BRPI0615538A2

BRPI0615538A2 - proteìna de fusão, ácido nucléico isolado, vetor, célula hospedeira, método de produção de um polipeptìdio, composição farmacêutica, composição alimentar, método para a redução do peso corpóreo, método para o tratamento de diabetes, método para aumentar a vida média de um peptìdio ou uma proteìna terapêutica recombinante em um indivìduo, método para aumentar a eficácia de um peptìdio ou proteìna terapêutica, método para o tratamento de diabetes ou redução do peso corpóreo

Info

Publication number: BRPI0615538A2
Application number: BRPI0615538-3A
Authority: BR
Inventors: Mizhou Hui
Original assignee: Amprotein Corp
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2006-03-28
Publication date: 2011-05-17
Also published as: CA2616551A1; AU2006279276A1; WO2007018619A2; EP1909823A2; IL188708A0; WO2007018619A3; KR20080050576A; US20090175795A1; JP2009510999A

Abstract

PROTEìNA DE FUSãO, áCIDO NUCLéICO ISOLADO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, MéTODO DE PRODUçãO DE UM POLIPEPTìDIO, COMPOSIçãO FARMACêUTICA, COMPOSIçAO ALIMENTAR, MéTODO PARA A REDUçãO DO PESO CORPOREO, MéTODO PARA O TRATAMENTO DE DIABETES, MéTODO PARA AUMENTAR A VIDA MéDIA DE UM PEPTìDIO OU UMA PROTEìNA TERAPêUTICA RECOMBINANTE EM UM INDIVìDUO, MéTODO PARA AUMENTAR A EFICáCIA DE UM PEPTìDIO OU PROTEìNA TERAPêUTICA, MéTODO PARA O TRATAMENTO DE DIABETES OU REDUçãO DO PESO CORPóREO. Uma proteína de fusão que inclui (i) um primeiro segmento que fica localizado no terminal amino da proteína de fusão e contém a seqúência de um primeiro peptídio ou proteína biológica ativa; e (ii) um segundo segmento que fica localizado no terminal carboxila da proteína de fusão e contém a seqúência de um segundo peptídio ou proteína biológica ativa. O primeiro e segundo segmentos são ligados de maneira operável e covalente. Também são descritos os ácidos nucléicos que codificam a proteína de fusão, os vetores e as células hospedeiras que têm ácidos nucléicos, e a composição e os métodos correlatos para tratamento do diabetes e/ou da obesidade.

Description

PROTEÍNA DE FUSÃO, ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, VETOR,CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDIO,COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMPOSIÇÃO ALIMENTAR, MÉTODO PARA AREDUÇÃO DO PESO CORPÓREO, MÉTODO PARA O TRATAMENTO DEDIABETES, MÉTODO PARA AUMENTAR A VIDA MÉDIA DE UM PEPTÍDIO OUUMA PROTEÍNA TERAPÊUTICA RECOMBINANTE EM UM INDIVÍDUO, MÉTODOPARA AUMENTAR A EFICÁCIA DE UM PEPTÍDIO OU PROTEÍNATERAPÊUTICA, MÉTODO PARA O TRATAMENTO DE DIABETES OU REDUÇÃO

DO PESO CORPÓREO

PEDIDO CORRELATO

O presente pedido reivindica a prioridade do Pedidode Patente U.S. Provisório de N°. de Série 60/703.950,depositado em 29 de julho de 2005; Pedido de Patente U.S.Provisório de N°. de Série 60/727.612, depositado em 17 deoutubro de 2005; Pedido de Patente U.S. Provisório de N°. deSérie 60/762.820, depositado em 27 de janeiro de 2006; ePedido de Patente U.S. Provisório de N°. de Série 60/773.385,depositado em 14 de fevereiro de 2006, cujos conteúdos sãoincorporados a titulo de referência em sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O diabetes mellitus, chamado geralmente dediabetes, refere-se a um processo de enfermidade derivado defatores causadores múltiplos e caracterizado por níveiselevados de glicose no plasma, denominado como hiperglicemia.Vide, por exemplo, LeRoith, D. et al. , (eds.), DIABETESMELLITUS (Lippincott-Raven Publishers, Filadélfia, Pa. EUA.1996) . De acordo com a American Diabetes Association, estima-se que o diabetes mellitus afeta aproximadamente 6% dapopulação mundial. A hiperglicemia descontrolada é associadacom a mortalidade aumentada e prematura devido a um riscoaumentado para doenças microvasculares e macrovasculares, asquais incluem nefropatia, neuropatia, retinopatia,hipertensão, doença cerebrovascular e doença cardíacacoronariana. Portanto, o controle da homeostase da glicose éuma abordagem importante para o tratamento do diabetes.

Há duas formas principais de diabetes: diabetestipo 1 (denominado anteriormente como diabetes insulino-dependente ou DMID); e diabetes tipo 2 (denominadoanteriormente como diabetes não-insulino-dependente ouDMNID). 0 diabetes tipo 1 é o resultado de uma deficiênciaabsoluta de insulina, o hormônio que regula a utilização daglicose. Esta deficiência de insulina é caracterizadageralmente pela destruição das células β dentro das ilhotasde Langerhans no pâncreas e deficiência absoluta de insulina.

O diabetes tipo 2 é uma doença caracterizada pela resistênciaà insulina acompanhada de deficiência de insulina relativa,em vez de absoluta. O diabetes tipo 2 pode variar daresistência à insulina predominante com deficiência deinsulina relativa à deficiência predominante de insulina comalguma resistência à insulina. A resistência à insulina é acapacidade diminuída da insulina de exercer a sua açãobiológica através de uma ampla faixa de concentrações. Emindivíduos resistentes à insulina, o corpo secretaquantidades anormalmente elevadas de insulina para compensaresse defeito. Quando quantidades inadequadas de insulinaestão presentes para compensar a resistência à insulina econtrolar adequadamente a glicose, um estado de tolerância àglicose alterado é desenvolvido. Em um número significativode indivíduos, a secreção de insulina declina adicionalmentee o nível de glicose no plasma aumenta, resultando no estadoclínico do diabetes.

A maior parte dos pacientes diabéticos do tipo 2 étratada tanto com agentes hipoglicêmicos que agem estimulandoa liberação de insulina das células beta quanto com agentesque intensificam a sensibilidade do tecido dos pacientes paraa insulina ou com a insulina. No entanto, esta terapia não é,na maioria dos casos, satisfatória.

A insulina estimula a captação da glicose pelomúsculo esqueletal e pelos tecidos adiposos principalmenteatravés da translocação através do transportador de glicose 4(GLUT4) dos sítios de armazenagem intracelulares dasuperfície celular (Saltiel, A. R. & Kahn7 C.R. (2001) Nature414:799-806; Saltiel, A. & Pessin, J. E. (2002) Trends inCell Biol. 12:65-71; White, M. F. (1998) Mol. Cell. Biochem.182:3-11). Em resposta à insulina, uma fração de GLUT4presente nas membranas intracelulares é redistribuída àmembrana plasmática, tendo por resultado um aumento de GLUT4na superfície celular e captação intensificada de glicose poressas células. A translocação de GLUT4 é mediadaprincipalmente através do receptor de insulina (IR).

Além do transporte de glicose, a insulina estáintimamente envolvida na adipogênese, um processo que envolvea proliferação de preadipócitos (células pré-gordas) e adiferenciação de preadipócitos em adipócitos (células gordas)com a acumulação de gordura nos adipócitos. Estudos com alinhagem de células de adipócitos 3T3-L1 sugerem que o papelque a insulina desempenha na adipogênese é principalmentemitótico. Antes da diferenciação, as células 3T3-L1 sãopreadipócitos similares a fibroblastos que contêm maisreceptores IGF-I do que IR. In vitro, a adipogênese depreadipócitos pode ser provocada por um coquetel geralmenteutilizado que induz a diferenciação, MIDI, que consiste em umagente de metilisobutilxantina (MIX) que eleva o cAMP; umglucocorticóide, dexametasona (DEX) ; e insulina (ou IGF-1) ,que interage com os receptores IGF-I nos preadipócitos (Tong,Q., Hotamisligil, G. S. (2001) Rev. in Endoc. S= MetabolicDisorders. 2:349-355; Rosen, E. D., et al. (200) Genes Dev.14:1293-1307). Quando tratados com o MDI, os preadipócitosconfluentes entram novamente no ciclo da célula e sãosubmetidos a aproximadamente dois ciclos de mitose (Modan-Moses, D., et al. (1998). Biochem J. 333:825-831; Tong, Q.,Hotamisligil, G. S. (2001) Rev. in Endoc. & MetabolicDisorders. 2:349-355; Rosen, E. D., et al. (2000). Genes Dev.14:1293-1307), um processo geralmente denominado comoexpansão clonal. Após a expansão clonal, os preadipócitossaem do ciclo da célula e começam a se diferenciar emadipócitos ao expressar genes de adipócitos.

Devido a seu efeito adipogênico, a insulina tem oefeito indesejável de promover a obesidade em pacientes comdiabetes tipo 2 (Moller, D. E. (2001) Nature 414:821-827).

Infelizmente, outras drogas antidiabéticas que estão sendoutilizadas atualmente para estimular o transporte de glicoseem pacientes com diabetes tipo 2 também possuem atividadeadipogênica. Desse modo, embora a terapia de drogas atualpossa fornecer a redução do açúcar no sangue, ela promovefreqüentemente a obesidade.

Conseqüentemente, é altamente desejável odesenvolvimento de uma nova geração de drogas antidiabéticasque corrijam a hiperglicemia sem gerar efeitos colateraisadipogênicos concomitantes. Compostos que induzem a captaçãode glicose em um paciente diabético sem causar hipoglicemiatambém são desejáveis. Uma série de proteínas terapêuticasfoi desenvolvida para tratar o diabetes ou a obesidade. Noentanto, muitas delas não são satisfatórias devido à fracaeficácia, aos efeitos colaterais ou à instabilidade.

Por outro lado, a obesidade é uma doença humana emcrescimento significativamente rápido no mundo. Os pacientesobesos têm freqüentemente uma função de tolerância à glicosealterada ou diabetes "químico ou pré-clínico". É altamentedesejável o desenvolvimento de uma nova geração de drogasantiobesidade que corrijam a função de tolerância à glicosealterada. Idealmente, os compostos que induzem a perda depeso e corrigem a tolerância à glicose alterada em pacientesobesos sem causar hipoglicemia também são desejáveis.

DESCRIÇÃO RESUMIDA

A presente invenção apresenta o uso de leptinahumana como um parceiro de fusão funcional para ampliar avida biológica de peptidios terapêuticos antidiabetes ouantiobesidade tais como o peptídio similar a glucagon 1 (GLP-1) ou seus análogos, peptídio YY e amilina. A fusão daleptina amplia a vida biológica dos peptidios terapêuticos eage em mais do que um efeito aditivo ou sinergístico com ospeptidios terapêuticos.

Conseqüentemente, um aspecto da presente invençãocaracteriza uma proteína de fusão que inclui (i) um primeirosegmento que fica localizado no terminal amino da proteína defusão e contém a seqüência de um primeiro peptídio ouproteína biológica ativa; e (ii) um segundo segmento que ficalocalizado no terminal carboxila da proteína de fusão econtém a seqüência de um segundo peptídio ou proteínabiológica ativa. 0 primeiro e segundo segmentos são ligadosde maneira operável e covalente.

Uma proteína ou um polipeptídio isolado refere-se auma proteína ou polipeptídio substancialmente livre demoléculas naturalmente associadas, isto é, pelo menos 75%(isto é, qualquer número entre 75% e 100%, inclusive) puro empeso seco. A pureza pode ser medida por qualquer métodopadrão apropriado, por exemplo, através de cromatografia decoluna, eletroforese em gel de poliacrilamida ou HPLC. Umpolipeptídio isolado da invenção pode ser purificado a partirde uma fonte natural (para os polipeptídios de tiposelvagem), produzido por técnicas de DNA recombinante ou pormétodos químicos.

0 primeiro ou segundo peptídio ou proteínabiológica ativa pode ser um hormônio do peptídio ou umhormônio da proteína. A primeira proteína biológica ativapode conter a seqüência de peptídio 1 similar a glucagon,amilina ou peptídio YY ou um equivalente funcional do mesmo.

Em uma realização, a primeira proteína biológicaativa contém a seqüência da SEQ ID NO.: 2. A segunda proteínabiológica ativa pode conter a seqüência de Leptina ou umaproteína que induz a perda de peso ou um equivalentefuncional. Ela mantém as suas funções de proteína biológicaativa quando fundida de modo covalente ao C-terminal de umpeptídio ou de uma proteína heteróloga. A segunda proteínabiológica ativa contém a seqüência da SEQ ID NO. : 1. Em umexemplo, a proteína de fusão contém a seqüência da SEQ IDNO.: 4, 5, 10, 11, 16 ou 17. Um polipeptídio "heterólogo", umácido nucléico ou um gene é aquele que se origina de umpolipeptídio diferente, de um ácido nucléico ou de um gene,ou, se o mesmo polipeptídio, ácido nucléico ou gene émodificado substancialmente a partir de sua forma original.

Em uma outra realização, a primeira proteínabiológica ativa contém a seqüência de resíduo de aminoácido3-36 do peptídio YY (SEQ ID NO.: 19). Neste caso, a proteínade fusão pode conter a seqüência da SEQ ID NO.: 12 ou 13.

Em uma realização adicional, a primeira proteínabiológica ativa contém a seqüência de resíduo de aminoácido1-36 de amilina (SEQ ID NO.: 18). Por exemplo, a proteína defusão contém a seqüência da SEQ ID NO.: 14 ou 15.

A proteína de fusão discutida acima pode conteradicionalmente um segmento de aglutinante que une o primeirosegmento e o segundo segmento. 0 segmento de aglutinante temcapacidade de dimerização. Ele pode conter o fragmento de Fcde uma imunoglobulina, por exemplo, IgA, IgE, IgD, IgG ou IgMou um equivalente funcional da mesma. De preferência, ofragmento de Fc é aquele de IgG, que, por exemplo, contém aSEQ ID NO.: 3.A proteína de fusão pode conter adicionalmente aSEQ ID NO. : 9 ou um equivalente funcional da mesma. A SEQ IDNO. : 9 é uma seqüência de peptídio de sinal de secreção detPA. Quando fundida ao C-terminal de uma proteína ou umpeptídio amadurecido, ela dirige a proteína ou o peptídio aotrajeto de secreção e ao espaço extracelular (por exemplo, ummeio de cultura de uma célula que expressa a proteína ou opeptídio). O peptídio de sinal de tPA pode ser clivado apartir da proteína ou do peptídio maduro após a secreção.Peptídios de sinal similares tais como aqueles de cadeiapesada e leve de IgG também podem ser utilizados para a mesmafinalidade de secreção.

Um outro aspecto da invenção caracteriza um ácidonucléico isolado que compreende uma seqüência que codifica aproteína de fusão descrita acima. 0 ácido nucléico podeconter a seqüência de uma SEQ ID NO.: 6-7.

Um ácido nucléico refere-se a uma molécula de DNA(por exemplo, um DNA ou um DNA genômico), uma molécula de RNA(por exemplo, um mRNA) ou a um análogo de DNA ou de RNA. Umanálogo de DNA ou de RNA pode ser sintetizado a partir dosanálogos do nucleotídeo. A molécula de ácido nucléico podeser de cordão único ou de cordão duplo, mas é de preferênciaDNA de cordão duplo. Um "ácido nucléico isolado" refere-se aum ácido nucléico cuja estrutura não é idêntica àquela denenhum ácido nucléico natural ou àquela de nenhum fragmentode um ácido nucléico genômico natural. 0 termo engloba,portanto, por exemplo, (a) um DNA que tem a seqüência departe de uma molécula de DNA genômico natural, mas não éflanqueado por ambas as seqüências de codificação queflanqueiam essa parte da molécula no genoma do organismo emque ocorre naturalmente; (b) um ácido nucléico incorporado emum vetor ou no DNA genômico de um procariota ou de umeucariota de uma maneira tal que a molécula resultante nãoseja idêntica a nenhum vetor natural ou DNA genômico; (c) umamolécula separada tal como um DNA, um fragmento genômico, umfragmento produzido por reação em cadeia de polimerase (PCR)ou por um fragmento de restrição; e (d) uma seqüência denucleotideo recombinante que seja parte de um. gene híbrido,isto é, um gene que codifica uma proteína de fusão. O ácidonucléico descrito acima pode ser utilizado para expressar aproteína de fusão da presente invenção. Para esta finalidade,pode-se ligar de modo operativo o ácido nucléico a seqüênciasreguladoras apropriadas para gerar um vetor de expressão.

Um vetor refere-se a uma molécula de ácido nucléicocom capacidade de transportar um outro ácido nucléico ao qualfoi ligado. 0 vetor pode ter capacidade de replicaçãoautônoma ou se integrar a um DNA hospedeiro. Os exemplos devetores incluem um plasmídio, um cosmídio ou um vetor viral.

0 vetor inclui um ácido nucléico em uma forma apropriada paraa expressão do ácido nucléico em uma célula hospedeira. Depreferência, o vetor inclui uma ou mais seqüênciasreguladoras ligadas de modo operativo à seqüência de ácidonucléico a ser expressa. Uma "seqüência reguladora" incluipromotores, intensificadores e outros elementos de controleda expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Asseqüências reguladoras incluem aquelas que dirigem aexpressão constitutiva de uma seqüência de nucleotideo, bemcomo as seqüências reguladoras e/ou indutíveis específicas detecido. 0 projeto do vetor de expressão pode depender de taisfatores como a escolha da célula hospedeira a sertransformada, o nível de expressão da proteína ou RNAdesejado, e outros ainda. 0 vetor de expressão pode serintroduzido em células hospedeiras para produzir umpolipeptídio da presente invenção. Também está dentro doâmbito da presente invenção uma célula hospedeira que contémo ácido nucléico descrito acima. Os exemplos incluem célulasde Ε. coli, células de insetos (por exemplo, utilizandovetores de expressão de baculovírus), células de levedura oucélulas de mamíferos. Vide, por exemplo, Goeddel, (1990) GeneExpression Technology: Methods in Enzymology 185, AcademicPress, San Diego, CA. Para produzir um polipeptídio dapresente invenção, pode-se cultivar uma célula hospedeira emum meio sob condições que permitam a expressão dopolipeptídio codificado por um ácido nucléico da presenteinvenção e purificar o polipeptídio a partir da célulacultivada ou do meio de células. Alternativamente, o ácidonucléico da presente invenção pode ser transcrito e traduzidoin vitro, por exemplo, utilizando seqüências reguladoras dopromotor T7 e polimerase T7.

Um "equivalente funcional" de um fator proteinosorefere-se a um derivado de polipeptídio da proteína, porexemplo, uma proteína que tem uma ou mais mutações,inserções, eliminações, truncamentos de ponto, uma proteínade fusão ou uma combinação dos mesmos. É pelo menos 70% (porexemplo, 80%, 90%, 95% ou 100% ou qualquer outro número entre70% e 100%, inclusive) idêntico ao fator e retémsubstancialmente a atividade do fator, por exemplo, umacapacidade de se ligar a um receptor do mesmo e de acionar otrajeto correspondente de transdução de sinal.

A "porcentagem de identidade" de duas seqüências deaminoácido ou de dois ácidos nucléicos é determinadautilizando o algoritmo de Karlin e Altschul, Proc. Natl.Acad. Sei. EUA 87:2264-68, 1990, modificada tal como emKarlin e Altschul Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 90:5873-77,1993. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST eXBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. J. Mol. Biol.215:403-10, 1990. As buscas de nucleotídeo BLAST podem serexecutadas com o programa NBLAST, score=100, wordlength=12para obter as seqüências de nucleotídeo homólogas àsmoléculas de ácido nucléico da invenção. As buscas daproteína BLAST podem ser executadas com o programa XBLAST,score=50, wordlength=3 para obter as seqüências de aminoácidohomólogas às moléculas de proteína da invenção. Onde háespaçamentos entre duas seqüências, Gapped BLAST pode serutilizado tal como descrito em Altschul et al., Nucleic AcidsRes. 25 (17) :3389-3402, 1997. Ao utilizar os programas BLAST eGapped BLAST, parâmetros padrão dos programas respectivos(por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser utilizados.

Dentro do âmbito da presente invenção, é incluídauma composição que compreende a proteína de fusão acimamencionada ou um ácido nucléico que codifica a proteína defusão. A composição pode ser uma composição farmacêutica quecontém um veículo farmaceuticamente aceitável ou umacomposição alimentar que contém um veículo nutricionalmenteaceitável. A composição pode ser utilizada para manter oureduzir o peso corpóreo de um indivíduo com necessidade domesmo ao administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz deproteína de fusão ou um ácido nucléico que codifica aproteína de fusão. Para estas finalidades, o indivíduo podereceber simultaneamente o primeiro ou segundo peptídio ou aproteína mencionada acima na forma de não-fusão.

A . invenção caracteriza uma outra composiçãofarmacêutica que inclui (i) Leptina ou um equivalentefuncional; (ii) um peptídio 1 similar a glucagon, amilina,peptídio YY ou um equivalente funcional dos mesmos; e (iii)um veículo farmaceuticamente aceitável.

A invenção também caracteriza uma composiçãoalimentar que compreende uma bactéria de ácido lácticorecombinante que produz e secreta as proteínas de fusão ou oprimeiro juntamente com o segundo peptídio ou a proteína.

As composições discutidas acima podem serutilizadas para tratar o diabetes ou a obesidade. Desse modo,dentro do âmbito da presente invenção é incluído um métodopara o tratamento de diabetes ou da obesidade. O métodoinclui a administração a um indivíduo com necessidade domesmo de uma quantidade eficaz da proteína de fusão discutidaacima ou de um ácido nucléico que codifica a proteína defusão. O método pode incluir simultaneamente a administraçãoao indivíduo do primeiro (particularmente uma versão de açãoprolongada) ou segundo peptídio ou da proteína que não éfundida.

Em um outro aspecto, a invenção caracteriza ummétodo para aumentar a vida média de um peptídio ou proteínaterapêutica recombinante em um indivíduo. O método inclui ajunção de uma proteína recombinante a um segmento que contéma SEQ ID NO.: No. 1 ou um equivalente funcional do mesmo paraa formação de uma proteína de fusão; e a determinação da vidamédia da proteína de fusão em um indivíduo. O peptídio ou aproteína terapêutica recombinante tem um efeito terapêuticosobre o diabetes ou a obesidade.

A invenção também caracteriza um método paraaumentar a eficácia de um peptídio ou proteína terapêuticarecombinante em um indivíduo. O método inclui a junção daproteína recombinante a um segmento que contém a SEQ ID NO.:1 ou um equivalente funcional do mesmo para a formação de umaquimera da proteína de fusão; e a determinação da eficácia daproteína de fusão em um indivíduo. O peptídio ou proteínaterapêutica recombinante tem um efeito terapêutico sobre odiabetes ou a obesidade, ou ambos. A fusão da SEQ ID NO. : 1aumenta a eficácia do peptídio ou proteína terapêuticarecombinante através de efeitos aditivos ou mais do queefeitos aditivos ou sinergísticos. Os parceiros de fusão nãointerferem na função biológica.

Os detalhes de uma ou mais realizações da invençãosão apresentados na descrição abaixo. Outras características,objetivos e vantagens da invenção ficarão evidentes a partirda descrição e das reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção se baseia, pelo menos em parte,na descoberta de um novo uso da Leptina como um parceiro defusão funcional para ampliar as vidas biológicas e a eficáciade peptídios ou polipeptídios terapêuticos antidiabetes ouantiobesidade. Não se esperava que a Leptina ou seuequivalente funcional, quando fundido aos C-terminais de umasérie de peptídios bioativos, por exemplo, peptídiosantidiabetes, ampliasse as vidas biológicas e a eficácia dospeptídios bioativos com ação mais do que aditiva ousinergística. Os exemplos dessas proteínas incluem o peptídio1 similar a glucagon, amilina ou peptídio YY (PYY) ou umequivalente funcional.

É sabido, no estado da técnica, que a fusão daproteína de N-terminal a uma proteína bioativa conduzfreqüentemente à perda de atividade completa, particularmentepara parceiros de fusão da proteína de tamanho grande. Porexemplo, pró-enzimas e pró-hormônios não são ativos devido àfusão do pró-peptídio em seus N-terminais. Essas enzimas pró-digestíveis e pró-hormônios tornam-se biologicamente ativossomente até que seus pró-peptídios sejam clivados. Alémdisso, a fusão da proteína de tamanho grande conduzfreqüentemente a um baixo rendimento da expressão.Inesperadamente, as proteínas fundidas de Leptina podem serproduzidas em nível de produção comercial em célulashospedeiras de mamíferos. A fusão não interfere com aatividade da Leptina ou uma proteína bioativa a que éfundida. Além disso, inesperadamente, a Leptina ou seuequivalente funcional amplia não somente as vidas biológicasdos peptídios bioativos, mas também intensifica a atividadeentre os mesmos.Além disso, quando GLP-I ou seus análogos, PYY ouamilina, são utilizados em conjunto com a Leptina (em umaproteína de fusão ou não), eles têm mais do que efeitosaditivos ou sinergísticos no peso corpóreo através da reduçãodo apetite ou da ingestão alimentar ou outros. Isto erainesperado, uma vez que o uso de GLP-I comercial ou Ieptinarecombinante sozinha não induziu a perda significativa depeso no presente modelo animal (as experiências piloto).

Desse modo, a administração simultânea de Leptina e GLP-I ouseus análogos, PYY ou amilina, pode ser utilizada notratamento da obesidade ou do diabetes.

Por exemplo, tal como mostrado nos exemplos abaixo,uma proteína de fusão GLPl-Fc-Ieptina não somente mantém aatividade de diminuição da glicose de GLP-I, mas tambémmantém a atividade de perda de peso da Leptina. Além disso,ela tem uma vida biológica muito mais longa ou um efeitoterapêutico muito, mais duradouro do que o análogo de GLP-I E4Byetta.

Leptina

A leptina, por exemplo, N°. de Acesso no GenBankNP 000221, é um hormônio derivado de adipose, um sensornutriente chave que regula a ingestão alimentar e o pesocorpóreo. A leptina recombinante é um agente eficaz para aperda de peso em animais pequenos. No entanto, o tratamentocom leptina em seres humanos obesos foi restringido a poucosindivíduos que sofrem de deficiência congênita de leptina.

Obviamente, a própria leptina não é um agente terapêuticohumano preponderante. Por outro lado, a regulação do apetitehumano, a ingestão alimentar e a perda de peso podem serregulados por mais de um fator. Tal como descrito na presenteinvenção, o uso de leptina como um parceiro de fusãofuncional para ampliar a vida biológica de outros agentesterapêuticos relacionados ao diabetes ou à perda de peso podeter valores terapêuticos adicionais.

A leptina a ser utilizada dentro da presenteinvenção pode ser selecionada a partir da proteína humana oumurina recombinante tal como determinado no Pedido de PatenteU.S. 20030203837 e Zhang et al. (Nature, 1994, 372:425-432;aqui incorporado a título de referência) ou aquelas que nãotêm um resíduo de glutaminila na posição 28 (Zhang et al. ,acima, na página 428) . Também é possível utilizar o análogohumano recombinante da proteína de Leptina tal comodeterminado no Pedido de Patente U.S. 20030203837 (SEQ IDNO. : 4 no mesmo) , que contém (1) uma arginina no lugar dalisina na posição 35 e (2) uma leucina no lugar da isoleucinana posição 74.

A proteína de Leptina murina é substancialmentehomóloga à Leptina humana, particularmente como uma proteínamadura, e, adicionalmente, particularmente no N-terminal.Pode-se preparar um análogo de proteína humana recombinanteao alterar (tal como substituir resíduos de aminoácido) , naseqüência humana recombinante, os aminoácidos que divergem daseqüência de murino. Uma vez que a proteína humanarecombinante tem atividade biológica em camundongos, talanálogo deve ser provavelmente ativo em seres humanos. Porexemplo, ao utilizar uma proteína humana que tem uma lisinano resíduo 35 e uma isoleucina no resíduo 74 de acordo com anumeração da SEQ ID NO.: 1, pode-se substituir por umaminoácido um ou mais dos aminoácidos nas posições 32, 35,50, 64, 68, 71, 74, 77, 89, 97, 100, 105, 106, 107, 108, 111,118, 136, 138, 142 e 145. Pode-se selecionar o aminoácido naposição correspondente da proteína murina.

A proteína de Leptina de rato (Murakami et al. ,Biochem. Biophys. Res. Comm. 1995; 209:944-952) ou a proteínade Leptina de macaco rhesus (Pedido de Patente U.S.20030203837) também pode ser utilizada. Essas proteínas deLeptina diferem da proteína de Leptina humana em uma série deposições. Pode-se substituir por um outro aminoácido um oumais dos aminoácidos nessas posições divergentes paraproduzir Leptina análoga. Outros análogos podem serpreparados ao suprimir uma parte da seqüência de aminoácidoda proteína. Vide, por exemplo, o Pedido de Patente U.S.20030203837, que é incorporado a título de referência.

Peptídio 1 Similar a Glucagon

0 peptídio 1 similar a glucagon (GLP-I), porexemplo, aquele de N°. de Acesso no GenBank P01275, ésintetizado em células endócrinas intestinais em duas formasmoleculares principais como GLP-I (7-36) e GLP-I (7-37). 0peptídio foi identificado primeiramente depois da clonagem deDNAs e genes para o pró-glucagon. Os estudos iniciais daatividade biológica de GLP-I utilizaram as formas estendidasde GLP-I de N-terminal de comprimento cheio (aminoácidos 1-37e 1-36). As moléculas GLP-I grandes eram geralmentedesprovidas de atividade biológica. Posteriormente, em 1987,foi verificado que a remoção dos primeiros seis aminoácidosresultava em uma versão mais curta da molécula de GLP-I comatividade biológica substancialmente intensificada.

A maior parte do GLP-I biologicamente ativocirculante é o GLP-I (6-36), com pouca quantidade (7-37) daforma GLP-I bioativa também detectável. 0 N-terminal é umlocus importante para a regulação da atividade biológica deGLP-1, uma vez que a clivagem mediada pela peptidase dedipeptideíla (DPP-IV) na alanina da posição 2 conduz àdegradação do peptídio. Os análogos de GLP-I com a alanina daposição 2 substituídos pela glutamina ou valina sãoresistentes à DPP-IV.

0 GLP-I tem efeitos potencialmente benéficosantidiabetes e antiobesidade. Por exemplo, retarda oesvaziamento gástrico, que mitiga a hiperglicemia após asrefeições; restringe o apetite; inibe a ingestão alimentar; ecausa o crescimento das células beta. Esses efeitos são degrande interesse para as empresas farmacêuticas. A AmylinPharmaceuticals está anunciando um análogo de GLP-I utilizadopara indicações relacionadas ao diabetes e ã obesidade. ANovo-Nordisk desenvolveu um outro GLP-I de ação prolongada.Pelo menos outras cinco empresas têm agora análogos de GLP-Iem desenvolvimento, incluindo o GLP-I Fundido com Albuminahumana da Science Genome.

Peptídio YY e Amilina

Além dos análogos de GLP-I, o peptídio YY (porexemplo, N°. de Acesso no GenBank P10082), amilina (porexemplo, N°. de Acesso no GenBank P10997) e muitos outrospolipeptídios ou proteínas também são agentes "antiobesidade"ou "antidiabetes" potenciais e podem ser fundidos à leptinapara ampliar as suas vidas biológicas e para ter ação aditivaou mais do que aditiva ou sinergística como uma moléculaquimérica. De fato, a Amylin Pharmaceuticals está atualmenteanunciando a amilina (nome comercial Smylin) para· indicaçõesrelacionadas ao diabetes e à obesidade.

Tal como descrito na presente invenção, uma sériede proteínas de fusão de Leptina e proteínas antiobesidadesão geradas. Os exemplos das mesmas incluem uma forma demonômero de GLP-l-3xGly-Leptin (SEQ ID NO.: 4), uma forma dedímero de GLP-l-3xGly-IgG'Fc-Ieptina (SEQ ID NO.: 5), (G8- ouV8-GLP-)-aglutinante-Leptina (SEQ ID NO.: 10), uma forma dedímero de análogos de GLP-I (G8- ou V8-GLP-1)-aglutinante-IgGl Fc-Ieptina (SEQ ID NO.: 11). Além disso, o peptídio YY(3-36)-3-36)-aglutinante-Leptina (SEQ ID NO.: 12), uma formade dímero do peptídio YY (3-36)-aglutinante-IgGl Fc-Ieptina(SEQ ID NO.: 13), amilina-aglutinante-Leptina (SEQ ID NO.:14), uma forma de dímero de amilina-aglutinante-IgGl Fc-leptina (SEQ ID NO.: 15) também foram produzidos.Esses agentes terapêuticos quiméricos têm vantagensadicionais em comparação ao GLP-I e à leptina sozinhos. Porexemplo, os agentes quiméricos são mais estáveis in vivo doque a Leptina ou o GLP-I. 0 perfil de farmacocinética, adistribuição do tecido, os efeitos colaterais e a eficáciadas moléculas quiméricas são diferentes daqueles de um usosimultâneo de duas moléculas individuais, ou seja, leptinanativa ou análogos de leptina e de GLP-I.

Os análogos de Leptina, GLP-1, peptidio YY ouamilina (ou fragmentos biologicamente ativos dos mesmos)podem ser utilizados na presente invenção. A seqüência decada análogo difere da seqüência de tipo selvagem por uma oumais substituições conservadoras de aminoácidos ou por uma oumais substituições não-conservadoras de aminoácidos,eliminações ou inserções que não anulam a sua atividadebiológica. A seguinte tabela relaciona as substituições deaminoácidos apropriadas:

Tabela. Substituições Conservadoras de Aminoácidos

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A proteína de fusão descrita na presente invençãopode ser derivada pela fixação de uma ou mais porçõesquímicas à porção da proteína. Os derivados quimicamentemodificados podem ser adicionalmente formulados para vias deadministração intra-arterial, intraperitoneal, intramuscular,subcutânea, intravenosa, oral, nasal, pulmonar, tópica ououtras. Foi verificado que a modificação química de proteínasbiologicamente ativas fornece vantagens adicionais sobdeterminadas circunstâncias, tais como o aumento daestabilidade e do tempo de circulação da proteína terapêuticae a diminuição da imunogenicidade. Vide a Patente U.S. N°.4.179.337, Abuchowski et al. , em Enzymes as Drugs. (J. S.Holcerberg e J. Roberts, eds. pp. 367-383 (1981); Francis,Focus on Growth Factors 3:4-10 (maio de 1992) (publicado pelaMediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, Londres N2 0,OLD, Reino Unido).

As porções químicas apropriadas para aderivatização podem ser selecionadas a partir de váriospolímeros solúveis em água. O polímero selecionado deve sersolúvel em água de modo que a proteína à qual ele é unido nãose precipite em um ambiente aquoso. De preferência, para ouso terapêutico da preparação do produto final, o polímero éfarmaceuticamente aceitável. 0 elemento versado na técnicapoderá selecionar o polímero desejado com base emconsiderações tais como se o conjugado de polímero/proteínaserá utilizado terapeuticamente e, em caso afirmativo, adosagem desejada, o tempo de circulação, a resistência àproteólise e outras considerações. Para as proteínas epeptídios presentes, a eficácia da derivatização pode serverificada ao administrar o derivado, na forma desejada (istoé, por meio de bomba osmótica, ou, com mais preferência, porinjeção ou infusão, ou formulado adicionalmente para aaplicação oral, pulmonar ou nasal, por exemplo) e ao observaros efeitos biológicos tal como descrito na presente invenção.

Um polímero solúvel em água pode ser selecionado dogrupo que consiste, por exemplo, em polietileno glicol,copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carbóxi metilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano,

copolíraero de etileno/anidrido maléico, poliaminoácidos(homopolímeros ou copolímeros aleatórios ou não-aleatórios) edextrano ou poli(n-vinil pirrolidona) polietileno glicol,homopo1íme ros de propileno glicol, copolímeros de óxido depolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados,maleato de poliestireno e álcool polivinílico. 0propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens demanufatura devido à sua estabilidade em água.

As proteínas de fusão podem ser adicionalmenteunidas aos poliaminoácidos para aumentar a vida média decirculação da proteína. Para as presentes finalidadesterapêuticas ou cosméticas, tal poliaminoácido deve seraquele que não crie uma resposta antigênica neutralizante ououtra resposta adversa. Tal poliaminoácido pode serselecionado do grupo que consiste em albumina do soro (talcomo a albumina do soro humana) , um anticorpo ou porção domesmo (como uma região constante do anticorpo, isto é, aregião de Fc), ou outros poliaminoácidos.

O polímero pode ter qualquer peso molecular e podeser ramificado ou não-ramifiçado. Para o polietileno glicol,o peso molecular preferido fica compreendido entreaproximadamente 2 kDa e aproximadamente 100 kDa (o termo"aproximadamente" indica que, nas preparações de polietilenoglicol, algumas moléculas pesarão mais, outras menos, do queo peso molecular indicado) para facilidade de manipulação ede manufatura. Outros tamanhos podem ser utilizados,dependendo do perfil terapêutico desejado (por exemplo, aduração da liberação prolongada desejada, os efeitos, sehouver algum, na atividade biológica, a facilidade demanipulação, o grau ou a falta de antigenicidade e outrosefeitos conhecidos do polietileno glicol a uma proteínaterapêutica ou análogo).

O número de moléculas do polímero unido dessamaneira pode variar e o elemento versado na técnica poderáverificar o efeito na função. Pode-se monoderivatizar ouprover, para uma di-, tri-, tetra-derivatização ou algumacombinação de derivatização, com a mesma porção ou comporções químicas diferentes (por exemplo, polímeros, taiscomo pesos diferentes de polietileno glicóis). A proporçãoentre as moléculas do polímero e as moléculas da proteína (oudo peptídio) irá variar, bem como as suas concentrações namistura de reação. Em geral, a razão mais favorável (emtermos de eficiência de reação pelo fato de que não hánenhuma proteína ou polímero não-reagido adicional) serádeterminada por fatores tais como o grau desejado dederivatização (por exemplo, mono, di-, tri-, etc.), o pesomolecular do polímero selecionado, se o polímero é ramificadoou não-ramificado, e as condições da reação.

As porções químicas devem ser unidas à proteína emconsideração aos efeitos sob os domínios funcionais ouantigênicos da proteína. Há uma série de métodos de fixaçãodisponíveis aos elementos versados na técnica. Por exemplo, aPatente EP 0 4 01 3 84 aqui incorporada a título de referência(acoplamento do PEG a G-CSF) , vide também Malik et al. , Exp.Hematol. 20:1028-1035 (1992) (com referência à peguilação deGM-CSF utilizando cloreto de tresila). Por exemplo, opolietileno glicol pode ser ligado de modo covalente aresíduos de aminoácido através de um grupo reativo, tal comoum grupo amino ou um grupo carboxila livre. Os gruposreativos são aqueles aos quais uma molécula ativada depolietileno glicol pode ser ligada. Os resíduos de aminoácidoque têm um grupo amino livre podem incluir resíduos de lisinae resíduos de aminoácido de N-terminal. Aqueles que têm umgrupo carboxila livre podem incluir resíduos de ácidoaspártico, resíduos de ácido glutâmico e resíduos deaminoácido de C-terminal. Os grupos sulfidrila também podemser utilizados como um grupo reativo ao unir a(s) molécula(s)de polietileno glicol. Para finalidades terapêuticas, afixação em um grupo amino é a preferida, tal como a fixaçãono N-terminal ou no grupo lisina. A fixação em resíduos,importante para a ligação do receptor, deve ser evitada se aligação do receptor for desejada.

Pode-se desejar especificamente a proteínaquimicamente modificada N-terminalmente. Utilizando opolietileno glicol como uma ilustração das presentescomposições, pode-se fazer a seleção a partir de umavariedade de moléculas de polietileno glicol (por pesomolecular, ramificação, etc.), a proporção entre as moléculasde polietileno glicol e as moléculas de proteína na misturade reação, o tipo de reação de peguilação a ser executada e ométodo de obtenção da proteína peguilada N-terminalmenteselecionada. 0 método para a obtenção do preparado N-terminalmente peguilado (isto é, separar esta porção de outraporção monopeguilada, caso necessário) pode ser executadopela purificação do material N-terminalmente peguilado de umapopulação de moléculas de proteína peguiladas. A modificaçãoquímica de N-terminal seletiva pode ser realizada pelaalquilação redutiva, a qual explora a reatividade diferencialde tipos diferentes de grupos amino primários (lisina contrao N-terminal) disponíveis para a derivatização em umaproteína particular. Sob condições de reação apropriadas, aderivatização substancialmente seletiva da proteína no N-terminal com um grupo carbonila que contém o polímero éobtida. Por exemplo, pode-se peguilar seletivamente aproteína N-terminalmente ao executar a reação a um pH quepermita que se beneficie das diferenças de pKa entre o grupoepsilon-amino dos resíduos de lisina e aquele do grupo aminodo resíduo de N-terminal da proteína. Por meio de talderivatização seletiva, a fixação de um polímero solúvel emágua a uma proteína é controlada: a conjugação com o polímeroocorre predominantemente no N-terminal da proteína e nenhumamodificação significativa de outros grupos reativos, taiscomo os grupos amino de cadeia lateral de lisina, ocorre.Utilizando a alquilação redutiva, o polímero solúvel em águapode ser do tipo descrito acima e deve ter um único aldeídoreativo para se acoplar à proteína. 0 propionaldeído depolietileno glicol, que contém um único aldeído reativo, podeser utilizado.

Um derivado N-terminalmente monopeguilado épreferido para facilidade de produção de um produtoterapêutico. A peguilação de N-terminal assegura um produtohomogêneo, uma vez que a caracterização do produto ésimplificada relativamente aos produtos di-, tri- ou multi-peguilados. 0 uso do processo de alquilação redutiva acimapara a preparação de um produto de N-terminal é o preferidopara facilidade de manufatura comercial.

Contudo, em um outro aspecto da presente invenção,são apresentados métodos de uso das composições farmacêuticasdas proteínas e derivados. Tais composições farmacêuticaspodem ser para a administração por via oral, pulmonar, nasal,transdermal ou por injeção, ou por meio de outras formas deadministração. Em geral, são englobadas pela invenção ascomposições farmacêuticas que compreendem quantidadeseficazes de proteína ou de produtos derivados da invençãojuntamente com diluentes, conservantes, solubilizantes,emulsificantes, veículos e/ou adjuvantes farmaceuticamenteaceitáveis. Tais composições incluem diluentes com váriosteores de tampão (por exemplo, Tris-HCI, acetato, fosfato),pH e resistência iônica; aditivos tais como agentesdetergentes e solubilizantes (por exemplo, Tween 80,polissorbato 80), antioxidantes (por exemplo, ácidoascórbico, metabissulfito de sódio), conservantes (porexemplo, Thimersol, álcool benzilico) e substâncias paraconferir volume (por exemplo, lactose, manitol); incorporaçãodo material em preparados em partículas de compostospolímericos tais como o ácido poliláctico, ácidopoliglicólico, etc. ou em lipossomas. 0 ácido hialurônicotambém pode ser utilizado, e este pode ter o efeito depromover a duração prolongada na circulação. Tais composiçõespodem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa deliberação in vivo e a taxa de depuração in vivo das proteínaspresentes e derivados. Vide, por exemplo, Remington'sPharmaceutical Sciences, 18a Ed. (1990, Mack Publishing Co.,Easton, Pa. 18042) páginas 1435-1712, que é aqui incorporadoa título de referência. As composições podem ser preparadasna forma líquida ou ainda em pó seco, tal como na formaliofilizada. Formulações de liberação prolongada implantáveistambém são contempladas, bem como as formulaçõestransdermais.

São contempladas para o uso na presente invenção asformas de dosagem sólidas orais, que são descritas geralmenteem Remington-s Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. 1990 (MackPublishing Co. Easton. Pa. 18042) no Capítulo 89, que é aquiincorporado a título de referência. As formas de dosagemsólidas incluem comprimidos, cápsulas, pílulas, trochas oupastilhas, cápsulas em forma de disco ou pelotas. Além disso,a encapsulação lipossomal ou proteinóide pode ser utilizadapara formular as presentes composições (Patente U.S. N°.4.925.673). A encapsulação lipossomal pode ser utilizada e oslipossomas podem ser derivatizados com vários polímeros (porexemplo, Patente U.S. N° . 5.013.556). Uma descrição dasformas de dosagem sólidas possíveis para a terapêutica éfornecida por Marshall, K. Em: Modern Pharmaceutics editadopor G. S. Banker e C. T. Rhodes Capitulo 10, 197 9, aquiincorporado a titulo de referência. Em geral, a formulaçãoirá incluir a proteína (ou análogo ou derivado) e osingredientes inertes que permitem proteção contra o ambienteestomacal e a liberação do material biologicamente ativo nointestino.

Também são contempladas especificamente as formasde dosagem orais das proteínas acima derivatizadas. Aproteína pode ser quimicamente modificada de modo que aaplicação oral do derivado seja eficaz. Geralmente, amodificação química contemplada é a fixação de pelo menos umaporção à própria molécula de proteína (ou de peptídio), ondea dita porção permite (a) a inibição da proteólise e (b) acaptação na corrente sangüínea a partir do estômago ou dosintestinos. Também são desejados o aumento da estabilidadetotal da proteína e o aumento do tempo de circulação nocorpo. Os exemplos de tais porções incluem: polietilenoglicol, copolímeros de etileno glicol e de propileno glicol,carbóxi metil celulose, dextrano, álcool polivinílico,polivinil pirrolidona e poliprolina. Abuchowski e Davis,Soluble Polymer-Enzyme Adducts. Em: "Enzymes as Drugsn,Hocenberg e Roberts, eds., Wiley-Interscience, Nova York,N.Y., (1981), PP 367-383; Newmark, et al., J.Appl. Biochem.4:185-189 (1982). Outros polímeros que poderiam serutilizados são o poli-1,3-dioxolano e o poli-1,3,6-tioxocano.

Para a proteína (ou derivado), a posição deliberação pode ser o estômago, o intestino delgado (oduodeno, o jejuno ou o íleo) ou o intestino grosso. 0elemento versado na técnica tem formulações disponíveis quenão serão dissolvidas no estômago; entretanto, elas irãoliberar o material no duodeno ou em outra parte do intestino.

De preferência, a liberação irá evitar os efeitos ambientaisprejudiciais do estômago, tanto pela proteção da proteína (ouderivado) quanto pela liberação do material biologicamenteativo além do ambiente estomacal, bem como no intestino.

A fim de assegurar a resistência gástrica completa,um revestimento impermeável a um pH de pelo menos 5,0 éessencial. Os exemplos de ingredientes inertes mais comunsque são utilizados como revestimentos entéricos incluem oacetato de trimelitato de celulose (CAT), ftalato de hidróxipropil metil celulose (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, acetato deftalato de polivinila (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric,acetato de ftalato de celulose (CAP), Eudragit L, Eudragit Se Shellac. Esses revestimentos podem ser utilizados comopelículas misturadas.

Um revestimento ou uma mistura de revestimentostambém pode ser utilizada nos comprimidos, que não se prestamà proteção contra o estômago. Isto pode incluir revestimentosde açúcar ou revestimentos que tornam o comprimido mais fácilde engolir. As cápsulas podem consistir em um revestimentoduro (tal como de gelatina) para a aplicação terapêuticaseca, isto é, em pó; para formas líquidas, um revestimento degelatina mole pode ser utilizado. 0 material de revestimentodas cápsulas em forma de disco pode ser amido denso ou outropapel comestível. Para as pílulas, pastilhas, comprimidosmoldados ou produtos triturados em comprimidos, técnicas emmassa a úmido podem ser utilizadas.

0 produto terapêutico pode ser incluído naformulação como multiparticulas finas em forma de grânulos oupelotas com um tamanho de partícula de aproximadamente 1 mm.

A formulação do material para a administração da cápsulatambém pode ser como um pó, levemente comprimido ou ainda emtabletes. O produto terapêutico pode ser preparado por meiode compressão.

Todos os agentes corantes e flavorizantes podem serincluídos. Por exemplo, a proteína (ou derivado) pode serformulada (tal como pela encapsulação de lipossoma ou demicroesfera) e então pode ser adicionalmente contida em umproduto comestível, tal como uma bebida refrigerada quecontém agentes corantes e flavorizantes.

Pode-se diluir ou aumentar o volume do produtoterapêutico com um material inerte. Esses diluentes podemincluir carboidratos, especialmente o manitol, alfa-lactose,lactose anidra, celulose, sacarose, dextranos modificados eamido. Determinados sais inorgânicos também podem serutilizados como cargas, incluindo o trifosfato de cálcio,carbonato de magnésio e cloreto de sódio. Alguns diluentescomercialmente disponíveis incluem Fast-Fio, Emdex, STA-Rx1500, Emcompress e Avicell.

Os desintegrantes podem ser incluídos na formulaçãodo produto terapêutico em uma forma de dosagem sólida. Osmateriais utilizados como desintegrantes incluem, mas semficar a eles limitados, o amido, incluindo o desintegrantecomercial com base em amido, Explotab. Glicolato de amido desódio, Amberlite, carbóxi metil celulose sódica,ultramilopectina, alginato de sódio, gelatina, casca delaranja, carbóxi metil celulose ácida, esponja natural ebentonita podem ser utilizados. Uma outra forma dedesintegrantes são as resinas de troca catiônica insolúveis.

As gomas em pó podem ser utilizadas como desintegrantes ecomo aglutinantes, e estas podem incluir gomas em pó taiscomo ágar, caraia ou tragacanto. 0 ácido algínico e seu salde sódio também são úteis como desintegrantes.

Os aglutinantes podem ser utilizados para manter oagente terapêutico para a formação de um comprimido duro epara incluir materiais dos produtos naturais tais comoacácia, tragacanto, amido e gelatina. Outros incluem a metilcelulose (MC), etil celulose (EC) e carbóxi metil celulose(CMC). A polivinil pirrolidona (PVP) e a hidróxi propil metilcelulose (HPMC) podem ser utilizadas em soluções alcoólicaspara a granulação do produto terapêutico.

Um agente antifriccional pode ser incluído naformulação do produto terapêutico para impedir furos duranteo processo de formulação. Os lubrificantes podem serutilizados como uma camada entre o produto terapêutico e orevestimento da matriz e estes podem incluir, mas sem ficar aeles limitados, o ácido esteárico, que inclui seus sais demagnésio e de cálcio, politetrafluoroetileno (PTFE), parafinalíquida, óleos vegetais e ceras. Os lubrificantes solúveistambém podem ser utilizados, tais como o lauril sulfato desódio, lauril sulfato de magnésio, polietileno glicol devários pesos moleculares, Carbowax 4000 e 6000.

Agentes deslizantes que podem incrementar aspropriedades de fluxo da droga durante a formulação e ajudarno rearranjo durante a compressão podem ser adicionados. Osagentes deslizantes podem incluir amido, talco, sílicapirogênica e aluminato de sílica hidratado.

Para ajudar na dissolução do produto terapêutico emambiente aquoso, um tensoativo pode ser adicionado como umagente de umidificação. Os tensoativos podem incluirdetergentes aniônicos tais como lauril sulfato de sódio,dioctil sulfosuccinato de sódio e dioctil sulfonato de sódio.

Os detergentes catiônicos podem ser utilizados e podemincluir cloreto de benzalcônio ou cloreto de benzetômio. Alista de detergentes não-iônicos potenciais que podem serincluídos na formulação como tensoativos inclui lauromacrogol400, estearato de polioxila 40, óleo de rícino hidrogenado depolioxietileno 10, 50 e 60, monoestearato de glicerol,polissorbato 40, 60, 65 e 80, éster de ácido graxo desacarose, metil celulose e carbóxi metil celulose. Estestensoativos podem estar presentes na formulação da proteínaou derivado sozinho ou como uma mistura em relaçõesdiferentes.

Os aditivos que intensificam potencialmente acaptação da proteína (ou derivado) são, por exemplo, osácidos graxos: ácido oléico, ácido linoléico e ácidolinolênico.

A formulação de liberação controlada pode serdesejável. A droga pode ser incorporada em uma matriz inerteque permite a liberação por meio de mecanismos de difusão oulixiviamento, isto é, gomas. Matrizes que se degeneramlentamente também podem ser incorporadas na formulação. Umaoutra forma de liberação controlada deste produto terapêuticoé por meio de um método com base no sistema terapêutico deOros (Alza Corp.), isto é, a droga é incluída em uma membranasemipermeável que permite que a água entre e puxe a drogapara fora através de uma única abertura pequena devido aosefeitos osmóticos. Alguns revestimentos entéricos também têmum efeito de liberação retardada.

Outros revestimentos podem ser utilizados para aformulação. Estes incluem uma variedade de açúcares que podemser aplicados em um recipiente de revestimento. Um agenteterapêutico também pode ser empregado em um comprimidorevestido por película e os materiais utilizados neste casosão divididos em dois grupos. 0 primeiro grupo são osmateriais não-entéricos e incluem a metil celulose, etilcelulose, hidróxi etil celulose, metil hidróxi etil celulose,hidróxi propil celulose, hidróxi propil metil celulose,carbóxi metil celulose sódica, povidona e polietilenoglicóis. 0 segundo grupo consiste em materiais entéricos quesão geralmente ésteres de ácido ftálico.

Uma mistura de materiais pode ser utilizada paraobter a melhor película de revestimento. 0 revestimento dapelícula pode ser realizado em um recipiente revestidor, emum leito fluidizado ou por revestimento por compressão.

Também é contemplado na presente invenção um novosistema de aplicação oral da presente proteína ou derivado damesma através de um sistema de expressão de bactérias deácido láctico do tipo alimentar. Um gene que codifica umaproteína de fusão pode ser reconstruído no plasmídio deexpressão do tipo alimentar pLEB590 e pLEB600 (Timo Takala,tese de PhD, ISBN 952-10-2260-4; disponível em http://ethesis.helsinki.fi) onde uma seqüência líder de secreçãoeficaz tal como usp45 é incorporada em seu N-terminal. 0plasmídio reconstruído pode ser adicionalmente transferidonas bactérias de ácido láctico do tipo alimentar para aexpressão e proliferação. As bactérias de ácido lácticotransformadas que expressam a proteína de fusão secretada talcomo GLPl-Ieptina podem ser congeladas a seco para aaplicação oral. As bactérias de ácido láctico são resistentesa ácidos e podem facilmente passar pela barreira do estômagocom pH baixo e podem permanecer no intestino por dias. Asproteínas de fusão secretadas podem ser absorvidas nointestino diretamente para a eficácia.

Também é contemplada na presente invenção aaplicação pulmonar da presente proteína ou derivado da mesma.Uma proteína de fusão é aplicada aos pulmões de um mamíferoao inalar e atravessa, através do revestimento epitelial dopulmão, a corrente sangüínea. Vide, por exemplo, Adjei etal., Pharmaceutical Research 1990, 7:565-569; Adjei et al. ,International Journal of Pharmaceutics 1990, 63:135-144;Braquet et al. , Journal of Cardiovascular Pharmacology 1989,13 (supl. 5): S. 143-146; Hubbard et al. , Annals of InternaiMedicine 1989, 3:206-212; Smith et al. , J. Clin. Invest.1989, 84:1145-1146; Oswein et al. "Aerosolization ofProteins", Procedimento do Simpósio sobre a Aplicação deDroga Respiratória II, Keystone, Colo., 1990, março; Debs etal. , The Journal of Immunology 1998, 140:3482-3488, e aPatente U.S. N°. 5.284.656.

É contemplada para o uso na prática da presenteinvenção uma ampla gama de dispositivos mecânicos projetadospara a aplicação pulmonar de produtos terapêuticos, incluindosem ficar a eles limitados, nebulizadores, inaladores commedidor de dose e inaladores em pó, os quais são conhecidospelos elementos versados na técnica.

Alguns exemplos específicos de dispositivoscomercialmente disponíveis apropriados para a prática dapresente invenção incluem o nebulizador Ultravent,manufaturado pela Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Mo.; onebulizador Acorn II, manufaturado pela Marquest MedicaiProducts, Englewood, Colo.; inalador com medidor de doseVentolin, manufaturado pela Glaxo Inc., Research TrianglePark, N.C.; e o inalador em pó Spinhaler, manufaturado pelaFisons Corp., Bedford, Mass.

Todos tais dispositivos requerem o uso deformulações apropriadas para aplicar a proteína (ou análogoou derivado). Tipicamente, cada formulação é específica aotipo de dispositivo empregado e pode envolver o uso de ummaterial propelente apropriado, além de diluentes, adjuvantese/ομ veículos úteis na terapia.

A proteína (ou derivado) deve ser preparadavantajosamente na forma de partículas com um tamanho médio departícula de menos de 10 μπι (ou micra) , com mais preferênciade 0,5 a 5 μτη, para uma aplicação mais eficaz ao pulmãodistai.

Os veículos incluem carboidratos tais comotrealose, manitol, xilitol, sacarose, lactose e sorbitol.

Outros ingredientes para o uso nas formulações podem incluemDPPC, DOPE, DSPC e DOPC. Tensoativos naturais ou sintéticospodem ser utilizados. 0 polietileno glicol pode ser utilizado(mesmo além de seu uso na derivatização da proteína ouanálogo). Dextranos, tais como o ciclodextrano, podem serutilizados. Sais de bile e outros intensificadoresrelacionados podem ser utilizados. Celulose e derivados decelulose podem ser utilizados. Aminoácidos podem serutilizados, tal como o uso em uma formulação com tampão.

Além disso, o uso de lipossomas, microcápsulas oumicroesferas, complexos de inclusão ou outros tipos deveículos é contemplado.

As formulações apropriadas para o uso com umnebulizador, tanto a jato quanto ultra-sônico, irãocompreender tipicamente a proteína (ou o derivado) dissolvidaem água até uma concentração de aproximadamente 0,1 a 25 mgda proteína biologicamente ativa por ml de solução. Aformulação também pode incluir tampão e um açúcar simples(por exemplo, para a estabilização da proteína e regulação dapressão osmótica). A formulação do nebulizador também podeconter um tensoativo, para reduzir ou impedir a agregação daproteína induzida pela superfície causada pela atomização dasolução na formação do aerossol.

As formulações para uso com um dispositivo deinalador com medidor de dose irão compreender geralmente umpó finamente dividido que contém a proteína (ou o derivado)suspensa em um propulsor com o auxílio de um tensoativo. 0propulsor pode ser qualquer material convencional empregadopara esta finalidade, tal como um clorofluorocarbono,hidroclorofluorocarbono, hidrofluorocarbono ouhidrocarboneto, que inclui o triclorofluorometano,diclorodifluorometano, diclorotetrafluoroetanol e 1,1,1,2-tetrafluoroetano, ou as combinações dos mesmos. Ostensoativos apropriados incluem o trioleato de sorbitano e alecitina de soja. O ácido oléico também pode ser útil comotensoativo.

As formulações para aplicar um dispositivo deinalador em pó compreenderão um pó seco finamente divididoque contém a proteína (ou o derivado) e podem incluir tambémum agente de avolumação, tal como Iactose, sorbitol,sacarose, manitol, trealose ou xilitol em quantidades quefacilitam a dispersão do pó a partir do dispositivo, porexemplo, 50 a 90% em peso da formulação.

A aplicação nasal da proteína (ou análogo ouderivado) também é contemplada. A aplicação nasal permite apassagem da proteína à corrente sangüínea diretamente após aadministração do produto terapêutico ao nariz, sem anecessidade de deposição do produto no pulmão. As formulaçõespara a aplicação nasal incluem aquelas com dextrano ouciclodextrano. A aplicação por meio do transporte através deoutras membranas mucosas também é contemplada.

Dentro do âmbito da presente invenção é incluído ummétodo para o tratamento de diabetes ou da obesidade aoadministrar a um indivíduo com necessidade do mesmo umaquantidade eficaz da proteína de fusão da presente invenção.

Os indivíduos a serem tratados podem ser identificados comotendo ou em risco de adquirir uma condição caracterizada comodiabetes ou obesidade. Esse método pode ser executado sozinhoou conjuntamente com outras drogas ou terapia. 0 termo"tratamento" refere-se à administração de uma composição a umindivíduo para a finalidade de curar, aliviar, amenizar,remediar, impedir ou melhorar um distúrbio, sintoma dodistúrbio, estado da doença secundário ao distúrbio oupredisposição para o distúrbio. Uma "quantidade eficaz" é umaquantidade da composição que pode produzir um resultadomedicamente desejável em um indivíduo tratado. 0 resultadomedicamente desejável pode ser objetivo (isto é, mensurávelpor algum teste ou marcador) ou subjetivo (isto é, oindivíduo dá uma indicação ou sente um efeito).

Um indivíduo a ser tratado pode ser identificadocomo com necessidade de tratamento para um ou mais dosdistúrbios observados acima. A identificação de um indivíduocom necessidade de tal tratamento pode depender do julgamentode um indivíduo ou profissional de saúde e pode ser subjetiva(por exemplo, opinião) ou objetiva (por exemplo, por ummétodo de teste ou de diagnóstico).

Em uma abordagem in vivo, uma composiçãoterapêutica (por exemplo, uma composição que contém umaproteína de fusão da invenção) é administrada ao indivíduo.Geralmente, a proteína é suspensa em um veículofarmaceuticamente aceitável (por exemplo, solução salinafisiológica) e administrada oralmente ou por meio de infusãointravenosa, ou injetada ou implantada subcutaneamente,intramuscularmente, intratecalmente, intraperitonealmente,intra-retalmente, intravaginalmente, intranasalmente,intragastricamente, intratraquealmente ou intrapulmonarmente.

A dosagem requerida depende da escolha da via deadministração; da natureza da formulação; da natureza dadoença do indivíduo; do tamanho, do peso, da área desuperfície, da idade e do sexo do indivíduo; de outras drogasque estão sendo administradas; e do julgamento do médicoatendente. As dosagens apropriadas ficam compreendidas nafaixa de 0,01-100,0 mg/kg. Deve-se esperar variações dedosagem necessárias em vista da variedade de composiçõesdisponíveis e das eficiências diferentes de várias vias deadministração. Por exemplo, espera-se que a administraçãooral requeira dosagens mais elevadas do que a administraçãopor injeção intravenosa. Variações nestes níveis de dosagempodem ser ajustadas utilizando rotinas empíricas padrão paraa otimização, tal como é bem compreendido no estado datécnica. A encapsulação da composição em um veículo deaplicação apropriado (por exemplo, micropartículaspoliméricas ou dispositivos implantáveis) pode aumentareficiência da aplicação, particularmente para a aplicaçãooral.

A eficácia de uma composição da presente invençãopode ser avaliada in vitro e in vivo. Vide, por exemplo, osexemplos abaixo. Resumidamente, a composição pode ser testadaquanto à sua eficácia in vitro. Para estudos in vivo, acomposição pode ser injetada em um animal (por exemplo, ummodelo de rato) e seus efeitos terapêuticos são entãoatingidos. Com base nos resultados, uma faixa de dosagem euma via de administração apropriada podem ser determinadas.

Os presentes métodos podem ser utilizadosconjuntamente com outros medicamentos, tais como aquelesúteis para o tratamento do diabetes (por exemplo, a insulinae possivelmente a amilina), medicamentos para diminuição docolesterol e da pressão arterial (tais como aqueles quereduzem os níveis de lipidios no sangue ou outrosmedicamentos cardiovasculares) e medicamentos para o aumentoda atividade (por exemplo, afetaminas). Supressores deapetite também podem ser utilizados. Tal administração podeser simultânea ou em seqüência.

Além disso, os presentes métodos podem serutilizados conjuntamente com procedimentos cirúrgicos, taiscomo as cirurgias plásticas destinadas a alterar a aparênciatotal de um corpo (por exemplo, as cirurgias de lipoaspiraçãoou a laser destinadas a reduzir a massa corpórea ou cirurgiasde implante destinadas a aumentar a aparência da massacorpórea). Os benefícios à saúde das cirurgias cardíacas,tais como as cirurgias de desvio ou outras cirurgiasdestinadas a aliviar uma condição deletéria causada pelobloqueio de vasos sangüíneos por depósitos de gordura, taiscomo placa arterial, podem ser aumentados com o usoconcomitante das presentes composições e métodos. Os métodospara eliminar cálculos biliares, tais como os métodos ultra-sônicos ou a laser, também podem ser utilizados antes,durante ou após o curso dos presentes métodos terapêuticos.

Os exemplos abaixo devem ser interpretados comomeramente ilustrativos e não-limitadores do restante dadescrição de qualquer maneira possível. Sem elaboraçãoadicional, acredita-se que o elemento versado na técnicapossa, com base na descrição da presente invenção, utilizar apresente invenção em toda a sua extensão. Todas aspublicações citadas na presente invenção são incorporadas atítulo de referência em sua totalidade.

Exemplo 1

Construtos que codificam as proteínas de fusão GLP-1-Fc-leptina e GLP-l-3G-leptina foram preparados.

Especificamente, o cDNA de EcorRI-tPA-GLP-l-3xGly-leptin-Not I é sintetizado primeiramente por um fornecedor deserviço comercial (Genscript) e digerido com EcoRI e Not I. Aseqüência de fusão resultante (SEQ ID NO.: 6) foi entãoclonada em um vetor de expressão de mamífero com base em CMVρCA, pCApuro e pCAdhfr para a expressão de mamífero.

Para construir um vetor de expressão que codificaGLP-I-3xGly-IgGl Fc-Ieptina (SEQ ID NO.: 5), um método de PCRde múltiplas etapas padrão foi utilizado pra gerar aseqüência de codificação (SEQ ID NO.: 7). Em resumo, aseqüência de fusão acima (SEQ ID NO.: 6) e o cDNA de IgGl Fc(SEQ ID NO. : 8) foram utilizados como moldes para a PCR. Osprimers foram projetados para sintetizar três fragmentos desobreposição de GLP-I, IgGl Fc e leptina. Esses fragmentosforam combinados para elaborar a seqüência final (SEQ ID NO.:7) por meio de reações de PCr de duas etapas. A seqüência defusão resultante incluiu uma seqüência de Kozae, umaseqüência de sinal de tPA em seu cDNA GLP-l-3xGly-IgGl Fc-leptina de N-terminal. Essa seqüência foi ligada ao vetor deexpressão de mamífero com base em CMV pCApuro e pCAdhfr paraa expressão de mamífero.

Exemplo 2

As proteínas de fusão GLP-l-3xGly-IgG Fc-Ieptina eGLP-1-3G-leptina foram expressas em células de CHO que foramcultivadas em uma suspensão livre de soro. Os dois construtosdescritos acima foram expressos em uma linhagem de células deCHO por meio de um método padrão. 0 sinal de secreção de tPA(SEQ ID NO.: 9) dirigiu a proteína de fusão expressa no meiocultivado. 0 meio de cultura de cada clone de célula foicoletado e submetido à análise de transferência dotutilizando anticorpos de fragmentos de Fc anti-humanos decoelho (PIERCE, Produto # 0031423). Foi verificado que umasérie de clones de células expressa níveis elevados deproteínas de fusão.

Exemplo 3

GLP-l-3xGly-IgG Fc-Ieptina foi graduada na culturade suspensão livre de soro. Os títulos da expressão e arobustez dos clones que expressam GLP-l-3xGly-IgG Fc-Ieptina(SEQ ID NO. : 5) foram efetuados no meio livre de componentesanimais livre de soro em uma placa com 96 cavidades eseguidos por estudos com bateladas de alimentação em umfrasco com agitador de 125 ml. Os clones que têm níveis deexpressão elevados foram graduados em um recipiente decultura de suspensão de 4 litros contendo o meio livre decomponentes animais livre de soro. 0 título da expressão nomeio condicional foi estudado por transferência dot namaneira descrita acima. Foi verificado que a graduação foibem-sucedida.

Para produzir a proteína de fusão, os meios foramcoletados e filtrados. A proteína foi purificada utilizando aresina de afinidade com a proteína A (Repligen) e eluída pelotampão de 0,5 M de arginina-HCI ao pH 3,3. O volumepurificado foi formulado em um tampão contendo 1% dearginina-HCI, 5 mM de histidina, 0,1% de Tween-20 e 1% demanitol ao pH 5,0, e armazenado a -80°C.

As seguintes moléculas também foram construídas eexpressas de uma maneira similar àquela descrita acima. Essasmoléculas modificaram (1) GLP-I (G8-GLP-)-aglutinante(GGGSGGGS)-Leptina (SEQ ID NO.: 10); (2) a forma de dímero deGLP-I modificado (G8-GLP-1)-aglutinante (GGGGSGGGGS)-IgGl Fc-leptina (SEQ ID NO.: 11); (3) o peptídio YY (3-36)-3-36)-aglutinante-Leptina (SEQ ID NO.: 12); (4) a forma de dímerodo peptídio YY (3-36)-aglutinante-IgGl Fc-Ieptina (SEQ IDNO.: 13); (5) amilina-aglutinante-leptina (SEQ ID NO.: 14);(6) a forma de dímero de amilina-aglutinante-IgGl Fc-Ieptina(SEQ ID NO. : 15) ; (7) a forma de monômero de G8-GLPl-3Gly-leptina (SEQ ID NO.: 16); e (8) a forma de dímero de G8-GLPl-3xGly-IgGl Fc-Ieptina (SEQ ID NO.: 17).

Exemplo 4

GLP-l-3xGly-IgG Fc-Ieptina foi purificada. Os meiosdescritos acima foram filtrados e purificados utilizando acoluna de afinidade com a proteína A para ligação (Regeneron)e 0,5 M de arginina-HCI ao pH 3,5 para a eluição. A proteínapurificada foi estudada por SDS-PAGE em gel.

Exemplo 5

A GLP-l-3xGly-IgG Fc-Ieptina expressa foicaracterizada. A integridade molecular da proteína expressafoi determinada por transferência Western reduzida e não-reduzida utilizando IgGl Fc anti-humano de coelho conjugadocom HRP (PIERCE, Produto # 0031423), anticorpos de leptinaanti-humanos de cabra (R&D Systems, Cat# AF398) e anticorposde IgG anti-cabra bovinos conjugados com HRP (Santa CruzBiotechnology Inc., Cat # sc-2350), anticorpos GLP-I anti-coelho (Alpha Diagnostic International, Cat # GLP15-P) eanticorpos de IgG anti-coelho de cabra conjugados com HRP(Santa Cruz Biotechnology Inc., Cat # sc-2004). Foi

verificado que a GLP-l-3xGly-IgG Fc-Ieptina expressa foireconhecida por todos os anticorpos primários. Os resultadosdemonstram que de fato a GLP-l-3xGly-IgG Fc-Ieptina foiexpressa.

Exemplo 6

A atividade terapêutica de GLP-l-3xGly-IgG Fc-leptina foi estudada.

Primeiro, o teste de tolerância à glicoseintraperitoneal (ip GTT) foi realizado para testar a ação deGLPl-Fc-Ieptina na secreção de insulina dependente deglicose. Resumidamente, a glicose do sangue de camundongo foimedida utilizando tiras de glicose do sangue com um toque.Uma amostra de sangue foi obtida a partir de um camundongoatravés de sangramento da cauda. Em seguida, 0,04, 0,1 ou 0,2mg de GLPl-Fc-Ieptina ou do fragmento de IgGl Fc humano daproteína de controle foi injetado intraperitonealmente.Imediatamente após as injeções, 0,2 ml da solução aquosa deglicose saturada foi injetado ip no camundongo. Uma e duashoras depois, uma outra amostra de sangue foi coletada damesma maneira para a medição da glicose. Byetta (0,025 mg;nome comercial do análogo de GLP-I E4, Amylin PharmaceuticalsInc) foi utilizado como controle positivo. Os resultados sãoresumidos nas Tabelas 1-4 abaixo:

Tabela 1

Efeitos de Byetta no nível de glicose no sangue

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Tabela 2Efeitos de 0,04 mg de GLPl-Fc-Ieptina no nível de glicose nosangue

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Tabela 3

Efeitos de 0,1 mg de GLPl-Fc-Ieptina no nível de glicose nosangue

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Tabela 4

Efeitos de 0,2 mg de GLPl-Fc-Ieptina no nível de glicose nosangue

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Conforme mostrado na Tabela 1, as injeções deByetta, 0,1 mg de GLPl-Fe-Ieptina e 0,2 mg de GLPl-Fc-Ieptinainibiram significativamente os níveis de glicose no sangue (P< 0,01, 0,05 e 0,05, respectivamente). Os resultados acimademonstram que a GLPI-Fc-Ieptina pode ser utilizada paradiminuir os níveis de glicose no sangue de uma maneiradependente da dose.

A experiência acima foi repetida com GLPl-Fc-leptina (0,2 mg) no dia 1 antes do teste de tolerância àglicose. Um teste de tolerância à glicose ip foi conduzidoduas vezes no dia 1 e no dia 2, respectivamente. Osresultados são resumidos na Tabela 5 abaixo:

Tabela 5

Efeitos a longo prazo de 0,2 mg de GLPl-Fc-Ieptina no nívelde glicose no sangue

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Conforme mostrado na Tabela 5, uma injeção de 0,2mg de GLPl-Fc-Ieptina inibiu o nível de glicose no sangue edurou por pelo menos dois dias.

Os efeitos de GLPl-Fc-Ieptina no peso corpóreoforam estudados. Os camundongos foram injetados com 0,1 mg deGLPl-Fc-Ieptina ou fragmento IgGl Fc humano da mesma maneiradescrita acima diariamente por sete dias. Nos dias 1 e 7, opeso corpóreo de cada camundongo foi medido e registrado. Osresultados são resumidos na Tabela 6 abaixo.

Tabela 6

Efeitos de GLPl-Fc-Ieptina no peso corpóreo

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Foi verificado, no dia 7, que os camundongosinjetados com GLPl-Fc-Ieptina perderam 11,3% do peso corpóreo(p < 0,05). Por outro lado, nenhuma perda de peso corpóreofoi observada nos camundongos injetados com fragmento de IgGlFc humano. Esses resultados demonstram que GLPl-Fc-Ieptinapode ser utilizado para reduzir o peso corpóreo.Em seguida, os efeitos de Byetta (análogo de GLP-IE4) no peso corpóreo foram estudados da mesma maneira. Cincomicrogramas de Byetta foram injetados em cada camundongo duasvezes por dia por sete dias. 0 peso corpóreo foi medido nosdias 1, 4 e 7. Os resultados são resumidos na Tabela 7abaixo.

Tabela 7

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Foi verificado que a administração de Byetta nãoteve nenhum efeito estatisticamente significativo no pesocorpóreo em comparação ao fragmento de IgGl Fc.

Nas experiências acima, durante o período do sétimodia, os níveis de glicose no sangue de cada camundongo forammedidos e registrados diariamente uma hora após a injeção dofragmento de GLPl-Fc-Ieptina (0,1 mg) ou de IgGl Fcdiariamente pela manhã. 0 mesmo teste foi executadoutilizando Byetta (5 pg do análogo de GLP-1; duas vezes aodia) . Os resultados são resumidos nas Tabelas 8 e 9 abaixo.

Tabela 8

Efeitos de GLPl-Fc-Leptina no Nível de Glicose no SangueDiário

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Tabela 8Efeitos de Byetta no Nível de Glicose no Sangue Diário<table>table see original document page 43</column></row><table>

Conforme mostrado nas Tabelas 8 e 9 abaixo, oscamundongos injetados com GLPl-Fc-Ieptina ou Byetta tiveramníveis mais baixos de glicose no sangue do que aquelesinjetados com fragmentos de IgGl Fc.

Os efeitos da leptina sobre o peso corpóreo foramestudados da mesma maneira descrita acima. Maisespecificamente, os camundongos foram injetados ip com 0,1mg/camundongo de leptina recombinante humana (R&D Systems,Cat # 398-LP) ou IgG Fc humano duas vezes ao dia (às 9:00 eàs 17:00 horas) por sete dias. Os resultados são resumidos naTabela 10 abaixo.

Tabela 10

Efeitos da Leptina sobre o Peso Corpóreo

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Conforme mostrado na Tabela 10, a Leptina resultouem menos do que a metade da perda de peso que GLPl-Fc-Leptinainduziu.

Os ensaios de GTT também foram similarmenterealizados em camundongos e coelhos em pequenos números.Todos os resultados suportam a inibição de GLPl-Fc-Ieptina nonível de glicose no sangue.

Em resumo, GLPl-Fc-Ieptina mantém não somente aatividade de diminuição da glicose com GLP-1, mas tambémmantém o efeito de perda de peso com a leptina em comparaçãocom o análogo de GLP-I comercial E4 Byetta. Além disso, aGLPl-Fc-Ieptina tem um efeito terapêutico muito maisprolongado do que o análogo de GLP-I E4 Byetta. Desse modo,para o uso clínico, uma freqüência de injeção bem menor érequerida. Além disso, com a injeção ip do análogo de GLP-Icomercial E4 Byetta (Tabela 7) ou de leptina recombinante(Tabela 10) sozinha ou combinada, o seu efeito não resultouem um grau similar de perda de peso que GLPl-Fc-Leptinainduziu. Em resumo, o uso de GLP-I junto com a leptina (porexemplo, como uma proteína de fusão) tem um efeito mais doque aditivo ou sinergístico na perda de peso.

OUTRAS REALIZAÇÕES

Todas as características descritas neste relatóriodescritivo podem ser combinadas em qualquer combinação. Cadacaracterística descrita neste relatório descritivo pode sersubstituída por uma característica alternativa que se prestea uma finalidade igual, equivalente ou similar. Desse modo, amenos que esteja indicado expressamente de alguma outramaneira, cada característica descrita é somente um exemplo deuma série genérica de características equivalentes ousimilares.

A partir da descrição acima, o elemento versado natécnica pode facilmente verificar as característicasessenciais da presente invenção e, sem se desviar do carátere do âmbito da mesma, pode fazer várias alterações emodificações na invenção para adaptá-la aos vários usos econdições. Desse modo, outras realizações também estão dentrodo âmbito das reivindicações seguintes.

Claims

1. PROTEÍNA DE FUSÃO, caracterizada pelo fato decompreender:um primeiro segmento que fica localizado noterminal amino da proteína de fusão e contém a seqüência deum primeiro peptídio ou proteína ativa biológica; eum segundo segmento que fica localizado no terminalcarboxila da proteína de fusão e contém a seqüência de umasegunda proteína ou peptídio biológico ativo em que oprimeiro e segundo segmentos são ligados de maneira operávele covalente.

2. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro ousegundo peptídio ou proteína biológica ativa é um hormônio dopeptídio ou da proteína.

3. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a primeiraproteína biológica ativa contém a . seqüência de peptídio 1similar a glucagon, amilina ou peptídio YY ou um equivalentefuncional dos mesmos.

4. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a primeiraproteína biológica ativa contém a seqüência da SEQ ID NO.: 2.

5. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a segundaproteína biológica ativa contém a seqüência de Leptina ou umaproteína relacionada à perda de peso ou um equivalentefuncional, em que a segunda proteína biológica ativa mantémuma função da mesma quando fundida de modo covalente ao C-terminal de um peptídio ou proteína heteróloga.

6. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a segundaproteína biológica ativa contém a seqüência da SEQ ID NO. : 1.

7. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo cora areivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a proteína defusão contém a seqüência da SEQ ID NO.: 4, 5, 10, 11, 16 ou 17.

8. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a primeiraproteína biológica ativa contém a seqüência de resíduo deaminoácido 3-36 do peptídio YY da SEQ ID NO.: 19.

9. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína defusão contém a seqüência da SEQ ID NO.: 12 ou 13.

10. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 3, caracterizada pelo fato de que a primeiraproteína biológica ativa contém a seqüência de resíduos deaminoácido 1-36 de amilina dentro da SEQ ID NO.: 18.

11. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a proteínade fusão contém a seqüência da SEQ ID NO.: 14 ou 15.

12. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreenderadicionalmente um segmento de aglutinante que une o primeirosegmento e o segundo segmento, em que o segmento deaglutinante tem capacidade de dimerização.

13. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o segmentode aglutinante contém o fragmento de Fc de uma imunoglobulinaou um equivalente funcional do mesmo.

14. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 13, caracterizada pelo fato de que aimunoglobulina é IgA, IgE, IgD, IgG ou IgM.

15. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 14, caracterizada pelo fato de que aimunoglobulina é IgG.

16. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o fragmentode Fc contém a SEQ ID NO.: 3.

17. PROTEÍNA DE FUSÃO, de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a proteína defusão contém adicionalmente a SEQ ID NO.: 9 ou um equivalentefuncional da mesma antes da secreção.

18. ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADO, caracterizado pelofato de compreender uma seqüência que codifica a proteína defusão de acordo com a reivindicação 1.

19. ÁCIDO NUCLÉICO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o ácido nucléico contém aseqüência de uma SEQ ID N0.: 6-8.

20. VETOR, caracterizado pelo fato de compreendero ácido nucléico de acordo com a reivindicação 18.

21. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada pelo fato decompreender um ácido nucléico de acordo com a reivindicação 18.

22. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM POLIPEPTÍDIO,caracterizado pelo fato de compreender a cultura de célulashospedeiras de acordo com a reivindicação 21, em um meio sobcondições que permitam a expressão de um polipeptídiocodificado pelo ácido nucléico e a purificação dopolipeptídio a partir da célula cultivada ou do meio decélula.

23. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelofato de compreender a proteína de fusão de acordo com areivindicação 1 ou um ácido nucléico que codifica a proteínade fusão; e um veículo farmaceuticamente aceitável.

24. COMPOSIÇÃO ALIMENTAR, caracterizada pelo fatode compreender a proteína de fusão de acordo com areivindicação 1 ou um ácido nucléico que codifica a proteínade fusão; e um veículo nutricionalmente aceitável.

25. MÉTODO PARA A REDUÇÃO DO PESO CORPÓREO,caracterizado pelo fato de compreender a administração a umindivíduo com necessidade do mesmo de uma quantidade eficazda proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 ou de umácido nucléico que codifica a proteína de fusão.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente aadministração simultânea ao indivíduo do primeiro ou dosegundo peptídio ou da proteína.

27. MÉTODO PARA 0 TRATAMENTO DE DIABETES,caracterizado pelo fato de compreender a administração a umindivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz daproteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 ou um ácidonucléico que codifica a proteína de fusão.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente aadministração simultânea ao indivíduo do primeiro ou segundopeptídio ou da proteína.

29. MÉTODO PARA AUMENTAR A VIDA MÉDIA DE UMPEPTÍDIO OU UMA PROTEÍNA TERAPÊUTICA RECOMBINANTE EM UMINDIVÍDUO, sendo que o método é caracterizado pelo fato decompreender:a junção de uma proteína terapêutica recombinante aum segmento que contém a SEQ ID NO.: 1 ou a um equivalentefuncional da mesma para a formação de uma proteína de fusão;ea determinação da vida média da proteína de fusãoem um indivíduo.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 29,caracterizado pelo fato de que o peptídio ou a proteínaterapêutica recombinante tem um efeito terapêutico sobre odiabetes ou a obesidade.

31. MÉTODO PARA AUMENTAR A EFICÁCIA DE UM PEPTÍDIOOU PROTEÍNA TERAPÊUTICA, caracterizado pelo fato decompreender:a junção do peptídio terapêutico ou da proteínarecombinante a um segmento que contém a SEQ ID NO. : 1 ou umequivalente funcional do mesmo para a formação de uma quimerada proteína de fusão; ea determinação da eficácia da proteína de fusão emum indivíduo.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que o peptídio ou proteínaterapêutica recombinante tem um efeito terapêutico sobre odiabetes ou a obesidade.

33. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada pelofato de compreender (i) Leptina ou um equivalente funcional;(ii) um peptídio 1 similar a glucagon, amilina, peptídio YYou um equivalente funcional dos mesmos; e (iii) um veículofarmaceuticamente aceitável.

34. COMPOSIÇÃO ALIMENTAR, caracterizada pelo fatode compreender (i) Leptina ou um equivalente funcional; (ii)um peptídio 1 similar a glucagon, amilina, peptídio YY ou umequivalente funcional dos mesmos e (iii) um veículonutricionalmente aceitável.

35. MÉTODO PARA 0 TRATAMENTO DE DIABETES OUREDUÇÃO DO PESO C0RPÓRE0, caracterizado pelo fato decompreender a administração a um indivíduo com necessidade domesmo de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica deacordo com a reivindicação 33.

36. MÉTODO PARA 0 TRATAMENTO DE DIABETES OUREDUÇÃO DO PESO CORPÓREO, caracterizado pelo fato decompreender a administração a um indivíduo com necessidade domesmo de uma quantidade eficaz da composição farmacêutica deacordo com a reivindicação 33.

37. COMPOSIÇÃO ALIMENTAR, caracterizada pelo fatode compreender uma bactéria de ácido láctico recombinante queproduz e secreta a proteína de fusão de acordo com areivindicação 1 ou equivalentes funcionais; e um veículonutricionalmente aceitável.

38. COMPOSIÇÃO ALIMENTAR, caracterizada pelo fatode compreender uma bactéria de ácido láctico recombinante queproduz e secreta a primeira versão ou versão de açãoprolongada da primeira junto com a segunda versão ou umaversão de ação prolongada da segunda.

39. COMPOSIÇÃO ALIMENTAR, caracterizada pelo fatode compreender uma bactéria de ácido láctico recombinante queproduz e secreta (i) Leptina ou um equivalente funcionaljunto com (ii) um peptídio 1 similar a glucagon, amilina,peptídio YY ou um equivalente funcional dos mesmos.