BRPI0615717A2

BRPI0615717A2 - inibição da expressão do gene viral usando pequeno rna interferente

Info

Publication number: BRPI0615717A2
Application number: BRPI0615717-3A
Authority: BR
Inventors: Roger L Kaspar; Heini Ilves; Attila A Seyhan; Alexander V Vlassov; Brian H Johnston
Original assignee: Somagenics Inc
Priority date: 2005-09-12
Filing date: 2006-06-01
Publication date: 2011-05-24
Also published as: EP1979480A2; CA2622242A1; JP2009521207A; CN101305095A; RU2008114304A; CN101305095B; KR20090003147A; CN102827841A; WO2007032794A3; AU2006291568A1; WO2007032794A2

Abstract

INIBIçãO DA EXPRESSãO DO GENE VIRAL USANDO PEQUENO RNA INTERFERENTE. A invenção proporciona métodos, composições, e kits compreendendo o pequeno RNA interferente (shRNA ou siRNA) que são úteis para a inibição da expressão do gene mediada por vírus. Os pequenos RNAs interferentes, como descritos neste documento, podem ser usados em métodos de tratamento de infecção por HCV. São descritas construções de shRNA e siRNA que alvejam a seqúência do sítio de entrada interno do ribossomo (IRES) do HCV.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INIBIÇÃO DAEXPRESSÃO DO GENE VIRAL USANDO PEQUENO RNAINTERFERENTE".

Este pedido reivindica o benefício do pedido PCTPCT/US2005/032768, depositado em 12 de setembro de 2005, quereivindica prioridade sob o 35 U.S.C. §119 do Pedido Provisório U.S. N-60/608.574, depositado em 10 de setembro de 2004, ambos os quais sãoincorporados neste documento por referência em sua totalidade.

DECLARAÇÃO COM RELAÇÃO À PESQUISA OU AODESENVOLVIMENTO PATROCINADO PELO GOVERNO FEDERAL

Esta invenção foi feita, em parte, durante o trabalho apoiadopelo subsídio n2 5R43AI056611 dos National Institutes of Health. O governopode ter certos direitos na invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

Â presente invenção refere-se à inibição da expressão do geneviral, por exemplo, da expressão do gene mediada pelo IRES da hepatite C,com o pequeno RNA interferente (shRNA e siRNA).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O tratamento e a prevenção das infecções pelo vírus da HepatiteC (HCV) permanecem um desafio principal para controlar este problema desaúde mundial; as terapias existentes são somente parcialmente efetivas enão está atualmente disponível nenhuma vacina. O vírus da Hepatite C(HCV) infecta mais do que 170 milhões de pessoas por todo o mundo e é acausa principal de transplantes de fígados. Os tratamentos existentes,incluindo a ribavirina e o interferon alfa peguilado, são eficazes somente emaproximadamente 50 por cento dos pacientes e têm efeitos colateraissubstanciais. O desenvolvimento de tratamentos do HCV mais efetivos édificultado pela falta de um bom modelo de animal pequeno, pelaincapacidade de cultivar estavelmente o vírus nas células de cultura detecidos, e pela alta taxa de mutação viral [1-3]. A disponibilidade de umsistema de replicon HCV tem permitido o estudo de replicação do HCV,interações entre hospedeiros-células e avaliações de agentes antivirais, emais recentemente, um modelo de fígado de camundongo humanizadoquimérico transgênico foi desenvolvido, que permite a infecção por HCVcompleta [4-7]. Além disso, o uso de formação de imagem in vivo dossistemas relatores dependentes do IRES do HCV tem facilitado a avaliaçãoeficiente da distribuição e da inibição por agentes anti-HCV no fígado docamundongo durante pontos múltiplos de tempo, usando os mesmos animais [8].

A interferência do RNA é uma via evolutivamente conservadaque resulta na infra-regulação da expressão do gene. A descoberta que osRNAs interferentes curtos sintéticos (siRNAs) de aproximadamente 19-29pares de bases podem inibir efetivamente a expressão do gene em células eanimais mamíferos, sem ativar uma resposta imune, resultou em umaagitação de atividade para desenvolver estes inibidores como substânciasterapêuticas [9]. A estabilização química dos siRNAs resulta na meia-vida no15 soro aumentada [10], sugerindo que a administração intravenosa podeatingir resultados terapêuticos positivos, se os problemas da distribuiçãopuderem ser superados. Além disso, os pequenos RNAs em grampo(shRNA) também têm mostrado forte inibição de genes-alvo em célulasmamíferas e podem ser facilmente expressos a partir de promotores de20 bacteriófagos (por exemplo, T7, T3 ou SP6) ou mamíferos (pol III, tal comoU6 ou H1, ou polll), tornando-os excelentes candidatos para a distribuiçãoviral [11].

Têm sido feitos esforços para encontrar inibidores à base deácidos nucléicos efetivos contra o HCV, visto que os tratamentos existentes25 não são inteiramente efetivos (revisto em [4, 12]). Estes esforços incluem osoligonucleotídeos anti-sentido tradicionais, os oligômeros defosforodiamidato morfolino [8], as ribozimas, e, mais recentemente, ossiRNAs. Foi mostrado que os siRNAs podem alvejar efetivamente o HCV emcélulas de cultura de tecidos humanas [13-19] e em sistemas de animais30 [20].

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção proporciona métodos, composições, e kits para ainibição da expressão do gene mediada pelo IRES em um vírus, porexemplo, o vírus da hepatite C (HCV).

Para as seqüências de RNA inibitórias listadas nas Figuras 4A e10 e na Tabela 1 (por exemplo, as SEQ ID NOs: 19-26), uma seqüênciacomplementar está subentendida, como estão as seqüências nãorelacionadas ao alvo que podem estar fixadas a uma ou ambas asextremidades de cada fita; por exemplo, as extremidades em 3', conformeserá sabido para alguém versado na técnica. As seqüências inibitórias (dereconhecimento anti-sentido) mostradas na Figura 4A, na Figura 10, e naTabela 1, podem ser incorporadas no shRNA ou no siRNA. No caso doshRNA, a seqüência mostrada está adicionalmente ligada à sua seqüênciacomplementar por um laço que inclui os resíduos de nucleotídeosnormalmente não relacionados ao alvo. Um exemplo de tal laço é mostradonas seqüências de shRNA representadas na Figura 1B e na Figura 1C, bemcomo nas Figuras 16A-B. No caso tanto dos siRNAs quanto dos shRNAs, afita complementar ao alvo em geral é inteiramente complementar, porém emalgumas modalidades, a fita complementar ao alvo pode contercombinações inadequadas (vide, por exemplo, as SEQ ID NOs: 13, 14, e15). A seqüência pode ser variada para alvejar uma ou mais variantes oufenótipos genéticos do vírus que está sendo alvejado, por alteração daseqüência de alvejamento para ser complementar à seqüência, da varianteou do fenótipo genético. A fita homóloga ao alvo pode diferir em torno de 0 acerca de 5 sítios por ter combinações inadequadas, inserções, ou remoçõesde cerca de 1 a cerca de 5 nucleotídeos, conforme for o caso, por exemplo,com microRNAs de ocorrência natural. Em algumas modalidades, umaseqüência pode alvejar múltiplas cepas virais, por exemplo, de HCV1 emboraa seqüência difira do alvo de uma cepa pelo menos um nucleotídeo (porexemplo, um, dois, ou três nucleotídeos) de uma seqüência de alvejamento.

Em um aspecto, a invenção proporciona uma composiçãocompreendendo pelo menos um pequeno RNA interferente que é pelomenos parcialmente complementar a, e capaz de interagir com, umaseqüência de polinucleotídeos de um vírus, de modo tal que a inibição daexpressão do gene viral resulte da interação do pequeno RNA interferentecom a seqüência-alvo viral. Em uma modalidade, a composição inclui pelomenos um shRNA, por exemplo, compreendendo, consistindo em, ouconsistindo essencialmente em, uma seqüência selecionada a partir dogrupo que consiste em SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, eSEQ ID NO: 18, ou compreendendo ou consistindo essencialmente em umaseqüência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:33. Em uma modalidade, o shRNAcompreende a, consiste na, ou consiste essencialmente na, seqüênciarepresentada em SEQ ID NO:12. Em uma outra modalidade, a composiçãoinclui pelo menos um siRNA. Em uma modalidade, a composição inclui pelomenos um siRNA ou shRNA, por exemplo, compreendendo ou consistindoessencialmente em uma seqüência selecionada a partir do grupo queconsiste em SEQ ID NO:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NÒ:22,SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ IDNO:27, SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:33. Em algumas modalidades, opequeno RNA interferente, por exemplo, shRNA ou siRNA, interage comuma seqüência viral de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, ou cerca de19 a cerca de 25 nucleotídeos, por exemplo, quaisquer de cerca de 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos. Em algumasmodalidades, o pequeno RNA interferente liga-se a uma seqüência do vírusda hepatite C. Em uma modalidade, o pequeno RNA interferente se liga auma seqüência dentro da seqüência do sítio de entrada interno doribossomo (IRES) de um vírus da hepatite C, por exemplo, à seqüênciarepresentada em SEQ ID NO:26 (resíduos 344-374 de SEQ ID NO:11). Emuma modalidade, o vírus da hepatite C é o genótipo 1a de HCV.

Em algumas modalidades, uma composição da invençãocompreende um excipiente farmaceuticamente aceitável, por exemplo, águaou solução salina, e opcionalmente, são proporcionadas em uma quantidadeterapeuticamente efetiva, por exemplo, para tratar a infecção por HCV emum ser humano ou em um primata não-humano, tal como um chimpanzé ouo macaco do novo mundo. Em uma modalidade, a composição é umacomposição farmacêutica compreendendo, consistindo em, ou consistindoessencialmente em, pelo menos um shRNA ou siRNA, conforme descritoneste documento, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a um kit que incluiquaisquer das composições descritas acima, e de modo opcional,adicionalmente inclui instruções para uso em um método de inibir aexpressão do gene em um vírus ou tratar uma infecção viral em umindivíduo, conforme descrito neste documento. Em uma modalidade, o kit épara uso em um método para tratar a infecção por HCV em um indivíduo, talcomo um ser humano, e compreende um shRNA compreendendo,consistindo em, ou consistindo essencialmente em, uma seqüênciaselecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:12, SEQ IDNO:16, SEQ ID NO:17, e SEQ ID NO:18; ou compreendendo ou consistindoessencialmente em uma seqüência selecionada a partir do grupo queconsiste em SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:33, ou um siRNAcompreendendo ou consistindo essencialmente em uma seqüênciaselecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 19, SEQ IDN0:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:23, SEQID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:33,e modo opcional adicionalmente compreende instruções para uso em ummétodo de inibir a expressão do gene em um vírus da hepatite C, tal como ogenótipo 1a de HCV, ou instruções para uso em um método de tratar umainfecção viral da hepatite C (tal como o genótipo 1a de HCV) em umindivíduo, tal como um ser humano, ou um primata não-humano, tal comoum chimpanzé.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um método para otratamento de uma infecção viral em um indivíduo, tal como um mamífero,por exemplo, um ser humano ou um primata não-humano. O método incluiadministrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente efetiva de umpequeno RNA interferente, tal como shRNA ou siRNA, que seja pelo menosparcialmente complementar a, e capaz de ligar-se a, uma seqüência depolinucleotídeos do vírus e um excipiente farmaceuticamente aceitável, demodo tal que a ligação do pequeno RNA interferente à seqüência depolinucleotídeos viral iniba a expressão do gene no vírus, por exemplo,diminua a quantidade de expressão viral no indivíduo ou diminua aquantidade de expressão viral que seria esperada em um indivíduo que nãorecebeu o pequeno RNA interferente. Em uma modalidade, a infecção viralcompreende um vírus da hepatite C, tal como o fenótipo 1a de HCV. Emalgumas modalidades, o vírus é selecionado a partir do grupo que consisteem genótipos 1a, 1b, 2a, e 2b da hepatite C. Em algumas modalidades, opequeno RNA interferente compreende, consiste em, ou consisteessencialmente em, quaisquer das seqüências de shRNA ou siRNAdescritas neste documento, bem como das seqüências localizadas dentro decinco nucleotídeos de uma das seqüências de siRNA ou shRNA descritasneste documento. Em algumas modalidades, o pequeno RNA interferente écomplementar a uma seqüência viral de cerca de 19 a cerca de 30nucleotídeos, ou cerca de 19 a cerca de 25 nucleotídeos, por exemplo,quaisquer de cerca de 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30nucleotídeos. Em uma modalidade, o vírus é um vírus da hepatite C, talcomo o genótipo 1a de HCV. Em uma modalidade, o pequeno RNAinterferente se liga a uma seqüência de cerca de 19 a cerca de 25nucleotídeos dentro da região do IRES do HCV 1a representada em SEQ IDNO:26. O. tratamento pode incluir a terapia (por exemplo, a melhora ou adiminuição em pelo menos um sintoma da infecção) ou a cura. Em algumasmodalidades, o shRNA é administrado parenteralmente, por exemplo, porinjeção ou infusão intravenosa.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um método deinibir a expressão do gene em um vírus, compreendendo contatar o RNAviral ou o mRNA viral com um pequeno RNA interferente ou introduzir umpequeno RNA interferente em uma célula contendo vírus, de modo tal que opequeno RNA interferente, por exemplo, shRNA ou siRNA, contenha umaseqüência que seja pelo menos parcialmente complementar a umaseqüência de polinucleotídeos do vírus e capaz de inibir a expressão dogene viral, por exemplo, através da indução da clivagem das seqüências depolinucleotídeos virais. Em algumas modalidades, o pequeno RNAinterferente compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em,qualquer uma das seqüências de shRNA ou siRNA descritas nestedocumento. Em algumas modalidades, o pequeno RNA interferente se liga auma seqüência viral de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos, ou cerca de19 a cerca de 25 nucleotídeos, por exemplo, quaisquer de cerca de 19, 20,21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucleotídeos. Em uma modalidade,o vírus é um vírus da hepatite C, tal como o HCV 1a. Em uma modalidade, opequeno RNA interferente interage com uma seqüência de cerca de 19 a10 cerca de 30 nucleotídeos dentro da região do IRES do genótipo 1a de HCVrepresentada na SEQ ID NO:26, bem como as seqüências localizadasdentro de cinco nucleotídeos de uma das seqüências de siRNA ou shRNAdescritas neste documento. Em mais outra modalidade, pelo menos doispequenos RNAs interferentes são introduzidos em uma célula.

A invenção também se refere a uma seqüência de RNA queconsiste em (a) uma primeira seqüência de RNA, de modo tal que a primeiraseqüência de RNA é uma seqüência ilustrada na Figura 10 ou nas Figuras16A-B, por exemplo, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ IDNO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID NO:41, SEQID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID N0:50, SEQ IDNO:51; SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQID NO:56, ou uma seqüência que difere de uma seqüência precedente porum, dois, ou três nucleotídeos; (b) uma segunda seqüência de RNA que éum complemento da primeira seqüência; (c) uma seqüência de laçoposicionada entre a primeira e a segunda seqüência de ácidos nucléicos, aseqüência de laço consistindo em 4-10 nucleotídeos; e (d) opcionalmente,um ressalto de dois nucleotídeos. Em algumas modalidades da invenção, aprimeira seqüência de RNA é SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ IDNO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID N0:40, SEQID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ IDΝ0:50, SEQ ID Ν0:51; SEQ ID ΝΟ:52, SEQ ID ΝΟ:53, SEQ ID ΝΟ:54, SEQID ΝΟ:55, ou SEQ ID ΝΟ:56. A seqüência de RNA pode, em alguns casos,incluir pelo menos um nucleotídeo modificado. A seqüência de laço de umaseqüência de RNA da invenção pode ser, por exemplo, quatro nucleotídeos,cinco nucleotídeos, seis nucleotídeos, sete nucleotídeos, oito nucleotídeos,nove nucleotídeos, dez nucleotídeos, ou pelo menos dez nucleotídeos. Emalgumas modalidades, a seqüência de RNA é um shRNA e inclui umaseqüência-alvo de HCV conforme descrita neste documento e umaseqüência complementar, ligada por um laço que inclui pelo menos umamolécula que não é de nucleotídeo. Em certas modalidades, o laço daseqüência de RNA está 3' a uma fita com sentido e 5' à fita anti-sentidocomplementar do shRNA. Em outras modalidades, o laço da seqüência deRNA está 3' a uma fita anti-sentido e 5' à fita com sentido complementar doshRNA. Em alguns casos, a seqüência de RNA inclui um ressalto de doisnucleotídeos e o ressalto de dois nucleotídeos é um 3'UU. Em alguns casos,o ressalto é um nucleotídeo, dois nucleotídeos, três nucleotídeos, ou mais.Em alguns casos, a primeira seqüência de RNA é qualquer uma de SEQ IDNOs:57-79, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, ou SEQ IDNO: 18. Em alguns casos, a seqüência de RNA é uma seqüência ilustradanas Figuras 16A-B.

A invenção também se refere a uma seqüência de DNA queinclui uma seqüência que codifica uma seqüência de RNA divulgada nestedocumento (por exemplo, uma seqüência de RNA ilustrada na Figura 10 ounas Figuras 16A-B). A invenção também inclui um vetor de expressãocompreendendo tal seqüência de DNA. Também está incluído um vetorretroviral que inclui tal seqüência de DNA, por exemplo, um vetor retroviralque, na infecção de uma célula com o vetor, pode produzir um provírus quepode expressar uma seqüência de RNA da invenção, por exemplo, semlimitação, uma seqüência de shRNA ilustrada nas Figuras 16A-B.

Em alguns aspectos, a invenção refere-se a uma composiçãoque inclui uma seqüência de RNA como divulgada neste documento (porexemplo, sem limitação, um shRNA ilustrado pelas Figuras 16A-B) e umexcipiente farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, acomposição compreende um vetor como descrito neste documento e umexcipiente farmaceuticamente aceitável. Em certas modalidades, umacomposição da invenção inclui pelo menos duas seqüências de RNA comodivulgadas neste documento.

Em um outro aspecto, a invenção inclui um método de inibir aexpressão ou a atividade de um vírus da hepatite C. O método incluiproporcionar uma célula que pode expressar um vírus da hepatite C, econtatar a célula com uma seqüência de RNA como divulgada nestedocumento (cujos exemplos não Iimitativos são ilustrados nas Figuras 16A-B). A célula pode ser um mamífero, por exemplo, um ser humano ou primatanão-humano, tal como um chimpanzé. Em certas modalidades, a célula écontatada com pelo menos duas seqüências de RNA diferentes.

Em alguns aspectos, a invenção refere-se a um método queinclui identificar um paciente infectado com, ou suspeito de estar infectadocom, um vírus da hepatite C, fornecer ao paciente uma quantidadeterapeuticamente efetiva de uma composição contendo uma ou maisseqüências de RNA diferentes divulgadas neste documento. Em algumasmodalidades, o método também inclui determinar se a carga viral dopaciente é diminuída subseqüente a fornecer a composição ao paciente. Emalgumas modalidades, o método também inclui determinar se pelo menosuma proteína viral ou seqüência de ácidos nucléicos viral é diminuída nopaciente subseqüente a fornecer a composição ao paciente.

A não ser que de outro modo definido, todos os termos técnicose científicos usados neste documento têm o mesmo significado comocomumente entendido por alguém versado na técnica à qual pertence estainvenção. Embora possam ser usados na prática ou no teste da presenteinvenção métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritosneste documento, os métodos e os materiais adequados são descritosabaixo. Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes e outrasreferências mencionados neste documento são incorporados por referênciaem sua totalidade. Além disso, os materiais, os métodos, e os exemplos sãosomente ilustrativos e não são pretendidos serem limitativos.

As outras características e vantagens da invenção serãoaparentes a partir da descrição detalhada, dos desenhos, e a partir dasreivindicações.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1A é uma representação da seqüência de nucleotídeosdo IRES do genótipo 1a da hepatite C (vide o Acesso do GenBank N-AJ242654). Os nucleotídeos de uma região-alvo, 344-374, estãosublinhados. Diversas regiões (indicadas em negrito) foram alvejadas comêxito pelos inibidores, incluindo a ribozima Heptazyme® (siRNA.com;posições 189-207), o siRNA Chiron 5U5 [25] (posições 286-304), ooligonucleotídeo anti-sentido de fosforotioato ISIS 14803 [34] (posições 330-349), o siRNA Mizusawa 331 [15] (posições 322-340) e um oligômero defosforodiamidato morfolino [8, 35] (posições 344-363). Uma lista maiscompleta de siRNAs que foram testados para infra-regular o IRES do HCV eoutros elementos de HCV pode ser encontrada em [2, 3].

A Figura 1B é uma representação das seqüências de RNA doshRNA HCVa-wt (shRNAI) e seus variantes mutados resultantes datranscrição com pol Ill a partir de um promotor U6 de moldes de DNAcorrespondentes. Dois pares de bases (sublinhados) do HCVa-wt foramalterados para criar as versões de shRNAs HCVa-wt contendo 1 (HCVSNP1ou HCVSNR2) ou 2 (HCVa-mut)-combinações inadequadas, conformemostrado.

A Figura 1C é uma representação das seqüências de shRNAsHCVb-wt (sh9), HCVc-wt (sh10), e HCVd-wt (sh11).

A Figura 1D é uma representação da estrutura secundária doIRES do HCV com sítios-alvo indicados para shRNA HCVa-wt, HCVb-wt,HCVc-wt e HCVd-wt.

A Figura 1E é uma representação esquémática da construção derelator de Iuciferase dupla pCDNA3/IRES do HCV, usada para produzir oalvo de IRES do HCV, bem como o controle de IRES do EMCV, em que oIRES do vírus de encefalomiocardite substitui o IRES do HCV e, portanto,não tem nenhum alvo para os shRNAs dirigidos pelo HCV. Em cada caso, aexpressão da Iuciferase de vaga-lume é dependente do início da tradução apartir da seqüência do IRES, enquanto que a Iuciferase de Renilla éexpressa em um modo dependente de cap.

A Figura 1F é um gráfico em barras representando os resultadosda triagem dos shRNAs quanto à capacidade de inibir a expressão do genemediada por IRES do HCV em células 293FT. As células 293FT foram co-transfectadas com a construção de relator de Iuciferase dupla pCDNA3/IRESdo HCV, o pSEAP2 (como um controle de transfecção e especificidade), eum shRNA (a 1 nM) em um cavidade de uma placa de cultura de tecidos de24 cavidades. O plasmídio pUC18 foi adicionado para proporcionar um totalde 800 ng de ácidos nucléicos por cavidade. 48 horas após a transfecção, ascélulas foram Iisadas e a atividade da Iuciferase de vaga-lume foi medida porum luminômetro. Todos os dados são os resultados de experimentosindependentes, individuais, efetuados em triplicata, e normalizados paraSEAP.

A Figura 2A é um gráfico em barras representando os resultadosdos experimentos testando a inibição da expressão do gene dirigida peloIRES do HCV, em células 293FT, que foram co-transfectadas com osplasmídios de expressão de relator de Iuciferase dupla e SEAP e 1 pmol deshRNAs transcritos in vitro. O plasmídio-alvo era o relator de Iuciferase duplapCDNA3/IRES do HCV (IRES do HCV1 como mostrado na Figura 1E). Aatividade da Iuciferase de vaga-lume foi medida como descrito no Exemplo1. As atividades da Iuciferase de vaga-lume e da SEAP foram normalizadaspara 100.

A Figura 2B é um gráfico em barras representando os resultadosdos experimentos testando a inibição do HCV versus EMCV em células293FT. Os dados são apresentados como atividade da Iuciferase divididapela atividade da SEAP normalizada para 100.

A Figura 2C é um gráfico em barras representando os resultadosdos experimentos demonstrando o efeito das combinações inadequadas debases individuais sobre a potência dos shRNAs. As condições experimentaisforam como descritas para a Figura 2A. O SNP1 e o SNP2 continham paresde bases mutados, conforme mostrado na Figura TB.

A Figura 2D é um gráfico de linhas representando os resultadosdos experimentos testando a resposta à dose da inibição da expressão dogene dirigida pelo IRES do HCV por shRNAs mutados (HCVa-mut) ou decontrole (229). As condições experimentais foram como descritas para aFigura 2A. Os dados são representados como Iuciferase dividida por SEAPnormalizados para 100. Todos os dados são os resultados de experimentosindependentes, individuais, efetuados em triplicata.

A Figura 2E é um gráfico de linhas representando os resultadosdos experimentos testando a resposta à dose dos shRNAs HCVa-wt, HCVa-mut, e 229 sobre a expressão do gene a partir do relator de Iuciferase duplanão tendo os sítios-alvo de shRNA. O procedimento foi como descrito para aFigura 2D, exceto que o alvo era a Iuciferase de vaga-lume dirigida peloIRES do EMCV em vez do IRES do HCV.

A Figura 2F é uma reprodução de uma análise por transferênciaNorthern de células 293FT co-transfectadas, tratadas como a seguir; 10 μgde RNA total isolado de células transfectadas com nenhum inibidor (caminho1), com o 229 (caminho 2), o HCVa-wt (caminho 3), ou oHCVa-mut (caminho4) foram separados por eletroforese em gel de desnaturação, transferidospara a membrana e hibridizados seqüencialmente com sondas de cDNAmarcadas com 32P para fLuc, SEAP, ou fator de alongamento 1A (EF1A). Amancha de RNA foi exposta a uma tela de fósforo de armazenamento paravisualização e quantificação (BioRad FX Molecular Imager).

A Figura 3A é um gráfico de linhas representando os resultadosdos experimentos testando a resposta à dose para os shRNAs HCVa-wt eHCVa-mut, usando a linhagem celular de hepatócitos humana, Huh7. Osprocedimentos foram como descritos para a Figura 2D, exceto que foramusadas as células Huh7.

A Figura 3B é um gráfico em linhas representando os resultadosdos experimentos demonstrando que o shRNA HCVa-wt não inibe um alvosimilar não tendo o IRES do HCV. As células foram transfectadas como naFigura 3A, exceto que o relator de Iuciferase dupla pCDNA3/IRES do EMCV(IRES do EMCV) foi adicionado no lugar do relator de Iuciferase duplapCDNA3/IRES do HCV (IRES do HCV). Todos os dados são apresentadoscomo atividade da Iuciferase dividida por SEAP. Todos os dados foramgerados a partir de experimentos independentes, individuais, efetuados emtriplicata.

A Figura 4A representa as seqüências de sete seqüências dereconhecimento virais de 19 pares de bases de siRNAs sintéticos e shRNAscontidos dentro do sítio-alvo de 25 nucleotídeos do genótipo 1A do HCV(SEQ ID NO:26) e a análise de sua pureza sobre gel de poliacrilamida nativoa 10% tingido com brometo de etídio. siRNAs: as fitas com sentido e anti-sentido continham os ressaltos 3'-UU; shRNAs: as seqüências de laço e osressaltos das extremidades em 3', 5' eram idênticos àqueles dos shRNAs depares de bases.

A Figura 4B é üm gráfico em barras representando os resultadosdos experimentos nos quais os inibidores de RNA (siRNAs e shRNAs) foramtestados quanto à inibição da expressão do gene mediada pelo IRES doHCV em uma concentração de inibidor de 1 nM, em células 293 FT.

A Figura 4C é um gráfico em barras representando os resultadosdos experimentos nos quais os inibidores de RNA foram testados quanto àinibição da expressão do gene mediada pelo IRES do HCV em umaconcentração de inibidor de 0,1 nM, em células 293 FT.

A Figura 5A é uma reprodução das imagens por IVIS decamundongos, em que o plasmídio relator de Iuciferase dupla do IRES doHCV (10 μg) e a SEAP (adicionada para controlar a eficiência da injeção e ainibição não-específica) foram co-injetados nas veias das caudas decamundongos, conforme descrito no Exemplo 1, com 100 μg do shRNA doHCV indicado ou do shRNA 229 de controle) diretamente ou na forma de100 μg de plasmídios de expressão de pol Ill expressando o shRNA (ou oplasmídio pUC18 como controle). Em diversos pontos de tempo (24, 36, 48,60, 72, 84 e 100 horas) após a injeção, a Iuciferina foi administrada de modointraperitoneal, e os camundongos foram representados por imagens usandoo sistema de formação de imagem in vivo IVIS. As imagens são decamundongos representativos a partir do ponto de tempo de 84 horas.

A Figura 5B é um gráfico representando os resultadosquantificados dos experimentos descritos para a Figura 5A, em que houve adistribuição direta de RNA. A quantificação foi efetuada usando o softwareImageQuant®. Cada ponto de tempo representa a média de 4-5camundongos. No ponto de tempo de 96 horas, os camundongos foramsangrados e a quantidade de atividade da SEAP determinada pelo ensaio depNPP, como descrito no Exemplo 1. Os dados quantificados sãoapresentados como atividade de Iuciferase dividida por SEAP, normalizadapara os camundongos de controle de pUC18 (100%, nenhuma barra deerros mostrada no controle de pUC18 por clareza; as barras de erros eramsimilares às outras mostradas).

A Figura 6 é um gráfico de barras representando os resultadosdos experimentos, nos quais foi comparada a inibição por shRNA eoligômero de fosforodiamidato morfolino da expressão do gene relatormediada pelo IRES do HCV, em camundongos. Os camundongos foram co-injetados, conforme descrito nos experimentos para a Figura 5, com oplasmídio relator de Iuciferase dupla do IRES do HCV e o pSEAP com 100μg dos inibidores de shRNA do HCV indicados ou 1 nmol de umoligonucleotídeo de morfolino, anteriormente mostrado inibir o constructo deexpressão do IRES do HCV [8]. Os camundongos foram representados porimagens em diversos tempos (12 horas, 24 horas, 48 horas, e 144 horas)após o tratamento. Os dados mostrados são para o ponto de tempo de 48horas. Os dados quantificados são apresentados como atividades daIuciferase e da SEAP, normalizados para os camundongos de controle depUC18 (sem adição). Os resultados apresentados são de 3-5 camundongospor constructo.

A Figura 7 é um gráfico representado os resultados deexperimentos nos quais as células BHK-21 foram transfectadastransientemente com plasmídios expressando um shRNA inibitório quealveja o gene nsp-1. Vinte e quatro horas após a transfecção, as célulasforam infectadas com 10 μΙ de vírus da Floresta de Semliki expressandoGFP hábeis na replicação (SFV-GFP-VA7; multiplicidade de infecção (MOI)1suficiente para cerca de 100% de infecção) e testadas quanto à expressãode GFP mediada por vírus através de citometria de fluxo, 24 horas após ainfecção. O nível de supressão mediada pelo siRNA foi cerca de 35%.Designações: Nsp 1. shRNA alvejando o gene de Nspl (nsp-1número2);vetor vazio, pU6; nunca antes tratadas, células BHK não infectadas.

A Figura 8 é um gráfico em barras representando os resultadosdos experimentos nos quais foi investigada a inibição do SFV deficiente nareplicação (SFV-PD713P-GFP) pelos shRNAs. As células BHK-21 foramtransfectadas transientemente com plasmídios que expressam os shRNAsinibidores. Quarenta e seis horas após a transfecção, as células foraminfectadas com o vírus SFV-GFP, em uma MOI de 5, com 8% de PEG, emmeio sem soro, por uma hora. Então, o meio completo foi adicionado e ascélulas foram Incubadas a 379C, durante a noite. As células foramanalisadas por citometria de fluxo a 9, 24, 32, 99, e 125 horas após ainfecção. Por clareza, somente três pontos de tempo são mostrados (9, 24 e32 horas). A quantidade de inibição de cada shRNA foi normalizada para oshRNA de capsídio. O mRNA do capsídio não está presente neste vírusdeficiente na replicação SFVGFP e, portando, o shRNA do capsídio nãodeve ter nenhum efeito sobre a expressão de GFP. A eficiência datransfecção para os contructos de expressão de shRNA para esteexperimento foi cerca de 70%, sugerindo que a inibição viral real ésignificativamente maior do que os níveis indicados. O quinto conjunto debarras (Mistos) refere-se a uma mistura de shRNAs que alvejam os nsp 1-4e o capsídio.

A Figura 9 é um gráfico de linhas representando os resultadosdos experimentos testando a inibição do replicon HCV pelos shRNAs.

A Figura 10 é uma tabela representando as seqüências e osresultados de uma triagem de shRNAs quanto à capacidade de inibir aexpressão do gene mediada pelo IRES do HCV1 nas células 293FT. Ascélulas foram co-transfectadas (usando Lipofectamine® 2000) com aconstrução de relator de Iuciferase dupla pCDNA3/IRES do HCV (40 ng), opSEAP2 (25 ng, como um controle de transfecção e especificidade), e umshRNA (a 1 ou 5 nM) em um cavidade de uma placa de cultura de tecidos de48 cavidades. O plasmídio pUC18 foi adicionado para proporcionar um totalde 400 ng de ácido nucléico por cavidade. Quarenta e oito horas após atransfecção, os sobrenadantes foram removidos para a análise da SEAP1 ascélulas foram lisadas, e a atividade da luciferase de vaga-lume foi medidapor um luminômetro. Todos os dados são os resultados de pelo menos doisexperimentos independentes, efetuados em triplícata. Os níveis de SEAPestavam uniformes em todas as amostras. Os experimentos de controle paratestar a especificidade dos shRNAs foram efetuados também na construçãode relator de Iuciferase dupla pCDNA3/IRES do HCV, onde C340 (no IRES)foi substituída com U.

A Figura 11 é uma representação diagramática da seqüência 3'terminal do IRES do HCV com segmentos alvejados pelos shRNAs. Amutação C340->U (usada para testar a especificidade dos shRNAs) estáindicada.

A Figura 12A é uma representação diagramática dasextremidades de 5' do IRES do HCV e das posições de alvejamento paraseis shRNAs de 19 bp.

A Figura 12B é um gráfico em barras representando osresultados de uma triagem dos shRNAs quanto à capacidade de inibir aexpressão do gene mediada pelo IRES do HCV, nas células 293FT. Osexperimentos foram conduzidos como para a Figura 10; concentração deshRNA, 1 nM.

A Figura 13A é uma representação diagramática das seqüênciasdas variantes testadas do shRNA de 25 pares de bases representado, comos diversos tamanhos de laço e as seqüências, bem como as extremidadesde 3' que foram testadas.

A Figura 13B é um gráfico em barras representando osresultados de uma triagem dos shRNAs representados na Figura 13A quantoà capacidade de inibir a expressão do gene mediada pelo IRES do HCV, nascélulas 293FT. Os experimentos foram conduzidos como para aqueles daFigura 10. Concentração de shRNA, 1 nM. (As seqüências dos shRNAs sãolistadas nas Figuras 16A-B).

A Figura 14A é uma representação diagramática das seqüênciasdas variantes testadas do shRNA de 19 bp representado, com os diversostamanhos de laço e as seqüências testadas, bem como as extremidades de3' que foram testadas.

A Figura 14B é um gráfico em barras representando osresultados de uma triagem dos shRNAs representados na Figura 14A quantoà capacidade de inibir a expressão do gene mediada pelo IRES do HCV, nascélulas 293FT. Os experimentos foram conduzidos como descritos para aFigura 10. Concentração de shRNA, 1 nM. (As seqüências dos shRNAs sãolistadas nas Figuras 16A-B).

A Figura 15 è um gráfico em barras representando os resultadosde uma triagem dos shRNAs (e siRNAs) quanto à atividade inibitória nosistema de replicon HCV. Os hepatócitos humanos (AVA5, um derivado dalinhagem celular Huh7), que expressam estavelmente os repliconssubgenômicos HCV, foram transfectados com os inibidores de RNA, e aquantidade de expressão do HCV foi determinada. Uma faixa deconcentrações foi testada e a concentração de sh/siRNA que resultou em50% de inibição (EC50) foi determinada. As barras escuras e clarasrepresentam os resultados de dois experimentos independentes.

As Figuras 16A-B são tabelas representando as seqüências deshRNA alvejando o IRES do HCV conforme indicado. Os laços de shRNAestão sublinhados. Os nucleotídeos indicados pela caixa baixa são não-complementares ao alvo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção proporciona composições, métodos, e kits para inibira expressão do gene viral (por exemplo, hepatite C) e/ou tratar uma infecçãoviral em um mamífero.

A interferência do RNA oferece uma nova abordagemterapêutica para tratar as infecções virais. A presente invenção proporcionapequenos RNAs interferentes (por exemplo, shRNAs e siRNAs) que alvejamuma seqüência viral e inibem (i.e., reduzem ou eliminam) a expressão dogene viral, e métodos de usar tais pequenos RNAs interferentes para otratamento de uma infecção viral em um mamífero, tal como um ser humano.

Em algumas modalidades, os constructos de pequenos RNAs interferentesda invenção inibem a expressão do gene de um vírus por indução daclivagem das seqüências de polinucleotídeos virais dentro ou próximas àseqüência-alvo que é reconhecida pela seqüência anti-sentido do pequenoRNA interferente.

Conforme -usado neste documento, o "pequeno RNAinterferente" refere-se a um constructo de RNA que contém uma ou maisseqüências curtas que são pelo menos parcialmente complementares a, epodem interagir com, uma seqüência de polinucleotídeos de um vírus. Ainteração pode ser na forma de uma ligação direta entre as seqüênciascomplementares (anti-sentido) do pequeno RNA interferente e asseqüências de polinucleotídeos do alvo viral, ou na forma de uma interaçãoindireta via mecanismo enzimático (por exemplo, um complexo protéico) quepermite que a seqüência anti-sentido do pequeno RNA interferentereconheça a seqüência-alvo. Em alguns casos, o reconhecimento daseqüência-alvo pelo pequeno RNA interferente resulta na clivagem dasseqüências virais dentro ou próximas ao sítio-alvo que é reconhecido pelaseqüência de reconhecimento (anti-sentido) do pequeno RNA interferente. Opequeno RNA interferente pode conter exclusivamente resíduos deribonucleotídeos, ou o pequeno RNA interferente pode conter um ou maisresíduos modificados, particularmente nas extremidades do pequeno RNAinterferente ou sobre a fita com sentido do pequeno RNA interferente. Otermo "pequeno RNA interferente", conforme usado neste documento, incluio shRNA e o siRNA, ambos os quais são entendidos e sabidos para aquelesna técnica referirem-se a constructos de RNA com características e tiposparticulares de configurações.

Conforme usado aqui, o "shRNA" refere-se a uma seqüência deRNA compreendendo uma região de fita dupla e uma região de laço em umaextremidade formando um laço em grampo. A região de fita dupla étipicamente cerca de 19 nucleotídeos a cerca de 29 nucleotídeos decomprimento sobre cada lado da haste, e a região de laço é tipicamentecerca de três a cerca de dez nucleotídeos de comprimento (e osnucleotídeos de ressalto de fita dupla 3' ou 5' terminais são opcionais). Umexemplo de tal shRNA, o shRNA HCVa-wt, tem uma região de fita dupla de25 pares de bases (SEQ ID NO:12), um laço de dez nucleotídeos, umaextensão GG sobre a extremidade 5', e uma extensão UU sobre aextremidade 3'. Os exemplos adicionais de shRNAs adequados para uso,por exemplo, na inibição da expressão de HCV, são proporcionados por todoo relatório descritivo, por exemplo, Figuras 16A-B.

Conforme usado neste documento, o "siRNA" refere-se a umamolécula de RNA compreendendo uma região de fita dupla com um ressaltoem 3' de resíduos não homólogos em cada extremidade. A região de fitadupla é tipicamente cerca de 18 a cerca dè 30 nucleotídeos de comprimento,e o ressalto pode ser de qualquer comprimento de resíduos não homólogos,por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou maisnucleotídeos. O siRNA pode também compreender dois ou mais segmentosde 19-30 pares de bases, separados por regiões não emparelhadas. Sem seenvolver com qualquer teoria específica, as regiões não emparelhadaspodem funcionar para impedir a ativação de vias de imunidade inatas. Um- exemplo de tal siRNA é o siRNA HCVa-wt, que tem uma região de fita duplade 25 pares de bases (SEQ ID NO:12), e uma extensão de UU sobre cadaextremidade 3'.

Em uma modalidade, um pequeno RNA interferente conformedescrito neste documento compreende uma seqüência complementar a umaseqüência do elemento do sítio de entrada interno do ribossomo (IRES) dehepatite C ("HCV"). Em uma modalidade, o vírus é um genótipo 1a de HCV.

A inibição do gene por siRNA mostrou inibir fortemente aexpressão do gene em diversos sistemas de mamíferos. Devido ao seu altonível de estrutura secundária, o IRES do HCV foi sugerido ser um alvoinsatisfatório para os siRNAs ou os shRNAs. Mizusawa descreveu,entretanto, o alvejamento bem-sucedido do IRES do HCV nas células decultura de tecidos 293 e Huh7, relatando 50 e 74 por cento de derrubamentoda expressão do gene, respectivamente. Similarmente, Seo e colaboradores[25] relataram a capacidade do siRNA a 100 nM de inibir a replicação deHCV (aproximadamente 85% de derrubamento) em 5-2 células Huh7. Foiagora demonstrado, como descrito neste documento, que os pequenosRNAs interferentes (shRNAs e siRNAs) dirigidos contra a extremidade 3' doIRES do HCV, incluindo e a jusante do sítio de iniciação da tradução deAUG, podem induzir 96 por cento de derrubamento da expressão da luciferase dependente de IRES do HCV a 0,3 nM em células 293FT e 75 porcento de derrubamento a 0,1 nM em células Huh7 (vide as Figuras 2D e 3A).Além disso, a distribuição direta de shRNA para o fígado do camundongo foimostrada inibir potentemente a expressão do relator dependente de IRES doHCV. Esta é a primeira demonstração de inibição de gene mediada por RNAiem um modelo de animal seguindo a distribuição direta de um grampo deRNA (não expresso in vivo a partir de um plasmídio ou vetor viral). A eficáciado shRNA distribuído diretamente para o fígado do camundongo seguindo ainjeção hidrodinâmica foi surpreendente em vista dos altos níveis denucleases encontradas no sangue. A observação que estes shRNAsderrubaram efetivamente a expressão do gene no fígado indica que estesinibidores de shRNA (1) são muito potentes e não necessitados em altosníveis no fígado do camundongo para causar a inibição do gene, (2) sãodistribuídos de modo suficiente e rápido para o fígado, por exemplo, anteseles são clivados por nucleases em quantidades que impedem um efeito inibitório, ou (3) são inerentemente estáveis à degradação da nuclease (ouuma combinação destas características).

Os relatórios sugerem que os transcritos sintetizados in vitro depromotores de bacteriófagos induzem potentemente o interferon (IFN) alfa ebeta devido à presença de um trifosfato em 5' não natural [26]. Além disso,os shRNAs expressos a partir dos vetores de expressão de pol III podemtambém induzir o IFN [27]. Como esta indução do interferon afetaria o usode shRNA em uma indicação clínica para infecção por HCV não está clara. Aterapia de HCV atual inclui o tratamento com o interferòn alfa, sugerindo quese o interferòn for induzido por shRNA, ele pode ter um efeito positivo. Até omomento, nenhum efeito colateral relacionado ao interferòn parece ter sidodescrito em animais seguindo a administração de RNAi [3]. Preocupaçõesadicionais têm sido apresentadas com relação aos efeitos fora de propósitodo siRNA, bem como os efeitos citotóxicos potenciais quando os siRNAs ouo shRNAs são distribuídos por vetores Ientivirais [28].

A presente invenção também se refere aos métodos de testar ossiRNAs e os shRNAs que alvejam seqüências do IRES do HCV, paraidentificar aquelas seqüências tendo atividade suficiente (por exemplo, amais alta atividade entre um grupo selecionado de tais seqüências) para seruma candidata para uso como um tratamento. O teste pode também incluir oexame quanto às atividades interferentes pequenas tendo efeitos fora depropósito indesejáveis ou efeitos citotóxidos gerais. Os efeitos fora depropósito incluem, sem limitação, o derrubamento de genes não alvejados, ainibição da expressão de genes não alvejados, e a competição com vias demicroRNA naturais (Birmingham et al., Nat. Methods. 2006 3(3):199-204;Grimm et al., Nature 2006 441(7092):537-541). Os métodos de identificar osefeitos citotóxicos são conhecidos na técnica (por exemplo, Marques et al.,Nat. Biotechnol. 2006 24(5):559-565; Robbins et al., Nat. Biotechnol. 200624(5):566-571).

A região de IRES na 5'-UTR de HCV é altamente conservada(92-100% idêntica [15, 29-31]) e tem diversos segmentos que parecem serinvariantes, tornando o IRES um alvo principal para os inibidores à base deácidos nucléicos. A região em torno do códon de iniciação da tradução deAUG é, de modo particular, altamente conservada, sendo invariante nasposições +8 até -65 (com a exceção de uma única variação de nucleotídeona posição -2), conforme observado em mais de 81 isolados de diversasposições geográficas [32]. Apesar da conservação de seqüência no motivode IRES, é improvável que o alvejamento de uma única seqüência, mesmose altamente conservada, seja suficiente para impedir os mutantes de fuga.Os vírus de RNA são sabidos terem altas taxas de mutação devidas à altataxa de erros da RNA polimerase e à ausência de atividade de correção deerros desta enzima. Em média, cada vez que o RNA de HCV é replicado umerro é incorporado na nova fita. Esta taxa de erros é aumentada pelaprodução prodigiosa de partículas virais em uma infecção ativa(aproximadamente um trilhão por dia em um paciente cronicamenteinfectado) [33]. Portanto, em algumas modalidades da invenção, diversossítios conservados são alvejados ou, alternativamente, os shRNAs comodescritos aqui são usados como um componente de um tratamento decombinação, tal como com ribaviram e/ou interferon peguilado. Conformedemonstrado neste documento, uma única combinação inadequada nãobloqueia completamente a atividade do shRNA (vide o Exemplo 2; Figura2D); assim, cada shRNA diferente pode ter alguma atividade contra umnúmero limitado de mutações. Desse modo, a invenção inclui os métodos deinibir a expressão de HCV usando um shRNA que pode incluir umacombinação inadequada com a seqüência-alvo. A invenção também inclui osmétodos de inibir a expressão de HCV por administração de pelo menosdois shRNAs diferentes alvejando um IRES do HCV, de modo tal que osshRNA difiram nas seqüências de alvejamento.

McCaffrey e colaboradores relataram que um oligonucleotídeo2G de fosforodiamidato morfolino dirigido contra um sítio IRES de HCVconservado, no sítio de iniciação da tradução de AUG, potentemente inibe a-expressão do gene relator [8].-O mesmo inibidor de morfolino foi usado paracomparação contra a inibição pelo shRNA descrita neste documento. Foiverificado que tanto a morfolina quanto o shRNA alvejando o sítio IRES deHCV conservado potente e fortemente inibiam a expressão do genedependente de IRES. Quatro mutações no morfolino foram requeridas parabloquear a atividade, enquanto que duas alterações no shRNA foramsuficientes, sugerindo maior especificidade do shRNA. Esta vantagempotencial, acoplada com a ausência de resíduos não naturais no inibidor deshRNA e presumivelmente menos efeitos colaterais resultantes, sãoequilibradas pela estabilidade aumentada do oligômero de morfolino.

Um plasmídio de Iuciferase relatora dupla foi usado, no qual aexpressão da Iuciferase de vaga-lume (fLuc) era dependente do IRES doHCV [24]. A expressão da Iuciferase de renilla a montante não é dependentede IRES do HCV e é traduzida em um processo dependente de Cap. Atransfecção direta de shRNAs de IRES do HCV1 ou alternativamenteshRNAs expressos a partir de vetores promotores de pollll, bloqueoueficientemente a expressão de fLuc mediada por IRES do HCV em células293FT e Huh7 humanas. Os shRNAs de controle contendo uma mutaçãodupla tiveram pouco ou nenhum efeito sobre a expressão de fLuc, e osshRNAs contendo somente uma única mutação mostraram inibição parcial.Estes shRNAs foram também avaliados em um modelo de camundongo,onde os constructos de DNA foram distribuídas para as células no fígado portransfecção hidrodinâmica via a veia do rabo. O plasmídio de expressão deIuciferase dupla, os shRNA, e o plasmídio de fosfatase alcalina secretadaforam usados para transfectar as células no fígado, e os animais foramrepresentados em imagens em pontos de tempo durante 12 a 96 horas. Aformação de imagem in vivo revelou que o shRNA de IRES do HCVdiretamente, ou alternativamente expresso a partir de um vetor de plasmídiode pollll, inibiu a expressão do gene relator dependente de IRES do HCV; osshRNAs mutantes ou irrelevantes tiveram pouco ou nenhum efeito. Estesresultados indicam que os shRNAs, distribuídos como RNA ou expressos apartir de vetores virais ou não virais, são úteis como antivirais efetivos para ocontrole de HCV e vírus relacionados.

O ensaio de três shRNAs adicionais alvejando diferentes sítiossobre o domínio IV do IRES do HCV revelou um outro shRNA potente,HCVd-wt, cuja posição-alvo está deslocada seis nucleotídeos daquela doHCVa-wt. O HCVb-wt e o HCVc-wt eram inibidores muito menos eficientes.

Para investigar adicionalmente os efeitos das seqüências locaissobre a potência, sete constructos de shRNA transcrito in vitro,compreendendo uma seqüência de 19 pares de bases complementar a umaseqüência do IRES do HCV e o siRNA sintético correspondentecompreendendo as mesmas seqüências de 19 pares de bases, alvejandotodas as posições possíveis dentro do sítio de 25 pares de bases do HCVa-wt (344-368), foram testadas quanto à atividade inibitória. Um siRNAsintético de 25 pares de bases correspondendo ao shRNA HCVa-wt foitambém testado. Todos os constructos testados exibiram um alto nível deatividade. Em geral, os siRNA de 19 pares de bases eram mais potentes doque os shRNAs de 19 pares de bases. O mais potente, o siHCV19-3, eraefetivo a 1 nm (>90% de inibição), 0,1 nM (aproximadamente 90% deinibição) e mesmo em uma concentração de 0,01 nM (aproximadamente40% de inibição). Assim, os shRNAs e os siRNAs de 19-25 pares de basesprojetados para alvejar a região 344-374 sobre o IRES do HCV sãogeralmente inibidores potentes da expressão de HCV, com algumasdiferenças locais.

Os pequenos RNAs em grampo da invenção podem,opcionalmente, incluir estruturas que resultam em ligações não-covalentesfortes entre as fitas com sentido e anti-sentido do shRNA. Os exemplos detais ligações não-covalentes incluem as reticulações mediadas por íons demetais. Tais reticulações podem ser formadas entre resíduos denucleotídeos naturais ou modificados, incluindo, por exemplo, basesmodificadas, açúcares, e grupos terminais, conforme descrito em Kazakov eHecht 2005, Nucleic Acid-Metal Ion Interactions. Em: King, R. B. (ed.),Encyclopedia of Inorganic Chemistry, 2- ed., Wiley, Chichester, vol. VI, págs.3690-3724, por exemplo, seção 5.4.3. Os exemplos não Iimitativos- adicionais de variantes de tais ligações são encontrados no pedido depatente WO 99/09045 (US2006074041); por exemplo, Figura 10. Em geral, aposição dos resíduos de nucleotídeos reticuláveis é nas extremidades dasfitas de RNA complementares que situam-se em proximidade exata com aformação do duplex. A adição de certos íons de metais (ou compostos decoordenação de íons de metais) pode resultar na reticulação de gruposfuncionais que têm forte afinidade por estes íons de metais, tais como -SH, -SCH3, fosforotioatos, imidazolidas, o-fenantrolinas, e outros. Estesnucleotídeos modificados são introduzidos durante a síntese química dasfitas de RNA com sentido e anti-sentido. Os nucleotídeos modificados nasfitas com sentido e anti-sentido podem formar pares de base ou serem partede ressaltos de 1 -3 nucleotídeos.Seqüências de Alvejamento

Os exemplos de seqüências de alvejamento são proporcionadospor todo o relatório descritivo. Os exemplos não Iimitativos de seqüências dealvejamento são proporcionados, por exemplo, na Tabela 1 e na Figura 10.Os exemplos não Iimitativos de shRNAs e siRNAs que incorporamseqüências de alvejamento são encontrados por todo o relatório descritivo,por exemplo, na Figura 1 e nas Figuras 16A-B.Laços

Os efeitos do tamanho e da seqüência da região de laço doshRNA foram também investigados. A região de laço do laço-tronco doshRNA pode ser tão pequena quanto dois a três nucleotídeos e não tem umlimite superior claro sobre o tamanho; geralmente, um laço é entre quatro enove nucleotídeos, e é geralmente uma seqüência que não causa efeitosnão pretendidos,por exemplo, por ser complementar a um gene que não éalvo. As seqüências de laço altamente estruturadas, tais como um tetralaçode GNRA, podem ser usadas na região de laço (por exemplo, como o laço)em um shRNA. O laço pode estar em qualquer extremidade da molécula; ouseja, a fita com sentido pode estar 5' ou 3' em relação ao laço. Também,uma região de duplex não-complementar (aproximadamente um a seis paresde bases, por exemplo, quatro pares de bases de GC) pode ser colocadaentre o duplex de alvejamento e o laço, por exemplo, para servir como um"grampo de GC" para reforçar a formação do duplex. Pelo menos 19 paresde bases de duplex complementar-alvo são necessários se um duplex não-complementar for utilizado.

Uma estrutura de laço pode também incluir ligações reversíveis,tais como ligações de S-S, que podem ser formadas por oxidação de grupos-SH introduzidos nos resíduos de nucleotídeos, por exemplo, conformedescrito em (Earnshaw et al., J. Mol. Biol., 1997, 274: 197-212; Sigurdssonet al. (Thiol-Containing RNA for the Study of Structure and Function ofRibozymes. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology, 1999, 18:71-77). Um exemplo não Iimitativo da posição para os resíduos denucleotídeos com grupos SH é nas extremidades das fitas de RNAcomplementares que situam-se em proximidade exata com a formação doduplex. Tais nucleotídeos modificados são introduzidos durante a síntesequímica das fitas de RNA com sentido e anti-sentido do pequeno RNAinterferente. Os nucleotídeos modificados nas fitas com sentido e anti-sentido podem formar pares de bases ou formar ressaltos não-complementares de um a três nucleotídeos.

Os exemplos não Iimitativos adicionais de laços e suasaplicações, por exemplo, em shRNA e siRNA alvejando HCV, podem serencontrados nos Exemplos.

Extremidades

A extremidade 3' de um shRNA conforme descrito nestedocumento pode ter um ressalto complementar que não é alvo de dois oumais nucleotídeos, por exemplo, UU ou dTdT, entretanto, os ressaltospodem ser qualquer nucleotídeo, incluindo os nucleotídeos quimicamentemodificados que, por exemplo, promovem a resistência à nucleaseaumentada. Em outras modalidades, existe um ou zero nucleotídeoressaltando sobre a extremidade 3'.

A extremidade 5' pode ter uma extensão não-complementar, porexemplo, dois Gs (conforme mostrado na Figura 1B), uma seqüência deGAAAAAA, ou somente um ou zero nucleotídeo estendendo-se além daregião de duplex complementar-alvo. Na seqüência mostrada na Figura 1B,os dois G's em 5" são incluídos principalmente para a facilidade datranscrição a partir de um promotor T7.

Características adicionais

As características adicionais que podem opcionalmente serincluídas nos shRNAs usados para inibir a expressão de HCV e que sãoincluídas pela invenção são as variações de comprimentos entre cerca de 19pares de bases e cerca de 30 pares de bases para a região de duplexcomplementar alvo, as pequenas modificações na seqüência alvejada(geralmente zero a cerca de dois nucleotídeos, e as modificações tãograndes quanto cerca de dez nucleotídeos em qualquer direção ao longo doalvo podem situar-se dentro da região capaz de ser alvejada). Similarmente,as combinações inadequadas são também toleradas: aproximadamente umaa cerca de duas na fita anti-sentido e aproximadamente uma a cerca denove na fita com sentido (esta desestabilizando o duplex em grampo, porémnão afetando a resistência da ligação da fita anti-sentido ao alvo); o númerotolerado depende parcialmente do comprimento do duplex complementar-alvo. Conforme descrito neste documento, um shRNA tendo pelo menossete combinações inadequadas de G-U dentro de uma região de duplexcomplementar-alvo de 29 pares de base pode ser usado com êxito parainibir a expressão de HCV1 por exemplo, usando uma seqüência alvejando oIRES do HCV. Observar que as duas mutações mostradas na Figura 1Blargamente anulam a inibição, porém os outros mutantes tendo mutaçõesem outras posições, particularmente se eles estiverem proximamenteespaçados e/ou próximos à extremidade, podem ser melhor tolerados.Certas variações são conhecidas na técnica ou demonstradas no presentepedido.Vetores

Os vetores adequados para produzir shRNAs e siRNAs sãodescritos neste documento e são conhecidos na técnica. Nos exemplos nãolimitativos, os shRNAs podem ser expressos usando promotores de Pol III,tais como U6 ou H1, no contexto de vetores derivados de vírus adeno-- associado ou Ientivirusi -O promotor de RNA nuclear U6 humano e opromotor H1 humano estão entre os promotores de pol Ill para expressarshRNAs.

Uma característica que é geralmente desejável em um vetor é aexpressão do transgene relativamente prolongada. Os vetores Ientivirais sãocapazes de transduzir células não divisoras e manter a expressão dotransgene de longa duração controlada. O serótipo 8 de vírus adeno-associado é considerado seguro e é caracterizado por expressão detransgene prolongada.

shRNA e siRNA candidatos

Em alguns casos, um ou mais pequenos RNAs interferentes sãoidentificados como tendo atividade para inibir um vírus alvejado, tal como oHCV. Podem ser efetuados testes adicionais para caracterizaradicionalmente a adequabilidade de tais RNAs para uso, por exemplo, paraa inibição da expressão de HCV em um animal. Os modelos de animaispodem ser usados para tal teste. Um exemplo não Iimitativo inclui ummodelo de camundongo, por exemplo, conforme ilustrado no Exemplo 3(infra). Outros modelos de animais adequados para testar um tratamentopara HCV são conhecidos na técnica, por exemplo, usando chimpanzés.

Métodos

A invenção refere-se aos métodos de inibição da expressão dogene em um vírus, compreendendo contatar o vírus com um pequeno RNAinterferente, tal como um shRNA ou siRNA, como descrito neste documento,que compreende uma seqüência que é pelo menos parcialmentecomplementar a, e é capaz de interagir com, uma seqüência depolinucleotídeos do vírus. Em algumas modalidades, o contato do víruscompreende introduzir o pequeno RNA interferente em uma célula quecontém o vírus, i.e., uma célula infectada com o vírus. A "inibição daexpressão do gene", conforme usada aqui, refere-se a uma redução (i.e.,diminuição no nível) ou eliminação da expressão de pelo menos um gene deum vírus. Por exemplo, a redução na expressão comparada à célula ou aoanimal correspondente infectado com o vírus. Em algumas modalidades, ainibição da expressão do gene é efetuada por clivagem da seqüência-alvoviral à qual se liga o pequeno RNA interferente. A expressão do gene podeser testada por ensaio do RNA viral ou da proteína viral. Em alguns casos, aeficácia de um método (por exemplo, um tratamento usando umacomposição descrita neste documento) é testada por avaliação de umanimal infectado quanto a uma diminuição nos sintomas ou uma alteração(por exemplo, diminuição) na expressão ou atividade de uma proteínaassociada com a infecção viral, por exemplo, uma proteína viral, tal comop24, ou uma proteína hospedeira, tal como um interferon.

A invenção também se refere aos métodos para tratar umainfecção viral ou para tratar um paciente suspeito de estar infectado(incluindo um paciente exposto ao vírus para tratamento profilático), em ummamífero, compreendendo a administração ao mamífero de umacomposição compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva deum pequeno RNA interferente, tal como um shRNA ou siRNA, como descritoaqui, que inclui uma seqüência que é pelo menos parcialmentecomplementar a, e capaz de interagir com (por exemplo, hibridizar com, sobcondições fisiológicas, ou efetuar a atividade de RNAi), uma seqüência depolinucleotídeos do vírus, por exemplo, a seqüência do IRES do HCV. Emalgumas modalidades, o mamífero é um ser humano. Em uma modalidade, omamífero é um ser humano e a infecção viral é uma infecção por HCV, talcomo uma infecção com o genótipo 1a de HCV, e o pequeno RNAinterferente compreende uma seqüência que é pelo menos complementar auma seqüência do IRES do HCV.

Conforme usado aqui, uma "quantidade terapeuticamenteefetiva" é uma quantidade" de um pequeno RNA interferente que podeproporcionar um resultado terapêutico desejado (por exemplo, redução oueliminação de uma infecção viral). Uma quantidade terapeuticamente efetivapode ser administrada em uma ou mais doses. Os exemplos não Iimitativosde doses são cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, por exemplo, cercade 1 a cerca de 5 mg/kg. Os métodos adequados de distribuição sãoconhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a administração intravenosa4por exemplo, via uma veia periférica ou via um cateter). Os exemplos nãolimitativos incluem a distribuição via a artéria hepática ou a veia portal.

Geralmente, nos métodos para tratar uma infecção viral em ummamífero, o pequeno RNA interferente é administrado com um veículofarmaceuticamente aceitável. Conforme usado aqui, um "veículofarmaceuticamente aceitável" (também chamado, de modo intercambiável,"excipiente farmaceuticamente aceitável", neste documento) é umasubstância relativamente inerte que facilita a administração do pequenoRNA, ou RNAs1 interferente. Por exemplo, um veículo pode dar forma ouconsistência à composição ou pode atuar como um diluente. Um veículofarmaceuticamente aceitável é biocompatível (i.e., não tóxico para ohospedeiro) e adequado para uma rota particular de administração para umasubstância farmacologicamente efetiva. Os veículos farmaceuticamenteaceitáveis, adequados, incluem, porém não estão limitados aos agentesestabilizantes, agentes molhantes e emulsificantes, sais para osmolaridadevariada, agentes de encapsulação, tampões, e intensificadores dapenetração na pele. Em algumas modalidades, o veículo farmaceuticamenteaceitável é a água ou a solução salina. Os exemplos de veículosfarmaceuticamente aceitáveis são descritos em Remingtoris PharmaceuticalSciences (Alfonso R. Gennaro, ed., 18â edição, 1990).

Nos métodos para tratar uma infecção viral, os pequenos RNAsinterferentes, como descritos neste documento, são geralmenteadministrados de modo parenteral, por exemplo, subcutaneamente,intravenosamente, ou intramuscularmente.

Composições

A invenção proporciona composições para inibir a expressão dogene viral e/ou tratar uma infecção viral em um mamífero, compreendendopelo menos um pequeno RNA interferente conforme descrito nestedocumento. As composições da invenção podem compreender dois ou maispequenos RNAs interferentes, conforme descritos neste documento. Deacordo com a invenção, um pequeno RNA interferente, por exemplo, shRNAou siRNA, compreende uma seqüência que é substancialmentecomplementar a uma seqüência de polinucleotídeos viral de cerca de 19 acerca de 30 nucleotídeos, onde a interação da seqüência substancialmentecomplementar do pequeno RNA interferente com a seqüência depolinucleotídeos do vírus inibe a expressão do gene viral, por exemplo,através de clivagem das seqüências de polinucleotídeos virais.

Em algumas modalidades, a composição compreende umshRNA que inclui uma seqüência selecionada a partir do grupo que consisteem SEQ ID NOs: 12, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, e 25. Em algumasmodalidades, a composição compreende um shRNA que inclui uma dasseguintes: SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37,SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID NO:41, SEQ IDΝΟ:42, SEQ ID ΝΟ:43, SEQ ID ΝΟ:44, SEQ ID ΝΟ:45, SEQ ID ΝΟ:46, SEQID ΝΟ:47, SEQ ID ΝΟ:48, SEQ ID ΝΟ:49, SEQ ID Ν0:50, SEQ ID Ν0:51;SEQ ID ΝΟ:52, SEQ ID ΝΟ:53, SEQ ID ΝΟ:54, SEQ ID ΝΟ:55, ou SEQ IDNQ:56 (Tabela 10). Em algumas modalidades, a composição compreendeum ou mais shRNAs de SEQ ID N0:57-110. Em algumas modalidades, acomposição compreende um siRNA compreendendo uma seqüênciaselecionada a partir de SEQ ID NOs:19, 20, 21, 22, 23, 24, e 25. Em outrasmodalidades, a composição compreende um siRNA que inclui umaseqüência de SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ IDNO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID N0:40, SEQ ID NO:41, SEQID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID N0:50, SEQ IDNO:51; SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, ouSEQ ID NO:56 (Figura 10). Em algumas modalidades, a composiçãocompreende um shRNA ou siRNA que se liga a, i.e., compreende umaseqüência substancialmente complementar a, uma seqüência de cerca de19 a cerca de 30 nucleotídeos dentro do elemento IRES do HCV, porexemplo, o genótipo 1a de HCV. Uma composição pode incluir mais do queum shRNA diferente, por exemplo, shRNAs alvejando diferentes seqüênciasde um IRES ou diferentes alelòs ou mutações de uma seqüência-alvo. UmshRNA ou siRNA conforme descrito aqui pode incluir mais do que uma dasseqüências identificadas. Gertas composições contêm mais do que umaseqüência diferente de shRNA ou siRNA.

Em algumas modalidades, a invenção proporciona umacomposição farmacêutica compreendendo um pequeno RNA interferente,conforme descrito neste documento, e um veículo farmaceuticamenteaceitável. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica éformulada para a administração parenteral a um mamífero, por exemplo, umser humano.

Uma composição farmacêutica que inclui um RNA interferentecurto (por exemplo, um siRNA ou um shRNA) é formulada para sercompatível com a sua rota de administração pretendida. Qs exemplos dasrotas de administração incluem a administração intravenosa, intradérmica,subcutânea, por inalação, transdérmica (tópica), transmucosa, e retal; ouoral. As soluções ou as suspensões usadas para aplicação parenteral,intradérmica, ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: umdiluente estéril, tal como a água para injeção, a solução salina, os óleosfixos, os polietileno glicóis, a glicerina, o propileno glicol ou outros solventessintéticos; os agentes antibacterianos, tais como o álcool benzílico ou osmetil parabenos; os antioxidantes, tais como o ácido ascórbico ou o bissulfitode sódio; os agentes quelantes, tais como o ácido etilenodiaminotetracético;os tampões, tais como os acetatos, os citratos ou os fosfatos, e os agentespara o ajuste da tonicidade, tais como o cloreto de sódio ou a dextrose. O pHpode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como o ácido clorídrico ou ohidróxido de sódio. Uma preparação parenteral pode estar encerrada emampolas, seringas descartáveis ou frascos pequenos de doses múltiplas,feitos de vidro ou plástico.

As composições farmacêuticas adequadas para uso injetávelincluem as soluções (onde solúveis em água) ou as dispersões aquosasestéreis e os pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções oudispersão injetável estéril. Para a administração intravenosa, os veículosadequados incluem a solução salina fisiológica, a água bacteriostática, oCremophor EL® (BASF, Parsippany, NJ) ou a solução salina tamponada comfosfato (PBS). Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve serfluida na medida em que exista a fácil capacidade de injetar com seringa. Eladeve ser estável sob as condições de fabricação e armazenagem e deve serconservada contra a ação contaminante de microorganismos, tais comobactérias e fungos. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersãocontendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietileno glicol líquido, e similares), e suas misturas adequadas. Afluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de umrevestimento, tal como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partículaselecionado, no caso de dispersão, e pelo uso de tensoativos. A prevençãoda ação de microorganismos pode ser obtida por diversos agentesantibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol,ácido ascórbico, timerosal, e similares. Em alguns casos, os agentesisotônicos são incluídos, por exemplo, os açúcares, ou os poliálcoois, taiscomo o manitol, o sorbitol, ou o cloreto de sódio. A absorção prolongada deuma composição injetável pode ser efetuada por inclusão na composição deum agente que retarde a absorção, por exemplo, o monoestearato dealumínio ou a gelatina.

As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas porincorporação do composto ativo na quantidade especificada em um solventeapropriado, com um ou uma combinação de ingredientes enumeradosacima, conforme necessário, seguida por esterilização filtrada. Geralmente,as dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em umveículo estéril que contenha um meio de dispersão básico e outrosingredientes selecionados a partir daqueles enumerados acima ou outrosconhecidos na técnica. Nõ" caso de pós estéreis para a preparação desoluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são asecagem a vácuo e a secagem por congelamento, que produz um pó doingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir deuma solução previamente filtrada estéril do mesmo.

As composições orais geralmente incluem um diluente inerte ouum veículo comestível. Para o propósito de administração terapêutica oral, ocomposto ativo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma decomprimidos, pastilhas, ou cápsulas, por exemplo, cápsulas de gelatina. Osagentes aglutinantes farmaceuticamente compatíveis podem ser incluídoscomo parte da composição. Os comprimidos, as pílulas, as cápsulas, aspastilhas e similares podem conter quaisquer dos ingredientes a seguir, oucompostos de uma natureza similar: um aglutinante, tal como a celulosemicrocristalina, a goma do tragacanto ou a gelatina; um excipiente, tal comoo amido ou a lactose, um agente desintegrante, tal como o ácido algínico, oPrimogel, ou o amido de milho; um lubrificante, tal como o estearato demagnésio ou o Sterotes; um agente de deslizamento, tal como o dióxido desilício coloidal; um agente adoçante, tal como a sacarose ou a sacarina; ouum agente aromatizante, taí como a menta, o salicilato de metila, ou aessência de laranja.

Para a administração por inalação, os compostos sãodistribuídos na forma de um spray aerossol a partir de recipiente ou dosadorpressurizado que contém um propulsor adequado, por exemplo, um gás, talcomo o dióxido de carbono, ou um nebulizador.

A administração sistêmica pode também ser por meiotransmucoso ou transdérmico. Para a administração transmucosa outransdérmica, são usados na formulação penetrantes apropriados para abarreira a ser permeada. Tais penetrantes são geralmente conhecidos natécnica, e incluem, por exemplo, para a administração transmucosa, osdetergentes, os sais biliares, e os derivados de ácido fusídico. Aadministração transmucosa pode ser efetuada através do uso de spraysnasais ou supositórios. Para a administração transdérmica, os compostosativos são formulados êm ungüentos, pomadas, géis, ou cremes, conformeconhecido em geral na técnica.

Os compostos podem também ser preparados na forma desupositórios (por exemplo, com bases convencionais de supositórios, taiscomo a manteiga de cacau e outros glicerídeos) ou enemas de retençãopara a distribuição retal.

Em uma modalidade, os compostos ativos são preparados comveículos que protegerão o composto contra a eliminação rápida do corpo, talcomo uma formulação de liberação controlada, incluindo os implantes e ossistemas de distribuição microencapsulados. Os polímeros biocompatíveis,biodegradáveis, podem ser usados, tais como o etileno acetato de vinila, ospolianidridos, o poli(ácido glicólico), o colágeno, os poliortoésteres, e opoli(ácido láctico). Os métodos para a preparação de tais formulações serãoaparentes para aqueles versados na técnica. Os materiais podem tambémser obtidos comercialmente a partir da Alza Corporation e NovaPharmaceuticals, Inc. As suspensões lipossômicas (incluindo os Iipossomosalvejados para células infectadas com anticorpos monoclonais paraantígenos virais) podem também ser usadas como veículosfarmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo commétodos conhecidos para aqueles versados na técnica, por exemplo,conforme descrito na Patente U.S. N- 4.522.811.

É vantajoso formular as composições orais ou parenterais naforma de unidade de dosagem pela facilidade de administração euniformidade da dosagem. A forma de unidade de dosagem, como usadaneste documento, refere-se às unidades fisicamente distintas, adequadascomo dosagens unitárias para os pacientes a serem tratados; cada unidadecontendo uma quantidade predeterminada de composto ativo, calculadapara produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículofarmacêutico selecionado.

A toxicidade e a eficácia terapêutica dos compostos descritosneste documento podem ser determinadas por procedimentosfarmacêuticos, conhecidos na técnica, por exemplo, em culturas de célulasou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letalpara 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente efetiva em 50%da população). A razão de doses entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é oíndice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. Oscompostos que exibem altos índices terapêuticos são preferidos. Emborapossam ser usados compostos que exibem efeitos colaterais tóxicos, deveser tomado cuidado para projetar um sistema de distribuição que alveje taiscompostos para o local do tecido-afetado, para minimizar o dano potencialàs células não infectadas e, desse modo, reduzir os efeitos colaterais.

Os dados obtidos a partir dos ensaios de culturas de células edos estudos com animais podem ser usados na formulação de uma faixa dedosagem para uso em seres humanos. A dosagem de tais compostos situa-se preferivelmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes queincluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variardentro desta faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da rotade administração utilizada. Para qualquer composto usado no método dainvenção, a dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente apartir dos ensaios de culturas de células. Uma dose pode ser formulada emmodelos de animais para atingir uma faixa de concentrações circulantes noplasma que inclui a IC50 (i.e., a concentração do composto de teste queatinge uma inibição semimáxima dos sintomas), como determinada nacultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar maisexatamente as doses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma podemser medidos, por exemplo, através de cromatografia desempenho.

A invenção também refere-se a um método de preparar ummedicamento para uso no tratamento de um paciente, por exemplo, para ainfecção por HCV. Tais medicamentos podem também ser usados paratratamento profilático de um paciente correndo o risco de, ou suspeito de ter,uma infecção por HCV.

Kits

A invenção proporciona kits compreendendo um pequeno RNAinterferente, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades,os kits também incluem instruções para uso nos métodos para inibir aexpressão do gene viral e/ou nos métodos para o tratamento de umainfecção viral em um mamífero, descritos neste documento. As instruçõespodem ser fornecidas na forma impressa ou na forma de um meio eletrônico,tal como um disquete, CD, ou DVD, ou na forma de um endereço no site darede, onde tais instruções possam ser obtidas.

Em algumas modalidades, os kits incluem uma composiçãofarmacêutica da invenção, por exemplo, incluindo pelo menos uma dose deunidade de pelo menos um pequeno RNA interferente, tal como um shRNAou um siRNA, e instruções proporcionando informação para um provedor decuidados de saúde com relação ao uso para tratar ou prevenir uma infecçãoviral. O pequeno RNA interferente é freqüentemente incluído como umacomposição farmacêutica aquosa estéril ou composição de pós secos (porexemplo, liofilizados).

Um acondicionamento adequado é proporcionado. Conformeusado neste documento, o "acondicionamento" refere-se a uma matriz sólidaou material costumeiramente usado em um sistema e capaz de manterdentro de limites fixos uma composição da invenção adequada para aadministração a um indivíduo. Tais materiais incluem õs frascos de vidro eplástico (por exemplo, polietileno, polipropileno, e policarbonato), os frascospequenos, o papel, o plástico, e os envelopes laminados de folha plástica, esimilares. Se as técnicas de esterilização por feixes de elétrons foremempregadas, os acondicionamentos devem ter densidade suficientementebaixa para permitir a esterilização dos conteúdos.

Os kits podem também adicionalmente incluir equipamento paraa administração de uma composição farmacêutica da invenção, tal como,por exemplo, seringas ou equipamento para administração intravenosa, e/ouuma solução estéril, por exemplo, um diluente, tal como a água, a soluçãosalina, ou uma solução de dextrose, para preparar uma composição de póssecos (por exemplo, liofilizados) para a administração.

Tabela 1

Listagem das Seqüências de Aivejamento Divulgadas no Pedido quepodem ser Incorporadas no shRNA óu no siRNA e Exemplos de taisshRNAs e siRNAs

<table>table see original document page 38</column></row><table>continuação

<table>table see original document page 39</column></row><table>

As Figuras 16A-B ilustram exemplos de shRNAs contendoseqüência alvejando o IRES do HCV1 e testados usando os métodosdescritos neste documento.

EXEMPLOS

A invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos a seguir.Os exemplos são proporcionados para propósitos ilustrativos somente. Elesnão são para serem interpretados como limitando o escopo ou o conteúdoda invenção de modo algum.

Exemplo 1: Projeto e Construção de Cassetes de Expressão de shRNA,Reações de Transcrição com T7, e Ensaios do Gene Relator

Os oligonucleotídeos quimicamente sintetizados foram obtidosde IDT (Coralville, IA), suspensos novamente em água sem RNase epirogênio (Biowhittaker), e anelados conforme descrito abaixo. Os pares deoligonucleotídeos a seguir, para preparar o shRNA, contêm um elementopromotor T7 (duplamente sublinhado), a seqüência de IRES do HCV comsentido e anti-sentido e uma estrutura de laço de microRNA miR-23 (descritafacilitar a localização citoplásmica [21, 22]).

T7-HCVa-wt fw:

5'-taatacaactcactataaaaaacacaaatcctaaacctca

aagaCTTCCTGTCAtctttgaggtttaggattçgtgctcTT-3' (SEQ ID NO:1);

T7-HCVa-wt rev:5'-AAgagcacgaatcctaaaçctcaaagaTGACAGGAAGtctttgaggtttaggattçgtgct ccctataataaatcatatta-3'(SEQ ID N0:2)

(Seqüência de promotor T7 duplamente sublinhada). Ostranscritos de T7 para shRNA HCVa-mut eram idênticos, com a exceção queas mudanças de nucleotídeos (G->C e C-»G) foram incorporadas nosoligonucleotídeos sintetizados nos resíduos unicamente sublinhados.

O shRNA HCVa-wt (Figura 1B) foi projetado para alvejar aregião 344-374 sobre o IRES do HCV; o HCVb-wt foi projetado para alvejar aregião 299-323 (Figura 1C); o HCVc-wt foi projetado para alvejar a região318-342 (Figura 1C); e o HCVd-wt foi projetado para alvejar a região 350-374 (Figura 1CJ.

Os shRNAs número1-7 (posições de alvejamento 344-362,345,363, 346-364, 347-365, 348-366, 349-367, 350-368 sobre o IRES doHCV; Vide a Figura 4A, que representa as seqüências de reconhecimentovirais de 19 pares de bases) foram transcritos in vitro usando o kitMEGAscript® (Ambion) e continham as mesmas seqüências de laço e osressaltos em 5', 3' que o shRNA HCVa-wt. Os siRNAs número1-7 (vide aFigura 4A, que representa as seqüências de reconhecimento virais de 19pares de bases) foram quimicamente sintetizados em Dharmacon (Lafayette,CO) e continham ressaltos 3'-UU sobre as fitas tanto com sentido quantoanti-sentido.

O par de oligonucleotídeos usado para preparar o shRNA decontrole (que alveja o fator de necrose tumoral alfa) é 229-5'-TAATACGACTCACTATAGGGGCGGTGCCTATGTCTCAGCCTCTTCTCACTTCCTGTCATGAGAAGAGGCTGAGACATAGGCACCGCC TT-3' (SEQ IDNO:3) e 229-3'-AAGGCG GTGCCTATGTC TCAGCC TCT TCTCATGACAGGAAG TGAGAAGAGGCTGAGACATAGGCACCCCTATAGTGAGTCGTATTA-5' (SEQ ID NO:4).

Construção de vetor de expressão de shRNA de pol III U6 - projeto devetores de expressão de shRNA em grampo pequeno

Os pares de oligonucleotídeos foram incubados juntos, a 95°C,por dois minutos, no tampão de RNA polimerase (por exemplo, 120 μΙ decada oligonucleotídeo a 100 μΜ em 60 μΙ de 5X tampão de anelamento(Promega; 1X = Tris-HCI a 10 mM (pH 7,5), NaCI a 50 mM) e lentamenteresfriados (anelados) durante 1 hora, até menos do que 40-C. Osoligonucleotídeos foram projetados para proporcionar ressaltos de 4 basespara a clonagem rápida no plasmídio pCRII-U6 digerido com BbsMBamM(os sítios de reconhecimento de Bbsl e BamHI ou os ressaltos estãosublinhados nas seqüências de oligonucleotídeos). O plasmídio deexpressão de pol Ill pCRII-U6 foi preparado por subclonagem do produto daPCR obtido a partir do DNA genômico HT-1080 humano usando osiniciadores e huU6-5' ATCGATCCCCAGTGGAAAGACGCGCAG (SEQ ID

NO:5) e huU6-3'-GGATCCGAATTCGAAGACCACGGTGTTTCGTCCTTTCCACAA-5' (SEQ IDNO:6) [23] no vetor pCRIl (Invitrogen), usando o kit de clonagem de TA(Invitrogen). O cassete consistindo nos oligonucleotídeos anelados(codificando o shRNA do IRES do HCV) foi ligado no plasmídio pCRII-U6digerido com BbsMBamW. O shRNA expresso contém uma estrutura delaço de microRNA miR-23 para facilitar a localização citoplásmica [21, 22].As construções finais de pCRII-U6 foram confirmadas por seqüenciamento.Os pares de iniciadores usados foram: pHCVa-wt 5'-ACCGGAGCACGAATCCTAAACCTCAAAGA CTTCCTGTCATCTTTGAGGTTTAGGATTÇGTGCTC Illlll G-31 (SEQ ID NO:7) e 5'-GATCCAAAAAA GAGCACGAATCCTAAACCTCAAAGA TGACAGGAAGTCTTTGAGGTTTAGGATTÇGTGCTC-S1 (SEQ ID NO:8). Osoligonucleotídeos contendo as mudanças apropriadas das seqüências nosresíduos sublinhados (vide acima) foram usados para gerar o pCRIl-U6/HCVa-mut (mutação dupla), o HCVsnpI (única alteração no lado de 5') eo HCVsnp2 (única alteração na extremidade de 3'), conforme representadona Figura 1B e descrito acima. O pCRII-U6/229 de controle foi preparado emum modo similar usando os oligonucleotídeos 5'-ACCGGGCGGTGCCTATGTCTCAGCCTCTTCTCACTTCCTGTCATGAGAAGAGGCTGAGACATAGGCACCGCCTTTTTT-31 (SEQ ID NO:9) e 3'-GATCAAAAAAGGCGGTGCCTATGTCTCAGCCTCTTCTCATGACAGGAAGTGAGAAGAGGCTGAGACATAGGCACCGCC-5' (SEQ ID NO: 10).Reação de transcrição com T7

Os pares de oligonucleotídeos foram incubados a 95eC, por doisminutos, no tampão de RNA polimerase (por exemplo, 120 μΙ de cadaoligonucleotídeo a 100 μΜ em 60 μΙ de 5X tampão de transcrição(Promega)), e lentamente resfriados (anelados) durante 1 hora, até menosdo que 409C. O shRNA foi transcrito a 429C, por quatro horas, a partir de 5μΜ do molde de DNA de fita dupla anelado resultante, usando o kit detranscrição AmpliScribe® T7 Flash (Epicentre Technologies), seguido porpurificação sobre uma coluna de rotação de filtração em gel (Microspin® G-50, Amersham Biosciences) que tinha sido inteiramente lavada três vezescom solução de salina tamporiada com fosfato (PBS), para remover oconservante.siRNAs

Os siRNAs foram preparados por anelamento de fitas de RNAcomplementares sintetizadas quimicamente (Dharmacon), cada umacontendo a seqüência de reconhecimento apropriada mais uma extensãoUU (de ressalto) sobre a extremidade de 3'.

Translecções e ensaios do gene relator

As células humanas 293FT (Invitrogen) e Huh7 (American TypeCulture Collection (ATCC), Manassas, VA) foram mantidas em DMEM(Biowhittaker®) com 10% de soro bovino fetal (HyCIone), suplementado comL-glutamina a 2 mM e piruvato de sódio a 1 mM. No dia antes datransfecção, as células foram semeadas a 1,7 χ 105 células/cavidade emuma placa com 24 cavidades, resultando em aproximadamente 80% deconfluência de células na hora da transfecção. As células foramtransfectadas com Lipofectamine® 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindoas instruções do fabricante. Para os experimentos de inibição, as células293FT ou Huh7 foram co-transfectadas (em triplicata) com 40 ng deconstructo de de relator de Iuciferase dupla (renilla e vaga-lume)pCDNA3/IRES do HCV, 50 ng de plasmídio de controle pSEAP2 (BDBiosciences Clontech, como controles da transfecção) e as quantidadesindicadas de shRNA gerado com T7 (quantidade típica 1 pmol) ouconstrução de expressão de shRNA pCRII-U6 (710 ng). O plasmídio pUC18compensatório foi adicionado à mistura de transfecção para dar umaconcentração final de 800 ng de ácido nucléico total por transfecção.Quarenta e oito horas mais tarde, o sobrenadante foi removido, aquecido a659C por 15-30 minutos, e 5-10 μΙ do sobrenadante foram adicionados a 150μl de sistema de substrato líquido de fosfato de p-nitrofenila (pNPP, Sigma).Após uma incubação por 30-60 minutos na temperatura ambiente, asamostras foram lidas (405 nm) em uma leitora de microplacas Thermomaxda Molecular Devices e quantificadas usando o software SOFTmax(Molecular Devices). As células restantes foram Iisadas e a atividade daluciferase medida usando o sistema de ensaio de Relator de LuciferaseDupla (Promega) e o luminômetro MicroLumat LB 96 P (Berthold).

Camundongos

Os camundongos fêmeas de seis semanas de idade Balb/cforam obtidos da área de animais da Stanford University. Os animais foramtratados de acordo com as NIH Guidelines for Animal Care (OrientaçõesNIH para o Cuidado do Animal") e as Guidelines of Stanford University("Orientações da Universidade de Stanford").

Injeções hidrodinâmicas dos camundongos e formação de imagem invivo

As injeções hidrodinâmicas nas veias dos rabos foram efetuadasconforme descrito por McCaffrey e colaboradores, com pequenasmodificações, incluindo a omissão de RNasina [24]. Um volume total de 1,8ml de solução salina tamponada com fosfato contendo inibidor (RNA ouplasmídio), 10 μg de plasmídio de Luc Dupla pHCV, e 2 μg de plasmídio decontrole pSEAP2 (BD Biosciences Clontech, contém o promotor inicial deSV40), foi injetado de modo constante na veia do rabo do camundongoaproximadamente cinco segundos (N = 4-6 animais por grupo). Nos temposindicados, 100 μΙ de Iuciferina a 30 mg/ml foram injetados de modointraperitoneal. Dez minutos após a injeção, os camundongos anestesiadosvivos foram analisados usando o sistema de formação de imagem IVIS7(Xenogen Corp., Alameda, CA) e os dados de emissão de luz resultantesquantificados usando o software Livinglmage (Xenogen). Os valores brutossão descritos como luz detectada relativa por minuto e os erros padrões damédia para cada grupo (N = 4-5 animais) são mostrados.Ensaio de fosfatase alcalina secretada (SEAP)

No dia 5, os camundongos foram sangrados através da veiaretrorbital do olho. O soro foi separado das células sangüíneas pormicrocentrifugação, aquecido a 65QC por 30 minutos para inativar os fosfatosalcalinos endógenos, e 5-10 μΙ do soro foram adicionados a-150 μΙ dosistema de substrato líquido de p-NPP (vide acima). Após uma incubaçãopor 30-60 minutos na temperatura ambiente, as amostras foram lidas (405nm) e quantificadas conforme descrito acima.

Exemplo 2: Inibição pelo shRNA da Expressão do Gene Mediada porIRES do HCV em Células de Cultura de Tecidos Humanas

Neste estudo, os pequenos RNAs interferentes (shRNAs esiRNAs), projetados e construídos como no Exemplo 1 para alvejar umaregião conservada do IRES da hepatite C, foram testados quanto à suacapacidade de inibir a expressão do relator mediada por IRES do HCV emcélulas de cultura de tecidos humanas.

A Figura 1A mostra o sítio-alvo do IRES do HCV (painel A), bemcomo o shRNA do HCV resultante da transcrição com T7 de um moldepreparado a partir de oligonucleotídeos hibridizados contendo umaseqüência de promotor T7 e o alvo de IRES do HCV (Figura 1B). Osresíduos sublinhados são aqueles que foram trocados para gerar os shRNAsde HCV mutantes. Os shRNAs contêm uma estrutura de laço de microRNAmir-23 que foi anteriormente sugerida facilitar a localização citoplásmica [21,22] e um tronco de RNA de 25 pares de bases com dois nucleotídeos nasextremidades 5' (duas guaninas) e 3' (duas uridinas) que pode tambémhibridizar, contudo, emparelhamentos de bases G:U que não de Watson-Crick. Para os shRNAs distribuídos por vetor, os oligonucleotídeos desobreposição foram subclonados em um vetor de expressão de polll (pCRIl-U6, vide o Exemplo 1).

Três outros shRNAs foram também projetados com o mesmocomprimento do tronco e seqüência de laço que alvejam posições próximasno Domínio IV do IRES do HCV (Figura 1C). O shRNA HCVb-wt alveja umaregião altamente estruturada (usada como controle negativo, para comparara eficiência), enquanto os shRNA HCVc-wt e HCVd-wt alvejam regiões quesão mais 'acessíveis' de acordo com os estudos bioquímicos de pegadas(Figura 1D; Brown et al., Nucleic Acids Res., 1992, 20:5041-5). Todos osRNAs foram transcritos in vitro a partir de moldes de dsDNA contendo umpromotor T7, similar ao shRNA HCVa-wt.

Para testar a eficácia dos shRNAs do HCV em inibir a expressãodo gene mediada por IRES do HCV1 as células 293FT ou Huh7 dehepatócitos humanas foram co-transfectadas com o plasmídio de expressãode Iuciferase dupla pCDNA3/IRES do HCV, o plasmídio de expressão defosfatasè alcalinã secretãda (pSEAP2, para controlar a eficiência detransfecção), bem como os shRNAs sintetizados in vitro ou alternativamente,os vetores de expressão de pol Ill contendo os cassetes de shRNAcorrespondentes.

Conforme visto na Figura 1F, os shRNA tanto HCVa-wt quantoHCVd-wt, que alvejam a região do IRES imediatamente a jusante do sítio deiniciação da tradução, de AUG (posições 344-368 e 350-374,respectivamente), inibem fortemente a expressão de fLuc mediada por IRESdo HCV nas células 293FT humanas. O HCVc-wt (alvejando 318-342)mostrou inibição moderada e o HCVb-wt (299-323) mostrou pouca, sealguma, atividade, conforme esperado. Assim, a triagem preliminar revelouum shRNA potente, o HCVa-wt, que foi escolhido para os estudosdetalhados adicionais.

Especificidade e potência de inibição da expressão do gene mediada porIRES do HCV pelos shRNAs em células 293FT

Para testar adicionalmente a inibição da expressão do genedirigida pelo IRES do HCV, as células 293FT foram co-transfectadas com osplasmídios de expressão de relator de Iuciferase dupla e SEAP, bem como 1pmol dos shRNAs transcritos in vitro. O plasmídio-álvo era o relator deIuciferase dupla pCDNA3/IRES do HCV (IRES do HCV1 como mostrado naFigura 1E). O plasmídio pUC18 foi adicionado à mistura de transfecção paradar uma concentração final de ácidos nucléicos totais de 800 ng portransfecção por cavidade (placas de cultura de tecidos com 24 cavidades).Quarenta e oito horas mais tarde, o sobrenadante foi removido para aanálise da SEAP, então as células foram Iisadas e a atividade da Iuciferasede vaga-lume e renilla (não mostrado) medida conforme descrito no Exemplo1. As atividades da Iuciferase de vaga-lume e da SEAP foram normalizadaspara 100. Os resultados são mostrados na Figura 2A.

O shRNA HCVa-wt alvejando a região do IRES imediatamente ajusante do sítio de iniciação da tradução de AUG inibiu fortemente aexpressão da fLuc mediada por IRES do HCV em ambas as linhagenscelulares 293FT (Figura 2) e Huh7 de hepatócitos (Figura 3B) humanas.Pouca ou nenhuma inibição foi observada usando um shRNA mutante(HCVa-mut) contendo duas alterações no emparelhamento do grampo deRNA (quanto à posição de combinação inadequada, vide a Figura 1B) ou umshRNA de TNF (229) não relacionado. O shRNA de TNF 229 é altamenteefetivo na inibição da expressão de TNF (Seyhan et al., RNA, 2005, 11:837-846), sugerindo que este shRNA é utilizado efetivamente pelo dispositivo deRNAi. As alterações de nucleotídeos individuais na região de grampo, naposição a montante ou a jusante (SNP1 e SNP2, respectivamente; vide aFigura 2C), tiveram um efeito parcial.

Pouca ou nenhuma inibição foi observada quando o shRNA deHCV foi alvejado para um constructo de Iuciferase dupla similar, na qual oIRES do HCV foi substituído pelo IRES do vírus de encefalomiocardite(EMCV) (Figuras 2B e 3B). Assim, os dados da Figura 2B ilustram que oshRNA HCVa-wt não inibe um alvo similar não tendo o IRES do HCV. Nesteexperimento, as células foram transfectadas como para a Figura 2A, excetoque o relator de Iuciferase dupla pCDNA3/EMCV (IRES do EMCV) foi usadocomo o alvo no lugar do pCDNA3/HCV. Estes dados são apresentados naFigura 2B como atividade da Iuciferase dividida pela atividade da SEAPnormalizada para 100.

Para confirmar que os shRNAs estavam atuando pordegradação de seu mRNA alvo, uma análise por transferência Northern foiefetuada (Figura 2F). Quantidades iguais de RNA total, isolado das célulastransfectadas com nenhum inibidor ou com os shRNAs HCVa-wt,HCVmutI/2, ou 229, foram separadas por eletroforese em gel. O RNAseparado foi transferido para uma membrana e hibridizado com sondas decDNA radiomarcadas, específicas para fLuc, SEAP e fator de alongamento1a (EF1A). O shRNA HCVa-wt (caminho 3) inibiu especificamente o acúmulode mRNA de fLuc (63% de inibição em comparação com o shRNA 229(caminho 2) quando corrigido para os níveis de mRNA de SEAP e EF1A;nenhuma inibição foi observada para o HCVa-mut1/2) (comparar oscaminhos 3 e 4) após a quantificação pelo phosphorimager. Estes dadosdemonstram que os shRNAs estavam degradando o mRNA alvo.

Os experimentos de resposta à dose mostraram quê o shRNAHCVa-wt inibiu efetivamente a expressão do gene dependente de IRES doHCV a 0,3 nM nas células 293FT (96 por cento de inibição, vide a Figura 2D)e 0,1 nM nas células Huh7 (75 por cento de inibição, vide a Figura 3A).

Para investigar adicionalmente os efeitos das seqüências locaissobre a potência, sete shRNAs de 19 bp transcritos in vitro e o siRNA de 19pares de bases- sintético correspondente, alvejando todas as posições- possíveis dentro do sítio de 31 pares de bases de HCVa (344-374; Figura4A), foram testados quanto à atividade inibitória. Um siRNA sintético de 25pares de bases, correspondendo ao shRNA HCVa-wt foi também testado.Todos eles exibiram um alto nível de atividade (Figura 4B). Os mais potentesforam as versões siRNA e shRNA de HCVa1 bem como o siRNA número3,que foi efetivo a 1 nM (>90% de inibição, Figura 4B) e 0,1 nM (cerca de 90%de inibição, Figura 4C). Assim, os shRNAs e siRNAs de 19-25 pares debases, projetados para alvejar a região 344-374 sobre IRES do HCV, sãopotentes, com algumas diferenças locais.Exemplo 3: Inibição pelo shRNA da Expressão do Gene Mediada peloIRES do HCV em um Sistema de Modelo de Camundonqo

A capacidade do shRNA do HCV e do plasmídio de expressãode shRNA do HCV de inibir a expressão do gene-alvo foi estendida para umsistema de modelo de camundongo usando injeção hidrodinâmica paradistribuir os ácidos nucléicos no fígado do camundongo. A Figura 5 mostraos resultados de injetar um grande volume de PBS (1,8 ml) contendo Lucdupla pHCV, pSEAP2, e shRNAs (excesso de 10 vezes sobre o alvo emuma base de massa de shRNA ou vetores de expressão de pol Illexpressando os shRNAs) nas veias dos rabos dos camundongos (n = 4-5camundongos). Nos pontos de tempo na Figura 5B, a Iuciferina foi injetadade modo intraperitoneal e os camundongos foram representados porimagens com uma câmera CCD esfriada, de alta sensibilidade (a Figura 5Amostra os camundongos representativos escolhidos a partir de cada grupo(4-5 camundongos por grupo) no ponto de tempo de 84 horas). Em todos ospontos de tempo selecionados, o shRNA do HCV fortemente inibiu aexpressão da Iuciferase variando de inibição de 98% (ponto de tempo de 84horas) até 94% (ponto de tempo de 48 horas), em comparação com oscamundongos injetados com pUC18 no lugar do inibidor de shRNA. OsshRNAs mutantes (mut) ou de controle (229) tiveram pouco ou nenhumefeito. Deve ser observado que a atividade da luciférase diminui com otempo, possivelmente devido à perda de silenciamento de DNA ou promotor[8] e que os dados são normalizados dentro de cada ponto de tempo (vide adescrição da Figura 5 acima).

A Figura 6 mostra uma comparação da atividade inibitória doshRNA HCVa-wt com um oligômero de fosforamidita morfolino que foianteriormente mostrado alvejar efetivamente este mesmo sítio [8]. Tanto oshRNA HCVa-wt quanto os oligômeros de morfolino bloquearamefetivamente a expressão da Iuciferase em todos os pontos de tempotestados. Os dados são mostrados para o ponto de tempo de 48 horas, ondea inibição foi 99,95 e 99,88 por cento, respectivamente, para os inibidores deshRNA HCVa-wt e morfolino.Exemplo 4: Inibição do Vírus da Floresta de Semliki (SFV) usando osshRNAs

O SFV tem sido usado como um sistema de modelo para osvírus de RNA de fita positiva mais virulentos. Para examinar o efeito inibitóriodo RNAi sobre o crescimento do SFV1 os shRNAs alvejando quatro genes deSFV (nsp-1, nsp-2 e nsp-4, e capsídio) e um controle combinadoinadequadamente para o sítio de nsp-4 foram gerados e expressos a partirde um promotor U6. Foi testada a sua capacidade de inibir a proliferação doSFV-A7-EGFP, uma versão da cepa de SFV hábil na replicação SFV-A7 queexpressa um gene relator de eGFP [49]. Uma redução modesta(aproximadamente 35%) da replicação do SFV-GFP foi vista com osshRNAs alvejando o nsp-1 (Figura 7), porém não as regiões de codificaçãode nsp-2, nsp-4 ou capsídio, nem com o siRNA combinadoinadequadamente (não mostrado).

Um sítio dentro da região de codificação do capsídio, que foianteriormente mostrado ser efetivo no vírus de Sindbis [50], não foi efetivono SFV. A homologia das seqüências de Sindbis-SFV neste sítio é somente77%. O SFV é um vírus que cresce muito rapidamente, produzindo até200.000 RNAs citoplásmicos durante o seu ciclo infeccioso. Para vide se ascélulas poderiam ser mais bem protegidas de um vírus de crescimento maislento, os efeitos destes siRNAs sobre uma cepa deficiente na replicação deSFV-GFP foram testados em dois experimentos separados. A Figura 8mostra que os shRNAs expressos a partir de U6 alvejando esta cepa de SFVpodem reduzir a expressão viral em >70% durante um período de tempo deaté cinco dias. Este efeito foi visto com os siRNAs alvejando os genes nãoestruturais nsp-1, nsp-2, e nsp-4, bem como um siRNA com umacombinação inadequada para nsp-4, porém não para o gene de capsídio(que está ausente neste vírus com defeito) ou outros controles (Figura 8).Observar que o comprimento da seqüência alvejada pelos shRNAs é 29nucleotídeos e a combinação inadequada única usada no shRNA decombinação inadequada de nsp-4 é aparentemente não destruidora para oefeito do RNAi. A ampla variação na eficácia dos diversos shRNAs ressalta aimportância de uma abordagem de biblioteca para encontrar os melhoressiRNAs e shRNAs quando lidando com os vírus que rapidamente sereplicam e são altamente mutagênicos, tais como o SFV.

Os experimentos de resposta à dose foram efetuados paraexaminar a inibição de um sistema de replicon HCV nas células Huh7 peloshRNA HCVa-wt e pelo shRNA HCVa-mut, bem como um shRNA decontrole não específico (229). A atividade antiviral dos compostos de testefoi testada na linhagem celular que replica estavelmente o RNA do HCV,AVA5, derivada por transfecção da linhagem celular de hepatoblastomahumana, Huh7 (Blight, et al., Science, 2000, 290:1972). Os inibidores à basede RNA foram co-transfectados com o plasmídio de expressão de DsRed emculturas que eram aproximadamente 80 por cento confluentes. Os níveis deRNA do HCV foram avaliados 48 horas após a transfecção, usando ahibridização de manchas de pontos. Os ensaios foram conduzidos emculturas em triplicata. Um total de 4-6 culturas de controle não tratadas, eculturas em triplicata tratadas com 10, 3, e 1 lU/ml de α-interferon (antiviralativo sem nenhuma citotoxicidade), e 100, 10, e 1 uM de ribavirina (nenhumaatividade antiviral e citotóxica), serviu como controles antivirais positivos e detoxicidade. A eficiência da transfecção foi estimada por microscopia defluorescência (expressão de DsRed). Ambos os níveis de HCV e RNA de b-actina nas culturas tratadas em triplicata foram determinados como umaporcentagem dos níveis médios de RNA detectado nas culturas não tratadas(total de 6). Os níveis de RNA de beta-actina são usados tanto como umindicador da toxicidade, quanto para normalizar a quantidade de RNA celularem cada amostra. Um nível de 30% ou menos de RNA do HCV (em relaçãoàs culturas de controle) é considerado ser um efeito antiviral positivo, e umnível de 50% ou menos de RNA de b-actina (em relação às culturas decontrole) é considerado ser um efeito citotóxico. A citotoxicidade é medidausando um ensaio de captação de corante vermelho neutro estabelecido(Korba, Β. E. e J. L. Gerin (1992) Use of a standardized cell culture assay todetermine activities of nucleoside analogs against hepatitis B virus replicon{Antivir. Res. 19:55-70).Inibição de um sistema de replicon HCV nas células Huh7 peloshRNA HCVa-wt e pelo shRNA HCVa-mut, bem como um shRNA decontrole irrelevante (229); resposta à dose. A atividade antiviral doscompostos de teste foi testada na linhagem celular que replica estavelmenteo RNA do HCV1 AVA5, derivada por transfecção da linhagem celular dehepatoblastoma humana, Huh7 (Blight, et al., Science, 2000, 290:1972). Osinibidores à base de RNA foram co-transfectados com o plasmídio deexpressão de DsRed em culturas -80 por cento confluentes e os níveis deRNA do HCV foram avaliados 48 horas após a transfecção, usando ahibridização de manchas de pontos. Os ensaios foram conduzidos emculturas em triplicata. Um total de 4-6 culturas de controle não tratadas, eculturas em triplicata tratadas com 10, 3, e 1 lU/ml de a-interferon (antiviralativo sem nenhuma citotoxicidade), e 100, 10, e 1 uM de ribavirina (nenhumaatividade antiviral e citotóxica), serviu como controles antivirais positivos e detoxicidade. A eficiência da transfecção foi estimada por microscopia defluorescência (expressão de DsRed). Ambos os níveis de HCV e RNA debeta-actina nas culturas tratadas em triplicata foram determinados comouma porcentagem dos níveis médios de RNA detectado nas culturas nãotratadas (total de 6). Os níveis de RNA de beta actina são usados tantocomo um indicador da toxicidade, quanto para normalizar a quantidade deRNA celular em cada amostra. Um nível de 30% ou menos de RNA do HCV(era relação-às culturas de controle)-é-considerado ser um efeito antiviralpositivo, e um nível de 50% ou menos de RNA de beta-actina (em relação àsculturas de controle) é considerado ser um efeito citotóxico. A citotoxicidadeé medida usando um ensaio de captação de corante vermelho neutroestabelecido (Korba et al., Antiviral Res., 1992, 19:55-70). Use of astandardized cell culture assay to determine activities of nucleoside analogsagainst hepatitis B virus replicon (Korba et al., 1992 supra).

Exemplo 5: Identificação dos shRNAs que Inibem a Expressão do GeneDependente do IRES do HCV em Células de Cultura de Tecidos

Investigou-se a capacidade dos pequenos RNAs em grampo(shRNAs) transcritos in vitro de inibir a expressão do gene dependente dosítio de entrada interno do ribossomo do vírus da hepatite Ç (IRES do HCV),nas células cultivadas. Conforme descrito supra, um shRNA de 25 pares debases, HCVa-wt, que alveja a extremidade 3' do IRES do HCV, próxima aosítio de iniciação da tradução de AUG (Tabela 2), foi verificado ser efetivopara romper a expressão do HCV. Para avaliar a capacidade dosconstructos de shRNAs co-transfectados de interferir com a função do IRES,utilizou-se um constructo de relator (plasmídio de Luciferase Dupla pHCV),na qual a expressão da Iuciferase de vaga-lume (fLuc) é dependente doIRES do HCV (Figura 1; Wang et al., Mol. Ther., 2005, 12:562-568). Nestesexperimentos, as células 293FT foram cultivadas e transfectadas com umconstructo de relator e o HCVa-wt ou uma das outras seqüências de teste,conforme descrito em Wang et al., 2005, supra.

Verificou-se que em uma concentração de 1 nM, o HCVa-wtcausou 90% de inibição da expressão da Iuciferase dependente do IRES doHCV, nas células 293FT (Wang et al., 2005, supra). Nos experimentossubseqüentes, 26 shRNAs adicionais alvejando diversas regiões do IRES doHCV foram projetados e testados (Figura 10, Figuras 16A-B; 3 dos 26 eramduplicatas daqueles descritos acima (HCVb, HCVc, HCVd-wt); 23 eramnovas seqüências) para identificar inibidores adicionais do HCV. O objetivoera identificar shRNAs que pudessem ser usados em combinação com oHCVa-wt, ,tornando mais difícil para o vírus desenvolver resistência por-mutação do sítio-alvo de HCVa-wt, ou como alternativas para o HCVa-wt. OsshRNAs a serem testados foram escolhidos para evitar regiões que variamentre diferentes genótipos do HCV. Algumas seqüências de teste foramselecionadas usando o algoritmo disponível em, por exemplo,jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/, e outras seqüências de teste queintencionalmente alvejaram seqüências do IRES do HCV que, devido ao seuteor de CG e outras características, não seriam recomendadas pela maioriados algoritmos, não foram consideradas, tais como as regiões ricas em GCou altamente estruturadas. Os shRNAs foram gerados por transcrição in vitroa partir de moldes de dsDNA usando a T7 RNA polimerase e, para promovera eficiência da transcrição, começaram com a seqüência 5'-pppGGG. Estaseqüência em 5' formou um ressalto de dois a três nucleotídeos, ocomprimento exato dependendo de se o sítio-alvo contém um ou maisresíduos de guanosina em sua extremidade de 5' (vide as Figuras 16A-B).Se o último nucleotídeo da fita com sentido de RNA correspondendo a umaseqüência-alvo fosse 1G', somente dois Gs mais tinham de ser adicionadospara a transcrição eficiente, e aqueles Gs são de fita simples sobre aextremidade de 5' do shRNA, não complementares ao alvo. Se o últimonucleotídeo da fita com sentido de shRNA correspondendo ao alvo, nãofosse um G, então para a transcrição eficiente nos sistemas de teste, três Gstinham de ser adicionados que não fossem complementares ao alvo. Todosos shRNAs testados neste grupo de experimentos tinham um comprimentode tronco de duplex de 21-25 pares de bases e um laço de 10 nucleotídeosderivado do microRNA-23, conforme descrito para o HCVa-wt.

Todos os shRNAs (total de 27, incluindo o HCVa-wt) foramtestados quanto à atividade, conforme descrito em Wang, 2005.Resumidamente, as células 293FT humanas foram co-transfectadas com oplasmídio de expressão de Relator de Luciferase Dupla® pHCV (Promega,Madison, Wl), e um plasmídio de expressão de fosfatase alcalina secretada(pSEAP2, Clontech, Mountain View, CA, para controlar a eficiência datransfecção e os possíveis efeitos fora de propósito), e o shRNA. Osresultados são mostrados na Figura 10. Os níveis de SEAP estavamuniformes em todas as amostras, indicando a transfecção eficiente e aausência de efeitos inibitórios ou tóxicos não específicos, nas concentraçõesde shRNA de 1 nM a 5 nM. A maioria dos shRNAs mostrou somenteatividade moderada (menos do que 60% de inibição a 1 nM). Sem seenvolver com qualquer teoria particular, este efeito é provável porque asáreas alvejadas sobre o IRES são altamente estruturadas. As exceçõesforam o HCVd-wt, o sh37, o sh39, o hcv17, que alvejam as posições doIRES próximas ao sítio do HCVa-wt. Estes shRNAs causaram 85-90% deinibição da expressão do gene dependente do IRES do HCV naconcentração de 1 nM. A baixa concentração de shRNA de 1 nM foiescolhida para permitir a fácil identificação dos shRNAs hiperfuncionais. Sea triagem fosse efetuada em shRNA a 10 nM, mais shRNAs mostrariam altaatividade; entretanto, uma inibição não específica significativa foi vista nestaconcentração em alguns casos. Assim, a triagem revelou uma região de 44nucleotídeos (posições 331-374 sobre o IRES do HCV) onde cinco shRNAsde sobreposição mostram alta atividade.

Exemplo 6: Efeito das Combinações Inadequadas de Bases Individuaissobre a Atividade do shRNA

É desejável que um tratamento para HCV seja efetivo contra oHCV mutado. Para determinar o desempenho dos RNAs descritos aquineste aspecto (por exemplo, os shRNAs alvejando o IRES do HCV), e paraabordar se os efeitos fora de propósito são problemáticos, testou-se asensibilidade do shRNA selecionado dirigido contra o IRES do HCV àsmutações pontuais na seqüência-alvo. Para estes experimentos, umamutação de C340->U foi introduzida no IRES do HCV usando o Kit deMutagênese Dirigida para õ Sítio QuikChangé® Il (Stratageney La Jolla, CA).Dos 27 shRNAs que foram testados nove alvejaram a região mutada (Figura11), portanto, a sua atividade poderia teoricamente ser afetada por estamutação. Todos estes shRNA foram testados com a versão mutada dopHCV, juntamente com os shRNAs selecionados alvejando outros sítioscomo controles. Para todos os shRNAs testados, a atividade foi verificadanão ser afetada ou ser ligeiramente diminuída,1 comparada com a atividadedo alvo perfeitamente-unido,-original (Figura-10).-

Entretanto, no sistema de replicon, os shRNAs foramsurpreendentemente verificados serem sensíveis à SNP (vide abaixo).

Exemplo 7: Mapeamento Exato dos Sitios-Alvo

Seis shRNAs curtos de 19 pares de bases foram projetados paraalvejar um sítio de 44 nucleotídeos próximo à extremidade de 3' do IRES doHCV: três alvejando os nucleotídeos 331-353 e três alvejando osnucleotídeos 354-374. Estas moléculas continham laços de 10 nucleotídeose ressaltos 5'-GG e 3'-UU. A triagem foi efetuada para identificar ascandidatas que não sejam de sobreposição que fossem mais efetivas entreaquelas seqüências testadas para a inibição da expressão do HCV. Todosos seis dos shRNAs testados foram capazes de inibir a atividade no sistemade ensaio. Três dos seis shRNAs (sh52, sh53, e sh54) foram identificadoscomo os mais efetivos (Figura 12). Isto não exclui o uso daqueles shRNAsque eram menos efetivos em uma composição, por exemplo, para tratar oHCV, por exemplo, como parte de uma composição que inclui mais do queum shRNA e/ou siRNA.

Exemplo 8: Projeto do shRNA: Efeitos do Comprimento do Tronco, doComprimento do Laço e da Seqüência, e da Extremidade de 3'

Experimentos adicionais foram efetuados para testar como oprojeto do shRNA afeta a atividade de silenciamento do gene. O HCVa-wtcontinha um tronco de 25 pares de bases com os ressaltos 5'-GG e 3'-UU(que podem formar pares de bases não canônicos) e um laço de rniR-23 dedez nucleotídeos. Para testar a importância destes parâmetros na eficáciapara a inibição da expressão, cada um destes parâmetros foi variadoseparadamente (Figura 13A). A seqüência do laço de microRNA-23 foiinicialmente selecionada porque ela é uma seqüência de ocorrência natural(Lagos-Quintana et al., Science, 2001, 293:854-258) e era, portanto,improvável de ser tóxica. Dois laços de dez nucleotídeos alternativos foramtestados, juntamente com os laços de seis nucleotídeos, cinco nucleotídeos,e quatro nucleotídeos, cada um em duas versões de uma seqüência. Nem otamanho do laço nem a seqüência foram verificados afetar a atividadedestes shRNAs de 25 pares de bases (Figura 13B; vide as Figuras 16A-Bquanto às seqüências).

Os pequenos RNAs em grampo não tendo a seqüência de 3'-UUterminal (ressalto de fita simples) tiveram a mesma eficácia que o shRNAparental contendo esta característica. O shRNA de controle, com regiõescom sentido de tamanho natural (25 nucleotídeos), porém anti-sentido curtas(13 nucleotídeos), não teve nenhuma atividade, confirmando a importânciada estrutura de duplex na seqüência de alvejamento. Os shRNAs tendo umaextremidade de 3'-CC em vez de 3'-UU (permitindo a formação de 2 paresde bases de Watson-Crick adicionais) foram mais efetivos do que o HCVa-wtpara diminuir a expressão do HCV, porém também afetaram os níveis daSEAP. Esta inibição não específica poderia ser uma conseqüência do troncomais longo (27 pares de bases), que pode induzir os genes da via sensívelao interferon e ativar a cinase R protéica (PKR). Surpreendentemente, omovimento do laço para a outra extremidade do shRNA resultou em umaredução dramática da atividade (15% de inibição a 1 nM, em vez de 90%).As explicações possíveis para este efeito incluem uma mudança na posiçãodo processamento da Dicer (e, portanto, da seqüência alvejada), bem comoum teor de GC diferente na extremidade de 5'.

Porque os shRNAs de 19 pares de bases foram mostradosapresentarem potência similar ao shRNA de 25 pares de bases, os efeitosdas variações do laço para os shRNAs de 19 pares de bases foramexaminados. Os resultados são mostrados na Figura 14; vide as Figuras16A-B quanto às seqüências. Os tamanhos dos laços de 10, 6, 5, e 4nucleotídeos foram testados, cada um em duas versões de seqüências. Asseqüências contendo todos os tamanhos dos laços demonstraram acapacidade de inibir a expressão do gene. Entretanto, em contraste com osresultados com os shRNAs de 25 pares de bases, a redução do tamanho dolaço, especialmente abaixo de 5 nucleotídeos, resultou na atividade reduzidapara os shRNAs de 19 pares de bases para ambas as seqüências de laçotestadas. Os laços de pelo menos 5-6 nucleotídeos demonstraram maisatividade.

A remoção do 3'-UU também resultou na redução dramática daatividade para os shRNAs de 19 pares de bases, bem como de 20 pares debases (porém não de 25 pares de bases). Sem se envolver com qualquerteoria particular, o 3'-UU e o 5'-GG podem formar pares de bases nãocanônicos e o tamanho global do duplex de shRNA é importante, de modotal que o duplex não possa ser menos do que 21 pares de bases para oprocessamento eficiente. Assim, para os shRNAS de 25 pares de bases,nem o tamanho do laço nem a presença de um 3'-UU importam, enquantoque estes parâmetros são importantes para a potência dos shRNAs curtos,por exemplo, de 19 pares de bases. Sem se envolver com qualquer teoriaparticular, pode ser que a Diver se ligue nas extremidades antes doprocessamento e não "sinta" o laço no caso dos shRNAs mais longos,porém para os shRNAs de 19 pares de bases, o laço é "sentido" a medidaque a Dicer "mede" 19-21 nucleotídeos a partir das extremidades.

Desse modo, foi verificado que os shRNAs de 19 pares de basespodem ser tão potentes quanto os shRNAs de 25 pares de bases e o siRNAde 19 pares de bases. Foi também verificado que algumas moléculas deshRNA eram ativas em baixas concentrações de 0,1-1 nM ("shRNAshiperpotentes". Qs outros grupos tipicamente usam siRNA a 10-25-50-100nM).

Estes dados demonstram que as seqüências que não incluemum 3'-UU que são pelo menos 22 pares de bases, por exemplo, 23 pares debases, 24 pares de bases, ou 25 pares de bases, podem ser adequadaspara a inibição da expressão do HCV. Similarmente, o tamanho do laço nãoé crítico para os shRNAs que são pelo menos 22 pares de bases decomprimento.

Exemplo 9: Sistema de Replicon HCV

Os diversos inibidores de shRNA e siRNA juntamente com oscontroles negativos foram usados para transfectar os hepatócitos humanos(AVA5, um derivado da linhagem celular Huh7), que expressamestavelmente os replicons subgenômicos HCV (Blight et al., Science, 2000,290:5498), e a quantidade de expressão do HCV foi determinada. Uma faixade concentrações foi testada e a concentração de RNA que resulta em 50%de inibição (IC50 ou EC50) foi determinada. As IC50s de dois experimentosindependentes são mostradas lado a lado na Figura 15. Os resultadosgeralmente correlacionam-se com os dados obtidos usando o sistema defLuc/IRES nas células 293 FT, com as seguintes diferenças: (1) os shRNAsde 19 pares de bases são mais potentes do que os siRNAs de 19 pares debases no sistema de replicon, enquanto que com o sistema de relator, ossiRNAs de 19 pares de bases eram mais potentes do que os shRNAs; (2) oshRNA HCVa-wt com mutações pontuais não demonstrou atividade nosistema de replicon, enquanto que ele era efetivo no sistema de relator defLuc/IRES; (3) em geral, o siRNA de 25 pares de bases e o shRNA de 25pares de bases tiveram menos atividade do que os outros shRNAs e siRNAsde 19 pares de bases testados. Em geral, os sistemas de IRES e repliconsão úteis para a identificação de seqüências candidatas. Os métodos deconfirmar a eficácia (por exemplo, para inibir a expressão do HCV em umpaciente) de um shRNA ou siRNA selecionado podem ser adicionalmentetestados usando os métodos descritos neste documento e os métodosconhecidos na técnica.Outras Modalidades

É para ser entendido que, embora a invenção tenha sidodescrita em conjunção com a sua descrição detalhada, a descriçãoprecedente é pretendida para ilustrar e não limitar o escopo da invenção,que é definida pelo escopo das reivindicações em anexo. Outros aspectos,vantagens, e modificações estão dentro do escopo das reivindicações quese seguem.

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Claims

1. Seqüência de RNA consistindo em:a. uma primeira seqüência de RNA1 onde a primeira seqüênciade RNA é SEQ ID NO:34, (SEQ ID NO:35), (SEQ ID NO:36), (SEQ IDNO:37), (SEQ ID NO:38), (SEQ ID NO:39), (SEQ ID N0:40), (SEQ IDNO:41), (SEQ ID NO:42), (SEQ ID NO:43), (SEQ ID N0:44), (SEQ IDNO:45), (SEQ ID NO:46), (SEQ ID NO:47), (SEQ ID NO:48), (SEQ IDNO:49), (SEQ ID N0:50), (SEQ ID NO.51); (SEQ ID NO:52), (SEQ IDNO:53), (SEQ ID NO:54), (SEQ ID NO:55), (SEQ ID NO:56), ou umaseqüência que difere de uma seqüência precedente por um, dois, ou trêsnucleotídeos;b. uma segunda seqüência de RNA que é um complemento daprimeira seqüência;c. uma seqüência de laço posicionada entre a primeira e asegunda seqüência de ácidos nucléicos, a seqüência de laço consistindo em-4-10 nucleotídeos; ed. opcionalmente, um ressalto de dois nucleotídeos.

2. Seqüência de RNA de acordo com a reivindicação 1, em quea primeira seqüência de RNA é SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ IDNO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID N0:40, SEQID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ IDN0:50, SEQ ID NO:51; SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQID NO:55, ou SEQ ID NO:56.

3. Seqüência de RNA de acordo com a reivindicação 1, em quea seqüência de RNA compreende pelo menos um nucleotídeo modificado.

4. Seqüência de RNA de acordo com a reivindicação 1, em quea seqüência de laço é 4 nucleotídeos, 5 nucleotídeos, 6 nucleotídeos, 7nucleotídeos, 8 nucleotídeos, 9 nucleotídeos, 10 nucleotídeos, ou pelomenos dez nucleotídeos.

5. ShRNA compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicoscomo definida na reivindicação 1 e uma seqüência complementar àseqüência como definida na reivindicação 1, ligada por um laçocompreendendo pelo menos uma molécula não que seja de nucleotídeo.

6. ShRNA compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicoscomo definido na reivindicação 4, onde o laço está 3' a uma fita com sentidoe 5' à fita anti-sentido complementar do shRNA.

7. ShRNA compreendendo uma seqüência de ácidos nucléicoscomo definido na reivindicação 4, onde o laço está 3' a uma fita anti-sentidoe 5' à fita com sentido complementar do shRNA.

8. Seqüência de RNA de acordo com a reivindicação 1, em quea seqüência de RNA compreende um ressalto de dois nucleotídeos que éum 3'UU.

9. Seqüência de RNA como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 8, onde a primeira seqüência é SEQ ID NO:33, SEQ IDNO:55, ou SEQ ID NO:56.

10. Seqüência de RNA de acordo com a reivindicação 1, em quea seqüência é qualquer uma de SEQ ID NOs:57-79, SEQ ID NO:12, SEQ IDNO:16, SEQ ID NO:17, ou SEQ ID NO:18.

11. Seqüência de DNA compreendendo uma seqüência quecodifica o RNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

12. Vetor de expressão compreendendo a seqüência de DNAcomo definida na reivindicação 11.

13. Vetor retroviral compreendendo a seqüência de DNA comodefinida na reivindicação 11.

14. Vetor retroviral de acordo com a reivindicação 13, em que nainfecção de uma célula com o vetor, um provírus é produzido que podeexpressar uma seqüência de RNA como definido na reivindicação 1.

15. Composição compreendendo uma seqüência de RNA comodefinida em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, e um excipientefarmaceuticamente aceitável.

16. Composição compreendendo um vetor compreendendo umaseqüência codificando a seqüência de RNA como definida em qualquer umadas reivindicações 1 a 10.

17. Composição de acordo com a reivindicação 15compreendendo pelo menos duas seqüências de RNA como definidas nareivindicação 1.

18. Método de inibir a expressão ou a atividade de um vírus dahepatite C, o método compreendendoa. proporcionar uma célula que pode expressar um vírus dahepatite C; eb. contatar a célula com uma seqüência de RNA como definidaem qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a célula -está em um mamífero.

20. Método de acordo com a reivindicação 18, em que omamífero é um ser humano.

21. Método de acordo com a reivindicação 18, em que omamífero é um primata não-humano.

22. Método de acordo com a reivindicação 18, em que a célula écontatada com pelo menos duas seqüências de RNA diferentes comodefinidas reivindicação 1.

23. Método compreendendoa. identificar um paciente infectado com, ou suspeito de estarinfectado com, um vírus da hepatite C;b. fornecer ao paciente uma quantidade terapeuticamente efetivade uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 15,-16, ou 17.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, adicionalmentecompreendendo determinar se a carga viral do paciente é diminuídasubseqüente a (b).

25. Método de acordo com a reivindicação 23, adicionalmentecompreendendo, subseqüente a (b), determinar se pelo menos uma proteínaviral ou seqüência de ácidos nucléicos viral é diminuída no paciente.

26. Método de inibir a expressão do gene em um vírus, o métodocompreendendo introduzir um pequeno RNA interferente em uma célulacontendo vírus, em que o pequeno RNA interferente compreende umaseqüência que é pelo menos parcialmente complementar a uma seqüênciade polinucleotídeos do vírus, em que a interação da seqüência pelo menosparcialmente complementar do pequeno RNA interferente com a ditaseqüência de polinucleotídeos do vírus resulta na inibição da expressão dogene no vírus.

27. Método de acordo com a reivindicação 26, em que opequeno RNA interferente é um shRNA.

28. Método de acordo com a reivindicação 26, em que opequeno RNA interferente é um siRNA.

29. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 26-28,onde o pequeno RNA interferente reconhece uma seqüência viral de cercade 19 a cerca de 30 nucleotídeos.

30. Método de acordo com a reivindicação 26, em que o vírus éum vírus da hepatite C.

31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que opequeno RNA interferente interage com uma seqüência dentro da seqüênciado sítio de entrada interno do ribossomo (IRES) do vírus da hepatite C.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que aseqüência do IRES compreende a seqüência representada em SEQ ID NO:11.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, em que opequeno RNA interferente reconhece uma seqüência de cerca de 19 a cercade 30 nucleotídeos dentro da região representada em SEQ ID NO:26.

34. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 30-33,em que o pequeno RNA interferente é um shRNA.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, em que o shRNAcompreende uma seqüência selecionada a partir do grupo que consiste emSEQ ID NO:12, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:27, SEQ IDNO:32, e SEQ ID NO:33.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, em que o shRNAtem a seqüência representada em SEQ ID NO:12.

37. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 30-33,onde o pequeno RNA interferente é um siRNA.

38. Método de acordo com a reivindicação 37, em que o siRNAcompreende uma seqüência selecionada a partir do grupo que consiste emSEQ ID NO:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ NO:-23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:32, e SEQID NO:33.

39. Método de tratar uma infecção viral em um mamífero, o ditométodo compreendendo administrar ao mamífero uma composiçãocompreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva de um pequenoRNA interferente que compreende uma seqüência que é pelo menosparcialmente complementar a uma seqüência de polinucleotídeos do vírus,onde a interação da dita seqüência pelo menos parcialmente complementardo pequeno RNA interferente com a dita seqüência de polinucleotídeos dovírus resulta na inibição da expressão do gene no vírus.

40. Método de acordo com a reivindicação 39, em que opequeno RNA interferente é um shRNA.

41. Método de acordo com a reivindicação 39, em que opequeno RNA interferente é um siRNA.

42. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 39-41,em que o pequeno RNA interferente reconhece uma seqüência viral decerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos.

43. Método de acordo com a reivindicação 39, em que o ditomamífero é um ser humano e a infecção viral compreende um vírus dahepatite C.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, em que opequeno RNA interferente compreende uma seqüência que é pelo menosparcialmente complementar a uma seqüência de polinucleotídeos dentro daseqüência do IRES do vírus da hepatite C.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, em que aseqüência do IRES compreende a seqüência representada em SEQ IDNO:11.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, em que opequeno RNA interferente liga reconhece uma seqüência de cerca de 19 acerca de 30 nucleotídeos dentro da região representada em SEQ ID NO:26.

47. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 43-46,em que o pequeno RNA interferente é um shRNA.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, onde o shRNAcompreende uma seqüência selecionada a partir do grupo que consiste emSEQ ID NO:12, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ IDN0:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ NO:23, SEQ ID NO:24, e SEQID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:33.

49. Método de acordo com a reivindicação 48, em que o shRNAtem a seqüência representada em SEQ ID NO:12.

50. Método de acordo com quaisquer das reivindicações 43-46,em que o pequeno RNA interferente é um siRNA.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, em que o siRNAcompreende uma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo emSEQ ID NO:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ NO:23,SEQ ID NO:24, e SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:32, e SEQ IDNO:33.

52. Composição compreendendo um shRNA compreendendouma seqüência selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID N0:20, SEQ IDNO:21, SEQ ID NO:22, SEQ NO: 23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQID NO:27, SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:33.

53. Composição compreendendo um siRNA compreendendouma seqüência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ IDNO:19, SEQ ID N0:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ NO: 23, SEQID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:32, e SEQ IDNO:33.

54. Composição farmacêutica compreendendo um shRNA deacordo com a reivindicação 52 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

55. Composição farmacêutica compreendendo um siRNA deacordo com a reivindicação 53 e um excipiente farmaceuticamente aceitável.

56. Kit compreendendo um shRNA e instruções para uso em ummétodo como definido em quaisquer das reivindicações 26, 30-33, 39, 43-46,e 18-25.

57. Kit de acordo com a reivindicação 56, em que o shRNAcompreende uma seqüência selecionada a partir do grupo que consiste emSEQ ID NO:12, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ IDN0:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ NO: 23, SEQ ID NO:24, SEQID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:32, e SEQ ID NO:33.

58. Kit compreendendo um siRNA e instruções para uso em ummétodo como definido em quaisquer das reivindicações 25, 29-32, 38, e 42-45.

59. Kit de acordo com a reivindicação 58, em que o siRNAcompreende uma seqüência selecionada a partir do grupo que consiste emSEQ ID NO: 19, SEQ ID N0:20, SEQ ID NÒ:21, SEQ ID NO:22, SEQ NO:-23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, e SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:32, e SEQID NO:33.

60. Método de acordo com a reivindicação 43, em que o vírus dahepatite C é um genótipo 1a.

61. Método de acordo com a reivindicação 39, em que omamífero é um ser humano.