BRPI0615400A2 - vacinas para malária baseadas em vetor adenoviral - Google Patents

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Joseph T Bruder
Imre Kovesdi
C Richter King
Duncan L Mcvey
Damodar R Ettyreddy
Denise Louise Doolan
Daniel John Carucci
Keith Limbach
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Genvec Inc
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Abstract

VACINAS PARA MALARIA BASEADAS EM VETOR ADENOVIRAL A invenção provê vetores adenovirais compreendendo um genoma adenoviral compreendendo seqúências de ácido nuclélco de codificação de antígeno heterólogo, tal comoseqúências de ácido nucléico de Plasrnodi um, ligadas de maneira operável aos promotores. A invenção provê ainda um método de induzir uma resposta imune contra malária em um mamífero compreendendo administrar os vetores adenovirais ao mamífero.

Description

VACINAS PARA MALÁRIA BASEADAS EM VETOR ADENOVIRALDeclaração Com Relação À Pesquisa E DesenvolvimentoPatrocinados Pelo Governo Federal
Esta invenção foi feita em parte com o apoio do- -Governo de acordo com Cooperative Research and DevelopmentAgreement (CRADA) Número NMR-04-1869, e emendas ao mesmo,executado entre Gen Vec, Inc. e o Naval Medicai ResearchCenter (NMRC). O Governo pode ter certos direitos sobreesta invenção.
ANTECEDENTES" DA INVENÇÃO
A malária é uma das doenças parasíticas maisdevastadoras que afetam os seres humanos. Na realidade, 41%da população do mundo vivem em áreas onde a malária étransmitida (por exemplo, partes da África, da Ásia, doOriente Médio, da América Central e do Sul, Hispaniola, eOceania). A Organização Mundial de Saúde (WHO) e os Centrospara Controle de Doenças (CDC) estimam que a maláriainfecta 300-500 milhões de pessoas e mata 700.000-3 milhõesde pessoas anualmente, com maior parte das mortes ocorrendoem crianças na África sub-Saara. A malária também é umaprincipal preocupação em termos de saúde para os militaresdos Estados Unidos operando em regiões tropicais no mundo.Por exemplo, em agosto de 2003, 28% da 26a UnidadeExpedicionária da Marinha e Força Tarefa Conjunta,brevemente empregadas na Monróvia, Libéria, foraminfectados com o parasita da malária Plasmodium falsiparum.Além disso, uma Unidade Expedicionária da Marinha de 157homens suportou uma taxa de mortalidade de 44% por malárianum periodo de 12 dias enquanto estacionados em RobertInternational Airport na Monrovia. Em todos os conflitosdurante o último século conduzidos em áreas endêmicas demalária, a malária foi a principal causa de mortes,excedendo as mortes infligidas pelo inimigo em seu impactosobre "pessoa-dias" perdidos de trabalho.
Para combater a malária durante as operações militaresdos Estados Unidos, drogas preventivas, repelentes deinsetos, e barreiras foram usadas com algum sucesso, porémdesenvolvimento de resistência à droga pelo parasita damalária e resistência ao inseticida pelos vetores demosquito limitou a eficácia desses agentes. Além disso, acarga logística e os efeitos colaterais associados ao usodesses agentes freqüentemente associados a taxas de não-submissão elevadas. As vacinas constituem as intervençõesterapêuticas mais dispendiosas, efetivas e eficientes paraas doenças infecciosas. A esse respeito, vacinação tem avantagem de administração antes do emprego dos militares eprovavelmente redução nos riscos de não-submissão. Contudo,décadas de pesquisa e desenvolvimento dirigidas para avacina da malária não comprovaram ser bem-sucedidas.Esforços recentes se concentraram no desenvolvimento devacinas contra vários genes de malária específicos esistemas de vetores de fornecimento incluindo adenovírus,vírus a catapora, e plasmídeos. O status atual dedesenvolvimento de vacina contra malária e ensaios clínicosé analisado, por exemplo, Graves and Gelband, CochraneDatabase Syst. Rev., 1: CD000129 (2003), Moore et al.,Lancet Infect. Dis., 2: 737-743 (2002), Carvalho et al,Scand. J. Inmunol, 56: 327-343 (2002), Moorthy and Hill,Br. Med. Buli, 62: 59-72 (2002), Greenwood and Alonso,Chem. Immunol, 80: 366-395 (2002), and Richie and Saul,Nature, 415: 694-701 (2002).
Durante os últimos 15-20 anos, uma série de ensaios devacina de Fase 1/2 foi reportada utilizando peptídeossintéticos ou proteínas recombinantes com base em antígenosmalariais. Aproximadamente 4 0 ensaios foram reportados comode 1998 (vide Engers and Godal, Parisitology Today, 14: 56-64 (1998)). A maioria desses ensaios foi dirigida contra oestágio de esporozoíto ou estágio de fígado do ciclo devida do Plasmodium, onde o uso de desafios de mosquitoexperimentais permitem rápido progresso através dos estudosde eficácia preliminares de Fase 1 para Fase 2a. Vacinasanti-esporozoíto testadas incluem peptídeos completamentesintéticas, conjugados de peptídeo sintético com proteínastais como toxóide tetânico (para prover ajuda de célula Τ),proteínas recombinantes de malária, construções quiméricasrecombinantes de formação de partícula, vírusrecombinantes, e vacinas de DNA e bactéria. Vários ensaiosde vacina de estágio de sangue assexual usaram osconjugados de peptídeo sintético ou proteínasrecombinantes. Também foi feito um único ensaio de umavacina de bloqueio de transmissão (Pfs25 recombinante). Umproblema recorrente identificado em todas essas estratégiasde vacinação é a dificuldade em obter uma resposta imuneduradoura e suficientemente forte em seres humanos, apesarda resposta imunogênica vigorosa em modelos animais.
Para superar essas limitações, o desenvolvimento deconjugados ou adjuvantes imune-estimulantes potentes paraestimular a resposta humana foi explorado, além dodesenvolvimento de vacinas dirigidas contra a proteínacircunsporozoíta (CSP), a principal proteína derevestimento de esporozoíto. Vacinas anti-CSP utilizandoproteínas recombinantes, conjugados de peptideo, conjugadosde proteína recombinante, e proteínas quiméricascomprovaram eliciar anticorpos anti-CSP. Embora esforçosconsideráveis ainda estejam sendo dirigidos aodesenvolvimento de vacinas baseadas em proteína;tecnologias alternativas tais como vacinas baseadas em DNAe virais mostraram alguma promessa com relação à eficáciade proteção e de imunogenicidade pelo menos em modelosanimais.
A esse respeito, vacinas de DNA codificando antígenosDe Plasmodium foram desenvolvidas e podem induzir respostasCD8+ CTL e IFN-γ, assim como proteção contra desafio deesporozoíto em camundongos (vide Sedegah et al. , Proc.Natl. Acad. Set USA, 91: 9866-9870 (1994), e Doolan et al,J. Exp. Med, 183: 1739-1746 (1996)) e macacos (Wang et al,Science, 282: 476-480 (1998), Rogers et al. , Infect.Immun., 69: 5565-5572 (2001), e Rogers et al., Infect.Immun., 70: 4329-4335 (2002)). Além disso, Ensaios clínicosde Fase I e Fase 2a estabeleceram a segurança,tolerabilidade, e imunogenicidade das vacinas de DNAcodificando antígenos de malária em seres humanos saudáveisnormais (vide, por exemplo, Wang et al. , Infect Immun., 66:4193-41202 (1998), Le et al, Vaccine, 18: 1893-1901 (2000),e Epstein et al, Hum. Gene Ther., 13: 1551-1560 (2002)).Contudo, a imunogenicidade da primeira e segunda geração devacinas de DNA em primatas não-humanos e em humanos ficouabaixo do considerado ótimo. Embora em modelos murinos, asvacinas de DNA não são eficazes na ativação de ambos osbraços do sistema imune (vide, por exemplo, Doolan et al.,supra, Sedegah et al. , supra, Sedegah et al. , Proc. NatlAcad. Set USA, 95: 7648-7653 (1998), Zavala et al,Virology, 280: 155-159 (2001), andPardoll, Nat. Rev.Immunol, 2: 227-238 (2002)).
Desse modo, permanece a necessidade de construçõesaperfeiçoadas que efetivamente forneçam antígenos damalária aos hospedeiros humanos de modo a impedir o inícioda doença e/ou proteger os hospedeiros humanos contrainfecções adicionais. A invenção provê tais construções.
Essas e outras vantagens da invenção serão evidentes apartir da descrição detalhada aqui provida.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção provê um vetor adenoviral compreendendo umgenoma adenoviral compreendendo três ou mais seqüências deácido nucléico de codificação de antígeno heterólogo, emque as três ou mais seqüências de ácido nucléico sãoligadas de maneira operável aos pelo menos dois promotoresdiferentes.
A invenção também provê um vetor adenoviralcompreendendo um genoma adenoviral compreendendo duas oumais seqüências de ácido nucléico, em que cada seqüência deácido nucléico codifica um antígeno De Plasmodium e éligado de maneira operável a pelo menos um promotor.
A invenção provê adicionalmente um método de induziruma resposta imune contra malária em um mamífero. 0 métodocompreende administrar ao mamífero (a) um vetor adenoviralcompreendendo um genoma adenoviral compreendendo três oumais seqüências de ácido nucléico, em que cada seqüência deácido nucléico codifica um antígeno de estágio pré-eritrocítico de Plasmodium e é de maneira operável ligado apelo menos um promotor, e (b) um vetor adenoviralcompreendendo um genoma adenoviral compreendendo duas oumais seqüências de ácido nucléico, em que cada seqüência deácido nucléico codifica um antígeno de estágio de sangue dePlasmodium e é de maneira operável ligado a pelo menos umpromotor, em que os antigenos são expressados nos mamíferospara induzir uma resposta imune contra a malária.
BREVE DESCRIÇÃO DAS VÁRIAS VISTAS DO DESENHO
A Figura 1 é um gráfico ilustrando os resultados de umensaio IFN-γ ELIspot conduzido duas semanas após oscamundongos serem imunizados de acordo com o regime prime-boost mostrado no Exemplo 4.
A Figura 2 é um gráfico ilustrando os resultados de umensaio IFN-γ ELIspot conduzido seis semanas após oscamundongos terem sido imunizados de acordo com o regimeprime-boost apresentado no Exemplo 4.
A Figura 3 é um gráfico ilustrando os resultados de umensaio ELISA PfAMAl-específico conduzido após oscamundongos serem imunizados de acordo com o regime prime-boost apresentado no Exemplo 4. O painel superiorcorresponde aos camundongos que não receberam umaimunização primária. O painel do meio corresponde aoscamundongos que receberam uma construção de DNA como umaimunização primária e um vetor adenoviral como um reforço.
O painel inferior corresponde aos camundongos que receberamum vetor adenoviral como uma imunização primária e um vetoradenoviral como um reforço.
A Figura 4 é um gráfico ilustrando os resultados de umensaio ELISA PfAMAl-específico conduzido após oscamundongos serem imunizados de acordo com o regime prime-boost apresentado no Exemplo 4. O painel superiorcorresponde aos camundongos que não receberam umaimunização primária. O painel do meio corresponde aoscamundongos que receberam uma construção de DNA como umaimunização primária e um vetor adenoviral como um reforço.O painel inferior corresponde aos camundongos que receberamum vetor adenoviral como uma imunização primária e um vetoradenoviral como um reforço.
A Figura 5 é um gráfico ilustrando os resultados de umensaio IFN-γ ELIspot conduzido após os camundongos seremimunizados de acordo com o regime mostrado no Exemplo 7. 0painel superior ilustra a resposta de célula-T LSAl-específica, enquanto o painel inferior ilustra a respostade célula-T CSP-específica.
A Figura 6 é um gráfico ilustrando os resultados de umensaio ELISA, conduzido após os camundongos seremimunizados de acordo com o regime apresentado no Exemplo 7.O painel superior corresponde aos camundongos que receberamuma dose de cada vetor adenoviral. 0 painel inferiorcorresponde aos camundongos que receberam duas doses decada vetor adenoviral.
A Figura 7 é um diagrama de construções de vetoradenoviral E1/E3/E4-trivalentes deletados expressando trêsdiferentes genes marcadores (isto é, luciferase, proteínafluorescente verde (GFP), e fosfatase alcalina secretada(SEAP)).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
0 desenvolvimento de uma única vacina que imuniza umhospedeiro contra múltiplos antxgenos de um único patógenoe protege contra desafio de patógeno (isto é, vacinas"multivalentes") provê um número de vantagens em relação àsmetodologias de vacinas atuais. Especificamente, as vacinasmultivalentes induzem respostas mais vigorosas dohospedeiro, e amplas contra um determinado patógeno, econstituem uma alternativa mais eficaz em termos de custopara a preparação e administração de múltiplas vacinas quevisam um único patógeno. Desse modo, a invenção provêvacinas baseadas em vetor adenoviral, multivalentesdirigidas contra malária. A esse respeito, a invenção provêum vetor adenoviral compreendendo um genoma adenoviralcompreendendo três ou mais seqüências de ácido nucléico decodificação de antígeno heterólogo, em que as três ou maisseqüências de ácido nucléico são ligadas de maneiraoperável aos pelo menos dois promotores diferentes. Ainvenção também provê um vetor adenoviral compreendendo umgenoma adenoviral compreendendo duas ou mais seqüências deácido nucléico, em que cada seqüência de ácido nucléicocodifica um antígeno Plasmodium e é ligada de maneiraoperável a pelo menos um promotor.
Adenovírus (Ad) é um vírus de DNA de filamento duplode 3 6 kb e eficientemente transfere DNA in vivo para umavariedade de diferentes tipos de células alvo. Para uso nainvenção, o adenovírus é feito preferivelmente deficienteem termos de replicação mediante deleção, integralmente ouem parte, de genes selecionados exigidos para replicaçãoviral. A região E3 que pode ser gasta também éfreqüentemente deletada para permitir espaço adicional paraum inserto de DNA maior. 0 vetor pode ser produzido emelevadas titulações e pode eficientemente transferir DNApara células replicantes e não-replicantes. A informaçãogenética recentemente transferida permanece epi-cromossomal, desse modo eliminando os riscos de mutagênesede inserção aleatória e alteração permanente do genotipo dacélula alvo. Contudo, se desejado, as propriedadesintegrativas de AAV podem ser conferidas ao adenovirusmediante construção de um vetor quimérico AAV-Ad. Porexemplo, os AAV ITRs e ácido nucléico codificando aproteína Rep incorporada em um vetor adenoviral permite queo vetor adenoviral se integre em um genoma de célula demamífero. Portanto, vetores quiméricos AAV-Ad podeconstituir uma opção desejável para uso na invenção.
Adenovirus a partir de várias origens, subtipos, oumisturas de subtipos podem ser usados como a fonte dogenoma viral para o vetor adenoviral. Embora adenovirusnão-humano (por exemplo, adenovirus de símio, aviário,canino, ovino, ou bovino) podem ser usados para gerar ovetor adenoviral, um adenovirus humano preferivelmente éusado como a fonte do genoma viral para o vetor adenoviral.Por exemplo, um adenovirus pode ser do subgrupo A (porexemplo, serotipos 12, 18, e 31), subgrupo B (por exemplo,serotipos 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35 e 50), subgrupo C(por exemplo, serotipos 1, 2, 5 e 6), subgrupo D (porexemplo, serotipos 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32,33, 36-39, e 42-48), subgrupo E (por exemplo, serotipo 4),subgrupo F (por exemplo, serotipos 4 0 e 41) , um serogruponão-classifiçado (por exemplo, serotipos 49 e 51) , ouqualquer outro serotipo adenoviral. Serotipos adenovirais 1a 51 (isto é, Adl a Ad51) estão disponíveis a partir daAmerican Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) .Preferivelmente, no contexto da invenção, o vetoradenoviral é do subgrupo C humano, especialmente serotipo 2ou ainda mais desejavelmente serotipo 5. Contudo,adenovírus não do grupo C podem ser usados para prepararvetores de transferência de gene adenoviral parafornecimento de produtos de gene às células hospedeiras.Adenovírus preferidos usados na construção de vetores detransferência de gene adenoviral não do grupo C incluemAdl2 (grupo A) , Ad7 e Ad35 (grupos Β) , Ad30 e Ad36 (grupoD) , Ad4 (grupo Ε) , e Ad41 (grupo F) . Vetores adenoviraisnão do grupo C, métodos de produzir vetores adenovirais nãogrupo C, e métodos de usar vetores adenovirais não grupo Csão revelados, por exemplo, nas Patentes US 5.801.030;5.837.511 e 5.849.561, e Publicações e Pedido de PatenteInternacional WO 97/12986 e WO 98/53087.
0 vetor adenoviral pode compreender uma mistura desubtipos e desse modo ser um vetor adenoviral "quimérico".Um vetor adenoviral quimérico pode compreender um genomaadenoviral que é derivado de dois ou mais (por exemplo, 2,3, 4, etc.) diferentes serotipos de adenovírus. No contextoda invenção, um vetor adenoviral quimérico pode compreenderaproximadamente quantidades diferentes ou iguais de genomade cada um dos dois ou mais diferentes serotipos deadenovírus. Quando o genoma de vetor adenoviral quimérico écompreendido dos genomas de dois diferentes serotipos deadenovírus, o genoma de vetor adenoviral quiméricocompreende preferivelmente não mais do que aproximadamente70% (por exemplo, não mais do que aproximadamente 65%,aproximadamente 50%, ou aproximadamente 4 0%) do genoma deum dos serotipos de adenovírus, com o restante do genoma deadenovírus quimérico sendo derivado do genoma do outroserotipo de adenovírus. Em uma modalidade, o vetoradenoviral quimérico pode conter um genoma adenoviralcompreendendo uma porção de um genoma de serotipo 2 e umaporção de um genoma de serotipo 5. Por exemplo,nucleotideos 1-456 de tal vetor adenoviral podem serderivados de um genoma de serotipo 2, enquanto que orestante dos genomas adenovirais podem ser derivados de umgenoma de serotipo 5.
O vetor adenoviral da invenção pode ser competente emtermos de replicação. Por exemplo, o vetor adenoviral podeter uma mutação (por exemplo, uma deleção, uma inserção, ouuma substituição) no genoma adenoviral que não inibe areplicação viral em células hospedeiras. 0 vetor adenoviraltambém pode ser condicionalmente competente em termos dereplicação. Preferivelmente, contudo, o vetor adenoviral édeficiente em termos de replicação em células hospedeiras.
Por "deficiente em replicação" se quer dizer que ovetor adenoviral requer complementação de uma ou maisregiões do genoma adenoviral que são exigidas parareplicação, como um resultado, por exemplo, de umadeficiência em pelo menos uma função de gene essencial dereplicação (isto é, de tal modo que o vetor adenoviral nãoreplica em células hospedeiras típicas, especialmenteaquelas em um paciente humano que poderiam estar infectadaspelo vetor adenoviral no curso do método inventivo). Umadeficiência em um gene, função de gene, ou região genômica,como aqui usada, é definida como uma mutação ou deleção dematerial genérico suficiente do genoma viral para obliterarou prejudicar a função do gene (por exemplo, de tal modoque a função do produto de gene é reduzida em pelo menosaproximadamente 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30vezes ou 50 vezes) cuja seqüência de ácido nucléico foisubmetida à mutação ou deletada integralmente ouparcialmente. A deleção de uma região de gene inteirafreqüentemente não é exigida para disrupção de uma funçãode gene essencial para replicação. Contudo, o propósito deprover espaço suficiente no genoma adenoviral para um oumais transgenes, remoção de uma maior parte de uma regiãode gene pode ser desejável. Embora deleção de materialgenético seja preferida, a mutação de material genético porintermédio da adição ou substituição também é apropriadapara disrupção da função de gene. As funções de geneessenciais para replicação são aquelas funções de gene quesão exigidas para replicação (por exemplo, propagação) esão codificadas, por exemplo, pelas regiões adenoviraisantigas (por exemplo, as regiões El E2 e E4) , regiõesrecentes (por exemplo, as regiões L1-L5), genes envolvidosem acondicionamento viral (por exemplo, o gene IVa2), eRNAs associados a vírus (por exemplo, VA-RNAl e/ou VA-RNA-2) .
0 vetor adenoviral deficiente em replicação requerdesejavelmente a complementação de pelo menos uma função degene essencial para replicação de uma ou mais regiões dogenoma adenoviral para replicação viral. Preferivelmente, ovetor adenoviral requer complementação de pelo menos umafunção de gene da região ElA, região ElB, ou da região E4do genoma adenoviral exigido para replicação viral(denotando um vetor adenoviral deficiente em El oudeficiente em E4) . Além de uma deficiência na região El, oadenovírus recombinante também pode ter uma mutação noprincipal promotor recente (MLP) conforme discutido naPublicação de Pedido de Patente Internacional WO 00/00628.Mais preferivelmente, o vetor adenoviral é deficiente empelo menos uma função de gene essencial para replicação(desejavelmente todas as funções de gene essenciais parareplicação) da região El e pelo menos uma função de gene daregião E3 não essencial (por exemplo, uma deleção Xba I daregião E3) (denotou um vetor adenoviral deficiente emE1/E3) . Com relação à região El, o vetor adenoviral pode10 ser deficiente em parte ou em toda a região ElA e/ou emparte ou em toda a região ElB7 por exemplo, em pelo menosuma função de gene essencial para replicação de cada umadas regiões ElA e ElB, desse modo exigindo complementaçãoda região ElA e da região ElB do genoma adenoviral parareplicação. 0 vetor adenoviral também pode exigircomplementação da região E4 do genoma adenoviral parareplicação, tal como através de uma deficiência em uma oumais funções de gene essencial para replicação da regiãoE4 .
Quando o vetor adenoviral é deficiente em El, o genomade vetor adenoviral pode compreender um início de deleçãoem qualquer nucleotídeo entre os nucleotídeos 335 a 375(por exemplo, nucleotídeo 356) e terminando em qualquernucleotídeo entre os nucleotídeos 3.310 a 3.350 (porexemplo, nucleotídeo 3.329) ou até mesmo terminando emqualquer nucleotídeo entre 3.490 e 3.530 (por exemplo,nucleotídeo 3.510) (com base no genoma de serotipo 5 doadenovírus). Quando deficiente em E2A, o genoma de vetoradenoviral pode compreender uma deleção começando emqualquer nucleotídeo entre os nucleotídeos 22.425 a 22.465(por exemplo, nucleotídeo 22.443) e terminando em qualquernucleotídeo entre os nucleotídeos 24.010 a 24.050 (porexemplo, nucleotídeo 24.032) (com base no genoma deserotipo 5 do adenovírus) . Quando deficiente em E3, ogenoma de vetor adenoviral pode compreender uma deleçãocomeçando em qualquer nucleotídeo entre os nucleotídeos28.575 a 29.615 (por exemplo, nucleotídeo 28.593) eterminando em qualquer nucleotídeo entre os nucleotídeos30.450 a 30.490 (por exemplo, nucleotídeo 30.470) (com baseno genoma de serotipo 5 de adenovírus). Quando deficienteem E4, o genoma de vetor adenoviral pode compreender umadeleção começando em, por exemplo, qualquer nucleotídeoentre os nucleotídeos 32.805 a 23.845 (por exemplo,nucleotídeo 32.826) e terminando, por exemplo, em qualquernucleotídeo entre os nucleotídeos 35.540 a 35.580 (porexemplo, nucleotídeo 35.561) (com base no genoma deserotipo 5 de adenovírus). Os pontos de extremidadedefinindo as porções de nucleotídeo deletadas podem serdifíceis de se determinar precisamente e tipicamente nãoafetarão significativamente a natureza do vetor adenoviral,isto é, cada um dos números de nucleotídeo anteriormentemencionados pode ser +/- 1, 2, 3, 4, 5 ou até mesmo 10 ou20 nucleotídeos.
Quando o vetor adenoviral é deficiente em pelo menosuma função de gene essencial para replicação em uma regiãodo genoma adenoviral (por exemplo, um vetor adenoviraldeficiente em El - ou E1/E3) o vetor adenoviral é referidocomo "deficiente em replicação singularmente". Um vetoradenoviral deficiente em replicação singularmenteparticularmente preferido é, por exemplo, um vetoradenoviral deficiente em replicação exigindo, no máximo, acomplementação da região El do genoma adenoviral, de modo apropagar o vetor adenoviral (por exemplo, para formarpartículas de vetor adenoviral).
O vetor adenoviral pode ser "múltiplas vezesdeficiente em replicação", significando que o vetoradenoviral é deficiente em uma ou mais funções de geneessencial para replicação em cada uma de duas ou maisregiões do genoma adenoviral, e requer complementaçãodessas funções para replicação. Por exemplo, o vetoradenoviral deficiente-El ou deficiente-El/E3 pode seradicionalmente deficiente em pelo menos uma função de genede replicação essencial da região E4 (denotado um vetoradenoviral deficiente E1/E4 ou E1/E3/E4), e/ou a região E2(denotado um vetor adenoviral deficiente E1/E2 ouE1/E2/E3), preferivelmente a região E2A (denotado um vetoradenoviral deficiente E1/E2A- ou E1/E2A/E3). Quando o vetoradenoviral é múltiplas vezes deficiente em replicação, asdeficiências podem ser uma combinação das deleções denucleotídeo discutidas acima com relação a cada regiãoindividual.
Se o vetor adenoviral da invenção for deficiente emuma função de gene essencial para replicação da região E2A,o vetor preferivelmente não compreende uma deleção completada região E2A, cuja deleção pref erivelmente é menor do queaproximadamente 230 pares de base de comprimento.Geralmente a região E2A dos códigos de adenovírus para umaDBP (proteína de ligação de DNA), um polipeptídeo exigidopara replicação de DNA. DBP é composto de 4 73 a 52 9aminoácidos dependendo do serotipo viral. Acredita-se queDBP é uma proteína assimétrica que existe como um elipsóideprolato consistindo em um Ct globular com um domínio Ntestendido. Estudos indicam que o domínio Ct é responsávelpela capacidade do DBP em se ligar aos ácidos nucléicos,ligar ao zinco, e função na síntese de DNA no nível dealongamento de cadeia de DNA. Contudo, o domínio Ntacredita-se que funcione na expressão de gene recente emambos os níveis, transcripcional e pós-transcripcional, éresponsável pela localização nuclear eficiente da proteína,e também pode estar envolvido no melhoramento de suaprópria expressão. Deleções no domínio Nt entre aminoácidos2 a 38 indicaram que essa região é importante para a funçãoDBP (Brough et al. , Virology, 196: 269-281 (1993)). Emboraas deleções na região E2A codificando para a região Ct doDBP não tenham efeito sobre a replicação viral, as deleçõesna região E2A que codificam os aminoácidos 2 a 38 dodomínio Nt do DBP prejudiquem a replicação viral. Épreferível que qualquer vetor adenoviral deficiente emreplicação múltipla contenha essa porção da região E2A dogenoma adenoviral. Especificamente, por exemplo, a porçãodesejada da região E2A a ser retida é aquela porção daregião E2A do genoma adenoviral que é definida pelaextremidade 5' da região E2A, especificamente as posiçõesAd5(23816) a Ad5(24032) da região E2A do genoma de serotipo5 adenoviral. Essa porção do genoma adenoviral é incluídadesejavelmente no vetor adenoviral porque ela não écompletada nas linhas de célula de complementação E2Aatuais de modo a prover o nível desejado de propagaçãoviral.
Embora as deleções descritas acima sejam descritas comrelação a um genoma serotipo 5 de adenovírus, aquelesversados na técnica podem determinar as coordenadas denucleotídeo das mesmas regiões de outros serotipos deadenovírus, tal como um genoma de serotipo 2 de adenovírus,sem experimentação indevida, com base na similaridade entreos genomas de vários serotipos de adenovírus,particularmente os serotipos 2 e 5 de adenovírus.
Em uma modalidade da invenção, o vetor adenoviral podecompreender um genoma adenoviral deficiente em uma ou maisfunções de gene essenciais para replicação de cada uma dasregiões El e E4 (isto é, o vetor adenoviral é um vetoradenoviral deficiente em E1/E4), preferivelmente com aregião de codificação inteira da região E4 tendo sidodelatada do genoma adenoviral. Em outras palavras, todos osquadros de leitura abertos (ORFs) da região E4 foramremovidos. Mais preferivelmente, o vetor adenoviral étornado deficiente em replicação mediante deleção de toda aregião El e mediante deleção de uma porção da região E4. Aregião E4 do vetor adenoviral pode reter o promotor E4nativo, seqüência de poliadenilação, e/ou a repetição determinal invertido do lado direito (ITR).
Deve ser considerado que a deleção de diferentesregiões do vetor adenoviral pode alterar a resposta imunedo mamífero. Especificamente, a deleção de regiõesdiferentes pode reduzir a resposta inflamatória gerada pelovetor adenoviral. Um vetor adenoviral deletado da região E4inteira pode eliciar uma resposta imune de hospedeiroinferior. Além disso, a proteína de revestimento do vetoradenoviral pode ser modificada de modo a diminuir acapacidade ou incapacidade do vetor adenoviral em serreconhecido por um anticorpo neutralizador dirigido contraa proteína de revestimento do tipo selvagem, conformedescrito no Pedido de Patente Internacional WO 98/40509.Tais modificações são úteis para tratamento de longo prazode distúrbios persistentes.
O vetor adenoviral, quando deficiente em replicaçãomúltipla, especialmente em funções de gene essenciais parareplicação das regiões El e E4, pode incluir uma seqüênciaespaçadora para prover desenvolvimento viral em uma linhade célula complementar similar àquela conseguida pelosvetores adenovirais deficientes em replicação única,particularmente um vetor adenoviral deficiente em El. Em umvetor adenoviral deficiente em E4 preferido da invenção emque a região de fibra L5 é retida, o espaçadorconvenientemente está localizado entre a região de fibra L5e o ITR do lado direito. Mais preferivelmente em tal vetoradenoviral, a seqüência de poliadenilação E4individualmente ou, mais preferivelmente, em combinação comoutra seqüência existe entre a região de fibra L5 e o ITRdo lado direito, de modo a superar suficientemente a regiãode fibra L5 retida do ITR do lado direito, de tal modo quea produção viral de tal vetor se aproxima daquela de umvetor adenoviral deficiente em replicação única,particularmente um vetor adenoviral deficiente em El dereplicação única.
A seqüência de espaçadores pode conter qualquerseqüência ou seqüências de nucleotídeo as quais são decomprimento desejado, tais como as seqüências de pelo menosaproximadamente 15 pares de base (por exemplo, entreaproximadamente 15 pares de base e aproximadamente 12.000pares de base), preferivelmente aproximadamente 100 paresde base a aproximadamente 10.000 pares de base, maispreferivelmente de aproximadamente 500 pares de base aaproximadamente 8.000 pares de base, ainda maispreferivelmente aproximadamente 1.500 pares de base aaproximadamente 6.000 pares de base, e mais preferivelmentede aproximadamente 2.000 a aproximadamente 3.000 pares debase de comprimento. A seqüência espaçadora pode sercodificadora ou não-codificadora e nativa ou não-nativa comrelação ao genoma adenoviral, mas não restaura a função dereplicação essencial para a região deficiente. O espaçadortambém pode conter um cassete de expressão variável depromotor. Mais preferivelmente, o espaçador compreende umaseqüência de poliadenilação adicional e/ou um genepassageiro. Preferivelmente, no caso de um espaçadorinserido em uma região deficiente para E4, ambos, aseqüência de poliadenilação de E4 e o promotor de E4 dogenoma adenoviral ou qualquer outro promotor (celular ouviral) permanece no vetor. O espaçador está localizadoentre o local de poliadenilação de E4 e o promotor de E4,ou, se o promotor de E4 não estiver presente no vetor, oespaçador é proximal para o ITR do lado direito. Oespaçador pode compreender qualquer seqüência depoliadenilação adequada. Exemplos de seqüências depoliadenilação adequadas incluem seqüências sintéticasotimizadas, BGH (Hormônio de Crescimento Bovino), víruspolioma, TK (Timidina Cinase), EBV (Vírus de Epstein Barr)e os papilomavírus, incluindo papilomavírus humanos e BPV(Vírus de Papiloma Bovino) . Preferivelmente,particularmente na região deficiente em E4, o espaçadorinclui uma seqüência de poliadenilação SV40. A seqüência depoliadenilação SV4 0 permite níveis de produção de vírussuperiores de vetores adenovirais, múltiplas vezesdeficientes em replicação. Na ausência de um espaçador, aprodução de proteína de fibras e/ou desenvolvimento viraldo vetor adenoviral deficiente em replicação múltipla, éreduzida mediante comparação com aquela de um vetoradenoviral deficiente em replicação única. Contudo, ainclusão do espaçador em pelo menos uma das regiõesadenovirais deficientes, preferivelmente a região E4, podeneutralizar essa diminuição na produção de proteína defibra e crescimento viral. Idealmente, o espaçador écomposto do gene glucuronidase. 0 uso de um espaçador em umvetor adenoviral é descrito adicionalmente, por exemplo, naPatente US 5.851.806 e Publicação de Pedido de PatenteInternacional WO 97/21820.
Observou-se que pelo menos um vetor adenoviraleficiente para E4 expressa um transgene em níveissuperiores por uma quantidade de tempo limitada in vivo eque a persistência da expressão de um transgene em pelomenos um vetor adenoviral pode ser modulado através da açãode um fator de trans-ação, tal como HSV ICPO, Ad pTP, CMV-IE2, CMV-IE86, HIV tat, HTLV-tax, HBV-X, AAV Rep 78, ofator celular a partir da linha de célula osteosarcoma U205que funciona como HSV ICPO, ou o fator celular nas célulasPC12 que é induzido pelo fator de crescimento de nervos,entre outros, conforme descrito, por exemplo, nas PatentesUS 6.225.113; 6.649.373 e 6.660.521, e Publicação de Pedidode Patente Internacional WO 00/34496. Em vista domencionado acima, um vetor adenoviral deficiente emreplicação (por exemplo, o vetor adenoviral pelo menosdeficiente em E4) ou um segundo vetor de expressão podecompreender uma seqüência de ácido nucléico codificando umfator de trans-ação que modula a persistência da expressãoda seqüência de ácido nucléico.
Convenientemente, o vetor adenoviral requer, nomáximo, a complementação das funções de gene essenciaispara replicação das regiões El, E2A, e/ou E4 do genomaadenoviral para replicação (isto é, propagação). Contudo, ogenoma adenoviral pode ser modificado para desarticular umaou mais funções de gene essencial para replicação conformedesejado pelo profissional, desde que o vetor adenoviralpermaneça deficiente e possa ser propagado utilizando, porexemplo, células complementares e/ou DNA exógeno (porexemplo, adenovírus ajudante) codificando as funções degenes essenciais para replicação desarticulada. A esserespeito, o vetor adenoviral pode ser deficiente em funçõesde gene essencial para replicação apenas das regiõesantigas do genoma adenoviral, apenas as regiões recentes dogenoma adenoviral, ambas as regiões antigas e recentes dogenoma adenoviral, ou todos os genes adenovirais (isto é,um adenovetor de alta capacidade (HC-Ad) , vide Morsy etal., Proe. Natl. Acad. Sei. USA, 95: 965-976(1998), Chen etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94: 1645-1650(1997), eKochnek et al. , Hum. Gene Ther., 10: 2451-2459(1999)).Vetores adenovirais deficientes em replicação, adequados,incluindo vetores adenovirais deficientes em replicaçãoindividual e múltipla, são revelados nas Patentes US5.837.511; 5.851.806; 5.994.106; 6.127.175 e 6.482.616;Publicações de Pedido de Patente US 2001/0043922 Al,2002/0004040 Al, 2002/0031831 Al, 2002/0110545 Al, e2004/0161848 Al; e Publicações de Pedido de PatenteInternacional WO 94/28152; WO 95/02697; WO 95/16772; WO95/34671; WO 96/22378; WO 97/12986; WO 97/21826 e WO03/022311.
Mediante remoção de toda ou parte, por exemplo, dasregiões El, E3 e E4 do genoma adenoviral, o vetoradenoviral resultante é capaz de aceitar insertos deseqüências de ácido nucléico exógeno enquanto mantendo acapacidade de serem embalados em capsídeos adenovirais. Aseqüência de ácido nucléico pode ser posicionada na regiãoEl, na região E3, ou na região E4 do genoma adenoviral. Narealidade, a seqüência de ácido nucléico pode ser inseridaem qualquer ponto no genoma adenoviral desde que a posiçãonão impeça a expressão da seqüência de ácido nucléico ouinterfira com a embalagem do vetor adenoviral.
Vetores adenovirais deficientes em replicação sãoproduzidos tipicamente em linhas de célula complementaresque proporcionam funções de gene não presentes nos vetoresadenovirais deficientes em replicação, mas exigiram apropagação viral, em níveis apropriados para gerar elevadastitulações de estoque de vetor viral. Convenientemente, alinha de célula complementar compreende integrar no genomacelular, seqüências de ácidos nucléicos adenovirais quecodificam as funções de gene exigidas para propagaçãoadenoviral. Uma linha de célula preferida complementa pelomenos uma e pref erivelmente todas as funções de genesessenciais para replicação não presentes em um adenovírusdeficiente em replicação. A linha de célula decomplementação pode complementar uma deficiência em pelomenos uma função de gene essencial para replicaçãocodificada por regiões antigas, regiões recentes, regiõesde envelope viral, regiões de RNA associadas a vírus, oucombinação das mesmas, incluindo todas as funçõesadenovirais (por exemplo, para possibilitar a propagação deamplicons adenovirais). Mais preferivelmente, a linha decélula de complementação completa uma deficiência em pelomenos uma função de gene essencial para replicação (porexemplo, duas ou mais funções de gene essenciais parareplicação) da região El do genoma adenoviral,particularmente uma deficiência em uma função de geneessencial para replicação de cada uma das regiões ElA eElB. Além disso, a linha de célula de complementação podecomplementar uma deficiência em pelo menos uma função degene essencial para replicação das regiões E2(particularmente no que diz respeito a polimerase de DNAadenoviral e proteína terminal) e/ou E4 do genomaadenoviral. Convenientemente, uma célula que complementauma deficiência na região E4 compreende a seqüência de geneE4-ORF6 e produz a proteína E4-0RF6. Tal célulaconvenientemente compreende pelo menos ERF6 e nenhuma outraORF da região E4 do genoma adenoviral. A linha de célulapreferivelmente é caracterizada adicionalmente em que elacontém os genes de complementação de uma forma nãosobreposta com o vetor adenoviral, o que minimiza, epraticamente elimina a possibilidade do genoma de vetorrecombinar com o DNA celular. Conseqüentemente, a presençade adenovírus competentes para replicação (RCA) éminimizada se não evitada no estoque de vetor, o qual,portanto, é adequado para certas finalidades terapêuticas,especialmente finalidades de vacinação. A ausência de RCAno estoque de vetor evita a replicação do vetor adenoviralem células não-complementadoras. A construção de taislinhas de célula de complementação envolve biologiamolecular padrão e técnicas de cultura de célula, tais comoaquelas descritas por Sambrook et al. acima, e Ausubel etal. , acima).
Linhas de célula de complementação para produzir ovetor adenoviral incluem, mas não são limitadas a, 293células (descritas em, por exemplo, Graham et al. , J. Gen.Virol., 36, 59-72(1977)), células PER.C6 (descritas em, porexemplo, Publicação de Pedido de Patente Internacional WO97/00326, e Patentes US 5.994.128 e 6.033.908), e células293-ORF6 (descritas em, por exemplo, Publicação de Pedidode Patente Internacional WO 95/34671 e Brough et al. , J.Virol., 71: 9206-9213 (1397)). Células de complementaçãoadicionais são descritas, por exemplo, nas Patentes US6.677.156 e 6.682.929, e Publicação de Pedido de PatenteInternacional WO 03/20879. Em alguns casos, o genomacelular não precisa compreender seqüências de ácidonucléico, cujos produtos genéticos complementam todas asdeficiências de um vetor adenoviral deficiente emreplicação. Uma ou mais funções de genes essenciais parareplicação carentes em um vetor adenoviral deficiente emreplicação podem ser fornecidas por um vírus ajudante, porexemplo, um vetor adenoviral que fornece em trans uma oumais funções de genes essenciais exigidas para replicaçãodo vetor adenoviral desejado. Vírus ajudante freqüentementeé construído para prevenir a embalagem de vírus ajudanteinfeccioso. Por exemplo, uma ou mais funções de genesessenciais para replicação da região El do genomaadenoviral são providas pela célula de complementação,enquanto que uma ou mais funções de genes essenciais parareplicação da região E4 do genoma adenoviral são providaspor um vírus ajudante.
Se o vetor adenoviral não é deficiente em replicação,idealmente o vetor adenoviral é manipulado para limitar areplicação do vetor para dentro de um tecido alvo. 0 vetoradenoviral pode ser um vetor adenoviral de replicaçãocondicional, o qual é construído para replicar sobcondições predeterminadas pelo médico. Por exemplo, asfunções de gene essenciais para replicação, por exemplo,funções de gene codificadas pelas regiões antigasadenovirais, podem ser ligadas de maneira operável a umaseqüência de controle de transcrição de tecido específicoou indutora, repressora, por exemplo, promotor. Nessamodalidade, a replicação requer a presença ou ausência defatores específicos que interagem com a seqüência decontrole de transcrição. Por exemplo, em tratamento dedoença auto-imune, pode ser vantajoso controlar areplicação de vetor adenoviral, por exemplo, em nóduloslinfáticos, para obter produção de antígeno contínua eprodução de células imunes de controle. Vetores adenoviraisde replicação condicional são descritos adicionalmente naPatente US 5.998.205.
Além da modificação (por exemplo, deleção, mutação, ousubstituição) de seqüências adenovirais codificando funçõesde genes essenciais para replicação, o genoma adenoviralpode conter modificações benignas ou não-letais, isto é,modificações que não tornam o adenovírus deficiente emreplicação ou, convenientemente, não afetam adversamente ofuncionamento e/ou produção viral de proteínas virais,mesmo se tais modificações estiverem em regiões do genomaadenoviral que de outro modo contém funções de geneessenciais para replicação. Tais modificações resultamcomumente da manipulação de DNA ou servem para facilitar aconstrução do vetor de expressão. Por exemplo, pode servantajoso remover ou introduzir locais de enzima derestrição no genoma adenoviral. Tais mutações benignasfreqüentemente não têm efeito adverso detectável nofuncionamento viral. Por exemplo, o vetor adenoviral podecompreender uma deleção de nucleotídeos 10.594 e 10.595(com base no genoma de serotipo 5 adenoviral), os quais sãoassociados à transcrição VA-RNA-1, mas cuja deleção nãoproíbe a produção de VA-RNA-I.
Similarmente, a proteína de revestimento de um vetoradenoviral pode ser manipulada para alterar aespecificidade de ligação ou reconhecimento de um víruspara um receptor viral em uma célula hospedeira potencial.
Para adenovírus, tais manipulações podem incluir deleção deregiões da fibra, penton ou hexon, inserções de váriosligantes nativos, ou não nativos, em porções da proteína derevestimento, e semelhantes. Manipulação da proteína derevestimento pode ampliar a faixa de células infectadaspelo vetor adenoviral ou possibilitar que o vetoradenoviral seja visado para um tipo de célula específico.
Qualquer técnica adequada para alterar a ligaçãonativa a uma célula hospedeira, tal como ligação nativa daproteína de fibra ao receptor de adenovírus ecoxsackievirus (CAR) de uma célula, pode ser empregada. Porexemplo, comprimentos diferentes de fibra podem serexplorados para remover a ligação nativa às células. Issoopcionalmente pode ser realizado por intermédio da adiçãode uma seqüência de ligação à base penton ou nódulo defibra. Essa adição de seqüência de ligação pode ser feitaou diretamente ou indiretamente por intermédio de umaseqüência de ligação bi-especifica ou multiespecífica. Emuma modalidade alternativa, a proteína de fibra adenoviralpode ser modificada para reduzir o número de aminoácidos noeixo de fibra, desse modo criando uma fibra de "eixo curto"(conforme descrito, por exemplo, na Patente US 5.962.311).O uso de um adenovírus compreendendo um gene de fibraadenoviral de eixo curto reduz o nível ou eficiência dafibra adenoviral se ligando ao seu receptor de célula-superfície e aumenta a ligação de base penton adenoviral aseu receptor de célula-superfície, desse modo aumentando aespecificidade da ligação do adenovírus a uma determinadacélula. Alternativamente, o uso de um adenovíruscompreendendo uma fibra de eixo curto possibilita alvodirigir o adenovírus para um receptor de célula-superfíciedesejado por intermédio da introdução de seqüência deaminoácido não-ativo seja na base penton ou no nódulo defibra.
Em ainda outra modalidade, os resíduos de ácidonucléico codificando resíduos de aminoácido associados àligação de substrato nativo podem ser mudados,suplementados, ou deletados (vide, por exemplo, Publicaçãode Pedido de Patente Internacional WO 00/15823, Einfeld etal., J. Virol., 75(23): 11284-11291 (2001), e van Beusechemet al., J. Virol., 76(6): 2753-2762 (2002)) de tal modo queo vetor adenoviral incorporando os resíduos de ácidonucléico que sofreram mutação (ou tendo a proteína de fibradesse modo codificada) é menos capaz de se ligar ao seusubstrato nativo. A esse respeito, o CAR nativo e os locaisde ligação de integrina do vetor adenoviral, tal como odomínio de nódulo da proteína de fibra adenoviral e umaseqüência Arg-Gly-Asp (RGD) localizada na base pentonadenoviral, respectivamente, podem ser removidos oudesestruturados. Qualquer resíduo(s) de aminoácido adequadode uma proteína de fibra que media ou auxilia na interaçãoentre o nódulo e CAR pode ser submetida à mutação ouremovida, desde que a proteína de fibra seja capaz detrimerizar. Similarmente, os aminoácidos podem seradicionados ao nódulo de fibra desde que a proteína defibra mantenha a capacidade de trimerizar. Resíduosadequados incluem aminoácidos dentro dos laços expostos dodomínio de nódulo de fibra de serotipo 5, tal como, porexemplo, o laço AB, o laço DE, o laço FG, e o laço HI, osquais são descritos adicionalmente, por exemplo, emRoelvink et al. , Science, 286: 1568-1571 (1999), e PatenteUS 6.455.314. Qualquer resíduo(s) de aminoácido adequado deuma proteína de base penton que media ou auxilia nainteração entre a base penton e integrinas pode sersubmetida à mutação ou removida. Resíduos adequadosincluem, por exemplo, um ou mais dos cinco motivos deseqüência de aminoácido RGD localizados na região hiper-variável da proteína de base penton Ad5 (como descrito, porexemplo, na Patente US 5.731.190). Os locais de ligação deintegrina nativa na proteína de base penton também podemser desarticulados mediante modificação da seqüência deácido nucléico codificando o motivo RGD nativo e tal modoque a seqüência de aminoácido RGD nativa é inacessível demodo conformacional para ligação ao receptor integrina αν,tal como mediante inserção de uma seqüência DNA em ouadjacente à seqüência de ácido nucléico codificando aproteína de base penton adenoviral. Preferivelmente, ovetor adenoviral compreende uma proteína de fibra e umaproteína de base penton que não se liga a CAR e integrinas,respectivamente. Alternativamente, o vetor adenoviralcompreende proteína de fibra e uma proteína de base pentonque se liga a CAR e integrinas, respectivamente, mas commenos afinidade do que as proteínas de revestimento do tiposelvagem correspondentes. O vetor adenoviral exibe ligaçãoreduzida ao CAR e integrinas se uma proteína de fibraadenoviral modificada e proteína de base penton se ligar aCAR e integrinas, respectivamente, com pelo menos 5 vezes,10 vezes, 20 vexes, 30 vezes, 50 vezes, ou 100 vezes menosafinidade do que uma proteína de fibra adenoviral não-modifiçada e proteína de base penton do mesmo serotipo.
O vetor adenoviral também pode compreender umaproteína de revestimento quimérico compreendendo umaseqüência de aminoácido não-nativa que se liga a umsubstrato (isto é, um ligante) , tal como um receptorcelular exceto CAR, o receptor de integrina αν. Talproteína de revestimento quimérico permite que um vetoradenoviral se ligue, e convenientemente, infecte as célulashospedeiras não infectadas naturalmente pelo adenovíruscorrespondente que mantém a habilidade de se ligar aosreceptores de superfície de célula nativa, desse modoexpandindo adicionalmente o repertório de tipos de célulasinfectados pelo vetor adenoviral. A seqüência de aminoácidonão-nativa da proteína de revestimento adenoviral quiméricapermite que um vetor adenoviral compreendendo a proteína derevestimento quimérica se ligue e, convenientemente,infecte as células hospedeiras não infectadas naturalmentepor um adenovírus correspondente sem a seqüência deaminoácido não-nativa (isto é, células hospedeiras nãoinfectadas pelo adenovírus do tipo selvagemcorrespondente), para se ligar às células hospedeirasnaturalmente infectadas pelo adenovírus correspondente commaior afinidade do que o adenovírus correspondente sem aseqüência de aminoácido não-nativa, ou se ligar às célulasalvo específicas com maior afinidade do que as células não-alvo. Uma seqüência de aminoácido "não-nativa" podecompreender uma seqüência de aminoácido não naturalmentepresente na proteína de revestimento adenoviral ou umaseqüência de aminoácido encontrada no revestimentoadenoviral, porém localizada em uma posição não-nativadentro do capsídeo. Por "se liga preferencialmente" se querdizer que a seqüência de aminoácido não-nativa se liga a umreceptor, tal como, por exemplo, integrina ανβ3, com pelomenos aproximadamente 3 vezes mais afinidade (por exemplo,pelo menos 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes,35 vezes, 45 vezes, ou 50 vezes mais afinidade) do que oligante não-nativo se liga a um receptor diferente, talcomo, por exemplo, integrina αvβ1.
Convenientemente, o vetor adenoviral compreende umaproteína de revestimento quimérico compreendendo umaseqüência de aminoácido não-nativa que confere à proteínade revestimento quimérico a capacidade de se ligar a umacélula imune mais eficientemente do que uma proteína derevestimento adenoviral do tipo selvagem. Especificamente,o vetor adenoviral pode compreender uma proteína de fibraadenoviral quimérica compreendendo uma seqüência deaminoácido não-nativa que facilita a admissão do vetoradenoviral pelas células imunes, preferivelmente células deapresentação de antígeno, tais como células dendríticas,monócitos, e macrófagos. Em uma modalidade preferida, ovetor adenoviral compreende uma proteína de fibra quiméricacompreendendo uma seqüência de aminoácido (por exemplo, umaseqüência de aminoácido não-ativa) compreendendo um motivoRGD incluindo, mas não limitado a, CRGDC (SEQ ID N0 :1),CXCRGDCXC (SEQ ID N°:2), em que X representa qualqueraminoácido, e CDCRGDCFC (SEQ ID N°:3), o qual aumenta aeficiência de transdução de um vetor adenoviral em célulasdendríticas. O motivo RGD, ou qualquer seqüência deaminoácido não-nativa, preferivelmente é inserido na regiãode nódulo de fibra adenoviral, idealmente em um laçoexposto do nódulo adenoviral, tal como o laço HI. Aseqüência de aminoácido não-nativa também pode ser anexadaao C-terminal da proteína de fibra adenoviral,opcionalmente por intermédio de uma seqüência espaçadora. Aseqüência espaçadora compreende preferivelmente entre um e200 aminoácidos, e pode (mas não precisa) ter uma funçãopretendida.
Onde as células dendríticas constituem a célula alvodesejada, a seqüência de aminoácido não-nativa podeopcionalmente reconhecer uma proteína tipicamenteencontrada nas superfícies de célula dendrítica tal como asproteínas de adesão, receptores de quemocina, receptores decomplemento, proteínas de co-estimulação, receptores decitocina, moléculas de apresentação de antígeno de altonível, proteínas de endereçamento, proteínas marcadoras,receptores para admissão de antígeno, proteínas desinalização, receptores de vírus, etc. Exemplos de taislocais de ligação-Iigante potenciais em células dendríticasincluem integrinas ανβ3, integrinas ανβ5, receptores 2A1,7-TM, variantes CDl, CDlla, CDllb, CDllc, CD21, CD24, CD32,CD4, CD4 0 e CD44, CD4 6, CD4 9d, CD50, CD54, CD58, CD64,ASGPR, CD80, CD83, CD86, caderina- E, integrinas, M342,MHC-I,MHC-II, MIDC-8, MMR, 0X62, p200-MR6, p55, S100, TNF-R, etc. Onde células dendríticas são visadas, o ligantepreferivelmente reconhece a proteína de superfície decélula CD4 0, tal como, por exemplo, por intermédio de umfragmento de anticorpo (bi)específico CD-40 ou porintermédio de um domínio derivado do polipeptídeo CD4 0L.
Onde os macrófagos são o alvo desejado, a seqüência deaminoácido não-nativa pode opcionalmente reconhecer umaproteína tipicamente encontrada nas superfícies de célulade macrófago, tal como receptores de fosfatidilserina,receptores de vitronectina, integrinas, receptores deadesão, receptores envolvidos na transdução de sinal e/ouinflamação, marcadores, receptores para indução decitocinas, ou receptores ascendentemente regulados a partirdo desafio por patógenos, membros da superfamília rica emcisteína de receptor depurador do grupo B (SRCR),receptores de ligação de ácido siálico, membros da famíliade receptores Fc, moléculas de superfície B7-1 e B7-2,receptores de linfócito, receptores de leucócito, moléculasde apresentação de antígeno, e semelhantes. Exemplos deproteínas alvo de superfície de macrófago, adequadas,incluem, mas não são limitadas a heparina sulfatoproteoglicanos, integrinas ανβ3, integrinas ανβ5, B7-1, B7-2, CDllc, CD13, CD16, CD163, CDla, CD22, CD23, CD29, Cd32,CD33, CD36, CD44, CD45, CD49e, CD52, CD53, CD54, CD71,CD87, CD9, CD98, receptores Ig, proteínas de receptor Fc(por exemplo, subtipos de Fca, Fcy, Fcs, etc.), receptor bde folato, HLA Classe I, Sialoadesina, siglec-5, ereceptor-2 semelhante a toll (TLR2).
Ode as células-B são o alvo desejado, a seqüência deaminoácido não-nativa pode reconhecer uma proteínatipicamente encontrada nas superfícies de célula-B, taiscomo integrinas e outras moléculas de adesão, receptores decomplemento, receptores de interleucina, receptores defagócito, receptores de imunoglobulina, marcadores deativação, receptores de transferrina, membros dasuperfamília rica em cisteína de receptor depurador (SRCR),receptores de fator de crescimento, selectinas, moléculasMHC, receptores TNF, e fatores associados a TNF-R. Exemplos de proteínas de superfície de célula-B incluem β-glicano,receptor de antígeno de célula B (BAC), B7-2, receptor decélula-B (BCR), receptor C3d, dímero CDl, CD18, CD19, CD20,CD21, CD22, CD23, CD40, CD5, CD6, CD69, CD69, CD71,CD79a/CD79b, CD95, endoglina, antígeno Faz, receptores deIg humano, proteínas de receptor Fc (por exemplo, subtiposde Fca, Fcg, Fce, etc.), IgM, gp200-MR6, Receptor deHormônio de Crescimento (GH-R), ICAM-1, ILT2, CD85,moléculas de MHC de classe Ie II, receptor de fator decrescimento de transformação (TGF-R), integrina α4β7, eintegrina ανβ3 .Em outra modalidade, o vetor adenoviral podecompreender uma proteína de revestimento de vírus quiméricaque não é seletivo para um tipo específico de célulaeucariótica. A proteína de revestimento quimérica difere deuma proteína de revestimento do tipo selvagem mediante umainserção de uma seqüência de aminoácido não-nativa em ou nolugar de uma seqüência de proteína de revestimento interno,ou ligação de uma seqüência de aminoácido não-nativa ao N-ou C- terminal da proteína de revestimento. Por exemplo, umligante compreendendo aproximadamente 5 a aproximadamente 9resíduos de lisina (preferivelmente sete resíduos delisina) é ligado ao C-terminal da proteína de fibraadenoviral por intermédio de uma seqüência de espaçadoresnão-funcionais. Nessa modalidade, a proteína derevestimento de vírus quimérica eficientemente se liga auma gama mais ampla de células eucarióticas do que umrevestimento de vírus do tipo selvagem, tal como descritona Patente US 6.465.253 e Publicação de Pedido de PatenteInternacional WO 97/20051. Tal vetor adenoviral podegarantir produção ampla do antígeno.
A habilidade de um vetor adenoviral em reconhecer umacélula hospedeira potencial pode ser modulada semmanipulação genética da proteína de revestimento, isto é,através do uso de uma molécula bi-específica. Por exemplo,combinar um adenovírus com uma molécula bi-específicacompreendendo um domínio de ligação-base penton e umdomínio que seletivamente se liga a um local de ligação desuperfície de célula específica permite alvo dirigir ovetor adenoviral para um tipo de célula específica;Similarmente, um antígeno pode ser conjugado para asuperfície a partícula adenoviral através de meio não-genético.
Uma seqüência de aminoácido não-nativa pode serconjugada para qualquer das proteínas de revestimentoadenoviral para formar uma proteína de revestimentoadenoviral quimérica. Portanto, uma seqüência de aminoácidonão-nativa pode ser conjugada, inserida ou ligada a umaproteína de fibra, uma proteína de base penton, umaproteína hexon, proteínas IX, VI ou IIIa, etc. Asseqüências de tais proteínas, e métodos para empregar asmesmas em proteínas recombinantes, são conhecidas natécnica (vide, por exemplo, as Patentes US 5.543.3285.559.099; 5.712.136; 5.731.190; 5.756.086; 5.770.4425.846.782; 5.962.311; 5.965.541; 5.846.782; 6.057.1556.127.525; 6.153.435; 6.329.190; 6.455.314; 6.465.2536.576.456; 6.649.407; 6.740.525, e Publicações de Pedido dePatente Internacional WO 96/07734, WO 96/26281, WO97/20051, WO 98/07877, WO 98/07865, WO 98/40509, WO98/54346, WO 00/15823, WO 01/58940, e WO 01/92549). Aproteína de revestimento adenoviral quimérica pode sergerada utilizada técnicas padrão de DNA recombinanteconhecidas na arte. Preferivelmente, a seqüência de ácidonucleico codificando a proteína de revestimento adenoviralquimérica está localizada dentro do genoma adenoviral e éligada de maneira operável a um promotor que regula aexpressão da proteína de revestimento em um adenovírus dotipo selvagem. Alternativamente, a seqüência de ácidonucléico codificando a proteína de revestimento adenoviralquimérica está localizada dentro do genoma adenoviral eparte de um cassete de expressão que compreende elementosgenéticos exigidos para expressão eficiente da proteína derevestimento quimérica.
A porção de proteína de revestimento da proteína derevestimento de adenovírus quimérica pode ser uma proteínade revestimento adenoviral de complemento completo ao qualo domínio de ligante é anexado, ou ela pode ser truncada,por exemplo, internamente ou no C- e/ou N- terminal.Contudo modificada (incluindo a presença do aminoácido não-nativo), a proteína de revestimento quiméricapreferivelmente é capaz de incorporar em um capsídeoadenoviral. Onde a seqüência de aminoácido não-nativa éligada à proteína de fibra, preferivelmente ela nãodesarticula a interação entre as proteínas virais, ou osmonômeros de fibra. Desse modo, a seqüência de aminoácidonão nativa preferivelmente não é ela própria um domínio deoligomerização, como tal, pode interagir adversamente com odomínio de trimerização da fibra de adenovírus.Preferivelmente a seqüência de aminoácido não-nativa éadicionada à proteína de vírion, e é incorporada de talmodo a ser prontamente exposta a um substrato, a umreceptor de superfície de célula, ou célula imune (porexemplo, no N- ou C- terminal da proteína adenoviral,ligada a um resíduo voltado para um substrato, posicionadoem um espaçador de peptídeo, etc.) para expor maximamente aseqüência de aminoácido não-nativa. Idealmente, a seqüênciade aminoácido não-nativa é incorporada em uma proteína defibra adenoviral no terminal-C da proteína de fibra (efixada por intermédio de um espaçador) ou incorporada em umlaço exposto (por exemplo, o laço HI) da fibra para criaruma proteína de revestimento quimérica. Onde a seqüência deaminoácido não-nativa é ligada a uma porção ou substituiuma porção da base penton, preferivelmente ela está dentrodas regiões hiper-variáveis para garantir que ela contate osubstrato, receptor de superfície de célula, ou célulaimune. Onde a seqüência de aminoácido não-nativa é ligadaao hexon, preferivelmente ela está dentro de uma regiãohipervariável Miksza et al., J. Virol., 70(3): 1836-44 (1996)). Onde o aminoácido não-nativo é ligado a umaporção ou substitui uma porção de pIX, preferivelmente elaestá dentro do C-terminal de pIX. O uso de uma seqüência deespaçadores para prolongar a seqüência de aminoácido não-nativa afastando-se da superfície da partícula adenoviralpode ser vantajoso em que a seqüência de aminoácido não-nativa pode estar mais disponível para ligação a umreceptor, e quaisquer interações estéricas entre aseqüência de aminoácido não-nativa e os monômeros de fibraadenoviral podem ser reduzidas.
Afinidade de ligação de uma seqüência de aminoácidonão-nativa com um receptor celular pode ser determinadamediante qualquer ensaio adequado, uma variedade dessesensaios é conhecida e é útil na seleção de uma seqüência deaminoácido não-nativa para incorporação em uma proteína derevestimento adenoviral. Convenientemente, os níveis detransdução das células hospedeiras são utilizados nadeterminação de eficiência de ligação relativa. Desse modo,por exemplo, células hospedeiras exigindo integrina ανβ3 nasuperfície da célula (por exemplo, células MDAMB435) podemser expostas a um vetor adenoviral compreendendo a proteínade revestimento quimérica e o adenovírus correspondente sema seqüência de aminoácido não-nativa, e então eficiênciasde transdução podem ser comparadas para determinar aafinidade de ligação relativa. Similarmente, ambas ascélulas hospedeiras exibindo integrina ανβ3 na superfícieda célula (por exemplo, células MDAMB4 3 5) e célulashospedeiras exibindo predominantemente ανβΐ na superfícieda célula (por exemplo, 293 células) podem ser expostas aosvetores adenovirais compreendendo a proteína derevestimento quimérica, e então as eficiências detransdução podem ser comparadas para determinar afinidadede ligação.
Em outras modalidades (por exemplo, para facilitar apurificação ou propagação dentro de um tipo de célulaconstruída específica), um aminoácido não-nativo (porexemplo, ligante) pode se ligar a um composto exceto umaproteína de célula-superfície. Desse modo, o ligante podese ligar às proteínas transportadas pelo sangue e/ou ninfa(por exemplo, albumina), seqüências de peptídeos sintéticostais como ácidos poliamínicos (por exemplo, polilisina,polihistidina, etc.), seqüências de peptídeos artificiais
(por exemplo, FLAG), e fragmentos de peptídeo RGD(Pasqualini et al. , J. Cell. Biolt 130: 1189 (1995)). Umligante pode até mesmo ligar substratos não-peptídeos, taiscomo plástico (por exemplo, Adey et al. , Gene, 156: 27(1995)), biotina (Saggio et al. , Biochem. J., 293: 613(1993)), a DNA sequence (Cheng et al, Gene, 171: 1 (1996),uma seqüência de DNA e Krook et al. , Biochem. Biophys.,Res. Conrnun., 204: 849 (1994)), streptavidina (Geibel etal. , Biochemistry, 34: 15430 (1995), e Katz, Biochemistry,34: 15421 (1995)), nitro-streptavidina (Balass et al. , Anal. Biochem., 243: 264 (1996)), heparina (Wickham et al.,Nature Biotechnol., 14: 1570-73 (1996)), e outrossubstratos.
Desestruturação da ligação nativa de proteínas derevestimento adenoviral a um receptor de superfície decélula também pode tornar o mesmo menos capaz de interagircom o sistema imune do hospedeiro inato ou adquirido. Nãoconsiderando a imunidade preexistente, a administração devetor adenoviral induz inflamação e ativa os mecanismosimune, inato e adquirido. Os vetores adenovirais ativam asrespostas imunes de antígeno específico (por exemplo,dependentes de Célula-T), as quais limitam a duração daexpressão de transgene após uma administração inicial dovetor. Além disso, exposição aos vetores adenoviraisestimula a produção de anticorpos neutralizadores pelascélulas B, que podem impedir a expressão de gene a partirde doses subseqüentes do vetor adenoviral (Wilson & Kay,Nat. Med., 3(9): 887-889 (1995)). Na realidade, a eficáciada administração repetida do vetor pode ser severamentelimitada pela imunidade do hospedeiro. Além da estimulaçãoda imunidade humoral, funções imunes mediadas por célulassão responsáveis pela eliminação do vírus a partir docorpo. Rápida eliminação do vírus é atribuída aosmecanismos imunes inatos (vide, por exemplo, Worgall etal. , Human Gene Therapy, 8: 37-44 (1997)), e provavelmenteenvolve as células Kupffer encontradas dentro do fígado.Desse modo, mediante remoção da ligação nativa de umaproteína de fibra de adenovírus e proteína de base penton,reconhecimento do sistema imune de um vetor adenoviral édiminuído, desse modo aumentando a tolerância do vetor pelohospedeiro.Outro método para evitar a imunidade de hospedeiropreexistente ao adenovirus, especificamente adenovirus deserotipo 5, envolve modificar uma proteína de revestimentoadenoviral de tal modo que ela exibe reconhecimentoreduzido pelo sistema imune do hospedeiro. Desse modo, osvetores adenovirais inventivos compreendem preferivelmentetal proteína de revestimento modificada. A proteína derevestimento modificada preferivelmente é uma proteínapenton, fibra, ou proteína hexon. Mais preferivelmente, aproteína de revestimento modificada é uma proteína hexon. Aproteína de revestimento pode ser modificada de qualquermaneira adequada, mas é preferivelmente modificada mediantegeração de diversidade na proteína de revestimento.Preferivelmente, tais variantes de proteína de revestimentonão são reconhecidas pelos anticorpos de neutralização deadenovirus específico de hospedeiro preexistente (porexemplo, humano). A diversidade pode ser gerada utilizandoqualquer método adequado conhecido na técnica, incluindo,por exemplo, evolução dirigida (isto é, embaralhamento depolinucleotídeo) e PCR com tendência a erro (vídeo, porexemplo, Cadwell, PCR Meth. Applr 2: 28-33 (1991), Leung etal., Techniquer 1: 11-15 (1989), e Pritchard et al, J.Theoretical Biolr 234: 497-509 (2005)). Preferivelmente, adiversidade de proteína de revestimento é gerada através detécnicas de evolução dirigida, tal como aquelas descritas,por exemplo, em Stemmer, Naturer 370: 389-91 (1994), Cherryet al, Nat. Biotechnol, 17: 379-84 (1999), e Schmidt-Dannert et al. , Nat Biotechnol., 18 (1): 750-53 (2000). Emgeral, a evolução dirigida envolve três operaçõesrepetidas: mutação, seleção e amplificação. As etapasprimárias realizadas em evolução dirigida incluemtipicamente (1) mutação ou recombinação de um gene deinteresse, (2) construção de uma biblioteca dos genessubmetidos ã mutação ou recombinados, (3) expressão dabiblioteca em células hospedeiras adequadas, (4) seleção decélulas que exprimem uma variante com uma função ouatividade desejada, e (5) isolamento de um gene codificandouma variante desejada. Esse processo é repetido até que onúmero desejado de variantes seja produzido.
No contexto da invenção, diversidade de proteína derevestimento é gerada mediante primeiramente realização demutações aleatórias no gene codificando a proteína derevestimento mediante, por exemplo, embaralhamento depolinucleotídeo ou PCR com tendência a erro. Os genes deproteína de revestimento submetidos à mutação sãoincorporados em uma biblioteca de vetores adenovirais Ad5deficiente em El, em que cada vetor Ad5 compreende umaproteína de fibra Ad3 5 e um cassete de expressão dual queexpressa dois genes marcadores (por exemplo, proteínafluorescente verde e luciferase) inseridos na região El.Vetores de biblioteca são propagados em células hospedeirasadequadas (por exemplo, E. coli) , e vetores codificandovariantes de proteína de revestimento potencial deinteresse são resgatadas sob condições competitivas napresença de anticorpos de neutralização anti-Ad5 humanos.Vetores resgatados ou são expandidos na presença deanticorpos de neutralização anti-Ad5, purificados, ouclonados e variantes de proteína de revestimento sãosubmetidas ã seqüenciação de ácido nucléico.
Quando identificada a atividade biológica da proteínacodificada pelas variantes de proteína de revestimentoproduzidas pela estratégia acima devem ser classificadas.Qualquer ensaio adequado para medir atividade biológicadesejada de uma variante de proteína de revestimento podeser usado. Por exemplo, a importância de avaliar aspropriedades de crescimento de um vetor Ad5 compreendendouma proteína de revestimento variante será facilmenteevidente para aqueles versados na técnica. Além disso, aimunogenicidade dos vetores Ad5 compreendendo uma proteínade revestimento variante e codificando um antígenoheterólogo (por exemplo, um antígeno Plasmodium) pode sercomparada com um vetor Ad5 similar compreendendo umaproteína de revestimento do tipo selvagem. Além disso, comoa variante de proteína de revestimento ideal não éreconhecida pelos anticorpos de neutralização de adenovírusespecífico preexistentes, é necessário avaliar os efeitosde neutralização potenciais do soro humano sobre asvariantes de proteína de revestimento.
Uma proteína de revestimento adenoviral também podeser modificada para remover a imunidade de hospedeiropreexistente mediante deleção de uma região de uma proteínade revestimento e substituindo a mesma com uma regiãocorrespondente a partir da proteína de revestimento deoutro serotipo de adenovírus, particularmente um serotipoque é menos imunogênico em seres humanos. A esse respeito,seqüências de aminoácido dentro da proteína de fibra, aproteína de base penton, e/ou a proteína hexon podem serremovidas e substituídas com seqüências correspondentes apartir de um serotipo de adenovírus diferente. Comodiscutido acima, um serotipo de adenovírus preferido parauso na invenção é serotipo 5. Desse modo, por exemplo,quando a proteína de fibra é modificada para remover aimunidade de hospedeiro preexistente, resíduos deaminoácido a partir da região de nódulo de uma proteína defibra de serotipo 5 podem ser deletados e substituídos comresíduos de aminoácido correspondentes a partir de umadenovírus de um serotipo diferente, tal como aquelesserotipos aqui descritos. Similarmente, quando a proteínade base penton é modificada para remover a imunidade dehospedeiro preexistente, seqüências de aminoácido dentro daregião hiper variável de uma proteína de base penton deserotipo 5 podem ser deletadas e substituídas com resíduosde aminoácidos correspondentes a partir de um adenovírus deum serotipo diferente, tal como aqueles serotipos aquidescritos. Preferivelmente, a proteína hexon do vetoradenoviral é modificada dessa maneira para remover aimunidade de hospedeiro preexistente. A esse respeito,quando o vetor adenoviral é de serotipo 5, os resíduos deaminoácido dentro de uma ou mais das regiões hipervariáveis, que ocorrem em laços da proteína hexon, sãoremovidos e substituídos com resíduos de aminoácidocorrespondentes a partir de um adenovírus de um serotipodiferente. Preferivelmente, resíduos de aminoácido dentrodos laços FGl, FG2, ou DEl de uma proteína hexon deserotipo 5 são deletados e substituídos com resíduos deaminoácidos correspondentes a partir de uma proteína hexonde um serotipo de adenovírus diferente. Uma região de laçointeira pode ser removida da proteína hexon de serotipo 5 esubstituída com a região de laço correspondente de outroserotipo de adenovírus. Alternativamente, porções de umaregião de laço podem ser removidas da proteína hexon deserotipo 5 e substituídas com a porção correspondente de umlaço hexon de outro serotipo de adenovírus. Um ou maislaços hexon, ou porções dos mesmos, de um vetor adenoviralde serotipo 5 podem ser removidos e substituídos com asseqüências correspondentes a partir de qualquer outroserotipo de adenovírus, tal como aqueles aqui descritos.Preferivelmente, um ou mais laços hexon, ou porções dosmesmos, de um vetor Ad5 são removidos e substituídos comseqüências de aminoácido correspondentes a partir de umadenovírus de serotipo 2, 34 ou 43. A estrutura dasproteínas hexon Ad2 e Ad5 e métodos de modificar asproteínas hexon são revelados, por exemplo, em Rux et al. ,J. Viroll 77: 9553-9566 (2003), e Patente US 6.127.525. Asregiões hiper variáveis de uma proteína hexon também podemser substituídas com seqüências aleatórias de peptídeos, ouseqüências de peptídeos derivadas e um patógeno causador dedoença (por exemplo, Plasmodium falciparum).
Modificações adequadas em um vetor adenoviral sãodescritas nas Patentes US 5.543.328; 5.559.099; 5.712.136;
5.871.727;6 . 057.155;6.465.253;5.731.190; 5.756.086; 5.770.442; 5.846.7825.885.808; 5.922.315; 5.962.311; 5.965.5416.127.525; 6.153.435; 6.329.190; 6.455.3146.576.456; 6.649.407; e 6.740.525; Publicações de Pedido dePedido de Patente US 2001/0047081 Al, 2002/0099024 Al,2002/0151027 Al, 2003/0022355 Al, e 2003/0099619 Al, ePedidos de Patente Internacionais WO 96/07734, WO 96/26281,WO 97/20051, WO 98/07865, WO 98/07877, WO 98/40509, WO98/54346, WO 00/15823, WO 01/58940, e WO 01/92549.
Em uma modalidade da invenção, o vetor adenoviralcompreende três ou mais seqüências de ácido nucléicoheterólogo. Uma "seqüência de ácido nucleico heterólogo" équalquer seqüência de ácido nucléico que não é obtida apartir de, derivada a partir de, ou baseada em umaseqüência de ácido nucléico de ocorrência natural do vetoradenoviral. Por "de ocorrência natural" se quer dizer que aseqüência de ácido nucléico pode ser encontrada na naturezae não foi modificada sinteticamente. Por exemplo, aseqüência de ácido nucleico heterólogo pode ser umaseqüência de ácido nucléico viral, bacteriana, vegetal ouanimal. Uma seqüência é "obtida" a partir de uma fontequando ela é isolada daquela fonte. Uma seqüência é"derivada" de uma fonte quando ela é isolada de uma fonte,mas modificada de qualquer maneira adequada (por exemplo,mediante deleção, substituição (mutação, inserção, ou outramodificação para a seqüência) de modo a não desarticular afunção normal do gene de origem. Uma seqüência é "baseadaem" uma fonte quando a seqüência é mais do que 70% idêntica(preferivelmente mais do que aproximadamente 80% idêntica,mais preferivelmente mais do que aproximadamente 90%idêntica, e mais pref erivelmente mais do queaproximadamente 95% idêntica) à fonte, mas obtida atravésde procedimentos sintéticos (por exemplo, síntese depolinucleotídeo, evolução direta, etc.). Determinar o graude identidade, incluindo a possibilidade de folgas, podeser realizado utilizando-se qualquer método adequado (porexemplo, BLASTnr, provido por GenBank). Apesar doanteriormente mencionado, a seqüência de ácido nucleicoheterólogo pode ser naturalmente encontrada no vetoradenoviral, porém localizada em uma posição não-nativadentro do genoma adenoviral e/ou de maneira operável ligadoa um promotor não-nativo. Embora o vetor adenoviral possacompreender três ou mais seqüências de ácidos nucléicosheterólogos (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou maisseqüências de ácidos nucléicos heterólogos) , o vetoradenoviral preferivelmente compreende três seqüências deácido nucleico heterólogos.
Qualquer tipo de seqüência de ácido nucléico (porexemplo, DNA, RNA, e cDNA) que pode ser inserida em umvetor adenoviral pode ser usado em conexão com a invenção.Preferivelmente, cada seqüência de ácido nucleicoheterólogo é DNA, e preferivelmente codifica uma proteína(isto é, uma ou mais seqüências de ácido nucléicocodificando uma ou mais proteínas) . Em uma modalidadeparticularmente preferida, cada uma das três ou maisseqüências de ácido nucleico heterólogos codifica umantígeno. Um "antígeno" é uma molécula que induz umaresposta imune em um mamífero. Uma "resposta imune" podeexigir, por exemplo, produção de anticorpos e/ou a ativaçãode células efetoras imunes (por exemplo, T células). Umantígeno no contexto da invenção pode compreendersubunidade, fragmento, ou epítopo de qualquer moléculaproteinácea, incluindo uma proteína ou peptídeo de origemviral, bacteriana, parasítica, fúngica, de protozoário, depríon, celular ou extracelular, a qual idealmente provocauma resposta imune em mamífero, preferivelmente levando àimunidade protetora. Por "epítopo" se quer dizer umaseqüência em um antígeno que é reconhecida por um anticorpoou um receptor de antígeno. Os epítopos também sãoreferidos na técnica como "determinantes antigênicos".Em uma modalidade, o antígeno é um antígeno de tumor.Por "antígeno de tumor" se quer dizer um antígeno que éexpresso pelas células de tumor, mas não células normais,ou um antígeno que é expresso em células normais, porém ésobre expresso em células de tumor. Exemplos de antígenosde tumor adequados incluem, porém não são limitados a, β-catenina, proteína de fusão BCR-ABL, K-ras, N-ras, PTPRK,NY-ESO-1/LAGE-2, SSX-2, TRP2-INT2, CEA, gplOO, kallikrein4, antígeno específico da próstata (PSA), TRP-l/gp75, TRP-2, tirosinase, EphA3, HER-2/neu, MUC1, p53, mdm-2, PSMA,RAGE-1, surviving, telomerase, e WTl. Outros antígenos detumor são conhecidos na arte e são descritos, por exemplo,em The Peptide Database of T-Cell Defined Tumor Antigens,mantido pelo Ludwig Institute for Câncer Research(http://www.cancerimmunity.org/statics/databases.htm), Vanden Eynde et al. , Curr. Opin. Immunol, 9: 684-93 (1997),Houghtonet al, Curr. Opin. Immunol, 13: 134-140 (2001), evan der Bruggen et al., Immunol. Rev., 188: 51-64 (2002).
Em outra modalidade, o antígeno pode ser um antígenoviral. O antígeno viral pode ser isolado de qualquer vírusincluindo, mas não limitado a um vírus a partir de qualqueruma das seguintes famílias virais: Arenaviridae,Arterivirus, Astroviridae, Baculoviridae, Badnavirus,Barnaviridae, Birnaviridae, Bromoviridae, Bunyaviridae,Caliciviridae, Capillovirus, Carlavirus, Caulimovirus,Circoviridae, Closterovirus, Comoviridae, Coronaviridae(por exemplo, Coronavirus, tal como vírus da síndromerespitatória aguda grave (SARS)), Corticoviridae,Cystoviridae, Deltavirus, Dianthovirus, Enamovirus,Filoviridae (por exemplo, vírus Marburg e vírus Ebola (porexemplo, cepa do Zaire, Reston, Costa do Marfim, ouSudão)), Flaviviridae, (e.g., vírus da Hepatite C, vírus daDengue 1, vírus da Dengue 2, vírus da Dengue 3, e vírus daDengue 4), Hepadnaviridae (e.g., vírus da Hepatite Β) ,Herpesviridae (por exemplo, vírus do Herpes Humano 1, 3, 4,5, e 6, e Citomegalovirus), Hypoviridae, Iridoviridae,Leviviridae, Lipothrixviridae, Microviridae,Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus da Influenza A and Β) ,Papovaviridae, Paramyxoviridae (por exemplo, sarampo,caxumba, e vírus sincicial respiratório humano),Parvoviridae, Picornaviridae (por exemplo, vírus da pólio,rinovírus, hepatovírus, e aphthovírus), Poxviridae (porexemplo, vírus vaccinia), Reoviridae (por exemplo,rotavirus), Retroviridae (por exemplo, lentivírus, tal comovírus da imunodeficiência humana (HIV) 1 e HIV 2),Rhabdoviridae, e Totiviridae. Antígenos retroviridae(retrovírus) particularmente preferidos incluem, porexemplo, antígenos HIV, tal como toda ou parte dasproteínas gag, env, ou pol, ou proteínas de fusãocompreendendo todas ou parte das proteínas gag, env, oupol. Qualquer classe de HIV é apropriada para seleção deantígeno, incluindo as classes A, B, C, MN e semelhante.Antígenos de coronavírus particularmente preferidosincluem, por exemplo, antígenos do vírus SARS. Antígenos dovírus SARS adequados para a invenção incluem, por exemplo,toda ou parte da proteína E, a proteína M, e a proteína deponta do vírus SARS. Antígenos virais adequados incluemtambém toda ou parte da proteína M da Dengue, proteína E daDengue, DlNSl da Dengue, DINS2 da Dengue, e D1NS3 daDengue. Os peptídeos antigênicos especificamente citadosaqui são apenas exemplares uma vez que qualquer proteínaviral pode ser usada no contexto da invenção.
Alternativamente ou adicionalmente, pelo menos umantígeno codificado pelo vetor adenoviral é um antígenobacteriano. 0 antígeno pode se originar de qualquerbactéria incluindo, mas não limitada a Actinomyces,Anabaena, Bacillus, Bacteroides, Bdellovibrio, Caulobaeter,Chlamydia, Chlorobium, Chromatium, Clostridium, Cytophaga,Deinoeoceus, Eseheriehia, Halobaeterium, Heliobaeter,Eyphomierobium, Methanobacterium, Microeoeeus,Myobaeterium, Myeoplasma, Myxoeoceus, Neisseria,Nitrobaeter, Oseillatoria, Proehloron, Proteus,Pseudomonas, PhodospirilIum, Riekettsia, Salmonella,Shigella, Spirillum, Spiroehaeta, Staphyloeoeeus,Streptoeoeeus, Streptomyees, Sulfolobus, Thermoplasma,Thiobacillus, e Treponema.
Desejavelmente, o antígeno é um antígeno parasita talcomo, mas não limitado a, um parasita da phylum Sporozoa(também referido como phylum Apicomplexa, Ciliophora,Rhizopoda, ou Zoomastigophora. Preferivelmente, o antígenoé um parasita da phylum Sporozoa e gênero Plasmodium. 0antígeno pode ser de qualquer espécie Plasmodium adequada,mas preferivelmente é de uma espécie Plasmodium que infectaos seres humanos e causa malária. Espécies Plasmodium queinfectam seres humanos incluem P. malariae, P. ovale, P.vivax e P. faleiparum. P vivax e P. faleiparum são as maiscomuns, e P. faleiparum é a mais mortal, espécie dePlasmodium em seres humanos. Alternativamente, o antígenopode ser de uma espécie de Plasmodium que infecta osanimais não-humanos. Por exemplo, P. vinekei, P. ehabaudi,Ρ. yoelii e P berghei infectam os roedores, Ρ. knowlesi, Ρ.cynomolgi, Ρ. simiovale, Ρ. fieldi, Ρ. inui, e P.brasilianum infectam os primatas não-humanos. P.gallinaceum infecta os pássaros. Para avançar a descobertade vacina, os genomas de algumas espécies Plasmodium foramseqüenciadas. Por exemplo, o genoma completo P. falciparumfoi seqüenciado e é revelado em Gardner et al. , Nature,419: 498-511 (2002). Além disso, a seqüência de genoma P.Yoelii completa é revelada em Carlton et al., Naturel 419:512-9 (2002) . Desse modo, aqueles de conhecimento comum natécnica podem identificar e isolar um antígeno dePlasmodium apropriado utilizando métodos de rotinaconhecidos na técnica.
Na natureza, os parasitas de malária são espalhadospor infectar sucessivamente dois tipos de hospedeiros:seres humanos e mosquitos Anopheles fêmeas. A esserespeito, parasitas de malária estão presentes como"esporozoítos" nas glândulas salivares do mosquitoAnopheles fêmea. Quando o mosquito Anopheles tira sanguecomo alimento de um ser humano, os esporozoítos sãoinjetados com a saliva do mosquito, entram no sistemacirculatório, e dentro de minutos de inoculação invadirãouma célula de fígado humana (hepatócito). Após invadir oshepatócitos, o parasita é submetido à replicação assexual.0 estágio do ciclo de vida do parasita abrangendo oesporozoíto e estágios de fígado tipicamente são referidosna técnica como "estágio pré-eritrocítico", o "estágio defígado", ou o "estágio exo-eritrocítico". A progênie,denominada "merozoítos", é liberada no sistema circulatórioapós a ruptura do hepatócito hospedeiro.Os merozoítos liberados a partir das célulasinfectadas do fígado invadem os eritrócitos (célulasvermelhas do sangue). Os merozoítos reconhecem as proteínasespecíficas na superfície do eritrócito e ativamenteinvadem a célula de uma maneira similar a outros parasitastransportados por mosquito. Após entrar no eritrócito, oparasita passa por um período trófico seguido de replicaçãoassexual para produzir infestações sucessivas demerozoítos. Os parasitas de merozoíto de progênie crescemdentro dos eritrócitos e destroem os mesmos, e são entãoliberados para iniciar outra rodada de infecção. Esseestágio de infecção tipicamente é referido na técnica comoo "estágio de sangue" ou "estágio eritrocítico". Osparasitas do estágio de sangue são aqueles que causam ossintomas da malária. Quando certas formas de parasitas deestágio de sangue (isto é, "gametócitos") são pegos por ummosquito Anopheles fêmea durante uma refeição de sangue,eles começam um outro ciclo diferente de crescimento emultiplicação no mosquito. 0 ciclo de vida do Plasmodium édescrito, por exemplo, em Ramasamy et al. , Med. Vet.Entomol., 11(3): 290-6 (1997), Hall et al., Science, 307(5706): 82-6 (2005), e I. W. Sherman, ed., Malaria:Parasite Biology, Pathogenesis, and Protection, AMericanSociety of Microbiology (1998).
Embora em algumas modalidades da invenção sejapreferido que o vetor adenoviral compreenda três ou maisseqüências de ácido nucleico heterólogos, em outrasmodalidades da invenção o vetor adenoviral pode compreendermenos do que três seqüências de ácido nucleico heterólogos.Desse modo, a invenção também provê um vetor adenoviralcompreendendo duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, ou mais) seqüências de ácido nucleicoheterólogos. Nessa modalidade, cada seqüência de ácidonucléico preferivelmente codifica um antígeno Plasmodium eé de maneira operável ligada a pelo menos um promotor. Emqualquer dos casos, o antigeno Plasmodium preferivelmente éum antígeno P. falciparum, porém preferivelmente codificaum antígeno que é expresso durante o estágio de sangue dainfecção (um "antígeno de estágio de sangue") e/ou umantígeno que é expresso durante o estágio pré-eritrocíticoda infecção (um "antígeno de estágio pré-eritrocítico").Antígenos de estágio de sangue são conhecidos na técnicacomo ativando o braço humoral (isto é, anticorpo-mediado)do sistema imune, enquanto que os antígenos de estágio pré-eritrocítico ativam o braço de célula-mediada do sistemaimune (isto é, resposta de Célula-T). Antígenos de estágiopré-eritrocítico adequados incluem, mas não são limitadosa, proteína de circunsporozoíta (CSP), proteína 2 desuperfície de esporozoíto (SSP2), antígeno 1 de estágio defígado (LSA-I), proteína 1 Pf exportada (PfExp-I)/proteína17 de eritrócito de hepatócito Py (PyHEP17), e Antígeno 2Pf. Os antígenos de estágio de sangue adequados incluem,mas não são limitados a, proteína 1 de superfície demerozoíto (MSP-I), proteína 2 de superfície de merozoíto(MSP-2), antígeno 175 de ligação de eritrócito (EBA-175),antígeno de superfície de eritrócito de anel-infectado(RESA), antígeno de repetição de serina (SERA), proteína deligação de glicoforina (GBP-130) , proteína 2 rica emhistidina (HRP-2), proteínas 1 e 2 associadas a roptria(RAP-1 e RAP-2), proteína 1 de membrana de eritrócito(PfEMP1), e antígeno 1 de membrana apical (AMA-I).
Em uma modalidade onde o vetor adenoviral compreendetrês ou mais seqüências de ácido nucléico heterólogo, cadauma das seqüências de ácido nucléico heterólogopreferivelmente codifica um antígeno de estágio pré-eritrocítico, um antígeno de estágio de sangue, oucombinações dos mesmos. Por exemplo, o vetor adenoviralpode compreender três seqüências de ácido nucléicoheterólogo, nas quais (i) cada seqüência de ácido nucléicoheterólogo codifica um antígeno de estágio pré-eritrocítico, (ii) cada ácido nucléico heterólogo codificaum antígeno de estágio de sangue, (iii) uma seqüência deácido nucléico heterólogo codifica um antígeno de estágiode sangue, (iii) uma seqüência de ácido nucléico heterólogocodifica um antígeno de estágio de sangue, e duasseqüências e ácido nucléico heterólogo codificaindividualmente um antígeno de estágio pré-eritrocítico, ou(iv) uma seqüência de ácido nucléico heterólogo codifica umantígeno de estágio pré-eritrocítico, e duas seqüências deácido nucléico heterólogo codificam individualmente umantígeno de estágio de sangue. Em uma modalidade preferidada invenção, cada uma das três ou mais seqüências de ácidonucléico heterólogo preferivelmente codifica um antígeno deestágio pré-eritrocítico. Mais preferivelmente, o vetoradenoviral compreende três seqüências de ácido nucléicoheterólogo codificando CST, SSP2, LSA-I ou Antígeno 2.
Similarmente, em modalidades onde o vetor adenoviralcompreende duas ou mais seqüências de ácido nucléicoheterólogo, codificando um antígeno de Plasmodium, cada umadas seqüências de ácido nucléico heterólogo,preferivelmente, codifica um antígeno de estágio pré-eritrocítico, um antígeno de estágio de sangue, oucombinações dos mesmos. Por exemplo, o vetor adenoviralpode compreender duas seqüências de ácido nucléicoheterólogo nas quais (i) cada seqüência de ácido nucléicoheterólogo codifica um antígeno de estágio de sangue, (ii)cada seqüência de ácido nucléico codifica um antígeno deestágio pré-eritrocítico, ou (iii) um seqüência de ácidonucléico heterólogo codifica um antígeno de estágio desangue, e uma seqüência de ácido nucléico heterólogocodifica um antígeno de estágio pré-eritrocítico. Em umamodalidade preferida da invenção, cada uma das seqüênciasde ácido nucléico preferivelmente codifica um antígeno deestágio de sangue. Mais preferivelmente, o vetor adenoviralcompreende duas seqüências de ácido nucléico heterólogo,cada urna das quais codifica MSP-I e AMA-1, respectivamente.
Será considerado que uma proteína inteira, viralintacta, bacteriana ou parasítica não é exigida paraproduzir uma resposta imune. Na realidade, a maioria dosepítopos antigênicos, é relativamente de tamanho pequeno e,portanto, fragmentos de proteína podem ser suficientes paraexposição ao sistema imune de um mamífero. Além disso, umaproteína de fusão pode ser gerada entre dois ou maisepítopos antigênicos de um ou mais antígenos. 0fornecimento de proteínas de fusão por intermédio de vetoradenoviral a um mamífero permite a exposição de um sistemaimune a múltiplos antígenos e, conseqüentemente, permiteque uma única composição de vacina proporcione imunidadecontra múltiplos patógenos. Além disso, a seqüência deácido nucléico heterólogo codificando um antígenoespecífico pode ser modificada para melhorar oreconhecimento do antígeno pelo hospedeiro mamífero. A esserespeito, a presença de uma seqüência de sinais eglicosilação podem afetar a imunogenicidade de um antígenoPlasmodium expresso por um vetor adenoviral. Embora tenhasido mostrado que os antígenos de estágio de sanguecompreendendo uma seqüência de sinais induzem respostasimunes robustas, uma seqüência de sinais nem sempre ésuficiente para a secreção eficiente de tráfico deproteínas P. falsiparum (vide, por exemplo, Yang et al. ,Vaccine, 15: 1303-13 (1997)). Similarmente, a glicosilaçãomostrou a redução da eficácia de uma vacina candidata combase no fragmento 42 kD de C-terminal do antígeno P.falciparum MSP-I (MSPl42) (vide, por exemplo, Stowers etal., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 99: 339-44 (2002));contudo, os resultados a partir dos estudos investigandooutras vacinas de proteína e DNA de P. falciparumdemonstraram que a glicosilação pode não afetar a eficáciada vacina (vide, por exemplo, Stowers et al. , Infect.Immun, 69: 1536-46 (2001)).
Desse modo as seqüências de ácido nucléico heterólogodescritas aqui codificam os antígenos que podem ou nãocompreender uma seqüência de sinais. Em uma modalidadepreferida da invenção, pelo menos uma das seqüências deácido nucléico heterólogo presentes no vetor adenoviralcodifica uma seqüência de sinais. 0 termo "seqüência desinais", conforme aqui usado, se refere a uma seqüência deaminoácido, tipicamente localizada no terminal amino de umaproteína, que visa à proteína para compartimentos celularesespecíficos, tal como o retículo endoplásmico, e direcionaa secreção da proteína madura a partir da célula na qualela é produzida. Seqüências de sinais tipicamente sãoremovidas de um polipeptídeo precursor e, desse modo, nãoestão presentes em proteínas maduras. Qualquer seqüência desinais que direciona a secreção da proteína codificada pelaseqüência de ácido nucléico heterólogo é adequada para usono vetor adenoviral inventivo. Preferivelmente, a seqüênciade sinais é uma seqüência de sinais heteróloga. Maispreferivelmente, a seqüência de sinais é a partir daproteína de fator de aceleração de deterioração humana(DAF), a qual mostrou que melhora a expressão da superfíciede célula e secreção de proteína P. falciparum MSP-I (vide,por exemplo, Burghaus et al. , Mol. Biochem. Parasitol.,104: 171-83 (1999)). As seqüências de ácido nucléicoheterólogo no vetor adenoviral inventivo são construídas detal modo que, quando expressas, uma seqüência de sinaisestá localizada no N-terminal de uma proteína codificadapor uma seqüência de ácido nucléico heterólogo. Porexemplo, seqüências de ácido nucléico codificando umantígeno MSPl42 P- falciparum compreendendo a seqüência desinais heterólogos inclui, SEQ ID N°:20, SEQ ID N°:22, eSEQ ID N°:24. Alternativamente, versões não-secretadas (NS)dos antígenos codificados pelas seqüências de ácidonucléico heterólogo podem ser geradas mediante qualquermeio adequado, mas preferivelmente são geradas mediantedeleção de uma seqüência de sinal a partir da seqüência deácido nucléico heterólogo. Seqüências de ácido nucléicocodificando os antígenos P. falciparum que carecem deseqüência de sinais incluem, por exemplo, SEQ ID N0:14(AMA-I) e SEQ ID N0 :18 (MSPl42). Um antígeno específicotambém pode ser dirigido para a superfície da célula pelapresença de uma seqüência de aminoácido de âncora naseqüência de aminoácido de antígeno. Tais seqüências deâncora são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo,âncoras de Glicosil Fosfatidil Inusitol (GPI). Proteínasancoradas GPI são proteínas ligadas com membranaencontradas em todo o reino animal. Proteínas ancoradas GPIsão ligadas em seu terminal carboxi através de uma ligaçãode fosfodiéster de fosfoetanolamina a um núcleo de tri-manosil glucosamina não-acetilada (Man3-GlcN). Aextremidade de redução de GlcN é ligada aofosfatidilinositol (PI) . PI é então ancorado através deoutra ligação de fosfodiéster à membrana de célula atravésde sua região hidrofóbica (vide, por exemplo, o sítio daweb da Sigma-Aldrich e Takeda et al. , Trends. Biochem.Sci., 20(9) : 367-71 (1995) . Deletar ou de outro modo inibira âncora GPI (por exemplo, por intermédio de uma parteposterior de inibição de âncora GPI) resulta em secreção doantígeno a partir da célula.
Além disso, as seqüências de ácido nucléico heterólogodescritas aqui codificam os antígenos que podem ou não serglicosilados (por exemplo, glicosilação N-Iigada ou co-ligada) . Em uma modalidade preferida da invenção, pelomenos uma das seqüências de ácido nucléico heterólogopresentes no vetor adenoviral codifica um antígeno que nãoé glicosilado (N-glicosilado ou 0-glicosilado). Maispreferivelmente, a seqüência de ácido nucléico heterólogocodifica um antígeno que não é N-glicosilado. Emboraestudos recentes indiquem que as proteínas P-falciparum nãocontêm quantidades significativas de carboidratos N-Iigadose O-Iigados (Gowda et al., Parisitol. Today, 15: 147-52(1999)), algumas proteínas P-falciparum contêm locais deglicosilação potenciais (Yang et al. , Glycobiology, 9:1347-56 (1999)). A glicosilação dos antígenos codificadospelas seqüências de ácido nucléico heterólogo no vetoradenoviral inventivo pode ser inibida mediante qualquermétodo adequado. Preferivelmente, a glicosilação é inibidapor fazer mutações em locais de glicosilação presentes nasseqüências de ácido nucléico heterólogo. Tais mutaçõesincluem aquelas que realizariam as deleções, assubstituições, e/ou as inserções de aminoácidos noantígeno. Preferivelmente, a glicosilação é inibidamediante mutação de uma seqüência de ácido nucléicoheterólogo codificando um antígeno de Plasmodium de talmodo que pelo menos um aminoácido de um local deglicosilação é substituído com um aminoácido diferente. Umasubstituição exemplar inclui a troca do resíduo deasparagina na posição 321 da proteína P. falciparum MSP-Icom um resíduo de glutamina. Além disso, certos resíduos deasparagina da proteína P. falciparum AMP-I também podem sersubstituídos para inibir a glicosilação. Por exemplo, oresíduo de asparagina na posição 162 pode ser substituídocom um resíduo de lisina, e os resíduos de asparagina nasposições 266, 371, 421, 422, e 499 podem ser substituídoscom resíduos de glutamina. Essas mutações são exemplares ede forma alguma limitadoras. Na realidade, qualquer mutaçãopode ser utilizada que desarticule um local de glicosilaçãonativo. Seqüências de ácido nucléico codificando osantígenos P. falciparum compreendendo glicosilação quesofreu mutação ainda inclui, por exemplo, SEQ ID N°:12, SEQID №:16 e SEQ ID №:22.
Quando a seqüência de ácido nucléico heterólogocodifica um antígeno, preferivelmente um antígenoPlasmodium, a seqüência de ácido nucléico heterólogocompreende códons expressados mais freqüentemente em sereshumanos do que no patógeno a partir do qual a seqüência deácido nucléico heterólogo é derivada. Embora o códigogenético geralmente seja universal através das espécies, aescolha entre códons sinônimos freqüentemente é dependenteda espécie. Utilização infreqüente de um códon específicopor um organismo provavelmente reflete um baixo nível doRNA de transferência correspondente (tRNA) no organismo.Desse modo, a introdução de uma seqüência de ácido nucléicoem um organismo que compreende códons que não sãofreqüentemente utilizados no organismo pode resultar emexpressão limitada da seqüência de ácido nucléico. Aquelesde conhecimento comum na técnica considerariam que, para seobter máxima proteção contra infecção de Plasmodium, ovetor adenoviral inventivo deve ser capaz de exprimir altosníveis de antígenos de Plasmodium em um mamífero,preferivelmente um ser humano, hospedeiro. A esse respeito,a seqüência de ácido nucléico heterólogo preferivelmentecodifica a seqüência de aminoácido nativa de um antígeno dePlasmodium, mas compreende códons que são expressados maisfreqüentemente em mamífero (por exemplo, humanos) do que emPlasmodium. Tais seqüências modificadas de ácido nucléicosão comumente descritas na técnica como "humanizadas" como"códon otimizados", ou utilizando códons "preferidosmamíferos" ou "preferidos humanos".
No contexto da invenção, uma seqüência de ácidonucléico de Plasmodium é dita com sendo "códon otimizada"se pelo menos aproximadamente 60% (pelo menosaproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80%, oupelo menos aproximadamente 90%) dos códons do tipo selvagemna seqüência de ácido nucléico forem modificados paracodificar os códons de mamíferos preferidos. Isto é, umaseqüência de ácido nucléico de Plasmodium é otimizada emtermos de códon se pelo menos aproximadamente 60% doscódons codificados na mesma forem códons preferidos demamíferos. Seqüências de ácido nucléico códon otimizadaspreferidas codificando antígeno CSP de P. falciparum,incluem, por exemplo, SEQ ID N0 :4, SEQ ID N°: 6, e SEQ IDN0:8. Seqüências de ácido nucléico códon otimizadaspreferidas codificando o antígeno SSP-2 de P. falciparumincluem, por exemplo, SEQ ID N0:28 e SEQ ID N0:30. Umaseqüência de ácido nucléico códon otimizada preferidacodificando o antígeno AMA-I de P. falciparum e o antígenoLSA-I inclui SEQ ID N0:10 e SEQ ID N0:26, respectivamente.Contudo, a invenção não é limitada a essas seqüênciasexemplares. Na realidade, as seqüências genéticas podemvariar entre diferentes cepas, e esse escopo natural devariação alélica é incluído no escopo da invenção.Adicionalmente e alternativamente, a seqüência de ácidonucléico de códon otimizado codificando um antígeno P.falciparum pode ser qualquer seqüência que hibridiza paraas seqüências descritas acima sob condições de estringênciapelo menos moderadas, preferivelmente elevadas, tais comoaquelas descritas em Sambrook et al. , acima. Determinar ograu de homologia pode ser realizado utilizando qualquermétodo adequado (por exemplo, BLASTnt, provido porGenBank).
Cada uma das seqüências de ácido nucléico heterólogono vetor adenoviral inventivo está convenientementepresente como parte de um cassete de expressão, isto é, umaseqüência de nucleotideo específica que possui funções asquais facilitam a subclonagem e recuperação de umaseqüência de ácido nucléico (por exemplo, um ou mais locaisde restrição) ou expressão de uma seqüência de ácidonucléico (por exemplo, locais de poliadenilação ou união).
Cada ácido nucléico heterólogo preferivelmente estálocalizado na região El (por exemplo, substitui a região Elintegralmente ou parcialmente) e/ou na região E4 do genomaadenoviral. Por exemplo, a região El pode ser substituídapor um ou mais cassetes de expressão de promotor variávelcompreendendo um ácido nucléico heterólogo.
Alternativamente, em modalidades onde o vetor adenoviralcontém a região El, mas é deficiente na região E4, a regiãoE4 pode ser substituída por um ou mais cassetes deexpressão. Dessa maneira, inserir um cassete de expressãona região E4 do genoma adenoviral inibe a formação de"adenovetores revertentes El" (REA), porque a recombinaçãohomóloga dentro da região El e o DNA de El de uma linha decélula complementar (por exemplo, célula 2 93) ou vírusajudante resulta em um genoma adenoviral contendo-El que émuito grande para embalagem dentro de um capsídeo deadenovírus. Cada cassete de expressão pode ser inserido emuma orientação 3'-5', por exemplo, orientado de tal modoque a direção de transcripção do cassete de expressão éoposta àquela do genoma adenoviral adjacente circundante.
Contudo, também é apropriado para um cassete de expressãoser inserido em uma orientação 5'-3' com relação à direçãode transcripção do genoma circundante. A esse respeito, épossível para o vetor adenoviral inventivo compreender pelomenos uma seqüência de ácido nucléico heterólogo que éinserido, por exemplo, na região El em uma orientação 3'-e pelo menos uma seqüência de ácido nucléico heterólogoinserido na região E4 em uma orientação 5'-3'. Emmodalidades onde a região E' e/ou E4 é substituída por doisou mais cassetes de expressão (por exemplo, um cassete deexpressão dual), cada um dos cassetes de expressão pode serposicionado em qualquer orientação com relação uns aosoutros. Por exemplo, dois cassetes de expressão podem serposicionados de tal modo que cada um dos promotoresrespectivos esteja adjacente ao outro. Dessa maneira, umcassete de expressão está em uma orientação 5'-3' comrelação à direção de transcrição do genoma adenoviral, e ooutro cassete de expressão está na orientação 3'-5'.Mediante posicionamento de dois promotores adjacentesmutuamente, a atividade de um dos promotores pode seraperfeiçoada pela atividade do promotor adjacente.
De acordo com a invenção, pelo menos uma seqüência deácido nucléico heterólogo (por exemplo, uma, duas, três oumais seqüências de ácido nucléico heterólogo) estálocalizada na região El do genoma adenoviral, e pelo menosuma seqüência de ácido nucléico heterólogo (por exemplo,uma, duas, três ou mais seqüências de ácido nucléicoheterólogo) está localizada na região E4 do genomaadenoviral. Em modalidades onde o vetor adenoviralcompreende três ou mais seqüências de ácido nucléico, pelomenos uma seqüência de ácido nucléico heterólogopreferivelmente está localizado na região E1 do genomaadenoviral, e pelo menos duas seqüências de ácido nucléicoheterólogo estão preferivelmente localizadas na região E54do genoma adenoviral. Alternativamente, pelo menos duasseqüências de ácido nucléico heterólogo podem estarlocalizadas na região E1 do genoma adenoviral, e pelo menosuma seqüência de ácido nucléico heterólogo pode estarlocalizada na região E4 do genoma adenoviral. Embora nãoseja preferido, todas as seqüências de ácido nucléicoheterólogo podem estar localizadas seja na região E1 ou naregião E4 do genoma adenoviral. Em modalidades onde o vetoradenoviral compreende duas ou mais seqüências de ácidonucléico codificando um antígeno Plasmodiuml cada uma dasduas ou mais seqüências de ácido nucléico preferivelmenteestá localizada na região E1 ou na região E4 do genomaadenoviral. Mais pref erivelmente, cada uma das duas ou maisseqüências de ácido nucléico heterólogo está localizada naregião E4 do genoma adenoviral. A inserção de um cassete deexpressão no genoma adenoviral (por exemplo, na região E1do genoma) pode ser facilitada por métodos conhecidos, porexemplo, pela introdução de um local de restrição singularem uma determinada posição do genoma adenoviral. Comomostrado acima, preferivelmente toda ou parte da região E3do vetor adenoviral também é deletada.
Preferivelmente, cada seqüência de ácido nucléicoheterólogo é preferivelmente ligada a (isto é, sob ocontrole transcripcional) um ou mais promotor e/ouelementos de aperfeiçoamento, por exemplo, como parte de umcassete de expressão de promotor variável. Técnicas paraligar de maneira operável juntas as seqüências sãoconhecidas na arte. Qualquer seqüência de promotor ouaperfeiçoador pode ser usada no contexto da invenção, desdeque expressão suficiente da seqüência de ácido nucléicoheterólogo seja conseguida e uma resposta imune robustacontra o antigeno codificado seja gerada. Preferivelmente,o promotor é um promotor heterólogo, em que o promotor nãoé obtido a partir de, derivado de, ou baseado em umpromotor de ocorrência natural do vetor adenoviral. A esserespeito, o promotor pode ser um promotor viral. Promotoresvirais adequados incluem, por exemplo, promotores decitomegalovirus (CMV), tal como o promotor imediato-antigoCMV de camundongo (mCMV) ou o promotor imediato-antigo CMVhumano (hCMV) (descrito, por exemplo, nas Patentes US5.168.062 e 5.385.839), promotores derivados de vírus deimunode ficiência humana (HIV), tal como o promotor derepetição de terminal longo de HIV, promotores de vírus desarcoma Rous (RSV) , tal como a repetição de terminal longode RSV ou um promotor de SEQ ID N0 :4, promotores de vírusde tumor mamário de camundongo (MMTV), promotores de HSV,tal como o promotor Lap2 ou promotor de cinase de timedinada herpes (Wagner et al. , Proc. Natl. Acad. Sci., 78:144-145(1981)), promotores derivados de SV40 ou vírus EpsteinBarr, um promotor viral adeno-associado, tal como opromotor p5, e semelhante. Preferivelmente, o promotor é opromotor imediato-antigo de CMV (camundongo ou humano), ouum promotor de RSV.
Alternativamente, o promotor pode ser um promotorcelular, isto é, um promotor que é nativo para célulaseucarióticas, preferivelmente de animais. Em um aspecto, opromotor celular é preferivelmente um promotor constitutivoque funciona em uma variedade de tipos de células, taiscomo as células associadas ao sistema imune. Promotoresconstitutivos adequados podem acionar a expressão de genescodificando fatores de transcrição, genes de preparação, ougenes estruturais comuns para as células eucarióticas.Promotores celulares adequados incluem, por exemplo, umpromotor de ubiquitina (por exemplo, um promotor UbC)(vide, por exemplo, Marinovic et al. , J. Biol. Chem.,277(19): 16673-16681 (2002)), um promotor de β-actinahumano, um promotor EF-Ια, um promotor YYl, um promotor defator-1 nuclear zipper de leucina básica (BLZF-I), umpromotor de enolase de neurônio especifico (NSE), umpromotor de proteína 70B de choque térmico (HSP70B), e umpromotor JEM-I. Preferivelmente, o promotor celular é umpromotor de ubiquitina.
Muitos dos promotores descritos acima são promotoresconstitutivos. Em vez de ser um promotor constitutivo, opromotor pode ser um promotor indutor, isto é, um promotorregulado para cima e/ou para baixo em resposta a um sinalapropriado. 0 uso de um promotor regulável ou seqüência decontrole de expressão é particularmente aplicável aodesenvolvimento de vacina de DNA visto que as proteínasantigênicas, incluindo antígenos virais e de parasitas,freqüentemente são tóxicos para as linhas de células decomplementação. Um promotor pode ser regulado para cimamediante uma fonte de energia radiante ou mediante umasubstância que desarticula as células. Por exemplo, umaseqüência de controle de expressão pode ser regulada paracima por drogas, hormônios, ultra-som, compostos ativadospor luz, radiofreqüência, quimioterapia, ecriocongelamento. Desse modo, a seqüência de promotor queregula a expressão da seqüência de ácido nucléicoheterólogo pode conter pelo menos uma seqüência reguladoraheteróloga responsiva à regulação por intermédio de umagente exógeno. Sistemas promotores que podem ser induzidosadequados incluem, mas não são limitados ao promotor IL-8,o sistema de promotor que pode ser induzido demetalotionina, o sistema de expressão IacZYA bacteriano, osistema de expressão de tetraciclina, e o sistema depolimerase T7. Adicionalmente, os promotores que sãoseletivamente ativados em estágios de desenvolvimentodiferentes (por exemplo, genes de globina sãodiferencialmente transcritos a partir dos promotoresassociados à globina em embriões e adultos) podem serempregados.
O promotor pode ser um promotor de tecido especifico,isto é, um promotor que é preferencialmente ativado em umdeterminado tecido e resulta na expressão de um produto degene no tecido onde ativado. Um promotor de tecidoespecífico adequado para uso na invenção pode ser escolhidopor aqueles de conhecimento comum na técnica com base notecido alvo ou tipo de célula. Promotores de tecidoespecífico preferidos para uso no método inventivo sãoespecíficos para células humanas, tal como o promotor deDectina-2 específico de célula dendrítica descrito emMorita et al., Gene Ther., 8:1729-37 (2001).
Em ainda outra modalidade, o promotor pode ser umpromotor quimérico. Um promotor é "quimérico" em que elecompreende pelo menos duas porções de seqüências de ácidonucléico obtidas a partir de, derivadas de, ou baseadas empelo menos duas fontes diferentes (por exemplo, duasregiões diferentes de um genoma do organismo, doisorganismos diferentes, ou um organismo combinado com umaseqüência sintética) . Preferivelmente, as duas porções deseqüência de ácido nucléico diferentes exibem menos do queaproximadamente 4 0%, mais preferivelmente menos do queaproximadamente 25%, e ainda mais preferivelmente menos doque aproximadamente 10% da identidade de seqüência de ácidonucléico para outro (o qual pode ser determinado pormétodos descritos aqui em outra parte). Promotoresquiméricos podem ser gerados utilizando técnicas debiologia molecular padrão, tais como aquelas descritas emSambrook et al. , Molecular Cloning, um Laboratory Manual,3a edição, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor,N.Y. (2001), e Ausubel et al.,Current Protocols inMolecular Biology, Greene Publishing Associates e JohnWiley Sc Sons, New York, N.Y. (1994) .
Um promotor pode ser selecionado para uso no método dainvenção mediante equiparação de seu padrão específico deatividade com o padrão desejado e nível de expressão doantígeno(s). A esse respeito, o vetor adenoviralcompreende, preferivelmente, duas ou mais seqüências deácido nucléico heterólogo que codificam diferentesantígenos e são de maneira operável ligadas a diferentespromotores exibindo perfis de expressão distintos. Porexemplo, um primeiro promotor é selecionado para mediar umpico inicial de produção de antígeno, desse modo preparandoo sistema imune contra um antígeno codificado. Um segundopromotor é selecionado para acionar a produção do mesmo oudiferente antígeno de tal modo que a expressão atinge omáximo, muitos dias após o pico inicial de produção deantígeno acionado pelo primeiro promotor, desse modo"reforçando" o sistema imune contra o antígeno.Alternativamente, um promotor quimérico pode ser construídoo qual combina os aspectos desejáveis de múltiplospromotores. Por exemplo, um promotor híbrido CMV-RSVcombinando o ímpeto de atividade inicial do promotor CMVcom o alto nível de manutenção de atividade do promotor RSVé especialmente preferido para uso em muitas modalidades dométodo inventivo. Além disso, um promotor pode sermodificado para incluir elementos heterólogos que melhorama sua atividade. Por exemplo, uma seqüência de promotor CMVhumano pode incluir um sinal de união sintética, a qualmelhora a expressão de uma seqüência de ácido nucléico, demaneira operável ligada a ela. Como os antígenos podem sertóxicos para as células eucarióticas, pode ser vantajosomodificar o promotor para diminuir a atividade em linhas decélula de complementação usadas para propagar o vetoradenoviral.
Múltiplas seqüências de ácido nucléico heterólogopodem ser de maneira operável ligadas aos mesmos oudiferentes promotores. Em uma modalidade preferida dainvenção, cada seqüência de ácido nucléico heterólogo éligada de maneira operável a um promotor separado. Emboraseja preferido que cada promotor seja diferente, aqueles deconhecimento comum na técnica considerarão as vantagens deutilizar um promotor particularmente eficiente paracontrolar a expressão de cada seqüência de ácido nucléicoheterólogo presente no vetor adenoviral. Desse modo, cadaseqüência de ácido nucléico heterólogo pode ser ligada demaneira operável ao mesmo promotor. Quando o vetoradenoviral compreende três ou mais seqüências de ácidonucléico heterólogo, as três ou mais seqüências de ácidonucléico heterólogo são ligadas de maneira operável a doisou mais diferentes promotores (por exemplo, duas seqüênciasde ácido nucléico heterólogo são individualmente ligadas demaneira operável ao mesmo promotor, e uma seqüência deácido nucléico heterólogo é ligado de maneira operável a umpromotor diferente). Mais preferivelmente, cada uma dastrês ou mais seqüências de ácido nucléico heterólogo éligado de maneira operável a um promotor diferente. Aseleção de um promotor apropriado para uma determinadaseqüência de ácido nucléico heterólogo dependerá de umnúmero de fatores, incluindo a resistência do promotor e aposição do cassete de expressão dentro do genomaadenoviral, e pode ser realizada utilizando métodos derotina conhecidos na técnica.
Para otimizar a produção de proteína, preferivelmentecada seqüência de ácido nucléico heterólogo compreendeadicionalmente um local 3' de poliadenilação da seqüênciade codificação. Qualquer seqüência de poliadenilaçãoadequada pode ser usada, incluindo uma seqüência otimizadasintética, assim como a seqüência de poliadenilação de BGH(Hormônio de Crescimento Bovino), globina D de camundongo(MGD), vírus de polioma, TK (Timidina Quinase) EBV (VírusEpstein Bar), e os papilomavírus, incluindo papilomavírushumanos e BPV (Vírus de Papiloma Bovino). Uma seqüência depoliadenilação preferida é a seqüência de poliadenilaçãoSV40 (Vírus de Sarcoma Humano-40). Além disso,preferivelmente todos os sinais de transcrição adequados (esinais de translação, quando apropriado) são corretamentearranjados de tal modo que a seqüência de ácido nucléico éadequadamente expressa nas células nas quais ela éintroduzida. Se desejado, a seqüência de ácido nucléicoheterólogo também pode incorporar locais de união (isto é,locais doadores de união e aceitadores de união) parafacilitar a produção de mRNA.
A invenção também provê um método de induzir umaresposta humana contra malária em mamíferos. O métodocompreende administrar ao mamífero (a) um vetor adenoviralcompreendendo um genoma adenoviral compreendendo três oumais seqüências de ácido nucléico, em que cada seqüência deácido nucléico codifica um antígeno de estágio pré-eritrocítico de Plasmodium e é de maneira operável ligada apelo menos um promotor, e (b) um vetor adenoviralcompreendendo um genoma adenoviral compreendendo duas oumais seqüências de ácido nucléico, em que cada seqüência deácido nucléico codifica um antígeno de estágio de sangue dePlasmodium e é de maneira operável ligado a pelo menos um
0 promotor. Descrições dos vetores adenovirais, antígenos dePlasmodium, e promotores, apresentadas acima em conexão comoutras modalidades da invenção também são aplicáveisàqueles mesmos aspectos do método anteriormente mencionado.
No método da invenção, os vetores adenoviraispreferivelmente são administrados a um mamífero (porexemplo, um ser humano) , em que as seqüências de ácidonucléico codificando os antígenos de Plasmodium sãoexpressas para induzir uma resposta imune contra osantígenos. Os vetores adenovirais podem ser formuladosseparadamente e administrados simultaneamente ouseqüencialmente em qualquer ordem. Alternativamente, osvetores adenovirais podem ser parte da mesma composiçãofarmacêutica. A resposta imune pode ser uma resposta imunehumoral, uma resposta imune mediada por célula ou,desejavelmente, uma combinação de imunidade humoral emediada por célula. Idealmente, a resposta imune provêproteção a partir de desafio subseqüente com o agenteinfeccioso compreendendo o antígeno. Contudo, a imunidadeprotetora não é exigida no contexto da invenção. O métodoinventivo adicionalmente pode ser utilizado para produção ecolheita de anticorpos.
Administração dos vetores adenovirais codificando osantígenos de Plasmodium pode ser um componente de um regimede múltiplas etapas para induzir uma resposta imune em ummamífero. Especificamente, o método inventivo poderepresentar um braço de um regime de imunização depreparação e reforço. 0 método inventivo, portanto, podecompreender administrar ao mamífero um vetor detransferência de gene inciante compreendendo uma seqüênciade ácido nucléico codificando pelo menos um antígeno antesda administração dos vetores adenovirais. 0 antígenocodificado pelo vetor de transferência de gene inciantepode ser o mesmo ou diferente dos antígenos dos vetoresadenovirais. Os vetores adenovirais inventivos são entãoadministrados para reforçar a resposta imune para umdeterminado patógeno. Mais do que uma composição de reforçocompreendendo os vetores adenovirais podem ser providas emqualquer quadro de tempo adequado (por exemplo, pelo menosaproximadamente 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas,12 semanas, 16 semanas, ou mais após a preparação) paramanter a imunidade.
Qualquer vetor de transferência de gene pode serempregado como um vetor de transferência de gene depreparação, incluindo, mas não limitado a um plasmídio, umretrovirus, um vírus adeno-associado, um vírus de vacina,um vírus do herpes, um alfavírus, ou um adenovírus.Idealmente, o vetor de transferência de gene inciante é umplasmídio, um alfavírus, ou um vetor adenoviral. Paramaximizar o efeito do regime de preparação, o vetor detransferência de gene inciante pode compreender mais do queuma seqüência de ácido nucléico heterólogo codificando umantígeno. Preferivelmente, o vetor de transferência de geneinciante compreende duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 5, oumais) outros ou mais (por exemplo, 3, 5, 7, 9 ou mais)seqüências de ácido nucléico heterólogo cada uma delascodificando um antígeno. Alternativamente, uma respostaimune pode ser preparada ou reforçada medianteadministração do próprio antígeno, por exemplo, umaproteína antigênica, patógeno intacto (por exemplo,esporozoítos de Plasmodiuiη), eritrócitos parasitizados,patógeno inativado, e semelhante.
Qualquer via de administração pode ser usada parafornecer o vetor adenoviral ao mamífero. Na realidade,embora mais do que uma via possa ser usada para administraro vetor adenoviral, uma via específica pode prover umareação mais imediata e mais efetiva do que outra via.Preferivelmente, o vetor adenoviral é administrado porintermédio de injeção intramuscular. Uma dose de vetoradenoviral também pode ser aplicada ou instilada nascavidades corpóreas, absorvidas através da pele (porexemplo, por intermédio de emplastro transdérmico) ,ingerida, topicamente aplicada ao tecido, ou administradade forma parenteral por intermédio, por exemplo, deadministração intravenosa, peritoneal, ou intra-arterial.
O vetor adenoviral pode ser administrado em ou sobreum dispositivo que permite a liberação controlada ousustentada, tal como uma esponja, malha biocompatível,reservatório mecânico, ou implante mecânico. Os implantes(vide, por exemplo, a Patente US 5.443.505), dispositivos(vide, por exemplo, a Patente US 4.863.457), tal como umdispositivo que pode ser implantado, por exemplo, umreservatório mecânico ou um implante ou um dispositivocompreendido de uma composição polimérica, sãoparticularmente úteis para administração do vetoradenoviral. O vetor adenoviral também pode ser administradona forma de formulações de liberação sustentada (vide, porexemplo, a Patente US 5.378.475) compreendendo, porexemplo, espuma de gel, ácido hialurônico, gelatina,sulfato de condroitina, poli-fosfo-éster, tal como bis-2-hidroxietil-tereftalato (BHET), e/ou um ácido polilático-glicólico.
A dose do vetor adenoviral administrada ao mamíferodependerá de um número de fatores, incluindo o tamanho deum tecido alvo, a extensão de quaisquer efeitos colaterais,a via específica de administração, e semelhante. A dosecompreende idealmente uma "quantidade eficaz" de vetoradenoviral, isto é, uma dose de vetor adenoviral queprovoca uma resposta imune desejada no mamífero. A respostaimune desejada pode requerer a produção de anticorpos,proteção a partir de desafio subseqüente, tolerância imune,ativação de células imunes, e semelhantes.Convenientemente, uma única dose de vetor adenoviralcompreende pelo menos aproximadamente IxlO5 partículas (aqual também é referida como unidades de partícula) do vetoradenoviral. A dose preferivelmente é de pelo menosaproximadamente IxlO6 partículas (por exemplo,aproximadamente IxIO6-IxIO12) , mais pref erivelmente pelomenos aproximadamente IxlO7 partículas, maispreferivelmente pelo menos aproximadamente IxlO8 partículas(por exemplo, aproximadamente IxIO8-IxIO11 partículas) , emais preferivelmente pelo menos aproximadamente IxlO9partículas (por exemplo, aproximadamente IxIO9-IxIO10partículas) do vetor adenoviral. A dose compreendedesejavelmente não mais do que aproximadamente IxlO14partículas, preferivelmente não mais do que aproximadamente1x1013 partículas, ainda mais pref erivelmente não mais doque aproximadamente 1x1012 partículas, ainda maispreferivelmente não mais do que aproximadamente IxlO11partículas, e mais pref erivelmente não mais do queaproximadamente IxlO10 partículas (por exemplo, não mais doque aproximadamente IxlO9 partículas). Em outras palavras,uma única dose de vetor adenoviral pode compreender, porexemplo, aproximadamente IxlO6 unidades de partícula (pu),2xl06 pu, 4xl06 pu, IxlO7 pu, 2xl07 pu, 4xl07 pu, IxlO8pu, 2xl08 pu, 4xl08 pu, IxlO9 pu, 2xl09 pu, 4xl09 pu, IxlO10pu, 2x1010 pu, 4x1010 pu, IxlO11 pu, 2x1o11 pu, 4x1o11 pu,1x1012 pu, 2xl012 pu, ou 4xl012 pu do vetor adenoviral.
O vetor adenoviral convenientemente é administrado emuma composição, preferivelmente uma composiçãofarmaceuticamente aceitável (por exemplo, fisiologicamenteaceitável), a qual compreende um carreador, preferivelmenteum carreador farmaceuticamente aceitável (por exemplo,fisiologicamente aceitável) e o vetor(es) adenoviral.Qualquer carreador adequado pode ser usado dentro docontexto da invenção, e tais carreadores são conhecidos natécnica. A escolha do carreador será determinada, em parte,pelo local específico no qual a composição deve seradministrada e pelo método específico usado paraadministrar a composição. Idealmente, no contexto devetores adenovirais, a composição preferivelmente é livrede adenovírus de replicação competente. A composiçãoopcionalmente pode ser estéril ou estéril com a exceção dovetor adenoviral inventivo.
Formulações adequadas para a composição incluemsoluções aquosas e não-aquosas, soluções estéreisisotônicas, as quais podem conter antioxidantes, tampões, ebacteriostat, e suspensões estéreis aquosas e não-aquosasque podem incluir agentes de suspensão, solubilizadores,agentes de espessamento, estabilizantes, e conservantes. Asformulações podem ser apresentadas em dose unitária ou emrecipientes vedados de múltiplas doses, tais como ampolas efrascos, e podem ser armazenadas em uma condiçãocongelada/seca (Iiofilizada) exigindo apenas a adição docarreador líquido estéril, por exemplo, água, imediatamenteantes do uso. Soluções suspensões extemporâneas podem serpreparadas a partir de pós estéreis, grânulos, ecomprimidos do tipo previamente descrito. Preferivelmente,o carreador é uma solução salina tamponada. Maispreferivelmente, o vetor adenoviral para uso no métodoinventivo é administrado em uma composição formulada paraproteger o vetor de expressão contra dano antes daadministração. Por exemplo, a composição pode ser formuladapara reduzir a perda do vetor adenoviral nos dispositivosusados para preparar, armazenar, ou administrar o vetor deexpressão, tal como artefatos de vidro, seringas ouagulhas. A composição pode ser formulada para diminuir asensibilidade à luz e/ou sensibilidade à temperatura dovetor de expressão. Com essa finalidade, a composiçãocompreende preferivelmente um carreador liquidofarmaceuticamente aceitável, tal como, por exemplo, aquelesdescritos acima, e um agente estabilizador selecionado dogrupo consistindo em polisorbato 80, L-arginina,polivinilpirrolidona, trehalose, e suas combinações. 0 usode tal composição prolonga a vida em estoque do vetor,facilita a administração, e aumenta a eficiência do métodoinventivo. Formulações para composições contendo vetoradenoviral são descritas adicionalmente, por exemplo, naPatente US 6.225.289; Patente US 6.514.943; Publicação dePedido de Patente US 2003/0153065 Al, e Publicação dePedido de Patente Internacional WO 00/34444. Uma composiçãotambém pode ser formulada para melhorar a eficiência detransdução. Além disso, aqueles de conhecimento comum natécnica considerarão que o vetor adenoviral pode estarpresente em uma composição com outros agentesbiologicamente ativos ou terapêuticos. Por exemplo, fatoresque controlam a inflamação, tal como ibuprofeno ouesteróides, podem ser parte da composição para reduzir oinchaço e a inflamação associados à administração in vivodo vetor viral. Conforme discutido aqui, estimuladores ouadjuvantes do sistema imune, por exemplo, interleucinas,lipopolissacarídeo, e RNA de filamento duplo, podem seradministrados para melhorar ou modificar qualquer respostaimune ao antígeno. Antibióticos, isto é, microbicidas efungicidas, podem estar presentes para tratar a infecçãoexistente e/ou reduzir o risco de infecção futura, tal comoinfecção associada aos procedimentos de transferência degene.
Os exemplos a seguir ilustram adicionalmente ainvenção, porém, evidentemente, não devem ser consideradoscomo de forma alguma limitando o seu escopo.
EXEMPLO 1
Esse exemplo demonstra a preparação de um vetoradenoviral compreendendo uma seqüência de ácido nucléicoheterólogo codificando um antígeno de estágio de sangue deP. falciparum.
Dez vetores adenovirais deficientes em E1/E3/E4 deserotipo 5 contendo, no lugar da região El deletada, umaseqüência de ácido nucléico codificando versões não-secretadas (NS), secretadas e glicosiladas (SG), esecretadas e não-glicosiladas (SNG) das proteínas AMA-I(PfAMAl) e MSP-I42 (PfMSPl42) de P. falciparum, foramgerados. A versão SG de PfMSPl42 foi gerada mediante fusãoda seqüência de sinal de fator de aceleração dedeterioração (DAF) para a extremidade 5' do gene PfMSPl42.
A versão SNG de PfMSPl42 contém a seqüência de sinal DAF euma substituição de asparagina para glutamina na porção deaminoácido 321. A versão SG de PfAMAl é o gene PfAMAl decomprimento completo. A versão SNG de PfAMAl contémsubstituições de asparagina para glutamina nas posições deaminoácido 286, 371, 421, 422, e 499, e um substituição deasparagina para lisina na posição de aminoácido 162. Aversão NS de PfAMAl contém uma deleção da seqüência desinal nativo.
Em cada construção de vetor adenoviral, o PfMSPl42 foiexpresso a partir de um cassete de expressão inserido nolocal da deleção El na orientação oposta com relação àtranscrição de vetor adenoviral. O cassete de expressãocontém, de 5' a 3', o promotor CNV humano (hCMV) tendo umsinal de união sintética, o gene PfMSPl42, e um sinal depoliadenilação SV40. Em cada construção de vetoradenoviral, o gene PfAMAl foi expresso a partir de umpromotor CMV murino (mCMV) em um cassete de expressãoinserido no local da deleção E4.
Para garantir que o cassete de expressão mCMVlocalizado na região E4 fosse comparável ao cassete deexpressão hCMV na região El, três vetores adicionais foramgerados como controles: (1) AdPfAMAl (SG) , o qualcompreende a versão SG de PfAMAl de maneira operável ligadoao promotor hCMV na região El, (2) AdmCMVPfAMAl (SG) , oqual compreende a versão SG de PfAMAl ligada de maneiraoperável ao promotor mCMV na região El, e (3)Ada. E41. PfAMAI (SG) que compreende a versão SG de PfAMAlligado de maneira operável ao promotor hCMV na região E4.
Os vetores compreendendo as versões SG, SNG, e NS dogene PfAMAl e do gene PfMSPl42 foram avaliadas em relaçãoao status de glicosilação e em relação à localizaçãocelular dos antígenos. Análise immunoblot indicou que opeso molecular aparente da versão SG de PfAMAl era superioràquela das versões NS ou S, sugerindo que a versão SG foimodificada pós-translacionalmente. Análise immunoblottambém indicou que o peso molecular aparente da versão SGde MSPl42 foi superior àquele das versões NS ou SNG,sugerindo que a versão SG foi modificada pós-translacionalmente. O status de glicosilação foi confirmadomediante infecção das células A54 9 com o PfAMAl dos vetoresPfMSPl42 e então tratando o lisato celular colhido 24 horaspós-infecção com Endo H ou PNGase F. Complexo de hidrólisePNGaseF, híbrido, e N-glicanos do tipo de elevada Manose eEndo H cliva apenas as estruturas do tipo de elevadamanose. 0 tratamento com ambas as enzimas resultou em umaredução no peso molecular aparente do produto PfAMAl (SG) edo produto MSP-I42 (SG) , indicando que PfAMAl (SG) e MSPl42(SG) são ambos N-glicosilados. Nenhuma mudança no pesomolecular aparente das versões NS ou SNG de PfAMAl foiobservada. Nenhuma mudança no peso molecular da versão NS euma mudança insignificante no peso molecular da versão SNGde PfMSPl42 foram observadas, possivelmente devido àsdiferenças em resistência iônica do tampão de digestãoenzimática. A expressão do antígeno PfAMAl (NS) foi muitoreduzida em relação aos antígenos SG e SNG; contudo, outrasimmunoblots utilizando anticorpos diferentes demonstraramque o antígeno NS é expresso eficientemente.
Análise de immunoblot de todas as construções deadenovetor indicou que nenhum dos vetores AMAI secretou oantígeno para os meios de cultura, e que a maior parte daproteína MSP não é secretada para os meios de cultura.Ensaios de imunofluorescência (IFA) indicaram que oantígeno PfAMAl (SG) está localizado na superfície dacélula, uma vez que níveis similares de PfAMAl foramobservados nas células não permeabilizadas versuspermeabilizadas. A versão SNG de AMAI não estava presenteno exterior da célula, quando permeabilização foinecessária para detectar o antígeno por IFA. A digestão deprotease de células infectadas intactas confirmou essasdescobertas e revelou que PfAMAl(SG) foi clivado portripsina e que os antigenos PfAMAl(SNG)e PfAMAI (NS) nãoforam clivados pela tripsina. Essa análise sugere que oantígeno PfAMAl(SG) está presente na superfície da célulaem uma conformação que é reconhecida pelo anticorpo 4G2 esensível à digestão de tripsina.
IFA também indicou que nenhum dos antigenos MSPI42estava associado com a superfície da célula, quandopermeabilização das células foi exigida para detectarantigenos PfMSPl por IFA. Contudo, digestão de protease decélulas infectadas intactas revelou que PfMSPl42 (SG) foiclicado pela tripsina e que os antigenos PfMSPl42 (SNG) ePfMSPl42 (NS) não foram clivados pela tripsina. Essaanálise sugere que o antígeno PfMSPl42 (SG) está presentena superfície da célula em uma conformação que é sensível àdigestão de tripsina, mas não é reconhecido pelos anti-soros policlonais usados no ensaio IFA. Os resultadosdesses experimentos são resumidos na Tabela 1.
Tabela 1
<table>table see original document page 81</column></row><table><table>table see original document page 82</column></row><table>
Os resultados desse exemplo demonstram a produção devetores adenovirais compreendendo versões secretadas, não-secretadas, glicosiladas, não-glicosiladas de antígenos deestágio de sangue de P. falciparum.
EXEMPLO 2
Esse exemplo demonstra a imunogenicidade de um vetoradenoviral compreendendo a seqüência de ácido nucléicoheterólogo codificando um antígeno de estágio de sangue deP. falciparum.
Quatro vetores adenovirais deficientes em E1/E3/E4 deserotipo 5 contendo, em vez da região El deletada, umaseqüência de ácido nucléico codificando as versões não-secretada (NS), secretada e glicosilada (SG), secretada enão-glicosilada (SNG), e do tipo selvagem das proteínasMSPl42(PfMSPl42) OU AMA-I(PfAMAl) de P. falciparum foramgerados conforme descrito no Exemplo 1. Para ancorar asproteínas MSPl42 à membrana da célula, as seqüências deácido nucléico codificando as versões MS, SG, e SNG dePfMSPl42 também continham uma seqüência de âncora deglicosil fosfatidil inisotol (GPI). Similarmente, aseqüência de ácido nucléico MSPl42 do tipo selvagemcontinha a seqüência de âncora DAF e a seqüência de sinalDAF (isto é, Ad. PfMSPl42 (DAS) ) . Em adição à versãosecretada e não-glicosilada (SNG) de PfAMAl descrita noExemplo 1, foi gerada uma segunda construção de adenovetorSNG PfAMAI (SNG2) . A versão SNG2 de PfAMAl contém asseguintes substituições de aminoácido: Asnl62Lys,Tyr2 87Leu, Thr288Val, Ala372Arg, Ser373Val, Ser423Lys,Asn4 22Asp, Ser424Asn, and Asn499Gln.
Os vetores adenovirais foram avaliados em relação aostatus de glicosilação e a localização celular dosantígenos conforme descrito no Exemplo 1. Respostas imunesde Célula-T induzidas pelos vetores adenoviraisrecombinantes descritos acima foram avaliadas em um modelode camundongo. Especificamente, camundongos BALB/c de 3-6semanas de idade foram imunizados intramuscularmente nomúsculo anterior da tibialis com os adenovetores deexpressão PfMSPl42 ou PfAMAl descritos acima em uma dose deIxlO8 pu em um volume total e 100 μΐ dividido entre os doismúsculos. Respostas de Célula-T CD8+ e CD4+ foram medidasmediante coloração de citocina intercelular (ICS) ou IFN-γELIspot após re-estimulação in vitro com grupos depeptídeos sintéticos derivados de PfMSPl42 ou PfAMAl.Camundongos não-submetidos anteriormente ao tratamento,não-imunizados foram avaliados em paralelo. As respostasanticorpos foram avaliadas por um ensaio ELISA utilizandodiluições seriais de anti-soros a partir dos camundongosimunizados com cada um dos PfMSPl42 dos adenovetores deexpressão PfAMAl. Os resultados desses experimentos sãoapresentados na
Tabela 2
<table>table see original document page 83</column></row><table><table>table see original document page 84</column></row><table>
Os resultados desse exemplo demonstram a produção devetores adenovirais compreendendo versões secretadas, não-secretadas, glicosiladas e não-glicosiladas de antígenos deestágio de sangue de P. falclparum e suas imunogenicidadesassociadas in vivo.
EXEMPLO 3
Esse exemplo demonstra o efeito do tipo promotor,assim como a localização e orientação do promotor, naexpressão de antígenos de Plasmodium codificados por umvetor adenoviral in vivo e in vitro.
O uso de múltiplas cópias de um único promotor potentepara expressar diferentes antígenos em um vetormultivalente deve levar à instabilidade do vetor devido àrecombinação homóloga entre os promotores. Portanto, paraidentificar promotores adequados para uma vacina de maláriabaseada em vetor adenoviral multivalente, um conjunto devetores adenovirais expressando luciferase a partir devários promotores foi selecionado em camundongos paraidentificar os promotores adequados para controlar aexpressão dos genes de Plasmodium. Especificamente, gruposde cinco camundongos-fêmea C57BL/6 foram injetados com1x1010 unidades de partícula (pu) de um vetor adenoviraldeficiente em E1/E3/E4 contendo um cassete de expressão deluciferase no local da deleção El. O gene de luciferase foiligado de maneira operável a cada um dos seguintespromotores: um promotor CMV humano (hCMV), um promotorquimérico de pinto (CCBA) aperfeiçoado de CMV humano, umpromotor de beta actina humano (hpA), um promotor CMVmurino, um promotor de fator alfa de alongamento (Efla) ,um promotor de ubiquitina (Ub) , um promotor RSV, umpromotor Ying Yang 1 (YYl), um promotor de fator-1 nuclearzíper de leucina básica (BLZF1), um promotor de enolase deneurônio específico (NSE), e um promotor 70B de choquetérmico específico (HSP70B). 24 horas após injeção nomúsculo tibialis de cada camundongo o tecido do músculo foicolhido e os níveis de luciferase foram medidos em unidadesleves relativas (RLU) / μg de proteína. Os camundongosinjetados com tampão de reação serviram como um controlenegativo.
Três categorias de promotores foram identificadas:expressão alta, média e baixa. Expressão alta é definidacomo atividade equivalente a, ou melhor do que o promotormCMV. 0 grupo de expressão alta inclui os promotores hCMV,CCBA, ΙαβΑ, Efla e mCMV. O grupo de expressão média inclui opromotor de Ubiquitina (Ub), enquanto que o grupo deexpressão baixa inclui os promotores RSV, YYl, BLZF-1, NSEe HSP79B.
O efeito da localização e orientação de cassetes deexpressão dentro do genoma de adenovetor também foiavaliado utilizando genes marcadores de luciferase in vivo.As regiões El e E4 conforme foi descoberto proporcionamníveis elevados equivalentes da expressão quando testadascom os promotores hCMV e mCMV. Similarmente, a orientaçãodo cassete de expressão dentro da região E4 não afetou osníveis de expressão. Contudo, expressão reduzida em 100vezes foi observada quando o cassete de expressão hpA foiinserido na região E3 deletada do adenovetor, em relação àexpressão observada quando o mesmo cassete foi inserido naregião El deletada.
Esses resultados sugerem que altos níveis de expressãode gene de Plasmodium em um adenovetor podem serconseguidos utilizando-se um promotor de elevada expressão,por exemplo, promotor hCMV, e inserindo o cassete deexpressão no local de uma deleção El e/ou E4.
EXEMPLO 4
Esse exemplo demonstra a preparação de um vetoradenoviral compreendendo dois antígenos de estágio desangue de P. falciparum de codificação de seqüência deácido nucléico heterólogo.
Com base nos experimentos descritos acima, foideterminado que um vetor adenoviral codificando o SNG asversões SG de ambos PfAMAl e PfMSPl42 mais provavelmenteresultaria na construção de vacina eficaz. Com essafinalidade, um vetor adenoviral deficiente em E1/E4 foiconstruído compreendendo o gene PfMSPl42 (SNG) em umcassete de expressão localizado na região El deletada e ogene PfAMAl (SNG) em um cassete de expressão localizado naregião E4 deletada do vírus. Especificamente, um vetor delançadeira El foi construído o qual expressa o antígenoPfMSPl42 (SNG) a partir do promotor hCMV (pAdCMV. PfMSPl42(SNG) ) . Um vetor de lançadeira E4 que expressa o antígenoPfAMAl (SNG) a partir do promotor mCMV
((pAdE4mCMV.PfAMAl(SNG) ) também foi gerado utilizando ométodo descrito, por exemplo, na Publicação de Pedido dePatente Internacional N0 W099/15686 e Patente US 6.329.200.Esses vetores de lançadeira foram recombinados complasmídeos gerados pela tecnologia AdFast™ (Gen Vec, Inc.,Gaithersburg, Maryland) (vide Publicação de Pedido dePatente Internacional N0 W099/15686 e Patente US 6.329.200)para gerar um novo plasmídeo de adenovetor denominadopAd (t. PfMSPl42SNG) E3 (10) E4 (mCMV. PfAMAlSNG) pkg. Esse
plasmídeo foi convertido em vírus e expandido para gerar umestoque de vetor de titulação elevada do vetor adenoviralAdt-PfMSPl42 (SNG) E4mCMV. P/AMAI (SNG) . De uma maneirasimilar, um segundo vetor adenoviral deficiente em E1/E4foi construído no qual a região El foi substituída com doiscassetes de expressão: um compreendendo o gene PfMSPl42(SG) e o outro compreendendo o gene PfAMAl (SG)(AdEl (MSPl42SSG/mCMVAMASG) ) . Estoques de titulação superiorde ambos os vetores foram completamente certificados e aidentidade estrutural genética dos mesmos foi confirmadapor intermédio de um ensaio baseado em PCR.
As respostas imunes de Célula-T induzidas pelo vetoradenoviral recombinante AdEl(MSPl42SSG/mCMVAMASG) foramavaliadas conforme descrito no Exemplo 2. Especificamente,os camundongos foram divididos em 16 grupos, dos quais osgrupos 1-5 não receberam imunização de preparação, osgrupos 6-10 receberam uma imunização de preparação de DNAde controle, DNA de PfAMAI, DNA de PfMSPl, ou um coquetelde DNA de PfAMAl e DNA de PfMSPl, e os grupos 11-15receberam uma imunização de preparação de AdNull, um vetordeficiente em E1/E4 codificando apenas PfAMAl (SG)(AdP/AMAl (SG) ) ou PfMSPl42 (SG) (AdP/MSPl42 (SG)), umcoquetel de AdP/AMAl (SG) e AdP/MSPl42 (SG) , ouAdEl (MSPl42SSG/mCMVAMASG) . Aos camundongos foi administradauma imunização de reforço em 4 semanas. A esse respeito, osGrupos 1-15 foram imunizados com qualquer um de AdNullfAdP/AMAl (SG) , AdP/MSPl42 (SG) , um coquetel de AdP/AMAl (SG)e AdP/MSPl42 (SG) , ou AdEl (MSPl42SSG/mCMVAMASG) . Oscamundongos do grupo 16 eram camundongos nunca tratadosanteriormente. Os camundongos foram sacrificados em 2semanas ou 6 semanas após a imunização. As respostas deanticorpos para os camundongos nos grupos 11-16 foramavaliadas por ensaios ELISA conforme descrito no Exemplo 2.
Os resultados desses experimentos são apresentados nasFiguras 1-4. A Figura 1 ilustra os resultados da análiseIFNy ELIspot dos camundongos tratados em duas semanas apósimunização. A Figura 2 ilustra os resultados da análiseIFNy ELIspot de camundongos tratados em 6 semanas apósimunização. As Figuras, 3 e 4, ilustram os resultados dosensaios ELISA para a proteína AMAI e proteína MSPl42,respectivamente.
Os resultados desse exemplo demonstram a produção eimunogenicidade de um vetor adenoviral inventivocompreendendo duas seqüências de ácido nucléico heterólogo,em que cada seqüência de ácido nucléico codifica umantígeno de Plasmodium e é de maneira operável ligado apelo menos um promotor.
EXEMPLO 5
Esse exemplo demonstra a preparação de um vetoradenoviral compreendendo uma seqüência de ácido nucléicoheterólogo codificando um antígeno de estágio pré-eritrocítico de P. falciparum.
Vetores adenovirais deficientes em E1/E3/E4 deserotipo 5 contendo, em vez da região El deletada, umaseqüência de ácido nucléico codificando o gene CSP de P.falciparum e o gene SSP-2 foram gerados utilizando osmétodos descritos, por exemplo, na Publicação de Pedido dePatente Internacional WO 99/15686 e Patente US 6.329.200. 0gene CSP ou o gene SSP-2 foi ligado de maneira operável aum dos seguintes promotores: hCMV, mCMV, RSV, ou Ub. Cadauma das construções de vetores adenovirais foi denominadode acordo com o gene de Plasmodium codificado desse modo eo promotor usado para controlar o gene de Plasmodium.
Para determinar a extensão na qual os níveis deexpressão de antígeno in vitro são afetados pela utilizaçãode promotor, células pulmonares embriônicas humanas (HEL)foram infectadas com um de seis vetores adenoviraiscompreendendo um cassete de expressão PfSSP2 inserido naregião El deletada do vetor. Todos os cassetes de expressãoutilizaram um gene PfSSP2 de códon-otimizado, exceto ovetor AdCMV. PfSSP2n, o qual continha a seqüência SSP-2nativa. O vetor AdCMV.PfSSP2dlTMCT compreende uma seqüênciade ácido nucléico codificando uma deleção de carboxi-terminal da seqüência de aminoácido PfSSP2 que remove odomínio transmembrana da proteína. Os vetores AdCMV.PiSSP2 ,AdRSV. PfrSSP2 , AdUb. PfrSSP2 , e AdmCMV. PfrSSP2 compreendem umaseqüência de ácido nucléico PfSSP2 ligado de maneiraoperável a um promotor de hCMV contendo um sinal de uniãosintético, o promotor de RSV, o promotor de Ub, ou opromotor de mCMV, respectivamente.
Um ensaio immunoblot demonstrou que os níveis maisaltos de expressão de PfSSP2 foram observados quando ospromotores hCMV e mCMV foram usados para controlar aexpressão do antígeno pfSSP2 de códon-otimizado. Comparaçãode AdCMV. PfSSP2 com AdCMV. PfSSP2n indica que o uso daseqüência PfSSP2 códon-otimizado melhorou a expressãoPfSSP2 em aproximadamente 100 vezes em relação à seqüêncianativa. A expressão de PfSSP2 a partir dos promotores RSV eUb foi reduzido em aproximadamente 20 a 100 vezes emrelação ao promotor de hCMV.
Os resultados desse exemplo demonstram a produção devetores adenovirais compreendendo uma seqüência de ácidonucléico heterólogo codificando um antígeno de estágio pré-eritrocítico de P. falciparum ligado de maneira operável avários promotores diferentes.
EXEMPLO 6
Esse exemplo demonstra a imunogenicidade de um vetoradenoviral codificando um antígeno de estágio pré-eritrocítico de P. falciparum in vivo.
A imunogenicidade induzida pelos vetores adenoviraisrecombinantes descritos no Exemplo 4 foi avaliada em ummodelo de camundongo. Especificamente, grupos de seiscamundongos BALB/c fêmea idades de 3-6 semanas (n=6 porgrupo) foram imunizados intramuscularmente no músculoanterior da tibialis com vetores expressando PfSSP2 códon-otimizado de mamífero a partir do promotor RSV, promotorhCMV, promotor mCMV, ou promotor Ub, ou PfSSP2 otimizadonão-códon (isto é, nativo) expresso a partir do promotorhCMV em uma dose de IxlO8 pu em um volume total de 100 μΐdivididos entre os dois músculos. Os camundongos foramdivididos em 10 grupos, dos quais os grupos 2-4 receberamuma imunização de preparação de DNA de PÍSSP2 seguido deuma imunização de reforço em 4 semanas com cada um dosadenovetores de PfSSP2. Os grupos 5-7 foram imunizados comduas doses dos adenovetores PfSSP2 em intervalos de quatrosemanas. Os grupos 8-10 foram imunizados com uma única dosedos adenovetores de PfSSP2. Os camundongos foramsacrificados nas duas semanas ou seis semanas após aimunização. Respostas de Célula-T CD8+ e CD4+ foram medidasmediante coloração de citocina intercelular (ICS) ou IFN-γELIspot após restimulação in vitro com grupos de peptídeossintéticos derivados de PfSSP2 e apresentados pelas célulasalvo A20/2J. Camundongos nunca antes tratados não-imunizados do grupo 1 foram avaliados em paralelo.
Uma resposta imune robusta foi observada quando PÍSSP2foi expresso a partir dos promotores hCMV ou mCMV, mas nãoa partir do promotor RSV. Além disso, uma elevadacorrelação entre as respostas IFN-γ in vitro e imunidadeprotetora in vivo foi observada (r2 = 0.903), e construçõesutilizando o promotor RSV foram insuficientemente efetivasem induzir a proteção estéril contra desafio de patógenoseja de curto prazo (2 semanas, 6 semanas, ou 12 semanaspós-imunização) ou de longo prazo (6 meses). Respostasimunes in vivo induzidas pelo adenovetor PÍSSP2 nativoexpresso a partir do promotor hCMV foram insuficientes, comfreqüências e magnitudes ou respostas comparáveis àquelasinduzidas pelos vetores compreendendo o promotor RSV. Essesdados confirmam que vacinas contra malária de adenovetorcandidato devem utilizar genes otimizados de códon demamífero preferivelmente às seqüências de genes nativos.
As respostas de Célula-T induzidas pelos adenovetoresforam predominantemente do fenótipo CD8+, embora asrespostas de Célula-T CD4+ tenham sido detectadas porcoloração de citocina intracelular. O perfil daimunogenicidade relativa de promotores para indução derespostas de Célula-T CD4+ foi similar àquela das respostasde Célula-T CD8+. Esses dados são consistentes com osresultados de outros estudos utilizando PyCSP no modelo demurino P. yoelii. Como a proteção contra malária em estágiopré-eritrocitico é mediada predominantemente pelas Células-T CD8+, com Células-T CD4+ desempenhando uma funçãosecundária, o perfil e fenótipo de respostas imuneinduzidas pelos vetores de adenovírus recombinantesdescritos aqui são desejáveis para proteção contra desafiode Plasmodium.
Mediante extrapolação, esses dados também sugerem queos promotores hCMV e mCMV, mas não o promotor RSV, podemser eficazes em induzir a imunidade protetora contra P.falciparum. Também consistente com os dados, não houve umadiferença significativa entre as respostas específicas deantígeno PfSSP2 induzidas pelos promotores hCMV ou mCMV nasdoses testadas. Os dados também estabeleceram IxlO8 pu comouma dose eficaz, a qual foi selecionada como a dose padrãopara estudos subseqüentes.
Os vetores adenovirais descritos no Exemplo 5 tambémforam avaliados em relação às suas capacidades em induzirrespostas de anticorpo de antígeno específico.Especificamente, as respostas de anticorpo eliciadas porconstruções expressando PfSSP2 a partir de promotores dealta, média ou baixa expressão foram comparadas. Osresultados dessa análise são apresentados na Tabela 3. Asrespostas de anticorpos foram comparáveis às respostas deCélulas-T eliciadas pelos vetores adenovirais testados. Aesse respeito, as construções de promotores de RSV foraminsuficientemente imunogênicas, e os promotores de CMVhumanos e murinos foram altamente eficazes na indução derespostas de anticorpos de antígenos específicos.
Tabela 3
<table>table see original document page 93</column></row><table>
Os resultados desse exemplo demonstram aimunogenicidade de um vetor adenoviral codificando umantígeno de estágio pré-eritrocítico de P.falciparum ligadode maneira operável a um promotor hCMV, mCMV, ou RSV invivo.
EXEMPLO 7
Esse exemplo demonstra a preparação de um vetoradenoviral compreendendo duas seqüências de ácido nucléicoheterólogo codificando antígenos de estágio pré-eritrocítico de P.falciparum.
Um vetor adenoviral deficiente em E1/E4 foi construídocompreendendo o gene PfCSP modificado para conter uma caudainibidora de âncora GPI (PfCSPt) em um cassete de expressãolocalizado na região El deletada e o gene PfLSA no cassetede expressão localizado na região E4 deletada doadenovírus. Especificamente, um vetor de lançadeira El foiconstruído o qual expressa o antígeno PfrCSPt a partir dopromotor hCMV. Um vetor de lançadeira E4 que expressa oantígeno PfLSA a partir do promotor mCMV também foi geradoutilizando os métodos descritos, por exemplo, na Publicaçãode Pedido de Patente Internacional WO 99/15686 e Patente US6.329.200. Esses vetores de lançadeira foram recombinadoscom os plasmídeos gerados pela tecnologia AdFast™ (GenVec,Inc., Gaithersburg, Maryland) (vide Publicação de Pedido dePatente Internacional WO 99/15686 e Patente US 6.329.200)para gerar um novo plasmídeo de adenovetor. Esse plasmídeofoi convertido em um adenovírus e expandido para gerar umestoque de vetor de elevada titulação do adenovetordenominado AdEl(CSPt)E4(mCMV.LSA). 0 estoque de elevadatitulação do vetor adenoviral foi completamentecertificado, e sua identidade estrutural genética foiconfirmada por um ensaio baseado em PCR. Ensaios immunoblotconfirmaram que esse vetor bivalente resultou em expressãoeficiente de ambos os antígenos, PfCSPt e PfLSA in vitro.
Respostas imunes de Célula-T induzidas pelos vetoresadenovirais recombinantes foram avaliadas conforme descritono Exemplo 2. Especificamente, os camundongos foramimunizados com uma ou duas doses quer seja de um vetor decontrole carente de qualquer antígeno P. falciparum(AdNull), um adenovetor deficiente em E1/E4 codificandoapenas o antígeno CSPt (AdPfCSPt), um adenovetor deficienteem E1/E4 codificando apenas o antígeno LSA (AdPfLSA) , umcoquetel de AdPfCSPt e AdPfLSA, ou AdEl (CSPt) E4 (mCMV. LSA).
Os camundongos foram sacrificados em 2 semanas e 6 semanasapós imunização. Respostas de anticorpos para cada grupo decamundongos tratados foram avaliadas pelos ensaios ELISAconforme descrito no Exemplo 2.
Os resultados desses experimentos são apresentados nasFiguras 5 e 6. A Figura 5 ilustra os resultados da análiseIFNy ELIspot dos camundongos tratados em 6 semanas apósimunização. A Figura 6 ilustra os resultados dos ensaiosELISA para os camundongos recebendo uma única dose ou dosedupla dos vetores adenovirais descritos acima. Essesresultados demonstram que um vetor adenoviral bivalentecodificando dois antigenos de malária de estágio pré-eritrocítico induziu respostas vigorosas de anticorpos eCélula-T contra ambos os antigenos in vivo.
EXEMPLO 8
Esse exemplo demonstra a preparação de um vetoradenoviral compreendendo três seqüências de ácido nucléicoheterólogo, cada uma das quais é ligada de maneira operávelaos pelo menos dois promotores diferentes.
Vetores adenovirais deletados E1/E3/E4 trivalentescompreendendo três seqüências de ácido nucléico codificandogenes marcadores foram gerados mediante incorporação de umúnico cassete de expressão inserido em vez da região El, eagora é inserido em vez da região E4. Os genes marcadorestestados incluíam luciferase fosfatase alcalina secretada(SEAP), e proteína fluorescente verde (GFP). Os promotorestestados incluíam o promotor RSV, um promotor CMV humanocom um sinal de união sintética (CMV) , o promotor de CMV decamundongo (mCMV), ο promotor de CCBA, e o promotor de EF-1a. As construções trivalentes que foram geradas sãorepresentadas esquematicamente na Figura 7.
Utilizando os métodos descritos na Publicação dePedido de Patente Internacional WO 99/15686 e Patente US6.329.200, todas as construções trivalentes foramresgatadas de um plasmídeo de adenovetor com eficiênciasimilar as dos plasmídeos de controle. A produção total deestoques de vetor purificados de duas das construções devetor adenoviral, AdEl(EF.S)E4(f.CCBA_mCMV.L) eAdEl(mCMV.L)E4(S.R_CMV.f), foi superior a dos outrosvetores adenovirais testados sugerindo que um modelo devetor pode ter vantagens de crescimento em relação aooutro.
Para determinar as características de crescimentodesses vetores, experimentos de curva de crescimento foramrealizados. Células 293-ORF6 (vide, Brough et al. , J.Virology, 70: 6497-6501 (1996)) foram infectadas com trêslisatos dos vetores trivalentes incluindo os dois com osrendimentos mais pobres em produção. Células foram obtidasem 48 e 72 horas após infecção e analisadas em relação apartículas de vetores ativos mediante uso do ensaio deunidades de formação de foco (ffu). Infecções com umamultiplicidade de infecção (MOI) de 20 ffu/célularesultaram em rendimentos significativos de vetores paratodos os vetores trivalentes. Rendimentos de vetorestrivalentes foram similares aos rendimentos obtidos com umadenovetor de controle que carrega apenas um cassete deexpressão (AdL.llD).
A geração de um vetor adenoviral expressando ambosPfCSP e PfSSP2 provou ser difícil porque esses antígenosinibem a conversão de plasmídeo de adenovetor parapartícula de adenovírus, e os rendimentos dos adenovetoresde expressão de PfSSP2 purificados foram de aproximadamente10 vezes inferiores a da maioria dos outros estoques deadenovetor. Para resolver esse problema, adenovetoresexpressando mutantes de PfSSP2 foram gerados. A esserespeito, PfSSP2-4 contém uma deleção de C-terminal queremove o domínio de transmembrana e C-terminal da proteínaSSP2. PÍSSP2-6 contém uma deleção no domínio detrombospondina de PfSSP2. Os vetores adenovirais deserotipo 5 de E1/E3/E4 deletados expressando cada um dessesgenes de SSP2 mutantes foram analisados em experimentos decurva de crescimento em paralelo com os vetores adenoviraisexpressando o PfSSP2 do tipo selvagem descrito acima.
O adenovetor codificando PfSSP2-6 cresceu paratitulações significativamente inferiores do que oadenovetor codificando PfSSP2 do tipo selvagem ou oadenovetor codificando PfSSP2-4, e portanto não foianalisado adicionalmente. O melhor desempenho decrescimento foi observado com o adenovetor compreendendo aseqüência de nucleotídeo de PfSSP2 nativo. Os adenovetoresque expressaram o antígeno SSP2 de códon otimizado a partirdo promotor de mCMV cresceu bem nesse ensaio, e induziurespostas imunes potentes no camundongo.
Os resultados desse exemplo demonstram a produção deum vetor adenoviral inventivo compreendendo três seqüênciasde ácido nucléico heterólogo, em que cada seqüência deácido nucléico é ligada de maneira operável aos pelo menosdois promotores diferentes.EXEMPLO 9
Esse exemplo demonstra a preparação de um vetoradenoviral compreendendo três seqüências de ácido nucléicoheterólogo, em que cada seqüência de ácido nucléicoheterólogo codifica um antigeno de Plasmodium.
Vetores adenovirais de serotipo 5 deletados-E1/E3/E4foram gerados os quais expressam ambos PfLSA e PfCSP apartir de cassetes de expressão dual localizados nasregiões E1 e E4 do genoma viral. Resultados preliminaresindicam que os vetores de expressão E1 estão crescendo bem.Além disso, os cassetes de expressão para um adenovetortrivalente expressando três antígenos de Plasmodium deestágio pré-eritrocítico foram construídos. Esses cassetesde expressão compreendem o gene de PfSSP2 inserido em umlocal de deleção El, e os genes PfLSA e PfCSP como parte deum cassete de expressão dual inserido em um local dedeleção E4.
EXEMPLO 10
Esse exemplo demonstra a preparação de um vetoradenoviral compreendendo uma proteína hexon modificada queexibe reconhecimento reduzido pelo sistema imune dehospedeiro.
Diversidade na proteína hexon de um adenovírus égerada mediante primeiramente fazendo mutações aleatóriasno hexon de codificação de gene mediante, por exemplo,embaralhamento de polinucleotídeo ou PCR com tendência aerro utilizando métodos descritos, por exemplo, em Stemmer,supra, Cherry et al. , supra, e Schmidt-Dannert et al.,supra. Genes de hexon submetidos à mutação são incorporadosem uma biblioteca de vetores adenovirais Ad5 deficientes emE1, em que cada vetor Ad5 compreende uma proteína de fibraAd3 5 e um cassete de expressão dual o qual expressa doisgenes marcadores (por exemplo, proteína fluorescente verdee luciferase) inseridos na região E1. Vetores de bibliotecasão propagados em células hospedeiras adequadas, e vetorescodificando variantes de hexon potenciais de interesse sãoresgatados sob condições competitivas na presença deanticorpos humanos neutralizadores de anti-Ad5. Vetoresresgatados ou são expandidos na presença de anticorpos deneutralização anti-Ad5, purificados, ou clonados evariantes de hexon são seqüenciadas.
As proteínas hexon modificadas são então testadas emrelação à habilidade em evitar anticorpos humanos deneutralização in vivo. Especificamente, um vetor adenoviralcompreendendo uma proteína hexon modificada codificada poruma seqüência de ácido nucléico variante conforme descritoacima, e codificando uma proteína de CSP P. yoelli(Ad(mod)-PyCSP), é gerado. Camundongo BALB/c (n=20 porgrupo) são imunizados com uma dose de 1x10^8 pu de Ad(mod)-PyCSP ou um vetor adenoviral PyCSP não-modificado (Ad-PyCSP), duas ou três vezes em intervalos de seis semanas.Em alguns grupos, os camundongos são pré-imunizados comadenovírus do tipo selvagem (serotipo 5) para geraranticorpos de neutralização anti-Ad5 preexistentes antes davacinação. Soros são coletados pré-imunização e em 14 diasapós imunização. Em 14 dias após a terceira imunização, 6camundongos de cada grupo são sacrificados para estudos deCélula-T, e 14 camundongos por grupo são desafiados paraavaliação da eficácia de proteção. Os camundongos que foramprotegidos contra desafio de parasita são ensaiados e outravez desafiados em 6 meses após reforço para avaliar aduração das respostas imunes induzidas por vacina eimunidade protetora.
Dependendo dos resultados desses experimentos, a dosede vetor adenoviral pode ser aumentada (por exemplo, para 1χ 10^10 pu) para confirmar que a potência do adenovirusmodificado por hexon não é limitada pelos anticorpos deneutralização gerados durante o processo de vacinação.Alternativamente, o intervalo entre imunizações pode seraumentado para gerar mais otimamente as respostas imunes deantígeno específico, robustas. Em ainda outra alternativa,o nível de anticorpos de neutralização preexistentes nomomento da preparação pode ser aumentado.
EXEMPLO 11
Esse exemplo demonstra a preparação de um vetoradenoviral compreendendo uma proteína hexon modificada.
Vetores adenovirais de serotipo 5 foram geradoscontendo laços quiméricos Ad5-Ad2 na proteína hexon.Especificamente, dois vetores adenovirais deficientes emE1/E4 foram gerados, um dos quais codificou o geneluciferase, enquanto que o outro codificou o antígenoPyCSP. As proteínas hexon quiméricas Ad5-A2 foram geradasmediante substituição do laço DEl hexon contendo regiõeshipervariáveis 1-6 de Ad5 (isto é, aminoácidos hexon Ad5132-315) e o laço FG contendo regiões hipervariáveis 7-9 apartir de Ad5 (isto é, aminoácidos de hexon Ad5 420-449)com os laços correspondentes a partir de um adenovirus deserotipo 2 (isto é, aminoácidos hexon Ad2 132-327, eaminoácidos hexon Ad2 432-465). Cada vetor foi desenvolvidopara titulações elevadas e foi produzido e purificado paraexperimentos in vivo de acordo com os métodos aquidescritos.
Uma abordagem similar foi usada para gerar um vetoradenoviral de serotipo 5 compreendendo laços quiméricosAd5-Ad4 3 na proteína hexon. A esse respeito, proteínashexon quiméricas Ad5-Ad43 foram geradas mediantesubstituição do laço FG1, correspondendo aos aminoácidoshexon Ad5 418-449, com o laço FG1 de Ad43, correspondendoaos aminoácidos hexon Ad43 410-440. Além disso, o laço Ad5DE1, correspondendo aos aminoácidos de hexon Ad5 123-316foram substituídos com o laço DEl de Ad43, correspondendoaos aminoácidos hexon Ad43 123-308. Vetores adenoviraiscarregando a troca de laço DE1 Ad5-Ad43 não foramresgatados, sugerindo que algumas das seqüências permutadasforam necessárias para recursos estruturais do hexon Ad5. Olaço DE1 é composto de seis regiões hipervariáveis eseqüências intermediárias, as quais são mais conservadasatravés dos serotipos. As seqüências intermediárias sãomais conservadas entre os dois hexons de grupo C (Ad2 eAd5) do que são entre Ad5 e o hexon de grupo D (Ad43).
Para gerar um hexon Ad5 que não é sensível aosanticorpos de neutralização Ad5, mas é capaz de dobrar emum capsídeo de adenovírus altamente estruturado, laços DE1quiméricos consistindo nas regiões hipervariáveis de Ad43inseridas no hexon Ad5 com seqüências intermediárias entreas regiões hipervariáveis derivadas de Ad5 foramsintetizadas. As substituições específicas de aminoácidofeitas nas regiões hipervariáveis de Ad5 são mostradas naTabela 4.
Tabela 4<table>table see original document page 102</column></row><table>
Um exemplo de uma quimera de laço hexon Ad5-Ad43específica gerada inclui uma substituição de HVRl(aminoácidos hexon de Ad5 13 6-165), HVR2 (aminoácidos hexonde Ad5 188-194), HVR3 (aminoácidos hexon Ad5 212-220), HVR4(aminoácidos hexon Ad5 252-260) , HVR5 (aminoácidos hexonAd5 268-281), e HVR6 (aminoácidos hexon Ad5 303-310) com osHVRs correspondentes a partir de Ad43.
Esse exemplo demonstra a geração de vetoresadenovirais de serotipo 5 compreendendo proteínas hexonquiméricas projetadas para evitar a imunidade de hospedeiropreexistente aos vetores Ad5.
EXEMPLO 12
Para avaliar a capacidade dos vetores adenoviraisgerados no Exemplo 11 para contornar os efeitos adversospotenciais dos anticorpos de neutralização de Ad5 dehospedeiro preexistente, uma estratégia de imunização depreparação-reforço utilizando esses vetores será realizadaem um modelo de camundongo.
Um experimento avaliará a capacidade de neutralizar osanticorpos gerados contra Ad5, Ad2, e Ad43 em camundongospara neutralizar os vetores adenovirais compreendendo asproteínas hexon quiméricas descritas no Exemplo 11.Especificamente, sete grupos diferentes de camundongosBalb/c receberão uma imunização de preparação contendo1x1010 unidades de partícula (pu) de uma das seguintesconstruções adenovirais: (1) um vetor de Ad5 deficiente emEl contendo uma proteína de fibra de Ad35 (Ad5El(L)F35) ,(2) um vetor de Ad5 deficiente em E1/E4- (AdEl(L) 11D), (3)Ad2 do tipo selvagem, (4) Ad34 do tipo selvagem, (5) Ad43do tipo selvagem, (6) Ad5 do tipo selvagem, e (7) Ad35 dotipo selvagem. Em 21 dias após imunização de preparação,sangue integral será colhido para se obter soro paraanálise de anticorpo de neutralização. No dia 22, oscamundongos receberão uma imunização de reforço contendo1x1010 pu de um dos vetores adenovirais modificados porhexon descritos no Exemplo 11. No 43° dia (isto é, 21 diasapós o reforço), sangue integral será outra vez colhido apartir dos camundongos tratados para avaliar a resposta deanticorpo de neutralização.
Um segundo experimento avaliará a capacidade dosvetores adenovirais modificados por hexon do Exemplo 11 emcontornar os anticorpos de neutralização Ad5.Especificamente, respostas de anticorpo e Célula-T geradasem resposta a um antígeno de teste, PyCSP, na presença e naausência de anticorpo de neutralização de Ad5 serãoavaliadas. Camundongos Balb/c são divididos em 12 grupos detratamento. No 21° dia antes da imunização, quatro gruposde camundongos são expostos ao Ad do tipo selvagem, e umgrupo é exposto a um vetor de Ad5 deficiente em E1/E4carente de um transgene (AdNull) . Dezoito dias após,camundongos expostos a Ad5 foram sangrados para se avaliaros níveis de anticorpos de neutralização. No dia seguinte,a todos os 12 grupos foi administrada uma imunização depreparação contendo 1x10^8 pu/mL de uma das seguintesconstruções de vetor adenoviral: (1) Ad5-PyCSP, que é umvetor Ad5 deficiente em E1/E4 compreendendo o gene PyCSPinserido na região E1, (2) Ad5PyCSP (H) 2-2, o qual é umvetor de Ad5 deficiente em E1 compreendendo o gene PyCSPinserido na região El e um hexon quimérico compreendendo olaço de DE1 de Ad2 e o laço FGl de Ad2, (3) Ad3 5-PyCSP, oqual é um vetor de Ad35 deficiente em E1 compreendendo ogene PyCSP inserido na região E1, e (4) Ad35PyCSP.F(5S), oqual é similar a Ad35-PyCSP, exceto que ele compreende umaproteína de fibra Ad5 no lugar da proteína de fibra Ad35.
Os camundongos expostos a AdNull foram preparados com umadose de AdNull, e os camundongos que nunca foram tratadosnão-imunizados também serviram como controles.
Seis semanas após administração da imunização depreparação, cada grupo de camundongos recebeu umaimunização de reforço contendo 1x10^8 pu/mL de Ad5-PyCSP,Ad5PyCSP(H)2-2, Ad35-PyCSP, ou Ad35PyCSP.F(5S). Asimunizações de preparação-reforço específicas sãoapresentadas na Tabela 5.
Tabela 5
<table>table see original document page 104</column></row><table><table>table see original document page 105</column></row><table>
Duas semanas após administração da imunização dereforço, os camundongos serão sangrados e respostas deCélula-T e anticorpos serão medidas utilizando os métodosaqui descritos.
Todas as referências, incluindo publicações, pedidosde patente, e patentes, citadas aqui são incorporadas comoreferência até o ponto em que como se cada referência fosseindividualmente e especificamente indicada para serincorporada como referência e fosse apresentada aqui em suatotalidade.
O uso dos termos "um" e "uns" e "o" e referênciassimilares no contexto de descrever a invenção(especificamente no contexto das reivindicações a seguir)devem ser considerados como abrangendo ambos, o singular eo plural, a menos que de outro modo aqui indicado ouclaramente contradito pelo contexto. Os termos"compreendendo", "tendo", "incluindo", e "contendo" devemser considerados como termos ilimitados (isto é,significando "incluindo, mas não limitado a") a menos quede outro modo assinalado. Declaração de faixas de valoresaqui servem apenas como um método abreviado de se referirindividualmente a cada valor separado abrangido dentro dafaixa, a menos que de outro modo aqui indicado, e cadavalor separado é incorporado no relatório descritivo comose fosse individualmente aqui citado. Todos os métodos aquidescritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada amenos que de outro modo aqui indicado ou de outro modoclaramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer um ede todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo,"tal como") aqui provido, serve apenas para melhor ilustrara invenção e não apresenta uma limitação ao escopo dainvenção a menos que de outra forma reivindicado. Nenhumalinguagem na especificação deve ser considerada comoindicando qualquer elemento não-reivindicado como essencialpara a prática da invenção.
Modalidades preferidas desta invenção são descritasaqui, incluindo o melhor modo conhecido dos inventores pararealização da invenção. Variações dessas modalidadespreferidas podem se tornar evidentes para aqueles deconhecimento comum na técnica mediante leitura da descriçãoanterior. Os inventores esperam que aqueles versados natécnica empreguem tais variações conforme apropriado, e osinventores pretendem que a invenção seja praticada de outraforma do que conforme aqui especificamente descrito.
Conseqüentemente, esta invenção inclui todas asmodificações e equivalentes da matéria exposta nasreivindicações anexas como permitidas pela lei aplicável.Além disso, qualquer combinação dos elementos descritosacima em todas as suas possíveis variações é abrangida pelainvenção a menos que de outro modo indicado aqui ou deoutro modo claramente contradito pelo contexto.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Genvec, Inc.
The United states of America, as Represented by thesecretary of the Navy, Naval MedicaT Research CenterBruder, Joseph TKovesdi, ImreKing, C RichterMcVey, Duncan LEttyreddy, Damodar RDoo ιan, Denise Louisecarucci, Daniel JohnLimbach, Keith
<120> vac|nas para malária baseadas em vetor adenoviral
<130> 254100
<150> US 60/713,110
<151> 31/08/02005
<160> 31
<170> PatentIn Versão 3.3
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 1
Cys Arg Gly asρ Cys
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> Característica MISC
<222> (2).·(2)
<223> "Xaa" pode ser qualquer aminoácido
<220>
<221> MISC_FEATURE<222> Ç8)..(8)
<223> ' Xaa" pode ser qualquer aminoácido<400> 2
Cys Xaa Cys Arg Gly Asp Cys Xaa Cys1 5
<210> 3<211> 9<212> PRT<213> Artificial<220>
<223> sintético
<400> 3
Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys1 5
<210> 4
<211> 1071
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 4
atgatgcgca agctggccat cctgtccgtg tcctccttcc tgttcgtgga ggccctgttc 60caggagtacc agtgctacgg CtCCtCCtCC aacacccgcg tgctgaacga gctgaactac 120gacaacgccg gcaccaacct gtacaacgag ctggagatga actactacgg caagcaggag 180aactggtact ccctgaagaa gaactcccgc tccctgggcg agaacgacga cggcaacaac 240gaggacaacg agaagctgcg caagcccaag cacaagaagc tgaagcagcc cgccgacggc 300aaccccgacc ccaacgccaa ccccaacgtg gaccccaacg ccaaccccaa cgtggacccc 360aacgccaacc ccaacgtgga ccccaacgcc aaccccaacg ccaaccccaa cgccaacccc 420aacgccaacc ccaacgccaa ccccaacgcc aaccccaacg ccaaccccaa cgccaacccc 480aacgccaacc ccaacgccaa ccccaacgcc aaccccaacg ccaaccccaa cgccaacccc 540aacgccaacc ccaacgccaa ccccaacgcc aaccccaacg ccaaccccaa cgtggacccc 600aacgccaacc ccaacgccaa ccccaacaag aacaaccagg gcaacggcca gggccacaac 660atgcccaacg accccaaccg caacgtggac gagaacgcca acgccaactc cgccgtgaag 720aacaacaaca acgaggagcc ctccgacaag cacatcaagg agtacctgaa caagatccag 780aactccctgt ccaccgagtg gtccccctgc tccgtgacct gcggcaacgg catccaggtg 840cgcatcaagc ccggctccgc caacaagccc aaggacgagc tggactacgc caacgacatc 900gagaagaaga tctgcaagat ggagaagtgc tcctccgtgt tcaacgtggt gaactcctcc 960atcggcctga tcatggtgct gtccttcctg ttcctgaacg aattcgatga tctgctgtgc 1020cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttcctta a 1071
<210> 5
<211> 356
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 5Met Met Arg Lys Leu Ala Ile Leu Ser vai ser ser Phe Leu Phe Val1 5 10 15
Glu Ala Leu Phe Gln Glu Tyr Gln Cys Tyr Gly ser Ser Ser Asn Thr20 25 30
Arg vai Leu Asn Glu Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Gly Thr Asn Leu Tyr35 40 45
Asn Glu Leu Glu Met Asn Tyr Tyr Gly Lys Gln Glu Asn Trp Tyr Ser50 55 60
Leu Lys Lys Asn Ser Arg ser Leu Gly Glu Asn Asp Asp Gly Asn ASn65 70 75 80
Glu Asp Asn Glu Lys Leu Arg Lys Pro Lys His Lys Lys Leu Lys Gln85 90 95
Pro Ala Asp Gly Asn Pro Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro100 105 110
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro115 120 125
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro130 135 140
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro145 150 155 160
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro165 170 175
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro180 185 190
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro195 200 205
Asn Lys Asn Asn Gln Gly Asn Gly Gln Gly His Asn Met Pro Asn Asp210 215 220
Pro Asn Arg Asn Val Asp Glu Asn Ala Asn Ala Asn Ser Ala Val Lys225 230 235 240
Asn Asn Asn Asn Glu Glu Pro Ser Asp Lys His Ile Lys Glu Tyr Leu245 250 255
Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val260 265 270Thr cys Gly Asn Gly Ile Gln Val Arg Ile Lys Pro Gly Ser Ala Asn275 280 285
Lys Pro Lys Asp Glu Leu Asp Tyr Ala Asn Asp Ile Glu Lys Lys Ile290 295 300
cys Lys Met Glu Lys Cys ser Ser Val Phe Asn Val Val Asn Ser ser305 310 315 320
Ile Gly Leu Ile Met vai Leu Ser Phe Leu Phe Leu Asn Glu Phe Asp325 330 335
Asp Leu Leu Cys Leu Leu Val Ala ser His Leu Leu Phe Ala Pro Pro340 345 350
Pro Cys Leu Pro355
<210> 6<211> 999<212> DNA<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 6
atgatgcgca agctggccat cctgtccgtg tcctccttcc tgttcgtgga ggccctgttc 60caggagtacc agtgctacgg ctcctcctcc aacacccgcg tgctgaacga gctgaactac 120gacaacgccg gcaccaacct gtacaacgag ctggagatga actactacgg caagcaggag 180aactggtact ccctgaagaa gaactcccgc tccctgggcg agaacgacga cggcaacaac 240gaggacaacg agaagctgcg caagcccaag cacaagaagc tgaagcagcc cgccgacggc 300aaccccgacc ccaacgccaa ccccaacgtg gaccccaacg ccaaccccaa cgtggacccc 360aacgccaacc ccaacgtgga ccccaacgcc aaccccaacg ccaaccccaa cgccaacccc 420aacgccaacc ccaacgccaa ccccaacgcc aaccccaacg ccaaccccaa cgccaacccc 480aacgccaacc ccaacgccaa ccccaacgcc aaccccaacg ccaaccccaa cgccaacccc 540aacgccaacc ccaacgccaa ccccaacgcc aaccccaacg ccaaccccaa cgtggacccc 600aacgccaacc ccaacgccaa ccccaacaag aacaaccagg gcaacggcca gggccacaac 660atgcccaacg accccaaccg caacgtggac gagaacgcca acgccaactc cgccgtgaag 720aacaacaaca acgaggagcc ctccgacaag cacatcaagg agtacctgaa caagatccag 780aactccctgt ccaccgagtg gtccccctgc tccgtgacct gcggcaacgg catccaggtg 840cgcatcaagc ccggctccgc caacaagccc aaggacgagc tggactacgc caacgacatc 900gagaagaaga tctgcaagat ggagaagtgc tcctccgtgt tcaacgtggt gaactcctcc 960atcggcctga tcatggtgct gtccttcctg ttcctgaac 999<210> 7
<211> 333
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
<400> 7
Met Met Arg Lys Leu Ala Ile Leu Ser Val Ser Ser Phe Leu Phe Val1 5 10 15
Glu Ala Leu Phe Gln Glu Tyr Gln Cys Tyr Gly Ser Ser Ser Asn Thr20 25 30
Arg Val Leu ASn Glu Leu Asn Tyr Asp Asn Ala Gly Thr Asn Leu Tyr35 40 45
Asn Glu Leu Glu Met Asn Tyr Tyr Gly Lys Gln Glu Asn Trp Tyr Ser50 55 60
Leu Lys Lys Asn Ser Arg Ser Leu Gly Glu Asn Asp Asp Gly Asn Asn65 70 75 80
Glu Asp Asn Glu Lys Leu Arg Lys Pro Lys His Lys Lys Leu Lys Gln85 90 95
Pro Ala Asp Gly Asn Pro Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro100 105 110
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn vai Asp Pro115 120 125
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro130 135 140
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro145 150 155 160
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
165 170 175
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro180 185 190
Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro195 200 205
Asn Lys Asn Asn Gln Gly Asn Gly Gln Gly His Asn Met Pro Asn Asp210 215 220Pro Asn Arg Asn VaT Asp Glu Asn Ala Asn Ala Asn Ser Ala vai Lys225 230 235 240
Asn Asn Asn Asn Glu Glu Pro Ser Asp Lys His He Lys Glu Tyr Leu245 250 255
Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser vai260 265 270
Thr Cys Gly Asn Gly Ile Gln Val Arg Ile Lys Pro Gly Ser Ala Asn275 280 285
Lvs Pro Lys Asp Glu Leu Asp Tyr Ala Asn Asp Ile Glu Lys Lys Ile290 295 300
Cvs lvs Met Glu Lys Cys Ser Ser vai Phe Asn vai vai Asn Ser Ser305 310 315 320
Ile Gly Leu Ile Met Val Leu Ser Phe Leu Phe Leu Asn325 330
<210> 8<211> 969<212> DNA<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
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<213> Artificial
<220>
Sintética
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Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro145 150 155 160
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro165 170 175
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro180 185 190
Asn Ala Asn Pro Asn vai Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro195 200 205Asn Lys Asn Asn Gln Gly Asn Gly Gln Gly His Asn Met Pro Asn Asp210 215 220
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Ile Gly
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Asn
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tactac
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<212> PRT
<213> Artificial
<223> Sintética<400> 17
1866
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Asp Glu Met Leu Asp Pro Glu Ala ser Phe Trp Gly Glu Glu Lys Arg595 600 «υ?
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<213> Artificial
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60
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<220> sintética
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<400> 23
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1 5 10 15
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<213> Artificial
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His Leu Asp Glu Arg Glu Glu cys Lys cys Leu Leu Asn Tyr Lys Gln340 345 350
Glu Gly Asp Lys Cys Val Glu Asn Pro Asn Pro Thr Cys Asn Glu Asn355 360 365
Asn Gly Gly Cys Asp Ala Asp Ala Thr Cys Thr Glu Glu Asp ser Gly370 375 380
Ser Ser Arg Lys Lys Ile Thr Cys Glu Cys Thr Lys Pro Asp ser Tyr385 390 395 400
Pro Leu Phe Asp Gly Ile Phe Cys ser Ser ser Met His Thr Thr Ser405 410 415
Gly Thr Thr Arg Leu Leu ser Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly420 425 430
Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr Met Gly Leu Leu Thr435 440
<210> 26
<211> 1404
<212> DNA
<213> Artificial
<220><223> Sintético<400> 26
atgaagcaca tcctgtacat ctccttctac ttcatcctgg tgaacctgct gatcttccac 60atcaacggca agatcaccaa gaactccgag aaggacgaga tcatcaagtc caacctgcgc 120tccggctcct ccaactcccg caaccgcatc aacgaggaga agcacgagaa gaagcacgtg 180ctgtcccaca actcctacga gaagaccaag aacaacgaga acaacaagtt cttcgacaag 240gacaaggagc tgaccatgtc caacgtgaag aacgtgtccc agaccaactt caagtccctg 300ctgcgcaacc tgggcgtgtc cgagaacatc ttcctgaagg agaacaagct gaacaaggag 360ggcaagctga tcgagcacat catcaacgac gacgacgaca agaagaagta catcaagggc 420caggacgaga accgccagga ggacctggag aaggccgccg agcagcagtc cgacctggag 480caggagcgcc tggccaagga gaagctgcag gagcgccgcg ccaaggagaa gctgcaggag 540cagcagcgcg acctggagca gcgcaaggcc gacaccaaga agaacctgga gcgcaagaag 600gagcacggcg acgtgctggc cgaggacctg tacggccgcc tggagatccc cgccatcgag 660ctgccctccg agaacgagcg cggctactac atcccccacc agtcctccct gccccaggac 720aaccgcggca actcccgcga ctccaaggag atctccatcg tggagaacac caaccgcgag 780tccatcacca ccaacgtgga gggccgccgc gacatccaca agggccacct ggaggagaag 840aaggacggct ccatcaagcc cgagcagaag gaggacaagt ccgccgacat ccagaaccac 900accctggaga ccgtgaacat ctccgacgtg aacgacttcc agatctccaa gtacgaggac 960gagatctccg ccgagtacga cgactccctg atcgacgagg aggaggacga cgaggacctg 1020gacgagttca agcccatcgt gcagtacgac aacttccagg acgaggagaa catcggcatc 1080tacaaggagc tggaggacct gatcgagaag aacgagaacc tggacgacct ggacgagggc 1140atcgagaagt cctccgagga gctgtccgag gagaagatca agaagggcaa gaagtacgag 1200aagaccaagg acaacaactt caagcccaac gacaagtccc tgtacgacga gcacatcaag 1260aagtacaaga acgacaagca ggtgaacaag gagaaggaga agttcatcaa gtccctgttc 1320cacatcttcg acggcgacaa cgagatcctg cagatcgtgg acgagctgtc cgaggacatc 1380accaagtact tcatgaagct gtaa 1404
<210> 27
<211> 467
<212> PRT
<213> Artificial
Sintética
<225><400> 27
Met Lys His Ile Leu Tyr ile Ser Phe Tyr Phe Ile Leu Val Asn Leu1 5 10 15
Leu ile Phe His Ile Asn Gly Lys ile Thr Lys Asn ser Glu Lys Asp20
25
30
Glu Ile Ile Lys Ser Asn Leu Arg Ser Gly ser Ser Asn Ser Arg Asn35 40 45
Arg Ile Asn Glu Glu Lys His Glu Lys Lys His vai Leu Ser His Asn50 55 60
Ser Tyr Glu Lys Thr Lys Asn Asn Glu Asn Asn Lys Phe Phe Asp Lys65 70 75 80
Asp Lys Glu Leu Thr Met Ser Asn Val Lys Asn Val Ser Gln Thr Asn85 90 95
Phe Lys Ser Leu Leu Arg Asn Leu Gly vai ser Glu Asn Ile Phe Leu100 105 110
Lys Glu Asn Lys Leu Asn Lys Glu Gly Lys Leu Ile Glu His Ile Ile115 120 125
Asn Asp Asp Asp Asp Lys Lys Lys Tyr Ile Lys Gly Gln Asp Glu Asn130 135 140
Arg Gln Glu Asp Leu Glu Lys Ala Ala Glu Gln Gln Ser Asp Leu Glu145 150 155 160
Gln Glu Arg Leu Ala Lys Glu Lys Leu Gln Glu Arg Arg Ala Lys Glu165 170 175
Lys Leu Gln Glu Gln Gln Arg Asp Leu Glu Gln Arg Lys Ala Asp Thry 180 185 190
Lys Lys Asn Leu Glu Arg Lys Lys Glu His Gly Asp Val Leu Ala Glu195 200 205
Asp Leu Tyr Gly Arg Leu Glu Ile Pro Ala Ile Glu Leu Pro Ser Glu210 215 220
Asn Glu Arq Gly Tyr Tyr Ile Pro His Gln Ser Ser Leu Pro Gln Asp225 230 235 240
Asn Arg Gly Asn ser Arg Asp ser Lys Glu Ile Ser Ile Val GTu Asn245 250 255
Thr Asn Arg Glu Ser Ile Thr Thr Asn Val Glu Gly Arg Arg Asp Ile260 265 270
His Lys Gly His Leu Glu Glu Lys Lys Asp Gly Ser Ile Lys Pro Glu275 280 285Gln Lys Glu Asp Lys Ser Ala Asp Ile Gln Asn His Thr Leu Glu Thr290 295 300
Val Asn Ile ser Asp Val Asn Asp Phe Gln Ile Ser Lys Tyr Glu Asp305 310 315 320
Glu Ile Ser Ala Glu Tyr Asp Asp ser Leu Ile Asp Glu Glu Glu Asp325 330 335
Asp Glu Asp Leu Asp Glu Phe Lys Pro Ile vai Gln Tyr Asp Asn Phe340 345 350
Gln Asp Glu Glu Asn lie Gly Ile Tyr Lys Glu Leu Glu Asp Leu Ile355 360 365
Glu Lys Asn Glu Asn Leu Asp Asp Leu Asp Glu Gly Ile Glu Lys Ser370 375 380
Ser Glu Glu Leu Ser Glu Glu Lys Ile Lys Lys Gly Lys Lys Tyr Glu385 390 395 400
Lys Thr Lys Asp Asn Asn Phe Lys Pro Asn Asp Lys Ser Leu Tyr Asp405 410 415
Glu His Ile Lys Lys Tyr Lys Asn Asp Lys Gln vai Asn Lys Glu Lys420 425 430
Glu Lys Phe Ile Lys Ser Leu Phe His Ile Phe Asp Gly Asp Asn Glu435 440 445
Ile Leu Gln He Val Asp Glu Leu Ser Glu Asp Ile Thr Lys Tyr Phe450 455 460
Met Lys Leu465
<210> 28
<211> 1533
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Sintético
60120
<400> 28
atggactgct ccggctccat ccgccgccac aactgggtga accacgccgt gcccctggccatgaagctga tccagcagct gaacctgaac gacaacgcca tccacctgta cgcctccgtgttctccaaca acgcccgcga gatcatccgc ctgcactccg acgcctccaa gaacaaggag 180aaggccctga tcatcatcaa gtccctgctg tccaccaacc tgccctacgg caagaccaac 240ctgaccgacg ccctgctgca ggtgcgcaag cacctgaacg accgcatcaa ccgcgagaac 300gccaaccagc tggtggtgat cctgac«_yac ggcaxccccg actccatcca ggactccctg 360
aaggagtccc gcaagctgtc cgaccgcggc gtgaagatcg ccgtgttcgg catcggccag 420
ggcatcaacg tggccttcaa ccgcttcctg gtgggctgcc acccctccga cggcaagtgc 480
aacctgtacg ccgactccgc ctgggagaac gtgaagaacg tgatcggccc cttcatgaag 540
gccgtgtgcg tggaggtgga gaagaccgcc tcctgcggcg tgtgggacga gtggtccccc 600
tgctccgtga cctgcggcaa gggcacccgc tcccgcaagc gcgagatcct gcacgagggc 660
tgcacctccg agctgcagga gcagtgcgag gaggagcgct gcctgcccaa gcgcgagccc 720
ctggacgtgc ccgacgagcc cgaggacgac cagccccgcc cccgcggcga caacttcgcc 780
gtggagaagc ccaacgagaa catcatcgac aacaaccccc aggagccctc ccccaacccc 840
gaggagggca agggcgagaa ccccaacggc ttcgacctgg acgagaaccc cgagaacccc 900
cccaaccccc ccaaccccga catccccgag caggagccca acatccccga ggactccgag 960
aaggaggtgc cctccgacgt gcccaagaac cccgaggacg accgcgagga gaacttcgac 1020
atccccaaga agcccgagaa caagcacgac aaccagaaca acctgcccaa cgacaagtcc 1080
gaccgctaca tcccctactc ccccctgtcc cccaaggtgc tggacaacga gcgcaagcag 1140
tccgaccccc agtcccagga caacaacggc aaccgccacg tgcccaactc cgaggaccgc 1200
gagacccgcc cccacggccg caacaacgag aaccgctcct acaaccgcaa gcacaacaac 1260
acccccaagc accccgagcg cgaggagcac gagaagcccg acaacaacaa gaagaaggcc 1320
ggctccgaca acaagtacaa gatcgccggc ggcatcgccg gcggcctggc cctgctggcc 1380
tgcgccggcc tggcctacaa gttcgtggtg cccggcgccg ccacccccta cgccggcgag 1440
cccgccccct tcgacgagac cctgggcgag gaggacaagg acctggacga gcccgagcag 1500
ttccgcctgc ccgaggagaa cgagtggaac taa 1533
<210> 29
<211> 510
<212> PRT
<213> Artificial
<220> ·<223> Sintética
<400> 29
Met Asp cys ser Gly Ser ile Arg Arg His Asn Trp Val Asn His Ala1 5 10 15
Val Pro Leu Ala Met Lys Leu Ile Gln Gln Leu Asn Leu Asn Asp Asn20 25 30
Ala ile His Leu Tyr Ala ser vai Phe Ser Asn Asn Ala Arg Glu ile35 40 45
Ile Arg Leu His Ser Asp Ala Ser Lys Asn Lys Glu Lys Ala Leu IleIle Ile Lys ser Leu Leu ser Thr Asn Leu Pro Tyr Gly Lys Thr Asn65 70 75 80
Leu Thr Asp Ala Leu Leu Gln Val Arg Lys His Leu Asn Asp Arg Ile85 90 95
Asn Arg Glu Asn Ala Asn Gln Leu Val Val Ile Leu Thr Asp Gly Ile100 105 HO
Pro Asp Ser Ile Gln Asp Ser Leu Lys Glu ser Arg Lys Leu Ser Asp115 120 125
Arg Gly vai Lys Ile Ala vai Phe Gly Ile Gly Gln Gly Ile Asn Val130 135 140
Ala Phe Asn Arg Phe Leu vai Gly Cys His Pro ser Asp Gly Lys çys145 150 155 160
Asn Leu Tyr Ala Asp Ser Ala Trp Glu Asn Val Lys Asn Val Ile Gly165 170 175
Pro Phe Met Lys Ala Val cys Val Glu vai Glu Lys Thr Ala ser Cys180 185 190
Gly vai Trp Asp Glu Trp Ser Pro cys ser Val Thr cys Gly Lys Gly195 200 205
Thr Arq ser Arg Lys Arg Glu Ile Leu His Glu Gly Cys Thr ser Glu210 215 220
Leu Gln Glu Gln Cys Glu Glu Glu Arg Cys Leu Pro Lys Arg Glu Pro225 230 235 240
Leu Asp vai Pro Asp Glu Pro Glu Asp Asp Gln Pro Arg Pro Arg Gly245 250 255
Asp Asn Phe Ala Val Glu Lys Pro Asn Glu Asn Ile He Asp Asn Asn260 265 270
Pro Gln Glu Pro Ser Pro Asn Pro Glu Glu Gly Lys Gly Glu Asn Pro275 280 285
Asn Gly Phe Asp Leu Asp Glu Asn Pro Glu Asn Pro Pro Asn Pro Pro290 295 300
Asn Pro Asp Il e Pro Glu Gln Glu Pro Asn Ile Pro Glu Asp Ser Glu305 310 315 320
Lys Glu Val Pro ser Asp Val Pro Lys Asn Pro Glu Asp Asp Arg Glu325 330 335
Glu Asn Phe Asp Ile Pro Lys Lys Pro Glu Asn Lys His Asp Asn Gln340 345 350
Asn Asn Leu Pro Asn Asp Lys Ser Asp Arg Tyr Ile Pro TVr ser Pro355 360 365
Leu ser Pro Lys Val Leu Asp Asn Glu Arg Lys Gln Ser Asp Pro Gln370 375 380
Ser Gln Asp Asn Asn Gly Asn Arg His vai Pro Asn ser Glu Asp Arg385 390 395 400
Glu Thr Arg Pro His Gly Arg Asn Asn Glu Asn Arg Ser Tyr Asn Arg405 410 415
Lys His Asn Asn Thr Pro Lys His Pro Glu Arg Glu Glu His Glu Lys420 425 430
Pro Asp Asn Asn Lys Lys Lys Ala Gly ser Asp Asn Lys Tyr Lys Ile435 440 445
Ala Gly Gly Ile Ala Gly Gly Leu Ala Leu Leu Ala Cys Ala Gly Leu450 455 460
Ala Tyr Lys Phe Val Val Pro Gly Ala Ala Thr Pro Tyr Ala Gly Glu465 470 475 480
Pro Ala Pro Phe Asp Glu Thr Leu Gly Glu Glu Asp Lys Asp Leu Asp485 490 495
Glu Pro Glu Gln Phe Arg Leu Pro Glu Glu Asn Glu Trp Asn500 505 510
<210> 30<211> 1563<212> DNA<213> Artificial
<220>
<223> sintético<400> 30
atgaaccacc tgggcaacgt gaagtacctg gtgatcgtgt tcctgatctt cttcgacctg 60
ttcctggtga acggccgcga cgtgcagaac aacatcgtgg acgagatcaa gtaccgcgag 120
gaggtgtgca acgacgaggt ggacctgtac ctgctgatgg actgctccgg ctccatccgc 180
cgccacaact gggtgaacca cgccgtgccc ctggccatga agctgatcca gcagctgaac 240
ctgaacgaca acgccatcca cctgtacgcc tccgtgttct ccaacaacgc ccgcgagatc 300
atccgcctgc actccgacgc ctccaagaac aaggagaagg ccctgatcat catcaagtcc 360ctgctgtcca ccaacctgcc ctacggcaag accaacctga ccgacgccct gctgcaggtg 420
cgcaagcacc tgaacgaccg catcaaccgc gagaacgcca accagctggt ggtgatcctg 480
accgacggca tccccgactc catccaggac tccctgaagg agtcccgcaa gctgtccgac 540
cgcggcgtga agatcgccgt gttcggcatc ggccagggca tcaacgtggc cttcaaccgc 600
ttcctggtgg gctgccaccc ctccgacggc aagtgcaacc tgtacgccga ctccgcctgg 660
gagaacgtga agaacgtgat cggccccttc atgaaggccg tgtgcgtgga ggtggagaag 720
accgcctcct gcggcgtgtg ggacgagtgg tccccctgct ccgtgacctg cggcaagggc 780
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tgcgaggagg agcgctgcct gcccaagcgc gagcccctgg acgtgcccga cgagcccgag 900
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gccggcggca tcgccggcgg cctggccctg ctggcctgcg ccggcctggc ctacaagttc 1560
gtg 1563
<210> 31<211> 521<212> PRT<213> Artificial
<400> 31
Met Asn His Leu Gly Asn Val Lys Tyr Leu Val Ile Val Phe Leu Ile15 10 15
Phe Phe Asp Leu Phe Leu Val Asn Gly Arg Asp Val Gln Asn Asn Ile20 25 30
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vai Asn His Ala vai Pro Leu Ala Met Lys Leu ile Gln Gln Leu Asn65 70 75 80
Leu Asn Asp Asn Ala Ile His Leu Tyr Ala Ser Val Phe Ser Asn Asn85 90 95
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Lys Ala Leu Ile Ile Ile Lys ser Leu Leu ser Thr Asn Leu Pro Tyr115 120 125
Gly Lys Thr Asn Leu Thr Asp Ala Leu Leu Gln Val Arg Lys His Leu130 135 140
Asn Asp Arg Ile Asn Arg Glu Asn Ala Asn Gln Leu Val Val Ile Leu145 150 155 160
Thr Asp Gly Ile Pro Asp Ser Ile Gln Asp Ser Leu Lys Glu Ser Arg165 170 175
Lys Leu Ser Asp Arg Gly vai Lys Ile Ala Val Phe Gly Ile Gly Gln180 185 190
Gly Ile Asn Val Ala Phe Asn Arg Phe Leu vai Gly cys His Pro ser195 200 205
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Asn Val ile Gly Pro Phe Met Lys Ala Val Cys Val Glu Val Glu Lys225 230 235 240
Thr Ala Ser Cys Gly vai Trp Asp Glu Trp Ser Pro Cys ser Val Thr245 250 255
Cys Gly Lys Gly Thr Arg ser Arg Lys Arg Glu Ile Leu His Glu Gly260 265 270
Cys Thr ser Glu Leu Gln Glu Gln Cys Glu Glu Glu Arg cys Leu Pro275 280 285
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Xrg Pro Arg Gly Asp Asn Phe Ala Val Glu Lys Pro Asn Glu Asn Ile105 310 315 320Ile Asp Asn Asn Pro Gln Glu Pro Ser Pro Asn Pro Glu Glu Gly Lys
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1
His Asp Asn Gln Asn Asn Leu Pro Asn Asp Lys Ser Asp Arg Tyr Ile
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Pro Tyr Ser Pro Leu Ser Pro Lys vai Leu Asp Asn Glu Arg Lys Gln420 425 430
Ser Asp Pro Gln Ser Gln Asp Asn Asn Gly Asn Arg His vai Pro Asn435 440 445
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ser Tyr Asn Arg Lys His Asn Asn Thr Pro Lys His Pro Glu Arg Glu465 470 475 480
Glu His Glu Lys Pro Asp Asn Asn Lys Lys Lys Ala Gly Ser Asp Asn
485 490 495
Lys Tyr Lys Ile Ala Gly Gly lie Ala Gly Gly Leu Ala Leu Leu Ala500 505 510
Cys Ala Gly Leu Ala Tyr Lys Phe ValS15 520

Claims (47)

1. Vetor adenoviral caracterizado pelo fato de quecompreende um genoma adenoviral compreendendo três ou maisseqüências de ácido nucléico de codificação de antígenoheterólogo, no qual as três ou mais seqüências de ácidonucléico são ligadas de maneira operável a pelo menos doispromotores heterólogos diferentes.
2. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que cada uma das três ou maisseqüências de ácido nucléico de codificação de antígenoheterólogo codifica um antígeno de Plasmodium.
3. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 1ou reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que cada umadas três ou mais seqüências de ácido nucléico decodificação de antígeno heterólogo codifica um antígeno deestágio de sangue de Plasmodium, um antígeno de estágiopré-eritrocítico de Plasmodium, ou um seu epítopo.
4. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que cada seqüência de ácidonucléico de codificação de antígeno heterólogo codifica umantígeno de estágio pré-eritrocítico de Plasmodium ou umepítopo do mesmo.
5. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que o antígeno de estágio pré-eritrocítico é selecionado do grupo consistindo em proteínacircunsporozoíta (CSP), proteína 2 de superfície deesporozoíto (SSP2), antígeno 1 de estágio de fígado (LSΑ-Ι) , proteína 1 exportada Pf (PfExp-I)/proteína 17 deeritrócito de hepatócito Py (PyHEP17), e seus epítopos.
6. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2, 3, 4 ou 5, caracterizado pelo fato de quecada seqüência de ácido nucléico de codificação de antígenoheterólogo compreende códons expressados maisfreqüentemente em mamíferos do que em Plasmodium.
7. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2 ,3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fatode que cada uma das três ou mais seqüências de ácidonucléico de codificação de antígeno heterólogo é ligado demaneira operável a um promotor diferente.
8. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o promotor é selecionado dogrupo consistindo em um promotor CMV humano (hCMV) , umpromotor CMV de camundongo (mCMV), um promotor quimérico debeta actina de pinto aperfeiçoado de CMV humano (CCBA), umpromotor hpA, um promotor EF-Ια, um promotor de Vírus deSarcoma de Rous, um promotor de ubiquitina, um promotor deenolase de neurônio específico (NSE), e um promotor eproteína 70B de choque térmico (HSP70B).
9. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelofato de que o vetor adenoviral é deficiente em replicação erequer complementação de ambas regiões El e E4 parapropagação.
10. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 9,caracterizado pelo fato de que o genoma adenoviral careceda região El inteira e de pelo menos uma porção da regiãoE4 .
11. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação-10, caracterizado pelo fato de que pelo menos duas dasseqüências de ácido nucléico de codificação de antígenoheterólogo são inseridas na região El deletada e pelo menosuma das seqüências de ácido nucléico de codificação deantígeno heterólogo é inserida na região E4 deletada dogenoma adenoviral.
12. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviralcompreende uma seqüência de ácido nucléico codificando umaproteína circunsporozoíta 2 inserida na região El deletada,uma seqüência de ácido nucléico codificando um antígeno deestágio de fígado inserido na região El deletada, e umaseqüência de ácido nucléico codificando proteína desuperfície de esporozoíto inserida na região E4 deletada.
13. Vetor adenoviral caracterizado pelo fato de quecompreende um genoma adenoviral compreendendo duas ou maisseqüências de ácido nucléico, em que cada seqüência deácido nucléico codifica um antígeno de Plasmodium e é demaneira operável ligada a pelo menos um promotor.
14. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que cada uma das duas oumais seqüências de ácido nucléico de codificação deantígeno codifica um antígeno de estágio pré-eritrocíticode Plasmodium ou um seu epítopo.
15. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que cada uma das duas oumais seqüências de ácido nucléico de codificação deantígeno codifica um antígeno de estágio de sangue dePlasmodium ou um seu epítopo.
16. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o antígeno de estágio desangue é selecionado do grupo consistindo em proteína 1 desuperfície de merozoíto (MSP-I), proteína 2 de superfíciede merozoíto (MSP-2), antígeno 175 de ligação de eritrócito(EBA-175), antígeno de superfície de eritrócito de anelinfectado (RESA), antígeno de repetição de serina (SERA),proteína de ligação de glicoforina (GBP-130), proteína 2rica em histidina (HRP-2), proteínas 1 e 2 associadas àroptria (RAP-1 e RAP-2), proteína 1 de membrana deeritrócito (PfEMP1) , antígeno 1 de membrana apical (AMA-I) ,e seus epítopos.
17. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato deque o antígeno codificado por cada ácido nucléico decodificação de antígeno compreende um peptídeo de sinal.
18. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 13, 14, 15, 16 ou 17, caracterizado pelofato de que o antígeno codificado por cada seqüência deácido nucléico de codificação de antígeno não é N-glicosilado.
19. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 13, 14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelofato de que cada seqüência de ácido nucléico de codificaçãode antígeno compreende códons expressados maisfreqüentemente em mamíferos do que em Plasmodium.
20. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizadopelo fato de que cada seqüência de ácido nucléico decodificação de antígeno é ligado de maneira operável a umpromotor diferente.
21. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizadopelo fato de que cada seqüência de ácido nucléico decodificação de antígeno é ligada de maneira operável aomesmo promotor.
22. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 20ou 21, caracterizado pelo fato de que o promotor éselecionado do grupo consistindo em um promotor de CMVhumano (hCMV), um promotor de CMV de camundongo (mCMV), umpromotor CCBA, um promotor ϊιβΑ, um promotor EF-Ια, umpromotor de Vírus de Sarcoma de Rous, e um promotor deubiquitina.
23. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22,caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral édeficiente em replicação e requer complementação de ambasregiões El e E4 para propagação.
24. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o genoma adenoviralcarece da região El inteira e de pelo menos uma porção daregião E4.
25. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dasseqüências de ácido nucléico de codificação de antígeno éinserida na região El deletada e pelo menos uma dasseqüências de ácido nucléico de codificação de antígeno éinserida na região E4 deletada do genoma adenoviral.
26. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as duas ou maisseqüências de ácido nucléico de codificação de antígeno sãoinseridas na região El deletada do genoma adenoviral.
27. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação-26, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviralcompreende uma seqüência de ácido nucléico codificando umantígeno 1 de membrana apical (AMA-I) e uma seqüência deácido nucléico codificando uma proteína 1 de superfície demerozoíto (MSP-I), ou epítopos dos mesmos, inseridos naregião El deletada do genoma adenoviral.
28. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação-24, caracterizado pelo fato de que as duas ou maisseqüências de ácido nucléico de codificação de antígeno sãoinseridas na região E4 deletada do genoma adenoviral.
29. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação-28, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviralcompreende uma seqüência de ácido nucléico codificando umantígeno 1 de membrana apical (AMA-I) e uma seqüência deácido nucléico codificando uma proteína 1 de superfície demerozoíto (MSP-I), ou seus epítopos, inserida na região E4deletada do genoma adenoviral.
30. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28ou 29, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviralnão é neutralizado por anticorpos humanos específicos deadenovírus.
31. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação-30, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviralcompreende uma proteína de revestimento modificada queexibe reconhecimento reduzido pelo sistema imune dohospedeiro.
32. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação-31, caracterizado pelo fato de que a proteína derevestimento modificada é selecionada do grupo consistindoem uma proteína de fibra, uma proteína penton, e umaproteína hexon.
33. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 3 0 ou 31 caracterizado pelo fato de que o vetoradenoviral compreende uma proteína de fibra em que o localde ligação CAR nativo é mutada.
34. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação-32, caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviralcompreende uma proteína de fibra compreendendo umaseqüência de aminoácido não-nativa.
35. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação-34, caracterizado pelo fato de que a seqüência deaminoácido não-nativa compreende uma seqüência RGD.
36. Vetor adenoviral, de acordo com a reivindicação-34, caracterizado pelo fato de que a seqüência deaminoácido não-nativa compreende uma seqüência de epítopode Plasmodium.
37. Vetor adenoviral, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fatode que as seqüências de ácido nucléico de codificação deantígeno são obtidas a partir de Plasmodium falciparum.
38. Método de induzir uma resposta imune contramalária em um mamífero caracterizado pelo fato decompreender administrar ao mamífero um vetor adenoviral dequalquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,- 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24,- 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 ou 37, emque os antígenos são expressados no mamífero para induziruma resposta imune contra malária.
39. Método de induzir uma resposta imune contramalária em um mamífero caracterizado por compreenderadministrar ao mamífero:(a) um vetor adenoviral compreendendo um genomaadenoviral compreendendo três ou mais seqüências de ácidonucléico, em que cada seqüência de ácido nucléico codificaum antígeno de estágio pré-eritrocítico de Plasmodium ou umepítopo do mesmo, e é ligado de maneira operável a pelomenos um promotor, e(b) um vetor adenoviral compreendendo um genomaadenoviral compreendendo duas ou mais seqüências de ácidonucléico, em que cada seqüência de ácido nucléico codificaum antígeno de estágio de sangue de Plasmodium, ou umepítopo do mesmo, e é de maneira operável ligado a pelomenos um promotor,em que os antígenos são expressos no mamífero parainduzir uma resposta imune contra malária.
40. Método, de acordo com a reivindicação 39,caracterizado pelo fato de que o vetor adenoviral édeficiente em replicação e requer complementação de ambasregiões E1 e E4 para a propagação.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato de que o genoma adenoviral careceda região El inteira e de pelo menos uma porção da regiãoE4.
42. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 39, 40 ou 41, caracterizado pelo fato de queo antígeno de estágio pré-eritrocítico é selecionado dogrupo consistindo em proteína circunsporozoíta (CSP),proteína 2 de superfície de esporozoíto (SSP2), antígeno 1de estágio de fígado (LSA-I), proteína 1 exportada Pf(PfExp-1)/proteína 17 de eritrócito de hepatócito Py(PyHEP17), e epítopos dos mesmos.
43. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 39, 4 0 ou 41, caracterizado pelo fato de queo antígeno de estágio de sangue é selecionado do grupoconsistindo em proteína 1 de superfície de merozoíto (MSP--1), proteína 2 de superfície de merozoíto (MSP-2), antígeno-175 de 1 igaçao de eritrócito (EBA-175) , antígeno desuperfí cie de eritrócito de anel infectado (RESA), antígenode repetição de serina (SERA), proteína de ligação deglicoforina (GBP-130), proteína 2 rica em histidina (HRP--2) , proteínas 1 e 2 associadas à roptria (RAP-1 e RAP-2) ,proteína 1 de membrana de eritrócito (PfEMP1), antígeno 1de membrana apical (AMA-1), e epítopos dos mesmos.
44. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 39, 40, 41, 42 ou 43, caracterizado pelofato de que cada seqüência de ácido nucléico compreendecódons expressados mais freqüentemente em mamíferos do queem Plasmodium.
45. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 39, 40, 41, 42, 43 ou 44, caracterizado pelofato de que a seqüência de ácido nucléico é ligada demaneira operável a um promotor diferente.
46. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45, caracterizadopelo fato de que cada seqüência de ácido nucléico é ligadade maneira operável ao mesmo promotor.
47. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 39, 40 ,41, 42, 43, 44, 45 ou 46,caracterizado pelo fato de que o método compreendeadministrar um vetor de transferência de gene inciante aomamífero, em que o vetor de transferência de gene inciantecompreende uma seqüência de ácido nucléico codificando umantígeno, antes de administrar os vetores adenovirais aomamífero.
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