BRPI0614554A2 - métodos para efetuar a evolução seletiva de protéinas in vitro - Google Patents
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Abstract
MéTODOS PARA EFETUAR A EVOLUçãO SELETIVA DE PROTEìNAS IN VITRO. A presente invenção refere-se a produção de variantes de uma proteína em um método de evolução in vitro, compreendendo as etapas: (A) provisão de um sistema de expressão in vitro compreendendo (i) uma sequência de ácido nucléico S que codifica para uma proteína Y a ser variada,(ii) uma molécula alvo X que é capaz de se ligar à proteína Y, e/ou pelo menos uma variante Y' desta, (iii) uma polimerase de RNA (Pol) que é capaz de transcrever a seqúência de ácido nucléico S, (iv) uma transcriptase reversa (RT) que é capaz de transcrição reversa de transcritos da seqúência de áci- do nucléico S, onde ou a molécula alvo X é acoplada a Pol e a proteína Y é acoplada a RT, ou a molécula alvo X é acoplada a RT e a proteína Y é acopIada a FoI, (B) incubação do sistema de expressão in vítro de (A) sob condições que capacitam transcrição, transcrição reversa e transíação para formar variantes Y' da proteína Y e seqúências de ácido nucléico S' que codificam para estas, e que favorecem a formação de variantes Y' com propriedades de ligação aperfeiçoadas para a molécula alvo X, (O) isolamento e, onde apropriado, caracterização daquelas variantes Y' que exibem propriedades de ligação aperfeiçoadas para ligação a X, e/ou isolamento das variantes S' de seqúência de ácido nucléico que codificam para Y'.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA EFETUAR A EVOLUÇÃO SELETIVA DE PROTEÍNAS IN VITRO".
DESCRIÇÃO
A presente invenção refere-se a produção de variantes de umaproteína em um método de evolução in vitro.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A importância aumentada da biotecnologia nos setores médicos,da indústria química e agronômicos significa que existe uma demanda au-mentada para proteínas otimamente adaptadas para sua proposta particularde uso. Estas proteínas são inicialmente isoladas principalmente a partir doambiente, a maioria dentro da estrutura das assim denominadas triagensmetagenômicas. Aumentadamente, elas são subseqüentemente adaptadaspor vários métodos às condições de uso planejadas "artificiais".
Desse modo, por exemplo, existem necessidades de enzimasque sejam mais termicamente estáveis do que suas variantes naturais, te-nham uma especificidade de substrato diferente, ou mostrem atividadesmais altas. As proteínas farmacêuticas, por exemplo, são pretendidas paraterem meias-vidas mais longas de modo a capacitar o uso de doses meno-res, ou inibir, via a alta afinidade e ligação específica às moléculas alvos,trajetórias metabólicas associadas à doença, ou rotas de infecção.
TÉCNICA ANTERIOR
Esta adaptação ocorre, em parte, pelas aproximações de dese-nho de proteína racionais. Contudo, as presentes possibilidades para conclu-ir a estrutura de uma proteína a partir de sua função desejada - o fenótipo -e para inferir a seqüência primária correspondente a partir da estrutura tridi-mensional da proteína, são muito limitadas. De modo a, não obstante, alcan-çar um aumento na função de uma proteína, as aproximações usadas nopresente são parcialmente evolutivas, e são resumidas pelo termo "evoluçãodireta".
Métodos de evolução direcionada para duração são baseados,de acordo com a técnica anterior atual, substancialmente na geração de umgrande número de variantes (progenia) da proteína a serem aperfeiçoadas,eseleção destas para derivados aperfeiçoados. Neste caso, o número de mu-tantes investigados pode, em alguns casos, ser muito grande, mas é usual-mente abaixo de 1011. Considerando-se uma proteína de somente 100 ami-noácidos, na teoria 20100 = 10130 variantes diferentes destes existem. Umabiblioteca com uma dimensão de 1011 conseqüentemente cobre somenteuma fração muito pequena das variantes possíveis. A possibilidade de des-cobrir-se a melhor variante teoricamente em tal biblioteca é aproximadamen-te zero.
De modo a abrigar um grande número de variantes para afinida-de máxima para uma molécula alvo, um grande número de protocolos já foidesenvolvido (por exemplo, levedura de dois híbridos, exibição bacterial,fago exibição, exibição ribossomal, exibição de mRNA).
A triagem para outras propriedades, tais como, por exemplo, ati-vidade enzimática, requer, na maior parte, formatos de ensaio que permitema investigação de somente um número relativamente pequeno de variantes(<106). É comum a estes métodos que eles sejam confinados a geração deuma biblioteca de mutantes e subseqüente seleção desta. Embora uma re-plicação (= próxima geração de mutantes do "vencedor" da seleção que o-correu por último) seja possível manualmente com estes protocolos, ela éapenas tão complicada quanto a etapa precedente. As aproximações cor-respondentes, portanto, se extendem geralmente somente sobre uma a duasgerações. Por esta razão, os protocolos mencionados não são aproximaçõesevolutivas no sentido verdadeiro, mas, ao contrário, são seleções exclusivasde reuniões disponíveis de variantes. Conseqüentemente, o potencial paraadaptação gradual sobre muitas gerações não pode ser utilizado, mas estaseria a precondição necessária para identificação em algumas circunstân-cias da variante mais ativa a partir de um número astronomicamente grandede possibilidades.
O princípio da evolução com suas três precondições - replica-ção, mutação e seleção - é capaz, dentro de um dado sistema, de propor-cionar evolução direta de estruturas simples a altamente adaptadas. Estemodelo do assim denominado "o relojoeiro cego" faz com que complexidadeseja criada sem uma entrada de desenho e sem conhecimento necessáriode dados estruturais.
Bauer et al. (PNAS (1989) 86, 7937-7941) foram capazes demostrar em 1989 que um processo evolutivo contínuo ocorre em capilar con-tendo replicase Qβ, e inoculado em uma extremidade com qualquer RNA.Uma polimerização dianteira é produzida ao longo do capilar, no curso doqual os polímeros de RNA produzidos desenvolvem mais rápido seqüênciasfago-específicas/estruturas secundárias, porque estas são replicadas maisrapidamente pela replicase. Embora este experimento não exiba usos práti-cos diretos, ele não comprova claramente o potencial dos três fatores dereplicação, mutação e seleção.
O documento WO 02/22869 descreve métodos para uso na evo-lução in vitro de bibliotecas de molécula. O sistema de dois híbridos é usadoneste caso. Contudo, somente uma polimerase que tem uma taxa de erroaumentada, mas não transcriptase reversa, é usada aqui. Este documento,desse modo, se refere ao assim denominado PCR propenso a erro.
O documento WO 2004/024917 descreve um método para evo-lução direta de enzimas, onde a proteína e seu DNA de codificação são es-pecialmente acoplados e encerrados em um compartimento. A proteína estána forma de uma construção de fusão com uma etiqueta de peptídeo. O ma-terial de partida é uma biblioteca de DNA. Contudo, nenhuma interação deligante-proteína é empregada para seleção, e nenhuma mutação é introduzi-da pela polimerase de RNA.
O documento WO 2005/030957 descreve uma seleção in vitrode proteínas que são acopladas como proteínas de fusão para DNA de codi-ficação.
Um sistema similar é também descrito em Bernath, K. et al. (J.Mol. Biol. (02.04.2005) 345 (5), 1015-1026).
O documento WO 01/51663 descreve sistemas integrados e mé-todos para modificação de ácido nucléico. O método NASBA usando replica-se Qβ, em particular, é empregado neste caso. Contudo, nenhuma mençãode introdução de mutações por polimerase de RNA é descrita.Embora proteínas de fusão compostas de transcriptase reversae outras proteínas tenham sido descritas, não existe menção do uso de pro-teínas de fusão de RT, ou proteínas de fusão de polimerase T7-RNA em e-volução in vitro.
Sistemas de replicase Οβ foram também investigados em deta-lhe (McCaskiII and Bauer (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993, 90, 4191-4195)).Esta publicação descreve ondas de evolução em um sistema de replicaseΌβ. A velocidade de migração do RNA frontal aumenta com a aptidão doreplicon. Contudo, o sistema da invenção não pode ser inferido a partir destapublicação.
O documento WO 2004/108926 descreve a evolução artificial deproteínas com capacidade de ligação aperfeiçoada. As proteínas são codifi-cadas em replicons de RNA que formam, através de replicação errônea,uma quase espécie. Contudo, expressão in vivo é envolvida neste caso.
Nenhum sistema in vitro que torna possível desenvolver proteí-nas são disponíveis até agora. Existe ainda uma necessidade de sistemas emétodos para evolução direcionada de proteínas com propriedades aperfei-çoadas que evitem a construção elaborada e triagem de bibliotecas mutantes.
A presente invenção se refere a um método para produção devariantes Y' de uma proteína Y, compreendendo as etapas:
(A) provisão de um sistema de expressão in vitro compreendendo
(i) uma seqüência de ácido nucléico S que codifica para umaproteína Y a ser variada,
(ii) uma molécula alvo X que é capaz de se ligar a proteína Y,e/ou pelo menos uma variante Y' desta,
(iii) uma polimerase de RNA (PoI) que é capaz de transcrever aseqüência de ácido nucléico S,
(iv) uma transcriptase reversa (RT) que é capaz de transcriçãoreversa de transcritos da seqüência de ácido nucléico S,onde ou a molécula alvo X é acoplada a Pol e a proteína Y é a-copiada a RT1
ou a molécula alvo X é acoplada a RT e a proteína Y é acopladaa Pol,
(B) incubação do sistema de expressão in vitro de (A) sob condi-ções que capacitam transcrição, transcrição reversa e translação para for-mar variantes Y' da proteína Y e seqüências de ácido nucléico S' que codifi-cam para estas, e que favorecem a formação de variantes Y' com proprieda-des de ligação aperfeiçoadas para a molécula alvo X,
(C) isolamento e, onde apropriado, caracterização daquelas va-riantes Y' que exibem propriedades de ligação aperfeiçoadas para ligação aX, e/ou isolamento das variantes de seqüência de ácido nucléico S' que co-dificam para Y'.
A invenção também se refere, em particular, a um método paraprodução de variantes Y' de uma proteína Y compreendendo as etapas:(A) provisão de um sistema de expressão in vitro compreenden-
do
(a) uma seqüência de ácido nucléico S que codifica para
(a1) uma seqüência de controle de transcrição ativável in transpor uma polimerase (Pol),
(a2) uma proteína Y a ser variada, e
(a3) uma transcriptase reversa (RT),ou alternativamente(a3') uma polimerase (Pol),
onde os segmentos de seqüência que codificam para (a2) e (a3)ou (a3') codificam para uma proteína de fusão sob o controle da seqüênciade controle de transcrição ativável in trans de (a1),
(b) um complexo de proteína compreendendo
(b1) um componente X que é capaz de se ligar a pelo menosuma variante de proteína Y a ser variada, e
(b2) a polimerase de RNA Pol para transcrição da seqüência deácido nucléico S de (a),ou alternativamente,(b2') a transcriptase reversa (RT),
(B) incubação do sistema de expressão in vitro de (A) sob condi-ções que capacitam a formação de variantes Y' da proteína Y,
(C) isolamento e, onde apropriado, caracterização daquelas va-riantes Y' que exibem propriedades de ligação aperfeiçoadas para ligação aX, e/ou isolamento das variantes S' de seqüência de ácido nucléico que co-dificam para Y'.
Esta invenção, desse modo, compreende sistemas autônomosque, por um lado, permitem seleção de uma dada biblioteca de variante nolaboratório, e, ao mesmo tempo, incluem um mecanismo de replicação. Nes-te particular, a seleção é pretendida - como uma evolução natural - paraalcançar variantes melhores adaptadas, via uma replicação preferida.
A presente invenção, desse modo, proporciona um método quecapacita a evolução de proteínas com propriedades aperfeiçoadas, em parti-cular, com propriedades de ligação aperfeiçoadas. O sistema da invençãocombina uma transcrição in vitro com uma translação in vitro e transcriçãoreversa. Verifica-se surpreendentemente que é possível em um sistema invitro combinar estes três processos para dar um método de evolução natu-ral. Neste sistema, os transcritos de mRNA de uma seqüência de ácido nu-cléico para uma proteína a ser variada são gerados, cujos transcritos são,em seguida, transcritos pela transcrição reversa de volta em cDNAs que po-dem, em seguida, ser transcritos e transcritos reversamente novamente.
Este tipo de amplificação usando polimerase de RNA e transcrip-tase reversa é já conhecido como alternativa para PCR. Um destes métodosde amplificação de ácido nucléico já conhecidos é o princípio NASBA (ver,por exemplo, Romana et. al., 1995, J. Virol. Methods, 54 (2-3): 109-119;Romano et al., 1997, Immunol. Invest. 26 (1-2):15-28).
A etapa de transcrição reversa com transcriptase reversa que éconhecida por ter uma certa taxa de erro devido a ausência de uma funçãode correção preferivelmente gera, partindo dos transcritos, cDNAs dos quaispelo menos alguns diferem a partir do gabarito original através de mutações.Transcrição repetida e transcrição reversa destes cDNAs resultam em umgrande número de variantes no nível de ácido nucléico, que codificam paravariantes da proteína a ser variada.
No sistema in vitro da invenção, os transcritos são transladadospara formar proteínas e variantes da proteína originalmente codificada.
Nos sistema de expressão da invenção, os reagentes requeridospara transcrição, transcrição reversa e translação (tais como, por exemplo,iniciadores, dNTPs, NTPs, tRNAs, aminoácidos etc) estão presentes emquantidade suficiente em um espaço desejado. Se a seqüência de ácido nu-cléico S, a molécula alvo X, a polimerase de RNA, e a transcriptase reversasão providas em um local particular no espaço definido, por exemplo, pelainoculação, como transcrição, transcrição reversa e translação que proce-dem os reagentes correspondentes são consumidos no local de inoculação,e uma progressiva assim denominada reação frontal é formada e contém ostranscritos, proteínas e transcritos reversos (cDNAs) que foram formadosmais tarde.
O sistema de replicação é preferivelmente construído de tal mo-do que ele permite uma taxa de mutação adequada durante as replicações.O número de variantes de uma construção inicial, que são teoricamente tes-tadas desse modo, é calculado a partir do número de progenia de um ven-cedor de uma geração para a energia do número total de gerações em umexperimento (por exemplo, 10 progenias por geração com 400 gerações =10400 variantes possíveis). Embora seja impossível para cada uma destas10400 variantes individuais explicitamente estarem presentes fisicamente emum experimento, o próprio sistema procura uma "trajetória", dentro de umterreno virtual complexo, que sempre conduz ao máximo absoluto. Somenteas variantes ao longo da trajetória existiram durante o experimento; todos ospontos (variantes) do terreno são teoricamente possíveis.
Os inventores da presente invenção encontraram possibilidadesde controlar a formação das variantes de proteína de tal modo que a trans-crição, transcrição reversa e translação de ácidos nucléicos que sofrerammutação particular formada que codifica para variantes de proteína com pro-priedades aperfeiçoadas que procedem preferencialmente. Aqueles cDNAse transcritos que codificam para variantes de proteína aperfeiçoadas estão,desse modo, presentes em grande número, e avançam mais rápido na poli-merização frontal.
A pressão evolutiva necessária para formação de variantes aper-feiçoadas muito particulares, é gerada conforme segue.
A proteína Y a ser variada é capaz de se ligar a uma moléculaalvo X. A variação da proteína Y no sentido da presente invenção resulta emvariantes Y' das quais pelo menos algumas têm propriedades de ligação a-perfeiçoadas para a ligação à molécula alvo X. De modo a favorecer a gera-ção de tais variantes e, onde apropriado, variar estas variantes adicional-mente de modo a aperfeiçoar as propriedades de ligação ainda mais, ascondições no método da invenção são escolhidas de modo que a ligaçãoentre Xea variante Y' com propriedades de ligação aperfeiçoadas conduz atranscrição reversa preferencial daqueles transcritos que codificam para asvariantes Y' com propriedades de ligação aperfeiçoadas. Os cDNAs resul-tantes desse modo codificam para variantes Y' com propriedades de ligaçãoaperfeiçoadas. O favorecimento da transcrição reversa de transcritos paravariantes Y' com propriedades de ligação aperfeiçoadas também favorecequantitativamente a transcrição renovada e translação das variantes.
De modo a alcançar isto, existe preferivelmente formação de umcomplexo de polimerase de RNA1 transcriptase reversa, X e uma variante Y',capacitando a transcrição reversa do transcrito pelo qual esta variante Y' foicodificada. Devido a proximidade espacial da RT ao transcrito que codificapara uma variante Y' com propriedades de ligação aperfeiçoadas para X,este transcrito é transcrito reversamente pela mesma RT que é complexadocom a variante aperfeiçoada Y' (ou formam uma proteína de fusão com es-ta). A figura 1 mostra diagramaticamente um método alternativo de acordocom a invenção.
Y no método da invenção é preferivelmente codificado por umácido nucléico S como proteína de fusão com uma proteína P, onde a prote-ína P é uma proteína que é envolvida na transcrição ou a transcrição rever-sa. P pode, desse modo, ser uma polimerase de RNA (Pol), ou uma trans-criptase reversa (RT)1 ou pode ser uma proteína que é associada com umapolimerase de RNA1 ou uma transcriptase reversa, ou pode ser ligada a esta.
Em duas alternativas preferidas (1 e 2) do método da invenção,a proteína Y é, ou (1) associada com RT ou codificada como proteína defusão com RT, ou (2) associada com Pol ou codificada como proteína defusão com Pol.
Y é preferivelmente codificado como proteína de fusão pela se-qüência de ácido nucléico S. Contudo, ele pode também ser codificado comoproteína Y pela seqüência de ácido nucléico S e, após translação, associadocom o componente adicional apropriado. Isto pode ser alcançado pelas inte-rações de proteína, ou via moléculas de ligação (por exemplo, bioti-na/avidina, biotina estreptavidina, etc.). Possibilidades adicionais para aco-plamento Y ou Y' a RT ou Pol incluem, entre outras, um acoplamento quími-co, via ligação covalente, ou ainda uma ligação via moléculas de reticulação,por exemplo, assim denominados articuladores, por exemplo, reticuladoresbifuncionais. Os reagentes de ligação adequados, neste caso, podem serselecionados sem problemas pelo versado na técnica.
Em uma variante para a primeira alternativa do método da in-venção, o complexo de proteína Y e RT podem também serem codificadospor duas seqüências de ácido nucléico diferentes S1 e S2, cada uma sob ocontrole de uma seqüência de controle de transcrição, o resultado neste ca-so não sendo uma proteína de fusão, mas sendo possível que a ligação en-tre Y e RT sejam trazidas sobre em outro modo, por exemplo, via bioti-na/avidina ou estreptavidina. Isto significa que a seqüência de ácido nucléicoS é, neste caso, na forma de duas seqüências de ácido nucléico S1 e S2. Éimportante que a proteína Y a ser variada esteja ligada a uma proteína deRT, ou esteja em uma forma complexada com esta, no final de translação.
A molécula alvo X está, de acordo com a alternativa menciona-da, associada ou (1) com Pol, ou (2) com RT, ou forma uma proteína de fu-são com os respectivos componentes.
A molécula alvo X pode ser uma proteína, um peptídeo, ou aindaum ácido nucléico, ou outra molécula. Ela pode, desse modo, ou ser providacomo ácido nucléico (por exemplo, codificado em um plasmídeo), e ser ex-pressa no sistema de expressão da invenção, ou pode ser provida como mo-lécula.
Na primeira alternativa, uma proteína Y a ser variada é codifica-da na forma de uma proteína de fusão com uma transcriptase reversa porum cassete de expressão. O cassete de expressão é provido na forma deuma seqüência de ácido nucléico S que é transcrita e transladada durante ométodo de evolução da invenção. Em adição a transcrição e transcrição re-versa, o presente método permite translação do transcrito de ácido nucléicoS. O resultado disto na primeira alternativa é uma proteína de fusão que in-clui a proteína Y a ser variada, e a transcriptase reversa RT.
A transcriptase reversa pode, contudo, também ser provida deacordo com a segunda alternativa como complexo com X, ou, do mesmomodo, como proteína de fusão, ou como complexo em que RT é acoplada aX em outro modo. De acordo com a segunda alternativa, a proteína de fusãocodificada pelo ácido nucléico S pode, ao invés de RT, incluir a polimerasede RNA Pol. Neste caso, uma polimerase de RNA deve ser provida no co-meço da reação. Se o método é, em seguida, efetuado sob condições quepermitem transcrição e translação, a polimerase Pol que é gerada pela trans-lação e codificada por S pode, em ciclos subseqüentes, usar o ácido nucléi-co de partida S e, onde apropriado, variantes S' deste como gabarito paratranscrição.
A seqüência de controle de transcrição é preferivelmente umpromotor que pode ser selecionado a partir de todos os promotores conven-cionais adequados para reações de polimerização de RNA. Os promotoresde polimerase de RNA T7, T3 e SP6 são preferidos para a proposta da pre-sente invenção. Contudo, outros promotores podem também ser seleciona-dos.
A transcrição é, conseqüentemente, efetuada pela provisão depolimerase de RNA, preferivelmente selecionada a partir de polimerase deRNA T7, polimerase de RNA T3, e polimerase de RNA SP6. A polimerase deRNA pode ser codificada por um ácido nucléico, ou pode ser introduzida co-mo proteína (ou proteína de fusão, ou complexo) no sistema de expressão,dependendo da alternativa selecionada do método da invenção.
É importante para a proposta da presente invenção que, se umaligação ocorre entre X e Y, ou X e Y', esta ligação traz a transcriptase rever-sa RT na proximidade espacial do transcrito. Isto significa que um complexoespacial de P/X/(Y ou Y')/RT é produzido. Isto significa que após uma reaçãode transcrição, e uma reação de translação tiver ocorrido, moléculas demRNA que foram apenas transcritas e que codificam para Y' estão presen-tes na proximidade espacial da polimerase de RNA Pol que é acoplada àproteína X. Se a ligação entre a proteína X e Y ou Y' em seguida ocorre, on-de Y ou Y' é complexada com RT, então preferivelmente uma proteína deRT está localizada na proximidade espacial para o transcrito. A proximidadeespacial entre o transcrito de RNA e a proteína de RT, via Y ou Y', promovetranscrição reversa da transcrição para Y'.
É, desse modo, possível, gerar variantes da seqüência de ácidonucléico S no nível de mRNA, que, em seguida, conduz a produtos de trans-lação que, do mesmo modo, representam variantes. É possível, desse mo-do, produzir variantes da proteína Y a ser variada, a saber, variantes Y'.Neste caso, variantes que se ligam melhor, ou que se ligam pior à proteínaX, são produzidas.
A vantagem evolutiva para variantes Y' que têm melhores pro-priedades em relação à ligação à proteína X é, em uma concretização prefe-rida, aquela, brevemente após transcrição, uma RT funcional é localizada naproximidade direta a seu próprio transcrito, e, desse modo, para Y', e prefe-rivelmente efetuam transcrição reversa na última. O resultado deste é maisrápido e/ou mais cDNAs que codificam para uma variante aperfeiçoada Y'.
Estas variantes com vantagem de seleção em seguida, por suavez, servem como seqüências de ácido nucléico de partida S' que podemser, por sua vez, transcritas, transcritas reversamente e transladadas. O usodestas é uma geração preferida e, desse modo, aumentada de variantes deseqüência de ácido nucléico S' e variantes Y' da proteína Y, que podem serisoladas após um período apropriado após o método tiver ocorrido. É tam-bém possível do mesmo modo fazer uso da taxa de erro da RT na geraçãode variantes da transcriptase reversa.
O sistema da presente invenção faz uso deste efeito pela gera-ção, através da seleção da polimerase e/ou transcriptase reversa, e/ou ascondições, variantes S' da seqüência de ácido nucléico originalmente provi-da S e, desse modo, variantes Y' das proteínas assim codificadas, especial-mente proteína Y.
As polimerases de RNA dependentes de DNA que têm uma taxade erro particular são preferivelmente usadas, resultando em transcritos commutações. Estas mutações podem ser, por exemplo, mutações de ponto, porexemplo, substituições, anulações, ou inserções podem ser geradas pelapolimerase.
Ambas as polimerases e RT não têm função de correção e, des-se modo, têm uma taxa de mutação mais alta do que polimerase com funçãode correção.
Por esta razão, portanto, as polimerases preferivelmente usadasexibem uma taxa de erro mais alta do que a polimerase tipo selvagem cor-respondente. As polimerases que têm uma taxa de mutação aumentada sãojá conhecidas na técnica anterior. Polimerase T7 e polimerase T3, mas tam-bém polimerase SP6, são preferidas. Variantes de polimerase T7 com taxasde erro aumentadas já existem (Brakmann and Grzeszik, 2001, Chem. Bio-chem. 2, 212-219).
Do mesmo modo, é também possível usar uma transcriptasereversa que é capaz de gerar transcritos com uma certa taxa de mutação.
As polimerases e transcriptases reversas sem atividade de 5'-3'-exonuclease são preferivelmente empregadas para Pol e RT, respectiva-mente. Para a proposta da presente invenção, uso pode ser feito, ou da taxade erro da polimerase de RNA, ou da transcripase reversa, ou ainda ambas.
É também possível aumentar a taxa de mutação (taxa de erro)em outro modo para gerar transcritos e/ou transcritos reversos como alterna-tiva, ou em adição ao Pol mencionado, e moléculas de RT com taxa de erroaumentada. Por exemplo, agentes mutagênicos, análogos de nucleotídeocomo substratos para Pol e/ou RT e/ou também, por exemplo, radiação UV,podem ser empregados. Tais substâncias mutagênicas podem ser selecio-nadas pelo versado na técnica porque estes conhecem a técnica anterior.
O método da invenção é adequado para ser efetuado in vitro. Oambiente de expressão pode ser qualquer ambiente de expressão adequadopara esta proposta, preferivelmente usando um capilar. Ao invés de um capi-lar, contudo, é também possível escolher um ambiente de expressão bidi-mensional, por exemplo, um ambiente entre duas placas de vidro. É tambémpossível usar um ambiente de expressão tridimensional.
No uso de um capilar, ele é inoculado em uma extremidade, naassim denominada região de inoculação, com uma seqüência de ácido nu-cléico S.
Se um sistema bidimensional é usado, é possível inocular o sis-tema em um canto, ou ainda em outro local, por exemplo, na parte interme-diária, com a seqüência de ácido nucléico S. O grau de liberdade e o númerode trajetórias seguidas pela evolução da proteína Y a ser variada são au-mentados por tal sistema bidimensional. O processo permanece controlávelnos casos através da observação das frentes de polimerização. Isto podeocorrer, por exemplo, através de reagentes de marcação tais como, por e-xemplo, reagentes de intercalamento. Novas variantes são, em seguida,formadas como frente mais rápida que se espalha linearmente no sistemacapilar, ou circularmente no sistema bidimensional. A amostragem ou isola-mento das variantes desejadas pode, em seguida, ocorrer no final dos capi-lares, ou na borda de um sistema bidimensional, ou em qualquer outro local.
É também possível usar um sistema de expressão tridimensionalde grande volume. As condições ambientais de expressão para esta propos-ta devem, em seguida, ser escolhidas de modo que o meio de reação tenhauma natureza mais viscosa, porque o líquido em um sistema de grande vo-lume é menos estabilizado pelas forças capilares.
A velocidade da frente de polimerização ao longo do capilar ousistema bi- ou tridimensional pode servir como indicador do progresso dodesenvolvimento de variantes e, desse modo, o aperfeiçoamento nas propri-edades de ligação da proteína Y a ser variada, e suas variantes Y'.
Em adição, todas as condições de reação necessárias paratranscrição e translação são ajustadas apropriadamente. Em particular, es-tas incluem a provisão de oligonucleotídeos apropriados como prímeres, ede nucleotídeos, especialmente dNTPs, NTPs1 etc. As enzimas apropriadase reagentes são requeridos para a translação, tais como, por exemplo, ri-bossomas, tRNAs, aminoácidos, transportadores de energia (tais como, porexemplo, GTP e similares), etc.
Tais condições de reação podem ser ajustadas pelo versado natécnica sem problemas, e os oligonucleotídeos de prímer apropriados podemtambém ser selecionados pelo versado na técnica.
O método da invenção permite a geração automática de varian-tes Y' da proteína Y no sistema provido. É, desse modo, possível permitirque as proteínas Y a serem variadas se desenvolvam em uma direção parti-cular que pode ser controlada através da capacidade da variante Y' se ligarà molécula alvo X.
É, desse modo, possível desenvolver qualquer proteína Y nométodo da invenção. Para esta proposta, uma proteína alvo X apropriadaque é capaz de se ligar a Y é simplesmente selecionada, e variantes compropriedades de ligação aperfeiçoadas para X são obtidas sem triagem ela-borada.
As variantes S' de seqüência de ácido nucléico (ou RNA ouDNA, ou ambos) são preferivelmente isoladas na frente de reação. Contudo,a Y'pode também ser isolada.
A presente invenção se refere adicionalmente a um kit para pro-dução de uma proteína com propriedades aperfeiçoadas, compreendendo
(a) um ambiente de expressão,
(b) uma seqüência de ácido nucléico S que codifica para umaseqüência de controle de expressão in trans por uma polimerase de RNAPol, uma proteína Y a ser variada, uma transcriptase reversa RT,
(c) um complexo compreendendo uma polimerase Pol e umaproteína X que é capaz de se ligar a pelo menos uma variante Y' da proteínaY a ser variada, ou uma seqüência de ácido nucléico codificando para talcomplexo.
A invenção se refere adicionalmente a um kit alternativo paraprodução de uma proteína com propriedades aperfeiçoadas, compreenden-do
(a) um ambiente de expressão,
(b) uma seqüência de ácido nucléico S que codifica para
(i) uma seqüência de controle de expressão ativável in trans poruma polimerase de RNA Poll
(ii) uma proteína Y a ser variada,
(iii) uma polimerase de RNA Pol,
(c) um complexo compreendendo uma transcriptase reversa RTe uma proteína X que é capaz de se ligar a pelo menos uma variante Y' daproteína Y a ser variada, ou uma seqüência de ácido nucléico codificandopara tal complexo.
DESCRIÇÃO DA FIGURA
A figura 1 mostra uma representação diagramática de um méto-do de acordo com a reivindicação 1. Uma frente de polimerização e evoluçãoavança em um sistema capilar preenchido com uma mistura de reaçãoNASBA. As moléculas geradas espacialmente preferencialmente aqui codifi-cam para variantes capazes de interagirem com a proteína X acoplada apolimerase de RNA T7.
EXEMPLO
Uma proteína de fusão composta de polimerase de RNA 17(NCBI Genbank, Ng de Acesso P00573) e proteína A (Ne de Acesso CA-A43604) é expressa em E. coli, purificada por cromatografia de afinidade, eajustada a uma concentração de 5 μg/ml em PBS/10% de glicerol. Subse-qüentemente, o anti-HIV Env anticorpo 2F5 (Hofmann-Lehmann et. al., 2001;Ferrantelli et al., 2003) é ligado na razão 1:1 ao domínio de proteína A daproteína de fusão quimérica (=complexo de RNA Pol 2F5).
Um capilar de vidro sinalizado que é aberto nas extremidades, etem um diâmetro interno de 1 mm, e um comprimento de 10 cm, é carregadocom cerca de 80 μl da seguinte mistura de reação.
Mistura de reação de translação in vitro de E. coli (sistema detranslação rápida RTS) de Roche, Penzberg na razão 1:1 com PBS.
+ complexo de RNA Pol/2F5 a uma concentração final de 0,05 μg/ml.
+ 10 mg/ml de PEG4000 para aumentar a viscosidade.
+ prímer de RT e segundo prímer a uma concentração final de 2 pmol/μl.
+ nucleotídeos de dNTP a uma concentração final de 0,1 g/μl cada.
+ nucleotídeos de NTP a uma concentração final de 0,1 nmol/μl cada.
+ onde apropriado brometo de etídium a uma concentração finalde 0,1 nmol/μl.
O capilar carregado é fixado horizontalmente em uma câmaraaquecida a 37°C, e inoculado em uma extremidade com 0,5 μΙ de uma solu-ção 1 μΜ de uma molécula de DNA trançada dupla. Esta molécula de DNAcompreende a estrutura de leitura aberta para a proteína de fusão compostade HIV Env e transcriptase reversa de vírus de leucemia de murina Moloney(NQ de Acesso AA046154).
A mistura de reação é fechada, e replicação do DNA inoculadopode se propagar como frente de polimerização como transcrito (RNA) etranscrito reverso (DNA) ao longo do capilar na direção dos reagentes dis-poníveis (para a outra extremidade).
Se brometo de etídio tiver sido adicionado à mistura, é possívelestabelecer em cada hora a posição da frente de polimerização atual, e de-terminar o ponto final da reação (extremidade do capilar alcançada), pormeio de uma lâmpada de UV mantida manualmente.
Após a extremidade do capilar ser alcançada, 2 μΙ da mistura dereação compreendendo a frente de polimerização (RNA & DNA) são removi-das a partir do capilar, e o DNA presente é amplificado por uma reação dePCR com oligonucleotídeos específicos. O produto de PCR é subclonadoem um vetor adequado, e transformado em E. coli.
A análise de seqüência de 384 clones revela uma distribuiçãoaleatória de seqüências diferentes que codificam para variantes desenvolvi-das HIV Env tendo uma afinidade aumentada para o anticorpo 2F5. Investi-gações mais detalhadas mostram repetição de motivos de proteína dentrodas variantes que são responsáveis pela afinidade aumentada.
REFERÊNCIAS
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(2) Brakmann, S. and S. Grzeszik. 2001. an Error-Prone T7 RNAPolymerase Mutant Generated by Directed Evolution. ChemBioChem. 2:212-219.
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Claims (13)
1. Método para produção de variantes Y' de uma proteína Y,compreendendo as etapas:(A) provisão de um sistema de expressão in vitro compreenden-do(i) uma seqüência de ácido nucléico S que codifica para umaproteína Y a ser variada,(ii) uma molécula alvo X que é capaz de se ligar a proteína Y,e/ou pelo menos uma variante Y' desta,(iii) uma polimerase de RNA (PoI) que é capaz de transcrever aseqüência de ácido nucléico S,(iv) uma transcriptase reversa (RT) que é capaz de transcriçãoreversa de transcritos da seqüência de ácido nucléico S,onde ou a molécula alvo X é acoplada a Pol e a proteína Yéa-coplada a RT,ou a molécula alvo X é acoplada a RT e a proteína Y é acopladaa Pol1(B) incubação do sistema de expressão in vitro de (A) sob condi-ções que capacitam transcrição, transcrição reversa e translação para for-mar variantes Y' da proteína Y e seqüências de ácido nucléico S' que codifi-cam para estas, e que favorecem a formação de variantes Y' com proprieda-des de ligação aperfeiçoadas para a molécula alvo X,(C) isolamento daquelas variantes Y' que exibem propriedadesde ligação aperfeiçoadas para ligação a X, e/ou isolamento das variantes S'de seqüência de ácido nucléico que codificam para Y'.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, compreendendo asetapas:(A) provisão de um sistema de expressão in vitro compreendendo(a) uma seqüência de ácido nucléico S que codifica para(a1) uma seqüência de controle de transcrição ativável in transpor uma polimerase de RNA Pol,(a2) uma proteína Y a ser variada, e(a3) uma transcriptase reversa (RT)1ou alternativamente(a3') uma polimerase de RNA (Pol),onde os segmentos de seqüência que codificam para (a2) e (a3)ou (a3') codifica para uma proteína de fusão sob o controle da seqüência decontrole de transcrição ativável in trans de (a1),(b) um complexo de proteína compreendendo(b1) um componente X que é capaz de se ligar à proteína Y e/oupelo menos uma variante Y'da proteína Y a ser variada, e(b2) a polimnerase de RNA (PoI) para transcrição da seqüênciade ácido nucléico S de (a),ou alternativamente,(b2') a transcriptase reversa (RT),(B) incubação do sistema de expressão in vitro de (A) sob condi-ções que capacitam a formação de variantes Y' da proteína Y,(C) isolamento daquelas variantes Y' que exibem propriedadesde ligação aperfeiçoadas para ligação a X, e/ou isolamento das variantes S'de seqüência de ácido nucléico que codificam para Y'.
3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, onde um complexo de Pol, RT, X e uma variante Y' que capacitatranscrição reversa do transcrito pelo qual esta variante Y' foi codificada éformado.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, onde a seqüência de ácido nucléico S codifica ou para uma prote-ína de fusão composta de Y e RT, quanto tanto uma proteína de fusão com-posta de Y e Pol.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, onde Pol, RT e/ou X são codificados por um ácido nucléico, ousão providos como proteínas, ou proteínas de fusão.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, onde um capilar, um ambiente de expressão bidimensional, ou umambiente de expressão tridimensional, é usado como sistema de expressãoin vitro.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, onde a seqüência de controle de transcrição é selecionada a partirde um promotor de polimerase de RNA T7, um promotor de polimerase deRNA T3, e um promotor de polimerase de RNA SP6.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, onde polimerase de RNA T7, polimerase de RNA T3, ou polimera-se de RNA SP6, é usada como Pol.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações pre-cedentes, onde uma polimerase de RNA exibindo uma taxa de erro aumen-tada do que a polimerase tipo selvagem correspondente é usada como Pol.
10. Kit para produção de uma proteína com propriedades aper-feiçoadas, compreendendo(a) um ambiente de expressão,(b) uma seqüência de ácido nucléico S que codifica para(b1) uma seqüência de controle de expressão in trans por umapolimerase de RNA,(b2) uma proteína Y a ser variada,(b3) uma transcriptase reversa,(c) um complexo compreendendo uma polimerase de RNA euma molécula alvo X que é capaz de se ligar a pelo menos uma variante Y'da proteína Y a ser variada, ou uma seqüência de ácido nucléico codificandopara tal complexo.
11. Kit para produção de uma proteína com propriedades aper-feiçoadas, compreendendo(a) um ambiente de expressão,(b) uma seqüência de ácido nucléico S que codifica para(b1) uma seqüência de controle de expressão ativável in transpor uma proteína p,(b2) uma proteína Y a ser variada,(b3') uma polimerase de RNA,(c) um complexo compreendendo uma transcriptase reversa euma molécula alvo X que é capaz de se ligar a pelo menos uma variante Y'da proteína Y a ser variada, ou uma seqüência de ácido nucléico codificandopara tal complexo.
12. Kit, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, onde o ambien-te de expressão é selecionado de um capilar, um ambiente de expressãobidimensional, e um ambiente de expressão tridimensional.
13. Kit, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12,compreendendo adicionalmente prímeres adequados, dNTPs, NTPs e/outampões.
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