BRPI0614474A2 - composições melhoradas de toxina botulìnica - Google Patents

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Abstract

COMPOSIçõES MELHORADAS DE TOXINA BOTULINICA Uma composição farmacêutica de toxina botulíniça de potência elevada que compreende dois excipientes (tal como, albumina e cloreto de sódio) em uma relação de peso para peso dentre cerca de 1 e cerca de 100.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSIÇÕES MELHORADAS DE TOXINA BOTULÍNICA".
ANTECEDENTES
A presente invenção refere-se à composições farmacêuticas me·lhoradas de toxina botulínica. Em particular, a presente invenção refere-se àcomposições farmacêuticas de toxina botulínica com uma potência aumen-tada.
Uma composição farmacêutica é uma formulação que contémpelo menos um ingrediente ativo (tal como, por exemplo, uma toxina Clostrí-dica, tal como uma neurotoxina botulínica) como também, por exemplo, umou mais excipientes, tampões, veículos, estabilizadores, conservantes e/ouagentes encorpantes, e é adequada para administração para um pacientepara alcançar um efeito ou resultado desejado. As composições farmacêuti-cas descritas aqui podem ter utilidade de diagnóstico, terapêutica, cosméticae/ou de pesquisa em várias espécies, tal como, por exemplo, em pacientesou indivíduos humanos.
Para estabilidade de armazenamento e conveniência de manipu-lação, uma composição farmacêutica pode ser formulada como um pó seca-do a vácuo ou liofilizado (isto é, secagem por congelamento) que pode serreconstituído com um fluido adequado, tal como solução salina ou água, an-tes da administração a um paciente. Alternadamente, a composição farma-cêutica pode ser formulada como uma suspensão ou solução aquosa. Umacomposição farmacêutica pode conter um ingrediente ativo proteináceo. Infe-lizmente, um ingrediente ativo de proteína pode ser muito difícil para estabili-zar (isto é, mantido em um estado onde a perda de atividade biológica sejaminimizada), resultando então em uma perda de proteína e/ou perda de ati-vidade de proteína durante a formulação, reconstituição (se preciso for) edurante o período de armazenamento antes de uso de uma proteína quecontém composição farmacêutica. Os problemas de estabilidade de ingredi-ente ativo de proteína podem ocorrer por causa de desnaturação, degrada-ção, dimerização, e/ou polimerização da proteína. Vários excipientes, talcomo, albuminas, gelatinas, polissacarídeos e aminoácidos (nativos ou re-combinantes) têm sido empregados com graus diferentes de sucesso paratentar e estabilizar um ingrediente ativo de proteína presente em uma com-posição farmacêutica. Adicionalmente, os crioprotetores tal como álcooisforam empregados para reduzir a desnaturação de proteína sob as condi-ções de congelamento de liofilização.
As albuminas são proteínas de plasma pequenas, abundantes. Aalbumina de soro humano tem um peso molecular de cerca de 69 kiloDal-tons (kD) e tem sido empregada como um ingrediente não ativo em umacomposição farmacêutica onde pode servir como veículo de volume e estabi-lizador de certos ingredientes ativos de proteína, presentes em uma compo-sição farmacêutica.
A função de estabilização de albumina em uma composição far-macêutica pode estar presente tanto durante a formulação de multietapa dacomposição farmacêutica quanto na reconstituição posterior da composiçãofarmacêutica formulada. Desse modo, a estabilidade pode ser dada atravésde albumina a um ingrediente ativo proteináceo em uma composição farma-cêutica por, por exemplo, (1) redução da adesão (geralmente referido como"aderência") do ingrediente ativo de proteína às superfícies, tal como as su-perfícies de artigos de vidro de laboratório, recipientes, ao frasco no qual acomposição farmacêutica é reconstituída e à superfície interna de uma se-ringa empregada para injetar a composição farmacêutica. A adesão de umingrediente ativo de proteína às superfícies pode levar a perda de ingredien-te ativo e a desnaturação do ingrediente ativo de proteína retido restante,ambos dos quais reduzem a atividade total do ingrediente ativo presente nacomposição farmacêutica e; (2) redução da desnaturação do ingrediente ati-vo que pode ocorrer na preparação de uma solução de baixa diluição do in-grediente ativo.
Como também podendo estabilizar um ingrediente ativo de pro-teína em uma composição farmacêutica, a albumina de soro humano tam-bém tem a vantagem de imunogenicidade geralmente desprezível quandoinjetada em um paciente humano. Um composto com uma imunogenicidadeapreciável pode causar a produção de anticorpos contra ele o que pode Ie-var a uma reação anafilática e/ou ao desenvolvimento de resistência a fár-maco, com a doença ou distúrbio a ser tratado desse modo tornando-se po-tencialmente refratário à composição farmacêutica que tem um componenteimunogênico. A gelatina tem sido empregada em algumas composições far-macêuticas de ingrediente ativo de proteína como um substituto de albumina.
Toxina Botulínica
A bactéria gram positiva Clostridium botulinum anaeróbia, pro-duz uma neurotoxina de polipeptídeo potente, toxina botulínica que causauma doença neuroparalítica nos seres humanos e animais referidos comobotulismo. Clostridium botulinum e seus esporos são geralmente encontra-dos no solo e a bactéria pode crescer dentro de recipientes de comida im-propriamente lacrados e esterilizados de fábricas de conservas com baseem caseiros, que são a causa de muitos dos casos de botulismo. Os efeitosde botulismo tipicamente aparecem 18 a 36 horas após comer os alimentosinfectados com uma cultura ou esporos de Clostridium botulinum. A toxinabotulínica pode aparentemente passar desatenuada através do revestimentodo intestino e atacar os neurônios motores periféricos. Os sintomas de into-xicação de toxina botulínica podem progredir de dificuldade de caminhar,engolir, e falar a paralisia dos músculos respiratórios e morte.
A toxina botulínica tipo A é o agente biológico natural mais letalconhecido pelo homem. Aproximadamente 50 picogramas de toxina botulíni-ca (complexo de neurotoxina purificado) tipo A é um LD50 em camundongos.De forma interessante, em uma base molar, toxina botulínica tipo A é 1,8bilhão vezes mais letal do que a difteria, 600 milhões de vezes mais letal doque cianeto de sódio, 30 milhões de vezes mais letal que cobrotoxina e 12milhões de tempos mais letal que cólera. "Singh, Criticai Aspects of BacterialProtein Toxins", páginas 63-84 (capítulo 4) de Natural Toxins II, editado porB. R. Singh e outros, Plenum Press, Nova York (1976) (onde o LD5O declara-do de toxina botulínica tipo A de 0,3 ng se iguala a 1 U, é corrigido pelo fatoque cerca de 0,05 ng de BOTOX® se iguala a 1 unidade). Uma unidade (U)de toxina botulínica é definida como o LD50 em injeção intraperitoneal emcamundongos Suíços Webster femininos que pesam 18-20 gramas cada.
Em outras palavras, uma unidade de toxina botulínica é a quantidade de to-xina botulínica que mata 50% de um grupo de camundongos Suíços Webs-ter femininos. Sete neurotoxinas botulínicas geralmente imunologicamentedistintas têm sido caracterizadas, estas sendo respectivamente sorotipos deneurotoxina botulínica A, B, C1, D, E, F, e G cada das quais é distinguidaatravés de neutralização com anticorpos de tipo específico. Os sorotipos di-ferentes de toxina botulínica variam nas espécies animais que eles afetam ena severidade e duração da paralisia que eles evocam. Por exemplo, foi de-terminado que toxina botulínica tipo A é 500 vezes mais potente, quandomedida pela taxa de paralisia produzida no camundongo, do que é a toxinabotulínica tipo B. Adicionalmente, a toxina botulínica tipo B foi determinadaser não tóxica em primatas a uma dose de 480 U/kg que é cerca de 12 ve-zes o LD5O de primata para toxina botulínica tipo A. As toxinas botulínicasque aparentemente se ligam com afinidade elevada aos neurônios motorescolinérgicos, são translocadas no neurônio e bloqueiam a liberação pré-sinática de acetilcolina.
As toxinas botulínicas têm sido empregadas em ajustes clínicospara o tratamento de distúrbios neuromusculares caracterizados por múscu-los esqueléticos hiperativos. A toxina botulínica tipo A foi aprovada pela Ad-ministração de Droga e Comida dos Estados Unidos em 1989 para o trata-mento de blefaroespasmo essencial, estrabismo e espasmo hemifacial empacientes acima de doze anos de idade. Os efeitos clínicos de injeção perifé-rica (isto é, intramuscular ou subcutânea) de toxina botulínica tipo A sãonormalmente vistos dentro de uma semana de injeção, e freqüentementedentro de algumas horas após a injeção. A duração típica de alívio sintomá-tico (isto é, paralisia de músculo flácido) de uma única injeção intramuscularde toxina botulínica tipo A pode ser de cerca de três meses a cerca de seismeses.
Embora todos os sorotipos de toxinas botulínicas aparentementeinibam a liberação da acetilcolina neurotransmissora na junção neuromuscu-lar, eles a fazem então afetando proteínas neurosecretoras diferentes e/ouclivando estas proteínas em sítios diferentes. A toxina botulínica A é um en-dopeptidase de zinco que pode especificamente hidrolisar uma ligação depeptídeo da proteína associada à vesícula, intracelular, SNAP-25. BotulínicaTipo E também cliva a proteína associada sinaptossômica de 25 kiloDalton(kD) (SNAP-25), porém alveja as seqüências de aminoácido diferentes den-tro desta proteína, quando comparado com a toxina botulínica tipo A. A toxi-na botulínica tipos B, D, F e G atuam em proteína associada à vesícula(VAMP, também chamado sinaptobrevina), com cada sorotipo clivando aproteína em um sítio diferente. Finalmente, a toxina botulínica tipo C1 foimostrada clivar tanto sintaxina quanto SNAP-25. Estas diferenças no meca-nismo de ação podem afetar a duração e/ou potência relativa de ação dosvários sorotipos de toxina botulínica.
Independente do sorotipo, o mecanismo molecular de intoxica-ção de toxina parece ser similar e envolver pelo menos três etapas ou está-gios. Na primeira etapa do processo, a toxina se liga à membrana pré-sináptica do neurônio alvo através de uma interação específica entre a ca-deia pesada (cadeia H) e um receptor de superfície de célula; o receptor éconsiderado ser diferente para cada sorotipo de toxina botulínica e para toxi-na de tétano. O segmento final de carboxila da cadeia H, Hc, parece ser im-portante para o alvejamento da toxina à superfície de célula.
Na segunda etapa, a toxina cruza a membrana plasmática dacélula envenenada. A toxina é engolida primeiro pela célula através de en-docitose mediada pelo receptor, e um endossoma que contém a toxina éformado. A toxina em seguida escapa do endossoma no citoplasma da célu-la. Acredita-se que esta última etapa seja mediada pelo segmento final deamino da cadeia Η, Hn, que ativa uma alteração conformacional da toxinaem resposta a um pH de cerca de 5,5 ou mais baixo. Os endossomas sãoconhecidos por possuírem uma bomba de próton que diminui pH intra-endossômico. O desvio conformacional expõe os resíduos hidrofóbicos natoxina, que permite para a toxina se embutir na membrana endossômica. Atoxina em seguida se transloca através da membrana endossômica no citosol.A última etapa do mecanismo de atividade de toxina botulínicaparece envolver a redução de ligação de dissulfeto unindo a cadeia de L e H.A atividade tóxica inteira de toxinas botulínicas e de tétano é contida na ca-deia de L da holotoxina; a cadeia de L é um zinco (Zn++) endopeptidase queseletivamente cliva as proteínas essenciais para reconhecimento e acopla-mento de vesículas contendo neurotransmissores com a superfície citoplás-mica da membrana plasmática, e fusão das vesículas com a membranaplasmática. A neurotoxina de tétano, toxina botulínica B, D, F, e G causam adegradação de sinaptobrevina (também chamada proteína de membranaassociada à vesícula (VAMP)), uma proteína de membrana sinaptossômica.A maioria das VAMP presente na superfície cistólica da vesícula sináptica éremovida como um resultado de qualquer um destes eventos de clivagem.Cada toxina especificamente cliva uma ligação diferente.
O peso molecular da molécula de proteína de toxina botulínica,para todos os sete dos sorotipos de toxina botulínica conhecidos, é cerca de150 kD. De forma interessante, as toxinas botulínicas são liberadas atravésde bactérias Clostrídicas como complexos que compreendem a molécula deproteína de toxina botulínica de 150 kD junto com as proteínas de não toxinaassociadas. Desse modo, o complexo de toxina botulínica tipo A pode serproduzido através de bactéria Clostrídica como formas de 900 kD, 500 kD e300 kD. As toxinas botulínicas tipos B e C1 aparentemente são produzidascomo um complexo de somente 500 kD. A toxina botulínica tipo D é produzi-da com ambos complexos de 300 kD e 500 kD. Finalmente, as toxinas botu-línicas tipos EeF são produzidas como complexos de cerca de somente300 de kD. Acredita-se que os complexos (isto é peso molecular maior doque cerca de 150 kD) contenham uma proteína de hemaglutinina de não to-xina e uma proteína de não hemaglutinina não tóxica de não toxina. Estasduas proteínas de não toxina (que junto com a molécula de toxina botulínicapode compreender o complexo deneurotoxina relevante) podem atuar parafornecer estabilidade contra desnaturação à molécula de toxina botulínica eproteção contra ácidos digestivos quando a toxina é ingerida. Adicionalmen-te, é possível que os complexos de toxina botulínica maiores (maior do quecerca de 150 kD de peso molecular) possam resultar em uma taxa mais len-ta de difusão da toxina botulínica longe de um local de injeção intramuscularde um complexo de toxina botulínica. Os complexos de toxina podem serdissociados em proteína de toxina e proteínas de hemaglutinina tratando ocomplexo com células vermelhas do sangue em pH 7,3. A proteína de toxinatem uma instabilidade acentuada na remoção da proteína de hemaglutinina.
Todos os sorotipos de toxina botulínica são feitos através debactérias Clostridium botulinum como proteínas de cadeia única inativas quedevem ser clivadas ou cortadas através de protease para se tornar neuroati-vas. As cepas bacterianas que fabricam os sorotipos de toxina botulínica A eG possuem protease endógena e os sorotipos AeG pode então ser recupe-rado de culturas bacterianas em predominantemente sua forma ativa. Emcontraste, os sorotipos de toxina botulínica C1, D1 e E são sintetizados atra-vés de cepas não proteolíticas e são então tipicamente inativos quando re-cuperados de cultura. Os sorotipos BeF são produzidos através de ambasas cepas proteolíticas e não proteolíticas e então podem ser recuperados naforma ou ativa ou inativa. Entretanto, até mesmo as cepas proteolíticas queproduzem, por exemplo, o sorotipo tipo B de toxina botulínica somente cli-vam uma porção da toxina produzida. A proporção exata de moléculas cor-tadas e não cortadas depende da duração de incubação e da temperaturada cultura. Portanto, certa porcentagem de qualquer preparação, por exem-plo, da toxina tipo B de toxina botulínica é provável que seja inativa, possi-velmente sendo responsável pela potência significantemente mais baixa co-nhecida de toxina botulínica tipo B quando comparado com a toxina botulíni-ca tipo o A. A presença de moléculas de toxina botulínica inativas em umapreparação clínica contribuirá com a carga de proteína total da preparação,que tem sido unida a antigenicidade aumentada, sem contribuir com sua efi-cácia clínica. Adicionalmente, sabe-se que a toxina botulínica tipo B tem, eminjeção intramuscular, uma duração mais curta de atividade e também é me-nos potente do que a toxina botulínica tipo A no mesmo nível de dose.
Em estudos in vitro foi indicado que a toxina botulínica inibe ocátion de potássio induzido pela liberação tanto de acetilcolina quanto denorepinefrina de culturas de célula primária de tecido do tronco encefálico.Adicionalmente, foi reportado que a toxina botulínica inibe a liberação evo-cada tanto de glicina quanto de glutamato em culturas primárias de neurô-nios da espinha dorsal e que em preparações de sinaptossoma do cérebro atoxina botulínica inibe a liberação de cada dos neurotransmissores de acetil-colina, dopamina, norepinefrina, CGRP e glutamato.
A toxina botulínica tipo A cristalina de qualidade elevada podeser produzida da cepa Hall A de Clostridium botulinum com característicasde >3 X 10^7 U/mg, um Α26ο/Α27β de menos do que 0,60 e um padrão distintode bandas em eletroforese de gel. O processo de Schantz conhecido podeser empregado para obter toxina botulínica tipo A cristalina, como apresen-tado em Schantz, EJ. , e outros, "Properties and use of Botulinum toxin andOther Microbial Neurotoxins in Medicine", Microbiol Rev. 56: 80-99 (1992).Geralmente, o complexo de toxina botulínica tipo A pode ser isolado e podeser purificado de uma fermentação anaeróbia cultivando- se Clostridium bo-tulinum tipo A em um meio adequado. A toxina bruta pode ser colhida atra-vés de precipitação com ácido sulfúrico e pode ser concentrada através deultramicrofiltração. A purificação pode ser realizada dissolvendo-se o precipi-tado de ácido em cloreto de cálcio. A toxina pode em seguida ser precipitadacom etanol frio. O precipitado pode ser dissolvido em tampão de fosfato desódio e pode ser centrifugado. Na secagem podem então ser obtidos apro-ximadamente 900 kD de complexo de toxina botulínica tipo A cristalina comuma potência específica de 3 X 10^7 LD50 U/mg ou maior. Este processo co-nhecido também pode ser empregado, em separação das proteínas de nãotoxina, para obter toxinas botulínicas puras, tal como, por exemplo: toxinabotulínica tipo A purificada com um peso molecular de aproximadamente 150kD com uma potência específica de 1 -2 X 10^8 LD50 U/mg ou maior; toxinabotulínica tipo B purificada, com um peso molecular de aproximadamente156 kD com uma potência específica de 1-2 X 10^8 LD50 U/mg ou maior, e;toxina botulínica tipo F purificada com um peso molecular de aproximada-mente 155 kD com uma potência específica de 1 -2 X 10^7 LD50 U/mg oumaior.Um puro (isto é, toxina botulínica de 150 kDa livre das proteínascomplexas de não toxina) pode ser obtido carregando-se uma solução deum complexo de toxina botulínica sobre um cromatógrafo de permuta de í-ons adequado em um tampão de pH 8 para desassociar as proteínas com-plexas de não toxina da molécula de toxina botulínica de 150 kDa, dessemodo fornecendo (no fluxo através da coluna) uma solução de um compo-nente neurotóxico de toxina botulínica com um peso molecular de aproxima-damente 150 kD.
A toxina botulínica pura (isto é, o componente neurotóxico depeso molecular de aproximadamente 150 kDa de um complexo de toxinabotulínica) tem sido empregada para tratar os seres humanos. Vide, por e-xemplo, Kohl A., e outros, "Comparison of the effect ofbotulinum toxin A (Bo-tox (R)) with the highly-purified neurotoxin (NT 201) in the extensor digitorumbrevis muscle test", Mov Disord 2000;15(Suppl 3): 165. Conseqüentemente,uma composição farmacêutica de toxina botulínica pode ser preparada em-pregando-se uma toxina botulínica pura (aproximadamente 150 kDa), aoinvés do uso de um complexo de toxina botulínica. Uma toxina botulínica tipoA pura está disponível de Merz Pharmaceuticals sob o nome comercial XE-OMIN.
As toxinas botulínicas e complexos de toxina já preparados epurificados adequados para preparar formulações farmacêuticas podem serobtidos de "List Biological Laboratories, Inc.", Campbell, Califórnia; the Cen-tre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, U.K.; Wako (Osa-ka, Japão), como também de Sigma Chemicals de St Louis1 Missouri.
Os exemplos de uso clínico de uma toxina botulínica são:
(1) cerca de 75-125 unidades de BOTOX®1 por injeção intramus-cular (músculos múltiplos) tratar distonia cervical;
(2) 5-10 unidades de BOTOX® por injeção intramuscular paratratar linhagens glabelares (sulcos da sobrancelha) (5 unidades injetadasintramuscularmente no músculo prócero e 10 unidades injetadas intramuscu-Iarmente em cada músculo corrugador das sobrancelhas);
(3) cerca de 30-80 unidades de BOTOX® para tratar constipaçãopor injeção intra-efíncter do músculo puborretal;
(4) cerca de 1-5 unidades por músculo de BOTOX® intramuscu-Iarmente injetado para tratar blefaroespasmo injetando-se no músculo orbi-cular do olho pré-társico lateral da pálpebra superior e o orbicular do olhopré-társico lateral da pálpebra inferior.
(5) tratar estrabismo, os músculos extra-oculares foram intra-muscularmente injetados com entre cerca de 1-5 unidades de BOTOX®, aquantidade injetada variando com base tanto no tamanho do músculo a serinjetado quando na extensão de paralisia de músculo desejado (isto é, quan-tidade de correção de dioptria desejada).
(6) tratar espasticidade do membro superior seguinte ao aciden-te vascular cerebral por injeções intramusculares de BOTOX® em cinco dife-rentes músculos flexores do membro superior, como segue:
(a) flexor profundo dos dedos: 7,5 U a 30 U
(b) flexor superficial dos dedos: 7,5 U a 30 U
(c) flexor ulnar do punho: 10 U a 40 U
(d) flexor radial do punho: 15 U a 60 U
(e) bíceps do braço: 50 U a 200 U. Cada um dos cinco músculosindicados foi injetado na mesma sessão de tratamento, de forma que o paci-ente receba de 90 U a 360 U de BOTOX® de músculo flexor do membro su-perior por injeção intramuscular em cada sessão de tratamento.
(7) tratar enxaqueca, injeção injetada pericranialmente (simetri-camente injetado no músculo glabelar, frontal e temporal) de 25 U de BO-TOX® mostrou benefício significante como um tratamento profilático de en-xaqueca comparado ao veículo como medido por medidas diminuídas defreqüência de enxaqueca, gravidade máxima, vomitando associado e uso demedicamento agudo durante o período de três meses que segue a injeçãode 25 U.
Sabe-se que a toxina botulínica tipo A pode ter uma eficácia du-rante até 12 meses (European J. Neurology 6 (Supp 4): S111-S1150:1999),e em algumas circunstâncias contanto que em 27 meses. O Laryngoscope109:1344-1346:1999. Entretanto, a duração habitual do efeito de uma inje-ção intramuscular de Botox® é tipicamente cerca de 3 a 4 meses.
O sucesso da toxina botulínica tipo A para tratar uma variedadede condições clínicas levou ao interesse por outros sorotipos de toxina botu-línica. A Patente Européia EP1112082 ("Formulações líquidas estáveis detoxina botulínica"), emitida em 31 de julho de 2002, reivindica uma formula-ção de toxina botulínica farmacêutica líquida estável que compreende umtampão (pH 5-6) e uma toxina botulínica, onde a formulação de toxina é es-tável como um líquido durante pelo menos um ano a temperaturas entre Ο-ΙΟ C ou pelo menos 6 meses a temperaturas entre 10 e 30 C. Tal formula-ção farmacêutica de toxina botulínica (uma modalidade da qual é comerci-almente vendido sob o nome comercial MyoBloc® ou NeuroBloc® por Solstí-cio Neurosciences, Inc., de San Diego, Califórnia) é preparada como umasolução líquida (nenhuma liofilização ou secagem a vácuo é realizada) quenão requer reconstituição antes do uso.
O Pedido de Patente Chinês CN 1215084A descreve uma toxinabotulínica tipo A livre de albumina formulada com gelatina, uma proteína de-rivada de animal. A Patente U.S. 6.087.327 também descreve uma composi-ção de toxina botulínica Tipo AeB formulada com gelatina.
A Patente U.S. 5.512.547 (Johnson e outros) intitulada "Compo-sição Farmacêutica de Neurotoxina botulínica e Método de Preparação" emi-tida em 30 de abril de 1996, reivindica uma formulação botulínica Tipo A pu-ra que compreende albumina e trealose, armazenamento estável a 37°C.
A Patente U.S. 5.756.468 (Johnson e outros) emitida em 26 demaio de 1998 ("Composições Farmacêuticas de Toxina Botulínica ou Neuro-toxina Botulínica e Método de Preparação"), e reivindica uma formulação detoxina botulínica Iiofilizada que compreende um tioalquila, albumina e trealo-se que podem ser armazenados entre 25°C e 42°C.
A Patente U.S. 5.696.077 (Johnson e outros) intitulada "Compo-sição Farmacêutica que Contém Complexo Botulínico B" emitida em 9 dedezembro de 1997 e reivindica que uma formação de complexo botulínicotipo B livre de cloreto de sódio, secada por congelamento, que compreendeum complexo tipo B e um excipiente de proteína.A Publicação de Pedido de Patente U.S. número 2003 0118598(Hunt) descreve o uso de vários excipientes tal como uma albumina recom-binante, colágeno ou um amido para estabilizar uma toxina botulínica.
Goodnough M.C., e outros, "Stabilization of botulinum toxin typeA during lyophilization", Appl Environ Microbiol 1992;58(10):3426-3428, e;Goodnough M.C., e outros, "Recovery of type-A botulinal toxin following lyo-philization", Acs Symposium Series 1994;567(-): 193-203 descubra formula-ções de toxina botulínica que compreendem albumina e cloreto de sódio emuma relação de cerca de 0,6:1 (isto é, 5 mg de BSA ou HSA por ml e 9 mgde NaCI por ml de solução de toxina botulínica reconstituída) e declara que aeliminação de cloreto de sódio da formulação de toxina botulínica (e aumen-to do HSA para até 9 mg/ml nas formulações livres de sal) contribuiu signifi-cantemente para obter uma formulação com toxina botulínica ativa.
A molécula de toxina botulínica (cera de 150 kDa), como tam-bém os complexos de toxina botulínica (cerca de 300-900 kDa), tal como ocomplexo de toxina tipo A, são extremamente suscetíveis a desnaturaçãodevido à desnaturação de superfície, calor, e condições alcalinas. A toxinainativa forma proteínas de toxóide que podem ser imunogênicas. Os anticor-pos resultantes podem tornar um paciente refratário à injeção de toxina.
Como no caso de enzimas geralmente, as atividades biológicasdas toxinas botulínicas (que são peptidases intracelulares) são dependentes,pelo menos em parte, de suas três conformações dimensionais. Desse mo-do, a toxina botulínica tipo A é desintoxicada através de calor, estiramentode superfície de várias substâncias químicas, e secagem de superfície. Adi-cionalmente, sabe-se que a diluição do complexo de toxina obtido pela cultu-ra conhecida, fermentação e purificação para concentrações de toxina muitomais baixas empregadas para formulação de composição farmacêutica, re-sulta na detoxificação rápida da toxina a menos que um agente estabilizanteadequado esteja presente. A diluição da toxina de quantidades de miligramapara uma solução que contém nánogramas por mililitro apresenta dificulda-des significantes por causa da perda rápida de toxicidade específica em talgrande diluição. Uma vez que a toxina botulínica pode ser empregada me-ses ou anos após a composição farmacêutica que contém toxina botulínicaser formulada, a toxina botulínica deve ser estabilizada com agente estabili-zante, tal como uma albumina ou gelatina. Adicionalmente, para estabilidadede armazenamento, a toxina botulínica pode ser processada em um estadosólido (isto é, um pó) por técnicas conhecidas de liofilização ou secagem avácuo.
Além, qualquer uma das condições de pH severo, temperatura efaixa de concentração requeridas para Iiofilizar (secar por congelamento) ousecar a vácuo uma composição farmacêutica que contém toxina botulínicaem um formato de armazenamento e transporte de toxina (pronta para usoou reconstituição por um médico) pode desintoxicar a toxina. Desse modo, agelatina e albumina de soro foram empregadas com um pouco de sucessopara estabilizar a toxina botulínica.
Uma composição farmacêutica que contém toxina botulínica co-mercialmente disponível é vendida sob a marca registrada BOTOX® (dispo-nível de Allergan, Inc., Irvine, Califórnia). BOTOX® consiste em um complexode toxina botulínica tipo A purificada, albumina de soro humano, e cloreto desódio embalado na forma estéril, secado a vácuo. A toxina botulínica tipo A éfeita de uma cultura da cepa HALL de Clostridium botulinum crescido em ummeio contendo amina N-Z e extrato de levedura. O complexo de toxina botu-línica tipo A é purificado da solução de cultura por uma série de precipita-ções ácidas para um complexo cristalino que consiste na proteína de toxinade peso molecular elevado ativa e uma proteína de hemaglutinina associa-da. O complexo cristalino é redissolvido em uma solução que contém solu-ção salina e albumina e filtrado estéril (0,2 mícron) antes de secagem a vá-cuo. BOTOX® pode ser reconstituído com solução salina estéril, não preser-vada antes de injeção intramuscular. Cada frasco de BOTOX® contém cercade 100 unidades (U) de complexo de toxina de Ciostridium botulinum tipo A,0,5 miligrama de albumina de soro humano e 0,9 miligramas de cloreto desódio em uma forma estéril, secada a vácuo sem um conservante.
Para reconstituir BOTOX® secado a vácuo, solução salina nor-mal estéril sem um conservante (0,9% de injeção de Cloreto de sódio) é em-pregada preparando-se a quantidade apropriada de diluente na seringa detamanho apropriado. Uma vez que BOTOX® é desnaturado borbulhando-seou por agitação violenta similar, o diluente é suavemente injetado no frasco.Por razões de esterilidade, o BOTOX® deveria ser administrado dentro decerca de 72 horas após a reconstituição. Durante este período de tempo,BOTOX® reconstituído é armazenado em um refrigerador (2° a 8°C). O BO-TOX® reconstituído é claro, incolor e livre de material particulado. O produtosecado a vácuo é armazenado em um congelador ou refrigerador.
Outras composições farmacêuticas que contêm toxina botulínicacomercialmente disponíveis incluem Dysport® (complexo de hemaglutininade toxina tipo A de Clostridium botulinum com albumina de soro humano elactose na formulação, disponível de Ipsen Limitado, Berkshire, REINO UNI-como um pó a ser reconstituído com 0,9% de cloreto de sódio antes douso), e MyoBloc® (uma solução injetável que compreende toxina botulínicatipo B, albumina de soro humano, succinato de sódio, e cloreto de sódio emcerca de pH 5,6, disponível de Elan Corporation, Dublin, Irlanda).
Foi reportado que uma alternativa adequada para albumina desoro humano como um estabilizador de toxina botulínica pode ser outra pro-teína ou alternativamente um composto de peso molecular baixo (não prote-ína). Carpender e outros, "lnteractions of StabiHzing Additives with ProteinsDuring Freeze-Thawing and Freeze-Drying, International Symposium on Bio-logical Product Freeze-Drying and Formulation", 24-26 de outubro de 1990;Karger (1992), 225-239.
Acredita-se que a albumina de soro humano funcione em umacomposição farmacêutica como mais que um mero agente encorpante. Des-se modo, a albumina aparentemente pode interagir com a toxina botulínicapara aumentar a potência da neurotoxina. Por exemplo, sabe-se que a al-bumina de soro bovino pode atuar como mais que um mero excipiente esta-bilizante para toxina botulínica tipo A, uma vez que a albumina de soro bovi-no aparentemente também acelera a taxa de catálise de substratos de pep-tídeo sintético, cujos substratos se assemelham ao substrato intraneuronalSNAP-25 para toxina botulínica tipo A Schmidt, e outros, "EndoproteinaseActivity of Type A Botulinum Neurotoxin Substrate Requirements and Activa-tion by Serum Aibumin, J. of Protein Chemistry", 16 (1), 19-26 (1997). Dessemodo, a albumina pode ter um efeito de potencialização, aparentemente afe-tando-se os cinéticos da taxa, na ação proteolítica intracelular de uma toxinabotulínica no substrato da toxina. Este efeito de potencialização pode serdevido a albumina que acompanhou a toxina botulínica sob endocitose datoxina em um neurônio alvo ou o efeito de potencialização pode ser devido àpresença preexistente da albumina citoplásmica dentro da proteína de neu-rônio antes da endocitose da toxina botulínica.
Acetilcolina
Tipicamente somente um único tipo de neurotransmissor de mo-lécula pequeno é liberado por cada tipo de neurônio no sistema nervoso domamífero. A acetilcolina neurotransmissora é segregada através de neurô-nios em muitas áreas do cérebro, porém especificamente pelas células pi-ramidais grandes do córtex motor, através de vários neurônios diferentesnos gânglios basais, pelos neurônios motores que inervam os músculos deesqueleto, pelos neurônios pré-gangliônicos do sistema nervoso autônomo(ambos simpáticos e párassimpáticos), pelos neurônios pós-gangliônicos dosistema nervoso parassimpático, e por alguns dos neurônios pós-gangliônicos do sistema nervoso simpático. Essencialmente, somente asfibras nervosas simpáticas pós-gangliônicas para as glândulas sudoríparas,os músculos piloeretor e alguns vasos sangüíneos são colinérgicos quandoa maioria dos neurônios pós-gangliônico do sistema nervoso simpático se-grega a norepinefrina neurotransmissora. Na maioria dos casos a acetilcoli-na tem um efeito excitatório. Entretanto, a acetilcolina é conhecida por terefeitos inibidores em algumas das terminações nervosas parassimpáticasperiféricas, tal como inibição da taxa cardíaca pelo nervo vagai.
Os sinais eferentes do sistema nervoso autônomo são transmiti-dos ao corpo através do sistema nervoso simpático ou sistema nervoso pa-rassimpático. Os neurônios pré-gangliônicos do sistema nervoso simpáticose estendem de corpos de célula de neurônio simpático pré-gangliônicaslocalizadas no chifre intermediolateral da espinha dorsal. As fibras nervosassimpáticas pré-gangliônicas, se estendem do corpo de célula, sinapse comneurônios pós-gangliônicos localizados ou em um gânglio simpático para-vertebral ou em um gânglio pré-vertebral. Desde então, os neurônios pré-gangliônicos de ambos o sistema nervoso simpático e parassimpático sãocolinérgicos, a aplicação de acetilcolina aos gânglios excitará ambos os neu-rônios pós-gangliônicos simpáticos e parassimpáticos.
A acetilcolina ativa dois tipos de receptores, receptores musca-rínicos e nicotínicos. Os receptores muscarínicos são encontrados em todasas células efetoras estimuladas pelos neurônios pós-gangliônicos, do siste-ma nervoso parassimpático como também naqueles estimulados pelos neu-rônios colinérgicos pós-gangliônicos do sistema nervoso simpático. Os re-ceptores nicotínicos são encontrados na medula adrenal, como também den-tro dos gânglios autônomos, isto é na superfície da célula do neurônio pós-gangliônico à sinapse entre os neurônios pré-gangliônicos e pós-gangliônicos de ambos os sistemas simpático e parassimpático. Os recepto-res nicotínicos também são encontrados em muitas terminações nervosasnão autônomas, por exemplo, nas membranas de fibras de músculo de es-queleto na junção neuromuscular.
A acetilcolina é liberada de neurônios colinérgicos quando vesí-culas pequenas, claras, intracelulares se fundem com a membrana de célulaneuronal pré-sináptica. Uma ampla variedade de células secretoras não neu-ronais, tal como, medula adrenal (como também a linhagem de célula PC12)e células ilhotas pancreáticas liberam catecolaminas e hormônio paratiróide,respectivamente, de grandes vesículas de núcleo denso. A linhagem de cé-lula PC12 é um clone de células de feocromocitoma de rato extensivamenteempregadas como um modelo de cultura de tecido para estudos de desen-volvimento de simpatoadrenal. A toxina botulínica inibe a liberação de ambosos tipos de compostos de ambos os tipos de células in vitro, permeabilizadas(como por eletroporação) ou por injeção direta da toxina na célula desnerva-da. A toxina botulínica também é conhecida por bloquear a liberação do glu-tamato neurotransmissor de culturas de célula de sinaptossomas corticais.
Uma junção neuromuscular é formada no músculo de esqueletopela proximidade de axônios para células de músculo. Um sinal transmitidoatravés dos resultados do sistema nervoso em uma ação potencial de axônioterminal, com ativação de canais de íon e liberação resultante da acetilcolinaneurotransmissora de vesículas sinápticas intraneuronais, por exemplo, naplaca terminal motora da junção neuromuscular. A acetilcolina cruza o espa-ço extracelular para se ligar com as proteínas receptoras de acetilcolina nasuperfície da placa terminal do músculo. Uma vez que a ligação suficienteocorreu, um potencial de ação da célula do músculo causa alterações docanal de íon da membrana específica, resultando em contração da célula domúsculo. A acetilcolina é então liberada das células do músculo e metaboli-zada através de colinesterases no espaço extracelular. Os metabólitos sãorecirculadas de volta no axônio terminal para reprocessamento em outra a -cetilcolina.
Desse modo, o que é necessário é um processo para prepararuma formulação farmacêutica de toxina botulínica onde pouca ou nenhumatoxina botulínica seja perdida durante a composição do processo. Alternati-vamente declarado, o que é necessário é um processo para preparar umaformulação farmacêutica de toxina botulínica que permite uma recuperaçãoelevada da toxina botulínica após a reconstituição. A perda de toxina botulí-nica durante a composição (que leva a uma recuperação inferior) apresentaa possibilidade de toxina inativa (toxóide) estar presente no produto final re-constituído, desse modo aumentando um potencial antigênico do produtosob administração a um paciente. O ideal teórico é ter 100% da toxina botu-línica que entra no processo de composição presente no produto final re-constituído e presente como toxina botulínica biologicamente ativa.
O que também é necessário, portanto, é uma composição far-macêutica que contém toxina botulínica com uma potência mais elevada,quando comparada com as potências de composições farmacêuticas conhe-cidas de toxina botulínica. Expresso de uma maneira alternativa, o que énecessário é uma composição farmacêutica de toxina botulínica com umapotência mais elevada da toxina botulínica para cada nanograma da toxinabotulínica presente na composição farmacêutica de toxina botulínica.SUMÁRIO
A presente invenção atende esta necessidade de fornecer umprocesso para preparar uma formulação farmacêutica de toxina botulínica naqual pouca ou nenhuma toxina botulínica é perdida durante o processo decomposição. Alternativamente declarado, um processo no escopo da pre-sente invenção permite a preparação de uma formulação farmacêutica detoxina botulínica com uma recuperação elevada da toxina botulínica após areconstituição. Significantemente, os processos no escopo da presente in-venção abrangem o ideal teórico permitindo-se que cerca de 100% da toxinabotulínica que entra no processo de composição esteja presente no produtofinal reconstituído como toxina botulínica biologicamente ativa.
Adicionalmente a presente invenção atende às necessidadesexpressas acima se fornecendo-se uma composição farmacêutica toxinabotulínica com uma potência mais elevada (isto é, um aumento), quandocomparado com as potências de composições farmacêuticas conhecidas detoxina botulínica. Em particular, a presente invenção atende a esta necessi-dade fornecendo-se uma composição farmacêutica de toxina botulínica empó (devido, por exemplo, a secagem por congelamento, liofilização e/ou se-cagem a vácuo) que sob (isto é, depois de) reconstituição com um fluido a-quoso (tal como solução salina ou água) tem uma potência aumentada (co-mo determinado, por exemplo, pelo ensaio de LD50 de camundongo), quan-do comparado com a potência após a reconstituição com um fluido aquosode uma composição farmacêutica de toxina botulínica em pó conhecida (talcomo Botox® ou Dysport®). A potência na reconstituição pode ser referidacomo potência "após" recuperação. Conseqüentemente, a presente inven-ção inclui uma composição farmacêutica de toxina botulínica com uma po-tência aumentada na recuperação, ou sinonímamente com uma potência derecuperação ou recuperada aumentada.
Brevemente, um aspecto importante da presente invenção paraatender estas necessidades duais de uma conservação elevada (isto é, per-da baixa ou pequena) da quantidade da toxina botulínica que entra em umprocesso de composição (quando comparado com a quantidade de toxinabotulínica ativa presente no produto final composto), e uma potência recupe-rada de composição farmacêutica de toxina botulínica elevada, é obtidocompondo-se a composição farmacêutica de toxina botulínica de forma sóli-da tal que dois dos excipientes presentes na composição farmacêutica detoxina botulínica estejam presentes, pelo menos durante o processo decomposição, em uma relação de peso para peso particular ou em uma faixade relação de peso para peso particular.
DEFINIÇÕES
Como empregado aqui, as palavras ou apresentados abaixo têmas seguintes definições.
"Cerca de" significa que o item, parâmetro ou termo então quali-ficado abrange uma faixa de mais ou menos dez por cento acima e abaixodo valor do item, parâmetro ou termo declarado.
"Administração", ou "administrador" significa a etapa de dar (istoé, administrar) uma composição farmacêutica a um indivíduo. As composi-ções farmacêuticas descritas aqui são "administradas localmente". As roti-nas sistêmicas (isto é, intravenosa ou oral) de administração são excluídasdo escopo da presente invenção, na medida onde uma administração sistê-mica resultaria em efeitos sistêmicos de um ingrediente ativo sistemicamenteadministrado. A administração sistêmica de um ingrediente ativo alvejadoque não resulta em efeitos sistêmicos não é excluída do escopo da presenteinvenção (vide, por exemplo, Pedidos de Patentes dos Estados Unidos pu-blicados 20040086532 e 20040086531). A administração local inclui, porémnão está limitada a, administração intramuscular (i.m.), administração intra-dérmica ou subdérmica, administração subcutânea, administração intratecal,administração intraperitoneal (i.p.), contato tópico, e implantação de um dis-positivo de liberação lenta tal como implante polimérico ou bomba miniosmótica.
"Toxina botulínica" significa uma neurotoxina produzida por Clos-tridium botulinum, como também uma toxina botulínica (ou a cadeia leve oua cadeia pesada desta) feita recombinantemente por uma espécie não Clos-trídica. A frase "toxina botulínica", como empregado aqui, abrange os soroti-pos de toxina botulínica A, B, C, D, E, F e G. A toxina botulínica, como em-pregado aqui, também abrange igualmente um complexo de toxina botulínica(isto é, os complexos de 300, 600 e 900 kDa) como também a toxina botulí-nica purificada (isto é, cerca de 150 kDa). A "toxina botulínica purificada" (oupura) é definida como uma toxina botulínica que é isolada, ou substancial-mente isolada, de outras proteínas, incluindo proteínas que formam umcomplexo de toxina botulínica. Uma toxina botulínica purificada (ou pura)pode ser maior do que 95% pura, e preferivelmente é maior do que 99% pura.
"Neurotoxina Clostrídica" significa uma neurotoxina produzidade, ou nativo para, uma bactéria Clostrídica, tal como Clostridium botuiinum,Clostridium butyricum ou Clostridium beratti, como também uma neurotoxinaClostrídica feita recombinantemente por uma espécie não Clostrídica.
"Potência realçada" com respeito a uma composição farmacêuti-ca que contém toxina botulínica significa que a composição tem uma potên-cia (como determinado, por exemplo, pelo ensaio de LD50 de camundongo)que é de pelo menos 5% e até 50%, ou mais, maior do que a potência deuma composição farmacêutica de toxina botulínica de referência. Uma com-posição farmacêutica de toxina botulínica de referência pode conter umatoxina botulínica, cloreto de sódio e HSA, onde a albumina e o cloreto desódio estão presentes em uma relação de peso para peso de cerca de 0,6:1.
"Completamente livre" (isto é, terminologia "consistindo em")significa que na faixa de detecção do instrumento ou processo sendo em-pregado, a substância não pode ser detectada ou sua presença não podeser confirmada.
"Essencialmente livre" (ou "consistindo essencialmente em") sig-nifica que somente quantidades de traço da substância podem ser detectadas.
"Excipiente" significa uma substância presente em uma compo-sição farmacêutica diferente do ingrediente farmacêutico ativo presente nacomposição farmacêutica. Um excipiente pode ser um tampão, veículo, es-tabilizador, conservante, diluente, veículo, e/ou agente encorpante, tal comouma albumina, gelatina, colágeno e/ou cloreto de sódio.
"Imobilização" significa uma etapa que impede um indivíduo demover uma ou mais partes do corpo. Se um número suficiente de partes docorpo está imobilizado, o indivíduo será conseqüentemente imobilizado.Desse modo, "imobilização" abrange a !'mobilização de uma parte de corpo,tal como um membro, e/ou a imobilização completa de um indivíduo.
"Toxina botulínica modificada" significa uma toxina botulínicaque teve pelo menos um de seus aminoácidos deletado, modificado, ousubstituído, quando comparado com uma toxina botulínica nativa. Adicio-nalmente, a toxina botulínica modificada pode ser uma neurotoxina recombi-nantemente produzida, ou um derivado ou fragmento de uma neurotoxinarecombinantemente feita. Uma toxina botulínica modificada retém pelo me-nos uma atividade biológica da toxina botulínica nativa, tal como, a capaci-dade de se ligar a um receptor de toxina botulínica, ou a capacidade de inibira liberação de neurotransmissor de um neurônio. Um exemplo de uma toxinabotulínica modificada é uma toxina botulínica que tem uma cadeia leve deum sorotipo de toxina botulínica (tal como sorotipo A), e uma cadeia pesadade um sorotipo de toxina botulínica diferente (tal como, sorotipo B). Outroexemplo de uma toxina botulínica modificada é uma toxina botulínica aco-plada a um neurotransmissor, tal como, substância P.
"Pacientes" significa um indivíduo humano ou não humano rece-bendo cuidado médico ou veterinário. Conseqüentemente, como descobertoaqui, as composições podem ser empregadas para tratar qualquer animal,tal como os mamíferos.
"Composição farmacêutica" significa uma formulação na qual umingrediente ativo pode ser uma neurotoxina, tal como uma neurotoxina Clos-trídica. A palavra "formulação" significa que há pelo menos um ingredienteadicional na composição farmacêutica além de um ingrediente ativo de neu-rotoxina. Uma composição farmacêutica é então uma formulação que é ade-quada para uso de diagnóstico, terapêutico ou cosmético (isto é, através deinjeção intramuscular ou subcutânea ou por inserção de um depósito ou im-plante) a um indivíduo, tal como um paciente humano. A composição farma-cêutica pode estar: em uma condição secada a vácuo ou liofilizada; uma so-lução formada após reconstituição da composição farmacêutica liofilizada ousecada a vácuo com solução salina ou água, ou; como uma solução que nãorequer reconstituição. O ingrediente ativo de neurotoxina pode ser um dossorotipos de toxina botulínica A, B, C-i, D1 E, F ou G ou uma toxina de tétano,todos dos quais podem ser feitos nativamente através de bactérias Clostrídi-cas. Como declarado, uma composição farmacêutica pode ser líquida ousólida, por exemplo, secada a vácuo. Os ingredientes constituintes de umacomposição farmacêutica podem ser incluídos em uma única composição(isto é, todos os ingredientes constituintes, com exceção de qualquer fluidode reconstituição exigido, estão presentes na hora da composição inicial dacomposição farmacêutica) ou como um sistema de dois componentes, porexemplo, uma composição secada a vácuo reconstituída com um diluente talcomo solução salina cujo diluente contém um ingrediente (tal como, água)não presente na composição inicial da composição farmacêutica.
"Polissacarídeo" significa um polímero de mais do que dois mo-nômeros de molécula de sacarídeo cujos monômeros podem ser idênticosou diferentes.
"Estabilizador de proteína" (ou "estabilizador primário") é um a-gente químico que ajuda a preservar ou manter a estrutura biológica (isto é,as três conformações dimensionais) e/ou a atividade biológica de uma prote-ína (tal como, uma neurotoxina Clostrídica, tal como uma toxina botulínica).
Os estabilizadores podem ser proteínas ou polissacarídeos. Os exemplos deestabilizadores de proteína incluem amido de hidroxietila (teta-amido), albu-mina de soro, gelatina, colágeno, como também uma albumina recombinan-te, gelatina ou colágeno. Como descrito aqui, o estabilizador primário podeser um agente sintético que não produziria uma resposta imunogênica (ouproduz uma resposta imune atenuada) em um indivíduo recebendo umacomposição que contém o estabilizador primário. Em outras modalidades dainvenção, os estabilizadores de proteína podem ser proteínas das mesmasespécies do animal que está sendo administrado pela proteína. Os estabili-zadores adicionais também podem ser incluídos em uma composição farma-cêutica. Estes estabilizadores adicionais ou secundários podem ser empre-gados sozinhos ou em combinação com estabilizadores primários, tal comoproteínas e polissacarídeos. Os estabilizadores secundários exemplares in-cluem, porém não estão limitados a, derivados de aminoácido não oxidantes(tal como, um derivado de triptofano, tal como N - acetil-triptofano (" NAT")),caprilato (isto é, caprilato de sódio), um polissorbato (isto é, P80), aminoáci-dos, e cátions de metal divalente, tal como zinco. Uma composição farma-cêutica também pode incluir os agentes conservantes tal como álcool benzí-lico, ácido benzóico, fenol, parabenos e ácido sórbico. Um "estabilizador re-combinante" é um "estabilizador primário" feito por meios recombinantes, talcomo, por exemplo, uma albumina recombinantemente feita (tal como, umaalbumina de soro humano recombinantemente feita), colágeno, gelatina ouum cresol, tal como um M-cresol.
"Estabilizando", "estabiliza", ou "estabilização" significa que umingrediente ativo farmacêutico (" PAI") retém pelo menos 20% e até 100% desua atividade biológica (que pode ser avaliada como potência ou como toxi-cidade por uma medição de LD50 ou ED50 in vivo) na presença de um com-posto que está estabilizando, estabiliza ou que fornece estabilização ao PAI.Por exemplo, em (1) preparação de diluições seriais de uma solução de ma-téria-prima ou volume, ou (2) em reconstituição com solução salina ou águade uma composição farmacêutica que contém toxina botulínica liofilizada, ousecada a vácuo à qual foi armazenada em ou abaixo de cerca de -2°C du-rante entre seis meses e quatro anos, ou (3) para uma composição farma-cêutica que contém toxina botulínica de solução aquosa que foi armazenadaa entre cerca de 2o e cerca de 8°C durante seis meses a quatro anos, a toxi-na botulínica presente na composição farmacêutica de solução aquosa oureconstituída tem (na presença de um composto que está estabilizando, es-tabiliza ou que fornece estabilização ao PAI) mais do que cerca de 20% eaté cerca de 100% da potência ou toxicidade que a toxina botulínica biologi-camente ativa teve antes de ser incorporada na composição farmacêutica.
"Substancialmente livre" significa presente a um nível de menosdo que um por cento em peso da composição farmacêutica."Formulação terapêutica" significa que uma formulação pode serempregada para tratar e desse modo aliviar um distúrbio ou uma doença, talcomo um distúrbio ou uma doença caracterizada por hiperatividade (isto é,espasticidade) de um músculo periférico.
Uma composição farmacêutica no escopo da invenção podecompreender uma toxina Clostrídica, tal como uma toxina botulínica, e umexcipiente que atua para estabilizar a composição farmacêutica de toxina Ano escopo da invenção também pode consistir essencialmente em uma toxi-na botulínica, e um estabilizador. Adicionalmente, a composição farmacêuti-ca no escopo da invenção pode consistir em uma toxina botulínica, e umestabilizador recombinante.
A toxina botulínica pode estar presente como um complexo detoxina botulínica (isto é, como um complexo de cerca de 300 kiloDalton acerca de 900 kiloDalton, dependendo do sorotipo de toxina botulínica parti-cular empregado) ou a toxina botulínica pode está presente como uma toxi-na botulínica purificada ou pura (significando presente como o componenteneurotóxico de cerca de 150 kiloDalton de um complexo de toxina botulínica)que é livre, substancialmente ou essencialmente livre de qualquer proteínado complexo de toxina botulínica (isto é, removida da associação das proteí-nas HA e NTNH). Desse modo, como mostrado pela Figura 1, uma toxinabotulínica feita naturalmente pela bactéria Clostridium botulinum é feita tipi-camente como um complexo compreendendo a molécula de toxina botulíni-ca (uma proteína com um peso molecular de cerca de 150 kiloDaltons) (tam-bém referida como o componente neurotóxico) e uma disposição de proteí-nas não tóxicas (hemaglutininas e não hemaglutininas) em uma associaçãoestrita, entretanto não covalente com o componente neurotóxico. Desse mo-do, como mostrado pela Figura 1, pode haver até cerca de sete moléculasnão neurotóxicas (peso total de cerca de 750 kDa) associadas (não covalen-temente) com o (cerca de 150 kDa) componente neurotóxico para formar umcomplexo de neurotoxina botulínica tipo A de 900 kDa. Na Figura 1: HA =NTHA = uma hemaglutinina não tóxica; LC = cadeia leve (cerca de 50 kDa);HC = cadeia pesada (cerca de 100 kDa); - S-S - = a ligação de dissulfetoúnica que une o LC e o HC, e; Zn = um átomo de zinco (toxina botulínica éum zinco endopeptidase). Conseqüentemente, LC mais HC é uma moléculacom um peso molecular de cerca de 150 kDa, e este é o componente neuro-tóxico do (no caso de toxina botulínica tipo A) complexo de 900 kDa.
Qualquer estabilizador recombinante que estiver presente emuma composição farmacêutica dentro do escopo da invenção pode ser umaalbumina recombinante, um colágeno recombinante, uma gelatina de re-combinante e/ou outro estabilizador primário recombinante. A composiçãofarmacêutica também pode compreender um estabilizador secundário, talcomo um metal (isto é, zinco) ou NAT.
Significantemente, uma composição farmacêutica dentro do es-copo da invenção pode ter uma potência ou estabilidade aumentada. Porpotência aumentada é entendido que a potência de uma primeira composi-ção farmacêutica de toxina botulínica é maior do que a potência de uma se-gunda composição farmacêutica de toxina botulínica. Por exemplo, uma pri-meira composição farmacêutica de toxina botulínica pode ter uma relaçãoparticular (tal como, 28:1) de dois excipientes (tal como, albumina e cloretode sódio) presente na primeira composição. Uma segunda composição far-macêutica de toxina botulínica pode ter uma relação conhecida (tal como,cerca de 0,6:1) dos mesmos dois excipientes (isto é albumina e cloreto desódio) presentes na segunda composição. A potência e potências relativaspodem ser determinadas por um método empregado para determinar umaatividade biológica de uma toxina botulínica, tal como um ensaio de LD50 decamundongo. Geralmente, potência maior significa que uma quantidade me-nor (isto é, menos unidades) de uma composição farmacêutica de toxinabotulínica é requerida para paralisar um músculo. Preferivelmente, uma pri-meira composição farmacêutica de toxina botulínica tem pelo menos umapotência maior de 5 % (e até uma potência maior que 50%) do que faz a se-gunda composição farmacêutica de toxina botulínica.
Uma composição farmacêutica dentro do escopo da presenteinvenção também pode incluir uma neurotoxina, e um polissacarídeo. O po-lissacarídeo estabiliza a neurotoxina. As composições farmacêuticas descri-tas aqui podem ter um pH dentre cerca de 5 e 7,3 quando reconstituídas ousob injeção.
A composição farmacêutica é adequada para administração aum paciente humano para alcançar um efeito terapêutico, e a neurotoxinapode ser um dos sorotipos de toxina botulínica A, B, Ci, D, E, F e G.
Uma outra modalidade da presente invenção é um método parausar uma composição farmacêutica, o método compreendendo a etapa deadministração local da composição farmacêutica a um paciente para alcan-çar um efeito terapêutico ou cosmético.
Composições Farmacêuticas Particulares
A invenção abrange uma composição farmacêutica que compre-ende: (a) uma toxina botulínica; (b) um primeiro excipiente, onde o primeiroexcipiente é uma albumina, e;
(c) um segundo excipiente,
(d) onde a relação de peso para peso do primeiro excipiente pa-ra o segundo excipiente presente na composição farmacêutica é maior doque 0,6 e menos do que cerca de 100. A potência da toxina botulínica nestacomposição farmacêutica pode ser entre cerca de 5% maior e cerca de200% maior do que a potência de uma toxina botulínica em uma composiçãofarmacêutica de comparação. A composição farmacêutica de comparaçãopode conter: (a) a mesma quantidade e tipo de toxina botulínica, e; (b) osmesmos primeiro e segundo excipientes, como faz a composição farmacêu-tica, e; (c) os primeiro e segundo excipientes podem estar presentes na com-posição farmacêutica de comparação em uma relação de peso para peso de0,6 ou menos. Adicionalmente, a potência da toxina botulínica na composi-ção farmacêutica pode ser cerca de 10% maior e cerca de 100% maior doque a potência da toxina botulínica na composição farmacêutica de compa-ração. Nesta composição farmacêutica a toxina botulínica está presente co-mo um complexo de toxina botulínica ou a toxina botulínica pode estar pre-sente como uma toxina botulínica pura (isto é, como um componente neuro-tóxico com um peso molecular de cerca de 150 kiloDaltons, e em substanci-almente livre das proteínas do complexo de toxina botulínica).O primeiro excipiente na composição farmacêutica pode ser umaalbumina de soro ou uma albumina recombinante. O segundo excipiente nacomposição farmacêutica pode ser cloreto de sódio. A relação de peso parapeso do primeiro excipiente para o segundo excipiente presente na compo-sição farmacêutica é entre cerca de 1 e cerca de 50.
Uma modalidade detalhada de uma composição farmacêuticadentro do escopo da invenção pode compreender: (a) entre cerca de 2,0 X10"11 gramas e cerca de 3,5 X 10~11 gramas de um toxina botulínica tipo Apara cada unidade de toxina botulínica presente na composição farmacêuti-ca, a unidade da toxina botulínica sendo determinada por um ensaio de po-tência de LD5O camundongo; (b) uma albumina, e (c) cloreto de sódio, (d)onde a relação de peso para peso da albumina para o cloreto de sódio pre-sente na composição farmacêutica é maior do que 0,6 e menor do que cercade 100. A potência da toxina botulínica na composição farmacêutica podeser entre cerca de 5% maior e cerca de 200% maior do que a potência deuma toxina botulínica em uma composição farmacêutica de comparação,cuja composição farmacêutica de comparação contém (a) a mesma quanti-dade e tipo de toxina botulínica, e (b) a mesma albumina e cloreto de sódio,como faz a composição farmacêutica da reivindicação 10, e (c) a albumina ecloreto de sódio estão presentes na composição farmacêutica de compara-ção em uma relação de peso para peso de 0,6 ou menos. A potência da to-xina botulínica na composição farmacêutica pode ser entre cerca de 10%maior e cerca de 100% maior do que a potência da toxina botulínica nacomposição farmacêutica de comparação. Alternativamente, a relação depeso para peso da albumina para o cloreto de sódio, presente na composi-ção farmacêutica pode ser entre cerca de 1 e cerca de 50.
A invenção também abrange um processo para a fabricação deuma composição farmacêutica (a) combinando-se cerca de 2,5 ng de umcomplexo de toxina botulínica tipo A com uma albumina e cloreto de sódioem uma relação de peso para peso da albumina para o cloreto de sódio nacomposição farmacêutica maior do que 0,6 e menor do que cerca de 100,para formar uma mistura, e; (b) secagem a vácuo da mistura, para dessemodo obter uma composição farmacêutica com uma potência após a recons-tituição dentre cerca de 70 unidades e cerca de 130 unidades. Este processopode também compreender a etapa, antes da etapa de secagem a vácuo, deliofilizar a mistura. Uma composição farmacêutica útil pode ser feita por esteprocesso.
A invenção também abrange uma composição farmacêutica adequada para administração a um ser humano, compreendendo: (a) umatoxina botulínica; (b) cloreto de sódio, e; (b) um estabilizador, onde a potên-cia da toxina botulínica presente na composição farmacêutica é cerca de 40unidades/ng. A relação de peso para peso da albumina para o cloreto desódio presente nesta composição farmacêutica pode ser maior do que 0,6 emenor do que cerca de 100. O estabilizador pode ser um estabilizador re-combinante, tal como uma albumina recombinante, um colágeno recombi-nante, e/ou uma gelatina recombinante. A toxina botulínica pode ser selecio-nada do grupo que consiste em tipos de toxinas botulínicas A, B, C, D, E, e F.
A invenção também abrange uma composição farmacêutica a-dequada para administração a um ser humano, compreendendo: (a) umatoxina botulínica; (b) cloreto de sódio, e; (b) uma albumina, onde a potênciada toxina botulínica presente na composição farmacêutica é entre cerca de24 unidades/ng e cerca de 60 unidades/ng. A relação de peso para peso daalbumina para o cloreto de sódio pode ser maior do que 0,6 e menor o quecerca de 100.
A invenção também abrange uma composição farmacêutica a-dequada para administração a um ser humano, compreendendo: (a) umatoxina botulínica; (b) cloreto de sódio, e; (c) uma albumina, onde a relaçãode peso para peso da albumina para o cloreto de sódio presente na compo-sição farmacêutica é entre cerca de 1 e cerca de 40 e a potência da toxinabotulínica presente na composição farmacêutica é entre cerca de 24 unida-des/ng e cerca de 60 unidades/ng.
A invenção também abrange um processo para a fabricação deuma composição farmacêutica de toxina botulínica que tem uma potênciadentre cerca de 30 a 40 unidades/ng e que é adequada para administração aum ser humano, o processo compreendendo as etapas de: (a) adicionar umcomplexo de toxina botulínica tipo A que tem uma potência dentre cerca de30-40 unidades/ng para albumina e cloreto de sódio em uma relação de pe-so para peso de cerca de 1 a cerca de 40, para formar uma mistura; (b) se-cagem a vácuo ou liofilização da mistura, e; (c) reconstituição da misturacom solução salina normal, para desse modo obter uma composição farma-cêutica de toxina botulínica que tem uma potência dentre cerca de 30 a 40unidades/ng.
Finalmente, a invenção também abrange um método para trataruma condição terapêutica ou cosmética, o método compreendendo a etapade administrar a um mamífero uma composição farmacêutica de toxina botu-línica que tem uma potência de cerca de 40 unidades/ng.
Os métodos precedentes podem ser praticados e as composições feitas empregando-se uma composição que compreende uma toxinabotulínica tipo A. Em outras modalidades da invenção, os métodos prece-dentes podem ser praticados com uma composição que compreende toxinabotulínica tipo B. Em outras modalidades da invenção, os métodos podemser praticados com uma composição que compreende uma pluralidade desorotipos de toxina botulínica, tal como os sorotipos de toxina botulínica se-lecionados do grupo que consiste em sorotipos de toxina botulínica A, B, C1,D, E, F e G. Em certas modalidades da invenção, as toxinas botulínicas puri-ficadas podem ser empregadas. Em outras modalidades, as toxinas botulíni-cas modificadas podem ser empregadas. As composições empregadas nosmétodos precedentes também podem incluir um ou mais aminoácidos alémda toxina botulínica e do polissacarídeo. As modalidades da invenção descri-ta aqui podem ser administradas intramuscularmente (dentro ou para as i-mediações de um músculo estriado, liso ou cardíaco), intradermicamente,topicamente, subcutaneamente, dentro de ou para as imediações de umaglândula, em um lúmen do corpo (tal como em um lúmen de bexiga) e/ouintratecalmente.FIGURAS
As seguintes figuras ilustram os aspectos da invenção.
Figura 1 é uma representação diagramática de um complexo detoxina botulínica de 900 kiloDalton.
Figura 2 é um gráfico que mostra a potência de LD50 de camun-dongo após a reconstituição (no eixo Y) de formulações de toxina botulínicasecadas a vácuo, Iiofilizadas feitas com 2,5 ng de toxina botulínica, 500 μ deHSA e de zero a 10N (9000 μg) de NaCI.
Figura 3 apresenta em três eixos dos dados de potência recupe-rada para várias formulações de toxina botulínica experimentais. O eixo de Xda Figura 3 representa a quantidade de cloreto de sódio (NaCI) presente empreparações de frasco de pesquisa ou experimentais em múltiplos do cloretode sódio normalizado (N) contra os 900 μg de conteúdo de NaCI em um fras-co de 100 unidades de Botox®. Desse modo, O número inteiro um no eixo Xna Figura 1 representa 900 μg de NaCI. O eixo Y da Figura 3 representa aquantidade de albumina de soro humano (HSA) presente nas mesmas pre-parações de frasco experimentais em múltiplos do HSA normalizado contraos 500 μg de conteúdo de HSA em um Frasco de 100 unidades de Botox®.
Desse modo, o número inteiro um no eixo de Y na Figura 3 representa 500μg de HSA. O eixo Z da Figura 3 representa a potência recuperada destascomposições de toxina botulínica experimentais secadas a vácuo, onde cadafrasco conteve exatamente a mesma quantidade de toxina botulínica (2,5 ng)e onde cada composição farmacêutica de toxina botulínica foi reconstituídacom a mesma quantidade de solução salina normal, e sua potência após areconstituição determinada pelo ensaio de LD5O de camundongo.
DESCRIÇÃO
A presente invenção é baseada na descoberta de uma toxinabotulínica estável com uma potência aumentada pode ser feita com uma re-lação particular de excipientes em uma composição farmacêutica de toxinabotulínica.
Descobriu-se que a potência de uma toxina botulínica em umacomposição farmacêutica de toxina botulínica pode ser aumentada signifi-cantemente formulando-se a composição farmacêutica de toxina botulínicacom relações particulares dos excipientes na composição farmacêutica detoxina botulínica. Tais relações de excipientes particulares permitem a ob-tenção de uma composição farmacêutica de toxina botulínica que tem umapotência mais elevada do que faz uma composição farmacêutica de toxinabotulínica com relações de excipiente diferentes. Por exemplo, a invençãopermite que uma composição farmacêutica de toxina botulínica seja prepa-rada com uma potência mais elevada por nanograma de toxina botulínicapresente na composição farmacêutica de toxina botulínica, do que a potên-cia de uma composição farmacêutica de toxina botulínica com relações deexcipientes diferentes.
A toxina botulínica presente na composição farmacêutica de toxina botulínica pode ser uma toxina botulínica tipo A, B, C, D, E, F ou G nati-va, recombinante, híbrida, quimérica ou modificada. Adicionalmente, a toxinabotulínica pode estar presente na composição farmacêutica de toxina botulí-nica ou como um complexo ou como uma toxina botulínica pura. Um com-plexo de toxina botulínica compreende uma molécula de toxina botulínica(cerca de 150 kDa) e uma ou mais proteínas de hemaglutinina não tóxicae/ou não hemaglutinina não tóxica. O complexo pode ter um peso molecularde, por exemplo, 300, 600 ou 900 kDa, com a quantidade em excesso de150 kDa que são atribuídas aos tóxico componentes de proteína de hema-glutinina não tóxica e/ou não hemaglutinina não tóxica do complexo. A molé-cula de toxina botulínica de 150 kDa também é referida como o componenteneurotóxico e como a toxina botulínica pura.
Um excipiente que pode estar presente em uma composiçãofarmacêutica de toxina botulínica pode ser uma proteína tal como uma albu-mina, tal como uma albumina de soro humano ou uma albumina recombi-nantemente feita. Outro excipiente que pode estar presente em uma compo-sição farmacêutica de toxina botulínica pode ser o cloreto de sódio. A albu-mina e cloreto de sódio podem ser empregados como excipientes estabili-zantes em uma composição farmacêutica de toxina botulínica. É conhecido ouso de cloreto de sódio e albumina como agentes encorpantes em umacomposição farmacêutica de toxina botulínica. A albumina é empregada co-mo um excipiente para estabilizar a toxina durante a secagem e impedir atoxina de aderir às superfícies, tal como as superfícies de vidro sobre asquais a toxina pode entrar em contato durante a fabricação e armazenamen-to. Vide, por exemplo, Rader R.A., Botulinum toxin A, em Ronald Rader, ed.BIOPHARMA: Biopharmaceutical Products em U.S. Market Rockville, MD:Biotechnology Information Institute; 2001 :pp. 271-274 (332), e; Rader R.A.,Botulinum toxin B, em Ronald Rader, ed. BIOPHARMA: BiopharmaceuticalProducts em U.S. Market Rockville, MD: Biotechnology Information Institute;2001 :pp. 274- 276 (333).
Uma modalidade da invenção é uma composição farmacêuticade toxina botulínica com relações particulares da albumina para o de cloretode sódio presente em uma composição farmacêuticas de toxina botulínica.Descobriu-se que tais relações permitem um aumento significante na potên-cia de uma composição farmacêutica de toxina botulínica Iiofilizada ou seca-da á vácuo reconstituída.
Há várias razões por que não seria esperado que a alteração deuma relação de excipientes presentes em uma composição farmacêutica detoxina botulínica aumentaria a potência da toxina botulínica, e por que al-guém esperaria exatamente que o oposto ocorresse.
Primeiro, a toxina botulínica é uma proteína relativamente gran-de para incorporação em uma formulação farmacêutica (o peso molecular docomplexo de toxina botulínica tipo A é 900 kD) e é portanto inerentementefrágil e lábil. O tamanho do complexo de toxina a torna muito mais friável elábil do que as proteínas menores, menos complexas/desse modo compon-do as dificuldades de formulação e manipulação se estabilidade da toxinativer que ser mantida. Conseqüentemente, a alteração de uma relação deexcipientes presentes em uma composição farmacêutica de toxina botulínicaseria esperada desnaturar, fragmentar ou de outro modo desintoxicar a mo-lécula de toxina ou causar desassociação das proteínas de não toxina pre-sentes no complexo de toxina.
Segundo, como o produto biológico conhecido mais letal, segu-rança excepcional, precisão, e exatidão são requeridos em todas as etapasda formulação de uma toxina botulínica que contém composição farmacêuti-ca. Desse modo, a alteração de uma relação de excipientes presentes emuma composição farmacêutica de toxina botulínica seria esperada exacerbarou interferir com a toxina botulínica já extremamente estrita que contém exi-gências de formulação de composição farmacêutica.
Terceiro, uma vez que a toxina botulínica foi a primeira toxinamicrobiana a ser aprovada (pelo FDA em 1989) para injeção para o trata-mento de doença humana, protocolos específicos tiveram que ser desenvol-vidos e aprovados para a cultura, produção em volume, formulação em umfarmacêutico e uso de toxina botulínica. Considerações importantes são apureza e dose da toxina para injeção. Conseqüentemente, a alteração deuma relação de excipientes presentes em uma composição farmacêutica detoxina botulínica seria esperada interferir com as exigências de dosagem epureza de toxina.
Quarto, as dificuldades particulares existem para estabilizar toxi-na botulínica tipo A, porque o tipo A consiste em uma molécula de toxina decerca de 150 kD em associação não covalente com proteínas de não toxinaque pesam cerca de 750 kD. Acredita-se que as proteínas de não toxinapreservem ou ajudem a estabilizar as estruturas secundárias e terciárias dasquais a toxicidade é dependente. Os procedimentos ou protocolos aplicáveisà estabilização de não proteínas ou a proteínas relativamente menores nãosão aplicáveis aos problemas inerentes com estabilização dos complexos detoxina botulínica, tal como o complexo toxina botulínica tipo A de 900 kD.Desse modo, ao mesmo tempo onde de pH 3,5 a 6,8 a toxina tipo A e prote-ínas de não toxina são unidas juntas não covalentemente, sob condiçõesligeiramente alcalinas (pH > 7,1), a toxina muito lábil é liberada do complexode toxina. Como apresentado previamente, toxina botulínica pura (isto é, amolécula de 150 kD) foi proposta como o ingrediente ativo em uma composi-ção farmacêutica. Desse modo, a alteração de uma relação de excipientespresentes em uma composição farmacêutica de toxina botulínica seria espe-rada desequilibrar este equilíbrio de estabilidade de toxina frágil.Descobriu-se que dentro de certas faixas quando concentraçõesde albumina foram aumentadas quando comparadas com a concentração decloreto de sódio, a potência da composição farmacêutica de toxina botulínicareconstituída aumentou. Também se descobriu que dentro de certas faixas,quando concentrações de cloreto de sódio foram aumentadas quando com-parado com a concentração de albumina, a potência da composição farma-cêutica de toxina botulínica reconstituída diminuiu. Surpreendentemente,descobriu-se que uma concentração elevada (absoluta) de cloreto de sódionão é danosa para a potência após reconstituição contanto que certa relaçãodo cloreto de sódio para a albumina tenha sido mantida. Desse modo, des-cobriu-se que existem relações ideais de cloreto de sódio para albumina (in-dependente das quantidades absolutas de cloreto de sódio ou de albuminapresente) na qual uma potência aumentada da composição farmacêutica detoxina botulínica após reconstituição possa ser obtida.
Como apresentado acima, descobriu-se que a estabilização derelações particulares de cloreto de sódio para albumina em uma composiçãofarmacêutica de toxina botulínica antes da liofilização ou secagem por con-gelamento pode ser empregada para otimizar a potência da composiçãofarmacêutica de toxina botulínica reconstituída.
Significantemente, também se descobriu que a reconstituição dacomposição farmacêutica de toxina botulínica com solução salina normal(0,9%), o fluido de reconstituição típico, não afete a otimização da potênciada composição farmacêutica de toxina botulínica obtida através de certasrelações estabelecidas de cloreto de sódio para albumina na composiçãofarmacêutica de toxina botulínica antes de sua liofilização ou secagem porcongelamento. Esta descoberta, portanto permite a conservação da tonici-dade da composição farmacêutica de toxina botulínica reconstituída adminis-trada a um paciente.
Sem desejar estar ligado a teoria, pode ser uma hipótese que oestabelecimento de certas relações de cloreto de sódio para albumina nacomposição farmacêutica de toxina botulínica antes de sua liofilização ousecagem por congelamento permita obter uma potência otimizada da com-posição farmacêutica de toxina botulínica após sua reconstituição fornecen-do-se um ambiente físico e químico hospitaleiro para a toxina botulínica du-rante as etapas ou procedimentos do processamento (composição ou formu-lação) ao mesmo tempo onde também reduzindo a adsorção da toxina botu-línica em superfícies de contato (tal como, frascos de vidro). Presumivelmen-te, o processamento de uma composição farmacêutica de toxina botulínicacom relações não otimizadas de cloreto de sódio e albumina, danifica a mo-lécula de toxina botulínica e aumenta sua adsorção às superfícies.
Desse modo, a alteração da relação de NaCI/HSA para uma re-lação particular pode aumentar a potência da toxina porque menos toxina épor conseguinte perdida durante o congelamento para desnaturação e ad-sorção às superfícies (este dois fenômenos podem ser referidos, por exem-plo, desnaturação causada por adsorção). HSA pode atuar como um criopro-tetor e NaCI como um degradante. Tipicamente, alguma quantidade de umatoxina botulínica aderirá à superfície de vidro. Determinou-se que quandomenos NaCI está presente em uma composição farmacêutica de toxina botu-línica, a toxina secada a vácuo não adere a uma superfície de vidro, dessemodo indicando que NaCI pode facilitar ou podem causar adsorção da toxinaàs superfícies de processamento ou armazenamento. Desse modo, as rela-ções de HSAiNaCI particulares podem ser ideais porque elas permitondeHSA forneça a crioproteção suficiente ao mesmo tempo onde contrariandoum efeito danoso (adsorção de superfície) causado pelo NaCI presente.
Desse modo, a descrição permite que uma composição farma-cêutica de toxina botulínica seja feita com uma potência que seja essencial-mente 100% da potência teoricamente possível. Adicionalmente a potênciaotimizada é mantida após a reconstituição com solução salina, o que permitea administração de uma composição farmacêutica de toxina botulínica isotô-nica. O resultado é um uso industrial mais eficiente do ingrediente ativo datoxina botulínica e uma exposição reduzida do paciente a toxina botulínicadegradada na composição farmacêutica de toxina botulínica final.
Uma vantagem significante da invenção é que permite umacomposição farmacêutica de toxina botulínica ser fabricada (composta deuma toxina botulínica bruta ou em volume) com consideravelmente menostoxina botulínica. Isto permite um processo industrial mais eficiente no qualmenos toxina em volume é empregada para fabricar a composição farma-cêutica de toxina botulínica final. Adicionalmente, porque a composição far-macêutica de toxina botulínica final contém menos toxina botulínica, o paci-ente, em uma unidade para base de unidade, é administrado com menostoxina botulínica, com vantagens resultantes de menos efeitos colaterais, talcomo imunogenicidade reduzida. Especificamente, a invenção permite umacomposição farmacêutica de toxina botulínica ser feita com a mesma potên-cia, porém com de cerca de 5% menos a cerca de 50% menos a toxina botu-línica total presente na composição farmacêutica de toxina botulínica. Porexemplo, uma composição farmacêutica de toxina botulínica que antigamen-te compreendia cerca de 20 unidades de toxina botulínica para cada 1 ng detoxina botulínica presente pode, de acordo com a invenção, ser feita agoracom até 40 unidades de toxina botulínica para cada 1 ng de toxina botulínicapresente na composição farmacêutica de toxina botulínica.
Um processo de fabricação de composição farmacêutica de to-xina botulínica (composição) pode tipicamente requerer tanto quanto 50% desobrepreço, significando que o processo industrial que é iniciado com umaquantidade 1,5X (isto é, 150 unidades) de uma toxina botulínica fornece umacomposição farmacêutica de toxina botulínica com uma quantidade 1X (istoé, 100 unidades) da toxina botulínica. Um processo de fabricação ou compo-sição é o processo pelo qual uma toxina botulínica (referida como toxina bru-ta ou em volume) obtida de fermentação bacteriana é em seguida diluída,composta e processada para a preparação de uma composição farmacêuti-ca de toxina botulínica adequada para administração aos seres humanospara propósitos terapêuticos e/ou cosméticos.
Desse modo, há uma perda inexplicada de até 50% da potênciada toxina botulínica durante o processo de composição. Foi postulado que osobrepreço de 50% é requerido devido à perda e/ou desnaturação de toxinabotulínica durante o processo de composição. A invenção indica que o so-brepreço de até 50% de toxina botulínica não é perdido durante a composi-ção, porém de preferência a composição química da formulação é o parâme-tro crítico na obtenção de recuperação total de toxina no produto acabado.Nenhum sobrepreço é necessário quando as relações otimizadas dos exci-pientes são empregadas fornecendo-se o ambiente apropriado durante oprocesso de secagem a vácuo. Ao mesmo tempo onde não querendo estarligado através de teoria, é plausível que relações ideais reduzam a adsorçãoàs superfícies e desnaturação durante o processo de secagem.
Desse modo, a invenção permite que uma composição farma-cêutica de toxina botulínica seja feita com, por exemplo, de cerca de 34%menos (se a quantidade de toxina botulínica em um frasco de 100 unidadesfor reduzida de 3,8 ng para 2,5 ng) a cerca de 48% menos (se a quantidadede toxina em um frasco de 100 unidades for reduzida de 4,8 ng para 2,5 ng,a cerca de cerca de 50% menos (se a quantidade de toxina em um frasco de100 unidades for reduzida de 5,0 ng para 2,5 ng.
A albumina de soro humano (derivada de plasma) está comerci-almente disponível de várias fontes, incluindo, por exemplo, Bayer Corpora-tion, divisão farmacêutica, Elkhart, Illinois, sob o nome comercial Plasbu-min®. Plasbumin® é conhecido por conter albumina obtida de plasma venosohumano misturado como também caprilato de sódio (um ácido graxo, tam-bém conhecido como octanoato) e acetiItriptofano ("NAT"). Vide, por exem-plo, a inserção de produto Bayer Plasbumin® -20 (orientações para uso) for-necida com o produto e como publicado emhttp://actsysmedical.com/PDF/plasbumin20.pdf. O caprilato e acetiltriptofanoem albumina de soro humano comercialmente disponível são adicionadosaparentemente por exigência de FDA para estabilizar a albumina durantepasteurização a 60 graus C. durante 10 horas antes de venda comercial.Vide, por exemplo, Peters, T., Jr., All About Albumin Biochemistry, Geneticsand Medicai Applications, Academic Press (1996), páginas 295 e 298. A al-bumina humana recombinante está disponível de várias fonts, incluindo, porexemplo, de Bipha Corporation of Chitose, Hokkaido, Japão, Welfide Corpo-ration de Osaka, Japão, e de Delta Biotechnology, Nottingham, REINO UNI-DO, como um produto de fermentação de levedura, sob o nome comercialRecombumin®.
É conhecido expressar albumina de soro humano recombinante(rHSA) nas espécies de levedura Pichia pastoris. Vide, por exemplo, Koba-yashi K., e outros, The development of recombinant human serum albumin,Ther Apher1 novembro de 1998; 2(4):257-62, e; Ohtani W., e outros, Physi-cochemical and immunochemical properties of recombinant human serumalbumin from Pichia pastoris, Anal Biochem, 1 de fevereiro, e 1998;256(1 ):56-62. Vide também a Patente U.S. 6.034.221 e Patentes Européias330 451 e 361 991. Uma vantagem clara de um rHSA é que ele é livre depatógenos derivados do sangue.
As relações de excipientes apresentadas aqui podem ser acredi-tadas ajudar a fornecer estabilidade a um ingrediente ativo de neurotoxina,tal como uma toxina botulínica, presente na composição farmacêutica por:(1) redução adesão (geralmente referido como "aderência") da toxina botulí-nica às superfícies, tal como as superfícies de artigos de vidro de laboratório,recipientes, o frasco no qual a composição farmacêutica é reconstituída e asuperfície interna da seringa empregada para injetar a composição farma-cêutica. A adesão da toxina botulínica às superfícies pode levar a perda detoxina botulínica e a desnaturação de toxina botulínica retida, ambas dasquais reduzem a toxicidade da toxina botulínica presente na composiçãofarmacêutica; (2) redução da desnaturação da toxina botulínica e/ou dissoci-ação da toxina botulínica de outras proteínas de não toxina presentes nocomplexo de toxina botulínica, cujas atividades de desnaturação e/ou disso-ciação podem ocorrer por causa da baixa diluição da toxina botulínica pre-sente na composição farmacêutica (isto é, antes da liofilização ou secagema vácuo) e na composição farmacêutica reconstituída; (3) redução da perdade toxina botulínica (isto é, devido à desnaturação ou dissociação de proteí-nas não toxina no complexo) durante as alterações consideráveis de con-centração e pH que ocorrem durante a preparação, processamento e re-constituição da composição farmacêutica.
Os três tipos de estabilizações de toxina botulínica presumivel-mente fornecidas pelas relações apresentadas aqui podem conservar e pre-servar a toxina botulínica com toxicidade nativa antes de injeção da compo-sição farmacêutica.
Em certas modalidades da invenção, as composições farmacêu-ticas da invenção podem compreender uma pluralidade de sorotipos de toxi-na botulínica. Em outras palavras, a composição pode incluir dois ou maisdiferentes sorotipos de toxina botulínica. Por exemplo, uma composição po-de incluir sorotipos de toxina botulínica A e B. Em outra modalidade, umacomposição pode incluir sorotipos de toxina botulínica A e Ε. O emprego deuma combinação de sorotipos de toxina botulínica permitirá aos cuidadorespersonalizarem a composição para alcançar um efeito desejado com basena condição sendo tratada. Em uma modalidade adicional da invenção, acomposição pode compreender uma toxina botulínica modificada. A toxinabotulínica modificada preferivelmente inibirá a liberação de neurotransmisso-res de um neurônio, porém pode ter uma potência maior ou menor do que atoxina botulínica nativa, ou pode ter um efeito biológico maior ou menor doque a toxina botulínica nativa. Porque as composições da invenção podemser empregadas para tratamento relativamente longo de animais, as compo-sições podem ser fornecidas em uma forma relativamente pura. Em umamodalidade, as composições são de um grau farmacêutico. Em certas mo-dalidades, a neurotoxina clostrídica tem uma pureza maior do que 95%. Emmodalidades adicionais, a neurotoxina clostrídica tem uma pureza maior doque 99%.
A invenção também abrange a adição de um conservante, ou nodiluente ou formulação propriamente dita, para permitir o armazenamentoprolongado. Um conservante preferido é álcool benzílico contendo soluçãosalina preservada.
Uma formulação líquida pode ser vantajosa. Uma apresentaçãode etapa única (por exemplo, seringa pré-carregada) ou uma configuraçãode produto que o usuário perceba como uma apresentação de etapa única(por exemplo, seringa em câmara dual) forneceria conveniência eliminando-se a etapa de reconstituição. A secagem por congelamento é um processocomplicado, oneroso e difícil. As formulações líquidas são freqüentementemais fáceis e mais econômicas para produzir. Por outro lado, as formulaçõeslíquidas são sistemas dinâmicos e, portanto mais suscetíveis à interação deexcipiente, reações rápidas, crescimento bacteriano, e oxidação, do que asformulações de secagem por congelamento. Um conservante compatívelpode ser necessário. Os antioxidantes tal como metionina também poderiamser úteis como limpadores especialmente se tensoativos são empregadospara reduzir a adsorção uma vez que muitos destes compostos contêm ouproduzem peróxidos. Quaisquer dos excipientes estabilizantes que podemser empregados em uma formulação secada por congelamento (por exem-plo, amido de hidroxietila ou um aminoácido tal como lisina) poderiam seradaptados ao uso em uma formulação líquida para ajudar na redução daadsorção e estabilizar a toxina. As suspensões similares àquelas desenvol-vidas para insulina são também os candidatos bons. Adicionalmente, a esta-bilização da toxina botulínica em um veículo líquido poderia requerer um veí-culo de baixo pH uma vez que a toxina é reportada ser lábil em pH acima de7. Esta acidez poderia produzir queimação e picadas na injeção. Uma serin-ga binária poderia ser empregada. A inclusão de um tampão co-dispensado,suficiente para elevar o pH a níveis fisiológicos, aliviaria o desconforto deinjeção de um pH baixo ao mesmo tempo onde mantendo a toxina a um bai-xo pH durante o armazenamento. Outra opção de seringa em câmara dualincluiria o material diluente e Iiofilizado segregado em câmara separada, so-mente misturando em uso. Esta opção fornece as vantagens de uma formu-lação líquida sem o tempo e recursos adicionais.
Como descrito aqui, a neurotoxina pode ser preparada e purifi-cada empregando técnicas bem-conhecidas na área. A toxina purificada po-de ser diluída subseqüentemente em um estabilizador tal como um polissa-carídeo (por exemplo, hetamido), ou uma albumina de soro recombinante,ou uma albumina de soro das espécies de animal que recebem a neurotoxi-na. É preferido que o estabilizador previna ou reduza a desnaturação da to-xina, e produza nenhuma, ou mínimas respostas, imunogênicas no animalque receberá a toxina. Alíquotas da toxina diluída são em seguida Iiofilizadasempregando os procedimentos convencionais.A neurotoxina Iiofilizada pode ser reconstituída antes de adminis-trar a neurotoxina a um indivíduo adicionando-se água, solução salina, ouqualquer solução de tampão à neurotoxina liofilizada. Em certas modalida-des, os tampões livres de sódio podem ser preferidos para ajudar a reduzir adesnaturação da neurotoxina.
As composições farmacêuticas da invenção podem ser adminis-tradas empregando modos convencionais de administração. Em modalida-des preferidas da invenção, as composições são administradas intramuscu-Iarmente ou subcutaneamente ao indivíduo. Em outras modalidades, ascomposições da invenção podem ser administradas intratecalmente. Alémdisso, as composições da invenção podem ser administradas com um oumais agentes analgésicos ou anestésicos.
O modo mais eficaz de administração e regime de dosagem pa-ra as composições desta invenção depende do tipo, severidade, e curso dacondição sendo tratada, a saúde do animal e resposta ao tratamento, e ojulgamento do doutor do tratamento. Conseqüentemente, os métodos e do-sagens das composições deveriam ser adaptados ao indivíduo individual.
As composições da invenção também podem ser injetadas nosmúsculos lisos (quando comparadas com os músculos estriados) para tratardisfunção colônica, da bexiga, esofágica, ou gastrointestinal, incluindo, po-rém não limitado à acalasia, fissura anal, esfíncter hiperativo de Oddi. A ad-ministração das composições pode reduzir ou pode prevenir as conseqüên-cias sistêmicas desfavoráveis de tratamento com drogas que especificamen-te não atuam no órgão de interesse.
As composições que contêm toxina botulínica podem ser admi-nistradas intramuscularmente, intratecalmente, ou subcutaneamente paraaliviar a dor experimentada pelo animal. Estes tratamentos também são res-tritos ao local de injeção e têm efeitos colaterais mínimos comparados comas abordagens sistêmicas atuais de tratamento destas síndromes de dorcom drogas que aliviam a dor.
O alívio da dor praticando-se os métodos da invenção pode serdeterminado observando-se a redução no número de sintomas que o animalestá exibindo. Um ou mais dos sintomas pode ser reduzido.
Como indicado acima, as dosagens da neurotoxina, tal comotoxina botulínica, nas composições podem variar. Em uma modalidade, ascomposições contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de neurotoxi-na, por exemplo, entre cerca de 1 U e cerca de 500 U de toxina botulínicatipo A. Preferivelmente as quantidades estão entre cerca de 10 U e cerca de300 U. Mais preferivelmente a quantidade é entre cerca de 20 U e 250 U, talcomo cerca de 50 U a 200 U, ou 70 U.
Alternativamente, a toxina botulínica, tal como toxina botulínicatipo A, pode ser administrada em quantidades entre cerca de 10"3 U/kg ecerca de 60 U/kg para aliviar a dor experimentada por um mamífero. Preferi-velmente, a toxina botulínica empregada é administrada em uma quantidadedentre cerca de 10"2 U/kg e cerca de 50 U/kg. Mais preferivelmente, a toxinabotulínica é administrada em uma quantidade dentre cerca de 10"1 U/kg eaproximadamente 40 U/kg. Mais preferivelmente, a toxina botulínica é admi-nistrada em uma quantidade dentre cerca de 1 U/kg e cerca de 30 U/kg. Emuma modalidade particularmente preferida dos presentes métodos descritos,a toxina botulínica é administrada em uma quantidade dentre cerca de 1U/kg e cerca de 20 U/kg.
As composições que contêm outros sorotipos de toxina botulíni-ca podem conter dosagens diferentes da toxina botulínica. Por exemplo, atoxina botulínica tipo B pode ser fornecida em uma composição em uma do-se maior do que uma composição que contém toxina botulínica tipo A. Emuma modalidade da invenção, a toxina botulínica tipo B pode ser administra-da em uma quantidade entre cerca de 1 U/kg e 150 U/kg. A toxina botulínicatipo B também pode ser administrada em quantidades de até 20.000 U (uni-dades de camundongo, como descrito acima). Em outra modalidade da in-venção, as toxinas botulínicas tipo E ou F podem ser administradas em con-centrações entre cerca de 0,1 U/kg e 150 U/kg. Além disso, em composiçõesque contêm mais do que um tipo de toxina botulínica, cada tipo de toxinabotulínica pode ser fornecido em uma dose relativamente menor do que adose tipicamente empregada para um único sorotipo de toxina botulínica. Acombinação de sorotipos de toxina botulínica pode então fornecer um grau eduração adequados de paralisia sem um aumento na difusão das neurotoxi-nas (por exemplo, vide Patente U.S. No. 6.087.327).
O processo de composição empregado na preparação de Botox®(uma composição farmacêutica em pó secada á vácuo) começa com a en-trada de cerca de 150 unidades da toxina botulínica de volume no processode composição. O produto final (pronto para reconstituição) compreendesomente cerca de 100 unidades da toxina botulínica (bem como a quantida-de específica de albumina e cloreto de sódio como excipientes adicionadosdurante o processo de composição). Desse modo, cerca de 50 unidades detoxina botulínica (cerca de um terço da quantidade da toxina botulínica queentrou no processo de composição) é perdida durante a composição, porexemplo, por desnaturação, absorção e inativação da toxina botulínica sobreas superfícies de processamento. Conseqüentemente, foi necessário come-çar o processo de composição com um sobrepreço de cerca de 50% (isto é,início com cerca de 150 unidades de toxina botulínica para obter um produtocom cerca de 100 unidades de toxina botulínica).
Cem unidades de toxina botulínica tipicamente compreendem decerca de 3,6 ng a cerca de 5 ng de toxina botulínica. Descobriu-se que alte-rando-se a relação dos excipientes de cloreto de sódio e albumina emprega-dos nos processos de composição é possível: (1) remover o fator de sobre-preço de 50%, e; (2) em um nanograma ao nanograma de base, obter umatoxina botulínica mais potente. Eliminando-se o fator de sobrepreço de 50%no processo de composição, alguém pode ter cerca de 100 unidades de to-xina botulínica que entra no processo de composição, e ainda na conclusãodo processo de composição ainda pode obter o produto com cerca de 100unidades de toxina botulínica. Adicionalmente, alguém pode obter um produ-to de toxina botulínica de 100 unidades que compreende somente cerca de2,4 ng de toxina botulínica, quando comparado ao 3,6 a 5 ng previamenterequerido de toxina botulínica requerida para obter um produto de toxina bo-tulínica de 100 unidades. Desse modo, a potência da toxina botulínica quefoi previamente tão baixa quanto cerca de 20 unidades por ng (100 unidadesdivididas por 5 ng) pode agora ser aumentada para tão elevada quanto cercade 42 unidades por ng (100 unidades divididas por 2,4 ng), que se iguala aum aumento de potência de cerca de 110%.
As composições farmacêuticas de toxina botulínica comercial-mente disponíveis aprovadas por órgãos fiscalizadores para uso em sereshumanos para tratar uma ou mais indicações incluem BOTOX® (Allergan,Inc, Irvine, Califórnia), Dysport® (Ipsen Pharmaceuticals, Paris, França) eMyoBloc® (Solstice Neurosciences, San Diego1 Califórnia).
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos não Iimitantes fornecem àqueles de ca-pacidade ordinária na técnica métodos e formulações preferidas específicase não são pretendidos limitar o escopo da invenção.
Nos Exemplos abaixo, o ensaio de dose50 letal de camundongobem-conhecido ("MLD5o") foi empregado para determinar a potência recupe-rada das formulações de toxina botulínica feitas. O MLD50 é um método paramedir a potência de uma toxina botulínica por injeção intraperitoneal da toxi-na botulínica em camundongos femininos (cerca de semanas de idade) pe-sando 17-22 gramas cada no início do ensaio. Cada camundongo é mantidoem uma posição deitado em decúbito dorsal com sua cabeça inclinada parabaixo e é intraperitonealmente injetado no abdômen direito inferior em umângulo de cerca de 30 graus empregando uma agulha de 25 a 27 gauge 3/8"a 5/8" com uma das várias diluições seriais da toxina botulínica em soluçãosalina. As taxas de mortalidade durante as 72 horas resultantes para cadadiluição são registradas. As diluições são preparadas de forma que a dilui-ção mais concentrada produza uma taxa de mortalidade de pelo menos 80%dos camundongos injetados, e a última diluição de concentração produz umataxa de mortalidade não maior do que 20% dos camundongos injetados. De-ve haver um mínimo de quatro diluições que se incluem dentro da faixa de-crescente de monotonia das taxas de mortalidade. A faixa de monotonia de-crescente começa com uma taxa de mortalidade de não menos do que 80%.Dentro das taxas decrescentes de monotonia de quatro ou mais, as duastaxas maiores e as duas taxas menores têm que estar diminuindo (isto é,não equivalente). A diluição na qual 50% dos camundongos morrem dentrode três dias após o período observação da injeção é definida como uma dilu-ição que compreende uma unidade (1 U) da toxina botulínica.
Nas Tabelas que seguem, "normalizado" quer dizer com respeitoà quantidade empregada em um frasco de 100 unidades de Botox®.
Exemplo 1
Formulações de Toxina Botulínica de Potência Elevada (Método de Pesqui-sa) com Várias Relações de Cloreto de sódio para Albumina
Uma experiência foi realizada para avaliar a potência recuperadade numerosas formulações de frasco de pesquisa de toxina botulínica com amesma quantidade de complexo de toxina botulínica tipo A em cada formu-lação, porém com quantidades diferentes de HSA e NaCI presentes dentrode cada formulação. Desse modo, ao mesmo tempo onde 2,5 ng da toxinabotulínica foi empregado constantemente por frasco, cada frasco de formu-lação conteve de OM (0 μg) de HSA a 10N (5000 μg) de HSA, e de OM (0 μg)de NaCI a 10N (9000 ng) de NaCI.
Os dados na Tabela 1 foram obtidos empregando procedimentosde preparação de lote de pesquisa. Desse modo, os dados da Tabela 1 fo-ram obtidos misturando-se uma das sete quantidades diferentes especifica-das de cloreto de sódio (NaCI) (de uma quantidade de 0,1 N de 90 μg porfrasco a uma quantidade de 10N de 9000 μg por frasco) com uma das trêsquantidades diferentes especificadas de albumina de soro humano (HSA)(Bayer) (de uma quantidade de 0,5N de 250 μg por frasco a uma quantidadede 1 N de 500 μg por frasco) com água estéril e a mesma quantidade (2,5ng/frasco) de complexo de toxina botulínica tipo A para preparar frascos decomposição farmacêutica de toxina botulínica experimental ou de pesquisa.Estes frascos foram então colocados em um liofilizador, secado a vácuo etampões. Os frascos foram então reconstituídos com solução salina normal etestados quanto à potência recuperada empregando uma versão refinada doensaio de LD50 de potência de camundongo.
Significantemente, a Tabela 1 mostra que, quando comparadocom a formulação de pesquisa equivalente Botox® (isto é, a formulação defrasco de pesquisa que continha 500 μς de HSA, 900 μς de NaCI e 2,5 ngde complexo de toxina botulínica tipo A, e teve uma potência recuperada de57 unidades)), uma potência elevada (61 a 89 unidades de atividade de toxi-na botulínica por frasco, isto é, de 107% a 156% maior do que a potência doformulação de pesquisa equivalente Botox®) foi obtido para cada uma dasseis formulações que tiveram relações de HSA:NaCI maiores do que 0,6 (asrelações de HSA:NaCI na Tabela 1 que foram maiores do que 0,6 foram re-lações de 0,7 a 5,6.
Os dados da Tabela 1, portanto mostram que uma formulaçãode toxina botulínica de potência elevada pode ser obtida aumentando-se arelação de HSA.NaCI da formulação.
Tabela 1: Potência de Formulações de Toxina Botulínica com Relações deHSA:NaCI de 0,03 a 5,6
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Um outro exemplo que mostra a potência de formulações depesquisa reconstituídas feitas de acordo com os procedimentos apresenta-dos neste Exemplo 1 é fornecido pela Tabela 2 abaixo e pela Figura 2. ATabela 2 mostra que as formulações que contiveram uma quantidade de 1Nconstante (500 μg) de HSA, 2,5 ng de toxina botulínica e quantidades deNaCI que variaram de zero a 10N (9000 μg), tiveram uma potência que nãovariou significantemente como a relação de HSA:NaCI que foi diminuída pa-ra abaixo de 0,6, porém que a potência da formulação aumentou de cerca de57 unidades a cerca de 90 unidades, quando a relação de HSA:NaCI foi au-mentada de 0,6 para cerca de 5.6.Tabela 2: Potência de Formulações de Toxina Botulínica com 1 N e Rela-ções de HSA:NaCI de 0,06 a 5,6
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A Figura 2 é uma representação gráfica dos dados da Tabela 2.
A Figura 3 apresenta uma vista combinada em três eixos dosdados gerados por este Exemplo 1. Figura 3 mostra que quando a relaçãode HSA:NaCI é aumentada além cerca de 0,6 (ou: (a) mantendo-se a quan-tidade de HSA na formulação constante [a uma quantidade entre 0 e 10N] ediminuindo a quantidade de NaCI na formulação [de 10N a 0], ou; (b) man-tendo-se a quantidade de NaCI constante e aumentando-se a quantidade deHSA na formulação), geralmente a potência recuperada da formulação au-menta. A quantidade de toxina botulínica em todas as formulações empre-gadas para gerar os dados da Figura 3 foi constante a 2,5 ng por frasco.
Exemplo 2
Formulações de Toxina Botulínica de Potência Elevada (Método Comercial)com Relação Particular de Cloreto de Sódio para Albumina .
Uma outra experiência foi realizada na qual as composiçõesfarmacêuticas de toxina botulínica foram feitas (compostas) empregandocomplexo de toxina botulínica tipo A, cloreto de sódio e albumina de sorohumano. As composições farmacêuticas de toxina botulínica contendo rela-ções diferentes de cloreto de sódio para HSA foram compostas empregandoos procedimentos de lote de fabricação comercial. As composições foramentão cada uma Iiofilizadas e secadas a vácuo para um estado em pó sólido,seguido por reconstituição com solução salina e avaliação de potência recu-perada de LD50 de camundongo.Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 3. Os dadosda Tabela 3 foram obtidos como segue: para os dados de BOTOX (última filana Tabela 3), frascos de 100 unidades de Botox® foram reconstituídos comsolução salina normal seguido por uso do ensaio de LD50 de camundongopara medir a potência. O 1 N de HSA, 2N de HSAj 5N de HSA e 10N deHSA representam formulações compostas do mesmo modo empregadaspara a fabricação de Botox® e com os mesmos excipientes, reconstituídasda mesma maneira, e potência avaliada empregando o mesmo ensaio deLD50 de camundongo, com somente as seguintes alterações:
(1) um (1 N), dois (2N), cinco (5N) ou dez vezes (1ON) tanto HSAfoi empregado no processo de composição para a fabricação destas quatroformulações complexas de toxina botulínica tipo A, quando comparado comquanto HSA é empregado na fabricação de Botox®. Desse modo, como mos-trado na Tabela 3, a formulação de 1 N (1 N significando normalizado paraconter a mesma quantidade daquele excipiente como está presente em umfrasco 100 de unidades de Botox®) foi composta para conter 500 μg de HSA,ao mesmo tempo onde a formulação de 10N foi composta para conter 5000μg de HSA.
(2) a quantidade de complexo de toxina botulínica tipo A empre-gada em cada das quatro formulações de 1 N de HSA, 2N de HSA, 5N deHSA e 10N de HSA foi 2,4 ng.
(3) a quantidade dé cloreto de sódio empregada no processo decomposição para a fabricação de cada das quatro formulações complexasde toxina botulínica tipo A foi alterada para fornecer, uma relação de pesopara peso constante do HSA para NaCI na formulação de 28. Desse modo,em cada uma destas quatro formulações a relação de HSA:NaCI foi 47 ve-zes o que é para Botox® (28 vs 0,6).
Significantemente, a Tabela 3 mostra que uma potência elevada(95 a 103 unidades de atividade de toxina botulínica por frasco) foi obtidapara cada das quatro relações de HSA:NaCI de 28 formulações de toxinabotulínica, e que esta potência elevada foi obtida no uso de cerca de 33% acerca de 52% de menos toxina botulínica (quando comparado para usar decerca de 3,6 ng a cerca de 5 ng de toxina botulínica por frasco de Botox®).
Adicionalmente, como mostrado pela Tabela 3, através de am-plas faixas das quantidades absolutas de HSA e cloreto de sódio presente,uma relação de peso para peso de HSA para cloreto de sódio de 28 permitiuconsistentemente uma potência de cerca de 40 unidades por ng da toxinabotulínica composta e reconstituída a ser obtida.
Tabela 3: Potência de Formulações de Toxina Botulínica com uma Relaçãode HSA:NaCI de 28
<table>table see original document page 50</column></row><table>
Desse modo, esta experiência mostrou que no processo de fa-bricação (composição), 50% de sobrepreço pode ser eliminado alterando-sea relação da composição da formulação, ao mesmo tempo onde ainda em-pregando os excipientes e processos industriais existentes.
Uma composição farmacêutica de acordo com a invenção des-crita aqui tem muitas vantagens, incluindo que a composição farmacêuticapode ter estabilidade elevada e % de recuperação elevada de potência detoxina comparável ou superior àquela obtida com composições farmacêuti-cas atualmente disponíveis.
Várias referências e/ou publicações foram citadas aqui, os con-teúdos das quais, em suas totalidades, estão aqui incorporados por referência.
Embora a presente invenção tenha sido descrita em detalhescom respeito a certos métodos preferidos, outras modalidades, versões, emodificações dentro do escopo da presente invenção são possíveis. Por e-xemplo, uma ampla variedade de polissacarídeos, proteínas e aminoácidosestabilizantes está dentro do escopo da presente invenção.Conseqüentemente, o espírito e escopo das seguintes reivindi-cações não deveriam estar limitados às descrições das modalidades preferi-das apresentadas acima.

Claims (37)

1. Composição farmacêutica que compreende:(a) uma toxina botulínica;(b) um primeiro excipiente, no qual o primeiro excipiente é umaalbumina, e;(c) um segundo excipiente;(d) no qual a relação de peso para peso do primeiro excipientepara o segundo excipiente presente na composição farmacêutica é maior doque 0,6 e menor do que cerca de 100.
2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1,no qual a potência da toxina botulínica na composição farmacêutica é entrecerca de 5% maior e cerca de 200% maior do que a potência de uma toxinabotulínica em uma composição, farmacêutica de comparação, cuja composi-ção farmacêutica de comparação contém (a) a mesma quantidade e tipo datoxina botulínica, e (b) o mesmo primeiro excipiente e o mesmo segundoexcipiente, como contido na composição farmacêutica de reivindicação 1, e;(c) os primeiro e segundo excipientes estão presentes na composição far-macêutica de comparação em uma relação de peso para peso de 0,6 oumenos.
3. Composição farmacêutica da reivindicação 2, no qual a po-tência da toxina botulínica na composição farmacêutica é entre cerca de-10% maior, e cerca de 100% maior do que a potência da toxina botulínica nacomposição farmacêutica de comparação.
4. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1,no qual a toxina botulínica está presente como um complexo de toxina botu-línica.
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1,no qual a toxina botulínica está presente como uma toxina botulínica pura.
6. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1,no qual o primeiro excipiente é uma albumina de soro.
7. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1,no qual o primeiro excipiente é uma albumina recombinante.
8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1,no qual o segundo excipiente é cloreto de sódio.
9. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1,no qual a relação de peso para peso do primeiro excipiente para o segundoexcipiente presente na composição farmacêutica é entre cerca de 1 e cercade 50.
10. Composição farmacêutica, que compreende:(a) entre cerca de 2,0 X 10"1 gramas e cerca de 3,5 X 10"11 gra-mas de um toxina botulínica tipo A para cada unidade de toxina botulínicapresente na composição farmacêutica, a unidade da toxina botulínica sendodeterminada por um ensaio de potência de LD50 de camundongo;(b) uma albumina, e(c) cloreto de sódio,(d) no qual a relação de peso para peso da albumina para o clo-reto de sódio presente na composição farmacêutica é maior do que 0,6 emenor do que cerca de 100.
11. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, no qual a potência da toxina botulínica na composição farmacêutica éentre cerca de 5% maior e cerca de 200% maior do que a potência de umatoxina botulínica em uma composição farmacêutica de comparação, cujacomposição farmacêutica de comparação contém (a) a mesma quantidade etipo de toxina botulínica, e (b) a mesma albumina e cloreto de sódio, comofaz a composição farmacêutica da reivindicação 10, e (c) a albumina e clore-to de sódio estão presentes na composição farmacêutica de comparação emuma relação de peso para peso de 0,6 ou menos.
12. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 11, no qual a potência da toxina botulínica na composição farmacêutica éentre cerca de 10% maior e cerca de 100% maior do que a potência da toxi-na botulínica na composição farmacêutica de comparação.
13. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 10, no qual a toxina botulínica está presente como um complexo de toxinabotulínica.
14. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação10, no qual a toxina botulínica está presente como uma toxina botulínica pu-ra.
15. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação10, no qual a albumina é uma albumina de soro.
16. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação10, no qual a albumina é uma albumina recombinante.
17. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação10, no qual a relação de peso para peso da albumina para o cloreto de só-dio, presente na composição farmacêutica é entre cerca de 1 e cerca de 50.
18. Processo para a fabricação de uma composição farmacêuti-ca, o processo que compreende as etapas de:(a) combinar cerca de 2,5 ng de um complexo de toxina botulíni-ca tipo A com uma albumina e cloreto de sódio em uma relação de peso pa-ra peso da albumina para o cloreto de sódio na composição farmacêuticamaior do que 0,6 e menor do que cerca de 100, para formar uma mistura, e;(b) secar a vácuo a mistura, para desse modo obter uma com-posição farmacêutica com uma potência após a reconstituição dentre cercade 70 unidades e cerca de 130 unidades.
19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, adicionalmentecompreendendo a etapa, antes da etapa de secagem a vácuo, de liofilizaçãoda mistura.
20. Composição farmacêutica, feita pelo processo como definidona reivindicação 18,
21. Composição farmacêutica, adequada para administração aum ser humano, compreendendo:(a) uma toxina botulínica;(b) cloreto de sódio, e;(c) um estabilizador; no qual a potência da toxina botulínica pre-sente na composição farmacêutica é cerca de 40 unidades para cada nano-grama da toxina botulínica.
22. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação- 21, no qual a relação de peso para peso da albumina para o cloreto de sódiopresente na composição farmacêutica é maior do que 0,6 e menor do quecerca de 100.
23. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, no qual a toxina botulínica está presente como um complexo de toxinabotulínica.
24. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 16, no qual a toxina botulínica está presente como uma toxina botulínica pura.
25. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 16, no qual o estabilizador é uma proteína.
26. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 16, no qual o estabilizador é um estabilizador recombinante.
27. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, no qual o estabilizador recombinante é selecionado do grupo que consis-te em uma albumina recombinante, um colágeno recombinante e uma gela-tina recombinante.
28. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, no qual o estabilizador é uma albumina.
29. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, no qual o estabilizador é uma albumina recombinante.
30. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 21, no qual a toxina botulínica é selecionada do grupo que consiste em toxi-nas botulínicas tipos A, B, C, D, E, e F.
31. Composição farmacêutica, adequada para administração aum ser humano, compreendendo:(a) uma toxina botulínica;(b) cloreto de sódio, e;(b) uma albumina;no qual a potência da toxina botulínica presente na composição farmacêuticaé entre cerca de 24 unidades/ng e cerca de 60 unidades/ng.
32. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-31, no qual a relação de peso para peso da albumina para o cloreto de sódioé maior do que 0,6 e menor do que cerca de 100.
33. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-31, no qual a albumina é uma albumina de soro.
34. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação-31, no qual a albumina é uma albumina recombinante.
35. Composição farmacêutica, adequada para administração aum ser humano, compreendendo:(a) uma toxina botulínica;(b) cloreto de sódio, e;(b) uma albumina;no qual a relação de peso para peso da albumina para o cloreto de sódiopresente na composição farmacêutica é entre cerca de 1 e cerca de 40 e apotência da toxina botulínica presente na composição farmacêutica é entrecerca de 24 unidades/ng e cerca de 60 unidades/ng.
36. Processo, para a fabricação de uma composição farmacêuti-ca de toxina botulínica que tem uma potência dentre cerca de 30 a 40 unida-des/ng e é adequado para administração a um ser humano, o processo com-preendendo as etapas de :(a) adicionar um complexo de toxina botulínica tipo A tendo umapotência dentre cerca de 30-40 unidades/ng para albumina e cloreto de só-dio em uma relação de peso para peso de cerca de 1 a cerca de 40, paraformar uma mistura;(b) secagem a vácuo ou liofilização da mistura, e;(c) reconstituir a mistura com solução salina normal, para dessemodo obter uma composição farmacêutica de toxina botulínica tendo umapotência dentre cerca de 30 - 40 unidades/ng.
37. Método, para tratar uma condição terapêutica ou cosmética,o método compreendendo a etapa de administrar a um mamífero uma com-posição farmacêutica de toxina botulínica que tem uma potência de cerca de-40 unidades/ng.
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