BRPI0614631A2 - proteìnas de fusão entre enzimas de degradação de parede celular de plantas, e seus usos - Google Patents

Abstract

PROTEìNAS DE FUSãO ENTRE ENZIMAS DE DEGRADAçãO DE PAREDE CELULAR DE PLANTAS, E SEUS USOS. A invenção refere-se ao uso de proteínas de fusão entre pelo menos duas enzimas de degradação de parede celular de plantas, as referidas enzimas sendo de tal forma que elas não contêm uma molécula de ligação a carboidratos C-terminal (CBM), e opcionalmente uma CBM, as referidas enzimas e a CBM sendo proteínas recombinantes correspondendo a proteínas nativas em fungos, ou suas formas mutadas, para realizar processos de degradação de parede celular de plantas no âmbito da preparação, a partir de plantas ou subprodutos vegetais, de compostos de interesse localizados na parede celular de plantas, ou no âmbito do branqueamento da polpa e do papel.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invençãopara "PROTEÍNAS DE FUSÃO ENTRE ENZIMAS DEDEGRADAÇÃO DE PAREDE CELULAR DE PLANTAS, ESEUS USOS".

A invenção refere-se à construção esuperprodução de enzimas de degradação de parede celular deplantas multifuncionais criadas por engenharia genética, e a seususos como instrumentos enzimáticos aperfeiçoados para avalorização de subprodutos agrícolas.

Os resíduos agrícolas representam uma grandefonte de recursos renováveis para a bioconversão delignoceluloses. Diariamente, os produtos da indústria alimentíciageram muitos desses subprodutos, considerados resíduospoluentes que precisam ser eliminados. Houve um grandeinvestimento em pesquisas para a valorização desses subprodutosno setor biotecnológico. Dentre os componentes valorizáveis, oácido ferúlico (ácido 4-hidroxi-3-metóxi-cinâmico) é umcomposto fenólico muito interessante, encontrado como o ácidohidroxicinâmico mais abundante no mundo vegetal. Por exemplo,o ácido ferúlico pode ser usado como antioxidante (23) ou sertransformado, por conversão microbiana, em vanilina "natural"como um aroma custoso nas indústrias alimentícia, cosmética efarmacêutica (4, 26). Dentre os subprodutos agrícolas, os farelosde trigo e de milho são substratos em potencial de acordo comsuas altas concentrações de ácido ferúlico na parede celular, istoé, 3% e 1% (p/p), respectivamente (43). Na fisiologia vegetal, oácido ferúlico é um componente estrutural essencial, comimportantes propriedades físicas e químicas das paredes celularesdas plantas. De fato, ele pode agir como um agente de reticulaçãoentre a lignina e os carboidratos ou entre os próprios carboidratos(16), influenciando na integridade da parede celular, e, assim,reduzindo a extensão da biodegradabilidade resultante dasenzimas microbianas (6).

As enzimas evoluídas em microorganismos,como as feruloil esterases (EC 3.1.1.73), são capazes dehidrolisar ligações de éster, ligando o ácido ferúlico aospolissacarídeos da parede celular das plantas. Essas enzimaspermitem uma acessibilidade facilitada de outras enzimaslignocelulolíticas à estrutura do polissacarídeo (para uma análise,consulte 12). Os estudos anteriores demonstram que as feruloilesterases agem em sinergia com as enzimas degradação de cadeiaprincipal, tais como p-(l,4)-endoxilanases, para aumentar aliberação de ácido ferúlico da parede celular da planta e paraprodução da quantidade suficiente necessária para as aplicações(2, 15, 50). Fungos filamentosos, como o Aspergillus niger, sãoprodutores bem conhecidos de enzimas de degradação de paredecelular de plantas. Dois genes diferentes que codificam asferuloil esterases de A. niger já foram clonadas (10, 11), e suasproteínas recombinantes correspondentes superproduzidas emPichia pastoris e A. niger (24, 30, 41). Várias feruloil esterasesfúngicas foram purificadas e caracterizadas (18, 47), masnenhum gene foi adicionalmente clonado. Trabalhos anterioresrelataram o isolamento de Penicillium funiculosum da primeiracinamoil esterase fungica (tipo B) com um domínio C-terminalmuito similar ao Módulo de Ligação a Carboidratos (CBM) dafamília 1 (27). Muitas glicosil hidrolases de microorganismosanaeróbicos e aeróbicos possuem uma estrutura modular. Além deum domínio catalítico, um ou mais CMB não catalíticos podemestar localizados tanto no N como no C-terminal, ou em ambos.As CBMs foram classificadas em famílias com seqüências deaminoácidos e estruturas 3D similares (http ://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html). As CBMs têm um grande papel nadegradação de substratos insolúveis (45). Por exemplo, eles sãoresponsáveis por manter o domínio de núcleo catalítico próximoao substrato, aumentando a longevidade e intimidade do contato.Além disso, em alguns casos, as CBMs também alteram aestrutura das microfibrilas da celulose com o enfraquecimento dasligações de hidrogênio das cadeias de celulose reunidas (13, 14,33).

A presente invenção envolve consideraçõessobre o efeito sinérgico entre as enzimas de degradação celular deplantas livres e fusionadas de fungos, como A. niger. Em umestado recente baseado em celulossomas bacterianas criadas porengenharia genética, a proximidade física de dois componentescatalíticos permitiu observar sinergia melhorada em substratosrecalcitrantes (17). Baseando-se nisto, os inventores projetaramuma proteína quimérica associando uma feruloil esterase fungicae um domínio de doquerina clostridial em que será inserida umasegunda enzima em uma proteína estruturada contendo CBMbacteriana (31). Entretanto, o rendimento de produção da proteínarecombinante não foi suficiente para aplicações de teste em escalaindustrial, fazendo-nos pensar em uma nova estratégia. Nopresente trabalho, os inventores fusionaram duas enzimasfungicas: a feruloil esterase A (FAEA) e a xilanase B (XYNB) deA. niger, separadas por um peptídeo de ligação hiperglicosiladopara obter uma enzima bifimcional (FLX) com eficiênciaaumentada para a liberação de ácido ferúlico. Além do mais, osinventores também adicionaram, em uma segunda construção,uma CBM fungica da celobiohidrolase B (CBHB) de A. niger naextremidade C-terminal dessa enzima bifuncional (FLXLC).

Ambas as enzimas híbridas foram produzidas com êxito em A.niger e totalmente caracterizadas, considerando os aspectosbioquímicos e cinéticos, e finalmente usadas para liberar o ácidoferúlico de substratos naturais: farelos de trigo e de milho. Oobjetivo desse trabalho foi comparar a eficiência de liberação doácido ferúlico usando enzimas livres ou fusionadas a fim deestudar a sinergia enzimática gerada pela proximidade física dasenzimas fungicas. Além do mais, o efeito da adição da CBM noC-terminal da enzima bifuncional foi investigado na construçãoda FLXLC.

A presente invenção baseia-se na demonstraçãodo efeito sinérgico da fusão em uma única proteína quimérica dasenzimas de degradação de plantas, as referidas enzimas sendo detal forma que eles não contém uma CBM, se comparado ao usodas enzimas de degradação de parede celular de plantas livres.

Assim, o principal objetivo da presenteinvenção é obter novas proteínas de fusão entre enzimas dedegradação de parede celular de plantas livres de CBM.

Outro objetivo da presente invenção é proporum novo processo para a separação dos compostos de interesseligados às paredes das células vegetais, por meio da aplicação dasreferidas proteínas de fusão às plantas, e vantajosamente aossubprodutos agrícolas, como substratos.

A presente invenção refere-se ao uso deproteínas de fusão entre pelo menos duas enzimas de degradaçãode parede celular de plantas, as referidas enzimas sendo de talforma que elas não contêm uma molécula de ligação acarboidratos C-terminal (CBM), e opcionalmente uma CBM, asreferidas enzimas e a CBM sendo proteínas recombinantescorrespondendo a proteínas nativas em fungos, ou suas formasmutadas, para realizar processos de degradação de parede celularde plantas no âmbito da preparação, a partir de plantas ousubprodutos vegetais, de compostos de interesse localizados naparede celular de plantas, ou no âmbito do branqueamento dapolpa e do papel.

A expressão "enzimas de degradação de paredecelular de plantas" refere-se a enzimas que são capazes de efetuara digestão dos componentes de parede celular, como a celulose,hemicelulose e lignina. As enzimas de degradação de paredecelular das plantas nas referidas proteínas de fusão são idênticas,ou diferentes uma da outra.

A expressão "molécula de ligação a carboidratosC-terminal" refere-se a uma molécula com afinidade por celulose,que direciona sua enzima associada à celulose.

A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, em que as enzimas de degradaçãode parede celular de plantas que não contêm uma CBM sãohidrolases selecionadas entre:

celulases, como celobiohidrolases,endoglicanases e exoglicanases, ou β-glicosidases,

hemicelulases, como xinalanases,lignases capazes de degradar ligninas, comolacases, manganês peroxidase, lignina peroxidase, peroxidaseversátil, ou enzimas suplementares como celobiosedesidrogenase, e álcool arílico oxidases,

- cinamoil éster hidrolases capazes de liberarácidos cinâmicos, como ácido ferúlico, e de hidrolisar ligaçõescruzadas de ácido diferúlico entre cadeias de hemicelulose, taiscomo feruloil esterases, cinamoil esterases e ácido clorogênicohidrolases. A invenção refere-se, mais particularmente, ao uso,conforme definido acima, em que as enzimas de degradação deparede celular de plantas que não contêm uma CBM sãoselecionadas entre feruloil esterases e xilanases.

A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, em que as enzimas de degradaçãode parede celular de plantas que não contêm uma CBMcorrespondem a enzimas nativas, ou a suas formas mutadas, defungos selecionados entre:

* ascomicetes, como linhagens de Aspergillus, emais particularmente, Aspergillus niger,

* basidiomicetes, como linhagens dePycnoporus ou Halociphina, e mais particularmente, Pycnoporuseinnabarinus, Pycnoporus sanguineus ou Haloeyphina villosa.

A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, em que as enzimas de degradaçãode parede celular de plantas que não contêm uma CBMcorrespondem a enzimas nativas, ou a suas formas mutadas, delinhagens de Aspergillus, tal como Aspergillus niger.

A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, em que pelo menos uma dasenzimas de degradação de parede celular de plantas é uma feruloilesterase selecionada entre:

a feruloil esterase A de A. niger, representadapela SEQ ID N°: 2, codificada pelo ácido nucléico representadopelo SEQ ID N-: 1,

a feruloil esterase B de A. niger, representadapela SEQ ID N°: 4, codificada pelo ácido nucléico representadopelo SEQ ID N2: 3.

A invenção se refere, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, em que pelo menos uma dasenzimas de degradação de parede celular de plantas é umaxilanase, conforme definida acima, tal como a xilanase B de A.niger, representada pelo SEQ ID N°: 6, codificada pelo ácidonucléico representado pelo SEQ ID N°: 5.

A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, em que a proteína sendo umaCBM é selecionada entre a CBM presente nas enzimas nativas, ouem suas formas mutadas, de fungos selecionados entreascomicetes, tal como linhagens de Aspergillus, e maisparticularmente, Aspergillus niger.

As CBMs que podem ser usadas de acordo coma presente invenção são as da família 1.

A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, em que a CBM é a CBM presentena celobiohidrolase B de A. niger, e representada pelo SEQ ID8, codificada pelo ácido nucléico representado pelo SEQ IDN°: 7.

A invenção também se refere ao uso, conformedefinido acima, de proteínas de fusão que compreendem ligantesentre pelo menos duas das proteínas compreendidas nas referidasproteínas de fusão, os referidos ligantes sendo polipeptídeos de 10a 100 aminoácidos, de preferência de cerca de 50 aminoácidos.

A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, de proteínas de fusão, em que umIigante está incluído entre cada proteína compreendida nasreferidas proteínas de fusão.A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, em que o ligante é um polipeptídeohiperglicosilado, tal como a seqüência representada pelo SEQ ID№: 10, presente na celobiohidrolase B de A. niger, e codificadapelo ácido nucléico representado pelo SEQ ID №: 9.

A invenção também se refere, maisparticularmente, ao uso, conforme definido acima, de proteínas defusão entre uma feruloil esterase e uma xilanase, e,opcionalmente, uma CBM.

A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, de proteínas de fusão entre aferuloil esterase A de A. niger, representada pelo SEQ ID №: 2,ou a feruloil esterase B de A. niger, representada pelo SEQ ID №:4, e a xilanase B de A. niger, representada pelo SEQ ID №: 6.

A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, da proteína de fusão entre aferuloil esterase A de A. niger, representada pelo SEQ ID №: 2, eda xilanase B de A. niger, representada pelo SEQ ID №: 6, areferida proteína de fusão compreendendo a seqüênciarepresentada pelo SEQ ID № : 10 como um ligantehiperglicosilado entre as duas proteínas anteriores, e sendorepresentado pelo SEQ ID №: 12.

A invenção refere-se ainda ao uso, conformedefinido acima, de proteínas de fusão entre a feruloil esterase Ade A. niger, representada pelo SEQ ID №: 2, da xilanase B de A.niger, representada pelo SEQ ID Ne : 6, e da CBM representadapelo SEQ ID N°: 8, presente na celobiohidrolase B de A. niger.

A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, da proteína de fusão entre aferuloil esterase A de A. niger, representada pelo SEQ ID N~: 2,da xilanase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N°: 6, e daCBM representada pelo SEQ ID N- : 8, a referida proteína defusão compreendendo a seqüência representada pelo SEQ ID N~:como um ligante hiperglicosilado entre cada uma das trêsproteínas anteriores, e sendo representado pelo SEQ ID N-: 14.

A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, da proteína de fusão entre aferuloil esterase B de A. niger, representada pelo SEQ ID Nfi: 4, eda xilanase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N-: 6, areferida proteína de fusão compreendendo a seqüênciarepresentada pelo SEQ ID N- : 10 como um ligantehiperglicosilado entre as duas proteínas anteriores, e sendorepresentado pelo SEQ ID N°: 16.

A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, de proteínas de fusão entre aferuloil esterase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N°: 4,da xilanase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N- : 6, e daCBM representada pelo SEQ ID Ns: 8, presente nacelobiohidrolase B de A. niger.

A invenção refere-se, mais particularmente, aouso, conforme definido acima, da proteína de fusão entre aferuloil esterase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N2: 4,da xilanase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N°: 6, e daCBM representada pelo SEQ ID N- : 8, a referida proteína defusão compreendendo a seqüência representada pelo SEQ ID N- :10 como um ligante hiperglicosilado entre cada uma das trêsproteínas anteriores, e sendo representado pelo SEQ ID N2: 18.

A invenção também se refere ao uso, conformedefinido acima, para realizar processos de degradação de paredecelular de plantas no âmbito da preparação dos seguintescompostos de interesse:

bioetanol,

antioxidantes, como ácido ferúlico ou ácidocaféico, que são ácidos cinâmicos, e hidroxitirosol, ou ácidogálico,

aromas, como vanilina ou p-hidroxibenzaldeído, obtidos da biotransformação do ácidoferúlico ou do ácido p-coumárico, respectivamente,

ou no âmbito do branqueamento da polpa e dopapel.

A invenção também se refere ao uso, conformedefinido acima, em que as referidas proteínas de fusão sãoadicionadas diretamente às plantas ou subprodutos vegetais comosubstratos, ou são segregadas por células de fungos transformadascom ácidos nucléicos que codificam as referidas proteínas defusão, tais como os fungos mencionados acima, e maisparticularmente, A. niger e Pycnoporus cinnabarinus, osreferidos fungos sendo colocados em contato com as referidasplantas ou subprodutos vegetais como substratos.

A invenção também se refere a um processo dedegradação de parede celular de plantas para a preparação, a partirde plantas ou subprodutos vegetais, de compostos de interesselocalizados na parede celular de plantas, caracterizado porcompreender as seguintes etapas:

o tratamento enzimático de plantas ousubprodutos vegetais ou resíduos industriais, com proteínas defusão conforme definidas acima, ou com células de fungostransformadas conforme definidas acima, opcionalmente, otratamento físico de plantas ou subprodutos vegetais usandoexplosão a vapor em combinação com a ação de proteínas defusão,

opcionalmente, a biotransformação commicroorganismos ou enzimas apropriadas dos compostosliberados pelas paredes celulares durante o tratamento enzimáticoacima, a recuperação, e, se necessária, a purificação do compostode interesse liberado pelas paredes celulares durante o tratamentoenzimático acima ou obtido durante a etapa de biotransformaçãoacima.

De preferência, as plantas tratadas comproteínas de fusão no processo de acordo com a invenção sãoselecionadas entre beterraba, trigo, milho, arroz, ou todas asárvores usadas nas indústrias papeleiras.De preferência, os subprodutos vegetais ouresíduos industriais tratados com proteínas de fusão no processode acordo com a invenção são selecionados entre palha de trigo,farelo de milho, farelo de trigo, farelo de arroz, bagaço de maçã,bagaço de café, subprodutos do café, água residual de usinas deoliva.

A invenção refere-se, mais particularmente, aum processo, conforme definido acima, para a preparação deantioxidantes como compostos de interesse, o referido processocompreendendo:

o tratamento de plantas ou subprodutos vegetaiscom proteínas de fusão compreendendo pelo menos duas dasseguintes enzimas de degradação de parede celular que nãocontêm uma CBM: feruloil esterase A, feruloil esterase B, ácidoclorogênico hidrolase, xilanase, em que a proteína de fusão épreferivelmente selecionada dentre feruloil esterase A-xilanase,feruloil esterase B-xilanase, feruloil esterase A-feruloil esterase AA-xilanase, feruloil esterase A-feruloil esterase B-xilanase, ácidoclorogênico hidrolase-xilanase.

a recuperação, e, se necessária, apurificação dos antioxidantes liberados pelas paredes celularesdas referidas plantas ou subprodutos vegetais.

A invenção refere-se, mais particularmente, aum processo, conforme definido acima, para a preparação deácidos cinâmicos, tal como ácido ferúlico, como antioxidante deinteresse, em que a proteína de fusão usada contém uma feruloil-esterase e uma xilanase, e opcionalmente uma CBM, conformedefinido acima, e é mais particularmente selecionada entre o SEQID NO : 12, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 16 e SEQ ID NO : 18.

De forma vantajosa, no âmbito da preparação deantioxidantes, tal como ácido ferúlico, as plantas tratadas com asproteínas de fusão definidas acima são escolhidas entre asseguintes: beterraba, trigo, trigo,arroz, subprodutos vegetais ouresíduos industriais tratados com proteínas de fusão definidasacima, sendo selecionados dentre o seguinte: palha de trigo, farelode milho, farelo de trigo, farelo de arroz, bagaço de maçã, bagaçode café, subprodutos do café, água residual de usinas de oliva.

A invenção refere-se ainda a um processo,conforme definido acima, para a preparação de aromas comocompostos de interesse, o referido processo compreendendo:

o tratamento de plantas ou subprodutos vegetaiscom as proteínas de fusão usadas no âmbito da preparação dosantioxidantes, conforme definido acima,

a biotransformação dos compostos liberadospelas paredes celulares durante a etapa anterior, pela colocaçãodos referidas compostos em contato com enzimas não definidasproduzidas por microorganismos selecionados entre ascomicetesou basidiomicetes, tal como A. nigerou P. cinnabarinus, respectivamente.

a recuperação, e, se necessária, a purificação,dos aromas obtidos na etapa de biotransformação anterior.A invenção refere-se, mais particularmente, aum processo conforme definido acima, para a preparação devanilina como um aroma de interesse, em que a proteína de fusãousada é selecionada entre as usadas para a preparação de ácidoferúlico conforme definido acima, e a etapa de biotransformação érealizada colocando o ácido ferúlico liberado pelas paredescelulares em contato com enzimas não definidas produzidas porascomicetes ou basidiomicetes, tal como A. niger ou P.cinnabarinus, respectivamente.

De forma vantajosa, as plantas e subprodutosvegetais, ou resíduos industriais usados no âmbito da preparaçãodos aromas, tal como vanilina, são selecionados entre osmencionados acima para a preparação dos antioxidantes.

A invenção refere-se ainda a um processo,conforme definido acima, para a preparação de bioetanol comoum composto de interesse, o referido processo compreendendo:

o tratamento de plantas ou subprodutosvegetais com proteínas de fusão compreendendo pelo menos duasdas seguintes enzimas de degradação de parede celular de plantasque não contêm CBM: celulases, gemicelulases esterases, lacases,peroxidases, álcool arílico oxidase, em que a proteína de fusão épreferivelmente escolhida entre a endoglicanase-exoglicanase,lacase-silanase, xilanase-celulase (endo ou exo glicanase), oreferido tratamento sendo vantajosamente combinado com umtratamento físico das referidas plantas ou subprodutos vegetais,a biotransformação das plantas ou subprodutosvegetais tratados obtidos pela etapa anterior em açúcaresfermentáveis, pelo uso de proteínas de fusão descrito acima oucom um fungo transformado segregando as proteínas de fusão, emcombinação com enzimas selecionadas entre celulases,hemicelulases ou esterases, ou microorganismos selecionadosentre ascomicetes, tal como A. niger or Trichoderma reesei,

a biotransformação dos açúcares fermentáveisem bioetanol por levedura;

A invenção refere-se, mais particularmente, aum processo, conforme definido acima, para a preparação deaçúcares fermentáveis para a produção de bioetanol subseqüente,em que a proteína de fusão é selecionada entre endoglicanase-exoglicanase, lacase-xilanase xilanase-celulase (endo ou exoglicanase).

De maneira vantajosa, as plantas e subprodutosvegetais ou resíduos industriais usados no âmbito da preparaçãodo bioetanol são selecionados entre o seguinte: madeira, plantasanuais ou subprodutos agrícolas.

A invenção também se refere a um processopara o branqueamento da polpa e do papel, o referido processocompreendendo:

o tratamento químico e físico de plantas ousubprodutos vegetais em combinação com proteínas de fusãocompreendendo pelo menos duas das seguintes enzimas dedegradação de parede celular de plantas que não contêm umaCBM: feruloil esterase A, feruloil esterase Β, xilanase, lacase,álcool arílico oxidase, manganês peroxidase, lignina peroxidase,peroxidase versátil ou celobiose desidrogenase. - opcionalmente,a biopolpação das plantas ou subprodutos vegetais tratados,obtidos na etapa anterior, com um fungo transformado segregandoproteínas de fusão que compreendem pelo menos duas dasseguintes enzimas de degradação de parede celular de plantas quenão contêm uma CBM: feruloil esterase A, feruloil esterase B,xilanase, lacase, álcool arílico oxidase, manganês peroxidase,lignina peroxidase, peroxidase versátil ou celobiosedesidrogenase.

a biopolpação das plantas ou subprodutosvegetais tratados, obtidos na etapa anterior, com proteínas defusão compreendendo pelo menos duas das seguintes enzimas dedegradação de parede celular de plantas que não contêm umaCBM: feruloil esterase A, feruloil esterase B, xilanase, lacase,álcool arílico oxidase, manganês peroxidase, lignina peroxidase,peroxidase versátil ou celobiose desidrogenase.

A invenção refere-se, mais particularmente, aum processo, conforme definido acima, para o branqueamento dapolpa e do papel, em que a proteína de fusão usada na primeiraetapa de tratamento das plantas e subprodutos vegetais éselecionada entre feruloil esterase A-xilanase, feruloil esterase B-xilanase, feruloil esterase A-feruloil esterase A-xilanase, feruloilesterase A-feruloil esterase B-xilanase, lacase-xilanase, álcoolarílico oxidase-manganês peroxidase, a proteína de fusãosegregada pelo fungo transformado usado na etapa debiopolpação sendo selecionada entre feruloil esterase A-xilanase,feruloil esterase B-xilanase, feruloil esterase A-feruloil esteraseA-xilanase, feruloil esterase A-feruloil esterase B-xilanase,lacase-xilanase, álcool arílico oxidase-manganês peroxidase,superproduzido por P. cinnabarinus ou A. niger, e a proteína defusão usada na etapa de biobranqueamento sendo selecionadaentre feruloil esterase A-xilanase, feruloil esterase B-xilanase,feruloil esterase A-feruloil esterase A-xilanase, feruloil esteraseA-feruloil esterase B-xilanase, lacase-xilanase, álcool arílicooxidase-manganês peroxidase.

A invenção também se refere a proteínas defusão entre pelo menos duas enzimas de degradação de paredecelular de plantas que não contêm uma molécula de ligação acarboidratos (CBM), e opcionalmente uma CBM, as referidasenzimas e a CBM sendo proteínas recombinantes correspondendoa proteínas nativas em fungos, ou suas formas mutadas, conformedefinidos acima.

A invenção refere-se, mais particularmente, a proteínasde fusão conforme definidas acima, compreendendo ligantes entre pelomenos duas das proteínas compreendidas nas referidas proteínas de fusão, osreferidos ligantes sendo conforme definido acima.

A invenção se refere, mais particularmente, aproteínas de fusão, conforme definidas acima, entre uma feruloilesterase e uma xilanase, e, opcionalmente, uma CBM.A invenção refere-se, mais particularmente, aproteínas de fusão conforme definidas acima, entre a feruloilesterase A de A. niger, representada pelo SEQ ID N°: 2, ou aferuloil esterase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N°: 4, ea xilanase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N-: 6.

A invenção refere-se, mais particularmente, àproteína de fusão, conforme definida acima, entre a feruloilesterase A de A. niger, representada pelo SEQ ID N-: 2, e axilanase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N°: 6, a referidaproteína de fusão compreendendo a seqüência representada peloSEQ ID N- : 10 como um ligante hiperglicosilado entre as duasproteínas anteriores, e sendo representado pelo SEQ ID N-: 12.

A invenção refere-se ainda a proteínas de fusão,conforme definidas acima, entre a feruloil esterase A de A. niger,representada pelo SEQ ID Nfi: 2, da xilanase B de A. niger,representada pelo SEQ ID Ns : 6, e a CBM representada peloSEQID N-: 8, presente na celobiohidrolase B de A. niger.

A invenção refere-se, mais particularmente, àproteína de fusão, conforme definida acima, entre a feruloilesterase A de A. niger, representada pelo SEQ ID N°: 2, daxilanase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N°: 6, e a CBMrepresentada pelo SEQ ID N- : 8, a referida proteína de fusãocompreendendo a seqüência representada pelo SEQ ID N2 : 10como um ligante hiperglicosilado entre cada uma das trêsproteínas anteriores, e sendo representado pelo SEQ ID N-: 14.A invenção refere-se, mais particularmente, àproteína de fusão, conforme definida acima, entre a feruloilesterase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N°: 4, e axilanase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N°: 6, a referidaproteína de fusão compreendendo a seqüência representada peloSEQ ID N- : 10 como um ligante hiperglicosilado entre as duasproteínas anteriores, e sendo representado pelo SEQ ID N-: 16.

A invenção refere-se ainda a proteínas defusão, conforme definidas acima, entre a feruloil esterase B de A.niger, representada pelo SEQ ID Ns: 4, da xilanase B de A.niger, representada pelo SEQ ID Nfi : 6, e a CBM representadapelo SEQ ID N°: 8, presente na celobiohidrolase B de A. niger.

A invenção refere-se, mais particularmente, àproteína de fusão, conforme definida acima, entre a feruloilesterase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N-: 4, daxilanase B de A. niger, representada pelo SEQ ID N°: 6, e a CBMrepresentada pelo SEQ ID Nfi : 8, a referida proteína de fusãocompreendendo a seqüência representada pelo SEQ ID N- : 10como um ligante hiperglicosilado entre cada uma das trêsproteínas anteriores, e sendo representado pelo SEQ ID N-: 18.

A invenção também se refere a ácidos nucléicosque codificam uma proteína de fusão conforme definida acima.

A invenção refere-se, mais particularmente, aosácidos nucléicos representados pelo SEQ ID NO : 11, 13, 15 e 17codificando as proteínas de fusão representadas pelo SEQ ID NO: 12, 14, 16 e 18, respectivamente.A invenção também se refere aos ácidosnucléicos representados pelo SEQ ID NO : 19 e 21correspondendo ao SEQ ID NO : 11 e 13, em que o a seqüênciaSEQ ID NO : 1 é substituída pela seqüência SEQ ID NO : 23 quecodifica a pré-feruloil esterase A correspondendo ao SEQ ID NO: 24, os referidos ácidos nucléicos SEQ ID NO : 19 e 21codificando as pré-proteínas de fusão correspondendo àsseqüências SEQ ID NO : 20 e 22.

A invenção também se refere aos ácidosnucléicos representados pelo SEQ ID NO : 25 e 27correspondendo ao SEQ ID NO : 15 e 17, em que o a seqüênciaSEQ ID NO : 3 é substituída pela seqüência SEQ ID NO : 29 quecodifica a pré-feruloil esterase B correspondendo ao SEQ ID NO: 30, os referidos ácidos nucléicos SEQ ID NO : 25 e 27codificando as pré-proteínas de fusão correspondendo àsseqüências SEQ ID NO : 20 e 22.

A invenção também se refere aos vetores, talcomo ρAN 52.3, transformados com um ácido nucléico conformedefinido acima.

A invenção também se refere a célulashospedeiras, como ascomicetes ou basidiomicetes, e maisparticularmente, A. niger ou P. cinnabarinus, transformadas comum ácido nucléico conforme definido acima, pelo uso de vetoresconforme mencionados acima.

A invenção também se refere a um processopara a preparação de proteínas de fusão conforme definidasacima, compreendendo a cultura in vitro de células hospedeirasconforme definidas acima, a recuperação, e, se necessária, apurificação das proteínas de fusão produzidas pelas referidascélulas hospedeiras na cultura.

A invenção é ilustrada em detalhes na descriçãodetalhada seguinte da preparação e das propriedades das enzimasquiméricas FLX (SEQ ID NO : 12) e FLXLC (SEQ ID NO : 14).

Duas enzimas quiméricas FLX e FLXLC foramprojetadas e superproduzidas com êxito em Aspergillus niger. Aconstrução da FLX é composta das seqüências que codificam aferuloil esterase A (FAEA) fusionada à endoxilanase B (XYNB)de A. niger. Um Módulo de Ligação a Carboidratos C-terminal(família 1 da CBM) foi inserido em FLX, gerando a segundaenzima híbrida: FLXLC. Entre cada parceiro, foi incluído umligante hiperglicosilado para estabilizar as construções. Asproteínas híbridas foram purificadas à homogeneidade e asmassas moleculares foram estimadas como sendo de 72 kDa e 97kDa para FLX e FLXLC, respectivamente. A integridade dasenzimas híbridas foi verificada por imunodetecção, que mostrouuma forma única pelo uso de anticorpos contra FAEA e marca depoliistidina. As propriedades fármaco-químicas de cada módulocatalítico das enzimas bifuncionais corresponderam às dasenzimas livres. Além disso, verificados que a FLXLC apresentouforte afinidade pela celulose microcristalina (Avicel) comparâmetros de ligação correspondendo a Kd 9.9 10-8 para aconstante de dissociação e 0,98 μιηοΐ/g de Avicel para acapacidade de ligação. Ambas as enzimas bifuncionais foraminvestigadas em relação à capacidade de liberar ácido ferúlico apartir de substratos naturais: farelos de trigo e de milho. Quandocomparado às enzimas livres FAEA e XYNB, obteve-se umefeito sinérgico maior pelo uso de FLX e FLXLC para ambos ossubstratos. Além do mais, a sinergia foi aumentada para FLXLCse comparada a FLX para a liberação de ácido ferúlico usandofarelo de milho como o substrato, confirmando um papel positivoda CBM. Em conclusão, esses resultados demonstraram que afusão em enzimas bifuncionais de hidrolases de parede celularnaturalmente livres e uma CBM de A. niger permite aumentar oefeito sinérgico sobre a degradação de substratos complexos.

Materiais e Métodos

Linhagens e meios de cultura

Foi usado Escherichia eoli JMl 09 (Promega)para a construção e propagação dos vetores, e a linhagem A. nigerD15#26 (pyrg-) (22) para a produção das proteínasrecombinantes. Após a co-transformação com vetores contendo,respectivamente, o gene pyrG e o cassete de expressão FLX ouFLXLC (Fig. 1), A. niger foi cultivado para seleção em meiosólido mínimo (sem uridina) contendo 70 mM de NaNO3, 7 mMde KCl, 11 mM de KH2HPO4, 2 mM de MgSO4, glicose a 1%(p/v) e microelementos [IOOOx estoque: 76 mM de ZnSO4, 25mM de MnCl2, 18 mM de FeSO4, 7,1 mM de CoCl2, 6,4 mM deCuSO4, 6,2 mM de Na2MoO4, 174 mM de ácidoetilenodiaminotetracético (EDTA)]. De modo a filtrar ostransformantes para as a produção de proteínas recombinante emmeio líquido, 100 ml de meio de cultura contendo 80 mM deNaNO3, 7 mM de KCl, 200 mM de Na2 HPO4, 2 mM de MgSO4,glicose a 6% (p/v) e microelementos foram inoculados por 1 χ 10^6esporos, ml"1 em um Erlenmeyer de fundo baffled. A. nigerBRFM131 (Banque de Ressources Fongiques de Marseille) foiusado para a extração do DNA genômico, sendo o DNAresultante usado como modelo para a estratégia de amplificaçãopor PCR da seqüência cbm do ligante.

Construção dos vetores de expressão etransformação fúngica

A fusão das seqüências que codificam paraFAEA (SEQ ID NO : 19 ; Y09330), XYNB (SEQ ID NO : 5 ;AY126481) e CBM (SEQ ID NO : 7 ; API56269) de A. niger foirealizada pelo método PCR de sobreposição-extensão (25). Aregião de codificação da FAEA de A. niger foi amplificada apartir do cDNA (41) usando o oligonucleotídeo iniciador (primer)direto 5 '-GGACTC ATGAAGC AATTCTCTGC A A A A T A C-3'(BspHi) e o oligonucleotídeo iniciador reverso 5'-ACTGGAGTAAGTCGAGCCCCAAGTACAAGCTCCGCT-3'A codificação do DNA genômico para a região do ligante deCBHB (SEQ ID NO : 9 ; AF156269) foi amplificada a partir deA. niger BRFM131 usando o oligonucleotídeo iniciador direto5AGCGGAGCTTGTACTTGGGGCTCGACTTACTCC AGT-3'e o oligonucleotídeo iniciador reverso 5'-GGTCGAGCTCGGGGTCGACGCCGCCGATGTCGAACT-3'.Finalmente, o gene xynB foi amplificado a partir do cDNA (29)com um oligonucleotídeo iniciador direto 5-AGTTCGACATCGGCGGCGTCGACCCCGAGCTCGACC -3'+e um oligonucleotídeo iniciador reverso 5-GGCrAAGCITTTAGTGGTGGGTGATGGACGAAG-3' (HindllI) (a marca His está empontilhado em todas as seqüências). Os fragmentos sobrepostosresultantes foram misturados, e uma seqüência fusionada foisintetizada em uma reação de etapa única usando ambos osoligonucleotídeos iniciadores externos. A construção foi clonadano vetor pGEM-T (Promega) e o produto clonado da PCR teve osequenciamento verificado. O fragmento fusionado foi clonadoem NcoI-HindIII linearizado e desfosforilado pAN52.3 para obtero plasmídeo pFLX (Fig. IA). O plasmídeo FLXLC foi construídousando pFLX como modelo para a amplificação do fragmento quecodifica para a seqüência XYNV do ligante FAEA recombinantecom o oligonucleotídeo iniciador direto 5-GGACTCATGAAGCAATTCTCTGCA A AATA C-T (BspHI) e ooligonucleotídeo iniciador reverso 5'-ACTGGAGTAAGTCGAGCCCTGAACAGTGATGGACGA-3'.O DNA genômico de A. niger BRFMl31 foi usado como modelopara a amplificação por PCR da seqüência da CBM do ligantecom dois oligonucleotídeos iniciadores específicos projetadoscom base na seqüência cbhB disponível (AF156269): umoligonucleotídeo iniciador direto 5!-TCGTCCATCACTGTTCAGGGCTCGACTTACTCCAGT-3' eum oligonucleotídeo iniciador reverso 5'-ATGCAAGÇITTTAGTGGTGGTGCT

GCGAGTAGTAC-3' CHindIIlλ 0 fragmento fusionado porsintetizado pelo método de PCR de sobreposição-extensão usandoambos os oligonucleotídeos iniciadores externos, controlado porsequenciamento, e clonado em pAN52.3 para obter o vetorpFLXLC (Fig. 1B). Em ambos os vetores de expressão, opromotor do gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gpdA)de A. nidulans, a região 5' não traduzida do mRNA de gpdA, e oterminador XrpC de A. nidulans, foram usados para conduzir aexpressão das seqüências recombinantes. Além disso, o peptídeode sinal (21 aminoácidos) da FAEA foi usado para direcionar asegregação de ambas as proteínas recombinantes.

Ambas as co-transformações fungicas foramrealizadas conforme descrito por Punt e van den Hondel (39)usando o pFLX ou os vetores de expressão pFLXLC,respectivamente, e pAB4-l (48), contendo o marcador de seleçãode pyrG, em uma razão de 10:1. Além disso, A. niger D15#26 foitransformado com o gene pyrG sem o vetor de expressão para oexperimento de controle. Co-transformantes foram selecionadospara fototrofia em uridina em placas de meio mínimo seletivo(sem uridina) e incubados durante 8 dias a 3 O0C. De modo aseparar os transformantes, quarenta clones individuais para cadaconstrução foram cultivados e verificados diariamente.

Separação das atividades da esterase e da

xilanaseAs culturas foram monitoradas durante 14 dias,a 30°C, em uma incubadora agitadora (130 r.p.m.). O pH foiajustado para 5,5 diariamente com uma solução de 1 M de ácidocítrico. Cada condição de cultura foi realizada em duplicata. Apartir do meio de cultura líquido, alíquotas (de 1 ml) foramcoletadas diariamente, removendo o micélio por filtração. Aatividade da esterase foi analisada, conforme descritoanteriormente, usando ferulato de metila (MFA) como o substrato(40), e a atividade da xinalase foi calculada medindo-se aquantidade de xilose liberada de xilana de birchwood a 1% (p/v)com base no método de Bailey et al. (1). As enzimas foramincubadas com uma solução de xilana [1% (p/v) de xilana debirchwood, 50 mM de tampão citrato de sódio pH 5,5] a 45°Cdurante 5 minutos. Os açúcares redutores liberados foramdeterminados pelo método DNS com xilose como padrão (35).Todos os ensaios foram realizados usando ensaios em branco paracorrigir quaisquer antecedentes nas amostras de enzima esubstrato.

As atividades foram expressas em nkatal (nkat),com 1 nkat sendo definido como a quantidade de enzima quecatalisa a liberação de 1 nMol de ácidos ferúlicos ou 1 nmol deaçúcares redutores por segundo sob condições estabelecidas. Cadaexperimento foi realizado em duplicada e as medições emtriplicata, e o desvio padrão foi menor do que 2% do meio para aatividade da esterase e menor do que 5% para a atividade daxilanase.Purificação das proteínas recombinantes

O melhor isolado para cada construção foiinoculado nas mesmas condições que o procedimento deseparação. A cultura foi coletada após 8 dias de crescimento,filtrada (0,7 μιη) e concentrada por ultrafiltração por meio de umamembrana de polietersulfona (corte de massa molecular de 30kDa) (Millipore). As frações concentradas foram dialisadas emum tampão de ligação de 30 mM de Tris-HCl, pH 7,0, e apurificação das proteínas marcadas com His foi realizada em umacoluna de Fluxo Rápido de Sefarose Quelante (13x15 cm)(Amersham Biosciences) (38). Com respeito ás proteínas livres, axilanase B recombinante, que contém uma seqüência de marcahis, também foi purificada na coluna de Fluxo Rápido de Sefarosequelante, como já foi descrito (29). Finalmente, a FAEArecombinante foi purificada em um procedimento de única etapausando uma coluna de fenil-sefarose, como já descrito (41).

Caracterização das proteínas recombinantes

Análise das proteínas e determinação daseqüência de aminoácidos N-terminal A concentração protéica foideterminada de acordo com Lowry et al. (34) com soroalbuminabovina como padrão. A produção e purificação das proteínasforam verificadas usando géis em placa SDS-PAGE (11%poliacrilamida) corados com azul Coomassie. As seqüências N-terminais foram determinadas de acordo com a degradação deEdman a partir de uma amostra FLX e FLXLC analisada por"electroblotting" (100 μg) em uma membrana de difluoreto depolivinilidina (Millipore). As análises foram realizadas em umApplied Biosystem 470A.

Análise Western blot. As proteínas totais epurificadas foram submetidas à eletroforese em gel depoliacrilamida SDS 11% de acordo com Laemmli (28) eanalisadas por "electroblotting" em membranas de nitroceluloseBA85 (Schleicher e Schuell) à temperatura ambiente durante 45minutos. As membranas foram incubadas em solução de bloqueio(50 mM de Tris, 150 mM de NaCl e 2% (v/v) de leite, pH 7,5) ànoite a 4°C. Em seguida, as membranas foram lavadas com TBS a0,2% Tween e tratadas com solução de bloqueio contendo soroanti-FAEA a uma diluição de 1/8000 ou contendo soro anti-poliistidina-peroxidase (Sigma). Para anticorpos anti-FAEA, asmembranas foram subseqüentemente incubadas com anti-imunoglobina G de coelho produzido em cabra, conjugado comraiz-forte peroxidase (Promega). Os sinais foram detectados como kit de Western blotting de quimiluminescência (Roche) deacordo com o procedimento do fabricante.

Temperatura e estabilidade do pH das proteínasrecombinantes. A termoestabilidade das proteínas recombinantespurificadas foi testada na faixa de 30 a 70°C. As alíquotas forampré-incubadas na temperatura designada, e, após resfriamento a0°C, as atividades da esterase e xilanase foram então analisadasconforme indicado anteriormente, em condições padrão. Asamostras foram analisadas por SDS-PAGE após a incubação como objetivo de verificar a integridade das proteínas bifuncionais. Oefeito do pH sobre a estabilidade protéica foi estudado pelaincubação das proteínas recombinantes purificadas em tampãocitrato-fosfato (pH 2,5 a 7,0) e fosfato de sódio (pH 7,0 a 8,0).Todas as incubações foram realizadas durante 90 minutos, e entãoas alíquotas foram transferidas em mistura de reaçãoconvencional para determinar a quantidade de atividade restante.A atividade determinada antes das pré-incubações foi observadaem 100%.

Efeito da temperatura e do pH sobre asatividades da esterase e da xilanase. Para determinar atemperatura ideal sob as condições usadas, alíquotas das proteínasrecombinantes purificadas foram incubadas a diversastemperaturas (30 a 70°C) e as atividades da esterase e da xilanaseforam analisadas. O pH ideal foi determinado usando tampãocitrato-fosfato (pH 2,5 a 7,0) e tampão fosfato de sódio (pH 7,0 a8,0) usando condições padrão.

Determinação da capacidade de ligação àcelulose e constantes de dissociação. Amostras da FLX e FLXLCpurificada foram adicionadas a tubos de microcentrífuga de 2 mlcontendo celulose em tampão fosfato de potássio de 25 mM (pH7) em um volume final de 1 ml. A capacidade da FLX (controle) eda FLXLC em ligar-se à celulose Avicel PH101 (Fluka) foideterminada usando várias quantidades de proteínasrecombinantes (entre 30 e 170 μg) e uma quantidade constante decelulose (2 mg). Ambas as proteínas recombinantes foramincubadas com celulose durante lha 4°C com agitação moderada.Após a centrifugação (4000 χ g durante 10 minutos), a quantidadede proteínas residuais no fluido sobrenadante (enzima livre) foideterminada. A quantidade de enzima ligada à celulose foicalculada subtraindo-se a quantidade de FLX livre, ou FLXLClivre, da quantidade total adicionada. Os dados foram analisadoscom o desenho de gráficos duplos recíprocos de 1/enzima ligadaversus 1/enzima livre. A constante de dissociação é definida comol/B=(Kd/Bmax χ l/F) + 1/Bmax, em que B é a concentração deenzimas ligadas e F é a concentração de enzimas livres (21,37).

Testes de aplicação

Hidrólise enzímica Farelo de trigo (WB) efarelo de milho (MB) foram desamidado. Esses substratos foramsubmetidos a tratamento térmico a 130°C durante 10 minutos. Ashidrólises enzímicas foram realizadas em tampão ácido 3-(N-morfolino)propanosulfônico (MOPS) a 0,1 M contendo 0,01% deazida de sódio a 0,01% ao pH de 6,0, em uma incubadora comagitação controlada termostaticamente a 40°C. O WB ou MB (200mg) foram incubados com a FAEA (SEQ ID NO : 2), XYNB(SEQ ID NO : 6), FAEA+XYNB, FLX e FLXLC purificadas,independentemente, em um volume final de 5 ml. Asconcentrações enzimáticas purificadas para enzimas livres ebifuncionais foram de: 11 nkatal de atividade da esterase e 6496nkatal de atividade da xilanase por 200 mg de farelo seco paracada ensaio. Essa razão corresponde à condição molar para molarencontrada na enzima bifuncional purificada. Cada ensaio foirealizado em duplicata, e o desvio padrão foi menor do que 5% damédia do valor para WB e MB.

Preparação do ácido hidroxicinâmico extraívelde ãlcali A concentração total de ácido hidroxicinâmico extraívelde álcali foi determinada pela adição de 20 mg de WB ou MB em2 N de NaOH e incubada durante 30 minutos a 35 0C emescuridão. O pH foi ajustado para 2 com 2N de HCL Os ácidosfenólicos foram extraídos três vezes com 3 ml de éter. A faseorgânica foi transferida para um tubo de teste e seca a 40°C. Ummililitro de metanol/H20 (50:50) (v/v) foi adicionado ao extratoseco e as amostras foram injetadas em um sistema HPLC,conforme descrito na próxima seção. A concentração total deácido ferúlico extraível de álcali foi considerada como 100% paraa hidrólise enzímica.

Determinação do ácido ferúlico Os hidrolisatosenzimáticos foram diluídos a !/2 com metanol a 100%,centrifugado a 12.000 χ g durante 5 minutos, e os sobrenadantesforam filtrados por meio de um filtro de náilon de 0,2 μπι(Gelman Sciences, Acrodisc 13, Ann Arbor, MI). Os líquidosfiltrados foram analisados por HPLC (25 μΐ, injetados). Asanálises HPLC foram efetuadas a 280 nm e 30°C em um, modeloHPllOO (Hewlett-Packard Rockville, MD) equipado com umdetector UV/VIS variável, um autoamostrador-autoinjetor de 100posições. As separações foram obtidas em uma coluna de faseinvertida Merck RP-18 (Chromolith 3,5 μιη, 4,6x100 mm,Merck). A taxa de fluxo foi de 1,4 ml/minuto. A fase móvel usadafoi 1% de ácido acético e 10% de acetonitrilo em água (A) versusacetonitrilo a 100% (B) durante um tempo de execução total de 20minutos, e o gradiente se alterou como segue: o solvente Bcomeçou em 0% durante 2 minutos, aumentando então para 50%em 10 minutos, para 100% em 3 minutos até o final da execução.Os dados foram processados por um HP 3365 ChemStation e aquantificação foi realizada por calibração externa padrão.

Resultados

Projeto e estudo da produção das enzimasbifuncionais

As seqüências de A. Niger que codificam aferuloil esterase A (FAEA) e a xilanase B (XYNB) foramfusionadas geneticamente pela adição, entre as duas parceiras, deuma seqüência do gene celobiohidrolase B (cbhB) que codificapara um ligante hiperglicosilado (Fig. IA). Para o FLXLC dasegunda construção, a FLX de fusão correspondente foi fusionadaa uma seqüência parcial do gene cbhB de A. niger que codificapara o ligante-CBM (Fig. 1B). Ambas as fusões traducionaisforam colocadas sob controle do promotor gpdA forte econstitutivo e do terminador trpC com seqüência de sinais faeAendógena para direcionar a segregação, protoplastos de A. NigerD15#26 foram co-transformados com uma mistura do vetor deexpressão pFLX ou pFLXLC e do plasmídeo pAB4-l contendo ogene pyrG. Os transformantes foram selecionados por suacapacidade de crescer em uma placa de meio mínimo sem uridina.Quarenta transformantes para cada construção foram inoculadosem um meio mínimo de glicose, reprimindo a expressão gênica dogene faeA e xynB endógeno. Para o hospedeiro de controletransformado com pAB4-l, não foi detectada nenhuma atividadeda esterase ou xilanase. Para ambas as construções, as atividadesda estearase e xilanase foram detectadas no meio extracelular dostransformantes após 2 dias de crescimento (Fig. 2). As atividadesda feruloil esterase e xilanase foram detectadas como uma formasincrônica durante a cultura. As atividades aumentam até o IO0 e11° dia para o melhor transformante de FLXLC e FLX,respectivamente, até atingir um nível que é mais ou menos estávelaté o 14° dia. A atividade máxima da esterase atingiu 13,0 nkat/mlpara FLX e 9,8 nkat/ml para o transformante FLXLC. Comrespeito à atividade da xilanase, o máximo de 2870 nkat/ml paraFLX e 2038 nkat/ml para o transformante FLXLC foram obtidos.Considerando a atividade específica do parceiro FAEA emenzimas bifuncionais, os rendimentos de produção foramestimados em 1,4 g/L e 1,5 g/L para os transformantes FLX eFLXLC, respectivamente.

Caracterização bioquímica e cinética dasenzimas bifuncionais

SDS-PAGE e análise Western blot Em ambos oscasos, as proteínas produzidas foram verificadas por eletroforeseem um gel de SDS/poliacrilamida (Fig. 3, pistas 1 e 3). As bandaspredominantes em torno de 72 kDa e 97 kDa foram observadasnas proteínas extracelulares totais dos transformantes FLX eFLXLC, respectivamente. A diferença entre as massasmoleculares teórica e observada para FLX e FLXLC indicou umaglicosilação em torno de 12% (p/p) e 26% (p/p), respectivamente.As enzimas recombinantes foram purificadas em uma coluna deFluxo Rápido de Sefarose Quelante e a homogeneidade dasfrações foi controlada por SDS-PAGE (pistas 2 e 4).

Ambas as enzimas quiméricas dossobrenadantes das proteínas totais e das frações purificadas foramimunodetectados usando anticorpos contra FAEA (Fig. 4A). Umaúnica banda foi revelada dos extratos totais de proteínas (pistas 1,3) e das amostras purificadas (pistas 2, 4) para os transformantesFLX e FLXLC, respectivamente. Os anticorpos contra a marca dehistidina C-terminal também foram usados para imunodetecção demodo a controlar a integridade das proteínas recombinantes, umavez que os anticorpos contra a xilanase ou CBM não estavamdisponíveis (Fig. 4B). Uma única banda foi detectada para FLX eFLXLC, confirmando que as enzimas bifuncionais foramproduzidas como proteínas intactas sem nenhuma forma dedegradação (pistas 5 a 8). O controle negativo (C) confirmou queambos os anticorpos eram específicos a epítopos e que a FAEAendógena não foi produzida nessas condições de cultura.

Sequenciamento N-terminal Os primeiros cincoaminoácidos de FLX e FLXLC foram seqüenciados (ASTQG) ealinhados com a FAEA nativa. Alinhamentos revelam 100% deidentidade entre proteínas recombinantes e a FAEA nativa. Essesresultados confirmaram que a FLX e a FLXLC foram processadascorretamente.Análise da afinidade por celulose e capacidadede ligação das enzimas bifuncionais. Ao contrário da FLX, aFLXLC contém a extremidade C-terminal, a CBM de A. nigercelobiohidrolase B. Ensaios de interação da FLXLC com celuloseforam realizadas a fim de determinar os parâmetros de ligação daCBM. A afinidade de ligação à celulose e a capacidade de ligaçãoda FLXLC foram determinadas para a celulose microcristalina,Avicel PHl01. os valores medidos foram de 9,9 10"8 M e 0,98μmol/g Avicel para a constante de dissociação (Kd) e a capacidadede ligação, respectivamente. Como esperado, não foi encontradanenhuma interação para a enzima quimérica FLX (sem CBM).

Parâmetros bioquímicos e cinéticos. A fim de controlar se a fusão de ambos os parceiros enzimáticos com ousem CBM possui características modificadas de cada enzima, osparâmetros bioquímicos e cinéticos de FLX e FLXLC foramcomparados com a FAEA e XYNB recombinante livre de acordocom as atividades da esterase e da xilanase (Tabela 1). Comrespeito o pH ideal e a estabilidade, não foi encontrada nenhumadiferença significativa entre ambas as enzimas bifuncionais e aFAEA ou XYNB livre. Para a temperatura ideal e estabilidade, aúnica distinção diz respeito a um ligeiro desvio medido para asatividades da xilanase. Além disso, a integridade da FLX e daFLXLC foi controlada por SDS-PAGE após a incubação, emdiferentes temperaturas, e ambas as enzimas bifuncionais ficaramtotalmente estáveis até 45°C e foram parcialmente clivadas a50°C. Os primeiros aminoácidos da forma clivada foramseqüenciados e identificados como GSGSS. O alinhamento dessaseqüência com FLX e FLXLC revela 100% de identidade comuma seqüência encontrada no ligante. Esses resultados mostraramque o ligante hiperglicosilado é estável até 45°C e uma clivagemaparece em 50°C antes da seqüência GSGSS. A proteína FLXLCquimérica, contendo duas seqüências de ligantes, foi clivadaapenas no ligante C-terminal (entre XYNB e CBM). O sítio declivagem potencial para proteases foi verificado nas seqüências deaminoácidos de ambas as proteínas híbridas usando uminstrumento de corte de peptídeo (19) e nenhum sítio de clivagemfoi encontrado nas adjacências de GSGSS.

Com respeito às propriedades cinéticas, asconstantes de Michaelis para FLX e FLXLC foram medidas apartir de um gráfico de Linewaver-Burk usando MFA e xilana debirchwood como substratos. Os valores encontrados para FLX eFLXLC estavam de acordo com os encontrados para a FAEA eXYNB recombinante livre (Tabela 1). As atividades específicasdas enzimas bifuncionais foram determinadas com base nasatividades da feruloil esterase e da xilanase e comparadas com aFAEA e XYNB livre (Tabela 1). Os valores encontrados para asenzimas bifuncionais estavam próximos aos encontrados para aFAE e a XYNB livre.

Em conclusão, esses resultados confirmaramque os parâmetros bioquímicos e cinéticos para os módulosenzimáticos fusionados (FAEA e XYNB) foram em sua maioriaconservados nos complexos bifuncionais FLX e FLXLC.Liberação enzimática do ácido ferúlico defarelo de trigo e milho

Com o objetivo de estudar o efeito sinérgicogerado pela proximidade física de duas enzimas nas proteínasbiíuncionais e a influência da adição de CBM, FLX e FLXLCforam comparadas com as enzimas livres FAEA e XYNB emrelação à eficiência de liberação de AF. Todas as enzimas forampurificadas à homogeneidade e incubadas com WB e MB porcausa de sua concentração naturalmente alta de FA contida naparede celular. Usando a FAEA livre, 41% e 51% do total de FAextraível de álcali da WB foram liberados após 4 e 16 h,respectivamente (Fig. 5A). Essas porcentagens foram aumentadasligeiramente para 51% (4h) e 54% (16h) com a adição da XYNBlivre. Considerando o efeito de FLX ou FLXLC, observamos umaliberação total de FA somente após 4h da incubação. Com o MBcomo o substrato (Fig. 5B), a FAEA livre liberou 4,2%, 4,8% deFA após 4h e 16h, respectivamente, e a adição de XYNB nãoaumentou essa porcentagem. Entretanto, FLX e FLXLC foramcapazes de liberar 6,2% e 7,2% após 4h de hidrólise,respectivamente. Se o tratamento enzimático fosse durante a noitepor 16 horas, as liberações teriam aumentado para 6,3% e 7,9%,respectivamente, para FLX e FLXLC. Os fatores de sinergiaforam determinados e comparados entre as enzimas livres(FAEA+XYNB) e fusionadas (FLX e FLXLC). Conformecalculado na tabela 2, a razão calculada foi maior do que 1,demonstrando, para ambos os substratos, que o efeito sinérgico émelhor para as enzimas biíuncionais do que para as enzimaslivres correspondentes. Com respeito à liberação de FA do MB, asinergia é maior para FLXLC (1,80 e 1,62) do que para FLX (1,53e 1,30) após 4h e 16h, respectivamente. Como conclusão, essesresultados demonstraram que, para ambos os substratos, asenzimas biíuncionais FLX e FLXLC foram mais eficientes para aliberação de FA se comparado às enzimas livres correspondentes(FAEA+XYNB). Além do mais, esses resultados parecemmostrar que a FLXLC é mais adaptada à liberação de FA usandoMB como o substrato, o que indica um efeito positivo gerado pelaCBM.

Conclusão

E necessária uma grande variedade de enzimaspara a biodegradação da parede celular de plantas devido a suaheterogeneidade na composição e estrutura. Algumascombinações entre diferentes enzimas hidrolíticas suplementaresde cadeia principal demonstraram importante efeito sinérgico,levando a uma degradação eficiente da parede celular (9, 12).Neste estudo, duas enzimas de degradação de parede celularvegetal e um módulo de ligação a carboidratos de A. niger foramfiisionados para estudar o efeito sinérgico sobre a degradação dossubstratos naturais. A construção de tais proteínas híbridas é umaspecto original da engenharia de proteínas, abrindo uma extensagama de aplicações em potencial. Aqui, o conceito subsiste norecrutamento de duas unidades funcionais para criar proteínasbiíuncionais aperfeiçoadas (3, 36). Tais organizaçõesmultimodulares são normalmente encontradas na natureza,levando à produção enzimática com mais de uma atividadeenzimática ou função protéica. Na área biotecnológica, algumasproteínas bifuncionais já foram investigadas, inclusive, porexemplo, um híbrido de α-amilase e glicoamilase (44). Osresultados desse estudo demonstraram um aumento da eficiênciada enzima, se comparado às enzimas livres para a digestão deamido bruto. Em outro trabalho, uma xilanase/endoglicanasequimérica (XynCenA) com uma CBM interna foi construída, masos resultados mostraram que a enzima híbrida não afetou demaneira significativa a hidrólise em xilanas homogêneas ousubstratos celulósicos, se comparado à enzima livre, entretanto,nenhum teste de aplicação foi investigado no substrato natural(46).

A fim de avaliar o efeito gerado pelaproximidade física de duas hidrolases de parede celular, a FAEAfoi fusionada à XYNB (FLX de construção). Uma BM fungica daCBHB de A. niger foi fusionada, na extremidade C-terminal nasegunda construção (FLXLC) para direcionar a enzimabifuncional na celulose. Para ambas as construções, um peptídeode ligação hiperglicosilado foi fusionado entre cada módulo(FAEA, XYNB ou CBM) por três razões principais. Em primeirolugar, o ligante é conhecido por reter a capacidade dos módulosem se dobrarem independentemente e conservarem uma liberdadeconformacional em relação um ao outro (36). No presente caso,tanto a feruloil esterase como xilanase foram capazes de adotaressa conformação, e as proteínas bifuncionais criadas porengenharia genética estavam ativas com propriedadesbioquímicas e cinéticas correspondendo a enzimas livres. Emsegundo lugar, o alto nível de glicosilação do ligante permiteaumentar a estabilidade da seqüência de proteínas pois protege oligante contra as atividades da protease, e, finalmente, evitando ofreqüente problema de clivagem entre os módulos fusionados (8,36). Esse efeito foi observado, pois ambas as enzimasbifuncionais eram estáveis, conforme ilustrado por SDS-PAGE epela análise Western blot. Entretanto, a estabilidade das enzimashíbridas demonstrou ter alguns limites com tratamento térmico.De fato, a influência do tratamento térmico sobre a integridade daFLX e FLXLC mostrou que elas permaneceram estáveis até 45°Ce depois clivaram na seqüência de ligante a 5 O0C. Por último, oligante hiperglicosilado poderia ter um papel positivo nasegregação, aumentando o rendimento da produção conformedemonstrado para o ligante hiperglicosilado da glicoamilase de A.niger (32). De fato, os sítios de glicosilação, devido à presença deum ou dois ligantes para FLX e FLXLC, respectivamente,poderiam, estender a retenção das proteínas recombinantes noretículo endoplasmático, fornecendo assim tempo adicional paracorrigir o enovelamento e resultando em um aumento de produção(42). Essa última hipótese poderia explicar porque os rendimentosde produção para ambas as enzimas bifuncionais foram maioresdo que os obtidos para as enzimas recombinantes livrescorrespondentes (29, 41).A fim de estudar o efeito sinérgico gerado pelaproximidade de ambos os módulos enzimáticos, e não um ganhodevido à modificação das propriedades enzimáticas comoresultado da mudança da conformação protéica durante oenovelamento, as características bioquímicas e cinéticas de cadamódulo foram controladas com cuidado. Todas as propriedadesbioquímicas e cinéticas de ambas as proteínas bifuncionais FLX eFLXLC, isto é, temperatura e estabilidades de pH, temperatura epH ideais, Km e atividades específicas, estavam na mesma faixa secomparado às enzimas livres. Com respeito à CBM originada daCBHB de A. niger, ensaios de ligação foram realizados emcelulose, uma vez que a última não foi caracterizada no passado(20). A celulose Avicel tem um importante grau de polimerizaçãode 100-250 unidades de glicopiranose e 50-60% de formacristalina com uma fase cristalina composta essencialmente dotipo lp, característico de plantas superiores (49). Os resultadosmostraram que a FLXLC possui afinidade por Avicel,confirmando que a estrutura da CBM não é perturbada e que aCBM conservou sua função na enzima híbrida.

Ambas as proteínas bifuncionais, FLX eFLXLC, foram finalmente testadas para estudar o efeito daproximidade física de duas enzimas fungicas complementaressobre a sinergia enzimática e a influência da adição de CBM. Oteste de aplicação foi baseado na liberação de FA de doissubstratos, um natural e outro de modelo, WB e MB, conhecidospela alta concentração de FA na parede celular da planta, deaproximadamente 1% e 3% (p/p), respectivamente (43). Ambosos substratos são gerados pela agricultura, e poderiam servalorizados nos setores farmacêutico, cosmético e agroalimentício(4, 26). As enzimas livres foram capazes de liberar 54% e 4,8%do teor de FA de WB e MB, respectivamente. Em contrapartida,as enzimas bifuncionais liberaram de forma eficaz a totalidade deFA de WB e até 6,3% ou 7,9% de MB, dependendo da presençaou ausência da CBM. Até o momento, os resultados anterioresencontrados para a liberação de FA a partir de WB foram obtidoscom uma xilanase de Trichoderma viride e a FAEA de A. niger,em que o valor máximo de 95% (p/p) de ácido ferúlico total foiliberado (15). Com respeito ao MB, uma quantidade importantede FA foi liberada (até 13,6%) com o uso da preparaçãocomercial Novozym 342 de Humicola insolens (5). Entretanto,deveríamos considerar que essa preparação comercial continhadiferentes tipos de atividades enzimáticas. No presente ensaio, atotalidade de FA do WB foi liberada pelo tratamento de enzimasbifuncionais, ao passo que menos de 8% foi obtido com MB.embora o teor de ácido ferúlico no farelo de milho seja maior doque o encontrado no farelo de trigo, a xilana do farelo de milho émais substituída por resíduos de xilose, arabinose e galactose (7,15). Assim, essa diferença poderia ser explicada pelo número desubstituições na estrutura do heteroxilano no milho, pela presençade xilose altamente ramificada na cadeia lateral e pela presença deuma ligação entre a arabinose e a xilose na proximidade do grupoFA, o que restringe seriamente a acessibilidade enzimática.Finalmente, se considerássemos a hidrólise do MB por FLXLX, aCBM apresentaria um efeito positivo sobre a liberação de FA,provavelmente (i) por causa do direcionamento de celulose queaumenta a concentração enzimática próxima ao substrato e/ou (ii)da desestabilização da estrutura de celulose, tornando o substratomais acessível. Como conclusão dos testes de aplicação, ao usarFLX ou FLXLC, obteve-se melhor efeito sinérgico em ambos ossubstratos para a liberação de FA, se comparado às enzimas livresFAEA e XYNB. Acredita-se que a melhoria geral na sinergia sedeva à proximidade física de cada parceiro enzimático nasenzimas bifuncionais, uma vez que todas as propriedadesbioquímicas e cinéticas principais não foram alteradas para cadaparceiro em proteínas híbridas. No caso do FLXLC, a sinergia foiinfluenciada positivamente pela adição de CBM C-terminal. Alémdisso, poder-se-ia propor ainda que a orientação espacial dossítios ativos não seja perturbado entre os módulos fusionados.

Como conclusão geral, a construção de novosinstrumentos enzimáticos para a degradação da parede celular deplantas, associando hidrolases de parede celular complementares,tal como uma enzima suplementar (FAEA) e uma enzima declivagem de cadeia principal (XYNB), demonstrou ser umaestratégia de interesse para aumentar o efeito sinérgico dosparceiros enzimáticos. Para aplicações biotecnológicas, autilização de tais proteínas híbridas é uma alternativa aostratamentos químicos caros e poluentes ou para aperfeiçoar osprocessos enzimáticos já existentes para a valorização dossubprodutos vegetais nos setores de produção de biocombustível,polpa e papel e agroindústrias.

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Figuras

A Fig. 1 ilustra os cassetes de expressão usadosneste estudo. De modo a projetar o inserto FLX (A), as seqüênciasde A. niger que codificam para FAEA, uma região ligante daCBHB e da XYNB foram fusionadas juntas. Na segundaconstrução (Β), o modelo FLX foi fusionado à seqüência cbhbque codifica a seqüência ligante e a CBM gerando o insertoFLXLC. Os cassetes de expressão estão sob controle do promotorgpda e do terminador trpC. Ambas as construções continham umaseqüência de codificação de seis histidinas na extremidade 3'.

(1) Seqüência de codificação do ligante:

GSTYSSGSSSGSGSSSSSSSTTTKATSTTLKTTSTTSSGSSSTSAA.

A Fig. 2 ilustra atividades no curso do tempo daferuloil esterase e xilanase extracelular em nas atividades daFeruloil esterase (A) e xilanase (B) de A. niger foram medidaspara o melhor transformante FLX (♦) e FLXLC ( ■ ). Asatividades foram determinadas usando MFA e xilana debirchwood como substratos para as atividades da esterase esinalanase, respectivamente.

A Fig. 3 ilustra o SDS-PAGE das proteínasextracelulares produzidas pelos transformantes FLX e FLXLC.

As proteínas totais e purificadas da FLX (pistas1 e 2, respectivamente) e da FLXLC (pistas 3 e 4,respectivamente) foram carregadas em um SDS-PAGE (11% depoliacrilamida). O Gel foi corado com azul Coomassie. SD:padrões de massa molecular.

A Fig. 4 ilustra análise Western blot dasproteínas totais e purificadas produzidas pelos transformantesFLX e FLXLC. Os anticorpos contra FAEA (A) ou a marca His(B) foram usados para imunodetecção das proteínas totaisextracelulares e purificadas dos transformantes FLX e FLXLC.Pistas 1, 5: proteínas extracelulares totais do transformante FLX.Pistas 2, 6: FLX purificado. Pistas 3, 7: proteínas extracelularestotais do transformante FLXLC. Pistas 4, 8: FLXLC purificada.C: linhagem de controle D15#26 transformada com pAB4-l. Adetecção foi realizada por quimiluminescência.

Fig. 5. Comparação da eficiência de liberaçãodo ácido ferúlico pela ação de enzimas livres ou bifuncionais. Foiutilizado farelo de trigo (A) e farelo de milho (B) para a hidrólisedo AF pelas enzimas livres ou bifuncionais. A liberação do FA foideterminada por HPLC após 4 horas (barras brancas) e 16 horas(barras pretas). As atividades foram expressas como aporcentagem da quantidade total de FA presente no substrato. Odesvio padrão foi de menos que 5% da média do valor para WB eMB.

Tabela. 1. Parâmetros psico-químicos ecinéticos para os parceiros de feruloil esterase e xilanase.

Atividade da feruloil Atividade da xilanaseesterase

<table>table see original document page 56</column></row><table> (1); (2) (Referências 41 e 29, respectivamente).

(3) Km foram expressos em molar para aatividade da feruloil esterase e em miligrama por mililitro para aatividade da xilanase.

(4) As atividades específicas foram expressasem nkatal por nmole de proteína, de modo a facilitar acomparação entre as proteínas livres e bifuncionais.

Para as estabilidades de pH e temperatura, asincubações foram realizadas durante 90 minutos.

Tabela 2. Comparação do efeito sinérgico sobrea liberação do ácido ferúlico entre enzimas livres e fusionadas.

<table>table see original document page 56</column></row><table>O fator de sinergia é definido como: (AFliberado pelas enzimas bifuncionais FLX ou FLXLC) / (AFliberado pelas enzimas livres FAEA + XYNB).

Claims (25)

1. - Uso de proteínas de fusão entre pelo menosduas enzimas de degradação de parede celular de plantas,caracterizado pelo fato de que as referidas enzimas são de talforma que elas não contêm uma molécula de ligação acarboidratos C-terminal (CBM), e opcionalmente uma CBM, asreferidas enzimas e a CBM sendo proteínas recombinantescorrespondendo a proteínas nativas em fungos, ou suas formasmutadas, para realizar processos de degradação de parede celularde plantas no âmbito da preparação, a partir de plantas ousubprodutos vegetais, de compostos de interesse localizados naparede celular de plantas, ou no âmbito do branqueamento dapolpa e do papel.

2. - Uso, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as enzimas de degradação deparede celular de plantas que não contêm um CBM são escolhidasentre enzimas capazes hidrolisar a celulose, a hemicelulose edegradar a lignina.

3. - Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que as enzimas de degradação deparede celular de plantas que não contêm um CBM são hidrolasesescolhidas entre:- celulases, como endoglicanases, exoglicanasese celobiohidrolases, ou β-glicosidases,- hemicelulases, como xinalanases,- Iignases capazes de degradar ligninas, comolacases, manganês peroxidase, lignina peroxidase, peroxidaseversátil, ou enzimas suplementares como celobiose desidrogenasee álcool arílico oxidases, - cinamoil éster hidrolases capazes de liberarácidos cinâmicos, como ácido ferúlico, e de hidrolisar ligaçõescruzadas de ácido diferúlico entre cadeias de hemicelulose, taiscomo feruloil esterases, cinamoil esterases e ácido clorogênicohidrolases.

4. - Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 3,caracterizado pelo fato de que as enzimas de degradação deparede celular de plantas que não contêm um CBM são escolhidasentre feruloil esterases e xilanases.

5. - Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as enzimas dedegradação de parede celular de plantas que não contêm umaCBM correspondem a enzimas nativas, ou a suas formas mutadas,de fungos selecionados entre:* ascomicetes, tal como: - linhagens de Aspergillus, e maisparticularmente, Aspergillus niger,linhagens de Trichoderma, e maisparticularmente, Trichoderma reesei,* basidiomicetes, como linhagens de Pycnoporus ou Haloeiphina, e mais particularmente, Pycnoporuseinnabarinus, Pycnoporus sanguineus ou Haloeyphina villosa.

6. - Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as enzimas dedegradação de parede celular de plantas que não contêm umaCBM correspondem a enzimas nativas, ou a suas formas mutadas,de linhagens de Aspergillus, tal como Aspergillus niger.

7. - Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que pelo menosuma das enzimas de degradação de parede celular de plantas éuma feruloil esterase escolhida entre:- a feruloil esterase A de A. niger, representadapelo SEQ ID NO : 2,- ou a feruloil esterase B de A. niger,representada pelo SEQ ID NO : 4.

8. - Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que pelo menosuma das enzimas de degradação de parede celular de plantas éuma xilanase, tal como a xilanase B de A. niger, representada peloSEQ ID NO : 6.

9. - Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a proteínasendo uma CBM é selecionada entre a CBM presente nas enzimasnativas, ou suas formas mutadas, de fungos selecionados entreascomicetes, tal como linhagens de Aspergillus, e maisparticularmente, Aspergillus niger.

10. - Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a CBM é aCBM presente na celobiohidrolase B de A. niger, e representadapelo SEQ ID NO : 8.

11. - Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 10, de proteínas de fusão, caracterizado porcompreender ligantes entre pelo menos duas das proteínascompreendidas nas referidas proteínas de fusão, os referidosligantes sendo polipeptídeos de 10 a 100 aminoácidos, depreferência de cerca de 50 aminoácidos.

12. - Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 11, de proteínas de fusão, caracterizado pelofato de que um ligante é incluído entre cada proteínacompreendida nas referidas proteínas de fusão.

13. - Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o ligante éum polipeptídeo hiperglicosilado, tal como a seqüênciarepresentada pelo SEQ ID NO : 10, presente na celobiohidrolaseB de A. niger.

14. - Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 13, de proteínas de fusão entre uma feruloilesterase e uma xilanase, e opcionalmente uma CBM, tal como:- as proteínas de fusão entre a feruloil esterase Ade A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 2, ou a feruloilesterase B de A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 4, e axilanase B de A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 6,- a proteína de fusão entre a feruloil esterase Ade A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 2, e a xilanase B deA. niger, representada pelo SEQ ID N°: 6, a referida proteína defusão compreendendo a seqüência representada pelo SEQ ID NO: 10 como um ligante hiperglicosilado entre as duas proteínasanteriores, e sendo representado pelo SEQ ID NO : 12,- as proteínas de fusão entre a feruloil esterase Ade A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 2, da xilanase B de A.niger, representada pelo SEQ ID NO : 6, e a CBM representadapelo SEQ ID NO : 8, presente na celobiohidrolase B de A. niger,- a proteína de fusão entre a feruloil esterase Ade A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 2, a xilanase B de A.niger, representada pelo SEQ ID NO : 6, e a CBM representadapelo SEQ ID NO : 8, a referida proteína de fusão compreendendoa seqüência representada pelo SEQ ID NO : 10 como um ligantehiperglicosilado entre cada uma das três proteínas anteriores, esendo representado pelo SEQ ID NO : 14,- a proteína de fusão entre a feruloil esterase Bde A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 4, e a xilanase B deA. niger, representada pelo SEQ ID N°: 6, a referida proteína defusão compreendendo a seqüência representada pelo SEQ ID NO: 10 como um ligante hiperglicosilado entre as duas proteínasanteriores, e sendo representado pelo SEQ ID NO : 16,- as proteínas de fusão entre a feruloil esterase Bde A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 4, da xilanase B de A.niger, representada pelo SEQ ID NO : 6, e a CBM representadapelo SEQ ID NO : 8, presente na celobiohidrolase B de A. niger,- a proteína de fusão entre a feruloil esterase Bde A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 4, a xilanase B de A.niger, representada pelo SEQ ID NO : 6, e a CBM representadapelo SEQ ID NO : 8, a referida proteína de fusão compreendendoa seqüência representada pelo SEQ ID NO :10 como um ligantehiperglicosilado entre cada uma das três proteínas anteriores, esendo representado pelo SEQ ID NO : 18.

15. - Uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 14, caracterizado por ser para realizarprocessos de degradação de parede celular de plantas no âmbitoda preparação dos seguintes compostos de interesse:- bioetanol,- antioxidantes, como ácido ferúlico ou ácidocaféico, que são ácidos cinâmicos, e hidroxitirosol, ou ácidogálico,aromas, como vanilina ou p-hidroxibenzaldeído, obtidos da biotransformação do ácidoferúlico ou do ácido /?-coumárico, respectivamente,ou no âmbito do branqueamento da polpa e do papel.

16. - Processo de degradação de parede celularde plantas no âmbito da preparação, a partir de plantas ousubprodutos vegetais, de compostos de interesse localizados naparede celular de plantas, caracterizado por compreender asseguintes etapas:- o tratamento enzimático de plantas ousubprodutos vegetais ou resíduos industriais, com proteínas defusão conforme definidas acima, ou com células fungicastransformadas conforme definido acima,- opcionalmente, o tratamento físico de plantasou subprodutos vegetais por explosão a vapor em combinaçãocom a ação de proteínas de fusão,- opcionalmente, a biotransformação, commicroorganismos ou enzimas apropriadas, dos compostosliberados pelas paredes celulares durante o tratamento enzimáticoacima, a recuperação, e, se necessária, a purificação do compostode interesse liberado pelas paredes celulares durante o tratamentoenzimático acima ou obtido durante a etapa de biotransformaçãoacima.

17. - Processo, de acordo com a reivindicação-16, caracterizado por ser para a preparação de antioxidantes, talcomo ácido ferúlico, ou ácido caféico, que são ácidos cinâmicos ehidroxitirosol ou ácido gálico, aromas, como vanilina ou p-hidroxibenzaldeído, obtidos pela biotransformação do ácidoferúlico ou p-coumárico, respectivamente, bioetanol, ou para obranqueamento da polpa e do papel.

18. - Proteínas de fusão entre pelo menos duasenzimas de degradação de parede celular de plantas,caracterizadas por não conter uma molécula de ligação acarboidratos C-terminal (CBM), e opcionalmente uma CBM, asreferidas enzimas e a CBM sendo proteínas recombinantescorrespondendo a proteínas nativas em fungos, ou suas formasmutadas.

19. - Proteínas de fusão, de acordo com areivindicação 18, caracterizadas pelo fato de que:- as enzimas de degradação de parede celular deplantas que não contêm uma CBM são conforme definido emqualquer uma das reivindicações 2 a 8,- a CBM é conforme definido nas reivindicações 9 ou 10.

20. - Proteínas de fusão, de acordo com areivindicação 18 ou 19, caracterizadas por compreender ligantesentre pelo menos duas das proteínas compreendidas nas referidasproteínas de fusão, os referidos ligantes sendo conforme definidosem qualquer uma das reivindicações 11 a 13.

21. - Proteínas de fusão, de acordo comqualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizadas porserem entre uma feruloil esterase e uma xilanase, e,opcionalmente, uma CBM, tal como:- as proteínas de fusão entre a feruloil esterase Ade A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 2, ou a feruloilesterase B de A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 4, e axilanase B de A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 6,- a proteína de fusão entre a feruloil esterase Ade A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 2, e a xilanase B deA. niger, representada pelo SEQ ID NO : 6, a referida proteína defusão compreendendo a seqüência representada pelo SEQ ID NO: 10 como um ligante hiperglicosilado entre as duas proteínasanteriores, e sendo representado pelo SEQ ID NO : 12,- as proteínas de fusão entre a feruloil esterase Ade A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 2, a xilanase B de A.niger, representada pelo SEQ ID NO : 6, e a CBM representadapelo SEQ ID NO : 8, presente na celobiohidrolase B de A. niger,- as proteínas de fusão entre a feruloil esterase Ade A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 2, a xilanase B de A.niger, representada pelo SEQ ID NO : 6, e a CBM representadapelo SEQ ID NO : 8, a referida proteína de fusão compreendendoa seqüência representada pelo SEQ ID NO : 10 como um ligantehiperglicosilado entre cada uma das três proteínas anteriores, esendo representado pelo SEQ ID NO : 14,- as proteína de fusão entre a feruloil esterase Bde A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 4, e a xilanase B deA. niger, representada pelo SEQ ID N°: 6, a referida proteína defusão compreendendo a seqüência representada pelo SEQ ID NO: 10 como um ligante hiperglicosilado entre as duas proteínasanteriores, e sendo representado pelo SEQ ID NO : 16,- a proteína de fusão entre a feruloil esterase Bde A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 4, da xilanase B de A.niger, representada pelo SEQ ID NO : 6, e a CBM representadapelo SEQ ID NO : 8, presente na celobiohidrolase B de A. niger,- a proteína de fusão entre a feruloil esterase Bde A. niger, representada pelo SEQ ID NO : 4, a xilanase B de A.niger, representada pelo SEQ ID NO : 6, e a CBM representadapelo SEQ ID NO : 8, a referida proteína de fusão compreendendoa seqüência representada pelo SEQ ID NO : 10 como um ligantehiperglicosilado entre cada uma das três proteínas anteriores, esendo representado pelo SEQ ID NO : 18.

22. - Ácidos nucléicos, caracterizados porcodificarem uma proteína de fusão, conforme definido emqualquer uma das reivindicações 18 a 21.

23. - Vetores, caracterizados por seremtransformados com um ácido nucléico conforme definido nareivindicação 22.

24. - Células hospedeiras, caracterizadas porserem transformadas com um ácido nucléico conforme definidona reivindicação 22, usando um vetor conforme definido nareivindicação 23.

25. - Processo para a preparação de proteínas defusão, de acordo com a reivindicação 18 a 21, caracterizado porcompreender a cultura in vitro de células hospedeiras de acordocom a reivindicação 24, a recuperação, e, se necessária, apurificação das proteínas de fusão produzidas pelas referidascélulas hospedeiras na cultura.