BRPI0615617A2

BRPI0615617A2 - gene sms 27

Info

Publication number: BRPI0615617A2
Application number: BRPI0615617-7A
Authority: BR
Inventors: Masako Shinjoh; Bastien Chevreux; Nigel Mouncey
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2005-09-08
Filing date: 2006-09-07
Publication date: 2011-05-24
Also published as: EA200800772A1; WO2007028609A1; CN101273126B; EP1937804A1; EA013412B1; CN101273126A; US9090920B2; CA2621009A1; US20090148909A1

Abstract

GENE SMS 27 A presente invenção relaciona-Se aos genes recentemente identif içados que codificam as proteínas que são envolvidas na síntese do ácido L-ascórbicO (em seguida também referido como vitamina C) . A invenção também apresenta os polinucleotídeos que compreendem as sequências de extensão completa do polinucleotídeo dos novos genes e os fragmentos destes, os novos polipeptídeos codificados pelos polinucleotideos e fragmentos destes, assim como seus equivalentes funcionais. A invenção atual relaciona-se também ao uso de tais polinucleotideos e de polipeptideos como ferramentas biotecnológicas na produção da vitamina C dos microorganismos, por meio de uma modificação dos tais polinucleotideos e/ou de polipeptídeos codificados tem um impacto direto ou indireto no rendimento, na produção, e/ou na eficiência da produção do produto de fermentação em tal microorganismo. São incluidos também métodos/processos de usar os polinucleotídeos e as seqúências modificadas do polinucleotídeo para transformar microorganismos hospedeiros. A invenção relaciona-se também aos microorganismos geneticamente projetados e ao seu uso para a produção direta da vitamina C.

Description

A presente invenção refere-se a genes recentementeidentificados que codificam proteínas que são envolvidas nasíntese de ácido L-ascórbico (doravante também mencionadocomo vitamina C) e/ou ácido 2-ceto-L-gulônico (doravantetambém mencionado como 2-KGA). A invenção também apresentapolinucleotídeos compreendendo as seqüências depolinucleotídeo de comprimento total dos genes novos efragmentos dos mesmos, os polipeptídeos novos codificadospelos polinucleotídeos e fragmentos dos mesmos, bem comoseus equivalentes funcionais. A presente invenção também serefere ao uso dos polinucleotídeos e polipeptídeos comoferramentas biotecnologias na produção de vitamina C e/ou2-KGA a partir de microorganismos, pelo que uma modificaçãodos polinucleotídeos e/ou polipeptídeos codificadas tem umimpacto direto ou indireto sobre o rendimento, produçãoe/ou eficiência de produção do produto de fermentação nomicroorganismo. São também incluídos métodos/processos deutilizar os polinucleotídeos e seqüências depolinucleotídeo modificadas para transformarmicroorganismos hospedeiros. A invenção também se refere amicroorganismos geneticamente construídos e seu uso para aprodução direta de vitamina C e/ou 2-KGA.

A vitamina C é um dos fatores nutrientes muitoimportantes e indispensáveis para os seres humanos. Avitamina C também é utilizada em ração de animais emboraalguns animais de fazendas possam sintetizar a mesma em seupróprio corpo.

Durante os últimos 70 anos, a vitamina C tem sidoproduzida industrialmente a partir de D-glicose pelo métodobem conhecido de Reichstein. Todas as etapas nesse processosão químicas exceto uma (a conversão de D-sorbitol em L-sorbose) que é realizada por conversão microbiana. Dessesua implementação inicial para a produção industrial devitamina C, várias modificações químicas e técnicas foramutilizadas para aperfeiçoar a eficiência do métodoReichstein. Os recentes desenvolvimentos da produção devitamina C são resumidos na Encyclopedia of IndustrialChemistry de Ullmann, 5a edição, vol. A27 (1996), pág. 547ff.

Diferentes etapas intermediárias da produção devitamina C foram executadas com o auxílio demicroorganismos ou enzimas isoladas a partir da mesma.

Desse modo, ácido 2-ceto-L gulônico (2-KGA), um compostointermediário que pode ser quimicamente convertido emvitamina C por intermédio de uma reação de rearranjoalcalino, pode ser produzido por um processo de fermentaçãoque se inicia a partir de L-sorbose ou D-sorbitol, porintermédio de cepas que pertencem, por exemplo, aos gênerosKetogulonicigenium ou Gluconobacter, ou por um processo defermentação alternativa se iniciando a partir de D-glicose,por intermédio de cepas recombinantes que pertencem aosgêneros Gluconobacter ou Pantoea.

Os métodos atuais de produção química para Vitamina Ctêm algumas características indesejáveis como elevadoconsumo de energia e uso de grandes quantidades desolventes orgânicos e inorgânicos. Portanto, durante asúltimas décadas, outras abordagens para fabricar Vitamina Cutilizando conversões microbiais, que seriam maiseconômicas como também ecológicas, têm sido pesquisadas.A produção direta de vitamina C a partir de diversossubstratos incluindo D-sorbitol, L-sorbose e L-sorbosonefoi reportada em vários microorganismos, como algas,levedura e bactérias de ácido acético, utilizando métodosde cultivo diferentes. Os exemplos de bactérias conhecidascapazes de produzir diretamente a Vitamina C incluem, porexemplo, cepas dos gêneros de Gluconobacter,Gluconacetobacter, Aeetobaeter, Ketogulonieigenium,

Pantoea, Pseudomonas ou Eseheriehia. Os exemplos delevedura ou algas conhecidas incluem, por exemplo, Candida,Saccharomyees, Zygosaeeharomyees, Sehizosaeeharomyes,Kluyveromyces ou Chlorella.

Microorganismos capazes de assimilar D-sorbitol paracrescimento possuem, normalmente, enzimas capazes de oxidaresse composto em um substrato de assimilação universal comoD-frutose. Além disso, microorganismos capazes de crescerem L-sorbose possuem uma enzima, reductase L-sorbosedependente de NAD(P)H, que é capaz de reduzir esse compostoem D-sorbitol, o qual é então adicionalmente oxidado em D-frutose. D-frutose é um excelente substrato para ocrescimento de muitos microorganismos, após ter sidofosforilado por intermédio de D-frutose cinase.

Por exemplo, no caso de bactérias de ácido acético, asquais são microorganismos gram-negativos de aeróbioforçados pertencendo ao gênero Aeetobaeter, Glueonobaeter eGl ueonaeetobaeter, esses microorganismos são capazes detransportar D-sorbitol para citosol e converter o mesmo emD-frutose por intermédio de uma desidrogenase D-sorbitoldependente de NAD citosólico. Algumas cepas individuais,como Glueonobaeter oxydans IFO 3292, e IFO 3293, sãocapazes também de transportar L-sorbose para o citosol ereduzir o mesmo em D-sorbitol por intermédio de umareductase L-sorbose dependente de NAD(P)H, que é entãoadicionalmente oxidada em D-frutose. Nessas bactérias, avia Embden-Meyerhof-Parnas, bem como o ciclo de ácidotricarboxíclico não é totalmente ativo, e a via principalque canaliza açúcares para dentro do metabolismo central éa via de fosfato pentose. D-frutose-6-fosfato, obtido apartir de D-frutose por uma reação de fosforilação entra navia de fosfato de pentose, sendo adicionalmentemetabolizado e produzindo energia de redução na forma decompostos tricarboxílicos e NAD(P)H necessários paracrescimento e manutenção.

Bactérias de ácido acético são bem conhecidas por suacapacidade em oxidar incompletamente diferentes substratoscomo álcoois, açúcares, álcoois de açúcar e aldeídos. Essesprocessos são genericamente conhecidos como fermentaçõesoxidativas ou oxidações incompletas, e foram bemestabelecidos por um longo tempo na indústria de alimentose química, especialmente na produção de vinagre e naprodução de L-sorbose. Um produto útil conhecido como sendoobtido a partir de oxidações incompletas de D-sorbitol ouL-sorbose utilizando cepas que pertencem ao gêneroGluconobacter é 2 -KGA.

As bactérias de ácido acético realizam essas reaçõesde oxidação incompleta por intermédio de diferentesdesidrogenases localizadas no espaço periplásmico, namembrana periplásmico bem como no citoplasma. Co-fatoresdiferentes são empregados pelas diferentes desidrogenases,o mais comum sendo PQQ e FAD para enzimas periplásmicas ouligadas à membrana, e NAD/NADP para enzimas citoplásmicas.

Embora todos os produtos dessas reações de oxidaçãodifundam de volta no ambiente aquoso externo através damembrana externa, alguns deles podem ser passiva ouativamente transportados para dentro da célula e seradicionalmente utilizados em vias metabólicas responsáveispor crescimento e formação de energia. Dentro da célula,produtos oxidados podem, muitas vezes, ser reduzidos devolta ao seu substrato original por intermédio dereductases, e então ser canalizados de volta para ometabolismo central.

Proteínas, em particular enzimas e transportadores,que são ativos na metabolização de D-sorbitol ou L-sorbosesão aqui referidas como estando envolvidas no Sistema deMetabolização de Sorbitol/Sorbose. Tais proteínas sãoabreviadas aqui como proteínas SMS e funcionam nametabolização direta de D-sorbitol ou L-sorbose.

A metabolização de D-sorbitol ou L-sorbose inclui emum lado a assimilação desses compostos no citosol econversão adicional em metabólitos úteis para vias deassimilação como a via Embden-Meyerhof-Parnas, a via defosfato pentose, a via Entner-Doudoroff, e o ciclo de ácidotricarboxíclico, todos envolvidos em reações anabólicas ede formação de energia totalmente vitais necessárias paracrescimento e manutenção de células vivas. Por outro lado,a metabolização de D-sorbitol ou L-sorbose também inclui aconversão desses compostos em produtos oxidados adicionaiscomo L-sorbosone, 2-KGA e Vitamina C pelos denominadosprocessos de oxidação incompleta.

Um objetivo da presente invenção é melhorar osrendimentos e/ou produtividade da produção de Vitamina C.

Surpreendentemente, verificou-se agora que proteínasSMS ou subunidades dessas proteínas tendo atividade emdireção ã ou que estão envolvidas na assimilação ouconversão de D-sorbitol, L-sorbose ou L-sorbosonedesempenham um papel importante na produção biotecnológicada vitamina C e/ou 2 -KGA.

Em uma modalidade, as proteínas SMS da presenteinvenção são selecionadas a partir de oxidorreductases [EC1] , preferivelmente oxidorreductases atuando sobre o grupoCH-OH de doadores [EC 1.1], mais preferivelmenteoxidorreductases com NAD+ ou NADP+ como aceitador [EC 1.1.1]e oxidorreductases com outros aceitadores [EC 1.1.99], maispreferivelmente selecionados de oxidorreductases quepertencem a classes de enzima . [EC 1.1.1.1], [EC 1.1.1.15]ou [EC 1.2.1.-], ou preferivelmente oxidorreductasesatuando sobre o grupo de doadores aldeído ou oxo [EX 1.2],mais preferivelmente oxidorreductases com NAD+ ou NADP+ comoaceitador [EC 1.2.1].

Além disso, as proteínas SMS da presente invençãopodem ser selecionadas do grupo que consiste emdesidrogenase de D-sorbitol dependente de PQQ ligada pormembrana, desidrogenase de L-sorbose ligada por membrana,desidrogenase de L-sorbosone ligada por membrana,desidrogenase de D-sorbitol dependente de FAD ligada pormembrana, desidrogenase de D-sorbitol dependente de NADcitosólico, desidrogenase de D-sorbitol dependente deNAD(P) (também chamada de reductase de sorbose dependentede NADPH) , desidrogenase de xilitol dependente de NAD,desidrogenase de álcool dependente de NAD, desidrogenase deL-sorbose ligada por membrana, reductase de L-sorbosedependente de NAD(P)H, desidrogenase de sorbosonedependente de NADP citosólico, reductase de L-sorbosonedependente de NAD(P)H citosólise, desidrogenase de aldeídoligado por membrana, desidrogenase de aldeído citosólico,desidrogenase de glicerol-3-fosfato, desidrogenase degliceraldeído-3-fosfato, e outros envolvidos em SMSincluindo proteínas envolvidas na regulação dos genes quecodificam essas enzimas, como por exemplo, fatores detranscrição, em particular repressores.

Em particular, verificou-se agora que as proteínas SMScodificadas por polinucleotídeos tendo uma seqüência denucleotídeos que hibridiza, preferivelmente, sob condiçõesaltamente rigorosas em uma seqüência mostrada na SEQ ID NO:1, desempenham um papel importante na produçãobiotecnológica da Vitamina C e/ou 2 -KGA. Verificou-seagora, que pela alteração genética do nível de expressão denucleotídeos, de acordo com a invenção em um microorganismocapaz de produzir diretamente a Vitamina C, como porexemplo, Gluconobacter, a fermentação direta da Vitamina Ce/ou 2-KGA pelo microorganismo pode ser aperfeiçoada aindamais.

Conseqüentemente, a invenção refere-se a umpolinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em:

(a) polinucleotídeos que codificam um polipeptídeocompreendendo a seqüência de aminoácido, de acordo com aSEQ ID NO:2,

(b) polinucleotídeos compreendendo a seqüência denucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1,

(c) polinucleotídeos compreendendo uma seqüência denucleotídeo que pode ser obtido por amplificação de ácidonucléico como reação de cadeia de polimerase, utilizandoDNA genômico a partir de um microorganismo como padrão e umconjunto iniciador (primer) de acordo com SEQ ID NO: 3 eSEQ ID NO: 4;

(d) polinucleotídeos compreendendo uma seqüência denucleotídeos codificando um fragmento ou derivado de umpolipeptideo codificado por um polinucleotídeo de qualquerum de (a) a (c) onde no derivado um ou mais resíduos deaminoácido são substituídos de forma conservativa emcomparação com o polipeptideo, e o fragmento ou derivadotem a atividade de um regulador de transcrição,preferivelmente um repressor de desidrogenase L-sorbose(SDH) e/ou desidrogenase L-sorbosone (SNDH) (SMS 27);

(e) polinucleotídeos, cuja fita complementarhibridiza sob condições rigorosas em um polinucleotídeocomo definido em qualquer um de (a) a (d) e que codifica umregulador de transcrição, preferivelmente um repressor dedesidrogenase L-sorbose (SDH) e/ou desidrogenase L-sorbosone (SNDH) (SMS 27); e

(f) polinucleotídeos que são pelo menos 60%, como 70,85, 90 ou 95% idênticos a um polinucleotídeo como definidoem qualquer um de (a) a (d) e que codificam um regulador detranscrição, preferivelmente um repressor de desidrogenaseL-sorbose (SDH) e/ou desidrogenase L-sorbosone (SNDH) (SMS 27);

ou

a fita complementar de um tal polinucleotídeo.

Verificou-se que a proteína de SMS como isolada apartir de Gluconobacter oxydans IFO 3293, mostrada na SEQID NO: 2 e descrita aqui é uma proteína de SMSparticularmente útil, uma vez que pareceu que executa umafunção crucial na produção direta de Vitamina C emmicroorganismos, em particular bactérias, como bactérias deácido acético, como Gluconobacter, Acetobacter eGluconacetobacter. Por conseguinte, a invenção se refere aum polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de acordocom a SEQ ID NO: 2. Essa proteína pode ser codificada poruma seqüência de nucleotídeo como mostrado na SEQ ID NO: 1.

A invenção portanto se refere também a polinucleotídeoscompreendendo a seqüência de nucleotídeos de acordo com SEQID NO: 1.

As seqüências de aminoácidos e nucleotídeosdeterminadas acima foram utilizadas como uma "seqüência deconsulta" para executar uma busca com programa Blast2(versão 2 ou BLAST a partir do National Center forBiotechnology [NCBI] contra o banco de dados PRO SW-SwissProt (liberação completa mais atualizaçõesincrementais)). A partir das buscas, o polinucleotídeo SMS27, de acordo com a SEQ ID NO: 1 foi anotado comocodificando um regulador de transcrição que pertence àfamília de TetR/AcrR. A proteína como codificada pela SEQID NO: 2 atua como um repressor por ligar diretamente àregião de promotor dos genes respectivos, incluindo osgenes que codificam para desidrogenase L-sorbose (SDH),como, por exemplo, mostrado na SEQ ID NO: 11 codificandouma proteína como da SEQ ID NO: 12, desidrogenase L-sorbosone (SNDH) , como por exemplo mostrado na SEQ ID NO:codificando uma proteína como de SEQ ID NO: 14, eexportador L-sorbosone, como por exemplo mostrado na SEQ IDNO: 15 codificando uma proteína como de SEQ ID NO: 16.

Um ácido nucléico, de acordo com a invenção pode serobtido por amplificação de ácido nucléico utilizando cDNA,mRNA ou alternativamente, DNA genômico, como padrão einiciadores de oligonucleotídeo apropriados como osiniciadores de nucleotídeo, de acordo com a SEQ ID NO: 3 eSEQ ID NO: 4, de acordo com técnicas de amplificação PCRpadrão. 0 ácido nucléico desse modo amplificado pode serclonado em um vetor apropriado e caracterizado por análisede seqüência de DNA.

0 padrão para a reação pode ser cDNA obtido portranscrição inversa de mRNA preparado a partir de cepasconhecidas ou que se suspeita compreenderem umpolinucleotídeo, de acordo com a invenção. 0 produto de PCRpode ser subclonado e seqüenciado para assegurar que asseqüências amplificadas representam as seqüências de umaseqüência de ácido nucléico nova como descrito aqui, ou umequivalente funcional da mesma.

0 fragmento de PCR pode ser então utilizado paraisolar um clone de cDNA de comprimento total por umavariedade de métodos conhecidos. Por exemplo, o fragmentoamplificado pode ser rotulado e utilizado para classificaruma biblioteca de cDNA de cosmídio ou bacteriófago.Alternativamente, o fragmento rotulado pode ser utilizadopara classificar uma biblioteca genômica.

Por conseguinte, a invenção se refere apolinucleotídeos compreendendo uma seqüência de nucleotídeoque pode ser obtido por amplificação de ácido nucléico comoreação de cadeia polimerase, utilizando DNA como DNAgenômico a partir de um microorganismo como um padrão e umconjunto iniciador de acordo com SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO:4.

A invenção também se refere a polinucleotídeoscompreendendo uma seqüência de nucleotídeos codificando umfragmento ou derivado de um polipeptídeo codificado por umpolinucleotídeo como descrito aqui, onde no derivado um oumais resíduos de aminoácido são substituídos de formaconservativa em comparação com o polipeptídeo, e ofragmento ou derivado tem a atividade de um polipeptídeo deSMS, preferivelmente um polipeptídeo de SMS 27.

A invenção também se refere a polinucleotídeos cujafita complementar hibridiza sob condições rigorosas com umpolinucleotídeo como definido aqui, e que codificam umpolipeptídeo de SMS, preferivelmente um polipeptídeo de SMS27.

A invenção também se refere a polinucleotídeos que sãopelo menos 60% idênticos a um polinucleotídeo, comodefinido aqui, e que codificam um polipeptídeo de SMS; e ainvenção também se refere a polinucleotídeos sendo a fitacomplementar de um polinucleotídeo como definido acima.

A invenção também se refere a iniciadores, sondas efragmentos que podem ser utilizados para amplificar oudetectar um DNA de acordo com a invenção e para identificarespécies relacionadas ou famílias de microorganismos tambémcontendo tais genes.

A presente invenção também se refere a vetores queincluem polinucleotídeos da invenção e microorganismos quesão geneticamente construídos com os polinucleotídeos ouvetores.

A invenção também se refere a processos para produzirmicroorganismos capazes de expressar um polipeptídeocodificado pelo polinucleotídeo acima definido e umpolipeptídeo codificado por um polinucleotídeo comodefinido acima.

A invenção também se refere a microorganismos, onde aatividade de um polipeptídeo de SMS, preferivelmente umpolipeptídeo de SMS 27, é reduzida ou abolida de modo que orendimento de Vitamina C e/ou 2-KGA que é diretamenteproduzida a partir de D-sorbitol ou L-sorbose, é aumentado.

A pessoa versada saberá como reduzir ou abolir aatividade de uma proteína de SMS, preferivelmente umaproteína de SMS 27. Isso pode ser, por exemplo, realizadopor modificação genética do organismo hospedeiro de talmodo que produza menos cópias ou nenhuma cópia da proteínade SMS, pref erivelmente a proteína de SMS 27, do que oorganismo do tipo selvagem ou pela diminuição ou aboliçãoda atividade específica da proteína de SMS, preferivelmentea proteína de SMS 27.

Na descrição a seguir, os procedimentos são detalhadospara obter esse objetivo, isto é, o aumento no rendimentoe/ou produção da vitamina C que é diretamente produzida apartir de D-sorbitol ou L-sorbose pela redução ou aboliçãoda atividade de uma proteína de SMS 27. Esses procedimentosse aplicam mutatis mutandis para outras proteínas de SMS.

As modificações para que o organismo produza menos ounenhuma cópia do gene e/ou proteína de SMS 27 podem incluiro uso de um promotor fraco, ou a mutação (por exemplo,inserção, deleção ou mutação de pontos) de (partes de) genede SMS 2 7 ou seus elementos reguladores. A diminuição ouabolição da atividade específica de uma proteína de SMS 27também pode ser realizada por métodos conhecidos natécnica. Tais métodos podem incluir a mutação (por exemplo,inserção, deleção ou mutação de pontos) do (partes do) genede SMS 27. Isso pode por exemplo, afetar a interação comDNA que é mediado pela região N-terminal de SMS 27 ouinteração com outras moléculas efetoras.

São também conhecidos na técnica métodos de reduzir ouabolir a atividade de uma dada proteína pelo contato daproteína de SMS 27 com inibidores específicos ou outrassubstâncias que interagem especificamente com a proteína deSMS 27. Para identificar tais inibidores específicos, aproteína de SMS 27 pode ser expressa e testada em relação àatividade na presença de compostos que se suspeita inibirema atividade da proteína de SMS 27. Compostos de inibição empotencial podem, por exemplo, ser anticorpos monoclonais oupoliclonais contra a proteína de SMS 27. Tais anticorpospodem ser obtidos por protocolos de imunização de rotina deanimais de laboratório apropriados.

A invenção pode ser executada em qualquermicroorganismo contendo um gene de SMS 27 ou homólogo domesmo. Microorganismos apropriados podem ser selecionados apartir do grupo que consiste em levedura, algas ebactérias, como cepas do tipo selvagem, cepas mutantesderivadas por mutagênese clássica e métodos de seleção oucomo cepas recombinantes. Os exemplos de tais bactériaspodem ser, por exemplo, Gluconobacter, Gluconacetobacter,Aeetobaeter, Ketogulonieigenium, Pantoea, Pseudomonas,Rhizobium, Sinohrizobium, como, Sinorhizobium meliloti,Bradyrhizobium, como Bradyrhizobium japonicum, Roseobaeter,Rals tonia, Pseudomonas, como por exemplo Pseudomonasputida, e Escherichia, como, por exemplo, Escherichia coli.São preferidos Gluconobacter ou Acetobacter aeeti, como porexemplo, G. oxydans, G. eerinus, G. frateurii, A. aeetisubsp. Xylinum ou A. aeeti subsp. Orleanus, preferivelmenteG. oxydans IFO 3293, e seus derivados contendo genesenvolvidos nas vias de produção de vitamina C e as regiõesadjacentes onde o gene SMS 2 7 ou seu equivalente poderiaestar localizado.

Microorganismos que podem ser utilizados para apresente invenção podem ser publicamente disponíveis defontes diferentes, por exemplo, Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder WegIB, D-38124 Braunschweig, Alemanha, American Type CultureCollection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108 EUA ouCulture Collection Division, NITE Biological ResourceCenter, 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818, Japão (anteriormente: Institute for Fermentation,Osaka (IFO), 17-85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-Ku,Osaka 532-8686, Japão). Os exemplos de bactérias preferidasdepositadas junto ao IFO são, por exemplo, Glueonobaeteroxydans (anteriormente conhecido como G. melanogenus) IFO3293, Glueonobaeter oxydans (anteriormente conhecido comoG. melanogenus) IFO 3292, Glueonobaeter oxydans(anteriormente conhecido como G. rubiginosus) IFO 3244,Glueonobaeter frateurii (anteriormente conhecido como G.industrius) IFO 3260, Glueonobaeter eerinus IFO 3266,Glueonobaeter oxydans IFO 3287, e Aeetobaeter aeeti subsp.Orleanus IFO 3259, que foram todos depositados em 05 deabril de 1954; Aeetobaeter aeeti subsp. Xylinum IFO 13693depositado em 22 de outubro de 1975, e Aeetobaeter aeetisubsp. Xylinum IFO 13773 depositado em 08 de dezembro de1977. A cepa Acetobacter sp. ATCC 15164, que também é umexemplo de uma bactéria preferida, foi depositada junto aoATCC.

Um microorganismo como da presente invenção, podeconter modificações adicionais no nível de DNA ou deproteína (vide acima), desde que essa modificação tenha umimpacto direto sobre o rendimento, produção e/ou eficiênciada produção direta de Vitamina C e/ou 2-KGA a partir dossubstratos, como, por exemplo, D-sorbitol ou L-sorbose.Tais modificações adicionais podem, por exemplo, afetaroutros genes que codificam proteínas de SMS como descritoacima, em particular genes que codificam desidrogenase deL-sorbosone ligadas por membrana, como desidrogenase de L-sorbosone SNDHai, desidrogenase de D-sorbitol ligadas porPQQ ligadas por membrana e/ou outros genes que codificamproteínas envolvidas no transporte de açúcar e/ou álcooisde açúcar, como por exemplo exportadores, em particularexportadores de sorbosone, preferivelmente um gene comomostrado na SEQ ID NO: 15. Os métodos de executar taismodificações são conhecidos na técnica, com alguns exemplosadicionalmente descritos aqui. Para o uso de SNDHai paraprodução direta de vitamina C bem como a seqüência deaminoácidos e nucleotídeos da mesma consulte WO 2005/017159que é aqui incorporado a título de referência.

De acordo com um objetivo adicional da presenteinvenção é fornecido o uso de um polinucleotídeo comodefinido acima ou um microorganismo que é geneticamenteconstruído utilizando tais polinucleotídeos na produção devitamina C e/ou 2-KGA.A invenção também se refere a processos para aexpressão de genes endógenos em um microorganismo, aprocessos para a produção de polipeptídeos como definidoacima em um microorganismo e a processos para a produção demicroorganismos capazes de produzir Vitamina C e/ou 2-KGA.Todos esses processos podem compreender a etapa de alterarum microorganismo, onde "alterar" como utilizado aquiabrange o processo para "alterar geneticamente" ou "alterara composição do meio de cultura de célula e/ou métodosutilizados para cultivar" de tal modo que o rendimento e/ouprodut ividade do produto de fermentação possa seraperfeiçoado em comparação com o organismo do tiposelvagem. Como utilizado aqui, "rendimento aperfeiçoado deVitamina C" significa um aumento de pelo menos 5%, 10%,25%, 30%, 40%, 50%, 75%, 100%, 200% ou ainda mais do que500%, em comparação com um microorganismo do tipo selvagem,isto é, um microorganismo que não seja geneticamentealterado.

O termo "geneticamente construído" ou "geneticamentealterado" significa a alteração científica da estrutura domaterial genético em um organismo vivo. Envolve a produçãoe uso de DNA recombinante. Mais particularmente é utilizadopara delinear o organismo geneticamente construído oumodificado a partir do organismo de ocorrência natural. Aengenharia genética pode ser feita por diversas técnicasconhecidas na arte, como por exemplo, substituição de gene,amplificação de gene, ruptura de gene, transfecção,transformação utilizando plasmídeos, vírus, ou outrosvetores. Um organismo geneticamente modificado, porexemplo, microorganismo geneticamente modificado, também éfreqüentemente mencionado como um organismo recombinante,por exemplo, microorganismo recombinante.

De acordo ainda com outro aspecto da invenção éfornecido um processo para a produção de Vitamina C e/ou 2- KGA por fermentação direta.

Vários substratos podem ser utilizados como uma fontede carbono em um processo da presente invenção, isto é, umprocesso para conversão direta de um dado substrato emvitamina C como, por exemplo, mencionado acima. Fontes decarbono particularmente adequadas são aquelas que sãofacilmente obteníveis a partir de via de metabolização deD-glicose ou D-sorbitol como, por exemplo, D-glicose, D-sorbitol, L-sorbose, L-sorbosone, 2-ceto-L-gulonato, D-gluconato, 2-ceto-D-gluconato ou 2,5-diceto-gluconato.

Preferivelmente, o substrato é selecionado, por exemplo, deD-glicose, D-sorbitol, L-sorbose ou L-sorbosone, maispreferivelmente de D-glicose, D-sorbitol ou L-sorbose, emais preferivelmente de D-sorbitol, L-sorbose ou L-sorbosone. 0 termo "substrato" e "substrato de produção"com relação ao processo acima utilizando um microorganismoé utilizado de forma intercambiável aqui.

Um meio como utilizado aqui para o processo acimautilizando um microorganismo pode ser qualquer meioapropriado para a produção de Vitamina C e/ou 2 -KGA.

Tipicamente, o meio é um meio aquoso compreendendo porexemplo, sais, substrato(s) e um certo pH. 0 meio no qual osubstrato é convertido em Vitamina C e/ou 2-KGA também émencionado como o meio de produção.

"Fermentação" ou "produção" ou "processo defermentação" como utilizado aqui, pode ser o uso de célulasde crescimento utilizando meios, condições e procedimentosconhecidos por pessoas versadas, ou o uso de células não emcrescimento denominadas em repouso, após terem sidocultivadas pelo uso de meios, condições e procedimentosconhecidos por pessoas versadas, sob condições apropriadaspara a conversão de substratos apropriados em produtosdesejados como Vitamina C e/ou 2 -KGA. Preferivelmente,células em repouso são utilizadas para a produção deVitamina C. Um exemplo de tal processo para a produção devitamina C é descrito em WO 2005/017159 (como incorporadoaqui a título de referência). Preferivelmente, 2-KGA éproduzido utilizando células em crescimento (vide, porexemplo, EP 0 518 136 BI).

0 termo "fermentação direta", "produção direta","conversão direta" e similares pretende significar que ummicroorganismo é capaz da conversão de um certo substratono produto especificado por intermédio de uma ou maisetapas de conversão biológica, sem a necessidade dequalquer etapa adicional de conversão química. Por exemplo,o termo "conversão direta de D-sorbitol em Vitamina C"pretende descrever um processo onde um microorganismo estáproduzindo Vitamina C e onde D-sorbitol é oferecido comouma fonte de carbono sem a necessidade de uma etapaintermediária de conversão química. Um único microorganismocapaz de fermentar diretamente a Vitamina C é preferido. 0microorganismo é cultivado sob condições que permitem talconversão a partir do substrato como definido acima.

Com relação ao processo acima utilizando ummicroorganismo é entendido que os microorganismos acimamencionados também incluem sinônimos ou basônimos de taisespécies tendo as mesmas propriedades fisiológicas, comodefinido pelo Código Internacional de Nomenclatura deprocariotes. A nomenclatura dos microorganismos, comoutilizado aqui, é a oficialmente aceita (na data dedepósito do pedido de prioridade) pelo InternationalCommittee on Systematics of Prokaryotes e Bacteriology andApplied Microbiology Division da International Union ofMicrobiological Societies, e publicado por seu veículo depublicação oficial International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology (IJSEM). Uma referênciaespecífica é feita a Urbance e outros, IJSEM (2001) vol.51: 1059-1070, com uma notificação corretiva em IJSEM(2001) vol. 51:1231-1233, descrevendo a reclassificaçãotaxonômica de G. oxydans DSM 4025 como Ketogulonicigeniumvulgare.

Como utilizado aqui, células em repouso se referem acélulas de um microorganismo que são, por exemplo, viáveisporém não em crescimento ativo, ou que estão crescendo emtaxas de crescimento baixas específicas, por exemplo, taxasde crescimento que são mais baixas do que 0,02 h"1,preferivelmente mais baixas do que 0,01 h"1. Diz-se que ascélulas que mostram as taxas de crescimento acima estão emum "modo de célula em repouso".

O processo da presente invenção como acima utilizandoum microorganismo pode ser executado em diferentes etapasou fases: preferivelmente, o microorganismo é cultivado emuma primeira etapa (também mencionada como etapa (a) oufase de crescimento) sob condições que permitemcrescimento. Essa fase é terminada pela mudança dascondições de tal modo que a taxa de crescimento domicroorganismo é reduzida levando a células em repouso,também mencionado como etapa (b), seguido pela produção davitamina C a partir do substrato utilizando (b) , tambémmencionado como a fase de produção.

A fase de crescimento e produção como executada noprocesso acima, utilizando um microorganismo, pode serrealizada no mesmo recipiente, isto é, somente umrecipiente, ou em dois ou mais recipientes diferentes, comuma etapa de separação de células opcional entre as duasfases. A Vitamina C produzida pode ser recuperada dascélulas por qualquer meio apropriado. Os meios derecuperação por exemplo em que a Vitamina C produzida possaser separada do meio de produção. Opcionalmente, a VitaminaC desse modo produzida pode ser adicionalmente processada.

Para fins da presente invenção referente ao processoacima utilizando um microorganismo, os termos "fase decrescimento", "etapa em crescimento", "etapa decrescimento" e "período de crescimento" são utilizados deforma intercambiável na presente invenção. 0 mesmo seaplica aos termos "fase de produção", "etapa de produção","período de produção".

Um modo de executar o processo acima utilizando ummicroorganismo da presente invenção, pode ser um processoonde o microorganismo é cultivado em um primeirorecipiente, o denominado recipiente de crescimento, comouma fonte para as células em repouso, e pelo menos partedas células são transferidas para um segundo recipiente, odenominado recipiente de produção. As condições norecipiente de produção podem ser tais que as célulastransferidas a partir do recipiente de crescimento setornam células em repouso como definido acima. A Vitamina Cé produzida no segundo recipiente e recuperada a partir domesmo.

Com relação ao processo acima utilizando ummicroorganismo, em um aspecto, a etapa de crescimento podeser executada em um meio aquoso, isto é, o meio decrescimento, suplementado com nutrientes apropriados paracrescimento sob condições aeróbicas. O cultivo pode serrealizado, por exemplo, em modo de batelada, alimentado embatelada, semicontínuo ou contínuo. O período de cultivopode variar dependendo, por exemplo, do hospedeiro, pH,temperatura e meio nutriente a ser utilizado, e pode ser,por exemplo, aproximadamente 10 h até aproximadamente 10dias, preferivelmente aproximadamente 1 até aproximadamente10 dias, mais preferivelmente aproximadamente 1 atéaproximadamente 5 dias quando realizado no modo de bateladaou alimentado em batelada, dependendo do microorganismo. Seas células são cultivadas no modo contínuo, o tempo depermanência pode ser, por exemplo, de aproximadamente 2 aaproximadamente 100 h, preferivelmente de aproximadamente 2h a aproximadamente 50 h, dependendo do microorganismo. Seo microorganismo for selecionado de bactérias, o cultivopode ser conduzido por exemplo, em um pH de aproximadamente3,0 a aproximadamente 9,0, preferivelmente aproximadamente4,0 a aproximadamente 9,0, mais preferivelmenteaproximadamente 4,0 a aproximadamente 8,0, ainda maispreferivelmente aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0.Se algas ou levedura forem utilizadas, o cultivo pode serrealizado, por exemplo, em um pH abaixo de aproximadamente7,0, preferivelmente abaixo de aproximadamente 6,0, maispreferivelmente abaixo de aproximadamente 5,5, e maispreferivelmente abaixo de aproximadamente 5,0. Uma faixa detemperatura apropriada para realizar o cultivo utilizandobactérias pode ser, por exemplo, de aproximadamente 130C aaproximadamente 40°C, preferivelmente de aproximadamente18 0C a aproximadamente 37°C, mais preferivelmente deaproximadamente 13 0C a aproximadamente 36°C, e maispreferivelmente ainda de aproximadamente 18 0C aaproximadamente 33°C. Se algas ou levedura foremutilizados, uma faixa de temperatura apropriada pararealizar o cultivo pode ser, por exemplo, deaproximadamente 150C a aproximadamente 40 °C,preferivelmente de aproximadamente 20°C a aproximadamente45°C, mais preferivelmente de aproximadamente 250C aaproximadamente 40°C, ainda mais preferivelmente deaproximadamente 25 °C a aproximadamente 38°C, e maispreferivelmente ainda de aproximadamente 3 00C aaproximadamente 38°C. O meio de cultura para crescimentonormalmente pode conter tais nutrientes como fontes decarbono assimiláveis, por exemplo, glicerol, D-manitol, D-sorbitol, L-sorbose, eritritol, ribitol, xilitol, arabitol,inositol, dulcitol, D-ribose, D-frutose, D-glicose,sacarose, e etanol, preferivelmente L-sorbose, D-glicose,D-sorbitol, D-manitol, glicerol e etanol; e fontes denitrogênio digeríveis como substâncias orgânicas, porexemplo, peptona, extrato de levedura e aminoácidos. Osmeios podem ser com ou sem uréia e/ou corpo fluido deinfusão de milho e/ou fermento de pão. Várias substânciasinorgânicas podem ser também utilizadas como fontes denitrogênio, por exemplo, nitratos e sais de amônio. Alémdisso, o meio de crescimento, pode conter normalmente saisinorgânicos, por exemplo, sulfato de magnésio, sulfato demanganês, fosfato de potássio e carbonato de cálcio. Ascélulas obtidas utilizando os procedimentos descritos acimapodem ser então adicionalmente incubadas essencialmente nosmesmos modos, temperatura e condições de pH como descritoacima, na presença de substratos como D-sorbitol, L-sorbose, ou D-glicose, de tal modo que convertem essessubstratos diretamente em vitamina C e/ou 2 -KGA. Aincubação pode ser feita em um meio rico em nitrogênio,contendo, por exemplo, fontes de nitrogênio orgânicas, porexemplo, peptona, extrato de levedura, fermento de pão,uréia, aminoácidos, e corpo fluido de infusão de milho, oufontes de nitrogênio inorgânicas, por exemplo, nitratos esais de amônio, em cujo caso as células serão capazes decrescer ainda mais enquanto produzem vitamina C e/ou 2-KGA.Alternativamente, a incubação pode ser feita em um meiodeficiente em nitrogênio, em cujo caso as células nãocrescerão substancialmente, e estarão em um modo de célulaem repouso, ou modo de biotransformação. Em todos os casos,o meio de incubação pode conter também sais inorgânicos,por exemplo, sulfato de magnésio, sulfato de manganês,fosfato de potássio, e cloreto de cálcio.

Com relação ao processo acima utilizando ummicroorganismo, na fase de crescimento as taxas específicasde crescimento são, por exemplo, pelo menos 0,02 h"1. Paracélulas crescendo no modo de batelada, alimentado porbatelada ou semicontínuo, a taxa de crescimento depende,por exemplo, da composição do meio de crescimento, pH,temperatura e similares. Em geral, as taxas de crescimentopodem estar, por exemplo, em uma faixa de aproximadamente0,05 a aproximadamente 0,2 h"1, pref erivelmente deaproximadamente 0,06 a aproximadamente 0,15 h"1, e maispreferivelmente de aproximadamente 0,07 a aproximadamente0,13 h"1.

Em outro aspecto do processo acima utilizando ummicroorganismo, células em repouso podem ser fornecidas porcultivo do microorganismo respectivo em placas agar dessemodo servindo como recipiente de crescimento, utilizandoessencialmente as mesmas condições, por exemplo, período decultivo, pH, temperatura, meio nutriente como descritoacima, com a adição de agar agar.

Com relação ao processo acima utilizando ummicroorganismo, se a fase de crescimento e produção foremexecutadas em dois recipientes separados, então as célulasa partir da fase de crescimento podem ser colhidas ouconcentradas e transferidas para um segundo recipiente, odenominado recipiente de produção. Esse recipiente podeconter um meio aquoso suplementado com qualquer substratode produção aplicável que pode ser convertido em Vitamina Cpelas células. As células a partir do recipiente decrescimento podem ser colhidas ou concentradas por qualqueroperação apropriada, como por exemplo centrifugação,microfiltração ou ultrafiltração de fluxo cruzado demembrana, filtração, decantação, floculação. As célulasdesse modo obtidas podem ser também transferidas para orecipiente de produção na forma do caldo original a partirdo recipiente de crescimento, sem serem colhidas,concentradas ou lavadas, isto é na forma de uma suspensãode células. Em uma modalidade preferida, as células sãotransferidas a partir do recipiente de crescimento para orecipiente de produção na forma de uma suspensão de célulassem qualquer etapa de lavagem ou isolamento intermediária.

Desse modo, em uma modalidade preferida do processoacima utilizando um microorganismo, a etapa (a) e a (c) doprocesso da presente invenção, como descrito acima, não sãoseparadas por nenhuma etapa de lavagem e/ou separação.

Com relação ao processo acima utilizando ummicroorganismo, se a fase de crescimento e produção foremexecutadas no mesmo recipiente, as células podem sercrescidas sob condições apropriadas até a densidadedesejada de células seguido por uma substituição do meio decrescimento com o meio de produção contendo o substrato deprodução. Tal substituição pode ser, por exemplo, aalimentação do meio de produção para o recipiente ao mesmotempo e taxa que a retirada ou colheita de sobrenadante apartir do recipiente. Para manter as células em repouso norecipiente, as operações para reciclagem ou retenção decélulas podem ser utilizadas, como por exemplo, etapas dereciclagem de células. Tais etapas de reciclagem, porexemplo, incluem porém não são limitadas a métodosutilizando centrífugas, filtros, etapas de micro-filtraçãoou ultrafiltração de fluxo cruzado de membrana, reatores demembrana, floculação ou imobilização de células em matrizesporosas, não porosas ou poliméricas apropriadas. Após umafase de transição, o recipiente é levado a processarcondições sob as quais as células estão em um modo decélula em repouso como definido acima, e o substrato deprodução é eficientemente convertido em Vitamina C.

0 meio aquoso no recipiente de produção, comoutilizado para a etapa de produção com relação ao processoacima utilizando um microorganismo, doravante denominadomeio de produção, pode conter somente o(s) substrato(s) deprodução a ser convertido em vitamina C, ou pode conter,por exemplo, sais inorgânicos adicionais, por exemplo,cloreto de sódio, cloreto de cálcio, sulfato de magnésio,sulfato de manganês, fosfato de potássio, fosfato decálcio, e carbonato de cálcio. 0 meio de produção tambémpode conter fontes de nitrogênio digeríveis como, porexemplo, substâncias orgânicas, por exemplo, peptona,extrato de levedura, uréia, aminoácidos, e corpo fluido deinfusão de milho, e substâncias inorgânicas, por exemplo,amônia, sulfato de amônio, e nitrato de sódio, em taisconcentrações que as células são mantidas em um modo decélula em repouso como definido acima. 0 meio pode ser comou sem uréia e/ou corpo fluido de infusão de milho e/oufermento de pão. A etapa de produção pode ser realizada,por exemplo, em modo de batelada, alimentado por batelada,semicontínuo ou contínuo. No caso de modo alimentado porbatelada, semicontínuo ou contínuo, as duas células apartir do recipiente de crescimento e meio de produçãopodem ser alimentadas contínua ou intermitentemente para orecipiente de produção em taxas de alimentação apropriadas.Alternativamente, somente o meio de produção pode seralimentado contínua ou intermitentemente para o recipientede produção, enquanto as células vindo do recipiente decrescimento são transferidas imediatamente para orecipiente de produção. As células vindo do recipiente decrescimento podem ser utilizadas como uma suspensão decélulas dentro do recipiente de produção ou podem serutilizadas, por exemplo, como células floculadas ouimobilizadas em qualquer fase sólida como matrizes porosasou poliméricas. 0 período de produção, definido como operíodo decorrido entre a entrada do substrato norecipiente de produção e a colheita do sobrenadantecontendo Vitamina C, o denominado fluxo de colheita, podevariar dependendo, por exemplo, do tipo e concentração decélulas, pH, temperatura e meio nutriente a ser utilizado,e é preferivelmente aproximadamente 2 a aproximadamente 100h. O pH e temperatura podem ser diferentes do pH etemperatura da etapa de crescimento, porém sãoessencialmente iguais aos para a etapa de crescimento.

Em uma modalidade preferida do processo acimautilizando um microorganismo, a etapa de produção érealizada em modo contínuo, significando que um primeirofluxo de alimentação contendo as células a partir dorecipiente de crescimento e um segundo fluxo de alimentaçãocontendo o substrato é alimentado contínua ouintermitentemente para o recipiente de produção. O primeirofluxo pode conter somente as células isoladas/separadas apartir do meio de crescimento ou uma suspensão de células,vindo diretamente da etapa de crescimento, isto é, célulassuspensas no meio de crescimento, sem qualquer etapaintermediária de separação de células, lavagem e/ouisolamento. O segundo fluxo de alimentação, como definidoaqui, pode incluir todos os outros fluxos de alimentaçãonecessários para a operação da etapa de produção, porexemplo, o meio de produção compreendendo o substrato naforma de um ou vários fluxos diferentes, água paradiluição, e base para controle de pH.Com relação ao processo acima utilizando ummicroorganismo, quando os dois fluxos são alimentadoscontinuamente, a razão da taxa de alimentação do primeirofluxo para a taxa de alimentação do segundo fluxo podevariar entre aproximadamente 0,01 e aproximadamente 10,preferivelmente entre aproximadamente 0,01 eaproximadamente 5, mais preferivelmente entreaproximadamente 0,02 e aproximadamente 2. Essa razãodepende da concentração de células e substrato no primeiroe segundo fluxo, respectivamente.

Outro modo de executar o processo como acimautilizando um microorganismo da presente invenção, pode serum processo utilizando uma certa densidade de células decélulas em repouso no recipiente de produção. A densidadede células é medida como unidades de absorvência (densidadeóptica) em 600 nm por métodos conhecidos pelas pessoasversadas. Em uma modalidade preferida, a densidade decélulas na etapa de produção é pelo menos aproximadamente10, mais preferivelmente entre aproximadamente 10 eaproximadamente 200, ainda mais preferivelmente entreaproximadamente 15 e aproximadamente 200, ainda maispreferivelmente entre aproximadamente 15 e aproximadamente120, e mais preferivelmente ainda entre aproximadamente 20e aproximadamente 120.

Com relação ao processo acima utilizando ummicroorganismo, para manter as células no recipiente deprodução na densidade desejada de células durante a fase deprodução como executado, por exemplo, no modo contínuo ousemicontínuo, qualquer meio conhecido na técnica pode serutilizado, como por exemplo, reciclagem de células porcentrifugação, filtração, ultrafiltração ou microfiltraçãode fluxo cruzado de membrana, decantação, floculação,retenção de células no recipiente por dispositivos demembrana ou imobilização de células. Além disso, caso aetapa de produção seja executada no modo contínuo ousemicontínuo e as células seja contínua ouintermitentemente alimentadas a partir do recipiente decrescimento, a densidade de células no recipiente deprodução pode ser mantida em um nível constante porexemplo, por colheita de uma quantidade de células a partirdo recipiente de produção correspondendo à quantidade decélulas sendo alimentadas a partir do recipiente decrescimento.

Com relação ao processo acima utilizando ummicroorganismo, a vitamina C produzida contida nodenominado fluxo de colheita é recuperada/colhida a partirdo recipiente de produção. 0 fluxo de colheita podeincluir, por exemplo, solução aquosa contendo células ouisenta de células vindo do recipiente de produção, quecontém Vitamina C como resultado da conversão do substratode produção pelas células em repouso no recipiente deprodução. As células ainda presentes no fluxo de colheitapodem ser separadas da Vitamina C por quaisquer operaçõesconhecidas na técnica, como por exemplo,filtração,centrifugação, decantação, ultrafiltração ou micro-filtração de fluxo cruzado de membrana, ultrafiltração oumicro-filtração de fluxo tangencial ou filtração final.Após essa operação de separação de células, o fluxo decolheita está essencialmente isento de células.

Em um aspecto adicional, o processo da presenteinvenção pode ser combinado com etapas adicionais deseparação e/ou purificação da Vitamina C produzida a partirde outros componentes contidos no fluxo de colheita, istoé, as etapas de processamento denominadas a jusante. Essasetapas podem incluir qualquer meio conhecido por uma pessoaversada, como, por exemplo, concentração, cristalização,precipitação, adsorção, permuta de íons, eletrodiálise,eletrodiálise de membrana bipolar e/ou osmose inversa. AVitamina C pode ser adicionalmente purificada como a formade ácido livre ou qualquer uma de suas formas de salconhecidas por intermédio de operações como, por exemplo,tratamento com carvão ativado, permuta de íons, adsorção eelução, concentração, cristalização, filtração e secagem.Especificamente, uma primeira separação de Vitamina C apartir de outros componentes no fluxo de colheita poderiaser executada por qualquer combinação ou repetiçãoapropriada, por exemplo, dos seguintes métodos:eletrodiálise de dois ou três compartimentos, eletrodiálisede membrana bipolar, osmose inversa ou adsorção, porexemplo, em resinas de permuta de íons ou resinas nãoiônicas. Se a forma resultante da Vitamina C for um sal deácido L-ascórbico, a conversão da forma de sal na forma deácido livre pode ser realizada, por exemplo, poreletrodiálise de membrana bipolar, permuta de íons,técnicas cromatográficas de leito em movimento simulado, esimilares. A combinação das etapas mencionadas, porexemplo, eletrodiálise e eletrodiálise de membrana bipolarem uma etapa poderia ser também utilizada como combinaçãodas etapas mencionadas, por exemplo, várias etapas depermuta de íons utilizando métodos cromatográficos de leitoem movimento simulado. Qualquer um desses procedimentosindividualmente ou em combinação constitui um meioconveniente para isolar e purificar o produto, isto é,Vitamina C. 0 produto desse modo obtido pode seradicionalmente isolado em um modo como, por exemplo porconcentração, cristalização, precipitação, lavagem esecagem dos cristais e/ou purificados adicionalmente, porexemplo, por tratamento com carvão ativado, permuta de íonse/ou recristalização.

Em uma modalidade preferida, a vitamina C é purificadaa partir do fluxo de colheita por uma série de etapas deprocessamento a jusante, como descrito acima, sem ter deser transferida para uma solução não aquosa em qualquermomento desse processamento, isto é, todas as etapas sãoexecutadas em um ambiente aquoso. Tal procedimento deprocessamento a jusante preferido pode incluir, porexemplo, a concentração do fluxo de colheita vindo dorecipiente de produção por intermédio de eletrodiálise dedois ou três compartimentos, conversão de vitamina C em suaforma de sal presente na solução concentração em sua formade ácido por intermédio de eletrodiálise de membranabipolar e/ou permuta de íons, purificação pelos métodoscomo, por exemplo, tratamento com carvão ativado, resinasnão iônicas ou de permuta de íon, seguido por uma etapa deconcentração adicional e cristalização. Esses cristaispodem ser separados, lavados e secos. Se necessário, oscristais podem ser novamente resolubilizados em água,tratados com carvão ativado e/ou resinas de permuta de íonse recristalizadas. Esses cristais podem ser entãoseparados, lavados e secos.Modalidades vantajosas da invenção tornar-se-ãoevidentes a partir das reivindicações dependentes. Esses eoutros aspectos e modalidades da presente invenção devemser evidentes para aqueles versados na técnica a partir dosensinamentos da presente invenção.

A seqüência do gene compreendendo uma seqüência denucleotídeos de acordo com SEQ ID NO: 1 codificando umaproteína de SMS 27 foi determinada pelo sequenciamento deum clone genômico obtido a partir de Gluconobacter oxydansIFO 3293 .

A invenção também se refere a um polinucleotídeocodificando pelo menos um fragmento biologicamente ativo ouderivado de um polipeptídeo de SMS 27 como mostrado na SEQID NO: 2.

Como utilizado aqui, "derivado ou fragmentobiologicamente ativo" significa um polipeptídeo que retémessencialmente a mesma função ou atividade biológica que opolipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 2. Os exemplos deatividade biológica podem, por exemplo, ser atividadeenzimática, atividade de sinalização ou reatividade deanticorpo. 0 termo "mesma função biológica" ou "equivalentefuncional" como utilizado aqui, significa que a proteínatem essencialmente a mesma atividade biológica, porexemplo, reatividade enzimática, sinalização ou deanticorpo, como um polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO:2.

Os polipeptídeos e polinucleotídeos da presenteinvenção são preferivelmente fornecidos em uma formaisolada, e preferivelmente são purificados parahomogeneidade.

0 termo "isolado" quer dizer que o material é removidode seu ambiente original (por exemplo, o ambiente naturalse estiver ocorrendo naturalmente). Por exemplo, umpolipeptideo ou polinucleotídeo de ocorrência naturalpresente em um microorganismo vivo não é isolado, porém omesmo polinucleotídeo ou polipeptideo, separado de algunsou todos dos materiais coexistentes no sistema natural, éisolado. Tais polinucleotídeos poderiam ser parte de umvetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos poderiamser parte de uma composição e ainda ser isolados em que talvetor ou composição não faça parte de seu ambiente natural.

Um polinucleotídeo ou ácido nucléico isolado comoutilizado aqui, pode ser um DNA ou RNA que não éimediatamente contínuo com as duas seqüências decodificação com as quais está imediatamente contínua (umana extremidade-5' e uma na extremidade-3' ) no genoma deocorrência natural do organismo do qual é derivado. Dessemodo, em uma modalidade, um ácido nucléico inclui algumasou todas as seqüências de não codificação 5' (por exemplo,promotor) que estão imediatamente contíguos à seqüência decodificação. 0 termo "polinucleotídeo isolado" inclui,portanto, por exemplo, um DNA recombinante que éincorporado em um vetor, em um vírus ou plasmídeo dereplicação autônoma, ou no DNA genômico de um procariota oueucariota, ou que existe como uma molécula separada (porexemplo, um cDNA ou um fragmento de DNA genômico produzidopor PCR ou tratamento de endonuclease de restrição)independente de outras seqüências. Também inclui um DNArecombinante que faz parte de um gene híbrido codificandoum polipeptideo adicional que é substancialmente livre dematerial celular, material viral ou meio de cultura (quandoproduzido por técnicas de DNA recombinante), ou precursoresquímicos ou outros produtos químicos (quando quimicamentesintetizado). Além disso, um "fragmento de ácido nucléicoisolado" é um fragmento de ácido nucléico que não ocorrenaturalmente como um fragmento e não seria encontrado noestado natural.

Como utilizado aqui, os termos "polinucleotídeo","gene" e "gene recombinante" se referem a moléculas deácido nucléico que podem ser isoladas do DNA cromossômico,que incluem um quadro de leitura aberto codificando umaproteína, por exemplo, proteínas de SMS G. oxydans IFO3293. Um polinucleotídeo pode incluir uma seqüência depolinucleotídeo como mostrado na SEQ ID NO: 1 ou fragmentosdo mesmo e regiões a montante e a jusante das seqüências degene que podem incluir, por exemplo, regiões promotoras,regiões reguladoras e regiões terminadoras importantes paraa expressão apropriada e estabilização do polipeptídeoderivado das mesmas.

Um gene pode incluir seqüências de codificação,seqüências não de codificação como, por exemplo, seqüênciasnão traduzidas localizadas nas extremidades 3' e 5' daregião de codificação de um gene, e seqüências reguladoras.Além disso, um gene se refere a uma molécula de ácidonucléico isolado, como definido aqui. É adicionalmentereconhecido pela pessoa versada que os polimorfismos deseqüência de DNA que levam a mudanças nas seqüências deaminoácido de proteínas de SMS podem existir em umapopulação, por exemplo, a população de Gluconobacteroxydans. Tal polimorfismo genético no gene de SMS 27 podeexistir entre indivíduos em uma população devido à variaçãonatural ou em células de populações diferentes. Taisvariações naturais podem resultar, tipicamente, em 1-5% devariância na seqüência de nucleotídeos do gene de SMS 27.Todas e quaisquer tais variações de nucleotídeo e opolimorfismo de aminoácido resultante em SMS 27 sãoresultado de variação natural e que não alteram a atividadefuncional de proteínas de SMS, pretendem estarcompreendidas no escopo da invenção.

Como utilizado aqui, os termos "polinucleotídeo" ou"molécula de ácido nucléico" pretendem incluir moléculas deDNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA(por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou RNA geradoutilizando análogos de nucleotídeo. A molécula de ácidonucléico pode ser de fita única ou fita dupla, porémpreferivelmente é DNA de fita dupla. O ácido nucléico podeser sintetizado utilizando análogos ou derivados deoligonucleotídeo (por exemplo, nucleotídeos defosforotioato ou inosina). Tais oligonucleotídeos podem serutilizados, por exemplo, para preparar ácidos nucléicos quetêm capacidades de pares de base alteradas ou resistênciaaumentada a nucleases.

A informação de seqüência como fornecida aqui, nãodeve ser tão estreitamente construída de modo a exigirinclusão de bases erroneamente identificadas. As seqüênciasespecíficas reveladas aqui podem ser facilmente utilizadaspara isolar o gene completo a partir de um microorganismorecombinante ou não recombinante capaz de converter umadada fonte de carbono diretamente em Vitamina C e/ou 2-KGA,em particular Gluconobacter oxydans, preferivelmenteGluconobacter oxydans IFO 32 93 que por sua vez pode serfacilmente submetido a análises de seqüência adicionaisdesse modo identificando erros de seqüência.

A menos que de outro modo indicado, todas asseqüências de nucleotídeo determinadas pelo sequenciamentode uma molécula de DNA da presente invenção foramdeterminadas utilizando um seqüenciador de DNA automatizadoe todas as seqüências de aminoácidos de polipeptídeoscodificados por moléculas de DNA determinadas aqui foramprevistas por translação de uma seqüência de DNAdeterminada como acima. Portanto, como sabido na técnicapara qualquer seqüência de DNA determinada por essaabordagem automatizada, qualquer seqüência de nucleotídeodeterminada aqui pode conter alguns erros. Seqüências denucleotídeo determinadas por automação são tipicamente pelomenos aproximadamente 90% idênticas, mais tipicamente pelomenos aproximadamente 95% a pelo menos aproximadamente99,9% idênticas à seqüência de nucleotídeo efetiva damolécula de DNA seqüenciada. A seqüência efetiva pode sermais precisamente determinada por outras abordagensincluindo métodos de sequenciamento de DNA manual bemconhecidos na técnica. Como é também conhecida na técnica,uma única inserção ou deleção em uma seqüência denucleotídeos determinada em comparação com a seqüênciaefetiva causará um deslocamento de quadro em translação daseqüência de nucleotídeo de tal modo que a seqüência deaminoácidos prevista codificada por uma seqüência denucleotídeo determinada será totalmente diferente daseqüência de aminoácidos efetivamente codificada pelamolécula de DNA seqüenciada, iniciando no ponto dessainserção ou deleção.A pessoa versada na técnica é capaz de identificaressas bases erroneamente identificadas e sabe como corrigiresses erros.

Uma molécula de ácido nucléico, de acordo com ainvenção, pode compreender somente uma porção ou umfragmento da seqüência de ácido nucléico fornecida pelapresente invenção, como, por exemplo, a seqüência mostradana SEQ ID NO: 1, por exemplo, um fragmento que pode serutilizado como uma sonda ou iniciador como, por exemplo,SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4 ou um fragmento codificandouma porção de uma proteína, de acordo com a invenção. Aseqüência de nucleotídeo determinada a partir da clonagemdo gene de SMS 2 7 permite a geração de sondas e iniciadoresprojetados para uso na identificação e/ou clonagem deoutros membros da família SMS 27, bem como homólogos de SMS2 7 de outras espécies. A sonda/iniciador compreende,tipicamente, oligonucleotídeos substancialmente purificadosque compreende, tipicamente, uma região de seqüência denucleotídeo que hibridiza preferivelmente sob condiçõesaltamente rigorosas a pelo menos aproximadamente 12 ou 15,preferivelmente aproximadamente 18 ou 20, maispreferivelmente aproximadamente 22 ou 25, ainda maispreferivelmente aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65 ou 75 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma seqüênciade nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento ouderivado da mesma.

Uma molécula de ácido nucléico abrangendo toda ou umaporção da seqüência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 1 podeser também isolada pela reação de cadeia de polimerase(PCR) utilizando iniciadores de oligonucleotídeo sintéticoprojetados com base nas informações de seqüência contidasaqui.

Um ácido nucléico da invenção pode ser amplificadoutilizando cDNA, mRNA ou alternativamente, DNA genômico,como padrão e iniciadores de oligonucleotídeo apropriados,de acordo com técnicas de amplificação de PCR padrão. 0ácido nucléico desse modo amplificado pode ser clonado emum vetor apropriado e caracterizado pelo fato de análise deseqüência de DNA.

Os fragmentos de um polinucleotídeo, de acordo com ainvenção, podem compreender também polinucleotídeos nãocodificando polipeptídeos funcionais. Tais polinucleotídeospodem funcionar como sondas ou iniciadores para uma reaçãode PCR.

Ácidos nucléicos, de acordo com a invenção,independente de se codificam polipeptídeos funcionais ounão funcionais, podem ser utilizados como sondas dehibridização ou iniciadores de reação de cadeia depolimerase (PCR). Os usos das moléculas de ácido nucléicoda presente invenção que não codificam um polipeptídeotendo uma atividade de SMS 27 incluem, entre outras coisas,(1) isolar o gene codificando a proteína da presenteinvenção, ou variantes alélicos do mesmo a partir de umabiblioteca de cDNA, por exemplo, de outros organismos doque Gluconobacter oxydans e (2) análise de Northen blotpara detectar expressão de mRNA da proteína em célulasespecíficas ou (3) uso em aumentar e/ou aperfeiçoar afunção ou atividade de genes de SMS 27 homólogos nos outrosorganismos.

Sondas baseadas nas seqüências de nucleotídeofornecidas aqui, podem ser utilizadas para detectartranscritos ou seqüências genômicas codificando proteínasiguais ou homólogas, por exemplo, em outros organismos.Moléculas de ácido nucléico correspondendo a variantesnaturais e homólogos de não G.oxydans do DNA G. oxydans SMS27 da invenção que são também abrangidas pela presenteinvenção, podem ser isoladas com base em sua homologia aoácido nucléico G. oxydans SMS 27 revelado aqui utilizando oDNA de G. oxydans, ou uma porção do mesmo, como uma sondade hibridização de acordo com técnicas de hibridizaçãopadrão, preferivelmente sob condições de hibridizaçãoaltamente rigorosas.

Em modalidades preferidas, a sonda compreende ainda umgrupo de rótulo fixado à mesma, por exemplo, o grupo derótulo pode ser um radioisótopo, um composto fluorescente,uma enzima, ou um co-factor de enzima.

As seqüências de gene homólogo podem ser isoladas, porexemplo, pela execução de PCR utilizando dois grupos deiniciador de oligonucletídeo de degenerar projetados combase em sequencias de nucleotxdeo como ensinado aqui.

0 padrão para a reação pode ser cDNA obtido portranscrição inversa de mRNA preparado de cepas conhecidasou que se suspeita expressarem um polinucleotídeo de acordocom a invenção. 0 produto de PCR pode ser subclonado eseqüenciado para assegurar que as seqüências amplificadasrepresentam as seqüências de uma nova seqüência de ácidonucléico como descrito aqui, ou um equivalente funcional damesma.

0 fragmento de PCR pode ser então utilizado paraisolar um clone de cDNA de comprimento completo por umavariedade de métodos conhecidos. Por exemplo, o fragmentoamplificado pode ser rotulado e utilizado para classificaruma biblioteca de cDNA de cosmídio ou bacteriófago.Alternativamente, o fragmento rotulado pode ser utilizadopara classificar uma biblioteca genômica.

A tecnologia de PCR também pode ser utilizada paraisolar seqüências de cDNA de comprimento total a partir deoutros organismos. Por exemplo, RNA pode ser isolado,seguindo procedimentos padrão, a partir de uma fonte de

tecido ou celular apropriada. Uma reação de transcriçãoinversa pode ser executada no RNA utilizando um iniciadorde oligonucleotideo específico para a extremidade mais 5'do fragmento amplificado para a iniciação da síntese deprimeira fita.

0 híbrido de RNA/DNA resultante pode então ser"caudado" (por exemplo, com guaninas) utilizando uma reaçãode transferase terminal padrão, o híbrido pode ser digeridocom RNaseH, e a síntese de segunda fita pode ser entãoiniciada (por exemplo, com iniciador poli-C). Desse modo,seqüências de cDNA a montante do fragmento amplificadopodem ser facilmente isolados. Para um exame de estratégiasde clonagem úteis, vide, por exemplo, Sambrook e outros,supra; e Ausubel e outros, supra.

Além disso, ácidos nucléicos codificando outrosmembros da família SMS 27, que desse modo têm uma seqüênciade nucleotídeo que difere de uma seqüência de nucleotídeode acordo com SEQ ID N0:1, estão compreendidos no escopo dainvenção. Além disso, ácidos nucléicos codificandoproteínas de SMS 27 a partir de espécies diferentes quedesse modo podem ter uma seqüência de nucleotídeo quedifere de uma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ IDNO: 1 estão compreendidas no escopo da invenção.

A invenção também se refere a um polinucleotídeoisolado hibridizável sob condições rigorosas,preferivelmente sob condições altamente rigorosas, em umpolinucleotídeo como o da presente invenção, como porexemplo, um polinucleotídeo mostrado na SEQ ID NO: 1.Vantajosamente, tal polinucleotídeo pode ser obtido de ummicroorganismo capaz de converter uma dada fonte de carbonodiretamente em Vitamina C, em particular Gluconobacteroxydans, preferivelmente Gluconobacter oxydans IFO 3293.

Como utilizado aqui, o termo "hibridizar" pretendedescrever condições para hibridização e lavagem sob asquais as seqüências de nucleotídeo pelo menosaproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 60%, pelomenos aproximadamente 70%, mais preferivelmente pelo menosaproximadamente 80%, ainda mais preferivelmente pelo menosaproximadamente 85% a 90%, mais preferivelmente ainda pelomenos 95% homólogas entre si permanecem tipicamentehibridizadas entre si.

Em uma modalidade, um ácido nucléico da invenção épelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oumais homólogo a uma seqüência de ácido nucléico mostrada naSEQ ID NO: 1 ou complemento da mesma.

Um exemplo não limitador preferido de condições dehibridização rigorosas é hibridização em 6x de cloreto desódio/citrato de sódio (SSC) em aproximadamente 45°C,seguido por uma ou mais lavagens em Ix SSC, 0,1% SDS a50°C, preferivelmente a 55°C, mais preferivelmente a 60°C eainda mais preferivelmente a 65°C.

Condições altamente vigorosas incluem incubações a420C por um período de vários dias, como 2-4 dias,utilizando uma sonda de DNA rotulada, como sonda de DNArotulada com digoxigenin (DIG), seguido por uma ou maislavagens em 2x SSC, 0,1% SDS em temperatura ambiente e umaou mais lavagens em 0, 5x SSC, 0,1% SDS ou 0, Ix SSC, 0,1%SDS a 65 - 68°C. Em particular, condições altamente rigorosasincluem, por exemplo, 2 h a 4 dias de incubação a 42 0Cutilizando uma sonda de DNA rotulada DIG (preparada, porexemplo, utilizando um sistema de rotulação DIG; RocheDiagnostics GmbH, 68298 Mannheim, Alemanha) em uma soluçãocomo solução DigEasyHyb (Roche Diagnostics GmbH) com ou sem100 μg/ml de DNA de esperma de salmão, ou uma soluçãocompreendendo formamida a 5 0%, 5x SSC (150 mM NaCl, 15 mMde citrato trissódico), 0,02% de sulfato de dodecil desódio, 0,1% de N-lauroíl sarcosina, e 2% de reagente debloqueio (Roche Diagnostics GmbH) seguido por lavagem dosfiltros duas vezes por 5 a 15 minutos em 2x SSC e 0,1% SDSem temperatura ambiente e então lavagem duas vezes por 15-30 minutos em 0,5x SSC e 0,1% SDS ou 0,Ix SSC e 0,1% SDS a65-68°C.

Preferivelmente, uma molécula de ácido nucléicoisolada da invenção que hibridiza preferivelmente sobcondições altamente rigorosas em uma seqüência denucleotídeo da invenção corresponde a uma molécula de ácidonucléico de ocorrência natural. Como utilizado aqui, umamolécula de ácido nucléico de "ocorrência natural" serefere a uma molécula de RNA ou DNA tendo uma seqüência denucleotídeo que ocorre na natureza (por exemplo, codificauma proteína natural). Em uma modalidade, o ácido nucléicocodifica uma proteína de G. oxydans SMS 27 natural.

0 técnico especializado saberá quais condições aplicarpara condições de hibridização rigorosa e altamenterigorosa. A orientação adicional em relação a taiscondições é prontamente disponível na técnica, por exemplo,em Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; e Ausubel e outros(eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology (JohnWiley & Sons, N.Y.). Evidentemente, um polinucleotídeo quehibridiza somente a uma seqüência poli (A) (como o tratopoli (A) terminal-3' de mRNAs), ou a uma extensãocomplementar de resíduos T (ou U), não seria incluído em umpolinucleotídeo da invenção utilizado para hibridizarespecificamente a uma porção de um ácido nucléico dainvenção, uma vez que tal polinucleotídeo hibridizaria aqualquer molécula de ácido nucléico contendo uma extensãode poli (A) ou complemento do mesmo (por exemplo,praticamente qualquer clone de cDNA de fita dupla).

Em uma abordagem típica, bibliotecas de cDNA ou DNAgenômico construído de outros organismos, por exemplo,microorganismos capazes de converter uma dada fonte decarbono diretamente em Vitamina C, em particular outraespécie de Gluconobacter pode ser classificada.

Por exemplo, as cepas de Gluconobacter podem serclassificadas em relação a polinucleotídeos homólogos poranálise de Southern e/ou Northern blot. Após detecção detranscritos homólogos em polinucleotídeos, de acordo com ainvenção, bibliotecas de DNA podem ser construídas de RNAisolado a partir da cepa apropriada, utilizando técnicaspadrão bem conhecidas por aqueles versados na técnica.Alternativamente, uma biblioteca de DNA genômico total podeser classificada utilizando uma sonda hibridizável em umpolinucleotídeo, de acordo com a invenção.

Uma molécula de ácido nucléico da presente invenção,como por exemplo, uma molécula de ácido nucléico mostradana SEQ ID NO: 1 ou um fragmento ou derivado da mesma, podeser isolado utilizando técnicas de biologia molecularpadrão e as informações de seqüência fornecidas aqui. Porexemplo, utilizando toda ou uma parte da seqüência de ácidonucléico mostrada na SEQ ID NO: 1 como uma sonda dehibridização, moléculas de ácido nucléico de acordo com ainvenção podem ser isoladas utilizando técnicas de clonageme hibridização padrão (por exemplo, como descrito emSambrook, J., Fritsh, E.F., e Maniatis, T. MolecularCloning: A Laboratory Manual. 2a ed., Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY, 1989) .

Além disso, oligonucleotídeos correspondendo a ouhibridizáveis com seqüências de nucleotídeo, de acordo coma invenção, podem ser preparados por técnicas sintéticaspadrão, por exemplo, utilizando um sintetizador de DNAautomatizado.

Os termos "homologia" ou "percentagem de identidade"são utilizados de forma intercambiável aqui. Para fins dapresente invenção, é definido aqui que para determinar apercentagem de identidade de duas seqüências de aminoácidoou de duas seqüências de ácido nucléico, as seqüências sãoalinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo,intervalos podem ser introduzidos na seqüência de umaprimeira seqüência de ácido nucléico ou aminoácido paraalinhamento ótimo com uma segunda seqüência de ácidonucléico ou aminoácido). Os resíduos de aminoácido ounucleotídeos em posições de aminoácido correspondentes ouposições de nucleotídeo são então comparados. Quando umaposição na primeira seqüência é ocupada pelo mesmo resíduode aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondentena segunda seqüência, então as moléculas são idênticasnaquela posição. A percentagem de identidade entre as duasseqüências é uma função do número de posições idênticascompartilhadas pelas seqüências (isto é, % de identidade =número de posições idênticas/número total de posições (istoé, posições de sobreposição) χ 100) . Preferivelmente, asduas seqüências são do mesmo comprimento.

A pessoa versada estará ciente do fato de que váriosprogramas de computador diferentes são disponíveis paradeterminar a homologia entre duas seqüências. Por exemplo,uma comparação de seqüências e determinação de percentagemde identidade entre duas seqüências pode ser realizadautilizando um algoritmo matemático. Em uma modalidadepreferida, a percentagem de identidade entre duasseqüências de aminoácido é determinada utilizando oalgoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Bio. (48): 444-453(1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote desoftware GCG (disponível em http://www.accelrys.com),utilizando uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e umpeso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4, e um pesode comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A pessoa versadareconhecerá que todos esses parâmetros diferentesfornecerão resultados levemente diferentes porém que apercentagem de identidade geral de duas seqüências não ésignificativamente alterada ao utilizar diferentesalgoritmos.

Ainda em outra modalidade, a percentagem de identidadeentre duas seqüências de nucleotideo é determinadautilizando o programa GAP no pacote de software GCG(disponível em http://www.accelrys.com) utilizando umamatriz NWSgapdna.CMP e um peso de intervalo de 40, 50, 60,7 0 ou 8 0 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Emoutra modalidade, a percentagem de identidade entre duasseqüências de nucleotideo ou aminoácido é determinadautilizando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS4:11-17 (1989) que foi incorporado no programa ALIGN(versão 2.0) (disponível emhttp://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi) utilizando umatabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade decomprimento de intervalo de 12 e uma penalidade deintervalo de 4.

As seqüências de proteína e ácido nucléico da presenteinvenção podem ser adicionalmente utilizadas como uma"seqüência de consulta" para executar uma busca contrabancos de dados públicos para, por exemplo, identificaroutros membros da família ou seqüências relacionadas. Taisbuscas podem ser executadas utilizando os programas BLASTNe BLASTX (versão 2.0) de Altschul, e outros (1990) J. Mol.Biol. 215:403-10. Buscas de nucleotideo BLAST podem serexecutadas com o programa BLASTN, marcação = 100,comprimento de palavra = 12 para obter seqüências denucleotideo homólogas às moléculas de ácido nucléico dapresente invenção. Buscas de proteína BLAST podem serexecutadas com o programa BLASTX, marcação = 50,comprimento de palavra = 3 para obter seqüências deaminoácido homólogas às moléculas de proteína da presenteinvenção. Para obter alinhamentos com intervalo para finsde comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado comodescrito em Altschul e outros (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Ao utilizar programas BLAST e GappedBLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (porexemplo, BLASTX e BLASTN) podem ser utilizados. Videhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Em outra modalidade preferida, uma molécula de ácidonucléico isolada da invenção compreende uma molécula deácido nucléico que é o complemento de uma seqüência denucleotídeo como da presente invenção, como por exemplo, aseqüência mostrada na SEQ ID NO: 1. Uma molécula de ácidonucléico, que é complementar a uma seqüência de nucleotídeorevelada aqui, é uma que é suficientemente complementar auma seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO: 1 detal modo que pode hibridizar com a seqüência de nucleotídeodesse modo formando um dúplex estável.

Em uma modalidade preferida adicional, um ácidonucléico da invenção como mostrado na SEQ ID NO: 1 ou ocomplemento do mesmo contém pelo menos uma mutação que levaa um produto de gene com atividade/função modificada. Pelomenos uma mutação pode ser introduzida por métodosdescritos aqui. Em um aspecto, pelo menos uma mutação levaa uma proteína de SMS 2 7 cuja função comparada com a cópiado tipo selvagem é total ou parcialmente destruída. Osmétodos para introduzir essas mutações são bem conhecidosna técnica.O termo "redução" de atividade, como utilizado aqui,abrange diminuir a atividade de um ou mais polipeptídeos noorganismo de produção, que por sua vez são codificadospelos polinucleotídeos correspondentes descritos aqui. Hádiversos métodos disponíveis na técnica para realizar aredução de atividade de uma dada proteína, nesse caso aproteína de SMS 27. Em geral, a atividade específica de umaproteína pode ser diminuída ou o número de cópia daproteína pode ser diminuído.

Para facilitar essa diminuição, o número de cópia dosgenes correspondendo aos polinucleotídeos descritos aquipode ser diminuído, como por exemplo, por subexpressão ouruptura de um gene. Diz-se que um gene é "sub-expresso" seo nível de transcrição do gene for reduzido em comparaçãocom o gene do tipo selvagem. Isso pode ser medido, porexemplo, por análise de Northern blot quantificando aquantidade de mRNA como uma indicação para expressão degene. Como utilizado aqui, um gene é sub-expresso se aquantidade de mRNA gerado for diminuída em pelo menos 1%,2%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% ou até mesmo mais doque 500%, em comparação com a quantidade de mRNA gerado deum gene do tipo selvagem. Alternativamente, um promotorfraco pode ser utilizado para orientar a expressão dopolinucleotídeo. Em outra modalidade, o promotor, regiãoreguladora e/ou o sítio de ligação de ribossomo a montantedo gene podem ser alterados para obter a expressãodescendente. A expressão também pode ser reduzida peladiminuição da meia-vida relativa do RNA mensageiro. Emoutra modalidade, a atividade do próprio polipeptídeo podeser diminuída empregando uma ou mais mutações na seqüênciade aminoácido de polipeptídeo, que diminui a atividade. Porexemplo, a alteração da afinidade do polipeptídeo para seusubstrato correspondente pode resultar em atividadereduzida. De modo semelhante, a meia vida relativa dopolipeptídeo pode ser diminuída. Em qualquer cenário, sejaexpressão de gene reduzida ou atividade reduzida, a reduçãopode ser obtida pela alteração da composição do meio decultura de célula e/ou métodos utilizados para cultivo."Expressão reduzida" ou "atividade reduzida", comoutilizado aqui, significa uma diminuição de pelo menos 5%,10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 200% ou mesmo mais do que 500%,em comparação com uma proteína do tipo selvagem,polinucleotídeo, gene; ou a atividade e/ou a concentraçãoda proteína presente antes dos polinucleotídeos oupolipeptídeos serem reduzidos. A atividade da proteína deSMS 27 pode ser também reduzida pelo contato da proteínacom um inibidor geral ou específico de sua atividade. Ostermos "atividade reduzida", "atividade diminuída ouabolida" são utilizados de forma intercambiável aqui.

Outro aspecto da invenção se refere a vetores,contendo um ácido nucléico codificando uma proteína deacordo com a invenção ou um equivalente funcional ou porçãodo mesmo. Como utilizado aqui, o termo "vetor" se refere auma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outroácido nucléico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um"plasmídeo", que se refere a um Ioop de DNA de fita dupla,circular no qual segmentos adicionais de DNA podem serligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, ondesegmentos adicionais de DNA podem ser ligados no genomaviral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma emuma célula hospedeira na qual são introduzidos (porexemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicaçãobacteriana). Outros vetores são integrados no genoma de umacélula hospedeira após introdução na célula hospedeira, eesse modo são replicados juntamente com o genomahospedeiro.

Os vetores recombinantes da invenção compreendem umácido nucléico da invenção em uma forma apropriada paraexpressão do ácido nucléico em uma célula hospedeira, o quesignifica que o vetor de expressão recombinante inclui umaou mais seqüências reguladoras, selecionadas com base nascélulas hospedeiras a serem utilizadas para expressão, queé operativamente ligado à seqüência de ácido nucléico a serexpressa. Em um vetor de expressão recombinante,"operativamente ligado" pretende significar que a seqüênciade nucleotídeo de interesse é ligada à(s) seqüência(s)reguladora(s) em um modo que permite expressão da seqüênciade nucleotídeo (por exemplo, em um sistema detranscrição/translação in vitro ou em uma célula hospedeiraquando o vetor é introduzido na célula hospedeira). 0 termo"seqüência reguladora" pretende incluir promotores,intensificadores e outros elementos de controle deexpressão (por exemplo, atenuador). Tais seqüênciasreguladoras são descritas, por exemplo, em Goeddel; GeneExpression Technology: Methods in Enzymology 185, AcademicPress, San Diego, CA (1990) . Seqüências reguladoras incluemaquelas que orientam expressão induzível ou constitutiva deuma seqüência de nucleotídeo em muitos tipos de célulashospedeiras e aquelas que orientam a expressão da seqüênciade nucleotídeo somente em uma certa célula hospedeira (porexemplo, seqüências reguladoras específicas de tecido).Será reconhecido por aqueles versados na técnica que odesenho do vetor de expressão pode depender de tais fatorescomo a escolha da célula hospedeira a ser transformada, onível de expressão de proteína desejado, etc. Os vetores deexpressão da invenção podem ser introduzidos nas célulashospedeiras para desse modo produzir proteínas oupeptídeos, codificados por ácidos nucléicos como descritoaqui, incluindo, porém não limitado a, proteínas mutantes,fragmentos das mesmas, variantes ou equivalentes funcionaisdas mesmas, e proteínas de fusão, codificadas por um ácidonucléico como descrito aqui, por exemplo, proteínas de SMS27, formas mutantes de proteínas de SMS 27, proteínas defusão e similares.

Os vetores de expressão recombinante da invenção podemser projetados para expressão de proteínas de SMS 2 7 em ummicroorganismo apropriado. Por exemplo, uma proteína deacordo com a invenção pode ser expressa em célulasbacterianas como cepas que pertence aos gênerosGluconobacter, Gluconacetobacter ou Aeetobaeter. Vetores deexpressão úteis na presente invenção incluem vetoresderivados de cromossomo, epissomo e vírus, por exemplo,vetores derivados de plasmídeos bacterianos, bacteriófagos,e vetores derivados de combinações dos mesmos como aquelesderivados de elementos genéticos de bacteriófago eplasmídeo, como cosmídios e fagemídios.

0 inserto de DNA pode ser operativamente ligado a umpromotor apropriado, que pode ser um promotor constitutivoou induzível. A pessoa versada saberá como selecionarpromotores apropriados. As construções de expressão podemconter sítios para iniciação de transcrição, terminação e,na região transcrita, um sítio de ligação de ribossomo paratranslação. A porção de codificação dos transcritos madurosexpressos pelas construções pode incluir, preferivelmente,um códon de iniciação no início e um códon de terminaçãoapropriadamente posicionado na extremidade do polipeptídeoa ser traduzida.

O DNA de vetor pode ser introduzido em célulashospedeiras apropriadas através de técnicas de transfecçãoou transformação, convencionais. Como utilizado aqui, ostermos "transformação", "transconjugação" e "transfecção"pretendem se referir a uma variedade de técnicasreconhecidas na arte para introduzir ácido nucléicoestranho (por exemplo, DNA) em uma célula hospedeira,incluindo co-precipitação de fosfato de cálcio ou cloretode cálcio, transfecção mediada por dextrano-DEAE,transdução, infecção, lipofecção, transfecção mediada porlipídeo catiônico ou eletroporação. Métodos apropriadospara transformar ou transfectar células hospedeiras podemser encontrados em Sambrook, e outros, (supra), Davis eoutros, Basic Methods in Molecular Biology (1986) e outrosmanuais de laboratório.

Para identificar e selecionar células que integraram oDNA estranho em seu genoma, um gene que codifica ummarcador selecionável (Por exemplo, resistência aantibiótico) é geneticamente introduzido nas célulashospedeiras juntamente com o gene de interesse. Marcadoresselecionáveis preferidos incluem aqueles que conferemresistência a drogas, como canamicina, tetraciclina,ampicilina e estreptomicina. Um ácido nucléico codificandoum marcador selecionável é preferivelmente introduzido emuma célula hospedeira no mesmo vetor que aquele quecodifica uma proteína de acordo com a invenção ou pode serintroduzido em um vetor separador como, por exemplo, umvetor suicide, que não pode replicar nas célulashospedeiras. As células estavelmente transfectadas com oácido nucléico introduzido podem ser identificadas porseleção de droga (por exemplo, células que incorporaram ogene marcador selecionável sobreviverão, enquanto as outrascélulas morrerão).

A invenção provê também um polipeptídeo isolado tendoa seqüência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 2 ou umaseqüência de aminoácido que pode ser obtido por expressãode um polinucleotídeo da presente invenção, como porexemplo, uma seqüência de polinucleotídeo mostrada na SEQID NO:1 em um hospedeiro apropriado.

Polipeptídeos de acordo com a invenção, podem contersomente substituições conservativas de um ou maisaminoácidos na seqüência de aminoácidos representada pelaSEQ ID NO: 2 ou substituições, inserções ou deleções deaminoácidos não essenciais. Por conseguinte, um aminoácidonão essencial é um resíduo que pode ser alterado nasseqüências de aminoácidos mostradas na SEQ ID NO: 2 semalterar substancialmente a função biológica. Por exemplo,resíduos de aminoácido que são conservados entre asproteínas da presente invenção, são previstos como sendoparticularmente não sensíveis à alteração. Além disso,aminoácidos conservados entre as proteínas, de acordo com apresente invenção e outras proteínas de SMS 27 não sãoprovavelmente sensíveis à alteração.O termo "substituição conservativa" pretendesignificar que uma substituição na qual o resíduo deaminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendouma cadeia lateral similar. Essas famílias são conhecidasna técnica e incluem aminoácidos com cadeias lateraisbásicas (por exemplo, lisina, arginina e histidina),cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico,ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas(por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina,treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares(por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina,prolina, fenil alanina, metionina, triptofano), cadeiaslaterais ramificadas-beta (por exemplo, treonina, valina,isoleucina), e cadeias alterais aromáticas (por exemplo,tirosina, fenil alanina, triptofano, histidina).

Como mencionado acima, os polinucleotídeos da invençãopodem ser utilizados na engenharia genética de uma célulahospedeira apropriada para tornar a mesma melhor e maiseficiente na fermentação, por exemplo, em um processo defermentação direta para Vitamina C.

De acordo com a invenção, uma célula hospedeirageneticamente construída/recombinantemente produzida(também mencionada como uma célula recombinante ou célulatransformada) contendo tal polinucleotídeo modificado ondea função da proteína ligada é significativamente modificadaem comparação com uma célula do tipo selvagem de tal modoque o rendimento, produção e/ou eficiência de produção deum ou mais produtos de fermentação como Vitamina C éaperfeiçoada. A célula hospedeira pode ser selecionada deum microorganismo capaz de produzir diretamente um ou maisprodutos de fermentação como, por exemplo, Vitamina C apartir de uma fonte de carbono dada, em particular,Gluconobacter oxydans, preferivelmente G. oxydans IFO 3293.

Uma "célula transformada" ou "célula recombinante" éuma célula na qual (ou em um ancestral da qual) foiintroduzido, por intermédio de técnicas de DNArecombinante, um ácido nucléico de acordo com a invenção,ou onde a atividade da proteína de SMS 2 7 foi diminuída ouabolida. Células hospedeiras apropriadas incluem células demicroorganismos capazes de produzir um produto defermentação dado, por exemplo, converter uma fonte decarbono dada diretamente em vitamina C. Particularmente,essas incluem cepas dos gêneros Pseudomonas, Pantoea,Escherichia, Carynebacterium, ketogulonicigenium e15 bactérias de ácido acético como por exemplo, Gluconobacter,Aeetobaeter ou Gluconoaeetobaeter, preferivelmenteAeetobaeter sp., Aeetobaeter aceti, Glueonobaeterfrateurii, Glueonobaeter cerinus, Glueonobaeterthailandicus, Glueonobaeter oxydans, mais preferivelmenteG. oxydans, mais preferivelmente G. oxydans IFO 3293.

Para melhorar a produção de Vitamina C e/ou 2-KGA deuma certa célula hospedeira recombinante, a expressão degene SMS 27 pode ser inibida naquele organismo, porexemplo, por alvejar seqüências de nucleotídeocomplementares à região reguladora de uma seqüência denucleotídeo de SMS 27 (por exemplo, um promotor de SMS 27e/ou intensificadores) para formar estruturas helicoidaistriplas que evitam transcrição de um gene de SMS 27 emcélulas alvo. Vide, genericamente, Helene, C. (1991)Anticancer Drug Des. 6 (6): 569-84; Helene, C. e outros(1992) Ann. Ν.Y. Acad. Sei. 660: 27-36; e Maher, L.J.

(1992) Bioassays 14 (12): 807 - 15.

A inibição ou prevenção de expressão de gene tambémpode ser obtida pela modificação do gene de SMS 27, porexemplo, pela introdução de uma ou mais mutações no gene deSMS 27 onde a modificação leva a uma proteína de SMS 27 comuma função que é significativamente diminuída em comparaçãocom a proteína do tipo selvagem.

Portanto, em uma outra modalidade, o polinucleotídeocontendo pelo menos uma mutação é derivado de umpolinucleotídeo como representado pela SEQ ID NO: 1 ouequivalentes do mesmo.

Uma mutação, como utilizada aqui, pode ser qualquermutação que leva a um polipeptídeo menos funcional ouinstável, por exemplo produtos de gene de SMS 27 menosfuncionais ou instáveis. Isso pode incluir, por exemplo,uma alteração no genoma de um microorganismo, que interferena síntese de SMS 27 ou leva à expressão de uma proteína deSMS 27 com uma seqüência de aminoácido alterada cuja funçãocomparada com a cópia do tipo selvagem tendo uma seqüênciade aminoácido não alterada é total ou parcialmentedestruída. A interferência pode ocorrer no nível detranscrição, translação ou pós-translação.

A alteração no genoma do microorganismo pode serobtida, por exemplo, por substituição através de umarecombinação de cruzamento única ou dupla de uma seqüênciade DNA do tipo selvagem por uma seqüência de DNA contendo aalteração.

Para seleção conveniente de transformantes domicroorganismo com a alteração em seu genoma a alteraçãopode, por exemplo, ser uma seqüência de DNA codificando ummarcador de resistência a antibiótico ou um genecomplementando uma auxotrofia possível do microorganismo.Mutações incluem, porém não são limitados a, mutações deinserção de deleção. Um exemplo de tal alteração inclui umaruptura de gene, isto é, uma perturbação de um gene de talmodo que o produto que é normalmente produzido a partirdesse gene não é produzido em uma forma funcional. Issopoderia ser devido a uma deleção completa, uma deleção einserção de um marcador seletivo, uma inserção de ummarcador seletivo, uma mutação de deslocamento de quadro,uma deleção em quadro, ou uma mutação de ponto que leva àterminação prematura. Em alguns desses casos o mRNA inteiropara o gene está ausente, em outros a quantidade de mRNAproduzido varia. Em todos os casos o polipeptídeocodificado pelo gene não é produzido em uma formafuncional, quer ausente ou em uma forma mudada, como porexemplo, uma proteína tendo atividade reduzida comodefinido aqui.

Uma alteração no genoma do microorganismo levando a umpolipeptídeo menos funcional ou não funcional também podeser obtida por realizar mutagênese aleatoriamente o genomado microorganismo utilizando, por exemplo, mutágenosquímicos, radiação ou elementos transponíveis e selecionarou classificar em relação a mutantes que são produtoresmelhores ou mais eficientes de um ou mais produtos defermentação. Métodos padrão para classificação e seleçãosão conhecidos por uma pessoa versada na técnica.

Em uma modalidade específica, é desejável nocautear ogene de SMS 2 7 da presente invenção, isto é, onde suaexpressão de gene é artificialmente suprimida para melhoraro rendimento, produtividade, e/ou eficiência de produção doproduto de fermentação quando introduzido em uma célulahospedeira apropriada. Os métodos de fornecer nocautes bemcomo microorganismos que contêm esses genes suprimidos sãobem conhecidos na técnica. A supressão do gene de SMS 27endógeno pode ser induzida por deleção de pelo menos umaparte do gene ou a região reguladora do mesmo. Comoutilizado aqui, "supressão da expressão de gene" incluisupressão completa e parcial, bem como supressão sobcondições específicas e também supressão da expressão dequalquer um dos dois alelos.

Para criar um microorganismo de nocaute no qual aexpressão do gene de SMS 27 é artificialmente suprimida,primeiramente o gene de SMS 27 pode ser clonado e então umvetor para recombinação homóloga pode ser construídoutilizando o gene para inativar o gene de SMS 27 endógenono microorganismo alvo. 0 vetor para recombinação homólogacontém então uma seqüência de ácido nucléico projetada parainativar o gene de SMS 27 endógeno no microorganismo alvo.

Tal ácido nucléico pode ser, por exemplo, uma seqüência deácido nucléico do gene de SMS 27 ou a região reguladora domesmo, como a região de flanquear existente do gene a serinativado (em eis), ou existindo separadamente (em trans),contendo pelo menos uma deleção parcial, oualternativamente pode ser uma seqüência de ácido nucléicodo gene de SMS 27 ou a região reguladora do mesmo contendooutros genes. Um gene que também pode funcionar como ummarcador é preferivelmente selecionado como o gene a serinserido no gene de SMS 27 ou a região reguladora do mesmo.Os genes de inserto a serem utilizados incluem, porexemplo, genes de resistência à droga como definido acima.Não há limitação específica sobre a posição onde os genespodem ser inseridos no gene de SMS 27, desde que a inserçãonaquela posição resulte na supressão da expressão do genede SMS 27 endógeno no alvo. Para evitar efeitos polares dainserção, deleções silenciosas em quadro podem serintroduzidas utilizando, por exemplo, o sistema sacB ou PCRde homologia de flanquear longa. Essas técnicas são bemconhecidas pelas pessoas versadas na arte.

As estratégias de mutagênese acima mencionadas paraproteínas de SMS 2 7 podem resultar em rendimentosaumentados de um composto desejado em particular, vitaminaC e/ou 2-KGA. Essa lista não pretende ser limitadora;variações nessas estratégias de mutagênese serãoprontamente evidentes para uma pessoa com conhecimentoscomuns na técnica. Por esses mecanismos, moléculas deproteína e ácido nucléico da invenção podem ser utilizadaspara gerar microorganismos como Gluconobacter oxydans oucepas relacionadas de bactérias expressando moléculas deproteína e ácido nucléico de SMS 2 7 mudadas de tal modo queo rendimento, produtividade, e/ou eficiência de produção deum composto desejado como vitamina C e/ou 2-KGA sãoaperfeiçoados.

Com relação ao processo acima utilizando ummicroorganismo, em um aspecto, o processo da presenteinvenção leva a rendimentos de Vitamina C que são pelomenos aproximadamente maiores do que 5,7 g/l, como 10 g/l,20 g/l, 50 g/l, 100 g/l, 200 g/l, 300 g/l, 400 g/l ou maiordo que 600 g/l. Em uma modalidade, o rendimento da VitaminaC produzida pelo processo da presente invenção está nafaixa de aproximadamente mais do que 5,7 a aproximadamente600 g/l. O rendimento da Vitamina C se refere àconcentração de vitamina C no fluxo de colheita saindodiretamente do recipiente de produção, isto é, osobrenadante livre de células compreendendo a Vitamina C.

Em um aspecto da invenção, microorganismos (emparticular dos gêneros de Gluconobacter, Gluconacetobactere Acetobacter) são fornecidos que são capazes de produzirdiretamente a Vitamina C a partir de uma fonte de carbonoapropriada como D-sorbitol e/ou L-sorbose. Quando medido,por exemplo, em um método de célula em repouso após umperíodo de incubação de 20 horas, verificou-se que essesorganismos são capazes de produzir a Vitamina C diretamentedo D-sorbitol ou L-sorbose, mesmo até um nível de 280 mg/le 670 mg/l respectivamente. Em outro aspecto da invenção,um microorganismo é fornecido capaz de produzir diretamentea Vitamina C em quantidades de 3 00 mg/l ao começar a partirde D-sorbitol ou mais ou 8 00 mg/l ou mais ao começar apartir de L-sorbose, respectivamente quando por exemplomedido em um método de célula em repouso após um período deincubação de 20 horas. Isso pode ser obtido pela diminuiçãoou abolição da atividade de um polipeptídeo de SMS,preferivelmente um polipeptídeo de SMS 27. 0 rendimento daVitamina C produzida a partir de D-sorbitol pode ser atémesmo tão elevado quanto 4 00, 600, 1000 mg/l ou mesmoexceder 1,5, 2, 4, 10, 20, 50, g/l. 0 rendimento daVitamina C produzida a partir de L-sorbose pode ser atémesmo tão elevado quanto 1000 mg/l ou mesmo exceder 1,5, 2,4, 10, 20, 50 g/l. Preferivelmente, essas quantidades deVitamina C podem ser obtidas quando medidas pelo método decélula em repouso após um período de incubação de 20 horas.

Como utilizado aqui, a medição em um "método de célulaem repouso" compreende (i) cultivar as células porintermédio de qualquer método bem conhecido pela pessoaversada na técnica, (ii) colher as células a partir docaldo de crescimento, e (iii) incubar as células colhidasem um meio contendo o substrato que deve ser convertido noproduto desejado, por exemplo, Vitamina C, sob condiçõesonde as células não crescem mais, isto é, não há aumento naquantidade de biomassa durante essa etapa denominadaconversão. Uma descrição mais geral do método de célula emrepouso é descrita, por exemplo, em WO 2005/017159 e nosparágrafos a seguir.

Em um aspecto da invenção, microorganismos (emparticular a partir dos gêneros de Gluconobacter,Gluconacetobacter e Acetobacter) são fornecidos que sãocapazes de produzir diretamente 2-KGA a partir de uma fontede carbono apropriada como D-sorbitol e/ou L-sorbose.

Quando medido, por exemplo, pelo método como do Exemplo 4verificou-se que esses organismos são capazes de produzir2-KGA diretamente a partir de D-sorbitol ou L-sorbose emquantidades de aproximadamente 0,5 a 0,7 g/l. Em outroaspecto da invenção, um microorganismo é fornecido capaz deproduzir diretamente 2-KGA em quantidades deaproximadamente 7, 8, 9, 10 g/l ou mais ou mesmoaproximadamente 50, 60, 70, 80, 90, 100 g/l ou mais aoiniciar a partir de L-sorbose. Isso pode ser obtido pordiminuir ou mesmo abolir a atividade de um polipeptídeoSMS, preferivelmente um polipeptídeo SMS 27 em G. oxydansIFO 3293.

0 microorganismo recombinante contendo, por exemplo,um gene de SMS 27 modificado e que é capaz de produzir oproduto de fermentação em rendimento, produtividade, e/oueficiência significativamente mais elevados, pode sercultivado em um meio aquoso suplementado com nutrientesapropriados sob condições aeróbicas como descrito acima.

As moléculas de ácido nucléico, polipeptideos,vetores, iniciadores e microorganismos recombinantesdescritos aqui, podem ser utilizados em um ou mais dosseguintes métodos: identificação de Gluconobacter oxydans eorganismos relacionados; mapeamento de genomas deorganismos relacionados a Gluconobacter oxydans;identificação e localização de seqüências de Gluconobacteroxydans, de interesse; estudos de evolução; determinação deregiões de proteína de SMS 2 7 exigidas para função;modulação de uma atividade ou função de proteína de SMS 27;modulação da atividade de uma via de SMS; e modulação deprodução celular de um composto desejado, como a Vitamina Ce/ou 2-KGA.

A invenção provê métodos para classificar moléculasque modulam a atividade de uma proteína de SMS 27, porinteração com a própria proteína ou um substrato ouparceiro de ligação da proteína de SMS 27, ou por modulaçãoda transcrição ou translação de uma molécula de ácidonucléico de SMS 27 da invenção. Em tais métodos, ummicroorganismo expressando uma ou mais proteínas de SMS 27da invenção é contatado com um ou mais dos compostos deteste, e o efeito de cada composto de teste sobre aatividade ou nível de expressão da proteína de SMS 27 éavaliado.

Em geral, a atividade biológica, enzimática ou outrade proteínas de SMS pode ser medida por métodos bemconhecidos por uma pessoa versada, como, por exemplo, pelaincubação de uma fração de célula contendo a proteína deSMS na presença de seu substrato, aceitador (es) oudoador(es) de elétrons incluindo metossulfato de fenazina(PMS), diclorofenol-indofenol (DCIP), NAD, NADH, NADP,NADPH, cujo consumo pode ser direta ou indiretamente medidopor métodos fotométricos, colorimétricos ou fluorimétricos,e outros componentes inorgânicos que poderiam serrelevantes para o desenvolvimento da atividade. Desse modo,por exemplo, a atividade de desidrogenase de D-sorbitolligado por membrana pode ser medida em um ensaio ondefrações de membrana contendo essa enzima são incubadas napresença de tampão de fosfato em pH 6, D-sorbitol e osaceitadores de elétron artificiais DCIP e PMS. A taxa deconsumo de DCIP pode ser medida em 600 nm, e é diretamenteproporcional à atividade de desidrogenase de D-sorbitolpresente na fração de membrana.

A atividade biológica, enzimática ou outra dasproteínas SMS, em particular a proteína SMS 27, pode sermedida por métodos bem conhecidos por uma pessoa versada natécnica, como por exemplo, por determinar a expressão degenes conhecidos como estando sob o controle da proteínaSMS 27 por métodos conhecidos por aqueles versados natécnica, como por exemplo Northern Blot, análise de fusãode transcrição, análise de microconjunto, etc. A ligação daproteína SMS 2 7 a regiões promotoras alvo pode serdemonstrada por experimentos de pegada de DNA, ensaios dedeslocamento de gel e similares.

Pode ser evidente a partir da descrição acima que oproduto de fermentação dos métodos de acordo com a invençãopode não ser limitado somente à Vitamina C. O "compostodesejado" ou "produto de fermentação" como utilizado aquipode ser qualquer produto natural de Gluconobacter oxydans,que inclui os produtos finais e intermediários de vias debiossíntese, como por exemplo, L-sorbose, L-sorbosone, D-gluconato, 2-ceto-D-gluconato, 5-ceto-D-gluconato, 2,5-diceto-D-gluconato e 2-ceto-L-gulonato (2-KGA), emparticular a geração biossintética de Vitamina C.

Desse modo, a presente invenção é dirigida ao uso deum polinucleotídeo, polipeptídeo, vetor, iniciador emicroorganismo recombinante como descrito aqui na produçãode Vitamina C e/ou 2-KGA, isto é, a conversão direta de umafonte de carbono em Vitamina C e/ou 2-KGA. Em umamodalidade preferida, um polinucleotídeo, polipeptídeo,vetor e microorganismo recombinante modificado, comodescrito aqui, é utilizado para melhorar o rendimento,produtividade e/ou eficiência da produção de Vitamina Ce/ou 2-KGA.

Os termos "produção" ou "produtividade" sãoreconhecidos na técnica e incluem a concentração do produtode fermentação (por exemplo, Vitamina C e/ou 2-KGA) formadoem um tempo dado e um dado volume de fermentação (porexemplo, kg de produto por hora por litro). O termo"eficiência de produção" inclui o tempo necessário para umque nível específico de produção seja obtido (por exemplo,quanto tempo demora para que a célula obtenha uma taxaespecífica de saída de um produto de fermentação). O termo"rendimento" é reconhecido na técnica e inclui a eficiênciada conversão da fonte de carbono no produto (isto é,Vitamina C). Isso é genericamente escrito como, porexemplo, kg de produto por kg de fonte de carbono. Por"aumentar o rendimento e/ou produção/produtividade" docomposto quer se dizer que a quantidade de moléculasrecuperadas, ou de moléculas recuperadas úteis daquelecomposto em uma dada quantidade de cultura durante umaquantidade dada de tempo é aumentada. Os termos"biossíntese" ou uma "via biossintética" são reconhecidosna técnica e incluem a síntese de um composto,preferivelmente um composto orgânico, por uma célula doscompostos intermediários no que pode ser um processoaltamente regulado e de multi-etapas. A linguagem"metabolismo" é reconhecida na técnica e inclui atotalidade das reações bioquímicas que ocorrem em umorganismo. O metabolismo de um composto específico, então,(por exemplo, o metabolismo de um aminoácido como glicina)compreende as vias biossintética, de modificação edegradação gerais na célula relacionada a esse composto. Alinguagem "transporte" ou "importar" é reconhecida natécnica e inclui o movimento facilitado de uma ou maismoléculas através de uma membrana celular através da qual amolécula seria de outro modo incapaz de passar ou serpassada ineficientemente.

A Vitamina C como utilizado aqui, pode ser qualquerforma química de ácido L-ascórbico encontrado em soluçõesaquosas, como por exemplo, não dissociadas, em sua forma deácido livre ou dissociada como um ânion. A forma de salsolubilizado de ácido L-ascórbico pode ser caracterizadacomo o ânion na presença de qualquer tipo de cátionsnormalmente encontrados em sobrenadantes de fermentação,como por exemplo, potássio, sódio, amônio ou cálcio. Tambémpodem ser incluídos cristais isolados da forma de ácidolivre de ácido L-ascórbico. Por outro lado, cristaisisolados de uma forma de sal de ácido L-ascórbico sãodenominados pelo nome de seu sal correspondente, isto é,ascorbato de sódio, ascorbato de potássio, ascorbato decálcio e similares.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção érelacionada a um processo para a produção de Vitamina Conde um nucleotídeo de acordo com a invenção ou umaseqüência de polinucleotídeo modificado, como descritoacima, é introduzido em um microorganismo apropriado, omicroorganismo recombinante é cultivado sob condições quepermitem a produção de Vitamina C em produtividade elevada,rendimento e/ou eficiência, o produto de fermentaçãoproduzido é isolado do meio de cultura e opcionalmenteadicionalmente purificado.

Essa invenção é adicionalmente ilustrada pelosexemplos a seguir os quais não devem ser interpretados comolimitadores. O teor de todas as referências, pedidos depatente, patentes e pedidos de patente publicados, citadosem todo esse pedido são incorporados pela presente a títulode referência.

Exemplos

Exemplo 1: Preparação de DNA cromossômico eamplificação de fragmento de DNA por PCR

DNA cromossômico de Gluconobacter oxydans IFO 3293 foipreparado a partir das células cultivadas a 30°C por 1 diaem meio líquido de caldo de manitol (MB) consistindo em 25g/l de manitol, 5 g/l de extrato de levedura (Difco) , e 3g/l de Bactopeptone (Difco) pelo método descrito porSambrook e outros (1989) "Molecular Cloning: A LaboratoryManual/Second edition", Cold Spring Harbor LaboratoryPress.

Um fragmento de DNA foi preparado por PCR com o DNAcromossômico preparado acima e um conjunto de iniciadores,Pf (SEQ ID NO: 3) e Pr (SEQ ID NO: 4) . Para a reação, o Kitde PCR Expand High Fidelity (Roche Diagnostics) e 10 ng doDNA cromossômico foram utilizados em volume total de 100 μΐde acordo com a instrução do fornecedor, para ter o produtode PCR contendo seqüência de DNA de SMS 27 (SEQ ID NO: 1).O produto de PCR foi recuperado a partir da reação e suaseqüência correta confirmada.

Exemplo 2: Ruptura do gene de SMS 27 em G. oxydans IFO3293

Para manipular um mutante de nocaute do gene de SMS27, PCR de Long-Flanking Homology (LFH) foi utilizado paramanipular uma mutação de inserção-deleção limpa. Emprimeiro lugar, as regiões a montante e a jusanteflanqueando o gene SMS 27 foram amplificadas por PCRutilizando os respectivos pares de iniciador SMS 27KmLFH+l(SEQ ID NO: 7) / SMS 27LFH-1 (SEQ ID NO: 8). O DNA genômicoG. oxydans IFO 3293 foi utilizado como padrão e ascondições de reação consistiam em 30 ciclos de desnaturaçãoa 95 °C por 1 min, com recozimento a 50 °C por 1 min. eextensão a 72 °C por 1,5 min. Nos dois casos, o polimerasede DNA Herculase (Stratagene) foi utilizado para minimizarerros gerados por PCR. O cassete de resistência àcanamicina foi amplificado utilizando DNA de plasmídeopUC4K (Amersham Bioscience, no. de acessão X064 04) como umpadrão e par de iniciadores SMS 2 7Km-l (SEQ ID NO: 9) / SMS27Km+l (SEQ ID NO: 10) para gerar um fragmento de 1,3-kb.

As condições de reação foram como acima. Os três produtosforam purificados por gel, misturados e utilizados nareação de PCR de segundo round com os iniciadores deflanquear SMS 27LFH+1 / SMS 27LFH-1 para gerar um produtode 2,6-kb. As condições de reação para a reação de segundoround consistiam em 94°C, 2 min., a seguir 10 ciclos de[ 94 ° C, 30 s, 63 ° C, 30 s, 68°C, 6 min.], seguido por 20ciclos de [ 94 ° C, 30 s, 63°C, 30 s, 68°C, 6 min. com umperíodo adicional de 20 s por ciclo] e uma extensão finalde 68°C por 10 min.

O produto de PCR foi clonado no vetor pGEM-TEasy(Promega) para fornecer plasmídeo pGEM-SMS 27. Esseplasmídeo foi transformado em células de G. oxydans IFO3293 competentes selecionando transformantes em meio deagar MB contendo canamicina em uma concentração final de 50μg ml"1, resultando em cepa mutante G. oxydans IFO 3293-SMS27::Km. PCR utilizando os iniciadores de flanquear SMS27LFH+1 / SMS 27LFH-1 foi usado para confirmar que amutação SMS 27::Km tinha integrado através de um cruzamentoduplo.

Exemplo 3: Produção de Vitamina C a partir de D-sorbitol utilizando células em repouso

As células de G. oxydans IFO 3293 e G. oxydans IFO3293-SMS 27::Kml foram revestidas primeiramente em meio MBpor três dias. As células foram raspadas dessas placas eespalhadas sobre meio No. 3 BD contendo 7% de sorbitol ecultivadas por 3 dias a 30°C. Essas células foramutilizadas em reações de células em repouso com 2% desorbitol como substrato e uma densidade de células deOD600=10 .

Exemplo 4: Produção de 2-KGA a partir de D-sorbitolutilizando células em repouso

De acordo com a montagem experimental do exemplo 3, ascélulas das cepas G. oxydans IFO 3293 e G oxydans IFO 3293-SMS 27::Km, foram testadas em relação a sua capacidade paraproduzir 2-KGA a partir de D-sorbitol.

Após 20 h de tempo de incubação, G. oxydans IFO 3293produziu 700 mg/l de 2-KGA a partir de D-sorbitol. Emcomparação, a cepa G. oxydans IFO 3293-SMS 27::Km produziumais de 7 g/l de 2-KGA.

Exemplo 5: Presença do gene de SMS 27 e equivalentesem outros organismos

A presença da SEQ ID NO: 1 e/ou equivalentes mostrandosimilaridade/identidade com a SEQ ID NO: 1 em outrosorganismos do que aqueles revelados anteriormente, porexemplo, organismos como mencionado na Tabela 1, pode serdeterminada por um experimento de hibridização de DNAsimples.

As cepas de Acetobacter aceti subsp. Xylinum IFO 13693e IFO 13773 são cultivadas a 27 °C por 3 dias no meio no.350 contendo 5 g/l de Bactopeptone (Difco) , 5 g/l deextrato de levedura (Difco) , 5 g/l de glicose, 5 g/l demanitol, 1 g/l de MgSO4.7H20, 5 ml/l de etanol, e 15 g/l deagar. Todas as outras cepas de Acetobacter,Gluconacetobacter e todas Glueonobaeter são cultivadas a27 °C por 3 dias em meio de agar de caldo de manitol (MB)contendo 2 5 g/l de manitol, 5 g/l de extrato de levedura(Difco) , 3 g/l de Bactopeptone (Difco) e 18 g/l de agar(Difco) . E- coli K-12 é cultivado no meio de agar de CaldoLuria. As outras cepas/células são cultivadas no meiorecomendado por fornecedores ou de acordo com métodosconhecidos na técnica. O DNA genômico é extraído comodescrito por, por exemplo, Sambrook e outros, 1989,"Molecular Cloning: A laboratory Manual/second edition",Cold Spring Harbor Laboratory Press a partir de umorganismo apropriado, como por exemplo mencionado na Tabela 1.

Preparações de DNA genômico são digeridas com enzimasde restrição como EcoRI e HindIII, e 1 μ9 dos fragmentos deDNA é separado por eletroforese de gel agarose (1% deagarose) . O gel é tratado com 0,25 N HCl por 15 min. eentão 0,5 N NaOH por 3 0 min., e então manchado sobrenitrocelulose ou uma membrana de náilon com Vacuum Blottermodelo 785 (BIO-RAD Laboratories AG, Suíça) de acordo com ainstrução do fornecedor. A mancha resultante é entãocolocada em contato/hibridizado com uma solução onde asonda, como, por exemplo, um fragmento de DNA com aseqüência SEQ ID N0:1 ou um fragmento de DNA contendo aparte ou toda a seqüência de SEQ ID NO: 1 para detectarfragmento(s) de DNA positivo(s) a partir de um organismo deteste. Uma sonda rotulada DIG, por exemplo, SEQ ID NO: 1,pode ser preparada de acordo com o Exemplo 1 utilizando okit de rotulação PCR-DIG (Roche Diagnostics) e um conjuntode iniciadores, SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4. Um resultadodessa mancha é representado na Tabela 1.

A hibridização pode ser executada sob condiçõesrigorosas ou altamente rigorosas. Um exemplo não limitador,preferido dessas condições é a hibridização em 6x decloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em aproximadamente45°C, seguido por uma ou mais lavagens em Ix SSC, 0,1% SDSa 50 °C, preferivelmente a 55°C, mais preferivelmente a 60°Ce ainda mais preferivelmente a 65°C. Condições altamenterigorosas incluem, por exemplo, 2h a 4 dias de incubação em42°C em uma solução como solução DigEasyHyb (RocheDiagnostics GmbH) com ou sem 100 μg/ml de DNA de esperma desalmão, ou uma solução compreendendo formamida a 50%, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM de citrato trissódico) , 0,02% desulfato de dodecil de sódio, 0,1% de N-lauroíl sarcosina, e2% de reagente de bloqueio (Roche Diagnostics GmbH) seguidopor lavagem dos filtros duas vezes por 5 a 15 minutos em 2xSSC e 0,1% SDS em temperatura ambiente e então lavagem duasvezes por 15-30 minutos em 0,5x SSC e 0,1% SDS ou 0,Ix SSCe 0,1% SDS a 65-68°C. Para detectar fragmentos de DNA comidentidade inferior ao DNA de sonda, as etapas de lavagemfinais podem ser feitas em temperaturas mais baixas como50-65°C e por tempo de lavagem mais curto como 1-15 min.

Os genes correspondendo aos sinais positivos nosrespectivos organismos mostrados na Tabela 1 podem serclonados por um método de PCR bem conhecido na técnicautilizando DNA genômico de tal organismo juntamente com umconjunto de iniciadores apropriado, como, por exemplo, SEQID NO: 3 e SEQ ID NO: 4 sob condições como descrito noExemplo 1 ou como a seguir: 5 a 100 ng de DNA genômico sãoutilizados por reação (volume total 50 μL). O sistema dePCR Expand High Fidelity (Roche Diagnostics) pode serutilizado com condições de reação consistindo em 94°C por 2min.; 30 ciclos de (i) etapa de desnaturação a 94°C por 15s., (ii) etapa de recozimento a 60°C por 30 s., (iii) etapade síntese a 72 °C por 0,5 a 5 min. dependendo docomprimento de DNA alvo (1 min/lkb); extensão a 72°C por 7min. Alternativamente, pode-se executar um PCR cominiciadores de degenerar, que podem ser sintetizados combase na SEQ ID NO: 2 ou seqüências de aminoácidos comoseqüências de consenso selecionadas por alinhamento devárias seqüências de aminoácidos obtidas por um programa debusca de seqüência como BLASTP (ou BLASTX quando aseqüência de nucleotídeo é utilizada como uma "seqüência deconsulta") para encontrar proteínas tendo uma similaridadecom a proteína da SEQ ID NO: 2. Para PCR utilizandoiniciadores de degenerar, a temperatura da segunda etapa derecozimento (vide acima) pode ser diminuída para 55 0C oumesmo para 50-45°C. Um resultado de um tal experimento émostrado na Tabela 1.

As amostras das reações de pCR são separadas poreletroforese de agarose gel e as faixas são visualizadascom um transi luminador após colorir com, por exemplo,brometo de etídio, isolado do gel e a seqüência correta éconfirmada.

As seqüências de consenso mencionadas acima poderiamser seqüências de aminoácido que pertencem a certascategorias de vários bancos de dados de família/domínio deproteína como PROSITE (banco de dados de domínios efamílias de proteína) , COGs (Cluster de grupos ortólogos) ,CDD (Bancos de dados de domínio conservado), pfam (coleçãogrande de múltiplos alinhamentos de seqüência e modelosMarkov ocultos cobrindo muitas famílias e domínios deproteína comuns). Após se poder selecionar certa proteínacom função idêntica/similar à proteína da presente invençãoa partir das proteínas contendo domínio ou família de taisbancos de dados, DNA correspondente codificando a proteínapode ser amplificado por PCR utilizando a seqüência deproteína ou sua seqüência de nucleotídeos quando disponívelem bancos de dados públicos.

Exemplo 6: Ruptura do gene de SMS 27 e equivalentes emoutros organismos para produção de Vitamina C e/ou 2-KGA

Para melhorar a produção de Vitamina C em ummicroorganismo apropriado que é capaz de produzirdiretamente Vitamina C a partir de um dado substrato,o genede SMS 2 7 e equivalentes como, por exemplo, um produto dePCR obtido no Exemplo 4, mencionado doravante como gene X,pode ser rompido de acordo com o gene de SMS 2 7 em G.oxydans IFO 32 93 (vide o Exemplo 2) para gerar um mutantede nocaute contendo gene equivalente de SMS 27:Km. Cepas dehospedeiro apropriadas para geração desses mutantes denocaute podem ser selecionadas de, por exemplo, cepas deGluconobacter listadas na Tabela 1, em particular, porexemplo, G. oxydans IFO 3292, G. oxydans ATCC 621H, G.oxydans IFO 12528, G. oxydans IFO 3291, G. oxydans IFO3255, G. oxydans IFO 3244, G. cerinus IFO 3266, G.frateurii IFO 3260, G. oxydans IFO 3287, Acetobacter acetisubsp. Orleanus IFO 3259, Aeetobaeter aceti subsp. XylinumIFO 13693, Aeetobaeter aceti subsp. Xylinum IFO 13773 eAeetobaeter sp. ATCC 15164 e seus derivados contendo genesenvolvidos nas vias de produção de vitamina C e as regiõesadjacentes onde o gene SMS 27 ou seu equivalente poderiaser localizado.O mutante de nocaute, como, por exemplo, mutante denocaute G. oxydans IFO 3293-SMS 27 gene equivalente: Kmpode ser gerado como a seguir: o produto de PCR obtido apartir de G. oxydans IFO 3293 descrito no Exemplo 5 éclonado em um vetor de E. coli pCR2.1-T0P0 e utilizado paratransformar E.coli TGl para ter um transf ormante de Aprcontendo gene pCR2.1 X. A seguir, o cassete Kmr isolado depUC-4K (Amersham Bioscience, no. de acessão X06404) éinserido em um do sítio de restrição do gene alvo comligase e o produto de ligação resultante é utilizado paratransformar E.coli TGl a fim de ter transf ormante Apr Kmrcontendo pCR2.1-gene X::Km. O plasmídeo pCR2.1-gene X: Kmpreparado a partir do transformante é digerido por duasenzimas de restrição selecionadas do sítio de clonagemmúltipla da parte de vetor para isolar um fragmento de DNAcontendo gene X::Km. O fragmento de DNA resultante éutilizado para transformar a cepa hospedeira contendo ogene equivalente de SMS 27 por eletroporação para ter omeio de ruptura de gene contendo gene equivalente SMS27: :Km.

Modificações adicionais incluindo genes envolvidos naconversão de D-sorbitol, L-sorbose e/ou L-sorbosone emVitamina C nas cepas podem ser geradas para melhorar aprodução de vitamina C por tais cepas.

A produção de vitamina C utilizando as células domutante de nocaute, por exemplo G. oxydans IFO 3292-geneequivalente SMS 27:: Km, e a cepa do tipo selvagemcorrespondente, por exemplo, G. oxydans IFO 3293, sãoexecutadas de acordo com o Exemplo 3.

A produção de 2-KGA utilizando as células do mutantede nocaute, por exemplo G. oxydans IFO 32 92- geneequivalente SMS 27: :Km, e a cepa do tipo selvagemcorrespondente, por exemplo G. oxydans IFO 3 2 92, sãoexecutadas de acordo com o Exemplo 4.

Na reação de células em repouso com L-sorbosone a 1 %como substrato, a cepa mutante pode produzir pelo menosmais de 20% de Vitamina C e pelo menos mais de 10% de 2-KGAem comparação com a cepa do tipo selvagem.

Tabela 1: Equivalentes do gene de SMS 27 em outrosorganismos

<table>table see original document page 76</column></row><table><table>table see original document page 77</column></row><table>

Sinal 1: Detecção de DNA em uma mancha com DNAgenômico de cepas diferentes e SEQ ID NO :1 como sondarotulada. Sinal 2: detecção de DNA de cepas diferentes emuma reação de PCR utilizando par de iniciadores SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO: 4. Sinal 3: detecção de DNA de cepasdiferentes em uma reação de PCR utilizando iniciadores dedegenerar. Para maior explicação, consulte o texto.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> DSM IP Assets B.V.

< 120 > Novo Gene SMS 2 7<130 > 24998

<160> 16

<170> PatentIn versão 3.2

<210 > 1<211> 495

< 212 > DNA

<213> Gluconobacter oxydans IFO 3293<4 O O > 1

atgccccttg agaaaagcag agcgtcctcc tctacgaaaa agcgtgtcag ggacgctgag60

gccacgaaat tacgcattct cgaagcggcg aagaaggagt ttgcccgaaa cgggcttgaa120

ggcgcgcggg tcgatacgat cgccctcgat gccaaggcca acaagaggat gctctaccac180

tatttcaaaa gtaaggacgg ccttttccgc accgtcctgg agcgggaata tctcaacatc240

cgggaggaag agaccagact ggatctggag aacctccccc cccaggacag ccctcgaaac300

gctcgtccgt ttcacatggg aatactatat cgccaatccg gagttcatca cccttgtgaa360cagcgagaac ctctgtcagg ccgcccatat ccggaattca cccacactga agacgatcag420

tcagaaattc gtccgccgca tccagtccct tctggatcgg ggcgttcggg aaaatgtctt480

ccgcgatggc attga495

<210> 2

<211> 164

<212 > PRT

<213> Gluconobacter oxydans IFO 3293

<4 O O > 2Met Pro Leu Glu1

Arg Asp Ala Glu20

Glu Phe Ala Arg35

Leu Asp Ala Lys50

Lys Asp Gly Leu65

Arg Glu Glu Glu

Ser Pro Arg Asn100

Ser Gly Val His115

Pro Tyr Pro Glu

Lys Ser Arg Ala5

Ala Thr Lys Leu

Asn Gly Leu Glu40

Ala Asn Lys Arg55

Phe Arg Thr Val70

Thr Arg Leu Asp85

Ala Arg Pro Phe

His Pro Cys Glu120

Phe Thr His Thr

Ser Ser Ser Thr10

Arg Ile Leu Glu25

Gly Ala Arg Val

Met Leu Tyr His60

Leu Glu Arg Glu75

Leu Glu Asn Leu90

His Met Gly Ile105

Gln Arg Glu ProGlu Asp Asp Gln

Lys Lys Arg Val15

Ala Ala Lys Lys30

Asp Thr Ile Ala45

Tyr Phe Lys Ser

Tyr Leu Asn Ile80

Pro Pro Gln Asp95

Leu Tyr Arg Gln110

Leu Ser Gly Arg125

Ser Glu Ile Arg130 135

Pro Pro His Pro Val Pro Ser Gly Ser Gly Arg145 150 155

Pro Arg Trp His

<210 > 3

<211> 20

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223 > primer

<400 > 3atgccccttg agaaaagcag20

<210 > 4

<211> 20

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220 >

<223> primer<400> 4

tcaatgccat cgcggaagac20

30 <210> 5

140

Ser Gly Lys Cys Leu160<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 5

gggtgacggg aacatcatga gc22

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 6

cacgaggcag acctcagcgc cgcgtaattt cgtggcctca gcg43

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223 > primer<4OO > 7

cagagatttt gagacacaac gtggcgatat gccgcctggt ctgcaag47

<210 > 8

<211> 21

< 212 > DNA

<213 > Artificial

< 220 >

<223 > primer

<400 > 8

gggcggcttc ctgcacatcg g21

<210 > 9

<211> 43

<212 > DNA

<213 > Artificial

< 220 >

<223 > primer<400> 9

cgctgaggcc acgaaattac gcggcgctga ggtctgcctc gtg43

<210> 10211> 47

212 > DNA

213 > Artificial

<22O >

<223 > primer

<4OO > 10

cttgcagacc aggcggcata tcgccacgtt gtgtctcaaa atctctg47

< 210 > 11

<211> 1596

<212 > DNA

<213> Gluconobacter oxydans IF03293

<400> 11

atgacgagcg gttttgatta catcgttgtc60

gcccgccttt ccgaaaatcc ttccgtccgt120

acgcatcccc tgatccatat gccggtcggt180

tgggatcttc tgacggagcc gcagaaacat240

ggccggattc tgggcggcgg atcgtccatc300

tccgatttcg accgctgggc ggcggaaggt360

aagtacttca tccgttccga aggcaatgcc

ggtggcggtt cggctggctg tgttctcgca

gtctgcctca tcgaggcggg ccggcgggac

ttcgcgaaga tgaccacggg gccgcatacc

gcgaacaacc gccagatccc ctatgtgcag

aacgcggaag tcttcacgcg gggacaccct

gcggatggct ggagcttccg ggatgtccag

gtgttttcgg gcacctggca tggcacgaacgggccgctcg gggtgtccaa cctcgcagat480

agctgtcagg aaatggggct gccctacaac540

gctggcatct accagatgac catccggaac600

ctgcgtccgg ccctggggcg gaagaacctg660

atcgtcttca acgggacgcg ggcgacgggc720

accgccgaag cgagccagga aatcgttgtg780

atgatgctgt cgggcgtcgg gcctgccgcg840

caggatctgc cgggcgtggg cgagaacctt900

gagctcaaga cggatgagag cttcgacaag960

ggtcttgaat acaccatgtt cagatccggc1020

gcgttctggt actcggaccc gtcatcgggt1080

ggggcagggg ctgaggcagg ggtgacgtcc1140

aacagctatg tgctgcgtcc gaagtctcgc1200

agggtcaatc cgatggtcga tcccaatttc1260

gcggaaggtg tgcggctgag ctacgagatg

ccgaacccga ccagccgtgc cttcgtgcag

cctgacttca atggcgcatc gcaggaaggg

aaccggcgct gctcgacggc tgtggggtat

acggttgtga cgcgggcgct ggtcctgaag

gtgcagtata tcgccaacgg caccctgaat

acggccggag cgatcggaac gccgaagctg

catcttcgcg aaaatggtat cccggtcgtg

caggaccatt tcggtgtgga tatcgtagcc

taccggaaac tgcactggat gctgtgggca

cccgtcgcgt ccaacgtggt tgagggcggc

gttcctgatc tccagttcca ttttcttgcg

gttcccaagg gcgcgtcggg gattacgctg

ggtaccgttc ggctgcgttc ggcagatcca

cttggagacc cggccgacct tgagacgtct

ttctcccagc cttccttgca gaagcacatc1320

aaggaaacat gcttctttag cggtaaacag ccgacgatgc agatgtatcg ggactatgcg1380

cgggaacatg gccggacctc ctatcatccg acatgcacct gcaagatggg gcgggatgac1440

atgtccgtcg tcgatccgcg tctgaaggtt catggccttg agggcatcag gatctgtgac1500

agctcggtca tgccgtcgct gctcggttcc aacaccaatg ccgcgacgat catgatcagt1560

gagcgggcag cggatttcat tcaggggaac gcctga1596

<210> 12

<211> 531

<212> PRT

<213> Gluconobacter oxydans IFO 3293

<400> 12

Met Thr Ser Gly Phe Asp Tyr Ile Val Val Gly Gly Gly Ser Ala Gly1 5 10 15 Cys Val Leu Ala Ala Arg Leu Ser Glu Asn Pro Ser Val Arg Val Cys 20 25 30 Leu Ile Glu Ala Gly Arg Arg Asp Thr His Pro Leu Ile His Met Pro35 40 45 Val Gly Phe Ala Lys Met Thr Thr Gly Pro His Thr Trp Asp Leu Leu 50 55 60 Thr Glu Pro Gln Lys His Ala Asn Asn Arg Gln Ile Pro Tyr Val Gln

65 70 75 80 Gly Arg Ile Leu Gly Gly Gly Ser Ser Ile Asn Ala Glu Val Phe ThrArg Gly His Pro100

Gly Trp Ser Phe115

Asn Ala Val Phe130

Val Ser Asn Leu145

Ser Cys Gln Glu

Ser Gln Glu Gly180

Arg Cys Ser Thr195

Asn Leu Thr Val210

Gly Thr Arg Ala225

Thr Ala Glu Ala

Thr Pro Lys Leu260

Arg Glu Asn Gly275

Asn Leu Gln Asp290

Asp Glu Ser Phe305

Gly Leu Glu Tyr

85

Ser Asp Phe Asp

Arg Asp Val Gln120

Ser Gly Thr Trp135

Ala Asp Pro Asn150

Met Gly Leu Pro165

Ala Gly Ile Tyr

Ala Val Gly Tyr200

Val Thr Arg Ala215

Thr Gly Val Gln230

Ser Gln Glu Ile245

Met Met Leu Ser

Ile Pro Val Val280

His Phe Gly Val295

Asp Lys Tyr Arg310

Thr Met Phe Arg

90

Arg Trp Ala Ala105

Lys Tyr Phe Ile

His Gly Thr Asn140

Pro Thr Ser Arg155

Tyr Asn Pro Asp170

Gln Met Thr Ile185

Leu Arg Pro Ala

Leu Val Leu Lys220

Tyr Ile Ala Asn235

Val Val Thr Ala250

Gly Val Gly Pro265

Gln Asp Leu Pro

Asp Ile Val Ala300

Lys Leu His Trp315

Ser Gly Pro Val

95

Glu Gly Ala Asp110

Arg Ser Glu Gly125

Gly Pro Leu Gly

Ala Phe Val Gln160

Phe Asn Gly Ala175

Arg Asn Asn Arg190

Leu Gly Arg Lys205

Ile Val Phe Asn

Gly Thr Leu Asn240

Gly Ala Ile Gly255

Ala Ala His Leu270

Gly Val Gly Glu285

Glu Leu Lys Thr

Met Leu Trp Ala320

Ala Ser Asn Val325 330 335

Val Glu Gly Gly Ala Phe Trp Tyr Ser Asp Pro Ser Ser Gly Val Pro

340 345 350

Asp Leu Gln Phe His Phe Leu Ala Gly Ala Gly Ala Glu Ala Gly Val

355 360 365

Thr Ser Val Pro Lys Gly Ala Ser Gly Ile Thr Leu Asn Ser Tyr Val

370 375 380

Leu Arg Pro Lys Ser Arg Gly Thr Val Arg Leu Arg Ser Ala Asp Pro385 390 395 400

Arg Val Asn Pro Met Val Asp Pro Asn Phe Leu Gly Asp Pro Ala Asp

405 410 415

Leu Glu Thr Ser Ala Glu Gly Val Arg Leu Ser Tyr Glu Met Phe Ser

420 425 430

Gln Pro Ser Leu Gln Lys His Ile Lys Glu Thr Cys Phe Phe Ser Gly

435 440 445

Lys Gln Pro Thr Met Gln Met Tyr Arg Asp Tyr Ala Arg Glu His Gly

450 455 460

Arg Thr Ser Tyr His Pro Thr Cys Thr Cys Lys Met Gly Arg Asp Asp465 470 475 480

Met Ser Val Val Asp Pro Arg Leu Lys Val His Gly Leu Glu Gly Ile

485 490 495

Arg Ile Cys Asp Ser Ser Val Met Pro Ser Leu Leu Gly Ser Asn Thr

500 505 . 510

Asn Ala Ala Thr Ile Met Ile Ser Glu Arg Ala Ala Asp Phe Ile Gln

515 520 525

Gly Asn Ala530

<210> 13

<211> 1497<212 > DNA

<213> Gluconobacter oxydans IFO 3293

<400> 13

atgaatgttg tctcaaagac tgtatcttta ccgttaaagc cgcgtgagtt cggattctat60

attgatggag aatggcgcgc aggtaaggat ttcttcgatc gttcctcgcc ggctcatgat120

gttcccgtca cccgtattcc acgctgcacc cgtgaggacc ttgatgaggc agtcgctgct180

gcacgtcgtg ctttcgagaa cggaagctgg tcgggcctgg cggccgcgga tcgtgcggcg240

gttcttctga aagccgcggg ccttctgcgc gagcgccgcg atgacatcgc ttactgggaa300

gttctcgaaa acgggaagcc catcagccag gcgaagggcg agatcgatca ctgtatcgcc360

tgtttcgaga tggcggccgg cgctgcgcgg atgctgcatg gtgatacgtt caacaatctg420

ggcgaggggc tgttcggcat ggtcctgcgg gagcccatcg gtgtcgtcgg tctgattacg480

ccgtggaact tcccgttcat gatcctgtgt gagcgcgcgc ctttcattct cgcatccggc540

tgcacgctgg tcgtcaagcc tgccgaagtc acgagtgcca cgacgcttct tctggcggaa600

gtgctggcgg atgcggggct gccgaagggt gtcttcaatg ttgtgacggg cacggggcgc660

acggtcgggc aggccatgac cgagcatcag gacatcgaca tgctgtcctt cacgggctcc720

acgggcgtcg gcaagtcctg catccatgcg gcggctgaca gcaacctgaa gaaactgggc780cttgagcttg gcggcaagaa cccgatcgtc gtgttcgctg acagcaacct tgaggatgcg840

gccgatgcgg tagctttcgg gattagtttc aacaccgggc agtgctgtgt gtcgtcgagc900

cgcctgattg tagagcggtc cgtggccgag aagttcgagc gtctcgttgt ggcgaaaatg960

gagaagatcc gcgtcggcga tccgttcgat cctgagacgc agatcggcgc cattacgacg1020

gaagcgcaga acaagaccat tctggactat atcgccaagg gcaaggccga gggcgccagg1080

ctgctctgcg gtggcgggat cgtcgatttc ggcaaagggc agtatatcca gccgacgctt1140

ttcacggatg tgaagccctc gatgggcatc gcgcgtgacg agatttttgg gccggtcctg1200

gcgtccttcc acttcgatac cgtcgatgag gcgatcgcga ttgccaatga cacggtttac1260

ggcctggccg catcggtctg gagcaaggat atcgacaagg cgcttgccgt gacccgtcgt1320

gttcgcgctg gccgcttctg ggtgaacacc atcatgagcg gtggtcccga gacgccgctg1380

ggtggtttca agcagtcggg ctggggccgt gaggccggtc tgtacggcgt tgaggaatat1440

acgcagatca aatctgtcca tatcgaaact ggcaaacgtt cgcactggat ttcgtaa1497

<210> 14

<211> 498

<212 > PRT

<213> Gluconobacter oxydans IFO 3293<400> 14

Met Asn Val Val Ser Lys Thr Val Ser Leu Pro Leu Lys Pro Arg Glu

1 · 5 10 15

Phe Gly Phe Tyr Ile Asp Gly Glu Trp Arg Ala Gly Lys Asp Phe Phe

20 25 30

Asp Arg Ser Ser Pro Ala His Asp Val Pro Val Thr Arg Ile Pro Arg

35 40 45

Cys Thr Arg Glu Asp Leu Asp Glu Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg Ala

50 55 60

Phe Glu Asn Gly Ser Trp Ser Gly Leu Ala Ala Ala Asp Arg Ala Ala

70 75 80

65 70

Val Leu Leu Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg Glu Arg Arg Asp Asp Ile

85 90 95

Ala Tyr Trp Glu Val Leu Glu Asn Gly Lys Pro Ile Ser Gln Ala Lys

100 105 HO

Gly Glu Ile Asp His Cys Ile Ala Cys Phe Glu Met Ala Ala Gly Ala

115 120 125

Ala Arg Met Leu His Gly Asp Thr Phe Asn Asn Leu Gly Glu Gly Leu

130 135 140

Phe Gly Met Val Leu Arg Glu Pro Ile Gly Val Val Gly Leu Ile Thr145 150 155 160

Pro Trp Asn Phe Pro Phe Met Ile Leu Cys Glu Arg Ala Pro Phe Ile

165 170 175

Leu Ala Ser Gly Cys Thr Leu Val Val Lys Pro Ala Glu Val Thr Ser

180 185 190

Ala Thr Thr Leu Leu Leu Ala Glu Val Leu Ala Asp Ala Gly Leu Pro

195 200 205

Lys Gly Val Phe Asn Val Val Thr Gly Thr Gly Arg Thr Val Gly Gln210 215 220Ala Met Thr Glu His Gln Asp Ile Asp Met Leu Ser Phe Thr Gly Ser225 230 235 240

Thr Gly Val Gly Lys Ser Cys Ile His Ala Ala Ala Asp Ser Asn Leu

245 250 255

Lys Lys Leu Gly Leu Glu Leu Gly Gly Lys Asn Pro Ile Val Val Phe

260 265 270

Ala Asp Ser Asn Leu Glu Asp Ala Ala Asp Ala Val Ala Phe Gly Ile

275 280 285

Ser Phe Asn Thr Gly Gln Cys Cys Val Ser Ser Ser Arg Leu Ile Val

290 295 300

Glu Arg Ser Val Ala Glu Lys Phe Glu Arg Leu Val Val Ala Lys Met305 310 315 320

Glu Lys Ile Arg Val Gly Asp Pro Phe Asp Pro Glu Thr Gln Ile Gly

325 330 335

Ala Ile Thr Thr Glu Ala Gln Asn Lys Thr Ile Leu Asp Tyr Ile Ala

340 345 350

Lys Gly Lys Ala Glu Gly Ala Arg Leu Leu Cys Gly Gly Gly Ile Val

355 360 365

Asp Phe Gly Lys Gly Gln Tyr Ile Gln Pro Thr Leu Phe Thr Asp Val

370 375 380

Lys Pro Ser Met Gly Ile Ala Arg Asp Glu Ile Phe Gly Pro Val Leu385 390 395 400

Ala Ser Phe His Phe Asp Thr Val Asp Glu Ala Ile Ala Ile Ala Asn

405 410 415

Asp Thr Val Tyr Gly Leu Ala Ala Ser Val Trp Ser Lys Asp Ile Asp

420 425 430

Lys Ala Leu Ala Val Thr Arg Arg Val Arg Ala Gly Arg Phe Trp Val

435 440 445

Asn Thr Ile Met Ser Gly Gly Pro Glu Thr Pro Leu Gly Gly Phe Lys450 455 460Gln Ser Gly Trp Gly Arg Glu Ala Gly Leu Tyr Gly Val Glu Glu Tyr465 470 475 480

Thr Gln Ile Lys Ser Val His Ile Glu Thr Gly Lys Arg Ser His Trp485 490 495

Ile Ser

<210 > 15

<211> 1401

<212 > DNA

<213> Gluconobacter oxydans IFO 32 93

<400> 15

atgagtgacg ttggcgtcgt agagagcgtt ccgcgcgttt cactcaacgg cagaagtgcc60

ctggtagcca ctctggctgc ggtggcaggt ctgatgttcg ggctggatct gggtgtcata120

tccggagcgc tgaaattcat cggtatcgag tttcaggtca atgatttcgg caaggagtgc180

attgtctccg gcatgatggt cggagcagcg ctcggggccc tgttcggtgg gcggctgtcc240

tatattctgg ggcgcaaaaa gctgctgatc atctcggcac tgctcttcat ttccgggtcg300

gcactctgcg cgctggcacc ctccgttccg gtcctgatcg cggggcgtgt ggtccttgga360

ctggcgatcg gcgtcgcgag ctttaccgct ccactctata tttcggagat tgcgcaccag420

cagcatcgcg gggcgctgat ttccgtctat cagctcatga ttacggtggg cattctggtc480

gcgttcatct ccgatgcgct tctggcctat tcgggatcat ggcgctggat gctggggatc540gtgggtgtcc ccggcgtgct gttcctgatc600

tggctggttc tgcgggggcg gcatgatgaa660

aatgatgcgc atgcgcggga cgagatcgtc720

ggcggatata cgctcttcaa gaaaaacccg780

gcgcttcagg cgatccagca gttcaccggc840

atcttcgaaa tggccggttt cggcaccagt900

ctggtcaatg tgctctccac gttcatcgcc960

cccatgctga tcgcgggctt catcatgatg1020

atgtatttcg gcacgggcaa cagcgatctg1080

tgcttcatcg tcgggtttgc attttccgcc1140

gttcagccca tgaaggggcg tgacttcggc1200

accaacatga ttgttggtct gaccttcctc1260

accttctggc tctatgccct gcttaatctc1320

ccggaaaccc gtggcgtgtc gcttgagcag1380

ctcaatcgta tcggcctgta a1401

ggtgtcctgt tccttccgga cagcccgcgc

gcgttcgatg tcctgcacgg gctgcgtggc

gaaatccgtg atcagcttgc acaggccgat

aacttccgcc gcgcggtcta tctgggcgtg

atcaacgtgg tcatgtacta cgcgccgcat

gccgccctgt ggggcacggt gatcgtggga

attggatatg tcgatcgctg gggccggcgg

gcgctcggta tgtttacggt cggcatgctg

gcgcgttacg cggcagttgc gatgctgctg

gggccgctgg tgtggatcct gtgctctgaa

atcgggtgct cgaccttcac caactggggc

tcgcttctga cgacactggg aagtgcccag

atcttcattt tcgtgacgat gaagttcgtg

atcgagcgga atctcatggc cggtaaaccc<210> 16

<211> 466

<212 > PRT

<213> Gluconobacter oxydans IFO 3293

<400> 16

Met Ser Asp Val Gly Val Val Glu Ser Val Pro Arg Val Ser Leu Asn1 5 10 15

Gly Arg Ser Ala Leu Val Ala Thr Leu Ala Ala Val Ala Gly Leu Met

20 25 30

Phe Gly Leu Asp Leu Gly Val Ile Ser Gly Ala Leu Lys Phe Ile Gly35 40 45

Ile Glu Phe Gln Val Asn Asp Phe Gly Lys Glu Cys Ile Val Ser Gly50 55 60

Met Met Val Gly Ala Ala Leu Gly Ala Leu Phe Gly Gly Arg Leu Ser65 70 75 80

Tyr Ile Leu Gly Arg Lys Lys Leu Leu Ile Ile Ser Ala Leu Leu Phe 85 90 95

Ile Ser Gly Ser Ala Leu Cys Ala Leu Ala Pro Ser Val Pro Val Leu

100 105 110

Ile Ala Gly Arg Val Val Leu Gly Leu Ala Ile Gly Val Ala Ser Phe115 120 125

Thr Ala Pro Leu Tyr Ile Ser Glu Ile Ala His Gln Gln His Arg Gly130 135 140

Ala Leu Ile Ser Val Tyr Gln Leu Met Ile Thr Val Gly Ile Leu Val145 150 155 160

Ala Phe Ile Ser Asp Ala Leu Leu Ala Tyr Ser Gly Ser Trp Arg Trp 165 170 175Met Leu Gly Ile180

Leu Phe Leu Pro195

Asp Glu Ala Phe210

Ala Arg Asp Glu225

Gly Gly Tyr Thr

Tyr Leu Gly Val260

Val Val Met Tyr275

Thr Ser Ala Ala290

Leu Ser Thr Phe305

Pro Met Leu Ile

Val Gly Met Leu340

Tyr Ala Ala Val355

Ser Ala Gly Pro370

Lys Gly Arg Asp385

Thr Asn Met Ile

Val Gly Val Pro

Asp Ser Pro Arg200

Asp Val Leu His215

Ile Val Glu Ile230

Leu Phe Lys Lys245

Ala Leu Gln Ala

Tyr Ala Pro His280

Leu Trp Gly Thr295

Ile Ala Ile Gly310

Ala Gly Phe Ile325

Met Tyr Phe Gly

Ala Met Leu Leu360

Leu Val Trp Ile375

Phe Gly Ile Gly390

Val Gly Leu Thr405

Gly Val Leu Phe185

Trp Leu Val Leu

Gly Leu Arg Gly220

Arg Asp Gln Leu235

Asn Pro Asn Phe250

Ile Gln Gln Phe265

Ile Phe Glu Met

Val Ile Val Gly300

Tyr Val Asp Arg315

Met Met Ala Leu330

Thr Gly Asn Ser345

Cys Phe Ile Val

Leu Cys Ser Glu380

Cys Ser Thr Phe395

Phe Leu Ser Leu410

Leu Ile Gly Val190

Arg Gly Arg His205

Asn Asp Ala His

Ala Gln Ala Asp240

Arg Arg Ala Val255

Thr Gly Ile Asn270

Ala Gly Phe Gly285

Leu Val Asn Val

Trp Gly Arg Arg320

Gly Met Phe Thr335

Asp Leu Ala Arg350

Gly Phe Ala Phe365

Val Gln Pro Met

Thr Asn Trp Gly400

Leu Thr Thr Leu415Gly Ser Ala Gln Thr Phe Trp Leu Tyr Ala Leu Leu Asn Leu Ile Phe

420 425 430

Ile Phe Val Thr Met Lys Phe Val Pro Glu Thr Arg Gly Val Ser Leu435 440 445

Glu Gln Ile Glu Arg Asn Leu Met Ala Gly Lys Pro Leu Asn Arg Ile450 455 460

Gly Leu465

Claims

1. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de serselecionado do grupo que consiste em:(a) polinucleotideos que codificam um polipeptídeocompreendendo a seqüência de aminoácido, de acordo com aSEQ ID NO:2,(b) polinucleotideos compreendendo a seqüência denucleotídeo de acordo com a SEQ ID NO: 1,(c) polinucleotideos compreendendo uma seqüência denucleotídeo que pode ser obtido por amplificação de ácidonucléico tal como reação de cadeia de polimerase,utilizando DNA genômico a partir de um microorganismo comopadrão e um conjunto iniciador de acordo com SEQ ID NO: 3 eSEQ ID NO: 4;(d) polinucleotideos compreendendo uma seqüência denucleotídeos codificando um fragmento ou derivado de umpolipeptídeo codificado por um polinucleotídeo de qualquerum de (a) a (c) onde no derivado um ou mais resíduos deaminoácido são substituídos de forma conservativa emcomparação com o polipeptídeo, e o fragmento ou derivadotem a atividade de um regulador de transcrição,preferivelmente um repressor de desidrogenase L-sorbose(SDH) e/ou desidrogenase L-sorbosone (SNDH);(e) polinucleotideos, cuja fita complementarhibridiza sob condições rigorosas em um polinucleotídeocomo definido em qualquer um de (a) a (d) e que codifica umregulador de transcrição, preferivelmente um repressor dedesidrogenase L-sorbose (SDH) e/ou desidrogenase L-sorbosone (SNDH); e(f) polinucleotideos que são pelo menos 60%, tal como-70, 85, 90 OU 95% idênticos a um polinucleotideo comodefinido em qualquer um de (a) a (d) e que codificam umregulador de transcrição, preferivelmente um repressor dedesidrogenase L-sorbose (SDH) e/ou desidrogenase L-sorbosone (SNDH);a fita complementar de um tal polinucleotideo.

2. Vetor caracterizado pelo fato de conter opolinucleotideo da reivindicação 1.

3. Vetor, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o polinucleotideo éoperativamente ligado a seqüências de controle de expressãopermitindo a expressão em células hospedeiras procarióticasou eucarióticas.

4. Microorganismo caracterizado pelo fato de sermanipulado geneticamente com um polinucleotideo dareivindicação 1 ou com o vetor da reivindicação 2 ou 3.

5. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de ser capaz de produzirdiretamente Vitamina C a partir de D-sorbitol emquantidades de 3 00 mg/l ou mais quando medido em um métodode célula em repouso após um período de incubação de 20horas.

6. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 5,caracterizado pelo fato de ser capaz de produzirdiretamente a Vitamina C de L-sorbose em quantidades de 800mg/l ou mais.

7. Polipeptideo caracterizado pelo fato de sercodificado por um polinucleotideo de acordo com areivindicação 1.

8. Processo para produzir células capazes de expressarum polipeptídeo da reivindicação 7 caracterizado pelo fatode compreender a etapa de manipular geneticamente célulascom o vetor da reivindicação 2 ou 3 ou com umpolinucleotideo da reivindicação 1.

9. Uso de um polinucleotideo rompido da reivindicação-1 caracterizado pelo fato de ser para a produção deVitamina C e/ou 2-KGA.

10. Microorganismo da reivindicação 4 ou ummicroorganismo contendo um gene endógeno compreendendo umpolinucleotideo da reivindicação 1 caracterizado pelo fatode ser geneticamente alterado de tal modo que leva a umrendimento e/ou eficiência de produção, aperfeiçoados, devitamina C e/ou 2-KGA produzido pelo microorganismo.

11. Microorganismo, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de produzir um polipeptídeo dareivindicação 7, com atividade de um regulador detranscrição diminuída ou abolida, preferivelmente umrepressor de gene de desidrogenase L-sorbose (SDH) e/oudesidrogenase L-sorbosone (SNDH).

12. Microorganismo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 4, 5, 6, 10 ou 11, caracterizado pelo fatode que o polinucleotideo, da reivindicação 1, é rompido.

13. Microorganismo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 4, 5, 6, 10, 11 ou 12, caracterizado pelofato de ser selecionado do grupo que consiste emPseudomonas, Pantoea, Escherichia, Ketogulonicigenium ebactérias de ácido acético como por exemplo, Gluconobacter,Acetobacter ou Gluconoacetobacter, preferivelmenteAeetobaeter sp. , Aeetobaeter aeeti, Glueonobaeterfrateurii, Gluconobacter eerinus, Gluconobacterthailandieus, Gluconobacter oxydans, mais preferivelmenteG. oxydans, mais preferivelmente G. oxydans IFO 3293.

14 . Processo para a produção de um gene regulador detranscrição endógeno rompido, preferivelmente um gene dedesidrogenase L-sorbose (SDH) e/ou desidrogenase L-sorbosone (SNDH) em um microorganismo, o microorganismocompreendendo um polinucleotídeo da reivindicação 1, oprocesso sendo caracterizado pelo fato de compreender aetapa de alterar o polinucleotídeo de tal modo que leva aum rendimento e/ou eficiência de produção aperfeiçoados deVitamina C e/ou 2-KGA produzida pelo microorganismo.

15. Processo para a produção de um microorganismocapaz de produzir Vitamina C e/ou 2-KGA caracterizado pelofato de compreender a etapa de alterar o microorganismo demodo que o microorganismo produz um polipeptídeo comatividade reduzida ou abolida de um regulador detranscrição, preferivelmente um repressor de gene dedesidrogenase L-sorbose (SDH) e/ou desidrogenase L-sorbosone (SNDH) levando a um rendimento e/ou eficiência deprodução aperfeiçoados de Vitamina C e/ou 2-KGA produzidapelo microorganismo.

16. Processo para a produção de um microorganismocontendo um gene endógeno compreendendo um polinucleotídeoda reivindicação 1 caracterizado pelo fato de compreender aetapa de alterar o microorganismo de modo que o geneendógeno seja sub-expresso ou rompido, levando a umrendimento e/ou eficiência de produção aperfeiçoados daVitamina C e/ou 2-KGA produzida pelo microorganismo.

17. Processo, de acordo com a reivindicação 15 ou 16,caracterizado pelo fato de ser para a produção de ummicroorganismo de qualquer uma das reivindicações 10, 11,-12 ou 13.

18. Microorganismo caracterizado pelo fato de que podeser obtido por um processo de qualquer uma dasreivindicações 14, 15 ou 16.

19. Processo para a produção de Vitamina C e/ou 2-KGAcom um microorganismo de qualquer uma das reivindicações-10, 11, 12 ou 13 ou reivindicações 4, 5 ou 6 caracterizadopelo fato de que o microorganismo é incubado/cultivado emum meio aquoso sob condições que permitem a produção diretade Vitamina C e/ou 2-KGA a partir de D-sorbitol ou L-sorbose e em que opcionalmente Vitamina C e/ou 2-KGA éisolada como o produto de fermentação.