BRPI0614990A2

BRPI0614990A2 - células hospedeiras geneticamente modificadas e uso das mesmas para produção de compostos isoprenóides

Info

Publication number: BRPI0614990A2
Application number: BRPI0614990-1A
Authority: BR
Inventors: Yoichiro Shiba; James Kirby; Eric M Paradise; Jay D Keasling
Original assignee: Univ California
Priority date: 2005-08-19
Filing date: 2006-08-17
Publication date: 2011-04-26
Also published as: US20090053797A1; WO2007024718A2; WO2007024718A3

Abstract

CéLULAS HOSPEDEIRAS GENETICAMENTE MODIFICADAS E USO DAS MESMAS PARA PRODUçãO DE COMPOSTOS ISOPRENOIDES A presente invenção refere-se a células hospedeiras eucarióticas geneticamente modificadas exibindo níveis de atividade aumentados deuma ou mais enzimas que geram precursores a serem utilizados pelas enzimas da via do mevalonato, níveis de atividade aumentados de uma ou mais enzimas de curso de mevalonato, prenil transferase e/ou níveis diminuídos de atividade de esqualeno sintase; tais células são úteis para produção de compostos isoprenóides. A presente invenção provê células hospedeiras eucarióticas geneticamente modificadas que produzem níveis mais altos de acetil-CoA do que uma célula controle; tais células são úteis para produção de uma variedade de produtos, incluindo compostos isoprenóides. São providos métodos para a produção de um composto isoprenóide ou um precursor isoprenóide em uma célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada objeto de estudo. Os métodos geralmente envolvem cultura de umacélula hospedeira geneticamente modificada objeto de estudo sob condições que promovem produção de altos níveis de um composto isoprenálde ou precursor de isoprenóide.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLULASHOSPEDEIRAS GENETICAMENTE MODIFICADAS E USO DAS MESMASPARA PRODUÇÃO DE COMPOSTOS ISOPRENÓIDES".

Referência Cruzada

O presente pedido de patente reivindica o benefício do Pedidode Patente Provisório U.S. Nq 60/709.605 depositado em 19 de agosto de2005, Pedido de Patente Provisório U.S. Ne 60/759.674 depositado em 17 dejaneiro de 2006 e Pedido de Patente Provisório U.S. N- 60/771.773 deposi-tado em 8 de fevereiro de 2006, pedidos de patente que são aqui incorpora-dos a título de referência em sua totalidade.

Campo da Invenção

A presente invenção referes-se ao campo de produção de com-postos isoprenóides, e em particular células hospedeiras que são genetica-mente modificadas para produzir compostos isoprenóides.

Antecedentes da Invenção

Os isoprenóides constituem um grupo extremamente grande ediverso de produtos naturais que têm uma origem biossintética comum, istoé, precursor metabólico único, difosfato de isopentenila (IPP). Compostosisoprenóides são também referidos como "terpenos" ou "terpenóides". Maisde 40.000 isoprenóides foram descritos. Por definição, isoprenóides sãoformados das chamadas unidades isopreno (C5). O número de átomos de Cpresentes nos isoprenóides é tipicamente divisível por cinco (C5, C10, C15,C20, C25, C30 e C40), embora isoprenóides de politerpenos irregulares te-nham sido descritos. Membros importantes dos isoprenóides incluem os ca-rotenóides, sesquiterpenóides, diterpenóides e hemiterpenos. Carotenóidesincluem, por exemplo, licopeno, β-caroteno, e similar, muitos dos quais fun-cionam como antioxidantes. Sesquiterpenos incluem, por exemplo, artemisi-nina, um composto tendo atividade antimalária. Diterpenóides incluem, porexemplo, taxol, um agente quimioterapêutico para câncer.

Os isoprenóides compreendem a família mais numerosa e estru-turalmente diversa de produtos naturais. Nesta família, terpenóides isoladosde plantas e outras fontes naturais são usados como compostos de sabor efragrância comerciais bem como fármacos antimalária e anticâncer. A maio-ria dos compostos terpenóides em uso hoje são produtos naturais ou seusderivados. Os organismos fonte (por exemplo, árvores, invertebrados mari-nhos) de muitos desses produtos naturais não são nem condescendentes aocultivo em larga escala necessário para produzir quantidades comercialmen-te viáveis nem à manipulação genética para produção ou derivatização au-mentada desses compostos. Deste modo, os produtos naturais devem serproduzidos semi-sinteticamente a partir de análogos ou sinteticamente u-sando síntese química convencional. Ainda, muitos produtos naturais têmestruturas complexas, e, como resultado, são atualmente não-econômicosou impossíveis de sintetizar. Tais produtos naturais devem ser ou extraídosde suas fontes nativas, tal como árvores, esponjas, corais e micróbios mari-nhos; ou produzidos sinteticamente ou semi-sinteticamente de precursoresmais abundantes. Extração de um produto natural a partir de uma fonte nati-va é limitada pela disponibilidade da fonte nativa; e produção sintética ousemi-sintética de produtos naturais pode sofrer de baixo rendimento e/oualto custo. Tais problemas de produção e disponibilidade limitada da fontenatural podem restringir o desenvolvimento comercial e clínico de tais produtos.

A biossíntese de produtos naturais isoprenóides em células hos-pedeiras engenheiradas poderia explorar os potenciais comercial e terapêu-tico não-realizados desses recursos naturais e dar bons agentes químicos efarmacêuticos menos dispendioso e mais amplamente disponíveis. Umgrande obstáculo para biossíntese de terpenóide de alto nível é produção deprecursores de terpeno. Em Saccharomyces cerevisiae, a via do mevalonatoprovê produção de difosfato de isopentenila (IPP), que pode ser isomerizadoe polimerizado em isoprenóides e terpenos de valor comercial. Outros pre-cursores valiosos são também produzidos, incluindo difosfato de farnesila(FPP) e difosfato de geranilgeranila (GPP). No entanto, muito do fluxo dereação é direcionado às etapas posteriores indesejadas do curso de esterol,resultando na produção de ergosterol.

Há uma necessidade na técnica de produção de isoprenóide a-perfeiçoada ou células hospedeiras de produção de precursor de isoprenói-de que provejam produção de alto nível de compostos isoprenóides, bemcomo os precursores de difosfato de poliprenila de tais compostos. A presen-te invenção refere-se a esta necessidade e provê vantagens relacionadas

Literatura

A Publicação de Patente U.S. № 2004/005678; Publicação dePatente U.S. N5 2003/0148479; Martin e outros (2003) Nat. Biotech.21(7):796-802; Polakowski e outros (1998) Appl. MicrobioL Biotechnol. 49:67-71; Wilding e outros (2000) J. Bacteriol 182(15): 4319-27; Publicação dePatente U.S. № 2004/0194162; Donald e outros (1997) Appl. Env. Microbiol.63:3341-3344; Jackson e outros (2003) Organ. Lett. 5:1629-1632; Publica-ção de Patente U.S. N9 2004/0072323; Publicação de Patente U.S. N92004/0029239; Publicação de Patente U.S. Nq 2004/0110259; Publicação dePatente U.S. N9 2004/0063182; Patente U.S. Ng 5,460,949; Publicação dePatente U.S. N2 2004/0077039; Patente U.S. Ns 6.531.303; Patente U.S. N96.689.593; Hamano e outros (2001) Biosci. Biotechnol. Biochem. 65:1627-1635; T. Kuzuyama. (2004) Biosci. Biotechnol. Biochem. 68(4): 931-934; T.Kazuhiko. (2004) Biotechnology Letters. 26: 1487-1491; Brock e outros(2004) Eur. J. Biochem. 271: 3227-3241; Choi1 e outros (1999) Appl. Environ.Microbio. 65 4363-4368; Parke e outros, (2004) Appl. Environ. Microbio. 70:2974-2983; Subrahmanyam e outros (1998) J. Bact. 180: 4596-4602; Murli eoutros (2003) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30: 500-509; Starai e outros(2005) J. Biol. Chem. 280:26200-26205; e Starai e outros (2004) J. Mol. Biol.340:1005-1012.

Sumário da Invenção

A presente invenção provê células hospedeiras eucarióticas ge-neticamente modificadas que exibem níveis de atividade aumentados deuma ou mais enzimas que geram precursores a serem utilizados pelas en-zimas de via do mevalonato, níveis de atividade aumentada de uma ou maisenzimas da via do mevalonato, níveis aumentados de atividade de preniltransferase e/ou níveis diminuídos de atividade de esqualeno sintase; taiscélulas são úteis para produção de compostos isoprenóides. Em um aspec-to, a presente invenção provê células hospedeiras eucarióticas geneticamen-te modificadas que produzem níveis mais altos de acetil-CoA do que umacélula controle; tais células são úteis para produção de uma variedade deprodutos, incluindo compostos isoprenóides. São providos métodos para aprodução de um composto isoprenóide ou um precursor de isoprenóide emuma célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada objeto. Os mé-todos geralmente envolvem cultura de uma célula hospedeira geneticamentemodificada hospedeiro sob condições que promovem produção de níveisaltos de um isoprenóide ou composto precursor de isoprenóide.

Características da Invenção

A presente invenção refere-se a uma célula hospedeira eucarió-tica geneticamente modificada que produz níveis aumentados de acetil-CoA,a célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada compreendendomodificações genéticas que provêem: a) um nível aumentado de atividadede acetaldeído desidrogenase e/ou b) um nível aumentado de atividade deacetil-CoA sintetase, onde as modificações genéticas provêem uma produ-ção aumentada de acetil-CoA, conforme comparado com uma célula contro-le não compreendendo as modificações genéticas. Por exemplo, em algu-mas modalidades, as modificações genéticas provêem produção de acetil-CoA em um nível que é pelo menos cerca de 10% maior (por exemplo, de apartir de cerca de 10% maior a 103 vezes, ou mais, maior) do que o nível deacetil-CoA produzida em uma célula controle não compreendendo as modifi-cações genéticas. Em algumas modalidades, a produção de acetil-CoA éaumentada em pelo menos cerca de 50%. Em algumas modalidades, a célu-Ia hospedeira eucariótica geneticamente modificada é geneticamente modifi-cada com um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeocodificando ALD. Em algumas modalidades, a célula hospedeira eucarióticageneticamente modificada é geneticamente modificada com um ácido nu-cléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando ACS. Emalgumas modalidades, a ACS é uma ACS variante que tem susceptibilidadereduzida à acetilação pós-traducional. Em algumas modalidades, a célulahospedeira eucariótica geneticamente modificada é uma célula de levedura.Em algumas modalidades, a célula hospedeira eucariótica geneticamentemodificada é Saccharomyces cerevisiae. Em algumas modalidades, a célulahospedeira geneticamente modificada compreende ainda uma ou mais modi-ficações genéticas adicionais, conforme descrito abaixo.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucarióticageneticamente modificada objeto que produz níveis aumentados de acetil-CoA, conforme aqui descrito, compreende ainda uma ou mais modificaçõesgenéticas que provêem um nível aumentado de atividade de uma ou maisenzimas da via do mevalonato. Em algumas dessas modalidades, a célulahospedeira geneticamente modificada é geneticamente modificada com umácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleosídeo codificandoum fator de transcrição Ecm22p variante, variante que tem atividade de ati-vação transcripcional aumentada comparado com Ecm22p do tipo selvagem,onde o nível de transcrição de uma ou mais enzimas da via do mevalonato éaumentado. Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações genéti-cas que provêem um nível aumentado de atividade de uma ou mais enzimasda via do mevalonato resulta em um aumento no nível de transcrição da hi-droximetilglutaril co-enzima A sintase, mevalonato cinase e fosfomevalonatocinase. Em outras modalidades, uma célula hospedeira eucariótica geneti-camente modificada objeto que produz níveis aumentados de acetil-CoA,conforme aqui descrito, é geneticamente modificada mais com um ácido nu-cléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando um fatorde transcrição Upc2p variante, variante que tem atividade de ativação trans-cripcional aumentada comparado com Upc2p do tipo selvagem, onde o nívelde transcrição de uma ou mais enzimas da via do mevalonato é aumentado.Em algumas modalidades, a uma ou mais modificações genéticas que pro-vêem um nível aumentado de atividade de uma ou mais enzimas da via domevalonato resulta em um aumento no nível de transcrição de hidroximetil-glutaril co-enzima A sintase, mevalonato sintase e fosfomevalonato cinase.Em outras modalidades, uma célula hospedeira eucariótica geneticamentemodificada objeto que produz níveis aumentados de acetil-CoA, conformeaqui descrito, é geneticamente modificada mais com um ácido nucléicocompreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando um fator detranscrição Upc2p variante, variante que tem atividade de ativação transcrip-cional aumentada comparado com Upc2p do tipo selvagem; e é genetica-mente modificada mais com um ácido nucléico compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição Ecm22p variante,variante que tem atividade de ativação transcripcional aumentada compara-do com Ecm22p do tipo selvagem; onde o nível de transcrição de uma oumais enzimas da via do mevalonato é aumentado. Em algumas modalida-des, a célula hospedeira geneticamente modificada compreende ainda umaou mais modificações genéticas que provêem estabilidade de plasmídeoaumentada de um ou mais vetores de expressão compreendendo a uma oumais modificações genéticas. Em algumas modalidades, um construto deexpressão compreende um alelo Ieu2-d, conforme descrito no Exemplo 3.Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificadacompreende ainda uma ou mais modificações genéticas adicionais, confor-me descrito abaixo.

Em algumas modalidades, a célula hospedeira eucariótica gene-ticamente modificada objeto que produz níveis aumentados de acetil-CoA,conforme aqui descrito, compreende ainda uma ou mais modificações gené-ticas que provêem um nível aumentado de atividade de preniltransferase.Em algumas dessas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modi-ficada é geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendoum promotor heterólogo, onde o promotor substitui um promotor endógenooperavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo endógeno codifican-do farnesil pirofosfato sintase, onde o promotor heterólogo provê um nívelaumentado de farnesil pirofosfato sintase comparado com uma célula contro-le. Em outras modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada égeneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo um pro-motor heterólogo, onde o promotor substitui um promotor endógeno opera-velmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo endógeno codificando ge-ranil pirofosfato sintase, onde o promotor heterólogo provê um nível aumen-tado de geranil pirofosfato sintase comparado com uma célula hospedeiracontrole. Em outras modalidades, a célula hospedeira geneticamente modifi-cada é geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendoum promotor heterólogo, onde o promotor substitui um promotor endógenooperavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo endógeno codifican-do geranilgeranil pirofosfato sintase, onde o promotor heterólogo provê umnível aumentado de geranilgeranil pirofosfato sintase comparado com umacélula hospedeira controle. Em algumas modalidades, o promotor heterólogoé um promotor GAL1. Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneti-camente modificada compreende ainda uma ou mais modificações genéticasque provêem estabilidade de plasmídeo aumentada de um ou mais vetoresde expressão compreendendo a uma ou mais modificações genéticas. Emalgumas modalidades, um construto de expressão compreende um aleloIeu2-d, conforme descrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, a célulahospedeira geneticamente modificada compreende ainda uma ou mais modi-ficações genéticas adicionais, conforme descrito abaixo.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucarióticageneticamente modificada objeto que produz níveis aumentados de acetil-CoA, conforme aqui descrito, compreende ainda uma ou mais modificaçõesgenéticas que provêem um nível diminuído de atividade de esqualenô sinta-se. Em algumas dessas modalidades, a célula hospedeira geneticamentemodificada é geneticamente modificada com um ácido nucléico compreen-dendo um promotor heterólogo, promotor heterólogo que substitui um pro-motor endógeno operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo en-dógena codificando esqualenô sintase, onde o promotor heterólogo provêum nível reduzido de esqualenô sintase comparado com uma célula hospe-deira controle. Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamentemodificada compreende ainda uma ou mais modificações genéticas que pro-vêem estabilidade de plasmídeo aumentada de um ou mais vetores de ex-pressão compreendendo a uma ou mais modificações genéticas. Em algu-mas modalidades, um construto de expressão compreende um alelo Ieu2-d,conforme descrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, a célula hospe-deira geneticamente modificada compreende ainda uma ou mais modifica-ções genéticas, conforme descrito abaixo.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucarióticageneticamente modificada objeto que produz níveis aumentados de acetil-CoA, conforme aqui descrito, compreende ainda uma ou mais modificaçõesgenéticas que provêem: a) um nível aumentado de atividade de uma ou maisenzimas da via do mevalonato; b) uma ou mais modificações genéticas queprovêem um nível aumentado de atividade de preniltransferase; e c) uma oumais modificações genéticas que provêem um nível diminuído de atividadede esqualeno sintase. Em algumas modalidades, a célula hospedeira euca-riótica geneticamente modificada objeto que produz níveis aumentados deacetil-CoA, e que compreende uma ou mais modificações genética que pro-vêem: a) um nível aumentado de atividade de uma ou mais enzimas da viado mevalonato; b) uma ou mais modificações genéticas que provêem umanível aumentado de atividade de preniltransferase; e c) uma ou mais modifi-cações genéticas que provêem um nível diminuído de atividade de esquale-no sintase, compreendendo ainda uma ou mais modificações genéticas queprovêem estabilidade de plasmídeo aumentada de um ou mais vetores deexpressão compreendendo a uma ou mais modificações genéticas. Em al-gumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada com-preende ainda uma ou mais modificações genéticas que provêem estabilida-de de plasmídeo aumentada de um ou mais vetores de expressão compre-endendo a uma ou mais modificações genéticas. Em algumas modalidades,um construto de expressão compreende um alelo Ieu2-d, conforme descritono Exemplo 3. Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamentemodificada compreende ainda uma ou mais modificações genéticas adicio-nais, conforme descrito abaixo.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucarióticageneticamente modificada objeto que produz níveis aumentados de acetil-CoA, conforme acima descrito, é geneticamente modificada mais com umácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificandouma hidroximetilglutaril co-enzima A redutase truncada.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucarióticageneticamente modificada objeto que produz níveis aumentados de acetil-CoA1 conforme aqui descrito, é geneticamente modificada mais com um áci-do nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando umaterpeno sintase.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucarióticageneticamente modificada objeto que produz níveis aumentados de acetil-CoA, conforme aqui descrito, compreende ainda uma ou mais modificaçõesgenéticas que provêem estabilidade de plasmídeo aumentada de um oumais vetores de expressão compreendendo a uma ou mais modificaçõesgenéticas. Em algumas modalidades, um construto de expressão compreen-de um alelo Ieu2-d, conforme descrito no Exemplo 3. Em algumas modalida-des, a célula hospedeira geneticamente modificada compreende ainda umaou mais modificações genéticas adicionais, conforme descrito abaixo.

A presente invenção refere-se a uma célula hospedeira eucarió-tica geneticamente modificada que produz um isoprenóide ou um compostoprecursor de isoprenóide através de uma via do mevalonato, a célula hospe-deira eucariótica geneticamente modificada compreendendo uma ou maismodificações genéticas que provêem um nível aumentado de atividade deuma ou mais enzimas da via do mevalonato, onde as modificações genéti-cas provêem produção de um isoprenóide ou um composto precursor deisoprenóide em um nível que é maior do que o nível do isoprenóide ou com-posto precursor de isoprenóide em uma célula controle não compreendendoas modificações genéticas. Em um aspecto, as modificações genéticas pro-vêem produção de um isoprenóide ou composto precursor de isoprenóideem um nível que é pelo menos cerca de 10% maior (por exemplo, de a partirde cerca de 10% maior a 103 vezes, ou mais, maior) ou mais, maior do que onível do isoprenóide ou composto precursor de isoprenóide em uma célulacontrole não compreendendo as modificações genéticas. Em um aspecto, asmodificações genéticas provêem produção de um isoprenóide ou compostoprecursor isoprenóide em um nível que é pelo menos cerca de 50% maior doque aquele na célula controle. Em outro aspecto, a célula hospedeira geneti-camente modificada compreende ainda uma ou mais modificações genéticasque provêem estabilidade de plasmídeo aumentada de um ou mais vetoresde expressão compreendendo a uma ou mais modificações genéticas. Emalgumas modalidades, um construto de expressão compreende um aleloIeu2-d, conforme descrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, a célulahospedeira geneticamente modificada é geneticamente modificada com umácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificandoum fator de transcrição Ecm22p variante, variante que tem atividade de ati-vação transcripcional aumentada comparado com Ecm22p do tipo selvagem,onde o nível de transcrição de uma ou mais enzimas da via do mevalonato éaumentado. Em algumas modalidades, a atividade de Ecm22p aumentadaresulta em um nível aumentado de transcrição de hidroximetilglutaril co-enzima A sintase, mevalonato cinase e fosfomevalonato cinase. Em algumasmodalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada é geneticamen-te modificada com um ácido nucléico compreendendo uma seqüência denucleotídeo codificando um fator de transcrição Upc2p, variante que tem ati-vidade de ativação transcripcional aumentada comparado com Upc2p do tiposelvagem, onde o nível de transcrição de uma ou mais enzimas da via domevalonato é aumentado. Em algumas modalidades, a célula hospedeirageneticamente modificada compreende uma ou mais modificações genéticasadicionais, conforme descrito abaixo.

A presente invenção refere-se a uma célula hospedeira eucarió-tica geneticamente modificada que produz um isoprenóide ou composto pre-cursor de isoprenóide através de uma via do mevalonato, a célula hospedei-ra eucariótica geneticamente modificada compreendendo uma ou mais modi-ficações genéticas que provêem um nível aumentado de atividade de prenil-transferase, onde as modificações genéticas provêem produção de um iso-prenóide ou um composto precursor de isoprenóide em um nível que é pelomenos cerca de 10% maior (por exemplo, de a partir de cerca de 10% maiora 103 vezes, ou mais, maior) do que o nível do isoprenóide ou compostoprecursor de isoprenóide em uma célula controle não compreendendo asmodificações genéticas; e onde a célula hospedeira geneticamente modifi-cada compreende ainda uma ou mais modificações genéticas que provêemestabilidade de plasmídeo aumentada de um ou mais vetores de expressãocompreendendo a uma ou mais modificações genéticas. Em algumas moda-lidades, um construto de expressão compreende um alelo Ieu2-d, conformedescrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, a célula hospedeira gene-ticamente modificada é geneticamente modificada com um ácido nucléicocompreendendo um promotor heterólogo, onde o promotor substitui um pro-motor endógeno operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo en-dógeno codificando farnesil pirofosfato sintase, onde o promotor heterólogoprovê um nível aumentado de farnesil pirofosfato sintase comparado comuma célula hospedeira controle. Em algumas modalidades, a célula hospe-deira geneticamente modificada é geneticamente modificada com um ácidonucléico compreendendo um promotor heterólogo, onde o promotor substituium promotor endógeno operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotí-deo endógeno codificando geranil pirofosfato sintase, onde o promotor hete-rólogo provê um nível aumentado de geranil pirofosfato sintase comparadocom uma célula hospedeira controle. Em algumas modalidades, a célulahospedeira geneticamente modificada é geneticamente modificada com umácido nucléico compreendendo um promotor heterólogo, onde o promotorsubstitui um promotor endógeno operavelmente ligado a uma seqüência denucleotídeo endógeno codificando geranilgeranil pirofosfato sintase, onde opromotor heterólogo provê um nível aumentado de geranilgeranil pirofosfatosintase comparado com uma célula hospedeira controle. Em algumas moda-lidades, a célula hospedeira geneticamente modificada compreende aindauma ou mais modificações genéticas adicionais, conforme descrito abaixo.

A presente invenção refere-se a uma célula hospedeira eucarió-tica geneticamente modificada que produz um isoprenóide ou um compostoprecursor de isoprenóide através de uma via do mevalonato, a célula hospe-deira eucariótica geneticamente modificada compreendendo uma ou maismodificações genéticas que provêem um nível diminuído de atividade deesqualeno sintase, onde as modificações genéticas provêem produção deum isoprenóide ou um composto precursor de isoprenóide em um nível queé pelo menos cerca de 10% maiór (por exemplo, de a partir de cerca de 10%maior a 103 vezes, ou mais, maior) do que o nível do isoprenóide ou com-posto precursor de isoprenóide em uma célula controle não compreendendoas modificações genéticas; e onde a célula hospedeira geneticamente modi-ficada compreende ainda uma ou mais modificações genéticas que provêemestabilidade de plasmídeo aumentada de um ou mais vetores de expressãocompreendendo a uma ou mais modificações genéticas. Em algumas moda-lidades, um construto dé expressão compreende um alelo Ieu2-d, conformedescrito no Exemplo 3. Em algumas modalidades, a célula hospedeira gene-ticamente modificada é geneticamente modificada com um ácido nucléicocompreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma hidroxime-tilglutaril co-enzima A redutase truncada. Em algumas modalidades, a célulahospedeira geneticamente modificada é geneticamente modificada com umácido nucléico compreendendo um promotor heterólogo, promotor heterólo-go que substitui um promotor endógeno operavelmente ligado a uma se-qüência de nucleotídeo endógena codificando esqualeno sintase, onde opromotor heterólogo provê um nível reduzido de esqualeno sintase compa-rado com uma célula hospedeira controle. Em algumas modalidades, a célu-la hospedeira geneticamente modificada compreende ainda uma ou maismodificações genéticas adicionais, conforme descrito abaixo.

A presente invenção refere-se a uma célula hospedeira eucarió-tica geneticamente modificada que produz um isoprenóide ou composto pre-cursor isoprenóide através de uma via do mevalonato, a célula hospedeiraeucariótica geneticamente modificada compreendendo modificações genéti-cas que provêem: a) um nível aumentado de atividade de uma ou mais en-zimas da via do mevalonato, b) um nível aumentado de atividade de prenil-transferase e c) um nível diminuído de atividade de esqualeno sintase, ondeas modificações genéticas provêem produção de um isoprenóide ou com-posto precursor de isoprenóide em um nível que é pelo menos cerca de 10%maior (por exemplo, de a partir de cerca de 10% maior a 103 vezes, ou mais,maior) do que o nível do isoprenóide ou composto precursor de isoprenóideem uma célula controle não compreendendo as modificações genéticas; eonde a célula hospedeira geneticamente modificada compreende ainda umaou mais modificações genéticas que provêem estabilidade de plasmídeoaumentada de um ou mais vetores de expressão compreendendo a uma oumais modificações genéticas. Em algumas modalidades, um construto deexpressão compreende um alelo Ieu2-d, conforme descrito no Exemplo 3.

Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada égeneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo codificando uma hidroximetiIgIutaril co-enzima A re-dutase. Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modi-ficada é geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendouma seqüência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição Ecm22pvariante, variante que tem atividade de ativação transcripcional aumentadacomparado com Ecm22p do tipo selvagem, onde o nível de transcrição deuma ou mais enzimas da via do mevalonato é aumentado. Em algumas mo-dalidades, a atividade de Ecm22p resulta em um nível aumentado de trans-crição de hidroximetilglutaril co-enzima-A sintase, mevalonato cinase e fos-fomevalonato cinase. Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneti-camente modificada é geneticamente modificada com um ácido nucléicocompreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando um fator detranscrição Upc2p variante, variante que tem atividade de ativação transcrip-cional aumentada comparado com Upc2p do tipo selvagem, onde o nível detranscrição de uma ou mais enzimas da via de mevalonato é aumentado. Emalgumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada é ge-ralmente modificada com um ácido nucléico compreendendo um promotorheterólogo, onde o promotor substitui um promotor endógeno operavelmenteligado a uma seqüência de nucleotídeo codificando farnesil pirofosfato sinta-se, onde o promotor heterólogo provê um nível aumentado de farnesil piro-fosfato sintase comparado com uma célula hospedeira controle. Em algumasmodalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada é geneticamen-te modificada com um ácido nucléico compreendendo um promotor heteró-logo, onde o promotor substitui um promotor endógeno operavelmente ligadoa uma seqüência de nucleotídeo endógeno codificando geranil pirofosfatosintase, onde o promotor heterólogo provê um nível aumentado de geranilpirofosfato sintase comparado com uma célula hospedeira controle. Em al-gumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada é gene-ticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo um promotorheterólogo, onde o promotor substitui um promotor endógeno operavelmenteligado a uma seqüência de nucleotídeo endógena codificando geranilgeranilpirofosfato sintase, onde o promotor heterólogo provê um nível aumentadode geranilgeranil pirofosfato sintase comparado com uma célula hospedeiracontrole. Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente mo-dificada é geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendoum promotor heterólogo, promotor heterólogo que substitui um promotor en-dógeno operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo endógenocodificando esqualeno sintase, onde o promotor heterólogo provê um nívelreduzido de esqualeno sintase comparado com uma célula hospedeira con-trole. Em algumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modifi-cada compreende ainda uma ou mais modificações genéticas adicionais,conforme descrito abaixo.

A presente invenção refere-se a métodos de produção de umcomposto isoprenóide ou um composto precursor de isoprenóide, os méto-dos geralmente envolvendo cultura de uma célula hospedeira geneticamentemodificada, conforme aqui descrito, sob condições adequadas de modo queo composto isoprenóide ou um composto precursor de isoprenóide é produ-zido pela célula. Em algumas modalidades, o composto isoprenóide ou umcomposto precursor de isoprenóide é isolado da célula e/ou do sobrenadantede cultura de célula e vai em algumas modalidades ser purificado.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é uma representação esquemática da via do mevalo-nato em Saccharomyces cerevisiae. As estruturas de intermediários e no-mes de genes codificando as várias enzimas na via são mostrados.

A figura 2 é uma representação esquemática de uma porção docurso de biossíntese de esterol em um organismo expressando amorfadienosintase (ADS). As estruturas de intermediários e os nomes dos genes codifi-cando as várias enzimas no curso são mostrados.As figuras 3A e 3B mostram produção de amorfadieno pela S.cerevisiae durante 96 horas de cultura expressando amorfadieno sintase(ADS) (♦): ADS e 3-hidroxi-3-metilglutaril co-enzima A redutase truncada(tHMGR) (·); ADS e upc2-1 (■)-; e ADS e ecm22-1 (A). Os dados são mos-trados como produção total (3A) e normalizados para densidade de célula(3B). Os dados são média ± desvios padrão (n=3).

A figura 4 mostra produção de amorfadieno em espécie S. cere-visiae EPY212 cultivada em concentrações de metionina de O, 0,1, 0,3, 05 e1 após 64 e 87 horas de cultura. Os dados são médias de médias de duasamostras.

A figura 5 mostra produção de amorfadieno pela S. cerevisiaepor várias linhagens de levedura durante 144 horas de expressão de cultura.Os dados são média ± desvio padrão (n=3).

A figura 6 mostra uma seqüência de nucleotídeo codificandouma HMGR truncada.

As figuras 7A e 7B mostram uma seqüência de aminoácido deHMGR truncada.

A figura 8 é uma representação esquemática do bypass de piru-vato desidrogenase em S. cerevisiae. As reações enzimáticas do bypass depiruvato desidrogenase são mostradas por setas duplas. O gene ALD6 codi-fica acetaldeído desidrogenase em citoplasma. Os genes ACS1 e ACS2 co-dificam acetil-CoA sintetase.

A figura 9 mostra vetores de expressão para amorfadieno sinta-se (ADS; por exemplo, pRS425ADS), acetaldeído desidrogenase (ALD) eacetil-CoA sintetase (ACS).

As figuras 10A-D mostram crescimento celular (OD6OO. figura10A), produção de amorfadieno (figura 10B), produção de acetato (figura10C); e produção de etanol (figura 10D) na linhagem de levedura de origem(controle) EPY213 e em dois transformantes (EPY213/pRS426ALD6 Nq 1 eEPY213/pRS426ALD6 № 2) geneticamente transformados compRS426ALD6. Os transformantes № 1 e № 2 produzem ALD em excesso.

As figuras 11A-D mostram crescimento celular (OD6QO; figura11 A), produção de amorfadieno (figura 11B), produção de acetato (figura11C); e produção de etanol (figura 11 D) na linhagem de levedura de origem(controle) EPY213 e em dois transformantes (EPY213/pRS426ACS1 N9 1 eEPY213/pRS426ACS1 Nq 2) geneticamente modificados com pRS426ACS1.Os transformantes Ne 1 e N- 2 produzem ACS em excesso.

As figuras 12A-D mostram crescimento celular (QD600; figura12A), produção de amorfadieno (figura 12B), produção de acetato (figura12C); e produção de etanol (figura 12D) na linhagem de levedura de origem(controle) EPY213, em EPY213/pRS426ALD6 transformante de produçãoem excesso de ALD, em EPY213/pRS426ACS1 transformante de produçãoem excesso de ACS e em dois transformantes (EPY213/pES-ALD6-ACS1 N91 e EPY213/pES-ALD6-ACS1 N9 2) geneticamente modificados com pES-ALD6-ACS1. Os transformantes EPY213/pES-ALD6-ACS1 N9 1 eEPY213/pES-ALD6-ACS1 N9 2 produzem ambas ALD e ACS em excesso.

As figuras 13A e 13B mostram uma comparação de atividade deenzima em linhagens superexpressando o gene ALD6 (figura 13A) ou o ge-ne ACS1 (figura 13B). A atividade de ALD (figura 13A) e a atividade de ACS(figura 13B) na linhagem de levedura de origem (controle) EPY213, naEPY213/pRS426/ALD6 e EPY213/pdeltaALD6 (figura 13A); e emEPY213/pRS246ACS1 e EPY213/pdeltaACS1 (figura 13B) são mostradas.

As figuras 14A-C mostram atividade de ALD em EPY213 eEPY213/pES-ALD6-ACS1 (figura 14A); atividade de ACS em PEY213 e emEPY213/pES-ALD6-ACS1 (figura 14B); e análise de SDS-PAGE de níveis deproteínas ACS e ALD em EPY213 e EPY213/pES-ALD6-ACS1 (figura 14C).figura 14C: marcador de peso molecular (Faixa 1); EPY213 (Faixa 2); eEPY213/pES-ALD6-ACS1 (Faixa 3).

A figura 15 é uma representação esquemática de regulação pós-traducional de atividade de ACS pelo sistema Pat/Sir2 em Salmonella enteri-ca. A proteína acetiItransferase (Pat) acetila ACD em Lys6Q0, tornando a en-zima inativa. A proteína desacetilase Sir2 dependente de NAD+ (CobB) ativaACS através de remoção de um grupo acetila inibidor.

A figura 16 mostra um alinhamento do C-terminal de aproxima-damente 50 aminoácidos de ACS de Salmonella enterica e Saccharomycescerevisiae. A localização do sítio de acetilação (Lys-609 em ACS de S. ente-rica) é mostrada por um asterisco. A Leu-641 de ACS de S. enterica, que écrítica para a acetilação de resíduo Lys-609, é mostrada pelo símbolo pound(#).

A figura 17 provê uma seqüência de aminoácido (SEQ IDNO:22) de S. cerevisiae acètaldeído desidrogenase.

A figura 18 provê uma seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO:23) codificando acetaldeído desidrogenase de S. cerevisiae.

A figura 19 provê uma seqüência de aminoácido (SEQ IDNO:24) de acetil-CoA sintetase de S. cerevisiae.

A figura 20 provê uma seqüência de nucleotídeo (SEQ IDNO:25) codificando acetil-CoA sintetase de S. cerevisiae.

A figura 21 é uma mostra esquemática de plasmídeo pRS425-Leu2d.

A figura 22 é um gráfico mostrando níveis de amorfadieno aolongo do tempo em cultura.

A figura 23 é um gráfico mostrando a porcentagem de célulasretendo plasmídeo ao longo do tempo.

Definições

Os termos "isoprenóide", "composto isoprenóide", "terpeno","composto terpeno", "terpenóide" e "composto terpenóide" são usados inter-comutavelmente aqui. Compostos isoprenóide são formados de vários nú-meros das chamadas unidades isopreno (C5). O número de átomos de Cpresentes nos isoprenóides é tipicamente uniformemente divisível por cinco(por exemplo, C5, C10, C15, C20, C25, C30 e C40). Isoprenóides e politer-penos irregulares foram relatados, e são também incluídos na definição de"isoprenóide". Compostos isoprenóide incluem, mas não estão limitados a,monoterpenos, sesquiterpenos, triterpenos, politerpenos e diterpenos.

Conforme aqui usado, o termo "difosfato de prenila" é usado in-tercomutavelmente com "pirofosfato de prenila" e inclui difosfatos de mono-prenila tendo um grupo prenila único (por exemplo, IPP e DMAPP), bem co-mo difosfatos de poliprenila que incluem 2 ou mais grupos prenila. Difosfatosde monoprenil incluem pirofosfato de isopentenila (IPP) e seu isômero piro-fosfato de dimetilalila (DMAPP).

Conforme aqui usado, o termo "terpeno sintase" refere-se aqualquer enzima que modifique enzimaticamente IPP, DMAPP ou um piro-fosfato de poliprenila, de modo que um composto terpenóide é produzido. Otermo "terpeno sintase" inclui enzimas que catalisam a conversão de um di-fosfato de prenila em um isoprenóide.

A palavra "pirofosfato" é usada aqui intercomutavelmente com"difosfato". Então, por exemplo, os termos "difosfato de prenila" e "pirofosfatode prenila" são intercomutáveis; os termos "pirofosfato de isopentenila" e"difosfato de isopentenila" são intercomutáveis;. Os termos " difosfato de far-nesila" e "pirofosfato de farnesila" são intercomutáveis, etc.

O termo "via do mevalonato" ou "via do MEV" é usado aqui parase referir ao curso biossintético que converte acetil-CoA em IPP. A via domevalonato compreende enzimas que catalisam as etapas que seguem: (a)condensação de duas moléculas de acetil-CoA em acetoacetil-CoA; (b) con-densação de acetoacetil-CoA com acetil-CoA para formar HMG-CoA; (c)conversão de HMG-CoA em mevalonato; (d) fosforilação de mevalonato emmevalonato 5-fosfato; (e) conversão de mevalonato 5-fosfato em mevalonato5-pirofosfato; e (f) conversão de mevalonato 5-pirofosfato em pirofosfato deisopentenila. A via do mevalonato é ilustrada esquematicamente na figura 1.

Conforme aqui usado, o termo "prenil transferase" é usado inter-comutavelmente com os termos "isoprenil difosfato sintase" e "poliprenil sin-tase" (por exemplo, "GPP sintase", "FPP sintase", "OPP sintase", etc) parase referir a uma enzima que catalisa a condensação 1'-4 consecutiva de di-fosfato de isopentenila com substratos de iniciador alílicos, resultando naformação de difosfato de prenila de vários comprimentos de cadeia.

Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucléico" usados interco-mutavelmente aqui referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos dequalquer comprimento, ou ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos. Destemodo, este termo inclui, mas não é limitado a, DNA ou RNA simples, duploou multifilamento, DNA genômico, cDNA, híbridos de DNA-RNA ou um polí-mero compreendendo bases purina e pirimidina ou outras bases de nucleo-tídeo naturais, química ou bioquimicamente modificadas, não-naturais ouderivatizadas.

Conforme aqui usado, os termos "operon" e "unidade de trans-crição única" são usados intercomutavelmente para se referir a duas ou maisregiões de codificação contíguas (seqüências de nucleotídeo que codificamum produto de gene tal como um mRNA ou uma proteína) que são coorde-nadamente reguladas por um ou mais elementos de controle (por exemplo,um promotor). Conforme aqui usado, o termo "produto de gene" refere-sé aum RNA codificado por DNA (ou vice versa) ou proteína que é codificado porum RNA ou DNA, onde um gene vai tipicamente compreender uma ou maisseqüências de nucleotídeo que codificam uma proteína, e podem tambémincluir íntrons e outras seqüências de nucleotídeo de não-codificação.

Os termos "peptídeo", "polipeptídeo" e "proteína" são usadosintercomutavelmente aqui e referem-se a uma forma polimérica de aminoá-cidos de qualquer comprimento, que pode incluir aminoácidos codificados enão-codificados, aminoácidos quimicamente ou bioquimicamente modifica-dos ou derivatizados e polipeptídios tendo estruturas principais de polipeptí-deo modificadas.

O termo "ocorrência natural" conforme aqui usado conforme a-plicado a um ácido nucléico, uma célula ou um organismo refere-se a umácido nucléico, célula ou organismo que é encontrado na natureza. Por e-xemplo, uma seqüência de polipeptídeo ou polinucleotídeo que está presen-te em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte nanatureza e que não foi intencionalmente modificado por um ser humano nolaboratório é de ocorrência natural.

O termo "ácido nucléico heterólogo", conforme aqui usado, refe-re-se a um ácido nucléico onde pelo menos um do que segue é verdadeiro:(a) o ácido nucléico é estranho ("exógeno") a (isto é, não naturalmente en-contrado em) um dado microorganismo hospedeiro ou célula hospedeira; (b)o ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotídeo que é natural-mente encontrada em (por exemplo, é "endógena a") um dado microorga-nismo hospedeiro ou célula hospedeira (por exemplo, o ácido nucléico com-preende uma seqüência de nucleotídeo endógena para o microorganismohospedeiro ou célula hospedeira); no entanto, no contexto de um ácido nu-cléico heterólogo, a mesma seqüência de nucleotídeo conforme encontradoendogenamente é produzida em uma quantidade não-natural (por exemplo,maior do que esperado Ou maior do que naturalmente encontrado) na célula,ou um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo quedifere em seqüência da seqüência de nucleotídeo endógeno mas codifica amesma proteína (tendo a mesma ou substancialmente a mesma seqüênciade aminoácido) conforme encontrado endogenamente é produzido em umaquantidade não-natural (por exemplo, maior do que esperado ou maior doque naturalmente encontrado) na célula; (c) o ácido nucléico compreendeduas ou mais seqüências de nucleotídeo que não são encontradas na mes-ma relação uma com a outra na natureza, por exemplo, o ácido nucléico érecombinante. Um exemplo de um ácido nucléico heterólogo é uma seqüên-cia de nucleotídeo codificando HGMR operavelmente ligada a um elementode controle transcripcional (por exemplo, um promotor) ao qual uma seqüên-cia de codificação de HMGR endógena (não ocorrendo naturalmente) não énormalmente operavelmente ligada. Outro exemplo de um ácido nucléicoheterólogo é um plasmídeo de número de cópia alto compreendendo umaseqüência de nucleotídeo codificando HMGR. Outro exemplo de um ácidonucléico heterólogo é um ácido nucléico codificando HMGR, onde uma célu-la hospedeira que não produz normalmente HMGR é geneticamente modifi-cada com o ácido nucléico codificando HMGR; devido ao fato de ácidos nu-cléicos codificando MHGR não serem encontrados naturalmente na célulahospedeira, o ácido nucléico é heterólogo para a célula hospedeira geneti-camente modificada.

"Recombinante", conforme aqui usado, significa que um ácidonucléico particular (DNA ou RNA) é o produto de várias combinações de e-tapas de clonagem, restrição e/ou ligação resultando em um construto tendouma seqüência de codificação e não-codificação estrutural distinguível deácidos nucléicos endógenos encontrados em sistemas naturais. Geralmente,seqüências de DNA codificando a seqüência de codificação estrutural po-dem ser montadas de fragmentos de cDNA e Iigantes de oligonucleotídeocurtos, ou de uma série de oligonucleotídeo sintéticos, para prover um ácidonucléico sintético que é capaz de ser expresso a partir de uma unidade detranscripcional recombinante contida em uma célula ou em um sistema detranscrição e tradução livre de célula. Tais seqüências podem ser providasna forma de uma estrutura de leitura aberta não-interrompida por seqüênciasnão-traduzidas internas, ou íintrons, que estão tipicamente presentes emgenes eucarióticos. DNA genômico compreendendo as seqüências relevan-tes pode ser também usado na formação de um gene recombinante ou uni-dade transcripcional. Seqüências de DNA não-traduzido podem estar pre-sentes 5' ou 3' da estrutura de leitura aberta, onde tais seqüências não inter-ferem com a manipulação ou expressão das regiões de codificação, e po-dem na verdade agir para modular a produção de um produto desejado atra-vés de vários mecanismos (vide "seqüências reguladoras de DNA", abaixo).

Deste modo, por exemplo, o termo polinucleotídeo ou ácido nu-cléico "recombinante" refere-se a um que é de ocorrência não-natural, porexemplo, é feito através da combinação artificial de dois segmentos normal-mente separados de seqüência através de intervenção humana. Esta com-binação artificial é freqüentemente realizada através de ou meios de sínteseou através da manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléi-cos, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética. Tal é geral-mente feito para substituir um códon com um códon redundante codificandoo mesmo aminoácido ou um conservativo, enquanto tipicamente introduzin-do ou removendo um sítio de reconhecimento de seqüência. Alternativamen-te, ela é realizada para unir segmentos de ácido nucléico de funções deseja-das para gerar uma combinação desejada de funções. Esta combinação arti-ficial é freqüentemente realizada ou através de meios de síntese química ouatravés de manipulação artificial de segmentos de ácidos nucléicos isolados,por exemplo, através de técnicas de engenharia genética.

Por "construto" se quer dizer um ácido nucléico recombinante,geralmente DNA recombinante, que foi gerado para o propósito de expres-são de uma seqüência(s) de nucleotídeo específica(s) ou deve ser usado naconstrução de outras seqüências de nucleotídeo recombinantes.

Conforme aqui usado, o termo "ácido nucléico exógeno" refere-se a um ácido nucléico que não é normalmente ou naturalmente encontradoe/ou produzido por uma dada bactéria, organismo ou célula na natureza. Umácido nucléico exógeno é um ácido nucléico que é introduzido exogenamen-te em uma célula hospedeira. Conforme aqui usado, o termo "ácido nucléicoendógeno" refere-se a um ácido nucléico que é normalmente encontrado eme/ou produzido por uma dada bactéria, organismo ou célula na natureza. Um"ácido nucléico endógeno" é também referido como um "ácido nucléico nati-vo" ou um ácido nucléico que é "nativo" a uma dada bactéria, organismo oucélula. Por exemplo, um cDNA gerado de um mRNA isolado de uma planta ecodificando uma terpeno sintase representa um ácido nucléico exógeno paraS. cerevisiae. Em S. cerevisiae, seqüências de nucleotídeo codificandoHMGS, MK e PMK no cromossomo seriam ácidos nucléicos "endógenos.

Os termos "seqüências reguladoras de DNA", "elementos decontrole" e "elementos reguladores", usados aqui intercomutavelmente, refe-rem-se a seqüências de controles transcripcional e traducional, tal comopromotores, aumentadores, sinais de poliadenilação, terminadores, sinais dedegradação de proteína e similar, que provêem e/ou regulam a expressão deuma seqüência de codificação e/ou produção de um polipeptídeo codificadoem uma célula hospedeira.

O termo "transformação" é usado intercomutavelmente aqui com"modificação genética" e refere-se a uma mudança genética permanente outransiente induzida em uma célula seguindo introdução de novo ácido nu-cléico (isto é, DNA exógeno para a célula). Mudança genética ("modifica-ção") pode ser realizada ou através da incorporação do novo DNA no geno-ma da célula hospedeira ou através de manutenção transiente ou estável donovo DNA como um elemento epissomal. Onde a célula for uma célula euca-riótica, uma mudança genética permanente é geralmente conseguida atra-vés da introdução do DNA no genoma da célula. Em células procarióticas,mudanças permanentes podem ser introduzidas no cromossomo ou atravésde elementos extracromossomais tal como plasmídeos e vetores de expres-são, que podem conter um ou mais marcadores selecionáveis para auxiliarem sua manutenção na célula hospedeira recombinante.

"Operavelmente ligado" refere-se à justaposição onde os com-ponentes então descritos estão em uma relação permitindo que eles funcio-nem em sua maneira pretendida. Por exemplo, um promotor é operavelmen-te ligado a uma seqüência de codificação se o promotor afetar sua transcri-ção ou expressão. Conforme aqui usado, os termos "promotor heterólogo" e"regiões de controle heterólogas" referem-se a promotores e outras regiõesde controle que não estão normalmente associados com um ácido nucléicoparticular na natureza. Por exemplo, uma "região de controle transcripcionalheteróloga para uma região de codificação" é uma região de controle trans-cripcional que não é normalmente associada com a região de codificação nanatureza.

Uma "célula hospedeira", conforme aqui usado, significa umacélula eucariótica in vivo ou in vitro ou uma célula de um organismo multice-Iular (por exemplo, uma linhagem de célula) culturada como uma entidadeunicelular, células eucarióticas que podem ser, ou foram, usadas como reci-pientes para um ácido nucléico (por exemplo, um vetor de expressão quecompreende uma seqüência de nucleotídeo codificando um ou mais produ-tos de gene tal como produtos do gene da via do mevalonato), e inclui a pro-gênie da célula original que foi geneticamente modificada pelo ácido nucléi-co. É compreendido que a progênie de uma célula única pode não ser ne-cessariamente completamente idêntica em morfologia ou em complementode DNA genômico ou total à origem, devido à mutação natural, acidental oudeliberada. Uma "célula hospedeira recombinante" (também referida comouma "célula hospedeira geneticamente modificada") é uma célula hospedeirana qual foi introduzido um ácido nucléico heterólogo, por exemplo, um vetorde expressão. Por exemplo, uma célula hospedeira eucariótica objeto é umacélula hospedeira eucariótica geneticamente modificada, em virtude de in-trodução em uma célula hospedeira eucariótica adequada de um ácido nu-cléico heterólogo, por exemplo, um ácido nucléico exógeno que é estranhopara a célula hospedeira eucariótica, ou um ácido nucléico recombinanteque é normalmente encontrado na célula hospedeira eucariótica.

Conforme aqui usado, o termo "isolado" pretende descrever umpolinucleotídeo, um polipeptídio ou uma célula que está em um ambientediferente daquele onde o polinucleotídeo, o polipeptídio ou a célula natural-mente acontece. Uma célula hospedeira geneticamente modificada isoladapode estar presente em uma população mista de células hospedeiras gene-ticamente modificadas.

Cassetes de expressão podem ser preparados compreendendouma região(ões) de iniciação de transcrição ou de controle transcripcional(por exemplo, um promotor), a região de codificação para a proteína de inte-resse, e uma região de terminação transcripcional. Regiões de controletranscripcional incluem aquelas que provêem superexpressão da proteína deinteresse na célula hospedeira geneticamente modificada; aquelas que pro-vêem expressão induzível, tal como quando um agente de indução é adicio-nado ao meio de cultura, transcrição da região de codificação da proteína deinteresse é induzida ou aumentada para um nível maior do que antes da in-dução.

Um ácido nucléico é "hibridizável" para outro ácido nucléico, talcomo um cDNA, DNA genômico, ou RNA, quando uma forma de filamentoúnico do ácido nucléico pode anelar para o outro ácido nucléico sob as con-dições apropriadas de temperatura e resistência iônica da solução. Condi-ções de hibridização e lavagem são bem-conhecidas e exemplificadas emSambrook, J. Fritsch, E.F. e Maniatis, T., Molecular Cloning: A LaboratoryManual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor (1989), particularmente capítulo 11 e Tabela 11.1 nele; e Sambrook,J. e Russel, W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edição,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (2001). As condi-ções de temperatura e resistência iônica determinam a "estringência" da hi-bridização. As condições de estringência podem ser ajustadas para avaliarfragmentos moderadamente similares, tal como seqüências homólogas deorganismos distantemente relacionados, a fragmentos altamente similares,tal como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos intimamen-te relacionados. Condições de hibridização e lavagens de pós-hibridizaçãosão úteis para se obter as condições de estringência determinadas deseja-das da hibridização. Um conjunto de lavagens de pós-hibridização ilustrati-vas é uma série de lavagens começando com 6 χ SSC (onde SSC é NaCI a0,15 M e tampão de citrato a 15 mM), SDS a 0,5% em temperatura ambientepor 15 minutos, então repetida com 2 χ SSC, SDS a 0,5% a 455 C por 30minutos e então repetida duas vezes com 0,2 χ SSC, SDS a 0,5% "a 50e Cpor 30 minutos. Outras condições estringentes são obtidas usando tempera-turas mais altas onde as lavagens são idênticas àquelas acima exceto pelatemperatura das duas lavagens de 30 minutos finais em 0,2 χ SSC, SDS a0,5%, que é aumentada para 609 C. Outro conjunto de condições altamenteestringentes usa duas lavagens finais em 0,1 χ SSC, SDS a 0,1% a 659 C.Outro exemplo de condições de hibridização estringentes é hibridização a50- C ou mais e 0,1 χ SSC (cloreto de sódio a 15 mM/citrato de sódio a 1,5mM). Outro exemplo de condições de hibridização estringentes é incubaçãoda noite para o dia a 42- C em uma solução: formamida a 50%, 5 χ SSC(NaCI a 150 mM, citrato de trissódio a 15 mM), fosfato de sódio a 50 mM (pH7,6), 5 χ solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10% e 20 pg/ml de DNAde esperma de salmão cisalhado, desnaturado, seguido por lavagem dosfiltros em 0,1 χ SSC em cerca de 659 C. condições de hibridização estringen-tes e condições de lavagem de pós-hibridização são condições de hibridiza-ção e condições de lavagem de pós-hibridização que são pelo menos tãoestringentes quanto as condições representativas acima.

A hibridização requer que os dois ácidos nucléicos contenhamseqüências complementares, embora dependendo da estringência da hibri-dização, divergências entre bases são possíveis. A estringência apropriadapara hibridização de ácidos nucléicos depende do comprimento dos ácidosnucléicos e do grau de complementação, variáveis bem-conhecidas na téc-nica. Quanto maior o grau de similaridade ou homologia entre duas seqüên-cias de nucleotídeo, maior o valor da temperatura de fusão (Tm) para híbri-dos de ácidos nucléicos tendo essas seqüências. A estabilidade relativa(correspondendo à Tm maior) de hibridizações de ácido nucléico diminui naseguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos maiores doque 100 nucleotídeos de comprimento, equações para cálculo da Tm foramderivadas (vide Sambrook e outros, supra, 9.50-9.51). Para hibridizaçõescom ácidos nucléicos mais curtos, isto é, oligonucleotídeos, a posição dasdivergências se torna mais importante, e o comprimento do oligonucleotídeodetermina sua especificidade (vide Sambrook e outros, supra, 11.7-11.8).Tipicamente, o comprimento para um ácido nucléico hibridizável é pelo me-nos cerca de 10 nucleotídeos. Comprimentos mínimos ilustrativos para umácido nucléico hibridizável são: pelo menos cerca de 15 nucleotídeos; pelomenos cerca de 20 nucleotídeos; e pelo menos cerca de 30 nucleotídeos.Ainda, o versado na técnica vai reconhecer que a temperatura e a concen-tração de sal da solução de lavagem podem ser ajustadas conforme neces-sário de acordo com fatores tal como comprimento da sonda.

O termo "substituição de aminoácido conservativa" refere-se àintercomutabilidade em proteínas de resíduos de aminoácido tendo cadeiaslaterais similares. Por exemplo, um grupo de aminoácidos tendo cadeias la-terais alifáticas consiste em glicina, alanina, valina, Ieucina e isoleucina; umgrupo de aminoácidos tendo cadeias laterais alifáticas-hidroxila consiste emserina e treonina; um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais contendoamida consiste em asparagina e glutamina; um grupo de aminoácido tendocadeias laterais aromáticas consiste em fenilalanina, tirosina e triptofano; umgrupo de aminoácidos tendo cadeias laterais básicas consiste em lisina, ar-ginina e histidina; e um grupo de aminoácidos tendo cadeias laterais conten-do enxofre consiste em cisteína e metionina. Grupos de substituição de ami-noácidos conservativa exemplares são: valina-leucina-isoleucina, fenilalani-na-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina.

"Ácidos nucléicos sintéticos" podem ser montados a partir deblocos de formação de oligonucleotídeo que são quimicamente sintetizadosusando procedimentos conhecidos daqueles versados na técnica. Essesblocos de formação são ligados e anelados para formar segmentos de geneque são então enzimaticamente montados para construir o gene todo. "Qui-micamente sintetizado", conforme relacionado a uma seqüência de DNA,significa que os nucleotídeos componentes foram montados in vitro. Síntesequímica manual de DNA pode ser realizada usando procedimentos bem es-tabelecidos, ou síntese química automatizada pode ser realizada usandouma de várias máquinas comercialmente disponíveis. A seqüência de nucle-otídeo dos ácidos nucléicos pode ser modificada para expressão ótima combase na otimização de seqüência de nucleotídeo para refletir o codon biasda célula hospedeira. O versado na técnica compreende a probabilidade deexpressão bem sucedida se o uso do códon for inclinado àqueles códonsfavorecidos pelo hospedeiro. Determinação de códons preferidos pode serbaseada em uma pesquisa de genes derivados da célula hospedeira ondeinformação de seqüência está disponível.

Um polinucleotídeo ou polipeptídeo tem uma certa "identidadede seqüência" com um outro polinucleotídeo ou polipeptídeo significandoque, quando alinhados, aquela porcentagem de bases ou aminoácidos é amesma, e na mesma posição relativa, quando comparando as duas seqüên-cias. Similaridade de seqüência pode ser determinada de várias maneirasdiferentes. Para determinar a identidade de seqüência, seqüências podemser alinhadas usando os métodos e programas de computador, incluindoBLAST, disponível em todo o mundo na web em ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.Vide, por exemplo, Altschul e outros (1990), J. Mol. Biol., 215:403-10. Outroalgoritmo de alinhamento é FASTA, disponível no pacote Genetics Compu-ting Group (GCG), da Madison, Wisconsin, USA, um subsidiária de proprie-dade integral do Oxford Molecular Group, Inc. Outras técnicas para alinha-mento são descritas em Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Me-thods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), Ed. Doolittle, AcademicPress, Inc., uma divisão da Harcout Brace & Co., San Diego, Califórnia,USA. De interesse particular são programas de alinhamento que permitemlacunas na seqüência. O Smith-Waterman é um tipo de algoritmo que permi-te lacunas nos alinhamentos de seqüência. Vide Meth. Mol. Biol., 70:173-187(1997). Também, o programa GAP usando o método de alinhamento Nee-dlemann and Wunsch pode ser utilizado para alinhar seqüências. Vide J.Mol Biol., 48:443-453 (1970).

Antes da presente invenção ser descrita mais, deve ser compre-endido que a presente invenção não é limitada às modalidades particularesdescritas, uma vez que tais podem, com certeza, variar. Deve ser tambémcompreendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de descri-ção de modalidades particulares apenas, e não pretende ser limitante, umavez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindi-cações apensas.

Onde uma faixa de valores for provida, é compreendido que ca-da valor interveniente, ao décimo da unidade do limite menor a menos que ocontexto dite claramente o contrário, entre os limites superior e inferior da-quela faixa e qualquer outro valor declarado ou interveniente naquela faixadeclarada, é compreendido na invenção. Os limites superior e inferior dessasfaixas menores podem ser independentemente incluídos nas faixas meno-res, e são também compreendidos na invenção, sujeitos a qualquer limiteespecificamente excluído na faixa declarada. Onde a faixa declarada incluirum ou ambos limites, faixas excluindo um ou ambos daqueles limites incluí-dos são também incluídas na invenção.

A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos ecientíficos usados aqui têm o mesmo significado conforme geralmente com-preendido por uma pessoa versada na técnica à qual a presente invençãopertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentesàqueles descritos aqui possam ser também usados na prática ou teste dapresente invenção, os métodos e materiais preferidos são agora descritos.Todas as publicações mencionadas aqui são incorporadas aqui a título dereferência para revelar e descrever os métodos e/ou materiais em conexãocom os quais as publicações são citadas.

Deve ser notado que conforme aqui usado e nas reivindicaçõesapensas, as formas singulares "um, uma", "e" e "o, a" incluem referentes noplural a menos que o contexto dite claramente de outro modo. Então, porexemplo, referência a uma "célula hospedeira geneticamente modificada"inclui uma pluralidade de tais células hospedeiras geneticamente modifica-das e referência ao "composto isoprenóide" inclui referência a um ou maiscompostos isoprenóide e seus equivalentes conhecidos daqueles versadosna técnica, e assim por diante. É ainda notado que as reivindicações podemser delineadas para excluir qualquer elemento opcional. Deste modo, a pre-sente declaração pretende servir como uma base antecedente para uso detal terminologia exclusiva como "apenas", só" e similar em conexão com arecitação de elementos da reivindicação, ou uso de uma limitação "negati-va".

As publicações discutidas aqui são providas apenas pela suadescrição antes da data do depósito do presente pedido de patente. Nadaaqui deve ser considerado como uma admissão de que a presente invençãonão é intitulada para antedatar tal publicação em virtude da invenção anteri-or. Ainda, as datas de publicação providas podem ser diferentes das datasde publicação reais que podem precisar ser independentemente confirma-das.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção provê células hospedeiras eucarióticas ge-neticamente modificadas que exibem níveis de atividade aumentados deuma ou mais enzimas que geram precursores a serem utilizados pelas en-zimas da via do mevalonato, níveis de atividade aumentados de uma oumais enzimas da via do mevalonato, níveis aumentados de atividade de pre-nil transferase e/ou níveis diminuídos de atividade de esqualeno sintase; taiscélulas são úteis para produção de compostos isoprenóides. Em um aspec-to, a presente invenção provê células hospedeiras eucarióticas geneticamen-te modificadas que exibem níveis de atividade aumentados de uma ou maisenzimas da vida do mevalonato, níveis aumentados de atividade de preniltransferase e níveis diminuídos de atividade de esqualeno sintase; tais célu-las são úteis para produção de compostos isoprenóides. A presente inven-ção provê células hospedeiras eucarióticas geneticamente modificadas queproduzem níveis mais altos de acetil-CoA do que uma célula controle; taiscélulas são úteis para produção de uma variedade de produtos, incluindocompostos isoprenóides. São providos métodos para a produção de umcomposto isoprenóide ou um precursor de isoprenóide em uma célula hos-pedeira eucariótica geneticamente modificada objeto. Os métodos geralmen-te envolvem cultura de uma célula hospedeira geneticamente modificadaobjeto sob condições que promovem a produção de níveis altos de um iso-prenóide ou composto precursor de isoprenóide.

As vias de esterol e mevalonato de S. cerevisiae são mostradasesquematicamente na figura 1 e na figura 2 (note que amorfadieno sintase(ADS) na figura 2 não é normalmente expressa em S. cerevisiae genetica-mente não-modificada). Esta via é típica de uma ampla variedade de célulaseucarióticas. FPP é convertido em esqualeno pela esqualeno sintase(ERG9). Esqualeno é convertido em ergosterol em etapas subseqüentes.Em células não-modificadas, muito do fluxo metabólico direciona FPP emdireção à síntese de esterol. Em uma célula hospedeira eucariótica geneti-camente modificada objeto, o fluxo metabólico é redirecionado em direção àprodução maior dos precursores de isoprenóide IPP e FPP.

Células Hospedeiras Geneticamente Modificadas

A presente invenção provê células hospedeiras eucarióticas ge-neticamente modificadas que exibem níveis de atividade aumentados deuma ou mais enzimas da via do mevalonato, níveis aumentados de atividadede prenil transferase e níveis diminuídos de atividade de esqualeno sintase;tais células são úteis para produção de compostos isoprenóides. A presenteinvenção provê células hospedeiras eucarióticas geneticamente modificadasque produzem níveis mais altos de acetil-CoA do que uma célula controle;tais células são úteis para produção de uma variedade de produtos, incluin-do compostos isoprenóides.

Células hospedeiras geneticamente modificadas aue exibem níveis de ativi-dade aumentados de uma ou mais enzimas da via do mevalonato de ativi-dade de prenil transferase e níveis diminuídos de atividade de esqualenosintase

A presente invenção provê células hospedeiras eucarióticas ge-neticamente modificadas, células que compreendem uma ou mais modifica-ções genéticas que provêem produção aumentada de isoprenóide ou com-postos precursores de isoprenóide. Comparado com célula hospedeira con-trole não-geneticamente modificada de acordo com a presente invenção,uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto exibe as caracterís-ticas que seguem: níveis de atividade aumentados de uma ou mais enzimasda via do mevalonato; níveis aumentados de atividade de prenil transferase;e níveis diminuídos de atividade de esqualeno sintase.

Níveis de atividade aumentados de uma ou mais enzimas da viado mevalonato, níveis aumentados de atividade de prenil transferase e ní-veis diminuídos de atividade de esqualeno sintase aumentam a produção deisoprenóide e precursor de isoprenóide por uma célula hospedeira geneti-camente modificada. Deste modo, em algumas modalidades, uma célulahospedeira geneticamente modificada objeto exibe aumentos em produçãode isoprenóide ou precursores de isoprenóide, onde isoprenóide ou produ-ção de precursor de isoprenóide é aumentada em pelo menos cerca de 10%,pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cer-ca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo me-nos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca dê 80%,pelo menos cerca de 90% pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cercade 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes,pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menoscerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes,pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo me-nos cerca de 500 vezes ou pelo menos cerca de 103 vezes, ou mais, na cé-lula hospedeira geneticamente modificada, comparado com o nível de pre-cursor de isoprenóide ou composto de isoprenóide produzido em uma célulahospedeira controle que não é geneticamente modificada conforme aquidescrito. Produção de isoprenóide ou precursor de isoprenóide é prontamen-te determinada usando métodos bem-conhecidos, por exemplo, cromatogra-fia de gás-espectrometria de massa, cromatografia líquida-espectrometria demassa, cromatografia de ferro-espectrometria de massa, detecção amperométrica pulsada, espectrometria uv-vis e similar.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamen-te modificada objeto provê produção aumentada de isoprenóide ou precursorde isoprenóide por célula, por exemplo, a quantidade de isoprenóide oucomposto precursor de isoprenóide produzida usando um método objeto épelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de20%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cer-ca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo me-nos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%,pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% pelo menos cerca de 2vezes, pelo menos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelomenos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cercade 30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes,pelo menos cerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menoscerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de400 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes ou 103 vezes, ou mais, maior doque a quantidade do composto isoprenóide ou precursor de isoprenóide pro-duzido pela célula hospedeira que não é geneticamente modificada pelosmétodos objeto, em uma base por célula. A quantidade de célula é medidaatravés da medição de peso de célula seco ou medição da densidade ópticada cultura de célula.

Em outras modalidades, uma célula hospedeira objeto geneti-camente modificada para produção aumentada de isoprenóide ou precursorisoprenóide por volume unitário de cultura de célula, por exemplo, a quanti-dade de composto isoprenóide ou precursor de isoprenóide produzida usan-do uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é pelo menoscerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelomenos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%,pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cer-ca de 80%, pelo menos cerca de 90% pelo menos cerca de 2 vezes, pelomenos cerca de 2,5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cercade 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes,pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menoscerca de 75 vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de200 vezes, pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes,pelo menos cerca de 500 vezes ou pelo menos cerca de 103 vezes, ou mais,maior do que a quantidade do composto isoprenóide ou precursor de isopre-nóide produzida por uma célula hospedeira que não é geneticamente modifi-cada pelos métodos objeto, em um volume por unidade de base de culturade célula.

Em algumas modalidades, um hospedeiro eucariótico geneticamentemodificado objeto produz um composto isoprenóide ou precursor de isopre-nóide em uma quantidade variando de a partir de 1 pg de composto isopre-nóide/ml a 100.000 pg de composto isoprenóide/ml, por exemplo, de a partirde cerca de 1 pg/ml a cerca de 100.000 pg/ml de composto isoprenóide, 1pg/lm a 5000 pg/ml de composto isoprenóide, 1 pg/ml a 4500 pg/ml de com-posto isoprenóide, 1 Mg/ml a 4000 μ g/m I de composto isoprenóide, 1 pg/ml to3500 pg/rnl de composto isoprenóide, 1 pg/ml a 3000 pg/ml de compostoisoprenóide, 1 Mg/ml a 2500 pg/ml de composto isoprenóide, 1 pg/ml a 2000Mg/ml de composto isoprenóide, 1 pg/ml a 1500 pg/ml de composto isopre-nóide, 1 pg/ml a 1000 pg/ml de composto isoprenóide, 5 pg/ml a 5000 pg/mlde composto isoprenóide, 10 Mg/ml a 5000 pg/ml de composto isoprenóide,20 pg/ml a 5000 pg/ml de composto isoprenóide, 30 pg/ml a 1000 pg/ml decomposto isoprenóide, 40 pg/ml a 500 pg/ml de composto isoprenóide, 50pg/ml a 300 pg/ml de composto isoprenóide, 60 pg/ml a 100 pg/ml de com-posto isoprenóide, 70 pg/ml a 80 pg/ml de composto isoprenóide, de a partirde cerca de 1 pg/ml a cerca de 1.000 pg/ml, de a partir de cerca de 1.000pg/ml a cerca de 2.000 pg/ml, de a partir de cerca de 2.000 pg/ml a cerca de3.000 pg/ml, de a partir de cerca de 3.000 pg/ml a cerca de 4.000 pg/ml, dea partir de cerca de 4.000 pg/ml a cerca de 5.000 pg/ml, de a partir de cercade 5.000 pg/ml a cerca de 7.500 pg/ml ou de a partir de cerca de 7.500pg/ml a cerca de 10.000 pg/ml ou maior do que 10.000 pg/ml de compostoisoprenóide, por exemplo, de a partir de cerca de 10 mg de composto iso-prenóide/ml a cerca de 20 mg de composto isoprenóide/ml, de a partir decerca de 20 mg de composto isoprenóide/ml a cerca de 50 mg de compostoisoprenóide/ml, de a partir de cerca de 50 mg de composto isoprenóide/ml acerca de 100 mg de composto isoprenóide/ml ou mais.

Os métodos objeto podem ser usados em uma variedade de tipos di-ferentes de células hospedeiras eucarióticas. Células hospedeiras são, emmuitas modalidades, organismos unicelulares ou são cultivadas em culturacomo células únicas. Células hospedeiras eucarióticas adequadas incluem,mas não estão limitadas a, células de levedura, células de inseto, células deplanta, células fúngicas e células de alga. Células hospedeiras eucarióticasadequadas incluem, mas não estão limitadas a, Pichia pastoris, Pichia fin-iandica, Pichia trehaiophiia, Pichia koelamae, Piehia membranaefaeiens, Pi-ehia opuntiae, Piehia thermotolerans, Piehia saiietaria, Piehia guereuum, Pi-chia pijperi, Piehia stiptis, Piehia methanoliea, Piehia sp., Saccharomyeeseerevisiae, Saccharomyees sp., Hansenuia poiymorpha, Kiuyveromyees sp.,Kiuyveromyees iaetis, Candida aibieans, Aspergillus niduians, Aspergillusniger, Aspergillus oryzae, Triehoderma reesei, Chrysosporium lueknowense,Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum, Neurospora eras-sa, Chlamydomonas reinhardtii e similar. Em algumas modalidades, a célulahospedeira é uma célula eucariótica que não uma célula de planta. Em al-gumas modalidades, a célula hospedeira geneticamente modificada objeto éuma célula de levedura. Em uma modalidade particular, a célula de leveduraé Saccharomyees eerevisiae.

Em uma modalidade exemplar, a via metabólica de Saeeha-romyees eerevisiae é engenheirada para produzir sesquiterpenos a partir dedifosfato de farnesila. Em tal sesquiterpeno, o amorfadieno é um precursorpara o fármaco antimalária artemisinina. Amorfadieno, ciclizado a partir dedifosfato de farnesila, pode ser usado como um ensaio para níveis de pre-cursor de isoprenóide.

Em uma modalidade exemplar, níveis de atividade de HMGR,uma prenil transferase, Ecm22p e Upc2p são aumentados e os níveis deatividade de esqualeno sintase são diminuídos. 3-Hidróxi-3-metilglutaril co-enzima A redutase (HMGR) e uma prenil transferase, por exemplo, farnesildifosfato sintase (FPPS), catalisam reações de base genética estreita emuma via de síntese de amorfadieno. Atividade alta de HMGR e uma preniltransferase, por exemplo, FPPS, supera esses de base genética estreita.

Dois fatores de transcrição, Ecm22p e Upc2p, são importantes em regulaçãode síntese de esterol. Cada um desses dois fatores é mutado em um únicoaminoácido próximo aos terminais C, mutação que aumenta a atividade decada fator. Esqualeno sintase catalisa a reação de farnesil difosfato em es-qualeno na via de síntese de esterol indesejada. Deste modo, para maximi-zar grupos precursores e prevenir fluxo indevido de esteróis, transcrição deEGR9 foi limitada.

Nível aumentado de atividade de uma ou mais enzimas da via do mevalonato

A via do mevalonato compreende enzimas que catalisam as eta-pas que seguem: (a) condensação de duas moléculas de acetil-CoA em ace-toacetil-CoA, tipicamente através da ação de acetoacetil-CoA tiolase; (b)condensação de acetoacetil-CoA com acetil-CoA para formar HMG-CoA1tipicamente através da ação de HMG sintase (HMGS); (c) conversão deHMG-CoA em mevalonato, tipicamente através da ação de HMGR; (d) fosfo-rilação de mevalonato em mevalonato 5-fosfato, tipicamente através da açãode mevalonato sintase (MK); (e) conversão de mevalonato 5-fosfato em me-valonato 5-pirofosfato, tipicamente através da ação de fosfomevalonato ci-nase (PMK); e (f) conversão de mevalonato 5-pirofosfato em isopentenil piro-fosfato, tipicamente através da ação de mevalonato pirofosfato descarboxilase (MPD).

Uma célula hospedeira eucariótica geneticamente modificadaobjeto compreende uma ou mais modificações genéticas resultando em umou mais do que segue: nível aumentado de atividade de HMGS; nível au-mentado de atividade de HMGR; nível aumentado de atividade de MK; nívelaumentado de atividade de PMK; e nível aumentado de atividade de MPD.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamen-te modificada objeto é geneticamente modificada de modo que o nível deatividade de uma ou mais enzimas da via do mevalonato é aumentado. Onível de atividade de uma ou mais enzimas da via do mevalonato em umacélula hospedeira geneticamente modificada objeto pode ser aumentado devárias maneiras, incluindo, mas não limitado a, 1) aumento da resistência depromotor do promotor ao qual a região de codificação da enzima da via domevalonato é operavelmente ligada; 2) aumento do número de cópia doplasmídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando a en-zima da via do mevalonato; 3) aumento da estabilidade de um RNA da en-zima da via do mevalonato (onde "um mRNA de enzima da via do mevalona-to" é um mRNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificandoa enzima da via do mevalonato); 4) modificação da seqüência do sítio deligação de ribossomo de um mRNA da enzima da via do mevalonato de mo-do que o nível de tradução do mRNA da enzima da via do mevalonato é au-mentado; 5) modificação das seqüências entre o sítio de ligação de ribosso-mo de um mRNA da enzima da via do mevalonato e o códon de início daseqüência de codificação da enzima da via do mevalonato de modo que onível de tradução do mRNA da enzima da via do mevalonato é aumentado;6) modificação de toda a região intercistrônica 5' do códon de início da regi-ão de codificação da enzima da via do mevalonato de modo que a traduçãodo mRNA da enzima da via do mevalonato é aumentada; 7) modificação douso do códon da enzima da via do mevalonato de modo que o nível de tra-dução do mRNA da enzima da via do mevalonato é aumentado, 8) expres-são de tRNAs de códon raros usados na enzima da via do mevalonato demodo que o nível de tradução do mRNA da enzima da via do mevalonato éaumentado; 9) aumento da estabilidade de enzima da enzima da via do me-valonato; 10) aumento da atividade específica (atividade de unidades porproteína unitária) da enzima da via do mevalonato; 11) expressão de umaforma modificada da enzima da via do mevalonato de modo que a enzimamodificada exibe solubilidade aumentada na célula hospedeira; ou 12) ex-pressão de uma forma modificada de uma enzima da via do mevalonato demodo que a enzima modificada não tem um domínio através do qual regula-gem acontece. As modificações acima podem ser feitas sozinhas ou emcombinação; por exemplo, duas ou mais das modificações acima podem serfeitas para prover um nível aumentado da atividade da enzima da via do me-valonato.

A enzima HMG-CoA redutase (HMGR) catalisa uma reação irre-versível que reduz 3-hidróxi-3-metilglutaril co-enzima A (HMG-CoA) em me-valonato. Esta etapa é a etapa comprometida em via de biossíntese de este-rol. Deste modo, HMGR é um ponto principal de regulagem em organismosque utilizam a via do mevalonato para produzir isoprenóides.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamen-te modificada objeto é geneticamente modificada de modo que o nível deatividade de HMGR é aumentado. O nível de atividade de HMGR na célulahospedeira geneticamente modificada pode ser aumentado de várias manei-ras, incluindo, mas não limitado a, 1) aumento de resistência do promotor aoqual a região de codificação de HMGR é operavelmente ligada; 2) aumentodo número de cópia do plasmídeo compreendendo uma seqüência de nu-cleotídeo codificando HMGR; 3) aumento da estabilidade de um mRNA deHMGR (onde um "mRNA de HMGR" é um mRNA compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo codificando HMGR); 4) modificação da seqüência dosítio de ligação de ribossomo de um mRNA de HMGR de modo que o nívelde tradução de mRNA de HMGR é aumentado; 5) modificação da seqüênciaentre o sítio de ligação de ribossomo de um mRNA de HMGR e o códon deinício da seqüência de codificação de HMGR de modo que o nível de tradu-ção do mRNA de HMGR é aumentado; 6) modificação de toda a região in-tercistrônica 5' do códon de início da região de codificação de HMGR demodo que a tradução do mRNA de HMGR é aumentada; 7) modificação douso do códon de HMGR de modo que o nível de tradução do mRNA de HM-GR é aumentado; 8) expressão de tRNAs de códon raros usados em HMGRde modo que o nível de tradução do mRNA de HMGR é aumentado; 9) au-mento da estabilidade de enzima da HMGR; ou 11) truncamento da HMGRpara remover um elemento regulador negativo. As modificações acima po-dem ser feitas sozinhas ou em combinação, por exemplo, duas ou mais dasmodificações acima podem ser feitas para prover um nível aumentado deatividade de HMGR.

Em muitas modalidades, o nível de HMGR é aumentado modifi-cando geneticamente uma célula hospedeira eucariótica de modo que elaproduz uma forma truncada de HMGR (tHMGR), forma truncada que temuma atividade enzimática aumentada com relação à HMGR do tipo selva-gem. tHMGR não tem um domínio de extensão de membrana e é então so-lúvel e não tem a inibição de feedback da HMGR. tHMGR retém sua regiãoC-terminal catalítica, e então retém a atividade da HMGR. Em algumas mo-dalidades, a HMGR truncada tem a seqüência de aminoácido mostrada nasfiguras 7A e 7B (SEQ ID NO:2). Em algumas modalidades, a HMGR trunca-da é codificada por um ácido nucléico compreendendo a seqüência de nu-cleotídeo mostrada na figura 6 (SEQ ID NO:1).

Em algumas modalidades, o nível de atividade de uma ou maisHMGS1 MK e PMK é aumentado. Em S. cerevisiae, os genes codificandoHMGS (ERG13), MK (ERG12) e PMK (ERG8) compreendem um elementoregulador de esterol que se liga a fatores de transcrição Ecm22p e Upc2p,onde, quando da ligação de Ecm22p e Upc2p, transcrição é ativada. Em al-gumas modalidades, o nível de atividade de uma ou mais HMGS, MK e PMKé aumentado através do aumento da atividade de Ecm22p e Upc2p. Vik eoutros (2001) MoL Cell Biol. 19:6395-405.

Normalmente S. cerevisiae não captura esteróis do ambientesob condições aeróbicas. Lewis e outros (1998 VeasM:93-106) isolaram ummutante de levedura, upc2-1 (controle de absorção), que resultou em absor-ção de esterol aeróbica. O alelo upc2-1 compreende uma transição de gua-nina para adenina na estrutura de leitura aberta designada YDR213W nocromossomo IV. Crowley e outros (1998) J. Bacteriol. 16:4177-4183. A se-qüência de ácido nucléico do tipo selvagem Upc2 é conhecida e pode serobtida através do N- de Acesso no GenBank Z68194. Este alelo do tipo sel-vagem é anotado como coordenadas 889746-892487 no cromossomo de S.cerevisiae. Conforme anteriormente verificado por Lewis e outros, sob condi-ções nativas o nível de absorção de esterol era 10 a 20 vezes maior do queo tipo selvagem isogênico. O mutante resultou em uma produção de ergoste-rol aumentada.

A mudança de aminoácido única próximo ao terminal C dos fato-res de transcrição Upc2p e Ecm22p foi mostrada aumentar a sua atividade.Em muitas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modificadaobjeto é geneticamente modificada de modo que Upc2p compreende umasubstituição de glicina-em-ácido aspártico no aminoácido 888; e Ecm22pcompreende uma substituição de glicina-em-ácido aspártico no aminoácido790.

Nível aumentado de atividade de preniltransferase

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucarióticageneticamente modificada objeto é geneticamente modificada de modo queo nível de atividade de geranil difosfato sintase (GPPS) e/ou farnesil difosfa-to sintase (FPPS) é aumentado.

A enzima difosfato de farnesila sintase (FPPS) catalisa uma rea-ção que converte geranil difosfato (GPP) em difosfato de farnesila (FPP).Esta etapa foi também mostrada ser Iimitante de taxa na via do mevalonato.Deste modo, FPPS é um ponto de regulagem em organismos que utilizamnaturalmente a via do mevalonato para produzir isoprenóides. Deste modo, epara facilidade de descrição adicional, níveis de modulação de atividade deuma prenil transferase são discutidos em termos de modulação do nível deatividade de FPPS.

Em algumas modalidades, o nível de atividade de FPPS é au-mentado. O nível de atividade de FPPS em uma célula hospedeira geneti-camente modificada pode ser aumentado de várias maneiras, incluindo, masnão limitado a, 1) aumento da resistência de promotor do promotor ao qual aregião de codificação de FPPS está operavelmente ligada; 2) aumento donúmero de cópia do plasmídeo compreendendo uma seqüência de nucleotí-deo codificando FPPS; 3) aumento da estabilidade de um mRNA de FPPS(onde um "mRNA de FPPS" é um mRNA compreendendo uma seqüência denucleotídeo codificando FPPS); 4) modificação da seqüência do sítio de liga-ção de ribossomo de um mRNA de FPPS de modo que o nível de traduçãodo mRNA de FPPS é aumentado; 5) modificação da seqüência entre o sítiode ligação de ribossomo de um mRNA de FPPS e o códon de início da se-qüência de codificação de FPPS de modo que o nível de tradução do mRNAde FPPS é aumentado; 6) modificação de toda a região intercistrônica 5' docódon de início da região de codificação de FPPS de modo que a traduçãodo mRNA de FPPS é aumentada; 7) modificação do uso do códon de FPPSde modo que o nível de tradução do mRNA de FPPS é aumentado, 8) ex-pressão de tRNAs de códon raros em FPPS de modo que o nível de tradu-ção do mRNA de FPPS é aumentado; 9) aumento da estabilidade da enzimade FPPS; ou 10) aumento da atividade específica (atividade de unidades porproteína unitária) de FPPS. As modificações acima podem ser feitas sozi-nhas ou em combinação, por exemplo, duas ou mais das modificações aci-ma podem ser feitas para proverem um nível aumentado de atividade deFPPS.

Nível diminuído de atividade de esgualeno sintase

A enzima esqualeno sintase catalisa uma reação que convertedifosfato de farnesila em esqualeno. Esta etapa é a primeira etapa no cursoque leva de difosfato de farnesila a ergosterol. Deste modo, limitando a açãodesta enzima, FPPS é desviado para vias de produção de terpenóide utili-zando, por exemplo, terpeno sintases ou GGPP sintase e subseqüentes ter-penos sintases.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamen-te modificada objeto é geneticamente modificada de modo que o nível deatividade de esqualeno sintase é diminuído. O nível de atividade de esqua-leno sintase na célula hospedeira geneticamente modificada pode ser dimi-nuído de várias maneiras, incluindo, mas não limitado a, 1) diminuição deresistência de promotor do promotor ao qual a região de codificação de es-qualeno sintase está operavelmente ligada; 2) diminuição da estabilidade deum mRNA de esqualeno sintase (onde um "mRNA de esqualeno sintase" éum mRNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando es-qualeno sintase); 3) modificação da seqüência do sítio de ligação de ribos-somo de um mRNA de esqualeno sintase de modo que o nível de traduçãodo mRNA de esqualeno sintase é diminuído; 4) modificação da seqüênciaentre o sítio de ligação de ribossomo de um mRNA de esqualeno sintase e ocódon de início da seqüência de codificação de esqualeno sintase de modoque o nível de tradução do mRNA de esqualeno sintase é diminuído; 5) mo-dificação de toda a região intercistrônica 5' do códon de início da região decodificação de esqualeno sintase de modo que a tradução do mRNA de es-qualeno sintase é diminuída; 6) modificação do uso do códon de esqualenosintase de modo que o nível de tradução do mRNA de esqualeno sintase édiminuído, 7) diminuição da estabilidade de enzima da esqualeno sintase; 8)diminuição da atividade específica (atividade de unidades por proteína unitá-ria) de esqualeno sintase ou 9) uso de um promotor quimicamente repressí-vel e repressão do promotor quimicamente repressível através da adição deum agente químico a um meio de crescimento. As modificações acima po-dem ser feitas sozinhas ou em combinação; por exemplo, duas ou mais dasmodificações acima podem ser feitas para prover um nível diminuído de ati-vidade de esqualeno sintase.

Em uma modalidade exemplar, a atividade de esqualenosintaseem S. cerevisiae foi reduzida ou eliminada. Mutantes de ERG9 de leveduraque são incapazes de converter mevalonato em esqualeno foram produzi-dos. Vide, por exemplo, Karst e outros (1977) Molec. Gen. Genet. 154:269-277; Patente U.S. Ne 5.589.372; e Publicação de Patente U.S. N92004/0110257. Modificações genéticas incluem diminuição da atividade deesqualeno sintase através do bloqueio ou redução da produção de esquale-no sintase, redução da atividade de esqualeno sintase ou através da inibiçãoda atividade de esqualeno sintase. Bloqueio ou redução de produção de es-qualeno sintase pode incluir colocação do gene de esqualeno sintase sob ocontrole de um promotor que requer a presença de um composto de induçãono meio de crescimento. Através do estabelecimento de condições de modoque o indutor seja depletado do meio, a expressão de esqualeno sintase po-de ser desativada. Alguns promotores são desativados pela presença de umcomposto de repressão. Por exemplo, os promotores dos genes CTR3 eCTR1 de levedura podem ser reprimidos através da adição de cobre. Blo-queio ou redução da atividade de esqualeno sintase pode incluir tecnologiade excisão similar àquela descrita na Patente U.S. N9 4.743.546, incorpora-da aqui a título de referência. Nesta modalidade, o gene ERG9 é clonadoentre seqüências genéticas específicas que permitem excisão controlada,específica, do gene ERG9 a partir do genoma. A excisão poderia ser estimu-Iada por, por exemplo, uma mudança na temperatura de cultivo da cultura,como na Patente U.S. N2 4.743.546, ou por algum outro sinal físico ou nutri-cional. Tal modificação genética inclui qualquer tipo de modificação e especi-ficamente inclui modificações feitas através de tecnologia recombinante eatravés de mutagênese clássica. Inibidores de esqualeno sintase são co-nhecidos (vide Patente U.S. № 4.871.721 e as referências citadas na Paten-te U.S. № 5.475.029) e podem ser adicionados a culturas de célula.

Em algumas modalidades, o uso do códon de uma seqüência decodificação de esqualeno sintase é modificado de modo que o nível de tra-dução do mRNA de ERG9 é diminuído. Redução do nível de tradução demRNA de ERG9 através da modificação do uso do códon é conseguida a-través da modificação da seqüência para incluir códons que são raros ounão geralmente usados pela célula hospedeira. Tabelas de uso de códonpara muitos organismos estão disponíveis, as quais sumarizam a porcenta-gem de tempo que um organismo específico usa um códon específico paracodificar um aminoácido. Certos códons são usados mais freqüentemente doque outros, códons "raros". O uso de códons "raros" em uma seqüência ge-ralmente diminui sua taxa de tradução. Deste modo, por exemplo, a seqüên-cia de modificação é modificada através da introdução de um ou mais có-dons raros, que afetam a taxa de tradução, mas não a seqüência de amino-ácido da enzima traduzida. Por exemplo, existem 6 códons que codificamarginina: CGT, CGC, CGA, CGG, AGA e AGG. Em E. coli os códons CGT eCGC são usados muito mais freqüente (codificando aproximadamente 40%das argininas em E. coli cada) do que o códon AGG (codificando aproxima-damente 2% das argininas em E. coli). Modificação de um códon CGT den-tro da seqüência de um gene para um códon AGG não mudaria a seqüênciada enzima, mas provavelmente mudaria a taxa de tradução do gene.

Estabilidade de plasmídeo aumentadaEm algumas modalidades, um construto de expressão (um "ve-tor de expressão") ou outro ácido nucléico usado para modificar genetica-mente uma célula hospedeira, para gerar uma célula hospedeira genetica-mente modificada objeto, exibe estabilidade aumentada na célula hospedei-ra. Estabilidade aumentada eleva o nível de um produto de gene codificado(por exemplo, uma enzima da via do mevalonato). Em algumas modalida-des, um construto de expressão compreende um gene LEU2 defeituoso, on-de o defeito no gene LEU2 confere estabilidade aumentada no construto deexpressão na célula hospedeira. Em algumas modalidades, um construto deexpressão compreende um alelo Ieu2-d, conforme descrito no Exemplo 3."Estabilidade de plasmídeo aumentada" na célula hospedeira geneticamentemodificada refere-se a um aumento em retenção do plasmídeo ao longo dotempo em cultura, comparado com o mesmo plasmídeo compreendendo ogene LEU2 do tipo selvagem. O gene LEU2, e defeitos do gene LEU2 queconferem estabilidade aumentada, foram descritos na literatura. Vide, porexemplo, Erhart e C.P. Hollenberg (1983). A presença de um gene LEU2defeituoso em plasmídeos recombinantes de DNA 2mu de Saccharomyceseerevisiae é responsável pela cura e número de cópia alto. J. BacterioL156(2):625-635.

Geração de uma célula hospedeira geneticamente modificada

Uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é gera-da usando métodos padrão bem-conhecidos daqueles versados na técnica.Em algumas modalidades, um ácido nucléico heterólogo compreendendouma seqüência de nucleotídeo codificando uma enzima da via do mevalona-to variante e/ou um ácido nucléico heterólogo compreendendo uma seqüên-cia de nucleotídeo codificando um fator de transcrição variante que controlaa transcrição de uma enzima(s) da via do mevalonato é introduzido em umacélula hospedeira e substitui todo ou uma parte de um gene endógeno, porexemplo, através de uma recombinação homóloga. Em algumas modalida-des, um ácido nucléico heterólogo é introduzido em uma célula hospedeirade origem, e o ácido nucléico heterólogo recombina com um ácido nucléicoendógeno codificando uma enzima da via do mevalonato, uma preniltransfe-rase, um fator de transcrição que controla a transcrição de uma ou mais en-zimas da via do mevalonato, ou uma esqualeno sintase, deste modo modifi-cando geneticamente a célula hospedeira de origem. Em algumas modalida-des, o ácido nucléico heterólogo compreende um promotor que tem resis-tência de promotor aumentada comparado com o promotor endógeno quecontrola a transcrição da preniltransferase endógena, e o evento recombi-nante resulta em substituição do promotor endógeno com o promotor heteró-logo. Em outras modalidades, o ácido nucléico heterólogo compreende umaseqüência de nucleotídeo codificando uma HMGR truncada que exibe ativi-dade enzimática aumentada comparado com a HMGR endógena, e o eventode recombinação resulta em substituição da seqüência de codificação deHMGR endógena com a seqüência codificando HMGR heteróloga. Em al-gumas modalidades, o ácido nucléico heterólogo compreende um promotorque provê transcrição regulada de uma seqüência de codificação de esqua-Ieno sintase operavelmente ligada e o evento de recombinação resulta emsubstituição do promotor de esqualeno sintase endógeno com o promotorheterólogo.

Células hospedeiras geneticamente modificadas que produzem níveis altosde acetil-CoA

A presente invenção provê células hospedeiras eucarióticas ge-neticamente modificadas que produzem níveis mais altos de acetil-CoA doque uma célula controle; tais células são úteis para produção de uma varie-dade de produtos, incluindo, mas não limitado a, compostos isoprenóides,policetídeos, poliidróxi alcanoatos, alcalóides, estatinas (por exemplo, Iovas-tatina), ácidos graxos e acetato. Em algumas modalidades, uma célula hos-pedeira geneticamente modificada objeto que produz uma quantidade eleva-da de acetil-CoA produz um composto isoprenóide em um nível que é maiordo que uma célula hospedeira controle. Em muitas modalidades, o compostoisoprenóide é um que é normalmente produzido pela célula hospedeira.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucarióticageneticamente modificada objeto que produz um nível de acetil-CoA que épelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de50%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo me-nos cerca de 10 vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de30 vezes, pelo menos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes,pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo me-nos cerca de 500 vezes, pelo menos cerca de 103 vezes, ou mais, maior doque o nível de acetil-CoA produzido por uma célula hospedeira controle.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucarióticageneticamente modificada objeto que produz um nível mais alto de acetil-CoA do que uma célula hospedeira controle é geneticamente modificada demodo que ela exibe um nível mais alto de atividade de acetaldeído desidro-genase (ALD) do que uma célula hospedeira controle. Por exemplo, em al-gumas modalidades, uma célula hospedeira eucariótica geneticamente mo-dificada objeto exibe um nível de atividade de ALD que é pelo menos cercade 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menoscerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10vezes, pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelomenos cerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cercade 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 500vezes, pelo menos cerca de 103 vezes, ou mais, maior do que o nível deALD exibido por uma célula hospedeira controle.

O nível de atividade de ALD em uma célula hospedeira geneti-camente modificada objeto pode ser aumentado de várias maneiras, incluin-do, mas não limitado a, 1) aumento da resistência de promotor do promotorao qual a região de codificação de ALD está operavelmente ligada; 2) au-mento do número de cópia do plasmídeo compreendendo uma seqüência denucleotídeo codificando ALD; 3) aumento da estabilidade de um mRNA deALD (onde um "mRNA de ALD" é um mRNA compreendendo uma seqüên-cia de nucleotídeo codificando ALD); 4) modificação da seqüência do sítio deligação de ribossomo de um mRNA de ALD de modo que o nível de traduçãodo mRNA de ALD é aumentado; 5) modificação da seqüência entre o sítio deligação do ribossomo de um mRNA de ALD e o códon de início da seqüênciade codificação de ALD de modo que o nível de tradução do mRNA de ALD éaumentado; 6) modificação de toda a região intercistrônica 5' do códon deinício da região de codificação de ALD de modo que a tradução do mRNA deALD é aumentada; 7) modificação do uso do códon de ALD de modo que onível de tradução do mRNA de ALD é aumentado, 8) expressão de tRNAsde códon raros usados em ALD de modo que o nível de tradução do mRNAde ALD éaumentado; 9) aumento da estabilidade da enzima de ALD; ou 10)aumento da atividade específica (atividade de unidades por proteína unitária)de ALD. As modificações acima podem ser feitas sozinhas ou em combina-ção; por exemplo, duas ou mais das modificações acima podem ser feitaspara prover um nível aumentado de atividade de ALD.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucariótica égeneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo codificando ALD, onde o ácido nucléico provê umnível aumentado de ALD na célula. Seqüências de nucleotídeo codificandoALD são conhecidas na técnica, e qualquer seqüência de nucleotídeo co-nhecida pode ser usada.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucariótica égeneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo codificando ACS, onde o ácido nucléico provê umnível aumentado de ACS na célula. Seqüências de nucleotídeo codificandoACS são conhecidas na técnica, e qualquer seqüência de nucleotídeo co-nhecida pode ser usada.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira eucarióticageneticamente modificada objeto que produz um nível mais alto de acetil-CoA do que uma célula hospedeira controle é geneticamente modificada demodo que ela exibe um nível mais alto de atividade de acetil-CoA sintetase(ACS) do que uma célula hospedeira controle. Por exemplo, em algumasmodalidades, uma célula hospedeira eucariótica geneticamente modificadaobjeto exibe um nível de atividade de ACS que é pelo menos cerca de10%,pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de2 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes, pelomenos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menos cercade 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 100 ve-zes, pelo menos cerca de 200 vezes, pelo menos cerca de 500 vezes, pelomenos cerca de 103 vezes, ou mais, maior do que o nível de ACS exibidopor uma célula hospedeira controle. Em um aspecto, um nível aumentado deatividade de ACS ou atividade de ALD é evidenciado por uma produção au-mentada de composto isoprenóide pela célula hospedeira geneticamentemodificada. Métodos para ensaio de produção de isoprenóide vão dependerdo isoprenóide específico sendo testado. Uma variedade de métodos é co-nhecida na técnica e são exemplificados aqui.

O nível de atividade de ACS em uma célula hospedeira geneti-camente modificada objeto pode ser aumentado de várias maneiras, incluin-do, mas não limitado a, 1) aumento de resistência de promotor do promotorao qual a região de codificação de ACS está operavelmente ligada; 2) au-mento do número de cópia do plasmídeo compreendendo uma seqüência denucleotídeo codificando ACS; 3) aumento da estabilidade de um mRNA deACS (onde um "mRNA de ACS" é um mRNA compreendendo uma seqüên-cia de nucleotídeo codificando ACS); 4) modificação da seqüência do sítiode ligação de ribossomo de um mRNA de ACS de modo que o nível de tra-dução do mRNA de ACS é aumentado; 5) modificação da seqüência entre osítio de ligação do ribossomo de um mRNA de ACS e o códon de início daseqüência de codificação de ACS de modo que o nível de tradução do mR-NA de ACS é aumentado; 6) modificação de toda a região intercistrônica 5'do códon de início da região de codificação de ACS de modo que a traduçãodo mRNA de ACS é aumentada; 7) modificação do uso do códon de ACS demodo que o nível de tradução do mRNA de FPPS é aumentado, 8) expres-são de tRNAs de códon raros usados em ACS de modo que o nível de tra-dução do mRNA de ACS é aumentado; 9) aumento da estabilidade da enzi-ma de ALD; ou 10) aumento da atividade específica (atividade de unidadespor proteína unitária) de ACS; 11) redução da atividade ou função de uma oumais proteínas em um sistema de modificação pós-traducional que inibe aatividade de ACS; ou 12) modificação da seqüência de aminoácido de ACSde modo que ela não seja modificada por um sistema de modificação pós-traducional que inibe a atividade de ACS. As modificações acima podem serfeitas sozinhas ou em combinação; por exemplo, duas ou mais das modifi-cações acima podem ser feitas para prover um nível aumentado de atividadede ACS.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamen-te modificada objeto é geneticamente modificada de modo que ela exibeambos um nível mais alto de atividade de ACS e um nível mais alto de ativi-dade de ALDS do que uma célula hospedeira controle.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamen-te modificada objeto é geneticamente modificada com um vetor de expres-são que compreende uma seqüência de nucleotídeo codificando ACS e/ouALD sob controle de um promotor forte. Em algumas dessas modalidades, ovetor de expressão é um vetor de expressão multicópia.

Na Salmonella enterica procariótica, ACS é pós-traducionalmente regulada através da acetilação/desacetilação do resíduoLys-609, conforme enzimaticamente mostrado na figura 15. A proteína acetiltransferase (Pat) catalisa a reação de acetilação; acetilação de ACS torna aenzima inativa. CobB, codificando a proteína desactilase Sir2 dependente deNAD+ catalisa a desacetilação de Lys-609 de ACS; remoção do grupo acetilainibidor ativa ACS. O LEU-641 de ACS de S. enterica é crítico para a acetila-ção de resíduo Lys-609. Embora a atividade de ACSL641p derivada de S. en-terica seja cerca de um terço daquela da ACS do tipo selvagem, Pat nãoacetila ACSL641p e não inibe sua atividade. As seqüências de aminoácidocircundando o sítio de acetilação são conservadas entre ACS de S. entericae ACS de S. cerevisiae, conforme mostrado na figura 16.

Em algumas modalidades, a seqüência de nucleotídeo codifi-cando ACS é modificada de modo que a ACS não é acetilada por um siste-ma de modificação pós-traducional na célula hospedeira. Em algumas moda-lidades, o códon codificando o aminoácido 707 (Leu) é modificado de modoque ele codifica um aminoácido outro que não leucina; por exemplo, a se-qüência de aminoácido IVRHLIDSVKL (SEQ ID NO:15) em ACS é modifica-da para IVRHSIDSVKL (SEQ ID NO:16) ou IVRHPIDSVKL (SEQ ID NO:17).Em outras modalidades, o códon codificando uma Iisina que é acetilada porum sistema de modificação pós-traducional no hospedeiro (por exemplo,Lys-675) é modificado de modo que ele não codifica mais lisina, por exem-plo, a seqüência de aminoácido de ACS é alterada de DLPKTRSGKIMR-RILRK (SEQ ID NO:18) para DLPKTRSGSIMRRILRK (SEQ ID NO:19). Emalgumas modalidades, uma proteína que contribui para a acetilação pós-traducional de ACS é funcionalmente desabilitada. Por exemplo, em algu-mas modalidades, uma proteína correspondendo à Pat (conforme mostradona figura 15) é funcionalmente desabilitada, por exemplo, por inativação dogene codificando Pat. Se ACS é acetilada é prontamente determinado usan-do, por exemplo, GC-espectrometria de massa.

Os métodos objeto podem ser usados em uma variedade de ti-pos diferentes de células hospedeiras eucarióticas. Células hospedeiras são,em muitas modalidades, organismos unicelulares ou são cultivadas em cul-tura como células únicas. Células hospedeiras eucarióticas adequadas in-cluem, mas não estão limitadas a, células de levedura, células de inseto,células de planta, células fúngicas e células de alga. Células hospedeiraseucarióticas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, Pichia pastoris,Pichia finlandica, Pichia trehaiophiia, Pichia kociamae, Pichia membranaefa-eiens, Piehia opuntiae, Piehia thermotoierans, Piehia salietaria, Piehia guer-cuum, Piehia pijperi, Piehia stiptis, Piehia methanoliea, Piehia sp., Saeeha-romyees eerevisiae, Saccharomyees sp., Hansenuia polymorpha, Kluyve-romyees sp., Kiuyveromyees iaetis, Candida aibieans, Aspergiiius nidulans,Aspergilius niger, Aspergiiius oryzae, Triehoderma reesei, Chrysosporiumiueknowense, Fusarium sp., Fusarium gramineum, Fusarium venenatum,Neurospora crassa, Chiamydomonas reinhardtii e similar. Em algumas mo-dalidades, a célula hospedeira é uma célula eucariótica outra que não umacélula de planta. Em algumas modalidades, a célula hospedeira genetica-mente modificada objeto é uma célula de levedura. Em uma modalidade par-ticular, a célula de levedura de Saccharomyees eerevisiae.

Níveis aumentados de acetil-CoA em uma célula favorecem aprodução de níveis mais altos de um composto isoprenóide selecionado pelacélula. Deste modo, em algumas modalidades, uma célula hospedeira gene-ticamente modificada objeto exibe aumentos em produção de isoprenóide ouprecursor de isoprenóide, onde produção de isoprenóide ou precursor deisoprenóide é aumentado em pelo menos cerca de de10%, pelo menos cer-ca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo me-nos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%,pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de80%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menoscerca de 2,5 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos cerca de 10 vezes,pelo menos cerca de 20 vezes, pelo menos cerca de 30 vezes, pelo menoscerca de 40 vezes, pelo menos cerca de 50 vezes, pelo menos cerca de 75vezes, pelo menos cerca de 100 vezes, pelo menos cerca de 200 vezes,pelo menos cerca de 300 vezes, pelo menos cerca de 400 vezes, pelo me-nos cerca de 500 vezes, pelo menos cerca de 103 vezes, ou mais, na célulahospedeira geneticamente modificada, comparado com o nível de compostoprecursor de isoprenóide ou isoprenóide produzido em uma célula hospedei-ra controle que não é geneticamente modificada conforme aqui descrito.Produção de isoprenóide ou precursor de isoprenóide é prontamente deter-minada usando métodos bem-conhecidos, por exemplo, cromatografia degás-espectrometria de massa, cromatografia líquida-espectrometria de mas-sa, cromatografia de íon-espectrometria de massa, detecção amperométricapulsada, espectrometria uv-vis e similar.

Em algumas modalidades, um hospedeiro eucariótico genetica-mente modificado objeto produz um composto isoprenóide ou precursor deisoprenóide em uma quantidade variando de a partir de 1 pg de compostoisoprenóide µg/ml a 100.000 µg de composto isoprenóide/ml, por exemplo, dea partir de cerca de 1 µg/ml a cerca de 10.000 µg/ml de composto isoprenói-de, 1 µg/ml a 5000 pg/ml de composto isoprenóide, 1 pg/ml a 4500 pg/ml decomposto isoprenóide, 1 µg/ml a 4000 pg/ml de composto isoprenóide, 1Mg/ml a 3500 pg/ml de composto isoprenóide, 1 pg/ml a 3000 pg/ml de com-posto isoprenóide, 1 pg/ml a 2500 pg/ml de composto isoprenóide, 1 pg/ml a2000 Mg/ml de composto isoprenóide, 1 pg/ml a 1500 Mg/ml de compostoisoprenóide, 1 Mg/ml a 1000 Mg/ml de composto isoprenóide, 5 Mg/ml a 5000pg/ml de composto isoprenóide, 10 pg/ml a 5000 Mg/ml de composto isopre-nóide, 20 Mg/ml a 5000 pg/ml de composto isoprenóide, 30 pg/ml a 1000pg/ml de composto isoprenóide, 40 pg/ml a 500 Mg/ml de composto isopre-nóide, 50 pg/ml a 300 pg/ml de composto isoprenóide, 60 pg/ml a 100 pg/mlde composto isoprenóide, 70 pg/ml a 80 Mg/ml de composto isoprenóide, dea partir de cerca de 1 pg/ml a cerca de 1.000 pg/ml, de a partir de cerca de1.000 pg/ml a cerca de 2.000 pg/ml, de a partir de cerca de 2.000 pg/ml acerca de 3.000 pg/ml, de a partir de cerca de 3.000 pg/ml a cerca de 4.000µg/ml, de a partir de cerca de 4,000 Mg/ml a cerca de 5.000 pg/ml, de a partirde cerca de 5.000 pg/ml a cerca de 7.500 pg/ml ou de a partir de cerca de7.500 Mg/ml a cerca de 10.000 pg/ml, ou maior do que 10.000 pg/ml de com-posto isoprenóide, por exemplo, de a partir de cerca de 10 mg de compostoisoprenóide/ml a cerca de 20 mg de composto isoprenóide/ml, de a partir decerca de 20 mg composto isoprenóide/ml a cerca de 50 mg compsoto iso-prenóide/ml, de a partir de cerca de 50 mg composto isoprenóide/ml a cercade 100 mg composto isoprenóide/ml ou mais.

Gerando uma célula hospedeira geneticamente modificada

Uma célula hospedeira objeto geneticamente modificada é gera-da usando métodos padrão bem-conhecidos daqueles versados na técnica.Por exemplo, em algumas modalidades, um vetor de expressão compreen-dendo uma seqüência de nucleotídeo codificando ACS e/ou ALD é introduzi-do em uma célula hospedeira.

Modificações genéticas adicionais

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira objeto geneti-camente modificada que exibe produção aumentada de acetil-CoA, confor-me acima descrito, é geneticamente modificada mais de modo que ela exibeum ou mais de: níveis de atividade aumentados de uma ou mais enzimas davia do mevalonato; 2) níveis aumentados de atividade de prenil transferase;e 3) níveis diminuídos de atividade de esqualeno sintase. Modificações ge-néticas que levam a 1) níveis de atividade aumentados de uma ou mais en-zimas da via do mevalonato; 2) níveis aumentados de atividade de preniltransferase; e 3) níveis diminuídos de atividade de esqualeno sintase sãodescritas acima.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamen-te modificada objeto que exibe produção aumentada de acetil-CoA, confor-me acima descrito, é geneticamente modificada mais para incluir um ou maisácidos nucléicos codificando uma poliprenil transferase e/ou uma terpenosintase, conforme descrito em mais detalhes abaixo.

Modificações Genéticas Adicionais

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamen-te modificada objeto compreende uma ou mais modificações genéticas emadição àquelas discutidas acima. Por exemplo, em algumas modalidades,uma célula hospedeira geneticamente modificada objeto é geneticamentemodificada mais com um ou mais ácidos nucléicos compreendendo seqüên-cias de nucleotídeo compreendendo uma ou mais de uma preniltransferase(por exemplo, uma preniltransferase outra que não FPP e GPP); uma terpe-no sintase; e similar.

Uso de códon

Em algumas modalidades, a seqüência de nucleotídeo codifi-cando um produto de gene (por exemplo, uma preniltransferase, uma terpe-no sintase, etc) é modificada de modo que a seqüência de nucleotídeo refle-te a preferência de códon para a célula hospedeira particular. Por exemplo, aseqüência de nucleotídeo vai em algumas modalidades ser modificada parapreferência de códon de levedura. Vide, por exemplo, Bennetzen e Hall(1982) J. Bioi Chem. 257(6): 3026-3031.

Conforme acima mencionado, em algumas modalidades, o usode códon de uma seqüência codificando esqualeno sintase é modificado demodo que o nível de tradução do mRNA de ERG9 é diminuído. Redução donível de tradução de mRNA de ERG9 através de modificação de uso de có-don é conseguida através de modificação da seqüência para incluir códonsque são raros ou não geralmente usados pela célula hospedeira. Tabelas deuso de códon para muitos organismos estão disponíveis, as quais sumari-zam a porcentagem de tempo que um organismo específico usa um códonespecífico para codificar um aminoácido. Certos códons são usados maisfreqüentemente do que outros, códons "raros". O uso de códons "raros" emuma seqüência geralmente diminui sua taxa de tradução. Deste modo, porexemplo, a seqüência de codificação é modificada pela introdução de um oumais códons raros, que afeta a taxa de tradução, mas não a seqüência deaminoácido da enzima traduzida. Por exemplo, existem 6 códons que codifi-cam arginina: CGT, CGC, CGA, CGG, AGA e AGG. Em E. coli os códonsCGT e CGC são usados com muito mais freqüência (codificando aproxima-damente 40% das argininas em E. coli cada um) do que o códon AGG (codi-ficando aproximadamente 2% de argininas em E. coli). Modificação de umcódon CGT dentro da seqüência de um gene para um códon AGG não mu-daria a seqüência da enzima, mas provavelmente diminuiria a taxa de tradu-ção do gene.

Fornecimento de acetil-CoA aumentado

Uma vez que acetil-CoA é um reagente usado por ambas aceto-acetil-CoA tiolase e HMGS na via do MEV, em algumas células hospedeiras,aumentos no agrupamento intracelular de acetil-CoA poderia levar a aumen-tos em isoprenóides e precursores de isoprenóide. Modificações que aumen-tariam os níveis de acetil-CoA intracelulares incluem, mas não estão Iimita-das a, modificações que diminuiriam a atividade total de Iactato desidroge-nase dentro da célula, modificações que diminuiriam a atividade total da ace-tato cinase dentro da célula, modificações que diminuiriam a atividade totalde álcool desidrogenase dentro da célula, modificações que interromperiamo ciclo do ácido tricarboxílico, tal como aqueles que diminuiriam a atividadetotal de 2-cetoglutarato desidrogenase, ou modificações que interromperiama fosforilação oxidativa, tal como aquelas que diminuiriam a atividade totalda (F1 F0)H+-ATP sintase ou suas combinações.

Preniltransferases

As preniltransferases constituem um grupo amplo de enzimasque catalisam a condensação consecutiva de IPP resultando na formação deprenil difosfato de vários comprimentos de cadeia. Preniltransferases ade-quadas incluem enzimas que catalisam a condensação de IPP com substra-tos de iniciador alílicos para formar compostos isoprenóides com de a partirde cerca de 5 unidades isopreno a cerca de 6000 unidades isopreno oumais, por exemplo, de a partir de cerca de 5 unidades isopreno a cerca de10 unidades isopreno, de a partir de cerca de 10 unidades isopreno a cercade 15 unidades isopreno, de a partir de cerca de 15 unidades isopreno acerca de 20 unidades isopreno, de a partir de cerca de 20 unidades isoprenoa cerca de 25 unidades isopreno, de a partir de cerca de 25 unidades iso-preno a cerca de 30 unidades isopreno, de a partir de cerca de 30 unidadesisopreno a cerca de 40 unidades isopreno, de a partir de cerca de 40 unida-des isopreno a cerca de 50 unidades isopreno, de a partir de cerca de 50unidades isopreno a cerca de 100 unidades isopreno, de a partir de cerca de100 unidades isopreno a cerca de 250 unidades isopreno, de a partir de cer-ca de 250 unidades isopreno a cerca de 500 unidades isopreno, de a partirde cerca de 500 unidades isopreno a cerca de 1000 unidades isopreno, de apartir de cerca de 1000 unidades isopreno a cerca de 2000 unidades isopre-no, de a partir de cerca de 2000 unidades isopreno a cerca de 3000 unida-des isopreno, de a partir de cerca de 3000 unidades isopreno a cerca de4000 unidades isopreno, de a partir de cerca de 4000 unidades isopreno acerca de 5000 unidades isopreno ou de a partir de cerca de 5000 unidadesisopreno a cerca de 6000 unidades isopreno ou mais.

Preniltransferases adequadas incluem, mas não estão limitadasa, uma E-isoprenil difosfato sintase, incluindo, mas não limitado a, geranildifosfato sintase, farnesil difosfato sintase, geranilgeranil difosfato (GGPP)sintase, hexaprenil difosfato (HexPP) sintase, heptaprenil difosfato (HepPP)sintase, octaprenil (OPP) difosfato sintase, solanesil difosfato (SPP) sintase,decaprenil difosfato (DPP) sintase, chicle sintase e gutta-percha sintase; euma Z-isoprenil difosfato sintase, incluindo, mas não limitado a, nonaprenildifosfato (NPP) sintase, undecaprenil difosfato (UPP) sintase, dehidrodolixildifosfato sintase, eicosaprenil difosfato sintase, sintase de borracha natural eoutras Z-isoprenil difosfato sintases.

As seqüências de nucleotídeo de várias preniltransferases deuma variedade de espécies são conhecidas, e podem ser usadas ou modifi-cadas para uso em geração de uma célula hospedeira eucariótica genetica-mente modificada objeto. Seqüências de nucleotídeo codificando preniltrans-ferases são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, mRNA de farnesilpirofosfato sintetase humana N9 de Acesso no GenBank J05262); Homo sa-piens)·, gene de farnesil difosfato sintetase (FPP) (N9 de Acesso no GenBankJ05091; Saccharomyces cerevisiae); gene de isopentenil difosfato: dimetilalildifosfato isomerase (J05090; Saccharomyces cerevisiae)·, Wang e Ohnuma(2000) Bioehim. Biophys. Aeta 1529:33-48; Patente U.S. N9 6.645.747; mR-NA de farnesil pirofosfato sintetase 2 (FPS2)/FPP sintetase 2/farnesil difosfa-to sintase 2 (At4g17190) de Arabidopsis thaiiana (N9 de Acesso no GenBankNM_202836); mRNA de geranilgeranil difosfato sintase (ggpps) de Ginkgobiioba (N9 de Acesso no GenBank AY371321); mRNA de geranilgeranil piro-fosfato sintase (GGPS1)/GGPP sintetase/farnesil-transferase (At4g36810) de Arabidopsis thaiiana (N9 de. Acesso no GenBankNM_119845); gene para farnesil, geranilgeranil, geranilfarnesil, hexaprenil,heptaprenil difosfato sintase de Synechococcus elongatus (SeIF-HepPS) (N9de Acesso no GenBank AB016095); etc.

Em muitas modalidades, uma célula hospedeira eucariótica égeneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo uma pre-niltransferase. Por exemplo, em muitas modalidades, uma célula hospedeiraé geneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo se-qüências de nucleotídeo codificando uma preniltransferase selecionada deuma GGPP sintase, uma GFPP sintase, uma HexPP sintase, uma HepPPsintase, uma OPP sintase, uma SPP sintase, uma DPP sintase, uma NPPsintase e uma UPP sintase.

Terpeno Sintases

Terpenos sintases catalisam a produção de compostos isopre-nóides através de uma das reações mais complexas conhecidas na Químicaou Biologia. Em geral, terpenos sintases são enzimas moderadamente di-mensionadas tendo pesos moleculares de cerca de 40 a 100 kD. Como umaenzima, terpenos sintases podem ser classificadas com tendo taxas de tur-nover baixas a moderadas acoplado com especificidade de reação e preser-vação de quiralidade excelentes. Turnover compreende ligação de substratoà enzima, estabelecimento de conformação de substrato, conversão desubstrato em produto e liberação de produto. Reações podem ser realizadasin vitro em solventes aquosos, tipicamente requerem íons de magnésio co-mo co-fator, e os produtos resultantes, que são freqüentemente altamentehidrofóbicos, podem ser recuperados através de divisão em um solvente or-gânico. Patente U.S. N9 6.890.752.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamen-te modificada objeto é geneticamente modificada mais com um ácido nucléi-co compreendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma terpenosintase. Em algumas modalidades, um ácido nucléico com o qual uma célulahospedeira é geneticamente modificada compreende uma seqüência de nu-cleotídeo codificando uma terpeno sintase que difere em seqüência de ami-noácido por um ou mais aminoácidos de uma terpeno sintase de ocorrêncianatural ou outra terpeno sintase de origem, por exemplo, uma terpeno sinta-se variante. Uma "terpeno sintase de origem" é uma terpeno sintase queserve como um ponto de referência para comparação. Terpeno sintases va-riantes incluem terpeno sintases de consenso e terpeno sintases híbridas.Em algumas modalidades, o ácido nucléico sintético compreende uma se-qüência de nucleotídeo codificando uma terpeno sintase de consenso. Emoutras modalidades, o ácido nucléico sintético compreende uma seqüênciade nucleotídeo codificando uma terpeno sintase híbrida.

Um ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotí-deo codificando qualquer terpeno sintase conhecida pode ser usado. Terpe-no sintases adequadas incluem, mas não estão limitadas a, amorfa-4,11-dieno sintase (ADS), beta-cariofileno sintase, germacreno A sintase, 8-epicedrol sintase, valenceno sintase, (+)-delta-cadineno sintase, germacrenoC sintase, (E)-beta-farneseno sintase, Casbeno sintase, vetispiradieno sinta-se, 5-epi-aristolocheno sintase, Aristolcheno sintase, beta-cariofileno, alfa-humuleno, (E,E)-alfa-farneseno sintase, (-)-beta-pineno sintase, Gama-terpineno sintase, Iimoneno ciclase, Linalool sintase, 1,8-cineol sintase, (+)-sabineno sintase, E-afha-bisaboleno sintase, (+)-bornil difosfato sintase, Ie-vopimaradieno sintase, Abietadieno sintase, isopimaradieno sintase,(E)-gama-bisaboleno sintase, taxadieno sintase, copalil pirofosfato sintase, kau-reno sintase, Iongifoleno sintase, gama-humuleno sintase, Delta-selinenosintase, beta-felandreno sintase, Iimoneno sintase, mirceno sintase, terpino-Ienp sintase, (-)-camfeno sintase, (+)-3-careno sintase, sin-copalil difosfatosintase, alfa-terpineol sintase, sin-pimara-7,15-dieno sintase, ent-sandaaracopimaradieno sintase, stemer-13-eno sintase, E-beta-ocimeno, S-Iinalool sintase, geraniol sintase, gama-terpineno sintase, Iinalool sintase, E-beta-ocimeno sintase, epi-cedrol sintase, alfa-zingibereno sintase, guaiadie-no sintase, cascarilladieno sintase, cis-muuroladieno sintase, afidicolan-16b-ol sintase, elizabetatrieno sintase, sandalol sintase, patchoulol sintase, Zin-zanol sintase, cedrol sintase, escareol sintase, copalol sintase, manool sinta-se e similar.

Seqüências de nucleotídeo codificando terpeno sintases são co-nhecidas na técnica e qualquer seqüência de nucleotídeo codificando terpe-no sintase conhecida pode ser usada para modificar geneticamente umacélula hospedeira. Por exemplo, as seqüências de codificação de nucleotí-deo de codificação de terpeno sintase que seguem, seguido por seus núme-ros de acesso no GenBank e os organismos onde elas foram identificadas,são conhecidas e podem ser usadas: mRNA de (-)-germacreno D sintase(AY438099; Populus balsamifera subsp. trichocarpa χ Populus deltoids)·,mRNA de Ε,Ε-alfa-farneseno sintase (AY640154; Cucumis sativus)·, mRNAde 1,8-cineol sintase (AY691947; Arabidopsis thalianá)·, mRNA de terpenosintase 5 (TPS5) (AY518314; Zea mays)\ mRNA de terpeno sintase 4(TPS4) (AY518312; Zea mays)\ mRNA de mirceno/ocimeno sintase (TPS10)(At2g24210) (NM_127982; Arabidopsis thaliana)·, mRNA de geraniol sintase(GES) (AY362553; Ocimum basilicum)·, mRNA de pineno sintase(AY237645; Picea sitchensis)·, mRNA de mirceno sintase 1e20 (AY195609;Antirrhinum majus)·, (Ε)-β-οαιηβηο sintase (0e23) mRNA (AY195607; Antir-rhinum majus)] mRNA de Ε-β-ocimeno sintase (AY151086; Antirrhinum ma-jus)·, mRNA de terpeno sintase (AF497492; Arabidopsis thaliana)·, mRNA de(-)-camfeno sintase (AG6.5) (U87910; Abies grandis); gene de (-)-4S-Iimoneno sintase (por exemplo, seqüência genômica) (AF326518; Abiesgrandis); gene de delta-selineno sintase (AF326513; Abies grandis)·, mRNAde amorfa-4,11-dieno sintase (AJ251751; Artemisia annua)·, mRNA de E-a-bisaboleno sintase (AF006195; Abies grandis)·, mRNA de gama-humulenosintase (U92267; Abies grandis)·, mRNA de δ-selineno sintase (U92266; Abi-es grandis)·, mRNA de pineno sintase (AG3.18) (U87909; Abies grandis)·,mRNA de mirceno sintase (AG2.2) (U87908; Abies grandis)·, etc.

Seqüências de aminoácido das terpeno sintases que seguemsão encontradas sob os números de Acesso GenBank mostrados em parên-teses, junto com o organismo onde cada uma foi identificada, seguindo cadaterpeno sintase: (-)-germacreno D sintase (AAR99061; Popuius baisamiferasubsp. trichocarpa χ Popuius deitoids)·, D-cadineno sintase (P93665; Gossy-pium hirsutum); 5-epi-aristolocheno sintase (Q40577; Nicotiana tabacum)·,Ε,Ε-alfa-farneseno sintase (AAU05951; Cucumis sativus); 1,8-cineol sintase(AAU01970; Arabidopsis thaiiana)·, (R)-Iimoneno sintase 1 (Q8L5K3; Citrusiimon)·, sin-copalil difosfato sintase (AAS98158; Oryza sativá)·, uma taxadienosintase (Q9FT37; Taxus chinensis; Q93YA3; Taxus bacca; Q41594; Taxusbrevifolia)·, uma D-cadineno sintase (Q43714; Gossypium arboretum)·, terpe-no sintase 5 (AAS88575; Zea mays)\ terpeno sintase 4 (AAS88573; Zeamays)·, terpenóide sintase (AAS79352; Vitis vinifera)·, geraniol sintase (A-AR11765; Ocimum basilicum)·, mirceno sintase 1e20 (AA041727; Antirrhi-num majus)·, 5-epi-aristolocheno sintase 37 (AAP05762; Nicotiana attenua-ta); (+)-3-careno sintase (AA073863; Picea abies); (-)-camfeno sintase (A-AB70707; Abies grandis)·, abietadieno sintase (AAK83563; Abies grandis)·,amorfa-4,11 -dieno sintase (CAB94691; Artemisia annuá)\ trichodieno sintase(AAC49957; Myrotheeium roridum); gama-humuleno sintase (AAC05728;Abies grandis)·, δ-selineno sintase (AAC05727; Abies grandis)·, etc.

Ácidos nucléicos. vetores, promotores

Para gerar uma célula hospedeira geneticamente modificada,um ou mais ácidos nucléicos compreendendo seqüências de nucleotídeocodificando um ou mais produtos de gene são introduzidos estavelmente outransientemente em uma célula hospedeira, usando técnicas estabelecidas,incluindo, mas não limitado a, eletroporação, precipitação de fosfato de cál-cio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, transfecção mediada por Ii-possoma, choque térmico na presença de acetato de lítio e similar. Paratransformação estável, um ácido nucléico vai geralmente incluir ainda ummarcador selecionável, por exemplo, qualquer um dos vários marcadoresselecionáveis bem-conhecidos tal como resistência à neomicina, resistênciaà penicilina, resistência à tetraciclina, resistência a cloranfenicol, resistênciaà canamicina e similar.

Em muitas modalidades, o ácido nucléico com o qual a célulahospedeira é geneticamente modificada é um vetor de expressão que incluium ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codi-fica um produto de gene, por exemplo, uma enzima da via do mevalonato,um fator de transcrição, uma preniltranferase, uma terpeno sintase, etc. Ve-tores de expressão adequados incluem, mas não estão limitados a, vetoresde baculovírus, vetores de bacteriófago, plasmídeos, fagemídeos, cosmí-deos, fosmídeos, cromossomos artificiais bacterianos, vetores virais (porexemplo, vetores virais baseados em vírus vaccínia, polivírus, adenovírus,vírus adeno-associado, SV40, vírus herpes simplex e similar), cromossomosartificiais baseados em P1, plasmídeos de levedura, cromossomos artificiaisde levedura e quaisquer outros vetores específicos para hospedeiros especí-ficos de interesse (tal como levedura). Deste modo, por exemplo, um ácidonucléico codificando um produto(s) de gene é incluído em qualquer um deuma variedade de vetores de expressão para expressão do(s) produto(s) degene. Tais vetores incluem seqüências de DNA cromossomais, não-cromossomais e sintéticas.

Vários vetores de expressão adequados são conhecidos daque-les de habilidade na técnica e muitos estão comercialmente disponíveis. Osvetores que seguem são providos a título de exemplo para células hospedei-ras eucarióticas: pXT1, pSG5 (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG e pS-VLSV40 (Pharmacia). No entanto, qualquer outro plasmídeo ou outro vetorpode ser usado contanto que ele seja compatível com a célula hospedeira.

A seqüência de nucleotídeo no vetor de expressão é operavel-mente ligada a uma seqüência(s) de controle de expressão apropriada(s)(promotor) para direcionar a síntese do produto de gene codificado. Depen-dendo do sistema de hospedeiro/vetor utilizado, qualquer um de vários ele-mentos de controle de transcrição e tradução adequados, incluindo promoto-res constitutivos e induzíveis, elementos aumentadores de transcrição, ter-minadores de transcrição, etc, pode ser usado no vetor de expressão (vide,por exemplo, Bitter e outros (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544).

Exemplos não-limitantes de promotores eucarióticos adequados(promotores que são funcionais em células eucarióticas) incluem imediatoinicial de CMV, timidina cinase de HSV, inicial e tardio de SV40, LTRs deretrovírus e metalotioneína-l de camundongo. Seleção do vetor e do promo-tor apropriado está bem dentro do nível de habilidade comum na técnica. Ovetor de expressão pode também conter um sítio de ligação de ribossomopara início de tradução e terminador de transcrição. O vetor de expressãopode também incluir seqüências apropriadas para amplificação de expres-são.

Ainda, os vetores de expressão vão em muitas modalidadesconter um ou mais genes marcadores selecionáveis para prover uma carac-terística fenotípica para seleção de células hospedeiras transformadas talcomo diidrofolato redutase ou resistência à neomicina para cultura de célulaeucariótica.

Em geral, vetores de expressão recombinantes vão incluir ori-gens de replicação e marcadores selecionáveis que permitem transformaçãoda célula hospedeira, por exemplo, o gene TRP1 de S. cerevisiae, etc.; e umpromotor derivado de um gene altamente expresso para direcionar a trans-crição da seqüência de codificação de produto de gene. Tais promotorespodem ser derivados de óperons codificando enzimas glicolíticas tal como 3-fosfoglicerato cinase (PGK), α-fator, fosfatase ácida ou proteínas de choquetérmico, entre outras.

Em muitas modalidades, uma célula hospedeira geneticamentemodificada é geneticamente modificada com um ácido nucléico que incluiuma seqüência de nucleotídeo codificando um produto de gene, onde a se-qüência de nucleotídeo codificando o produto de gene é operavelmente liga-da a um promotor induzível. Promotores induzíveis são bem-conhecidos natécnica. Promotores induzíveis adequados incluem, mas não estão limitadosa, o pL do bacteriófago λ; Plac; Ptrp; Ptac (promotor híbrido Ptrp-lac); umpromotor induzível por isopropil-beta-D-tiogalactopiranosídeo (IPTG), porexemplo, um promotor IacZ; um promotor induzível por tetraciclina; um pro-motor induzível por arabinose, por exemplo, PBAD (vide, por exemplo, Guz-man e outros (1995) J. BacterioL 177:4121-4130); um promotor induzível porxilose, por exemplo, Pxyl (vide, por exemplo, Kim e outros (1996) Gene181:71-76); um promotor GAL 7; um promotor de triptofano; um promotor delac; um promotor induzível por álcool, por exemplo, um promotor induzívelpor metanol, um promotor induzível por etanol; um promotor induzível porrafinose; um promotor induzível por calor, por exemplo, promotor PL Iambdainduzível por calor, um promotor controlado por um repressor sensível a ca-Ior (por exemplo, vetores de expressão baseados em Iambda reprimidos porCI857; vide, por exemplo, Hoffmann e outros (1999) FEMS Microbiol Lett.177(2):237-34); e similar.

Em muitas modalidades, uma célula hospedeira geneticamentemodificada é geneticamente modificada com um ácido nucléico que incluiuma seqüência de nucleotídeo codificando um produto de gene, onde a se-qüência de nucleotídeo codificando o produto de gene é operavelmente liga-da a um promotor constitutivo. Em levedura, vários fatores contendo promo-tores constitutivos ou induzíveis podem ser usados. Para uma revisão videCurrent Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988, Ed. Ausubel e outros,Greene Publish. Assoc. & Wiley lnterscience, Ch. 13; Grant, e outros, 1987,Expression and Secretion Veetors for Yeast, em Methods in Enzymobgy,Eds. Wu & Grossman, 31987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, pp.516-544;Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3; Bitter,1987, Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in Enzymobgy,Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, pp. 673-684; e The Mo-lecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Eds. Strathern e outros,Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II. Um promotor constitutivo tal comoADH ou LEU2 ou um promotor induzível tal como GAL pode ser usado (Clo-ning in Yeast, Ch. 3, R. Rothstein em: DNA Cloning Vol. 11, A Practical Ap-proach, Ed. DM Glover, 1986, IRL Press, Wash., D.C.). Alternativamente,vetores podem ser usados, os quais promovem integração de seqüências deDNA estranho ao cromossomo da levedura.

Composições compreendendo uma célula hospedeira eucariótica genetica-mente modificada objeto

A presente invenção provê ainda composições compreendendouma célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada objeto. Umacomposição objeto compreende uma célula hospedeira eucariótica geneti-camente modificada objeto e vai em algumas modalidades compreender umou mais componentes adicionais, componentes que são selecionados combase em parte no uso pretendido da célula hospedeira eucariótica genetica-mente modificada. Componentes adequados incluem, mas não estão Iimita-dos a, sais; tampões; estabilizadores; agentes de inibição de protease; com-postos de preservação de membrana celular e/ou parede celular, por exem-plo, glicerol, dimetilsulfóxido, etc; meios nutricionais apropriados para a célu-la; e similar.

Métodos para Produção de Compostos Isoprenóides

A presente invenção provê métodos de produção de um com-posto isoprenóide ou precursor de isoprenóide. Os métodos geralmente en-volvem cultura de uma célula hospedeira geneticamente modificada objetoem um meio adequado.

Compostos precursores isoprenóides que podem ser produzidosusando o método objeto incluem qualquer composto isoprenil difosfato.Compostos isoprenóides que podem ser produzidos usando o método dainvenção incluem, mas não estão limitados a, monoterpenos, incluindo, masnão limitado a, limoneno, citranelol, geraniol, mentol, álcool perilílico, linalool,thujona-, sesquiterpenos, incluindo, mas não limitado a, periplanona B, ging-kolide B, amorfadieno, artemisinina, ácido artemisínico, valenceno, nootka-tone, epi-cedrol, epi-aristolocheno, farnesol, gossypol, sanonin, periplanonae forskolin; diterpenos, incluindo, mas não limitado a, casbeno, eleutherobin,paclitaxel, prostratina e pseudopterosina; e triterpenos, incluindo, mas nãolimitado a, arbrusideE, bruceantin, testosterona, progesterona, cortisona,digitoxin. Isoprenóides também Incluem, mas nao estão limitados a, carote-nóides tal como licopeno, a- e β-caroteno, a- e β-criptoxantina, bixina, zea-xantina, astaxantina e luteína. Isoprenóides também incluem, mas não estãolimitados a, triterpenos, compostos esteróides e compostos que são compos-tos de isoprenóides modificados por outros grupos químicos, tal como terpe-no-alcalóides mistos e co-enzima Q-10.

Em algumas modalidades, um método objeto compreende aindaisolamento do composto isoprenóide da célula e/ou do meio de cultura.

Em geral, uma célula hospedeira geneticamente modificada ob-jeto é culturada em um meio adequado (por exemplo, caldo Luria-Bertoni,opcionalmente suplementado com um ou mais agentes adicionais, tal comoum indutor (por exemplo, onde uma ou mais seqüências de nucleotídeo codi-ficando um produto de gene estão sob o controle de um promotor induzível),etc.). Em algumas modalidades, uma célula hospedeira geneticamente modi-ficada objeto é culturada em um meio adequado; e o meio de cultura é so-breposto com um solvente orgânico, por exemplo, dodecano, formando umacamada orgânica. O composto isoprenóide produzido pela célula hospedeirageneticamente modificada se divide na camada orgânica, da qual ele podeser purificado. Em algumas modalidades, onde uma ou mais seqüências denucleotídeo codificando produto de gene são operavelmente ligadas a umapromotor induzível, um indutor é adicionado ao meio de cultura; e, após umtempo adequado, o composto isoprenóide é isolado da camada orgânicasobreposta sobre o meio de cultura.

Em algumas modalidades, o composto isoprenóide será separa-do de outros produtos que possam estar presentes na camada orgânica.Separação do composto isoprenóide de outros produtos que possam estarpresentes na camada orgânica é prontamente conseguida usando, por e-xemplo, técnicas cromatográficas padrão.

Em algumas modalidades, o composto isoprenóide é puro, porexemplo, pelo menos cerca de 40% puro, pelo menos cerca de 50% puro,pelo menos cerca de 60% puro, pelo menos cerca de 70% puro, pelo menoscerca de 80% puro, pelo menos cerca de 90% puro, pelo menos cerca de95% puro, pelo menos cerca de 98% puro, ou mais de 98% puro, onde "pu-ro" no contexto de um composto isoprenóide refere-se a um composto iso-prenóide que é livre de outros compostos isoprenóides, macromoléculasnão-isoprenóides, etc.

Exemplos

Os exemplos que seguem são apresentados de modo a proveraqueles versados na técnica com descrição completa de como fazer e usar apresente invenção, e não pretendem limitar o escopo do que os inventoresconsideram sua invenção, nem pretendem representar que os experimentosabaixo são todos ou os únicos experimentos realizados. Esforços têm sidofeitos para assegurar a precisão com relação aos números usados (por e-xemplo, quantidades, temperatura, etc), mas alguns erros e desvios experi-mentais devem ser levados em consideração. A menos que de outro modoindicado, partes estão em partes em peso, peso molecular é peso molecularponderai médio, temperatura está em graus Celsius e pressão está na oupróximo da atmosférica. Abreviações padrão podem ser usadas, por exem-plo, bp, par(es) de base; kb, quilobase (s); PL (picolitro(s); s ou seg, segun-do(s); min, minuto(s); h ou hr, hora(s); aa, aminoácido(s); kb, quilobases(s);NT, nucleotídeo(s); i.m., intramuscular(mente); i.p., intraperitoneal(mente);s.c., subcutânea(mente) e similar.

Exemplo 1: Produção de níveis altos de um composto isoprenóide em umacélula de levedura geneticamente modificadaMateriais e Métodos

Agentes químicos. Dodecano e cariofileno foram comprados daSigma-Aldrich (St. Louis, MO). Ácido fluoórtico (5-FOA) foi comprado da Zy-mo Research (Orange, CA). Misturas de Suplemento Completas para formu-lação de Meios Definidos Sintéticos foram compradas da Qbiogene (Irvine,CA). Todos os outros componentes do meio foram comprados ou da Sigma-Aldrich ou Becton, Dickinson (Fraklin Lakes, NJ).

Linhagens e meios. Linhagens de Escherichia coli DH10B eDH5a foram usadas para transformação bacteriana e amplificação de plas-mídeo na construção dos plasmídeo de expressão usados neste estudo. Aslinhagens foram cultivadas a 379 C em meio Luria-Bertani com 100 mg litro"1de ampicilina com a exceção de plasmídeos baseados em ρδ-UB que foramcultivados com 50 mg litro"1 de ampicilina.

A linhagem Saccharomyces cerevisiae BY4742 (Baker Brach-mann e outros (1998) VeasM 4(2): 115-132), um derivado de S288C, foi usa-da como a linhagem de origem para todas as linhagens de levedura. Estalinhagem foi cultivada em meio rico em YPD. Burk e outros, Methods in yeastgenetics: a Cold Spring Harbor Laboratory course manual, 2000, Plainview,NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Linhagens de levedura engenhei-radas foram cultivadas em Meio Definido Sintético (SD) (Burke e outros,(2000) supra), com leucina, uracila, histidina e/ou metionina retirada ondeapropriado. Para indução de genes expressos a partir do promotor GAL1,linhagens de S. cerevisiae foram cultivadas em 2% de galactose como a úni-ca fonte de carbono.

Construção de plasmídeo. Para criar o plasmídeo pRS425ADSpara expressão de ADS com o promotor GAL1, ADS foi amplificado atravésde reação de cadeia de polimerase (PCR) a partir de pADS (Martin e outros(2003) Λ/aí. BiotechnoL 21(7): p. 796-802) usando o par de iniciador ADS-Spel-F/ADS-Hindlll-R (Tabela 1). Usando esses iniciadores, a seqüência denucleotídeo 5'-AAAACA-3' foi clonada imediatamente a montante do códonde início de ADS. Esta seqüência de consenso foi usada para tradução efici-ente (Looman e outros (1993) Nucleie Aeids Research. 21(18):4268-71; Yune outros (1996) Molecular Microbioi 19(6): 1225-39.) de ADS e os outros ge-nes induzíveis por galactose usados neste estudo. O produto amplificado foiclivado com Spel e Hinúlll e clonado em pRS425GAL digerido com ISpeI eHindlll (Mumberg e outros (1995) Gene 156(1):119-122).Tabela 1

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Sítios de restrição estão sublinhados e negrito indica um códonde início ou parada.

Para expressão de tHMGR, o plasmídeo pRS-HMGR foi constru-ído. Primeiro sítios de restrição Sacll foram introduzidos em pRS426GAL1(Mumberg e outros (1995) Gene 156(1): 119-122) na extremidade 5' do pro-motor GAL1 e extremidade 3' do terminador de CYC1. O cassete depRS426GAL1 promotor-sítio de clonagem múltipl-terminado foi amplificadoatravés de PCR usando o par de iniciador pRS42X-PvullSacll-F/pRS42X-PvuIISacII-R (Tabela 1). O produto amplificado foi clonado diretamente empRS426GAL1 digerido com Pvull para construir o vetor pRS426-Sacll. Odomínio catalítico de HMG1 foi amplificado através de PCR a partir do plas-mídeo pRH 127-3 (Donald e outros (1997) Appi Environ. Microbiol.63(9):3341-44) com o par de iniciador HMGR-BamHI-F/HMGR-Sall-R. Oproduto amplificado foi clivado com BamHI e Sal\ e clonado em pRS426-Sacll digerido com BamVW e Xho\.

O alelo Upc2-1 de UPC2 foi amplificado através de PCR a partirdo plasmídeo pBD33 usando par de iniciador UPC2-BamHI-F/UPC2-Sall-R.O produto amplificado foi clivado com BamHI e Sa/1 e clonado em pRS426-Sacll digerido com SamHI e Xho\ para criar o plasmídeo pRS-UPC2. Damesma maneira o gene ECM22 contendo a mutação tipo upc2-1 (glicina emaspartato no resíduo 790) foi amplificado através de PCR a partir do plasmí-deo pBD36 usando o par de iniciador ECM22-BamHI-F/UPC2-Sall-R. O pro-duto amplificado foi clivadó com BamHI e SalI e clonado em pRS426-Saclldigerido com SamHI e Xho\ para criar o plasmídeo pRS-ECM22.

Um plasmídeo foi construído para a integração do cassete deexpressão de tHMGR de pRS-HMGR no genoma de levedura utilizandoplasmídeo ρδ-UB (Lee e outros (1997) Biotechnol. Prog. 13(4):368-373).pRS-HMGR foi clivado com Sacll e o fragmento de cassete de expressão foiextraído com gel e clonado em ρδ-UB digerido com Sacll. Para a integraçãode upc2-1, põ-UPC2 foi criado de uma maneira idêntica através de digestãode pRS-UPC2 com Sacll e movendo o fragmento apropriado para ρδ-UB.

Para substituir o promotor de ERG9 com o promotor de MET3, oplasmídeo pRS-ERG9 foi construído. O plasmídeo pRH973 (Gardner e ou-tros (1999) J. Bioi Chem. 274(44):31671-31678) continha um segmento 5*truncado de ERG9 posto atrás do promotor de MET3. pRH973 foi clivadocom Apa\ e C/al e clonado em pRS403 digerido com Apa\ e C/al (Sikorski eoutros (1989) Genetics, 122(1): 19-27).

Para expressão de ERG20, o plasmídeo pRS-ERG20 foi cons-truído. O plasmídeo pRS-Sacll foi primeiro digerido com Sa/I e Xho\ que cri-ou extremidades coesas compatíveis. O plasmídeo foi então auto-ligado,eliminando sítios Sa/I e Xho\ para criar o plasmídeo pRS-Sacll-DX. ERG20foi amplificado através de PCR a partir do DNA genômico de BY4742 usan-do o par de iniciador ERG20-Spel-F/ERG20-Saml-R. O produto amplificadofoi clivado com Spel e Smal e clonado em pRS-Sacll-DX digerido com Spele Smal. Para a integração do cassete de expressão de ERG20, pRS-ERG20foi clivado com Sacll e o fragmento do cassete de expressão foi extraídocom gel e clonado em ρδ-UB digerido com Sacll.

Uma descrição de plasmídeos usada neste estudo é provida naTabela 2.

Tabela 2

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Uma lista de linhagens de levedura usadas neste estudo e osgenótipos relevantes das linhagens é provida na Tabela 3.

Tabela 3

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Transformação de levedura e construção de linhagem:

Linhagem de S. cerevisiae (Carrie Baker Brachmann e outros(1998) "Yeast" 14(2):115-132), um derivado de S288C foi usado como a li-nhagem de origem para todas as linhagens de S. cerevisiae. Transformaçãode todas as linhagens de S. cerevisiae foi realizada através do método deacetato de lítio padrão (Gietz e outros (2002) Guide to Yeast Genetics andMolecular and Cell Biology, Pt B., Academic Press Inc: San Diego. 87-96).Três a dez colônias de cada transformação foram avaliadas quanto à sele-ção do transformante de produção de amorfadieno mais alta. A linhagemEPY201 foi construída através da transformação da linhagem BY4742 complasmídeo pRS425ADS e a seleção em placas SD-LEU. As linhagensEPY203, EPY204, EPY205 e EPY206 foram construídas através da trans-formação da linhagem EPY201 com plasmídeos pRS-HMGR, pRS-UPC2,pRS-ECM22 e -ERG20, respectivamente. Transformantes foram seleciona-dos em placas SD-LEU-URA. O plasmídeo ρδ-HMGR foi digerido com Xho\antes da transformação do DNA em linhagem EPY201 para a construção deEPY207. A linhagem EPY207 foi culturada e posta em placa em placas SD-LEU incluindo 1 g/L de seleção de 5-FOA da perda do marcador URA3. Oauxótrofo de uracila resultante foi então transformado com plasmídeo ρδ-UPC2 digerido com Xho\ para a construção de PEY209, que foi selecionadoem placas SD-LEU-URA. O plasmídeo pRS-ERG9 foi clivado com Hindi paraa integração da fusão PMettERG9 nos Ioci ERG9 de EPY209 para a cons-trução de EPY212. Esta linhagem foi selecionada em placas SD-LEU-URA-HIS-MET. PEY212 foi culturado e posto em placa em placas SD-LEU-HIS-MET contendo 5-FOA para seleção da perda do marcador URA3. O auxótro-fo de uracila resultante foi então transformado com DNA de plasmídeo ρδ-ERG20 digerido com Xho\ para a construção de EPY214, que foi seleciona-do em placas SD-LEU-URA-HIS-MET.

Cultivo de levedura. Durante o curso de tempo dos experimen-tos para a medição de produção de amorfadieno, tubos de cultura contendo5 mL de meio SD (2% de galactose)(com omissões de aminoácido apropria-das conforme acima descrito) foram inoculados com as linhagens de interes-se. Esses inócuos foram cultivados a 30Q C para uma densidade óptica de600 nm (OD600) de aproximadamente 1. Frascos baffled de 250 mL contendo50 mL de meio SD foram inoculados para um OD6OO de 0,05 com essasculturas de semente. A figura 4 representa linhagens cultivadas em SD-URA-LEU-HIS com metionina no nível indicado. O meio para linhagens mos-trado na figura 5 continha SD-URA suplementado com metionina para umaconcentração final de 1 mM. Todos os outros experimentos de produção u-saram SD-URA ou SD-URA-LEU onde apropriado.

Todos os frascos também continham 5 mL de dodecano. Esta camada dedodecano foi amostrada e diluída em acetato de etila para determinação deprodução de amorfadieno através de GC-MS.

Análise de GC-MS de amorfadieno. Produção de amorfadienopelas várias linhagens foi medida através de GC-MS conforme anteriormentedescrito (Martin e outros (2001) Biotechnology and Bioengineering,75(5):497-503) através de escaneamento para apenas dois íons, o íon mole-cular (204 m/z) e o íon de 189 m/z. As concentrações de amorfadieno foramconvertidas em equivalentes de cariofileno usando uma curva padrão de ca-riofileno e a abundância relativa de íons 189 e 204 m/z para seus íons totais.

Resultados

Para maximizar a produção de amorfadieno, uma abordagemem etapas foi tomada com a integração sucessiva de construtos no genomade S. cerevisiae.

Produção de amorfadieno. Uma célula hospedeira plataforma,S. cerevisiae, foi engenheirada para produção de alto nível de isoprenóides.S. cerevisiae direciona toda sua produção de isoprenóide através de difosfa-to de isopentenila (IPP)1 e a maior parte destes então através de difosfato defarnesila (FPP). Os níveis de IPP e FPP foram aumentados na célula hospe-deira. IPP e FPP são metabolizados para uma variedade de produtos nati-vos. Ao invés da medição dos níveis de FPP, o nível de amorfadieno, umproduto direto de FPP que não será metabolizado ou degradado durante ocurso do crescimento, foi medido. Amorfadieno sintase (ADS) foi expressaem S. cerevisiae para a ciclização enzimática de FPP para o sesquiterpenoamorfadieno. Amorfadieno é também prontamente quantificado através deGCMS.

ADS foi expresso no plasmídeo de 2 mícrons pRS425ADS sob ocontrole induzível do promotor GAU. Culturas de S. cerevisiae foram culti-vadas por seis dias em galactose para expressão de ADS1 e os níveis deamorfadieno foram medidos a cada 24 horas. S. cerevisiae modificada ape-nas pela introdução de pRS425AD atingiu uma produção de amorfadienomáxima de 4,6 pg de amorfadieno mL"1 após quatro dias (figura 3A).

Experimentos controle anteriores consistindo em meio spikedcom amorfadieno puro mostrou a perda rápida de sesquiterpeno a partir dafase líquida. Uma camada dodecano equivalente a 10% do volume do meiofoi adicionada a cada frasco agitador para seqüestrar o amorfadieno a partirda cultura. A adição desta camada orgânica assegura medição precisa daquantidade total de amorfadieno produzido pela prevenção de perda para oar. A volatização de amorfadieno é um problema particular durante curso detempo prolongado de vários dias tal como aqueles usados neste estudo.

Superexpressão de HMG-CoA redutase. A importância médicada biossíntese de colesterol e a facilidade experimental de análise em S.cerevisiae fizeram dela um organismo ideal para estudo da regulagem da viado mevalonato durante as décadas passadas (Szkopinska e outros (2000)Biochemical and Biophysicai Research Communications, 267(1 ):473-477;Dimster-Denk e outros (1999) J. Lipid Res., 40(5):850-860).

Esses estudos elucidaram um sistema complexo de regulagem,com 3-hidróxi-3-metilglutaril-co-enzima A redutase (HMGR) como um pontode controle regulador principal da via. Duas isozimas de HMGR, Hmglp eHmb2p, estão presentes em levedura, com Hmg1 ρ sendo a mais estável dasduas (Hampton e outros (1996) Trends in Biochemichai Sciences, 21 (4): 140-145). Hmglp é uma proteína ligada à membrana integral contendo uma re-gião N-terminal responsável pelo ancoramento da proteína à membrana ER(Liscum e outros (1985) J. Bioi. Chem. 260(1 ):522-530). Para expressão deuma forma solúvel da enzima Donald e outros ((1997) Appi. Environ. Micro-bioi. 63(9):3341-44) removeram o N-terminal ligado à membrana da Hmglpe expressaram apenas o domínio cataiítico. No estudo da requerente, estaforma truncada de HMGR (tHMGR) em um plasmídeo de 2 mícrons foi ex-pressa sob o controle do promotor GAL1. Quando expressa em conjuntocom ADS1 S. cerevisiae atingiu uma produção máxima de 11,2 pg de amor-fadieno mL"1 após dois dias (figura 3A).

Superexpressão de fatores de transcrição envolvidos emesterol. Em outra abordagem para aumentar amorfadieno, dois fatores detranscrição de S. cerevisiae previamente identificados pela sua importânciaem regulagem de biossíntese de esterol foram usados. Mutantes de S. cere-visiae Upc2-1 foram originalmente identificados pela habilidade única emabsorver esteróis sob condições aeróbicas (Lewis e outros (1988) Yeast,4(2):93-106). Caracterização adicional mostrou que esses mutantes tinhamcapacidades de síntese de esterol aumentadas (Lewis e outros (1988) Ye-ast, 4(2):93-106). A mutação responsável por essas características é umatransição de guanina para adenina única no gene UPC2\ esta mutação porponto resulta em uma mudança de resíduo de glicina para aspartato no ami-noácido 888 próximo ao terminal carbono Crowley e outros (1998) J. Bacte-riol., 180(16):4177-83). Um homólogo deste gene, ECM22, foi mais tardeidentificado com 45% de identidade de seqüência de aminoácido (Shianna eoutros (2001) J. Bacteriol., 183(3):830-834). 36 aminoácidos são completa-mente conservados entre UPC2 e ECM22 no Iocus da mutação por pontoupc2-1 (Shianna e outros (2001) J. Bacteriol, 183(3):830-834). A mutaçãopor ponto upc2-1 foi introduzida no alelo de ECM22 do tipo selvagem resul-tando em uma linhagem com um fenótipo similar àquele do mutante upc2-1(Shianna e outros (2001) J. Bacteriol, 183(3):830-834).

Vik e Rine identificaram ERG2 e ERG3 como alvos para regula-gem de gene por Ecm22p e Upc2p. Um elemento regulador de esterol de 7pares de base foi identificado como a localização de ligação necessária paraesses fatores de transcrição. Este elemento de seqüência de 7 pares de ba-se é encontrado nos promotores de muitos outros genes de curso de esterolincluindo ERG8, ERG12 e ERG13 (Vik e outros (2001) Moi Cell. Biol.,21(19):6395-6405). Os produtos de enzima para cada um desses três genesestão envolvidos em síntese de isoprenóide a montante de FPP (vide figura1).

Foi tomado como hipótese que co-expressão dos alelos mutan-tes para UPC2 e ECM22 com ADS aumentaria a produção de amorfadienoatravés do aumento do fluxo metabólico através da via do mevalonato. Osalelos mutantes upc2-1 de UPC2e ECM22 foram, cada um ,expressos sob ocontrole do promotor GAL1 em um plasmídeo de 2 mícrons em uma linha-gem já carregando pRS425ADS. Produção de amorfadieno absoluta nasculturas aumentou apenas minimamente para expressão de UPC2 eECM22, em parte devido a densidades de célula diminuídas. No entanto,produção normalizada para densidade celular aumentou 76% e 53% para aexpressão de UPC2e ECM22, respectivamente (figura 3B).

Este aumento relativamente pequeno em produção de amorfadi-eno comparado com superexpressão de tHMGR apóia o fato de que a ativi-dade de HMGR é a base genética estreita e Iimitante principal da via do me-valonato. Até mesmo expressão de alto nível de ERG8, ERG12 e ERG13 éimprovável de aumentar muito fluxo através do curso se HMGR permanecerem nível de expressão basal. As densidades de célula menores observadaspara a superexpressão de UPC2 e ECM22 são improváveis devido a umfluxo aumentado através da vida do mevalonato para FPP. Elas são ao con-trário provavelmente causadas por uma mudança desfavorável em regula-gem transcripcional para um ou múltiplos outros genes controlados porUPC2 e ECM22.

Co-expressão de tHMGR e upc2-1. Superexpressão de tHMGRe upc2-1 cada aumentou o rendimento final de amorfadieno nas culturas ce-lulares. Para testar a possibilidade de um efeito sinérgico a partir da super-expressão desses genes juntos, os cassetes de expressão foram integradosseqüencialmente ao genoma de S. cerevisiae. O plasmídeo ρδ-UB (Lee eoutros (1997) Biotechnol Prog., 13(4):368-373) foi usado para a construçãodos plasmídeos de integração. Este plasmídeo contém um URA3 BlasterCassette reutilizável permitindo a reciclagem do marcador URA3. Adicional-mente, ele integra em uma δ-seqüência (encontrada nas repetições termi-nais longas de sítios de transposon Ty), dos quais existem aproximadamente425 dispersos no genoma (Dujon (1996) Trends in Genetics, 12(7):263-270).

tHMGR foi integrada ao cromossomo de uma linhagem carre-gando pRS425AD usando ρδ-HMGR. O nível de produção de amorfadienode 13,8 pg amorfadieno mL"1 era comparável nesta linhagem à linhagemEP203 que continha tHMGR em um plasmídeo de muita cópia (figura 5). A-pós reciclagem do marcador URA3 através da colocação em placa em 5-FOA, upc2-1 foi integrado ao cromossomo usando o plasmídeo põ-UPC2.Os efeitos de superexpressão de tHMGR e upc2-1 combinaram para aumen-tar a produção de amorfadieno para 16,2 pg de amorfadieno mL"1 (figura 5).Embora expressão de upc2-1 em combinação com tHMGR tenha aumenta-do a produção de amorfadieno absoluta em 17%, este aumento é apelascomparável àquele visto quando upc2-1 é expresso com ADS sozinha. Coma remoção do bottleneckàe HMGR1 um impacto mais significante era espe-rado a partir da expressão de upc2-1. Aumentos potenciais em produção deamorfadieno poderiam ser prevenidos devido ao direcionamento de FPP aoutros metabólitos.

Sb-regulagem de esqualeno sintase. Os aumentos vistos emprodução de amorfadieno sugeriram um agrupamento de precursor de FPPaumentado. FPP é central para a síntese de vários compostos de S. cerevi-siae incluindo esteróis, dolicóis e poliprenóis, e proteínas preniladas. Emborafluxo aumentado através da via do mevalonato tenha levado à produção deamorfadieno maior, várias outras enzimas estavam também competindo pa-ra o agrupamento aumentado de FPP, mais importantemente esqualeno sin-tase codificada por ERG9. A síntese de esqualeno é o ponto de ramificaçãode FPP levando a ergosterol. Em uma linhagem expressando o domínio ca-talítico de HMGR e contendo uma deleção de ERG9, FPP foi visto acumular(Song (2003) Analytical Biochemistry, 317(2):180-185). Com o objetivo deencaminhar FPP para longe da produção de esterol e em direção à produ-ção de amorfadieno, redução em atividade de esqualeno sintase seria útil.No entanto, uma deleção de ERG9 é letal sem suplementação exógena deesteróis.

Empregando uma estratégia alternativa, ERG9 foi transcripcio-nalmente sub-regulado pondo seu promotor nativo com um promotor repres-sível de metionina. Pmets (Cherest e outros, (1985) Gene, 34(2-3):269-281).Gardner e outros utilizaram previamente tal fusão de Pmet3-ERG9 para oestudo de sinais de degradação de HMGR (Gardner e outros (1999) J. Biol.Chem. 274(4):31671 -31678; Gardner e outros (2001) J. Biol. Chem.,276(12):8681-8694). O plasmídeo pBS-ERG9 foi construído para utilizar amesma estratégia que Gardner na substituição do promotor nativo de ERG9com o promotor de MET3. A utilidade da fusão Pmet3-ERG9 é ressaltada pe-lo controle regulador rígido entre 0 e 100 μΜ de concentrações extracelula-res de metionina (Mao e outros (2002) Current Microbiology, 45(1):37-40).Na presença das concentrações extracelulares altas de metionina, expres-são a partir do promotor de MET3 é baixa. Depois de integração de pRS-ERG9 no Iocus de ERG9, a expressão de esqualeno sintase poderia ser a-justada com base em suplementação de metionina para o meio.

pRS-ERG9 foi integrada à linhagem EPY209, e produção deamorfadieno foi medida com uma faixa de 0 a 1 mM de metionina no meio.Pontos de tempo de 64 e 87 horas após inoculação são mostrados (figura 4).Os dados sugerem que expressão mínima de ERG9 (concentrações de me-tionina acima de 0,5M) maximizam a produção de amorfadieno. Conforme asculturas de S. cerevisiae aumentam em densidade celular e metabolizam osnutrientes no meio, a concentração de metionina provavelmente cai, expli-cando porque culturas providas com 0,1 mM de metionina no meio têm ren-dimentos menores de amorfadieno. 1 mM de metionina foi selecionado paraexperimentos futuros para assegurar concentrações extracelulares altas du-rante todos os cursos de tempo prolongados.

A linhagem EPY212 contendo uma cópia integrada de tMHGR eupc2-1 bem como alelo repressível de metionina de ERG9 foi cultivada emcultura e produção de amorfadieno foi medida por seis dias (figura 5). Limi-tação de FPP incorporado ao esqualeno teve um grande impacto sobre aprodução de amorfadieno, aumentando-a quatro vezes para 61 pg de amor-fadieno mL/1 sobre a linhagem EPY209 contendo o alelo ERG9 do tipo sel-vagem. Embora limitada em sua habilidade em produzir ergosterol, EPY212ainda cresceu para um OD final -75% daquele de EPY209.

Superexpressão de FPP Sintase. FPP sintase (FPPS)1 codifi-cada por ERG20, foi direcionada como o próximo alvo para superexpressãoem expectativas de aumento de rendimentos de sesquiterpeno adicional. Umaumento de seis vezes em atividade de FPPS foi correlacionado com umaumento de 80% e 32% em dolicol e ergosterol, respectivamente (Szkopins-ka e outros (2000) Biochemical and Biophysical Research Communications,267(1 ):473-477). Similar aos estudos superexpressando HMGR e upc2-1,ERG20 foi primeiro clonado atrás do promotor GAL1 em um plasmídeo demuita cópia para criar pRS-ERG20. Co-expressão de ERG20 neste plasmí-deo com pRS425ADS realmente diminuiu a produtividade absoluta de amor-fadieno em 60%. É possível que um aumento na atividade de FPPS tenhaaumentado apenas o teor de outros produtos derivados de FPP tal comoergosterol. Outra possibilidade é que a superexpressão de FPPS tenha au-mentado a concentração intracelular de FPP-o principal sinal para degrada-ção de HMGR (Gardner e outros (1999) J. Biol Chem. 274(44):31671-31678). Sem a superexpressão de uma forma desregulada da redutase,concentrações de FPP aumentadas poderiam agir para limitar o fluxo atra-vés da via do mevalonato e diminuir a produção de amorfadieno.

PÕ-ERG20 foi então construído para a integração e expressãode ERG20 na produtor mais alto de amorfadieno da requerente. O marcadorURA3 foi reciclado, e põ-ERG20 integrado ao cromossomo para criar a Ii-nhagem EPY212. Esta linhagem superexpressando FPPS aumentou mais aprodução de amorfadieno para 73 μιη de amorfadieno mL'1 (figura 5). Antesa requerente tinha visto uma diminuição de 60% em produção de amorfadie-no na linhagem EPY206 superexpressando ERG20 com ADS. No entanto,agora em uma linhagem expressando tHMGR e upc2-1 e com uma esquale-no sintase regulada, a produção de amorfadieno aumentou 20% com a su-perexpressão de ERG20.

Nas linhagens EPY206 e EPY212 cada uma expressandoERG20, uma diminuição na densidade celular foi observada. Esta diminuiçãoem crescimento celular poderia ser explicada por uma toxidez causada dire-tamente por ERG20p. Alternativamente um efeito poderia surgir de um acú-mulo ou depleção de um intermediário de curso devido ao fluxo modificadoatravés da FPP sintase.Exemplo 2: Células de levedura geneticamente modificadas para produzirníveis mais altos de acetil-CoA

Um plasmídeo multicópia, pRS426ALD6 foi construído, o qualcarrega o gene ALD6 codificando acetaldeído desidrogenase. Construtos deplasmídeo são ostrados esquematicamente na figura 9. QuandopRS426ALD6 foi introduzido na linhagem EPY213 de S. cerevisiae controle(MATa Iys2 ura3 erg9::pMET-ERG9 pRS425 tHMGR integrado a ADS, upc2-1), crescimento celular e nível de produção de amorfadieno diminuíram, con-forme mostrado nas figuras 10a e 10b. Superexpressão do gene ALD6 au-mentou o nível de atividade de acetaldeído desidrogenase (ALD) cerca de20 vezes mais do que aquele das linhagens de controle, e levou a um acú-mulo de acetato em cerca de 1 g/L (16 mM) no meio, conforme mostrado nafigura 10c. Superprodução de ALD resultou em uma redução no fluxo decarbono através de fermentação de álcool e um aumento no fluxo de carbo-no através do bypass de piruvato desidrogenase que leva à via do mevalo-nato.

O plasmídeo multicópia pRS426ACS1 (conforme mostrado nafigura 9) foi construído. pTS426ACS1 carrega o gene ACS1 codificando ace-til-CoA sintetase (ACS). Quando pRS426ACS1 foi introduzido na linhagemEPY213, atividade de ACS aumentou 2-3 vezes. Superexpressão do geneACS1 levou a um consumo de acetato e um aumento do nível de produçãode amorfadieno de 20-50% conforme mostrado nas figuras 11A-D. Essesdados mostram que superprodução de ACS é eficaz para aumentar a produ-ção de isoprenóide através do bypass de piruvato desidrogenase e a via domevalonato.

O plasmídeo multicópia pES-ALD6-ACS1 (conforme mostradona figura 9) foi construído. pES-ALD6-ACS1 provê superexpressão de am-bos genes ALD6 e ACS1. Superexpressão de ambas ALD e ACS não foieficaz para aumentar a produção de amorfadieno, e resultou em uma quan-tidade muito maior de acúmulo de acetato no meio, conforme mostrado nasfiguras 12A-D. A linhagem superexpressando ambos genes ALD6 e ACS1mostraram um nível 50 vezes maior de atividade de ALD, comparado com alinhagem ΕΡΥ213 controle, conforme mostrado na figura 14A. Superexpres-são de ambos genes ALD6e ACS1 não resultou em um aumento na ativida-de de ACS, conforme mostrado na figura 14B. Análise de eletroforese emdodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) mostrou que maisproteína com um peso molecular deduzido de ACS foi observado na linha-gem superexpressando ambos genes ALD6e ACS1, conforme mostrado nafigura 14C.

No procarionte Salmonella enteríca, ACS é pós-traducionalmente regulada através de acetilação/desacetilação do resíduoLys-609, conforme mostrado esquematicamente na figura 15. A proteína a-cetil transferase (Pat) catalisa a reação de acetilação; acetilação de ACStorna a enzima inativa. CobB, codificando a proteína desacetilase Sir2 de-pendente de NAD+ catalisa a desacetilação de Lys-609 de ACS; remoção dogrupo acetila inibidor ativa ACS. O Leu-641 de ACS de S. enteríca é críticopara a acetilação do resíduo Lys-609. Embora a atividade de ACSL641Pderivada de S. enteríca seja cerca de um terço daquela de ACS do tipo sel-vagem, Pat não acetila ACSL641P e não inibe sua atividade. As seqüênciasde aminoácido circundando o sítio de acetilação são conservadas entre ACSde S. enteríca e ACS de S. cerevisiae, conforme mostrado na figura 16.

Exemplo 3: Produção de altos níveis de um composto isoprenóide em umacélula de levedura geneticamente modificada

Plasmídeo pRS425-Leu2d foi construído deletando o promotorcomeçando dos 29 pares de base antes do códon de início ATG do geneLEU2em pRS425ADS para criar o alelo Ieu2-d. Um plasmídeo de 2 mícronsleu2-d como o marcador de seleção foi previamente verificado aumentar onúmero de cópia e estabilidade do plasmídeo. O plasmídeo pRS415-Leu2d émostrado esquematicamente na figura 21.

A linhagem de S. cerevisiae EPY224 foi curada do plasmídeopRS425ADS e transformada com um pRS425ADS-Leu2d recém-construído.

Cada uma dessas linhagens (EPY224 contendo pRS425ADS; eEPY224 contendo pRS425ADS-Leu2d) foi cultivada da noite para o dia emum tubo de cultura contendo 10 mL de meio sinteticamente definido (semleucina, histidina e metionina) contendo 2% de glicose. Seis culturas de 50mL foram inoculadas de cada uma das culturas da noite para o dia. Trêscontinham meio sinteticamente definido (SD) sem leucina, suplementadocom um adicional de 1mM de metionina e contendo 1,8% de galactose/0,2%de glicose; este meio é referido como SD-Leu). Três continham meio YP (ex-trato de levedura, peptona) suplementado com um adicional de 1 mM de me-tionina e contendo 1,8% de galactose/0,2% de glicose; este meio é referidocomo YPG. 5 mL de dodecano foram também adicionados a cada frasco.

As culturas foram cultivadas por 144 horas. A cada 24 horas acamada de dodecano era amostrada para quantificar os níveis de amorfadi-eno através de GC-MS. A densidade óptica (OD6oo) foi também medida. Osníveis de amorfadieno ao longo do tempo são apresentados na figura 22.Conforme mostrado na figura 22, após 120 horas em cultura, EPY224 con-tendo pRS425ADS-Leu2d e cultivada em meio YPG produziu amorfadienoem níveis acima de 700 pg/ml; EPY224 contendo pRS425ADS e cultivadaem meio YPG produziu amorfadieno em níveis acima de cerca de 500 pg/ml;EPY224 contendo ou pRS425ADS-Leu2d ou pRS425ADS e cultivada emSD-Leu produziu níveis baixos de amorfadieno.

A estabilidade do plasmídeo foi testada em 24, 72 e 144 horas.Uma pequena alíquota de cada cultura foi diluída em posta em placa emplacas de Levedura Peptona Dextrose (YPD; "rica") e SD-Leu ("seletiva").Colônias foram contadas em cada placa e a porcentagem de células retendoo plasmídeo foi determinada dividindo a contagem de célula nas placas sele-tivas para as células contendo o plasmídeo (SD-Leu) pelas placas não-seletivas (YPD). A figura 23 é um gráfico mostrando a porcentagem de célu-las retendo o plasmídeo ao longo do tempo, quando cultivadas em váriosmeios de cultura: EPY224 contendo pRS425ADS e cultivada em meio seleti-vo (SD-Leu) ("Leu2 seletivo"); EPY224 contendo pRS425ADS-Leu2d e culti-vada em meio seletivo ("Leu2-d seletivo"); EPY224 contendo pRS425ADS ecultivada em meio rico (YPF) ("LEU2 Rico"); e EPY224 contendopRS425ADS-Leu2 e cultivada em meio rico ("Leu2-d Rico").

Embora a presente invenção tenha sido descrita com referênciaàs suas modalidades específicas, deve ser compreendido por aqueles ver-sados na técnica que várias mudanças podem ser feitas e equivalentes po-dem ser substituídos sem se afastar dos verdadeiros espírito e escopo dainvenção. Ainda, muitas modificações podem ser feitas para adaptar umasituação, material, composição de matéria, processo etapa ou etapas deprocesso particulares ao objetivo, espírito e escopo da presente invenção.Todas tais modificações pretendem estar dentro do escopo das reivindica-ções apensas.Listagem de Seqüência

<110> SHXBA, YOICHIROKIRBY, JAMESPARADISEf ERIC M.KEASLING, JAY D.

<120>- "CÉLULAS HOSPEDEIRAS GENETICAMENTE MODIFICADAS E USO DASMESMAS PARA PRODUÇÃO DE COMPOSTOS ISOPRENÓIDES".

<130> BERK-05IWO

<150> 60/709,605<151> 2005-08-19

<150> 60/759,674<151> 2006-01-17

<150> 60/771,773<151> 2006-02-08

<160> 25

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1<211> 1509<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência codificada truncada da hidroximetilglutaril co-enzima A redutase

<400> 1

atggttttaa ccaataaaac agtcatttct ggatcgaaag tcaaaagttt atcatctgcg 60caatcgagct catcaggacc ttcatcatct agtgaggaag atgattcccg cgatattgaa 120agcttggata agaaaatacg tcctttagaa gaattagaag cattattaag tagtggaaat 180acaaaacaat tgaagaacaa agaggtcgct gccttggtta ttcacggtaa gttacctttg 240tacgctttgg agaaaaaatt aggtgatact acgagagcgg ttgcggtacg taggaaggct 300ctttcaattt tggcagaagc tcctgtatta gcatctgatc gtttaccata taaaaattat 360gactacgacc gcgtatttgg cgcttgttgt gaaaatgtta taggttacat gcctttgccc 420gttggtgtta taggcccctt ggttatcgat ggtacatctt atcatatacc aatggcaact 480acagagggtt gtttggtagc ttctgccatg cgtggctgta aggcaatcaa tgctggcggt 540ggtgcaacaa ctgttttaac taaggatggt atgacaagag gcccagtagt ccgtttccca 600actttgaaaa gatctggtgc ctgtaagata tggttagact cagaagaggg acaaaacgca 660attaaaaaag cttttaactc tacatcaaga tttgcacgtc tgcaacatat tcaaacttgt 720ctagcaggag atttactctt catgagattt agaacaacta ctggtgacgc aatgggtatg 780aatatgattt ctaaaggtgt cgaatactca ttaaagcaaa tggtagaaga gtatggctgg 840gaagatatgg aggttgtçtc cgttfcctggt aactactgta ccgacaaaaa accagctgcc 900atcaactgga tcgaaggtcg tggtaagagt gtcgtcgcag aagctactat tcctggtgat 960gttgtcagaa aagtgttaaa aagtgatgtt tccgcattgg ttgagttgaa cattgctaag 1020aatttggttg gatctgcaat ggctgggtct gttggtggat ttaacgcaca tgcagctaat 1080ttagtgacag ctgttttctt ggcattagga caagatcctg cacaaaatgt tgaaagttcc 1140aactgtataa cattgatgaa agaagtggac ggtgatttga gaatttccgt atccatgcca 1200tccatcgaag taggtaccat cggtggtggt actgttctag aaccacaagg tgccatgttg 1260gacttattag gtgtaagagg cccgcatgct accgctcctg gtaccaacgc acgtcaatta 1320gcaagaatag ttgcctgtgc cgtcttggca ggtgaattat ccttatgtgc tgccctagca 1380gccggccatt tggttcaaag tcatatgacc cacaacagga aacctgctga accaacaaaa 1440cctaacaatt tggacgccac tgatataaat cgtttgaaag atgggtccgt cacctgcatt 1500aatcctaa

<210> 2<211> 502<212> PRT

<213 > Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência truncada da hidroximetilglutaril co-enzima A redutase

<400> 2 Met Val Leu Thr Asn Lys Thr Val Ile Ser Gly Ser Lys Val Lys Ser1 5 10 15 Leu Ser Ser Ala Gln Ser Ser Ser Ser Gly Pro Ser Ser Ser Ser Glu20 25 30 Glu Asp Asp Ser Arg Asp Ile Glu Ser Leu Asp Lys Lys Ile Arg Pro35 40 45 Leu Glu Glu Leu Glu Ala Leu Leu Ser Ser Gly Asn Thr Lys Gln Leu50 55 60 Lys Asn Lys Glu Val Ala Ala Leu Val Ile His Gly Lys Leu Pro Leu55 70 75 80Tyr Ala Leu Glu Lys Lys Leu Gly Asp Thr Thr Arg Ala Val Ala Val 85 90 95 Arg Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu Ala Glu Ala Pro Val Leu Ala Ser100 105 110 Asp Arg Leu Pro Tyr Lys Asn Tyr Asp Tyr Asp Arg Val Phe Gly Ala 115 120 125 Cys Cys Glu Asn Val Ile Gly Tyr Met Pro Leu Pro Val Gly Val Ile130 135 140 Gly Pro Leu Val Ile Asp Gly Thr Ser Tyr His Ile Pro Met Ala Thr145 150 155 160Thr Glu Gly Cys Leu Val Ala Ser Ala Met Arg Gly Cys Lys Ala Ile 165 170 175 Asn Ala Gly Gly Gly Ala Thr Thr Val Leu Thr Lys Asp Gly Met Thr180 185 190 Arg Gly Pro Val Val Arg Phe Pro Thr Leu Lys Arg Ser Gly Ala Cys 195 200 205 Lys Xle Trp Leu Asp Ser Glu Glu Gly Gln Asn Ala Ile Lys Lys Ala210 215 220 Phe Asn Ser Thr Ser Arg Phe Ala Arg Leu Gln His Ile Gln Thr Cys225 230 235 240Leu Ala Gly Asp Leu Leu Phe Met Arg Phe Arg Thr Thr Thr Gly Asp 245 250 255 Ala Met Gly Met Asn Met Ile Ser Lys Gly Val Glu Tyr Ser Leu Lys260 265 270 Gln Met Val Glu Glu Tyr Gly Trp Glu Asp Met Glu Val Val Ser Val275 280 285 Ser Gly Asn Tyr Cys Thr Asp Lys Lys Pro Ala Ala Ile Asn Trp Ile290 295 300 Glu Gly Arg Gly Lys Ser Val Val Ala Glu Ala Thr Ile Pro Gly Asp 305 310 315 320Val Val Arg Lys Val 325 Leu Lys Ser Asp Val 330 Ser Ala Leu Val Glu 335 LeuAsn Ile Ala Lys Asn Leu Val Gly Ser Ala Met Ala Gly Ser Val Gly340 345 350 Gly Phe Asn Ala His Ala Ala Asn Leu Val Thr Ala Val Phe Leu Ala355 360 365 Leu Gly Gln Asp Pro Ala Gln Asn Val Glu Ser Ser Asn Cys Ile Thr370 375 380 Leu Met Lys Glu Val Asp Gly Asp Leu Arg Ile Ser Val Ser Met Pro385 390 395 400Ser Ile Glu Val Gly Thr Ile Gly Gly Gly Thr Val Leu Glu Pro Gln 405 410 415Gly Ala Met Leu 420 Asp Leu Leu Gly Val Arg Gly Pro His Ala Thr Ala 425 430Pro Gly Thr 435 Asn Ala Arg Gln Leu Ala Arg Ile Val Ala Cys Ala Val 440 445Leu Ala Gly Glu Leu Ser Leu Cys Ala Ala Leu Ala Ala Gly His Leu 450 455 460Val Gln Ser His Met Thr His Asn Arg Lys Pro Ala Glu Pro Thr Lys465 470 475 480Pro Asn Asn Leu Asp 485 Ala Thr Asp Ile Asn Arg Leu Lys Asp Gly Ser 490 495Val Thr Cys Ile 500 Lys Ser

<210> 3<211> 32<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético<400> 3

ggactagtaa aacaatggcc ctgaccgaag ag

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético

<400> 4

ccaagctttc agatggacat cgggtaaac

<210> 5<211> 35<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético<400> 5

cgggatccaa aacaatggct gcagaccaat tggtg

<210> 6<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético<400> 6

gcgtcgactt aggatttaat gcaggtgacg

<210> 7<211> 29<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciadorsintético<400> 7

ctgccgcggg gccgcaaatt aaagccttc

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético

<400> 8

ctgccgcggt agtacggatt agaagccgc

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético

<400> 9

cgggatccaa aacaatgagc gaagtcggta tacag

<210> 10<211> 34<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético<400> 10

gcgtcgac&G ataacgaaaa atcagagaaa tttg

<210> 11<211> 36<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético<400> 11

cgggatccaa aacaatgaca tccgatgatg ggaatg

<210> 12

<211> 34

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético

<400> 12gcgtcgactt acataaaagc tgaaaagttt gtag

<210> 13<211> 37

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético

<400> 13

ggactagtaa aacaatggct tcagaaaaag aaattag

<210> 14<211> 30<212> DKA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético

<400> 14

tcccccgggc tatttgcttc tcttgtáaac

<210> 15<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético

<400> 15

Ile Val Arg His Leu Ile Asp Ser Val Lys Leu1 5 10

<210> 16<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético

<400> 16

Ile Val Arg His Ser Ile Asp Ser Val Lys Leu1 5 10

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético

<400> 17

Ile Val Arg His Pro Ile Asp Ser Val Lys Leu1 5 io<210> 18<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético<400> 18

Asp Leu Pro Lys Thr Arg Ser Gly Lys Ile Met Arg Arg Ile Leu Arg

1 5 10 15

Lys

<210> 19<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Iniciador sintético<400> 19

Asp Leu Pro Lys Thr Arg Ser Gly Ser Ile Met Arg Arg Ile Leu Arg

1 5 .10 15

Lys

<210> 20<211> 52<212> PRT

<213> Salmonella enterica<400> 20

Ser Leu Pro Lys Thr Arg Ser Gly Lys Ile Met Arg Arg Ile Leu Arg1 5 10 15 Lys Ile Ala Ala Gly Asp Thr Ser Asn Leu Gly Asp Thr Ser Thr Leu 20 25 30 Ala Asp Pro Gly Val Val Glu Lys Leu Leu Glu Glu Lys Gln Ala Ile 35 40 45 Ala Met Pro Ser

50

<210> 21<211> 47<212> PRT

<213> Saccharornyces cerevisiae<400> 21

Asp Leu Pro Lys Thr Arg Ser Gly Lys Ile Met Arg Arg Ile Leu Arg

1 5 10 15

Lys Ile Leu Ala Gly Glu Ser Asp Gln Leu Gly Asp Val Ser Thr Leu

20 25 . 30

Ser Asn Pro Gly Ile Val Arg His Leu Ile Asp Ser Val Lys Leu35 40 45

<210> 22<211> 500<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 22 Met Thr Lys Leu His Phe Asp Thr1 5 Pro Asn Gly Leu Thr Tyr Glu Gln 20 Lys Phe Met Lys Ala Gln Asp Gly 35 40Ser Thr Glu Asn Thr Val Cys Glu 50 55 Val Glu Tyr Ala Ile Glu Cys Ala65 70 Trp Ala Thr Gln Asp Pro Arg Glu 85 Ala Asp Glu Leu Glu Ser Gln Ile 100 Iieu Asp Asn Gly Lys Thr Leu Ala 115 120Ala Ile Asn Cys Leu Arg Asp Ala 130 135 Gly Arg Thr Ile Asn Thr Gly Asp145 150 Glu Pro Ile Gly Val Cys Gly Gln 165 Met Met Leu Ala Trp Lys Ile Ala 180 Cys Ile Leu Lys Pro Ala Ala Val 195 200Ala Ser Leu Cys Lys Lys Val Gly 210 215 Val Pro Gly Pro Gly Arg Thr Val225 230 Arg Ile Arg Lys Leu Ala Phe Thr 245 Val Ala Val Asp Ser Ser Glu Ser 260 Leu Gly Gly Lys Ser Ala His Leu 275 280Lys Thr Leu Pro Asn Leu Val Asn 290 295 Ile Cys Ser Ser Gly Ser Arg Ile305 310 Glu Leu Leu Ala Ala Phe Lys Ala 325 Gly Asn Pro Phe Asp Lys Ala Asn 340 Gln Gln Phe Asp Thr Ile Met Asn 355 360Gly Ala Lys Ile Leu Thr Gly Gly 370 375 Phe Ile Arg Pro Thr Val Phe Tyr385 390 Val Lys Glu Glu Ile Phe Gly Pro 405 Thr Leu Glu Glu Gly Val Glu Met 420 Gly Ser Gly Ile Glu Thr Glu Ser 435 440Lys Met Leu Lys Ala Gly Thr Val

Ala Glu Pro Val Lys Ile Thr Leu 10 15 Pro Thr Gly Leu Phe Ile Asn Asn25 30 Lys Thr Tyr Pro Val Glu Asp Pro 45 Val Ser Ser Ala Thr Thr Glu Asp 60 Asp Arg Ala Phe His Asp Thr Glu 75 80Arg Gly Arg Leu Leu Ser Lys Leu 90 95 Asp Leu Val Ser Ser Ile Glu Ala105 110 Leu Ala Arg Gly Asp Val Thr Ile 125 Ala Ala Tyr Ala Asp Lys Val Asn 140 Gly Tyr Met Asn Phe Thr Thr Leu 155 160Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Ile 170 175 Pro Ala Leu Ala Met Gly Asn Val185 190 Thr Pro Leu Asn Ala Leu Tyr Phe 205 Ile Pro Ala Gly Val Val Asn Ile 220 Gly Ala Ala Leu Thr Ash Asp Pro 235 240Gly Ser Thr Glu Val Gly Lys Ser 250 255 Asn Leu Lys Lys Ile Thr Leu Glu:?>fe'5 270 Val Phe Asp Asp Ala Asn Ile Lys 285 Gly Ile Phe Lys Asn Ala Gly Gln 300 Tyr Val Gln Glu Gly Ile Tyr Asp 315 320Tyr Leu Glu Thr Glu Ile Lys Val 330 335 Phe Gln Gly Ala Ile Thr Asn Arg345 350 Tyr Ile Asp Ile Gly Lys Lys Glu 365 Glu Lys Val Gly Asp Lys Gly Tyr 380 Asp Val Asn Glu Asp Met Arg Ile 395 400Val Val Thr Val Ala Lys Phe Lys 410 415 Ala Asn Ser Ser Glu Phe Gly Leu 425 430 Leu Ser Thr Gly Leu Lys Val Ala 445 Trp Ile Asn Thr Tyr Asn Asp Phe450 455 460

Asp Ser Arg Val Pro Phe Gly Gly Val Lys Gln Ser Gly Tyr Gly Arg465 470 475 480

Glu Met Gly Glu Glu Val Tyr His Ala Tyr Thr Glu Val Lys Ala Val485 490 495

Arg Ile Lys Leu500

<210> 23<211> 1503<212> DNA

<213> Saccharoroyces cerevisiae<400> 23

atgactaagc tacactttga cáctgctgaa ccagtcaaga tcacacttcc aaatggtttg 60

acatacgagc aaeeaaecgg tetatteatt aaeaaeaagt ttatgaaagc tcaagacggt 120

aagacctatc ccgtcgaaga tccttccact gaaaacaccg tttgtgaggt ctcttctgcc 180

accactgaag atgttgaata tgctatcgaa tgtgccgace gtgctttcca cgacactgaa 240

tgggctaccc aagacccaag agaaagagge cgtctactaa gtaagttggc tgacgaattg 300

gaaagccaaa ttgacttggt ttcttccatt gaagctttgg acaatggtaa aactttggcc 360

ttagcccgtg gggatgttac cattgcaatc aactgtctaa gagatgetge tgcctatgee 420

gacaaagtca acggtagaac aatcaacaeç ggtgacggct acatgaactt caccacctta 480

gagccaatcg gtgtcfcgtgg tcaaattatt ccatggaaet ttccaataat gatgttggct 540

tggaagatcg ccccagcatt ggccatgggt aacgtctgta tcttgaaacc cgctgctgtc 600

acacctttaa atgccctata ctttgcttct ttatgtaaga aggttggtat tccagctggt 660

gtcgtcaaca tegttceagg tcctggtaga actgttggtg etgetttgae caacgaccca 720agaatcagaa agctggcttt taccggttct acagaagtcg gtaagagtgt tgctgtcgac 780tettetgaat ctaacttgaa gaaaatcact ttggaactag gtggtaagtc cgcccatttg 840

gtctttgacg atgctaacat taagaagact ttaceaaatc tagtaaacgg tattttcaag 900

aacgctggtc aaatttgttc ctctggttct agaatttacg ttcaagaagg tatttacgae 960gaactattgg ctgctttcaa ggettacttg gaaaccgaaa tcaaagttgg taatccattt 1020

gacaaggcta acttecaagg tgctatcact aaccgtcaac aattcgacac aattatgaac 1080tacatcgata tcggtaagaa agaaggcgcc aagatcttaa ctggtggcga aaaagteggt 1140gaeaagggtt aetteateag accaaccgtt ttctacgatg ttaatgaaga catgagaatt 1200gttaaggaag aaatttttgg accagttgtc actgtcgcaa agttcaagac tttagaagaa 1260

ggtgtcgaaa tggetaaeag ctctgaattc ggtctaggtt ctggtatcga aacagaatct 1320ttgagcacag gtttgaaggt ggccaagatg ttgaaggccg gtaccgtctg gatcaacaca 1380

tacaacgatt ttgactccag agttccattc ggtggtgtta agcaatctgg ttacggtaga 1440gaaatgggtg aagaagtcta ccatgcatac actgaagtaa aagctgtcag aattaagttg 1500taa 1503

<210> 24<211> 713<212> PRT

<213> Saecharomyces cerevisiae

<400> 24

Met Ser Pro Ser Ala Val Gln Ser Ser Lys Leu Glu Glu Gln Ser Ser1 5 10 15 Glu Ile Asp Lys 20 Leu Lys Ala Lys Met 25 Ser Gln Ser Ala Ala 30 Thr AlaGln Gln Lys 35 Lys Glu His Glu Tyr 40 Glu His Leu Thr Ser 45 Val Lys IleVal Pro 50 Gln Arg Pro Ile Ser 55 Asp Arg Leu Gln Pro 60 Ala Ile Ala ThrHis Tyr Ser Pro HiS Leu Asp Gly Leu Gln Asp Tyr Gln Arg Leu His65 70 75 80Lys Glu Ser Ile Glu 85 Asp Pro Ala Lys Phe 90 Phe Gly Ser Lys Ala 95 ThrGln Phe Leu Asn Trp Ser Lys Pro Phe Asp Lys Val Phe Ile Pro Asp 100 105 110Pro Lys Thr Gly Arg Pro Ser Phe Gln Asn Asn Ala Trp Phe Leu Asn

115 120 125

Gly Gln Leu Asn Ala Cys Tyr Asn Cys Val Asp Arg His Ala Leu Lys

130 135 140

Thr Pro Asn Lys Lys Ala Ile Ile Phe Glu Gly Asp Glu Pro Gly Gln145 150 155 160

Gly Tyr Ser Ile Thr Tyr Lys Glu Leu Leu Glu Glu Val Cys Gln Val

165 170 175

Ala Gln Val Leu Thr Tyr Ser Met Gly Val Arg Lys Gly Asp Thr Val

180 185 190

Ala Val Tyr Met Pro Met Val Pro Glu Ala Ile Ile Thr Leu Leu Ala

195 200 205

Ile Ser Arg He Gly Ala Ile His Ser Val Val Phe Ala Gly Phe Ser

210 215 220

Ser Asn Ser Leu Arg Asp Arg Ile Asn Asp Gly Asp Ser Lys Val Val225 230 235 240

Ile Thr Thr Asp Glu Ser Asn Arg Gly Gly Lys Val Ile Glu Thr Lys

245 250 255

Arg Ile Val Asp Asp Ala Leu Arg Glu Thr Pro Gly Val Arg His Val

260 265 270

Leu Val Tyr Arg Lys Thr Asn Asn Pro Ser Val Ala Phe His Ala Pro

275 280 285

Arg Asp Leu Asp Trp Ala Thr Glu Lys Lys Lys Tyr Lys Thr Tyr Tyr

290 295 300

Pro Cys Thr Pro Val Asp Ser Glu Asp Pro Leu Phe Leu Leu Tyr Thr305 310 315 320

Ser Gly Ser Thr Gly Ala Pro Lys Gly Val Gln His Ser Thr Ala Gly

325 330 335

Tyr Leu Leu Glyi Ala Leu Leu Thr Met Arg Tyr Thr Phe Asp Thr His

340 345 350

Gln Glu Asp Val Phe Phe Thr Ala Gly Asp Ile Gly Trp Ile Thr Gly

355 360 365

His Thr Tyr Val Val Tyr Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Cys Ala Thr Leu

370 375 380

Val Phe Glu Gly Thr Pro Ala Tyr Pro Asn Tyr Ser Arg Tyr Trp Asp385 390 395 400

Ile Ile Asp Glu His Lys Val Thr Gln Phe Tyr Val Ala Pro Thr Ala

405 410 415

Leu Arg Leu Leu Lys Arg Ala Gly Asp Ser Tyr Ile Glu Asn His Ser

420 425 430

Leu Lys Ser Leu Arg Cys Leu Gly Ser Val Gly Glu Pro Ile Ala Ala

435 440 445

Glu Val Tzp Glu Trp Tyr Ser Glu Lys Ile Gly Lys Asn Glu Ile Pro

450 455 460

Ile Val Asp Thr Tyr Trp Gln Thr Glu Ser Gly Ser His Leu Val Thr465 470 475 480

Pro Leu Ala Gly Gly Val Thr Pro Met Lys Pro Gly Ser Ala Ser Phe

í 485 490 495

Pro Phe Phe Gly Ile Asp Ala Val Val Leu Asp Pro Asn Thr Gly Glu

500 505 510

Glu Leu Asn Thr Ser His Ala Glu Gly Val Leu Ala Val Lys Ala Ala

515 520 525

Trp Pro Ser Phe Ala Arg Thr Ile Trp Lys Asn His Asp Arg Tyr Leu

530 535 540

Asp Thr Tyr Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Tyr Tyr Phe Thr Gly Asp Gly545 550 555 560

Ala Ala Lys Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Trp Ile Leu Gly Arg Val Asp

565 570 575

Asp Val Val Asn Val Ser Gly His Arg Leu Ser Thr Ala Glu Ile Glu

580 585 590

Ala Ala Ile Ile Glu Asp Pro Ile Val Ala Glu Cys Ala Val Val Gly595 600 605$he Asn Asp Asp Leu Thr Gly Gln Ala Val Ala Ala Phe Val Val Leu610 615 620Lys Asn Lys Ser Ser Trp Ser Thr Ala Thr Asp Asp Glu Leu Gln Asp625 630 635 640Ile Lys Lys His Leu Val Phe Thr Val Arg Lys Asp Ile Gly Pro Phe 645 650 655Ala Ala Pro Lys Leu Ile Ile Leu Val Asp Asp Leu Pro Lys Thr Arg 660 665 670Ser Gly Lys Ile Met Arg Arg Ile Leu Arg Lys Ile Leu Ala Gly Glu 675 680 685Ser Asp Gln Leu Gly Asp Val Ser Thr Leu Ser Asn Pro Gly Ile Val 690 695 700Arg His Leu Ile Asp Ser Val Lys Leu 705 710

<210> 25<211> 2142<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae<400> 25

atgtcgccct ctgccgtaca atcatcaaaa ctagaagaac agtcaagtga aattgacaag 60ttgaaagcaa aaatgtccca gtctgccgcc actgcgcagc agaagaagga acatgagtat 120gaacatttga cttcggtcaa gatcgtgcca caacggccca tctcagatag actgcagccc 180gcaattgcta cccactattc tccacacttg gacgggttgc aggactatca gcgcttgcac 240aaggagtcta ttgaagaccc tgctaagttc ttcggttcta aagctaccca atttttaaac 300tggtctaagc cattcgataa ggtgttcatc ccagacccta aaacgggcag gccctccttc 360cagaacaatg catggttcct caacggccaa ttaaacgcct gttacaactg tgttgacaga 420catgccttga agactcctaa caagaaagcc attattttcg aaggtgacga gcctggccaa 480ggctattcca ttacctacaa ggaactactt gaagaagttt gtcaagtggc acaagtgctg 540acttactcta tgggcgttcg caagggcgat aetgttgccg tgtacatgcc tatggtccca 600gaagcaatca taaccttgtt ggccatttcc cgtatcggtg ccattcactc cgtagtcttt 660gccgggtttt cttccaactc cttgagagat cgtatcaacg atggggactc taaagttgtc 720atcactacag atgaatccaa cagaggtggt aaagtcattg agactaaaag aattgttgat 780gacgcgctaa gagagacccc aggcgtgaga cacgtcttgg tttatagaaa gaccaacaat 840ccatctgttg ctttccatgc ccccagagat ttggattggg caacagaaaa gaagaaatac 900aagacctact atccatgcac acccgttgat tctgaggatc cattattctt gttgtatacg 960tctggttcta ctggtgcccc caagggtgtt caacattcta ccgcaggtta cttgctggga 1020gctttgttga ccatgcgcta cacttttgac actcacoaag aagacgtttt cttcacagcf. 1080ggagacattg gctggattac aggccacact tatgtggttt atggtccctt actatatggc 1140tgtgccactt tggtctttga agggactcct gcgtacccaa attactcccg ttattgggat 1200attattgatg aacacaaagt cacccaattt tatgttgcgc caactgcttt gcgtttgttg 1260aaaagagctg gtgattccta catcgaaaat cattccttaa aatctttgcg ttgcttgggt 1320tcggtcggtg agccaattgc tgctgaagtt tgggagtggt actctgaaaa aataggtaaa 1380aatgaaatcc ccattgtaga cacctactgg caaacagaat ctggttcgca tctggtcacc 1440ccgctggctg gtggtgttac accaatgaaa ccgggttctg cctcattccc cttcttcggt 1500attgatgcag ttgttcttga ccctaacact ggtgaagaac ttaacaccag ccacgcagag 1560ggtgtccttg ccgtcaaagc tgcatggcca tcatttgcaa gaactatttg gaaaaatcat 1620gataggtatc tagacactta tttgaaccct taccctggct actatttcac tggtgatggt 1680gctgcaaagg ataaggatgg ttatatctgg attttgggtc gtgtagacga tgtggtgaac 1740gtctctggtc accgtctgtc taccgctgaa attgaggctg ctattatcga agatccaatt 1800gtggccgagt gtgctgttgt cggattcaac gatgacttga ctggtcaagc agttgctgca 1860tttgtggtgt tgaaaaacaa atctagttgg tccaccgcaa cagatgatga attacaagat 1920atcaagaagc atttggtctt tactgttaga aaagacatcg ggccatttgc cgcaccaaaa 1980ttgatcattt tagtggatga cttgcccaag acaagatccg gcaaaattat gagacgtatt 2040ttaagaaaaa tcctagcagg agaaagtgac caactaggcg acgtttctac attgtcaaac 2100cctggcattg ttagacatct aattgattcg gtcaagttgt aa 2142

Claims

1. Célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada queproduz níveis aumentados de acetil-CoA, a célula hospedeira eucarióticageneticamente modificada compreendendo modificações genéticas que pro-vêem:a) um nível aumentado de atividade de acetaldeído desidroge-nase (ALD), e/oub) um nível aumentado de atividade de acetil-CoA sintetase(ACS)1em que as modificações genéticas provêem produção de acetil-CoA em Umnível que é maior do que o nível de acetil-CoA produzida em uma célula con-trole não compreendendo as modificações genéticas.

2. Célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada deacordo com a reivindicação 1, compreendendo uma seqüência de nucleotí-deo codificando ALD.

3. Célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada deacordo com a reivindicação 1, compreendendo uma seqüência de nucleotí-deo codificando ACS.

4. Célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada deacordo com a reivindicação 3, em que a ACS é uma ACS variante que temsusceptibilidade reduzida à acetilação pós-traducional.

5. Célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada deacordo com a reivindicação 1, em que a célula hospedeira eucariótica gene-ticamente modificada é uma célula de levedura.

6. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo com areivindicação 5, em que a célula hospedeira eucariótica geneticamente modi-ficada é Saccharomyces cerevisiae.

7. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo com areivindicação 1, compreendendo ainda uma ou mais modificações genéticasque provêem um nível aumentado de atividade de uma ou mais enzimas davia do mevalonato.

8. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo com areivindicação 1, compreendendo uma ou mais modificações genéticas queprovêem nível aumentado de atividade de preniltransferase.

9. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo com areivindicação 1, compreendendo ainda uma ou mais modificações genéticasque provêem um nível diminuído de atividade esqualeno sintase.

10. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 1, em que a célula hospedeira geneticamente modificada égeneticamente modificada mais com um ácido nucléico compreendendo umaseqüência de nucleotídeo codificando uma hidroximetilglutaril co-enzima-Aredutase truncada.

11. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 7, em que a célula hospedeira geneticamente modificada égeneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição Ecm22p variante,variante que tem atividade de ativação transcripcional aumentada compara-do com Ecm22p do tipo selvagem, em que o nível de transcrição de uma oumais enzimas da via do mevalonato é aumentado.

12. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 11, em que o nível de transcrição da hidroximetilglutaril co-enzima-A sintase, mevalonato cinase e fosfomevalonato cinase é aumentado.

13. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 7, em que a célula hospedeira geneticamente modificada égeneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo uma se-qüência de nucleotídeo codificando um fator de transcrição Upc2 variante,variante que tem atividade de ativação transcripcional aumentada compara-do com Upc2p do tipo selvagem, em que o nível de transcrição de uma oumais enzimas da via do mevalonato é aumentado.

14. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 13, em que o nível de transcrição da hidroximetilglutaril co-enzima-A sintase, mevalonato cinase e fosfomevalonato cinase é aumentado.

15. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 8, em que a célula hospedeira geneticamente modificada égeneticamente modificada com um ácido nucléico compreendendo um pro-motor heterólogo, em que o promotor substitui um promotor endógeno ope-ravelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo endógena codificandofarnesil pirofosfato sintase, em que o promotor heterólogo provê um nívelaumentado de farnesil pirofosfato sintase comparado com uma célula hos-pedeira controle.

16. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 15, em que o promotor heterólogo é um promotor GAL1.

17. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 8, em que a célula hospedeira geneticamente modificadacompreende um promotor heterólogo, em que o promotor substitui um pro-motor endógeno operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo en-dógena codificando geranil pirofosfato sintase, em que o promotor heterólo-go provê um nível aumentado de geranil pirofosfato sintase comparado comuma célula hospedeira controle.

18. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 17, em que o promotor heterólogo é um promotor GAL1.

19. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 8, em que a célula hospedeira geneticamente modificadacompreende um promotor heterólogo, em que o promotor substitui um pro-motor endógeno operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo en-dógena codificando geranilgeranil pirofosfato sintase, em que o promotorheterólogo provê um nível aumentado de geranilgeranil pirofosfato sintasecomparado com uma célula hospedeira controle.

20. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 19, em que o promotor heterólogo é um promotor GAL1.

21. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 9, em que a célula hospedeira geneticamente modificadacompreende um promotor heterólogo, promotor heterólogo que substitui umpromotor endógeno operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeoendógena codificando esqualeno sintase, em que o promotor heterólogoprovê um nível reduzido de esqualeno sintase comparado com uma célulahospedeira controle.

22. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 1, em que a célula hospedeira geneticamente modificadacompreende ainda uma seqüência de nucleotídeo codificando uma terpenosintase.

23. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 22, em que a terpeno sintase é selecionada de amorfa-4,11-dieno sintase (ADS), beta-cariofileno sintase, germacreno A sintase, 8-epicedrol sintase, valenceno sintase, (+)-delta-cadineno sintase, germacrenoC sintase, (E)-beta-farneseno sintase, Casbeno sintase, vetispiradieno sinta-se, 5-epi-aristolocheno sintase, Aristolcheno sintase, beta-cariofileno, alfa-humuleno, (E,E)-alfa-farneseno sintase, (-)-beta-pineno sintase, Gama-terpineno sintase, Iimoneno ciclase, Linalool sintase, 1,8-cineol sintase, (+)-sabineno sintase, E-alfa-bisaboleno sintase, (+)-bornil difosfato sintase, Ie-vopimaradieno sintase, Abietadieno sintase, isopimaradieno sintase,(E)-gama-bisaboleno sintase, taxadieno sintase, copalil pirofosfato sintase, kau-reno sintase, Iongifoleno sintase, gama-humuleno sintase, Delta-selinenosintase, beta-felandreno sintase, Iimoneno sintase, mirceno sintase, terpino-leno sintase, (-)-camfeno sintase, (+)-3-careno sintase, sin-copalil difosfatosintase, alfa-terpineol sintase, sin-pimara-7,15-dieno sintase, ent-sandaaracopimaradieno sintase, estemer-13-eno sintase, E-beta-ocimeno,S-Iinalool sintase, geraniol sintase, gama-terpineno sintase, Iinalool sintase,E-beta-ocimeno sintase, epi-cedrol sintase, alfa-zingibereno sintase, guaia-dieno sintase, cascarilladieno sintase, cis-muuroladieno sintase, afidicolan-16b-ol sintase, elizabetatrieno sintase, sandalol sintase, patchoulol sintase,Zinzanol sintase, cedrol sintase, escareol sintase, copalol sintase e manoolsintase.

24. Célula hospedeira geneticamente modificada de acordo coma reivindicação 22, em que a terpeno sintase é amorfa-4,11-dieno sintase.

25. Método para aumento da produção de um precursor de iso-prenóide ou um isoprenóide em uma célula hospedeira, o método compre-endendo cultura da célula hospedeira eucariótica geneticamente modificadacomo definida na reivindicação 1, em um meio adequado e sob condiçõesque promovem produção do composto isoprenóide ou precursor de isopre-nóide, em que o composto isoprenóide ou um precursor de isoprenóide éproduzido em um nível que é maior do que o nível do composto isoprenóideou precursor de isoprenóide em uma célula controle não compreendendo asmodificações genéticas.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que as condi-ções compreendem inclusão no meio de cultura de um agente de induçãoque ativa um promotor induzível.

27. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o com-posto isoprenóide é um monoterpeno.

28. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o isopre-nóide é um politerpeno.

29. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o isopre-nóide é um diterpeno.

30. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o isopre-nóide é um triterpeno.

31. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o isopre-nóide é um carotenóide.

32. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o isopre-nóide é um sesquiterpeno.

33. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o sesqui-terpeno é amorfadieno.

34. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a célulahospedeira geneticamente modificada compreende ainda uma ou mais modi-ficações genéticas que provêem um nível aumentado de atividade de umaou mais enzimas da via do mevalonato.

35. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a célulahospedeira geneticamente modificada compreende ainda uma ou mais modi-ficações genéticas que provêem um nível aumentado de atividade de prenil-transferase.

36. Método de acordo com a reivindicação 25, em que a célulahospedeira geneticamente modificada compreende ainda uma ou mais modi-ficações genéticas que provêem um nível diminuído de atividade de esqua-leno sintase.

37. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o com-posto isoprenóide ou um precursor de isoprenóide é produzido em um nívelque é pelo menos cerca de 50% maior do que o nível do composto isopre-nóide ou precursor de isoprenóide na célula controle.

38. Célula hospedeira eucariótica geneticamente modificada deacordo com a reivindicação 1, em que as modificações genéticas provêemprodução de acetil-CoA em um nível que é pelo menos cerca de 50% maiordo que o nível de acetil-CoA produzida na célula controle.