a molécula-alvo X,
(i) onde apropriado uma célula compreendendo
(ii) um primeiro ácido nucléico que codifica para uma proteína Ya ser variada,
(iii) um segundo ácido nucléico que codifica para a molécula-alvoX, onde Y é capaz de se ligar à molécula-alvo X,
(iv) um terceiro ácido nucléico que codifica para um marcador deevolução sob o controle de uma seqüência de controle de expressão quepode ser modulada, e
onde a célula é capaz de permitir a formação de variantes Y' daproteína Y, onde as variantes Y' da proteína Y são caracterizadas por pro-priedades de ligação modificadas para a molécula-alvo X, e
(v) onde apropriado, um meio de seleção adequado.O método aqui descrito tem a vantagem de evitar métodos detriagem elaborados a uma grande extensão, e que quaisquer proteínas po-dem ser envolvidas.
É possível, em particular, através da combinação de evoluçãodireta com um sistema que é baseado no sistema de dois híbridos de leve-dura, alcançar evolução de proteínas tendo propriedades de ligação aperfei-çoadas para uma molécula-alvo X autonomamente. Não é, neste particular,mais necessário para as variantes formadas após cada geração serem iso-ladas e caracterizadas; ao contrário, o sistema pode ser deixado por si parauma pluralidade de gerações até que as variantes Y' da proteína Y tendo asmelhores propriedades de ligação para a molécula-alvo X apropriadamenteselecionada terem se formado automaticamente.
De modo a tornar possível pela evolução in vivo baseada emreplicon de DNA também aperfeiçoar proteínas extracelulares (por exemplo,imunoglobulinas, Anticalins, etc.), receptores, etc., é possível para a molécu-la-alvo X ser expressa na célula de tal modo que ela é exportada para a su-perfície da célula, ou no periplasma da célula, e permanece ancorada nestecompartimento. As variantes de interação codificadas por replicon são, domesmo modo, ancoradas na superfície da célula, e podem, onde apropriado,interagiram, via um domínio de articulador flexível com a molécula-alvo X.
Uma interação aumentada, por sua vez, conduz (possivelmente via uma ter-ceira molécula que é deslocada pela interação) a uma vantagem de seleçãoda célula relevante. O sinal pode ocorrer, por exemplo, via uma mudançaconformacional do domínio de ancoramento de membrana com cascata desinal subseqüente no núcleo da célula (por exemplo, otimizando a afinidadede insulina para o receptor de insulina).
É também concebível regular os transportadores de membranaque conduzem ou moléculas essenciais no interior da célula, ou citoxinaspotenciais fora da célula.
É também concebível expressar moléculas-alvo X como proteínadi-, tri-, ou multimérica, pelo que, com o aumento da afinidade entre as mo-léculas, existe reticulação destas e formação de grupos na superfície. Istopode ter efeitos na adesão das células às superfícies, pelo que, por sua vez,seleção para células fortemente aderentes é possível, onde células forte-mente menos aderentes são eliminadas com estringência aumentada.
A adesão é, do mesmo modo, usada para efetuar seleção devariantes Y' de interação codificadas por replicon que são expressas em cé-lulas na superfície da célula no modo seguinte. A molécula-alvo X (proteína,peptídeo, ácido nucléico, outros polímeros, moléculas orgânica ou inorgânicapequenas (por exemplo, intermediária de uma reação enzimaticamente cata-lisada)) é, neste caso, ligada a uma matriz sólida ou líquida (ou micelas), etrazida em contato com a suspensão de célula. As células que expressamvariantes de afinidade mais alta têm uma grande afinidade para a matriz só-lida. Com o aumento da estringência (por exemplo, sal, pH, competidores deligação, etc.), células fracamente aderentes são lavadas, e as células remanes-centes são expostas a meio fresco, e nova matriz é provida, enquanto parte damatriz antiga é removida. Este processo pode facilmente ser automático.
As células que expressam Iigantes muito bons não serão desta-cadas novamente a partir da superfície. Não obstante, elas são ainda capa-zes, onde apropriado, de divisão de célula. Células filhas têm, se o ambientedireto é ocupado, a oportunidade de alcançar regiões distantes com matrizfresca. É possível, neste caso, mudar o tipo de matriz de etapa para etapa(onde uma "etapa" é definida como a partir da inoculação de novo meio paraa próxima inoculação com parte da matriz), por exemplo, gotas magnéticas esuperfícies de polivinila (placa Eliza). Desse modo, sempre somente "matrizrecentemente ocupada" é transferida de uma etapa para a próxima.
Em cada caso (intra e extracelular), é possível aumentar a afini-dade não somente para proteínas, mas também para moléculas orgânica ouinorgânica pequenas. É possível para esta proposta acoplar a molécula, co-valentemente, por exemplo, a biotin. Esta molécula é introduzida no cito-plasma, ou no meio extracelular (pode ser por penetração de membrana). Aoinvés da molécula-alvo X, neste caso streptavidin (como fusão no caso dedois híbridos) é expressa. A molécula-alvo/quimera de biotin se liga à strep-tavidin e, desse modo, apresenta a molécula-alvo de modo a agir como alvode afinidade.
Descrição da figura
Figura 1: Representação diaqramática do sistema para evolução autônomoin vivo
O plasmídeo 1 codifica, sob o controle da seqüência de ativaçãoa montante (UAS), para uma marcador de evolução que efetua mediação decrescimento mais rápido. A proteína de fusão composta de domínio de liga-ção de DNA e o componente X (ligação/X) é codificada pelo plasmídeo 2, ese liga a UAS. Dependendo da resistência da interação entre o componenteXea proteína Y ou Y', o domínio de ativação fundida (ativador) é capaz derecrutar o complexo de transcrição da própria célula, e expressão dependen-te do marcador de evolução ocorre. A proteína de fusão Y/ativador é codifi-cada por um replicon que suporta replicação autônoma e propensa a erropor uma polimerase de RNA dependente de RNA (Phi).
Exemplo
Partindo de um gene sintético, um produto de PCR compreen-dendo os seguintes elementos é gerado: promotor T7 + estrutura de leiturapara o domínio de ativação da proteína de levedura Gal4 (Fields and Stern-glanz, 1994), fundidos a um peptídeo de 30 aminoácidos aleatórios(=Act/30X). Devido à aleatoriedade dos 30 aminoácidos C-terminais, umabiblioteca de gene que compreende um número de aproximadamente 109variantes diferentes foi gerado. Em uma reação de transcrição, 5 pmol doproduto PCR foram transcritos com polimerase "T7" em uma reação de100μΙ (=Act/30X replicon).
Um cassete de expressão de levedura para a polimerase Οβ deRNA dependente de RNA (NQ de Acesso AAM33128) é clonado no plasmí-deo pAs (Fields and Sternglanz, 1994) (= pAs-Οβ). Este plasmídeo permiteseleção para prototrofia de triptofan em levedura.
A estrutura de leitura para integrase HIV (NQ de Acesso A-AC61700.1) é clonada, fundida ao domínio de ligação de DNA Gal, no plas-mídeo pAs-Οβ (=pAs-Qp-lnt), transformada na cepa de levedura Y190, eselecionada para prototrofia de triptofan.A cultura de levedura transformada com pAs-QP-lnt é transfor-mada com 10 μς de RNA de replicon Act/30X (taxa de transformação decerca de 500 000), e diretamente incubada em 50 ml de cultura líquida detriptofan/histidina com adição de 12 mM de 3-aminotriazol (3-AT), e com agi-tação a 30°C.
Após um OD (600 nm) de 3,0 ser alcançado, 50 ml de meio fres-co são inoculados com 200 μΙ da cultura, e novamente agitados até que oOD alcance 3,0 (isto corresponde a 8 duplicações de geração). O tempo pa-ra alcançar este OD dividido por oito corresponde ao tempo de geração dapopulação de levedura.
Se o tempo de geração se aproxima de 60 minutos, a concen-tração de 3-AT é inicialmente aumentada para 25 mM (após a 5§ transferên-cia) e, em seguida, para 50 mM (após a 8- transferência). Um tempo de ge-ração de 85 minutos é alcançado após a 10- transferência, e cai não adicio-nalmente mesmo após uma transferência adicional.
20 μ da cultura de levedura da 10ê cultura de transferência foramblindados nas placas de triptofan/histidina, e incubada a 30°C por 3 dias. Acolônia maior é transferida em 30 ml de meio de triptofan/histidina, desen-volvida a um OD de 3,0, e centrifugada. O pélete de célula é rompido comgotas de vidro em tampão STET, fenol e clorofórmio, o sobrenadante aquosoé extraído 2x com clorofórmio, e os ácidos nucléicos presentes são precipi-tados com etanol. O pélete seco (DNA & RNA) é ressuspensa em 100 μΙ de10 mM Tris. 5 μΙ desta são transcritos em DNA com transcriptase reversa comum oligonucleotídeo específico para o replicon, e amplificada por PCR. O pro-duto de PCR é subclonado em um vetor adequado e transformado em E. coli.
A análise de seqüência de 384 clones de E. coli revela uma dis-tribuição aleatória de seqüências diferentes que codificam para variantesdesenvolvidas Act/30X que têm uma afinidade aumentada para integraseHIV. Investigações mais recentes mostram repetição de motivos de aminoá-cido dentro do peptídeo variável (30X) que são responsáveis pela afinidadeaumentada.
Claims (24)
1. Método para produção de variantes Y' de uma proteína Y1 on-de a variante Y' da proteína Y são caracterizadas por propriedades de liga-ção modificadas para uma molécula-alvo X, compreendendo as etapas:(a) provisão de uma célula compreendendo(a1) um primeiro ácido nucléico que codifica para uma proteínaY a ser variada,(a2) um segundo ácido nucléico que codifica para a molécula-alvo X, e(a3) um terceiro ácido nucléico que codifica para um marcadorde evolução sob o controle de uma seqüência de controle de expressão quepode ser modulada,onde a expressão do marcador de evolução é modulada pela ligação de Ye/ou Y' a X,(b) cultivo da célula sob condições que(b1) capacita formação de variantes Y' da proteína Y e(b2) permite seleção para aquelas células que exibem um ex-pressão, modulada por comparação com a célula de (a), do marcador deevolução, e(c) identificação e, onde apropriado, isolamento daquelas célulasque exibem uma expressão modulada do marcador de evolução, e(d) onde apropriado, identificação e/ou caracterização de varian-tes Y' da proteína Y nas células de (c).
2. Método de acordo com a reivindicação 1, onde a célula é umacélula procariótica ou eucariótica.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, onde a célula é se-lecionada de E. coli, células de levedura, células de planta e células de ver-tebradas, especialmente células de mamífero.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, onde o primeiro ácido nucléico é replicado e/ou transcrito comuma taxa de variação que é aumentada pela comparação com a taxa de va-riação natural.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, onde o primeiro ácido nucléico é na forma de um replicon de RNA,e a célula de (a) compreende adicionalmente uma replicase capaz de repli-car o replicon de RNA para formar variantes.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, onde o replicon deRNA é selecionado a partir de seqüências de RNA lineares, genomas deorganismos baseados em RNA, plasmídeos de RNA, bacteriófagos de RNAe análogos de RNA.
7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, onde a replica-se é selecionada de polimerases de RNA dependentes de RNA, tais como,por exemplo, replicases Οβ, Phi6, Phi8, Phi9, Phi10, Phil 1, Phi13 e Phi14.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, onde o marcador de evolução é selecionado de genes cuja ex-pressão produz propagação mais rápida da célula possível.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, onde o marcador de evolução é selecionado de genes que codifi-cam para proteínas associadas à superfície que torna possível para a célulase ligar a uma matriz sólida.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, onde o método é efetuado intracelularmente.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, onde a proteína Y e suas variantes Y' são cada acopladas aum primeiro modulador de expressão, e X é acoplado a um segundo modu-Iador de expressão, onde uma interação do primeiro modulador de expres-são e do segundo modulador de expressão com o ácido nucléico que codifi-ca para o marcador de evolução é necessária para modular a expressão domarcador de evolução.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, onde X é uma proteína.
13. Método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, onde o pri-meiro ácido nucléico codifica para uma proteína de fusão composta de Y e oprimeiro modulador de expressão, e o segundo ácido nucléico codifica parauma proteína de fusão composta de X e o segundo modulador de expres-são, ou onde o primeiro ácido nucléico codifica para uma proteína de fusãocomposta de Y e o segundo modulador de expressão, e o segundo ácidonucléico codifica para uma proteína de fusão composta de X e o primeiromodulador de expressão.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 13, onde o primeiro modulador de expressão é um modulador para umapolimerase.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 13, onde o segundo modulador de expressão é um modulador para umapolimerase.
16. Método de acordo com a reivindicação 14, onde a seqüênciade controle de expressão que pode ser modulada no terceiro ácido nucléicoinclui uma seqüência de ativação a montante (UAS), e o segundo modulador deexpressão é uma proteína de ligação capaz de se ligar especificamente à UAS.
17. Método de acordo com a reivindicação 15, onde a seqüênciade controle de expressão que pode ser modulada no terceiro ácido nucléicoinclui uma seqüência de ativação à montante (UAS), e o primeiro modulador deexpressão é uma proteína de ligação capaz de se ligar especificamente à UAS.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, onde a seqüência de controle de expressão que pode ser mo-dulada inclui uma seqüência de ativação à montante (UAS) que permite liga-ção da proteína Ga14.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, onde a ligação de Y e/ou Y' a X capacita à ativação da seqüência decontrole de expressão que pode ser modulada no terceiro ácido nucléico.
20. Célula compreendendo(i) um primeiro ácido nucléico que codifica para uma proteína Y aser variada,(ii) um segundo ácido nucléico que codifica para uma molécula-alvo X, onde Y é capaz de se ligar à molécula-alvo X,(iii) um terceiro ácido nucléico que codifica para um marcador deevolução sob o controle de uma seqüência de controle de expressão quepode ser modulada,e onde a célula é capaz de permitir a formação de variantes Y' da proteína Y,onde as variantes Y' da proteína Y são caracterizadas por propriedades deligação modificadas para a molécula-alvo X.
21. Célula de acordo com a reivindicação 20, onde o primeiroácido nucléico é na forma de um replicon de RNA, e a célula compreendeadicionalmente uma replicase capaz de replicar o replicon de RNA para for-mar variantes.
22. Célula de acordo com a reivindicação 20 ou 21, que é umacélula procariótica ou eucariótica.
23. Kit para produção de variantes Y' de uma proteína Y, onde avariante Y' da proteína Y são caracterizadas por propriedades de ligaçãomodificadas para uma molécula-alvo X, compreendendo(i) onde apropriado uma célula(ii) um primeiro ácido nucléico que codifica para uma proteína Ya ser variada,(iii) um segundo ácido nucléico que codifica para a molécula-alvoX, onde Y é capaz de se ligar à molécula-alvo X,(iv) um terceiro ácido nucléico que codifica para um marcador deevolução sob o controle de uma seqüência de controle de expressão quepode ser modulada, eonde a célula é capaz de permitir a formação de variantes Y' da proteína Y,onde as variantes Y' da proteína Y são caracterizadas por propriedades deligação modificadas para a molécula-alvo X, e(v) onde apropriado, um meio de seleção adequado.
24. Kit para produção de variantes Y' de uma proteína Y, com-preendendo:(i) uma célula como definida em qualquer uma das reivindica-ções 20 a 22,(ii) meio de seleção com o qual as células podem ser seleciona-das na base da expressão modulada do gene de seleção.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE102005037349A DE102005037349A1 (de) | 2005-08-08 | 2005-08-08 | Verfahren für die kontinuierliche zielgerichtete Evolution von Proteinen in vivo |
| DE102005037349.6 | 2005-08-08 | ||
| PCT/EP2006/007797 WO2007017228A1 (de) | 2005-08-08 | 2006-08-07 | Verfahren für die kontinuierliche zielgerichtete evolution von proteinen in vivo |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0614294A2 true BRPI0614294A2 (pt) | 2011-03-22 |
Family
ID=37487683
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0614294-0A BRPI0614294A2 (pt) | 2005-08-08 | 2006-08-07 | métodos para efetuar a evolução seletiva de proteìnas in vivo |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20100151517A1 (pt) |
| EP (1) | EP1913139B1 (pt) |
| JP (1) | JP2009504144A (pt) |
| CN (1) | CN101238212A (pt) |
| AT (1) | ATE440136T1 (pt) |
| AU (1) | AU2006278182A1 (pt) |
| BR (1) | BRPI0614294A2 (pt) |
| CA (1) | CA2618160A1 (pt) |
| DE (2) | DE102005037349A1 (pt) |
| WO (1) | WO2007017228A1 (pt) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2025000521A1 (zh) * | 2023-06-30 | 2025-01-02 | 清华大学 | 一种生长耦联的酵母定向进化筛选方法、装置及应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6562622B1 (en) * | 1998-05-08 | 2003-05-13 | Diatech Pty, Ltd | Continuous in vitro evolution |
| GB0022458D0 (en) * | 2000-09-13 | 2000-11-01 | Medical Res Council | Directed evolution method |
| FR2823219B1 (fr) * | 2001-04-10 | 2003-07-04 | Pasteur Institut | Mutants de la desoxycytidine kinase possedant une activite enzymatique elargie |
| WO2004039995A1 (en) * | 2002-11-01 | 2004-05-13 | Evogenix Pty Ltd | Mutagenesis methods using ribavirin and/or rna replicases |
| US20080199915A1 (en) * | 2003-06-06 | 2008-08-21 | Rna-Line Oy | Methods and Kits For Mass Production Of Dsrna |
-
2005
- 2005-08-08 DE DE102005037349A patent/DE102005037349A1/de not_active Withdrawn
-
2006
- 2006-08-07 BR BRPI0614294-0A patent/BRPI0614294A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-08-07 AU AU2006278182A patent/AU2006278182A1/en not_active Abandoned
- 2006-08-07 JP JP2008525457A patent/JP2009504144A/ja not_active Ceased
- 2006-08-07 US US11/917,957 patent/US20100151517A1/en not_active Abandoned
- 2006-08-07 DE DE502006004607T patent/DE502006004607D1/de active Active
- 2006-08-07 CN CNA2006800286286A patent/CN101238212A/zh active Pending
- 2006-08-07 CA CA002618160A patent/CA2618160A1/en not_active Abandoned
- 2006-08-07 EP EP06763002A patent/EP1913139B1/de not_active Not-in-force
- 2006-08-07 AT AT06763002T patent/ATE440136T1/de active
- 2006-08-07 WO PCT/EP2006/007797 patent/WO2007017228A1/de not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2006278182A1 (en) | 2007-02-15 |
| ATE440136T1 (de) | 2009-09-15 |
| CN101238212A (zh) | 2008-08-06 |
| DE102005037349A1 (de) | 2007-02-15 |
| DE502006004607D1 (de) | 2009-10-01 |
| EP1913139A1 (de) | 2008-04-23 |
| JP2009504144A (ja) | 2009-02-05 |
| WO2007017228A1 (de) | 2007-02-15 |
| US20100151517A1 (en) | 2010-06-17 |
| CA2618160A1 (en) | 2007-02-15 |
| EP1913139B1 (de) | 2009-08-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Recent advances in silent gene cluster activation in Streptomyces | |
| Robinson et al. | Origins of DNA replication in the three domains of life | |
| Davis et al. | Directing evolution: the next revolution in drug discovery? | |
| ES2316085T3 (es) | Procedimiento para la evolucion dirigida continua de proteinas in vitro. | |
| Martella et al. | EMMA: an extensible mammalian modular assembly toolkit for the rapid design and production of diverse expression vectors | |
| Lassila et al. | Assembly of robust bacterial microcompartment shells using building blocks from an organelle of unknown function | |
| Brautaset et al. | Positively regulated bacterial expression systems | |
| US12428633B2 (en) | Inducible dimerization of recombinases | |
| Pu et al. | Evolution of C‐terminal modification tolerance in full‐length and split T7 RNA Polymerase biosensors | |
| Selleck et al. | Recombinant protein complex expression in E. coli | |
| Bobonis et al. | Bacterial retrons encode tripartite toxin/antitoxin systems | |
| Ogawa et al. | Switching the ligand specificity of the biosensor XylS from meta to para-toluic acid through directed evolution exploiting a dual selection system | |
| Paterson et al. | Genetic analysis of the mobilization and leading regions of the IncN plasmids pKM101 and pCU1 | |
| Brinkman et al. | Interactions of the energy transducer TonB with noncognate energy-harvesting complexes | |
| Miller et al. | Regulation of the integration-excision reaction by bacteriophage λ | |
| EP1470224B1 (en) | Molecular libraries | |
| BRPI0614294A2 (pt) | métodos para efetuar a evolução seletiva de proteìnas in vivo | |
| Jewel et al. | Virus-assisted directed evolution of biomolecules | |
| Sen et al. | Sequence‐specific interaction of nascent antiterminator RNA with the zinc‐finger motif of Escherichia coli RNA polymerase | |
| Jayaram et al. | The 2μm plasmid of Saccharomyces cerevisiae | |
| Yuzenkova et al. | Mapping of RNA polymerase residues that interact with bacteriophage Xp10 transcription antitermination factor p7 | |
| Brown et al. | Directed evolution of the nonribosomal peptide synthetase BpsA to enable recognition by the human phosphopantetheinyl transferase for counter-screening antibiotic candidates | |
| Małachowska et al. | TECS: a toxin expression control strategy as a tool for optimization of inducible promoters | |
| Picard et al. | Allosteric regulation within the highly interconnected structural scaffold of AraC/XylS homologs tolerates a wide range of amino acid changes | |
| Weber et al. | Precise and Scarless Insertion of Transposable Elements by Cas9-Mediated Genome Engineering |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B11A | Dismissal acc. art.33 of ipl - examination not requested within 36 months of filing | ||
| B11Y | Definitive dismissal - extension of time limit for request of examination expired [chapter 11.1.1 patent gazette] |