BRPI0615680A2 - vetores e métodos para a eficiência aperfeiçoada de transformação de plantas - Google Patents
vetores e métodos para a eficiência aperfeiçoada de transformação de plantas Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0615680A2 BRPI0615680A2 BRPI0615680-0A BRPI0615680A BRPI0615680A2 BR PI0615680 A2 BRPI0615680 A2 BR PI0615680A2 BR PI0615680 A BRPI0615680 A BR PI0615680A BR PI0615680 A2 BRPI0615680 A2 BR PI0615680A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- dna
- plant
- cell
- transformation
- spp
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/41—Rhizobium
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Fodder In General (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
VETORES E MéTODOS PARA A EFICIêNCIA APERFEIçOADA DE TRANSFORMAçãO DE PLANTAS Proporcionam-se métodos e composições para a transformação aperfeiçoada de plantas mediada por bactéria. Os métodos geralmente permitem a transformação das plantas com integração reduzida da cadeia principal do vetor e uma frequêncía alta de ocorrências de transformação com poucas cópias. Vetores são descritos para obter estes resultados, como são os métodos para o seu uso.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VETORES EMÉTODOS PARA A EFICIÊNCIA APERFEIÇOADA DE TRANSFORMA-ÇÃO DE PLANTAS".
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Este pedido reivindica a prioridade do pedido provisório U.S. N-de Série 60/714.501, depositado em 6 de setembro de 2005, cujos conteú-dos inteiros são incorporados por referência neste documento.
1. Campo da Invenção
A presente invenção refere-se, em geral, ao campo da biologiamolecular. Mais especificamente, a invenção refere-se a métodos aperfeiço-ados para a transformação genética de plantas e composições para atingiristo.
2. Descrição da Técnica Relacionada
A transformação de células de plantas por um método mediadopor Agrobacterium envolve a exposição das células e tecidos de plantas auma suspensão de células de Agrobacterium que contêm certos plasmídiosde DNA. Estes plasmídios têm sido construídos especificamente para contertransgenes que expressarão nas células de plantas (vide, por exemplo, aPatente U.S. N- 5.034.322). Mais freqüentemente, um ou mais dos transge-nes são um transgene marcador selecionável positivo que permite que ascélulas de plantas desenvolvam-se na presença de um composto de seleçãopositivo, tal como um antibiótico ou herbicida. Estas células podem ser adi-cionalmente manipuladas para regenerar em plantas férteis inteiras.
Os métodos para introduzir os transgenes nas plantas por ummétodo de transformação mediada por Agrobacterium geralmente envolvemum T-DNA (DNA de transferência) que incorpora os elementos genéticos depelo menos um transgene e transfere estes elementos genéticos para o ge-noma de uma planta. O(s) transgene(s) é(são) tipicamente construído(s) emum vetor de plasmídio de DNA e é(são) normalmente flanqueado(s) por umaregião de DNA de limite à direita (RB) e uma região de DNA de limite à es-querda (LB) de plasmídio Ti de Agrobacterium. Durante o processo de trans-formação mediada por Agrobaeterium, o plasmídio de DNA é cortado poruma endonuclease, VirD2, nas regiões de limite à direita e à esquerda. Umaúnica fita de DNA de entre os cortes, chamada a fita T1 é transferida da célu-la de Agrobacterium para a célula de planta. A seqüência que corresponde àregião de T-DNA é inserida no genoma da planta.
A integração do T-DNA no genoma da planta geralmente come-ça na RB e continua no final do T-DNA, na LB. Entretanto, as endonucleasesalgumas vezes não cortam igualmente em ambos os limites. Quando istoacontece, o T-DNA que é inserido no genoma da planta freqüentemente con-tém algum ou todo o DNA do vetor de plasmídio. Este fenômeno é referidocomo "leitura completa do limite". Normalmente é preferido que somente o(s)transgene(s) localizado(s) entre as regiões de limite à direita e à esquerda (oT-DNA) seja(m) transferido(s) para o genoma da planta sem qualquer doDNA do vetor de plasmídio adjacente (a cadeia principal do vetor). O DNAda cadeia principal do vetor contém diversos elementos de manutenção doplasmídio, incluindo, por exemplo, a origem de replicação, os genes marca-dores selecionáveis bacterianos, e outros fragmentos de DNA que não sãorequeridos para expressar a(s) característica(s) desejada(s) em produtoscomerciais de cultivo.
São dirigidos recursos consideráveis no exame do genoma deplantas transgênicas de cultivo quanto à presença do DNA da cadeia princi-pal do vetor. Métodos tais como a reação em cadeia por polimerase (PCR) ea análise por Southern blot são mais freqüentemente empregados para iden-tificar o DNA da cadeia principal do vetor estranho. Estes métodos são con-sumidores de tempo e caros para o trabalho de exame em grande escala. Asplantas transgênicas que são verificadas conter o DNA da cadeia principaldo vetor não são geralmente preferidas para a comercialização. Ademais, asplantas transgênicas que contêm mais do que dois transgenes são normal-mente de pouco valor para o desenvolvimento comercial. São gastos esfor-ços substanciais regenerando plantas a partir de cultura de células de plan-tas que não têm nenhum potencial comercial.
Assim, seria de grande benefício se pudessem ser desenvolvi-dos métodos e composições que reduzissem muito a ocorrência de DNA dacadeia principal do vetor no genoma de plantas transgênicas e/ou aumen-tassem a freqüência das ocorrências de transformação com poucas cópias.Menos plantas transgênicas teriam de ser produzidas se um maior númeroestivesse livre do DNA da cadeia principal do vetor e mais plantas teriamuma ou duas cópias dos transgenes, aumento bastante a eficiência da pro-dução de plantas transgênicas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
De acordo com um aspecto da invenção, proporcionam-se cons-tructos e métodos para aperfeiçoar a qualidade das ocorrências na transfor-maçãó de células de plantas mediadas de modo bacteriano, tal como atransformação de plantas mediada por Agrobacterium. A invenção é vantajo-sa em proporcionar uma freqüência reduzida de ocorrências dé transforma-ção de DNA da cadeia principal do vetor, isto é, a região que não é de T-DNA1 e de aumentar a freqüência das ocorrências de transformação de T-DNA com uma ou duas cópias do T-DNA.
A invenção também proporciona constructos de DNA para trans-formar as plantas, compreendendo: i) pelo menos uma região de limite de T-DNA; ii) pelo menos um transgene heterólogo adjacente à região de limite;iii) uma região de codificação para um marcador selecionável bacteriano; eiv) pelo menos um segmento de DNA, compreendendo um elemento eis e/outrans de uma origem de replicação para manter um baixo número de cópiasdo constructo de DNA em uma bactéria de transformação de células de plan-tas.
Em certas modalidades da invenção, os elementos da origem dereplicação para manter um baixo número de cópias de um constructo deDNA em uma célula bacteriana de transformação de células de plantas(competente para a transformação de células de plantas) compreendem umou mais de repA (por exemplo, SEQ ID NO:32 ou SEQ ID NO:38); repB (porexemplo, SEQ ID NO:33 ou SEQ ID NO:39); repC (por exemplo, SEQ IDNO:34 ou SEQ ID N0:40); igsl (por exemplo, SEQ ID NO:35 ou SEQ IDNO:41); igs2 (por exemplo, SEQ ID NO:36 ou SEQ ID NO:42). Um construc-to pode também opcionalmente incluir uma seqüência palindrômica, por e-xemplo, a seqüência palindrômica de 16 bp de SEQ ID NO:37. Estes ele-mentos podem ser arranjados em eis ou em trans em relação um ao outro.
Em algumas modalidades, a uma região de limite de T-DNA édefinida como uma região de limite à direita (RB) ou uma região de limite àesquerda (LB). Além disso, em certas modalidades, as seqüências de RBe/ou LB compreendem a SEQ ID NO:43 ou a SEQ ID NO:44. Nas modalida-des particulares, um transgene heterólogo, quando expresso em uma célulade planta transformada, proporciona um fenótipo agronômico para a célulaou a planta transformada derivada da célula. Nas modalidades adicionais,uma região de codificação para um marcador selecionável bacteriano é umgene de resistência a antibióticos selecionado a partir de gene de resistênciaà canamicina, gene de resistência à gentamicina, gene de resistência aocloranfenicol, gene de resistência à espectinomicina, gene de resistência àestreptomicina, gene de resistência à tetraciclina, gene de resistência à am-picilina, gene de resistência à blasticidina, gene de resistência à higromicina,gene de resistência à puromicina, ou gene de resistência à Zeocina.
Em algumas modalidades, uma origem de replicação compreen-de uma seqüência de repABC selecionada a partir de SEQ ID NOs: 1, 2, 3,ou 4. Em uma modalidade, o pelo menos um segmento de DNA compreendeos genes de replicação repA, repB, e repC. Em algumas modalidades, o pelomenos um segmento de DNA compreende a seqüência intergênica 1 (igsl) ea seqüência intergênica 2 (igs2). Em algumas modalidades, o pelo menosum segmento de DNA compreende uma seqüência palindrômica de 16 paresde bases. Em outras modalidades, o segmento de DNA compreende todasas seqüências de repABC necessárias para manter um baixo número decópias (1-3 cópias por célula) em Agrobacterium ou outras bactérias compe-tentes para transformar células de plantas. Os constructos que contêm re-pABC e os métodos ou o seu uso são descritos em mais detalhe abaixo.
Os constructos de DNA da presente invenção podem ser trans-feridas para qualquer célula, por exemplo, tal como uma bactéria competen-te para a transformação de células de plantas. Tais bactérias são conheci-das na técnica e podem, por exemplo, pertencer às seguintes espécies: A-grobacterium spp., Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp.,Phyllobacterium spp. Ochrobactrum spp. e Bradyrhizobium spp. De prefe-rência, tais bactérias podem pertencer à Agrobacterium spp. Os constructosde DNA da presente invenção podem adicionalmente compreender uma oumais origens de replicação para manter as cópias do constructo na E. coli.Em algumas modalidades, a origem de replicação para manter as cópias doconstructo na E. coli é derivada de pelo menos um de pBR322 e pUC.
A presente invenção também se refere a uma bactéria de trans-formação de células de plantas compreendendo o constructo de DNA dapresente invenção, e que pode ser usada para transformar uma célula deplanta. Em algumas modalidades, as bactérias de transformação de plantassão selecionadas a partir de Agrobacterium spp., Rhizobium spp., Sinorhizo-bium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobaeterium spp. Oehrobaetrum spp. ouBradyrhizobium spp.
A presente invenção também se refere a um método para trans-formar uma célula de planta compreendendo: contatar pelo menos uma pri-meira célula de planta com uma bactéria de transformação de célula de plan-ta da presente invenção; e selecionar pelo menos uma célula de plantatransformada com pelo menos um transgene heterólogo. Em algumas moda-lidades, a célula de planta é uma célula de planta de soja, canola, milho, oualgodão. Em uma modalidade, um método da invenção adicionalmente com-preende regenerar uma planta a partir da célula de planta.
A presente invenção também se refere a um método de produziralimento, ração ou um produto industrial, compreendendo: obter a planta dapresente invenção ou uma parte dela; e preparar o alimento, a ração ou oproduto industrial a partir da planta ou parte dela.
A invenção também inclui os métodos de transformar genetica-mente as plantas com os constructos de DNA da presente invenção e redu-zir a freqüência de plantas transformadas com uma região do vetor que nãoé de T-DNA. Em algumas modalidades, a freqüência de plantas transforma-das com uma região que não seja de T-DNA pode ser definida como menosdo que, ou igual a, cerca de 20%. Em algumas modalidades, a freqüência émenor do que, ou igual a, cerca de 15%, em algumas modalidades menor doque cerca de 10%, e em algumas modalidades menor do que, ou igual a,cerca de 8% ou 5%. Em algumas modalidades dos métodos da invenção, afreqüência de ocorrências de transformação com uma ou duas cópias de T-DNA é maior do que, ou igual a, cerca de 70% ou 75%. Em algumas modali-dades, esta freqüência pode ser elevada para maior do que, ou igual a, cer-ca de 80% ou 85%, e em algumas modalidades, para maior do que cerca de90% ou 95%.
Além de um oriRi de tamanho natural, a presente invenção incluivetores de transformação de plantas contendo mutantes e variantes de oriRlque conservam uma função substancialmente similar à seqüência de tama-nho natural, quando usados na presente invenção. Por exemplo, os reque-rentes identificaram a seqüência truncada descrita em SEQ ID NO: 3, que éadequada para uso na presente invenção. Alguém versado na técnica podeprontamente fazer alterações, remoções, substituições adicionais, etc. naseqüência de oriRi e examinar quanto à atividade funcional usando os méto-dos da presente invenção. Assim, a presente invenção inclui tais variantes emutantes.
As características e as vantagens adicionais da invenção serãoapresentadas, em parte, na descrição que se segue e, em parte, serão ób-vias a-partir da descrição, ou podem ser aprendidas por prática da invenção.
As características e as vantagens da invenção serão compreendidas e atin-gidas por meio dos elementos e das combinações particularmente mostra-dos nas reivindicações em anexo.
É para ser entendido que tanto a descrição geral precedentequanto a descrição detalhada a seguir são ilustrativas e explicativas somentee não são restritivas da invenção, conforme reivindicada.
Os desenhos que acompanham, os quais são incorporados no, econstituem uma parte deste, relatório descritivo, ilustram as diferentes moda-Iidades da invenção e, juntamente com a descrição, servem para explicar osprincípios da invenção.
A não ser que de outro modo definidos, todos os termos técnicose científicos usados neste documento têm o mesmo significado como co-mumente entendidos por alguém versado na técnica à qual pertence estainvenção. A terminologia usada na descrição da invenção neste documentoé para descrever modalidades particulares somente e não é pretendida serlimitativa da invenção. Conforme usadas na descrição da invenção e nasreivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" sãopretendidas incluir as formas plurais também, a não ser que o contexto cla-ramente indique de outro modo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 mostra um mapa de plasmídio de pMON83856, o ve- -tor de base com um fragmento de oriRi de 5,6 kb usado para o constructo depMON83882 para a transformação da soja e pMON97352 para a transfor-mação do milho.
A figura 2 mostra um mapa de plasmídio de pMON83882, o ve-tor de teste com um fragmento de oriRi de 5,6 kb e o gene marcador sele-cionável de 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (CP4-EPSPS) e o geneuidA (gus) de interesse, como um exemplo, para a transformação da soja.
A figura 3 mostra um mapa de plasmídio de pMON83934, umvetor de base com um fragmento de oriRi de 4,2 kb usado para o constructode pMON83937.
A figura 4 mostra um mapa de plasmídio de pMON83937, umvetor de teste com um fragmento de oriRi de 4,2 kb e o gene marcador sele-cionável CP4 e o GOI (gus), como um exemplo, para a transformação dasoja.
A figura 5 mostra um mapa de plasmídio de pMON97352, umvetor de teste com um fragmento de oriRi de 5,6 kb e o gene marcador sele-cionável CP4 e o GOI (gus), como um exemplo, para a transformação domilho.
A figura 6 mostra um mapa de plasmídio de pMON92726, o qualfoi usado como um controle para a transformação do milho. Ele contém amesma estrutura de gene que o pMON97352, exceto pela origem de replica-ção. Ele contém oriVem vez de oriRi.A figura 7 mostra um mapa de plasmídio de pMON87488, umvetor de transformação de 2 T-DNA, o qual foi usado como um controle paraa transformação da soja. Ele contém oriVem vez de oriRi.
A figura 8 mostra um mapa de plasmídio de pMON96001, umvetor de teste de transformação de 2 T-DNA com um fragmento de orifíi de4,3 kb e o gene marcador selecionável CP4 e o GOI (gus), como um exem-plo, para a transformação da soja.
A figura 9 mostra um mapa de plasmídio de pMON96010, umvetor de teste de transformação de 2 T-DNA com um fragmento de oriRi de5,6 kb e o gene marcador selecionável CP4 e o GOI (gus), como um exem-plo, para a transformação da soja.
A figura 10 mostra o efeito do tipo de origem de replicação sobrea freqüência de transformação no milho. As barras de erros representam ointervalo de segurança de 95%; * indica uma diferença significativa entreor/f?/'(pMON97352) e or/V(pMON92726).
A figura 11 mostra o efeito do tipo de origem de replicação sobrea transferência da seqüência da cadeia principal na transformação do milho.As barras de erros representam o intervalo de segurança de 95%; * indicauma diferença significativa entre oriRi (pMON97352) e oriV (pMON92726).oriRi/oriV, RB, e LB indicam o tipo de sonda da cadeia principal usada.
A figura 12 mostra o efeito do-tipo de origem de replicação sobrea qualidade do transgene na transformação do milho. As barras de erros re-presentam o intervalo de segurança de 95%. 0, 1,2, 3+ indicam o númerode cópias.
A figura 13 mostra um mapa de plasmídio de pMON96951 con-tendo a origem de replicação de repABC a partir do plasmídio p42b de Rhi-zobium ef//'CFN42 e o gene marcador selecionável de EPSPS CP4 para soja.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A invenção agora será descrita por referência a modalidadesmais detalhadas, com referência ocasional aos desenhos que acompanham.Esta invenção pode ser concretizada, entretanto, em diferentes formas e nãodeve ser interpretada como limitada às modalidades apresentadas nestedocumento. De preferência, estas modalidades são ilustrativas e proporcio-nadas de modo que esta descrição será eficiente e completa, e transmitiráinteiramente o escopo da invenção para aqueles versados na técnica.
A presente invenção refere-se, em parte, à descoberta que aorigem de replicação repABC, tal como aquela de pRi de Agrobacterium rhi-zogenes ("oriRí' ou "oriPRf), que mantém 1-3 cópias em bactérias, tais co-mo Agrobacterium, pode ser usada em vetores de transformação de plantase pode conferir ocorrências de transformação altamente desejáveis. Os veto-res da invenção podem, por exemplo, reduzir significativamente a freqüênciade ocorrências de transformação que transferem a região que não é de "Γ-ΟΝΑ, isto é, o DNA da cadeia principal do vetor, e podem, por exemplo, au-mentar significativamente o número ocorrências de transformação com umaou duas cópias de T-DNA, isto é, o gene de interesse. A técnica anterior nãoensina ou sugere o uso de oriRi para obter estes resultados inesperados detransformação. Os vetores e os métodos da invenção aperfeiçoam as ocor-rências de transformação na preparação de plantas transgênicas de cultivo.
Conforme usado neste documento, uma planta transgênica decultivo contém uma molécula de polinucleotídeo exógeno ou um transgeneheterólogo inserido no genoma de uma célula de planta de cultivo. Uma cé-lula de planta de cultivo inclui, sem limitação, uma célula de:planta, e adicio-nalmente compreende culturas em suspensão, embriões, regiões meriste-máticas, tecido do calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, óvu-los, pólen e microesporos, e sementes, e fruta. Por "exógeno" ou "heterólo-go" pretende-se uma molécula de polinucleotídeo que se origina do lado defora da célula de planta na qual é introduzida a molécula de polinucleotídeo.Uma molécula de polinucleotídeo exógeno pode ter uma seqüência de nu-cleotídeos de ocorrência natural ou de ocorrência não natural. Alguém ver-sado na técnica entende que uma molécula de polinucleotídeo exógeno po-de ser uma molécula heteróloga derivada de uma espécie diferente de qual-quer outro organismo ou da espécie de planta do que a planta na qual é in-troduzida a molécula de polinucleotídeos, ou pode ser uma molécula de poli-nucleotídeo derivada da mesma espécie de planta que a planta na qual ela éintroduzida.
O polinucleotídeo exógeno (transgene heterólogo), quando ex-presso em uma célula de planta transformada, proporciona uma característi-ca agronômica para a célula ou para uma planta transformada derivada dacélula. Estes genes de interesse (GOI) proporcionam características agro-nômicas benéficas para as plantas de cultura, por exemplo, incluindo, porémna limitadas aos elementos genéticos compreendendo resistência a herbici-das (Patente U.S. N2 5.633.435; Patente U.S. N2 5.463.175), rendimentoaumentado (Patente U.S. N2 5.716.837), controle de inseto (Patente U.S. N26.063.597; Patente U.S. N2 6.063.756; Patente U.S. N2 6.093.695; PatenteU.S. N2 5.942.664; Patente U.S. N2 6.110.464), resistência a doenças fúngi-cas (Patente U.S. N2 5.516.671; Patente U.S. N2 5.773.696; Patente U.S. N26.121.436; e Patente U.S. N2 6.316.407; e Patente U.S. N2 6.506.962), resis-tência a vírus (Patente U.S. N2 5.304.730 e Patente U.S. N2 6.013.864), re-sistência a nematóides (Patente U.S. N2 6.228.992), resistência a doençasbacterianas (Patente U.S. N2 5.516.671), produção de amido (Patente U.S.N2 5.750.876 e Patente U.S. N2 6.476.295), produção de óleos modificados(Patente U.S. N2 6.444.876), alta produção de óleos (Patente U.S. N25.608.149 e Patente U.S. N2 6.476.295), teor modificado de ácidos graxos- (Patente U.S. N2 6.537.750), alta produção de proteínas (Patente U.S. N26.380.466), amadurecimento das frutas (Patente U.S. N2 5.512.466), nutri-ção aumentada de animais e seres humanos (Patente U.S. N2 5.985.605 ePatente U.S. N2 6.171.640), biopolímeros (Patente U.S. N2 5.958.745 e Pubde Patente U.S. 2003/0028917), resistência à tensão ambiental (Patente U.S.N2 6.072.103), peptídeos farmacêuticos (Patente U.S. N2 6.080.560), carac-terísticas aperfeiçoadas de processamento (Patente U.S. N2 6.476.295), di-gestibilidade melhorada (Patente U.S. N2 6.531.648), baixo teor de rafinose(Patente U.S. N2 6.166.292), produção industrial de enzimas (Patente U.S.N2 5.543.576), aroma aperfeiçoado (Patente U.S. N2 6.011.199), fixação denitrogênio (Patente U.S. N2 5.229.114), produção de sementes híbridas (Pa-tente U.S. N2 5.689.041), e produção de biocombustível (Patente U.S. N25.998.700), os elementos genéticos e os transgenes descritos nas patenteslistadas acima são incorporados neste documento por referência.
A presente invenção proporciona constructos de DNA recombi-nante de plantas para produzir plantas transgênicas de cultivo. Os métodosque são bastante conhecidos para aqueles versados na técnica podem serusados para preparar o constructo de DNA recombinante de planta de culti-vo da presente invenção. Estes métodos incluem as técnicas de DNA re-combinante in vitro, as técnicas sintéticas, e a recombinação genética in vivo.Tais técnicas são descritas em Sambrook e outros, (1989). As moléculas depolinucleotídeos exógenos criadas pelos métodos podem ser transferidaspara uma célula de planta de cultivo por uma bactéria de transformação deplanta, tal como Agrobacterium, ou por outros métodos conhecidos para a-queles versados na técnica de transformação de plantas. A transferência degene para as plantas foi mostrada usando diversas espécies de bactérias,conforme descrito em Broothaerts e outros (2005) e no pedido provisório US60800872, neste documento incorporado por referência. Os constructos deDNA recombinante da presente invenção podem ser transferidas para umacélula de planta de cultivo por transformação usando Sinorhizobium meliloti,Rhizobium sp., Mesorhizobium ioti, ou qualquer outra bactéria capaz detransformar uma célula de planta.
A-invenção inclui os vetores de transformação de plantas parauso na transformação de plantas mediada por Agrobacterium. Os vetores dapresente invenção são geralmente plasmídios, porém a origem de replicaçãooriRi pode ser substituída por outras origens de replicação da família re-pABC para manter o número de cópias muito baixo (1-3 cópias por célula)no Agrobacterium. Também, os vetores sem uma origem de replicação paraa manutenção em Agrobacterium são capazes de manter eles próprios noAgrobacterium com seqüências no T-DNA que podem ser integradas noplasmídio Ti em A. tumefaciens, plasmídio Ri em A. rhizogenes ou no cro-mossomo de Agrobacterium através de recombiriação homóloga. Isto resultano mesmo efeito de uma redução na inserção da seqüência que não é de T-DNA e um aumento nas ocorrências de transformação com baixo número decópias, visto que o cromossomo, o plasmídio Ti ou Ri está presente em umaúnica cópia. Quando as espécies Rhizobia ou que não sejam de Agrobacte-rium forem usadas para a transformação de plantas, o GOI contendo o T-DNA pode ser integrado no cromossomo ou nos plasmídios de repABC nasbactérias hospedeiras, o quê pode produzir o mesmo efeito que o Agrobac-terium faz.
Um vetor da presente invenção pode compreender pelo menosuma de região de limite à direita ou de limite à esquerda do plasmídio Ti deAgrobacterium. Os vetores podem compreender pelo menos um par de Iimi-tes. Os vetores podem incluir quatro pares de limites, porém o vetor freqüen-temente compreende um ou dois pares.
Os vetores da presente invenção podem adicionalmente com-preender uma região de codificação para um marcador selecionável para amanutenção em hospedeiros bacterianos. As regiões de codificação para osmarcadores selecionáveis incluem Spec/Strp que codifica para a Tn7 amino-glicosídeo adeniltransferase (aadA) conferindo resistência à espectinomicinaou à estreptomicina, ou um gene marcador selecionável para gentamicina(Gm, Gent). Os outros genes de resistência incluem os genes de resistênciaà carbenecilina, ampicilina, e canamicina. Outros são conhecidos e podemser prontamente usados na presente invenção por aqueles versados na téc-nica. -
Os vetores da presente invenção podem também compreenderuma região de codificação para um gene marcador selecionável de planta, oqual está tipicamente localizado no T-DNA, para selecionar as células deplantas transformadas com o reagente correspondente. O marcador selecio-nável de planta pode proporcionar resistência a um composto de seleçãopositivo, por exemplo, resistência a antibióticos (por exemplo, canamicina,G418, bleomicina, higromicina, etc.), ou resistência a herbicidas (por exem-plo, incluindo, porém não limitados ao: glifosato, Dicamba1 glufosinato, sulfo-niluréia, imidazolinonas, bromoxinil, dalapon, cicloexanodiona, inibidores daprotoporfirinogênio oxídase, e herbicidas de isoxaflutol). As moléculas depolinucleotídeos que codificam proteínas envolvidas na tolerância aos herbi-cidas são conhecidas na técnica, e incluem, porém não estão limitadas auma molécula de polinucleotídeo codificando a) tolerância a um glifosatoincluem as 5-enolpiruvinilshikimato-3-fosfato sintases (EPSPS; Patente U.S.5.627.061, Patente U.S. 5.633.435, Patente U.S. 6.040.497, Patente U.S.5.094.945, W004074443, e W004009761), a glifosato oxidorreductase(GOX; Patente U.S. 5.463.175), a glifosato descarboxilase (W005003362 ePedido de Patente U.S. 20040177399), e a glifosato-N-acetil transferase(GAT; publicação de Patente U.S. 20030083480) conferindo tolerância aoglifosato; b) a dicamba monooxigenase (DMO, codificada por ddmC) confe-rindo tolerância aos herbicidas similares à auxina, tais como dicamba (Pedi-dos de Patentes U.S. 20030115626, 20030135879; Herman e outros, 2005);c) a fosfinotricina acetiltransferase (ba/) conferindo tolerância à fosfinotricinaou ao glufosinato (U.S. 5.646.024, U.S. 5.561.236, EP 275.957; U.S.5.276.268; U.S. 5.637.489; U.S. 5.273.894); d) a ácido 2,2-dicloropropiônicodesalogenase conferindo tolerância ao ácido 2,2-dicloropropiônico (DaIapon)(W09927116); e) a acetoidroxiácido sintase ou a acetolactato sintase confe-rindo tolerância aos inibidores da acetolactato sintase, tais como sulfoniluréia,imidazolinona, triazolopirimidina, pirimidiloxibenzoatos e ftalida (U.S.6.225.105; U.S. 5.767.366. U.S. 4.761.373; U.S. 5.633.437; U.S. 6.613.963;U.S. 5.013.659; U.S. 5.141.870; U.S. 5.378.824; U.S. 5.605.011); f) a haloa-rilnitrilase (Bxn) para conferir tolerância ao bromoxinil (W08704181A1; U.S.4.810.648; W08900193A); g) a acetil-coenzima A carboxilase modificadapara conferir tolerância à cicloexanodiona (setoxidim) e ao ariloxifenoxipropi-onato (haloxifop) (U.S. 6.414.222); h) a diidropteroato sintase {sul\) para con-ferir tolerância aos herbicidas de sulfonamida (U.S. 5.597.717; U.S.5.633.444; U.S. 5.719.046); i) o polipeptídeo do fotossistema Il de 32 kD(psbA) para conferir tolerância aos herbicidas de triazina (Hirschberg e ou-tros, 1983); j) a antranilato sintase para conferir tolerância ao 5-metiltrip-tofano (U.S. 4.581.847); k) o ácido diidrodipicolínico sintase (dapA) para con-ferir tolerância à ami.noetil cisteína (W08911789); I) a fitoeno dessaturase(crtI) para conferir tolerância aos herbicidas de piridazinona, tais como o nor-flurazon (JP06343473); m) a hidróxi-fenil piruvato dioxigenase para conferirtolerância aos herbicidas de ciclopropilisoxazol, tais como o isoxaflutol (WO9638567; U.S. 6.268.549); n) a protoporfirinogênio oxidase I modificada (pro-tox) para conferir tolerância aos inibidores de protoporfirinogênio oxidase(U.S. 5.939.602); e o) a ariloxialcanoato dioxigenase (AAD-1) para conferirtolerância a um herbicida contendo uma porção de ariloxialcanoato(W005107437). Os exemplos de tais herbicidas incluem as fenóxi auxinas(tais como 2,4-D e diclorprop), a piridilóxi auxinas (tais como o fluoroxipir e otriclopir), os inibidores da ariloxifenoxipropionatos (AOPP) acetil- coenzima Acarboxilase (ACCase) (tais como haloxyfop, quizalofop, e diclofop), e os ini-bidores da fenoxiacetato protoporfirinogênio oxidase IX substituídos em 5(tais como o pyraflufen e o flumiclorac).
Além de um marcador selecionável de planta, em algumas mo-dalidades pode ser desejável usar um gene relator. Em algumas situações,um gene relator pode ser usado com ou sem um marcador selecionável. Osgenes relatores são genes que não estão tipicamente presentes no organis-mo ou tecido receptor e tipicamente codificam as proteínas, resultando emalguma alteração fenotípica ou propriedade enzimática. Os exemplos de taisgenes são proporcionados em Wising e outros (1988), que é incorporadoneste documento por referência. Os genes relatores preferidos incluem abeta-glicuronidase (GUS) do lócus uidA de E. coli, o gene de cloranfenicolacefil transferase de Tn9 de E. coli, a proteína fluorescente verde da medusabioluminescente Aequorea victoria, e os genes de Iuciferase do vaga-lumePhotinus pyralis. Um ensaio para detectar a expressão do gene relator podeentão ser efetuado, em um tempo adequado após o dito gene ter sido intro-duzido nas células receptoras. Tal ensaio preferido envolve o uso do genecodificando a beta-glicuronidase (GUS) do lócus uidA de E. coli, conformedescrito por Jefferson e outros (1987), para identificar as células transforma-das, referido neste documento como GUS.
Em algumas modalidades, os vetores da presente invençãocompreendem uma origem de replicação para a manutenção em E. coli. Es-tas origens de replicação podem ser derivadas, por exemplo, de pBR322 oude pUC. Um exemplo de tal origem de replicação é Co/E1. Os vetores dapresente invenção podem incluir qualquer origem de replicação que mante-nha pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70,80, 90, ou 100 ou mais cópias de plasmídios em E. coli. Em algumas moda-lidades, a ori mantém um maior número de cópias em E. coli (por exemplo,mais do que 5, 10, 15, 20, 25, ou 30, e em algumas modalidades adicionais,mais do que 10, 15, 20, 25 ou 30). Tais vetores com alto número de cópiastornam mais fácil amplificar a quantidade de DNA disponível para a trans-formação. Assim, em algumas modalidades, a presente invenção inclui umvetor contendo uma ori que proporciona altos números de cópias em célulasde E. coli, e uma segunda ori, tal como uma ori pertencendo à família de re-pABC, por exemplo, oriRi, que mantém o número de cópias extremamentebaixo, por exemplo, 1 -3, em Agrobacterium.
Os vetores da presente invenção também compreendem pelomenos um segmento de DNA, compreendendo elementos eis e/ou trans, oqual é necessário e suficiente para a manutenção do plasmídio com baixascópias (1-3 cópias) em uma bactéria transformadora de plantas, tal comoAgrobacterium. O pelo menos um segmento de DNA preferivelmente com-preende uma origem de replicação da família de repABC. Ademais, o pelomenos um segmento de DNA pode incluir uma origem de replicação deplasmídio Ri de Agrobacterium rhizogenes (oriRi) e/ou origem de repABC deplasmídio p42b de Rhizobium etli. Ainda adicionalmente, a família de re-pABC preferivelmente compreende os genes de replicação repA, repB, erepC. O pelo menos um segmento também pode compreender as seqüên-cias da região intergênica, igsl e igs2. Ainda adicionalmente, o pelo menosum segmento de DNA pode incluir um palíndromo de 16 bp após repC.
Conforme usado aqui, a "origem de replicação" de um plasmídiode "repABC', isto é, um plasmídio que utiliza tais seqüências para a replica-ção e a divisão em uma célula, pode ser definida como compreendendo re-pA (por exemplo, SEQ ID NO:32 de pRi de A. rhizogenes; SEQ ID NO:38 dep42b de R. etli), repB (por exemplo, SEQ ID NO: SEQ ID. NO:33 de A. rhizo-genes; SEQ ID NO:39 de p42b de R. etli), repC (por exemplo, SEQ ID NO:SEQ ID NO:34 de A. rhizogenes; SEQ ID N0:40 de p42b de R. etli), /gs1(por exemplo, SEQ ID NO:35 de A. rhizogenes; SEQ ID NO:41 de p42b de R.etli)), igs2 (por exemplo, SEQ ID NO:36 de A. rhizogenes; SEQ ID NO:42 dep42b de R. etli), e pode opcionalmente compreender uma seqüência palin-drômica (por exemplo, SEQ ID NO:37). Em outras modalidades, a origem dereplicação pode compreender aquelas seqüências requeridas para manter onúmero de cópias baixo (por exemplo, de 1 a cerca de 3 cópias) dentro deuma célula bacteriana transformadora de células de plantas. Os exemplosde tais origens de replicação de repABC são encontrados em SEQ IDNOs:1-4, na oriRi do plasmídio Ri de A. rhizogenes, e no plasmídio p42b deR. etli, entre outros.
Em uma modalidade, o pelo menos um segmento é como identi-ficado em SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o pelo menos um segmen-to consiste essencialmente na seguinte seqüência: oriRi de 5618 bp de ba-ses de pMON83882 (633-6250), identificada como SEQ ID NO:2. Em umaoutra modalidade, o pelo menos um segmento compreende e/ou consisteessencialmente na seqüência identificada em SEQ ID NO:3. Em mais umaoutra modalidade, o pelo menos um segmento pode ser repABC de p42b apartir de R. etli, como identificado em SEQ ID NO:4.
Estão incluídas na definição de qualquer da seqüência de ácidosnucléicos ou polipeptídeos definida neste documento as seqüências que exi-bem um grau especificado de identidade com tais seqüências. Por exemplo,deve ser observado que, embora sejam descritas neste documento seqüên-cias de ácidos nucléicos específicas, podem ser feitas modificações nas se-qüências descritas, sem sair do escopo da invenção. Em particular, as se-qüências de ácidos nucléicos que são substancialmente idênticas àquelasapresentadas neste documento podem ser usadas com a presente invenção.Uma primeira seqüência de ácidos nucléicos mostra "identidade substancial"com uma seqüência de ácidos nucléicos de referência se, quando alinhadaotimamente (com as inserções ou as remoções de nucleotídeos apropriadastotalizando menos do que 20 por cento da seqüência de referência sobre ajanela de comparação) com o outro ácido nucléico (ou sua fita complemen-tar), houver pelo menos cerca de 75% de identidade de seqüência de nucle-otídeos, preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade, mais pre-ferivelmente pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, ou 89% de identi-dade, e mais preferivelmente ainda pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade sobre uma janelade comparação de pelo menos 200 posições de nucleotídeos, preferivelmen-te pelo menos 300 posições de nucleotídeos, mais preferivelmente pelo me-nos 400 posições de nucleotídeos, e mais preferivelmente ainda sobre ocomprimento inteiro do primeiro ácido nucléico. O alinhamento de seqüên-cias ótimo para alinhar uma janela de comparação pode ser conduzido pelométodo de similaridade de Pearson e Lipman (1988); preferivelmente porimplementações computadorizadas destes algoritmos no Wisconsin Gene-tics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, Madison, Wl.
O ácido nucléico de referência pode ser uma molécula de tamanho naturalou uma porção de uma molécula mais longa.
Alternativamente, dois ácidos nucléicos têm identidade substan-cial se um hibridiza com o outro sob condições severas de hibridização. Otermo "condições severas de hibridização" é definido como as condições sobas quais uma seqüência de teste hibridiza especificamente com (uma) se-qüência(s)-alvo, porém não com as seqüências que não são alvo, conformepode ser determinado empiricamente. O termo "condições severas" é fun-cionalmente definido em relação à hibridização de uma sonda de ácido nu-cléico com um ácido nucléico-alvo (isto é, com uma seqüência de ácidosnucléicos particular de interesse) pelo procedimento de hibridização especí-fica (vide, por exemplo, Sambrook e outros, 1989, em 9.52-9.55, Sambrook eoutros, 1989 em 9.47-9.52, 9.56-9.58; Kanehisa, 1984; e Wetmur e Davidson,1968). As condições severas apropriadas para a hibridização de DNA são,por exemplo, 6,0x cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) em torno de 45°C,seguido por uma lavagem de 0,2x SSC a 50°C. Os detalhes de tais métodossão conhecidos para aqueles versados na técnica ou podem ser encontra-dos nos manuais de laboratório, incluindo, porém não limitados ao CurrentProtocols in Molecular Biology (1989). Em algumas modalidades, podem serusadas condições de severidade menores alterando-se a lavagem para cer-ca de 2,Ox SSC a 50°C. Além disso, a temperatura na etapa de lavagem po-de ser aumentada de condições de baixa severidade na temperatura ambi-ente, aproximadamente 22°C, para condições de maior severidade em tornode 65°C. Tanto a temperatura quanto o sal podem ser variados, ou a tempe-ratura ou a concentração de sal pode ser mantida constante, enquanto aoutra variável é alterada. Por exemplo, a hibridização usando as sondas deDNA ou RNA ou os iniciadores pode ser efetuada a 65°C em 6x SSC, 0,5%de SDS, 5x Denhardt1S, 100 μρ/ηιΙ- de DNA não-específico (por exemplo,DNA de esperma de salmão sonicado) com lavagem a 0,5x SSC, 0,5% deSDS a 65°C, para a severidade alta.
Uma molécula de ácido nucléico é dita ser o "complemento" deuma outra molécula de ácido nucléico se elas exibirem complementaridadecompleta. Conforme usado neste documento, as moléculas são ditas exibi-rem "complementaridade completa" quando cada nucleotídeo de uma dasmoléculas for complementar a um nucleotídeo da outra. Duas moléculas sãoditas serem "minimamente complementares" se elas puderem hibridizar umacom a outra com estabilidade suficiente para permitir que elas permaneçamaneladas uma à outra sob pelo menos as condições convencionais de "baixaseveridade". Similarmente, as moléculas são ditas serem "complementares"se elas puderem hibridizar uma com a outra com estabilidade suficiente para- permitir que elas permaneçam aneladas uma à outra sòb as condições con-vencionais de "alta severidade". Contempla-se que as condições de hibridi-zação de menor severidade, tais como as temperaturas de hibridização e/oude lavagem menores, podem ser usadas para identificar seqüências relacio-nadas tendo um grau menor de similaridade de seqüência se a especificida-de de ligação da sonda ou do iniciador à(s) seqüência(s)-alvo for preservada.
Desse modo, as seqüências de nucleotídeos da presente invenção podemser usadas pela sua capacidade de formar seletivamente moléculas duplascom trechos complementares de fragmentos de DNA. A detecção dos seg-mentos de DNA via hibridização é bastante conhecida para aqueles versa-dos na técnica, e assim, dependendo da aplicação imaginada, desejar-se-áempregar condições variadas de hibridização para atingir graus variados deseletividade da sonda em relação à seqüência-alvo e o método de escolhadependerá dos resultados desejados. As condições convencionais de seve-ridade são descritas em Sambrook, e outros (1989) e por Haymes e outros(1985).
O constructo de DNA da presente invenção pode ser introduzidano genoma de um hospedeiro de planta desejado por um método adequadode transformação de plantas mediada por Agrobacterium. Os métodos paratransformar plantas por transformação mediada por Agrobacterium tumefad-ens incluem: Fraley e outros, (1985), e Rogers e outros, (1987). A transfor-mação mediada por Agrobacterium é atingida através do uso de uma bacté- -ria do solo geneticamente engenheirada que pertence ao gênero Agrobacte-rium. Diversas espécies de Agrobacterium medeiam a transferência de umDNA específico, conhecido como "T-DNA", que podem ser geneticamenteengenheiradas para carregar qualquer pedaço desejado de DNA para muitasespécies de plantas. Os eventos principais que marcam o processo da pato-gênese mediada por T-DNA são a indução de genes da virulência, e o pro-cessamento e a transferência da fita T. Este processo é a matéria de muitasrevisões (Ream, 1989; Howard e Citovsky, 1990; Kado, 1991; Winans, 1992;Zambryski, 1992; Gelvin, 1993; Binns e Howitz, 1994; Hooykaas e Beijers-bergen, 1994; Lessl e Lanka, 1994; Zupan e Zambryski, 1995). As espéciesque não são Agrobacterium, tais como Sinorhizobium meliloti, Rhizobium sp.,Mesorhizobium loti, podem também ser usadas para transferir os genes u-sando os constructos de DNA da presente invenção (Broothaerts e outros,2005 e o pedido provisório US 60/800.872, neste documento incorporadospor referência). Podem também ser usados outros métodos para introduzir oDNA nas células. Estes métodos são bastante conhecidos para aqueles ver-sados na técnica e podem incluir os métodos químicos e os métodos físicos,tais como a microinjeção, a eletroporação, e o bombardeio de microprojéteis.
As técnicas de regeneração de células de plantas valem-se damanipulação de certos fitos-hormônios em um meio de crescimento de cultu-ra de tecido, também tipicamente valendo-se de um marcador de biocidae/ou herbicida que tenha sido introduzido juntamente com as seqüências denucleotídeos desejadas. A escolha da metodologia com protocolos adequa-dos estando disponível para hospedeiros a partir de Leguminosae (alfaia,soja, trevo, etc.), Umbelliferae (cenoura, aipo, pastinaca), Cruciferae (repolho,rabanete, canola/colza, etc.), Cucurbitaceae (melões e pepino), Gramineae(trigo, cevada, arroz, milho, etc.), Solanaceae (batata, tabaco, tomate, pi-mentas), diversas culturas florais, tais como girassol, e árvores contendonozes, tais como amêndoas, cajus, nozes, e noz-pecã. Vide, por exemplo,Ammirato e outros (1984); Shimamoto e outros (1989); Fromm (1990); Vasile outros, (1990); Vasil e outros (1992); Hayashimoto (1990); e Datta e outros(1990). Tais técnicas de regeneração são descritas, em geral, em Klee eoutros (1987). Os métodos e as composições para transformar plantas porintrodução de um constructo de DNA transgênica em um genoma da plantana prática desta invenção podem incluir quaisquer dos métodos bem-conhecidos e demonstrados. Por exemplo, a transformação mediada porAgrobaeterium é ilustrada nas Pats. U.S. N- 5.824.877; 5.591.616; e6.384.301, todas as quais são incorporadas neste documento por referência.
As plantas que podem ser feitas por prática da presente inven-ção incluem quaisquer plantas que estejam sujeitas à transformação e à re-generação e incluem, porém não estão limitadas à, Acácia, alfafa, aneto,maçã, damasco, alcachofra, rúcula, aspargo, abacate, banana, cevada, fei-jão, beterraba, amora-preta, uva-do-monte, brócolis, cóuve de Bruxelas, re-polho, canola, meloa, cenoura, mandioca, couve-flor, aipo, repolho chinês,cereja, coentro, cítricos, laranjas pequenas e "clementines", café, milho, al-godão, pepino, pseudotsuga, berinjela, chicória, escarola, eucalipto, erva-doce, figos, árvores da floresta, abóbora, uva, toranja, melão, batata mexi-cana, kiwi, alface, alhos porró, limão, lima, pinheiro teda, manga, melão, co-gumelo, noz, aveia, quiabo, cebola, laranja, uma planta ornamental, mamão,salsa, ervilha, pêssego, amendoim, pêra, pimenta, caqui, pinho, abacaxi,banana-da-terra, ameixa, romã, choupo, batata, abóbora, marmelo, pinhomonterey, radicchio, rabanete, framboesa, arroz, centeio, sorgo, pinho do sul,soja, espinafre, abóbora, morango, beterraba sacarina, cana-de-açúcar, gi-rassol, batata-doce, liquidâmbar, tangerina, chá, tabaco, tomate, turfa, umaparreira, melancia, trigo, inhames, e abobrinha. Nas modalidades preferidas,a planta é uma planta de soja, milho, canola, ou algodão. Nas modalidadesparticulares, a planta é uma planta de milho. Nas modalidades particulares, aplanta é uma planta de soja. Em outras modalidades, a planta é uma plantade algodão. E ainda em mais modalidades, a planta é uma planta de canola.
Os presentes métodos produzem eficiências aperfeiçoadas detransformação, reduzindo significativamente a freqüência de plantas trans-formadas com o DNA da cadeia principal do vetor, ou o "não-T-DNA". Emalgumas modalidades, a freqüência de plantas transformadas com não-T-DNA é menor do que, ou igual a, cerca de 20%. Em algumas modalidades, afreqüência de plantas transformadas com não-T-DNA é menor do que, ouigual a, cerca de 15%, ou menor do que, ou igual a, cerca de 10%, ou menordo que, ou igual a, cerca de 8% ou 5%. Adicionalmente, os métodos da in-venção produzem ocorrências de transformação com uma ou duas cópias deT-DNA muito altas. Por exemplo, em algumas modalidades, a freqüência deocorrências de transformação com uma ou duas cópias de T-DNA é maiordo que, ou igual a, cerca de 70% ou 75%, conforme medida usando Sou-thern blot. Em algumas modalidades, esta freqüência é maior do que, ouigual a, cerca de 80% ou 85%, e em alguns casos, 90% ou 95%, conformemedida com Southern blot.
Em algumas modalidades, a freqüência de plantas transforma-das com uma região do vetor que não é de T-DNA é cerca de 50%, 40%,20%, 15%, ou 10% menor do que a freqüência de T-DNA verificada namesma variedade de planta que tenha sido transformada com um vetor detransformação de planta que não contenha o elemento repABC, tal como oelemento oriRi da presente invenção. Em outras modalidades, a freqüênciadas ocorrências de transformação com uma ou duas cópias do T-DNA é cer-ca de 50%, 40%, 20%, 15%, ou 10% maior do que a freqüência das ocor-rências de transformação com uma ou duas cópias do T-DNA em relação àmesma variedade de planta transformada com o vetor de transformação deplanta que não contém o elemento repABC, tal como o elemento orifíi dapresente invenção.Assim, certas modalidades da presente invenção proporcionammétodos que envolvem o uso do elemento repABC, tal como a oriRi a partirde Agrobacterium rhizogenes e a origem de repABC a partir do plasmídiop42b de Rhizobium etli, incluindo as seqüências apresentadas neste docu-mento, para reduzir a freqüência de plantas transformadas com a região dovetor que não é de T-DNA. A presente invenção também está dirigida ao usodo elemento repABC, tal como a oriRi a partir de Agrobacterium rhizogenese a origem de repABC a partir do plasmídio p42b de Rhizobium etli, incluindoas seqüências apresentadas aqui, para aumentar a freqüência das ocorrên-cias de transformação com uma ou duas cópias do T-DNA. Em algumasmodalidades, ambos os métodos são empregados em combinação para ob-ter ocorrências de transformação tendo menores freqüências de incorpora-ção da cadeia principal e maiores freqüências de ocorrências de transforma-ção com uma ou duas cópias de T-DNA.
EXEMPLOS
Os exemplos a seguir são proporcionados para melhor elucidara prática da presente invenção e não devem ser interpretados de modo al-gum para limitar o escopo da presente invenção. Aqueles versados na técni-ca reconhecerão que diversas modificações, adições, substituições, trunca-mentos, etc., podem ser feitos nos métodos e genes descritos neste docu-mento, ao mesmo tempo não saindo do espírito e do escopo da- presenteinvenção.
Exemplo 1
Preparação de Vetores
As etapas de clonagem seguiram os protocolos padrões descri-tos por Sambrook e outros (1989). O fragmento de oriRi de 5,6 kb, excisadode pCGN1589 com a digestão por Dral, foi usado para substituir o fragmentode oriV de pMON67438 que foi digerido com PshAI e BstXI e embotado coma T4 DNA polimerase. Isto resultou em um vetor de base com oriRipMON83856 (figura 1). O vetor de teste com oriRi de 5,6 kb pMON83882(figura 2) foi feito por inserção dos fragmentos de gus e CP4 a partir do vetorde controle com oriV pMON67438, seqüencialmente digerido com Accl (em-botado)/BamHI, em pMON83856 que tinha sido aberto com Pmel/BamHI.Para truncar o fragmento de oriRi, dois iniciadores, 5' CACGTGTACAAGG-TAGAATCCGCCTGAG 3' (oriRi 5' promotor a montante; SEQ ID NO:5) e 5'GTATACAGGCTCTCCTTCACGATCAAC 3' (oriRi 3' após repO. SEQ IDNO:6 ), foram sintetizados e a PCR foi efetuada com pfu polimerase de altafidelidade e pMON83856 como um molde. O produto da PCR foi purificado einserido em pMON8393C), que foi digerido com Afel e Xhol e embotado comT4 DNA polimerase, para substituir o fragmento de oriV. O vetor resultantepMON83934 (figura 3), com a oriRi truncada, foi então confirmado por se-qüenciamento de DNA. Para preparar o vetor de teste pMON83937 (figura 4)com uma oriRi truncada, o pMON83934 foi aberto com Kpnl, embotado comT4 DNA polimerase, e seguido por digestão com BamHI; o fragmento de guse Cp4 a partir do vetor de controle com oriV pMON67438 foi seqüencialmen-te digerido com Accl, preenchido com T4 DNA polimerase, e então adicio-nalmente digerido com BamHI. Os dois fragmentos foram ligados com T4DNA Iigase e resultaram no pMON83937.
Para construir o vetor de transformação de milho pMON97352(figura 5), uma seqüência Iigadora contendo os sítios de Spel e PspOMI foisintetizada por anelamento de dois oligos 5'-AGCTTGGGCCCCTCGAGGCTAGCACTAGTG-31 (SEQ ID NO:7 e 5'-GATCCACTAGTGCTAGCCTCGAGGGGCCCA-3' (SEQ ID NO: 8), e inserida em pMON83856 com a digestãopor BamHI e Hindlll. O vetor com oriRi intermediário resultante foi abertocom Spel e PspOMI e ligado com os cassetes de expressão de CP4 e gusexcisados de pMON92726 (figura 6) com digestão por Notl e Spel (vide afigura 5, pMON97352). O vetor parental com oriV pMON992726 foi usadocomo um vetor de controle para comparar com o vetor de teste com oriRi domilho pMON97352.
Para construir o vetor de controle com oriV de 2T pMON87488(figura 7), o limite à direita de octopina foi excisado de pMON51676, embo-tado com T4 DNA polimerase e inserido em pMON87485, que foi aberto comSall/Spel, preenchido com T4 DNA polimerase e tratado com CIP. Para pre-parar os vetores com oriRi de 2T, pMQN96001 (figura 8) e pMQN96010 (fi-gura 9), a oriV em pMON87488 foi removida com Afél e Xhol, o vetor foipreenchido com T4 DNA polimerase e inserido com o replicon de orifíi de4,2 kb a partir de pMON83934, obtido por digestão de pMON83934 com P-mll e BstZI 71, resultando em pMON96001. O replicon de oriRi de 5,6 kb apartir de pCGN1589, obtido por sua digestão com digestão por Dral, foi inse-rido para produzir pMON96010.
EXEMPLO 2
Transformação da Cultura de Soia
A transformação das células de soja e a regeneração das célu-Ias em plantas férteis intactas por transformação mediada por Agrobacteriumpodem ser conduzidas usando diversos métodos conhecidos na técnica. Ummétodo para a transformação da soja (por exemplo, Patentes U.S. N—6.384.301 e 7.002.058) foi utilizado com um processo de organogênese.
Os constructos de DNA descritos na presente invenção (por e-xemplo, o plasmídio pMON83882, substancialmente conforme mostrado nafigura 2, e o plasmídio pMON83937, substancialmente conforme mostradona figura 4) são transformadas em uma cepa de Agrobacterium acalmadaABI. Os dois vetores de controle com oriV, pMON67438 e pMON83898(mesmo GOI, porém em diferentes orientações), foram também transferidospara as células de Agrobacterium. Dois constructos de T DNA e os respecti-vos controles, conforme descrito acima, foram também usados para trans-formar a soja. O constructo de DNA foi transferido para o Agrobacterium poreletroporação. Colônias individuais foram recuperadas sobre o meio LB com50 mg/l (para os vetores com oriRi) ou 75 mg/l de espectinomicina e 50 mg/lde canamicina e inoculadas em 20-50 ml de meio LB líquido com a mesmaseleção, em um agitador com 200 rpm. O plasmídio no Agrobacterium foiverificado por digestão com enzima de restrição de plasmídio minipreparadoa partir da cultura de 10 ml. O restante da cultura líquida foi misturado comglicerol até uma concentração final de 20%, dividido em alíquotas e armaze-nado a -8°C como culturas de sementes.
Para preparar o inóculo de Agrobacterium para a transformação,0,25-1 ml de cultura de sementes congelada foi inoculado em 250 ou 500 mlde meio LB com a mesma seleção de antibióticos, conforme acima mencio-nado, e desenvolvido durante a noite a 26°C-28°C, com agitação a 200 rpm,até a fase de crescimento de mid-log. A cultura foi girada e diretamente sus-pensa em um meio de inoculação (meio INO) na concentração de D066o a-proximadamente 0,3, conforme medida em um espectrofotômetro.
O cultivar de soja A3525 foi usado para a transformação media-da por Agrobacterium, conforme descrito (por exemplo, Patente U.S.7.002.058). As sementes de soja foram germinadas por menos do que 14horas, na temperatura ambiente, em meio BGM, e os explantes do meriste-ma das sementes de soja maduras foram excisados por máquina, conformedescrito no Pedido de Patente US 20050005321. Para a sonicação em bate-lada, aproximadamente 100 explantes na cobertura de PLANTCON forammisturados com 20 ml da suspensão de Agrobacterium em meio INO e soni-cados no Sonicador W-113 por 20 segundos. Para a sonicação em volume,aproximadamente 1000 explantes na cobertura de plantcon foram mistura-dos com 100 ml da suspensão de Agrobacterium no meio INO e sonicadospor 20 segundos. Após a sonicação, os explantes foram co-cultivados nomesmo PLANTCON por 2-4 dias, a 23°C, com período de luz/escuridão de16/8 horas. Então, os explantes foram transferidos para a superfície do meiode seleção WPM com 75 μΜ de glifosato. Cada PLANTCON continha cercade 50 explantes. Após 2 semanas, os- explantes foram transferidos nova-mente para o meio WPM sólido com 75 uM de glifosato, com a radícula pri-mária inserida no meio, cada PLANTCON contendo aproximadamente 25explantes. Os brotos com três folhas inteiramente expandidas, recuperadosdepois de 6-10 semanas após a inoculação, foram enraizados em meio BRMcom 0,1 mg/l de IAA e seleção com glifosato a 25 μΜ. As plantinhas enrai-zadas foram transferidas para a estufa para a maturidade. Os diversos mei-os usados para a transformação da soja são detalhados abaixo, na .TABELA 1 Componentes dos meios para a transformação da soja
<table>table see original document page 27</column></row><table>Continuação
<table>table see original document page 28</column></row><table>
Outras células de plantas dicotiledôneas podem ser transforma^das e regeneradas em plantas intactas por métodos conhecidos na técnicade transformação de planta e cultura de tecido. O uso de métodos mediadospor Agrobacterium para transferir o T-DNA dos plasmídios da presente in-venção é bastante conhecido na técnica. Por exemplo, algodão (Pats. U.S.N25 5.004.863; 5.159.135; 5.518.908, 5.846.797, e 6.624.344, incorporadaspor referência neste documento) e Brassica (Patente US N2 5.750.871).
Exemplo 3
Transformação de Cultura de Milho
Dois vetores, pMON97352 (oriRi, cópia única em Agrobacterium)e pMON92726 (oriV, múltiplas cópias em Agrobacterium como um controle)contendo os mesmos cassetes de gene marcador selecionável de plantaCP4 e gene gus, ambos dirigidos por promotores de actina do arroz (figura5), foram eletroporados na cepa de Agrobacterium turhefaciens ABI para atransformação do milho. O Agrobacterium contendo o vetor em estoque deglicerol foi riscado sobre meio LB sólido suplementado com os antibióticos(tudo em ingrediente ativo) canamicina (40 mg/L), espectinomicina (31 mg/L),estreptomicina (38 mg/L) e cloranfenicol (25 mg/L) e incubado a 28°C por 2dias. Dois dias antes da inoculação em Agrobacterium dos embriões imatu-ros do milho, uma colônia ou um pequeno laço de Agrobacterium da placade Agrobaeterium foi coletado e inoculado em 25 mL de meio LB líquido su-plementado com 62 mg/L de espectinomicina e 40 mg/L de canamicina, emum frasco de 250 mL. O frasco foi colocado sobre um agitador a aproxima-damente 150-200 rpm e 27-28°C, durante a noite. A cultura de Agrobaeteri-um foi então diluída (1 para 5) no mesmo meio líquido e colocada de voltasobre o agitador. Diversas horas depois, um dia antes da inoculação, as cé-lulas de Agrobaeterium foram giradas a 3500 rpm por 15 min. O pélete decélulas de bactéria foi ressuspenso em caldo de indução com 200 μΜ deacetossiringona e 50 mg/L de espectinomicina e 25 mg/L de canamicina e adensidade da célula foi ajustada para 0,2 em D066o· A cultura de células debactérias (50 mL em cada frasco de 250 mL) foi então colocada de volta so-bre o agitador e desenvolvida durante a noite. Na manhã do dia da inocula-ção, as células de bactérias foram giradas e lavadas com meio líquido 1/2MS Vl (Tabela 2), suplementado com 200 μΜ de acetossiringona. Após umacentrifugação mais, o precipitado de células de bactérias é suspenso nova-mente em meio 1/2 MS PL (Tabela 2) com 200 μΜ de acetossiringona (Ta-bela 2) e a densidade da célula foi ajustada para 1,0 em D066o para a inocu-lação.
Os reagentes estão comercialmente disponíveis e podem seradquiridos de diversos fornecedores (vide, por exemplo, Sigma ChemicalCo., St. Louis, Mo).<table>table see original document page 30</column></row><table>A linhagem de milho LH244 (Patente U.S. N2 6.252.148) foi usa-da neste estudo. As espigas contendo os embriões imaturos foram colhidase mantidas refrigeradas a 4°C até o uso. Os embriões imaturos foram isola-dos das espigas esterilizadas na superfície e diretamente gotejados na sus-pensão de células de Agrobacterium preparada em tubo de microcentrífugae inoculados por 5 a 20 min. Após a suspensão de células de Agrobacteriumser removida usando uma pipeta de transferência estéril com ponta fina, osembriões imaturos foram transferidos para o meio de co-cultura (Tabela 2).Os embriões foram cultivados em uma incubadora escura (23°C) por apro-ximadamente 24 h.
Após o co-cultivo, os embriões foram transferidos para um meioMS modificado (MS de Indução, Tabela 2) suplementado com 500 mg/L decarbenicilina e glifosato a 0,1 mM a 30°C, por 2 semanas, seguidas por umasemana adicional em uma sala de cultura escura, a 27-28°C. Todos os pe-daços de calos foram então transferidos individualmente para o primeiromeio de regeneração, o mesmo meio mencionado acima, exceto que 2,4-D epicloram foram substituídos por 3,5 mg/L de BAP (MS/6BA, Tabela 2) e onível de carbenicilina foi gotejado para 250 mg/L. As culturas foram movidaspara uma sala de cultura com fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuro e27°C. Após 5-7 dias, os pedaços de calos foram transferidos para o segundomeio de regeneração (MSOD, Tabela 2). Em outras 2 semanas, os pedaçosde calos que tinham brotos regenerados foram transferidos para o mesmomeio sem hormônio em Phytatrays® para mais desenvolvimento. As plantasregeneradas (RO) com uma ou mais raízes saudáveis foram movidas para osolo em potes de turfa em uma câmara de crescimento. Em 7 a 10 dias, elasforam transplantadas para potes de 30,48 cm (12 polegadas) e movidas parauma estufa com condições para o crescimento normal da planta de milho. Asplantas foram autopolinizadas ou cruzadas com plantas do tipo selvagem.
EXEMPLO 4
Análise Molecular para o DNA da Cadeia Principal e o Número de Cópias
A. Soja transformada com Constructos de Um T-DNA
O DNA foi extraído das amostras de tecidos coletadas das plan-tas desenvolvidas em estufa, transformadas com os plasmídios de DNA dapresente invenção. Um método à base de PCR foi usado para testar o DNAquanto à presença da seqüência de oriRi usando o iniciador dianteiro de re-pA 5'-ACAAGGTAGAATCCGCCTGAG-3' (Xd487b; SEQ ID NO:11) e o ini-ciador reverso de repA 5 '-TTCAACTCTGGCATCTCAGAC-3' (Xd488; SEQID NO: 12) como um indicador da cadeia principal do vetor. Este DNA estáadjacente à LB e a sua presença no DNA extraído das plantas regeneradasindica que ocorreu a transferência das seqüências do vetor além da LB. ODNA pode ser isolado dos tecidos das plantas por qualquer número de mé-todos, por exemplo, o procedimento de CTAB (Rogers e outros, 1985) ou oKit de Planta DNAeasy® 96 (N2 do Cat. 69181, Qiagen Inc., Valencia, Calif.)seguindo as instruções dos fabricantes. O Taqman® (PE Applied Biosystems,Foster City, Calif.) é descrito como um método de detectar e quantificar apresença de uma seqüência de DNA e é inteiramente entendido nas instru-ções fornecidas pelo fabricante. As moléculas de iniciadores de DNA (SEQID NO:11 e 12) foram usadas no método descrito para identificar o DNA deoriRi a partir dos extratos de plantas. As condições e o aparelho usados po-dem ser modificados por aqueles versados na técnica para proporcionar osmesmos resultados.
Os eixos dos meristemas da soja excisados das sementes ma-duras foram transformados com um plasmídio de DNA de controle(pMON67438 ou pMON83898) e um plasmídio da presente invenção(pMON83882 ou pMON83937), então regenerados nas plantas intactas. Asplantas intactas foram analisadas quanto à presença do gene de interesse(CP4) e das seqüências de oriRi e oriV sem T-DNA. A Tabela 3 mostra osresultados desta análise.
Das 39 plantas testadas, somente 3 tinham seqüências da ca-deia principal do vetor, uma freqüência de 7,7%. Em comparação, o plasmí-dio de controle (um plasmídio com oriV) exibiu uma freqüência da cadeiaprincipal do vetor de 21 % a 25% (dependendo de quais amostras foram con-sideradas). Esta diferença é bem dramática e inteiramente inesperada.
Um outro componente importante de uma planta transgênicacomercialmente viável é a ocorrência da baixa complexidade do inserto. Istoé freqüentemente referido como "baixo número de cópias". É difícil selecio-nar a progênie e reproduzir com êxito a característica transgênica se o nú-mero de cópias do inserto for muito alto. Idealmente, somente uma únicacópia do transgene estaria presente em uma ocorrência transgênica.
O número de cópias pode ser determinado por diversos métodosconhecidos na técnica da biologia molecular. A análise por Southern blot é ométodo mais comumente usado. Os métodos que utilizam a tecnologia Inva-der® (Third Wave Inc. Madison1 Wl) são também usados para determinar onúmero de cópias dos insertos de T-DNA nas plantas transgênicas. 1
As células de plantas de soja foram transformadas com umplasmídio de DNA de controle (pMON67438) e um plasmídio da presenteinvenção (pMON83882), então regeneradas nas plantas intactas, conformeacima descrito. As plantas transgênicas resultantes foram analisadas quantoao número de cópias usando dois métodos diferentes: 1) o método do "Inva-der CP4" e 2) a Southern blot. Os resultados são mostrados na Tabela 3.
Tabela 3. Efeitos da cadeia principal do vetor de pRi ori so-bre a freqüência da transformação, o número de cópias, e o inserto natransformação da soja. a Dados reunidos a partir de três experimentosem conjunto. b Número de plantas a partir da comparação em conjunto.Número de plantas reunidas de plantas de pMON67438 produzidas.
<table>table see original document page 33</column></row><table>
Utilizando o método do "Invader CP4", o plasmídio inventivo,pMON83882, resultou em ocorrências de transformação com uma única cópia41% do tempo, em comparação com o plasmídio de controle pMON67438, queresultou em uma ocorrência de transformação com uma única cópia somen-te 25% do tempo, usando as amostras reunidas de outros experimentos, ousomente 37% do tempo, usando os experimentos em conjunto. Consideran-do as ocorrências de uma e de duas cópias juntas, o pMON83882 resultounas ditas ocorrências 79,5% do tempo, em comparação com 60% a partirdos experimentos em conjunto e 63% a partir das amostras reunidas empre-gando o plasmídio de controle. Usando a comparação por Southern blot, opMON83882 produziu ocorrências com uma cópia 56,4% do tempo e 33,3%do tempo ocorrências com duas cópias, para um total de quase 90% de o-corrências com uma e duas cópias combinadas. Novamente, estes resulta-dos tanto foram dramáticos quanto inesperados.
B. Análise Molecular do Número de Cópias de Transqene em Trans-formantes com Dois T-DNA de Soja.
Para analisar o impacto de oriRi sobre a transformação com 2T-DNA, o vetor com oriRi de 4,2 kb de 2T pMON96001 foi comparado em con-junto com o vetor com or/Vde 2T pMON87488 por seis vezes. O vetor comoriRi de 5,6 kb de 2T pMON96010 foi também incluído nos últimos dois ex-perimentos de comparação nestes experimentos preliminares (Tabela 4,Grupo A). O DNA total foi extraído dos segmentos de sementes das semen-tes maduras colhidas da estufa e usado para determinar o número de cópiasdo transgene pela tecnologia Invader usando a sonda de CP4 e as sondasde NOS. O ensaio de detecção CP 4 Invader® usou a seqüência a seguircomo um sítio de alvejamento: 5' TCGCTTTCCTTGACGCGGAGTTCTTCCAGACCGTTCAT CACGG 3' (SEQ ID NO: 13) e GTAGGTGATTGGCGTTG(SEQ ID NO: 14) como uma seqüência de sonda. O ensaio de detecção NOSInvader® usou a seguinte seqüência em 3' como um sítio de alvejamentoTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACT (SEQ IDNO:15 e GTrATTTATGAGATGGGTTTTTATGA (SEQ ID NO: 16) como se-qüência de sonda NOS Invader®.
Os transformantes com 1 e/ou 2 cópias foram aumentados de35% no vetor com or/Vde controle para acima de 40% em ambos os vetorescom oriRi. A freqüência de plantas sem marcadores nas plantas RO (ocor-rências sem marcadores/plantas RO totais) foi aumentada de 4,76% no vetorde controle com oriV para 16,4% e 18,4%, respectivamente, no vetor comduas oriRi. Globalmente, a freqüência de transformação sem marcador (o-corrências sem marcadores/número inicial de explantes) mais do que dupli-cou nos dois vetores com oriRi de 2T comparados ao vetor com oriVde 2T.
Experimentos adicionais em paralelo com maior número inicialde explantes foram usados para comparar o vetor com oriV de controle de2T com o vetor com oriRi de 4,2 kb de 2T (Tabela 4, Grupo Β). O vetor comoriRi de 2T reproduziu os resultados: a freqüência de ocorrências com 1+2cópias e a freqüência sem marcador (% de MF) são ambas aumentadas e afreqüência de transformação sem marcador é mais do que duplicada no ve-tor com oriRi. Os resultados indicaram que os vetores com oriRi de 2T sãosignificativamente mais eficientes em produzir plantas sem marcadores doque o vetor com oriV de 2T, por aumento das ocorrências com poucas có-pias e melhora da freqüência de transformação sem marcador.<table>table see original document page 36</column></row><table>C. Análise Molecular do DNA da Cadeia Principal do Vetor e do Nú-mero de Cópias do Transqene em Milho Transformado com Construc-tos de um T-PNA
Para investigar o efeito da origem de replicação oriRi sobre atransformação do milho, o vetor com oriRi de 5,6 kb pMON97352 contendoos genes gus e CP4, ambos dirigidos pelo promotor de actina do arroz, foicomparado ao vetor com oriV pMON92726 como a mesma estrutura de T-DNA contendo os genes gus e CP4. Os embriões imaturos do milho do culti-var LH244 foram inoculados com Agrobacterium contendo o vetor com oriRiou o com oriVem paralelo. Cada tratamento consistia em cerca de 110 em-briões. No total, 16 experimentos de comparação em conjunto foram inicia-dos. O vetor com oriRi mostrou uma freqüência de transformação significati-vamente menor do que o vetor de controle com oriV (figura 10), com TF mé-dia de 9,5% e 16,3% para os vetores com oriRi e oriV, respectivamente. En-tretanto, a eficiência de transformação global com os vetores com oriRi eoriV foi a mesma.
A presença da seqüência da cadeia principal nas plantas de mi-lho transgênicas foi determinada pelo ensaio Endpoint TaqMan® (AppliedBiosystems, Foster City, CA) para a seqüência de oriRi ou oriV, as seqüên-cias de LB que estão flanqueando a 3' para a leitura completa curta próximaao sítio de corte de LB e as seqüências de RB que estão flanqueando a 5'antes do sítio de corte de RB para a leitura completa da cadeia principal in-tacta. Os iniciadores de oriV são 5' AACGCCTGATTTTACGCGAG 3' (dian-teiro; SEQ ID NO: 17) e 5' CAATACCGCAGGGCACTTATC 3' (reverso; SEQID N0:18), com a sonda CCCACAGATGATGTGGAC (SEQ ID N0:19) rotu-lada com o corante fluorescente 6-FAM na extremidade de 5'. Os iniciadoresde oriRi são 5' TGGCAAGGAATGGGTTTGAG 3' (dianteiro; SEQ ID N0:20)e 5' CTACAACTACAGGCGCTGCTTTT 3' (reverso; SEQ ID N0:21), com asonda 6-FAM-TGGCGAAGTCTGTCC (SEQ ID NO:22) para detectar a se-qüência de oriRi 621 bp a jusante do sítio de corte de LB. Os iniciadores deflanqueio a 5' de RB são 5" GCCAAGGGATCI I I Il GGAAT 3' (dianteiro;SEQ ID NO:23) e 5' CCACCCAAACGTCGGAAA 3' (reverso; SEQ ID NO:24),com a sonda 6FAM-TGCTCCGTCGTCAGG (SEQ ID NO:25) para detectar oflanqueio a 5' de RB 186 bp antes do sítio de corte de RB. Os iniciadorespara detectar LB 35 bp a jusante do sítio de corte de LB eram 5'GCACCCGGTGGAGCTT 3' (dianteiro; SEQ ID NO:26) e 5' TCTGCCTAACCGGCTCAGT 3' (reverso; SEQ ID NO:27), com a sonda CATGTTGGTTTCTACGCAG (SEQ ID NO:28) rotulado com o corante fluorescente 6-FAM naextremidade de 5'. Aproximadamente 10 ng de DNA foram usados para areação do Endpoint TaqMan® de acordo com a instrução do fabricante (Ap-plied Biosystems, Foster City, CA).
Conforme mostrado na Figura 11, aproximadamente 95% dasplantas transgênicas derivadas do vetor com oriRi estavam livres da cadeiaprincipal, o que é significativamente melhor do que o vetor de controle comor/V mostrando aproximadamente 78% de freqüência sem a cadeia principal.Visto que a cadeia principal do vetor começa em LB, após o sítio de corte, etermina antes do sítio de corte de RB, o uso de três sondas diferentes dacadeia principal (LB a jusante, oriRi/orN e RB a montante) nas plantas deri-vadas dos vetores tanto com oriRi quanto com oriV revelou que a maior par-te da cadeia principal do vetor transferida continha a seqüência inteira dacadeia principal do vetor.
O número de cópias do transgene CP4 foi determinado pelo en-saio Invader® de acordo com a instrução do fabricante (Third Wave Techno-logies Inc. Madison, Wl) usando a seqüência de CP4. O número de cópiasdo transgene gus foi medido por determinação do terminador transcricionaldo cassete de gus (mostrado como Pis 4 nas figuras 5 e 6) usando a tecno-logia de TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA). Os iniciadores depinll de TaqMan® eram 5' ATGAAATAAAAGGATGCACACAT 3' (dianteiro;SEQ ID NO:29) e 5' ACAACTTTGATGCCCACATT 3' (reverso; SEQ IDN0:30), com a sonda TGACATGCTAATCAC- (SEQ ID N0:31) rotulada comos corantes fluorescentes 6-FAM na extremidade de 5' e MGBNFQ na ex-trem idade de 3'.
A figura 12 mostra os resultados do ensaio do número de cópiasdo transgene. O vetor com oriRi aumentou significativamente a freqüênciade plantas com cópias individuais comparado ao vetor com oriV de controle,enquanto que a freqüência de ocorrências com 2 ou mais cópias no vetorcom oriRi foi diminuída. Ambos os ensaios TaqMan® e Invader® com duassondas diferentes mostraram resultados similares. Visto que as plantas sema cadeia principal com cópias individuais são as mais valiosas tanto para apesquisa quanto para o desenvolvimento, o vetor com oriRi que aumenta afreqüência com cópia única e que diminui as ocorrências contendo a cadeiaprincipal no milho representa um aperfeiçoamento significativo para a quali-dade na produção de ocorrências transgênicas.
Exemplo 5
Constructo de vetor de transformação de planta contendo a origem de repli-cação de repABC a partir de Rhizobium
Para clonar a origem de replicação de repABC a partir da cepade Rhizobium etli CFN42, a cepa da USDA foi obtida do USDA RhizobiumCollection Center. Um fragmento de repABC de 4,3 kb foi amplificado a partirdo plasmídio de R. etli p42b encontrado na cepa CFN42, por PCR, com osiniciadores 5' CCACGTGAGTTACGGCTGATCGACCAGAC 3' (Xd745; SEQID NO:9) e 5' GCCTAGGACGTCAACTCCAACCGCACCGT 3' (Xd746; SEQID NO: 10), e ligado ao vetor de clonagem de embotar TOPO (Invitrogen,Carlsbad, CA, EUA), o que resultou em pMON96941 e foi confirmado porseqüenciamento. O fragmento de repABC foi digerido com Pmll e Avrll (mos-trados pela seqüência sublinhada nos iniciadores) e ligado ao pMON96948aberto com Smal e Avrll. O ligado foi transferido diretamente para as célulascompetentes de Agrobacterium tumefaciens AB2 (uma cepa sensível à ca-namicina), e preparado sobre placa de LB com 50 mg/l de canamicina. Ascolônias resistentes à can foram inoculadas em meio LB líquido com 50 mg/lde canamicina, e um DNA de plasmídio foi preparado por miniprep. O cons-tructo foi confirmado através de digestão por restrição. Visto que o vetorpMON96951 não contém uma origem de replicação de E. coii, ele não podeser mantido na E. coli.
O pMON96951 (figura 13) é usado para transformar as espéciesde plantas conforme descritas acima. As ocorrências transgênicas são anali-sadas quanto à integração reduzida da cadeia principal do vetor e à alta fre-qüência de ocorrências de transformação com poucas cópias pelos métodosdescritos no Exemplo 4.
As outras modalidades da invenção serão aparentes para aque-les versados na técnica a partir de consideração do relatório descritivo e prá-tica da invenção descrita neste documento. Pretende-se que o relatório des-critivo e os exemplos sejam considerados como ilustrativos somente, comum escopo e um espírito verdadeiros da invenção sendo indicados pelasreivindicações que se seguem.LISTAGEM DE REFERENCIAS
As que seguem são incorporadas neste documento por referên-cia:
Patente U.S. 4.581.847Patente U.S. 5.004.863Patente U.S. 5.094.945Patente U.S. 5.229.114Patente U.S. 5.304.730Patente U.S. 5.463.175Patente U.S. 5.518.908Patente U.S. 5.591.616Patente U.S. 5.608.149Patente U.S. 5.633.437Patente U.S. 5.646.024Patente U.S. 5.719.046Patente U.S. 5.767.366Patente U.S. 5.846.797Patente U.S. 5.958.745Patente U.S. 6.011.199Patente U.S. 6.063.597Patente U.S. 6.080.560Patente U.S. 6.121.436Patente U.S. 6.225.105Patente U.S. 6.268.549Patente U.S. 6.384.301Patente U.S. 6.476.295Patente U.S. 6.537.750
Patente U.S. 4.761.373Patente U.S. 5.013.659Patente U.S. 5.141.870
Patente U.S. 4.810.648Patente U.S. 5.034.322Patente U.S. 5.159.135
Patente U.S. 5.273. 894; Patente U.S. 5.276.268
Patente U.S. 5.378.824
Patente U.S. 5.512.466
Patente U.S. 5.543.576
Patente U.S. 5.597.717
Patente U.S. 5.627.061
Patente U.S. 5.463.175Patente U.S. 5.516.671Patente U.S. 5.561.236Patente U.S. 5.605.011Patente U.S. 5.633.435Patente U.S. 5.633.444; Patente U.S. 5.637. 489
Patente U.S. 5.689.041
Patente U.S. 5.750.871
Patente U.S. 5.773.696
Patente U.S. 5.939.602
Patente U.S. 5.985.605
Patente U.S. 6.013.864
Patente U.S. 6.063.756
Patente U.S. 6.093.695
Patente U.S. 6.166.292
Patente U.S. 6.228.992
Patente U.S. 6.316.407
Patente U.S. 6.414.222
Patente U.S. 6.506.962
Patente U.S. 5.716.837Patente U.S. 5.750.876Patente U.S. 5.824.877Patente U.S. 5.942.664Patente U.S. 5.998.700Patente U.S. 6.040.497Patente U.S. 6.072.103Patente U.S. 6.110.464
Patente U.S. 6.171.640
Patente U.S. 6.252.148
Patente U.S. 6.380.466Patente U.S. 6.444.876Patente U.S. 6.531.648Patente U.S. 6.624.344
Patente U.S. 6.613.963Patente U.S. 7.002.058; Pub. de Patente U.S. 2003/0028917; Pub. de Patente U.S. 20040177399; Pub. de Patente U.S. Pub. de Patente U.S20030083480; Pub. de Patente U.S. 20030115626; Pub. de Patente U.S20050005321; Pub. de Patente U.S. 20030135879; Ped. Prov. U.S.60/800.872;Ped. PCT W004074443; Ped. PCT W004009761; Ped. PCT W09927116;Ped. PCT W08704181A1; Ped. PCT W08900193A; Ped. PCT W08911789;Ped. PCTWO 9638567; Ped. PCT W005107437; Ped. PCT W005003362Ped. Europeu 275.957Ped. Japonês 06343473
Ammirato e outros, Em: Handbook of Plant Cell Culture-Crop Species,Macmillan Publ. Co., 1984.
Ausubel e outros, Em: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley &Sons, lnc, NY, 6.3.1-6.3.6, 1989.
Binns e Howitz, In: Bacterial Pathogenesis of plants and Animais, Dang(Ed.), Berlin: Stringer Verlag, 119-138, 1994.
Broothaerts e outros, Nature, 433:629-633, 2005.Datta e outros, Bio/Technology, 8:736-740, 1990.Fraley e outros, Bio/Technology, 3:629-635, 1985.Fromm, UCLA Symposium on Molecular Strategies for Crop Improvement,16-22 de abril, CO, 1990.
Gelvin, Em: Transgenic Plants, Kung e Wu (Eds.), Academic Press, San Di-ego, 49-87, 1993.
Hayashimoto, Plant Physiol., 93:857-863, 1990.
Haymes e outros, Em: Nucleie Aeid Hybridization, A Praetieal Approaeh, IRLPress, Washington, D.C., 1985
Herman e outros, J. Biol. Chem., 280(26):24759-24767, 2005.Hooykaas e Beijersbergen, Ann. Rev. Phytopathol., 32:157-179, 1994.
Howard e Citovsky, Bioassays, 12:103-108, 1990.Jefferson e outros, Bioehem. Soe. Trans., 15:7-19, 1987.
Kado, Crit. Rev. Plant Sei., 10:1 -32, 1991.Kanehisa, Nuel. AeidsRes., 12:203-213, 1984.
Klee e outros, Ann. Rev. PIantPhys., 38:467-486, 1987.Lessl e Lanka, Cell, 77:321-324, 1994.
Pearson e Lipman, Proe. Natl. Aead. Sei. USA, 85(8):2444-2448, 1988.Ream; Ann. Rev. Phytopathol., 27: 583-618, 1989.Rogers e outros, Methods Enzymol., 153:253-277, 1987.Rogers e outros, Plant Mol. Biol., 5:69-76, 1985.
Sambrook e outros, Em: Molecular cloning: a Iaboratory manual, 2- Ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor1 NY, 1989.Sambrook e outros, Em: Molecular cloning: a Iaboratory manual, 2- Ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 9.52-9.55, 1989.Sambrook e outros, Em: Molecular cloning: a Iaboratory manual, 2- Ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 9.47-9.52, 9.56-9.58,1989.
Shimamoto e outros, Nature, 338:274-276, 1989.Vasil e outros, Bio/Technology, 10:667-674, 1992.Vasil e outros, Bio/Technology, 8:429434,1990.Wetmure Davidson, J. Mol. Biol., 31:349-370, 1968.Winans, Microbiol. Rev., 56:12-31, 1992.Wising e outros Ann. Rev. Genetics, 22, 421, 1988.Zambryski, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 43: 465-490, 1992.Zupan e Zambryski, Ann. Rev. Phytopathol., 27:583-618, 1995.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS
<110>YE, XUDONGGILBERTSON, LARRY A.PETERSON, MICHAEL W
<120> VETORES E MÉTODOS PARA A EFICIÊNCIA APERFEIÇOADA DE TRANS-
FORMAÇÃO DE PLANTAS
<130>MONS:124WO
<140><141>DESCONHECIDO2006-09-06
<150><151>
60/714,5012005-09-06
<160>
44
<210> 1
<211> 7299
<212> DNA
<213> Agrobacterium rhizogenes
<400>
1
agatcctaca aggtagaatc cgcctgagtc gcaagggtga cttcgcctat attggacgac 60
ggcgcgcaga gggegaccto tttttgggtt acgattgtag gattatcact aaaacaatac 120
atgaacatat tcaaatggca atctctctaa ggcattggaa ataaatacaa ataacagttg 180
ggtggagttt ttcgacctga gggcgttaac cttctgttaa cctaaaagct cttgcccaaa 240
cagcagaatc ggcgctaatt gccagcggcg gaacttttcc agtttogcga aaaatatcgc 300
cactggcaag gaatgggttt gagatggcga agtctgtcct aaaagcagog cctgtagttg 360
tagggttgac ggccttgatg gagcgtcafcg ccgatgccct ctcgagccaa cttcaagcac 420
atcatcttaa ggttttcccg ccgcattccg agaagggcat tcgaacattc gggccatcgg 480
aggcgtccaa gctgctcggc gttggcgagt catatttacg gcagaccgcg tctgagatgc 540
cagagttgaa tgttagcatg agcccgggtg gcaggcgaat gttctcaatt gaagatatcc 600
atgtgattcg gaagtatatg gatcaggtcg gccgcgggaa ccggcgctac cfcgccacatc 660
gtcgaggcgg cgagcagctt caggttatct ctgtgatgaa tttcaaaggt gggtcgggta 720
agaccaccac cgccgcgcat ctggcgcagt acctcgctat gcgcggatat cgagtcttgg 780
ccattgatct cgatcctcaa gcgagccttt ctgcactctt tggaagccaa ccggagacgg 840
acgttggccc gaacgaaacg ctctacggcg ctataaggta tgatgatgag caggtggcaa 900
tcgaacgagt cgtccgaggg acttacattc ccgacctcca cctgattcct ggtaaccttg 960agctgatgga gtttgaacac gatacgccaccgctctttta tggtcgcatc agccaagtaatggtcatcga ctgccctccc cagcttgggtcgtccattct tgtcacggtc catccgcagatggcaatgac atcgaacctt ttgcgtgaaaattggatgcg ctatctgata acccgtttcgtaggttatct gcggtcgatt tttggcgaaaccgcggtttc ggacgctggc ctgacaaacctcacgcgctc gaoctatgat cgagccttggaaacactgat caaaaaagca tggggtaggcctcaactgac gcccctgaga cgtcgcccgcgccgctcctc ggçgtaacaa ggaaggagcgtggtaacgca ctgcgagagc aaaacgatcgtctcgctgaa ggtcaggcag tgatagagttgcaggatcgt atgcgagggg acattgacgggcaagtccca atccttgtgc gaccgcatcccggccaccgc cggctacgcg ccgtttcagacgaactgacg gacgagcaag tggtcgtagctcttaccttc atcgaaaagg cgcgcttcgcgattgtcatc gccgcgatgt cgatcgacaacgacgccctc ccctctgaac tgaccgatgcgagttggcaa caacttgccg agctgattgaatatgctatg tcggaggaag ttcaagcgctcgctagtctg aagcccagtc gggttgcgcgcggcaccaga attgcacagg tgacgcagaggaaggcgacg cccgattttg cgaccttcgtgtaccacgct gagaaccaac ggaaacggggcaacgtcgcc gtcgcggaag cccttctgtc
gcgcgctçjat gaaccgcaaa gagggcgaca 1020ttgaagatat "cgcggataac tatgacgtcg 1080atctcacgct atccgcattg actgcggcga 1140tgctggatgt gatgtcaatg aaccagtttc 1200tcgagaatgc tggcgccaag ttcaagttta 1260aaccgagcga cggaccacag aaccaaatgg 1320atgtcctcaa ttttccgatg cttaaaacca 1380agactctatt cgaagtggag cgtggcctgt 1440aggcgatgaa cgccgtcaac gacgagatcg 1500ccacatgagc cggaagcaca tccttggcgt 1560cgacaatagg acggcaaaga accgctccat 1620cgatccggca acgaagctca cagcgaacat 1680tcttagccgt gccgaagaga tcgagcggcg 1740ggatgcctcg tcaatagaac cgtctttcgt 1800gctccttact tcgatccggg aacaaggaca 1860gagccagccg ggccgatatc aggttgcctt 1920actcggactt ccggtcagag cggtcgttcg 1960acagggtcag gaaaacaatg agcgcgaaga 2040acatcgcctg aacaggcagt tttctcgaga 2100gagcaatttg tccaagatgc ttctgctcgt 2160tattggtgcc gctcctggtg ttggacggcc 2220gaaagtttct tcaccggccg acgtggctaa 2280gccatcggca gaacgattca aggcggtgat 2340tggacttccc gaggtcatgg ccaccccaga 2400caaggccaaa ctggaaatca cgattgacag 2460gctcgatcat gtgccagcgc tgtatcaagc 2520agagtaaacc gcaaaagaaa agagccccct 2580tctctagcgc gaacagaatc gcatttcctc 2640gaatcctcgt caagagtcct tagcgccgttaggtgaaaga tgatgcagac aggaagtgtacttgcgcttg tgcggcgcca gacggcgctgaagtggaagg tctttagaga cgcgtccgcgagtcttgccg tccttgatgc gctattgagcgcacagctga tcgtcttcoc gtcgaatgctggcgcgactt tgcgtaggca catcgccatggatagcgcca acggaaagcg ttacgctcgttttggcttcg atttgtctcc gcttctcgcgcaggtgatgg ccgatcgagc agcattcaggcgggacgttc ggaagctaat tacggcagctgctgtogagg aagtctatgt ggaacttgtggatgtagagt caattctcga agagatgtgggaaattagag acaattcaga aaataatagccagaattcaa aacccgaatc cgttaatgaagctaagccga gtgaaataga ccgggcaaggatgatcctga aagcatgccc gaccattggctggcgtgacc tcatgtcggc tgcggtggtggcttaccaag acgcgtgtga ggcaatgggaattttggagc gagcgaactt catcaattcgcggagcgagc tcgggaagtt ttcacttggcgggcagggga cgttgcggtt tggctagaatcagctgacca cagacctaat aggttgaaaaatccgattcc cggagtacca agcgtgctctcgaaggcccc atgccgatcg ttgatcgtgattgccggccg aggcatgtag tcgcggagcatgactcttgg atcgagctgg cagacaaagcgacgaagaga tccagaatcc gccggacggtcctagaggta gaagagcaaa gaaagcacca
ttggtgagct gatttccttt gccfcgctgaa 2700acgacgccat tcgggcggcg gccaatgacg 2760gccgatatca aacaaggcaa gacagcggac 2820gccatggaac tacttggaat ccagtccaac 2880tttcacccgg aaacggagtt gcgtcaggag 2940cagcttgccc ttcgggcgca tgggatggct 3000ctcgtggagt caggcttgat cgtccggaag 3060aaggatggcg ctggtcagat cgagcgcgcg 3120cggtccgaag agctagcgat gatggcacag. 3180atggccaaag aaagtctgac gatttgccga 3240atggaagagg gagcggaggg cgactggcaa 3300ggtagaattc cacgcgcccc gacgcttgct 3360atgctccagg aagagataat caaccggttg 3420accaatgctg cccagagcga gcagcacata 3480cttgaacctc gctctgaaaa ggagcagggc 354 0agcgagccga taaaagcgtt ccccctcggg 3600aattatgggc cgagcggtgc ggttgctagc 3 660gttcggtcta tgctgggggt cagcccgtcg 3720ccggagaatg cggeagcagc gatggcgtgc 3780cccgggggct atctccgaga tctgacacgg 3 840ccgatgataa tggcgctctt gaaggctagc 3 900tagcgagtat ggagcaggat ggtctgtggt 3960catgagcgtt ttttggatga tcgacagacc 4020gatgggagcg ataacattac tcaacaagca 4080aggagagcct gctctacatg cggcggtatt 4140ctgcctattt actgccctag gcacaaacgt 4200aataacccac acagaggacg attaatggct 4260actgctgctg ccgaagttga gccggctgct 4320gccgaaacag cccgcacggg atcgttcaaa 4380tccgtgaagc cgaaaacccg cggcctcagcatcgaagctc aggtcgctgg cggcgcaacctccgttcaga cctattatca atggaagagagccgtgtctg tttcagttga cgatgaactccggcggctca gaaagctagc ttctctctgacaaaagactt ggaatcaact agcggcctttcatctctcaa tgaatgaatg ccttggaaaaagcaatccca atcttctggc atatgaaaaagacgaacagg cgacaagcca aggcccgaccggcggtgggc cgtgcggtcg cggccgacggccgttccgtc ctggagaagg ttgtcgcgtcccaggttttg aggaagagct tgccgctatcttgatcgtga agctccgtga ggagaacgacggcgcctgag cacgatgctg gcccacttgcctaatgatcg cggcgcttga acatcgctagttttgcactc ggagacacag cctcccaaaaacatcgagcg gatcaaggga aactggaatgctggccaggt ccaacctacg gccatgcccgattgacccac tcggctgacg gtacatcagccgttgatctc aggccgttgc ggcagaaaacctgtggtaat gcctatttca gatgaaacagattatggcca cacctctacg atctagggagatttgcacac acatacctcg atgcggaataatgacgatgc gatcgccaac atcgcgcatccaaaaaactt cacaaaactt aagctgattagtgcgtacgg aaaattccat cgacgcattaatgacaacgc tgtgccgaag gaaggattcgaaagggatta tgcgttggca ggagagcgaa
aaccgagaaa aactggagaa gatcggtcaa 4440ttgaaggacg ccgttaagat cgtgggtatt 4500gctgcggttc aacctgtctc acagaatccg 4560ggcgagttca tccaactcga ggaggaaaat 4620aaaattgcgc gcagaaaacg cggacttacg 4680gggggtccct cgctaaatca acttgacgcg 4740tttccgcgca ttctgatcgt tgcgctatca 4800accacgaccc aaattcgtcg tcgaatataa 4860aacgtcaatc tggggcaatc tgggtttgca 4920agtcgtgccg aagagtagtc tgccgcaagt 4 980caaggttacc gtcgtggtcc ctcggtgctg 5040gaggcggaaa accgtcgtct gaagcgcctc 5100aggcttaagt tcgcgcttcg acgatttggg 5X60ttcagcgggc aaacaacatg gagtggagat 5220gggtcttcgg cgccgctgaa ccgtgctcca 5280acctggcgçc gctcgttggt gaactcctca 5340acatccttcg acccgtcacg gcgatccgct 5400caaagccaac ggcatttcca cgtcaagcac 5460tggcgagctc atccggaccc agacgaactg 5520ctccatcctc gcagccgatc caacactttc 5580ccttttttaa acttggcgcg tcattctgat 5640tgcgagaagt ggaaagaaat gaagaacccg 5700aaaatgcatc atcgcttggt gaggccctgg 5760acattgttac agacgacccg gtggaaacgt 5820acaaatcagt gaaacagggt ttcgaacgca 5B80gccggcttgg tattgctagt aaggcgctat 5940tagaacatcc tgaatatgct ccagctctgc 6000ttgaggcggt tggtggaact ttcaggttgc 6060ááacacccca gcggaaaccg gctcttgtag atcatatctt gagtatgccc gaaggtttcg 6120atcaagctca tgcccttgag tctatagccc ctcatgttgg cgatctaagc gcggaagatc 6180gccatcgtgt tgtgaacaaa atgctcgagc actttgccac cccgtttcaa gaaggggggc 6240tgccaaccga cgaaaatttt tgtggaacgt acgctttgtc caaggegttt cctcatatgg 6300aagacagcct aaaagcaaag atgctggatg tggtgttaga gcatcctcac ttagccaacc 6360tccattggac gcagagagaa ctagttgaag ggtggcatca agaccgtgaa gctgagaagt 6420cagcctggcg ttccaatcaa aagccaattg tcgaggggcg acttgcagac ctcgaacgat 6480cgatccacag tgatatcgag gtgacaaaca ggagtgattt tgcgaggatg cgttcagcca 6540ggcccttgca acaagctata agcgatacgt tcgatcttgc gcgtgaggag ctcaaaagcc 6600gccctcgtga agggcggggt cgataattac atctattggt ctttctgccg aacctctatg 6660aaatccgcac gtcaaatgtg gcttttactt cccgatttca attgaagcgc taagctgaaa 672 0atcccgtccc catttctgac ctaacggttt catcaccggg gcagggagcg gcgcttaaaa 6780cggtgacggc caccaccaaa ggacatgttc gctcacgcgg tgcctccgtg cttctttgca 6840agagcctgct tcaggctgat gatctccttc agtgcgttgg tgtgaatccg ctccaggcgt 6900ttcagttcgc tctccaaata ggcgttgcgc ttatccagcc tcgtccgatc ttcttccaag 6960ctctccattt tcactagcgc gttatggtaa ttcaaccgta actcctcaaa aaaagcacgt 7020tcggcgacga aatgggtttc ggaatcgagt tcaggtatgt cgccgacatg cacgacgcga 7080accgccttgc cggcagcggc gagccgggcg cggtaagcgc gttgaatttc cgcttgggtc 7140agcgcgtttg gcttgcgggg ccgcgaggaa atttgggagt aaccataacg gttatttatc 7200ataacgcgtt atcactggat agcatcggcg caggcggatg gcgcgcttcg ccgggtcgaa 7260atcaatattt ccagatcgag atggattgaa gacctgaag 7299
<210> 2<211> 5617
<212> DNA
<213> Agrobacteriuun rhizogenes
<400> 2
agatcctaca aggtagaatc cgcctgagtc gcaagggtga cttcgcctat attggacgac 60ggcgcgcaga gggcgacctc tttttgggtt acgattgtag gattatcact aaaacaatac 120atgaacatat tcaaatggca atctctctaa ggcattggaa ataaatacaa ataacagttg 180ggtggagttt ttcgacctga gggcgttaac cttctgttaa cctaaaagct cttgcccaaa 240cagcagaatc ggcgctaatt gccagcggcgcactggcaag gaatgggttt gagatggcgatagggttgac ggccttgatg gagcgtcatgatcatcttaa ggttttcccg ccgcattccgaggcgtccaa gctgctcggc gttggcgagtcagagttgaa tgttagcatg agcccgggtgatgtgattcg gaagtatatg gatcaggtcggtcgaggcgg cgagcagctt caggttatctagaccaccac cgccgcgcat ctggcgcagtcoattgatct cgatcctcaa gcgagcctttacgttggccc gaacgaaacg ctctacggcgtcgaacgagt cgtccgaggg acttacattcagctgatgga gtttgaacac gatacgccaccgctctttta tggtcgcatc agocaagtaatggtcatcga ctgccctccc cagcttgggtcgtccattct tgtcacggtc catccgcagatggcaatgac atcgaacctt ttgcgtgaaaattggatgcg ctatctgata acccgtttcgtaggttatct gcggtcgatt tttggcgaaaccgcggtttc ggacgctggc ctgacaaacctcacgcgctc gacctatgat cgagccttggaaacactgat caaaaaagca tggggtaggcctcaactgac gcccctgaga cgtcgcccgcgccgctcctc ggcgtaacaa ggaaggagcgtggtaacgca ctgcgagagc aaaacgatcgtctcgctgaa ggtcaggcag tgatagagttgcaggatcgt atgcgagggg acattgacgggcaagtccca atccttgtgc gaccgcatcc
gaacttttcc agtttcgcga aaaatatcgc 300agtctgtcct aaaagcagcg cctgtagttg 360ccgatgccct ctcgagccaa cttcaagcac 420agaagggcat tcgaacattc gggocatcgg 480catatttacg gcagaccgcg tctgagatgc 540gcaggcgaat gttctcaatt gaagatatcc 600gccgcgggaa ccggcgctac ctgccacatc 660ctgtgatgaa tttcaaaggt gggtcgggta 720acctcgctat gcgcggatat cgagtcttgg 780ctgcactctt tgggagccaa ccggagacgg 840ctataaggta tgatgatgag caggtggcaa 900ccgacctcca cctgattcct ggtaaccttg 960gcgcgctgat gaaccgcaaa gagggcgaca 1020ttgaagatat cgcggataac tatgacgtcg 1080atctcacgct atccgcattg actgcggcga 1140tgctggatgt gatgtcgatg aaccagtttc 1200tcgagaatgc tggcgccaag ttcaagttta 1260aaccgagcga cggaccacag aaccaaatgg 1320atgtcctcaa ttttccgatg cttaaaacca 1380agactctatt cgaagtggag cgtggcctgt 1440aggcgatgaa cgccgtcaac gacgagatcg 1500ccacatgagc cggaagcaca tccttggcgt 1560cgacaatagg acggcaaaga accgctccat 1620cgatccggca acgaagctca cagcgaacat 1680tcttagccgt gccgaagaga tcgagcggcg 1740ggatgcctcg tcaatagaac cgtctttcgt 1800gctccttact tcgatccggg aacaaggaca 1860gagccagccg ggccgatatc aggttgcctt 1920cggscaccgc cggccacgcg^ecgccccagacgaactgacg gacgagcaag tggtcgtagctcttaccttc atcgaaaagg cgcgcttcgcgattgtcatc gccgcgafcgt cgatcgacaacgacgccctc ccctctgaac tgaccgatgcgagttggcaa caacttgccg agctgattgaatatgctatg tcggaggaag ttcaagcgctcgctagtctg aagcccagtc gggttgcgcgcggcaccaga attgcacagg tgacgcagaggaaggcgacg cccgattttg cgaccttcgtgtaccacgct gagaaccaac ggaaacggggcaacgtcgcc gtcgcggaag cccttctgtcgaatcctcgt caagagtttt fcagcgccgttaggtgaaaga tgatgcagac aggaagtgtacttgcgcttg tgcggcgcca gacggcgctgaagtggaagg tctttagaga cgcgtccgcgagtcttgccg tccttgatgc gctattgagcgcacagctga tcgtcttccc gtcgaatgctggcgcgactt tgcgtaggca catcgccatggatagcgcca acggaaagcg ttacgctcgttttggcttcg atttgtctcc gcttctcgcgcaggtgatgg ccgatcgagc agcattcaggcgggacgttc ggaagctaat tacggcagctgctgtcgagg aagtctatgt ggaacttgtggatgtagagt caattctcga agagatgtgggaaattagag acaattcaga aaataatagccagaattcaa aacccgaatc cgttaatgaagctaagccga gtgaaataga ccgggcaaggatgatcctga aagcatgccc gaccattggc
actcggactt ccggtcagag cggtcgttcg 1980acagggtcag gaaaacaatg agcgcgaaga 2040acatcgcctg aacaggcagt tttctcgaga 2100gagcaatttg tccaagatgc ttctgctcgt 2160tattggtgcc gctcctggtg ttggacggcc 2220gaaagtttct tcaccggccg acgtggctaa 2280gccatcggca gaacgattca aggcggtgat 2340tggacttccc gaggtcatgg ccaceccaga 2400caaggccaaa ctggaaatca cgàttgacag 2460gctcgatcat gtgccagcgc tgtatcaagc 2520agagtaaacc gcaaaagaaa agagccccct 2580tctctagcgc gaacagaatc gcatttcctc 2640ttggtgagct gatttocttt gcctgctgaa 2700acgacgccat tcgggcggcg gccaatgacg 2760gccgatatca aacaaggcaa gacagcggac 2820gccatggaac tacttggaat ccagtccaac 2880tttcacccgg aaacggagtt gcgtcaggag 2940cagcttgccc ttcgggcgca tgggatggct 3000ctcgtggagt caggcttgat cgtccggaag 3060aaggatggcg ctggtcagat cgagcgcgcg 3120cggtccgaag agctagcgat gatggcacag 3180atggccaaag aaagtctgac gatttgccga 3240atggaagagg gagcggaggg cgactggcaa 3300ggtagaattc cacgcgcccc gacgcttgct 3360atgctccagg aagagataat caaccggttg 3420accaatgctg cccagagcga gcagcacata 3480cttgaacctc gctctgaaaa ggagcagggc 3540agcgagccga taaaagcgtt ccccctcggg 3600aattatgggc cgagcggtgc ggttgctagc 3660tggcgtgacc tcatgtcggc tgcggtggtggcttaccaag acgcgtgtga ggcaatgggaattttggagc gagcgaactt catcaattcgcggagcgagc tcgggaagtt ttcacttggcgggcagggga cgttgcggtt tggctagaatcagctgacca cagacctaat aggttgaaaaatccgattcc cggagtacca agcgtgctctcgaaggcccc atgccgatcg ttgatcgtgattgccggccg aggcatgtag tcgcggagcatgactcttgg atcgagctgg cagacaaagcgacgaagaga tccagaatcc gccggacggtcctagaggta gaágagcaaa gaaagcaccatccgtgaagc cgaaaacccg cggcctcagcatcgaagctc aggtcgctgg cggcgcaacctccgttcaga cctattatca atggaagagagccgtgtctg tttcagttga cgatgaactccggcggctca gaaagctagc ttctctctgacaaaagactt ggaatcaact agcggcctttcatctctcaa tgaatgaatg ccttggaaaaagcaatccca atcttctggc atatgaaaaa"gacgaacagg cgacaagcca aggcccgaccggcggtgggc cgtgcggtcg cggccgacggccgttccgtc ctggagaagg ttgtcgcgtcccaggttttg aggaagagct tgccgctatcttgatcgtga agctccgtga ggagaacgacggcgcctgag cacgatgctg gcccacttgcctaatgatcg cggcgcttga acatcgctagttttgcactc ggagacacag cctcccaaaa
gttcggtcta tgctgggggt cagcccgtcg 3720 ccggagaatg cggcagcagc gatggcgtgc 3780cccgggggct atctccgaga tctgacacgg 3840 ccgatgataa tggcgctctt gaaggctagc 3900tagcgagtat ggagcaggat ggtctgtggt 3960catgagcgtt ttttggatga tcgacagacc 4020gatgggagcg ataacattac tcaacaagca 4060aggagagcct gctctacatg cggcggtatt 4140ctgcctattt actgccctag gcacaaacgt 4200 aataacccac acagaggacg attaatggct 4260actgctgctg ccgaagttga gccggctgct 4320gccgaaacag cccgcacggg atcgttcaaa 4380aaccgagaaa aactggagaa gatcggtcaa 4440ttgaaggacg ccgttaagat cgtgggtatt 4500gctgcggttc aacctgtctc acagaatccg 4560ggcgagttca tccaactcgá ggaggaaaat 4620aaaattgcgc gcagaaaacg cggacttacg 4680gggggtccct cgctaaatca acttgacgcg 4740tttccgcgca ttctgatcgt tgcgctatca 4800accacgaccc aaattcgtcg tcgaatataa 4860 aacgtcaatc tggggcaatc tgggtttgca 4920agtcgtgccg aagagtagtc tgccgcaagt 4980caaggttacc gtcgtggtcc ctcggtgctg 5040gaggcggaaa accgtcgtct gaagcgcctc 5100aggcttaagt tcgcgcttcg acgatttggg 5160 ttcagcgggc aaacaacatg gagtggagat 5220gggtcttcgg cgccgctgaa ccgtgctcca 5280acctggcgcc gctcgttggt gaactcctca 5340acaccgageg -gaccaaigggá' áactggaatg acatccttcg acccgtcacg gcgatccgct 5400ctggccaggt ccaacctacg gccatgcccg caaagccaac ggcatttcca cgtcaagcac 5460attgacccac tcggctgacg gtacatcagc tggcgagctc atccggaccc agacgaactg 5520cgttgatctc aggccgttgc ggcagaaaac ctccatcctc gcagccgatc caacactttc 5580ctgtggtaat gcctatttca gatgaaacag ccttttt 5617
<210> 3
<211> 4115
<212> DNA
<213> Agrobacteriiain rhizogenes
<400> 3
tacaaggtag aatccgcctg agtcgcaagg gtgacttcgc ctatattgga cgacggcgcg 60cagagggcga cctctttttg ggttacgatt gtaggattat cactaaaaca atacatgaac 120atattcaaat ggcaatctct ctaaggcatt ggaaataaat acaaataaca gttgggtgga 180gtttttcgae ctgagggcgt taaccttctg ttaacctaaa agctcttgcc caaacagcag 24 0aatcggcgct aattgccagc ggcggaactt ttccagtttc gcgaaaaata tcgccactgg 300caaggaatgg gtttgagatg gcgaagtctg tcctaaaagc agcgcctgta gttgtagggt 360
Il
tgacggcctt gatggagcgt catgccgatg ccctctcgag ccaacttcaa gcacatcatc 420Ctaaggtttt cccgccgcat tccgagaagg gcattcgaac attcgggcca tcggaggcgt 4 80ccaagctgct cggcgttggc gagtcatatt tacggcagac cgcgtctgag atgccagagt 540tgaatgttag catgagcccg ggtggcaggc gaatgttctc aattgaagat atccatgtga 600ttcggaagta tatggatcag gtcggccgcg ggaaccggcg ctacctgcca catcgtcgag 660gcggcgagca gcttcaggtt atctctgtga tgaatttcaa aggtgggtcg ggtaagacca 720ccaccgccgc gcatctggcg cagtacctcg ctatgcgcgg atatcgagtc ttggccattg 780atctcgatcc tcaagcgagc ctttctgcac tctttgggag ccaaccggag acggacgttg 840gcccgaacga aacgctctac ggcgctataa ggtatgatga tgagcaggtg gcaatcgaac 900gagtcgtccg agggacttac attcccgacc tccacctgat tcctggtaac cttgagctga 960tggagtttga acacgatacg ccacgcgcgc tgatgaaccg caaagagggc gacacgctct 1020tttatggtcg catcagccaa gtaattgaag atatcgcgga taactatgac gtcgtggtca 1080tcgactgccc tccccagctt gggtatctca cgctatccgc attgactgcg gcgacgtcca 1140ttcttgtcac ggtccatccg cagatgctgg atgtgatgtc gatgaaccag tttctggcaa 1200tgacatcgaa ccttttgcgt gaaatcgagatgcgctatct gataacccgt ttcgaaccgaatctgcggtc gatttttggc gaaaatgtcctttcggacgc tggcctgaca aaccagactcgctcgaccta tgatcgagcc ttggaggcgatgatcaaaaa agcatggggt aggcccacattgacgcccct gagacgtcgc ccgccgacaacctcggcgta acaaggaagg agcgcgatcccgcactgcga gagcaaaacg atcgtcttagtgaaggtcag gcagtgatag agttggatgctcgtatgcga ggggacattg acgggctcctcccaatcctt gtgcgaccgc atccgagccaccgccggcta cgcgccgttt cagaactcgggacggacgag caagtggtcg tagcaeagggcttcatcgaa aaggcgcgct tcgcacatcgoatcgccgcg atgtcgatcg acaagagcaacctcccctct gaactgaccg atgetattgggcaacaactt gccgagctga ttgagaaagttatgtcggag gaagttcaag cgctgccatctctgaagccc agtcgggttg cgcgtggactcagaattgca caggtgacgc agagcaaggcgacgcccgat tttgcgacct tcgtgctcgacgctgagaac caacggaaac ggggagagtacgccgtcgcg gaagcccttc tgtctctctatcgtcaagag tttttagcgc cgttttggtgaagatgatgc agacaggaag tgtaacgacgcttgtgcggc gccagacggc gctggccgataaggtcttta gagacgcgtc cgcggccatg
atgctggcgc caagttcaag tttaattgga 1260gcgacggacc acagaaccaa atggtaggtt 1320tcaattttcc gatgcttaaa accaccgcgg 13 80tattcgaagt ggagcgtggc ctgttcacgc 1440tgaacgccgt caacgacgag atcgaaacac 1500gagccggaag cacatccttg gcgtctcaac 1560taggacggca aagaaccgct ccatgccgct 1620ggcaacgaag ctcacagcga acattggtaa 1680ccgtgccgaa gagatcgagc ggcgtctcgc 174 0ctcgtcaata gaaccgtctt tcgtgcagga 1800tacttcgatc cgggaacaag gacagcaagt 1860gccgggccga tatcaggttg octtcggcca 1920acttccggtc agagcggtcg ttcgcgaact 1980tcaggaaaac aatgagcgcg aagatcttac 2040cctgaacagg cagttttctc gagagattgt 2100tttgtccaag atgcttctgc tcgtcgacgc 21S0tgccgctcct ggtgttggac ggccgagttg 2220ttcttcaccg gccgacgtgg ctaaatatgc 2280ggcagaacga ttcaaggcgg tgatcgctag 2340tcccgaggtc atggccaccc cagacggcac 2400caaactggaa atcacgattg acaggaaggc 2460tcatgtgcca gcgctgtatc aagcgtacca 2520aaccgcaaaa gaaaagagcc ccctcaacgt 2580gcgcgaacag aatcgcattt cctcgaatcc 2640agctgatttc ctttgcctgc tgaaaggtga 2700ccattcgggc ggcggccaat gacgcttgcg 2760atcaaacaag gcaagacagc ggacaagtgg 2820gaactacttg gaatccagtc caacagtctt 2880gccgtccttg acgcgccacx; gagcctccacctgatcgtct tcccgtcgaa tgctcagcttactttgcgta ggcacatcgc catgctcgtggccaacggaa agcgttacgc tcgtaaggatttcgatttgt ctccgcttct cgcgcggtccatggccgatc gagcagcatt caggatggccgttcggaagc taattacggc agctatggaagaggaagtct atgtggaact tgtgggtagagagtcaattc tcgaagagat gtggatgctcagagacaatt cagaaaataa tagcaccaattcaaaacccg aatccgttaa tgaacttgaaccgagtgaaa tagaccgggc aaggagcgagctgaaagcat gcccgaccat tggcaattatgacctcatgt cggctgcggt ggtggttcggcaagacgcgt gtgaggcaat gggaccggaggagcgagcga acttcatcaa ttcgcccggggagctcggga agttttcact tggcccgatggggacgttgc ggtttggcta gaattagcgaaccacagacc taataggttg aaaacatgagttcccggagt accaagcgtg ctctgatgggccccatgccg atcgttgatc gtgaaggaga
<210> 4
<211> 4304
<212> DNA
<213> Rhizobium etli
<400> 4
agttacggct gatcgaccag acccggcaccgcgaaccgat gccttgcatc tgcgggcttggattcggatt atactgctgc tgttcccggccgattgctgg acccgccagc ggcacgcccg
ccggaaacgg agttgcgtca ggaggcacag 2940gcccttcggg cgcatgggat ggctggcgcg 3000gagtcaggct tgatcgtccg gaaggatagc 3060ggcgctggtc agatcgagcg cgogtttggc 3120gaagagcfcag cgatgatggc acagcaggtg 3180aaagaaagtc tgacgatttg ccgacgggac 3240gagggagcgg agggcgactg gcaagctgtc 3300attccacgcg ccccgacgct tgctgatgta 3360caggaagaga taatcaaccg gttggaaatt 3420gctgcccaga gcgagcagca catacagaat 3480cctcgctctg aaaaggagca gggcgctaag 3540ccgataaaag cgttccccct cgggatgatc 3600gggccgagcg gtgcggttgc tagctggcgt 3660tctatgctgg gggtcagccc gtcggcttac 3720aatgcggcag cagcgatggc gtgcattttg 3780ggctatctcc gagatctgac acggcggagc 3840ataatggcgc tcttgaaggc tagcgggcag 3900gtatggagca ggatggtctg tggtcagctg 3960cgttttttgg atgatcgaca gaccatccga 4020agcgataaca ttactcaàca agcacgaagg 4080gcctg 4115
ttaccgccgc gccccgctcc atccacgcca 60
cagcaaggcg ctttgcacgc ccgacattgc 120
cggtctcgtc cgattcggcc tgtgaatgtg 180
gccggcgcaa gcgcttgaaa tagactggac 240aaeettttga taggatcttg ttaaccctataaatgcggtt tcaaagcgcg tagagcttttggcaccgcaa atagaaaaag caattteegaggaactatcc gacaagctga agcagcatcggggtctgcgg gaatttcagc ttgctgaagttcttcgaaat ctttcgctcg agggcaagggccgatcgtat acggeggagc agatggaggacgccggaaca cattatgtgc gtcatcgccgcgtcaacttc aaggggggca gcggcaagaccgccctgacc ggtcaccgcg tcctggccgtcatacacggc tttcagccgg agttcgacgttcgctatgac gatcagcggc gtccgctgcgccttcatctc gtgccgggca atctcgaactcctcgctcag ggcaaagcga gcgattatgggctggcctcg gtcgcggatg attacgacgtctttttgacc atgagcgeea tttgcggtgcgatgetcgat gtcatgtcga tgtgecagttgctgaaggga gccggcggca atatgaacctcgatccgcag gacgggccgc agaegeagatccatgtgctc accaacccga tgctgcgcagccagacgctg tacgaagtcg agcgaagtcaggaggcgatg gagteagtea acacggaaatgaaatgagcg ggaagtttac tgcggtaaacaaatcttctg tcgggcctga tggacgattctgagccggcc cctcgcgacg agaggcagcatgcggtcacc cgcagcatcg atgccttggcagagcagctg gcgagcggcg agacggtgatcttcgtgacc gaccggctgg cgcatactga
ttgccttgcc acccctceag aatcggcgct 300
aaatcgeatt ttcgagattt ecatgaatat 360
tgtcgaccag ctgatcatcg gtcaggcaca 420
cctcgaaatg tttcctccgc gcgcgctaaa 480
ggcgcggttt ctcggegtga ecagcggcta 540
tgccctcccc caggttacgc cgtctggccg 600
gatgcgtggc tttctcgagc ataatgcgcg 660
cggccacgaa catctgcagg tegttgetgt 720
gacgagtgcc gcgcatcttg cccagcatct 780
cgatetcgat ccgcaagcgt ctçtttctgc 840.
caacgaaaac gagacactct acgccgccat 900
ggacattatc cggcegacea acttcccgaa 960
gatggaattc gagcacgata cgccgcgggt 1020
gcgcgtcttc tttgcccggc tggatgaggc 1080
cgtcatcatc gattgccctc cccagcttgg 1140
gacggcggtt ctgatçaccg tteatccgca 1200
cetgeaaatg cttggcgaag tgctgaacac 1260
cgactggetg egttaectcg tgacccgcta 1320
9ETtcgccttc atgcgctcga tgttcaagag 1380
cgtcgcgatc tccgatgcgg egatgaetaa 1440
gtttacccgc gcgacctatg accgcgccat 1500
cgtcgatctc atccataagg catggggccg 1560
cggggcaagg agctggttga tggcgcgtaa 1620
caagaagttt actgcggtaa acaatgagga 1680
tateacetat aaggggattg gcgcgctcgg 1740
cgccaaggcc gatgccgcca aggcgatcga 1800
cgatctcgac ccggcgctga tcgaagattc 1860
cgaacagttc cgggaattag tcgaggcgat 1920ccgcccgcgc ggccaggact: caccgaccctatatcagatc gcttttggtc atcgtcgtgcccgggcggtg gtcaagagaç tcgacgaccgttcgaattcg gcacgcgccg .atctctccttçgacacgttg ggtttcgacc gggaaacgatggtgtccaag atgctgtcgg tcacgaagcgcgtagccaag acgactggcc gcgatcgctgaaacatcgca gcccgggcga ttgagttcacggacgcccgc ttcgaoatgc ttgtcgccttcgccgcagtt cagcccgtgg cgcacgcctggatcaaggat gatggaaaac agttcaccattggcgcctac atcgccagca atctggatcgtttgacgaag aacggagatc aataagcaaaaagccctctc tgatctagac acccagagaatttggcaccg aatttggtga ggcgtgatctagcggaagtg tgacacgccc ttcgggcggcaggccgctgc ccgaaaaatc gagcccggccccctgtgcga ggccaggccg ctgctcggcaccttgctgag cttttatccc aagggagagccttcgaatac gcagctctct ctgcgcgcgcacctggcggc gctgatcgag gccggattgcgttacgctcg caaggagcag ggcggggagacgctgcttgc gcgcgcggac gagatcgagctgcagctgca gcggctcaaa gagcgcctgatcgagatggc cgtggaagag ggcgcctctggaggcatcgt cgaacggctg ccgcgctcgcacgaactgga actgttgcgc gaagaaatcacaaatcaaag cggcaatgcc caacattctgacactactga acttgaacca cgcttcgaaa
tgtgcgcccg catcccgaga gggaggggcg IS80gcgggcggca aaggagctcg gccgacctgt 2040cgaccatgtc attgcgcagg gccaggagaa 2100catcgagagg acgatgtttg ccgacaagct 2160catgtcggca ctcagcgcag acaagacgac 2220gattccggcc gaagtcctgg ccgcgatcgg 2280gcatgatctt tcggcgaaat tcgagacgga 2340cagatcggtg gagttcgaga cggccgagcc 2400catcagcagg aaccaacagg cgtcgcccgc 2460gcagcgccgg gacggagccg tcaaagcgaa 2520cgcgctgaag gcggagaagg catctgcctt 2580tctctacgag gcgttcgaga agacacagga 2640agaaaaggcc cccgaacgtt gccgtcgcgg 2700tcacatttec gcgaatcata gtcaagagtc 2760tttgccttga agaaggcgaa gaaaatggaa 2820ggccgatgac gtttggcatg ttggcaágtc 2880gatcgattga taaatggaaa ctctatcgcg 2940ttacagaccg ggcgctttcc atcctgaacg 3000tctocgagga gaacggcttg gtcgtatttc 3060atggaatggc ggagcagacg atccgtcgcc 3120tgatccgcaa ggacagcccg aacggcaagc 3180tccgtgaggc attcggcttc tcgctggcgc 3240ggctggcggc cgagatggca gccgaacgat 3300cgctttgcag gcgcgacatc gccaagctca 3360gtgattggag cggggtccac ctgcattttc 3420catccttcga gaagattgcc gccgcactcg 34 80ccaatcagtt ggaaatgcag gttaaagctc 3540agcggcacat acagaattca aacccacact 3600cgaagcaggg cgcaacggtg gacgaccaat 3660cggaaggttg ggccgagccg agggccagaa tagcgacaca ggaggggaag ggcaggccca 3720tgccagctgc aaactcagcc tcggttgccg gcggcgggct caaatccttc ccgctgggcc 3780tggtgctgca ggcctgccca gagatcgccg cctatggacc gcagggctcg gtgggcacat 3840ggcgcgatct gatggcggcg gctgtcgtcg tgcgctcaat gctcggagtg agcccctcgg 3900cctatgaaca ggcctgcgag gtcatggggc ctgaaaatgc ggctaccgtc atagcgtgcg 3960tgcttgaaag ggcagggcac atcaattccg ccggtggtta cctccgtgac ctgacccgcc 4020gcgccgagag aggcgaattt gccatcggac cgatgttgat ggcgcttgtc cgçaccaatt 4080cgccaatcag aggcaagacc ggatgaaaaa tttcgtgtca tctgtccgtg gcgatctatg 4140gttaacgaaa ggtgacggaa ataaacaggg tgataacttc ttgttaggat attcttcctt 4200tgagatcatg aagttacaag atttttgatt ggcaaggcga gggaaggacc tgatcgacga 4260tcggccggcg ttcgctggag aaacggtgcg gttggagttg acgt 4304
<210> 5
<211> 28<212> DNA
<213> Agrobacterium rhizogenes
<400> 5
cacgtgtaca aggtagaatc cgcctgag 28
<210> 6<211> 27
<212> DNA
<213> Agrobacterium rhizogenes
<400> 6
gtatacaggc tctccttçac gatcaac 27
<210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Seqüência Artificial<220> <223> Descrição da Seqüência<400> 7
agcttgggcc cctcgaggct agcactagtg 30
<210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Seqüência Artificial<220> <223> Descrição da Seqüência
<400>
8gatccactag tgctagcctc gaggggccc
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético
<400> 9
ccacgtgagt tacggctgat cgaccagac
<210> 10 <211> 29 <212> DNA <213> Seqüência Artificial<22 0> <223> Descrição da Seqüência<400> 10
gcctaggacg tcaactccaa ccgcaccgt
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Agrobacterium rhizogenes
< 4 OO > 11
acaaggtaga atccgcctga g
<210> 12<211> 21<212> DNA
<213> Agrobacterium rhizogenes
<400> 12
ttcaactctg gcatctcaga c
<210> 13
<211> 43
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 13
tcgctttcct tgacgcggag ttcttccaga ccgttcatca cgg
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético<400> 14gtaggtgatt ggcgttg
<210> 15<211> 44<212> DNA<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 15
tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gact
<210> 16<211> 26<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220><223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético
<400> 16
gttatttatg agatgggttt ttatga
<210> 17<211> 20<212> DNA<213> Escherichia coli
<400> 17aacgcctgat tttacgcgag
<210> 18<211> 21<212> DNA<213> Escherichia coli
<400> 18caataccgca gggcacttat c
<210> 19<211> 18<212> DNA<213> Seqüência Artificial<220><223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético
<400> 19cccacagatg atgtggac
<210> 20<211> 20<212> DNA<213> Agrobacterium rhizogenes
<400> 20tggcaaggaa tgggtttgag 20
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Agrobacterium rhizogenes
<400> 21
ctacaactac aggcgctgct ttt 23
<210> 22
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético
<400> 22
tggcgaagtc tgtcc 15
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> Agrobacteriiim tumefaciens
<400> 23
gccaagggat ctttttggaa t 21
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 24
ccacccaaac gtcggaaa 1B
<210> 25
<211> 15
<212> DNA
.<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético
<400> 25
tgctccgtcg tcagg 1S
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> Agrobacterium tiimefaciens
<400>
26gcacccggtg gagctt χ 6
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 27
tctgcctaac cggctcagt 19
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético
<400> 28
catgttggtt tctacgcag 19
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> Solanum tuberosum
<400> 29
atgaaataaa aggatgcaca cat 23
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Solanum tuberosum
<400> 30
acaactttga tgcccacatt 20
<210> 31
<211> 15
<212> DNA
<213> Seqüência Artificial<22 0>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Iniciador Sintético
<400> 31
tgacatgcta atcac 15
<210> 32
<211> 1215
<212> DNA
<213> Agrobacterium rhizogenes
<400>
32atggcgaagt ctgtcctaaa agcagcgcct gtagttgtag ggttgacggc cttgatggag 60cgtcatgccg atgccctctc gagccaactt caagcacatc atcttaaggt tttcccgccg 120cattccgaga agggcattcg aacattcggg ccatcggagg cgtccaagct gctcggcgtt 180ggcgagtcat atttacggca gaccgcgtct gagatgccag agttgaatgt tagcatgagc 240ccgggtggca ggcgaatgtt ctcaattgaa gatatccatg tgattcggaa gtatatggat 300caggtcggcc gcgggaaccg gcgctacctg ccacatcgtc gaggcggcga gcagcttcag 360gttatctctg tgatgaattt caaaggtggg tcgggtaaga .ccaccaccgc cgcgcatctg 420gcgcagtacc tcgctatgcg cggatatcga gtcttggcca ttgatctcga tcctcaagcg 480agcctttetg cactctttgg gagccaaccg gagacggacg ttggcccgaa cgaaacgctc 540tacggcgcta taaggtatga tgatgagcág gtggcaatcg aacgagtcgt ccgagggact 600tacattcccg acctccacct gattcctggt aaccttgagc tgatggagtt tgaacacgat 660acgccacgcg cgctgatgaa ccgcaaagag ggcgacacgc tcttttatgg tcgcatcagc 720caagtaattg aagatatcgc ggataactat gacgtcgtgg tcatcgactg ccctccccag 780cttgggtatc tcacgctatc. cgcattgact gcggcgacgt ccattcttgt cacggtccat 840ccgcagatgc tggatgtgat gtcgatgaac cagtttctgg caatgacatc gaaccttttg 900cgtgaaatcg agaatgctgg cgccaagttc aagtttaatt ggatgcgcta tctgataacc 960cgtttcgaac cgagcgacgg accacagaac caaatggtag gttatctgcg gtcgattttt 1020ggcgaaaatg tcctcaattt tccgatgctt aaaaccaccg cggtttcgga cgctggcctg 1080acaaaccaga ctctattcga agtggagcgt ggcctgttca cgcgctcgac ctatgatcga 1140gccttggagg cgatgaacgc cgtcaacgac gagatcgaaa cactgatcaa aaaagcatgg 1200ggtaggccca catga 1215
<210> 33
<211> 939
<212> DNA
<213> Agrobacterixim rhizogenes
<400> 33
atgccgctcc tcggcgtaac aaggaaggag cgcgatccgg caacgaagct cacagcgaac 60attggtaacg cactgcgaga gcaaaacgat cgtcttagcc gtgccgaaga gatcgagcgg 120
cgtctcgctg aaggtcaggc agtgatagag ttggatgcct cgtcaataga accgtctttc 180
gtgcaggatc gtatgcgagg ggacattgac gggctcctta cttcgatccg ggaacaagga 240
cagcaagtcc caatccttgt gcgaccgcat ccgagccagc cgggccgata tcaggttgcc 3 00ttcggccacc gccggctacg cgccgtttca gaactcggac ttccggtcag agcggtcgtt 360cgcgaactga cggacgagca agtggtcgta gcacagggtc aggaaaacaa tgagcgcgaa 420gatcttacct tcatcgaaaa ggcgcgcttc gcacatcgcc tgaacaggca gttttctcga 480gagattgtca tcgccgcgat gtcgatcgac aagagcaatt tgtccaagat gcttctgctc 540gtcgacgccc tcccctctga actgaccgat gctattggtg' ccgctcctgg tgttggacgg 600ccgagttggc aacaacttgc cgagctgatt gagaaagttt cttcaccggc cgacgtggct 660aaatatgcta tgtcggagga agttcaagcg ctgccatcgg cagaacgatt caaggcggtg 720atcgctagtc tgaagcccag tcgggttgcg cgtggacttc ccgaggtcat ggccacccca 780gacggcacca gaattgcaca ggtgacgcag agcaaggcca aactggaaat cacgattgac 840aggaaggcga cgcccgattt tgcgaccttc gtgctcgatc atgtgccagc gctgtatcaa 900gcgtaccacg ctgagaacca acggaaacgg ggagagtaa 939
<210> 34
<211> 1218
<212> DNA
<213> Agrobacteri\im rhizogenes
<400> 34 atgatgcaga caggaagtgt aacgacgcca ttcgggcggc ggccaatgac gcttgcgctt 60gtgcggcgcc agacggcgct ggccgatatc aaacaaggca agacagcgga caagtggaag 120gtctttagag acgcgtccgc ggccatggaa ctacttggaa tccagtccaa cagtcttgcc 180gtccttgatg cgctattgag ctttcacccg gaaacggagt tgcgtcagga ggcacagctg 240atcgtcttcc cgtcgaatgc tcagcttgcc cttcgggcgc atgggatggc tggcgcgact 300ttgcgtaggc acatcgccat gctcgtggag tcaggcttga tcgtccggaa ggatagcgcc 360aacggaaagc gttacgctcg taaggatggc gctggtcaga tcgagcgcgc gtttggcttc 420gatttgtctc cgcttctcgc gcggtccgaa gagctagcga tgatggcaca gcaggtgatg 480gccgatcgag cagcattcag gatggccaaa gaaagtctga cgatttgccg acgggacgtt 540cggaagctaa ttacggcagc tatggaagag ggagcggagg gcgactggca agctgtcgag 600gaagtctatg tggaacttgt gggtagaatt ccacgcgccc cgacgcttgc tgatgtagag 660tcaattctcg aagagatgtg gatgctccag gaagagataa tcaaccggtt ggaaattaga 720gacaattcag aaaataatag caccaatgct gcccagagcg agcagcacat acagaattca 780aâacccgaat ccgttaatga acttgaacct cgctctgaaa aggagcaggg cgctaagccg 840agtgaaatag accgggcaag gagcgagccg ataaaagcgt tccccctcgg gatgatcctg 900aaagcatgcc cgaccattgg caattatggg ccgagcggtg cggttgctag ctggcgtgac 960ctcatgtcgg ctgcggtggt ggttcggtct atgctggggg tcagcccgtc ggcttaccaa 1020
gacgcgtgtg aggcaatggg accggagaat gcggcagcag cgatggcgtg cattttggag 1080
cgagcgaact tcatcaattc gcccgggggc tatctccgag atctgacacg gcggagcgag 1140
ctcgggaagt tttcacttgg cccgatgata atggcgctct tgaaggctag cgggcagggg 1200
acgttgcggt ttggctag 1218
<210> 35
<211> 80<212> DNA
<213> Agrobacterium rhizogenes
<400> 35
gccggaagca catccttggc gtctcaactg acgcccctga gacgtcgccc gccgacaata 60ggacggcaaa gaaccgctcc 80
<210> 36<211> 152<212> DNA<213> Agrobacterium rhizogenes
<400> 36
accgcaaaag aaaagagccc cctcaacgtc gccgtcgcgg aagcccttct gtctctctag 60cgcgaacaga atcgcatttc ctcgaatcçt cgtcaagagt ttttagcgcc gttttggtga 120gctgatttcc tttgcctgct gaaaggtgaa ag 152
<210> 37<211> 16<212> DNA<213> Agrobacterium rhizogenes
<400> 37gtggtcagct gaccac 16
<210> 38<211> 1215<212> DNA<213> Rhizobium etli
<400> 38
atgaatatgg caccgcaaat agaaaaagca atttccgatg tcgaccagct gatcatcggt 60
caggcacagg aactatccga caagctgaag cagcatcgcc tcgaaatgtt tcctccgcgc 120
gcgctaaagg gtctgcggga atttcagctt gctgaagtgg cgcggtttct cggcgtgacc 180
agcggctatc ttcgaaatct ttcgctcgag ggcaagggtg ccctccccca ggttacgccg 240
tctggccgcc gatcgtatac ggcggagcag atggaggaga tgcgtggctt tctcgagcat 300aatgcgcgcg ccggaacaca ttatgtgcgtgttgctgtcg tcaacttcaa ggggggcagccagcatctcg ccctgaccgg tcaccgcgtccfcttctgcca tacacggctt tcagccggaggccgccattc gctatgacga tcagcggcgtttcccgaacc ttcatctcgt gccgggcaatccgcgggtcc tcgctcaggg caaagcgagcgatgaggcgc tggcctcggt cgcggatgatcagcttggct ttttgaccat gagcgccattcatccgcaga tgctcgatgt catgtcgatgctgaacacgc tgaagggagc cggcggcaatacccgctacg atccgcagga cgggccgcagttcaagagcc atgtgctcac caacccgatgatgactaacc agacgctgta cgaagtcgagcgcgccatgg aggcgatgga gtcagtcaactggggccgga aatga
<210> 39
<211> 1050
<212> DNA
<213> Rhizobium etli
<400> 39
atggcgcgta aaaatcttct gtcgggcctgaacaatgagg atgagccggc ccctcgcgacggcgcgctcg gtgcggtcac ccgcagcatcaaggcgatcg aagagcagct ggcgagcggcatcgaagatt ccttcgtgac cgaccggctggtcgaggcga-tccgcctgcg cggccaggatagggaggggc gatatcágat cgcttttggtggccgacctg tccgggcggt ggtcaagagaggccaggaga attcggcacg cgccgatctcaagctcgaca cgttgggttt cgaccgggaa
catcgccgcg gccacgaaca tctgcaggtc 360ggcaagacga cgagtgccgc gcatcttgcc 420
ctggccgtcg atctcgatcc gcaagcgtct 480
ttcgacgtca acgaaaacga gacactctac 540ccgctgcggg acattatccg gccgaccaac 600
ctcgaactga tggaattcga gcacgatacg 660
gattatgggc gcgtcttctt tgcccggctg 720tacgacgtcg tcatcatcga ttgccctccc 780tgcggtgcga cggcggttct gatcaccgtt 840
tgccagttcc tgcaaatgct tggcgaagtg 900
atgaacctcg actggctgcg ttacctcgtg 960acgcagatgg tcgccttcat gcgctcgatg 1020
ctgcgcagcg tcgcgatctc cgatgcggcg 1080
cgaagtcagt ttacccgcgc gacctatgac 1140acggaaatcg tcgatctcat ccataaggca 1200
1215
atggacgatt ccaagaagtt tactgcggta 60gagaggcagc atatcaccta taaggggatt 120gatgccttgg ccgccaaggc cgatgccgcc 180gagacggtga tcgatctcga cccggcgctg 240gcgcatactg acgaacagtt ccgggaatta 300tcaccgatcc ttgtgcgccc gcatcccgag 360catcgtcgtg cgcgggcggc aaaggagctc 420ctcgacgacc gcgaccatgt cattgcgcag 480tccttcatcg agaggacgat gtttgccgac 540acgatcatgt cggcactcag cgcagacaag 600acgacggtgt ccaagabgct gteggtcaeg
atcggcgtag ccaagacgac tggccgcgat
acggaaaaca tcgcagcccg ggcgattgag
gagccggacg cccgcttcga catgcttgtc
cccgccgccg cagttcagcc cgtggcgcac
gcgaagatca aggatgatgg aaaacagttc
gcctttggcg cctacatcgc cagcaatctg
caggatttga cgaagaacgg agatcaataa
<210> 40
<211> 1293
-<212> DNA
<213> Rhizobium etli
<400> 40
atggaaageg gaagtgtgae gacgcccttc
gcaagtcagg ccgctgcccg aaaaatcgag
tatcgcgccc tgtgegagge caggccgctg
ctgaacgcct tgctgagctt ttatcccaag
gtatttcctt cgaatacgea gctctctctg
cgtcgccacc tggcggcgct gatcgaggcc
ggcaagcgtt acgctcgcaa ggagcagggc
ctggcgccgc tgcttgcgcg cgcggacgag
gaacgattgc agctgcagog gctcaaagag
aagctcatcg agatggccgt ggaagagggc
cattttcgag gcatcgtcga acggctgccg
gcactcgacg aactggaact gttgcgcgaa
aaagctccaa atcaaagcgg caatgcccaa
ccacactaca ctactgaact tgaaccacgc
gaccaatcgg aaggttgggc cgagccgagg
aggcccatgc cagctgcaaa ctcagoctcg
ctgggcctgg tgctgcaggc etgcccagag
ggcacatggc gcgatctgat ggcggcggct
ccctcggcct atgaacaggc Ctgegaggte
aagcggatte cggccgaagt cctggccgcg 660
cgctggcatg atctttcggc gaaattcgag 720
ttcaccagat cggtggagtt cgagacggcc 780
gectteatca gcaggaacca acaggcgtcg 840
gcctggcagc gccgggacgg agccgtcaaa 900
accatcgcgc tgaaggcgga gaaggeatct 960
gatcgtctct acgaggcgtt cgagaagaca 1020
gggcggcggc cgatgacgtt tggeatgttg 60
cceggccgat egattgataa atggaaaetc 120
etcggcatta cagaccgggc gctttccate 180
ggagagctet ccgaggagaa cggettggtc 240
egcgcgcatg gaatggegga geagacgatc 300ggattgetga tcegeaagga cagcecgaac 360
ggggagatce gtgaggeatt cggettcteg 420
atcgagcggc tggeggecga gatggcagee 480
cgcctgaegc tttgcaggcg egacatcgce 540
geetctggtg attggagegg ggtccacctg 600
cgctcgecat cettegagaa gattgccgce 660
gaaatcacca ateagttgga aatgeaggtt 720
cattctgagc ggcacataca gaattcaaae 780
ttcgaaaega agcagggcgc aacggtggae 840
gecagaatag cgaeaeagga ggggaagggc 900
gttgceggeg gegggctcaa atccttcceg 960
atcgccgcet atggacegea gggeteggtg 1020
gtcgtcgtgc getcaatget eggagtgage 1080
atggggeetg aaaatgcggc taccgteata 1140gcgtgcgtgc ttgaaagggc agggcacatc aattccgccg gtggttacct ccgtgacctg 1200acccgccgcg ccgagagagg cgaatttgcc atcggaccga tgttgatggc gcttgtccgc 1260accaattcgc caatoagagg caagaccgga tga 1253
<210> 41
<211> 42
<212> DNA
<213> Rhizobium etli
<400> 41
gcgggaagtt tactgcggta aaccggggca aggagctggt.tg 42
<210> 42
<211> 149
<212> DNA
<213> Rhizobium etli
<400> 42
gcaaaagaaa aggcccccga acgttgccgt cgcggaagcc ctctctgatc tagacaccca 60gagaatcaca tttccgcgaa tcatagtcaa gagtctttgg caccgaattt ggtgaggcgt 120gatcttttgc cttgaagaag gcgaagaaa 149
<210> 43
<211> 331
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 43
aggatttttc ggcgctgcgc tacgtccgcg accgcgttga gggatcaagc cacagcagcc 60cactcgacct tctagccgac ccagacgagc caagggatct ttttggaatg ctgctccgtc 120gtcaggcttt ccgacgtttg ggtggttgaa cagaagtcat tatcgcacgg aatgccaagc IBOactcccgagg ggaaccctgt ggttggcatg cacatacaaa tggacgaacg gataaacctt 240ttcacgccct tttaaatatc cgattattct aataaacgct cttttctctt aggtttaccc 300gccaatatat cctgtcaaac actgatagtt t 331
<210> 44
<211> 442
<212> DNA
<213> Agrobacterium tumefaciens
<400> 44
ctcatctaag cccccatttg gacgtgaatg tagacaogtc gaaataaaga tttccgaatt 60agaataattt gtttattgct ttcgcctata aatacgacgg atcgtaattt gtcgttttat 120caaaatgtac tttcatttta taataacgct gcggacatct acatttttga attgaaaaaa 180aattggtaat tactctttct ttttctccat attgaccatc atactcattg ctgatccatg 240tagatttccc ggacatgaag ccatttacaa ttgaatatat cctgccgccg ctgccgcttt 300gcacccggtg gagcttgcat gttggtttct acgcagaact gagccggtta ggcagataat 360ttccattgag aactgagcca tgtgcacctt ccccccaaca cggtgagcga cggggcaacg 420gagtgatcca catgggactt tt 442
Claims (21)
1. Constructo de DNA para transformar plantas compreendendo:i) pelo menos uma região de limite de T-DNA;ii) pelo menos um transgene heterólogo adjacente à região delimite;iii) uma região de codificação para um marcador selecionávelbacteriano; eiv) pelo menos um segmento de DNA1 compreendendo umelemento eis e/ou trans de uma origem de replicação paramanter um baixo número de cópias do constructo de DNAem uma bactéria competente para a transformação de pelomenos uma primeira célula de planta.
2. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, em quepelo menos uma região de limite de T-DNA é uma região de limite à direitaou uma região de limite à esquerda.
3. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, em queo transgene heterólogo quando expresso em uma célula de planta transfor-mada proporciona um fenótipo agronômico para a célula ou uma plantatransformada derivada da célula.
4. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, em quea região de codificação para o marcador selecionável bacteriano compreen-de um gene de resistência a antibióticos selecionado a partir do grupo con-sistindo em um gene de resistência à canamicina, gene de resistência à gen-tamicina, gene de resistência ao cloranfenicol, gene de resistência à espec-tinomicina, gene de resistência à estreptomicina, gene de resistência à tetra-ciclina, gene de resistência à ampicilina, gene de resistência à blasticidina,gene de resistência à higromicina, gene de resistência à puromicina, e genede resistência à Zeocina.
5. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, em quea origem de replicação compreende uma origem de repABC.
6. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 5, em quea origem de repABC é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:4.
7. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, em queo pelo menos um segmento de DNA compreende os genes de origem dereplicação repA, repB, e repC.
8. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, em queo pelo menos um segmento de DNA compreende a seqüência intergênica 1(igsl) e a seqüência intergênica 2 (igs2).
9. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, em queo pelo menos um segmento de DNA compreende uma seqüência palindrô-mica de 16 pares de bases.
10. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, em quea bactéria é selecionada a partir do grupo que consiste em Agrobacteriumspp., Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobaete-rium spp. Ochrobactrum spp. e Bradyrhizobium spp.
11. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 1, adicio-nalmente compreendendo pelo menos uma primeira origem de replicaçãopara manter as cópias do constructo em E. coli.
12. Constructo de DNA de acordo com a reivindicação 11, emque a origem de replicação é derivada de pBR322 e/ou pUC.
13. Célula transformada com o constructo de DNA como definido -na reivindicação 1.
14. Célula de acordo com a reivindicação 13, definida como umacélula de planta.
15. Célula de acordo com a reivindicação 13, definida com umacélula bacteriana.
16. Célula bacteriana de acordo com a reivindicação 15, em quea célula é competente para a transformação de pelo menos uma primeiracélula de planta.
17. Célula bacteriana de acordo com a reivindicação 16, em quea bactéria é selecionada a partir do grupo que consiste em Agrobacteriumspp., Rhizobium spp., Sinorhizobium spp., Mesorhizobium spp., Phyllobacte-rium spp., Ochrobactrum spp. e Bradyrhizobium spp.
18. Método para transformar uma célula de planta compreen-dendo contatar pelo menos uma primeira célula de planta com a célula bac-teriana como definido na reivindicação 16, em que a célula bacteriana écompetente para a transformação da dita primeira célula de planta; e sele-cionar a dita primeira célula com base na presença de pelo menos um trans-gene heterólogo introduzido na célula de planta pela célula bacteriana.
19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a célulade planta é uma célula de planta de soja, canola, milho, ou algodão.
20. Método de acordo com a reivindicação 18, adicionalmentecompreendendo regenerar uma planta a partir da célula de planta.
21. Método de produzir alimento, ração ou um produto industrialcompreendendo: obter a planta de acordo com a reivindicação 20 ou umaparte dela; e preparar o alimento, a ração ou o produto industrial a partir daplanta ou de sua parte.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US71450105P | 2005-09-06 | 2005-09-06 | |
| US60/714,501 | 2005-09-06 | ||
| PCT/US2006/034503 WO2007030432A2 (en) | 2005-09-06 | 2006-09-06 | Vectors and methods for improved plant transformation efficiency |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0615680A2 true BRPI0615680A2 (pt) | 2011-05-24 |
Family
ID=37415562
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0615680-0A BRPI0615680A2 (pt) | 2005-09-06 | 2006-09-06 | vetores e métodos para a eficiência aperfeiçoada de transformação de plantas |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US8993846B2 (pt) |
| EP (2) | EP1941046A2 (pt) |
| JP (4) | JP5889508B2 (pt) |
| CN (1) | CN101305097A (pt) |
| AU (1) | AU2006287650A1 (pt) |
| BR (1) | BRPI0615680A2 (pt) |
| CA (2) | CA2621394C (pt) |
| MX (1) | MX2008003190A (pt) |
| WO (1) | WO2007030432A2 (pt) |
| ZA (1) | ZA200802009B (pt) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8993846B2 (en) * | 2005-09-06 | 2015-03-31 | Monsanto Technology Llc | Vectors and methods for improved plant transformation efficiency |
| US8334428B2 (en) * | 2006-11-15 | 2012-12-18 | Purdue Research Foundation | Backbone-free low transgene copy transgenic plants |
| EP2450448B1 (en) | 2007-03-09 | 2014-09-17 | Monsanto Technology LLC | Methods for plant transformation using spectinomycin selection |
| EP2300617B1 (en) | 2008-07-16 | 2016-03-23 | Monsanto Technology LLC | Methods and vectors for producing transgenic plants |
| MY194828A (en) * | 2009-03-30 | 2022-12-19 | Monsanto Technology Llc | Rice transgenic event 17053 and methods of use thereof |
| CN102747096B (zh) * | 2011-04-18 | 2015-04-08 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 基因搜寻载体、随机基因突变调控方法及用途 |
| US9392758B2 (en) * | 2011-08-26 | 2016-07-19 | Integrated Plant Genetics, Inc. | Transformation of mature citrus |
| EP3119186B1 (en) * | 2014-03-20 | 2023-09-20 | Monsanto Technology LLC | Transgenic maize event mon 87419 and methods of use thereof |
| DK3341483T3 (da) | 2015-08-28 | 2020-03-16 | Pioneer Hi Bred Int | Ochrobactrum-medieret transformation af planter |
| US11377662B2 (en) | 2018-01-10 | 2022-07-05 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Agrobacterium-mediated and particle bombardment transformation method for cowpea and dry bean meristem explants |
Family Cites Families (94)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US489A (en) | 1837-11-25 | Improvement in the mode of constructing springs for carriages, wagons | ||
| US894A (en) | 1838-08-25 | Machinery for raising heavy bodies | ||
| US5273A (en) | 1847-09-04 | George w | ||
| US5637A (en) | 1848-06-20 | Improvement in water-wheels | ||
| US5094945A (en) | 1983-01-05 | 1992-03-10 | Calgene, Inc. | Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase, production and use |
| US5034322A (en) * | 1983-01-17 | 1991-07-23 | Monsanto Company | Chimeric genes suitable for expression in plant cells |
| US4761373A (en) | 1984-03-06 | 1988-08-02 | Molecular Genetics, Inc. | Herbicide resistance in plants |
| US4581847A (en) | 1984-09-04 | 1986-04-15 | Molecular Genetics Research And Development | Tryptophan overproducer mutants of cereal crops |
| US4956282A (en) * | 1985-07-29 | 1990-09-11 | Calgene, Inc. | Mammalian peptide expression in plant cells |
| KR950008571B1 (ko) | 1986-01-08 | 1995-08-03 | 롱쁠랑 아그로시미 | 할로아릴니트릴 분해 유전자, 그의 용도 및 이를 함유한 세포 |
| US4810648A (en) | 1986-01-08 | 1989-03-07 | Rhone Poulenc Agrochimie | Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene |
| ATE57390T1 (de) | 1986-03-11 | 1990-10-15 | Plant Genetic Systems Nv | Durch gentechnologie erhaltene und gegen glutaminsynthetase-inhibitoren resistente pflanzenzellen. |
| US5750871A (en) * | 1986-05-29 | 1998-05-12 | Calgene, Inc. | Transformation and foreign gene expression in Brassica species |
| US5637489A (en) | 1986-08-23 | 1997-06-10 | Hoechst Aktiengesellschaft | Phosphinothricin-resistance gene, and its use |
| US5276268A (en) | 1986-08-23 | 1994-01-04 | Hoechst Aktiengesellschaft | Phosphinothricin-resistance gene, and its use |
| US5273894A (en) | 1986-08-23 | 1993-12-28 | Hoechst Aktiengesellschaft | Phosphinothricin-resistance gene, and its use |
| US5378824A (en) | 1986-08-26 | 1995-01-03 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase |
| US5013659A (en) | 1987-07-27 | 1991-05-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase |
| US5605011A (en) | 1986-08-26 | 1997-02-25 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase |
| US5004863B2 (en) * | 1986-12-03 | 2000-10-17 | Agracetus | Genetic engineering of cotton plants and lines |
| CN87100603A (zh) | 1987-01-21 | 1988-08-10 | 昂科公司 | 抗黑素瘤疫苗 |
| US5229114A (en) | 1987-08-20 | 1993-07-20 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Approaches useful for the control of root nodulation of leguminous plants |
| US5244802A (en) * | 1987-11-18 | 1993-09-14 | Phytogen | Regeneration of cotton |
| US5258300A (en) | 1988-06-09 | 1993-11-02 | Molecular Genetics Research And Development Limited Partnership | Method of inducing lysine overproduction in plants |
| US5416011A (en) * | 1988-07-22 | 1995-05-16 | Monsanto Company | Method for soybean transformation and regeneration |
| GB8825402D0 (en) | 1988-10-31 | 1988-11-30 | Cambridge Advanced Tech | Sulfonamide resistance genes |
| US5689041A (en) | 1989-08-10 | 1997-11-18 | Plant Gentic Systems N.V. | Plants modified with barstar for fertility restoration |
| US6117677A (en) * | 1990-03-16 | 2000-09-12 | Thompson; Gregory A. | Plant stearoyl-ACP desaturases genes |
| US5543576A (en) | 1990-03-23 | 1996-08-06 | Mogen International | Production of enzymes in seeds and their use |
| US5498830A (en) | 1990-06-18 | 1996-03-12 | Monsanto Company | Decreased oil content in plant seeds |
| CA2083948C (en) | 1990-06-25 | 2001-05-15 | Ganesh M. Kishore | Glyphosate tolerant plants |
| US5633435A (en) | 1990-08-31 | 1997-05-27 | Monsanto Company | Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases |
| BR9107191A (pt) | 1990-12-26 | 1994-06-14 | Monsanto Co | Controle de amadurecimento de frutos e senescência em plantas |
| US5767366A (en) | 1991-02-19 | 1998-06-16 | Louisiana State University Board Of Supervisors, A Governing Body Of Louisiana State University Agricultural And Mechanical College | Mutant acetolactate synthase gene from Ararbidopsis thaliana for conferring imidazolinone resistance to crop plants |
| US5304730A (en) | 1991-09-03 | 1994-04-19 | Monsanto Company | Virus resistant plants and method therefore |
| US5518908A (en) * | 1991-09-23 | 1996-05-21 | Monsanto Company | Method of controlling insects |
| ATE398679T1 (de) * | 1992-07-07 | 2008-07-15 | Japan Tobacco Inc | Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze |
| US6011199A (en) | 1992-12-15 | 2000-01-04 | Commonwealth Scientific | Method for producing fruiting plants with improved fruit flavour |
| US6013864A (en) | 1993-02-03 | 2000-01-11 | Monsanto Company | Plants resistant to infection by luteoviruses |
| US6414222B1 (en) | 1993-02-05 | 2002-07-02 | Regents Of The University Of Minnesota | Gene combinations for herbicide tolerance in corn |
| JP3759628B2 (ja) | 1993-06-08 | 2006-03-29 | 麒麟麦酒株式会社 | ブリーチング除草剤耐性植物の製造 |
| US6326527B1 (en) * | 1993-08-25 | 2001-12-04 | Dekalb Genetics Corporation | Method for altering the nutritional content of plant seed |
| JPH09506249A (ja) | 1993-11-24 | 1997-06-24 | モンサント・カンパニー | 植物病原体の抑制方法 |
| US5939602A (en) | 1995-06-06 | 1999-08-17 | Novartis Finance Corporation | DNA molecules encoding plant protoporphyrinogen oxidase and inhibitor-resistant mutants thereof |
| US6080560A (en) | 1994-07-25 | 2000-06-27 | Monsanto Company | Method for producing antibodies in plant cells |
| US5750876A (en) | 1994-07-28 | 1998-05-12 | Monsanto Company | Isoamylase gene, compositions containing it, and methods of using isoamylases |
| US5633437A (en) | 1994-10-11 | 1997-05-27 | Sandoz Ltd. | Gene exhibiting resistance to acetolactate synthase inhibitor herbicides |
| US5716837A (en) | 1995-02-10 | 1998-02-10 | Monsanto Company | Expression of sucrose phosphorylase in plants |
| FR2734842B1 (fr) | 1995-06-02 | 1998-02-27 | Rhone Poulenc Agrochimie | Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides |
| US5846797A (en) | 1995-10-04 | 1998-12-08 | Calgene, Inc. | Cotton transformation |
| US6946588B2 (en) | 1996-03-13 | 2005-09-20 | Monsanto Technology Llc | Nucleic acid encoding a modified threonine deaminase and methods of use |
| US5958745A (en) | 1996-03-13 | 1999-09-28 | Monsanto Company | Methods of optimizing substrate pools and biosynthesis of poly-β-hydroxybutyrate-co-poly-β-hydroxyvalerate in bacteria and plants |
| US5773696A (en) | 1996-03-29 | 1998-06-30 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
| US6166292A (en) | 1996-04-26 | 2000-12-26 | Ajinomoto Co., Inc. | Raffinose synthetase gene, method of producing raffinose and transgenic plant |
| US5985605A (en) | 1996-06-14 | 1999-11-16 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Dept. Of Agriculture & Agri-Food Canada | DNA sequences encoding phytases of ruminal microorganisms |
| US5998700A (en) | 1996-07-02 | 1999-12-07 | The Board Of Trustees Of Southern Illinois University | Plants containing a bacterial Gdha gene and methods of use thereof |
| US5845797A (en) * | 1996-07-31 | 1998-12-08 | Daikyo Seiko, Ltd. | Rubber plug for drug vessel |
| US6063756A (en) | 1996-09-24 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Bacillus thuringiensis cryET33 and cryET34 compositions and uses therefor |
| US6093695A (en) | 1996-09-26 | 2000-07-25 | Monsanto Company | Bacillus thuringiensis CryET29 compositions toxic to coleopteran insects and ctenocephalides SPP |
| US6017534A (en) | 1996-11-20 | 2000-01-25 | Ecogen, Inc. | Hybrid Bacillus thuringiensis δ-endotoxins with novel broad-spectrum insecticidal activity |
| US5942664A (en) | 1996-11-27 | 1999-08-24 | Ecogen, Inc. | Bacillus thuringiensis Cry1C compositions toxic to lepidopteran insects and methods for making Cry1C mutants |
| US6121436A (en) | 1996-12-13 | 2000-09-19 | Monsanto Company | Antifungal polypeptide and methods for controlling plant pathogenic fungi |
| US6040497A (en) | 1997-04-03 | 2000-03-21 | Dekalb Genetics Corporation | Glyphosate resistant maize lines |
| US7105724B2 (en) | 1997-04-04 | 2006-09-12 | Board Of Regents Of University Of Nebraska | Methods and materials for making and using transgenic dicamba-degrading organisms |
| US6171640B1 (en) | 1997-04-04 | 2001-01-09 | Monsanto Company | High beta-conglycinin products and their use |
| US6380466B1 (en) | 1997-05-08 | 2002-04-30 | Calgene Llc | Production of improved rapeseed exhibiting yellow-seed coat |
| CN1192110C (zh) * | 1997-06-30 | 2005-03-09 | 辛根塔默根有限公司 | 用于植物转化的质粒和使用此质粒的方法 |
| IL122270A0 (en) | 1997-11-20 | 1998-04-05 | Yeda Res & Dev | DNA molecules conferring to plants resistance to a herbicide and plants transformed thereby |
| US6072103A (en) | 1997-11-21 | 2000-06-06 | Calgene Llc | Pathogen and stress-responsive promoter for gene expression |
| US6063597A (en) | 1997-12-18 | 2000-05-16 | Monsanto Company | Polypeptide compositions toxic to coleopteran insects |
| US6284948B1 (en) | 1998-05-18 | 2001-09-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genes and methods for control of nematodes in plants |
| US6444876B1 (en) | 1998-06-05 | 2002-09-03 | Calgene Llc | Acyl CoA: cholesterol acyltransferase related nucleic acid sequences |
| CN1219064C (zh) | 1998-08-04 | 2005-09-14 | 嘉吉有限公司 | 植物脂肪酸去饱和酶启动子 |
| US6531648B1 (en) | 1998-12-17 | 2003-03-11 | Syngenta Participations Ag | Grain processing method and transgenic plants useful therein |
| WO2000042207A2 (en) * | 1999-01-14 | 2000-07-20 | Monsanto Technology Llc | Soybean transformation method |
| CN1350587A (zh) | 1999-05-13 | 2002-05-22 | 孟山都技术有限公司 | 植物的获得性抗性基因 |
| US6603061B1 (en) * | 1999-07-29 | 2003-08-05 | Monsanto Company | Agrobacterium-mediated plant transformation method |
| US6252148B1 (en) | 1999-12-06 | 2001-06-26 | Holden's Foundation Seeds Llc | Inbred corn line LH244 |
| US6613963B1 (en) | 2000-03-10 | 2003-09-02 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Herbicide tolerant Brassica juncea and method of production |
| CN102212534A (zh) | 2000-10-30 | 2011-10-12 | 弗迪亚股份有限公司 | 新的草甘膦n-乙酰转移酶(gat)基因 |
| US6514299B1 (en) | 2000-11-09 | 2003-02-04 | Millennium Fuels Usa, Llc | Fuel additive and method therefor |
| US6696621B2 (en) * | 2001-02-23 | 2004-02-24 | Paradigm Genetics, Inc. | Selectable marker in plants |
| ATE530654T1 (de) * | 2001-07-06 | 2011-11-15 | Monsanto Technology Llc | Verfahren zur förderung der aufspaltung von transgenen bei pflanzen und zusammensetzungen dafür |
| US6746387B2 (en) | 2001-07-10 | 2004-06-08 | Kryptane Systems, Inc. | Agricultural roller |
| AU2003247962B2 (en) | 2002-07-18 | 2008-06-12 | Monsanto Technology Llc | Methods for using artificial polynucleotides and compositions thereof to reduce transgene silencing |
| EP1581642B1 (en) | 2002-12-18 | 2011-04-20 | Athenix Corporation | Genes conferring herbicide resistance |
| CA2509227C (en) * | 2002-12-19 | 2013-05-21 | Monsanto Technology, Llc | Elevation of oil levels in brassica plants |
| CN101173273B (zh) | 2003-02-18 | 2013-03-20 | 孟山都技术有限公司 | 抗草甘磷的i型5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶 |
| WO2005003362A2 (en) | 2003-03-10 | 2005-01-13 | Athenix Corporation | Methods to confer herbicide resistance |
| US7575917B2 (en) | 2003-04-09 | 2009-08-18 | Monsanto Technology Llc | DNA constructs and methods to enhance the production of commercially viable transgenic plants |
| US7402734B2 (en) * | 2003-06-16 | 2008-07-22 | Monsanto Technology Llc | Method and apparatus for preparation of genetically transformable plant tissue |
| CN102094032B (zh) | 2004-04-30 | 2014-02-26 | 美国陶氏益农公司 | 新除草剂抗性基因 |
| US8993846B2 (en) * | 2005-09-06 | 2015-03-31 | Monsanto Technology Llc | Vectors and methods for improved plant transformation efficiency |
| CA2843961A1 (en) | 2006-05-16 | 2007-11-29 | Monsanto Technology Llc | Use of non-agrobacterium bacterial species for plant transformation |
-
2006
- 2006-09-05 US US11/516,036 patent/US8993846B2/en active Active
- 2006-09-06 JP JP2008530131A patent/JP5889508B2/ja active Active
- 2006-09-06 EP EP06802936A patent/EP1941046A2/en not_active Ceased
- 2006-09-06 CA CA2621394A patent/CA2621394C/en active Active
- 2006-09-06 BR BRPI0615680-0A patent/BRPI0615680A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2006-09-06 CN CNA2006800414265A patent/CN101305097A/zh active Pending
- 2006-09-06 WO PCT/US2006/034503 patent/WO2007030432A2/en not_active Ceased
- 2006-09-06 AU AU2006287650A patent/AU2006287650A1/en not_active Abandoned
- 2006-09-06 CA CA2965377A patent/CA2965377C/en active Active
- 2006-09-06 MX MX2008003190A patent/MX2008003190A/es active IP Right Grant
- 2006-09-06 EP EP19161091.4A patent/EP3536793A1/en active Pending
-
2008
- 2008-03-03 ZA ZA200802009A patent/ZA200802009B/xx unknown
-
2014
- 2014-05-21 JP JP2014105544A patent/JP6046079B2/ja active Active
-
2015
- 2015-03-09 US US14/642,674 patent/US10202611B2/en active Active
- 2015-11-30 JP JP2015233457A patent/JP6077631B2/ja active Active
-
2016
- 2016-11-22 JP JP2016226968A patent/JP6348952B2/ja active Active
-
2019
- 2019-01-08 US US16/242,887 patent/US10752908B2/en active Active
-
2020
- 2020-07-16 US US16/931,315 patent/US20210010011A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20070074314A1 (en) | 2007-03-29 |
| JP6348952B2 (ja) | 2018-06-27 |
| JP6077631B2 (ja) | 2017-02-08 |
| JP5889508B2 (ja) | 2016-03-22 |
| US10202611B2 (en) | 2019-02-12 |
| JP2017074051A (ja) | 2017-04-20 |
| AU2006287650A1 (en) | 2007-03-15 |
| US20190211346A1 (en) | 2019-07-11 |
| JP2014193173A (ja) | 2014-10-09 |
| US20210010011A1 (en) | 2021-01-14 |
| US10752908B2 (en) | 2020-08-25 |
| CA2965377A1 (en) | 2007-03-15 |
| EP3536793A1 (en) | 2019-09-11 |
| WO2007030432A3 (en) | 2007-06-07 |
| EP1941046A2 (en) | 2008-07-09 |
| CA2621394A1 (en) | 2007-03-15 |
| JP6046079B2 (ja) | 2016-12-14 |
| MX2008003190A (es) | 2008-03-18 |
| CN101305097A (zh) | 2008-11-12 |
| ZA200802009B (en) | 2008-12-31 |
| CA2621394C (en) | 2018-02-20 |
| US20150232865A1 (en) | 2015-08-20 |
| JP2009506787A (ja) | 2009-02-19 |
| CA2965377C (en) | 2021-12-14 |
| JP2016105708A (ja) | 2016-06-16 |
| US8993846B2 (en) | 2015-03-31 |
| WO2007030432A2 (en) | 2007-03-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10752908B2 (en) | Vectors and methods for improved plant transformation efficiency | |
| RU2611188C2 (ru) | Штаммы agrobacterium, модифицированные для увеличения частоты трансформации растений | |
| Karthikeyan et al. | Agrobacterium-mediated transformation of leaf base derived callus tissues of popular indica rice (Oryza sativa L. sub sp. indica cv. ADT 43) | |
| JP6657325B2 (ja) | 植物形質転換効率を改善するための多重形質転換エンハンサー配列の使用 | |
| Puddephat et al. | Recovery of phenotypically normal transgenic plants of Brassica oleracea upon Agrobacterium rhizogenes-mediated co-transformation and selection of transformed hairy roots by GUS assay | |
| US10435698B2 (en) | Methods and vectors for producing transgenic plants | |
| Nakajima et al. | Embryogenic callus induction and Agrobacterium-mediated genetic transformation of ‘Shine Muscat’grape | |
| BR112020002321A2 (pt) | novas estirpes de agrobacterium tumefaciens reivindicação de prioridade | |
| AU2013200116A1 (en) | Vectors and methods for improved plant transformation efficiency |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B06F | Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette] | ||
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B09B | Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette] | ||
| B12B | Appeal against refusal [chapter 12.2 patent gazette] |