BRPI0614419A2

BRPI0614419A2 - peptìdeos derivados de gdnf

Info

Publication number: BRPI0614419A2
Application number: BRPI0614419-5A
Authority: BR
Inventors: Elisabeth Bock; Vladimir Berezin
Original assignee: Copenhagen University
Priority date: 2005-08-16
Filing date: 2006-08-15
Publication date: 2011-03-29
Also published as: US20090221506A1; CN101287747A; EP1919933A2; ZA200802571B; US8138148B2; WO2007019860A2; JP2009504689A; WO2007019860A3; CA2619017A1; AU2006281798A1

Abstract

PEPTìDEOS DERIVADOS DE GDNF A presente invenção relaciona-se aos fragmentos de peptídeos derivados das proteínas pertencendo à superfamília do TGE-beta, composições farmacêuticas compreendendo os referidos fragmentos de peptídeos e usos dos mesmos para tratamento de uma doença ou condição em que os efeitos de estimulação da diferenciação celular neuronal, sobrevivência celular neuronal, estimulação da plasticidade neural associada com aprendizagem e memória e/ou inibindo a resposta inflamatória são benéficas para tratamento.

Description

"PEPTÍDEOS DERIVADOS DE GDNF"

Campos da Invenção

A presente invenção relaciona-se a fragmentos depeptideos derivados das proteínas pertencendo à superfamíliado TGF-beta, composições farmacêuticas compreendendo osreferidos fragmentos e usos dos mesmos para o tratamento deuma doença ou condição em que os efeitos da estimulação dadiferenciação celular neuronal, sobrevivência celularneuronal, estimulação da plasticidade neural associada comaprendizagem e memória e/ou inibição da respostainflamatória são beneficiadas para tratamento.

Antecedente da Invenção

GNDF foi originalmente purificado e caracterizadono início do da década 1990 como um fator neurotrófico quesuporta a sobrevivência e diferenciação dos neurôniosdopaminérgicos do mesencéfalo, e na base das seqüênciasaminoácidas do GDNF, foi possível ser clone do gene GDNF(Lin et al, 1993). Neurturina (NRTN, também conhecido comoNTN) foi isolado em 1996 baseados em sua habilidade depromover a sobrevivência de neurônios simpáticos (Kotzbaueret al, 1996). Subseqüentemente, persepina (PSPN, tambémconhecidos como PSP) e artemina (ARTN, também conhecido comoART), foram clonados na base da homologia de seqüência(Milbrandt et al, 1998; Baloh et al, 1998). Supostamente,análises da Base de Dados do Genoma têm indicado a uma outraforma de descobrir outra família de ligantes GDNF funcionais(Airaksinen & Saarma, 2002).

Uma variedade de ações biológicas tem sidorelacionada para os GFLs, NRTN, PSPN, e ARTN, tipo GDNF,como promover a sobrevivência dos neurônios dopaminérgicosdo mesencéfalo (Lin et al, 1993; Milbrandt et al, 1998;Baloh et al, 1998a). A sobrevivência de várias outrassubpopulações neuronais no SNC é suportada por GFLs,incluindo neurônios motores centrais (Milbrandt et al, 1998)e neurônios noradrenérgicos (Arenas et al, 1995). GDNF,NRTN, e ARTN também suporta a sobrevivência dos neurônios noSNP, incluindo simpático, parassimpático, sensório (Lotbaueret al, 1996; Baloh et al, 1998), e neurônios antéricos(Hearn et al, 1998). Em adição para sua sobrevivênciapromovendo efeitos, o GFLs também promove diferenciaçãoneuronal (Lin et al, 1993; Baloh et al, 1998a; Yan et al,2003; Paratcha et al, 2003).

Como típico para proteínas secretadas, os quatromembros da família GDNF são sintetizados como pré pró-formasinativas. 0 peptídeo sinal é quebrado da pré pró-forma deGDNF, e pró-GDNF é secretada. Quebra adicional torna a pró-GDNF em GDNF madura de 134 aminoácidos longos. NRTN maduracontém 100 aminoácidos, PSPN madura consiste de 96aminoácidos, e ARTN madura contém 113 aminoácidos (Kotzbaueret al, 1996; Milbrandt et al, 1998; Baloh et al, 1998). OsGFLs são quite homólogos, dividindo de 53 a 64% desimilaridade de seqüência. A identidade da(s) protease(s)quebrando os pró-GFLs de GFLs maduras tendo ainda serdeterminada.

As seqüências de quatro GFLs revelam a existênciade sete resíduos cisteína conservados dentro de proteínasmaduras. Esses resíduos são colocados em uma forma similarcomo os sete resíduos cisteína conservados encontrados emmembros da superfamília do fator transformante decrescimento (TGF)-β. Portanto, embora eles mostrem menor que20% de similaridade de seqüência com os outros membros dafamília, os GFLs são considerados serem membros dasuperfamília do TGF-β, constituindo sua própria subfamília(Lin et al, 1993; Kotzbauer et al, 1996; Milbrandt et al,199-8; Baloh et al, 1998). Todos os membros da superfamíliado TGF-β pertencem à cisteína nodal da superfamília do fatorde crescimento nodal (Saarma & Sariola, 1999). As proteínasnesta família são caracterizadas por serem proteínasdiméricas contendo um nodal topológico formado por trêsresíduos cisteína. Junto com dois aminoácidos adjacentesdesses resíduos cisteína formam um anel covalente, atravésdos quais a terceira cisteína passa.

Sítios de ligação GFRa possíveis em GDNF têm sidoinvestigados em dois estudos (Eket-jall et al, 1999; Balohet al, 2000). 0 primeiro estudo identificou três aminoácidoscarregados negativamente em dedo 1 e um dedo 2, que sãocríticos para ligação de GDNF para GFRal (Eketjall et al,1999). Esses resíduos são colocados na parte mais distai dosdedos, como são quatro aminoácidos hidrofóbicos (um no dedo1, o resto no dedo 2) também mostrou ser crucial paraligação do GDNF a GFRal. Em adição, a região N-terminalflexível do GDNF é indicada ser de importância para ligaçãoao GFRal. Em contraste, os aminoácidos positivamentecarregados concentrados em destilação, não parecem estarenvolvidos na ligação do GFRal (Eketjall et al, 1999).Surpreendentemente, nenhum dos resíduos identificados nodedo 2 ou nenhum dos resíduos hidrofóbicos no dedo 1 foramrequeridos para ligação do GDNF na presença de RET desdemoléculas GDNF mutadas nessas posições foram ainda capazesde induzir fosforilação de RET. Deleção da região N-terminalnão inibe também a fosforilação de RET. Os autorespropuseram a existência de dois sítios de ligação distintospara GDNF em GFRal. Um sítio de ligação consistindo dereceptores GFRal sozinhos podem ser utilizados para ligaçãode GDNF na ausência de RET, enquanto outro sítio de ligaçãoconsistindo de resíduos de GFRal e RET podem vir a uso,quando GDNF interage com um complexo GFRal-RET pré-associado(Eketlajj et al, 1999).

No estudo por Baloh et al (2000), foi encontradoque duas regiões no dedo 2 foram importantes para ativaçãoinduzida por GDNF de RET através de GFRal, onde o N-terminalflexível não foi requerido. Experimentos similares mostraramque as duas regiões correspondentes em NRTN e ARTN foramimportantes para a habilidade desses GFLs de ativar RETatravés de GFRa2 e GFRa3, respectivamente. Para NRTN e ARTN,regiões compreendendo a maior parte N-terminal da grande a-hélice foram também requeridas para ativação de RET (Balchet al, 2000).

Em resumo, a existência de mais que um sítioligante em GFLs está indicado de dois estudos, e embora elespareçam ter alguma discrepância a cerca de qual dedo é maisimportante, o trabalho de Eketjall et al (1999) e Baloh etal (2000) destaca a importância das regiões dedo na ligaçãode GDNF de seu complexo receptor e subseqüentemente ativaçãode RET.

O entendimento da interação entre NCAM e GDNF/GFRal é ainda muito limitado, mas estudos têm indicado queambos GDNF e GFRal ligam a NCAM, e que o ligante de NCAM aGDNF é grandemente potenciado em presença de GFRal (Paratchaet al, 2003). Além disso, no mesmo estudo foi sugerido que ocrescimento do neurito induzido por GDNF ocorreindependentemente do FGFR e provavelmente tambémindependentemente de interações trans NCAM homofilicas. Ainteração GDNF- GFRa-NCAM no fato pareceu interferir cominterações NCAM homofilicas (Paratcha et al, 2003).

Referências

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Balch RH, Tansey MG, Lampe PA, Fahmer TJ, EnomotoH, Simburger KS, Leitner ML, Araki T, Johnson EM Jr,Milbrandt J. Artemin, A novel member of the GDNF ligandfamily, supports peripheral and central neurons and signalsthrough the GFRa3-RET receptor complex. Neuron.1998;21:1291-302.

Baloh RH, Tansey MG, Johnson EM Jr, Milbrandt J.Functional mapping of receptor specificity domains of glialcell line-derived neurotrophic factor (GDNF) family ligandsand production of GFRal RET-specific agonists. J. Biol.Chem. 2000; 275:3412-20.

Eketjall S., Fainzilber M, Murray-Rust J, IbanezCF. Distinct structural elements in GDNF mediate binding toGFRal and activation of the GFRal-c-RET receptor complex.EMBO J. 1999 1; 18:5901-10.

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Kotzbauer PT, Lampe PA, Heuckeroth RO, Golden JP,Creedon DJ, Johnson EM Jr, Milbrandt J. Neuritin, a relativeog glial-cell-line-derived neurotrophic factor. Nature.1996; 384:467-70.

Lin LF, Doherty DH, Lile JD, Bektesh S, Collins F.GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor formidbrain dopaminergic neurons. Science. 1993; 260:1130-2.

Milbrandt J, de Sauvage FJ, Fahrner TJ, Baloh RH,Leitner ML, Tansey MG, Lampe PA, Heuckeroth RO, KotzbauerPT, Simburger KS, Golden JP, Davies JA, Vejsada R, Kato AC,Hynes M, Sherman D, Nishimura M, Wang LC, Vandlen R, MoffatB, Klein RD, Poulsen K, Gray C, Garces A, Johnson Em Jr, etal. Persephin, a novel neurotrophic factor related to GDNFand neurturin. Neuron. 1998; 20:245-53.

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Resumo da Invenção

A presente invenção revela fragmentos de peptideoscurtos de proteínas pertencendo a superfamília do TGF-beta,em particular GDNF, NRTN, PSPN, ARTN, TGF-beta 1, TGF-beta2, TGF-beta 3 e TGF-beta 4, capazes de estimular adiferenciação celular neuronal, sobrevivência celularneuronal e plasticidade neural associadas com aprendizagem ememória e capacidade de inibição da resposta inflamatória.

De acordo com a invenção, todos os fragmentos peptídicosdescritos aqui são estruturalmente similares, em outraspalavras eles compreendem um motivo aminoácido comum que éum pré-requisito para atividade biológica de peptideos.

Então, o primeiro aspecto da presente invençãorelaciona-se a um peptídeo tendo uma seqüência de 6 a 22resíduos aminoácidos contíguos compreendendo o motivo defórmula:

Xa- (X) -Xb-Xc-Xd-Xfem que

Xa é resíduo aminoácido D, Ε, A ou G,(x) é uma seqüência de 2-3 resíduos aminoácidos ouum resíduo aminoácido único selecionado do grupo consistindode resíduos aminoácidos A, D, E, G, I, K, L, P, Q. S. T e V,Xb é resíduo aminoácido Y ou H, ou um resíduoaminoácido hidrofóbico, e pelo menos um de Xc, Xd ou Xf é umresíduo aminoácido carregado ou hidrofóbico.

A invenção revela seqüências peptídicasparticulares derivadas de GDNF, NRTN, PSPN, ARTN, TGF-beta1, TGF-beta 2, TGF-beta 3 e TGF-beta 4, em que todoscompreendem o motivo do acima e são capazes de estimular adiferenciação celular neuronal, sobrevivência celularneuronal e/ou plasticidade neural associadas comaprendizagem e memória.

Adicionalmente, a invenção relaciona-se a umcomposto compreendendo uma seqüência peptídica do motivoacima, em particular um composto compreendendo uma seqüênciaderivada de GDNF, NRTN, PSPN, ARTN, TGF-beta 1, TGF- beta 2,TGF-beta 3 ou TGF-beta 4.

Então, a invenção relaciona-se a usos deseqüências peptídicas relvadas e compostos compreendendo asmesmas para a fabricação de um medicamento e/ou para aprodução de um anticorpo. A invenção também se relaciona ascomposições farmacêuticas compreendendo peptídeos, compostose/ou anticorpos da invenção.

Métodos de estimulação a diferenciação celular deneuritos, sobrevivência celular neuronal e/ou plasticidadeneuronal associada com aprendizagem e memória compreendendouso de peptídeos, compostos, anticorpos e/ou composiçõesfarmacêuticas da invenção estão também no objetivo daproteção, bem como métodos de tratamento compreendendo aadministração a um indivíduo em necessidade de umaquantidade efetiva de um peptídeo, composto, anticorpo oucomposição farmacêutica da invenção.

Descrição dos Desenhos

Figura 1: crescimento de neurito induzido por GDNFnos neurônios do hipocampo primário. Células foramestimuladas com GDNF (1, 5, 10, 50 e 100 mg/mL) por 24horas. Crescimento de neurônios no meio sozinho serviu comocontrole. Para o controle absoluto do comprimento docrescimento do neurito foram 11,65 μπι ± 1,57 μπι. Resultadossão expressos como porcentagem de controle e apresentadoscomo média±EP A figura é baseada nos resultados de 5experimentos independentes. A média do comprimento docrescimento do neurito foi comparada utilizando ANOVA defator único para medidas repetidas. F(5. 24) = 5,903,p<0,01, mostra que há um efeito do tratamento de GDNFestatisticamente significante geral.

Figura 2: Gl não induz crescimento de neurito nosneurônios do hipocampo primário. Células foram estimuladoscom (G1 (0,3, 1, 3, 9, e 27 μg/mL) por 24 horas. Neurônioscrescidos em meio sozinho serviram como controle. Paracontroles o crescimento absoluto do crescimento do neuritofoi 11,68 μπι ± 2,20 μπι (A) ou 11,00 μπι ± 0,94 μπι (Β).Resultados são expressos como porcentagem de controle eapresentados como média ± EP. A figura é baseada nosresultados de 5 (A) ou 4 (B) experimentos independentes. Asmédias do dos comprimentos de crescimento de neurito foramcomparadas utilizando ANOVA de fator único para medidasrepetidas. F(5, 24) = 0, 4873, p=0, 7823, mostra que o efeitogeral do tratamento Gl não é significativamente estatístico.

Figura 3: Crescimento de neurito induzido por G2nos neurônios do' hipocampo primário. Células foramestimuladas com G2 (0,1, 0,3, 1, 3, e 9 μg/mL) por 24 horas.

O crescimento de neurônios no meio sozinho serviu comocontrole. Para controles o crescimento absoluto docrescimento de neurito foi 11,50 μπι ± 2,20 μπ\. Resultadossão expressos como porcentagem de controle e apresentada1 como média ± EP. A figura é baseada nos resultados de 4experimentos independentes. A média dos comprimentos docrescimento de neuritos foi comparada utilizando ANOVA defator único para medidas repetidas. F(5( 13) = 91,91,p<0,0001, mostra que há um efeito estatístico significantegeral do tratamento G2. O efeito das concentraçõesindividuais de G2 foi comparado ao controle utilizando opós-teste com teste de comparações múltiplas Tukeys.

Figura 4: G3 não induz crescimento de neurito emneurônios do hipocampo primário. Células foram estimuladascom G3 (0,3, 1, 3, 9, e 27 μg/mL) por 24 horas. Neurônioscrescidos em meio sozinho serviram como controle. Paracontroles do crescimento absoluto do crescimento de neuritosfoi 11,68 μπι ± 2,20 μιη (A) ou 11,00 μπι ± 0,94 μπι (Β).Resultados são expressos com porcentagem de controle eapresentados como médias ± EP. A figura é baseada nosresultados de 5 (A) ou 4 (B) experimentos independentes. Amédia dos comprimentos de crescimento de neurito foicomparada utilizando ANOVA de fator único para medidasrepetidas. F(5/ ia) = 1,710, p=0, 1833, mostra que o efeitogeral do tratamento G3 não é estatisticamente significante.

Figura 0: crescimento do neurito induzido por GDNFno crescimento de neurônios do hipocampo em co-cultura comfibroblastos controles ou fibroblastos expressando NCAM.Neurônios foram crescidos em cima de ou fibroblastoscontroles (curva preta) ou fibroblastos expressando NCAM(curva vermelha) e estimulados com GDNF (1, 5, 10, 50, e 100ng/mL) por 24 horas. Crescimento de neurônios no meiosozinho serviu como controles. Resultados são expressos comoporcentagem de controle (neurônios não estimulados nosfibroblastos controles) e apresentado como média ± EP. Paracontroles no crescimento absoluto de fibroblastos controledo crescimento de neurito foi 38, 97 μτη ± 0,21 μπι. A figura ébaseada nos resultados de 4 experimentos independentes. Asmédias do comprimento do crescimento de neurito foramcomparadas utilizando ANOVAs de fator único separadas paramedidas repetidas. F(5/ i8) = 27, 33, p<0, 0001, mostra que temum efeito significante geral do tratamento de GDNF paracrescimento dos neurônios nos fibroblastos controles. F(5fi8)= 9,967, p<0,001 mostra que existe um efeito significantegeral de tratamento GDNF para crescimento de neurônios emfibroblastos expressando NCAM. O efeito das concentraçõesindividuais de GDNF foi comparado ao controle adequadoutilizando teste de comparações múltiplas Tukeys. * pretasindicam valores de ρ para comparação de crescimento decélulas não estimuladas em fibroblastos controles, enquantovermelho indica valores de ρ para comparação aocrescimento de células não estimuladas em fibroblastosexpressando NCAM. Os dois controles comparados utilizando umteste t pareado, que mostrou que eles são estatisticamentesignificantemente diferentes (valor de ρ indicado por +preta). Para cada concentração a diferença entre crescimentode neurito no crescimento de neurônios nos fibroblastoscontroles e no crescimento de neurônios nos fibroblastosexpressando NCAM foi calculado e expresso como porcentagemde controle (neurônios não estimulados em fibroblastoscontroles) (curva azul). ANOVA de fator único para medidas repetidas mostrou que as diferenças médias não são todas asmesmas (F(5, i8) = 5, 835, p<0,05). A diferença nasconcentrações individuais de GDNF foi comparada à diferençade dois controles adequados (o crescimento do neuritomediado por NCAM) utilizando o pós-teste com teste decomparações múltiplas de Tukeys. * azuis indicam valores de p.

Figura 6: Gl interfere com crescimento de neuritoinduzido por NCAM em crescimento de neurônios de hipocampoem co-cultura com fibroblastos controles ou fibroblastosexpressando NCAM (curva vermelha) e estimulada com Gl (0,3,1, 3, 9, 27 e 81 μg/mL) por 24 horas. Crescimento deneurônios em meio sozinho serviu como controles. Resultadossão expressos como porcentagens de controle (neurônios nãoestimulados nos fibroblastos controle) e apresentados comomédias ± EP. Para controles no comprimento absolutofibroblastos de controle de crescimento de neurito foram34, 64 μπι ± 0,63 μπι para. A figura é baseada nos resultadosde 4 experimentos independentes. As médias de comprimento decrescimento de neurito foram comparadas utilizando ANOVAs defator único separada para medidas repetidas. F (^r 15) —1,581, p=0,2422, mostra que não existe efeito significantegeral do tratamento de Gl para crescimento de neurônios nosfibroblastos controles. F(4, χ5) = 10,45, p<0,001 mostra queexiste um efeito significante estatístico geral dotratamento Gl para crescimento de neurônio nos fibroblastos1 expressando NCAM. Este efeito parece ser inibitório em altasconcentrações de Gl. 0 efeito das concentrações individuaisde Gl foi comparado ao controle adequado utilizando o pós-teste com teste de comparações múltiplas de Tukeys. *vermelhos indicam valores de ρ para comparação docrescimento de células não estimuladas em fibroblastosexpressando NCAM. Os dois controles foram comparadosutilizando um teste t pareado, que mostrou que eles sãoestatisticamente significante diferente (valor ρ indicadopor + preta). Para cada concentração a diferença entre ocrescimento de neurito no crescimento de neurôncios nosfibroblastos controles e em crescimento de neurônios nosfibroblastos expressando de NCAM foi calculado e expressocomo porcentagem de controle (neurônios não estimulados emfibroblastos controles) (curva azul). ANOVA de fator únicopara medidas repetidas mostraram que a média de diferençasnão são todos os mesmos (F(4i 15) = 3, 389, p<0,05). Adiferença em concentrações individuais de GDNFp2 foicomparada com a diferença de dois controles utilizando opós-teste com teste de comparações múltiplas de Tukeys. azuis indicam calores de p.

Figura 7: crescimento de neurito induzido por G2em crescimento de neurônios de hipocampo em co-cultura comfibroblastos controles ou fibroblastos expressando NCAM.Neurônios foram crescidos em cima de ou fibroblastoscontroles (curva preta) ou fibroblastos expressando NCAM(curva vermelha) e estimulado com (G2 (0,1, 0,3, 1, 3, e 9μς/mL) por 24 horas. Neurônios crescidos em meio sozinhoserviram como controles. Resultados são expressos comoporcentagem de controle (neurônios não estimulados emfibroblastos controles) e apresentados como médias ± EP.

Para controles no comprimento absoluto de fibroblastoscontroles do crescimento neurito foi 38, 74 μιη ± 0,47 μιηpara. A figura é baseada nos resultados de 4 experimentosindependentes. A média de comprimentos de crescimento deneurito foram comparadas utilizando ANOVAs de fator únicoseparados para medidas repetidas. F (5, ia) = 81.76, p<0, 0001,mostra que existe um efeito significante geral do tratamentoG2 para neurônios crescidos nos fibroblastos controles.F (5,18) = 176,6, p<0, 0001 mostra que existe um efeitosignificante geral do tratamento G2 para o crescimento dosneurônios em fibroblastos expressando NCAM. O efeito dasconcentrações individuais de G2 foi comparado ao controleadequado utilizando pós-teste com teste de comparaçõesmúltiplas de Tukeys. * pretos indicam valores de ρ paracomparação com o crescimento de células não estimuladas emfibroblastos controles, enquanto * vermelhos indicam valoresde ρ para comparação do crescimento de células nãoestimuladas em fibroblastos expressando NCAM. Os doiscontroles foram comparados utilizando um teste t pareado,que mostrou que eles são estatisticamente significantementediferentes (valores de ρ indicados por + preta) . Para cadaconcentração a diferença entre o crescimento do neurito nocrescimento de neurônios nos fibroblastos controles e emneurônios em fibroblastos expressando NCAM foram calculadose expressos como porcentagem de controle (neurônios nãoestimulados em fibroblastos controles) (curva azul). ANOVAde fator único para medidas repetidas mostrou que as médiasde diferenças não são todas as mesmas (F(5,i8) = 3,761, parap<0,05). A diferença nas concentrações individuais de GDNFou GDNFpl foi comparada para a diferença de dois controlesadequados (o crescimento de neurito mediada por NCAM)utilizando o pós-teste com teste de comparações múltiplas deTukeys. *azuis indicam valores de p.

Figura 8: G3 interfere com crescimento de neuritoinduzido por NCAM no crescimento neurônios de hipocampo emco-cultura com fibroblastos controles ou fibroblastosexpressando NCAM. Neurônios foram crescidos em cima de oufibroblastos controles (curva preta) ou fibroblastosexpressando NCAM (curva vermelha) e estimulado com G3 (0,3,1, 3, 9, 27 e 81 μg/mL) por 24 horas. Neurônios crescidos emmeio sozinho serviram como controles. Resultados sãoexpressos como porcentagem de controle (neurônios nãoestimulados em fibroblastos controles) e apresentados comomédias ± EP. Para controles no comprimento absoluto defibroblastos controles do crescimento neurito foram 34, 20 μιη±0,68 μιη. A figura é baseada nos resultados de 4experimentos independentes. A média de comprimentos decrescimento de neurito foram comparadas utilizando ANOVAs defator único separados para medidas repetidas. F(4, i5) =2,440, p<0,1039, mostra que não existe um efeitosignificante geral do tratamento GDNFp3 para neurônioscrescidos nos fibroblastos controles. F(4,i5) = 5, 967, p<0,01mostra que existe um efeito significante estatístico geraldo tratamento G3 para o crescimento dos neurônios emfibroblastos expressando NCAM. Este efeito parece serinibitório em concentrações mais altas de G3. O efeito dasconcentrações individuais de G3 foi comparado ao controleadequado utilizando pós-teste com teste de comparaçõesmúltiplas de Tukeys. * vermelhos indicam valores de ρ paracomparação com o crescimento de células não estimuladas emfibroblastos expressando NCAM. Os dois controles foramcomparados utilizando um teste t pareado, que mostrou queeles são estatisticamente significantemente diferentes(valores de ρ indicados por + preta). Para cada concentraçãoa diferença entre o crescimento do neurito no crescimento deneurônios nos fibroblastos controles e em crescimentos deneurônios em fibroblastos expressando NCAM foram calculadose expressos como porcentagem de controle (neurônios nãoestimulados em fibroblastos controles) (curva azul). ANOVAde fator único para medidas repetidas mostrou que as médiasde diferenças não são todas as mesmas (F(4,15)=1,314,p=0,3199). A diferença nas concentrações individuais deGDNFp2 foi comparada para a diferença de dois controlesutilizando o pós-teste com teste de comparações múltiplas deTukeys. *azuis indicam valores de p.

Figura 9: Envolvimento de NCAM no crescimento deneurito mediado por GDNF ou G2; Neurônios hipocampaistransfectados com cyt-NCAM-A, cyt-NCAM-B ou vetor vazioforam crescidos em fibroblastos controles e estimulados com10 ng/mL de GDNF ou 3 μς/mL de GDNFpl por 18 horas. Meiosozinho foi adicionado aos controles. **p<0,01, ***p<0,001.

Figura 10: Envolvimento de NCAM no crescimento deneurito mediado por GDNF ou G2. Neurônios hipocampaistransfectados com cyt-NCAM-A, cyt-NCAM-B ou vetor vazioforam crescidos em fibroblastos expressando NCAM eestimulados com 10 ng/mL de GDNF ou 3 μg/mL de GDNFpl por 18horas. Meio sozinho foi adicionado aos controles. **p<0,01,***p<0,001.

Figura 11: O inibidor PP2 Fyn-quinase diminui ocrescimento do neutrito induzido por GDNF nos neurônios dohipocampo. Neurônios foram crescidos em cima de oufibroblastos controles (curva preta) ou fibroblastosexpressando NCAM (curva vermelha). 10 ng/mL de GDNF foiutilizado para estimulação, e neurônios foram incubados comPP2 (0,2, 1, 5, e 25 μΜ) por 24 horas. Neurônios estimuladoscom GDNF, mas sem PP2 serviram como controles positivos.Crescimento de neurônios em meio sozinho serviram comocontroles negativos, e são indicados pelos círculos pretos evermelhos não conectados às curvas. Resultados são expressoscomo porcentagem de controle negativo (neurônios nãoestimulados nos fibroblastos controles) e apresentados comomédias ± EP. A figura é baseada nos resultados de 6experimentos independentes. A média dos comprimentos deneuritos foram comparadas utilizando ANOVAs de fator únicoseparados. *** e +++ p<0,001 quando comparados aos controlescorrespondentes.

Figura 12: 0 inibidor PP2 Fyn-quinase diminui ocrescimento do neutrito induzido por G2 nos neurônios dohipocampo. Neurônios foram crescidos em cima de oufibroblastos controles (curva preta) ou fibroblastosexpressando NCAM (curva vermelha). 3 μg/mL de G2 foiutilizado para estimulação, e neurônios foram incubados comPP2 (0,2, 1, 5, 25 e 100 μΜ para) por 24 horas. Neurôniosestimulados com G2, mas sem PP2 serviram como controlespositivos. Crescimento de neurônios em meio sozinho serviramcomo controles negativos, e são indicados pelos círculospretos e vermelhos não conectados às curvas. Resultados sãoexpressos como porcentagem de controle negativo (neurôniosnão estimulados nos fibroblastos controles) e apresentadoscomo médias ± EP. A figura é baseada nos resultados de 6experimentos independentes. A média dos comprimentos deneuritos foram comparadas utilizando ANOVAs de fator únicoseparados. *** e +++ p<0,001 ou ++++ p<0,0001 quandocomparados aos controles correspondentes.

Figura 13: 0 inibidor de FGFR SU5402 diminui ocrescimento do neurito induzido por GDNF nos neurônios dohipocampo. Neurônios foram crescidos em cima de oufibroblastos controles (curva preta) ou fibroblastosexpressando NCAM (curva vermelha). 10 ng/mL de GDNF foiutilizado para estimulação, e neurônios foram incubados comSU5402 (1, 5, e 25 μΜ) . Neurônios estimulados com GDNF, massem SU5402 serviram como controles positivos. Neurônioscrescidos em meio sozinho serviram como controles negativos,e são indicados pelos círculos pretos e vermelhos nãoconectados às curvas. Resultados são expressos comoporcentagem de controle negativo (neurônios não estimuladosnos fibroblastos controles) e apresentados como médias ± EP.

As médias de comprimento do crescimento de neurito foramcomparadas utilizando ANOVAs de fator único. * pretasindicam valores de para comparação ao crescimento docontrole positivo nos fibroblastos controles, enquanto *vermelhos indicam valores de ρ para comparação com ocrescimento do controle positivo nos fibroblastosexpressando NCAM. Os dois controles negativos foramcomparados utilizando um teste t pareado, que mostrou queeles são estatisticamente significantemente diferentes(valor de ρ indicado por + preta).

Figura 14: 0 inibidor de FGFR SU5402 diminui ocrescimento do neurito induzido por G2 nos neurônios dohipocampo. Neurônios foram crescidos em cima de oufibroblastos controles (curva preta) ou fibroblastosexpressando NCAM (curva vermelha). 3 μg/mL de GDNFpl foiutilizado para estimulação, e neurônios foram incubados comSU5402 (1, 5, 25, e 100 μΜ para) por 24 horas. Neurôniosestimulados com G2, mas sem SU5402 serviram como controlespositivos. Neurônios crescidos em meio sozinho serviram comocontroles negativos, e são indicados pelos círculos pretos evermelhos não conectados às curvas. Resultados são expressoscomo porcentagem de controle negativo (neurônios nãoestimulados ou fibroblastos controles) e apresentados comomédias ± SEM. As médias de comprimento do crescimento deneurito foram comparadas utilizando ANOVA de fator único. 0efeito de concentrações individuais de SU5402 foi comparadoao controle positivo utilizando pós-teste com teste decomparações múltiplas de Tukeys. * pretas indicam valores depara comparação ao crescimento do controle positivo nosfibroblastos controles, enquanto * vermelhos indicam valoresde ρ para comparação com o crescimento do controle positivonos fibroblastos expressando NCAM. Os dois controlesnegativos foram comparados utilizando um teste t pareado,que mostrou que eles são estatisticamente significantementediferentes (valor de ρ indicado por + preta).

Figura 15: Transfecção com FGFR dominante negativodiminui crescimento de neurito mediada por GDNF ou G2.Neurônios do hipocampo transfectados com dnFGFR, wtFGFR ouvetor vazio foram crescidos nos fibroblastos controles eestimulados com 10 ng/mL de GDNF ou 3 μg/mL de GDNFpl por 18horas. Médio sozinho foi adicionado aos controles. A figuraé baseada em resultados de 5 experimentos independentes.Avaliação estatística foi feita por aplicação do teste tpareado. *p< 0,05 e *** p< 0,001, quando comparado aoscontroles correspondentes.

Figura 16: Transfecção com FGFR dominante negativodiminui crescimento de neurito mediada por GDNF ou G2.Neurônios do hipocampo transfectados com dnFGFR, wtFGFR ouvetor vazio foram crescidos nos fibroblastos expressandoNCAM e estimulados com 10 ng/mL de GDNF ou 3 μg/mL de GDNFplpor 18 horas. Médio sozinho foi adicionado aos controles. Afigura é baseada em resultados de 5 experimentosindependentes. Avaliação estatística foi feita por aplicaçãodo teste t pareado. *p< 0,05, ** p< 0,01 e ***p<0,001,quando comparado aos controles correspondentes.

Figura 17: Efeito da artemina no crescimento doneurito de neurônios granulares cerebelares (CGN). *p<0,05,quando comparado ao controle não tratado.

Figura 18: Efeito do peptídeo Al no crescimento doneurito de CGN. *p<0,05 e **p<0,01, quando comparado aocontrole não tratado.

Figura 19: Efeito do peptídeo A2 no crescimento doneurito de CGN. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, e****p<0,0001, quando comparado ao controle não tratado.

Figura 20: Efeito do peptídeo A3 no crescimento doneurito de CGN. ***p<0,001, e ****p<0,0001, quando comparadoao controle não tratado.

Figura 21j_ Efeito de neurturina no crescimento doneurito de CGN. *p<0,05 e **p<0,01, quando comparado aocontrole não tratado.

Figura 22: Efeito do peptídeo Nl no crescimento doneurito de CGN. *p<0,05, quando comparado ao controle nãotratado.

Figura 23: Efeito do peptideo N2 no crescimento doneurito de CGN. *p<0,05 e p<0, 0001, quando comparado aocontrole não tratado.

Figura 24: Efeito do peptideo N3 no crescimento doneurito de CGN. *p<0,05, quando comparado ao controle nãotratado.

Figura 25: Efeito de um peptideo derivado de GDNF,Gah (SEQ ID NO:9; ET-TYDKILKNLSRNR), na sobrevivência deneurônios dopaminérgicos. Diagrama indica que Gah aumentar asobrevivência de neurônios dopaminérgicos.

C3d é um controle positivo (o peptideo que estáaumentado na sobrevivência de neurônios dopaminérgicos, verDittlevsen et al, J. Neurochem., 2003).

Figura 26: Análise de ligação por ressonância deplasmon de superfície (SPR). Ligação de um peptideo derivadode GDNF, Gah (SEQ ID NO:9 ETTYDKILKNLSRNR) , para os módulosIgl-2 de NCAM. Resultados indicam que o peptideo Gah éprovavelmente parte do sítio de ligação do GDNF para amolécula de adesão celular neural (NCAM).

Figura 27: Análise de ligação por ressonância deplasmon de superfície (SPR) . SPR mostra a ligação de umpeptideo derivado de GDNF, Gah (SEQ ID NO: 9ETTYDKILKNLSRNR), para o receptor GFRal.

Figura 28: Análise de ligação por ressonância deplasmon de superfície (SPR). A figura mostra a ligação dopeptideo derivado de GDNF, Gi (SEQ ID NO:16 DDLSFLDDNLVY),para o receptor GFRal.Figura 29: Efeito de um peptideo derivado deartemina, ArtGah (SEQ ID NO:10, RSPHDLSLASLLGAG), nasobrevivência de neurônios granulares cerebelares (CGN).Diagrama indica que ArtGah aumenta a sobrevivência de CGNs.

Figura 30: Efeito de um peptideo derivado deartemina, ArtGg (SEQ ID NO:2, VPVRALGLGHRSDEL), nasobrevivência de neurônios granulares cerebelares (CGN).Diagrama indica que ArtGg aumenta a sobrevivência de CGNs.

Figura 31: Efeito de um peptideo derivado deartemina, ArtGi (SEQ ID NO: 17, EAVSFMDVNSTWR) , nasobrevivência de neurônios granulares cerebelares (CGN).Diagrama mostra que ArtGi aumenta a sobrevivência de CGNs.

Figura 32: Efeito de um peptideo derivado deneurturina, NeuGg (SEQ ID NO:3, VRVSELGLGYASDET), nasobrevivência de neurônios granulares cerebelares (CGN).Diagrama mostra que NeuGg aumenta a sobrevivência de CGNs.

Figura 33: Efeito de um peptideo derivado deneurturina, NeuGi (SEQ ID NO:18, DEVSFLDAHSRY), nasobrevivência de neurônios granulares cerebelares (CGN).Diagrama mostra que NeuGi aumenta a sobrevivência de CGNs.

Figura 34: Análise de ligação por ressonância deplasmon de superfície (SPR). A figura mostra a ligação dopeptideo derivado de neurturina, NeuGah (SEQ ID NO:11VYDLGLRRLRQRR), para os receptores GFRa.

Figura 35: Análise de ligação por ressonância deplasmon de superfície (SPR). A figura mostra a ligação dopeptideo derivado de neurturina, NeuGg (SEQ ID NO:3VRVSELGLGYASDET), para os receptores GFRa.Figura 36: Análise de ligação por ressonância deplasmon de superfície (SPR). A figura mostra a ligação dopeptídeo derivado de neurturina, NeuGi (SEQ ID NO: 18DEVSFLDAHSRY), para os receptores GFRa.

Figura 38: Análise de ligação por ressonância deplasmon de superfície (SPR). A figura mostra a ligação de umpeptídeo derivado de artemina, ArtGi (EAVSFMDVNSTWR), paraos receptores GFRa.

Descrição Detalhada da Invenção

Seqüências Peptídicas

Primeiro aspecto da invenção relaciona-se a umpeptídeo tendo uma seqüência de 6 a 22 resíduos aminoácidoscontíguos compreendendo o motivo:

Xa- (X) -Xb-Xc-Xd-Xf

em que

Xa é resíduo aminoácido D, Ε, A ou G,(x) é uma seqüência de 2-3 resíduos aminoácidos ouum resíduo aminoácido único selecionado do grupo consistindode resíduos aminoácidos A, D, E, G, I, K, L, P, Q. S. T e V,

Xb é resíduo aminoácido Y ou H, ou um resíduoaminoácido hidrofóbico, e pelo menos um de Xe, Xd ou Xf é umresíduo aminoácido carregado ou hidrofóbico.

De acordo com a invenção, em uma modalidadepreferida Xa pode ser um resíduo aminoácido acídico, porexemplo, E ou D. Em outra modalidade preferida Xa pode ser Aou G.

Em algumas modalidades a posição (x) do motivoacima pode preferivelmente ser ocupada por uma seqüência dequaisquer dois resíduos aminoácidos, em que uma seqüênciapreferida é uma seqüência de qualquer dois dos seguintesresíduos L, G, A, S, Τ, K ou I, em que as seqüências L-G, L-A, L-S, T-Q, T-T ou K-I são mais preferidos.

Em outra(s) modalidade(s) pode(m) ser umaseqüência de quaisquer três resíduos aminoácidos,preferivelmente os resíduos selecionados de L, G, A, S, T,Κ, I, em que mais preferida é a seqüência L-X-G, X sendoqualquer resíduo aminoácido, e a mais preferida seqüência éL-Q-G.

Em ainda outras modalidades (x) pode serrepresentado por qualquer resíduo aminoácido único,preferivelmente um resíduo aminoácido carregado ouhidrofóbico. Mais preferivelmente o resíduo aminoácido podeser selecionado de D, Ε, A, V ou P.

0 resíduo na posição Xb do motivo acima em umamodalidade preferida pode ser A, L, V ou W. Em outramodalidade preferida Xb por ser H. Ainda em outra modalidadepreferida Xb pode ser Y.

De acordo com a invenção Xc, Xd ou Xf pode serindependentemente qualquer resíduo aminoácido, entretanto, épreferido que pelo menos um de Xc, XtJ ou Xf é selecionado deum resíduo aminoácido carregado ou hidrofóbico. Emparticular, um resíduo carregado ou hidrofóbico é preferidona posição Xf, em que entre os resíduos hidrofóbicos,resíduos A, I, V, L ou M são mais preferidos, e entre oscarregados são mais preferidos os resíduos R, E ou D.

A invenção ainda relaciona-se a um peptídeocompreendendo uma seqüência aminoácida de fórmulaX1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10em que

X1 é um resíduo aminoácido selecionado de D, A, Eou H,

X2 é um resíduo aminoácido selecionado de L, G, T,D, A, Ε, V ou P,

X3 é um resíduo aminoácido selecionado de G, Q, I,S, G, L, Τ, V ou A,

X4 é um resíduo aminoácido selecionado de L, W, G,

A, Υ, H, S, F, P ou T,

X5 um resíduo aminoácido selecionado de G, Κ, M, A,R, L, S, F ou I,

X6 um resíduo aminoácido selecionado de Υ, H, W, K,N, S, R, A, M, L, D ou V,

X7 é um resíduo aminoácido selecionado de E, R, A,I, V, W, L, D ou Y,

X8 é um resíduo aminoácido selecionado de T, S, H,L, R, D, V, A ou Y,X9 é um resíduo aminoácido selecionado de K, D, E,

R, G, Q, A, S, Ν, Η, V ou I,

X10 é um resíduo aminoácido selecionado de Ε, Ρ, N,A, R, G, L ou S,

em que a referida seqüência aminoácida estácompreendida no motivo conforme descrito acima.

Um peptídeo compreendendo a seqüência aminoácidaacima é preferivelmente 10 a 22 resíduos aminoácidos decomprimento, ou um fragmento das mesmas compreendendo pelomenos 6 resíduos aminoácidos compreendendo o motivo dainvenção. De acordo com a invenção tal seqüência aminoácidapreferivelmente compreende uma seqüência selecionada dasseguintes seqüências:

LNVTDLGLGYETKEE (SEQ ID N0:1)

VPVRALGLGHRSDEL (SEQ ID NO:2)

VRVSELGLGYASDET (SEQ ID NO:3)

LSVAELGLGYASEEK (SEQ ID NO:4)

IDFRKDLGWKWIHEPKG (SEQ ID NO:5)

IDFKRDLGWKWIHEPKG (SEQ ID NO:6)

IDFRQDLGWKWVHEPKG (SEQ ID NO:7)

IDLQGMKWAKNWVLEPPG (SEQ ID NO:8)

ETTYDKILKNLSRNR (SEQ ID NO: 9) RSPHDLSLASLLGAG (SEQ ID NO: 10) ARVYDLGLRRLRQRR (SEQ ID NO: 11) RTQHGLALARLQGQG (SEQ ID NO: 12) WSLDTQYSKVLALYN (SEQ ID NO: 13) WSSDTQHSRVLSLYN (SEQ IS NO: 14) RSADTTHSTVLGLYN (SEQ ID NO: 15) DDLSFLDDNLVY (SEQ ID NO: 16) EAVSFMDVNSTW (SEQ ID NO: 17) DEVSFLDAHSRY (SEQ ID NO: 18) DVAFLDDRHRWQ (SEQ ID NO: 19) EPLPIVYYVGRK (SEQ ID NO: 20) EPLTILYYIGKT (SEQ ID NO: 21) ou EPLTILYYVGRT (SEQ ID NO: 22)

Em algumas modalidades preferidas o peptídeo podecompreender uma das seguintes seqüências:LNVTDLGLGYETKEE (SEQ ID N0:1)

VPVRALGLGHRSDEL (SEQ ID NO:2)

VRVSELGLGYASDET (SEQ ID NO:3) ou

LSVAELGLGYASEEK (SEQ ID NO:4), ou fragmento dasmesmas,

Em outras modalidades preferidas o peptideo podecompreender uma das seguintes seqüências:

IDFRKDLGWKWIHEPKG (SEQ ID NO: 5)

IDFKRDLGWKWIHEPKG (SEQ ID NO:6)

IDFRQDLGWKWVHEPKG (SEQ ID NO:7) ou

IDLQGMKWAKNWVLEPPG (SEQ ID NO:8), ou um fragmentodas mesmas.

Em outras modalidades preferidas o fragmento podecompreender uma das seguintes seqüências:

ETTYDKILKNLSRNR (SEQ ID NO: 9)

RSPHDLSLASLLGAG (SEQ ID NO:10)

ARVYDLGLRRLRQRR (SEQ ID NO:11) OU

RTQHGLALARLQGQG (SEQ ID NO:12), ou um fragmentodos mesmos.

Em ainda outras modalidades preferidas o fragmentopode compreender uma das seguintes seqüências:

WSLDTQYSKVLALYN (SEQ ID NO:13)

WSSDTQHSRVLSLYN (SEQ IS NO:14) ou

RSADTTHSTVLGLYN (SEQ ID NO:15), ou fragmentos dosmesmos.

Em ainda outras modalidades preferidas o peptideopode compreender uma das seguintes seqüências:

DDLSFLDDNLVY (SEQ ID NO:16)EAVSFMDVNSTWR (SEQ ID NO:17)

DEVSFLDAHSRY (SEQ ID NO:18) ou

DVAFLDDRHRWQ (SEQ ID NO:19), ou um fragmento dosmesmos.

Algumas modalidades podem preferivelmente tratarde peptideo que compreende uma das seguintes seqüências:

EPLPIVYYVGRK (SEQ ID NO:20)

EPLTILYYIGKT (SEQ ID NO:21) ou

EPLTILYYVGRT (SEQ ID NO:22), ou um fragmento dosmesmos.

Em algumas modalidades preferidas a invençãotratar de um peptideo que compreende as seqüências:

VPVRALGLGHRSDEL (SEQ ID NO:2)

VRVSELGLGYASDET (SEQ ID NO:3)

ETTYDKILKNLSRNR (SEQ ID NO:9)

RSPHDLSLASLLGAG (SEQ ID NO:10)

ARVYDLGLRRLRQRR (SEQ ID NO:11)

DDLSFLDDNLVY (SEQ ID NO:16)

EAVSFMDVNSTWR (SEQ ID NO:17)

DEVSFLDAHSRY (SEQ ID NO:18).

Como já mencionado acima, peptideos da invençãocompreendem de 6 a 22 resíduos aminoácidos contíguos.Entretanto, o comprimento de um peptideo pode serpreferivelmente selecionado, por exemplo, na variação de 6 a10 resíduos aminoácidos, tais como 7 a 9 resíduosaminoácidos, ou na variação de 11 a 15 resíduos aminoácidos,tal como, por exemplo, 12 a 14 resíduos aminoácidos. Ocomprimento de um peptideo pode também ser na variação de 16a 20 resíduos aminoácidos, por exemplo, 17 a 19 resíduosaminoácidos. Ele também pode ser de 21 a 22 resíduosaminoácidos.

Por exemplo, em uma modalidade preferida opeptídeo pode ser uma seqüência de 18 resíduos aminoácidos.Então, uma seqüência de 18 resíduos aminoácidos preferida dainvenção é a seqüência IDLQGMKWAKNWVLEPPG (SEQ ID NO:8).

Em outra modalidade preferida o peptídeo pode seruma seqüência de 17 resíduos aminoácidos. Neste caso, umaseqüência de 17 resíduos aminoácidos pode ser selecionadadas seguintes seqüências aminoácidas:

IDFRKDLGWKWIHEPKG (SEQ ID NO:5)

IDFKRDLGWKWIHEPKG (SEQ ID NO:6) ou

IDFRQDLGWKWVHEPKG (SEQ ID NO:7).

Ainda, em outra modalidade preferida o peptídeopode ser uma seqüência de 15 resíduos aminoácidos. Talseqüência pode ser preferível selecionada das seguintesseqüências:

LNVTDLGLGYETKEE (SEQ ID NO: :1)VPVRALGLGHRSDEL (SEQ ID NO: :2)VRVSELGLGYASDET (SEQ ID NO: :3)LSVAELGLGYASEEK (SEQ ID NO: :4)ETTYDKILKNLSRNR (SEQ ID NO: :9)RSPHDLSLASLLGAG (SEQ ID NO: : 10)ARVYDLGLRRLRQRR (SEQ ID NO: : 11)RTQHGLALARLQGQG (SEQ ID NO: : 12)WSLDTQYSKVLALYN (SEQ ID NO: : 13)WSSDTQHSRVLSLYN (SEQ IS NO: :14) ouRSADTTHSTVLGLYN (SEQ ID NO:15).

Ainda, em outra modalidade preferida o peptídeopode ser uma seqüência de 12 resíduos aminoácidos. Talpeptídeo pode ser preferivelmente selecionado para formar asseguintes seqüências:

DDLSFLDDNLVY (SEQ ID NO:16)EAVSFMDVNSTWR (SEQ ID NO:17)DEVSFLDAHSRY (SEQ ID NO:18)DVAFLDDRHRWQ (SEQ ID NO:19)EPLPIVYYVGRK (SEQ ID NO:20)

EPLTILYYIGKT (SEQ ID NO:21) ouEPLTILYYVGRT (SEQ ID NO:22).

Conseqüentemente, um peptídeo consistindo dequalquer das seguintes seqüênciasLNVTDLGLGYETKEE (SEQ ID NO:l)

VPVRALGLGHRSDEL (SEQ ID NO:2)VRVSELGLGYASDET (SEQ ID NO:3)LSVAELGLGYASEEK (SEQ ID NO:4)IDFRKDLGWKWIHEPK (SEQ ID NO:5)IDFKRDLGWKWIHEPKG (SEQ ID NO:6)

IDFRQDLGWKWVHEPKG (SEQ ID NO:7)IDLQGMKWAKNWVLEPPG (SEQ ID NO:8)ETTYDKILKNLSRNR (SEQ ID NO: 9)RSPHDLSLASLLGAG (SEQ ID NO:10)ARVYDLGLRRLRQRR (SEQ ID NO:11)

RTQHGLALARLQGQ (SEQ ID NO:12)WSLDTQYSKVLALYN (SEQ ID NO:13)WSSDTQHSRVLSLYN (SEQ IS NO:14)RSADTTHSTVLGLYN (SEQ ID NO:15)DDLSFLDDNLVY (SEQ ID NO:16)EAVSFMDVNSTWR (SEQ ID NO:17)DEVSFLDAHSRY (SEQ ID NO:18)DVAFLDDRHRWQ (SEQ ID NO:19)

EPLPIVYYVGRK (SEQ ID NO:20)EPLTILYYIGKT (SEQ ID NO:21) ouEPLTILYYVGRT (SEQ ID NO:22)

é uma das modalidades preferidas da invenção.

No presente pedido o código de uma letra padrãopara resíduos aminoácidos é aplicado bem como o código detrês letras padrão. Abreviações para aminoácidos são deacordo com as recomendações em IUPAC-IUB Joint Commission onBiochemical Nomenclature Eur. J. Biochem., 1984, vol. 184,pp 9-37. Através da descrição e reivindicações ou o códigode três letras ou o código de uma letra para aminoácidosnaturais são utilizados. Onde a forma L ou D não tenha sidoespecificada ela é para ser entendida que o aminoácido emquestão tem a forma natural L, cf. Purê & Appl. Chem. Vol.(56(5) pp 595-624 (1984) ou a forma D, a fim de que ospeptídeos formados possam ser constituídos de aminoácidos deforma L, forma D, ou uma seqüência de formas L e formas Dmisturadas).

Onde nada é especificado é para ser entendido queo aminoácido C-terminal de um peptídeo da invenção existecomo um ácido \carboxilico livre, este pode também serespecificado como "-0H". Entretanto, o aminoácido C-terminalde um composto da invenção pode ser o derivado aminado, queé indicado como "-NH2". Onde nada mais é declarado oaminoácido N-terminal de um polipeptideo compreende um grupoamino livre, este pode também ser especificado como wH-".

Onde nada mais é especificado aminoácido pode serselecionado de qualquer aminoácido, se de ocorrência naturalou não, tal como alfa aminoácidos, beta aminoácidos, e/ougama aminoácidos. Conseqüentemente, o grupo compreende masnão é limitado a: Ala, Vai, Leu, He, Pro, Phe, Trp, Met,Gly, Ser, Thr, Cys, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His Aib,Nal, Sar, Irn, análogos de Lisina, DAP, DAPA e 4Hyp.

Também, de acordo com a invenção as modificaçõesdos compostos/peptideos podem ser feitas, tais como, porexemplo, glicosilação e/ou acetilação de aminoácidos.

Resíduos aminoácidos básicos são de acordo com ainvenção representados pelos resíduos de aminoácidos Arg,Lys, e His, resíduos aminoácidos acídicos - pelos resíduosde aminoácidos Glu e Asp. Resíduos aminácidos básicosconstituem um grupo de resíduos aminoácidos carregados. 0grupo de resíduos aminoácidos hidrofóbicos é representadopelos resíduos de aminoácidos Leu, lie, Vai, Ohe, Trp, Tyr,e Met.

Em uma modalidade variante pode ser entendido comoseqüências aminoácidas exibindo gradualmente divergindo daseqüência pré-determinada preferida, como o número efinalidades de inserções, deleções e substituições incluindosubstituições conservativas aumentadas. Esta diferença émedida como uma redução na homologia entre a seqüência pré-determinada e o variante.A invenção relaciona-se a seqüência depeptideo/fragmentos de ocorrência natural, preparadossinteticamente/recombinante, e/ou seqüência de peptídeo/fragmentos preparados por meios de clivagemenzimática/química de um polipeptideo maior, em que areferida seqüência de peptideo/fragmentos são partesintegrais dos referidos polipeptideos maiores. A invençãorelaciona-se a seqüências peptidicas individuais isoladas.

A invenção também se relaciona às variantes deseqüências de peptideos descritas acima.

Em um aspecto o temo "variante de uma seqüênciapeptídica" significa que os peptideos podem ser modificados,por exemplo, por substituição de um ou mais resíduosaminoácidos. Ambos os aminoácidos L-aminoácidos e D-aminoácidos pode ser utilizados. Outra modificação podecompreender derivados de tais ésteres, açúcares etc.Exemplos são metil e acetil ésteres.

Em outro aspecto, variantes dos fragmentos depeptideos de acordo com a invenção podem compreender, dentroda mesma variante, ou fragmentos dos mesmos ou entrevariantes diferentes, ou fragmentos dos mesmos, pelo menosuma substituição, tal como uma pluralidade de substituiçõesintroduzidas independentemente de uma outra. Variantes docomplexo, ou fragmentos dos mesmos podem então compreendersubstituições conservativas independentemente de uma outra,em que pelo menos uma glicina (Gly) do referido variante, oufragmentos dos mesmos é substituído com um aminoácidoselecionado do grupo de aminoácidos consistindo de Ala, Vai,Leu, e lie, e independentemente os mesmos, variantes, oufragmentos dos mesmos, em que pelo menos uma alanina (Ala)dos referidos variantes, ou fragmentos dos mesmos ésubstituído com um aminoácido selecionado do grupo deaminoácidos consistindo de GLy, Vai, Leu, e lie, eindependentemente dos mesmos, variantes, ou fragmentos dosmesmos, em que pelo menos uma valina (Val) do referidovariante, ou fragmentos dos mesmos é substituído com umaminoácido selecionado do grupo de aminoácidos consistindode Gly, Ala, Leu, e lie, e independentemente dos mesmos,variantes, ou fragmentos dos mesmos, em que pelo menos umaleucina (Leu) do referido variante, ou fragmentos dos mesmosé substituído com um aminoácido selecionado do grupo deaminoácidos consistindo de Gly, Ala, Vai, e lie, eindependentemente dos mesmos, variantes, ou fragmentos dosmesmos, em que pelo menos uma isoleucina (Ile) dos referidosvariantes, ou fragmentos dos mesmos é substituído com umaminoácido selecionado do grupo de aminoácidos consistindode Gly, Ala, Val e Leu, e independentemente dos mesmos,variantes, ou fragmentos dos mesmos em que pelo menos umácido aspártico (Asp) do referido variante, ou fragmentosdos mesmos é substituído com um aminoácidos selecionado dogrupo de aminoácidos consistindo de GLu, Asn, e Gln, eindependentemente dos mesmos, variantes, ou fragmentos dosmesmos, em que pelo menos uma asparagina (Asn) dos referidosvariantes, ou fragmentos dos mesmos é substituído com umaminoácido selecionado do grupo de aminoácidos consistindode Asp, Glu, e Gln, e independentemente dos mesmos,variantes, ou fragmentos dos mesmos, em que pelo menos umaglutamina (Gln) dos referidos variantes, ou fragmentos dosmesmos é substituído com um aminoácido selecionado do grupode aminoácidos consistindo de Asp, Glu, e Asn, e em que pelomenos uma fenilalanina (Phe) dos referidos variantes, oufragmentos dos mesmos é substituída com um aminoácidoselecionado do grupo de aminoácidos consistindo de Tyr, Trp,His, Pro, e preferivelmente selecionados do grupo deaminoácidos consistindo de Tyr e Trp, e independentementedos mesmos, variantes, ou fragmentos dos mesmos, em que pelomenos uma tirosina (Tyr) dos referidos variantes, oufragmentos dos mesmos é substituído com um aminoácidoselecionado do grupo de aminoácidos consistindo de Phe, Trp,His, Pro, preferivelmente um aminoácido selecionado do grupode aminoácidos consistindo de Phe e Trp, e independentementedos mesmos, variantes, ou fragmentos dos mesmos, em que pelomenos uma arginina (Arg) do referido fragmento é substituídocom um aminoácido selecionado do grupo de aminoácidosconsistindo de Lys e His, e independentemente dos mesmos,variantes, ou fragmentos dos mesmos, em que pelo menos umalisina (Lys) dos referidos variantes, ou fragmentos dosmesmos é substituído com um aminoácido selecionado do grupode aminoácidos consistindo de Arg e His, e independentementedos mesmos, variantes, ou fragmentos dos mesmos, eindependentemente dos mesmos, variantes, ou fragmentos dosmesmos, e em que pelo menos uma prolina (Pro) dos referidosvariantes, ou fragmentos dos mesmos é substituído com umaminoácido selecionado do grupo de aminoácidos consistindode Phe, Tyr, Trp, e His, e independentemente dos mesmos,variantes, ou fragmentos dos mesmos, em que pelo menos umacisteina (Cys) dos referidos variantes, ou fragmentos dosmesmos é substituído com um aminoácido selecionado do grupode aminoácidos consistindo de Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn,Gln, Ser, Thr, e Tyr.

Outros critérios para um variante de uma seqüênciade peptídeo são discutidos abaixo.

É então seguido do acima que o mesmo equivalentefuncional de um fragmento peptídeo, ou fragmento do referidoequivalente funcional compreende mais que uma substituiçãoaminoácida conservativa de mais que um grupo de aminoácidosconservativos como definido aqui acima. O termo"substituição aminoácida conservativa" é utilizadosinonimamente aqui como o termo "substituição aminoácidahomóloga".

Os grupos de aminoácidos conservativos são como osseguintes:

P, A, G (neutro, fracamente hidrofóbico) ,

S, T (neutro, amina ácida)

Q, N (hidrofílica, amina ácida)

E, D (hidrofílica, acídica)

Η, K, R (hidrofílica, básica)

A, L, I, V, M, F, Y, W (hidrofóbica, aromática)

C (formando uma ligação cruzada)

Substituições conservativas podem ser introduzidasem qualquer posição de um peptídeo pré-determinado preferidoda invenção ou fragmento do mesmo. Este pode, entretanto serdesejável introduzir substituições não conservativas,particularmente, mas não limitados a, substituição nãoconservativa em qualquer uma ou mais posições.

Uma substituição não conservativa levando aformação de um fragmento equivalente funcionalmente dopeptideo da invenção pode, por exemplo, i) diferirsubstancialmente em polaridade, por exemplo, um resíduo comuma cadeia lateral não polar (Ala, Leu, Pro, Trp, Vai, lie,Leu, Phe ou Met) substituído por um resíduo com uma cadeialateral polar tal como Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, ou Glnou um aminoácido carregado tal como Asp, Arg, ou Lys, ousubstituindo um resíduo carregado ou um resíduo polar por umnão polar; e/ou, ii) diferir substancialmente no seu efeitona orientação da estrutura do peptideo tal como substituiçãode ou para Pro ou Gly por outro resíduo; e/ou iii) diferesubstancialmente na carga elétrica, por exemplo,substituição de um resíduo carregado negativamente tal comoGlu ou Asp para um resíduo positivamente carregado tais comoLys, His ou Arg (e vice versa) ; e/ou iv) diferesubstancialmente no volume estérico, por exemplo,substituição de um resíduo grande tais como His, Trp, Phe ouTyr para um tendo uma cadeia lateral menor, por exemplo,Ala, Gly ou Ser (e vice versa).

A substituição de aminoácidos pode em umamodalidade ser feita baseada nos seus valores dehidrofobicidade e hidrofilicidade e a similaridade relativados substituintes da cadeia lateral do aminoácido, incluindocarga, tamanhos e semelhantes. Exemplarmente substituiçõesaminoácidas que tomam várias das precedentes característicasem consideração são bem conhecidas pelos versados na técnicae incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serinae treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina eisoleucina.

Como foi mencionada acima a presente invençãorelaciona-se aos fragmentos, variantes e homólogos dasseqüências peptídicas descritas acima.

No presente contexto

i) um fragmento é uma seqüência que tem pelomenos 40% mais pref erivelmente em pelo menos 50%, maispreferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelomenos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, maispreferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelomenos 95% do comprimento de uma seqüência correspondendo auma seqüência compreendendo o motivo da invenção, emparticular uma seqüência selecionada das seqüências de SEQID Nos:1-22. É preferido que um fragmento de uma seqüênciaselecionada das seqüências de SEQ ID Nos:1-22 compreendepelo menos 4 resíduos aminoácidos do motivo Xa- (x) -Xb-Xc-Xd~Xf que é descrito acima, mais preferivelmente resíduos Xb-Xc-Xd-Xf do referido motivo, tal como, por exemplo, seqüênciasDLSFLDDNLVY (SEQ ID NO:23), VSFMDVNSTWR (SEQ ID NO:24),EVSFLDAHSRY (SEQ ID NO: 25) que são os fragmentos deseqüências identificadas como SEQ ID NO:16, 17 e 18correspondentemente;

ii) uma variante é uma seqüência aminoácida tendopelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, maispreferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelomenos 90%, mais preferivelmente 95% de homologia a umaseqüência compreendendo o motivo da invenção, em particulara uma seqüência selecionada das seqüências de SEQ ID Nos: 1-22, ou é uma seqüência aminoácida tendo pelo menos 60%, maispreferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelomenos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, maispreferivelmente 95% de aminoácido positivos unidoscomparados a uma seqüência compreendendo o motivo dainvenção, em particular a uma seqüência de SEQ ID NOS:1-22.Um aminoácido positivo unido é definido aqui como umaidentidade ou similaridade definida por propriedades físicase/ou químicas dos aminoácidos tendo à mesma posição em duasseqüências comparadas. Aminoácidos positivos unidospreferidos da presente invenção são KaR, EaD, LaM, QaΕ, I a V, IaL, A a S, Y a W, KaQ, SaT, NaSeQaR.A homologia de uma seqüência aminoácida com outro aminoácidoé definida como uma porcentagem de aminoácidos idênticos nasseqüências combinadas. A homologia das seqüências pode sercalculada utilizando algoritmos bem conhecidos tais comoBLOSUM 30, BLOSUM 40, BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55,BLOSUM 60, 62, BLOSUM 65, BLOSUM 70, BLOSUM 75, BLOSUM 80,BLOSUM 85, ou BLOSUM 90;

iii) um homólogo é uma seqüência aminoácida quetem menos que 60% mas mais que 30%, tal como 50-59%, porexemplo, 55%, tal como 40-49%, por exemplo, 45%, tal como30-39%, por exemplo, 35% de homologia para uma seqüênciacompreendendo o motivo da invenção, em particular a umaseqüência de SEQ ID Nos: 1-22.

É presumido que fragmentos, variantes e homólogoscomo aqui definidos acima permanecem em pelo menos algumaatividade biológica da seqüência original, por exemplo, umacapacidade de estimular a plasticidade neural, tal comoassociada com diferenciação celular neural e/ou tal comoassociada com memória e aprendizagem, estimulando desobrevivência celular, tais como inibição da apoptose,ativação do receptor de uma proteína que a referidaseqüência original é derivada.

Como mencionado acima, a invenção relaciona-seambos, a peptídeos de ocorrência natural, preparadossinteticamente ou recombinantemente e peptídeos preparadospor meios de quebra enzimática/química de uma seqüênciapolipeptídica maior. Os peptídeos produzidos por quebraenzimática de uma seqüência polipeptídica maior vêm comopeptídeos, que são preparados por meios de expressãorecombinante ou por meios de síntese química, em que asreferidas seqüências peptídicas são seqüências integrais dospolipeptídeos maiores ou proteínas, são de acordo com ainvenção derivadas de seqüências dos referidos polipeptídeosmaiores ou proteínas.

A invenção preferivelmente relaciona-se apeptídeos derivados das seqüências das proteínas pertencendoa superfamília do TGF-beta de proteínas, em particular,GDNF, ARTN, NRTN, PSTN, TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3 eTGF-beta 4.

Então, em uma modalidade um peptídeo da invençãopode ter ou compreender uma seqüência correspondente a umaseqüência integral de fato neurotrófico derivado da glia(GDNF). Tal peptideo de acordo com a invenção é derivado dofator neurotrófico derivado da glia (GDNF). Exemplos deseqüências derivadas de GDNF que encontram o critério parauma seqüência de peptideo da invenção são SEQ ID NOs: 1, 9 e16.

Um peptideo, de acordo com a invenção, pode ter oucompreender uma seqüência de peptideo derivada de artemina(ARTN). Seqüências de peptideo derivadas de ARTN da invençãosão identificadas aqui como SEQ ID NOs: 2, 10 e 17. Umaseqüência de peptideo pode também derivar de neurturina(NRTN) ou persefina (PSTN). As seqüências da invençãoderivadas de NRTN e PSTN são identificadas aqui como SEQ IDNOs: 3, 11 e 18 e SEQ ID NOs: 4, 12 e 19correspondentemente.

Um peptideo da invenção pode compreender umaseqüência derivada do fator de crescimento transformadorbeta 1 (TGF-beta 1), fator de crescimento transformador beta2 ( TGF-beta 2), fator de crescimento transformador beta 3 (TGF-beta 3), ou fator de crescimento transformador beta 4 (TGF-beta 4), em que seqüências preferidas derivadas dessasproteínas são identificadas aqui como SEQ ID NOs:5-8, 13-15ou 20-22, correspondentemente.

De acordo com a presente invenção uma seqüência depeptideo isolada como descrita acima pode ser formulada comoum composto.

Um composto pode conter uma cópia única de umaseqüência aminoácida individual selecionada de qualquer dosdescritos acima, ou ela pode conter duas ou mais cópias detal seqüência aminoácida. Isto significa que o composto dainvenção pode ser formulado como um monômero de umaseqüência de peptideo, tal como contendo uma seqüênciapeptidica individual única, ou ela pode ser formulada comoum multimero de uma seqüência de peptideo, isto é, contendoduas ou mais seqüências de peptideos individuais, em que asreferidas seqüências de peptideo individual podem serrepresentadas por duas ou mais cópias da mesma seqüência oupor duas ou mais seqüências de peptideos individuaisdiferentes. Um multimero pode também compreender umacombinação de seqüência de comprimento inteiro e um ou maisfragmentos dos mesmos. Em uma modalidade um composto podeconter duas ou mais seqüências aminoácidas, tal composto édefinido aqui como dimero, em outra modalidade um compostopode conter mais de duas seqüências aminoácidas, tais comoexemplos, três, quatro ou mais seqüências. A presenteinvenção preferivelmente relaciona-se a compostos contendoduas ou mais seqüências peptidicas da invenção. Entretanto,compostos contendo 3, 5, 6, 7, 8 ou mais seqüências estãotambém no objetivo da invenção.

Os fragmentos de peptideos formulados como dimerosou multimeros podem ter as seqüências de aminoácidosidênticas, ou elas pode ter diferentes seqüênciasaminoácidas. Um exemplo de tal composto pode ser um compostocontendo SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO: 9, outro exemplo pode serum composto contendo SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO: 16. Quaisqueroutras combinações das seqüências da invenção podem serfeitas dependendo de diferentes modalidades. As seqüênciaspodem ser conectadas a cada outra através de ligaçãopeptidica, ou conectadas a cada outra através de umamolécula ligante ou agrupamento.

Um composto da invenção pode conter duas ou maiscópias idênticas de uma seqüência, tal como, por exemplo,duas cópias de uma seqüência selecionada de SEQ ID NOs: 1-22, em que as referidas duas seqüências podem ser conectadasa cada outra através de uma molécula ligante ou agrupamento.Um composto em que as seqüências são conectadas através dogrupo ligante é preferido. Um exemplo de tal grupo ligantepode ser um ácido di-, tri- ou tetracarboxilico aquiral.Ácidos di-, tri- ou tetracarboxilicos aquirais e um métodode produção tal como um composto (um método ligante demontagem (LPA)) são descritos em W00018791 e W02005014623.Outro exemplo de um possível ligante pode ser o aminoácidolisina. Seqüências peptídicas individuais podem ser ligadasa uma molécula núcleo tal como lisina formando assim ummultímero dendrítico (dendrímero) de uma(s) seqüência(s)peptidica individual. Produção de dendrímeros é também bemconhecida na técnica (PCT/US90/02039, Lu et al, (1991) MolImmunol. 28:623-630; Defoort et al, (1992) Int J. Pept ProtRes., 40:214-221; Drijfhout et al (1991) Int J Pept Prt Res.(37:27-32), e dendrímeros são no presente amplamenteutilizados na pesquisa e em aplicações médicas. É umamodalidade preferida da invenção prover um compostodendrimérico compreendendo quatro seqüências aminoácidasindividuais ligadas a molécula núcleo lisina. È tambémpreferida que pelo menos uma de quatro seqüênciasaminoácidas individuais compreendam uma seqüência aminoácidade fórmula definida acima. É ainda mais preferido se todasas quatro seqüências aminoácidas de um composto dendriméricoindividualmente compreender uma seqüência aminoácida defórmula definida acima.

Compostos multiméricos da invenção, tais como LPA-dimeros ou Lisina-dendrimeros, são compostos preferidos dainvenção. Entretanto, outros tipos de compostos multiméricoscompreendendo duas ou mais seqüências da invenção podem serpreferidos dependendo das modalidades.

2. Atividade Biológica

Uma seqüência de peptideo da invenção e umcomposto compreendendo uma seqüência da invenção possuematividade biológica. A invenção preferivelmente relaciona-sea uma atividade biológica selecionada de

- capacidade de estimulação da plasticidade neuralassociada com diferenciação celular neural, por exemplo,estimulação do crescimento do neurito,

- capacidade da plasticidade neural associada commemória e aprendizagem, por exemplo, estimulando a eficáciasináptica,

capacidade de estimulação da sobrevivência

celular, por exemplo, inibindo apoptose,

- capacidade de ligação de um receptor alfa dafamília do GDNF (GFR alfa) e ativação ou inibição de sinalde transdução, tal como transdução de sinal associada comreceptor de tirosina quinase RET ou associado com moléculade adesão celular neural (NCAM),

- capacidade de ligação a um componente de umcomplexo de molécula de adesão celular neural (NCMA)/GFR.

Então, em uma modalidade preferida um peptideo, de acordocom a invenção, se liga a NCAM.

Então, em uma modalidade uma seqüência de peptideoisolada como descrito acima é capaz de ligar ao receptorGFRalfa selecionado de GFR alfa 1, GFR alfa 2, GFR alfa 3 ouGFR alfa 4.

Os autores da presente invenção tem identificadoum motivo aminoácido que está presente em um grupo deproteínas pertencendo a superfamília do TGF beta deproteínas, em particular, proteínas GDNF< ARTN, NRTN, PSTN,TGF beta 1, TGF beta 2, TGF beta 3 e TGF beta 4, e associadoa presença deste motivo com a atividade biológica dasreferidas proteínas e fragmentos de peptídeos da invençãoderivadas dos mesmos. 0 motivo, de acordo com a invenção éessencial para ligação da seqüência de peptideo da invençãopara o receptor, em particular para o receptor GFR alfa,ainda mais particular para GFR alfa 1, GFR alfa 2, GFR alfa3 ou GFR alfa 4.

Receptores GFR alfa são receptores principais nocérebro. Receptores GFR afã fazem um complexo receptormulticomponente junto com receptor de tirosina quinase RETsinalizando através do qual dirige a diferenciação decélulas precursoras neurais, crescimento axonal, promoção desobrevivência neuronal, plasticidade neural associada comaprendizagem e memória particular. A capacidade deseqüências peptídicas da invenção de ligação e ativando oGFR alfa -Ret ou complexo receptor serve para modular asrespostas biológicas dependente da atividade dos referidoscomplexos receptor. Conseqüentemente, a invenção provê ummétodo de modular a atividade do complexo receptor GFRalfa-Ret compreendendo o uso de uma seqüência peptideo isolada dainvenção ou um composto compreendendo a referida seqüência.Em modalidade preferida, a invenção relaciona-se a um métodopara ativar o receptor GFR alfa.

Em outra modalidade, uma seqüência peptideoisolada como descrito acima é capaz de ligar ao complexoreceptor GFR alfa-molécula de adesão celular neural (NCAM) eativando ou inibindo dessa forma a transdução de sinalassociada à NCAM.

NCAM desempenha um papel de molécula de adesãocelular principal de células neuronais que tem ao mesmotempo uma molécula do tipo receptor que associada com viasde transdução de sinal intracelular múltiplas nas célulasneuronais. Tem sido recentemente mostrado que o receptor GFRalfa recruta NCAM em um complexo de sinalização que éativado por ligante GDNF ao GFR alfa (Paratcha et al (2003)Cell 113:867-879).

Então, de acordo com a invenção uma seqüênciapeptideo isolada da invenção é capaz de estimular adiferenciação celular neuronal através de ativar um doscomplexos receptores GFN alfas descritos acima. O termo"diferenciação neuronal" é entendido aqui ambos comodiferenciação de células precursoras neurais, ou célulastronco neurais, e ainda diferenciação de células neurais,tais como, por exemplo, maturação de células neuronais. Umexemplo de tal diferenciação pode ser crescimento de neuritode neurônios imaturos, ramificação de neuritos, e tambémregeneração de neurônio.

Então, uma modalidade preferida da invençãorefere-se a atividade biológica de uma seqüência peptideoassociada com estimulação da diferenciação de precursoresneurais/células tronco ou neurônios imaturos, em outramodalidade preferida a invenção se relaciona a estimulaçãodo crescimento do neurito de neurônios maduros, por exemplo,neurônios que foram traumatizados mas sobreviveram e estãocomprometidos com a regeneração dos processos danosos.Conseqüentemente, a invenção também de relaciona a um métodopara estimular a diferenciação celular neuronalcompreendendo uso de uma seqüência peptideo da invenção ouum composto compreendendo a referida seqüência.

Uma das modalidades mais preferidas da invençãorelaciona-se a atividade das seqüências peptideo em conexãocom aprendizagem e memória, em particular, a capacidade deuma seqüência peptideo para estimular a plasticidadesináptica, formação da espinha dorsal, eficácia sináptica.Então, a invenção também se relaciona a um método paraestimulação da memória e/ou aprendizagem compreendendo o usode uma seqüência peptideo da invenção e/ou compostocompreendendo a referida seqüência. A invenção relaciona-sea ambas, a memória de curto termo e memória de longo termo.Uma seqüência peptideo da invenção pode tambémestimular a sobrevivência celular neuronal. A invençãorelaciona-se a capacidade de estimular a sobrevivênciacelular neuronal devido a ambos, trauma e doençadegenerativa. Conseqüentemente, a invenção relaciona-se a ummétodo para estimulação da sobrevivência celular,preferivelmente sobrevivência celular neuronal por uso deuma seqüência peptideo da invenção e/ou compostocompreendendo a referida seqüência.

Em ainda outra modalidade uma seqüência peptideoda invenção pode modular a adesão celular, em particularadesão celular mediada NCAM. 0 termo "modulando a adesãocelular" inclui ambas, estimulação e inibição da adesãocelular. Esta atividade de uma seqüência peptideo queinfluencia um ótimo número de processos no desenvolvimento esistema neural adulto, e tem uma ótima relevância a umnúmero de condições patológicas, por exemplo, câncer. Então,um método para modular a adesão celular, em particularadesão celular mediada por NCAM, por uso de uma seqüênciapeptideo da invenção ou um composto compreendendo a referidaseqüência está também no objetivo da invenção.

As seqüências de peptideo da invenção e compostoscompreendendo os mesmos são biologicamente ativas ambas,substâncias solúveis/móveis do meio de crescimento celular esubstâncias imóveis do substrato de crescimento celular. Emalgumas modalidades pode ser preferido usar um peptideo ouum composto compreendendo os mesmos como uma substânciasolúvel, enquanto em outras modalidades pode ser preferidousar uma seqüência peptideo como substrato celular.Entretanto, seqüências peptideo solúveis ou compostoscompreendendo os mesmos são mais preferidos.

Em outra modalidade, a seqüência peptideo dainvenção é também capaz de inibir um processo inflamatório,em particular um processo inflamatório no cérebro.

Inflamação é uma reação de defesa causada por danotecidual devido a uma injúria mecânica ou bacteriana, vírusou outras infecções do organismo. A resposta inflamatóriaenvolve três estágios principais: primeiro, dilatação decapilares para aumentar o fluxo sangüíneo; segundo, mudançasestruturais microvasculares e escape de proteínas do plasmada corrente sangüínea; e terceiro a transmigraçãoleucocitária através do endotélio e acúmulo no local dainjúria e infecção. A resposta inflamatória começa com umaliberação de mediadores inflamatórios. Mediadoresinflamatórios são solúveis, moléculas difusíveis que agemlocalmente no local do dano tecidual e infecção, e em locaismais distantes, influenciando eventos conseqüentes daresposta inflamatória. Mediadores inflamatórios podem serexógenos, por exemplo, produtos bacterianos ou toxinas, ouendógenos, que são produzidos dentro do sistema imune porele mesmo, bem como células teciduais injuriadas,linfócitos, células mastócitos e proteínas do sangue.

Neuroinflamação desempenha um papel proeminente naprogressão da doença de Alzheimer e pode ser responsávelpara degeneração nas regiões vulneráveis tal como ohipocampo. Neuroinflamação é associada com níveis elevadosde glutamato extracelular e potencialmente uma estimulaçãoaumentada de receptores glutamato N-metil-D-aspartato.

Antiinflamatória é outra atividade biológicaimportante da seqüência peptideo da invenção. Então, ainvenção relaciona-se a peptideo antiinflamatório, que écapaz de servir como um inibidor da resposta inflamatóriasustentada, em particular no cérebro.

A presença continua de mediadores inflamatórios,tal como, por exemplo, TNF alfa no corpo em resposta dapresença sustentada de produtos bacterianos ou mesmobactérias vivas localmente durante dias ou semanas seguindotrauma e/ou infecção promove as reações a inflamação, talcomo, por exemplo, calor, edema, e dor. A repostainflamatória sustentada tem sido comprovada ser muito nocivopara o corpo. Se produtos bacterianos ou bactérias vivas setornam espalhados universalmente no corpo do seu local focaa reação inflamatória se torna decisiva e fora de controle eleva a sepse que eventualmente evolui ainda para sepsesevera e choque séptico. Peptideos antiinflamatórios podemser utilizados para bloquear ou suprimir a decisiva daresposta inflamatória sustentada representada por umacascata de citocina massiva e nociva no sangue e órgãosvitais tais como pulmão, fígado, intestino, cérebro e rins.

No presente contexto pelo termo "compostoantiinflamatório" significa um composto que é capaz de pelomenos uma das seguintes atividades:

i) diminuir ou inibir a expressão gênica nascélulas imunes, preferivelmente monócitos/macrófagos emreposta aos produtos bacterianos, bactéria viva ou traumapara produzir mediadores inflamatórios endógenos incluindoreceptores para mediadores inflamatórios e fatores detranscrição envolvidos na transdução de sinal dos mediadoresinflamatórios, os referidos mediadores sendo preferivelmenteselecionados do grupo compreendendo citocinas, selecionadasdo grupo TNF alfa, IL-1, IL-6, G-CSF, GM-CSF, M-CSF.

Quimiocinas selecionadas do grupo compreendendo IL-8, MCP-1,receptores selecionados do grupo fator tecidual e IL-2Ralfa,

ii) diminuição ou inibição da produção debradicinina pela fase de contato de sistema,

iii) diminuição ou inibição do potencial deatração para monócitos, e/ou

iv) diminuição ou inibição do tempo de vida demonócitos, neutrófilos e outras células imunes servindo comoum indutor de apoptose,

v) diminuição ou inibição de células endoteliaisvasculares para expressar a adesão de moléculas, a referidaadesão de moléculas sendo preferivelmente selecionadas dogrupo compreendendo PECAM, ICAM-1, E-selectinas, VCAM-I

vi) diminuição ou inibição da ativação do sistemade fase de contato para produzir bradicinina levando aoaumento da permeabilidade vascular,

vii) estimular a síntese de um mediadorantiinflamatório selecionado do grupo de IL-IO e IL-12,

viii) inibição da ativação do complemento,

ix) diminuição do risco da degeneração celularneural na presença de neuroinflamação crônica, por exemplo,neurônios que expressam receptores N-metil-D-aspartatoglutamato.

Um dos exemplos não limitados de atividadebiológica das seqüências peptideo da invenção e compostoscompreendendo os mesmos são descritos na aplicação abaixo.

Estimulação do Crescimento de Neurito

Substâncias com o potencial para promover ocrescimento de neurito bem como estimular a regeneração e/oudiferenciação de células neuronais, tais como certos fatorestróficos endógenos, são principais alvos na pesquisa paracompostos que facilitam, por exemplo, regeneração neuronal eoutras formas de plasticidade neuronal. Para avaliar opotencial do presente composto, a habilidade para estimularo crescimento do neurito relacionada a sinalização,interfere com adesão celular, estimula crescimento deneurito, regeneração de nervos, podem ser investigados.Compostos da presente invenção são mostrados para promover ocrescimento e é assim considerado serem bons promotores deregeneração de conexões neuronais, e assim de recuperaçãofuncional após os danos bem como promotores de funçãoneuronal em outras condições onde tal efeito é requerido.

No presente contexto "diferenciação" é relacionadoaos processos de maturação de neurônios e extensão deneuritos, que tomam ligar após a última divisão celular dosreferidos neurônios. Os compostos da presente invenção podemser capazes de parar a divisão celular neural e iniciando amaturação das referidas células, tais como extensão dainiciação de neuritos. De outra forma, "diferenciação" érelacionada a iniciação do processo de transformação degenética, bioquímica, morfológica e fisiológica de célulasdo progenitor neuronal, células neurais imaturas ou célulastronco embrionárias levando a formação de células tendocaracterísticas funcionais de célula neuronal normal comotais características são definidas na técnica. A invençãodefine "células neurais imaturas" como uma célula que tempelo menos uma característica de célula neural aceita natécnica como um traço característico para a célula neural.

De acordo com a presente invenção um compostocompreendendo pelo menos uma das seqüências peptídeo acima écapaz de estimular o crescimento do neurito. A invençãorelaciona-se ao melhoramento/estimulação do crescimento deneurito tal como cerca de 75% de melhoramento/estimulaçãoacima do valor do crescimento de neurito das célulascontrole/não estimuladas, por exemplo 50%, tal como cerca de150%, por exemplo, 100%, tal como cerca de 250, por exemplo200%, tal como cerca de 350%, por exemplo 300%, tal comocerca de 450%, por exemplo, 400%, tal como cerca de 500%.

Estimação da capacidade de um composto candidatopara estimular o crescimento do neurito pode ser feita porusar qualquer método conhecido ou ensaio para estimação docrescimento do neurito, tal como, por exemplo, como odescrito nos Exemplos abaixo.

De acordo com a invenção um composto tem atividadeneuritogênica ambos como um componente imóvel insolúvel dosubstrato de crescimento celular e como um componentesolúvel do meio de crescimento celular. No presente contexto"imóvel" significa que o composto é ligado/preso a umasubstância que é insolúvel em água ou uma solução de água eassim ela se torna insolúvel em tal solução também. Paraaplicações médicas, ambos os compostos insolúvel e insolúvelsão considerados pela aplicação, entretanto, compostossolúveis são referidos. Sob "composto solúvel" é entendidoum composto, que é solúvel em água ou uma solução de água.

Produção de Seqüências de Peptideo Individuais

As seqüências de peptideo da presente invençãopodem ser preparados por qualquer método sintéticoconvencional, tecnologias de DNA recombinante, clivagemenzimática de proteínas de comprimento completo cujasseqüências peptidicas são derivadas de, ou uma combinaçãodos métodos referidos.

Preparação Recombinante

Então, em uma modalidade os peptideos da invençãosão produzidos pelo uso de tecnologias de DNA recombinante.

A seqüência de DNA codificando um peptideo ou acorrespondente proteína de comprimento completo o peptideooriginado de pode ser preparado sinteticamente por métodospadrões estabelecidos, por exemplo, o método fosfoamidinadescrito por Beaucage e Caruthers, 1981, Tetrahedron Left.22:1859-1869, ou o método descrito por Matthes et al, 1984,EMBO J. 3:801-805. De acordo com o método fosfoamidina,oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em umsintetizador de DNA automático, purificado, anelado, ligadoe clonado em vetores adequados.A seqüência DNA codificando um peptideo podetambém ser preparado por fragmentação das seqüências DNAcodificando a proteína de comprimento completocorrespondente do peptideo original, utilizando DNAase I deacordo com o protocolo padrão (Sambrook et al, Molecularcloning: A Laboratory manual. 2a ed, CSHL Press, Cold SpringHarbor, NI, 1989) . A presente invenção relaciona-se aproteínas de comprimento complete selecionada dos grupos deproteínas identificadas acima. O DNA codificando asproteínas de comprimento completo da invenção possaalternativamente ser fragmentado utilizando endonucleoasesde restrição específicas. Os fragmentos de DNA são aindapurificados utilizando procedimentos padrões descritos emSambrook et al, Molecular cloning: A Laboratory manual, 2aed, CSHL Press, Cols Spring Harbor, NI, 1989.

A seqüência de DNA codificando uma proteína decomprimento completo pode também ser de origem genômica oucDNA, por exemplo, obtidos por preparação de uma bibliotecagenômica ou cDNA e selecionando para seqüências de DNAcodificando para toda ou parte de proteína de comprimentocompleto por hibridização utilizando padrões deoligonuleotídeos sintéticos de acordo com técnicas padrões(cf. Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2a Ed., Cold Spring Harbor, 1989). A seqüência de DNA podetambém ser preparada por reação em cadeia polimeraseutilizando iniciadores específicos, por exemplo, comodescrito em US 4.683.202 ou Salki et al, 1988. Science239:487-491.A seqüência de DNA é então inserida em um vetor deexpressão recombinante, que pode ser qualquer vetor, quepode convenientemente ser sujeito a procedimentos de DNArecombinante. A escolha do vetor sempre dependerá da célulahospedeira que ele vai ser introduzido. Então, o vetor podeser um vetor replicante livremente, isto é, um vetor queexiste como uma entidade extracromossomal, a replicação doqual é independente da replicação cromossomal, por exemplo,um plasmideo. Alternativamente, o vetor pode ser um que,quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado nogenoma da célula hospedeira e replicado junto com o(s)cromossomo(s) em que ele tenha sido integrado.

No vetor, a seqüência de DNA codificando umpeptideo ou uma proteína de comprimento completo deve seroperavelmente conectado a uma seqüência promotora adequada.O promotor pode ser qualquer seqüência de DNA, que mostraatividade transcricional na célula hospedeira de escolha epode ser derivado de genes codificando proteínas ouhomólogas ou heterólogas para a célula hospedeira. Exemplosde promotores adequados para direcionar a transcrição daseqüência de DNA codificante nas células mamíferas são opromotor SV 40 (Subramani et al, 1981, Mol. Cell Biol.1:854-864), a promotor MT-I (gene metalotioneína) (Palmiteret al, 1983, Science 222:809-814) ou o promotor tardioprincipal adenovírus 2. Um promotor adequado para uso emcélulas de inseto é o promotor poliedrina (Vasuvedan et al,1992, FEBS Lett. 311:7-11). Promotores adequados para uso emcélulas de leveduras hospedeiras incluem promotores de genesglicolíticos de levedura (Hitzeman et al, 1980, J. Biol.Chem. 255:12073-12080; Alber e Kawasaki, 1982, J. Mol. Appl.Gen. 1:419-434) ou genes de deidrogenase álcool (Young etal, 1982, em Genetic Engineering of Microorganisms forChemicals, Hollaender et al, eds., Plenum Press, NI), oupromotores TPIl (US 4.599.311) ou ADH2-$c (Russell et al,1983, Nature 304:652-654). Promotores adequados para uso emcélulas hospedeiras de fungos filamentosos são, por exemplo,o promotor ADH3 (McKnight et al, 1985, EMBO J. 4:2093-2099)ou o promotor tpiA.

A seqüência de DNA codificante pode também seroperacionalmente conectada a um terminador adequado, talcomo o terminado do hormônio de crescimento humano(Palmitier et al, op. cit) ou promotores (para hospedeirosfúngicos) o TPIl (Alber e Kawasaki, op. cit) ou ADH3(McKnight et al, op. cit). 0 vetor pode ainda compreenderelementos tais como sinais de poliadenilação (por exemplo,de SV 40 ou a região 5 Elb de adenovirus) , seqüênciasenhancer transcricionais (por exemplo, o enhancer SV 40) eseqüências enhancer traducionais (por exemplo, umacodificando adenovirus VA RNAs).

0 vetor de expressão recombinante pode aindacompreender uma seqüência de DNA capacita o vetor parareplicar na célula hospedeira em questão. Um exemplo de talseqüência (quando a célula hospedeira é uma célula mamífera)é a origem SV 4 0 de replicação. 0 vetor pode tambémcompreender um marcador selecionável, por exemplo, um genedo produto do qual complementa um defeito na célulahospedeira, tal como o gene codificando a diidrofolatoredutase (DHFR) ou um que confira resistência a um fármaco,por exemplo, neomicina, hidromicina ou metotrexato.

Os procedimentos utilizados para ligar asseqüências de DNA codificando os peptideos ou proteínas decomprimento completo, o promotor e o terminador,respectivamente, e para inseri-los em vetores adequadoscontendo a informação necessária para replicação, são bemconhecidos pelos versados na técnica (cf., por exemplo,Sambrook et al, na obra citada).

Para obter peptideos recombinantes da invenção asseqüências de DNA podem ser úteis fusionadas com umaseqüência de segundo peptídeo e uma clivagem de protease nosítio da seqüência codificante, dando uma construção de DNAcodificando a proteína de fusão, em que o local de clivagemda protease codificando a seqüência posicionada entre ofragmento HBP e segundo peptídeo codificando o DNA, inseridoem um vetor de expressão recombinante, e expresso em célulashospedeiras recombinantes. Em uma modalidade, o referidosegundo peptídeo selecionado de, mas não limitado ao grupocompreendendo glutation-S-redutase, timosina de bezerro,tioredoxina bacteriana ou variantes naturais ou sintéticosubiquitinados humanos, ou peptideos dos mesmos. Em outramodalidade, uma seqüência peptídeo compreendendo um local declivagem de protease pode ser o Fator Xa, com a seqüênciaaminoácida IEGR, enteroquinase, com a seqüência aminoácidaDDDDK, trombina, com a seqüência aminoácida LVPR/GS, ouAcharombacter lyticus, com a seqüência aminoácida XKX, sítiode clivagem.

A célula hospedeira em que o vetor de expressão éintroduzido pode ser qualquer célula que seja capaz deexpressão de peptideos ou proteínas de comprimento completo,e é preferivelmente uma célula eucariótica, tais comocélulas invertebradas (inseto) ou células vertebradas, porexemplo, oócitos Xenopus laevis ou células mamíferas, emparticular células de inseto e mamíferas. [Exemplos delinhagens de células mamíferas adequadas são as linhagenscelulares HEK293 (ATCC CRL-1573), COS (ATCC CRL-1650), BHK(ATCC CRL-1632, ATCC CCL-IO) ou CHO (ATCC CCL-61) ]. Métodosde transfectar células mamíferas e expressando as seqüênciasde DNA introduzidas nas células são descritas em, porexemplo, Kaufman e Sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, pp. 601-621; Southern e Berg, 1982, J, Mol. Appl, Genet. 1:327-341;Loyter et al, 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 79:422-426;Wigler et al, 1978, Cell 14:725; Corsaro e Pearson, 1981, emSomatic Cell Genetics 7, p.603; Graham e van der Eb, 1973,Virol. 52:456; e Neumann et al, 1982, EMBO J. 1:841-845.

Alternativamente, células de fungos (incluindocélulas de levedura) podem ser utilizadas como célulashospedeiras. Exemplos de células de levedura adequadasincluem células de Saccharomyces spp. ou Schizosaccharomycesspp. em cepas particulares de Saccharomyees eerevisiae.Exemplos de outras células fúngicas são células de fungosfilamentosos, por exemplo, Aspergillus spp. ou Neurosporaspp., em cepas particulares de Aspergillus oryzae ouAspergillus niger. 0 uso de Aspergillus spp. para aexpressão de proteínas é descrita em, por exemplo, EP 238 023.

O meio utilizado para as culturas de células podeser qualquer meio convencional adequado para crescimento decélulas de mamíferos, tal como meio contendo soro ou livrede soro contendo suplementos apropriados, ou um meioadequado para crescimento de inseto, levedura ou célulasfúngicas. Meios adequados são disponíveis de fornecedorescomerciais ou podem ser preparados de acordo com fórmulaspublicadas (por exemplo, em catálogos da TVmerican TypeCulture Collection).

Os peptídeos ou proteínas de comprimento completorecombinantemente produzidos pelas células pode então serrecuperadas do meio de cultura por procedimentosconvencionais incluindo a separação de células de hospedeirodo meio por centrifugação ou filtração, precipitando oscomponentes proteináceos do sobrenadante ou filtrado pormeios de um sal, por exemplo, sulfato de amônio, purificaçãopor uma variedade de procedimentos cromatográficos, porexemplo, HPLC, cromatografia de troca iônica, cromatografiapor afinidade, ou semelhantes.

Preparação Sintética

Os métodos para produção sintética de peptídeossão bem conhecidos na técnica. Descrições detalhadas bemcomo práticas de recomendação para produção de peptídeossintéticos podem ser encontradas em Synthetic Peptides: AUser's Guide (Advances in Molecular Biology) , Grant G. A.,ed., Oxford University Press, 2002, ou em: PharmaceuticalFormulation:Development of Peptides and Proteins, Frokjaer eHovgaard eds., Taylor e Francis, 1999.

Peptideos podem, por exemplo, ser sintetizados poruso de química Fmoc e com cisteínas protegidas por Acm. Apóspurificação por HPLC de fase reversa, peptídeos podem serainda processados para obter, por exemplo, isoformasmodificadas cíclicas ou C- ou N-terminal. Os métodos paraciclização e modificação terminal são bem conhecidos natécnica e descritos em detalhes nos manuais citados acima.

Em uma modalidade preferida as seqüências depeptídeo da invenção são produzidas sinteticamente, emparticular, pelo método Síntese de Peptídeo Assistida porSeqüência (SAPD).

Por peptídeos SAPS podem ser sintetizados ouanalisados em um recipiente de polietileno equipado com umfiltro de polipropileno para filtração ou em uma versão defluxo contínuo do método de fase sólida de poliamida(Dryland, A. e Sheppard, R. C. (1996) J. Chem. Soe. PerkinTrans. I, 125-137) em um sintetizador de peptídeocompletamente mecanizado utilizando 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) ou tert-butiloxicarbonil,(Boc) como grupo protetor N-a-amino e grupos de proteçãocomum adequado para funcionalidade de cadeia lateral.

Quando sintetizado, seqüências peptídeosindividuais podem então ser formuladas como multímetrosutilizando técnicas bem conhecidas na técnica, por exemplo,dímeros das seqüências podem ser obtidos pelo método de LPAdescritas em WO 00/18791, polímeros dendriméticos pelasíntese MAP descrita em PCT/US90/02039.

Anticorpo

É um objetivo de a presente invenção prover umanticorpo, fragmento ligador de antígeno ou proteínarecombinante do mesmo capaz de reconhecer e seletivamenteligar a um epítopo em GDNF, ARTN, NRTN, PSTN, TGF beta 1,TGD beta 2, TGF beta 3 e/ou TGF beta 4, o referido epítopocompreendendo o motivo da invenção ou uma seqüênciaselecionada de SEQ ID NOs:1-22, ou um fragmento da referidaseqüência.

Pelo termo "epítopo" significa o grupo específicode átomos (em uma molécula de antígeno) que é reconhecidapor (que é do antígeno) anticorpos (assim causando umaresposta imune). 0 termo "epítopo" é o equivalente para otermo "determinante antigênico". 0 epítopo pode compreender3 ou mais resíduos aminoácidos, tais como, por exemplo,resíduos aminoácidos 4, 5, 6, 7, 8, localizados em bempróximos, tal como dentro de uma seqüência aminoácidacontígua, ou localizada em partes distantes da seqüênciaaminoácida de um antígeno, mas devido a proteína dobrada tersido aproximada a cada outra.

Moléculas de anticorpos pertencentes a uma famíliade proteínas do plasma chamadas imunoglobulinas quebloqueiam a construção básica, a prega ou domínio daimunoglobulina, é utilizado em várias formas em muitasmoléculas do sistema imune e outros sistemas dereconhecimento biológico. Uma imunoglobulina típica temquatro cadeias polipeptídicas, contendo uma região deligação de antígeno conhecida como uma região variável e umaregião conhecida não variante como a região constante.

Anticorpos nativos e imunoglobulinas sãousualmente glicoproteinas heterotetraméricas de cerca de150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves idênticas(L) e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve éligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfetocovalente, enquanto o número de ligações dissulfetos variaentre as cadeias pesada de diferentes isotipos deimunoglobulinas. Cada cadeia pesada e leve pode também terpontes de dissulfeto intracadeias regularmente espaçadas.Cada cadeia pesada tem em uma terminação um domínio variável(VH) seguida por um número de domínios constantes. Cadacadeia leve tem um domínio variável em uma terminação (VL) eum domínio constante em sua outra terminação. O domínioconstante de cadeia leve é alinhado com o primeiro domínioconstante de cadeia pesada, e o domínio variável de cadeialeve é alinhado com o domínio variável da cadeia pesada.Resíduos aminoácidos particulares são acreditados paraformar uma interface entre os domínios variáveis de cadeialeve e pesada (Novotny J, & Haber E. Proc. Natl. Acad. Sei.EUA 82 (14) :4592-6, 1985) .

Dependendo das seqüências aminoácidas do domínioconstante de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem serdeterminadas a classes diferentes. Existem pelo menos cinco(5) classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE,IgG e IgM, e várias dessas podem ser ainda divididas emsubclasses (isotipos), por exemplo, IgG-1, IgG-2, IgG-3 eIgG-4; IgA-I e IgA-2. Os domínios constantes de cadeiaspesadas que correspondem a diferentes classes deimunoglobulinas são chamadas alfa (α) , delta (δ) , epsilon(ε), gama (γ) e um (μ), respectivamente. As cadeias leves deanticorpos podem ser assigned por um de dois tiposclaramente distintos, chamados kappa (κ) e lambda (λ) ,baseados nas seqüências amino de seu domínio constante. Assubunidades de estruturas e configurações tri-dimensionaisde diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

O termo "variável" no contexto de domínio variávelde anticorpos, refere-se ao fato que certas porções dosdomínios variáveis diferem extensivamente na seqüência entreanticorpos. Os domínios variáveis são para ligar edeterminar a especificidade de cada anticorpo particularpara seu antígeno particular. Entretanto, variabilidade nãoé igualmente distribuída através de domínios variáveis deanticorpos. É concentrado em três segmentos chamados deregiões determinantes de complementariedade (CDRs) tambémconhecidos como regiões hipervariáveis ambos nos domínios dacadeia leve e cadeia pesada variáveis.

As porções mais altamente conservadas de domíniosvariáveis são chamadas de regiões conservadas (RC). Osdomínios variáveis de cada cadeia pesada e leve nativascompreendem quatro regiões FR, largamente uma configuraçãoadotando folha β, conectadas por três CDRs, que formam alçasconectoras, e em alguns casos formando parte da estruturafolha β. Os CDRs em cada cadeia são mantidos juntos emproximidade pelas regiões FR e, com os CDRs de outra cadeia,contribuem para a formação do sitio de ligação de antigenodos anticorpos. Os domínios constantes não são envolvidosdiretamente na ligação de anticorpo para um antigeno, masexibe várias funções efetoras, tal como participação doanticorpo na toxicidade celular dependente de anticorpo.

Um anticorpo que é contemplado para uso napresente invenção então pode estar em qualquer de umavariedade de formas, incluindo uma imunoglobulina inteira,um fragmento de anticorpo tal como Fv, Fab, e fragmentossimilares, um anticorpo de cadeia única que incluir asregiões determinantes de complementaridade de domíniovariáveis (CDR) , e formas semelhantes, todas das quais caemsob o termo amplo "anticorpo", como aqui utilizado. Apresente invenção contempla o uso de qualquer especificidadede um anticorpo, policlonal ou monoclonal, e não é limitadoa anticorpos que reconhecem e imunoreagem com um antigenoespecífico. Em modalidades preferidas, no contexto de ambos,métodos terapêuticos e de seleção descritos abaixo, umanticorpo ou fragmento do mesmo é utilizado que éimunoespecífico para um antigeno ou epítopo da invenção.

O termo "fragmento de anticorpo" refere-se a umaporção de um anticorpo de comprimento completo, geralmente oantigeno ligante ou região variável. Exemplos de fragmentosde anticorpo incluem Fab, Fab', F(ab')2 e fragmentos Fv; Adigestão de anticorpos papaína produz dois fragmentos deligação de antigeno idênticos, chamado o fragmento Fab, cadacom um sítio de ligação de antigeno único, e um resíduo defragmento "Fc", assim chamado por sua habilidade decristalizar facilmente. Tratamento de pepsina produz umfragmento F(ab')2 que tem dois fragmentos de ligação deantigeno que são capazes de antigeno de ligação cruzada, eum outro fragmento residual (que é denominado pFc').

Fragmentos adicionais podem incluir dianticorpos, anticorposlineares, moléculas de anticorpo de cadeia única, eanticorpos multiespecíficos formados de fragmentos deanticorpos. Como aqui utilizado, "fragmento funcional" comrespeito a anticorpos, referem-se a fragmentos Fv, F(ab) eF(ab')2·

O termo "fragmento anticorpo" é aqui utilizadoalternadamente com o termo "fragmento de ligação aantigeno".

Fragmentos de anticorpo podem ser pequenos comocerca de 4 aminoácidos, 5 aminoácidos, 6 aminoácidos, 7aminoácidos, 9 aminoácidos, cerca de 12 aminoácidos, cercade 15 aminoácidos, cerca de 17 aminoácidos, cerca de 18aminoácidos, cerca de 20 aminoácidos, cerca de 25aminoácidos, cerca de 30 aminoácidos ou mais. Em geral, umfragmento de anticorpo da invenção pode ter qualquer tamanhosuperior ao limite enquanto ele tem propriedades similaresou imunológicas relativas ao anticorpo que se liga comespecificidade a um epitopo compreendendo uma seqüência depeptideo selecionada de qualquer das seqüênciasidentificadas aqui como SEQ ID NOs: 1-22 ou fragmento dasreferidas seqüências. Então, no contexto da presenteinvenção o termo "fragmento de anticorpo" é idêntico aotermo "fragmento de ligação de antigeno".Fragmentos de anticorpos retêm algumas habilidadespara ligar seletivamente com seu antigeno ou receptor.Alguns tipos de fragmentos de anticorpos são definidos comosegue:

(1) Fab é o fragmento que contém um fragmento deligação de antigeno monovalente de uma molécula deanticorpo. Um fragmento Fab pode ser produzido por digestãodo anticorpo total com a enzima papaina para produzir umacadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada.

(2) Fab' é o fragmento de uma molécula deanticorpo pode ser obtida por tratamento do anticorpo totalcom pepsina, seguida por redução, para produzir uma cadeialeve intacta e uma porção da cadeia pesada. Dois fragmentosFab' são obtidos por molécula de anticorpo.

Fragmentos Fab' difere dos fragmentos Fab pelaadição de uns poucos resíduos na terminação carboxil dacadeia pesada do domínio CHl incluindo uma ou mais cisteínasda região dobradiça do anticorpo.

(3) (Fab')2 é o fragmento de um anticorpo que podeser obtido pelo tratamento do anticorpo total com a enzimapepsina sem redução subseqüente.

(4) F(ab')2 é um dímero de dois fragmentos Fab'mantido junto por duas ligações dissulfeto.

Fv é o fragmento de anticorpo mínimo que contém umreconhecimento de antigeno completo e sítio de ligação. Estaregião consiste de um dímero de um domínio variável decadeia pesada e uma leve em uma associação não covalenteestreita (dímero VH-VL). É nesta configuração que os trêsCDRs de cada domínio variável interage para definir um sitiode ligação de antígeno na superfície do dímero VH-VL.Coletivamente, os seis CDRs conferem especificidade deligação de antígeno do anticorpo. Entretanto, mesmo umdomínio variável único (ou metade de um Fv compreendendosomente três CDRs específicos para um antígeno) tem ahabilidade de reconhecer e ligar ao antígeno, embora em umamenor afinidade que o sítio de ligação inteiro.

(5) Anticorpo de cadeia única ("SCA"), definidocomo uma molécula geneticamente produzida contendo a regiãovariável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada,ligada por um ligante polipeptídeo adequado como umamolécula de cadeia única geneticamente fusionada. Taisanticorpos de cadeia única são também referidos como "Fv decadeia única" ou fragmentos de anticorpos "sFv". Geralmente,o polipeptídeo Fv ainda compreende um ligador polipeptídeoentre os domínios VH e VI que permite o sFv formar aestrutura desejada para ligação de antígeno. Para umarevisão de sFv ver Pluckthun em The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies 113: 269-315 Rosenburg e Moore eds.Springer-Veriag, NI, 1994.

O termo "dianticorpos" refere-se a um fragmento deanticorpo pequeno com dois sítios de ligação de antígeno,cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeiapesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve(VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL) . Pelo uso de umligador que é muito curto para permitir o pareamento entreos dois domínios da mesma cadeia, os domínios são forçados aparear com domínios complementares de outra cadeia e criardois sítios de ligação de antígeno. Dianticorpos sãodescritos mais completamente em, por exemplo, EP 404.097; WO93/11161, e Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sei. EUA90:6444-6448 (1993).

A invenção contempla ambos, anticorpo policlonal emonoclonal, fragmentos de ligação a antígeno e proteínasrecombinantes dos mesmos, que são capazes de se ligar a umepítopo de acordo com a invenção.

A preparação de anticorpos policlonais é bemconhecida pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, Greenet al, 1992. Production of Polyclonal Antisera, em:Immunochemical Protocols (Manson, ed.), páginas 1-5 (HumanaPress); Coligan, et al, Production of Polyclonal Antisera inRabbits, Rats Mice and Hamsters, em: Current Production ofPolyclonal Antisera in Rabbits, Rats Mice and Hamsters, em:Current Protocols in Immunology, seção 2.4.1, que são aquiincorporados por referência.

A preparação de anticorpos monoclonais da mesmaforma é convencional. Ver, por exemplo, Kohler & Milstein,Nature, 256:495-7 (1975); Coligan et al, seções 2.5.1-2.6.7;e Harlow et al, em: Antibodies: A Laboratory Manual, páginas726, Cols Spring Harbor Pub. (1988). Anticorpos monoclonaispodem ser isolados e purificados de culturas de hibridomaspor uma variedade de técnicas bem estabelecidas. Taistécnicas de isolação incluem cromatografia por afinidade comSefarose Proteína-A, cromatografia por exclusão de tamanho,e cromatografia de troca iônica. Ver, por exemplo, Coliganet al, seções 2.7.1-2.7.12 e seções 2.9.1-2.9.3; Bames etal, Purification of Immunoglobulin G (IgG) em: Methods inMolecular Biology, 1992, 10:79-104, Humana Press, NI.

Métodos de manipulação in vitro e in vivo deanticorpos monoclonais são bem conhecidos por aquelesversados na técnica. Por exemplo, os anticorpos monoclonaisa serem utilizados de acordo com a presente invenção podemser feitos pelo método de hibridoma primeiro descrito porKohler e Milstein, 1975, Nature 256, 495-7, ou pode serfeito pelos métodos recombinantes, por exemplo, comodescrito em EUA 4.816.567. Os anticorpos monoclonais parauso com a presente invenção podem também ser isolados debibliotecas de fagos de anticorpo utilizando as técnicasdescritas em Clackson et al, 1991, Nature 352:624-628, bemcomo em Marks et al, 1991, J Mol Biol 222: 581-597. Outrométodo envolve humanização de um anticorpo monoclonal pormeio recombinante para gerar anticorpos contendo seqüênciashumanas especificas e reconhecíveis. Ver, para revisão,Holmes et al, 1997, J Immunol 158:2192-2201 e Vaswani et al,1998, Annals Allergy, Asthma & Immunol 81:105-115.

O termo "anticorpo monoclonal" como aqui utilizadorefere-se a um anticorpo obtido de uma população deanticorpos substancialmente homogêneos, isto é, osanticorpos individuais compreendendo a população sãoidênticos exceto para possível ocorrência de mutaçõesnaturais que podem estar presentes em quantidades menores.Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendodirecionados contra um sítio antigênico único. Além disso,em contraste às preparações de anticorpo policlonalconvencional que tipicamente incluem diferentes anticorposdirecionados contra determinantes diferentes (epitopos),cada anticorpo monoclonal é direcionado contra umdeterminante único no antigeno. Em adição a suaespecificidade, os anticorpos monoclonais são vantajososporque eles são sintetizados pela cultura de hibridoma, nãocontaminada por outras imunoglobulinas. 0 modificador"monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtidode uma população de anticorpos substancialmente homogênea, enão ser construída como requerendo produção do anticorpo porqualquer método particular.

Os anticorpos monoclonais aqui especificamenteincluem anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) em que umaporção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou homólogaàs seqüências correspondentes em anticorpos derivados de umaespécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclassede anticorpo particular, enquanto os resíduos da(s)cadeia(s) são idênticos com ou homóloga as seqüênciascorrespondentes em anticorpos derivados de outras espéciesou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo, bemcomo fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibama atividade biológica desejada (EUA 4.816.567); Morrison etal, 1984, Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855.

Métodos de fazer fragmentos de anticorpo sãoconhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, NI, 1988, aqui incorporado por referência).Fragmentos de anticorpo da presente invenção podem serpreparados por hidrólise proteolitica do anticorpo ou porexpressão em E. coli de DNA codificando o fragmento.Fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por digestão depepsina ou papaina de anticorpos inteiros por métodosconvencionais. Por exemplo, fragmentos de anticorpos podemser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos compepsina para prover um fragmento 5S denotado F(ab')2. Estefragmento pode ser ainda clivado utilizando um agenteredutor tiol, e opcionalmente um grupo bloqueador para osgrupos sulfinidril resultando de clivagem de ligaçõesdissulfeto, para produzir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'.Alternativamente, uma clivagem enzimática utilizandoprodutos pepsina produz dois fragmentos monovalentes Fab' eum fragmento Fc diretamente. Esses métodos são descritos,por exemplo, em EUA 4.036.945 e EUA 4.331.647, e referênciascontidas nas mesmas. Essas patentes são aqui incorporadas emsuas totalidades por referência.

Outros métodos de clivagem de anticorpos, taiscomo separação de cadeias pesadas para formar fragmentos decadeia leve-pesada monovalentes, ainda clivagem defragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas ougenéticas possa também ser utilizada, contanto que osfragmentos se ligam ao antígeno que é reconhecido peloanticorpo intacto. Por exemplo, fragmentos Fv compreendemuma associação de cadeias VH e VL. Esta associação pode sernão covalente ou as cadeias variáveis podem ser ligadas poruma ligação dissulfeto intermolecular ou ligação cruzada porquímico tal como glutaraldeido. Preferivelmente, osfragmentos Fv compreendem cadeias VH e VL conectadas por umligador peptídeo. Essas proteínas ligantes de antígeno decadeia única (sFv) são preparadas por construção de um geneestrutural compreendendo seqüências de DNA codificando osdomínios VH e VL conectados por um oligonicleotídeo. O geneestrutural é inserido em um vetor de expressão, que ésubseqüentemente introduzido em uma célula hospedeira . talcomo E. coli. As células hospedeiras recombinantessintetizam uma cadeia polipeptídica única com um peptídeoligador trazendo os dois domínios V. Métodos para produçãode sFvs são descritos, por exemplo, por Whitlow, et al,1991, em: Methods: A Companion to Methods in Enzymology,2:97; Bird et al, 1988, Science 242:423-426; EUA 4.946.778;e Pack et al, 1993, BioTechnology 11:1271-77.

Outra forma de um fragmento de anticorpo é umpeptídeo codificando para uma região determinante decomplementaridade única (CDR). Peptídeos CDR ("unidades dereconhecimento mínimo") são sempre envolvidos noreconhecimento e ligação de antígeno. Peptídeos CDR podemser obtidos por clonagem ou construção de genes codificandoo CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes sãopreparados, por exemplo, pelo uso da reação em cadeiapolimerase para sintetizar a região variável do RNA dascélulas produtoras de anticorpo. Ver, por exemplo, Larricket al, Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol.2, página 106 (1991).

A invenção contempla formas humanas e humanizadasde anticorpos não humanos (por exemplo, murino). Taisanticorpos humanizados são imunoglobulinas quiméricas,cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas (taiscomo Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subseqüentes ligadorasde antigenos de anticorpos) que contém uma seqüência mínimaderivada de imunoglobulina não humana, tal como o epítoporeconhecedor da seqüência. Para a maior parte, anticorposhumanizados são imunoglobulinas (anticorpo recipiente) emque resíduos de uma região determinante de complementaridade(CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de um CDRde umas espécies não humanas (doador de anticorpo) tais comocamundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidadee capacidade desejadas. Anticorpo(s) humanizado(s) contendouma (a) seqüência (s) mínima de anticorpo(s) da invenção,tal como uma(s) seqüência (s) reconhecendo o(s) epítopo(s)descrito(s) aqui, em uma das modalidades preferidas dainvenção.

Em alguns exemplos, resíduos de regiõesconservadas Fv da imunoglobulina humana são substituídos porresíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorposhumanizados podem compreender resíduos que não sãoencontrados ou no anticorpo recipiente nem no CDR importadoou seqüências de regiões conservadas. Essas modificações sãofeitas para ainda refinar e aperfeiçoar o desempenho doanticorpo. Em geral, anticorpos humanizados compreenderãosubstancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois,domínios variáveis, em que toda ou substancialmente todas asregiões CDR correspondem aquelas de uma imunoglobulina nãohumana e todas ou substancialmente todas das regiões FR sãoaquelas de uma seqüência consenso de imunoglobulina humana.

O anticorpo humanizado otimamente também compreenderá pelomenos uma porção de uma região constante de imunoglobulina(Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Paradetalhes adicionais, ver: Jones et al, 1986, Nature 321,522-525; Reichmann et al, 1988, Nature 332, 323-329; Presta,1992, Curr Op Struct Biol 2:593-596; Holmes et al, 1997, JImmunol 158:2192-2201 e Vaswani, et al, 1998, AnnaisAllergy, Asthma & Immunol 81:105-115.

A geração de anticorpos pode ser alcançada porqualquer método padrão na técnica para produção deanticorpos policlonais e monoclonais utilizando fragmentosnaturais ou recombinantes de GDNF, ARTN, NRTN, PSTN, TGFbeta 1, TGD beta 2, TGF beta 3 e TGF beta 4, o referidofragmento compreendendo uma seqüência selecionada da SEQ IDNO:1-22, como um antigeno. Tais anticorpos podem ser tambémgerados utilizando variantes, homólogos ou fragmentos deseqüências de peptideo de SEQ ID NOs:1-22, os referidosvariantes, homólogos e fragmentos são seqüências de peptideoimunogênico que encontram os seguintes critérios:

(i) sendo uma seqüência aminoácida contígua depelo menos 6 aminoácidos;

(ii) compreendendo ρ motivo da invenção.

Os anticorpos podem também serem produzidos invivo pelo indivíduo a ser tratado, por exemplo, pelaadministração de um fragmento imunogênico de acordo com ainvenção ao referido indivíduo. Conseqüentemente, a presenteinvenção ainda relaciona-se a uma vacina compreendendo umfragmento imunogênico descrito acima.

O pedido também se relaciona a um método paraproduzir um anticorpo da invenção do referido métodocompreendendo um passo de prover um fragmento imunogênicodescrito acima.

A invenção relaciona-se a ambos os anticorpos, quesão capazes de modular, tal como aumentar ou atenuar afunção biológica de GDNF, ARTN, NRTN, PSTN, TGF beta 1, TGFbeta 2, TGD beta 3 e TGF beta 4, em particular uma funçãorelacionada a diferenciação celular neural, sobrevivênciae/ou plasticidade, e para um anticorpo, que pode reconhecere especificamente se ligar as proteínas tardias sem modulara atividade biológica da mesma.

A invenção relaciona-se ao uso dos anticorposacima para 1) aplicações terapêuticas quando da modulação daatividade de GDNF, ARTN, NRTN, PSTN, TGF beta 1, TGF beta 2,TGD beta 3 e TGF beta 4 humana é necessário, 2) detectare/ou monitorar as proteínas tardias in vitro e/ou in vivopara propósitos diagnósticos, 3) propósitos de pesquisa.

Composição Farmacêutica

A invenção também se relaciona a uma composiçãofarmacêutica compreendendo um ou mais dos compostosdefinidos acima, em que o composto é capaz de estimular ocrescimento do neurito e/ou diferenciação celular neural,sobrevivência de células neurais e/ou estimulação doaprendizado e/ou memória. Então, a invenção se relaciona auma composição farmacêutica capaz de estimular adiferenciação de células neuronais e/ou estimular aregeneração de células neuronais, e/ou estimular aplasticidade neuronal em conexão com aprendizado e memória,e/ou estimulando a sobrevivência de células neurais.

No presente contexto, o termo "composiçãofarmacêutica" é utilizado sinonimamente com o termo"medicamento".

Em uma composição as seqüências de peptideo podemser formuladas como compreendendo fragmentos de peptideosindividuais isolados ou multimeros ou dimeros dos mesmoscomo discutido acima.

A composição farmacêutica pode ter os efeitosdescritos acima nas células in vitro ou in vivo, em que acomposição é administrada a um paciente.

O medicamento da invenção compreende umaquantidade efetiva de um ou mais dos compostos como definidoacima, ou uma composição como definido acima em combinaçãocom os aditivos farmaceuticamente aceitáveis. Talmedicamento pode adequadamente ser formulado paraadministração oral, percutânea, intramuscular, intravenosa,intracraniana, intratecal, intracerebroventricular,intranasal ou pulmonar.

Estratégias no desenvolvimento de formulação demedicamentos e composições baseadas nos compostos dapresente invenção geralmente correspondem a estratégias deformulação para qualquer outro produto fármaco baseado emproteína. Problemas potenciais e a orientação requerida parasuperar esses problemas são distribuídos com vários livrostextos, por exemplo, "Therapeutic Peptides and ProteinFormulation. Processing and Delivery Systems", Ed. A;K;Banga, Technomic Publishing AG, Basel, 1995.

Injetáveis são normalmente preparados ou comosoluções líquidas ou suspensões, formas sólidas adequadaspara solução em, ou suspensão em, líquido antes a injeção. Apreparação pode também ser emulsifiçada. O ingrediente ativoé sempre misturado com excipientes que são farmaceuticamenteaceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo.

Excipientes adequados são, por exemplo, água, salina,dextrose, glicerol, etanol ou semelhantes, e combinações dosmesmos. Em adição, se desejado, a preparação pode contermenores quantidades de substâncias auxiliares tais comoagentes umidificantes ou emulsificantes, agentes tamponantesde pH, ou que aumentam a efetividade ou transporte dapreparação.

Formulações dos compostos da invenção podem serpreparadas por técnicas conhecidas por um versado natécnica. As formulações podem conter veículosfarmaceuticamente aceitáveis e excipientes incluindomicroesferas, lipossomos, microcápsulas, nanopartículas ousemelhantes.

A preparação pode adequadamente ser administradapor injeção, opcionalmente no local onde o ingrediente ativoé para exercer seu efeito. Formulações adicionais que sãoadequadas para outros modos de administração incluemsupositórios, nasal, pulmonar e em alguns casos, formulaçõesorais. Para supositórios, ligantes tradicionais e veículosincluem polialquileno glicóis ou triglicerídeos. Taissupositórios podem ser formados de misturas contendo o(s)ingrediente(s) ativo(s) na variação de 0,5% a 10%,preferivelmente 1-2%. Formulações orais incluem taisexcipientes normalmente empregados como, por exemplo, grausfarmacêuticos de manitol, lactose, amido, esterato demagnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio esemelhantes. Essas composições tomam a forma de soluções,suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações deliberação controlada ou pós e geralmente contêm 10-95% do(s) ingrediente(s) ativo(s), preferivelmente 25-70%.

Outras formulações são tais adequadas paraadministração nasal e pulmonar, por exemplo, inaladores eaerossóis.

O composto ativo pode ser formulado como formasneutras ou sais. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluemsais de adição ácida (formados com os grupos amino livres docomposto peptídeo) e que são formados com ácidos inorgânicostais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, outais ácidos orgânicos com ácido acético, ácido oxálico,ácido tartárico, ácido mandélico, e semelhantes. Saisformados com o grupo carboxila livre podem também serderivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo,hidróxido de sódio, de potássio, de amônio, de cálcio, ouférrico, e tais bases orgânicas como isopropilamina,trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína esemelhantes.

As preparações são administradas em uma formacompatível com a formulação de dosagem, e em tal quantidadecomo será terapeuticamente efetiva. A quantidade a seradministrada depende no paciente a ser tratado, incluindo,por exemplo, o peso e idade do paciente, a doença a sertratada e o estágio de doença. Variações de dosagemadequadas são por quilo do peso corporal normalmente daordem de vários cem μg do ingrediente ativo poradministração com uma variação preferida de cerca de 0,1 μga 5000 μg por quilo do peso corporal. Utilizando formasmonoméricas dos compostos, as dosagens adequadas são semprena variação de cerca de 0,1 μg a 5000 μg por quilo do pesocorporal, tal como na variação de cerca de 0,1 μg a 3000 μgpor quilo de peso corporal, e especialmente na variação decerca de 0,1 μg a 1000 μg por quilo de peso corporal.

Utilizando formas multiméricas dos compostos, as dosagensadequadas são sempre na variação de 0,1 μg a 1000 μg porquilo do peso corporal, tal como na variação de cerca de 0,1μg a 750 μg por quilo do peso corporal, e especialmente navariação de cerca de 0,1 μg a 500 μg por quilo do pesocorporal como na variação de cerca de 0,1 μg a cerca de 250μg por quilo do peso corporal. Em particular, quandodosagens menores administradas nasalmente são utilizadasquando administradas por outras vias. Administração pode serfeita uma vez ou pode ser seguida por administraçõessubseqüentes. A dosagem será também dependente da via deadministração e variará com a idade e peso do paciente a sertratado. Uma dosagem preferida de formas multiméricas podeser no intervalo de 1 mg a 70 mg por 70 kg de peso corporal.Para algumas indicações uma aplicação localizadaou substancialmente localizada é preferida.

Alguns dos compostos da presente invenção sãosuficientemente ativos, mas para alguns dos outros, o efeitoserá aumentado se a preparação ainda compreender aditivosfarmaceuticamente aceitáveis e/ou veículos. Tais aditivos eveículos serão conhecidos na técnica. Em alguns casos, serávantajoso incluir um composto, que promova distribuição dasubstância ativa para seu alvo.

Em muitos exemplos, será necessário administrar aformulação de tempo múltiplo. A administração pode ser umainfusão contínua, tal como infusão ou administraçãointraventricular em mais doses tais como mais vezes por dia,diariamente, mais vezes em uma semana, semanalmente etc.Preferivelmente o medicamento será administrado dentro de 8horas do fator inicial, tal como dentro de 5 horas do fatorinicial. Muitos dos compostos exibem um efeito de longotermo pelo qual a administração dos compostos pode serconduzida com longos intervalos, tais como 1 semana ou 2semanas.

Em conexão com o uso em nervos guias, aadministração pode ser contínua ou em porções menoresbaseados sob liberação controlada do(s) composto(s)ativo(s). Além disso, precursores podem ser utilizados paracontrole da taxa de liberação e/ou o sítio de liberação.Outros tipos de implantes e bem como administração oral podesimilarmente ser baseados sob liberação controlada e/ou ouso de precursores.Como discutido acima, a presente invençãorelaciona-se ao tratamento de indivíduos para indução dadiferenciação, estimulando a regeneração, plasticidade esobrevivência de células neurais in vitro ou in vivo, oreferido tratamento envolvendo a administração de umaquantidade efetiva de um ou m ais compostos como definidoacima.

Outra estratégia para administração é implantar ouinjetar células capazes de expressar e secretar o compostoem questão. Assim o composto pode ser produzido no localonde ele vai agir.

Tratamento

Em um aspecto adicional, a presente invençãorelaciona-se a referidos peptídeos, fragmentos, ou variantesdos mesmos para uso na indução da diferenciação e/ouestimulação da regeneração, plasticidade e/ou sobrevivênciade células neurais. 0 uso é para o tratamento para prevenirdoenças e condições do sistema nervoso central e periférico,e dos músculos ou de vários órgãos.

Tratamento pelo uso de compostos/composições deacordo com a invenção é uma das modalidades úteis paraindução da diferenciação, modulação da proliferação,estimulação da regeneração, plasticidade neuronal esobrevivência de células sendo implantadas outransplantadas. Isto é particularmente útil quando do uso decompostos tendo um efeito de longa duração.

Então, o tratamento compreende tratamento e/ouprofilaxia de morte celular na relação de doenças oucondições dos sistemas nervoso central e periférico, taiscomo dano nervoso pós-operatório, dano nervoso traumático,por exemplo, resultando de injúria da espinha vertebral,mielinação impedida de fibras nervosas, danos pós-esquemáticos, por exemplo, resultando de um derrame,demência multi-infarto, esclerose múltipla, degeneraçãonervosa associada com diabetes mellitus, degeneração neuro-muscular, esquizofrenia, doença de Alzheimer, doença deParkinson, ou doença de Huntington.

Também, em relação a doenças ou condições dosmúsculos incluindo condições com função impedida dasconexões neuromusculares, tais como distúrbios de atrofiamuscular genética ou traumática; ou para o tratamento dedoenças ou condições de vários órgãos, tais como condiçõesdegenerativas das gônadas, do pâncreas, tais como diabetesmellitus tipo I e II, do rim, tal como nefrose dos compostosde acordo com a invenção pode ser utilizada para induzir adiferenciação, modulação da proliferação, estimulação daregeneração, plasticidade neuronal e sobrevivência, isto é,estimulação da sobrevivência.

Em ainda uma modalidade adicional para uso docomposto e/ou composição farmacêutica é para a estimulaçãoda habilidade para aprender e/ou para a memória de curtoe/ou longo termo.

Em particular, o composto e/ou composiçãofarmacêutica da invenção pode ser utilizado no tratamento decondições clinicas, tais como psicoses, tais como condiçõespsicóticas orgânicas pré-senil, psicoses alcoólicas,psicoses de fármacos, condições psicóticas orgânicastransientes, doença de Alzheimer, lipidoses cerebral,epilepsia, paresia geral (sifilis), degeneraçãohepatolenticular, coréia de Huntington, doença de Jakob-Creutzfeldt, esclerose múltipla, doença de Pick do cérebro,sifilis, distúrbios esquizofrênicos, psicoses afetivas,distúrbios neuróticos, distúrbios de personalidade,incluindo caráter neurose, distúrbio de personalidade nãopsicótica associada com síndromes de cérebro orgânica,distúrbio de personalidade paranóide, personalidadefanática, personalidade paranóica (distúrbio), traçosparanóicos, desvio e distúrbios sexual, retardo mental,doença no sistema nervoso e sentidos órgãos, anomaliascognitivas, doença inflamatória do sistema nervoso central,tais como meningite, encefalite, degenerações cerebrais taiscomo doença de Alzheimer, doença de Pick, degeneração senildo cérebro, comunicação hidrocéfalo, hidrocéfalo obstrutiva,doença de Parkinson incluindo outra doença piramidal extra edistúrbios do movimento anormal, doença espinocerebelar,ataxia cerebelar, de Maria, Sanger-Brown, dissinergiacerebellaris mioclônica, degeneração cerebelar primária,tais como atrofia muscular espinal, familiar, juvenil,atrofia muscular espinhal adulta, doença neuronal motora,esclerose lateral amiotrófica, doença neuronal motora,paralisia bulbar progressiva, paralisia pseudobulbar,esclerose lateral primária, outras doenças celulares docorno anterior, doença celular do corno anterior, nãoespecifica, outras doenças da espinha vertebral,siringomielia e siringobulbia, meilopatias vasculares,infarto agudo da espinha vertebral (embólico) (nãoembólico), trombose arterial da espinha vertebral, edema daespinha vertebral, mielopatia necrótica sub-aguda,degeneração da espinha vertebral combinada sub-aguda emdoenças classificadas em outro lugar, mielopatia, induzidapor fármaco, mielite induzida por radiação, distúrbios dosistema nervoso autonômico, distúrbios autonômicosperiféricos, simpatéticos, parassimpatéticos, ou sistemavegetativo, disautonomia familiar [sindrome Riley-Day],neuropatia autonômica periférica idiopática, sincope ousindrome do sinus da carótida, distrofia ou paralisiasimpatética cervical; neuropatia autonômica periférica emdistúrbios classificados em outro lugar, amiloidose, doençasdo sistema nervoso periférico, lesões do plexo braqueal,sindrome da costela cervical, sindrome costoclavicular,sindrome anterior escaleno, sindrome da saida torácica,neurite braquial ou radiculite, incluindo em recém nascido,inflamatória e neuropatia tóxica, incluindo polineuriteinfectiva aguda, sindrome de Guillain-Barre, polineuritepós-infecciosa, polineuropatia em doença vascular decolágeno, distúrbios afetando as múltiplas estruturas doolho, endoftalmite purulenta, doenças do ouvido e processomastóide, anormalidade de órgãos e tecidos leves em recémnascidos, incluindo no sistema nervoso, complicações daadministração de anestésico ou outra sedação em labor edistribuição, doenças na pele incluindo infecção, problemade circulação insuficiente, injúrias, incluindo apóscirurgia, injúria por esmagamento, queimaduras. Injúriaspara nervos e espinha vertebral, incluindo divisão do nervo,lesão na continuidade (com ou sem ferida aberta) , neuromatraumático (com ou sem ferida aberta), paralise transientetraumática (com ou sem ferida aberta), punção acidental oulaceração durante procedimento medido, injúria do nervoóptico e vias, injúria do nervo óptico, nervo cranianosegundo, injúria de quiasma óptico, injúria da vias ópticas,injúria do córtex visual, cegueira não especifica, injúriade outro(s) nervo(s) craniano(s), injúria de outros e nervosnão especificados. Envenenamento por fármacos, substânciasmedicinais e biológicas, distúrbios de atrofia musculartraumático ou genético; ou para o tratamento de doenças oucondições de vários órgãos, tais como condiçõesdegenerativas das gônadas, dos pâncreas, tais como diabetesmellitus tipo I e II, do rim, tal como nefrose.

Inflamação do cérebro é sempre conseqüência deinfecção, processos auto-imunes, toxinas, e outrascondições.

Infecções virais são relativamente causasfreqüentes desta condição. Encefalite pode ocorrer comomanifestação primária ou secundária de INFECÇÕES PORTO GAVIRIDAE; INFECÇÕES POR HERPESVIRIDAE; INFECÇÕES PORADENOVIRIDAE; INFECÇÕES POR FLAVIVIRIDAE; INFECÇÕES PORBUNYAVIRIDAE; INFECÇÕES POR PICORNAVIRIDAE; INFECÇÕES PORPARAMYXOVIRIDAE; INFECÇÕES POR ORTHOMYXOVIRIDAE; INFECÇÕESOR RETROVIRIDAE; e INFECÇÕES POR ARENAVIRIDAE.

Conseqüentemente, um peptideo, com posto oucomposição farmacêutica da invenção pode ser utilizada paratratamento de inflamação no cérebro associada com umainfecção viral.

Um grande corpo de dados clínicos e experimentaisindicam que a ativação do complemento é um mecanismoimportante para injúria neuronal e da glia nas síndromesGuillain-Barré. Inibição da ativação do complementoconseqüentemente pode ser esperado limitar a progressão dadoença (Halstead et al (2005) Annals of Neurology 58:203-21).

Então, em outra modalidade, uma seqüênciapeptídeo, um composto e composição farmacêutica podem serutilizados para tratamento da síndrome Guillain-Barré, duasformas variantes, tal como síndrome Miller Fisher, e outrosdistúrbios neuromusculares dependente de complemento.

Seqüências de peptídeo, compostos e composiçãofarmacêutica podem também ser utilizados para tratamento decriança com autismo.

Autismo é um distúrbio cerebral que começa cedo nainfância e persiste através da maioridade; afeta três áreascruciais do desenvolvimento: comunicação, interação social,e área criativa ou imaginativa. É estimado afligir entre 2 e5 de cada 1000 crianças e é quatro vezes mais provavelmentede acometer meninos que meninas. Crianças com autismo têmdificuldades em interação social e comunicação e podemmostrar comportamento repetitivo e ter ligações não usuais aobjetos ou rotinas.

Nos anos recentes, têm sido aconselhados deirregularidades do sistema imune em crianças com autismo.

Então, uma seqüência de peptideo, composto ou umacomposição compreendendo os mesmos podem vantajosamente serutilizados para tratamento de inflamação, em particularinflamação do cérebro.

Um aspecto adicional da invenção é um processo deprodução da composição farmacêutica, compreendendo misturade uma quantidade efetiva de um ou mais dos compostos dainvenção, ou uma composição farmacêutica de acordo com ainvenção com um ou mais aditivos ou veículosfarmaceuticamente aceitáveis, e administrar uma quantidadeefetiva de pelo menos um do referido composto, ou referidacomposição farmacêutica a um paciente.

Em uma modalidade do processo como mencionadoacima, os compostos são utilizados em combinação com umdispositivo prostético, em que o dispositivo é um guianervoso prostético. Então, em um aspecto adicional, apresente invenção relaciona-se a um guia nervoso prostético,caracterizado em que ele compreende um ou mais dos compostosou composição farmacêutica como definido acima. Guiasnervosos são conhecidos na técnica.

Outro aspecto da invenção relaciona-se ao uso deum composto como definido acima.

Em particular, o uso de um composto de acordo coma invenção é para a produção de uma composição farmacêutica.A composição farmacêutica é preferivelmente para otratamento ou profilaxia de qualquer das doenças e condiçõesmencionadas acima.Em ainda um aspecto adicional a invençãorelaciona-se a um método de tratamento de uma doença oucondição como discutida acima por administração de umcomposto como aqui definido.

Exemplos

1. Efeito de proteínas GDN, artemina e neurturinae fragmentos de peptídeo Al, A2, A3, Gl, G2, G3, Nl e N2derivados dessas proteínas na diferenciação celular neuronal.

Peptídeos

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Métodos

As diferentes versões do ensaio de crescimento deneurito foram utilizadas neste estudo, monoculturas e co-culturas.Em monoculturas, neurônios são crescidosdiretamente no plástico e somente o estimulo neuritogênico éum apresentado pela substância adicionada. Em co-culturas,neurônios são crescidos em cima de uma monocamada confluentede fibroblastos expressando NCAM-140 (LBNllO) oufibroblastos controles negativos NCAM (LVN212). NCAM nosneurônios interagem com NCAM ou células LBNllO assimestimulando o crescimento de neurito dos neurônios. Estesistema então permite o estudo de interações NCAM-NCAM einterações entre NCAM e ou-ETtars moléculas.

Para todos os experimentos células foram crescidasem meio neurobasal com suplementos como descrito acima em umvolume final de 300 μL/poço em lâminas Lab Tek® PermanoxChamber de 8 poços ou 500 μL/poço em lâminas Lab Tek®Permanox Chamber de 4 poços.

Para monoculturas, neurônios do hipocampo primárioforam plaqueados em lâminas Lab Tek® Permanox Chamber de 8poços em uma densidade de 10.000 células/poço.

Para co-culturas, células L foram plaqueadas emlâminas Lab Tek® Permanox Chamber de 8 poços em umadensidade de 100.000 células/poço, exceto para experimentosde transfecção onde células foram plaqueadas em lâminas LabTek® Permanox Chamber de 4 poços em uma densidade de 200.000células/poço. Células L foram crescidas por 24 horas em DMEMsuplementado com 10% (v/v) de SFB, 1% (v/v) de glutamax, 100U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina, 2,5 μg/mLde fungizona, e 567 μg/mL de neomicina (G418), seguido porduas lavagens em meio neurobasal com suplementos antes dosneurônios do hipocampo primário serem plaqueados em umadensidade de 7.000 células/poço em lâminas de 8 poços ou20.000 células/poço em lâminas de 4 poços.

Para avaliar os efeitos dos peptideos nocrescimento do neurito, GDNF e os peptideos, Gl, G2, G3, Al,A2, A3, NI, N2 e N3 foram diluídos para as concentraçõesapropriadas e adicionados aos neurônios aproximadamente 10minutos após cultura. Meio sozinho foi adicionado aoscontroles, e células foram incubadas por 24 horas.

Para avaliar o envolvimento de diferentes vias detransdução de sinal intracelular inibidores farmacológicos,em particular o inibidor de FGFR SU5402 e inibidor da Fyn-quinase PP2, foram diluídos às concentrações apropriadas eadicionados aos neurônios imediatamente após plaqueio. Após10 minutos GDNF, GDNFpl ou meio (controles) foi adicionado ecélulas foram incubadas por 24 horas.

Adicionalmente, neurônios foram transientementetransfectados com uma versão negativa dominante do FGFR(dnFGFR) . Como uma alternativa para o uso de um inibidorfarmacológico FGFR. O plasmídeo dnFGFR codifica um FGFR quenão possui o domínio quinase. Este receptor mutante inibe afunção do FGFR selvagem por unir em dímeros que faltam àatividade quinase. A transfecção com um vetor vazio serviucomo controle. Transfecção foi também feita com wtFGFR a fimde acessar o efeito da super-expressão do FGFR.

Para investigar o papel do NCAM-180 e NCAM-140,respectivamente, transfecções foram realizadas complasmídeos codificando ou o domínio citoplasmático de NCAM-180 ou NCAM-140. Os domínios citoplasmáticos superexpressoscompetem com os domínios citoplasmáticos das moléculas NCAMendógenas por alvos citoplasmáticos, provavelmentefuncionando como inibidores da sinalização de NCAM-180 ouNCAM-140. Transfecção com um vetor vazio serviu comocontrole.

Transfecções foram feitas com um dispositivoNucleofector® e um kit Rat Neuron Nucleofector® (Amaxa Inc.,Gaithersburg, MD, EUA). Este método de transfecção é baseadona eletroporação em combinação com uma solução Nucleofector®contendo agentes lipofílicos. Esses agentes formamlipossomos contendo o plasmídeo DNA, que então entra nascélulas durante a eletroporação. O método permite atransfecção de células não dividas tais como neurônios. 3 μgdo plasmídeo de interesse foram misturados com a soluçãoNucleofector® e neurônios do hipocampo primário foramressuspensos na mistura, eletroporado no dispositivoNucleofector®, e transferido para o meio neurobasal comsuplementos e 5% (v/v) de SFB. Células foram então incubadaspor 2 horas após os quais eles foram ressuspensos em meiosem soro, contadas, plaqueadas e incubados por 6 horas antesdo GDNF ou GDNFpl ser adicionado. Meio sozinho foiadicionado ao controle e células foram incubadas por 18horas.

Todas as transfecções transientes neste estudoincluíram co-transfecção com um plasmídeo codificando EGFP,que permite a identificação de células transfectadas. Paragarantir que todas as células expressando EGFP também sãotransfectadas com o plasmídeo de interesse, uma proporção de1:5 entre o plasmídeo codificando EGFP e o plasmídeo deinteresse foi utilizado (isto é, 0,5 μς de plasmídeocodificando EGFP foi utilizado para cada transfecção).

Experimentos de crescimento de neurito foramterminados após o tempo fixo por fixação das células. Paravisualizar neurônios e seus neuritos, imunocoloração de GAP-43 foi feita. Esta coloração é específica para neurônios.Células transfectadas e seus neuritos devem ser visíveis semimunocoloração devido a fluorescência emitida por GFP; Nesteestudo entretanto, foi encontrado que a intensidade dafluorescência própria do GFP foi muito fraco para prover aqualidade da imagem requerida para a própria identificaçãoou células transfectadas e análises de comprimentos deneuritos. GFP é uma proteína citoplasmática, e desde queneuritos finos somente contêm um volume pequeno decitoplasma, GFP é somente encontrado em pequenas quantidadesna maioria dos neuritos. Assim, um protocolo de coloraçãodupla, onde células foram imunocoradas contra GFP e GAP-43,foi adotado. Este protocolo permitiu a identificação decélulas transfectadas na base da coloração GFP em combinaçãocom visualização de neuritos baseada na coloração GAP-43.

Sem remoção prévia o meio de 300 μL/poço (lâminasde 8 poços) ou 500 μL/poço (lâminas de 4 poços) de umasolução de PBS contendo 0,4 mM de CaC12, 0,05 M de sacarosee 8% (v/v) de formaldeído foi adicionado para as culturaspor 20 minutos. Células foram então lavadas por 10 minutosem PBS seguido por lavagem em PBS com 1% (p/v) em BSA por 20minutos, após os quais as células foram incubadas comanticorpos primários por uma noite a 4°C.

Anticorpos de coelho anti-rato GAp-43 foramdiluídos 1:1000 para corar células não tranfectadas e 1:2000para corar células transfectadas. Anticorpos anti-GFP decamundongo foram diluídos 1:1000. Anticorpos foram diluídosem uma solução de PBS contendo 7% (v/v) de SFB para bloqueara ligação não específica, 50 mM de glicina para bloquear oformaldeído utilizando para fixação, 0,2% (v/v) de saponinapara permeabilizar células, e 0,02% (v/v) de NaN3 parapreservar anticorpos para uso tardio.

No próximo dia células foram lavadas por 10minutos em PBS seguido por lavagem em PBS com 1% (p/v) deBSA por 20 minutos. Células foram então incubadas comanticorpos secundários diluídos em PBS com 1% (p/v) BSA poruma hora em temperatura ambiente. Anticorpos cabra anti-coelho IgG conjugados a Alexa 488 foram diluídos 1:1000 paracélulas não transfectadas e 1:2000 para célulastransfectadas. Anticorpos cabra anti-camundongo IgGconjugados a Alexa 546 foram diluídos 1:1000. Finalmentecélulas foram lavadas 3x7 minutos em PBS e montadas com meiode aumentada fluorescência.

Microscópio fluorescente assistido por computadorfoi feito utilizando um microscópio invertido diafoto Nikon(Nikon, Tóquio, Japão) com uma objetiva Nikon Plan 20xacoplada a uma câmera de vídeo (Grungid ElectronicsGermany). Para cada condição em todos os experimentos deimagens de aproximadamente 200 células (células nãotransfectadas) ou 100 células (células transfectadas) foramobtidas em séries sistemáticas de campos de visão, em que aposição da primeira imagem foi escolhida aleatoriamente comodescrito por Ronn et al (2000c) . Este dá a todas as célulasuma chance igual de ser escolhida. Para cada campo de visãode células transfectadas coradas por GFP foi gravadaprimeiro (luz verde) antes de mudar a luz para azul e gravara coloração GAP-43. Luz foi então mudada para preto antes demover para o próximo campo de visão.

Crescimento de neurito foi analisado por contagemdo número de interseções entre neuritos e linhagens teste emuma estrutura de contagem imparcial utilizando um programapacote "ProcessLength" desenvolvido no Laboratório deProteína (Ronn et al, 2000). Crescimento do neurito podeentão ser quantificado como o número de interseções porcélulas, que se relaciona ao comprimento absoluto deneuritos (L) por células pela fórmula: L= ^dl)/2 (1= onúmero de interseções por células, d= a distancia verticalentre duas linhas paralelas na estrutura).

Resultados

Uma parte importante de diferenciação neuronal é ocrescimento de axons e dendritos, coletivamente conhecidocomo neuritos. O ensaio de crescimento de neurito é então umensaio de diferenciação neuronal, e é sempre utilizado parateste do potencial neuritogênico de uma dada substância. Emessência, neurônios são crescidos por certo período de tempoem presença da molécula de interesse, após o que ocrescimento de neuritos é quantificado. Além disso, pelaaplicação de diferentes inibidores, o mecanismo detransdução de sinal sustentando a resposta neuritogênicavista pode ser investigada.

2. Efeitos de peptideos derivados de GDNF,Artemina, Neurturina na sobrevivência neuronal.

Cultura celular primária

Neurônios Dopaminérgicos

Neurônios dopaminérgicos foram preparados deembriões de ratos Wistar no dia 15 embrionário (CharlesRiver, Sulzfeld, Germany or Mollegaard, Denmark). Uma ratagrávida foi sacrificada e o útero foi tomado e mantido nogelo em solução de sal balanceada de Hanks (HBSS; Gibco,BRL) . A parte ventral do mesencéfalo foi dissecada doscérebros embriônicos, homogeneizados no gelo na solução desal balanceada de Gey (GBSS; Gibco, BRL) suplementado com 5g de glicose/ L (Sigma-Aldrich) e depois tripsinizado. Ascélulas dissociadas foram lavadas em presença de DNAse 1 einibidor de tripsina de soja (Sigma-Aldrich).

Neurônios Granulares Cerebelares

Neurônios granulares cerebelares (CGN) forampreparados ratos Wistar sete dias após o nascimento largelycomo previamente descrito por Schousboe et al (1989). Tecidocerebelar foi dissecado em solução Krebs-Ringer modificadomantido no gelo, e tratada como descrito para os neurôniosdo hipocampo acima. Todas as culturas foram incubadas a 37°Cem uma atmosfera umidifiçada contendo 5% de CO2. Todos osanimais foram manuseados de acordo com as normas nacionaispara o bem estar animal.

Ensaio de Sobrevivência

Neurônios Dopaminérgicos

Neurônios dopaminérgicos foram plaqueados em umadensidade de 150.000 células/cm2 em placas de cultura decélula de 24 poços revestida com poli-D-lisina como descritoacima. Os neurônios foram deixados para diferenciar por seisdias sem ou com várias concentrações de peptideo, após osquais 6-OHDA foi adicionado em uma concentração de 100 μΜpor duas horas. Uma solução estoque foi preparada pordissolução de 6-OHDA a uma concentração de 10 mM em 0,1%(p/v) de metabissulf ito de sódio a fim de prevenir aoxidação. Após duas horas com 6-OHDA, o meio foi trocadopara meio Neurobasal com suplementos e peptideo, e asculturas celulares foram ainda incubados por 24 horas,fixados e imunocorados por tirosina hidroxilase, 98 imagenspara cada condição experimental em cada experimentoindividual foram automaticamente gravada por video.

Neurônios Granulares Cerebelares

Culturas primárias de CGN foram plaqueadas em umadensidade de 100.000 células/cm2 em lâminas permanox de 8poços revestido com poli-L-lisina em meio Neurobasal-A(Gibco, BRL) suplementado com 2% (v/v) B27, 0,5% (v/v) deglutamax, 100 /mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicinae KCl, fazendo a concentração final de KCl no meio 40 mM. 24horas após o plaqueio, citosina-p-D-arabinofuranosida (Ara-C; Sigma-Aldrich) foi adicionada a uma concentração final de10 μΜ para evitar proliferação de células da glia, após osquais os neurônios foram permitidos diferenciar por seisdias adicionais a 37°C. Morte celular apoptótica foiinduzida por lavar duas vezes e mudar o meio para Meio BasalEagle (BME; Gibco BRL) suplementado com 1% (v/v) glutamina,100 U/mL penicilina e 100 μς/mL estreptomicina, 3,5 D-glicose/L e 1% (v/v) piruvato de sódio (Gibco BRL) junto comvárias concentrações de peptídeo. Assim a concentração depotássio nas culturas foi reduzida a 5 mM de KCl (D'Mello etal, 1993) . Dois dias após a indução de apoptose, as célulasforam fixadas com 4% (v/v) de formaldeido e coradas comHoechst 33258 por 25 minutos como descrito por Kruman et al(1997). Imagens de 1000-1500 neurônios foram aleatoriamentegravados para cada grupo em cada experimento utilizandomicroscópio de fluorescência assistido por computador comodescrito para o ensaio de crescimento de neurito dohipocampo. Núcleos de neurônios mortos e vivos foramcontados utilizando o programa pacote Prima desenvolvido noLaboratório Proteína, e a fração dos neurônios vivosrelativos ao número total de neurônios foram estimadas.

Resultados

Resultados são revelados e resumidos na figura 25e figuras 29 a 33.

3. Ligação de peptídeos derivados de GDNF,artemina e neurturina para GFR e NCAM.

Análise de Ressonância Plasmon de Superfície (SPR)

Análises de ligação fora feitas empregando umInstrumento BIAcoreX (Biosensor AB, Uppsala, Suécia) a 25°Cutilizando 10 mM pH 7.4 de fosfato de sódio contendo 150 mMde NaCl como tampão de corrida (salina tamponada comfosfato, PBS) . A taxa de fluxo foi 5 μΐ,/min. Dados foramanalisados por ajuste de curva não linear utilizando oprograma do fabricante. O receptor de proteínas, porexemplo, NCAM Igl-Ig2 e proteínas GFR, foram imobilizadas emum chip sensor CM5 utilizando um kit acoplador amina(Biosensor AB) como segue: o chip foi ativado por 20 μΐϋ desolução de ativação; a proteína foi imobilizada utilizando12 μg/mL de proteína em 10 mM de tampão fosfato de sódio pH6.0; o chip foi bloqueado por 35 μΐϋ de solução bloqueadora.A curva correspondendo à diferença entre a ligação aoreceptor e um chip branco foi utilizado para análises.

Resultados

Resultados são revelados e resumidos nas figuras26 a 28 e figuras 34 a 38.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Copenhagen University<120> "Peptideos derivados de GDNF"<130> P1059PC00

<160> 25

<170> PantenIn versão 3.3

<210> 1<211> 15<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 1

Leu Asn Val Thr Asp Leu Gly Leu Gly Tyr Glu Thr Lys Glu Glu1 5 10 15

<210> 2<211> 15<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 2

Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu15 10 15

<210> 3<212> 23<222> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

Val Arg Val Ser Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Asp Glu Thr1 5 10 15

<210> 4<211> 15<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 4

Leu Ser Val Ala Glu Leu Gly Leu Gly Tyr Ala Ser Glu Glu Lys1 5 10 15

<210> 5<211> 17<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 5

Ile Asp Phe Arg Lys Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys

15 10 15

Gly

<210> 6<211> 17<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 6

Ile Asp Phe Lys Arg Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys

15 10 15

Gly

<210> 7<211> 17<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 7

Ile Asp Phe Arg Gln Asp Leu Gly Trp Lys Trp Val His Glu Pro Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 8<211> 18<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 8

Ile Asp Leu Gln Gly Met Lys Trp Ala Lys Asn Trp Val Leu Glu Pro

15 10 15

Pro Gly

<210> 9<211> 15<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 9

Glu Thr Thr Tyr Asp Lys Ile Leu Lys Asn Leu Ser Arg Asn Arg15 10 15

<210> 10<211> 15<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 10

Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly15 10 15<210> 11<211> 15<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Ala Arg Val Tyr Asp Leu Gly Leu Arg Arg Leu Arg Gln Arg Arg1 5 10 15

<210> 12<211> 15<212> PRT<213> Homo

sapiens

<4 00> 12

Arg Thr Gln His Gly Leu Ala Leu Ala Arg Leu Gln Gly Gln Gly15 10 15

<210> 13<211> 15<212> PRT<213> Homo

sapiens

<4 00> 13

Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn15 10 15

<210> 14<211> 15<212> PRT

<213> Homo sapiens

<4 00> 14Trp Ser Ser Asp Thr Gln His Ser Arg Val Leu Ser Leu Tyr Asn1 5 10 15

<210> 15<211> 15<212> PRT<213> Homo

sapiens

<400> 15

Arg Ser Ala Asp Thr Thr His Ser Thr Val Leu Gly Leu Tyr Asn1 5 10 15

<210> 16<211> 12<212> LRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

Asp Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr1 5 10

<210> 17<211> 12<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp15 10

<210> 18<211> 12<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 18

Asp Glu Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr1 5 10

<210> 19<211> 12<212> PRT<213> Homo

sapiens

<400> 19

Asp Val Ala Phe Leu Asp Asp Arg His Arg Trp Gln15 10

<210> 20<211> 12<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr Tyr Val Gly Arg Lys15 10

<210> 21<211> 12<212> PRT<213> Homo

sapiens

<400> 21

Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Ile Gly Lys Thr15 10

<210><211><212>

2212PRT<213> Homo sapiens

<400> 22

Glu Pro Leu Thr Ile Leu Tyr Tyr Val Gly Arg Thr1 5 10

<210> 23<211> 11<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Asp Leu Ser Phe Leu Asp Asp Asn Leu Val Tyr15 10

<210> 24<211> 11<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg15 10

<210> 25<211> 11<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

Glu Val Ser Phe Leu Asp Ala His Ser Arg Tyr15 10

Claims

1. Peptídeo CARACTERIZADO pelo fato de ter uma se-qüência de 6 a 22 resíduos aminoácidos contíguos compreen-dendo um motivo de fórmula: <formula>formula see original document page 109</formula> em queXa é resíduo aminoácido D, Ε, A ou G,(x) é uma seqüência de 2-3 resíduos aminoácidos ouum resíduo aminoácido único selecionado do grupo consistindode resíduos aminoácidos A, D, E, G, I, K, L, P, Q. S. T e V,Xb é resíduo aminoácido Y ou H, ou um resíduo ami-noácido hidrofóbico, e pelo menos um de Xe, Xd ou Xf é umresíduo aminoácido carregado ou hidrofóbico.

2. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que (x) é uma seqüência de doisresíduos aminoácidos.

3. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 2,CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência é L-G, K-I, L-S,G-L, T-Q ou T-T.

4. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que (x) é uma seqüência de trêsresíduos aminoácidos de fórmula L-x-G, em que χ é qualquerresíduo aminoácido.

5. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência L-Q-G.

6. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que (x) é um resíduo aminoácidoúnico selecionado de resíduos aminoácidos carregados ou hi-drofóbicos.

7. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 6,CARACTERIZADO pelo fato de que (x) é um resíduo aminoácidocarregado.

8. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 7,CARACTERIZADO pelo fato de que (x) é D ou E.

9. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 6,CARACTERIZADO pelo fato de que (x) é um resíduo aminoácidohidrofóbico.

10. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 9,CARACTERIZADO pelo fato de que (x) é A, P ou V.

11. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações precedentes 1-10, CARACTERIZADO pelo fato de queXa é D ou E.

12. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações precedentes 1-10, CARACTERIZADO pelo fato de queXa é G.

13. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações precedentes 1-10, CARACTERIZADO pelo fato de queXa é A.

14. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações precedentes 1-13, CARACTERIZADO pelo fato de queXb é A, L, V ou W.

15. Seqüência de peptídeo, de acordo com qualqueruma das reivindicações precedentes 1-13, CARACTERIZADO pelofato de que Xb é Y.

16. Peptideo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações precedentes 1-13, CARACTERIZADO pelo fato de queXb é H.

17. Peptideo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações precedentes 1-16, CARACTERIZADO pelo fato de quepelo menos um de Xe, Xd ou Xf é um resíduo aminoácido carregado.

18. Peptideo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações precedentes 1-16, CARACTERIZADO pelo fato de quepelo menos um de Xe, Xd ou Xf é um resíduo aminoácido hidro-fóbico.

19. Peptideo, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptideo compreen-de uma seqüência aminoácida de fórmulaX1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10em queX1 é um resíduo aminoácido selecionado de D, A, Eou H,X2 é um resíduo aminoácido selecionado de L, G, T,D, A, Ε, V ou P,X3 é um resíduo aminoácido selecionado de G, Q, I,S, G, L, Τ, V ou A,X4 é um resíduo aminoácido selecionado de L, W, G,A, Υ, H, S, F, P ou T,X5 um resíduo aminoácido selecionado de G, Κ, M, A,R, L, S, F ou I,X6 um resíduo aminoácido selecionado de Υ, H, W, K,N, S, R, A, M, L, D ou V,X7 é um resíduo aminoácido selecionado de E, R, A,I, V, Wf Lf D ou YfX8 é um resíduo aminoácido selecionado de T, S, HfL, R, D, V, A ou Y,X9 é um resíduo aminoácido selecionado de K, D, E,R, Gf Qf A, S, Ν, Η, V ou IfX10 é um resíduo aminoácido selecionado de Ε, Ρ, N,A, R, Gf L ou Sfem que a referida seqüência aminoácida está com-preendida no motivo conforme descrito na reivindicação 1.

20. Peptídeo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações 1-18 ou 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o re-ferido peptídeo compreende uma seqüência aminoácida selecio-nada das seqüências expostas nas SEQ ID NOs: l-22f ou umfragmento, variante ou homólogo da referida seqüência.

21. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo está compreendidoem uma seqüência selecionada deLNVTDLGLGYETKEE (SEQ ID NO:1)VPVRALGLGHRSDEL (SEQ ID NO:2)VRVSELGLGYASDET (SEQ ID NO:3) ouLSVAELGLGYASEEK (SEQ ID NO:4)

22. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo está compreendidoem uma seqüência selecionado deIDFRKDLGWKWIHEPKG (SEQ ID NO:5)IDFKRDLGWKWIHEPKG (SEQ ID NO:6)IDFRQDLGWKWVHEPKG (SEQ ID NO:7) ouIDLQGMKWAKNWVLE PPG (SEQ ID NO:8).

23. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo está compreendidoem uma seqüência selecionada deETTYDKILKNLSRNR (SEQ ID NO:9)RSPHDLSLASLLGAG (SEQ ID NO:10)ARVYDLGLRRLRQRR (SEQ ID NO:11) ouRTQHGLALARLQGQ (SEQ ID NO:12).

24. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo está compreendidoem uma seqüência selecionado deWSLDTQYSKVLALYN (SEQ ID NO:13)WSSDTQHSRVLSLYN (SEQ IS NO:14) ouRSADTTHSTVLGLYN (SEQ ID NO:15).

25. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo está compreendidoem uma seqüência selecionada deDDLSFLDDNLVY (SEQ ID NO:16)EAVSFMDVNSTW (SEQ ID NO:17)DEVSFLDAHSRY (SEQ ID NO:18) ouDVAFLDDRHRWQ (SEQ ID NO:19).

26. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo está compreendidoem uma seqüência selecionada deEPLPIVYYVGRK (SEQ ID NO:20)EPLTILYYIGKT (SEQ ID NO:21) ouEPLTILYYVGRT (SEQ ID NO:22),

27. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é deriva-do do fator neurotrófico derivado da glia (GDNF).

28. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 27,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo compreende uma se-qüência selecionada das seqüências de SEQ ID NOs: 1, 9 ou 18.

29. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é deriva-do de artemina.

30. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 29,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo compreende uma se-qüência selecionada das seqüências de SEQ ID NOs: 2, 10 ou 17.

31. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é deriva-do de neurturina.

32. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo compreende uma se-qüência selecionada das seqüências de SEQ ID NOs: 3, 11 ou 18.

33. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptídeo é deriva-do de persefina.

34. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptídeo compreende uma se-qüência selecionada das seqüências de SEQ ID NOs: 4, 12 ou 19.

35. Peptideo, de acordo com a reivindicação 20,CARACTERIZADO pelo fato de que o referido peptideo é deriva-do do fator transformador de crescimento beta-1 (TGF beta --1), fator transformador de crescimento beta-2 (TGF beta -2),fator transformador de crescimento beta-3 (TGF beta -3) oufator transformador de crescimento beta-4 (TGF beta -4).

36. Peptideo, de acordo com a reivindicação 35,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptideo compreende uma se-qüência selecionada das sequencias de SEQ ID NOs: 5-8, 13-15ou 20-22.

37. Peptideo, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de que oreferido peptideo é capaz de estimular a diferenciação deuma célula precursora neural, estimular o crescimento doneurito, estimular a sobrevivência celular neuronal, estimu-lar a plasticidade neural associada com memória e aprendiza-gem, e/ou inibir uma resposta inflamatória.

38. Um peptideo CARACTERIZADO pelo fato de consis-tir de qualquer das seguintes seqüênciasLNVTDLGLGYETKEE (SEQ ID N0:1)VPVRALGLGHRSDEL (SEQ ID NO:2)VRVSELGLGYASDET (SEQ ID NO:3)LSVAELGLGYASEEK (SEQ ID NO:4)IDFRKDLGWKWIHEPKG (SEQ ID NO:5)IDFKRDLGWKWIHEPKG (SEQ ID NO:6)IDFRQDLGWKWVHEPKG (SEQ ID NO:7)IDLQGMKWAKNWVLEPPG (SEQ ID NO:8) ETTYDKILKNLSRNR (SEQ ID NO:9)RSPHDLSLASLLGAG (SEQ ID NO: 10)ARVYDLGLRRLRQRR (SEQ ID NO: 11)RTQHGLALARLQGQG (SEQ ID NO: 12).WSLDTQYSKVLALYN (SEQ ID NO: 13)WSSDTQHSRVLSLYN (SEQ IS NO: 14)RSADTTHSTVLGLYN (SEQ ID NO: 15).DDLSFLDDNLVY (SEQ ID NO: 16) EAVSFMDVNSTW (SEQ ID NO: 17) DEVSFLDAHSRY (SEQ ID NO: 18) DVAFLDDRHRWQ (SEQ ID NO: 19) •EPLPIVYYVGRK (SEQ ID NO: 20) EPLTILYYIGKT (SEQ ID NO: 21) OUEPLTILYYVGRT (SEQ ID NO: 22) íou um fragmento, variante, ou homólogo do mesmo.

39. Peptideo, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que o fragmento é selecionado deDLSFLDDNLVY (SEQ· ID NO: 23)VSFMDVNSTWR (SEQ ID NO:24), ouEVSFLDAHSRY (SEQ ID NO:25).

40. Composto CARACTERIZADO pelo fato de compreen-der um peptideo de qualquer -uma das reivindicações preceden-tesl-39.

41. Composto, de acordo com a reivindicação 40,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptideo é formulado comomonômero consistindo de cópia única de uma seqüência de pep-tideo individual.

42. Composto, de acordo com a reivindicação 41,CARACTERIZADO pelo fato de que o peptideo é formulado comoum multímero consistindo de duas ou mais cópias de uma se-qüência peptideo individual, tais como um dimero ou tetrâme-ro de uma seqüência peptideo individual.

43. Composto, de acordo com a reivindicação 42,CARACTERIZADO pelo fato de que o multímero é um dendrímero.

44. Uso de um peptideo, de acordo com qualquer dasreivindicações 1-39 ou um composto de acordo com as reivin-dicações 40-43, CARACTERIZADO pelo fato de fabricar um medi-camento.

45. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fa-to de compreender um peptideo conforme descrito em qualquerdas reivindicações 1-39 e/ou composto conforme descrito con-forme as reivindicações 40-43.

46. Método de estimulação do crescimento do neuri-to, sobrevivência celular neural, diferenciação celular doprecursor neural e/ou inibição da inflamação CARACTERIZADOpelo fato de utilizar um peptideo conforme qualquer das rei-vindicações 1-39, composto conforme as reivindicações 40-43,ou composições farmacêutica conforme a reivindicação 45.

47. Uso de um peptideo, de acordo com as reivindi-cações 1-39, composto de acordo com as reivindicações 40-43,ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 45CARACTERIZADO pelo fato de ser para crescimento do neurito,sobrevivência celular neural, diferenciação celular de pre-cursor neural e/ou inibição da inflamação.

48. Uso de um peptideo, de acordo com as reivindi-cações 1-39, composto de acordo com as reivindicações 40-43,ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 45CARACTERIZADO pelo fato de tratar uma condição ou doença, emque o crescimento do neurito, sobrevivência celular neural,diferenciação celular de precursor neural e/ou inibição dainflamação é útil para tratamento.

49. Uso, de acordo com a reivindicação 48,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é umacondição ou doença do sistema nervoso central e periférico.

50. Uso, de acordo com a reivindicação 49,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é sele-cionada de dano nervoso pós-operatório, dano do nervo trau-mático, defeito da mielinação das fibras nervosas, danospós-isquêmicos, tais como após derrame, degeneração nervosaassociada com diabetes mellitus, distúrbios afetando o reló-gio circadiano ou transmissão neuromuscular.

51. Uso, de acordo com a reivindicação 48,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença selecio-nada de condições ou doenças dos músculos incluindo condi-ções com função defeituosa de conexões neuromusculares, taiscomo após transplante de órgão, ou tais como os distúrbiosmusculares genéticos ou atróficos traumáticos.

52. Uso, de acordo com a reivindicação 48,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é câncer.

53. Uso, de acordo com a reivindicação 52,CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é qualquer câncerenvolvendo neoangiogênese.

54. Uso, de acordo com a reivindicação 52,CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um câncer do sis-tema neural.

55. Uso, de acordo com a reivindicação 49,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é umahabilidade defeituosa de aprendizado e/ou memória defeituosa.

56. Uso, de acordo com a reivindicação 55,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é doençade Parkinson, doença de Alzheimer, doença de Huntington oudemência tal como demência multi-infarto.

57. Uso, de acordo com a reivindicação 49,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é umadoença mental, tais como uma distúrbio do pensamento e/ouhumor, distúrbios neuropsiquiátricos incluindo distúrbiosbipolar (BPD), geneticamente relacionados a distúrbios afe-tivos unipolares, distúrbios ilusórios, parafrenia, psicoseparanóica, esquizofrenia, distúrbio esquizotipo, distúrbioesquizoafetivo, distúrbios afetivos unipolares relacionadosgeneticamente e esquizoafetivo bipolar, psicose psicogênica,catatonia, distúrbios afetivos unipolares relacionados gene-ticamente e bipolar periódico, psicose ciclóide, distúrbiode personalidade esquizóide, distúrbio de personalidade pa-ranóide, distúrbios afetivos unipolares relacionados geneti-camente e bipolar relacionados a distúrbios afetivos e sub-tipos de distúrbio afetivo unipolar.

58. Uso, de acordo com a reivindicação 48,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença são osdanos corporais devido ao consumo de álcool.

59. Uso, de acordo com a reivindicação 48,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é umadoença prion.

60. Uso, de acordo com a reivindicação 47,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é carac-terizada pela presença de uma resposta inflamatória sustentada.

61. Uso, de acordo com a reivindicação 60,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é infla-mação do cérebro ou doença autoimune.

62. Uso, de acordo com a reivindicação 60,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é sín-drome de Guillain-Barré, sua forma variante, tal como sín-drome de Miller Fisher, ou outro complemento dependente dedistúrbio neuromuscular.

63. Uso, de acordo com a reivindicação 60,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é autismo.

64. Uso, de acordo com a reivindicação 61,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é umainfecção viral ou bacteriana.

65. Uso, de acordo com a reivindicação 60,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é umadoença autoimune periférica ou condição inflamatória.

66. Condição ou doença CARACTERIZADA pelo fato deser diabetes do tipo 1, artrite reumatóide, psoriase, dis-túrbios da pele, alergias variadas, glomerulonefrites, con-forme descrito na reivindicação 65

67. Uso de um peptideo, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1-39, ou um composto de acordo com as.reivindicações 40-43, CARACTERIZADO por ser para a produçãode um anticorpo.

68. Anticorpo capaz de reconhecer e ligar a um e-pitopo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o motivo ami-noácido conforme descrito na reivindicação 1 e/ou peptideoconforme descrito em qualquer das reivindicações 1-40.

69. Método de tratamento, CARACTERIZADO pelo fatode compreender a administração a um indivíduo em necessidadede uma quantidade efetiva de um peptideo conforme descritonas reivindicações 1-40, composto conforme descrito nas rei-vindicações 40-43, composição farmacêutica conforme descritana reivindicação 45 e/ou um anticorpo conforme descrito nareivindicação 61.