BRPI0615662A2 - formulações de microorganismos viáveis e seus métodos de produção e uso - Google Patents

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Abstract

FORMULAçõES DE MICROORGANISMOS VIáVEIS E SEUS MéTODOS DE PRODUçãO E USO A presente invenção refere-se às formulações de microorganismos viáveis em uma substância insolúvel na água, absorvente na água e métodos para produzir formulações de microorganismos viáveis. é também descrito um método de tratar plantas e / ou sementes de plantas com a formulação do presente pedido.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para"FORMULAÇÕES DE MICROORGANISMOS VIÁVEIS E SEUS MÉTODOSDE PRODUÇÃO E USO".
Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido de
Patente Provisório No. De série 60/715.076, depositado no dia 8 desetembro de 2005, que é aqui a seguir incorporado por referência em suatotalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se às formulações demicroorganismos viáveis e seus métodos de produção e uso.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Certos microorganismos são produzidos em grandesquantidades e podem ser formulados para diversos usos comerciais. Porexemplo, produtos microbianos têm sido usados na agricultura para protegeras plantas contra pragas e doenças, para melhorar o desempenho e nutriçãoda planta, e como inoculáveis para silagens. Esses produtos microbianosdevem ser produzidos de uma maneira que seja eficiente, isenta decontaminação e apropriada para manter níveis altos de microorganismosviáveis. A produção de formulações microbianas para uso comercial requer asecagem de microorganismos de uma maneira que preserve a viabilidadedos micróbios, forneça um meio apropriado para o uso comercial, emantenha um prazo de validade ampliado do produto microbiano.
Uma faixa de microorganismos foi produzidas e formuladas parauso comercial. Exemplos de microorganismos comercialmente formuladosincluem cepas de espécies de Lactobacillus para uma variedade dealimentos, probióticos, e usos para alimentação de animais; fungosentornofagos, tais como espécies de Beaveria e Metarhizum, para o controlede insetos que atacam as plantas; fungos que protegem as plantas contradoenças, tais como espécies de Triehoderma e Clonostachys; bactérias queprotegem as plantas contra doença, tais como espécies de Pseudomonas eBaeillus, como também Rhizobium e Bradyrhizobium-, e bactériasrelacionadas que fixam o nitrogênio através de um relacionamento simbióticocom legumes e fungos, tais como espécies de Colletotrichum, que sãousadas como controles de erva daninha por causar doença em ervasdaninhas. Esses usos de microorganismos são bem-documentados (Hornbyet al., Biological Control of Soil-Borne Plant Pathogens1 Wallinford1 U.K.(1990); TeBeest, Microbial Control of Weeds, New York, Chapman and Hall(1991); Vurro et al., Enhancing Biocontrol Agents and Handling Risks, IOSPress1 Amsterdam (2001)).
Microorganismos formulados para uso comercial são usualmenteproduzidos em sistemas de fermentação líquidos (submersos) (Jin et al.,Principies in the Deveiopment of Bioiogical Control Systems EmployingTrichoderma Species Against Soil-borne Plant Pathogenic Fungit p. 174-195Em Leatham1 G.F. (ed) Symposium on Industrial Mycology, Mycological Soe.Am., Brock/Springer Series in Contemporary Bioscience (1992); Stowell,"Submerged Fermentation of Biologieal Herbieides, Mierobial Control ofWeeds," D.O. TeBeest. New York, Chapman and Hall (1991); Jin et al.,"Conidial Biomass and Desiccation Tolerance in Trichoderma harzianum,"Biological Control 1:237-243 (1992); Jin et al., "Development of Media andAutomated Liquid Fermentation Methods to Produce Desiccation-tolerantPropagules of Trichoderma harzianuni" Biol. Cont. 1:261-214 (1996); Agosinet al., "Industrial Production of Active Propagules of Trichoderma forAgricultural Uses1" Trichoderma and Gliocladium1 Vol. 2. G.E. Harman andC. P. Kubicek. London1 Taylor & Francis pp. 205-227 (1998)) ou emfermentação semi-sólida.
Em todos os casos, os microorganismos são submetidos àsecagem até um nível que evita a deterioração rápida dos propágulos e / ouo crescimento de micróbios de contaminação (Jin et al., "Conidial Biomassand Desiccation Tolerance in Triehoderma harzianum," Biological Control1:237-243 (1992)). Métodos de secagem típicos incluem secagemconvectiva (por exemplo, secagem por aspersão ou camadas fluidizadas) eaquecimento estático. Todos esses métodos de secagem têm potencial paradanificar as células ou esporos sensíveis dos microorganismos. A fisiologiade esporos produzidos por microorganismos pode drasticamente influenciaros métodos que podem ser usados para secar a biomassa (Agosin et al.,"Industrial Production of Active Propagules of Trichoderma for Agricultura!Uses," Trichoderma and Gliocladium, Vol. 2. Harman and Kubicek, London1Taylor & Francis pp. 205-227 (1998)). Similarmente, os microorganismosdiferem substancialmente nos tipos de propágulos resistentes que sãoproduzidos. Por exemplo, endósporos de espécies de Bacillus são flexíveis osuficiente para suportar temperaturas relativamente altas e fortemanipulação física sem perda de viabilidade. As formulações comerciaisdessas bactérias tipicamente têm prazo de validade longo. Contrastando,alguns microorganismos produzem esporos não resistentes e existemsomente como células vegetativas. Esses microorganismos, que têm umprazo de validade mais curto, incluem espécies de Pseudomonas eBradyrhizobium. Microorganismos que são intermediários em sensibilidadeincluem esporos fúngicos, tais como conidia, ou espécies de TrichodermalClonostaehys, e Colletotrichum.
Uma cepa de Triehoderma, cepa T22 T. harzianum, goza derelativamente um largo uso na agricultura comercial (Harman, "The Mythsand Dogmas of Biocontrol. Changes in Perceptions Derived from Researchon Triehoderma harzianum T-22," Plant Disease 84:373-393 (2000)). Essemicróbio tem sido produzido em grandes quantidades e formulado em ummeio à base de argila. As formulações desse micróbio têm a desvantagemde serem difíceis de suspensão na água para aplicações de spray,formulações de tratamento de sementes de pasta fluida, ou aplicações deensopar em estufas.
As formulações desse micróbio são também limitadas àcapacidade que eles têm de formar misturas com pesticidas químicos eprodutos biológicos. Foi feita uma tentativa para produzir uma formulaçãoseca da cepa T22 de T. harzianum em combinação com o fungicida químicomancozeb. A combinação de mancozeb e T22, quando foi aplicada àsporções de sementes de batata, resultou em rendimento e qualidade(tamanho) melhorados das batatas em safras sucessivas. Entretanto, adinâmica do tratamento de sementes de batata requer que quaisquerprodutos que estão sendo aplicados necessitam ser formulados em umapreparação seca única. Quando T22 e mancozeb foram misturados juntos earmazenados em uma formulação seca, o prazo de validade de T22 foireduzido em cerca de 6 meses na ausência do fungicida para somente cercade 1 mês na presença dele. Esse problema tem até agora sido o principalfator quanto ao porquê o T22 não é usado significativamente comotratamento de sementes de batata.
Métodos novos e melhorados de produzir formulações demicroorganismos viáveis que têm níveis de atividade altos e prazo devalidade prolongado são necessários. As formulações de microorganismos,para serem comercialmente úteis, necessitam da capacidade de seremsubmetidas à suspensão em água e misturadas com outros agentesbiológicos ou pesticidas químicos sem implicações tóxicas sobre omicroorganismo. Além do mais, seria útil formular agentes biológicos comuma base de alimento para ajudar os micróbios crescerem rapidamente epara serem altamente competitivos quando aplicados. As formulações atuaispermitem o crescimento de micróbios competitivos em qualquer base dealimento adicionada. Métodos de processamento que evitam danos àscélulas ou esporos microbiais são também necessários.
A presente invenção é direcionada para superar essas e outraslimitações na técnica.
SUMÁRIO DA INVFNÇÃO
Um aspecto da presente invenção refere-se a um método deprodução de uma formulação de microorganismos viáveis. Esse métodoenvolve prover uma suspensão aquosa de microorganismos viáveis e acombinação da suspensão aquosa com uma substância insolúvel na água,absorvente em água sob condições eficazes para produzir uma formulaçãode microorganismos viáveis.
Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma formulaçãode microorganismos viáveis. A formulação inclui uma substância insolúvel naágua, absorvente na água, em que a substância insolúvel na água,absorvente na água está presente em uma quantidade de pelo menos cercade 90% do peso total da formulação. A formulação também incluimicroorganismos misturados com a substância insoluvel na água,absorvente na água, com os microorganismos que estão presentes naformulação em uma quantidade de pelo menos cerca de 5 χ 108 unidades deformação de colônias por grama de formulação.
Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a umapreparação de microorganismos viáveis incluindo a formulação comodescrito acima, suspensa em uma solução.
Ainda um outro aspecto da presente invenção refere-se aométodo de tratar uma planta ou a semente de uma planta com ummicroorganismo. Esse método envolve prover uma preparação ou umaformulação como descrito acima e aplicar a preparação ou a formulação em
uma planta ou semente de planta sob condições eficazes para tratar a plantaou a semente da planta.
A presente invenção descreve um processo simples de secageme formulação fúngica e de microorganismos bacterianos que é econômico erequer poucos equipamentos, e provê produtos com excelente viabilidade eque são acessíveis ao uso comercial. As formulações da presente invençãopossuem atividade suficiente de microorganismo para ser eficaz em umavariedade de aplicações, incluindo aplicações que exigem suspensão naágua, tal como spray, irrigação por gotejamento, e outras aplicações desistemas de distribuição baseados em água. As formulações da presenteinvenção não são poeirentas e têm alto nível de atrativo cosmético. O prazode validade das formulações da presente invenção é significativamente maislongo do que o prazo de validade das formulações atuais. As formulações dapresente invenção são também protegidas contra efeitos tóxicos de outrosagentes biológicos ou químicos (por exemplo, pesticidas), provendo aoportunidade de produzir co-formulações desses materiais. Além disso, asformulações da presente invenção contêm uma barreira para evitar ocrescimento de microorganismos indesejáveis que aumenta a eficáciabiológica do microorganismo desejado. O método da presente invençãoreduz a quantidade de processamento a jusante e, portanto, minimiza aquantidade de prejuízo que as células ou esporos microbiais podemsustentar.
O método da presente invenção alcança vantagens significativasfornecendo suave, mas relativamente rápida secagem dos microorganismos,o que evita temperaturas elevadas. O processo não é dispendioso.Adicionalmente, a presente invenção torna possível simultaneamente secare encapsular células microbiais.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 é uma fotomicrografia mostrando a precipitação dasfibras de celulose cobertas com Trichoderma conidia.
As Figuras 2A-B são fotomicrografias mostrando o crescimentode T22 em sementes de milho (3 dias de germinação) em secadores.Fungos de contaminação foram observados em toda semente não tratada(Figura 2A) mas só raramente em sementes tratadas com T22 (Figura 2B).
As Figuras 3A-B são gráficos comparando preparaçõesdiferentes de T22 como aplicadas à linha de milho endógamo Mo 17. Osníveis de cfu da preparação B (Figura 3A) foram de 2,4 χ 109, enquanto queo nível de cfu da preparação comercial (Figura 3B) foi de uma ordem demagnitude inferior.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Um aspecto da presente invenção refere-se a um método deprodução de uma formulação de microorganismos viáveis. Esse métodoenvolve prover uma suspensão aquosa de microorganismos viáveis ecombinar a suspensão aquosa com uma substância insolúvel em água,absorvente em água sob condições eficazes para produzir uma formulaçãode microorganismos viáveis.
Muitos microorganismos benéficos podem ser secados eformulados de acordo com os métodos da presente invenção. Osmicroorganismos podem incluir, sem limitação, espécies dos reinosEubacteria, Archaebacteria, Protista, e Fungos.
Em adição aos próprios microorganismos, propágulos dosmicroorganismos podem também ser formulados de acordo com os métodosda presente invenção. Propágulos incluem, sem limitação, esporos fúngicos,hifa, vesículas, e células auxiliares. Os microorganismos podem ter umautilidade comercial em aplicações agrícolas e são úteis para controlar pragasde insetos, ervas daninhas e doença das plantas, ou para prover nutriçãopara as plantas de modo que o seu crescimento e / ou o rendimento éaumentado. Espécies de microorganismos apropriados incluem, semlimitação, espécies dos gêneros Bacillus e Pseudomonas (úteis para ocontrole de insetos); Beauveria, Metarhizum, e espécies da divisãoOomycota (controle de ervas daninhas); Colletotrichum, Phytophthora,O Trichoderma, Clonostachys, e Rhizoctonia binucleada (para controlardoenças das plantas); e Bradyrhizobium, Rhizobium e gêneros relacionados(para melhorar s nutrição da planta e inclusive o rendimento). Outrosmicroorganismos similares podem também ser formulados usando o métododa invenção. Microorganismos com utilidade comercial em processamento> de alimentos, preparação de bebida fermentada, e para tratamento deforragem e água de esgoto são também apropriados para formulação deacordo com o método da presente invenção.
Microorganismos preferidos incluem espécies dos fungosTrichoderma e espécies da bactéria Bradyrhizobium.
De acordo com o método da presente invenção,microorganismos viáveis são fornecidos em uma suspensão aquosa, ou emum ambiente de outra maneira apropriado para manter a viabilidade dosmicroorganismos a serem formulados. Suspensões aquosas demicroorganismos são comumente conhecidas e podem ser preparadas deacordo com os métodos conhecidos daqueles de conhecimento comum natécnica. A produção e / ou fermentação de microorganismos em grandeescala é largamente conhecida.
Microorganismos viáveis, tipicamente suspensos em umasolução, são combinados com uma substância insolúvel na água,absorvente na água de acordo com o método da presente invenção. Asubstância insolúvel na água, absorvente na água pode ser qualquermaterial orgânico ou inorgânico capaz de remover a umidade suavementeda suspensão de microorganismos viáveis. Substâncias inorgânicasapropriadas incluem zeólito, esferas porosas ou pós, sílica, e similares.Substâncias orgânicas apropriadas incluem materiais de plantas, tais comoprodutos agrícolas do solo (por exemplo, espigas de milho), produtos demadeira porosos, celulose, e similares. Além disso, as ciclodextrinas podemser úteis como substâncias insolúveis na água, absorventes na água. Asciclodextrinas são largamente usadas em muitas indústrias para encapsular/ligar uma ampla variedade de materiais relativamente apolares. Asciclodextrinas não são orenosas, estão disponíveis em quantidadesvolumosas, e têm baixa solubilidade na água (dependendo da composiçãoatual da molécula de ciclodextrina). As ciclodextrinas podem ser usadascomo agentes de formulação para líquido separador ou materiais sólidosapolares que podem ser suspensos na água, tais como pesticidas eadjuvantes de pesticidas. Qualquer combinação das substâncias descritasacima insolúveis na água, absorventes na água pode também ser usada. Emuma modalidade preferida, a substância insolúvel na água, absorvente naágua é um pó de celulose finamente triturado.
A substância insolúvel na água, absorvente na água écombinada com a suspensão aquosa de microorganismos viáveis para umaquantidade de cerca de 80 a 99% em peso total da formulação. Dessamaneira, a suspensão aquosa de microorganismo viável está presente naformulação em uma quantidade de cerca de 1 a 20% em peso total daformulação. Preferivelmente, a substância insolúvel na água, absorvente naágua está presente na formulação na quantidade de pelo menos cerca de80%, 85%, 90%, 95%, ou 99% em peso total da formulação.
A combinação da suspensão aquosa de microorganismosviáveis com a substância insolúvel na água, absorvente na água pode serrealizada por uma variedade de métodos. Em uma modalidade preferida, aetapa de combinação é realizada amassando a suspensão aquosa com a
substância insolúvel na água, absorvente na água em um recipiente ou sacoflexível.
A combinação da suspensão aquosa de microorganismosviáveis com a substância insolúvel na água, absorvente na água é realizadapara alcançar uma formulação de microorganismos viáveis que têm umaatividade na água (Aw) em ou abaixo de cerca de 1,0.
De acordo com uma modalidade do método da presenteinvenção, a suspensão aquosa de microorganismos viáveis pode sercontatada com um material de encapsular antes de combinar osmicroorganismos com a substância insolúvel na água, absorvente na água.O material de encapsular irá depois encapsular os microorganismos. Emuma modalidade preferida, o material de encapsular é um material solúvel naágua capaz de formar um filme ou uma microesfera quando secado.Materiais apropriados para encapsular incluem, sem limitação, quitosanasnativas ou modificadas, nativos de amidos modificados, glucanos oudextrinas, celuloses modificadas de modo que são solúveis, e qualquer umde diversos vegetais nativos ou modificados ou gomas microbianas,incluindo ágares, guar, alfarroba, musgo-da-irlanda, xantanos, pectinas, esimilares, e combinações dos mesmos. Em uma modalidade preferida, omaterial de encapsular é uma dextrina, tal como Crystal-Tex (National Starchand Chemical Co., Bridgeágua, NJ).
Encapsular os microorganismos de acordo com o método dapresente invenção provê muitas vantagens. Em particular, osmicroorganismos encapsulados são mais resistentes aos pesticidasquímicos, que podem drasticamente reduzir o tempo de validade demicroorganismos não encapsulados por toxidade de contato. Por exemplo,poderá ser desejável combinar formulações de microorganismos com outrosagentes químicos ou biológicos. Quando os microorganismos são colocadosjuntos em um recipiente com, por exemplo, um fungicida químico, o fungicidaquímico poderá ser prejudicial para um microorganismo não encapsulado.Dessa maneira, encapsular evita o contato dos microorganismos com opesticida químico, a menos que o pesticida químico tenha uma pressão devapor significativa. Encapsular os microorganismos pode, portanto, servantajoso quando formular misturas de microorganismos com pesticidasquímicos e outros produtos biológicos.As formulações de microorganismos viáveis produzidas pelométodo da presente invenção podem ser secadas. Entretanto, a secagemdos microorganismos requer métodos que mantenham a viabilidade dosmicroorganismos. Em uma modalidade preferida, o método de secagem ésecagem no ar. Secagem no ar é um método que evita que osmicroorganismos entrem em contato com temperaturas altas.
O método dâ presente invenção pode ser posto em prática paraproduzir formulações de microorganismos viáveis que têm pelo menos cercade 5 χ 108 a 1 χ 1012 de unidades formadoras de colônias ("cfu") demicroorganismos por grama de formulação. "Quando o microorganismo é umfungo, as formulações de microorganismos viáveis preferivelmente têm pelomenos cerca de 5 χ 108 a 1 χ 1011 de cfu. Quando o microorganismo ébactéria, as formulações de microorganismos viáveis preferivelmente têmpelo menos cerca de 5 χ 108 a 1 χ 1012 de cfu. Quando o microorganismo éBacillus, as formulações de microorganismos viáveis preferivelmente têmpelo menos cerca de 5 χ 10s a 1 χ 1012 de cfu. Em uma modalidadepreferida, a formulação tem pelo menos cerca de 5 χ 108 de cfu por gramade formulação.
Um outro aspecto da presente invenção refere-se a umaformulação de microorganismos viáveis. A formulação inclui uma substânciainsolúvel na água, absorvente na água, em que a substância insolúvel naágua, absorvente na água está presente em uma quantidade de pelo menoscerca de 90% em peso total da formulação. A formulação também incluimicroorganismos misturados com a substância insolúvel na água,absorvente na água, com os microorganismos estando presentes naformulação em uma quantidade de pelo menos cerca de 5 χ 108 unidades deformação de colônias por grama de formulação.
Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a umapreparação de microorganismos viáveis incluindo a formulação comodescrito acima, suspensa em uma solução.
A preparação da presente invenção pode ser suspensa em umasolução para aplicações comerciais em forma de spray, irrigação porgotejamento, ou outro sistema de distribuição baseado na água.
Outro aspecto da presente invenção refere-se ao método detratar uma planta ou uma semente de planta com um microorganismo. Essemétodo envolve prover uma preparação ou uma formulação como descritoacima e aplicar a preparação ou a formulação em uma planta ou umasemente de planta sob condições eficazes para tratar a planta ou sementede planta.
Tratar uma planta ou semente de planta de acordo com ométodo da presente invenção pode incluir, sem limitação, conferir resistênciaàs doenças, conferir resistência às pragas, melhorar a nutrição e / ourendimento ou qualquer combinação dos mesmos.
Esses aspectos da presente invenção são adicionalmenteilustrados pelos exemplos abaixo.
EXEMPLOS
Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar asmodalidades da presente invenção, mas não pretendem de maneiranenhuma limitar seu escopo.
EXEMPLO 1 - PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES DE BRADYRHIZORIlIME TRICHODERMA
Preparação A. Uma pasta congelada de Bradyrhizobiumconcentrada a partir de uma fonte comercial foi usada como um material departida, e uma suspensão de esporo conidial concentrada de cepa T22 deTrichoderma harzianium foi usada como um segundo material de partida. Asuspensão de Bradyrhizobium inicial continha cerca de 5 χ 109 de unidadesde formação de colônias / ml da bactéria. A suspensão da cepa T22 deTrichoderma harzianium continha cerca de 5 χ 108 de cfu/ml. DextrinaCrystal Tex foi adicionada às suspensões de esporos pra dar uma misturade 4% em peso/volume e misturada até ser dissolvida. Celulose (SigmacellType 50, Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) foi adicionada para cadapreparação para dar dois volumes de celulose para cada volume desuspensão de célula + Crystal Tex. Esses foram misturados poramassamento à mão em um saco de plástico até uma mistura uniforme serobtida. O resultado foi um pó de fluxo livre castanho amarelado ou verdeclaro para as preparações de Trichoderma e Bradyrhizobium,respectivamente. A atividade inicial da água (Aw) das preparações foiaproximadamente de 0,94. Os materiais foram secados no ar e os níveis deatividade da umidade foram 0,44 e 0,55 para as preparações deTrichoderma e Bradyrhizobium, respectivamente.
Preparação B. Uma segunda preparação foi preparada comcepa T22 de Trichoderma harzianium. As suspensões de esporos de péletesverdes centrifugadas e gelatinosas foram obtidas. Isto foi contido em 135 ml,e para prover um material manipulável, este volume foi aumentado para 250ml, e 3g de Crystal Tex foram dissolvidas nisso. Isto foi misturado comSigmacell (145 g) e o material foi levado à exaustão, de modo que 115 g deoutra celulose foram usadas para aumentar. Esse material continhapartículas maiores do que o material de Sigmacell. O resultado foi um fluxolivre verde, porém um pó tanto grumoso. O material foi passado por umapeneira de malha 8 para diminuir o grumo. A atividade da água inicial daamostra foi de 1,00, e, depois de secagem ao ar, isto diminuiu para 0,30.
EXEMPLO 2 - CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS
Cada um dos materiais foi facilmente suspenso em água.Exames microscópicos da suspensão mostraram um nível alto de célulasconidiais ou bacterianas nas preparações de Triehoderma ouBradyrhizobium, respectivamente. As suspensões de Triehoderma foramcolocadas em caldo de dextrose de batata e incubadas com vibraçãodurante uma noite e examinadas na manhã seguinte. Todas as conidiaisinchadas e germinadas, em contraste com os resultados obtidos commateriais secados por pulverização.
O plaqueamento da preparação de Triehoderma tanto A ou Bdeu 3 a 5 χ 109 de cfu/g de material, a despeito do fato de que a preparaçãoB teve um nível mais alto de Triehoderma, como foi evidente a partir deambas as quantidades da biomassa fúngica adicionada, e como indicadopela cor do esporo. O cfu/g das preparações do Bradyrhizobium foram 5 a 8χ 109 de cfu/g.Parte do motivo para essa discrepância foi evidente pelaobservação da preparação Β. O material era inicialmente verde (que é a corda conidia de Trichoderma) mas depois de alguns minutos, muito do materialfoi precipitado como fibras de celulose verde escuro. O exame microscópicodemonstrou que as fibras de celulose precipitadas estavam totalmentecobertas com conidia de Trichoderma (Figura 1). O processo deplaqueamento mede cada partícula, quer uma célula única ou uma fibra decelulose revestida com milhares de conidias, como uma partícula única. Istonão é necessariamente um problema para a atividade biológica dapreparação, uma vez que uma partícula com muitos esporos pode serigualmente eficaz, ou tanto mais do que uma preparação que consistesomente em células de esporo único. As partículas "carregadas" podemprover um sítio mais ativo para a atividade e o crescimento domicroorganismo e uma vez que o crescimento é crítico para a atividade, istopode não ser problema.
A celulose empregada teve um grande efeito sobre a ligação dosesporos. Algumas celuloses são quase totalmente deficientes na suacapacidade enquanto outros são muito eficientes. Embora não pretenda serexcludente para outros materiais, é considerado que materiais com um altonível de hemiceluloses podem dar uma ligação de esporos mais alta do queceluloses mais puras. Qualquer tipo pode ser eficaz, dependendo do usoprevisto. Se as conidias livres são desejáveis, então as celuloses semligação são preferidas. Entretanto, é fácil prever uma celulose de ligação ouuma mistura de hemicelulose + esporo ligado que depois pode ser revestidacom um aglutinante ou protetor que pode ser solúvel, insolúvel na água, ouque forma um gel. Esse sistema de ligação + revestimento forneceriaconcentrações de conidia localizada muito altas que poderiam serformuladas para serem resistentes às condições desagradáveis como apresença de produtos químicos incompatíveis mesmo em suspensões naágua. Outra possibilidade é impregnar as fibras de celulose com um meio decrescimento de Trichoderma que, depois de posterior encapsulação,proveria níveis muito altos de atividade de Trichoderma. Um exemplo de umuso para tal formulação é para o uso em sementes de vegetais, tais comoaquelas de cenouras, cebolas ou aipo. O Trichoderma requer uma fontenutriente para germinação e crescimento e essas sementes fornecem níveismuito baixos de exudatos de nutrientes, dessa maneira o crescimento doTrichoderma está faltando e os tratamentos das sementes não sãoeficientes. As celuloses de ligação de Trichoderma impregnadas denutrientes provêm um sistema de distribuição excelente para tais materiais.
Para os produtos serem úteis, eles devem ser tantobiologicamente ativos e custoefetivos. Na presente invenção, isto tem sidodirigido testando a eficácia de tratamentos de sementes, como descrito emExemplo 3.
EXEMPLO 3 - ATIVIDADE BIOLÓGICA DE PREPARAÇÕES
As formulações de cepa T22 de Trichoderma harzianium foramaplicadas às sementes de Mol 17 da linha endógama. Essa linha emparticular responde aos tratamentos eficazes de sementes de modo queexiste crescimento mais rápido com o organismo do que sem ele. Isso é umefeito que pode ser medido dentro de 7 a 14 dias depois de plantarsementes no solo (Harman et al., "Interaction Between Trichodermaharzianum Cepa T22 and Milho Inbred Line Mo 17 and Effects of thisInteraction on Diseases Caused by Pythium ultimum and Colletotrichumgraminicola " Fitopatoiogia 94:147-153 (2004), que é aqui a seguirincorporado por referência em sua totalidade). Além disso, é possíveldiretamente observer o crescimento de ambos T22 e outros fungos emsementes dentro de poucos dias depois de serem colocados em sugadoresde umidade quando a germinação das sementes começa.
De maior interesse foram os tratamentos de sementes que sãoaltamente custo efetivas, assim sendo desejou-se identificar formulaçõesque pudessem ser aplicadas às sementes em quantidades pequenasenquanto ainda demonstrassem atividade biológica. Dessa maneira, duastaxas de aplicação das preparações foram testadas 0,58ml/kg (1 oz/cwt) e0,06 ml/kg (0,1 oz/cwt). A taxa de 1 oz. Iguala-se a 616 pg da preparaçãopara 1 grama de sementes. Para o tratamento, as formulações descritasacima foram suspensas em água. As preparações foram feitas naconcentração de 300 mg de formulação em 5 ml de água ou, paraconcentrações mais baixas, 10X a diluição dessa concentração. Qualqueruma dessas concentrações prove um tratamento de sementes altamenteeconômico. Para o milho, na taxa alta, 0,453 Kg (1 libra) de formulaçãotrataria sementes suficientes para plantar mais do que 0,121 Km2 (30 acres).Esse material foi aplicado às sementes tanto manualmente com mistura ou,para quantidades maiores de sementes, em um em um tratador delaboratório de lote pequeno comercial Hege. Nenhuma outra etiquetaadesiva ou aditivo foi adicionada uma vez que o milho usado como o meiode encapsular forneceu excelente adesão do material às sementes.
Os primeiros testes foram avaliações do crescimento do T22 nassementes de milho (3 dias de germinação) em secadores, e essesresultados são apresentados nas Figuras 2A-B. Na fotomicrografia rotulada"não tratado" (Figura 2A), existe um crescimento copioso de fungoscontaminadores (CF) no ponto de ligação da semente para o sabugo demilho (na ponta da flecha) e pelas estruturas circulares no substrato dosecador próximo a esse ponto. Esses são fungos que estabeleceram umacolônia na semente desde a sua produção no campo. A esporulação é apartir de espécies de Penicilina, e as estruturas circulares são espécies deRhizopus ou Mucor spp. Fungos de contaminação foram observados emtodas as sementes não tratadas mas só raramente em sementes tratadascom T22. Inversamente, o T22 foi observada em todas as sementes tratadaspor grande parte ou toda a superfície das sementes, independente de teremsido tratadas com uma taxa de 2,96 ml (0,1 ou) 29,57 ml (1 oz), ou sePreparação A ou B foi usada. Na Figura 2B, o T22 é visto na borda dasemente, onde o contraste para fins fotográficos é melhor do que nasuperfície das sementes. Nessa figura, quando a fotografia é maior, philadestípicos de T22 a partir do início da esporulação são evidentes. Este é odiagnóstico para a presença de T22. Claramente, o T22 elimina os fungos decontaminação nascidos na semente e bem-crescidos eles mesmos.
A capacidade de diferentes preparações de T22 foi testada coma linha de milho endógamo Mo 17. Os resultados a seguir compararam apreparação B com um produto comercial formulado em uma base de argila.Os níveis de cfu da preparação B foram 2,4 χ 109 enquanto que o nível decfu da preparação comercial foi de uma ordem de magnitude mais baixa. AsFiguras 3A-B demonstram a eficácia das duas preparações, comparandoalturas do milho em mm 10 dias depois de plantado, com um total de 30plantas medidas. As alturas das plantas foram classificadas a partir damenor para a maior sendo dado para cada planta um número de 1 a 30dependendo do tamanho das plantas. "Verificação" refere-se ao crescimentodas plantas a partir das sementes sem nenhum tratamento. "RC" refere-seao crescimento das plantas a partir das sementes tratadas com umaformulação baseada em celulose, e "RS" é a formulação com base em argilacomercial. RC ou RS 1 refere-se a uma taxa de 0,58 ml/kg (1 oz) cwt e RCou RS 2 refere-se à taxa de 2,96 ml (0,1 oz). A formulação de RC deu umaboa intensificação no crescimento em até mesmo a taxa de 0,1 oz, enquantoque esta taxa com a formulação RS foi largamente ineficaz. A taxa de 1 ozcom a formulação RC foi provavelmente superótima. Dessa maneira, asformulações de RC são claramente altamente eficazes — 45,36 Kg (100 Ib)de semente conseguirá plantar cerca de 0,008 Km2 (dois acres), portanto aquantidade de formulação de RC para ser usada por acre é de cerca de 1,48ml (0,05 oz).
A Bradyrhizobium foi testada em sementes de soja plantadasindividualmente em recipientes de plástico tubulares com uma extremidadedistai cônica contendo orifícios que permitem a água em excesso fluir parafora do recipiente a fim de evitar alagamento de água do solo. As medidasincluíram a formação de nódulos, indicando tratamento eficaz das sementes.Quando as plantas amadureceram e o nitrogênio residual foi removido domeio de plantação, as plantas com fixação de nitrogênio eficaz eramevidentes por uma cor verde mais escura do que as plantas sem nódulos efixação de nitrogênio eficaz. O solo usado tinha um nível baixo de bactériade fixação de nitrogênio nativa. A plantação em recipientes de plantasindividuais permite a identificação de plantas individuais raras a partir dassementes não tratadas em que tais organismos de fixação de nitrogênionativo existem. Em todos os casos, as sementes foram plantadas em umamistura de 1:1 de um solo de campo de marga arenoso Arkport: MisturaCornell, que é uma mistura de turfa, vermiculite, perlite e nutrientes.
As formulações de celulose de Bradyrhizobium funcionarambem, com os melhores resultados ocorrendo quando ambos, T22 eBradyrhizobium, foram usados. A nodulação em sojas com 18- dias denascidas podem ser medidas pelo peso total de nódulos produzidos. ComT22 e Bradyrhizobium juntos, o peso do nódulo foi de 42 mg/planta e quandoas plantas de soja foram tratadas somente com Bradyrhizobium, o peso donódulo foi somente a metade (21 mg/planta).
Embora a invenção tenha sido descrita com detalhes para finsde ilustração, entende-se que tais detalhes são somente para aquele fim, evariações podem ser feitas a esse respeito por aqueles versados na técnicasem sair do espírito e escopo da invenção que é definido pelasreivindicações a seguir.

Claims (34)

1. Método para produzir uma formulação de microorganismosviáveis, o dito método compreendendo: prover uma suspensão aquosa demicroorganismos viáveis e combinar a suspensão aquosa com umasubstância insolúvel na água, absorvente na água sob condições eficazespara produzir uma formulação de microorganismos viáveis.
2. Método de acordo com a reivindicação 1 , em que aformulação tem uma atividade na água (Aw) em, ou abaixo de cerca de 1,0.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 , em que aformulação compreende pelo menos cerca de 5 χ 108 de unidades deformação de colônias de microorganismos por grama de formulação.
4. Método de acordo com a reivindicação 1 , em que asubstância insolúvel na água, absorvente na água compreende pelo menoscerca de 90% em peso total da formulação.
5. Método de acordo com a reivindicação 1 , em que osmicroorganismos são selecionados a partir do grupo que consiste embactérias, oomicetos, fungos, e combinações dos mesmos.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, em que osmicroorganismos são fungos.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o fungo éuma espécie do gênero Trichoderma.
8. Método de acordo com a reivindicação 5, em que osmicroorganismos são bactérias.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a bactéria éuma espécie do gênero Bradyrhizobium.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que asubstância insolúvel na água, absorvente na água é selecionada a partir dogrupo que consiste em zeólito, pós ou esferas porosas, sílica, produtosagrícolas da terra, produtos de madeira porosa, celulose, ciclodextrinas, ecombinações dos mesmos.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que asubstância insolúvel na água, absorvente na água é um pó de celulose.
12. Método de acordo com a reivindicação 1 , em que a ditacombinação é posta em prática amassando a suspensão aquosa com asubstância insolúvel na água, absorvente na água em um saco ou recipienteflexível.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, queadicionalmente compreende:contatar a suspensão aquosa com um material de encapsularantes da dita combinação, em que o dito material de encapsular é capaz deencapsular os microorganismos.
14. Método de acordo com reivindicação a 13, em que o materialde encapsular é selecionado a partir do grupo que consiste em quitosannativo ou modificado, amido nativo ou modificado, glucano, dextrina,celulose modificada que é solúvel na água, vegetal nativo ou modificado ougoma microbiana e combinações dos mesmos.
15. Método de acordo com a reivindicação 13, compreendendoadicionalmente:combinar a formulação de microorganismos viáveis com umpesticida químico.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendoadicionalmente:secar a formulação de microorganismos viáveis sob condiçõeseficazes para manter a viabilidade dos microorganismos.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, em que a ditasecagem é realizada por secagem no ar.
18. Formulação de microorganismos viáveis compreendendo:uma substância insolúvel na água, absorvente na água, em que a substânciainsolúvel na água, absorvente na água está presente em uma quantidade depelo menos cerca de 90% em peso total da formulação emicroorganismos misturados com a substância insolúvel naágua, absorvente na água, os ditos microorganismos estando presentes naformulação em uma quantidade de pelo menos cerca de 5 χ 10 8 unidades deformação de colônias por grama de formulação.
19. Formulação de acordo com a reivindicação 18, em que aformulação tem uma atividade na água (Aw) em, ou abaixo de cerca de 1,0.
20. Formulação de acordo com a reivindicação 18, em que asubstância insolúvel na água, absorvente na água é selecionada a partir dogrupo que consiste em zeólito, pós ou esferas porosas, sílica, produtosagrícolas da terra, produtos de madeira porosa, celulose, ciclodextrinas, ecombinações dos mesmos.
21. Formulação de acordo com a reivindicação 20, em que asubstância insolúvel na água, absorvente na água é pó de celulose.
22. Formulação de acordo com a reivindicação 18, em que osmicroorganismos são selecionados a partir do grupo que consiste emfungos, bactérias, e combinações dos mesmos.
23. Formulação de acordo com a reivindicação 22, em que osmicroorganismos são fungos.
24. Formulação de acordo com a reivindicação 23, em que ofungo é uma espécie do gênero Tríchoderma.
25. Formulação de acordo com a reivindicação 22, em que osmicroorganismos são bactérias.
26. Formulação de acordo com a reivindicação 25, em que abactéria é uma espécie do gênero Bradyrhizobium.
27. Formulação de acordo com a reivindicação 18adicionalmente compreendendo:um material para encapsular que encapsuia osmicroorganismos.
28. Formulação de acordo com a reivindicação 27, em que omaterial de encapsular está presente em uma quantidade de pelo menoscerca de 1% em peso total da formulação.
29. Formulação de acordo com a reivindicação 27, em que omaterial de encapsular é selecionado do grupo que consiste em quitosannativo ou modificado, amido nativo ou modificado, glucano, dextrina,celulose modificada que é solúvel na água, vegetal nativo ou modificado ougoma microbiana e combinações dos mesmos.
30. Preparação de microorganismos viáveis compreendendo aformulação como definida na reivindicação 18, suspensa em uma solução.
31. Método de tratar uma planta ou uma semente de planta comum microorganismo, o dito método compreendendo:prover uma preparação como definida na reivindicação 30 eaplicar a preparação para uma planta ou semente de planta sobcondições eficazes para tratar uma planta ou uma semente de planta.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que o ditotratamento confere resistência a doenças, confere resistência à pragas,melhora a nutrição e / ou rendimento, ou uma combinação dos mesmos.
33. Método de tratar uma planta ou uma semente de planta comum microorganismo, o dito método compreendendo: prover uma formulaçãocomo definida na reivindicação 18, eaplicar a formulação para uma planta ou semente de planta sobcondições eficazes para tratar a planta ou a semente de planta.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que o ditotratamento confere resistência às doenças, confere resistências às pragas emelhora a nutrição e / ou rendimento ou uma combinação dos mesmos.
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