BRPI0615649A2

BRPI0615649A2 - método para aumentar o acúmulo de uma proteìna inseticida em uma célula hospedeira, para produzir uma célula vegetal resistente a uma praga de inseto, para controlar infestação e para proteger uma cultura, composição inseticida, produto de mercadoria, planta transgênica ou célula vegetal, sequência de nucleotìdeo, proteìna inseticida, progênie ou semente de planta, vetor, célula hospedeira e cassete de expressão

Info

Publication number: BRPI0615649A2
Application number: BRPI0615649-5A
Authority: BR
Inventors: Heather M Anderson; James A Baum; Catherine A Chay; James K Roberts; Bei Zhang
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 2005-08-31
Filing date: 2006-08-30
Publication date: 2011-05-24
Also published as: US9121035B2; MX2008002801A; US20090068159A1; ZA200801477B; AU2006284856A1; WO2007027776A3; EP1920060B1; CA2618430A1; ECSP088226A; CN101300353A; CR9769A; RU2008112187A; EP1920060A2; AU2006284856B2; ATE505548T1; AR057515A1; DE602006021318D1; WO2007027776A2

Abstract

MéTODO PARA AUMENTAR O ACúMULO DEUMA PROTEìNA INSETICIDA EM UMA CéLULA HOSPEDEIRA, PARA PRODUZIR UMA CéLULA VEGETAL RESISTENTE A UMA PRAGA DE INSETO, PARA CONTROLAR INFESTAçãO E PARA PROTEGER UMA CULTURA, COMPOSIçãO INSETICIDA, PRODUTO DE MERCADORIA, PLANTA TRANSGENICA OU CéLULA VEGETAL, SEQUêNCIA DE NUCLEOTIDEO, PROTEìNA INSETICIDA, PROGENIE OU SEMENTE DE PLANTA, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA E CASSETE DE EX- PRESSãO. A presente invenção refere-se a sequências de polinucíeotídeo isoladas que codificam as proteinas ET37, TIC8IO e T1C812 de Bacílius thuringiensis, e sequências de nucleotídeos para uso na expressão de T1C809, ET37, TIC8IO e T1C812, e fusões de várias combinações insetícidamente eficazes destas proteínas tais como TIC 127, nas plantas Métodos de produção e utilização das sequências de polinucleotídeo e as proteínas no desenvolvimento de células vegetais transgênicas e plantas transgênicas apresentando resistência melhorada aos insetos contra (1) insetos Coleopteran incluindo verme da raiz do milho ocidental (Dibrotica virgifera), verme da raiz do milho sulista (Dibrotica undecempunctata) verme da raiz do milho do nor- te (Dibrotica. Barben), verme da raiz do milho mexicano (Dibrotica. virgifera zeae), verme da raiz do milho brasileiro (Dibrotica balteata) e complexo do verme da raiz do milho brasileiro (Dibrotica viridula e Dibrotica speciosa), e contra os insetos Hemípteran, como percevejos Lygus, são divulgados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOPARA AUMENTAR O ACÚMULO DE UMA PROTEÍNA INSETICIDA EMUMA CÉLULA HOSPEDEIRA, PARA PRODUZIR UMA CÉLULA VEGE-TAL RESISTENTE A UMA PRAGA DE INSETO, PARA CONTROLARINFESTAÇÃO E PARA PROTEGER UMA CULTURA, COMPOSIÇÃOINSETICIDA, PRODUTO DE MERCADORIA, PLANTA TRANSGÊNICAOU CÉLULA VEGETAL, SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO, PROTEÍNAINSETICIDA, PROGÊNIE OU SEMENTE DE PLANTA, VETOR, CÉLULAHOSPEDEIRA E CASSETE DE EXPRESSÃO".Fundamentos da Invenção

A presente invenção refere-se, de uma forma geral, ao campoda biologia molecular das plantas, e mais particularmente às novas seqüên-cias de polinucleotídeo e proteínas codificadas a partir de tais seqüênciasderivadas do Bacillus thuringiensis e que codificam as proteínas ET29,TIC809, ET37, TIC810 e TIC812 que apresentam toxicidade à espécie cole-opteran e aos insetos dentro da superordem referida como Hemípteros. Asproteínas tóxicas coleopteran incluem ET29, TIC809 (uma seqüência de a-minoácido variante de ET29). As TIC810 e TIC812 e seqüências de nucleo-tídeo que codificam estas proteínas são aqui também fornecidas. QuandoTIC810 ou TIC812 forem combinadas juntamente com ET29, TIC809 ouET37, as composições inseticidas são fornecidas as quais apresentam po-tência surpreendentemente maior contra a espécie coleopteran quandocomparado com a apresentação de apenas ET29, TIC809 ou ET37 isolada-mente, e a combinação das duas (TIC810 com ET29, TIC809, ou ET37, ouTIC812 com ET29, TIC809 ou ET37) surpreendentemente fornece umacomposição tóxica aos Hemípteros, particularmente quando fornecida nadieta das espécies tais como Lygus hesperus (percevejo de planta mancha-do ocidental, WTPB). Métodos de produção e uso de polinucleotídeos quecodificam estas proteínas e as relacionadas no desenvolvimento de plantastransgênicas e células de planta que são resistentes à infestação de insetosColeópteros e Hemípteros são também apresentados.

Os métodos e composições ambientalmente sensíveis para ocontrole ou erradicação da infestação de insetos são desejáveis em muitosexemplos por que as lavouras de interesse comercial são freqüentemente osalvos de ataque dos insetos, particularmente ataque de pestes de inseto co-leopteran e Iepidopteran. Isto é especialmente verdadeiro para os agriculto-res, viveiristas e produtores, e áreas comerciais e residenciais que visamcontrolar populações de inseto usando métodos e composições ambiental-mente amigáveis. Controlar ou erradicar infestações de hemíptero de cultu-ras é também de importância comercial, e é cada vez mais importante comopesquisas de biotecnologia para que os métodos de controle de pragas co-leopteran e Iepidopteran se tornem mais amplamente disponível, em especi-al porque menos aplicações de inseticida químico são utilizadas, o que resul-ta na atividade inseticida de amplo espectro.

As propriedades de inseticida da bactéria Bacillus thuringiensistem sido há muito reconhecido. A B. thuringiensis é bem-conhecida pelaprodução de cristais proteicos parasporais, ou δ-endotoxinas, que apresentatam toxicidade específica para uma grande variedade de larvas lepidópteras,coleópteras e dípteras (English et al., Patente U.S. ns 6.063.597). As compo-sições compreendendo cepas B. thuringiensis que produzem proteínas inse-ticidas têm sido utilizados comercialmente como inseticidas ambientalmenteaceitáveis porque apresentam toxicidade aos insetos-alvo específicos, e dei-xam de apresentar toxicidade para as plantas, animais e outros organismosnão-alvos.

Mais de 250 δ-endotoxinas diferentes foram isoladas e caracteri-zadas. As seqüências que codificam algumas destas δ-endotoxinas foramutilizadas para a construção de produtos de B. thuringiensis geneticamenteplanejados nos quais uma ou mais proteínas inseticidas são expressas asquais apresentam atividade inseticida específica para pragas-alvo, e foramaprovadas para uso agrícola, como composições inseticidas topicamenteaplicadas. As plantas transgênicas expressando uma ou mais proteínas del-ta endotoxinas inseticidas Bt para uso no controle de um ou mais insetosdentro de uma determinada classe, tal como pragas Lepidopteran ou coleop-teran, foram aprovadas para comercialização e foram bem-sucedidas. Noentanto, existe um risco de que as populações de insetos de pragas-alvoque se alimentam destas plantas transgênicas irão desenvolver resistência auma ou mais das toxinas produzidas pelas plantas e, por isso, permaneceuma necessidade de identificar novas proteínas inseticidas que possam serusadas isoladamente ou juntamente com outras que manifestam os suasefeitos tóxicos através de diferentes modos de ação. As novas composiçõesinseticidas são desejáveis para a produção de plantas transgênicas que ex-pressam uma ou mais proteínas inseticida de B. thuringiensis tóxicas para amesma espécie de inseto, fornecendo um meio de manejo da resistência eretardando ou eliminando o desenvolvimento da resistência de qualquer es-pécie de inseto suscetível a qualquer um dos um ou mais agentes inseticidasexpressos dentro de uma planta transgênica.

A maioria das toxinas Bt apresentam toxicidade para espécieslepidópteras. Poucas foram demonstradas serem eficazes contra as espé-cies coleopterans, e diferentes toxinas citolíticas que não apresentam ne-nhuma especificidade de faixa de hospedeiros, nenhuma toxina Bt forammostradas expor atividade inseticida para espécies lepidópteras ou coleopte-ran e para espécies Hemipterans de pragas de inseto. Assim, existe umanecessidade de identificar novas composições inseticidas específicas decoleopteran e/ou Hemipteran, e métodos para controlar infestações pormembros das famílias de inseto Coleópteras e Hemipteras1 em particularpara Coleópteras, pelos membros da família Chrysomelidae, mais especial-mente, pelo gênero Diabrotica na família Chrysomelidae, que podem incluiraqueles que são do gênero Diabrotica incluindo Diabrotica virgifera (vermeda raiz do milho ocidental, WCR), Diabrotica undecempunctata (verme daraiz do milho sulista, SCR), Diabrotica barberi (verme da raiz do milho donorte, NCR), Diabrotiea virgifera zeae (verme da raiz do milho mexicano,MCR), Diabrotiea balteata (verme da raiz do milho brasileiro, BZR) e com-plexo do verme da raiz do milho brasileiro (BCR)1 que consistem em Diabro-tiea viridula e Diabrotiea speeiosa) e, em particular, pelos membros da supe-rordem Hemíptera, o que inclui qualquer praga de inseto dentro do subor-dem Heteroptera, incluindo insetos comumente referidos como percevejosde mau cheiro, Lygus bugs(lncluindo Lygus Hesperus, Lygus Iineolorus eLygus elisus), percevejos assassinos, percevejos, percevejos de flores, e asubordem Homoptera, incluindo insetos comumente conhecidos como cigar-ras, pulgões, cigarrinhas, insetos escaladores e moscas brancas.

Sumário da Invenção

A presente invenção fornece composições de polipeptídeo isola-das de B. thuringiensis que apresentam atividade inseticida contra pragas deinseto Coleóptera e Hemiptera, e fornece seqüências de nucleotídeo quecodificam tais polipeptídeos. A presente invenção fornece controle da infes-tação de insetos coleópteros e Hemípteros por coexpressar pelo menos du-as proteínas de B. thuringiensis nas plantas como proteínas independentesou como uma proteína de fusão das duas, resultando em níveis surpreen-dentemente elevados de acúmulo de proteínas inseticidas para proporcionarcontrole eficaz de pragas de inseto Coleóptera e Hemiptera alvos e fornecemelhorias no manejo da resistência de inseto de infestações de insetos Co-leópteros e Hemípteros. Além disso, um método para aumentar o nível deacúmulo na planta de uma proteína inseticida de B. thuringiensis ou sua va-riante é fornecido o qual também fornece a vantagem adicional de uma au-sência de morfologia de planta anormal para as plantas transgênicas queexpressam essas proteínas.

Na realização do exposto, uma molécula de polinucleotídeo éfornecida como apresentada na SEQ ID NO: 1, isolada da cepa de B. thurin-giensis EG5078. A molécula de polinucleotídeo codifica uma proteína inseti-cida, conforme estipulado na SEQ ID NO: 2, designada aqui como ET37,apresentando bioatividade inibidora de praga de inseto coleopteran.

Uma molécula de polinucleotídeo conforme estabelecido na SEQID NO: 3 é também fornecida a qual é isolada da cepa de B. thuringiensisEG4096 que codifica uma seqüência de aminoácido TIC810, conforme esti-pulado na SEQ ID NO: 4.

Ainda outra seqüência de polinucleotídeo é fornecida, tal comoestabelecido na SEQ ID NO: 5, que codifica uma seqüência de aminoácidoTIC812, conforme estipulado na SEQ ID NO: 6, que é isolada da cepa de B.thuríngiensis EG5078. A TIC812 é substancialmente idêntica à TIC810.

Especificamente aqui contemplado é uma molécula de polinu-cleotídeo isolada que codifica uma proteína inseticida ou um fragmento inse-ticida dela que apresenta, pelo menos, de cerca de 70% a cerca de 99% oumaior de semelhança de seqüência com uma seqüência de polipeptídeo,conforme estipulado na SEQ ID NO: 4 e SEQ ID NO: 6, ou qualquer percen-tagem entre estas. A proteína inseticida ou fragmento inseticida é codificadopor uma molécula de polinucleotídeo isolada derivada de B. thuríngiensis, ecompreende uma seqüência de polinucleotídeo que apresenta, pelo menos,cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, ou cerca de 99% ou mais deidentidade de seqüência ou qualquer percentagem no meio-termo, ou quehibridiza sob condições severas, em uma seqüência de polinucleotídeo sele-cionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 5 ou o com-plemento destas.

Em mais uma outra modalidade, é fornecido uma molécula depolinucleotídeo para utilização na obtenção da expressão melhorada de umaproteína inseticida em uma planta. A proteína inseticida preferivelmente a-presenta atividade biológica no controle de uma praga de inseto Coleopteranou Hemipteran ou ambas, e pode ser codificada a partir de uma seqüênciade nucleótido planajada para expressão em uma célula vegetal, tal como éapresentada na SEQ ID NO: 15 (TIC810) ou SEQ ID NO: 19 (ET37).

Outras seqüências de polinucleotídeo são fornecidas neste do-cumento, para uso na obtenção de células vegetais estavelmente transfor-madas que expressam uma ou mais das proteínas da presente invenção.Tais seqüências de nucleotídeo incluem, mas não se destina a ser limitada aelas, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NÃO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 43 e SEQ ID NO: 46.

As seqüências de oligoncleotídeo são fornecidas para utilizaçãona identificação das seqüências de nucleotídeo relacionadas em outras bac-térias, e em particular nas outras cepas bacterianas de Bacillus incluindoBacillus thuríngiensis e Bacillus Iaterosperous e Bacillus entomocidus.As proteínas inseticidas são fornecidas as quais são exemplifi-cadas pelas seqüências de aminoácido, tais como apresentadas nas SEQ IDNO: 2, NO SEQ ID: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14 e SEQID NO: 47 (TIC127). Nas modalidades particulares, a SEQ ID NO: 4(TIC810) e a SEQ ID NO: 6 (TIC812) são fornecidas como proteínas acessó-rias, acompanhantes, ou proteínas que, de outra maneira, estabilizam e me-lhoram a expressão e acúmulo de uma segunda proteína expressa contem-poraneamente bem com estas proteínas acessórias. As TIC809, ET29 eET37 são todas proteínas inseticidas que apresentam maiores níveis de es-tabilidade e, por conseguinte, melhoram os níveis de acúmulo quando estãocada uma contemporaneamente expressa juntamente com uma seqüênciade aminoácido de TIC810 ou TIC812. Estas seqüências podem ser expres-sas em conjunto no mesmo compartimento subcelular, ou seja, ambas nocitoplasma ou ambas direcionadas para a inserção e acúmulo no cloroplastoou plastídeo de uma célula vegetal, ou contemporaneamente expressa paraacumular em diferentes compartimentos subcelulares, tal como uma TIC810no citoplasma e uma ET29 ou TIC809 direcionada para inserção e acúmulono cloroplasto ou plastídeo da planta. Além disso, a combinação de qualqueruma das proteínas TIC809, ET29, ou ET37, juntamente com uma das prote-ínas TIC810 ou TIC812 resulta em uma composição que é surpreendente-mente estabilizada com relação à expressão de alto nível e acúmulo de am-bos os componentes de proteína nas células vegetais e apresenta atividadeinseticida dirigida ao controle de pragas de planta nas ordens Coleoptera eHemiptera. A combinação de proteínas pode igualmente ser expressa comouma fusão de peptídeo, por exemplo, tal como a SEQ ID NO: 47.

Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a umacultura biologicamente pura de uma cepa tipo silvestre de B. thuringiensisselecionada do grupo consistindo em EG5078, a partir da qual a seqüênciade polinucleotídeo como apresentada na SEQ ID NO: 1 que codifica a prote-ína ET37 e a SEQ ID NO: 5 que codifica a proteína TIC812 são isoladas, e aEG4096, a partir da qual a SEQ ID NO: 3 que codifica a proteína TIC810 e aSEQ ID NO: 7 que codifica a proteína ET29 são isoladas. As EG4096 eEG5078 foram depositadas junto ao Northern Regional Research LaboratoryofAgricultural Research Service CenterCoIIection (NRRL)1 USDA1 1815 Nor-th University Street, Peoria1 IL 61604, em conformidade com o Tratado deBudapeste no International Recognition of the Deposit of Microorganism forthe Purposes of Patent Procedure e foram atribuídos aos Números de aces-so NRRL-B-21582 e NRRL-B-30841, respectivamente. A EG4096 foi deposi-tada em 30 de maio de 1996 e A EG5087 foi depositada em 3 de maio de2005.

A presente invenção também relaciona-se com uma construçãode DNA recombinante para expressão em uma planta ou célula vegetal queinclui um cassete de gene duplo simultaneamente expressando uma primei-ra seqüência de polinucleotídeo e uma segunda seqüência de polinucleotí-deo onde a primeira seqüência de polinucleotídeo codifica uma seqüência depolipeptídeo selecionada do grupo consistindo em ET29, TIC809 e ET37 oufragmentos inseticidamente ativos destes, e onde a segunda seqüência depolinucleotídeo codifica uma seqüência de polipeptídeo selecionada do gru-po consistindo em TIC810 e TIC812, e fragmentos inseticidamente ativosdestes. A primeira seqüência de polinucleotídeo é selecionada do grupoconsistindo em SEQ ID NO: 13 e SEQ ID NO: 17 e a segunda seqüência depolinucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 15 eSEQ ID NO: 19, em que a segunda seqüência de polinucleotídeo é coex-pressa com a primeira seqüência de polinucleotídeo para aumentar ou me-lhorar a expressão da primeira seqüência de polinucleotídeo, e para facilitara atividade inseticida direcionado para controlar a infestação de pragas deplanta Coleopteran e Hemipteran.

A presente invenção também reporta-se a uma célula hospedei-ra transformada para conter o vetor de expressão ou a construção de DNArecombinante da presente invenção, aqui divulgados. A célula hospedeirapode ser selecionada do grupo consistindo em uma célula bacteriana, umacélula fúngica e uma célula vegetal. Em um aspecto da modalidade, a célulahospedeira é uma célula bacteriana tal como uma célula B. thuringiensis queé transformada para conter o vetor de expressão da presente invenção. Emum outro aspecto da modalidade, a célula hospedeira é uma célula de plantatransgênica transformada para conter a construção de DNA recombinante dapresente invenção. A construção de DNA recombinante pode compreenderseqüências de polinucleotídeo que codificam uma combinação de duas dasquatro proteínas simultaneamente em que as seqüências de polipeptídeosão apresentadas nas SEQ NO ED: 14 (TIC809), SEQ ID NO: 16 (TIC810),SEQ ID NO: 18 (ET37) e SEQ ID NO: 20 (TIC812). As combinações preferí-veis das proteínas podem incluir TIC809 e TIC810, TIC809 e TIC812, ET37e TIC810, e ET37 e TIC812 onde a coexpressão da seqüência de polinu-cleotídeo que codifica TIC810 ou TIC812 com a seqüência de polinucleotí-deo que codifica TIC809 (ou ET29) ou ET37 resultará (a) no acúmulo au-mentado de proteína TIC809 (ou ET29) ou ET37 na célula vegetal, (b) nascondições normais de crescimento celular, (c) em uma planta transgênicaregenerada da célula vegetal hospedeira, (d) em um fenótipo normal, e (e)em níveis aumentados de resistência aos insetos Coleopteran e Hemipteran.

A célula vegetal transgênica da presente invenção pode com-preender uma célula vetetal de milho, uma célula vegetal de trigo, uma célu-la vegetal de centeio, uma célula vegetal de cevada, uma célula vegetal deaveia, uma célula vegetal de trigo mourisco, uma célula vegetal de sorgo, um20 célula vegetal de arroz, uma célula vegetal de cana, uma célula vegetal deguandu, uma célula vegetal de amendoim, uma célula vegetal de cebola,uma célula vegetal de alho, uma célula vegetal de capim (incluindo capimpanasco, festuca, bromus, Timothy, pomar, Bermuda, zoysia e outras mais),uma célula vegetal de Arabidopsis, uma célula vegetal de brócolis, uma célu-La vegetal de girassol, uma célula vegetal de canola, uma célula vegetal deervilha, uma célula vegetal de cowpea, uma célula vegetal de feijão, umacélula vegetal de café, uma célula vegetal de soja, uma célula vegetal dealgodão, uma célula vegetal de linhaça, uma célula vegetal de couve-flor,uma célula vegetal de aspargo, uma célula vegetal de alface, uma célulavegetal de repolho, um célula vegetal de tabaco, uma célula vegetal de es-peciarias (incluindo caril, mostarda, salva, salsa, pimenta, tomilho, coentro,louro, cominho, curcuma, noz moscada, canela, e similares), uma célula ve-getal de beterraba, uma célula vegetal de batata, uma célula vegetal de ba-tata doce, uma célula vegetal de cenoura, uma célula vegetal de nabo, umacélula vegetal de aipo, uma célula vegetal de tomate, uma célula vegetal deberingela, uma célula vegetal de pepino, uma celular vegetal de abóbora oumelão e outras mais, uma célula vegetal de árvore frutífera (incluindo maçã,abricó, pêssego, pera, ameixa, laranja, limão, lima, e similares), uma célulavegetal de nogueira (incluindo bolota, hicória, pau-brasil, pecan, nozes, ave-lã, e similares), uma célula vegetal de uva, uma célula vegetal de bagas (in-cluindo amora silvestre, mirtilo, morango, amora, e similares) e células vege-tais de flores.

Em outra modalidade, a presente invenção diz respeito a umaplanta transgênica transformada para conter um construto de DNA recombi-nante, aqui divulgada. A planta transgênica pode ser regenerada a partir dacélula vegetal transgênica da presente invenção, ou pode ser a partir de umasemente transgênica que é obtida da planta transgênica regenerada ou deseus descendentes. A planta transgênica é selecionada do grupo consistindoem uma planta monocotiledônea e uma planta dicotiledônea que pode incluirmonocotiledôneas tais como milho, trigo, centeio, cevada, aveia, trigo mou-risco, sorgo, arroz, cana-de-açúcar, cebola, alho, capim, ou dicotedôneastais como girassol, canola, ervilha, cowpeas, guandu, feijão, soja, café, bró-colis, algodão, linhaça, couve-flor, Arabidopsis, aspargo, alface, tabaco,plantas aromáticas (incluindo caril, mostarda, salva, salsa, pimenta, tomilho,coentro, louro, cominho, curcuma, noz moscada, canela e similares), beter-raba, batata, batata doce, cenoura, nabo, aipo, tomate, beringela, pepino,abóbora ou melão, árvores frutíferas (incluindo maçã, abricó, pêssego, pera,ameixa, laranja, limão, lima e similares), plantas de baga (incluindo amorasilvestre, mirtilo, morango, amora e similares), nogueiras (incluindo bolota,hicória, pau-brasil, pecan, nozes, avelã, e similares), videiras e flores.

Em outra modalidade, a presente invenção diz respeito a umasemente transgênica da planta transgênica transformada para conter umconstruto de DNA recombinante. A semente transgênica pode ser da plantatransgênica que é regenerada a partir da célula vegetal transgênica da pre-sente invenção, ou pode ser da descendência da planta transgênica regene-rada, ou de híbridos criados como resultado do cruzamento ou reproduçãoda planta transgênica com uma planta não-transgênica. Em um aspecto, asemente transgênica pode ser revestida com um revestimento de semente eem que o revestimento de semente compreende uma composição herbicida,um revestimento de semente fungicida, um revestimento de semente bacte-ricida, um revestimento de semente inseticida, um revestimento de sementecom hormônio vegetal, um revestimento de semente com nutriente, um re-vestimento de semente inóculo microbiano, um revestimento de sementecolorido, um revestimento de semente repelente a aves, um revestimento desemente repelente a roedores, um revestimento de semente de proteína in-seticida, um revestimento de semente bacteriano contendo uma proteínainseticida, um revestimento de semente com RNA de fita única, um revesti-mento de semente com RNA de fita dupla, um revestimento de semente commicro RNA ou um revestimento de semente com RNA de pequena interfe-rência. Um meio de habilitar e estabilizar um revestimento de semente com-preendendo tais composições únicas ou dsRNA é combinar essas moléculasde RNA com moléculas de DNA complementares de modo que os híbridosmoleculares de DNA-RNA estabilizados são apresentados na composiçãode revestimento de sementes, permitindo a apresentação do dsRNA ou RNAde fita única para uma praga que se alimentam da semente ou o microambi-ente dentro da área da germinação da semente ou as microraízes de umagerminação emergente disparam após a germinação das sementes revesti-das.

De acordo com uma modalidade da presente invenção, é forne-cido um método de geração de uma planta resistente à infestação de insetoColeopteran e/ou Hemipteran, compreendendo as etapas de:a) inserir no genoma de uma célula vegetal uma primeira molécula deácido nucleico que funciona na planta para codificar um primeira pro-teína selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 14 (TIC809)e SEQ ID NO: 18 (ET37), e uma segunda molécula de ácido nucleicoque funciona na planta para codificar uma segunda proteína selecio-nada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 16 (TIC810) e SEQ IDNO: 20 (TIC812);

b) obter a célula vegetal que contém as moléculas de ácido nucleico daetapa (a); e

c) gerar a partir da célula vegetal uma planta transgênica que expressatanto proteínas, em que a planta transgênica apresenta resistência depraga Coleopteran e/ou Hemipteran, em comparação com uma plantaque carece de ditas moléculas.

Em outra modalidade, a presente invenção também fornece ummétodo para controlar uma infestação de praga de insetos Coleopteran e/ouHemipteran de uma planta, que compreende fornecer na dieta da praga deinseto uma planta, tecido vegetal ou células vegetais que expressam umaproteína TIC809, ET2 ou ET37 juntamente com uma proteína TIC810 ouTIC812.

As composições de polinucleotídeo e polipeptídeo e métodosaqui divulgados encontrarão benefícios particulares quando usados contrapragas de inseto Coleopteran e Hemipteran selecionadas do grupo de famí-lias Coleopteran consistindo em Chrysomelidae, Cucujidae1 Scarabaeidae,Trogositidae, Tenebrionidae, Curculionidae, Elateridae e Bruchidae, e demembros da ordem Hemiptera incluindo especificamente os membros dassubordens Heteroptera e Homoptera. Em um aspecto da invenção, os inse-tos Coleopteran são aqueles da família Chrysomelidae. Os insetos Coleopte-ran exemplares na família Chrysomelidae podem incluir aqueles que são dogênero Diabrotica incluindo D. virgifera (WCR), D. undecempunctata (SCR)1D. barberi (NCR), D. virgifera zeae (MCR), D. balteata (BZR) e complexoBrazilian Corn Rootworm (BCR), que consiste em D. viridula e D. speciosa).

Uma molécula com seqüência de ácido nucleico pode ser cons-truída para incorporar uma terceira seqüência genética estrutural que codifi-ca um terceiro agente (dsRNA ou proteína), como um meio para fornecer namesma planta um traço agronômico adicional que apresenta atividade dire-cionada ao controle de mais do que uma praga de planta, tal como apresen-tando controle de inseto Coleopteran e/ou Hemipteran e um traço adicionalde uma resistência de inseto Lepidopteran, resistência à infestação bacteria-na, viral ou fúngica, resistência a nematoides, ou para fornecer um traço su-plementar tal como um traço de resistência à herbicida, um traço de rendi-mento, um traço de estresse, uma intensificação alimentar ou traço que re-sulta na melhoria do processamento de alimento, e similares. O método po-de consistir das etapas de inserir no genoma de uma célula vegetal umaprimeira molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína que é sele-cionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 14 (TIC809) e SEQ ID NO: 18(ET37). A primeira molécula de ácido nucleico está ligada a uma segundamolécula de ácido nucleico que codifica uma proteína selecionada do grupoconsistindo em SEQ ID NO: 16 (TIC810) e SEQ ID NO: 20 (TIC812). Umaterceira molécula de ácido nucleico que é introduzida no genoma da plantacodifica um agente que fornece uma característica agronômica que é dife-rente daquela fornecida pela primeira e segunda moléculas de ácidos nuclei-cos, incluindo, mas não limitado a elas, resistência aos insectos Lepidopte-ran, resistência à infestação bacteriana, viral ou fúngica, resistência a nema-toides, ou para fornecer uma característica suplementar tal como um traçode resistência a herbicida, um traço de rendimento, um traço de estresse,uma intensificação da alimentação ou traço que resulta na melhoria do pro-cessamento de alimento, e similares.

Além de fornecer as proteínas da presente invenção em umacomposição para controlar a infestação de praga de inseto Coleoptera ouHemiptera, uma seqüência de polinucleotídeo que transcreve uma moléculade ácido ribonucleotídeo (RNA) que funciona, quando ingerido por uma pra-ga invertebrada, para controlar a infestação de pragas invertebradas medi-ante a inibição de uma função biológica dentro da praga como um segundomodo de ação ou como um aspecto de manejo de resistência aos insetos dacomposição é também especificamente contemplado. A molécula de RNApode compreender uma molécula de dsRNA, uma molécula de siRNA, umamolécula de miRNA, ou uma molécula de ssRNA, e deve ser específica parainibir um gene essencial de uma praga-alvo tal como uma praga visada pe-las composições da presente invenção.As composições e os métodos divulgados pela presente inven-ção fornecem muitas vantagens sobre a técnica anterior incluindo aquelasespecificamente acima descritas. Essas vantagens podem incluir: obter con-trole melhorado de pragas de inseto suscetíveis incluindo não apenas aque-Las que infestam as plantas, obter um maior número de linhagens de plantasresistentes a insetos comercialmente viáveis; alcançar porteção de longatemporada dos patógenos de inseto; e aumentar a incidência de plantastransformadas morfologicamente normais.

Descrição das Seqüências

SEQ ID NO: 1 é uma seqüência de polinucleotídeo B. thuringi-ensis que codifica uma proteína ET37 inseticida.

SEQ ID NO: 2 é um seqüência de aminoácido de ET37 codifica-da pela seqüência de polinucleotídeo como apresentada na SEQ ID NO: 1.

SEQ ID NO: 3 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificauma proteína TIC810 inseticida.

SEQ ID NO: 4 é um seqüência de aminoácido de TIC810 codifi-cada pela seqüência de polinucleotídeo como apresentada na SEQ ID NO:3.

SEQ ID NO: 5 é uma seqüência de polinucleotídeo B. thuringi-ensis que codifica uma proteína TIC812.

SEQ ID NO: 6 é uma seqüência de aminoácido de TIC812 codi-ficada pela seqüência de polinucleotídeo como apresentada na SEQ ID NO:5.

SEQ ID NO: 7 é uma seqüência de polinucleotídeo B. thuringi-ensis que codifica uma proteína ET29.

SEQ ID NO: 8 é uma seqüência de aminoácido de ET29 codifi-cada pela seqüência de polinucleotídeo como apresentada na SEQ ID NO:7.

SEQ ID NO: 9 é uma seqüência de polinucleotídeo B. thuringi- ensis que codifica TIC810 a partir da posição 1 do nucleotídeo até a posição657 do nucleotídeo e que codifica ET29 a partir da posição 716 do nucleotí-deo até 1411.SEQ ID NO: 10 é uma seqüência de polinucleotídeo B. thuringi-ensis que codifica TIC812 a partir da posição 1 do nucleotídeo a 657 e quecodifica ET37 a partir da posição 716 do nucleotídeo a 1411.

SEQ ID NO: 11 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaTIC810 a partir da posição 1 do nucleotídeo até a posição 657 do nucleotí-deo e que codifica ET37 a partir da posição 716 do nucleotídeo a 1411.

SEQ ID NO: 12 é uma seqüência de polinucleotídeo que codificaTIC812 a partir da posição 1 do nucleotídeo a 657 e que codifica ET29 a par-tir da posição 716 do nucleotídeo 716 a 1411.

SEQ ID NO: 13 é uma seqüência de polinucleotídeo construídapara expressão de uma célula vegetal que codifica uma proteína TIC809.

SEQ ID NO: 14 é um seqüência de aminoácido de TIC809 codi-ficada pela seqüência de polinucleotídeo, como apresentada na SEQ ID NO:13.

SEQ ID NO: 15 é uma seqüência de polinucleotídeo construídapara expressão de uma célula vegetal que codifica uma proteína TIC810.

SEQ ID NO: 16 é um seqüência de aminoácido de TIC810 codi-ficada pela seqüência de polinucleotídeo como apresentada na SEQ ID NO:15.

SEQ ID NO: 17 representa uma seqüência de polinucleotídeoconstruída para expressão em uma célula vegetal que codifica uma proteínaET37.

SEQ ID NO: 18 é um seqüência de aminoácido de ET37 codifi-cada pela seqüência de polinucleotídeo como apresentada na SEQ ID NO:19.

SEQ ID NO: 19 é uma seqüência de polinucleotídeo construídapara expressão de uma célula vegetal que codifica uma proteína TIC812.

SEQ ID NO: 20 é um seqüência de aminoácido de TIC812 codi-ficada pela seqüência de polinucleotídeo como apresentada na SEQ ID NO:17.

SEQ ID NO: 21 é um iniciador de amplificação térmica para utili-zação na amplificação de uma seqüência de nucleotídeo que codifica umaseqüência de aminoácido de TIC810 e é aqui referida como pr370.

SEQ ID NO: 22 é um iniciador de amplificação térmica para utili-zação na amplificação de uma seqüência de nucleotídeo que codifica umaseqüência de aminoácido de TIC810 e é aqui referida como pr371.

SEQ ID NO: 23 é um iniciador de amplificação térmica para utili-zação na amplificação de uma seqüência de nucleotídeo que codifica umaseqüência de aminoácido de TIC810 e é aqui referida como pr375.

SEQ ID NO: 24 é um iniciador de amplificação térmica para utili-zação na amplificação de uma seqüência de nucleotídeo que codifica umaseqüência de aminoácido de TIC810 e é aqui referida como pr376.

SEQ ID NO: 25 é um iniciador de amplificação térmica para utili-zação na amplificação de uma seqüência de nucleotídeo que codifica umaseqüência de aminoácido de ET29 e é aqui referida como pr365.

SEQ ID NO: 26 é um iniciador de amplificação térmica para utili-zação na amplificação de uma seqüência de nucleotídeo que codifica umaseqüência de aminoácido de ET29 e é aqui referida como pr372.

SEQ ID NO: 27 é um iniciador de amplificação térmica para utili-zação na amplificação de uma seqüência de nucleotídeo que codifica umaseqüência óperon TIC810_ET29 ou TIC812_ET37 e é aqui referida comopr421.

SEQ ID NO: 28 é uma seqüência de nucleotídeo sintética pre-sente no vetor de transformação pMON64138 e que consiste em um primei-ro cassete de expressão de planta que codifica uma proteína TIC809 e umsegundo cassete de expressão de planta que codifica uma proteína TIC810.

ID NO: 29 é uma seqüência de aminoácido de TIC809 codi-ficada a partir do primeiro cassete de expressão de planta, como apresenta-do na SEQ ID NO: 28.

SEQ ID NO: 30 é uma seqüência de aminoácido de TIC810 codi-ficada a partir do segundo cassete de expressão de planta, como apresenta-do na SEQ ID NO: 28.

SEQ ID NO: 31 é uma seqüência de nucleotídeo sintética pre-sente em pMON64139 e que consiste em um primeiro cassete de expressãode planta que codifica uma TIC809 direcionada a cloroplasto e um segundocassete de expressão de planta que codifica uma TIC810 direcionada a clo-roplasto.

SEQ ID NO: 32 é uma seqüência de aminoácido de TIC809 codi-ficada a partir do primeiro cassete de expressão de planta, como apresenta-do na SEQ ID NO: 31.

SEQ ID NO: 33 é uma seqüência de aminoácido de TIC810 codi-ficada a partir do segundo cassete de expressão de planta, como apresenta-do na SEQ ID NO: 31.

SEQ ID NO: 34 é uma seqüência de nucleotídeo sintética pre-sente em pMON70513 e consiste em um cassete de expressão de plantaque codifica uma seqüência de aminoácido de TIC809.

SEQ ID NO: 35 é uma seqüência de aminoácido de TIC809 codi-ficada a partir do cassete de expressão de planta, como apresentado naSEQ ID NO: 34.

SEQ ID NO: 36 é uma seqüência de nucleotídeo sintética pre-sente em pMON70514 e consiste em um cassete de expressão de plantaque codifica uma seqüência de aminoácido de TIC809 direcionada ao cloro-plasto.

SEQ ID NO: 37 é uma seqüência de aminoácido de TIC809 codi-ficada a partir do cassete de expressão de planta, como apresentado naSEQ ID NO: 36.

SEQ ID NO: 38 é uma seqüência de nucleotídeo sintética pre-sente em pMON64144 e consiste em uma cassete de expressão de plantaque codifica uma seqüência de aminoácido de TIC809 direcionada ao cloro-plasto.

SEQ ID NO: 39 é uma seqüência de aminoácido de TIC809 codi-ficada a partir do cassete de expressão de planta, como apresentado naSEQ ID NO: 38.

SEQ ID NO: 40 é uma seqüência de nucleotídeo sintética pre-sente em pMON64150 e consiste em um primeiro cassete de expressão deplanta que codifica uma seqüência de aminoácido de TIC809 direcionada aocloroplasto e um segundo cassete de expressão de planta que codifica umaseqüência de aminoácido de TIC810 direcionada ao cloroplasto.

SEQ ID NO: 41 é uma seqüência de aminoácido de TIC809 codi-ficada a partir do primeiro cassete de expressão de planta, como apresenta-do na SEQ ID NO: 40.

SEQ ID NO: 42 é uma seqüência de aminoácido de TIC810 codi-ficada a partir do segundo cassete de expressão de planta, como apresenta-do na SEQ ID NO: 40.

SEQ ID NO: 43 é uma seqüência de nucleotídeo sintética pre-sente em pMON64151 e consiste em um primeiro cassete de expressão deplanta que codifica uma seqüência de aminoácido de TIC809 e um segundocassete de expressão de planta que codifica uma seqüência de aminoácidode TIC810.

SEQ ID NO: 44 é uma seqüência de aminoácido de TIC809 codi-ficada a partir do primeiro cassete de expressão de planta, como apresenta-do na SEQ ID NO: 43.

SEQ ID NO: 45 é uma seqüência de aminoácido de TIC810 codi-ficada a partir do segundo cassete de expressão de planta, como apresenta-do na SEQ ID NO: 43.

SEQ ID NO: 46 é uma seqüência de nucleotídeo que codifica umpeptídeo de TIC127 que corresponde a uma fusão entre TIC809 (codificadapela posição de nucleotídeo 1-696) e TIC810 (codificada pela posição denucleotídeo 754-1407), em que uma seqüência articuladora curta (codificadapela posição de nucleotídeo 697-753), foi introduzida para permitir que asduas proteínas fossem separadas por proteólise depois da expressão emuma célula vegetal (ou após a ingestão no tubo digestivo de uma praga deinseto-alvo).

SEQ ID NO: 47 é uma seqüência de aminoácido de TIC127.

Descrição Detalhada da Presente Invenção

As seqüências de polinucleotídeo derivadas de B. thuringiensissão aqui fornecidas as quais codificam as proteínas ET29, ET37, TIC809,TIC810 e TIC812, bem como uma fusão entre os derivados de ET29 TIC809e TTC810. As seqüências de nucleotídeo sintéticas construídos para ex-pressão nas plantas são também fornecidas que codificam as seqüências deaminoácido de ET29, TIC809, ET37, TIC810 e TIC812 assim como a fusãode proteína TIC127 entre TIC809 e TIC810. Os métodos de elaboração eutilização das seqüências de polinucleotídeo no desenvolvimento de plantastransgênicas e células de vegetais que são resistentes à infestação de inse-tos Coleopteran e Hemipteran também são divulgados. As proteínas sãotambém fornecidas como composições inseticidas quer em formulações paraaplicação tópica em vários ambientes agrícolas ou animais, ou como com-posições insecticidas produzidas por uma célula hospedeira preferida talcomo uma célula bacteriana, uma célula vegetal ou uma célula de leveduraou fúngica. Com referência ao termo "derivado", pretende-se que uma se-qüência seja diretamente isolável de uma fonte específica, ou após o isola-mento de uma determinada fonte, uma seqüência tal como uma seqüênciade nucleotídeo é modificada para codificar uma proteína que é substancial-mente idêntica como a seqüência que foi isolada de uma fonte particular.Alternativamente, uma seqüência de aminoácido pode ser substancialmentea mesma como uma seqüência de aminoácido isolada de uma determinadafonte, ou codificada de uma determinada seqüência de nucleotídeo. Umaseqüência de aminoácido pode ser uma quimera de várias diferentes se-qüências de aminoácido que foram cada uma individualmente isolada deuma fonte específica, mas vários segmentos de tais diferentes seqüênciasde aminoácido foram remendados entre si para produzir a quimera. Nestesentido, a quimera é obtida de cada uma das diferentes seqüências de ami-noácido. A seqüência de nucleotídeo pode ser similarmente derivada de ou-tras seqüências de nucleotídeo. A seqüência de nucleotídeo pode ser deri-vada de outras seqüências de nucleotídeo como uma conseqüência da suaprodução ou que tendo sido obtidas por referência a uma ou mais seqüên-cias de nucleotídeo. Da mesma forma, as seqüências de aminoácido podemser obtidas ou produzidas por referência a uma ou várias de outras seqüên-cias de aminoácido e, por conseguinte, serem derivadas desta maneira.

As seqüências de polinucleotídeo sintéticas da presente inven-ção são preferivelmente designadas para a expressão in planta de proteínasinseticidas em tecidos de planta e células vegetais. Em particular, as proteí-nas inseticidas da presente invenção são referidas como proteínas ET29,ET37, TIC809, TTC810, TIC812 e TIC127. Uma seqüência de aminoácidode qualquer uma destas proteínas destina-se a estarem dentro do escopo dapresente invenção desde que apresente atividade inseticida pelo menos e-quivalente àquela da proteína de comprimento total da qual era derivada.

Em uma modalidade, a presente invenção relaciona-se com umacultura biologicamente pura de uma bactéria de B. thuríngiensis contendouma seqüência de nucleotídeo que codifica uma ou mais das proteínas aquidivulgadas. Em particular, as seqüências de nucleotídeo são aquelas esta-belecidas na SEQ ID NO: 1 que codifica ET37 (SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO:3 que codifica TIC810 (SEQ ID NO: 4), SEQ ID NO: 5 que codifica TIC812(SEQ ID NO: 6), e SEQ ID NO: 7 que codifica ET29 (SEQ ID NO: 8). Damesma forma, as fusões são contempladas e especificamente incorporadasneste documento, tal como TIC127 (SEQ ID NO: 46 que codifica a SEQ IDNO: 47). Uma cultura biologicamente pura pode também incluir aquelas quesão transformadas com uma seqüência de polinucleotídeo da presente in-venção ou com duas ou mais seqüências de polinucleotídeo, pelo menosuma primeira seqüência de polinucleotídeo sendo selecionada do grupo queconsiste em uma seqüência de codificação de ET37 e uma seqüência decodificação de ET29, e pelo menos uma segunda seqüência de polinucleotí-deo a ser selecionada do grupo consistindo em uma seqüência de codifica-ção de TIC810 e uma seqüência de codificação de TIC812. As cepas exem-plares, isto é, EG4096 e EG5078, foram depositadas no Northern RegionalResearch Laboratory of Agricultural Research Service Center Collection(NRRL), USDA, 1815 North University Street, Peoria, IL 61604, em confor-midade com o Tratado de Budapeste no International Recognition of the De-posit of Microorganism for the Purposes of Patent Procedure e foram atribuí-dos os números de acesso conforme indicado na Tabela 1.Tabela 1. Cepas de B. thurinaiensis exemplares

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A seqüência de polinucleotídeo de ocorrência natural (nativa)que codifica ET37 é definida na SEQ ID NO: 1. Esta seqüência apresentacerca de 99% de identidade de seqüência na seqüência de polinucleotídeoque codifica uma proteína inseticida ET29, conforme revelado na PatenteU.S. n- 6093695, e como aqui divulgado pela SEQ ID NO: 7. A seqüência deaminoácido de ET37 codificada a partir da SEQ ID NO: 1 é apresentada naSEQ ID NO: 2. A atividade inseticida da proteína ET37 é aqui demonstradaem bioensaios utilizando insetos Coleopteran do gênero Diabrotica, incluindoWCR e SCR1 e insetos Hemipteran do gênero Lygus. No decurso da condu-ção de análise da seqüência dos plasmídeos extra-cromossômicos em queas seqüências de codificação de ET37 e ET29 estão localizadas nas respec-tivas cepas, uma estrutura de leitura aberta única foi identificada a montantede cada uma das estruturas de leitura aberta das ET37 e ET29, estas cor-respondendo respectivamente às seqüências que codificam as proteínasTIC812 e TIC810. A molécula de polinucleotídeo nativa (SEQ ID NO: 3) quecodifica uma proteína TIC810 (SEQ ID NO: 4) é posicionada imediatamentea montante da seqüência de codificação de ET29 na cepa de B. thuringien-sis EG4096. A molécula de polinucleotídeo nativa (SEQ ID NO: 5) que codi-fica uma proteína TIC812 (SEQ ID NO: 6) é posicionado imediatamente amontante da seqüência de codificação de ET37 na cepa de B. thuríngiensisEG5078.

Todas as ET29, ET37, TIC810 e TIC812 podem ser remotamen-te relacionadas com a família de toxina inseticida Cyt, no entanto a partir deuma perspectiva filogenética, as proteínas ET29 e 37 estão muito mais pró-ximas uma da outra do que as outras proteínas Cyt1 e as proteínas TIC810 e812 estão também muito próximas uma da outra do que as outras proteínasCyt. A seqüência de aminoácido de ET37 compartilha cerca de 99% de se-melhança de seqüência com aquela da ET29. As TIC810 e TIC812 apresen-tam de cerca de 97% de semelhança de seqüência de aminoácido um com ooutro. A TIC810 apresenta cerca de 33% de semelhança de seqüência deaminoácido com ET29 e ET37. Do mesmo modo, a proteína TIC812 apre-senta cerca de 32% de semelhança de seqüência de aminoácido com ET29e ET37. A comparação de semelhança é baseada em alinhamentos em pa-res entre as proteínas utilizando a Wisconsin Package Version 10,3, Accel-rys Inc., San Diego, CA.

Em conformidade com a presente invenção, certas combinaçõesde expressão das proteínas TIC810, TIC812, ET37 e ET29 em uma célulahospedeira funcionam para obter um nível elevado de acúmulo de proteínainseticida na célula hospedeira, resultando na melhoria da atividade insetici-da direcionado para determinadss pragas de insetos Coleopteran e Hemipte-ran alvos. Uma seqüência de polinucleotídeo que codifica a ET29 pode sercoexpressa com uma seqüência de polinucleotídeo que codifica uma proteí-na TIC810 para obter uma maior expressão e ou acúmulo da proteína inseti-cida ET29 em uma célula hospedeira. Do mesmo modo, uma seqüência depolinucleotídeo que codifica a ET37 pode ser coexpresso com uma sequên-cia de polinucleotídeo que codifica a TIC812 para obter uma maior expres-são e ou acúmulo da proteína inseticida ET37 em uma célula hospedeira. Éprevisto que a TIC812 é permutável com TIC810 como um agente inseticida,e como uma proteína acompanhante ou acessória requerida para a estabili-zação, acúmulo, e faixa de bioatividade de hospedeiro melhorada de ET37ou ET29. A coexpressão de TIC810 ou TIC812 juntamente com ET37 ouET29 resulta na melhoria da expressão e/ou acúmulo de ET37 ou ET29.

Tais combinações são aqui referidas como composições inseticidas estabili-zadas. Além disso, as composições estabilizadas apresentam uma maiorgama de hospedeiros, pelo menos com referência à sua eficácia inseticidadirecionado às pragas de inseto Coleopteran e Hemipteran, do que qualquerum dos componentes individuais das composições. Uma célula recombinan-te em que uma primeira proteína consistindo em ET37 ou ET29 e uma se-gunda proteína consistindo em TIC810 ou TIC812 apresentam maiores ní-veis de acúmulo de ET29/ET37, proporciona níveis de resistência aos inse-tos Coleopteran e Hemipteran que eram anteriormente inatingíveis com asproteínas inseticidas ET37 E ET29, e resulta em uma ausência de morfolo-gia e/ou fenótipo anormal da célula ou organismo consistindo em tais célulasrecombinantes, tudo em comparação a uma célula que expressa ET29 ouET37 na ausência de TIC810 ou TIC812.

As combinações inseticidas acima podem também ser expres-sas em uma planta juntamente com pelo menos uma proteína inseticida adi-cional diferente da proteína que compreende a combinação, apresentandoum modo de ação diferente de qualquer proteína que compreende a combi-nação, e tóxicas à mesma espécie de inseto como as proteínas da combina-ção. Esta segunda combinação, que inclui a proteína inseticida adicional,fornece um meio de manejo de resistência aos insectos Coleopteran. Taisproteínas adicionais incluem, mas não estão limitadas a elas, toxinas Cole-opteran Cry3Bb e variantes, Cry22A, TIC901, TIC1201, TIC407, TIC417,CryET70, as toxinas binárias PS149BI, ET33/34 e ET80/76, e várias outrasproteínas que foram mostradas apresentar atividade inseticida Coleopteran,tais como patatinas, variantes de Cry3Aa, e composições inseticidas não-específicas isoláveis de espécies bacterianas, tais como Xenhorabdus ePhotorhabdus.

A proteína ET29 ou ET37 cada uma pode ser combinada comTIC810 ou TIC812 e coexpressa em uma planta com um agente que apre-senta atividade inseticida direcionado de outra maneira a uma espécie depraga de inseto Coleopteran, alcançando o controle desejado de mais de umtipo de praga de planta comum selecionado do grupo consistindo em pragasde inseto Lepidopteran, e pragas de inseto Hemipteran. Além disso, taiscombinações podem ser combinadas com outros agentes que ainda são efi-cazes em controlar pragas de vírus, pragas bacterianas, pragas fúngicas, eoutras mais. Os agentes contemplados em tais combinações podem ser ex-pressos juntamente com a combinação de ET29/ET37 e TIC810/TIC812 oufornecidos através da aplicação de agentes inseticidas ou pesticidas em umaformulação agricolamente aceitável, talvez com um veículo tal como um e-moliente, coloide, pulverizador, pó, mistura ou polvilho. Em situações em queas composições seriam úteis no controle das pragas animais tais como pul-gas, carrapatos, piolhos, ácaros e outras mais, é útil incluir junto da combi-nação ET29/ET37 e TIC810/TIC812 um agente que seja eficaz para contro-lar as mesmas ou outras pragas para as quais a associação é direcionada, eentão tais aplicações devem ser fornecidas em uma formulação farmaceuti-camente aceitável. As formulações particulares das combinações inseticidasda presente invenção estão previstas para utilização na aplicação tópicae/ou sistêmica nas culturas de campo, gramíneas, frutas e legumes, e plan-tas ornamentais. Em uma modalidade, a composição inseticida compreendeuma suspensão circulável de óleo de células bacterianas que é expressa emuma ou mais das novas proteínas insecticidas aqui divulgadas. As célulasexemplares podem ser cepas de B. thuringiensis EG4096, EG5078, SIC8134ou SIC8135, no entanto, qualquer uma de tais células hospedeiras bacteria-nas tais como B. megaterium, B. subtilis, E. coli ou Pseudomonas spp. ex-pressando uma composição inseticida seria útil.

As composições inseticidas da presente invenção podem sercombinadas com outros métodos de biotecnologia, tais como a tecnologia desupressão genética mediada por RNA de fita dupla, para atingir o controledesejado de uma ou mais pragas de uma determinada planta. As seqüên-cias de nucleotídeo específicas selecionadas das seqüências nativas dascélulas de uma praga particular que são envolvidas em um percurso biológi-co essencial são expressas em uma célula vegetal, de tal modo que resul-tam na formação de um RNA de fita dupla, ou mesmo um RNA de fita duplaestabilizada. Desta forma, após a ingestão pela praga de uma quantidadepesticidamente eficaz do RNA, ou seja, uma ou mais células vegetais ex-pressando o RNA de fita dupla derivada das células de tais pragas, a su-pressão de um ou mais percursos biológicos essenciais é suprimida na pra-ga. A praga contemporaneamente ingere junto do dsRNA, uma quantidadepesticidamente eficaz das composições inseticidas aqui descritas, resultandona provisão de um sistema de manejo de resistência de inseto ou praga efi-caz que evita o risco do aparecimento de resistência porque os dois agentespesticidas estão funcionando através de diferentes modos de ação. Umacélula vegetal particular recombinante que expressa uma composição cor-respondente às proteínas inseticidas de Coleopteran e Hemipteran da pre-sente invenção também pode expressar como moléculas de dsRNA uma oumais seqüências derivadas do genoma de uma praga Coleopteran direcio-nada e uma ou mais seqüências derivadas do genoma de uma praga Hemip-teran direcionada, resultando na provisão de múltiplas quantidades insectici-damente eficazes das proteínas da presente invenção e dos dsRNAs desig-nados para supressão de um ou mais genes essenciais nas pragas Coleop-teran e/ou Hemipteran direcionadas. As plantas consistindo do gene quecodifica uma ou mais das proteínas da presente invenção isoladamente ouem combinação com agentes de controle de praga adicionais tais como a-gentes de dsRNA apresentam rendimento melhorado e tolerância à secacomparado com as plantas que carecem de tais agentes pesticidas. Issopode ter acontecido porque essas características resultam em massas deraiz estabilizadas, que são mais uniformes, fortes e saudáveis e fornecemmais nutrientes e umidade que concentra capacidade em comparação àsmassas de raiz que carecem de tais agentes.

Uma proteína quimérica pode ser sintetizada em que uma se-qüência que codifica ET29 ou ET37 e uma seqüência que codifica TIC810ou TIC812 se fundiram entre si, fornecendo a expressão da composição in-seticida estabilizada como uma proteína isolada. É contemplado que a prote-ína quimérica não pode ser estabilizada ou apresentar bioatividade inseticidaa menos que os dois peptídeos fundidos sejam desvinculados. Esta separa-ção física pode ser conseguida mediante a inclusão como um espaçadorentre as proteínas de uma única seqüência de peptídeo que é a meta paraqualquer número de proteases conhecidas na técnica. A proteína quiméricatambém pode ser ligada às outras seqüências que afetam a estabilidade daquimera, resultando na formação de uma forma cristalina ou inclusão de or-ganismo que consiste substancialmente no peptídeo de quimera-fusão paraa exclusão de outras composições contaminantes, peptídeos ou moléculas.Tais quimeras ou fusões são aqui exemplificadas aqui no Exemplo 11 comoTIC127 (fusão seqüencial de TIC809 e TIC810 ligadas por um pequeno pep-tídeo) e TIC128 (fusão seqüencial de TIC810 e TIC809) e são mostradaspara expor a bioatividade inseticida a Coleopteran e Hemipteran.

Os vétores de expressão para uso em uma célula hospedeirasão também fornecidos. Os vetores de expressão compreendendo as se-qüências que resultam na expressão de uma combinação de, pelo menos,duas das seqüências de polinucleotídeo aqui divulgadas, são fornecidos nasmodalidades exemplares. Em uma modalidade, um vetor de expressão éuma molécula de polinucleotídeo isolada e purificada compreendendo umacombinação de duas seqüências de polinucleotídeo diferentes, cada se-qüência contendo um promotor funcional em uma célula hospedeira deseja-da que é operativamente ligada a um segmento de nucleotídeo que codificauma TIC809, TIC810, TIC812, ET29 ou ET37. Em algumas modalidades, umtérmino de transcrição e uma seqüência de poliadenilação podem ser incluí-das 3' do segmento de nucleotídeo que codifica uma destas proteínas.

Os vetores de expressão para uso em uma célula hospedeirabacteriana são fornecidos, por exemplo, em uma célula de E. coli ou umacélula de Bacillus incluindo um de B. thuringiensis, B. megaterium, B. subti-lis, ou espécies Bacillus afins. Os vetores de expressão da célula hospedeirabacteriana podem conter uma seqüência de nucleotídeo expressando umaou mais das proteínas da presente invenção em série, em grande parte damesma forma que podem ser expressos na maioria das células bacterianas,ou seja, em um cassete de expressão policistrônica. Alternativamente, umvetor de expressão bacteriana pode consistir em uma seqüência de nucleo-tídeo que codifica apenas uma das proteínas da presente invenção.

Os promotores que funcionam nas bactérias são conhecidos natécnica. Um promotor exemplar de proteínas cristais de Bacillus pode incluirqualquer um dos promotores genéticos de proteína cristal conhecidos, inclu-indo o promotor genético ET29 (Patente U.S. n- 6.093.695), e promotoresespecíficos para fatores sigma de B. thuringiensis (Baum and Malvar, Molec.Microbiol., 18(1): 1-12, 1995). Alternativamente, os promotores genéticosque codificam a proteína cristal submetidos à mutagênese ou recombinantespodem ser planejados por aqueles qualificados na técnica e utilizados parapromover a expressão das novas seqüências de polinucleotídeo aqui divul-gadas. Para o propósito da presente invenção, o promotor aqui utilizado paraa expressão das seqüências de polinucleotídeo é promotor crylA.

Os construtos de DNA recombinante para expressão em umacélula vegetal são fornecidos. Tais construções tipicamente contêm dois oumais cassetes de expressão funcionais de planta que estão ligados entre side modo a permitir a introdução simultânea dos dois ou mais cassetes deexpressão no mesmo local em um genoma vegetal ou, alternativamente po-dem conter dois ou mais cassetes de expressão funcionais de planta queestão ligados dentro do construto ou vetor, mas são capazes de serem intro-duzidos independentemente em diferentes locais dentro de um genoma ve-getal. Estes cassetes de expressão podem ser referidos como um primeiro eum segundo cassete de expressão que expressa, respectivamente, umaprimeira seqüência de polinucleotídeo que codifica uma primeira proteína euma segunda seqüência de polinucleotídeo que codifica uma segunda prote-ína. Pretende-se que a primeira proteína possa ser qualquer uma das prote-ínas aqui divulgadas, e a segunda proteína pode ser qualquer uma das ou-tras proteínas aqui divulgadas diferentes da primeira proteína. As seqüên-cias de polinucleotídeo exemplares são fornecidas conforme estabelecidonas SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17 e SEQ ID NO: 19.

Os promotores utilizados no construto de DNA recombinante dapresente invenção deve expôr a capacidade de conduzir a expressão dasseqüências de polinucleotídeo que codificam os agentes inseticidas quandointroduzidos nas células vegetais. Os promotores que são úteis na expres-são das seqüências de polipeptídeo nas plantas podem ser promotores in-duzíveis, constitutivos, específicos do tecidos ou desenvolventemente espe-cíficos para utilização em uma planta monocotiledônea ou dicotiledônea. Emuma modalidade, o promotor selecionado para utilização pode ser um pro-motor constitutivo e, para o propósito da presente invenção, o promotor podeespecificamente compreender um promotor de vírus mosaico da couve-florreforçado (CaMV 35S). Em outra modalidade, o promotor selecionado podeser um promotor específico do tecido e, para o propósito da presente inven-ção, o promotor pode especificamente compreender uma promotor específi-co da raiz Rcc3 isolado de arroz (Pedido de Patente US n2 de série11X075.113).

Um vetor ou construção pode também incluir elementos que fun-cionam para regular o nível e o tempo da expressão do gene de interesse aque estão vinculados, além de um ou mais promotores. Por exemplo, oconstruto pode incluir uma seqüência íntron. A seqüência íntron empregadana presente invenção pode incluir um íntron de actina de arroz (Patente U.S.ne 5.641.876). O construto de DNA recombinante também pode ter uma se-qüência líder de translação entre o promotor e a seqüência de codificação. Ovector ou construto também pode incluir, dentro da região de codificação deinteresse, uma seqüência de ácido nucleico que atua, no todo ou em parte,para encerrar a transcrição desta região. Em uma modalidade, a seqüênciade poliadenilação da presente invenção pode ser a partir da região 3' não-traduzida de um gene da proteína de choque térmico do trigo (tahspl7).

Um construto de DNA recombinante pode incluir outros elemen-tos igualmente. Por exemplo, o construto pode conter segmentos de DNAque fornecem função de replicação e um ou mais marcadores selecionáveispara utilização nas células bacterianas. O construto pode também compre-ender um marcador controlável, um marcador selecionável e outros elemen-tos como apropriado para a seleção de células vegetais ou bacterianas ten-do as construções de DNA recombinante da invenção. Os construtos deDNA recombinante são designadas com marcadores selecionáveis adequa-dos que podem conferir tolerância ao antibiótico ou herbicida na célula. Asseqüências de polinucleotídeo com tolerância a antibiótico incluem, mas nãosão limitadas a elas, seqüências de polinucleotídeo que codificam as proteí-nas envolvidas na tolerância a canamicina, neomicina, higromicina, e outrosantibióticos conhecidos na técnica. Um gene com tolerância a antibiótico, emum tal vetor, pode ser substituído por um gene com tolerância a herbicidaque codifica a sintase de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato (EPSPS, descritanas Patentes U.S. n- 5.627.061 e 5.633.435; Padgette et al. Herbicide Re-sistant Crops1 Lewis Publishers1 53-85, 1996) ou outros genes marcadoresselecionáveis e seus equivalentes, tais como basta tolerância, tolerância debarra, resistência a metotrexato, glifosato oxidoreductase, glifosato acetiltransferase, fosfonato acetilase (phnO e derivados alelos de Enterobacteria-ceae), e genes de tolerância dicamba, e similares. As plantas expressandoas propriedades de tolerância a inseto da presente invenção que estão aco-pladas com um ou mais desses marcadores selecionáveis são particular-mente úteis para fins comerciais.

As seqüências de polinucleotídeo da presente invenção podemser usadas para transformar uma célula vegetal que pode ser regeneradapara produzir uma planta transgênica que apresenta resistência aos insetosmelhorada quando comparada com a planta ou célula vegetal da qual aplanta transgênica é derivada. As seqüências de polinucleotídeo da presenteinvenção podem ser modificadas para melhorar a sua expressão na célulahospedeira da planta. A expressão das seqüências de polinucleotídeo dapresente invenção na célula vegetal pode atingir acumulações das proteínasinseticidas no citoplasma, ou pode resultar nas proteínas inseticida sendoacumuladas em uma organela subcelular tal como um cloroplasto, um plas-tídeo ou uma mitocôndria.

Na realização do exposto, as seqüências de polinucleotídeo quecodificam as proteínas da presente invenção, como apresentado nas SEQ IDNO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18 e SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 47têm sido melhorados para expressão nas plantas. Tais seqüências de poli-nucleotídeo aqui exemplificadas são definidas nas SEQ ID NO: 13 (TIC809),SEQ ID NO: 15 (TIC810), SEQ ID NO: 17 (ET37), SEQ ID NO: 19 (TIC812),e SEQ ID NO: 46 (TIC127), e além disso, nas seqüências do cassete de ex-pressão conforme estabelecido nas SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 31, SEQ IDNO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, NO SEQ ID: 40 e SEQ ID NO: 43.

A coexpressão de pelo menos uma de uma proteína TIC810 ou TIC812, jun-tamente com uma ou mais de uma proteína inseticida ET29, TIC809, ouET37 melhora (ou assiste, atua como um acompanhante, estabiliza, ou podeinteragir com a proteína inseticida como uma proteína acessória), com a ex-pressão e/ou acúmulo da proteína inseticida. A coexpressão em uma plantatransgênica resulta na ausência de baixos níveis de expressão e/ou acúmuloe ausência de efeitos fitotóxicos observados quando apenas uma proteínainseticida, como ET29, ET37, ou TIC809 é expressa isoladamente.

Existem muitos métodos para introdução do construto de DNArecombinante compreendendo a combinação das seqüências de polinucleo-tídeo nas células e métodos adequados são supostos de incluir virtualmentequalquer método pelo qual o DNA pode ser introduzido em uma célula vege-tal, tal como por infecção de Agrobacterium, liberação direta de DNA tal co-mo, por exemplo, por transformação mediada por PEG de protoplastos (Omi-rulleh et al., Plant Mol. Biol., 21:415-428, 1993), por absorção de DNA medi-ada por dessecação/inibição, por eletroporação ou por bombardeio de mi-croprojéteis e similares.

Em consideração do manejo de resistência aos insectos (IRM),as composições e os métodos da presente invenção são úteis na produçãode plantas transgênicas que expressam duas ou mais proteínas tóxicas deB. thuringiensis na mesma espécie de inseto e que confere um nível de ma-nejo de resistência para retardar o aparecimento de resistência de qualquerespécie de inseto suscetível a um ou mais dos agentes inseticidas expres-sos nas plantas transgênicas. Alternativamente, a expressão de uma proteí-na inseticida de B. thuringiensis tóxica para uma determinada praga de inse-to-alvo juntamente com um agente proteico diferente tóxico para a mesmapraga de inseto, mas que confere toxicidade através de um método diferentedaquele apresentado pela toxina B. thuringiensis é desejável. Tais outrosagentes proteicos diferentes podem compreender qualquer um de proteínasinseticidas Cry1 proteínas inseticidas Cyt, proteínas inseticidas de Xenorhab-dus sp. ou Photorhabdus sp., proteínas inseticidas vegetativas de B. thurin-giensis, e outras mais. Um meio para atingir este resultado seria produzirdois eventos transgênicos diferentes, um evento expressando uma combina-ção das duas proteínas inseticidas da presente invenção, ativa contra inse-tos Coleopteran e Hemipteran, e o outro manifestando uma terceira proteínainseticida, e a reprodução dos dois traços juntos em uma planta híbrida. Aterceira proteína inseticida poderia ser aquela que apresenta atividade inse-ticida Coleopteran, aquela que apresenta uma atividade inseticida Hemipte-ran, aquela que apresenta atividade inseticida direcionada tanto para Cole-opteran quanto para Hemipteran (e talvez toxicidade a outras ordens de in-setos igualmente), ou aquela que apresenta atividade inseticida direcionadaa uma ou mais de outras ordens de insetos diferentes de pragas de insetoColeopteran e Hemipteran incluindo, mas não limitado a elas, Lepidopteran,Orthoptera, Diptera e outras mais.

Uma quantidade pesticida das proteínas inseticidas da presenteinvenção pode ser fornecida na dieta de uma praga de inseto. Tipicamente,a dieta consiste em uma parte da planta sobre a qual o inseto se alimentanormalmente, tal como um tecido de planta ou célula vegetal, mas pode tam-bém incluir outras composições tais como uma dieta artificial formulada parapromover o desenvolvimento e a sobrevivência de uma determinada pragade inseto. As proteínas inseticidas podem ser fornecidas em uma composi-ção que é aplicada na superfície da dieta, ou mais preferivelmente podemser produzidas pelo mecanismo da síntese de proteína de uma célula e, co-mo descrito acima, acumuladas dentro da célula vegetal ou secretadas forada célula vegetal, desde que a quantidade da toxina de proteína fornecidaseja uma quantidade inseticida suficiente para inibir a praga de inseto a par-tir da alimentação mais adiante, ou inibir o crescimento e desenvolvimentoda praga de inseto, ou para causar mortalidade à praga de inseto.

As plantas transgênicas podem ser autofecundadas (auto-polinização) para gerar sementes que apresentam um genótipo que é homo-zigoto com relação ao transgene que codifica a proteína inseticida. Tais se-mentes produzem plantas e sementes que são apenas homozigotas comrelação ao transgene que codifica a proteína inseticida. Freqüentemente, asplantas transgênicas que são produzidas são geradas em variedades quedeixa de expor as mais desejáveis qualidades agronômicas. Portanto, asplantas recombinantes homozigóticas podem ser cruzadas com linhagenscongênitas que apresentam qualidades particulares agronomicamente im-porta ntes.

A presente invenção constatará utilidade particular na criação deplantas transgênicas de interesse comercial, incluindo várias relvas gramí-neas, trigo, milho, arroz, cevada, aveia, uma variedade de plantas ornamen-tais e produtos hortícolas, assim como uma série de árvores e plantas queproduzem nozes e frutas. Especificamente, estas plantas podem incluir mi-lho, trigo, centeio, cevada, aveia, trigo mourisco, sorgo, arroz, cebola, capim,girassol, canola, ervilhas, feijão, soja, algodão, linhaça, couve-flor, aspargos,alface, tabaco, mostarda, beterraba, batata, batata doce, cenoura, nabo, ai-po, tomate, beringela, pepino, abóbora, maçã, abricó, pêssego, pera, amei-xa, laranja, amora silvestre, mirtilo, morango, amora e limão. Em geral, ainvenção é útil em variedades vegetais monocotiledônea e dicotiledônea. Aplanta transgênica é selecionada do grupo consistindo em uma planta mo-nocotiledônea e uma planta dicotiledônea que pode incluir monocotiledôneastais como milho, trigo, centeio, cevada, aveia, trigo mourisco, sorgo, arroz,cana-de-açúcar, cebola, alho, capim, ou dicotiledôneas tais como girassol,canola, ervilha, cowpeas, guandu, feijão, soja, café, brócolis, algodão, linha-ça, couve-flor, Arabidopsis, aspargos, alface, tabaco, plantas aromáticas (in-cluindo caril, mostarda, salva, salsa, pimenta, tomilho, coentro, louro, comi-nho, curcuma, noz moscada, canela e similares), beterraba, batata, batatadoce, cenoura, nabo, aipo, tomate, beringela, pepino, abóbora ou melão,árvores frutíferas (incluindo maçã, abricó, pêssego, pera, ameixa, laranja,limão, lima e similares), plantas de baga (incluindo amora silvestre, mirtilo,morango, amora e similares), nogueiras (incluindo bolota, hicória, pau-brasil,pecan, nozes, avelã, e similares), videiras e flores.

A informação de seqüência de DNA aqui fornecida permite a e-laboração de seqüências de nucleotídeo ou sondas e/ou iniciadores apre-sentando a capacidade de especificamente hibridizar às seqüências de nu-cleotídeo aqui reveladas, ou as seqüências homólogas que codificam as pro-teínas relacionadas com as TIC810, TIC812, ET37 e ET29. A capacidade detais sondas de ácido nucleico em especificamente hibridizar uma seqüênciaque codifica uma toxina relacionada ou proteína acessória/semelhante a a-companhante fornece particular utilidade em uma variedade de modalidades.

Mais importante ainda, as sondas podem ser utilizadas em uma variedadede ensaios para detectar a presença de seqüências complementares emuma determinada amostra. A natureza do ambiente regulador sob o qual asplantas transgênicas contendo os genes da presente invenção são comer-cializadas fornece uma utilidade particular para ser capaz de detectar a pre-sença das seqüências que codificam as proteínas, bem como as proteínasda presente invenção em uma amostra biológica e fornece um meio de de-tecção da violação de certas modalidades reivindicadas durante o termo dequalquer patente que seja emitida.

Em certas modalidades, é vantajosa a utilização de iniciadoresde oligonucleotídeo, isoladamente ou em pares ou outras séries de iniciador.

A seqüência de tais iniciadores é projetada usando um polinucleotídeo dapresente invenção para uso na detecção, amplificação ou mutação de umsegmento definido de uma toxina ou seqüência de codificação da proteínaacessória/semelhante a acompanhante de B. thuringiensis ou outras fontesque utilizam métodos de amplificação térmica. Os segmentos da toxina rela-cionada ou seqüências de codificação acessórias/semelhantes a acompa-nhante de outras espécies também podem ser amplificadas.

Kits para a detecção, em uma amostra biológica, de polinucleo-tídeo ou seqüências de aminoácido da presente invenção também estão pre-vistos. Estes kits contêm uma ou mais seqüências de polinucleotídeo, cadauma para uso como uma sonda para detectar a presença de uma seqüênciade polinucleotídeo que codifica uma proteína inseticida da presente invençãoou seu fragmento. Tais kits podem também ou alternativamente conter anti-corpos específicos para ligação a um ou mais polipeptídeos das proteínas dapresente invenção, assim como reagentes para uso com a sonda ou anticor-pos, e os kits devem também conter amostras de controle para utilização nagarantia de que os nucleotídeos ou peptídeos identificados com a sonda eou anticorpos e reagentes estavam funcionando de acordo com as instru-ções do fabricante. Todos os reagentes necessários para a realização dosmétodos de identificação das seqüências de nucleotídeo ou peptídeos de-vem ser embalados juntos em um kit, junto das instruções de uso. Um kitexemplar pode conter um TIC810 ou seqüência de polinucleotídeo relacio-nada que codifica uma proteína inseticida juntamente com uma amostra dosiniciadores de amplificação da seqüência de nucleotídeo exemplares pr375 epr376 como apresentados na SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO: 24, juntamentecom os reagentes necessários para a realização de uma reação de amplifi-cação, todos acondicionados juntos no kit.

Os anticorpos que se ligam especificamente aos epítopos apre-sentados apenas por qualquer uma das proteínas ET37, TIC810 e TIC812ou os seus homólogos podem também ser utilizados para identificar a pre-sença de qualquer uma das proteínas ET37, TIC810 e TIC812 ou os seushomólogos, para purificar as proteínas ou homólogos, para identificar umaseqüência de nucleotídeo da qual uma proteína ET37, TIC810 ou TIC812 ouum homólogo está sendo expressa, e para uso nos kits designados parapermitir a detecção de uma proteína ET37, TIC810 ou TIC812 ou um homó-logo ou a detecção de uma seqüência de nucleotídeo que expressa a proteí-na ou seu homólogo. Os artífices versados facilmente observarão que taisanticorpos também fornecem a identificação das fusões de tais proteínas,tais como TIC127 e similares.

Os produtos e/ou composições agronômica e comercialmenteimportantes de matérias, incluindo, mas não limitado a eles, alimentaçãoanimal, mercadorias, e produtos e subprodutos de algodão ou soja ou milhoque são destinados a serem utilizados como alimentos para animais ou parauso como alimentos para consumo humano ou para uso em composiçõesque são destinadas ao consumo humano, incluindo, mas não limitado a eles,semente de algodão, óleo de sementes de algodão, sólidos de sementes dealgodão, e semelhantes, farelo de soja, óleo de soja, farinha de soja, e simi-lares, farinha milho, fubá, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho,pipoca, bolos de milho, cereais contendo milho ou soja, e subprodutos demilho, e similares, são destinados a estarem dentro do escopo da presenteinvenção se estes produtos e composições de matéria contiverem quantida-des detectáveis das seqüências de nucleotídeo aqui apresentadas comosendo diagnóstico da presença de uma seqüência que codifica uma ET29,uma ET37, uma TIC809, uma TIC810, uma TIC812, uma TIC127, ou suascombinações e similares. Destiladores de mercadorias sólidas secas tam-bém são contemplados como um produto agronômico e comercialmente im-portante, especialmente se conter quantidades detectáveis de uma seqüên-cia de nucleotídeo que codifica uma ou mais das proteínas da presente in-venção, ou quantidades detectáveis de uma ou mais das proteínas da pre-sente invenção.

A semente que compreende quantidades detectáveis de se-quências de nucleotídeo que codifica estas proteínas, ou semente ou partesde planta que podem ser transformadas em produtos que contêm quantida-des detectáveis de tais seqüências de nucleotídeo ou proteínas estão dentrodo escopo da presente invenção.

Aqueles versados na técnica, em função destes exemplos, deve-se observar que muitas mudanças podem ser feitas sobre a divulgação ante-rior sem se afastar do espírito e do escopo das invenções divulgadas.

Tendo ilustrado e descrito os princípios da presente invenção,ficará evidente para as pessoas versadas na técnica que a invenção podeser modificada na organização e detalhe sem divergir de tais princípios. Rei-vindicamos todas as modificações que estão dentro do espírito e do escopodas reivindicações anexas.

Todas as publicações e documentos de patente publicados cita-dos neste relatório descritivo são aqui incorporados mediante referência namesma extensão como se cada publicação ou pedido de patente individualfosse especifica e individualmente indicado para ser incorporado por refe-rência.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Este exemplo ilustra a construção de uma seqüência de nucleo-tídeo que funciona para atingir a expressão de uma proteína ET29 nas célu-las vegetais de milho.

A ET29 é uma proteína derivada de B. thuringiensis e foi anteri-ormente demonstrada de apresentar atividade biológica inseticida contra alarva da raiz quando fornecida na dieta das larvas da raiz do milho (PatentesU.S. n25 6.093.695, 6.537.756, 6.686.452). As seqüências de codificação deBt nativo foram mostradas apresentar níveis inaceitáveis de síntese proteicaquando expressa em células vegetais (Patente U.S. n2 5.500.365). A ex-pressão de proteína ET29 em células vegetais de milho, e especificamentenas células de raízes de milho, pode fornecer plantas de milho com a prote-ção de dano de alimentação da larva da raiz do milho. Consequentemente,uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína inseticida ET29 deB. thuringiensis foi construída a qual foi antecipada para ser mais altamenteexpressa nas plantas, evitando certas seqüências de nucleotídeo adversasque foram anteriormente mostradas de serem problemáticas, embora man-tendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica a proteína inseticida nati-va, com uma excepção; um códon de alanina suplementar na posição dois(2) da seqüência de codificação (SEQ ID NO: 13), foi incluído na seqüênciasintética para facilitar a desenvoltura da clonagem. A seqüência de aminoá-cido da ET29 de variante ALA2 conforme estabelecido na SEQ ID NO: 14,foi designada como TIC809 e nos bioensaios apresenta não menos atividadebiológica do que a ET29 nativa.

A região de codificação TIC809 como apresentada na SEQ IDNO: 13 foi subclonada em um vetor de transformação de planta binário. E-Iementos a montante da região de codificação TIC809 incluíram um promotorde CaMV 35S reforçado, uma seqüência líder não-traduzida 5' de proteínade ligação a/b de clorofila principal do trigo, uma primeira íntron de gene ac-tina 1 do arroz e seqüência éxon da região líder não-traduzida (UTL) de flan-queamento, e, opcionalmente, de uma seqüência de codificação de peptídeoem trânsito da subunidade pequena de cloroplasto ribulose 1,5-bisfosfatocarboxilase de milho. A expressão in planta de uma proteína de fusão queconsiste no peptídeo em trânsito no cloroplasto (ctp) ligado ao N-terminal daproteína TIC809 permite o direcionamento da proteína TIC809 nos plastí-deos. Uma região não-traduzida hsp17 3' do trigo (UTR), foi incorporada ajusante da TIC809 para alcançar o término da transcrição e poliadenilaçãodos transcritos de mRNA.

Os vetores de transformação da planta contêm um marcadorselecionável da tolerância a glifosato. O vetor de transformação da plantapMON70513 fornece expressão de uma proteína TIC809 solúvel no cito-plasma enquanto o pMON70514 fornece expressão de uma proteína TIC809direcionada ao plastídeo.

Exemplo 2

Este exemplo ilustra a comparação da expressão de plastídeodirecionado versus não-direcionado de TIC809 nos ensaios de protoplastode milho transitórios, e a subsequente análise de plantas transgênicas trans-formadas para expressar a proteína TIC809 direcionada aos plastídeos demilho.

Os ensaios de expressão transitórios utilizando protoplastos demilho transformados com pMON7C)513 ou pMON70514 foram comparadosuns com os outros e com um controle de vetor vazio. Os resultados indica-ram baixos níveis de expressão da proteína TIC809 não-direcionada compa-rada com a proteína TIC809 direcionada. Consequentemente, apenaspMON70514 foi analisado mais adiante. Os eventos de milho transgênicoforam produzidos após a transformação mediada por Agrobacterium de pro-toplastos de milho. As plantas de milho regeneradas ("plantas RO"), foramselecionadas com relação à tolerância de glifosato e ao número de cópias dohsp17 de trigo (tahsp17) 3' UTR. Amostras de raiz e folha no estágio de seisfolhas (V6) de cada evento de milho transgênico foram selecionadas comrelação a presença e quantidade de proteína ET29 utilizando um métodoELISA.

Dezenove (19) de oitenta e sete (87) eventos transgênicos anali-sados por ELISA apresentaram um fenótipo anormal distintivo caracterizadopor um talo clorótico, e oito (8) destes apresentaram anormalidades de pen-dão ou espiga. O nível médio de expressão de TIC809 nas folhas e no tecidoda raiz das plantas que apresentam um fenótipo anormal foi de 2,2 e 2,0 par-tes por milhão, respectivamente. Os níveis médios de TIC809 nas folhas eraízes das plantas fenotipicamente normais foram de 1,4 e 1,1 ppm, respec-tivamente. Estes resultados sugerem que níveis mais elevados de proteínaTIC809 podem ser correlacionados com os fenótipos anormais observados.

Exemplo 3

Este exemplo ilustra a clonagem de um gene que codificaTIC810, uma proteína expressa de dentro de um óperon de Bacillus thuringi-ensis em que o gene ET29 (í/'c809) também reside, e a identificação destaexpressão de TIC810 não apresenta nenhuma bioatividade insetivida de lar-va da raiz do milho.

O et29 foi originalmente clonado em um fragmento 7,1 kb EcoRIde DNA obtido da cepa B. thuringiensis EG4096 (Patente U.S. n- 6.686.452),e foi retido no plasmídio pEG1303, um vetor de transporte capaz de replica-ção em B. thuringiensis e em E. coli. A cepa de B. thuringiensis recombinan-te EG11502 contendo pEG1303 produz baixos níveis de proteína cristalET29 quando cultivada em meio C2 (Donovan et al, Mol. Gen. Genet. 214:365-372,1988).

A seqüência de codificação ET29 foi subclonada a partir dofragmento 7,1 EcoRI grande em pEG1303 como um fragmento -1,5 kb Kpnl-Clal no vetor de transporte com número de cópia elevado PEG854.9 (Baumet al, (1996) Appl. Env. Microbiol. 62:4367-4373) com a expectativa de queum aumento no nível de expressão ET29 seria observado a partir do frag-mento menor. O plasmídeo resultante, pMON78402, foi suposto de conterDNA nativo 5' e 3' suficiente da região de codificação ET29 para incorporarquaisquer elementos de expressão necessários tais como um promotor de-pendente da esporulação. Surpreendentemente, nenhuma formação de cris-tal de proteína foi detectada quando pMON78402 foi introduzido na cepahospedeira de B. thuringiensis acristaliferosa EG10650, sugerindo que a re-gião 5' presente no pMON78402 não pode conter o promotor ET29 nativo eque a transcrição de ET29 a partir do clone em pEG1303 foi conduzido apartir de um promotor sustentado pelo vetor fortuito. Além disso, a seqüênciado fragmento 7,1 kb EcoRI inteiro em pEG1303 revelou a presença de umaestrutura de leitura aberta interrompida imediatamente a montante da regiãode codificação da ET29. A região de codificação interrompida continha umdos sítios EcoRI terminais usados para clonar o fragmento de 7,1 kb EcoRIem pEG1303. Uma pesquisa FASTX das bases de dados de proteína não-redundantes existentes, assim como um banco das seqüências de proteínacristal de B. thuríngiensis sugeriram que esta região de codificação parcialcodifica uma seqüência de aminoácido que apresenta aproximadamente36% de identidade de seqüência da proteína ET29. Esta proteína relaciona-da foi designada TIC810. Isto sugeriu que o gene ET29 residia dentro de umóperon não caracterizado que incluía pelo menos o gene TIC810 a montan-te, e que desde então a TIC810 foi provavelmente coexpressa com ET29,também poderia da mesma forma apresentar atividade inseticida contra alarva da raiz do milho.

A seqüência de codificação de ET29 nativa é definida na SEQ IDNO: 9 a partir da posição 716 até 1408. Um sítio NheI único estava presentedentro desta seqüência de codificação (nucleotídeos 820 - 825, como apre-sentado na SEQ ID NO: 9). A seqüência de codificação de TIC810 parcialem pEG1303 é mostrada conforme estabelecida na SEQ ID NO: 9 a partir daposição de nucleotídeo 369 até 654. O sítio EcoRI que dividiu ao meio a se-qüência de codificação de TIC810 é definido na SEQ ID NO: 9 nos nucleotí-deos 369 - 374. A digestão NheI de DNA EG4096 ou digestão NheI e enzi-mas de restrição compatíveis acopladas com ligação e PCR inversa permitiua identificação da seqüência de nucleotídeo da extremidade 5' da região decodificação de TIC810.

O DNA genômico de EG4096 (5 pg) foi digerido em volumes de50 μΙ com enzimas de restrição compatíveis em várias combinações asquais incluem NheI, Nhe\ + Bln\, NheI + Spel, e NheIl + Xba\. Dez microlitrosdas digestões completas foram misturados com 80 μΙ de água estéril, 10 μΙde tampão 10X Iigase (New England BioLabs, Beverly, MA) e 2 μΙ de T4 Ii-gase e incubados durante a noite a 4°C. Os produtos de ligação foram usa-dos como modelos de amplificação térmica utilizando um kit Elongase® daInvitrogen (Carlsbad, CA) e os iniciadores divergentes pr370 e pr371 (con-forme apresentado nas SEQ ID NO: 21 e SEQ ID NO: 22, respectivamente).

A SEQ ID NO: 21 corresponde ao complemento inverso de nucleotídeos650-671, como apresentado na SEQ ID NO: 9, e SEQ ID NO: 22 correspon-de aos nucleotídeos 744-764, como apresentado na SEQ ID NO: 9.

As enzimas de restrição utilizadas para cada reação produziramextremidades compatíveis. O DNA de B. thuringiensis é rico em AT, e porisso era previsível que as enzimas de restrição Spel e Xba\ devem produzirprodutos de PCR menores do que as enzimas de restrição Bln\ e NheI. Ape-nas as combinações Spe\-Nhe\ e Xba\-Nhe\ produziram fragmentos de DNAamplificados. Os fragmentos de DNA amplificados foram clonados e se-quenciados e agrupados com o segmento EcoR\-Nhe\ consistindo em nucle-otídeos 369 - 825, como apresentada na SEQ ID NO: 9. Uma seqüência a-grupada predita para codificar TIC810 foi identificada como definido na SEQID NO: 3. O gene TIC810 foi subseqüentemente amplificados diretamente doDNA genômico EG4096 utilizando uma polimerase termo-estável de alta fi-delidade. Múltiplos clones foram utilizados para confirmar a seqüência. Ogene TIC810 é previsto para codificar uma proteína de ~25.000 Dalton, co-mo apresentado na SEQ ID NO: 4. A seqüência de aminoácido de TIC810deduzida apresenta cerca de 33% de identidade de seqüência de aminoáci-do para a seqüência de aminoácido ET29, sugerindo que TIC810 tambémpode expor bioatividade inseticida.

A expressão de TIC810 em uma cepa acristaliferosa de B. thu-ringiensis foi examinada. O gene TIC810 foi amplificado utilizando os inicia-dores pr375 e pr376 (como apresentado na SEQ ID NO: 23 e SEQ ID NO:24, respectivamente), produzindo um amplicon que codifica uma variante daseqüência de aminoácido TIC810 que contém um códon de início da transla-ção ATG para o códon GTG nativo. O iniciador pr375 também incorpora umsítio Spel 5' para a região de codificação TIC810 enquanto o iniciador pr376incorpora um sítio Xho\ 3' para o amplicon da região de codificação TIC810,permitindo a subclonagem do amplicon no vetor de transporte de B. thuringi-ensis-E. Coli pMON47407. O amplicon que codifica TIC810 foi inserido nestevetor exatamente a jusante de um promotor crylA endógeno do vetor. Asseqüências posicionados a jusante do promotor cry\A apresentam expressãodependente da esporulação no B. thuringiensis. O plasmídeo recombinanteresultante pMON78409 contendo a seqüência que codifica a proteínaTIC810 foi introduzida na cepa hospedeira B. thuríngiensis acristaliferosaEG10650 por eletroporação para gerar a cepa de B. thuríngiensis recombi-nante SIC8116. A cepa SIC8116 produziu corpos de inclusão parasporaiscontendo proteína TIC810 quando cultivada em meio de esporulação C2.

Nenhuma bioatividade de inseticida foi observada quando as larvas da raizdo milho foram expostas aos meios artificiais superpostas com culturas quesofrem esporulação de SIC8116, sugerindo que as proteínas TIC810 nãoapresentam bioatividade de inseticida direcionada à CRW.

Exemplo 4

Este exemplo ilustra que a expressão de ET29 sob o controle deum promotor dependente da esporulação cry 1A resulta em níveis fracos deexpressão e comportamente de célula hospedeira fisiológico anômalo.

A cepa de B. thuríngiensis recombinante EG11502, contendo oplasmídeo pEG1303, produziu pequenas quantidades da proteína cristalET29. Em uma tentativa de aumentar a expressão de ET29 em B. thuríngi-ensis, a seqüência de codificação de ET29 foi inserida no vetor de transportede B. thuringiensis-E. Coli pMON47407. A seqüência de codificação de ET29foi amplificada a partir do DNA de pEG1303 utilizando os iniciadores pr365 epr372 (SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 26, respectivamente). Após a confir-mação de seqüência, o fragmento de gene ET29 amplificado foi inserido nacadeia principal do vetor pMON47407 em uma orientação eficaz para ex-pressão de ET29 a partir do promotor crylA endógeno do vetor. Para avaliara produção de proteína ET29, o plasmídeo recombinante resultante,plC17507, foi introduzido na cepa de B. thuríngiensis EG10650, para produ-zir a cepa recombinante SIC8114. A cepa SIC8114 produziu uma menorquantidade de proteína ET29 do que a cepa recombinante original de ET29EG11502 e apresentou esporulação fraca no meio de esporulação C2. Esteresultado sugeriu que a superexpressão de ET29 pode ser prejudicial para acélula hospedeira, ou que algum outro fator presente na cepa nativa EG4096e não da cepa recombinante fosse necessária para a expressão eficientee/ou acúmulo de ET29.Exemplo 5

Este exemplo ilustra a identificação de um óperon que apresentahomologia com a TIC810/ET29 óperon.

Outras cepas de Bt foram examinadas por análise Southern blotcom relação a presença de seqüências relacionadas com o TIC810/ET29óperon em EG4096. Um fragmento de restrição 5,4 kb C/al de DNA total deEG5078 da cepa Bt foi observado hibridizar em uma sonda de hibridaçãoespecífica de ET29. Este fragmento 5,4 kb C/al foi clonado no vetor detransporte de B. thuringiensis-E. Coli pEG854 (Baum et al., (1990) Appl. Env.Microbiol. 56:3420-3428) e também no vetor de E. coli pBluescript IISK paragerar os plasmídeos recombinantes pEG1325 e pEG1323, respectivamente.

A análise de seqüência da inserção 5,4 kb apresentou dois genes firmemen-te ligados semilares aos genes ET29 e TIC810 na cepa de B. thuringiensisEG4096. A seqüência de codificação proximal 5' foi designada como f/'c812(conforme definido na SEQ ID NO: 5), e foi prevista para codificar um poli-peptídeo TIC812 (conforme definido no SEQ ID NO: 6).

TIC812 apresenta cerca de 97% de identidade de seqüência deaminoácido com a proteína TIC810. A seqüência de codificação 3' proximalfoi designada como eí37 (SEQ ID NO: 1) e foi prevista para codificar a se-quência de aminoácido de ET37, como apresentada na SEQ ID NO: 2. AET37 apresenta mais do que cerca de 99% de identidade de seqüência deaminoácido com as proteínas ET29, diferindo apenas em uma posição deaminoácido.

O vetor de transporte pEG1325, contendo os genes tanto deTIC812 quanto de ET37, foi introduzido na cepa hospedeira de B. thuringi-ensis acristaliferosa EG10650 usando um procedimento de eletroporação. Acepa recombinante resultante, EGI 1541, produziu um alto nível da proteínaET37 quando cultivada em meio de esporulação C2. No entanto, a quantida-de de proteína TIC812 presente nos esporos foi de aproximadamente ape-nas 25% da quantidade de proteína ET37. A mistura de proteínaET37/TIC812 produzida pela cepa EG5078 foi observada de ser tóxica paraas larvas da raiz do milho, quando testada no bioensaio.Por causa da semelhança entre os opérons TIC810/ET29 eTIC812/ET37, e porque ET37 e ET29 diferem em apenas uma posição deaminoácido, é improvável que as duas proteínas apresentem propriedadesinseticidas ou citotóxicas significativamente diferentes. O baixo nível deET29 quando expresso isoladamente em comparação com o maior nível deproteína ET37 quando expresso a partir de seu óperon nativo, acoplado coma identidade substancial entre as proteínas TIC810 e TIC812, sugere que asproteínas TIC810 e TIC812 podem estar a desempenhar um papel no au-mento dos níveis, ou fornecer alguma estabilização, das suas respectivasproteínas ET29 ou ET37. Portanto, a coexpressão de TIC812 juntamentecom a proteína ET37 pode ser a causa da superprodução observada de deET37 na cepa EG11541. Da mesma forma, a coexpressão de TIC810 eET29 também poderá resultar na superprodução de ET29.

Para testar esta hipótese, as seqüências de codificação de415 ET29, ET37, TIC810 e TIC812 individuais foram amplificadas e clonadas novetor de expressão de B. thuringiensis pMON47407 acima descrito, de modoque a expressão de cada um estava sob o controle do promotor crylA endó-geno ao vetor. O códon GTG de ocorrência natural na posição 1 da seqüên-cia de codificação de TIC812 foi modificado para um códon ATG. As se-quências de codificação tandem de TIC810-ET29 (SEQ ID NO: 9) e as se-qüências de codificação tandem de TIC812-ET37 (SEQ ID NO: 10), foramcada uma ampliada a partir do DNA genômico e clonadas no vetor de clona-gem TOPO pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) e suas seqüênciasconfirmadas. Os fragmentos de DNA amplificados foram então clonados novetor pMON47407 de modo que as seqüências de codificação tandem este-jam sob o controle do promotor cryMK endógeno ao vetor. Assim, cada inser-ção foi clonada em pMON47407 na mesma orientação e utilizou o mesmopromotor. A cepa de B. thuringiensis acristaliferosa EG10650 foi utilizadacomo a cepa hospedeira para todos os estudos de expressão. Os construtosde plasmídeo e as cepas de B. thuringiensis recombinantes contendo estesplasmídeos são listados na Tabela 2.Tabela 2. Plasmídeos Construídos para Análise de Expressão de TIC810/ET29 e TIC812/ET37

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1 - par de iniciador utilizado para amplificação da seqüência de codificaçãoinserida no pMON474Q7.

As cepas recombinantes e EG10650 foram cada uma cultivadaem 30 mililitros de meio C2 em um frasco obstruído de 250 mililitro durante 3dias a 28°C com agitação vigorosa. Os esporos e os cristais foram coletadospor centrifugação de baixa velocidade, lavados uma vez com 30 mililitros detampão de lavagem (Tris-HCI a 10 mM, EDTA a 0,1 mM, 0,005% de TritonX-100, pH 6,8), e colocado novamente em suspensão em tampão de lava-gem em um volume final de 3 mililitros. Estes concentrados 10X C2 foramentão analisados por SDS-PAGE. As concentrações de proteína foram de-terminadas por densitometria utilizando BSA como um padrão.

A análise SDS-PAGE indicou que: 1) tanto ET29 quanto ET37apresentaram produção fraca quando expressos sozinhos; 2) tanto TIC810quanto TIC812 acumularam em níveis elevados quando expressos sozinhos;e 3) ET29 e ET37 apresentaram níveis dramaticamente elevados de expres-são quando coexpressos juntamente com TIC810 ou TIC812, respectiva-mente. A produção de proteína ET29 foi de cerca de 4,6 vezes mais elevadana presença de TIC810 do que na sua ausência, e a produção de ET37 foide cerca de 6,6 vezes mais elevada na presença de TIC812 do que na suaausência. Além disso, as cepas SIC8134 contendo a seqüência de codifica-ção tandem de TIC810_ET29 e SIC8135 contendo a seqüência de codifica-ção tandem de TIC812_ET37 apresentaram esporulação e Iise normais. Es-tes resultados indicam que TIC810 e TIC812 eram necessários para a pro-dução de alto nível de ET29 e ET37 em B. thuríngiensis, respectivamente, epodem estar agindo como proteínas acessórias ou acompanhantes.

A suspensão de esporo-cristal 10X de TIC812/ET37 foi usadadiretamente em um bioensaio contra WCR. As proteínas cristais nas sus-pensões foram quantificadas por eletroforese em gel de SDS-poliacrilamidae densitometria utilizando albumina de soro bovino como um padrão. 200 mlde dieta para WCR foram preparadas de uma forma semelhante àquela quefoi descrita por Pleau et al. (Entomol. Exp. AppI. 105:1-11, 2002). Vinte μΙ deamostra foram aplicados por poço e permitiu a secagem antes da aplicaçãode uma única larva de inseto neonato por poço com um pincel de cerdasfinas. As placas foram seladas com milar e ventiladas usando um alfinete deinseto. Vinte e quatro larvas foram testadas por concentração de amostra.

As placas de bioensaio foram incubadas a 27°C, 60% de RH1 em completaescuridão durante 5 a 7 dias. O número de larvas sobreviventes por trata-mento foi registrado no final de 5 a 7 dias, dependendo da experiência. Aslarvas sobreviventes foram pesadas em uma microbalança (Cahn C-33). Osdados foram analisados usando software estatístico JMP® 4 (SAS Institute,Cary, N. C., USA). Os dados de bioensaio estão listados na Tabela 3.

Os resultados sugerem que as culturas sofridas esporulação dacepa de B. thuríngiensis tipo silvestre EG5078 contendo uma mistura deET37 e TIC812 foram observadas de serem tóxicas para larvas da raiz domilho ocidentais, causando redução significativa quando comparado com ocontrole. Uma suspensão de esporos 10X comparável da cepa hospedeiracry-B. thuríngiensis EG10650 não apresentou nenhuma atividade contra aslarvas WCR no bioensaio. Uma amostra contendo 500 mg de proteína inse-ticida de larva da raiz Cry3Bb foi incluída como um controle positivo.<table>table see original document page 46</column></row><table>Exemplo 6

Este exemplo ilustra a coexpressão das proteínas TIC810 eTIC809 nos protoplastos do milho.

As seqüências de nucleotídeo sintéticas que codificam as prote-ínas de B. thuríngiensis TIC810 e ET29 (TIC809) foram construídas paraexpressão nas plantas. A seqüência sintética que codifica TIC809 é definidana SEQ ID NO: 13 e a translação da seqüência de aminoácido é definida naSEQ ID NO: 14. A seqüência sintética que codifica TIC810 é definida naSEQ ID NO: 15, e a translação da seqüência de aminoácido é definida naSEQ ID NO: 16. As seqüências de codificação sintéticas para TIC809 eTIC810 foram clonadas em vetores de expressão para os estudos de ex-pressão transitória com protoplastos de milho. Os elementos genéticos emtorno da(s) região(ões) de codificação das seqüências de codificação deTIC809 e TIC810 eram idênticos, exceto pela adição do peptídeo de trânsitodo cloroplasto (ctp), conforme descrito no Exemplo 1. Os construtos de plas-mídeo são descritos em parte na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4. Construtos de Plasmídeo para o Ensaio Transitório da Expressãode TIC810/TIC809

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Os protoplastos foram preparados pela digestão do tecido dafolha de milho por 12 dias em manitol a 0,6 M, MES a 10 mM pH 5,7, 2% decelulase RS, e 0,3% de macerozima R10 durante 2 horas. Todas as trans-formações foram realizadas utilizando 50 pg de DNA e 1,3 χ 106 células.

A expressão de TIC809 em protoplastos foi medida por meio deuma ELISA com anticorpos policlonais levantados contra a proteína ET29.Os resultados são apresentados na Tabela 5 e representam a média de trêsamostras duplicadas.

Tabela 5. Expressão transitória de TIC809 nos protoplastos de milho

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1 - As comparações para todos os pares usando Tukey-Kramer HSD1 alfa =0,05. Tratamentos com a mesma letra não são significativamente diferen-tes umas das outras.

2 - (ng ET29/mg de proteína total).

Os resultados indicam que a proteína TIC809 direcionada aocloroplasto resultou em um aumento na expressão de TIC809 no sistematransitório em comparação com a expressão de TIC809 não-direcionada.Mediante a comparação da expressão de pMON84203 com a expressão depMON84202, a expressão de proteína TIC809 direcionada é observada seraproximadamente 20 vezes mais elevada do que aquela da proteína TIC809não-direcionada. No entanto, a coexpressão da proteína TIC810 não-direcionada com a TIC809 não-direcionada também resulta em um aumentosignificativo na expressão da proteína TIC809 (comparar pMON64134 compMON84202). Em cinco das seis experiências, direcionando tanto TIC810quanto TIC809 ao plastídeo resultou em níveis equivalentes ou superioresde expressão e de acúmulo de TIC809 comparado com a quantidade acu-mulada quando TIC809 for direcionada ao plastídeo isoladamente. Em qual-quer caso, a coexpressão de TIC809 e TIC810 entre si em qualquer locali-zação celular comum resulta em maiores níveis de acúmulo de TIC809 com-parado com os níveis de acúmulo de TIC809 quando expresso nesse com-partimento na ausência de TIC810.pMON64136 e ρΜΟΝ64137 foram construídos para testar o efei-to da expressão de TIC809 quando localizados em compartimento subcelu-Iar diferente de TIC810. O direcionamento de TIC810 ao plastídeo não teveimpacto significativo sobre a expressão do TIC809 não-direcionado (compa-rar pMON64136 com pMON84202). Do mesmo modo, o TIC810 não-direcionado não teve impacto significativo sobre a acúmulo do TIC809 dire-cionado (comparar pMON64137 com pMON84203). No entanto, o TIC810não-direcionado aumentou ou estabilizou o acúmulo do TIC809 não-direcionado. Estes resultados sugerem que a localização das duas proteínaspara o mesmo espaço dentro da célula resulta em um maior acúmulo da pro-teína inseticida contra Iarvar da raiz TIC809, talvez como resultado de algu-ma interação entre as proteínas, estabilizando o acúmulo da proteínaTIC809. Estes resultados são consistentes com a observação de que a co-expressão de TIC810 e ET29, ou coexpressão de TIC812 e ET37, resulta naexpressão de alto nível de ET29 ou ET37 respectivamente em B. thuríngiensis.

Um plasmídeo contendo um gene Iuciferase (LUX) foi incluídocomo um controle nos ensaios de expressão de protoplasto transitórios. Em-bora Iuciferase seja geralmente incluída nos ensaios transitórios como umindicador da eficiência transformação, foi observado que os níveis de ex-pressão de Iuciferase variaram amplamente dependendo da construção deplasmídeo testada, presumivelmente devido aos efeitos fitotóxicos das prote-ínas Bt acumuladas. O acúmulo baixo de TIC809 foi correlacionado com bai-xos níveis de luciferase. Em cada caso, exceto quando TIC809 está Iocali-zado no cloroplasto, a coexpressão do TIC810 não-direcionada no mesmocompartimento com TIC809 resultou em um aumento dramático nos níveisde expressão tanto de luciferase quanto de TIC809 (comparar pMON64134com pMON84202). Os dados de luciferase são apresentados na Tabela 6.Tabela 6. Níveis de Iuciferase na experiência de ensaio transitório

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1 Comparações para todos os pares usando Tukey-Kramer HSD1 alfa = 0,05.Tratamentos com a mesma letra não são significativamente diferentes unsdos outros.

Exemplo 7

Este exemplo ilustra os resultados da coexpressão de TIC810 eTIC809 no milho transgênico.

Os cassetes de expressão de TIC809, ctp-TIC809, TIC809-TIC810 e ctpTIC809-ctpTIC810 foram introduzidos nos vetores de transfor-mação de planta binários adequados para uso na transformação de milho.Diferentemente das seqüências que codificam as proteínas Bt1 as constru-ções diferem uma da outra apenas no que diz respeito à presença ou au-sência de uma seqüência de codificação do peptídeo de direcionamento docloroplasto. Um gene conferindo tolerância a glifosato foi utilizado como ummarcador selecionável para a transformação mediada por Agrobacteríum.

pMON64138 contém um cassete para a expressão in planta deTIC809 e TIC810. pMON64139 contém uma cassete para a expressão inplanta de TIC809 direcionado ao cloroplasto e TIC810 direcionado ao cloro-plasto. pMON70513 contém um cassete para a expressão in planta deTIC809. pMON70514 contém uma cassete para a expressão in planta de umTIC809 direcionado ao cloroplasto. As plantas de milho transgênicas regene-radas obtidas após transformação usando estes quatro plasmídeos e sele-ção de glifosato foram selecionadas usando um ensaio TaqMan® com rela-ção a presença do gene marcador selecionável de glifosato e da presençada(s) sequência(s) de tahsp17 3'. Um ensaio de PCR de ponto final foi utili-zado para confirmar a presença das seqüências de codificação de TIC809e/ou TIC810, onde pertinente, em cada caso. Os eventos transformados comconstruções contendo tanto TIC809 quanto TIC810 eram esperados de a-presentar duas cópias da seqüência de tahsp17 3' porque cada seqüênciade codificação é delimitada em sua extremidade 3' pelo elemento tahsp17 3".

As plantas transgênicas e de controle contendo seis folhas (estágio V6) eraízes foram analisadas usando um ELISA de ET29 para determinar o nívelde acúmulo de TIC809.

As plantas regeneradas após transformação com pMON70513contendo apenas a seqüência de codificação de TIC809 direcionada ao cito-plasma se comportaram como acima indicado nos exemplos 1 e 2. As plan-tas apresentaram fenótipos e características substancialmente anormais,tipicamente caracterizadas visualmente por um caule clorótico, entre outrasanormalidades. Os níveis de expressão e/ou acúmulo de TIC 809 foram cal-culados não mais do que cerca de 2,0 ppm no tecido da raiz.

Quinze plantas RO transformadas com pMON64138 foram anali-sadas com relação a presença do marcador de glifosato e a presença e nú-mero de cópia dos elementos tahsp17 3', assim como com relação a pre-sença do OriV para detecção de qualquer cadeia principal do vetor, e comrelação a presença e integridade dos genes que codificam as proteínasTIC809 e TIC810 direcionadas ao citoplasma. Um evento não continha aseqüência de codificação de TIC809 de comprimento total e foi também de-terminado apresentar níveis indetectáveis de proteína TIC809. Os 14 even-tos restantes apresentaram uma média de cerca de 12 ppm de TIC809 (pesofresco), no tecido da folha ou tecido da raiz. Os níveis de TIC809 no tecidoda raiz variaram de cerca de 0,2 ppm em uma planta de cerca de 45 ppm naplanta que apresenta o maior nível de expressão e/ou acúmulo. Este resul-tado sugeriu que a coexpressão de TIC810 juntamente com TIC809 nos te-cidos da planta fornece níveis melhorados de expressão e/ou acúmulo daproteína TIC809. Mais significativamente, os fenótipos anormais não foramobservados nas plantas expressando tanto TIC809 quanto TIC810 no cito-plasma. O nível de expressão de TIC809 era mais uniforme no tecido da ra-iz, do que no tecido da folha, e mais plantas apresentaram níveis mais ele-vados de expressão de TIC809 nas raízes do que nas folhas.

Quinze plantas RO foram regeneradas a partir das células vege-tais transformadas usando pMON64139 contendo as seqüências de codifi-cação de TIC809 e TIC810 direcionadas ao cloroplasto. Um caso foi identifi-cado na análise de triagem que não continha o cassete de expressão deTIC809 de comprimento total, e também não apresentou níveis detectáveisde proteína TIC809. Os 14 eventos restantes foram avaliados em cerca de4,4 ppm e cerca de 8,6 ppm de proteína TIC809 no tecido da raiz e folharespectivamente. Os níveis de TIC809 nas raízes variaram de cerca de 0,2ppm a cerca de 45 ppm. As plantas de milho transformadas compMON70514, contendo o gene ctpTIC809, foram avaliadas somente em cer-ca de 1,7 ppm de proteína TIC809 no tecido da folha e cerca de 6,3 ppm deproteína TIC809 no tecido da raiz. Assim, a coexpressão da TIC810 não-direcionada juntamente com a TIC809 não-direcionada resultou em níveismais elevados de expressão e/ou acúmulo de TIC809 do que foi alcançadocom a proteína TIC809 direcionada ao cloroplasto. Além disso, as plantasRO que produzem níveis elevados de proteína TIC809 não apresentaramclorose de caule ou outras manifestações da fitotoxicidade associada com aexpressão in planta da proteína TIC809 isoladamente. A coexpressão daTIC810 direcionada ao cloroplasto juntamente com a TIC809 direcionada aocloroplasto também resultou no aumento dos níveis de acúmulo de TIC809quando comparado com os níveis de proteína TIC809 direcionada ao cloro-plasto expressa na ausência de TIC810.

Dezoito plantas RO transformadas para coexpressar as proteínasTIC809 direcionadas e TIC810 direcionadas foram analisadas com relaçãoao gene marcador selecionável de tolerância ao glifosato, ao número de có-pia tahsp17 3', à presença de OriV (cadeia principal), e com relação às se-quências de codificação de TIC809 e TIC810 intactas. Um evento não conti-nha uma seqüência de codificação de TIC809 intacta e não conseguiu apre-sentar níveis detectáveis de proteína TIC809. As 17 plantas restantes foramavaliadas em 8,6 e 4,4 ppm de proteína TIC809 na folha e na raiz, respecti-vamente. A expressão na raiz da proteína TIC809 variou de cerca de 1 ppmpara cerca de 9 ppm. Os eventos que apresentam expressão de proteínaTIC809 e TIC810 direcionado ao cloroplasto não conseguiram apresentarclorose de caule ou outras manifestações de fitotoxicidade associads com aexpressão in planta da proteína TIC809 isoladamente.

Exemplo 8

Este exemplo ilustra a expressão reforçada da raiz do milho deTIC809 direcionada ao plastídeo.

pMON64144 foi construído para conter uma TIC809 direcionadaao cloroplasto sob o controlo operável de um promotor de raiz RCc3 (Pedidode Patente US na de série 11X075.113) e ladeada 5' de uma seqüência decodificação CTP por um íntron HSP70 de proteína de choque térmico de mi-lho e 3' da seqüência de codificação de TIC809 por uma seqüência terminale de poliadenilação da transcrição hsp17 3' do trigo. A seqüência do cassetede expressão é apresentada na SEQ ID NO: 38.

As plantas de milho foram regeneradas após a transformaçãomediada por Agrobacterium do tecido de milho com o vetor pMON64144. Asplantas de milho regenerada foram selecionadas usando um ensaio Taq-Man® com relação a presença do marcador selecionável de glifosato e daseqüência de flanqueamento 3' do trigo. A presença da seqüência de codifi-cação de TIC809 intacta foi confirmada utilizando um ensaio de PCR de pon-to final. As amostras de raiz e folha de 23 plantas de milho RO no estágio deseis folhas foram selecionados usando um ELISA de ET29.

O nível médio de TIC809 acumulado no tecido de raiz foi de 0,4ppm. Nenhuma proteína TIC809 foi detectada nas folhas, sugerindo que aatividade do promotor RCc3 é reforçada nas células da raiz. 8 das 23 plantasRO apresentaram uma concentração de proteína TIC 809 abaixo do nível dedetecção na raiz. Nenhuma das plantas testadas apresentaram níveis maio-res do que cerca de 1 ppm de TIC809. Ao contrário, um construto similar sobo controle de um promotor e35S apresentou em média cerca de 1,4 ppm deproteína TIC809 no tecido da raiz e cerca de 1,7 ppm nas folhas (n = 87).Exemplo 9

Este exemplo ilustra a coexpressão in planta de TIC809 eTIC810, cada uma sob o controle de diferentes promotores.

No Exemplo 7 os genes de TIC809 e TIC810 foram cada um ex-presso in planta a partir dos cassetes de expressão separados, a expressãode cada seqüência de codificação sendo conduzida a partir dos promotorese35S separados, mas idênticos. Neste exemplo os cassetes de expressãoforam designados de modo que a expressão de TIC809 fosse substancial-mente localizada no tecido de raiz usando um promotor RCc3, enquanto aexpressão de TIC810 estivesse sob o controle de um promotor e35S.

pMON64150 contém dois cassetes de expressão. Um cassete(SEQ ID NO: 40) continha uma seqüência de codificação de TIC809 direcio-nada ao cloroplasto operavelmente ligada em sua extremidade 5' a um pro-motor RCc3 de arroz e um íntron HSP70 de proteína de choque térmico demilho, e em sua extremidade 3' a uma seqüência de término e poliadenila-ção da transcrição hsp17 3' do trigo. O outro cassete (SEQ ID NO: 40) conti-nha uma seqüência de codificação TIC810 direcionada ao cloroplasto opera-velmente ligada em sua extremidade 5' a um promotor e35S e uma seqüên-cia íntron actina de arroz, e em sua extremidade 3' a uma seqüência de tér-mino e poliadenilação da transcrição hsp17 3' do trigo.

pMON64151 é idêntico ao pMON64150 exceto que as seqüên-cias de codificação nos dois cassetes de expressão carecem da seqüênciade codificação de peptídeo direcionado ao cloroplasto (SEQ ID NO: 43 eSEQ ID NO: 40, respectivamente).

As plantas regeneradas a parti do tecido de milho transformadascom pMON64150 ou pMON64151 foram testadas para confirmar a presençae integridade das seqüências de codificação de TIC809 e TIC810. As folhase raízes destes eventos foram testadas no estágio de 6 folhas usando umELISA de ET29 para determinar os níveis de acúmulo de proteína TIC809.

As plantas transformadas com pMON64150 apresentaram, em média, cercade 1,5 ppm de TIC809 por planta, enquanto as plantas transformadas compMON64151 apresentaram, em média, cerca de 0,4 pm de TIC809 por plan-ta. As plantas de ρΜΟΝ641δΟ apresentaram níveis de acúmulo da raiz deTIC809 de cerca de 0,4 para cerca de 6 ppm, com mais do que dois terçosdos eventos apresentando níveis de TIC809 pelo menos cerca de 1 ppm. Otecido da folha consistentemente apresentou níveis de acúmulo de TIC809abaixo dos limites de detecção para o ensaio.

O acúmulo médio na raiz de TIC809 foi maior nos eventos depMON64151 do que nos eventos gerados usando os cassetes de expressãode pMON64150 direcionados ao cloroplasto (pMON64151, 6,6 ppm vspMON64150, 1,4 ppm). Estes resultados são consistentes com os resultadosobtidos através do uso de construções em que a TIC809 foi expressa a partirdo promotor e35S (pMON64138 e pMON64139). A maior diferença entre asplantas que expressam TIC809 a partir do promotor RCc3 versus e35S foi afalta de acúmulo de TIC809 nas folhas quando a expressão foi controladapelo promotor de RCc3. Os eventos tanto pMON64150 quanto pMON64151apresentaram fenótipos normais.

Exemplo 10

Este exemplo ilustra a bioatividade inseticida da espécie Hemip-teran das composições compreendendo TIC809 e TIC810, e seus homólo-gos como aqui divulgados.

As composições compreendendo ET29 e/ou TIC809 ou ET37foram aqui divulgadas para ser inseticida à espécie Coleopteran de pragasde inseto. As TIC810 e TIC812 não demonstraram bioatividade inseticidapara a espécie de inseto Coleopteran1 mas, como aqui revelado, são úteispara facilitar o nível elevado de expressão e estabilidade da ET29 ou TIC809e ET37. A ET29 também havia anteriormente demonstrado bioatividade in-seticida direcionada à espécie Ctenocephalides, e é previsto que a ET37também demonstrou atividade para esta espécie. Foi especulado queTIC810 e/ou TIC812 também apresentam bioatividade inseticida e assimestas proteínas foram testadas no bioensaio contra outras pragas de planta,por exemplo, contra espécies de praga de inseto Hemipteran tais como Ly-gus hesperus (Western Tarnished Plant Bug; WTPB).

O WTPB é um inseto penetrante de sucção fitofagoso que atacainúmeras ervas daninhas e culturas. O WTPB danifica as culturas agrícolas,incluindo algodão, pelo dano de alimentação direta. Um ensaio para testaras composições inseticidas usando esta classe de insetos deve permitir ocomportamento alimentar natural do inseto. O ensaio de alimentação em-pregado baseia-se em um formato de placa de micro-título com 96 reserva-tórios usando um sistema de sachê como descrito por Habibi et al., (Archivesof Insect Biochem. and Phys. 50: 62-1 A (2002)). A dieta artificial do WTPB éfornecida por Bio-Serv® (Bio-Serv® Diet F9644B, Frenchtown, NJ).

Quinhentos e dezoito mililitros de água fervente submetida a au-toclave são combinados com 156,3 gramas de Bio-Serv® Diet F9644B emum misturador com superfície esterilizada. Os conteúdos de quatro ovos degalinha esterilizados na superfície são adicionados e a mescla é misturadaaté que lisa, depois ajustada para um volume total de um litro e deixada es-friar. As amostras de toxina são preparadas pela mistura de vinte microlitrosde amostra na concentração desejada, com duzentos microlitros de dietamisturada (1:10). Dependendo do número de amostras individuais desejadopara teste, esta quantidade pode ser redimensionada para cima ou parabaixo.

Uma folha de Parafilm® (Pechiney Plastic Packing, Chicago, IL)é colocada sobre um tubo de vácuo designado para o formato de 96 poços(Analytical Research Systems, Gainesville, FL) e um vácuo de aproximada-mente -20 milímetros de mercúrio é aplicado, o que é suficiente para causarextrusão da Parafilm® nos reservatórios. Quarenta microlitros de amostra deteste são acrescentados aos poços com Parafilm®. Uma folha de películaMylar (Clear Lam Packaging, Inc., Elk Grove Village, IL) é depois colocadasobre a Parafilm® e selada suavemente com uma tacha de ferro (BienfangSealector II, Hunt Corporation, Philadelphia1 PA). Os saches de Parafilm®são depois colocados sobre uma placa de 96 poços de fundo plano conten-do ovos de WTPB colocados em suspensão em agarose. Após a eclosão, asninfas de WTPB se alimentarão mediante a perfuração do sachê que é apre-sentado acima delas. A digestão extraoral como um resultado da extrusãodas secreções orais de WTPB no sachê pode levar à proteólise e degrada-ção dos conteúdos da dieta antes da ingestão pelo inseto. Para garantir, aproteína intacta foi sendo apresentada ao inseto em sua dieta, os sachês dedieta são substituídos a cada dois dias. Este realce permite durante maistempo a apresentação dos conteúdos intatos da dieta ao longo do ensaio dealimentação. Os sachês de dieta de inseto são substituídos nos dias dois,quatro e seis. As pontuações de nanismo e mortalidade são determinadasno dia 8 e comparadas com a verificação não-tratada (UTC).

As proteínas ET29 (ou TIC809), TIC810, ET37 e TIC812 (Pedidode Patent US número 60\713.111), foram testadas individualmente e emcombinações tais como, por exemplo, TIC809 acrescido de TIC810, comrelação à sua toxicidade para o WTPB. As proteínas cristais foram expres-sas na cepa de Bacillus thuringiensis acrstaliferosa EG10650 e purificadaspelos gradientes da etapa desacarose para eliminar esporos e detritos celu-lares. Os gradientes da etapa de sacarose (10 ml de cada um de 55, 70 e79% de sacarose em Tris-HCI a 10 mM, EDTA a 0,1 mM, 0,005% de TritonX-100, pH 7,5) foram preparadas em tubos de centrifugação Ultra-Clear de25 por 89 milímetros (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA). As suspen-sões de esporo-cristal foram colocadas em camadas em cima dos gradien-tes e centrifugadas a 18000 rpm (40°C) durante 4 a 18 h em uma ultracentrí-fuga equipada com um rotor SW28. Os cristais de proteína foram recupera-dos da interface de sacarose de 55 - 70% ou 70 - 79% e colocados emsuspensão em Tris-HCI a 25 mM pH 7,5. Os bioensaios iniciais continham asproteínas inseticidas Bt purificadas em uma concentração final de 200 partespor milhão (ppm). A toxina específica de Coleopteran, Cry3Bbl (Donovan etal., Appl. Environ. Microbiol. 58: 3921-3927 (1992)), a toxina específica deLepidopteran CryIAc (Baum et al., Appl. Environ. Microbiol. 56:3420 - 3428(1990), e a toxina específica de Lepidopteran CryIBbI (Patente U.S. n-5.322.687) foram incluídas como controles negativos no ensaio de alimenta-ção. Surpreendentemente, as ninfas de WTPB apresentaram nanismo emortalidade quando expostas à combinação das proteínas TIC810 acresci-das de ET29 e como esperado, nenhum nanismo e mortalidade foram detec-tados quando expostas somente à ET29, ou a qualquer uma das outros pro-teínas BT Cry3Bbl, CryIAc ou Cry1Bb1, todas das quais não apresentaramnenhuma diferença significativa quando comparadas com o controle não-tratado.

Os bioensaios de Lygus foram expandidos para incluir as prepa-rações de cristal individuais de TIC810, TIC812, e uma mistura de TIC812 eET37. Semelhantes aos resultados descritos acima, somente a combinaçãodas duas proteínas apresentaram atividade inseticida significativa. A TIC810acrescida de ET29 e TIC812 acrescida de ET37 apresentaram redução sig-nificativa de mortalidade e massa, quando comparado com os controles não-tratados ou aos bioensaios utilizando somente as proteínas individuais. Noentanto, as combinações de TIC810 acrescida de ET29 (ou TIC809) apre-sentaram maior redução de mortalidade e massa do que a combinação deTIC812 acrescida de ET37.

Os resultados destes bioensaios indicaram que nem TIC810nem TIC812 isoladamente são tóxicos para WTPB, e que uma mistura deambos TIC810 e ET29 ou de TIC812 e ET37 é tóxica para WTPB1 seme-lhante aos resultados observados quando testados contra as larvas da raizdo milho.

Exemplo 11

Este exemplo ilustra a construção de cassetes para expressar aTIC809 e/ou TIC810, e seus homólogos.

Os vetores de transformação da planta são construídos para a-tingir alto nível de expressão de proteínas TIC809 e/ou ET37 tóxicas à larvada raiz nas plantas. Os vetores contendo seqüências de codificação deTIC812 e ET37 podem ser utilizados para coexpressar a proteína TIC812 eET37, desse modo obtendo plantas protegidas de inseto que apresentamníveis elevados de produção de proteína ET37 in planta. A coexpressão deTIC810 juntamente com ET37 é suficiente para alcançar altos níveis estáveisde acúmulo de ET37 em uma célula hospedeira. Similarmente, a coexpres-são de TIC812 juntamente com ET29 ou mesmo com TIC809 é suficientepara alcançar altos níveis estáveis de acúmulo de ET29 ou TIC809 em umacélula hospedeira. Como indicado mais acima.Prevê-se que as proteínas da classe Cytl e Cyt2 que apresentacerca de 15 para cerca de 100 por cento de similaridade da seqüência deaminoácido com ET29 e/ou ET37 apresentarão expressão e/ou acúmulo me-lhorado quando expressas em uma célula hospedeira juntamente comTIC810, TIC812, ou um proteína ortóloga ou homólogo que apresenta umaseqüência de aminoácido que apresenta cerca de 50 a cerca de 100% desimilaridade de seqüência de aminoácido de TIC810 ou TIC812, e quequaisquer efeitos fenotípicos negativos causados por tal expressão de prote-ína Cyt serão melhorados pela coexpressão de tal proteína Cyt com TIC810,TIC812, ou suas variantes.

O relatório descritivo acima descreve as modalidades preferidasda presente invenção. Ficará entendido por aqueles versados na técnicaque, sem divergir do escopo e espírito da presente invenção e sem experi-mentação indevida, a presente invenção pode ser realizada dentro de umaampla faixa de parâmetros equivalentes. Embora a presente invenção tenhasido descrita em conexão com as suas modalidades específicas, ficará en-tendido que é capaz de outras modificações. A presente invenção é destina-da a cobrir eventuais utilizações, variações ou adaptações da invenção se-guindo os princípios da invenção de um modo geral. Diversas permutações ecombinações dos elementos fornecidos em todas as reivindicações que seseguem são possíveis e caem dentro do escopo desta invenção.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente publicadosreferidos neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência co-mo se cada publicação ou patente individual fosse especial e individualmen-te mencionada para ser incorporada por referência.Listagem de Seqüência<110> Monsanto Technology LLCAnderson, Heather MBaum, James AChay, Catherine A

Roberts, James KZhang, Bei

<120> MÉTODO PARA AUMENTAR O ACÚMULO DE UMA PROTEÍNA IN-SETICIDA EM UMA CÉLULA HOSPEDEIRA, PARA PRODUZIRUMA CÉLULA VEGETAL RESISTENTE A UMA PRAGA DE INSE-

TO, PARA CONTROLAR INFESTAÇÃO E PARA PROTEGER UMACULTURA, COMPOSIÇÃO INSETICIDA, PRODUTO DE MERCA-DORIA, PLANTA TRANSGÊNICA OU CÉLULA VEGETAL, SE-QÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO, PROTEÍNA INSETICIDA, PRO-GÊNIE OU SEMENTE DE PLANTA, VETOR, CÉLULA HOSPE-

DEIRA E CASSETE DE EXPRESSÃO<130> 38-21 (53327) B<150> 60/713,111<151> 2005-08-31<160> 47

<170> Patentln version 3.3<210> 1<211> 696<212> DNA<213> Baci77us thuringiensis<220>

<221> CDS<222> (1)..(696)<223> ET37<400> 1

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230

3

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Baci7 7us thuringiensis

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<213> BaciTlus thuringiensis<220>

<221> CDS<222> (1)(696)<223> ET29<400> 7

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Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly Ser Thr

35 40 45

Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile Pro50 55 60

Gln Ala Ala Val Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr Val Gln Gln Gly Thr65 70 75 80

vai Gln vai Ser vai Met Ile Asp Lys Ile vai Asp Ile Met Lys Asn85 90 95

vai Leu Ser Ile vai Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln Val Thr

100 105 110

Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn ser Gln Glu Ser Glu115 120 125

Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr Ser Tyr Tyr

130 135 140

Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly Val Met145 150 155 160

Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser vai Asp Ile Glu Lys Glu

165 170 175

Lys Val Leu Phe Val Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala Val Thr180 185 190

vai Lys Ala Ile Asn vai Val Gln Ala Leu Gln Ser Ser Arg Asp Ser195 200 205

Lys Val vai Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys Arg

210 215 220

His Lys Ile Cys ser Asn ser225 230

<210> 9<211> 1411<212> DNA

<213> BacilTus thuringiensis<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(1411)

<223> TIC810 ORF 1-657; ET29 ORF 716-1411<400> 9

atgagtaaag aaattcgttt aaatttgagt agagaatcag gggcagattt atatttaaaa 60atacttgctt ttgtaaaacc tgagcatttt tttcaagcat atttattatg tagagaattt 120gagtctatcg tagatcctac aacaagagaa tcggattttg acaaaacact taccattgta 180aagagtgatt caactttagt tacggttggt acaatgaata ctaaacttgt gaatagtcaa 240gaaattctag ttagtgattt gattacgcaa gttggaagtc agatagctga taccttaggt 300attacagaca ttgatgcaaa tacacagcaa caattaacag aattaattgg aaatttattt 360gtgaatctga attctcaagt tcaagaatat atttattttt atgaggaaaa agaaaagcaa 420acaagttatc gctataacat ccttttcgtt tttgaaaaag agtcttttat caccatttta 480ccaatgggat tcgatgtgac tgtgaacact aataaagaag cggttcttaa gttaacacct 540 aaagataaag tcacttatgg tcatgtatca gtaaaagctt taaatattat tcaacttatc 600 acagaagata aatttaactt tcttgctaca ttaaaaaagg cactaaaaac tctataagcg 660 ggttaagtag gtaaaataga attaaaatga aacagtatga aaggggtaat tttatatgtt 720 ctttaatcgc gttattacat taacagtacc atcttcagat gtggttaatt atagtgaaat 780 ttatcaggta gctccacaat atgtgaatca agctcttacg ctagctaaat atttccaagg 840 agcaattgat ggttcaacat tacgttttga ttttgaaaaa gccttacaaa ttgcaaatga 900 tattccacag gcagcagtgg taaacacttt aaatcaaact gtgcagcaag gtacagtcca 960 agtatcagtg atgatagaca agattgtaga cattatgaag aatgtattat ctattgtaat 1020 tgataacaaa aagttttggg atcaggtaac agctgctatt acaaatacat tcacaaatct 1080 aaattcgcaa gaaagcgaag catggatttt ttattacaaa gaagatgcac ataaaactag 1140 ttactattat aatatcttat ttgctataca ggatgaggaa acaggtgggg taatggcgac 1200 attaccgatt gcatttgata ttagtgtaga tattgaaaaa gaaaaggttc tatttgttac 1260 tatcaaggat actgaaaatt atgcggttac agtaaaagct attaatgtag tacaagcact 1320 tcaatcttcc cgagattcaa aagttgtaga tgcttttaaa tcgccacgtc acttacctag 1380 aaaaagacat aaaatttgta gtaactctta a 1411 <210> 10 <211> 1411 <212> DNA <213> Baci7 Jus thuringiensis <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1411) <223> TIC812 ORF 1-657; ET37 ORF 716-1411 <400> 10 atgagtaaag aaattcgttt aaatttgagt agagaatcag gggcagattt atatttaaaa 60 atacttgctt ttgtaaaacc tgagcatttt tttcaagcat atttattatg tagagaattt 120 gagtctatcg tagatcctac aacaagagaa ttggattttg acaaaacgct taccattgta 180 aagagtgatt caactttagt tacggttggt acaatgaata ctaaacttgt gaatagtcaa 240 gaaattctag ttagtgattt gattaagcaa gttggaagtc agatagctga taccttaggt 300 attacagaca ttgatgcaaa tacacagcaa cgattaacgg aattaattga aaatttattt 360 gtgaatctga attctcaagt tcaagactat atttattttt atgaggaaaa agaaaagcaa 420acaagttatc gctataacat ccttttcgtt tttgaaaaag agtcttttat caccatttta 480 ccaatgggat tcgatgtgac tgtgaacact aataaagaag cggttcttaa gttaacacct 540 aaagataaag tcacttatgg tcatgtatca gtaaaagctt taaatattat tcaatttatc 600 acagaagata aattgaactt tcttgctaca ttaaaaaagg cactaaaaac tctataagtg 660 ggttaagtag gtaaaataga attaaaatga aacagtatga aaggggtaat tttatatgtt 720 ctttaatcgc gttattacat taacagtacc atcttcagat gtggttaatt atagtgaaat 780 ttatcaggta gctccacaat atgtgaatca agctcttacg ctagctaaat atttccaagg 840 agcaattgat ggttcaacat tacgttttga ttttgaaaaa gccttacaaa ttgcaaatga 900 tattccacag gcagcagtgg taaacacttt aaatcaaact gtgcagcaag gtacagtcca 960 agtatcagtg atgatagaca agattgtaga cattatgaag aatgtattat ctattgtaat 1020 tgataacaaa aagttttggg atcaggtaac agctgctatt acaaatacat tcacaaatct 1080 aaattcgcaa gaaagcgaag catggatttt ttattacaaa gaagatgcac ataaaactag 1140 ttactattat aatatcttat ttgctataca ggatgaggaa acaggtgggg taatggcgac 1200 attaccgatt gcatttgata ttagtgtaga tattgaaaaa gaaaaggttc tatttgttac 1260 tatcaaggat actgaaaatt atgctgttac agtaaaagct attaatgtag tacaagcact 1320 tcaatcttcc cgagattcaa aagttgtaga tgcttttaaa tcgccacgtc acttacctag 1380 aaaaagacat acaatttgta gtaactctta a 1411 <210> 11 <211> 1531 <212> DNA <213> Seqüência Artificial <220> <223> ORF TIC810 1-657; ORF ET37 716 - 1411 <220> <221> <222> misc_feature Cl)..(1531) <223> TIC810 ORF 1-657; ET37 ORF 716-1411 <400> 11 gaattcgccc ttgcctaggt atgagtaaag aaattcgttt aaatttgagt agagaatcag 60 gggcagattt atatttaaaa atacttgctt ttgtaaaacc tgagcatttt tttcaagcat 120 atttattatg tagagaattt gagtctatcg tagatcctac aacaagagaa tcggattttg 180 acaaaacact taccattgta aagagtgatt caactttagt tacggttggt acaatgaata 240ctaaacttgt gaatagtcaa gaaattctag ttagtgattt gattacgcaa gttggaagtc 300agatagctga taccttaggt attacagaca ttgatgcaaa tacacagcaa caattaacag 360aattaattgg aaatttattt gtgaatctga attctcaagt tcaagaatat atttattttt 420atgaggaaaa agaaaagcaa acaagttatc gctataacat ccttttcgtt tttgaaaaag 480agtcttttat caccatttta ccaatgggat tcgatgtgac tgtgaacact aataaagaag 540cggttcttaa gttaacacct aaagataaag tcacttatgg tcatgtatca gtaaaagctt 600taaatattat tcaacttatc acagaagata aatttaactt tcttgctaca ttaaaaaagg 660cactaaaaac tctataagcg ggttaagtag gtaaaataga attaaaatga aacagtatga 720aaggggtaat tttatatgtt ctttaatcgc gttattacat taacagtacc atcttcagat 780gtggttaatt atagtgaaat ttatcaggta gctccacaat atgtgaatca agctcttacg 840ctagctaaat atttccaagg agcaattgat ggttcaacat tacgttttga ttttgaaaaa 900gccttacaaa ttgcaaatga tattccacag gcagcagtgg taaacacttt aaatcaaact 960gtgcagcaag gtacagtcca agtatcagtg atgatagaca agattgtaga cattatgaag 1020aatgtattat ctattgtaat tgataacaaa aagttttggg atcaggtaac agctgctatt 1080acaaatacat tcacaaatct aaattcgcaa gaaagcgaag catggatttt ttattacaaa 1140gaagatgcac ataaaactag ttactattat aatatcttat ttgctataca ggatgaggaa 1200acaggtgggg taatggcgac attaccgatt gcatttgata ttagtgtaga tattgaaaaa 1260gaaaaggttc tatttgttac tatcaaggat actgaaaatt atgctgttac agtaaaagct 1320attaatgtag tacaagcact tcaatcttcc cgagattcaa aagttgtaga tgcttttaaa 1380tcgccacgtc acttacctag aaaaagacat acaatttgta gtaactctta agaagaccga 1440caataagata aaatcttatt gcctatcttc ttagaataac aaatggctgt tatggggaag 1500cactaaatgg actcgagtta agggcgaatt c 1531

<210> 12

<211> 1531

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> ORF TIC812 1-657; ORF ΕΤ29 716-1411<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1531)

<223> TIC812 ORF 1-657; ΕΤ29 ORF 716-1411<400> 12

gaattcgccc ttgcctaggt atgagtaaag aaattcgttt aaatttgagt agagaatcag 60 gggcagattt atatttaaaa atacttgctt ttgtaaaacc tgagcatttt tttcaagcat 120 atttattatg tagagaattt gagtctatcg tagatcctac aacaagagaa ttggattttg 180 acaaaacgct taccattgta aagagtgatt caactttagt tacggttggt acaatgaata 240 ctaaacttgt gaatagtcaa gaaattctag ttagtgattt gattaagcaa gttggaagtc 300 agatagctga taccttaggt attacagaca ttgatgcaaa tacacagcaa cgattaacgg 360 aattaattga aaatttattt gtgaatctga attctcaagt tcaagactat atttattttt 420 atgaggaaaa agaaaagcaa acaagttatc gctataacat ccttttcgtt tttgaaaaag 480 agtcttttat caccatttta ccaatgggat tcgatgtgac tgtgaacact aataaagaag 540 cggttcttaa gttaacacct aaagataaag tcacttatgg tcatgtatca gtaaaagctt 600 taaatattat tcaatttatc acagaagata aattgaactt tcttgctaca ttaaaaaagg 660 cactaaaaac tctataagtg ggttaagtag gtaaaataga attaaaatga aacagtatga 720 aaggggtaat tttatatgtt ctttaatcgc gttattacat taacagtacc atcttcagat 780 gtggttaatt atagtgaaat ttatcaggta gctccacaat atgtgaatca agctcttacg 840 ctagctaaat atttccaagg agcaattgat ggttcaacat tacgttttga ttttgaaaaa 900 gccttacaaa ttgcaaatga tattccacag gcagcagtgg taaacacttt aaatcaaact 960 gtgcagcaag gtacagtcca agtatcagtg atgatagaca agattgtaga cattatgaag 1020 aatgtattat ctattgtaat tgataacaaa aagttttggg atcaggtaac agctgctatt 1080 acaaatacat tcacaaatct aaattcgcaa gaaagcgaag catggatttt ttattacaaa 1140 gaagatgcac ataaaactag ttactattat aatatcttat ttgctataca ggatgaggaa 1200 acaggtgggg taatggcgac attaccgatt gcatttgata ttagtgtaga tattgaaaaa 1260 gaaaaggttc tatttgttac tatcaaggat actgaaaatt atgcggttac agtaaaagct 1320 attaatgtag tacaagcact tcaatcttcc cgagattcaa aagttgtaga tgcttttaaa 1380 tcgccacgtc acttacctag aaaaagacat aaaatttgta gtaactctta agaagaccga 1440 caataagata aaatcttatt gtctatcttc ttagaataac aaatggctgt tatggggaag 1500 cactaaatgg actcgagtta agggcgaatt C 1531 <210> 13 <211> 702 <212> DNA <21Β> Seqüência Artificial

<220>tgg gatTrp Asp110age cagSer Gln125

gcc cac aag acg

aag tttLys Phe

ctg aacLeu Asn

144

<223> Seqüência sintética para uso na expressão de TIC809(ET29 MET-ALA) na planta

<220>

<221> CDS<222> (1)..(702)<223> TIC809<400> 13

atg gcc ttc ttc aac cgg gtg ate acc ctc acg gtg ccg tcg tca gac 48Met Ala Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser1 5 10

gtg gtc aac tac tcg gag ate tac cag gtg gct cct cag tat gtc aac 96vai vai Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln vai Ala Pro Gln Tyr20 25 30

cag gcc ctg acc ctg gcc aag tac ttc cag ggc gcc ate gacGln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp35 40 45

acc ctg agg ttc gac ttc gag aag gcg tta cag ate gcc aacThr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn50 55 60

ccg cag gcc gcg gtg gtc aac acc ctg aac cag acc gtc cagPro Gln Ala Ala Val vai Asn Thr Leu Asn Gln Thr vai Gln65 70 75

acc gtc cag gtc age gtc atg ate gac aag ate gtg gac ateThr Val Gln Val Ser Val Met Ile Asp Lys Ile vai Asp Ile85 90

aat gtc ctg tcc ate gtg ata gac aac aag aag ttt tgg gat cag gtc 336Asn vai Leu Ser Ile Val Ile Asp Asn Lys

100 105

acg gct gcc ate acc aac acc ttc acg aacThr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn115 120

gag gcc tgg ate ttc tat tac aag gag gac gcc cac aag acg tcc tac 432

tca gacSer Asp15

gtc aacVal Asn

ggc ageGly Ser

gac ateAsp Ile

cag gggGln Gly80

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cag gtcGln vai

gag tcgGlu ser

tcc tacGlu Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr Ser Tyr130 135 140 tat tac aac ate CtC ttc gcc ate cag gac gaa gag acg ggt ggc gtgTyr Tyr Asn Ile Leu Phe Ala lie Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly vai145 150 155 160atg gcc acg ctg CCC ate gcc ttc gac ate agt gtg gac ate gag aagMet Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp lie Ser vai Asp Ile Glu Lys 165 170 175 gag aag gtc ctg ttc gtg acc ate aag gac act gag aat tac gcc gtcGlu Lys vai Leu Phe vai Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala vai 180 185 190 acc gtc aag gcg ate aac gtg gtc cag gea ctc cag tct age agg gatThr vai Lys Ala Ile Asn vai Val Gln Ala Leu Gln Ser Ser Arg Asp 195 200 205 tct aag gtg gtt gat gcg ttc aaa tcg cca cgg cac tta CCC cgg aagSer Lys vai vai Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys210 215 220 agg cat aag att tgc tct aac tcg tga tga Arg His Lys Ile Cys ser Asn Ser 225 230 <210> 14 <211> 232 <212> PRT <213> Seqüência Artifici al <220> <223> Construto Sintético <400> 14

480

528

576

624

15 tct aag gtg gtt gat gcg ttc aaa tcg cca cgg cac tta ccc cgg aag 672

702

Met Ala Phe Phe Asn Arg vai Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser ser Asp15 10 15

30 Val Val Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro Gln Tyr Val Asn

20 25 30

Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly ser35 40 45

Thr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile

50 55 60

Pro Gln Ala Ala Val Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr vai Gln Gln Gly5 65 70 75 80

Thr vai Gln Val ser vai Met Ile Asp Lys Ile Val Asp Ile Met Lys

85 90 95

Asn vai Leu ser Ile vai Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln vai100 105 110

10 Thr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn Ser Gln Glu Ser115 120 125

Glu Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr ser Tyr

130 135 140

Tyr Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly Val15 145 150 155 160

Met Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser vai Asp Ile Glu Lys

165 170 175

Glu Lys Val Leu Phe Val Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala Val180 185 190

20 Thr Val Lys Ala Ile Asn vai vai Gln Ala Leu Gln ser Ser Arg Asp195 200 205

Ser Lys Val vai Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys

210 215 220

Arg His Lys Ile Cys Ser Asn ser25 225 230

<210> 15<211> 666<212> DNA

<213> Seqüência Artificial30 <220>

<223> Seqüência sintética para uso na expressão de TIC810na planta<220> <221> CDS <222> (1). .(666) <223> TIC810 <400> 15 atg age aaa gaa ate agg ctc aac Ctt tct cgt gag age ggc gcc gac Met Ser Lys Glu Ile Arg Leu Asn Leu Ser Arg Glu Ser Gly Ala Asp 1 5 10 15 ctg tac ctc aag ate ctc gcc ttc gtg aag CCC gag cac ttc ttt cag Leu Tyr Leu Lys 20 Ile Leu Ala Phe Val 25 Lys Pro Glu HiS Phe 30 Phe Gln gcg tac ctc ctg tgc cgc gag ttc gag age ate gtg gat CCt aca acc Ala Tyr Leu Leu 35 Cys Arg Glu Phe 40 Glu Ser lie vai Asp 45 Pro Thr Thr cgc gag tct gac ttc gac aag acg ctg acc ate gtg aag tcg gac tcc Arg Glu 50 Ser Asp Phe Asp Lys 55 Thr Leu Thr lie vai 60 Lys Ser Asp ser acc CtC gtg acc gtg ggc acg atg aac acc aag ctg gtc aat age caa Thr Leu vai Thr vai Gly Thr Met Asn Thr Lys Leu vai Asn Ser Gln 65 70 75 80 gag ate ctc gtg tcg gac ttg ate act caa gtc ggt tcc cag ate gcc Glu Ile Leu vai Ser 85 Asp Leu He Thr Gln 90 Val Gly Ser Gln Ile 95 Ala gat acc ctc ggc ate acg gac ate gac gcc aac acc cag caa cag ctc Asp Thr Leu Gly 100 He Thr Asp lie Asp 105 Ala Asn Thr Gln Gln 110 Gln Leu acg gag ctg ate ggc aac ctc ttc gtg aac ctc aat tcc caa gtt cag Thr Glu Leu lie 115 Gly Asn Leu Phe 120 Val Asn Leu Asn Ser 125 Gln Val Gln gag tac ate tac ttc tac gag gag aag gag aag cag acc tcc tac cgc Glu Tyr 130 Ile Tyr Phe Tyr Glu 135 Glu Lys Glu Lys Gln 140 Thr Ser Tyr Argtac aac ate ctc ttc gtg ttc gaa aag gag tcg ttc ate acc att ctg 480

Tyr Asn lie Leu Phe vai Phe Glu Lys Glu Ser Phe Ile Thr Ile Leu145 150 155 160

cca atg ggc ttc gac gtg acc gtg aac acg aac aag gag gcc gtc ctg 528

Pro Met Gly Phe Asp vai Thr Val Asn Thr Asn Lys Glu Ala vai Leu

165 170 175

aag ctg acc ccg aag gac aag gtt acc tac ggc cac gtc age gtc aag 576

Lys Leu Thr Pro Lys Asp Lys Val Thr Tyr Gly His vai Ser Val Lys

180 185 190

gcc ctc aac ate ate cag ctc att acg gag gac aag ttc aac ttc ctc 624

Ala Leu Asn Ile Ile Gln Leu Ile Thr Glu Asp Lys Phe Asn Phe Leu

195 200 205

gea acc ctc aag aag gct ctc aag acc ctg tga tga gaa ttc

Ala Thr Leu Lys Lys Ala Leu Lys Thr Leu Glu Phe

210

215

220

666

<210> 16 <211> 218 <212> PRT <213> Seqüência Artificial <220> <223> Construto Sintético <400> 16 Met Ser Lys Glu Ile Arg Leu Asn Leu Ser Arg Glu Ser Gly Ala Asp 1 5 10 15 Leu Tyr Leu Lys He Leu Ala Phe vai Lys Pro Glu His Phe Phe Gln 20 25 30 Ala Tyr Leu Leu Cys Arg Glu Phe Glu Ser lie Val Asp Pro Thr Thr 35 40 45 Arg Glu Ser Asp Phe Asp Lys Thr Leu Thr Ile Val Lys Ser Asp Ser50 55 60 Thr Leu vai Thr vai Gly Thr Met Asn Thr Lys Leu Val Asn Ser Gln65 70 75 8080

Glu lie Leu Val Ser Asp85

Asp Thr Leu Gly Ile Thr100

Thr Glu Leu Ile Gly Asn115

Glu Tyr Ile Tyr Phe Tyr130

Tyr Asn Ile Leu Phe Val145 150

Pro Met Gly Phe Asp vai165

Lys Leu Thr Pro Lys Asp180

Ala Leu Asn Ile Ile Gln195

Ala Thr Leu Lys Lys Ala210

<210> 17<211> 699<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência sintética para expressão de ET37 na planta<220><221> CDS<222> (1)..(699)<22 3> ET37<400> 17

atg ttc ttc aac cgg gtg ate acc ctc acg gtg ccg tcg tca gac gtg 48Met Phe Phe Asn Arg vai Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser ser Asp vai1 5 10 15

Leu Ile Thr Gln Val Gly Ser Gln Ile Ala

90 95

Asp lie Asp Ala Asn Thr Gln Gln Gln Leu

105 110

Leu Phe vai Asn Leu Asn ser Gln Val Gln

120 125

Glu Glu Lys Glu Lys Gln Thr ser Tyr Arg135 140

Phe Glu Lys Glu ser Phe Ile Thr Ile Leu155 160

Thr vai Asn Thr Asn Lys Glu Ala vai Leu

170 175

Lys vai Thr Tyr Gly His vai ser vai Lys

185 190

Leu Ile Thr Glu Asp Lys Phe Asn Phe Leu

200 205

Leu Lys Thr Leu215gtc aacvai Asn

gcc ctgAla Leu

ctg aggLeu Arg50cag gccGln Ala65

gtc cagVal Gln

gtc ctgvai Leu

gct gccAla Ala

gcc tggAla Trp130tac aacTyr Asn145

gcc acgAla Thr

aag gtcLys vai

tac tcg gag ateTyr Ser Glu Ile20

acc ctg gcc aagThr Leu Ala Lys35

ttc gac ttc gagPhe Asp Phe Glu

gcg gtgAla vai

gtc agevai Ser

tcc ateSer Ile100ate accIle Thr115

ate ttclie Phe

gtc aacVal Asn70

gtc atgvai Met85

gtg atavai Ile

aac accAsn Thr

tat tacTyr Tyr

ate ctc ttc gccIle Leu Phe Ala150

ctg ccc ate gccLeu Pro lie Ala165

ctg ttc gtg accLeu Phe Val Thr

tac cagTyr Gln

tac ttcTyr Phe40

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acc ctgThr Leu

ate gacIle Asp

gac aacAsp Asn

ttc acgPhe Thr120aag gagLys Glu135

ate cagIle Gln

ttc gacPhe Asp

ate aagIle Lys

gtg gctvai Ala25

cag ggcGln Gly

tta cagLeu Gln

aac cagAsn Gln

aag ateLys Ile90

aag aagLys Lys105

aac ctgAsn Leu

gac gccAsp Ala

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cct cagPro Gln

gcc ateAla Ile

ate gcclie Ala60

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gtg gacvai Asp

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gtg gacvai Asp

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96

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gat cagAsp Gln110cag gagGln Glu125

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ggg accGly Thr80

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gtc acgvai Thr

tcg gagSer Glu

tac tatTyr Tyr

ggt ggc gtg atgGly Gly vai Met160

ate gag aag gagIle Glu Lys Glu175

tac gcc gtc accTyr Ala vai Thr

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576180

gtc aag gcg ate aacvai Lys Ala Ile Asn195

aag gtg gtt gat gcgLys vai vai Asp Ala210

cat acc att tgc tetHis Thr Ile Cys Ser225

<210> 18<211> 231<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Construto Sintético<400> 18

Met Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp Val1 5 10 15

Val Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro Gln Tyr Val Asn Gln

20 25 30

Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly Ser Thr

35 40 45

Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile Pro50 55 60

Gln Ala Ala Val Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr Val Gln Gln Gly Thr65 70 75 80

vai Gln vai Ser Val Met Ile Asp Lys Ile vai Asp Ile Met Lys Asn85 90 95

vai Leu Ser Ile Val Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln vai Thr

100 105 110

Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn Ser Gln Glu Ser Glu

185

gtg gtc cag gea ctc cagvai vai Gln Ala Leu Gln200

ttc aaa tcg cca cgg cacPhe Lys Ser Pro Arg His215

aac tcg tga tga

Asn Ser

230

190

tet age agg gat tet 624Ser Ser Arg Asp Ser205

tta ccc cgg aag agg 672Leu Pro Arg Lys Arg220

699115 120 125

Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr Ser Tyr Tyr

130 135 140

Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly vai Met145 150 155 160

Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser vai Asp Ile Glu Lys Glu

165 170 175

Lys vai Leu Phe Val Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala Val Thr180 185 190

vai Lys Ala Ile Asn Val vai Gln Ala Leu Gln Ser Ser Arg Asp Ser195 200 205

Lys Val Val Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys Arg

210 215 220

His Thr lie Cys Ser Asn ser225 230

<210> 19<211> 657<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência sintética para expressão de TIC812 naplanta

<220>

<221> CDS<222> (1)..(657)<22 3> TIC812<400> 19

atg age aaa gaa ate agg ctc aac ctt tet cgt gag age ggc gcc gac 48Met Ser Lys Glu Ile Arg Leu Asn Leu Ser Arg Glu Ser Gly Ala Asp1 5 10 15

ctg tac ctc aag ate ctc gcc ttc gtg aag ccc gag cac ttc ttt cag 96Leu Tyr Leu Lys Ile Leu Ala Phe vai Lys Pro Glu His Phe Phe Glngcg tacAla Tyr

cgc gagArg Glu50

acc ctcThr Leu65

gag ateGlu Ile

gat accAsp Thr

acg gagThr Glu

gac tacAsp TyrIBOtac aacTyr Asn145

cca atgPro Met

ctc ctgLeu Leu35

ctg gacLeu Asp

gtg accvai Thr

ctc gtgLeu Val

ctc ggcLeu Gly100ctg ateLeu Ile115

ate tacIle Tyr

ate ctclie Leu

ggc ttcGly Phe

tgc cgcCys Arg

ttc gacPhe Asp

gtg ggcvai Gly70

tcg gacser Asp85

ate acglie Thr

gag aacGlu Asn

ttc tacPhe Tyr

ttc gtgPhe vai150gac gtgAsp vai165

aag gacLys Asp

gag ttc gag ageGlu Phe Glu Ser

aag acg ctg accLys Thr Leu Thr

acg atg aac accThr Met Asn Thr

ttg ateLeu Ile

gac ateAsp Ile

ctc ttcLeu Phe120gag gagGlu Glu135

ttc gaaPhe Glu

aag caaLys Gln90

gac gccAsp Ala105

gtg aacvai Asn

aag gagLys Glu

ate gtg gat

Ile Val Asp45

ate gtg aag

lie vai Lys60

aag ctg gtc

Lys Leu vai75

gtc ggt tcc

vai Gly Ser

aac acc cagAsn Thr Gln

ctc aat tccLeu Asn Ser125

aag cag accLys Gln Thr

140tcg ttc ateSer Phe Ile155

aac aag gagAsn Lys Glu

aag ctg acc ccgLys Leu Thr Pro180

gcc ctc aac ate ate cag

acc gtg aac acgThr vai Asn Thr170

aag gtt acc tac ggc cac gtcLys vai Thr Tyr Gly His vai185

ttc att acg gag gac aag ctc

30

cct aca accPro Thr Thr

tcg gac tccSer Asp Ser

aat age caaAsn Ser Gln80

cag ate gccGln Ile Ala95

caa agg ctcGln Arg Leu110

caa gtt cagGln Val Gln

tcc tac cgcSer Tyr Arg

acc att ctgThr lie Leu160

gcc gtc ctgAla vai Leu

175age gtc aagSer Val Lys190

aac ttc ctc

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624Ala Leu Asn Ile Ile Gln Phe Ile Thr Glu Asp Lys Leu Asn Phe Leu

195 200 205

gca acc ctc aag aag gct ctc aag acc ctg tga 657

Ala Thr Leu Lys Lys Ala Leu Lys Thr Leu210 215

<210> 20<211> 218<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Construto Sintético<400> 20

Met Ser Lys Glu lie Arg Leu Asn Leu Ser Arg Glu Ser Gly Ala Asp1 5 10 15

Leu Tyr Leu Lys Ile Leu Ala Phe Val Lys Pro Glu His Phe Phe Gln

20 25 30

Ala Tyr Leu Leu Cys Arg Glu Phe Glu Ser Ile Val Asp Pro Thr Thr

35 40 45

Arg Glu Leu Asp Phe Asp Lys Thr Leu Thr Ile vai Lys Ser Asp Ser50 55 60

Thr Leu vai Thr vai Gly Thr Met Asn Thr Lys Leu vai Asn Ser Gln65 70 75 80

Glu Ile Leu Val Ser Asp Leu Ile Lys Gln Val Gly ser Gln Ile Ala85 90 95

Asp Thr Leu Gly Ile Thr Asp Ile Asp Ala Asn Thr Gln Gln Arg Leu

100 105 110

Thr Glu Leu Ile Glu Asn Leu Phe vai Asn Leu Asn Ser Gln Val Gln

115 120 125

Asp Tyr Ile Tyr Phe Tyr Glu Glu Lys Glu Lys Gln Thr Ser Tyr Arg130 135 140

Tyr Asn Ile Leu Phe Val Phe Glu Lys Glu Ser Phe Ile Thr Ile Leu145 150 155 160Pro Met Gly Phe Asp Val Thr vai Asn Thr Asn Lys Glu Ala Val Leu

165 170 175

Lys Leu Thr Pro Lys Asp Lys Val Thr Tyr Gly His Val Ser Val Lys180 185 190

Ala Leu Asn Ile Ile Gln Phe Ile Thr Glu Asp Lys Leu Asn Phe Leu195 200 205

Ala Thr Leu Lys Lys Ala Leu Lys Thr Leu

210 215

<210> 21<211> 22<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência sintética; iniciador de amplificação tér- mica

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(22)

<223> iniciador de amplificação térmica; pr370<400> 21

cctacttaac ccgcttatag ag 22

<210> 22<211> 21<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência sintética; iniciador de amplificação tér-mica

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(21)

<223> iniciador de amplificação térmica; pr371<400> 22

cagtaccatc ttcagatgtg g 21

<210> 23<211> 49<212> DNA

<213> seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência sintética; iniciador de amplificação tér-mica

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(49)

<223> iniciador de amplificação térmica; pr375<400> 23

gactagtaat gagtaaagaa attcgtttaa atttgagtag agaatcagg 49

<210> 24<211> 30<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência sintética; iniciador de amplificação tér-mica

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(30)

<223> Iniciador de amplificação térmica; pr376<400> 24

aactcgagcc tacttaaccc gcttatagag 30

<210> 25<211> 35<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<22Β> Seqüência sintética; iniciador de amplificação tér-mica

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(35)

<223> iniciador de amplificação térmica; pr365<400> 25

aactcgagtc catttagtgc ttccccataa cagcc 35

<210> 26<211> 43<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência sintética; iniciador de amplificação tér-mica

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(43)<223> iniciador de amplificação térmica; pr372<400> 26

aacctaggat gttctttaat cgcgttatta cattaacagt acc 43

<210> 27<211> 49<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência sintética; iniciador de amplificação tér-mica

<220>

<221> misc_feature<222> (1)..(49)<223> Iniciador de amplificação térmica; pr421<400> 27

gcctaggtat gagtaaagaa attcgtttaa atttgagtag agaatcagg

<210><211><212><213><220><223>

<220><221><223>

<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221>

28

4257DNA

Seqüência Artificial

Seqüência sintética; pMON64138 cassettes de expres-são codificando TIC89 e TIC810

misc_feature

PMON64138 primeiro e segundo cassettes de expressãode planta

promotor(1)..(614)e35S

(650)(710)CAB líder de trigo

íntron

(727)..(1206)actina de arroz

CDS

(1216)..(1917)TIC809

terminador90 <222> C1921)..(2130) <223> trigo Hspl7 <220> <221> promotor <222> (2168)..(2781) <223> CaMV 35S enh <220> <221> 5" UTR <222> (2817)..(2877) <223> CAB Iider de trigo <220> <221> íntron <222> (2894)..(3373) <22 Β> actina de arroz <220> <221> CDS <222> (3383)..(4042) <223> TIC810 <220> <221> terminador <222> (4048)..(4257) <223> trigo Hspl7 <400> 28 ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60 cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120 ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180 agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240 aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 300 gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 360 aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 420 cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 480 aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 540gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 600ttcatttgga gaggacacgc tgacaagctg actctagcag atcctctaga accatcttcc 660acacactcaa gccacactat tggagaacac acagggacaa cacaccataa gatccaaggg 720aggcctccgc cgccgccggt aaccaccccg cccctctcct ctttctttct ccgttttttt 780ttccgtctcg gtctcgatct ttggccttgg tagtttgggt gggcgagagg cggcttcgtg 840cgcgcccaga tcggtgcgcg ggaggggcgg gatctcgcgg ctggggctct cgccggcgtg 900gatccggccc ggatctcgcg gggaatgggg ctctcggatg tagatctgcg atccgccgtt 960gttgggggag atgatggggg gtttaaaatt tccgccgtgc taaacaagat caggaagagg 1020ggaaaagggc actatggttt atatttttat atatttctgc tgcttcgtca ggcttagatg 1080tgctagatct ttctttcttc tttttgtggg tagaatttga atccctcagc attgttcatc 1140ggtagttttt cttttcatga tttgtgacaa atgcagcctc gtgcggagct tttttgtagg 1200tagaagtgat caacc atg gcc ttc ttc aac cgg gtg ate acc ctc acg gtg 1251

Met Ala Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val1 5 10

15 ccg tcg tca gac gtg gtc aac tac tcg gag ate tac cag gtg gct cct 1299Pro Ser Ser Asp Val Val Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro

20 25

cag tat gtc aac cag gcc ctg acc ctg gcc aag tac ttc cag ggc gcc 1347Gln Tyr vai Asn Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala30 35 40

ate gac ggc age acc ctg agg ttc gac ttc gag aag gcg tta cag ate 1395Ile Asp Gly Ser Thr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile45 50 55 60

gcc aac gac ate ccg cag gcc gcg gtg gtc aac acc ctg aac cag acc 1443Ala Asn Asp Ile Pro Gln Ala Ala Val Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr

65 70 75

gtc cag cag ggg acc gtc cag gtc age gtc atg ate gac aag ate gtg 1491vai Gln Gln Gly Thr vai Gln vai Ser vai Met Ile Asp Lys Ile Val80 85 90

gac ate atg aag aat gtc ctg tcc ate gtg ata gac aac aag aag ttt 1539Asp Ile Met Lys Asn Val Leu Ser Ile vai Ile Asp Asn Lys Lys Phe95 100 105tgg gat cag gtc acg gct gcc ate acc aac acc ttc acg aac ctg aac 1587Trp Asp Gln vai Thr Ala Ala ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn

110 115 120

age cag gag tcg gag gcc tgg ate ttc tat tac aag gag gac gcc cac 1635Ser Gln Glu Ser Glu Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His125 130 135 140

aag acg tcc tac tat tac aac ate ctc ttc gcc ate cag gac gaa gag 1683Lys Thr Ser Tyr Tyr Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu145 150 155

acg ggt ggc gtg atg gcc acg ctg ccc ate gcc ttc gac ate agt gtg 1731Thr Gly Gly Val Met Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile ser Val

160 165 170

gac ate gag aag gag aag gtc ctg ttc gtg acc ate aag gac act gag 1779Asp Ile Glu Lys Glu Lys Val Leu Phe Val Thr Ile Lys Asp Thr Glu 175 180 185

aat tac gcc gtc acc gtc aag gcg ate aac gtg gtc cag gea ctc cag 1827Asn Tyr Ala vai Thr vai Lys Ala Ile Asn Val Val Gln Ala Leu Gln

190 195 200

tet age agg gat tet aag gtg gtt gat gcg ttc aaa tcg cca cgg cac 1875Ser Ser Arg Asp Ser Lys vai vai Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His205 210 215 220

tta ccc cgg aag agg cat aag att tgc tet aac tcg tga tga 1917

Leu Pro Arg Lys Arg His Lys Ile Cys Ser Asn ser225 230

attctgcatg cgtttggacg tatgctcatt caggttggag ccaatttggt tgatgtgtgt 1977gcgagttctt gcgagtctga tgagacatct ctgtattgtg tttctttccc cagtgttttc 2037tgtacttgtg taatcggcta atcgccaaca gattcggcga tgaataaatg agaaataaat 2097tgttctgatt ttgagtgcaa aaaaaaagga attagatctg tgtgtgtttt ttggatcccc 2157agcttctgca ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg 2217gattccattg cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct 2277cctacaaatg ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca 2337gtggtcccaa agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa 2397ccacgtcttc aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg 2457gtaatatccg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag 2517atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc 2577gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc 2637gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc 2697actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc ctctatataa 2757ggaagttcat ttcatttgga gaggacacgc tgacaagctg actctagcag atcctctaga 2817accatcttcc acacactcaa gccacactat tggagaacac acagggacaa cacaccataa 2877gatccaaggg aggcctccgc cgccgccggt aaccaccccg cccctctcct ctttctttct 2937ccgttttttt ttccgtctcg gtctcgatct ttggccttgg tagtttgggt gggcgagagg 2997cggcttcgtg cgcgcccaga tcggtgcgcg ggaggggcgg gatctcgcgg ctggggctct 3057cgccggcgtg gatccggccc ggatctcgcg gggaatgggg ctctcggatg tagatctgcg 3117atccgccgtt gttgggggag atgatggggg gtttaaaatt tccgccgtgc taaacaagat 3177caggaagagg ggaaaagggc actatggttt atatttttat atatttctgc tgcttcgtca 3237ggcttagatg tgctagatct ttctttcttc tttttgtggg tagaatttga atccctcagc 3297attgttcatc ggtagttttt cttttcatga tttgtgacaa atgcagcctc gtgcggagct 3357tttttgtagg tagaagtgat caacc atg age aaa gaa ate agg ctc aac ctt 3409

Met Ser Lys Glu Ile Arg Leu Asn Leu235 240

tet cgt gag age ggc gcc gac ctg tac ctc aag ate ctc gcc ttc gtg 3457Ser Arg Glu Ser Gly Ala Asp Leu Tyr Leu Lys Ile Leu Ala Phe vai

245 250 255

aag ccc gag cac ttc ttt cag gcg tac ctc ctg tgc cgc gag ttc gag 3505Lys Pro Glu His Phe Phe Gln Ala Tyr Leu Leu Cys Arg Glu Phe Glu260 265 270

age ate gtg gat cct aca acc cgc gag tet gac ttc gac aag acg ctg 3553Ser Ile Val Asp Pro Thr Thr Arg Glu Ser Asp Phe Asp Lys Thr Leu

275 280 285

acc ate gtg aag tcg gac tcc acc ctc gtg acc gtg ggc acg atg aac 3601Thr lie vai Lys Ser Asp Ser Thr Leu vai Thr vai Gly Thr Met Asn290 295 300 305

acc aag ctg gtc aat age caa gag ate ctc gtg tcg gac ttg ate act 3649Thr Lys Leu Val Asn Ser Gln Glu lie Leu vai Ser Asp Leu Ile Thr

310 315 320

caa gtc ggt tcc cag ate gcc gat acc ctc ggc ate acg gac ate gac 3697Gln Val Gly Ser Gln Ile Ala Asp Thr Leu Gly Ile Thr Asp Ile Asp 325 330 335

gcc aac acc cag caa cag ctc acg gag ctg ate ggc aac ctc ttc gtg 3745Ala Asn Thr Gln Gln Gln Leu Thr Glu Leu Ile Gly Asn Leu Phe vai

340 345 350

aac ctc aat tcc caa gtt cag gag tac ate tac ttc tac gag gag aag 3793Asn Leu Asn Ser Gln vai Gln Glu Tyr Ile Tyr Phe Tyr Glu Glu Lys355 360 365

gag aag cag acc tcc tac cgc tac aac ate ctc ttc gtg ttc gaa aag 3841Glu Lys Gln Thr Ser Tyr Arg Tyr Asn Ile Leu Phe Val Phe Glu Lys370 375 380 385

gag tcg ttc ate acc att ctg cca atg ggc ttc gac gtg acc gtg aac 3889Glu Ser Phe Ile Thr Ile Leu Pro Met Gly Phe Asp Val Thr vai Asn

390 395 400

acg aac aag gag gcc gtc ctg aag ctg acc ccg aag gac aag gtt acc 3937Thr Asn Lys Glu Ala Val Leu Lys Leu Thr Pro Lys Asp Lys Val Thr 405 410 415

tac ggc cac gtc age gtc aag gcc ctc aac ate ate cag ctc att acg 3985Tyr Gly His Val Ser Val Lys Ala Leu Asn Ile Ile Gln Leu Ile Thr

420 425 430

gag gac aag ttc aac ttc ctc gea acc ctc aag aag gct ctc aag acc 4033Glu Asp Lys Phe Asn Phe Leu Ala Thr Leu Lys Lys Ala Leu Lys Thr435 440 445

ctg tga tga gaattctgca tgcgtttgga cgtatgctca ttcaggttgg 4082

Leu450

agccaatttg gttgatgtgt gtgcgagttc ttgcgagtct gatgagacat ctctgtattg 4142tgtttctttc cccagtgttt tctgtacttg tgtaatcggc taatcgccaa cagattcggc 4202gatgaataaa tgagaaataa attgttctga ttttgagtgc aaaaaaaaag gaatt 4257<210> 29<211> 232<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Construto Sintético<400> 29

Met Ala Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp1 5 10 15

vai Val Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro Gln Tyr Val Asn

20 25 30

Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly Ser

35 40 45

Thr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile50 55 60

Pro Gln Ala Ala Val Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr Val Gln Gln Gly65 70 75 80

Thr Val Gln Val Ser Val Met Ile Asp Lys Ile Val Asp Ile Met Lys85 90 95

Asn Val Leu Ser Ile Val Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln Val

100 105 110

Thr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn Ser Gln Glu Ser

115 120 125

Glu Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr Ser Tyr130 135 140

Tyr Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly Val145 150 155 160

Met Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser vai Asp Ile Glu Lys165 170 175

Glu Lys Val Leu Phe Val Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala Val

180 185 190

Thr Val Lys Ala Ile Asn Val Val Gln Ala Leu Gln Ser Ser Arg Asp195 200 205

Ser Lys vai vai Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys

210 215 220

Arg His Lys Ile Cys Ser Asn ser225 230

<210> 30<211> 218<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Construto Sintético<400> 30

Met Ser Lys Glu Ile Arg Leu Asn Leu ser Arg Glu Ser Gly Ala Asp 10 15

Leu Tyr Leu Lys Ile Leu Ala Phe vai Lys Pro Glu His Phe Phe Gln

20 25 30

Ala Tyr Leu Leu Cys Arg Glu Phe Glu Ser Ile vai Asp Pro Thr Thr

35 40 45

Arg Glu Ser Asp Phe Asp Lys Thr Leu Thr Ile Val Lys Ser Asp Ser 50 55 60

Thr Leu vai Thr vai Gly Thr Met Asn Thr Lys Leu vai Asn Ser Gln65 70 75 80

Glu Ile Leu Val Ser Asp Leu Ile Thr Gln vai Gly Ser Gln Ile Ala85 90 95

Asp Thr Leu Gly Ile Thr Asp Ile Asp Ala Asn Thr Gln Gln Gln Leu

100 105 110

Thr Glu Leu Ile Gly Asn Leu Phe vai Asn Leu Asn Ser Gln Val Gln

115 120 125

Glu Tyr Ile Tyr Phe Tyr Glu Glu Lys Glu Lys Gln Thr ser Tyr Arg 130 135 140

Tyr Asn Ile Leu Phe vai Phe Glu Lys Glu Ser Phe Ile Thr Ile Leu145 150 155 160Pro Met Gly Phe Asp Val Thr Val Asn Thr Asn Lys Glu Ala Val Leu

165 170 175

Lys Leu Thr Pro Lys Asp Lys Val Thr Tyr Gly His vai ser Val Lys180 185 190

Ala Leu Asn Ile Ile Gln Leu Ile Thr Glu Asp Lys Phe Asn Phe Leu195 200 205

Ala Thr Leu Lys Lys Ala Leu Lys Thr Leu

210 215

<210> 31<211> 5079<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220><223> Seqüência sintética; cassettes de expressão codifi-cando TIC809 e TIC810 em pMON64139

<220>

<221> misc_feature<223> pMON64139<220>

<221> promotor<222> (1)..(614)<223> e35S<220>

<221> 5'UTR<222> (650)..(710)<223> CAB lider trigo<220>

<221> íntron<222> (727)..(1206)<223> Actina de arroz (Éxon 727-738; intron 739-1199; Éxon1200-1206)

<220><221> transit_peptide

<222> (1230)..(1370)

<223> Sinal de SSU de milho<220>

<221> íntron

<222> (1231)..(1539)

<223> Zm RbcS

<220>

<221> transit_peptide

<222> (1540)..(1626)

<223> Zm RbcS<220>

<221> CDS

<222> (1627)..(2328)

<223> TIC809<220>

<221> terminador

<222> (2332)..(2541)

<223> trigo Hspl7<220>

<221> promotor

<222> (2579)..(3192)

<223> CaMV 35S enh<220>

<221> 5'UTR

<222> (3228)..(3288)

<223> CAB Iider de trigo<220>

<221> íntron

<222> (3305)..(3784)

<223> Actina de arroz (Éxon 3305-3316; íntron 3317-3777;Éxon 3778-3784)<220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>ggtccgatgtcccagctatcccatcattgcagatggacccaaagcaagtggaaacctcctaggaaggtggcctctgccgaaagacgttccgggatgacgcttcatttgga

transit_peptide(3808)..(3948)Maize SSU - signal

íntron

(3949)..(4117)Zm RbcS

transit_peptide(4118)..(4204)Zm Rbcs

CDS

(4205)..(4864)TIC810

terminador(4870)..(5079)trigo Hspl731

aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 300tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 360tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 420aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 480tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 540tatccttcgc aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 600tgacaagctg actctagcag atcctctaga accatcttcc 660acacactcaa gccacactat tggagaacac acagggacaa cacaccataa gatccaaggg 720aggcctccgc cgccgccggt aaccaccccg cccctctcct ctttctttct ccgttttttt 780ttccgtctcg gtctcgatct ttggccttgg tagtttgggt gggcgagagg cggcttcgtg 840cgcgcccaga tcggtgcgcg ggaggggcgg gatctcgcgg ctggggctct cgccggcgtg 900gatccggccc ggatctcgcg gggaatgggg ctctcggatg tagatctgcg atccgccgtt 960gttgggggag atgatggggg gtttaaaatt tccgccgtgc taaacaagat caggaagagg 1020ggaaaagggc actatggttt atatttttat atatttctgc tgcttcgtca ggcttagatg 1080tgctagatct ttctttcttc tttttgtggg tagaatttga atccctcagc attgttcatc 1140ggtagttttt cttttcatga tttgtgacaa atgcagcctc gtgcggagct tttttgtagg 1200tagaagtgat caacctctag aggatcagca tggcgcccac cgtgatgatg gcctcgtcgg 1260ccaccgccgt cgctccgttc ctggggctca agtccaccgc cagcctcccc gtcgcccgcc 1320gctcctccag aagcctcggc aacgtcagca acggcggaag gatccggtgc atgcaggtaa 1380caaatgcatc ctagctagta gttctttgca ttgcagcagc tgcagctagc gagttagtaa 1440taggaaggga actgatgatc catgcatgga ctgatgtgtg ttgcccatcc catcccatcc 1500catttcccaa acgaaccgaa aacaccgtac tacgtgcagg tgtggcccta cggcaacaag 1560aagttcgaga cgctgtcgta cctgccgccg ctgtcgaccg gcgggcgcat ccgctgcatg 1620caggcc atg gcc ttc ttc aac cgg gtg ate acc ctc acg gtg ccg tcg 1668Met Ala Phe Phe Asn Arg vai Ile Thr Leu Thr vai Pro ser1 5 10

tca gac gtg gtc aac tac tcg gag ate tac cag gtg gct cct cag tat 1716Ser Asp Val vai Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro Gln Tyr15 20 25 30

gtc aac cag gcc ctg acc ctg gcc aag tac ttc cag ggc gcc ate gac 1764Val Asn Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp35 40 45

ggc age acc ctg agg ttc gac ttc gag aag gcg tta cag ate gcc aac 1812Gly Ser Thr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn

50 55 60

gac ate ccg cag gcc gcg gtg gtc aac acc ctg aac cag acc gtc cag 1860Asp Ile Pro Gln Ala Ala vai vai Asn Thr Leu Asn Gln Thr Val Gln65 70 75

cag ggg acc gtc cag gtc age gtc atg ate gac aag ate gtg gac ate 1908Gln Gly Thr Val Gln Val Ser Val Met Ile Asp Lys Ile vai Asp Ile

80 85 90

atg aag aat gtc ctg tcc ate gtg ata gac aac aag aag ttt tgg gat 1956Met Lys Asn vai Leu Ser Ile Val Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp95 100 105 110

cag gtc acg gct gcc ate acc aac acc ttc acg aac ctg aac age cag 2004Gln vai Thr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn ser Gln

115 120 125

gag tcg gag gcc tgg ate ttc tat tac aag gag gac gcc cac aag acg 2052Glu Ser Glu Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys ThrIBO 135 140

tcc tac tat tac aac ate ctc ttc gcc ate cag gac gaa gag acg ggt 2100Ser Tyr Tyr Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly145 150 155

ggc gtg atg gcc acg ctg ccc ate gcc ttc gac ate agt gtg gac ate 2148Gly Val Met Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser Val Asp Ile

160 165 170

gag aag gag aag gtc ctg ttc gtg acc ate aag gac act gag aat tac 2196Glu Lys Glu Lys Val Leu Phe Val Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr175 180 185 190

gcc gtc acc gtc aag gcg ate aac gtg gtc cag gea ctc cag tet age 2244Ala vai Thr vai Lys Ala Ile Asn vai vai Gln Ala Leu Gln Ser Ser

195 200 205

agg gat tet aag gtg gtt gat gcg ttc aaa tcg cca cgg cac tta ccc 2292Arg Asp ser Lys vai vai Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro210 215 220

cgg aag agg cat aag att tgc tet aac tcg tga tga attctgcatg 2338

Arg Lys Arg His Lys Ile Cys Ser Asn Ser225 230

cgtttggacg tatgctcatt caggttggag ccaatttggt tgatgtgtgt gcgagttctt 2398gcgagtctga tgagacatct ctgtattgtg tttctttccc cagtgttttc tgtacttgtg 2458taatcggcta atcgccaaca gattcggcga tgaataaatg agaaataaat tgttctgatt 2518ttgagtgcaa aaaaaaagga attagatctg tgtgtgtttt ttggatcccc agcttctgca 2578 ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 2638 cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 2698 ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 2758 agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 2818 aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 2878 gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 2938 aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 2998 cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 3058 aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 3118 gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc etetatataa ggaagttcat 3178 ttcatttgga gaggacacgc tgacaagctg actctagcag atcctctaga accatcttcc 3238 acacactcaa gccacactat tggagaacac acagggacaa cacaccataa gatccaaggg 3298 aggcctccgc cgccgccggt aaccaccccg cccctctcct ctttctttct ccgttttttt 3358 ttccgtctcg gtctcgatct ttggccttgg tagtttgggt gggcgagagg cggcttcgtg 3418 cgcgcccaga tcggtgcgcg ggaggggcgg gatctcgcgg ctggggctct cgccggcgtg 3478 gatccggccc ggatctcgcg gggaatgggg ctctcggatg tagatctgcg atccgccgtt 3538 gttgggggag atgatggggg gtttaaaatt tccgccgtgc taaacaagat caggaagagg 3598 ggaaaagggc actatggttt atatttttat atatttctgc tgcttcgtca ggcttagatg 3658 tgctagatct ttctttcttc tttttgtggg tagaatttga atccctcagc attgttcatc 3718 ggtagttttt cttttcatga tttgtgacaa atgcagcctc gtgcggagct tttttgtagg 3778 tagaagtgat caacctctag aggatcagca tggcgcccac cgtgatgatg gcctcgtcgg 3838 ccaccgccgt cgctccgttc ctggggctca agtccaccgc cagcctcccc gtcgcccgcc 3898 gctcctccag aagcctcggc aacgtcagca acggcggaag gatccggtgc atgcaggtaa 3958 caaatgcatc ctagctagta gttctttgca ttgcagcagc tgeagetage gagttagtaa 4018 taggaaggga actgatgatc catgcatgga ctgatgtgtg ttgcccatcc catcccatcc 4078 catttcccaa acgaaccgaa aacaccgtac tacgtgcagg tgtggcccta cggcaacaag 4138 aagttcgaga cgctgtcgta cctgccgccg ctgtcgaccg gcgggcgcat ccgctgcatg 4198 caggcc atg age aaa gaa ate agg ctc aac ctt tet cgt gag age ggc 4246 Met Ser Lys Glu Ile Arg Leu Asn Leu Ser Arg Glu Ser Gly 235 240 245

gcc gac ctg tac ctc aag ate ctc gcc ttc gtg aag ccc gag cac ttc 4294Ala Asp Leu Tyr Leu Lys Ile Leu Ala Phe Val Lys Pro Glu His Phe

250 255 260

ttt cag gcg tac ctc ctg tgc cgc gag ttc gag age ate gtg gat cct 4342Phe Gln Ala Tyr Leu Leu Cys Arg Glu Phe Glu Ser Ile Val Asp Pro265 270 275

aca acc cgc gag tet gac ttc gac aag acg ctg acc ate gtg aag tcg 4390Thr Thr Arg Glu Ser Asp Phe Asp Lys Thr Leu Thr Ile vai Lys Ser

280 285 290

gac tcc acc ctc gtg acc gtg ggc acg atg aac acc aag ctg gtc aat 4438Asp Ser Thr Leu vai Thr vai Gly Thr Met Asn Thr Lys Leu Val Asn295 300 305 310

age caa gag ate ctc gtg tcg gac ttg ate act caa gtc ggt tcc cag4486

Ser Gln Glu Ile Leu vai Ser Asp Leu Ile Thr Gln Val Gly Ser Gln315 320 325

ate gcc gat acc ctc ggc ate acg gac ate gac gcc aac acc cag caa 4534Ile Ala Asp Thr Leu Gly Ile Thr Asp Ile Asp Ala Asn Thr Gln Gln

330 335 340

cag ctc acg gag ctg ate ggc aac ctc ttc gtg aac ctc aat tcc caa 4582Gln Leu Thr Glu Leu Ile Gly Asn Leu Phe Val Asn Leu Asn Ser Gln345 350 355

gtt cag gag tac ate tac ttc tac gag gag aag gag aag cag acc tcc 4630Val Gln Glu Tyr Ile Tyr Phe Tyr Glu Glu Lys Glu Lys Gln Thr ser360 365 370

tac cgc tac aac ate ctc ttc gtg ttc gaa aag gag tcg ttc ate acc 4678Tyr Arg Tyr Asn Ile Leu Phe Val Phe Glu Lys Glu Ser Phe Ile Thr375 380 385 390

att ctg cca atg ggc ttc gac gtg acc gtg aac acg aac aag gag gcc 4726Ile Leu Pro Met Gly Phe Asp Val Thr Val Asn Thr Asn Lys Glu Ala395 400 405

gtc ctg aag ctg acc ccg aag gac aag gtt acc tac ggc cac gtc age 4774Val Leu Lys Leu Thr Pro Lys Asp Lys Val Thr Tyr Gly His Val Ser410 415 420

gtc aag gcc ctc aac ate ate cag ctc att acg gag gac aag ttc aac 4822Val Lys Ala Leu Asn Ile Ile Gln Leu Ile Thr Glu Asp Lys Phe Asn425 430 435

ttc ctc gea acc ctc aag aag gct ctc aag acc ctg tga tga 4864

Phe Leu Ala Thr Leu Lys Lys Ala Leu Lys Thr Leu440 445 450

gaattctgca tgcgtttgga cgtatgctca ttcaggttgg agccaatttg gttgatgtgt 4924gtgcgagttc ttgcgagtct gatgagacat ctctgtattg tgtttctttc cccagtgttt 4984tctgtacttg tgtaatcggc taatcgccaa cagattcggc gatgaataaa tgagaaataa 5044attgttctga ttttgagtgc aaaaaaaaag gaatt 5079

<210> 32<211> 232<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Construto Sintético<400> 32

Met Ala Phe Phe Asn Arg vai Ile Thr Leu Thr Val Pro ser ser Asp1 5 10 15

Val Val Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro Gln Tyr Val Asn

20 25 30

Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly Ser35 40 45

Thr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile50 55 60

Pro Gln Ala Ala Val Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr Val Gln Gln Gly65 70 75 80

Thr Val Gln Val Ser vai Met Ile Asp Lys Ile vai Asp Ile Met Lys85 90 95

Asn vai Leu Ser Ile vai Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln vai100 105 110Thr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn Ser Gln Glu Ser

115 120 125

Glu Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr Ser Tyr130 135 140

Tyr Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly Val145 150 155 160

Met Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser Val Asp Ile Glu Lys

165 170 175

Glu Lys vai Leu Phe vai Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala Val 180 185 190

Thr vai Lys Ala Ile Asn vai vai Gln Ala Leu Gln Ser Ser Arg Asp

195 200 205

Ser Lys Val Val Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys210 215 220

Arg His Lys Ile Cys Ser Asn ser225 230

<210> 33<211> 218<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Construto Sintético<400> 33

Met Ser Lys Glu Ile Arg Leu Asn Leu Ser Arg Glu Ser Gly Ala Asp1 5 10 15

Leu Tyr Leu Lys Ile Leu Ala Phe Val Lys Pro Glu His Phe Phe Gln

20 25 30

Ala Tyr Leu Leu Cys Arg Glu Phe Glu Ser Ile Val Asp Pro Thr Thr35 40 45

30 Arg Glu ser Asp Phe Asp Lys Thr Leu Thr Ile Val Lys ser Asp Ser50 55 60

Thr Leu vai Thr Val Gly Thr Met Asn Thr Lys Leu vai Asn ser Gln65 70 75 80

Glu Ile Leu vai Ser Asp Leu Ile Thr Gln vai Gly Ser Gln Ile Ala

85 90 95

Asp Thr Leu Gly Ile Thr Asp Ile Asp Ala Asn Thr Gln Gln Gln Leu100 105 110

Thr Glu Leu Ile Gly Asn Leu Phe vai Asn Leu Asn Ser Gln Val Gln

115 120 125

Glu Tyr Ile Tyr Phe Tyr Glu Glu Lys Glu Lys Gln Thr Ser Tyr Arg130 135 140

Tyr Asn Ile Leu Phe vai Phe Glu Lys Glu Ser Phe Ile Thr Ile Leu145 150 155 160

Pro Met Gly Phe Asp Val Thr vai Asn Thr Asn Lys Glu Ala Val Leu

165 170 175

Lys Leu Thr Pro Lys Asp Lys vai Thr Tyr Gly His vai ser Val Lys180 185 190

Ala Leu Asn Ile Ile Gln Leu Ile Thr Glu Asp Lys Phe Asn Phe Leu

195 200 205

Ala Thr Leu Lys Lys Ala Leu Lys Thr Leu210 215

<210> 34<211> 2148<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência sintérica; cassette de expressão emPMON70513 codificando TIC809

<220>

<221> misc_feature

<223> pMON70513 cassette de expressão da planta<220>

<221> promotor<222> (1)..(614)<223> e35S <220> <221> 5* UTR <222> (650)..(710) <223> CAB líder de trigo <220> <221> íntron <222> (727)..(1206) <223> actina de arroz <220> <221> CDS <222> (1216)..(1917) <223> TIC809 <220> <221> terminador <222> (1939)..(2148) <223> trigo Hspl7 <400> 34 ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gaaacctcct cggattccat tgcccagcta aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt cctctgccga cagtggtccc aaagatggac aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc ttcatttgga gaggacacgc tgacaagctg acacactcaa gccacactat tggagaacac aggcctccgc cgccgccggt aaccaccccg ttccgtctcg gtctcgatct ttggccttgg

aatatccgga aacctcctcg gattccattg 60agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 300tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 360gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 420ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 480tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 540aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 600actctagcag atcctctaga accatcttcc 660acagggacaa cacaccataa gatccaaggg 720CCCCtCtCCt CtttCtttCt ccgttttttt 780tagtttgggt gggcgagagg cggcttcgtg 840cgcgcccaga tcggtgcgcg ggaggggcgg gatctcgcgg ctggggctct cgccggcgtg 900gatccggccc ggatctcgcg gggaatgggg ctctcggatg tagatctgcg atccgccgtt 960gttgggggag atgatggggg gtttaaaatt tccgccgtgc taaacaagat caggaagagg 1020ggaaaagggc actatggttt atatttttat atatttctgc tgcttcgtca ggcttagatg 1080tgctagatct ttctttcttc tttttgtggg tagaatttga atccctcagc attgttcatc 1140ggtagttttt cttttcatga tttgtgacaa atgcagcctc gtgcggagct tttttgtagg 1200tagaagtgat caacc atg gcc ttc ttc aac cgg gtg ate acc ctc acg gtg 1251

Met Ala Phe Phe Asn Arg vai Ile Thr Leu Thr vai1 5 10

ccg tcg tca gac gtg gtc aac tac tcg gag ate tac cag gtg gct cct 1299Pro Ser Ser Asp Val Val Asn Tyr ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro

15 20 25

cag tat gtc aac cag gcc ctg acc ctg gcc aag tac ttc cag ggc gcc 1347Gln Tyr vai Asn Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala 30 35 40

gcc aac gac ate ccg cag gcc gcg gtg gtc aac acc ctg aac cag acc 1443Ala Asn Asp Ile Pro Gln Ala Ala vai Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr

65 70 75

gtc cag cag ggg acc gtc cag gtc age gtc atg ate gac aag ate gtg 1491Val Gln Gln Gly Thr vai Gln Val Ser vai Met Ile Asp Lys Ile vai80 85 90

gac ate atg aag aat gtc ctg tcc ate gtg ata gac aac aag aag ttt 1539Asp Ile Met Lys Asn vai Leu Ser Ile vai Ile Asp Asn Lys Lys Phe

95 100 105

tgg gat cag gtc acg gct gcc ate acc aac acc ttc acg aac ctg aac 1587Trp Asp Gln vai Thr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn 110 115 120

160 165 170

gac ate gag aag gag aag gtc ctg ttc gtg acc ate aag gac act gag 1779Asp lie Glu Lys Glu Lys Val Leu Phe vai Thr Ile Lys Asp Thr Glu175 180 185

aat tac gcc gtc acc gtc aag gcg ate aac gtg gtc cag gea ctc cag 1827Asn Tyr Ala vai Thr vai Lys Ala Ile Asn vai Val Gln Ala Leu Gln

190 195 200

tet age agg gat tet aag gtg gtt gat gcg ttc aaa tcg cca cgg cac 1875Ser Ser Arg Asp Ser Lys Val Val Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His205 210 215 220

tta ccc cgg aag agg cat aag att tgc tet aac tcg tga tga 1917

Leu Pro Arg Lys Arg His Lys Ile Cys Ser Asn Ser225 230

attcggatcc aagggcgaat tctgcatgcg tttggacgta tgctcattca ggttggagcc 1977aatttggttg atgtgtgtgc gagttcttgc gagtctgatg agacatctct gtattgtgtt 2037tctttcccca gtgttttctg tacttgtgta atcggctaat cgccaacaga ttcggcgatg 2097aataaatgag aaataaattg ttctgatttt gagtgcaaaa aaaaaggaat t 2148

<210> 35<211> 232<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Construto Sintético<400> 35

Met Ala Phe Phe Asn Arg vai Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp15 10 15vai Val Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln vai Ala Pro Gln Tyr vai Asn

20 25 30

Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly Ser35 40 45

Thr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile50 55 60

Pro Gln Ala Ala vai vai Asn Thr Leu Asn Gln Thr vai Gln Gln Gly65 70 75 80

Thr vai Gln Val Ser vai Met Ile Asp Lys Ile vai Asp Ile Met Lys85 90 95

Asn vai Leu Ser Ile vai Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln vai

100 105 110

Thr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn ser Gln Glu Ser115 120 125

Glu Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr Ser Tyr130 135 140

Tyr Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly Val145 150 155 160

Met Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser Val Asp Ile Glu Lys165 170 175

Glu Lys vai Leu Phe vai Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala vai

180 185 190

Thr Val Lys Ala Ile Asn vai Val Gln Ala Leu Gln ser ser Arg Asp195 200 205

Ser Lys Val vai Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys210 215 220

Arg His Lys Ile Cys Ser Asn Ser225 230

<210> 36<211> 2541<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência sintética; cassette de expressão wmPMON70514 codificando TIC809

<220>

<221> misc_feature

<223> pMON70514 cassette de expressão de planta<220>

<221> promotor

<222> (1)..(614)

<223> e35S<220>

<221> 5'UTR

<222> (650)..(710)

<223> CAB "líder de trigo<220>

<221> íntron

<222> (727)..(1206)

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<221> transit_peptide

<222> (1230)..(1270)

<223> Zm RbcS<220>

<221> íntron

<222> (1371)..(1539)

<223> Zm RbcS<220>

<221> transit_peptide

<222> (1540)..(1626)

<223> Zm RbcS<220>

<221> CDS<222> (1627)..(2328) <223> TIC809 <220> <221> terminadoγ <222> (2332)..(2541) <223> trigo Hspl7 <400> 36 ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gaaacctcct cggattccat tgcccagcta aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt cctctgccga cagtggtccc aaagatggac aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc ttcatttgga gaggacacgc tgacaagctg acacactcaa gccacactat tggagaacac aggcctccgc cgccgccggt aaccaccccg ttccgtctcg gtctcgatct ttggccttgg cgcgcccaga tcggtgcgcg ggaggggcgg gatccggccc ggatctcgcg gggaatgggg ggaaaagggc actatggttt atatttttat tgctagatct ttctttcttc tttttgtggg ggtagttttt cttttcatga tttgtgacaa tagaagtgat caacctctag aggatcagca ccaccgccgt cgctccgttc ctggggctca gctcctccag aagcctcggc aacgtcagca caaatgcatc ctagctagta gttctttgca taggaaggga actgatgatc catgcatgga catttcccaa acgaaccgaa aacaccgtacaatatccgga aacctcctcg gattccattg 60agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 120tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 180ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 240gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 300tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 360gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 420ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 480tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 540aagacccttc ctctatataa ggaagttcat 600actctagcag atcctctaga accatcttcc 660acagggacaa cacaccataa gatccaaggg 720cccctctcct ctttctttct ccgttttttt 780tagtttgggt gggcgagagg cggcttcgtg 840gatctcgcgg ctggggctct cgccggcgtg 900ctctcggatg tagatctgcg atccgccgtt 960atatttctgc tgcttcgtca ggcttagatg 1080tagaatttga atccctcagc attgttcatc 1140atgcagcctc gtgcggagct tttttgtagg 1200tggcgcccac cgtgatgatg gcctcgtcgg 1260agtccaccgc cagcctcccc gtcgcccgcc 1320acggcggaag gatccggtgc atgcaggtaa 1380ttgcagcagc tgcagctagc gagttagtaa 1440ctgatgtgtg ttgcccatcc catcccatcc 1500tacgtgcagg tgtggcccta cggcaacaag 1560aagttcgaga cgctgtcgta cctgccgccg ctgtcgaccg gcgggcgcat ccgctgcatg 1620caggcc atg gcc ttc ttc aac cgg gtg ate acc ctc acg gtg ccg tcg 1668Met Ala Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser15 10

tca gac gtg gtc aac tac tcg gag ate tac cag gtg gct cct cag tat 1716Ser Asp vai vai Asn Tyr ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro Gln Tyr15 20 25 30

50 55 60

gac ate ccg cag gcc gcg gtg gtc aac acc ctg aac cag acc gtc cag 1860Asp Ile Pro Gln Ala Ala Val vai Asn Thr Leu Asn Gln Thr vai Gln65 70 75

cag ggg acc gtc cag gtc age gtc atg ate gac aag ate gtg gac ate 1908Gln Gly Thr vai Gln vai Ser vai Met Ile Asp Lys Ile Val Asp Ile80 85 90

atg aag aat gtc ctg tcc ate gtg ata gac aac aag aag ttt tgg gat 1956Met Lys Asn Val Leu Ser Ile Val Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp95 100 105 110

cag gtc acg gct gcc ate acc aac acc ttc acg aac ctg aac age cag 2004Gln vai Thr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn ser Gln115 120 125

gag tcg gag gcc tgg ate ttc tat tac aag gag gac gcc cac aag acg 2052Glu Ser Glu Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr

130 135 140

ggc gtg atg gcc acg ctg ccc ate gcc ttc gac ate agt gtg gac ate 2148Gly vai Met Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser vai Asp Ile

160 165 170

gcc gtc acc gtc aag gcg ate aac gtg gtc cag gea ctc cag tet age 2244Ala vai Thr vai Lys Ala Ile Asn vai Val Gln Ala Leu Gln Ser ser

195 200 205

cgg aag agg cat aag att tgc tet aac tcg tga tga attctgcatg 2338

Arg Lys Arg His Lys Ile Cys Ser Asn ser225 230

cgtttggacg tatgctcatt caggttggag ccaatttggt tgatgtgtgt gcgagttctt 2398gcgagtctga tgagacatct ctgtattgtg tttctttccc cagtgttttc tgtacttgtg 2458taatcggcta atcgccaaca gattcggcga tgaataaatg agaaataaat tgttctgatt 2518ttgagtgcaa aaaaaaagga att 2541

<210> 37<211> 232<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Construto Sintético<400> 37

Met Ala Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp1 5 10 15

Val Val Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro Gln Tyr Val Asn20 25 30

Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly Ser35 40 45

Thr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile50 55 60

Pro Gln Ala Ala Val Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr vai Gln Gln Gly65 70 75 80

Thr Val Gln Val Ser vai Met Ile Asp Lys Ile Val Asp Ile Met Lys85 90 95

Asn vai Leu Ser Ile Val Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln Val

100 105 110

Thr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn Ser Gln Glu Ser115 120 125

Glu Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr Ser Tyr130 135 140

Tyr Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly vai145 150 155 160

Met Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser Val Asp Ile Glu Lys165 170 175

Glu Lys vai Leu Phe vai Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala vai

180 185 190

Thr Val Lys Ala Ile Asn vai vai Gln Ala Leu Gln Ser ser Arg Asp195 200 205

Ser Lys vai vai Asp Ala Phe Lys ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys210 215 220

Arg His Lys Ile Cys ser Asn ser225 230

<210> 38<211> 4083<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência sintética; cassette de expressão empM0N64144 codificando TIC809

<220>

<221> misc_feature<223> ρΜ0Ν64144 cassette de expressão de planta<220><221> promotor<222> (1)..(1844)<223> arroz Rcc3<220><221> 5'UTR<222> (1845)..(1943)<223> arroz Rcc3<220><221> íntron<222> (1952)..(2755)<223> HSP70<220><221> transit_peptide<222> (2772)..(2912)<223> Zm RbcS<220><221> íntron<222> (2913)..(3081)<223> Zm RbcS<220><221> transit_peptide<222> (3082)..(3168)

<223> Zm RbcS<220><221> CDS<222> (3169)..(3870)<223> TIC809<220><221> terminador<222> (3874)..(4083)<223> trigp Hspl7 <400> 38 gcaatcaacc aacatatact gaatatggga aagtttcttt tagcttttct aaattaagta 60ctgattctta aacttaagtg agaatctagc ctgttcaggg gcgacggcta aaggacatag 120caccactagt ctacgcgatt gcaaaaaaga agaatgcaag cctgcaacaa gtatcgcttt 180cccgaccaat ggttggttga cctcggtttg ccggtaacct caggctggac gacagaacta 240attagccaac ttgtcaatgt ctagggtgct gttcatagcc tgcagttgac agagtacgaa 300aaggacaaga tcacatggaa gctaactagt cacggcgaat acatgacgac atcggcctac 360aacgcacaac ttcttggcat aaaagcttca atttcaatgc ccctatctgg aagccctagg 420cgccgcgcaa atgtaaaaca ttcgcttcgc ttggcttgtt atccaaaata gagtatggac 480ctccgacaga ttggcaaccc gtgggtaatc gaaaatggct ccatctgccc ctttgtcgaa 540ggaatcagga aacggccctc acctcctggc ggagtgtaga tatgtgaaag aatctaggcg 600acacttgcag actggacaac atgtgaacaa ataagaccaa cgttatggca acaagcctcg 660acgctactca agtggtggga ggccaccgca tgttccaacg aagcgccaaa gaaagccttg 720cagactctaa tgctattagt cgcctaggat atttggaatg aaaggaaccg cagagttttt 780cagcaccaag agcttccggt ggctagtctg atagccaaaa ttaaggagga tgccaaaaca 840tgggtcttgg cgggcgcgaa acaccttgat aggtggctta ccttttaaca tgttcgggcc 900aaaggccttg agacggtaaa gttttctatt tgcgcttgcg catgtacaat tttattcctc 960tattcaatga aattggtggc tcactggttc attaaaaaaa aaagaatcta gcctgttcgg 1020gaagaagagg attttgttcg tgagagagag agagagagag agagagagag agagagagaa 1080ggaggaggag gattttcagg cttcgcattg cccaacctct gcttctgttg gcccaagaag 1140aatcccaggc gcccatgggc tggcagttta ccacggacct acctagccta ccttagctat 1200ctaagcgggc cgacctagta gccacgtgcc tagtgtagat taaagttgcc gggccagcag 1260gaagccacgc tgcaatggca tcttcccctg tccttcgcgt acgtgaaaac aaacccaggt 1320aagcttagaa tcttcttgcc cgttggactg ggacacccac caatcccacc atgccccgat 1380attcctccgg tctcggttca tgtgatgtcc tctcttgtgt gatcacggag caagcattct 1440taaacggcaa aagaaaatca ccaacttgct cacgcagtca cgctgcaccg cgcgaagcga 1500cgcccgatag gccaagatcg cgagataaaa taacaaccaa tgatcataag gaaacaagcc 1560cgcgatgtgt cgtgtgcagc aatcttggtc atttgcggga tcgagtgctt cacagctaac 1620caaatattcg gccgatgatt taacacatta tcagcgtaga tgtacgtacg atttgttaat 1680taatctacga gccttgctag ggcaggtgtt ctgccagcca atccagatcg ccctcgtatg 1740cacgctcaca tgatggcagg gcagggttca catgagctct aacggtcgat taattaatcc 1800cggggctcga ctataaatac ctccctaatc ccatgatcaa aaccatctca agcagcctaa 1860tcatctccag ctgatcaaga gctcttaatt agctagctag tgattagctg cgcttgtgat 1920cgatcgatct cgggtacgta gcaatagatc taccgtcttc ggtacgcgct cactccgccc 1980tctgcctttg ttactgccac gtttctctga atgctctctt gtgtggtgat tgctgagagt 2040ggtttagctg gatctagaat tacactctga aatcgtgttc tgcctgtgct gattacttgc 2100cgtcctttgt agcagcaaaa tatagggaca tggtagtacg aaacgaagat agaacctaca 2160cagcaatacg agaaatgtgt aatttggtgc ttagcggtat ttatttaagc acatgttggt 2220gttatagggc acttggattc agaagtttgc tgttaattta ggcacaggct tcatactaca 2280tgggtcaata gtatagggat tcatattata ggcgatacta taataatttg ttcgtctgca 2340gagcttatta tttgccaaaa ttagatattc ctattctgtt tttgtttgtg tgctgttaaa 2400ttgttaacgc ctgaaggaat aaatataaat gacgaaattt tgatgtttat ctctgctcct 2460ttattgtgac cataagtcaa gatcagatgc acttgtttta aatattgttg tctgaagaaa 2520taagtactga cagtattttg atgcattgat ctgcttgttt gttgtaacaa aatttaaaaa 2580taaagagttt cctttttgtt gctctcctta cctcctgatg gtatctagta tctaccaact 2640gacactatat tgcttctctt tacatacgta tcttgctcga tgccttctcc ctagtgttga 2700ccagtgttac tcacatagtc tttgctcatt tcattgtaat gcagatacca agcggcctct 2760agaggatcag catggcgccc accgtgatga tggcctcgtc ggccaccgcc gtcgctccgt 2820tcctggggct caagtccacc gccagcctcc ccgtcgcccg ccgctcctcc agaagcctcg 2880gcaacgtcag caacggcgga aggatccggt gcatgcaggt aacaaatgca tcctagctag 2940tagttctttg cattgcagca gctgcagcta gcgagttagt aataggaagg gaactgatga 3000tccatgcatg gactgatgtg tgttgcccat cccatcccat cccatttccc aaacgaaccg 3060aaaacaccgt actacgtgca ggtgtggccc tacggcaaca agaagttcga gacgctgtcg 120tacctgccgc cgctgtcgac cggcgggcgc atccgctgca tgcaggcc atg gcc ttc 3177

Met Ala Phe

1

ttc aac cgg gtg ate acc ctc acg gtg ccg tcg tca gac gtg gtc aac 3225Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp Val Val Asn

5 10 15

tac tcg gag ate tac cag gtg gct cct cag tat gtc aac cag gcc ctg 3273Tyr ser Glu Ile Tyr Gln vai Ala Pro Gln Tyr Val Asn Gln Ala Leu20 25 30 35

acc ctg gcc aag tac ttc cag ggc gcc ate gac ggc age acc ctg agg 3321Thr Leu

ttc gacPhe Asp

gcg gtgAla vai

gtc agevai Ser

85tcc ateSer Ile100

ate accIle Thr

ate ttcIle Phe

ate etcIle Leu

ctg cccLeu Pro165ctg ttcLeu Phe180

gcg ateAla Ile

Ala Lys Tyr40

ttc gag aagPhe Glu Lys55

gtc aac accvai Asn Thr70

gtc atg atevai Met lie

gtg ata gacvai Ile Asp

aac acc ttcAsn Thr Phe120

tat tac aagTyr Tyr Lys

135ttc gcc atePhe Ala Ile150

ate gcc ttclie Ala Phe

gtg acc atevai Thr Ile

aac gtg gtcAsn vai vai200

Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly Ser45

gcc aac gac ateAla Asn Asp Ile

gcg ttaAla Leu

ctg aacLeu Asn

gac aagAsp Lys90

aac aagAsn Lys105

acg aacThr Asn

gag gacGlu Asp

cag gacGln Asp

gac ateAsp Ile170aag gacLys Asp185

cag geaGln Ala

cag ateGln Ile60

cag accGln Thr75

ate gtgIle Val

aag tttLys Phe

ctg aacLeu Asn

gcc cacAla His140gaa gagGlu Glu155

agt gtgSer Val

act gagThr Glu

ctc cagLeu Gln

gtc cagvai Gln

gac ateAsp Ile

tgg gatTrp Asp110age cagSer Gln125

aag acgLys Thr

acg ggtThr Gly

gac ateAsp lie

aat tacAsn Tyr190tet ageSer Ser205

cag gggGln Gly80

atg aagMet Lys95

cag gtcGln Val

gag tcgGlu Ser

tcc tacSer Tyr

ggc gtgGly vai160gag aagGlu Lys175

gcc gtcAla vai

agg gatArg Asp

Thr Leu Arg50

ccg cag gccPro Gln Ala65

acc gtc cagThr Val Gln

aat gtc ctgAsn vai Leu

acg gct gccThr Ala Ala115

gag gcc tggGlu Ala Trp

130tat tac aacTyr Tyr Asn145

atg gcc acgMet Ala Thr

gag aag gtcGlu Lys Val

acc gtc aagThr vai Lys195

tet aag gtgSer Lys Val210

3369

3417

3465

3513

3561

3609

3657

3705

3753

3801gtt gat gcg ttc aaa tcg cca cgg cac tta ccc cgg aag agg cat aag 3849Val Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys Arg His Lys

215 220 225

att tgc tct aac tcg tga tga attctgcatg cgtttggacg tatgctcatt 3900Ile Cys Ser Asn ser230

caggttggag ccaatttggt tgatgtgtgt gcgagttctt gcgagtctga tgagacatct 3960ctgtattgtg tttctttccc cagtgttttc tgtacttgtg taatcggcta atcgccaaca 4020gattcggcga tgaataaatg agaaataaat tgttctgatt ttgagtgcaa aaaaaaagga 4080att 4083

<210> 39<211> 232<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Construto Sintético<400> 39

Met Ala Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp 10 15

Val Val Asn Tyr ser Glu Ile Tyr Gln vai Ala Pro Gln Tyr Val Asn

20 25 30

Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly ser

40 45

Thr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile25 50 55 60

Pro Gln Ala Ala vai Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr Val Gln Gln Gly65 70 75 80

Thr vai Gln vai ser vai Met Ile Asp Lys Ile Val Asp Ile Met Lys85 90 95

Asn Val Leu ser Ile Val Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln Val

100 105 110

Thr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn Ser Gln Glu Ser115 120 125

Glu Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr ser Tyr

130 135 140

Tyr Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly vai 145 150 155 160

Met Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile ser Val Asp Ile Glu Lys

165 170 175

Glu Lys vai Leu Phe Val Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala Val180 185 190

Thr vai Lys Ala Ile Asn Val Val Gln Ala Leu Gln Ser Ser Arg Asp195 200 205

Ser Lys vai Val Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys

210 215 220

Arg His Lys Ile Cys Ser Asn ser 225 230

<210> 40<211> 6641<212> DNA

<213> Seqüência Artificial <220>

<223> Seqüência sintética; cassettes de expressão emPMON64150 codificando TIC809 e TIC810

<220>

<221> misc_feature <223> pMON64150 primeiro e segundo cassettes de expressãode planta

<220>

<221> promotor<222> (1)..(1844) <223> arroz Rcc3<220>

<221> 5'UTR<222> (1845)..(1943)

<223> Rcc3 lider de arroz<220>

<221> íntron

<222> (1952)..(2755)

<223> HSP70 intron<220>

<221> transit_peptide

<222> (2772)..(2912)

<223> Zm RbcS<220>

<221> íntron

<222> (2913)..(3081)

<223> Zm RbcS<220>

<221> transit_peptide

<222> (3082)..(3168)

<223> Zm RbcS<220>

<221> CDS

<222> (3169)..(3870)

<223> TIC809<220>

<221> terminador

<222> (3874)..(4083)

<223> trigo Hspl7<220>

<221> promotor

<222> (4139)..(4750)

<223> e35S<220>

<221> 5'UTR<222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>gcaatcaacc

(4751)..C4759)Iider

5'UTR

(4786)..(4846)CAB líder de trigo 1

íntron

(4863)..(5342)actina de arroz

transit_peptide(5366)..(5506)Zm.RbcS

íntron

(5507)..(5676)zm.RbcS

transit_peptide(5677)..(5766)Zm RbcS

CDS

(5767)..(6426)TIC810

terminador(6432)..(6641)trigo Hspl740

aacatatact gaatatggga aagtttcttt tagcttttct aaattaagta

60ctgattctta aacttaagtg agaatctagccaccactagt ctacgcgatt gcaaaaaagacccgaccaat ggttggttga cctcggtttgattagccaac ttgtcaatgt ctagggtgctaaggacaaga tcacatggaa gctaactagtaacgcacaac ttcttggcat aaaagcttcacgccgcgcaa atgtaaaaca ttcgcttcgcctccgacaga ttggcaaccc gtgggtaatcggaatcagga aacggccctc acctcctggcacacttgcag actggacaac atgtgaacaaacgctactca agtggtggga ggccaccgcacagactctaa tgctattagt cgcctaggatcagcaccaag agcttccggt ggctagtctgtgggtcttgg cgggcgcgaa acaccttgataaaggccttg agacggtaaa gttttctatttattcaatga aattggtggc tcactggttcgaagaagagg attttgttcg tgagagagagggaggaggag gattttcagg cttcgcattgaatcccaggc gcccatgggc tggcagtttactaagcgggc cgacctagta gccacgtgccgaagccacgc tgcaatggca tcttcccctgaagcttagaa tcttcttgcc cgttggactgattcctccgg tctcggttca tgtgatgtcctaaacggcaa aagaaaatca ccaacttgctcgcccgatag gccaagatcg cgagataaaacgcgatgtgt cgtgtgcagc aatcttggtccaaatattcg gccgatgatt taacacattataatctacga gccttgctag ggcaggtgttcacgctcaca tgatggcagg gcagggttcacggggctcga ctataaatac ctccctaatctcatctccag ctgatcaaga gctcttaattcgatcgatct cgggtacgta gcaatagatc

ctgttcaggg gcgacggcta aaggacatag 120agaatgcaag cctgcaacaa gtatcgcttt 180ccggtaacct caggctggac gacagaacta 240gttcatagcc tgcagttgac agagtacgaa 300cacggcgaat acatgacgac atcggcctac 360atttcaatgc ccctatctgg aagccctagg 420ttggcttgtt atccaaaata gagtatggac 480gaaaatggct ccatctgccc ctttgtcgaa 540ggagtgtaga tatgtgaaag aatctaggcg 600ataagaccaa cgttatggca acaagcctcg 660tgttccaacg aagcgccaaa gaaagccttg 720atttggaatg aaaggaaccg cagagttttt 780atagccaaaa ttaaggagga tgccaaaaca 840aggtggctta ccttttaaca tgttcgggcc 900tgcgcttgcg catgtacaat tttattcctc 960attaaaaaaa aaagaatcta gcctgttcgg 1020agagagagag agagagagag agagagagaa 1080cccaacctct gcttctgttg gcccaagaag 1140ccacggacct acctagccta ccttagctat 1200tagtgtagat taaagttgcc gggccagcag 1260tccttcgcgt acgtgaaaac aaacccaggt 1320ggacacccac caatcccacc atgccccgat 1380tctcttgtgt gatcacggag caagcattct 1440cacgcagtca cgctgcaccg cgcgaagcga 1500taacaaccaa tgatcataag gaaacaagcc 1560atttgcggga tcgagtgctt cacagctaac 1620tcagcgtaga tgtacgtacg atttgttaat 1680ctgccagcca atccagatcg ccctcgtatg 1740catgagctct aacggtcgat taattaatcc 1800ccatgatcaa aaccatctca agcagcctaa 1860agctagctag tgattagctg cgcttgtgat 1920taccgtcttc ggtacgcgct cactccgccc 1980tctgcctttg ttactgccac gtttctctga atgctctctt gtgtggtgat tgctgagagt 2040ggtttagctg gatctagaat tacactctga aatcgtgttc tgcctgtgct gattacttgc 2100cgtcctttgt agcagcaaaa tatagggaca tggtagtacg aaacgaagat agaacctaca 2160cagcaatacg agaaatgtgt aatttggtgc ttagcggtat ttatttaagc acatgttggt 2220gttatagggc acttggattc agaagtttgc tgttaattta ggcacaggct tcatactaca 2280tgggtcaata gtatagggat tcatattata ggcgatacta taataatttg ttcgtctgca 2340gagcttatta tttgccaaaa ttagatattc ctattctgtt tttgtttgtg tgctgttaaa 2400ttgttaacgc ctgaaggaat aaatataaat gacgaaattt tgatgtttat ctctgctcct 2460ttattgtgac cataagtcaa gatcagatgc acttgtttta aatattgttg tctgaagaaa 2520taagtactga cagtattttg atgcattgat ctgcttgttt gttgtaacaa aatttaaaaa 2580taaagagttt cctttttgtt gctctcctta cctcctgatg gtatctagta tctaccaact 2640gacactatat tgcttctctt tacatacgta tcttgctcga tgccttctcc ctagtgttga 2700ccagtgttac tcacatagtc tttgctcatt tcattgtaat gcagatacca agcggcctct 2760agaggatcag catggcgccc accgtgatga tggcctcgtc ggccaccgcc gtcgctccgt 2820tcctggggct caagtccacc gccagcctcc ccgtcgcccg ccgctcctcc agaagcctcg 2880gcaacgtcag caacggcgga aggatccggt gcatgcaggt aacaaatgca tcctagctag 2940tagttctttg cattgcagca gctgcagcta gcgagttagt aataggaagg gaactgatga 3000tccatgcatg gactgatgtg tgttgcccat cccatcccat cccatttccc aaacgaaccg 3060aaaacaccgt actacgtgca ggtgtggccc tacggcaaca agaagttcga gacgctgtcg 3120tacctgccgc cgctgtcgac cggcgggcgc atccgctgca tgcaggcc atg gcc ttc 3177

Met Ala Phe1

ttc aac cgg gtg ate acc ctc acg gtg ccg tcg tca gac gtg gtc aac 3225Phe Asn Arg vai Ile Thr Leu Thr vai Pro Ser Ser Asp Val Val Asn1 5 10 15

tac tcg gag ate tac cag gtg gct cct cag tat gtc aac cag gcc ctg 3273

Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln vai Ala Pro Gln Tyr Val Asn Gln Ala Leu

20 25 30 35

acc ctg gcc aag tac ttc cag ggc gcc ate gac ggc age acc ctg agg 3321

Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly Ser Thr Leu Arg

40 45 50

ttc gac ttc gag aag gcg tta cag ate gcc aac gac ate ccg cag gcc 3369Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile Pro Gln Ala

55 60 65

gcg gtg gtc aac acc ctg aac cag acc gtc cag cag ggg acc gtc cag 3417Ala vai vai Asn Thr Leu Asn Gln Thr vai Gln Gln Gly Thr Val Gln 70 75 80

gtc age gtc atg ate gac aag ate gtg gac ate atg aag aat gtc ctg 3465Val Ser Val Met Ile Asp Lys Ile vai Asp Ile Met Lys Asn vai Leu

85 90 95

tcc ate gtg ata gac aac aag aag ttt tgg gat cag gtc acg gct gcc 3513Ser Ile Val Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln Val Thr Ala Ala100 105 110 115

ate acc aac acc ttc acg aac ctg aac age cag gag tcg gag gcc tgg 3561Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn Ser Gln Glu Ser Glu Ala Trp120 125 130

ate ttc tat tac aag gag gac gcc cac aag acg tcc tac tat tac aac 3609Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr Ser Tyr Tyr Tyr Asn

135 140 145

ate etc ttc gcc ate cag gac gaa gag acg ggt ggc gtg atg gcc acg 3657Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly Val Met Ala Thr150 155 160

ctg ccc ate gcc ttc gac ate agt gtg gac ate gag aag gag aag gtc 3705Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser Val Asp Ile Glu Lys Glu Lys vai

165 170 175

ctg ttc gtg acc ate aag gac act gag aat tac gcc gtc acc gtc aag 3753Leu Phe vai Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala Val Thr Val Lys180 185 190 195

gcg ate aac gtg gtc cag gea etc cag tet age agg gat tet aag gtg 3801Ala Ile Asn vai vai Gln Ala Leu Gln Ser Ser Arg Asp Ser Lys vai200 205 210

gtt gat gcg ttc aaa tcg cca cgg cac tta ccc cgg aag agg cat aag 3849vai Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys Arg His Lys215 220 225att tgc tct aac tcg tga tga attctgcatg cgtttggacg tatgctcatt 3900Ile Cys Ser Asn Ser230

caggttggag ccaatttggt tgatgtgtgt gcgagttctt gcgagtctga tgagacatct 3960 ctgtattgtg tttctttccc cagtgttttc tgtacttgtg taatcggcta atcgccaaca 4020 gattcggcga tgaataaatg agaaataaat tgttctgatt ttgagtgcaa aaaaaaagga 4080 attagatctg tgtgtgtttt ttggatcccc ggggcggccg cgttaacaag cttctgcagg 4140 tccgattgag acttttcaac aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc 4200 agctatctgt cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca 4260 tcattgcgat aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga 4320 tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa 4380 gcaagtggat tgatgtgatg gtccgattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa 4440 cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga 4500 aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc 4560 tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga 4620 cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga 4680 tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga CCCttCCtCt atataaggaa gttcatttca 4740 tttggagagg acacgctgac aagctgactc tagcagatcc tctagaacca tcttccacac 4800 actcaagcca cactattgga gaacacacag ggacaacaca ccataagatc caagggaggc 4860 ctccgccgcc gccggtaacc accccgcccc tctcctcttt ctttctccgt ttttttttcc 4920 gtctcggtct cgatctttgg ccttggtagt ttgggtgggc gagaggcggc ttcgtgcgcg 4980 cccagatcgg tgcgcgggag gggcgggatc tcgcggctgg ggctctcgcc ggcgtggatc 5040 cggcccggat ctcgcgggga atggggctct cggatgtaga tctgcgatcc gccgttgttg 5100 ggggagatga tggggggttt aaaatttccg ccgtgctaaa caagatcagg aagaggggaa 5160 aagggcacta tggtttatat ttttatatat ttctgctgct tcgtcaggct tagatgtgct 5220 agatctttct ttcttctttt tgtgggtaga atttgaatcc ctcagcattg ttcatcggta 5280 gtttttcttt tcatgatttg tgacaaatgc agcctcgtgc ggagcttttt tgtaggtaga 5340 agtgatcaac ctctagagga tcagcatggc gcccaccgtg atgatggcct cgtcggccac 5400 cgccgtcgct ccgttccagg ggctcaagtc caccgccagc ctccccgtcg cccgccgctc 5460 ctccagaagc ctcggcaacg tcagcaacgg cggaaggatc cggtgcatgc aggtaacaaa 5520 tgcatcctag ctagtagttc tttgcattgc agcagctgca gctagcgagt tagtaatagg 5580 aagggaactg atgatccatg catggactga tgtgtgttgc ccatcccatc ccatttccca 5640accccaaacg aaccaaaaca cacgtactac gtgcaggtgt ggccggccta cggcaacaag 5700aagttcgaga cgctgtcgta cctgccgccg ctgtcgaccg gcgggcgcat ccgctgcatg 5760caggcc atg age aaa gaa ate agg ctc aac ctt tet cgt gag age ggc 5808Met Ser Lys Glu Ile Arg Leu Asn Leu Ser Arg Glu Ser Gly235 240 245

gcc gac ctg tac ctc aag ate ctc gcc ttc gtg aag ccc gag cac ttc 5856Ala Asp Leu Tyr Leu Lys Ile Leu Ala Phe Val Lys Pro Glu His Phe

250 255 260

ttt cag gcg tac ctc ctg tgc cgc gag ttc gag age ate gtg gat cct 5904Phe Gln Ala Tyr Leu Leu Cys Arg Glu Phe Glu Ser Ile Val Asp Pro265 270 275

aca acc cgc gag tet gac ttc gac aag acg ctg acc ate gtg aag tcg 5952Thr Thr Arg Glu Ser Asp Phe Asp Lys Thr Leu Thr Ile Val Lys Ser280 285 290

gac tcc acc ctc gtg acc gtg ggc acg atg aac acc aag ctg gtc aat 6000Asp Ser Thr Leu vai Thr Val Gly Thr Met Asn Thr Lys Leu Val Asn295 300 305 310

age caa gag ate ctc gtg tcg gac ttg ate act caa gtc ggt tcc cag 6048Ser Gln Glu Ile Leu Val Ser Asp Leu Ile Thr Gln Val Gly Ser Gln315 320 325

ate gcc gat acc ctc ggc ate acg gac ate gac gcc aac acc cag caa 6096lie Ala Asp Thr Leu Gly Ile Thr Asp Ile Asp Ala Asn Thr Gln Gln

330 335 340

cag ctc acg gag ctg ate ggc aac ctc ttc gtg aac ctc aat tcc caa 6144Gln Leu Thr Glu Leu Ile Gly Asn Leu Phe vai Asn Leu Asn Ser Gln345 350 355

gtt cag gag tac ate tac ttc tac gag gag aag gag aag cag acc tcc 6192vai Gln Glu Tyr Ile Tyr Phe Tyr Glu Glu Lys Glu Lys Gln Thr Ser360 365 370

tac cgc tac aac ate ctc ttc gtg ttc gaa aag gag tcg ttc ate acc 6240Tyr Arg Tyr Asn Ile Leu Phe vai Phe Glu Lys Glu Ser Phe Ile Thr375 380 385 390att ctg cca atg ggc ttc gac gtg acc gtg aac acg aac aag gag gcc 6288Ile Leu Pro Met Gly Phe Asp vai Thr vai Asn Thr Asn Lys Glu Ala

395 400 405

gtc ctg aag ctg acc ccg aag gac aag gtt acc tac ggc cac gtc age 6336Val Leu Lys Leu Thr Pro Lys Asp Lys Val Thr Tyr Gly His Val Ser410 415 420

gtc aag gcc ctc aac ate ate cag ctc att acg gag gac aag ttc aac 6384vai Lys Ala Leu Asn lie Ile Gln Leu Ile Thr Glu Asp Lys Phe Asn425 430 435

ttc ctc gea acc ctc aag aag gct ctc aag acc ctg tga tga 6426

Phe Leu Ala Thr Leu Lys Lys Ala Leu Lys Thr Leu440 445 450

gaattctgca tgcgtttgga cgtatgctca ttcaggttgg agccaatttg gttgatgtgt 6486gtgcgagttc ttgcgagtct gatgagacat ctctgtattg tgtttctttc cccagtgttt 6546tctgtacttg tgtaatcggc taatcgccaa cagattcggc gatgaataaa tgagaaataa 6606attgttctga ttttgagtgc aaaaaaaaag gaatt 6641

<210> 41<211> 232<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Construto Sintético<400> 41

Met Ala Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp1 5 10 15

Val Val Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro Gln Tyr Val Asn

20 25 30

Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly Ser35 40 45

30 Thr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile50 55 60

Pro Gln Ala Ala Val Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr vai Gln Gln Gly65 70 75 80

Thr Val Gln vai Ser vai Met Ile Asp Lys Ile vai Asp Ile Met Lys

85 90 95

Asn Val Leu Ser Ile Val Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln Val 100 105 110

Thr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn ser Gln Glu Ser

115 120 125

Glu Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr ser Tyr130 135 140

Tyr Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly Val145 150 155 160

Met Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser Val Asp Ile Glu Lys

165 170 175

Glu Lys Val Leu Phe Val Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala Val 180 185 190

Thr Val Lys Ala Ile Asn Val Val Gln Ala Leu Gln ser Ser Arg Asp

195 200 205

Ser Lys vai Val Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys210 215 220

Arg His Lys Ile Cys ser Asn Ser225 230

<210> 42<211> 218<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Construto Sintético<400> 42

Met Ser Lys Glu Ile Arg Leu Asn Leu ser Arg Glu Ser Gly Ala Asp 1 5 10 15

Leu Tyr Leu Lys Ile Leu Ala Phe vai Lys Pro Glu His Phe Phe Gln20 25 30Ala Tyr Leu Leu Cys Arg Glu Phe Glu Ser Ile vai Asp Pro Thr Thr

35 40 45

Arg Glu Ser Asp Phe Asp Lys Thr Leu Thr Ile Val Lys Ser Asp Ser50 55 60

Thr Leu Val Thr Val Gly Thr Met Asn Thr Lys Leu Val Asn Ser Gln65 70 75 80

Glu Ile Leu vai Ser Asp Leu Ile Thr Gln vai Gly Ser Gln Ile Ala

85 90 95

Asp Thr Leu Gly Ile Thr Asp Ile Asp Ala Asn Thr Gln Gln Gln Leu100 105 110

Thr Glu Leu Ile Gly Asn Leu Phe Val Asn Leu Asn Ser Gln vai Gln

115 120 125

Glu Tyr Ile Tyr Phe Tyr Glu Glu Lys Glu Lys Gln Thr Ser Tyr Arg130 135 140

Tyr Asn Ile Leu Phe Val Phe Glu Lys Glu Ser Phe Ile Thr Ile Leu145 150 155 160

Pro Met Gly Phe Asp vai Thr vai Asn Thr Asn Lys Glu Ala vai Leu

165 170 175

Lys Leu Thr Pro Lys Asp Lys Val Thr Tyr Gly His Val ser Val Lys180 185 190

Ala Leu Asn Ile Ile Gln Leu Ile Thr Glu Asp Lys Phe Asn Phe Leu

195 200 205

Ala Thr Leu Lys Lys Ala Leu Lys Thr Leu210 215

<210> 43<211> 5813<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Seqüência sintérica; cassettes de expressão emPMON64151 codificando TIC809 e TIC810

<220><221> misc_feature

<223> ρΜΟΝ64151 primeiro e segundo cassettes de expressãode planta

<220>

<221> promotor

<222> (1)..(1844)

<223> rice Rcc3<220>

<221> 5*UTR

<222> (1845)..(1943)

<223> Rcc3 Iider de arroz<220>

<221> íntron

<222> (1952)..(2755)

<223> HSP70 intron<220>

<221> CDS

<222> (2772)..(3473)

<223> TIC809<220>

<221> terminador

<222> (3477)..(3686)

<223> trigo Hspl7<220>

<221> promotor

<222> (3724)..(4337)

<223> e35S

<220>

<221> 5'UTR

<222> (4373)..(4433)

<223> CAB lider de trigo<220><221> íntron <222> (4450)..(4929) <223> actina de arroz <220> <221> CDS <222> (4939)..(5598) <223> TIC810 <220> <221> terminador <222> (5604)..(5813) <223> trigo Hspl7 <400> 43 gcaatcaacc aacatatact gaatatggga ctgattctta aacttaagtg agaatctagc caccactagt ctacgcgatt gcaaaaaaga cccgaccaat ggttggttga cctcggtttg attagccaac ttgtcaatgt ctagggtgct aaggacaaga tcacatggaa gctaactagt aacgcacaac ttcttggcat aaaagcttca cgccgcgcaa atgtaaaaca ttcgcttcgc ctccgacaga ttggcaaccc gtgggtaatc ggaatcagga aacggccctc acctcctggc acacttgcag actggacaac atgtgaacaa acgctactca agtggtggga ggccaccgca cagactctaa tgctattagt cgcctaggat cagcaccaag agcttccggt ggctagtctg tgggtcttgg cgggcgcgaa acaccttgat aaaggccttg agacggtaaa gttttctatt tattcaatga aattggtggc tcactggttc gaagaagagg attttgttcg tgagagagag ggaggaggag gattttcagg cttcgcattg aatcccaggc gcccatgggc tggcagttta

133

aagtttcttt tagcttttct aaattaagta 60ctgttcaggg gcgacggcta aaggacatag 120agaatgcaag cctgcaacaa gtatcgcttt 180ccggtaacct caggctggac gacagaacta 240gttcatagcc tgcagttgac agagtacgaa 300cacggcgaat acatgacgac atcggcctac 360atttcaatgc ccctatctgg aagccctagg 420ttggcttgtt atccaaaata gagtatggac 480gaaaatggct ccatctgccc ctttgtcgaa 540ggagtgtaga tatgtgaaag aatctaggcg 600ataagaccaa cgttatggca acaagcctcg 660tgttccaacg aagcgccaaa gaaagccttg 720atttggaatg aaaggaaccg cagagttttt 780atagccaaaa ttaaggagga tgccaaaaca 840aggtggctta ccttttaaca tgttcgggcc 900tgcgcttgcg catgtacaat tttattcctc 960attaaaaaaa aaagaatcta gcctgttcgg 1020agagagagag agagagagag agagagagaa 1080cccaacctct gcttctgttg gcccaagaag 1140ccacggacct acctagccta ccttagctat 1200ctaagcgggc cgacctagta gccacgtgcc tagtgtagat taaagttgcc gggccagcag 1260gaagccacgc tgcaatggca tcttcccctg tccttcgcgt acgtgaaaac aaacccaggt 1320aagcttagaa tcttcttgcc cgttggactg ggacacccac caatcccacc atgccccgat 1380attcctccgg tctcggttca tgtgatgtcc tctcttgtgt gatcacggag caagcattct 1440taaacggcaa aagaaaatca ccaacttgct cacgcagtca cgctgcaccg cgcgaagcga 1500cgcccgatag gccaagatcg cgagataaaa taacaaccaa tgatcataag gaaacaagcc 1560cgcgatgtgt cgtgtgcagc aatcttggtc atttgcggga tcgagtgctt cacagctaac 1620caaatattcg gccgatgatt taacacatta tcagcgtaga tgtacgtacg atttgttaat 1680taatctacga gccttgctag ggcaggtgtt ctgccagcca atccagatcg ccctcgtatg 1740cacgctcaca tgatggcagg gcagggttca catgagctct aacggtcgat taattaatcc 1800cggggctcga ctataaatac ctccctaatc ccatgatcaa aaccatctca agcagcctaa 1860tcatctccag ctgatcaaga gctcttaatt agctagctag tgattagctg cgcttgtgat 1920cgatcgatct cgggtacgta gcaatagatc taccgtcttc ggtacgcgct cactccgccc 1980tctgcctttg ttactgccac gtttctctga atgctctctt gtgtggtgat tgctgagagt 2040ggtttagctg gatctagaat tacactctga aatcgtgttc tgcctgtgct gattacttgc 2100cgtcctttgt agcagcaaaa tatagggaca tggtagtacg aaacgaagat agaacctaca 2160cagcaatacg agaaatgtgt aatttggtgc ttagcggtat ttatttaagc acatgttggt 2220gttatagggc acttggattc agaagtttgc tgttaattta ggcacaggct tcatactaca 2280tgggtcaata gtatagggat tcatattata ggcgatacta taataatttg ttcgtctgca 2340gagcttatta tttgccaaaa ttagatattc ctattctgtt tttgtttgtg tgctgttaaa 2400ttgttaacgc ctgaaggaat aaatataaat gacgaaattt tgatgtttat ctctgctcct 2460ttattgtgac cataagtcaa gatcagatgc acttgtttta aatattgttg tctgaagaaa 2520taagtactga cagtattttg atgcattgat ctgcttgttt gttgtaacaa aatttaaaaa 2580taaagagttt cctttttgtt gctctcctta cctcctgatg gtatctagta tctaccaact 2640gacactatat tgcttctctt tacatacgta tcttgctcga tgccttctcc ctagtgttga 2700ccagtgttac tcacatagtc tttgctcatt tcattgtaat gcagatacca agcggcctct 2760agaggatctc c atg gcc ttc ttc aac cgg gtg ate acc ctc acg gtg ccg 2810Met Ala Phe Phe Asn Arg vai Ile Thr Leu Thr vai Protcg tca gac gtg gtc aac tac tcg gag ate tac cag gtg gct cct cag 2858Ser Ser Asp vai Val Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro Gln15 20 25tat gtc aac cag gcc ctg acc ctg gcc aag tac ttc cag ggc gcc ate 2906Tyr vai Asn Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile30 35 40 45

gac ggc age acc ctg agg ttc gac ttc gag aag gcg tta cag ate gcc 2954Asp Gly Ser Thr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala

50 55 60

aac gac ate ccg cag gcc gcg gtg gtc aac acc ctg aac cag acc gtc 3002Asn Asp Ile Pro Gln Ala Ala Val Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr Val65 70 75

cag cag ggg acc gtc cag gtc age gtc atg ate gac aag ate gtg gac 3050Gln Gln Gly Thr Val Gln Val Ser Val Met Ile Asp Lys Ile Val Asp

80 85 90

ate atg aag aat gtc ctg tcc ate gtg ata gac aac aag aag ttt tgg 3098Ile Met Lys Asn vai Leu Ser Ile Val Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp95 100 105

gat cag gtc acg gct gcc ate acc aac acc ttc acg aac ctg aac age 3146Asp Gln Val Thr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn Ser110 115 120 125

cag gag tcg gag gcc tgg ate ttc tat tac aag gag gac gcc cac aag 3194Gln Glu Ser Glu Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys

130 135 140

acg tcc tac tat tac aac ate ctc ttc gcc ate cag gac gaa gag acg 3242Thr Ser Tyr Tyr Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr145 150 155

ggt ggc gtg atg gcc acg ctg ccc ate gcc ttc gac ate agt gtg gac 3290Gly Gly vai Met Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser Val Asp

160 165 170

ate gag aag gag aag gtc ctg ttc gtg acc ate aag gac act gag aat 3338Ile Glu Lys Glu Lys vai Leu Phe Val Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn175 180 185

tac gcc gtc acc gtc aag gcg ate aac gtg gtc cag gea ctc cag tet 3386Tyr Ala vai Thr Val Lys Ala Ile Asn Val Val Gln Ala Leu Gln Ser190 195 200 205

age agg gat tet aag gtg gtt gat gcg ttc aaa tcg cca cgg cac tta 3434Ser Arg Asp Ser Lys Val Val Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu210 215 220

ccc cgg aag agg cat aag att tgc tet aac tcg tga tga attctgcatg 3483Pro Arg Lys Arg His Lys Ile Cys Ser Asn Ser225 230

cgtttggacg tatgctcatt caggttggag ccaatttggt tgatgtgtgt gcgagttctt 3543 gcgagtctga tgagacatct ctgtattgtg tttctttccc cagtgttttc tgtacttgtg 3603 taatcggcta atcgccaaca gattcggcga tgaataaatg agaaataaat tgttctgatt 3663 ttgagtgcaa aaaaaaagga attagatctg tgtgtgtttt ttggatcccc agcttctgca 3723 ggtccgatgt gagacttttc aacaaagggt aatatccgga aacctcctcg gattccattg 3783 cccagctatc tgtcacttta ttgtgaagat agtggaaaag gaaggtggct cctacaaatg 3843 ccatcattgc gataaaggaa aggccatcgt tgaagatgcc tctgccgaca gtggtcccaa 3903 agatggaccc ccacccacga ggagcatcgt ggaaaaagaa gacgttccaa ccacgtcttc 3963 aaagcaagtg gattgatgtg atggtccgat gtgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg 4023 gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa 4083 aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg 4143 cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag 4203 aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg tgatatctcc actgacgtaa 4263 gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc etetatataa ggaagttcat 4323 ttcatttgga gaggacacgc tgacaagctg actctagcag atcctctaga accatcttcc 4383 acacactcaa gccacactat tggagaacac acagggacaa cacaccataa gatccaaggg 4443 aggcctccgc cgccgccggt aaccaccccg CCCCtCtCCt ctttctttct ccgttttttt 4503 ttccgtctcg gtctcgatct ttggccttgg tagtttgggt gggcgagagg cggcttcgtg 4563 cgcgcccaga tcggtgcgcg ggaggggcgg gatctcgcgg ctggggctct cgccggcgtg 4623 gatccggccc ggatctcgcg gggaatgggg ctctcggatg tagatctgcg atccgccgtt 4683 gttgggggag atgatggggg gtttaaaatt tccgccgtgc taaacaagat caggaagagg 4743 ggaaaagggc actatggttt atatttttat atatttctgc tgcttcgtca ggcttagatg 4803 tgctagatct ttctttcttc tttttgtggg tagaatttga atccctcagc attgttcatc 4863 ggtagttttt cttttcatga tttgtgacaa atgcagcctc gtgcggagct tttttgtagg 4923 tagaagtgat caacc atg age aaa gaa ate agg ctc aac ctt tet cgt gag 4974Met ser Lys Glu Ile Arg Leu Asn Leu Ser Arg Glu235 240

age ggc gcc gac ctg tac ctc aag ate ctc gcc ttc gtg aag ccc gag 5022Ser Gly Ala Asp Leu Tyr Leu Lys Ile Leu Ala Phe Val Lys Pro Glu245 250 255 260

cac ttc ttt cag gcg tac ctc ctg tgc cgc gag ttc gag age ate gtg 5070His Phe Phe Gln Ala Tyr Leu Leu Cys Arg Glu Phe Glu Ser Ile vai

265 270 275

gat cct aca acc cgc gag tet gac ttc gac aag acg ctg acc ate gtg 5118Asp Pro Thr Thr Arg Glu Ser Asp Phe Asp Lys Thr Leu Thr Ile vai280 285 290

aag tcg gac tcc acc ctc gtg acc gtg ggc acg atg aac acc aag ctg 5166Lys Ser Asp Ser Thr Leu vai Thr vai Gly Thr Met Asn Thr Lys Leu295 300 305

gtc aat age caa gag ate ctc gtg tcg gac ttg ate act caa gtc ggt 5214Val Asn Ser Gln Glu Ile Leu Val Ser Asp Leu Ile Thr Gln vai Gly

310 315 320

tcc cag ate gcc gat acc ctc ggc ate acg gac ate gac gcc aac acc 5262Ser Gln Ile Ala Asp Thr Leu Gly Ile Thr Asp Ile Asp Ala Asn Thr325 330 335 340

cag caa cag ctc acg gag ctg ate ggc aac ctc ttc gtg aac ctc aat 5310Gln Gln Gln Leu Thr Glu Leu Ile Gly Asn Leu Phe Val Asn Leu Asn

345 350 355

tcc caa gtt cag gag tac ate tac ttc tac gag gag aag gag aag cag 5358Ser Gln vai Gln Glu Tyr Ile Tyr Phe Tyr Glu Glu Lys Glu Lys Gln360 365 370

acc tcc tac cgc tac aac ate ctc ttc gtg ttc gaa aag gag tcg ttc 5406Thr Ser Tyr Arg Tyr Asn Ile Leu Phe Val Phe Glu Lys Glu Ser Phe375 380 385

ate acc att ctg cca atg ggc ttc gac gtg acc gtg aac acg aac aag 5454Ile Thr Ile Leu Pro Met Gly Phe Asp vai Thr Val Asn Thr Asn Lys390 395 400gag gcc gtc ctg aag ctg acc ccg aag gac aag gtt acc tac ggc cac 5502Glu Ala vai Leu Lys Leu Thr Pro Lys Asp Lys vai Thr Tyr Gly His405 410 415 420

gtc age gtc aag gcc ctc aac ate ate cag etc att acg gag gac aag 5550Val Ser Val Lys Ala Leu Asn Ile Ile Gln Leu Ile Thr Glu Asp Lys

425 430 435

ttc aac ttc ctc gea acc ctc aag aag gct ctc aag acc ctg tga tga 5598Phe Asn Phe Leu Ala Thr Leu Lys Lys Ala Leu Lys Thr Leu440 445 450

gaattctgca tgcgtttgga cgtatgctca ttcaggttgg agccaatttg gttgatgtgt 5658gtgcgagttc ttgcgagtct gatgagacat ctctgtattg tgtttctttc cccagtgttt 5718tctgtacttg tgtaatcggc taatcgccaa cagattcggc gatgaataaa tgagaaataa 5778attgttctga ttttgagtgc aaaaaaaaag gaatt 5813

<210> 44<211> 232<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Construto sintético<400> 44

Met Ala Phe Phe Asn Arg vai Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp1 5 10 15

Val Val Asn Tyr ser Glu lie Tyr Gln Val Ala Pro Gln Tyr Val Asn20 25 30

Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly ser35 40 45

Thr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile

50 55 60

Pro Gln Ala Ala vai vai Asn Thr Leu Asn Gln Thr vai Gln Gln Gly65 70 75 80

Thr vai Gln vai ser vai Met Ile Asp Lys Ile vai Asp Ile Met Lys85 90 95Asn Val Leu Ser Ile vai100

Thr Ala Ala Ile Thr Asn115

Glu Ala Trp Ile Phe Tyr130

Tyr Tyr Asn Ile Leu Phe145 150

Met Ala Thr Leu Pro Ile165

Glu Lys vai Leu Phe vai180

Thr vai Lys Ala Ile Asn195

ser Lys vai vai Asp Ala210

Arg His Lys Ile Cys Ser225 230

<210> 45<211> 218<212> PRT<213> Seqüência Artificial<220>

<223> Construto Sintético<400> 45

Met Ser Lys Glu Ile Arg Leu Asn Leu Ser Arg Glu Ser Gly Ala Asp1 5 10 15

Leu Tyr Leu Lys Ile Leu Ala Phe Val Lys Pro Glu His Phe Phe Gln20 25 30

Ala Tyr Leu Leu Cys Arg Glu Phe Glu Ser Ile Val Asp Pro Thr Thr35 40 45

Arg Glu Ser Asp Phe Asp Lys Thr Leu Thr Ile vai Lys Ser Asp Ser50 55 60

Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln Val

105 110

Thr Phe Thr Asn Leu Asn ser Gln Glu Ser

120 125

Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr Ser Tyr135 140

Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly Val155 160

Ala Phe Asp Ile ser Val Asp Ile Glu Lys

170 175

Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala Val

185 190

Val Val Gln Ala Leu Gln Ser Ser Arg Asp

200 205

Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys215 220

Asn serThr Leu vai Thr vai Gly Thr Met Asn Thr Lys Leu Val Asn Ser Gln65 70 75 80

Glu Ile Leu Val Ser Asp Leu Ile Thr Gln Val Gly ser Gln Ile Ala85 90 95

Asp Thr Leu Gly Ile Thr Asp Ile Asp Ala Asn Thr Gln Gln Gln Leu100 105 110

Thr Glu Leu Ile Gly Asn Leu Phe vai Asn Leu Asn ser Gln vai Gln

115 120 125

Glu Tyr Ile Tyr Phe Tyr Glu Glu Lys Glu Lys Gln Thr ser Tyr Arg I30 135 140

Tyr Asn Ile Leu Phe Val Phe Glu Lys Glu Ser Phe Ile Thr Ile Leu145 150 155 160

Pro Met Gly Phe Asp Val Thr vai Asn Thr Asn Lys Glu Ala Val Leu165 170 175

Lys Leu Thr Pro Lys Asp Lys Val Thr Tyr Gly His vai Ser vai Lys

180 185 190

Ala Leu Asn Ile Ile Gln Leu Ile Thr Glu Asp Lys Phe Asn Phe Leu

195 200 205

Ala Thr Leu Lys Lys Ala Leu Lys Thr Leu 210 215

<210> 46<211> 1413<212> DNA

<213> Seqüência Artificial<220>

<221> CDS<222> (1)(1407)<223> TIC127<220>

<223> Construto sintético<220>

<223> (1)..(696)

<223> TIC809 seqüência de aminoácido<220>

<223> (697)..C753)

<223> seqüência de aminoácido ligante ou espaçadora susce-tível à proteólise

<220>

<223> (754)..(1407)

<223> TIC810 seqüência de aminoácido

<400> 46

atg gcc ttc ttc aac cgg gtg ate acc ctc acg gtg ccg tcg tca gac 48Met Ala Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro ser ser Asp1 5 10 15

gtg gtc aac tac tcg gag ate tac cag gtg gct cct cag tat gtc aac 96Val Val Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro Gln Tyr vai Asn20 25 30

cag gcc ctg acc ctg gcc aag tac ttc cag ggc gcc ate gac ggc age 144Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly Ser

35 40 45

acc ctg agg ttc gac ttc gag aag gcg tta cag ate gcc aac gac ate 192Thr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile 50 55 60

ccg cag gcc gcg gtg gtc aac acc ctg aac cag acc gtc cag cag ggg 240Pro Gln Ala Ala Val vai Asn Thr Leu Asn Gln Thr vai Gln Gln Gly65 70 75 80

acc gtc cag gtc age gtc atg ate gac aag ate gtg gac ate atg aag 288 Thr vai Gln vai Ser vai Met Ile Asp Lys Ile vai Asp Ile Met Lys

85 90 95

aat gtc ctg tcc ate gtg ata gac aac aag aag ttt tgg gat cag gtc 336Asn vai Leu Ser Ile vai Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln Val100 105 110

acg gct gcc ate acc aac acc ttc acg aac ctg aac age cag gag tcg 384Thr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn Ser Gln Glu Ser

115 120 125

gag gcc tgg ate ttc tat tac aag gag gac gcc cac aag acg tcc tac 432Ala Trp lie Phe130

tac aac ate ctcTyr Asn Ile Leu

gcc acgAla Thr

aag gtcLys vai

gtc aagvai Lys195aag gtgLys vai210

cat aagHis Lys

cgc gccArg Ala

ctc aacLeu Asn

ctg ccc

Leu Pro165

ctg ttc

Leu Phe180

gcg ate

Ala Ile

gtt gatvai Asp

att tgcIle Cys

gag gagGlu Glu245ctt tctLeu Ser260

gtg aagvai Lys

gcc ttcAla Phe275

gag ttc gag ageGlu Phe Glu Ser290

aag acg ctg acc

Tyr Tyr Lys

135

ttc gcc ate

Phe Ala Ile150

ate gcc ttc

Ile Ala Phe

gtg acc atevai Thr Ile

aac gtg gtcAsn vai Val200

gcg ttc aaaAla Phe Lys

215tct aac tcgSer Asn Ser230

gag ctg cctGlu Leu Pro

cgt gag ageArg Glu Ser

ccc gag cacPro Glu His280

ate gtg gatIle vai Asp

295ate gtg aag

Glu Asp Ala His Lys140

cag gac gaa gag acgGln Asp Glu Glu Thr155

agt gtg gacSer Val Asp

gac ateAsp Ile170aag gacLys Asp185

cag geaGln Ala

tcg ccaser Pro

aag cccLys Pro

ccc cgcPro Arg250ggc gccGly Ala265

ttc tttPhe Phe

act gag aatThr Glu Asn

ctc cag tctLeu Gln ser205

cgg cac ttaArg His Leu220gcc ctg ctcAla Leu Leu235

aag atg ageLys Met Ser

gac ctg tacAsp Leu Tyr

Thr ser Tyr

ggt ggc gtgGly Gly Val160

ate gag aagIle Glu Lys

175tac gcc gtcTyr Ala vai190

age agg gatSer Arg Asp

ccc cgg aagPro Arg Lys

aag gag gctLys Glu Ala240

aaa gaa ateLys Glu Ile

255ctc aag ateLeu Lys lie270

ctc ctg tgcLeu Leu Cys

cag gcg tacGln Ala Tyr285

cct aca acc cgc gagPro Thr Thr Arg Glu300

tcg gac tcc acc ctc gtg acc gtg

tct gac ttcSer Asp Phe

480

528

576

624

672

720

768

816

864

912

960Asp Lys Thr Leu Thr Ile Val Lys Ser Asp Ser Thr Leu Val Thr Val305 310 315 320

ggc acg atg aac acc aag ctg gtc aat age caa gag ate ctc gtg tcg 1008Gly Thr Met Asn Thr Lys Leu vai Asn Ser Gln Glu Ile Leu vai Ser325 330 335

gac ttg ate act caa gtc ggt tcc cag ate gcc gat acc ctc ggc ate 1056Asp Leu Ile Thr Gln Val Gly ser Gln Ile Ala Asp Thr Leu Gly Ile

340 345 350

acg gac ate gac gcc aac acc cag caa cag ctc acg gag ctg ate ggc 1104Thr Asp Ile Asp Ala Asn Thr Gln Gln Gln Leu Thr Glu Leu Ile Gly355 360 365

aac ctc ttc gtg aac ctc aat tcc caa gtt cag gag tac ate tac ttc 1152Asn Leu Phe vai Asn Leu Asn Ser Gln vai Gln Glu Tyr Ile Tyr Phe370 375 380

tac gag gag aag gag aag cag acc tcc tac cgc tac aac ate ctc ttc 1200Tyr Glu Glu Lys Glu Lys Gln Thr Ser Tyr Arg Tyr Asn Ile Leu Phe385 390 395 400

gtg ttc gaa aag gag tcg ttc ate acc att ctg cca atg ggc ttc gac 1248Val Phe Glu Lys Glu Ser Phe Ile Thr Ile Leu Pro Met Gly Phe Asp405 410 415

gtg acc gtg aac acg aac aag gag gcc gtc ctg aag ctg acc ccg aag 1296vai Thr vai Asn Thr Asn Lys Glu Ala vai Leu Lys Leu Thr Pro Lys

420 425 430

gac aag gtt acc tac ggc cac gtc age gtc aag gcc ctc aac ate ate 1344Asp Lys vai Thr Tyr Gly His vai Ser vai Lys Ala Leu Asn Ile Ile435 440 445

cag ctc att acg gag gac aag ttc aac ttc ctc gea acc ctc aag aag 1392Gln Leu Ile Thr Glu Asp Lys Phe Asn Phe Leu Ala Thr Leu Lys Lys450 455 460

gct ctc aag acc ctg tgatga 1413

Ala Leu Lys Thr Leu465

<210> 47<211> 469<212> PRT

<213> Seqüência Artificial<400> 47

Met Ala Phe Phe Asn Arg Val Ile Thr Leu Thr Val Pro Ser Ser Asp1 5 10 15

Val Val Asn Tyr Ser Glu Ile Tyr Gln Val Ala Pro Gln Tyr Val Asn

20 25 30

Gln Ala Leu Thr Leu Ala Lys Tyr Phe Gln Gly Ala Ile Asp Gly Ser35 40 45

Thr Leu Arg Phe Asp Phe Glu Lys Ala Leu Gln Ile Ala Asn Asp Ile

50 55 60

Pro Gln Ala Ala Val Val Asn Thr Leu Asn Gln Thr Val Gln Gln Gly65 70 75 80

Thr vai Gln Val Ser Val Met Ile Asp Lys Ile Val Asp Ile Met Lys

85 90 95

Asn vai Leu Ser Ile Val Ile Asp Asn Lys Lys Phe Trp Asp Gln Val

100 105 110

Thr Ala Ala Ile Thr Asn Thr Phe Thr Asn Leu Asn Ser Gln Glu Ser115 120 125

Glu Ala Trp Ile Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Ala His Lys Thr Ser Tyr

130 135 140

Tyr Tyr Asn Ile Leu Phe Ala Ile Gln Asp Glu Glu Thr Gly Gly Val145 150 155 160

Met Ala Thr Leu Pro Ile Ala Phe Asp Ile Ser Val Asp Ile Glu Lys

165 170 175

Glu Lys Val Leu Phe Val Thr Ile Lys Asp Thr Glu Asn Tyr Ala Val

180 185 190

Thr Val Lys Ala Ile Asn Val vai Gln Ala Leu Gln Ser Ser Arg Asp195 200 205

Ser Lys vai vai Asp Ala Phe Lys Ser Pro Arg His Leu Pro Arg Lys

210 215 220

Arg His Lys Ile Cys ser Asn Ser Lys Pro Ala Leu Leu Lys Glu Ala225 230 235 240

Pro Arg Ala Glu Glu Glu Leu Pro Pro Arg Lys Met Ser Lys Glu Ile

245 250 255

Arg Leu Asn Leu Ser Arg Glu Ser Gly Ala Asp Leu Tyr Leu Lys Ile 260 265 270

Leu Ala Phe Val Lys Pro Glu His Phe Phe Gln Ala Tyr Leu Leu Cys

275 280 285

Arg Glu Phe Glu ser Ile vai Asp Pro Thr Thr Arg Glu Ser Asp Phe290 295 300

Asp Lys Thr Leu Thr Ile vai Lys Ser Asp Ser Thr Leu vai Thr vai305 310 315 320

Gly Thr Met Asn Thr Lys Leu Val Asn Ser Gln Glu Ile Leu Val Ser

325 330 335

Asp Leu Ile Thr Gln vai Gly Ser Gln Ile Ala Asp Thr Leu Gly Ile340 345 350

Thr Asp Ile Asp Ala Asn Thr Gln Gln Gln Leu Thr Glu Leu Ile Gly

355 360 365

Asn Leu Phe Val Asn Leu Asn Ser Gln Val Gln Glu Tyr Ile Tyr Phe370 375 380

Tyr Glu Glu Lys Glu Lys Gln Thr Ser Tyr Arg Tyr Asn Ile Leu Phe385 390 395 400

vai Phe Glu Lys Glu Ser Phe Ile Thr Ile Leu Pro Met Gly Phe Asp

405 410 415

vai Thr vai Asn Thr Asn Lys Glu Ala vai Leu Lys Leu Thr Pro Lys 420 425 430

Asp Lys vai Thr Tyr Gly His vai Ser vai Lys Ala Leu Asn Ile Ile

435 440 445

Gln Leu Ile Thr Glu Asp Lys Phe Asn Phe Leu Ala Thr Leu Lys Lys450 455 460

Ala Leu Lys Thr Leu465

Claims

1. Método para aumentar o acúmulo de uma primeira proteínainseticida em uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de que com-preende contemporaneamente expressar a referida primeira proteína sele-cionada do grupo consistindo em ET37, ET29 E TIC809 com uma segundaproteína inseticida selecionada do grupo consistindo em TIC810 e TIC812,em que a dita expressão contemporânea intensifica o acúmulo da primeiraproteína em comparação com o acúmulo da dita primeira proteína expressana ausência da dita segundo proteína.

2. Composição apresentando atividade inseticida, caracterizadapelo fato de que compreende uma primeira proteína selecionada do grupoconsistindo em ET37, ET29 e TIC809, e uma segunda proteína selecionadado grupo consistindo em TIC810 e TIC812.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizadapelo fato de que a dita primeira proteína é TIC809 e a dita segunda proteínaé TIC810.

4. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizadapelo fato de que a relação da dita primeira proteína para a dita segunda pro-teína é de cerca de 1:1 a cerca de 2:1.

5. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracterizadapelo fato de que é fornecida na dieta de uma praga de planta Coleopteran ouHemipteran em uma formulação agrícola aceitável.

6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de que a dita formulação consiste em ambas as proteínas expres- sas em uma célula vegetal.

7. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracterizadapelo fato de que a dita praga Coleopteran é uma larva da raiz do milho e adita praga Hemipteran é um percevejo Lygus.

8. Produto de mercadoria, caracterizado pelo fato de que com-preende uma quantidade detectável de uma primeira proteína selecionadado grupo consistindo em ET37, ET29 e TIC809 e uma quantidade detectávelde uma segunda proteína selecionada do grupo consistindo em TIC810 eTIC812.

9. Produto de mercadoria, caracterizado pelo fato de que com-preende uma quantidade detectável de (1) uma primeira seqüência de nu-cleotídeo que codifica uma primeira proteína selecionada do grupo consis-tindo em ET37, ET29 e TIC809 e a segunda seqüência de nucleotídeo quecodifica uma segunda proteína selecionada do grupo consistindo em TIC810e TIC812; (2) uma primeira proteína selecionada do grupo consistindo emET37, ET29 e TIC809 e uma segunda proteína selecionada do grupo consis-tindo em TIC810 e TIC812; (3) tanto (1) quanto (2); ou (4) qualquer combi-nação de (1) e (2).

10. Produto de mercadoria de acordo com a reivindicação 8 ou-9, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo consistindo emsemente de algodão, óleo de semente de algodão, farinha de sementes dealgodão, semente de soja, óleo de soja, farelo de soja, farinha de soja, sóli-dos de mercadorias secas de destilador, semente de milho, farinha de milho,fubá de milho, xarope de milho, óleo de milho, amido de milho, alimentaçãoanimal, e cereais fabricados no todo ou em parte para conter subprodutos desoja e/ou milho.

11. Método para produzr uma célula vegetal resistente a umapraga de inseto, caracterizado pelo fato de que compreende a transformaçãoda dita célula vegetal para expressar uma quantidade inseticidamente eficazde uma composição de toxina, a dita composição de toxina compreendendouma primeira proteína selecionada do grupo consistindo em ET29, ET37 eTIC809 e uma segunda proteína selecionada do grupo consistindo emTIC810 e TIC812.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe-lo fato de que a dita célula vegetal é regenerada em uma planta transgênicafértil.

13. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pe-Io fato de que a dita célula vegetal é selecionada do grupo constituído deuma célula vegetal monocotiledônea e uma célula vegetal dicotiledônea.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pe-Io fato de que (1) a dita célula vegetal monocotiledônea é selecionada dogrupo consistindo em célula vegetal de milho, trigo, aveia, arroz, sorgo, milo,trigo mourisco, centeio, capim (festuca, campim de manada, bromus, pomar,St. Augustine, Bermuda, bentgrass), e cevada, e (2) dita célula vegetal dico-tiledônea é selecionada do grupo consistindo em células vegetais de alfafa,maçã, abricó, aspargos, feijão, bagas, amora silvestre, mirtilo, canola, ce-noura, couve-flor, aipo, cereja, grão de bico, árvore cítrica, algodão, cowpea,amora, pepino, pepino, beringela, árvore frutífera, uva, limão, alface, linhaça,melão, mostarda, nogueira, quiabo, laranja, ervilha, pêssego, amendoim,pera, ameixa, batata, soja, abóbora, morango, beterraba, girassol, batatadoce, tabaco, tomate, nabo e legumes.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pe-lo fato de que as plantas e sementes progênies são produzidas a partir dadita planta transgênica, e em que as ditas plantas e sementes progêniescompreendem as ditas primeira e segunda proteínas.

16. Planta transgênica ou célula vegetal resistente à infestaçãode insetos, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência denucleotídeo que codifica uma primeira toxina cyt selecionada do grupo con-sistindo em ET37, ET29, TIC809 e uma segunda toxina cyt selecionada dogrupo consistindo em TIC810 e TIC812.

17. Planta transgênica ou célula vegetal de acordo com a reivin-dicação 16, caracterizada pelo fato de que a dita planta transgênica é sele-cionada do grupo consistindo em uma planta dicotiledônea ou célula vegetaldicotiledônea e uma planta monocotiledônea ou célula vegetal monocotile-dônea, a dita planta dicotiledônea ou célula vegetal dicotiledônea sendo ain-da selecionada do grupo consistindo em alfafa, maçã, abricó, aspargos, fei-jão, bagas, amora silvestre, mirtilo, canola, cenoura, couve-flor, aipo, cereja,grão de bico, árvore cítrica, algodão, cowpea, amora, pepino, curcúbita, be-ringela, árvore frutífera, uva, limão, alface, linhaça, melão, mostarda, noguei-ra, quiabo, laranja, ervilha, pêssego, amendoim, pera, ameixa, batata, soja,abóbora, morango, beterraba, girassol, batata doce, tabaco, tomate, nabo elegumes, e a dita planta monocotiledônea sendo ainda selecionada do grupoconsistindo em milho, trigo, aveia, arroz, sorgo, milo, trigo mourisco, centeio,capim (festuca, campim de manada, bromus, pomar, St. Augustine, Bermu-da, bentgrass) e cevada.

18. Planta transgênica ou célula vegetal de acordo com a reivin-dicação 17, caracterizada pelo fato de que é resistente a (1) infestação deinseto coleóptero, em que o dito inseto coleóptero é selecionado do grupoconsistindo em um Chrysomelidae, Cucujidae, Scarabaeidae, Trogositidae,Tenebrionidae, Curculionidae, Elateridae e Bruchidae, e (2) infestação deinseto hemíptero, em que os ditos hemípteros são selecionados das subor-dens Heteroptera e Homoptera.

19. Planta transgênica ou célula vegetal de acordo com a reivin-dicação 18, caracterizada pelo fato de que a dita Chrysomelidea é uma es-pécie Diabrotica selecionada do grupo consistindo em D. virgifera (verme daraiz do milho ocidental), D. undecempunctata (verme da raiz do milho sulis-ta), D. barberi (verme da raiz do milho do norte), D. virgifera zeae (verme daraiz do milho mexicano), D. balteata (verme da raiz do milho brasileiro) ecomplexo do verme da raiz do milho brasileiro (BCR) ainda compreendendoD. virídula e D. speciosa.

20. Progênie ou semente da planta transgênica ou célula vegetalde acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que a dita pro-gênie ou semente compreende a dita seqüência de nucleotídeo.

21. Método para controlar infestação de inseto coleóptero ouhemíptero de uma planta, caracterizado pelo fato de que que é mediante ofornecimento na dieta do inseto de uma ou mais células vegetais transfor-madas com uma seqüência de ácido nucleico que compreende na ligaçãooperável um promotor funcional de planta e uma seqüência de nucleotídeoque codifica uma proteína de fusão, em que a dita proteína de fusão com-preende uma primeira seqüência de aminoácido selecionada do grupo con-sistindo em uma SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 e SEQ ID NO: 14, e uma se-gunda seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQNO ID: 4 e SEQ ID NO: 6.

22. Método para proteger uma cultura em um campo de infesta-ção de insetos, caracterizado pelo fato de que compreende o desenvolvi-mento de uma planta de cultura transgênica que compreende uma quantida-de inseticidamente eficaz de uma primeira proteína e uma segunda proteína,a dita primeira proteína sendo selecionada do grupo consistindo em umaET37, uma ET29 e uma TIC809 e a dita segunda proteína sendo seleciona-da do grupo consistindo em TIC810 e TIC812, e que fornece as proteínasconjuntamente na dieta do inseto para inibir o inseto de sobreviver na ditaplanta de cultura transgênica.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que que dito inseto é selecionado do grupo consistindo em um in-seto coleóptero e um inseto hemíptero.

24. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pe-lo fato de que que a dita planta de cultura transgênica compreende ainda umagente inseticida adicional tóxico para o mesmo inseto como a primeira e asegunda proteínas, em que dito o agente inseticida adicional é selecionadodo grupo consistindo em uma toxina de Bacillus, uma toxina de Xenorhab-dus, uma toxina de Photorhabdus e um dsRNA específico para supressão deum ou mais genes essenciais no dito inseto.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 22a 24, caracterizado pelo fato de que que o rendimento da dita cultura é me-lhorado em comparação com o rendimento de uma cultura isogênica quecarece das ditas proteínas inseticidas.

26. Seqüência de nucleotídeo isolada e purificada, caracterizadapelo fato de que codifica uma proteína inseticida, a dita proteína sendo sele-cionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 2, NO SEQ ID: 4, SEQ ID NO:-6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 47.

27. Seqüência de nucleotídeo isolada e purificada de acordocom a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é selecionada do gru-po consistindo em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ IDNO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 46.

28. Proteína inseticida isolada e purificada, caracterizada pelofato de que é selecionada do grupo que consiste em uma ET37, umaTIC809, uma TIC810, uma TIC812 e uma TIC127.

29. Planta ou célula vegetal, caracterizada pelo fato de que étransformada com uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma proteínainseticida, a dita proteína inseticida sendo selecionada do grupo que consis-te em uma ET37, uma TIC809, uma TIC810, uma TIC812 e uma TIC127.

30. Progênie ou semente da planta como definido na reivindica-ção 29, caracterizada pelo fato de que a dita progenitura ou semente com-preende a dita seqüência de nucleotídeo.

31. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende uma se-quência de nucleotídeo que codifica uma proteína selecionada do grupoconsistindo em ET37, TIC809, TIC810, TIC812 e TIC127.

32. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compre-ende uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma proteína cyt, a ditaproteína sendo selecionada do grupo consistindo em uma ET37, umaTIC809, uma TIC810, uma TIC812 e uma TIC127.

33. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 32, carac-terizada pelo fato de que é selecionada do grupo consistindo em uma célulavegetal, uma célula fúngica e uma célula bacteriana.

34. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 33, carac-terizada pelo fato de que a dita célula vegetal é selecionada do grupo consis-tindo em uma célula vegetal monocotiledônea e uma célula vegetal dicotile-dônea.

35. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 34, carac-terizada pelo fato de que (1) a dita célula vegetal monocotiledônea é sele-cionada do grupo consistindo em célula vegetal de milho, trigo, aveia, arroz,sorgo, milo, trigo mourisco, centeio, capim (festuca, campim de manada,bromus, pomar, St. Augustine, Bermuda, bentgrass) e cevada, e (2) a ditacélula vegetal dicotiledônea é selecionada do grupo consistindo em célulasvegetais de alfafa, maçã, abricó, aspargos, feijão, bagas, amora silvestre,mirtilo, canola, cenoura, couve-flor, aipo, cereja, grão de bico, árvore cítrica,algodão, cowpea, amora, pepino, pepino, beringela, árvore frutífera, uva,limão, alface, linhaça, melão, mostarda, nogueira, quiabo, laranja, ervilha,pêssego, amendoim, pera, ameixa, batata, soja, abóbora, morango, beterra-ba, girassol, batata doce, tabaco, tomate, nabo e legumes.

36. Cassete de expressão para uso na expressão de uma prote-ína inseticida em uma célula hospedeira, caracterizado pelo fato de quecompreende na ligação operável uma seqüência de promotor funcional nadita célula hospedeira e uma seqüência de nucleotídeo que codifica a ditaproteína, a dita proteína sendo selecionada do grupo consistindo em ET37,TIC809, TIC810, TIC812 e TIC127.

37. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que a dita célula hospedeira é selecionada do gru-po consistindo em uma célula bacteriana, uma célula fúngica, uma célula demamífero, e uma célula vegetal.

38. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 37,caracterizado pelo fato de que(a) a dita célula bacteriana é selecionada do grupo consistindo em umacélula da espécie Bacillus, uma célula da espécie Enterobacteriacae,uma célula da espécie Pseudomonas, uma célula da espécie Clostri-dium, e uma célula da espécie Rhizobium, e uma célula da espécieAgrobacterium; e(b) a dita célula vegetal é selecionada do grupo de plantas consistindoem uma planta dicotiledônea e uma planta monocotiledônea, a ditaplanta dicotiledônea sendo ainda selecionada do grupo consistindoem alfafa, maçã, abricó, aspargos, feijão, bagas, amora silvestre, mir-tilo, canola, cenoura, couve-flor, aipo, cereja, grão de bico, árvore cí-trica, algodão, cowpea, amora, pepino, pepino, beringela, árvore frutí-fera, uva, limão, alface, linhaça, melão, mostarda, nogueira, quiabo,laranja, ervilha, pêssego, amendoim, pera, ameixa, batata, soja, abó-bora, morango, beterraba, girassol, batata doce, tabaco, tomate, naboe legumes, e a dita planta monocotiledônea sendo selecionada dogrupo consistindo em milho, trigo, aveia, arroz, sorgo, milo, trigo mou-risco, centeio, capim (festuca, timothy, bromus, pomar, St. Augustine,Bermuda, bentgrass) e cevada.

39. Cassete de expressão de acordo com a reivindicação 36,caracterizado pelo fato de que a dita célula hospedeira é uma célula vegetale o dito cassete de expressão ainda compreende em ligação operável umaseqüência selecionada do grupo consistindo em uma seqüência intensifica-dora de expressão, uma seqüência líder não-traduzida, uma seqüência ín-tron, uma seqüência de codificação de peptídeo de direcionamento ao cloro-plasto, e uma seqüência de término e poliadenilação da transcrição.

40. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o cassetede expressão como definido em qualquer uma das reivindicações 36 a 39.