BRPI0615730A2 - extrato de planta e uso do mesmo como agente crioprotetor - Google Patents

Abstract

EXTRATO DE PLANTA E USO DO MESMO COMO UM AGENTE CRIOPROTETOR. Um meio de crioconservação compreendendo um extrato de planta contendo proteína é revelado. Métodos, composições, usos e kits para crioconservação de material biológico, tal como uma molécula, organela, célula, embrião, tecido ou árgão também são revelados.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção Para "EXTRATODE PLANTA E USO DO MESMO COMO UM AGENTE CRIOPROTETOR" .

Referência Remissiva a Pedidos Relacionados.

O presente pedido reivindica o beneficio do Pedido dePatente Provisório dos Estados Unidos N- 60/719.188,depositado em 22 de setembro de 2005, o qual é incorporadoneste documento por referência em sua totalidade.

Campo da Invenção.

A presente invenção se refere â criopreservação decélulas ou tecidos. Mais especificamente, a presenteinvenção se relaciona ao uso de um extrato derivado deplanta como um agente crioprotetor para talcriopreservação.

Antecedentes da Invenção.

O congelamento tem sido utilizado há vários anos comouma abordagem para preservar células vivas. Entretanto, acrioconservação e recuperação de células vivas provou serdifícil, uma vez que condições relativamente adversas deambos congelamento e descongelamento de células durante suacrioconservação resulta em baixa viabilidade de célulasdescongeladas. Várias estratégias foram buscadas a fim demelhorar a viabilidade de células descongeladas, referenteprincipalmente ao desenvolvimento de agentes crioprotetorese métodos aperfeiçoados de crioproteção (por exemplo, taxasaperfeiçoadas de resfriamento). 0 agente crioprotetorpadrão na indústria para uma variedade de tipos de célulasé dimetil sulfoxido (DMSO). Contudo, a despeito de seu usodifundido, DMSO pode ser tóxico para as células e terefeitos adversos sobre a função celular os quais podem, porexemplo, comprometer o uso de tais células descongeladaspara uma variedade de aplicações.

Um exemplo de um tipo de célula o qual exibe umavariedade de funções fisiologicamente relevantes é ohepatócito. Dentre os tipos de células hepáticas,hepatócitos são os mais importantes para a função do órgão,representando cerca de 70% da população celular total e 80%do volume de tecido hepático (1) . Eles são responsáveispela maioria das funções hepato-específicas (2) , tais comosíntese e secreção de proteínas essenciais (por exemplo,ceruloplasmina, fatores de coagulação, albumina) .Hepatócitos também estão envolvidos na biotransformação decompostos hidrofóbicos endógenos e exógenos (xenobióticos,produtos tóxicos) em produtos solúveis em água que podemser facilmente excretados no meio extracelular (porexemplo, urina e bile) (3).

Hepatócitos, assim, representam um modelofisiologicamente relevante do fígado, especialmente como umsistema experimental "in vitro" para a avaliação do destinometabólico e efeitos biológicos dos xenobióticos. Paraxenobióticos que são metabolizados principalmente pelofígado, o uso de hepatócitos mais provavelmente proporcionaresultados os quais são representativos daqueles obtidos"ín vivo", ambos em termos de perfis metabólicos e taxas deeliminação metabólica (4-6).

Tradicionalmente, hepatócitos recentemente isoladossão requeridos para a maioria dos estudos sobre ometabolismo e toxicidade de xenobióticos, como por exemplo,as principais enzimas de metabolização de xenobióticos,tais como, as isoformas induzíveis de citocromo P450 (CYP)declinam rapidamente em cultura. Entretanto, isso requer ouso de fígados recentemente obtidos para o preparo dehepatócitos para experimento. Então, a crioconservação dehepatócitos recentemente isolados, mantendo altaviabilidade e funções hepáticas adequadas apósdescongelamento, diminuiria significativamente anecessidade de tal tecido fresco. Como tal, hepatócitoscrioconservados de alta qualidade seriam de valorconsiderável para investigações nos campos de hepatologia,farmacologia e toxicologia (7-9).

Os principais problemas com os métodos clássicos decrioconservação de hepatócitos são a baixa taxa desobrevivência em cultura, pobre atividade metabólica eintegridade funcional. Além disso, hepatócitos não replicamem cultura, conforme é o caso para linhagens de células.Assim, um método eficiente de crioconservação é necessáriopara reduzir o dano celular e funcional causado emhepatócitos durante congelamento. Vários agentescrioprotetores, tal como DMSO mencionado acima, sãoatualmente usados para proteger células da desidrataçãocausada pela formação de gelo intracelular durantecongelamento. Entretanto, eles são ou tóxicos para ascélulas e precisam ser eliminados rapidamente apósdescongelamento (10) ou causam estresse osmótico que afetaa competência metabólica da célula (11). Conseqüentemente,a célula crioconservada não representa o estado metabóliconativo das células ou tecidos e torna a interpretação deresultados obtidos, durante o estudo de tais células,errôneos.

Portanto, existe uma necessidade contínua porabordagens aperfeiçoadas para a crioproteção de células.

A presente descrição se refere a uma série dedocumentos, o conteúdo dos quais é aqui incorporado porreferência em sua totalidade.Sumário da Invenção.

A invenção se refere a reagentes e métodos paracrioconservação baseado no uso de um extrato de planta.Mais especificamente, de acordo com a presenteinvenção, é proporcionado um meio de crioconservaçãocompreendendo um extrato de planta compreendendo proteína.

A invenção ainda proporciona uma composiçãocompreendendo o meio acima mencionado e um materialbiológico. Em uma modalidade, a composição é congelada.

A invenção ainda proporciona um método paracrioconservação de um material biológico, o métodocompreendendo congelamento de uma suspensão do materialbiológico no meio acima mencionado.

A invenção ainda proporciona um método paracrioconservação de um material biológico, o métodocompreendendo introdução do material biológico no meioacima mencionado e congelamento do meio compreendendo omaterial biológico.

A invenção ainda proporciona um kit ou embalagemcompreendendo o meio acima mencionado.

A invenção ainda proporciona o uso do meio acimamencionado para crioconservação de um material biológico.

A invenção ainda proporciona um extrato de plantacompreendendo proteína para uso em crioconservação.

A invenção ainda proporciona uma composiçãocompreendendo o extrato acima mencionado e um materialbiológico. Em uma modalidade, a composição é congelada.A invenção ainda proporciona uma embalagem de kitcompreendendo o extrato de planta compreendendo proteínaacima mencionado juntamente com instruções para acrioconservação de um material biológico.

A invenção ainda proporciona o uso do extrato acimamencionado para crioconservação de um material biológico.

A invenção ainda proporciona um método paracrioconservação de um material biológico, o métodocompreendendo introdução do extrato acima mencionado em ummeio de crioconservação antes de congelamento.

Em uma modalidade, o extrato acima mencionado éderivado de uma planta não aclimatada.

Em uma modalidade, o extrato acima mencionado éderivado de uma planta aclimatada ao frio.

Em uma modalidade, o extrato acima mencionado éderivado das partes aéreas ou tecido de folha de umaplanta.

Em uma modalidade, a planta acima mencionada é umaplanta da família selecionada de Poaceae (Gramineae) ,Leguminoseae e Amaranthaceae.

Em uma modalidade, a planta acima mencionada éselecionada de trigo, centeio, cevada, alfafa e espinafre.

Em uma modalidade, o extrato acima mencionado ésubstancialmente solúvel.Em uma modalidade, o extrato acima mencionado éenriquecido em proteína.

Em uma modalidade, o extrato enriquecido em proteínaacima mencionado é preparado através de precipitação desal. Em uma outra modalidade, a precipitação de sal acimamencionada é precipitação com sulfato de amônio.

Em uma modalidade, o meio ou extrato acima mencionadoé substancialmente isento de DMSO.

Em uma modalidade, o meio ou extrato acima mencionadoé substancialmente isento de soro animal exógeno (porexemplo, soro bovino fetal). Em uma outra modalidade, omeio acima mencionado é substancialmente isento de ambosDMSO e soro animal exógeno.

Em uma modalidade, o meio ou extrato acima mencionadoé substancialmente isento de glúten.

Em modalidades, o meio ou extrato acima mencionado ésubstancialmente isento de:

a) DMSO;

b) soro animal exógeno (por exemplo, soro bovino fetal);

c) glúten;

d) (a) e (b) ;

e) (a) e (c) ;

f) (b) e (c) ; ou

g) (a) , (b) e (c) .Em uma modalidade, a viabilidade após congelamento domaterial biológico acima mencionado crioconservado no meioacima mencionado é maior do que ou igual a 4 0%, em umaoutra modalidade, maior do que ou igual a 50%, em ainda umaoutra modalidade, maior do que ou igual a 60%.

Em uma modalidade, o nível ou atividade de umparâmetro funcional após descongelamento do materialbiológico acima mencionado crioconservado no meio acimamencionado é maior do que ou igual a 4 0%, em uma outramodalidade, maior do que ou igual a 5 0%, em ainda uma outramodalidade, maior do que ou igual a 60%. Em modalidades, oparâmetro funcional é selecionado da eficiência deplaqueamento, aderência, morfologia celular, secreçãocelular, síntese de proteína, desintoxicação de amônio eatividade enzimática.

Em uma modalidade, o meio ou extrato acima mencionadoé para crioconservação de um material biológico selecionadode uma molécula, organela, célula, embrião, tecido e órgão.Em uma modalidade, a célula é uma célula eucariótica. Emuma modalidade, a célula é uma célula primária, umalinhagem de célula ou uma célula imortalizada. Em umamodalidade, a célula, embrião, tecido ou órgão é umacélula, embrião, tecido ou órgão de mamífero. Em umamodalidade, a célula, embrião, tecido ou órgão é umacélula, embrião, tecido ou órgão humano. Em uma modalidade,a célula ou tecido é um hepatócito ou tecido hepático.

Outras vantagens e características da presenteinvenção se tornarão mais evidente na leitura da descriçãonão restritiva a seguir de modalidades específicas damesma, fornecida a título de exemplo apenas com referênciaaos desenhos em anexo.

Breve Descrição dos Desenhos.

Figura 1: Potencial de crioconservação de extratos deproteína de trigo (WPEs) sobre hepatócitos isolados derato. Análise da viabilidade de suspensões de hepatócitosde rato após congelamento foi avaliada com o teste comcalceína/PI através de citometria de fluxo. A viabilidadede hepatócitos de rato (1,5 χ IO6 células/ml) foi avaliadaapós 7 dias de congelamento em WME, FBS a 10% suplementadocom FBS a 50% (FBS) , 20 mg de BSA (BSA) ou 20 mg deproteínas de E. coli (E. coli) , DMSO a 15% e 2 0 mg de BSA(DMSO + BSA) ou DMSO a 15% e FBS a 50% (DMSO) . O efeito deWPEs sobre a viabilidade da suspensão de hepatócitos derato também foi avaliada após 7 dias de congelamento em WMEsuplementado com 20 mg de WPEs CA (aclimatado a frio) ou NA(não aclimatado). Hepatócitos recentemente isolados(fresco) serviram como referência. Dados (média ± SEM)representam medições em triplicata de pelo menos seisexperimentos independentes com diferentes preparados decélula (n = 18).

Figura 2: Viabilidade de hepatócitos frescos ecrioconservados após semeadura: efeito de WPEs.Determinação da viabilidade usando ensaio de LDH durante umperíodo de 4 dias após semeadura de hepatócitosdescongelados de rato que tinham sido crioconservados por 7dias em WME suplementado com DMSO a 15% e FBS a 50% (DMSO) ,WPEs NA e CA. A viabilidade {%) foi obtida pela subtraçãodo LDH liberado por hepatócitos mortos ou danificados doLDH total nas células. LDH total foi avaliado através delise de células com Triton X-IOO a 10%. A liberação de LDHno meio mensurou a perda da viabilidade de hepatócitos emcultura, proporcionando uma medição indireta da integridadeda membrana de células. Hepatócitos recentemente isoladosserviram como uma referência. Controles foram feitos parasubtrair a atividade intrínseca da planta. Dados (SEMmédia) representam medições em triplicata de quatroexperimentos com diferentes preparados de células (n = 12) .Significância estatística: * p<0,05, ** p<0,01 e ***p<0,001.

Figura 3: Análise de aderência e morfologia celular dehepatócitos crioconservados de rato através de microscopiaconfocal. A aderência foi visualizada 24 h após semeadurade hepatócitos descongelados de rato, os quais tinham sidocrioconservados por 7 dias em WME, FBS a 10% suplementadocom DMSO a 15% e FBS a 50% (B) , WPEs NA (C) ou CA (D) .Hepatócitos recentemente isolados (A) serviram como umareferência. As setas indicam contatos célula com célula.Hepatócitos de rato, 175 χ IO3 células, foram visualizadosatravés de microscopia confocal sob 40X Hoffman (A-D).Fotografias de células são mostradas a partir de umexperimento representativo, o qual foi repetido pelo menosem triplicata.

Figura 4: Secreção de albumina e desintoxicação deamônio para uréia através de hepatócitos frescos ecrioconservados: efeito benéfico de WPEs. (A) Secreção dealbumina (pg/106 células/24 h) no meio de cultura decélulas durante um período de 4 dias após semeadura dehepatócitos descongelados de rato e (B) produção de uréia^g/lO6 células) durante intervalos de tempo de 24h após 1,2 e 3 dias em cultura, para hepatócitos descongelados derato que tinham sido crioconservados durante 7 dias em WMEsuplementado com DMSO a 15% e FBS a 50% (DMSO) , WPEs NA eCA. Hepatócitos recentemente isolados serviram como umareferência. Controles foram feitos para subtrair aatividade intrínseca da planta. Dados (média ± SEM)representam medições em triplicata de quatro experimentoscom diferentes preparados de célula (n = 12). Significânciaestatística: * p<0,05, " p<0,01 e *** p<0,001.

Figura 5: Atividade e expressão das isoenzimas decitocroma P450 em hepatócitos frescos e crioconservados:efeito de WPEs. (A) Atividade das isoformas CYPlAl e CYP2Bde citocromo P450 e (B) expressão da isoforma CYPlAl, 48 hapós semeadura de hepatócitos descongelados de rato quetinham sido crioconservados durante 7 dias em WMEsuplementado com DMSO a 15% e FBS a 5 0% (DMSO) , WPEs NA eCA. Hepatócitos recentemente isolados (frescos) serviramcomo uma referência. (A) A taxa de indução das isoformas decitocroma P450 foi medida através de ensaios EROD (CYPlAl)e PROD (CYP2B) após uma indução de 24 h com benzo-a-pireno(+). (B) Expressão da isoforma CYPlAl do citocroma P450após uma indução de 24 h com benzo-a-pireno ( + ) .Imunodetecção com anticorpo CYPlAl sobre 3 0 μg de extratosde proteína de mamífero após uma indução de 24 h com benzo-a-pireno (+) e quantificação através de densitometria. Ataxa de indução é a taxa entre a densidade da rota não-induzida sobre a densidade da rota induzida. Hepatócitosrecentemente isolados (frescos) e frescos + NA também foramtestados. Coloração de membrana foi usada como um controlede carga de proteína. Hepatócitos recentemente isolados(frescos) serviram como uma referência. Dados (média ± SEM)representam medições em triplicata de quatro experimentoscom preparados diferentes de célula (n = 12) . Imunodetecção(B) de proteínas é mostrada a partir de um experimentorepresentativo, o qual foi repetido pelo menos emtriplicata. Significância estatística: * p<0,05.

Figura 6: Potencial de crioconservação dos PEs sobrehepatócitos isolados de rato. Análise da viabilidade desuspensões de hepatócitos de rato após congelamento foiavaliada com o teste de calceína/PI por citometria defluxo. A viabilidade de hepatócitos de rato (1,5 χ IO6células/ml) foi avaliada após 7 dias de congelamento emWME, FBS a 10% suplementado com DMSO a 15% e FBS a 50%(DMSO) . O efeito de PEs de trigo (Triticum aestivum) cvClair, trigo cv Glenlae, cevada (Hordeum vulgare), centeio(Secale cereale), alfafa (Medicago sativa) ou espinafre(Spinacia oleracea) sobre a viabilidade da suspensão dehepatócitos de rato também foi avaliada após 7 dias decongelamento em WME suplementado com 2 0 mg ou 4 0 mg (+) dePEs de planta NA. Hepatócitos recentemente isolados(frescos) serviram como uma referência. Dados (média ± SEM)representam medições em duplicata de pelo menos trêsexperimentos independentes com diferentes preparados decélula (n = 6) .

Figura 7: Crioconservação de células eucarióticas comDMSO e WPEs. Análise da viabilidade de suspensões decélulas eucarióticas após congelamento foi avaliada com oteste de calceína/PI através da citometria de fluxo. Aviabilidade de células de hepatócitos primários de rato,linhagens de células A54 9 (carcinoma de pulmão humano),Caco-2 (adenocarcinoma cólon-retal humano), CHO-Bl (ováriode hâmster chinês transfectado com cDNA TGF-bl), HeLa(células de câncer cervical tiradas de Henrietta Lacks),HIEC (células de epitélio intestinal humano) e Jurkat(leucemia de células T humanas) (1,5 χ IO6 células/ml) foiavaliada após 7 dias de congelamento em seus respectivosmeios de crescimento suplementados com DMSO a 15% e FBS a50% (DMSO) ou WPEs NA Clair (NA) . Hepatócitos recentementeisolados (frescos) serviram como uma referência. Dados(média ± SEM) representam medições em triplicata de pelomenos três experimentos independentes com diferentespreparados de célula (n = 9).

Figura 8: Potencial de criopreservação de proteínasWPEs a partir de frações de precipitação com sulfato deamônio sobre hepatócitos isolados de rato. A viabilidade desuspensões de hepatócitos (1,5 χ IO6 células/ml) após 7dias de congelamento foi avaliada com calceína/PI porcitometria de fluxo. Hepatócitos foram congelados em WME,FBS a 10% (WME) , suplementado com DMSO a 15% e FBS a 50%(DMSO) OU 2 0 mg de WPE (WPE) NA (não-aclimatado) ou CA(aclimatado a frio) ou 20 mg de fração de proteína NA ou CAa 41-60% (41-60) ou 20 mg de fração de proteína NA ou CA a61-80% (61-80) ou 20 mg da fração de proteína NA ou CA a81-100% (81-100) . Hepatócitos recentemente isolados(frescos) serviram como referência. Dados (média ± SEM)representam medições em triplicata de três preparadosdiferentes de WPEs em três experimentos independentes comdiferentes preparados de célula (n = 27) .

Figura 9: Influência do soro bovino fetal (FBS) sobreo potencial de crioconservação do WPE NA (não aclimatado)sobre hepatócitos isolados de rato. A viabilidade desuspensões de hepatócitos (1,5 χ 10 6 células/ml) após 7dias de congelamento foi avaliada com calceína/PI atravésde citometria de fluxo. Hepatócitos foram congelados emWME, suplementado com DMSO a 15% e FBS a 50% (DMSO) ou DMSOa 15% (DMSO-FBS) ou 20 mg de WPE NA e FBS a 10% (NA) ou 20mg de WPE NA (NA-FBS). Hepatócitos recentemente isolados(frescos) serviram como referência. Dados (média ± SEM)representam medições em triplicata de dois preparadosdiferentes de WPEs em três experimentos independentes comdiferentes preparados de célula (n = 18) .

Figura 10: Quantificação de glúten dos WPEs NA (nãoaclimatados) e CA (aclimatados a frio). Análisequantitativa do conteúdo de glúten foi avaliada através deum imunoensaio enzimático indireto (ELISA). Dados (média ±SEM) representam medições em duplicata de dois preparadosdiferentes de WPEs (n = 4).

Descrição de Modalidades Ilustrativas.

Nos estudos descritos neste documento, os requerentesdesenvolveram um método aperfeiçoado de crioconservaçãopara células, tais como hepatócitos isolados, condutivos aoarmazenamento a longo prazo através de congelamento, talcomo armazenamento em nitrogênio líquido. Os requerentesdescobriram, surpreendentemente, que quando células,incluindo hepatócitos, bem como várias linhagens decélulas, foram crioconservadas com extratos de planta (porexemplo, trigo), a viabilidade celular após descongelamentoera equivalente ou melhor do que aquela de células queforam crioconservadas com DMSO. Quando hepatócitos quetinham sido crioconservados com extratos de planta foramdescongelados e semeados em placas de cultura, suamorfologia era similar àquela de células frescas. Alémdisso, funções hepato-específicas, tais como secreção dealbumina e biotransformação de amônio em uréia, foram bemmantidas durante 4 dias em cultura. As funções hepato-específicas eram comparáveis àquelas de células frescas, aqual estava em contraste com hepatócitos que tinham sidocrioconservados com dimetil sulfóxido. Os níveis de induçãode isoenzimas CYPlAl e CYP2B de citocroma P450 emhepatócitos que tinham sido crioconservados com extratos detrigo eram similares àqueles em hepatócitos frescos.

Essas descobertas mostram claramente que extratos deplanta, tais como extratos de trigo, são crioconservadoresmuito melhor para células (por exemplo, células primárias,tais como hepatócitos primários) do que dimetil sulfóxido.Tais extratos proporcionam as vantagens adicionais de seremum produto natural e representam um crioconservanteeficiente, não tóxico, econômico e útil para o usuário comamplas aplicações para diferentes sistemas biológicos. Essemétodo de crioconservação permite armazenamento por longoprazo e recuperação de grandes quantidades de célulassaudáveis, as quais mantêm suas funções diferenciadas, talcomo no caso de hepatócitos.

Conseqüentemente, em um primeiro aspecto, a invençãoproporciona um extrato de planta compreendendo proteínapara uso em crioconservação. "Extrato de plantacompreendendo proteína" , conforme usado neste documento,se refere a um extrato ou preparado obtido de material deplanta de uma forma tal que ele compreende proteína domaterial de planta. Em uma modalidade, tal extrato pode serum extrato bruto obtido, por exemplo, a partir detrituração (por exemplo, em um misturador ou dispositivosimilar) do material de planta em um solvente adequado (porexemplo, um solvente aquoso (por exemplo, água)), o qualpode ser seguido por meios adequados para remover matériaem partículas (por exemplo, filtração, centrifugação).

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um meio decrioconservação compreendendo um extrato de plantacompreendendo proteína.

O meio ou extrato da invenção pode, em modalidades,ser proporcionado em uma forma pronta para uso, uma formaconcentrada (ou seja, requerendo diluição) ou em uma formadesidratada (ou seja, requerendo reconstituição com umsolvente aquoso adequado (por exemplo, água)). Tais formasdo meio da invenção podem, em modalidades, serproporcionadas em kits ou embalagens adequadas, em outrasmodalidades junto com instruções (por exemplo, materialescrito e/ou gráfico e/ou em uma forma legível emcomputador) para seu uso, preparo e/ou reconstituição. Ainvenção ainda proporciona kits ou embalagens contendo taisformas de meios ou extrato, em outras modalidades junto cominstruções para sua reconstituição/reidratação, diluição ouseu preparo em geral.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona umacomposição compreendendo o extrato acima mencionado e umveículo ou carreador biologicamente compatível ouaceitável.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona umacomposição compreendendo o meio acima mencionado e ummaterial biológico.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um métodode preparo do meio acima mencionado, compreendendointrodução de um extrato de planta compreendendo proteínaem uma solução adequada para armazenamento ou cultura de ummaterial biológico.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um métodode preparo da composição acima mencionada, compreendendointrodução de um material biológico no meio acimamencionado.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um métodopara crioconservação de um material biológico compreendendocongelamento de uma suspensão ou mistura do materialbiológico no meio acima mencionado.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um métodopara crioconservação de um material biológicocompreendendo, introdução ou suspensão do materialbiológico no meio acima mencionado e congelamento dasuspensão ou mistura do material biológico no meio acimamencionado.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona o uso domeio ou extrato acima mencionado para a crioconservação dematerial biológico.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um métodopara crioconservação de um material biológico, o referidométodo compreendendo introdução do extrato acima mencionadoem um meio de crioconservação antes de congelamento.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona um kit ouembalagem compreendendo o meio ou extrato acima mencionado.Em uma modalidade, o kit ou embalagem pode aindacompreender instruções (por exemplo, material escrito e/ougráfico) para a crioconservação de material biológico.

Em um outro aspecto, a invenção proporciona umaembalagem compreendendo a composição acima mencionada. Emuma modalidade, a composição é congelada, caso no qual aembalagem pode ainda compreender instruções (por exemplo,material escrito e/ou gráfico) para descongelamento dacomposição.

O meio, extrato e métodos da invenção são vantajosospelo fato de que a crioconservação pode ser realizada naausência de crioprotetores químicos tradicionais, tal comoDMSO.

0 meio, extrato e métodos da invenção também sãovantajosos pelo fato de que crioconservação pode serrealizada na ausência de componentes obtidos de fontesanimais, tal como soro animal exogenamente adicionado (porexemplo, soro bovino fetal, soro fetal de bezerro), assim,reduzindo o risco de contaminação por patógenostransmitidos de tais fontes animais durante o preparo detais componentes. Em uma modalidade, o meio e extrato dainvenção são substancialmente isentos de criconservantesquímicos (por exemplo, DMSO) e soro animal exógeno (porexemplo, soro bovino fetal, soro fetal de bezerro).

Em uma outra modalidade, o meio e o extrato dainvenção são substancialmente isentos de glúten (ousubstancialmente isentos de glúten). "Substancialmenteisentos de glúten", conforme usado neste documento, serefere a um nível de glúten de 200 ppm ou menos no meio ouextrato.

Em outras modalidades, o meio e extrato da invençãosão substancialmente isentos de DMSO, soro animal exógeno(por exemplo, soro bovino fetal), glúten ou quaisquercombinações dos mesmos."Meio" ou "meios", conforme usado neste documento, serefere a uma solução a qual é condutiva ao materialbiológico de apoio, tal como células, em um estado viável.Tais meios contêm, tipicamente, por exemplo, meiosadequados para manter a isotonicidade e meios detamponamento para manter o pH de acordo com o materialbiológico de interesse. Tais meios também podem conteroutros aditivos os quais são conhecidos na técnica, taiscomo agentes para manter ou promover o crescimento celular,agentes para inibir crescimento microbiano (por exemplo, umantibiótico) e/ou um agente indicador de pH.

Em uma modalidade, o extrato de planta acimamencionado é derivado de uma planta não aclimatada outecido da mesma. "Não aclimatada", conforme usado nestedocumento, se refere a uma planta a qual não expressaproteínas anti-congelamento ou tolerantes ao congelamento.Esse termo, assim, abrange (a) plantas as quais nãocompreendem genes que codificam proteínas anti-congelamentoou tolerantes ao congelamento, (b) plantas as quais nãopodem sofrer indução de expressão de proteínas anti-congelamento ou tolerantes ao congelamento e (c) plantas asquais são capazes de indução de expressão de proteínasanti-congelamento ou tolerantes ao congelamento, mas nãoestão sujeitas a tal indução quando o material da planta éobtido para preparar o extrato. No último caso, talausência de indução significa, tipicamente, que a plantanão foi exposta às condições de aclimatação ao frio(temperatura menor do que 15 °C) para que tal induçãoocorra. Em contraste, uma planta "aclimatada ao frio",conforme usado neste documento, se refere a uma planta aqual não é somente capaz de sofrer indução de expressão deproteína anti-congelamento ou associadas à tolerância aocongelamento ou reguladas pelo frio, mas foi assim induzidaatravés de tratamento adequado (por exemplo, tratamentopelo frio) e, portanto, expressa tais proteínas. Assim, umaplanta capaz de aclimatação (por exemplo, trigo do inverno)seria uma planta "não aclimatada" na ausência de talindução e seria considerada uma planta "aclimatada ao frio"se ela não foi assim induzida.

Em uma modalidade, o extrato de planta acimamencionado é derivado de uma planta aclimatada ao frio outecido da mesma. "Aclimatada ao frio", conforme usado nestedocumento, é definido acima.

Em uma modalidade, o extrato de planta acimamencionado é obtido de um outro tecido da planta que nãotecido da semente. Em uma modalidade, o extrato de plantaacima mencionado é obtido das partes aéreas ou tecido defolha de uma planta.Em modalidades, a planta é de uma família de plantaselecionada de Poaceae (Gramineae) , Leguminoseae eAmaranthaceae. Em uma outra modalidade, a planta éselecionada de trigo (por exemplo, trigo (Triticumaestivum) cv Clair, trigo cv Glenlae), cevada (por exemplo,Hordeum vulgare), centeio (por exemplo, Secale cereale) ,alfafa (por exemplo, Medicago safciva) ou espinafre (porexemplo, Spinacia oleracea).

Em uma modalidade, o extrato de planta acimamencionado é substancialmente solúvel. "Substancialmentesolúvel", conforme usado neste documento, se refere a umasolução na qual virtualmente todo o soluto é dissolvido nosolvente e parece ser límpida a olho nu. Soluçõessubstancialmente solúveis podem ser preparadas através deuma série de métodos conhecidos na técnica, incluindométodos mecânicos de remoção de partículas, matéria nãodissolvida (por exemplo, filtração, centrifugação) ouatravés de adição ou remoção de componentes ou tratamentoda solução para intensificar a solubilidade.

Em uma modalidade, o extrato de planta acimamencionado é enriquecido em proteína. "Enriquecido emproteína", conforme usado neste documento, se refere a umpreparado o qual sofreu um tratamento que resulta em umamaior concentração de proteína no preparado após taltratamento ou resulta em uma maior quantidade de proteínacom relação aos outros componentes do preparado, após taltratamento. Assim, o termo também abrange um preparado oqual sofreu um tratamento para reter, separar, isolar oupurificar proteínas em uma parte maior do que uma ou maisdos outros componentes presentes no preparado antes de taltratamento. Tratamentos adequados são conhecidos na técnicae incluem, por exemplo, ultrafiltração/microfiltração,centrifugação, cromatografia, eletroforese e precipitação(por exemplo, precipitação com sulfato de amônio) . Em umamodalidade, o extrato de planta enriquecido em proteína éobtido através de precipitação com sulfato de amônio. Emuma modalidade, o extrato de planta enriquecido em proteínaé a fração de precipitado obtida em mais de 4 0% de sulfatode amônio (por exemplo, a fração de 41-100%) , em outramodalidade, a fração de 41-80% de sulfato de amônio, em umaoutra modalidade, a fração de 41-60% de sulfato de amônio.Em uma outra modalidade, o extrato de planta enriquecido emproteína é a fração de precipitado obtida em mais do que60% de sulfato de amônio (por exemplo, a fração de 61-100%), em uma outra modalidade, a fração de 61-80% desulfato de amônio. Em uma outra modalidade, o extrato deplanta enriquecido de proteína é a fração de precipitadoobtida em mais do que 8 0% de sulfato de amônio, porexemplo, a fração de 81-100% de sulfato de amônio.

Conforme mencionado acima, uma vantagem do meio dainvenção é que a possibilidade de permitir acrioconservação na ausência de DMSO. Conseqüentemente, emuma modalidade, o meio acima mencionado é "substancialmenteisento de DMSO", o qual, conforme usado neste documento, serefere a um meio ao qual DMSO não foi diretamenteadicionado como um crioprotetor.

Conforme observado acima, outra vantagem do meio dapresente invenção é que a possibilidade de permitir acrioconservação na ausência de componente de fontesanimais, tal como soro animal. Conseqüentemente, em umamodalidade, o meio acima mencionado é substancialmenteisento de soro animal exógeno (ou seja, em casos ondematerial biológico de uma fonte animal está sendocrioconservada, soro exógeno representa soro derivado de umanimal diferente do que a fonte do material biológico) . Emuma outra modalidade, o meio acima mencionado ésubstancialmente isento de soro bovino fetal. Conformeusado neste documento, "substancialmente isento de soroanimal" ou "substancialmente isento de soro bovino fetal"se refere a um meio ao qual soro animal ou soro bovinofetal não foi diretamente adicionado. Em uma modalidade, omeio acima mencionado é substancialmente isento de ambosDMSO e soro animal exógeno (por exemplo, soro bovinofetal).

"Material biológico", conforme usado neste documento,se refere a qualquer material derivado de um sistemabiológico incluindo, mas não limitado a, material contendoinformação genética e o qual é capaz de auto-reprodução oureprodução em um sistema biológico adequado. Emmodalidades, o material biológico é selecionado de umamolécula, organela, célula, embrião, tecido ou órgão. Emmodalidades, o material biológico é eucariótico ouprocariótico. Em uma modalidade, a célula é uma célulaprimária. "Célula primária", conforme usado nessedocumento, se refere a uma célula obtida diretamente de umorganismo vivo, o qual não é imortalizado. Em modalidades,a célula é eucariótica. Em uma modalidade, a célula,embrião, tecido ou órgão é uma célula, embrião, tecido ouórgão de animal, em uma outra modalidade, uma célula,embrião, tecido ou órgão de mamífero, em ainda uma outramodalidade, uma célula, embrião, tecido ou órgão humano. Emuma outra modalidade, a célula é um hepatócito, tal como umhepatócito humano primário. Em outras modalidades, omaterial é uma linhagem de célula ou célula imortalizada.Em uma modalidade, a viabilidade do material biológico(por exemplo, célula, tecido ou órgão) após crioconservaçãocom o meio acima mencionado, ou seja, determinada apósdescongelamento, será pelo menos 40% da viabilidade inicial(ou seja, a viabilidade do material biológico antes dacrioconservação). Em outras modalidades, a viabilidade serápelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou 75% daviabilidade inicial. Métodos para determinar a viabilidadesão conhecidos na técnica. Por exemplo, determinadosmétodos adequados para determinar a viabilidade sãodescritos nos exemplos abaixo.

Em uma modalidade, o nível ou atividade de umparâmetro funcional (por exemplo, o qual reflete a.atividade metabólica) do material biológico (por exemplo,molécula, organela, célula, embrião, tecido ou órgão) apóscrioconservação com o meio acima mencionado, ou seja,determinado após descongelamento, será pelo menos 4 0% donível ou atividade do parâmetro funcional (ou seja, o nívelou atividade anterior â crioconservação). Em outrasmodalidades, o nível ou atividade de um parâmetro funcionalserá pelo menos 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% ou 75% donível ou atividade inicial do parâmetro funcional. Emmodalidades, o parâmetro funcional é selecionado deeficiência de plaqueamento, aderência, morfologia celular,secreção (por exemplo, de albumina), síntese de proteína,desintoxicação de amônio e atividade enzimática (porexemplo, LDH, diferentes isoformas de citocromo P450).Métodos para determinar um nível ou atividade de váriosparâmetros funcionais são conhecidos na técnica. Porexemplo, determinados métodos adequados são descritos nosexemplos abaixo.

Uma composição (compreendendo o meio acima mencionadoe material biológico) da invenção pode ser preparado paracongelamento em uma série de maneiras, pelo fato de que osvários componentes podem ser combinados em diferentesseqüências. Por exemplo, em uma modalidade, o materialbiológico pode ser introduzido em meio já compreendendo oextrato de planta. Outra possibilidade pode ser, porexemplo, introduzir o material biológico em uma solução demeio e, então, subseqüentemente, introduzir o extrato deplanta na mistura.

Em modalidades, congelamento controlado da composiçãoacima mencionada pode ser realizado usando um dispositivode congelamento programável, o qual facilita taxas deresfriamento ótimas e reprodüzíveis. Tais dispositivos sãoconhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis.

Recipientes preferidos para congelamento da composiçãoacima mencionada são aqueles que são estáveis emtemperaturas criogênicas e permitem transferência de calorapropriada para ambos congelamento e descongelamento. Taisrecipientes incluem, por exemplo, frascos plásticos vedadospara pequenos volumes (por exemplo, 1-2 ml) e sacos depoliolefina (tipicamente mantidos entre placas de metalpara congelamento) para volumes maiores, ambos os quais sãoconhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis.

Congelamento é, geralmente, realizado usando meiosadequados (tais como um congelador, o dispositivo acimamencionado ou contato do material biológico com umsubstrato/banho abaixo de 0 0C apropriado) para diminuir atemperatura da amostra para uma temperatura adequada (porexemplo, -20 °C, -80 °C) em uma taxa apropriada. Emmodalidades, as amostras congeladas podem ser transferidaspara um recipiente adequado para armazenamento criogênico alongo prazo, tal como aqueles empregando armazenamento emnitrogênio líquido (cerca de -196 °C) ou em vapor denitrogênio líquido (cerca de -105 °C) . Tais dispositivossão conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis.

A presente invenção é ilustrada em maiores detalhespor meio dos exemplos não limitativos a seguir.Exemplos.

Exemplo 1: Materiais e Métodos.Produtos químicos: Colagenase, insulina, meio deWilliams E (WME), sulfóxido de dimetila (DMSO), resofurinae todos os outros produtos químicos foram obtidos da SigmaChemical Company (St-Louis, MO) . Meio de Leibovitz (L-15) ,gentamicina e vitaminas MEM foram obtidos da Gibco/LifeTechnologies (Burlington, ONT) . Calceína, 7-etóxi-resorufin-O-deetilase (EROD) e 7-pentóxi-resorufin-O-depentilase (PROD) foram obtidos da Molecular Probes(Eugene, OR). Iodeto de propídio (PI) foi obtido daCalbiochem (San Diego, CA) . Anticorpos para IAl decitocroma P-450 (IgG policlonal de cabra CYPlAl (G-18)) epara IgG anti-cabra (IgG anti-cabra de camundongo conjugadaa peroxidase de Armoracia rusticana (HRP)) foram obtidos daSanta Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) . Soro bovinofetal (FBS) foi obtido da Medicorp (Montreal, QC).

Materiais de planta e condições de crescimento: Ogenótipo de trigo do inverno (Triticum aestivum L. cvClair, LT50 (temperatura letal qüe mata 50% das mudas) - 19°C foi usado nesse estudo. As plantas de trigo foramcrescidas e tratadas conforme previamente descrito (12) .Resumidamente, plantas de controle foram crescidas durante10 dias a 20 °C e aclimatação ao frio (CA) foi realizada a4 °C por um período de 7 dias.Extração de proteína total: As partes aéreas das mudasforam coletadas e misturadas até que uma solução homogêneafosse obtida com água nanopura gelada. 0 homogeneizado foifiltrado através de 3 camadas de "Miracloth" e centrifugadoa 30.000 g durante 4 5 min a 4 °C. O pH do sobrenadante foiajustado para 7,4 e esterilizado usando um filtro de 0,22μm. O extrato foi concentrado através de liofilização e armazenado a -20 °C.

Isolamento e cultura de hepatócitos: Kepatócitos foramisolados de ratos machos "Sprague-Dawley" (120-180 g) ,obtidos de Charles River Canada (Saint-Constant, QC) , emuma técnica de digestão com colagenase em duas etapas (13;14) . Os animais foram mantidos e manipulados de acordo comas diretri-zes do Canadian Council on Animal Care ("conselhocanadense de cuidado ao animal") para o cuidado e uso deanimais experimentais (15). A viabilidade celular foiavaliada através de citometria de fluxo (FACScan™, BectonDickinson, Oakville, ON) com PI a 2 μΜ (16) . Célulasisoladas foram diluídas a 3,5 X 105/ml e cultivadas emlâminas de cultura tecidual (Corning, Acton, MA) em meioWME suplementado com FBS a 10%, insulina (0,2 μg/ml) egentamicina (50 μg/ml) em uma atmosfera umidificada de 5%de CO2 e 95% de ar a 37 °C. Após 3 h, o meio foi trocado eas células foram incubadas durante a noite em meio L-15(16) suplementado com insulina e gentamicina.

Crioconservação de hepatócitos isolados: Imediatamenteapós isolamento, a suspensão de hepatócito foi adicionada auma mistura de meio WME gelado suplementado com FBS a 10% eextratos de proteína de trigo (WPEs) não-aclimatados (NA)ou CA em criofrascos gelados. Controles positivos (DMSO a15% + FBS a 50%) e negativos (WME) foram também preparados.Os tubos contendo células foram, então, congelados em umataxa de resfriamento de 1 ° C/min em um recipiente decongelamento controlado (Nalgene, Rochester, NY) para -80°C durante um dia e, então, transferidos para nitrogêniolíquido.

Descongelamento de hepatócitos crioconservados: Oshepatócitos congelados foram descongelados rapidamenteatravés de leve agitação em um banho de água a 37 °C.Análises de viabilidade foram realizadas sobre a suspensãode hepatócito. Para análises metabólicas e de aderência, asuspensão de hepatócito foi diluída 10 vezes através daadição de meio WME gelado, imediatamente apósdescongelamento. Uma etapa de centrifugação em "Percoll"isotônico a 30% foi realizada para remover as célulasmortas quando a viabilidade foi menor do que 80%. Apóscentrifugação (4 °C, 50 g, 2 min), hepatócitos foramsuspendidos em 10 ml de meio WME. Os hepatócitos foramlavados duas vezes conforme acima, então, suspendidos a 3,5X 105/ml em WME e cultivados em lâminas de cultura detecido em meio WME suplementado com insulina e gentamicinaem uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 e 95% de ar a 37°C. Após 3 h, o meio foi trocado e as células foramincubadas durante a noite em meio L-15 suplementado cominsulina e gentamicina.

Ensaios de viabilidade: Após ciclos decongelamento/descongelamento, suspensões de hepatócitosforam coradas com as sondas fluorescentes calceína a 4 μΜ ePI a 2 μΜ em meio WME durante 5 minutos. As amostras foramanalisadas por citometria de fluxo (excitação a 488 nm)usando um Becton Dickinson FACScan™. 0 número de célulasvivas expressando a fluorescência verde da calceína e onúmero de células mortas expressando a fluorescênciavermelha de PI foram determinados com o software CellQuest™ (Becton Dickinson, Oakville, ON).

Atividade de lactato desidrogenase (LDH) foideterminada no meio de hepatócitos cultivados como umamedida de deterioração de hepatócitos, conforme descritopor Moldeus e colaboradores (17) . 0 meio de cultura dehepatócito foi removido diariamente e a atividade do LDHliberado no meio foi quantificada (18).

Eficiência de plaqueamento: A eficiência deplaqueamento foi determinada através de medição daatividade de LDH em células antes da semeadura e emculturas de 3 e 24 h de idade. A eficiência de plaqueamentofoi definida como a atividade de LDH em culturas de 24 h deidade dividido pela atividade de LDH em células em pré-cultura.

Aderência e morfologia celular: Aderência e morfologiacelular foram avaliadas através de microscopia confocal.Para as observações por microscopia confocal, lâminas decultura tecidual revestidas com colágeno foram usadas.

Todas as análises foram realizadas usando o microscópioconfocal MRC1024 da BioRad (Microscience, Cambridge, MA)equipado com um laser de argônio (excitação a 488 nm)combinado com um microscópio invertido Eclipse modelo TE3000 (Nikon, Montreal, QC) com lentes objetivas de 40XHoffman.

Determinação de secreção de albumina: A secreção dealbumina de hepatócitos foi quantificada a cada 24 h, até96 h, em diferentes meios de cultura de hepatócito atravésdo ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) de acordo comUotila e colaboradores (19) , com modificações mínimas (20) .Resumidamente, lâminas com 96 poços (Nunc, Napierville, IL)foram cobertas com anti-soro de coelho anti-albumina derato (1 μ5/π\1) . As lâminas foram incubadas por 3 0 min emtemperatura ambiente (RT) , então, a 4 0C durante a noite,lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS),bloqueadas durante 3 0 min em RT com FBS a 5% em PBS e,então, lavadas novamente com PBS. Diluições seriais daamostra e padrão de albumina foram adicionadas (200μΐ/poço) . As lâminas foram incubadas para III em "RT" elavadas com PBS suplementado com Tween-20 a 0,05% (PBS-T).Desde então, o anticorpo secundário (anti-albumina de ratoperoxidase-conjugado; 2 μ9/ιη1) foi adicionado e as lâminasforam incubadas durante 1 h em RT. Após 3 lavagens com PBS-T, as lâminas foram incubadas com substrato o-fenilenodiamina (OPND) (NaH2PO4 a 0,1 Μ, 1 mg/ml de OPND,0,4 μΐ/ml de H2O2) durante 3 0 min em RT no escuro. A reaçãofoi cessada com H2SO4 a 4 M. As concentrações de albuminaforam determinadas a 550 nm usando uma curva padrãooscilando de 0 a 250 ng/dl de albumina de rato usando umleitor ELISA (SPECTRAFLuor Plus™, Tecan, CA).

Determinação de uréia: Para avaliar a biotransformaçãomediada por hepatócito de amônia em uréia, hepatócitoscultivados foram expostos ao meio de cultura L-15 contendoNH4Cl a 10 mM. Amostras de meio foram coletadas no início eapós intervalos de exposição à amônia de 24 h, durante 3dias. A concentração de uréia nas amostras foi medidacolorimetricamente usando o conjunto reagente de nitrogêniouréia (BioTron Diagnostics, Hemet, CA) e um leitor ELISA a540 nm. As concentrações de uréia foram determinadas usandouma curva padrão oscilando de 0 a 45 mg/gl de uréia. Osresultados são apresentados como μg de uréia/106 células.

Atividade enzimãtica e expressão de proteína deisoformas de citocromo P450: As atividades enzimáticas deCYPlAl e 2B foram medidas em culturas de hepatócitosinduzidas com benzo-a-pireno (10 μΜ). Células foram lavadas2 vezes com PBS e os substratos EROD (8 μΜ) ou PROD (17 μΜ)(Aexc: 530 nm; Xem: 585 nm) foram adicionados às placas decultura e incubados por 1 h. 0 sobrenadante (3 00 μΐ) foimisturado com 200 μΐ de ETOH e a atividade em 200 μΐ damistura foi medida usando um leitor ELISA a 585 nm. Aatividade enzimática foi determinada usando uma curvapadrão oscilando de 0 a 200 μΜ de resorufina.

A expressão da proteína CYPlAl foi determinada apósuma indução de 24 h com benzo-a-pireno (10 μΜ) . As célulasforam lavadas com PBS e raspadas das lâminas, suspendidasem 100 μΐ de tampão de Iise (Tris-HCl a 20 mM, EGTA a 2 mM,EDTA a 2 mM, β-mércaptoetanol a 6 mM) e homogeneizadas

através de ultra-som. Amostras de proteína (30 μ9) forammisturadas com tampão de amostra de Laemmli e separadassobre um gel de SDS poliacrilamida a 12% (SDS-PAGE) (21) .Eletroforese foi realizada a 140 volts por 50 min. Atransferência de proteínas para uma membrana de fluoreto depolivinilideno (PVDF) foi realizada a 8 0 mA/membrana por1,5 h. As membranas foram bloqueadas com 5% de leite em póem tampão TBS-T (Tris-HCl a 2 mM, NaCl a 13,7 mM, Tween a0,1%) por 1 h em RT. As membranas foram lavadas 3 vezes comTBS-T, incubadas com um anticorpo primário (CYPlAl (G-18) ,diluídas 1/1000) durante a noite a 4 °C, lavadas 3 vezescom TBS-T e, então, incubadas por 1 h com o anticorposecundário HRP conjugado (IgG anti-cabra, diluição a1/1000) . As bandas de proteína que reagiram com o anticorpoforam reveladas usando o reagente Western LightningChemiluminescence Plus™ (PerkinElmer Life Sciences, Boston,MA) e o filme BioMax MS™ (Eastman-Kodak, Rochester, NY) . Asproteínas sobre o filme foram quantificadas através dedensitometria usando um teste Molecular Dynamics (Amersham,Baie d'Urfe, Qc) e o software IP Lab Gel (Scanalytics Inc.,Fairfax, VA).Análise estatística: Resultados quantitativos foramexpressos como a média + SD de pelo menos 3 placasrepetidas para cada condição com um mínimo de 3 repetiçõesexperimentais, com cada repetição experimental usandocélulas de um procedimento de isolamento de hepatócitodiferente. Os dados foram normalizados para os controlesexperimentais não crioconservados em cada intervalo detempo no mesmo experimento. A comparação entre os grupos ea análise para as diferenças entre as médias dos controlese grupos tratados foram realizadas usando ANOVA seguidopelo teste "post-hoc" de Newman-Keuls (P<0,05). 0 limiarpara significância estatística foi considerado p<0,05 (*) ,p<0,01 (**) e p<0,001 (***).

Exemplo 2: Criopreservação de hepatócitos de rato usandotécnicas clássicas.

Experimentos iniciais foram projetados para determinaro protocolo ótimo de crioconservação para hepatócitosrecentemente isolados de rato usando DMSO. Concentrações dehepatócito oscilando de 1,5 a 5xl06 células/ml foramcongeladas para -80 °C em meio de Williams suplementado comFBS a 10% e DMSO de 5 a 25%. Os melhores resultados foramobtidos quando células foram crioconservadas com DMSO a15%. A taxa de congelamento também foi avaliada usando trêsdiferentes aparelhos de congelamento: Styrofoam (4 h a -20°C, 18 h a -80 °C) , um congelador programável (-6°C/h até -20 0Ci então, 18 h a -80 0C) ou um aparelho Nalgene™ (-l°C/min até -80 0C por 18 h) . Os resultados indicaram queuma concentração de hepatócito de 5xl06 células/ml econgelamento no aparelho Nalgene™ constituíam as condiçõesótimas para a crioconservação de hepatócitos de rato usandoDMSO. Essas condições foram usadas como uma referência paracrioconservação clássica nos experimentos subseqüentes.

Exemplo 3: Potencial de crioconservação de WPEs sobrehepatócitos de rato.

A capacidade de diferentes WPEs de melhorar aviabilidade de hepatócitos de rato crioconservados,comparado com DMSO, foi avaliada. Os resultados na figura 1apresentam a viabilidade de hepatócitos de rato após 7 diasde congelamento na presença de WPEs, outras proteínas eDMSO comparado com hepatócitos frescos. A viabilidade dehepatócitos com DMSO a 15% + FBS a 50% (controle positivo)foi de 62,5%, comparado com 86,3% para hepatócitosrecentemente isolados. Quando DMSO a 15% + 20 mg de BSAforam usados, a viabilidade de hepatócitos crioconservadosfoi de 3 8,7%. Por outro lado, baixa viabilidade foi obtidana presença de 20 mg de BSA, meio WME, 20 mg de FBS ouproteínas de E. coli (3,9; 1,6; 6,5 e 3,3%;respectivamente). Entretanto, resultados significativosforam obtidos com a adição de 20 mg de WPE NA,proporcionando uma viabilidade de 68,4%. Esses níveis deviabilidade eram comparáveis com aqueles obtidos com ocrioprotetor clássico, DMSO. Em comparação, uma quantidadeigual de WPE CA proporcionou uma viabilidade de 35,8% (fig.1). Essas descobertas demonstram que os WPEs contêmcompostos específicos com atividade crioprotetora pelomenos equivalente ao crioprotetor comumente usado, DMSO.

Nossos resultados também demonstram que extratos deoutras plantas, tais como cevada, centeio, alfafa eespinafre, possuíam atividade crioprotetora parahepatócitos (veja figura 6). Uma quantidade igual de outrasproteínas, tais como BSA ou proteínas de E. coli, nãomostraram qualquer atividade de crioconservação, indicandoque a atividade crioprotetora é específica aos extratos de planta.

A viabilidade de hepatócitos também foi avaliadausando a liberação de LDH. A liberação de LDH celular medea perda de viabilidade do hepatócito em culturaproporcionando uma medição indireta da integridade damembrana das células. Os resultados na fig. 2 mostram queos níveis de viabilidade para hepatócitos crioconservadoscom WPEs foram melhores do que aqueles obtidos com DMSO.Após 24 h em cultura, altas viabilidades de 76,4 e 89,3%foram obtidas para hepatócitos crioconservadas com os WPEsNA e CA, respectivamente, comparado com 60,2% para o DMSOclássico. Viabilidade aperfeiçoada na presença de WPEs,comparado com DMSO, foi mantida durante o período decultura de 96 h. WPEs melhoraram a viabilidade em níveissimilares àqueles obtidos em hepatócitos frescos durante 96h. O teste com LDH realizado sobre hepatócito pósdescongelamento após semeadura demonstra, adicionalmente,que hepatócitos crioconservados com WPEs mantiveram melhorviabilidade celular em cultura do que aqueles que foramcrioconservados com DMSO. Foi ainda demonstrado que aviabilidade celular dos hepatócitos crioconservados com WPEfoi similar àquela de hepatócitos frescos, indicando queWPEs são menos tóxicos e mais eficientes como agentes decrioconservação do que DMSO.

Exemplo 4: Eficiência de plaqueamento, aderência emorfologia celular dos hepatócitos de rato crioconservados.

A capacidade de células descongeladas de sobreviver emcultura é uma indicação da crioconservação com sucesso dehepatócitos. A eficiência do plaqueamento de células foiavaliada 3 h e 24 h após semeadura e cultura. Após 3 h emcultura, as eficiências de plaqueamento dos hepatócitos derato descongelados crioconservados com DMSO, WPEs NA e CA,foram ligeiramente menores do que para os hepatócitos derato recentemente isolados (62,5 a 64,9%, comparado com77,3%, tabela 1) . Após 24 h em cultura, a eficiência deplaqueamento foi maior do que 50% para os hepatócitos derato descongelados crioconservados com DMSO, WPEs CA e NA,com relação aos hepatócitos não crioconservados (100%)(tabela 1) . Essas descobertas demonstram que a eficiênciade plaqueamento de hepatócitos era comparável na presençade WPEs e do crioprotetor clássico DMSO.

Tabela 1: Eficiência de plaqueamento de hepatócitos de ratodescongelados após crioconservação com WPEs comparado comhepatócitos recentemente isolados.

<table>table see original document page 44</column></row><table>

*Eficiência de plaqueamento foi avaliado pela atividade deLDH em hepatócitos recentemente isolados e crioconservados,conforme descrito em materiais e métodos. Os dados sãoexpressos como a média ± SEM a partir de três experimentosdiferentes.

Análise morfológica dos hepatócitos, crioconservadosdescongelados, através da microscopia confocal é mostrada24 h após semeadura de hepatócitos que foramcrioconservados com WPEs (Fig. 3C e D), assim como com DMSO(fig. 3B) , comparado com hepatócitos recentemente isolados(fig. 3A) . Na mesma concentração de célula, os hepatócitosfrescos e crioconservados com WPE mostravam morfologiacelular similar. Hepatócitos crioconservados com WPE (fig.3C e D) pareciam como a célula fresca (fig. 3A) com umamorfologia celular redonda. Eles também pareciam ser maisdispersos do que aqueles crioconservados com DMSO (fig.3B) . Além disso, nós podemos observar a presença decontatos célula a célula para ambos hepatócitos frescos,crioconservados com WPEs NA e CA, enquanto que nenhumcontato célula a célula foi detectado para os hepatócitoscrioconservados com DMSO (fig. 3B).

Os estudos de eficiência de plaqueamento, assim,indicam que ambos hepatócitos crioconservados com DMSO eWPEs tiveram um bom desempenho, com eficiências de fixaçãona faixa de 50% com relação às células frescas. Essesresultados eram similares àqueles obtidos para hepatócitoscrioconservados com DMSO em outros estudos (22,23). Alémdisso, análise microscópica de hepatócitos pósdescongelados semeados sobre placas revestidas com colágenodemonstrou sua capacidade de se fixar e restaurar amorfologia próxima do normal com contatos célula a célula,após crioconservação com WPE. As propriedades de fixação emorfologia celular foram melhores conservadas emhepatócitos que tinham sido crioconservados com WPE, em vezde DMSO, demonstrando novamente a maior eficiência de WPEsem crioconservar hepatócitos de rato. Os contatos célula acélula estavam presentes em hepatócitos de ratocrioconservados com WPE, sugerindo uma melhor conservaçãode integridade da membrana.

Exemplo 5: Secreção de albumina por hepatócitos de ratocrioconservados.

Secreção de albumina é um marcador especifico parasíntese de proteína em hepatócitos, porque requer expressãode gene fígado específico e vias traducionais e secretóriasintactas. Os efeitos de WPEs sobre a produção de albuminapor hepatócitos de rato crioconservados foram monitoradosatravés de um período de 4 dias após plaqueamento em placasde cultura (fig. 4A) . Secreção de albumina por hepatócitosrecentemente isolados diminuiu progressivamente com o tempodos dias 1 a 4, embora a diminuição fosse muito mais rápidaem células que tinham sido crioconservadas com DMSO. Emhepatócitos frescos, 85% da atividade secretora de albuminaforam mantidos após 4 dias em cultura enquanto que, emcélulas crioconservads com DMSO, restaram apenas 48% deatividade. Contudo, 83% da atividade secretora de albuminaforam mantidos em hepatócitos que foram crioconservados comos WPEs CA após 4 dias. Esse valor é comparável com aquelede hepatócitos recentemente isolados. Quando hepatócitosforam crioconservados com WPEs NA, os níveis de secreção dealbumina foram aproximadamente 3 0% menos do que aqueles dehepatócitos crioconservados com WPEs CA. Esses resultadosdemonstram que a função hepato-específica da secreção dealbumina foi bem mantida no decorrer do período de culturade 4 dias em hepatócitos crioconservados com WPE e que essafunção foi consideravelmente aperfeiçoada com WPEs CAcomparado com DMSO (fig. 4A).

Exemplo 6: Desintoxicação de amônio por hepatócitos de rato crioconservados.

Os efeitos de WPEs sobre a desintoxicação de amôniopor hepatócitos de rato crioconservados foram medidos nosdias 2, 3 e 4 após plaqueamento em placas de cultura,comparado com células frescas (fig. 4B) . A produção deuréia por hepatócitos recentemente isolados ecrioconservados com DMSO diminuiu progressivamente com otempo. Uma diminuição importante na produção de uréia peloshepatócitos crioconservados com DMSO foi observada noquarto dia após plaqueamento, comparado com os hepatócitosfrescos. Os hepatócitos frescos mantiveram 55% da atividadede desintoxicação inicial, enquanto que as células tratadascom DMSO mantiveram apenas 16% da atividade inicial após 4dias em cultura. Por outro lado, após subtração daatividade de arginase da planta, a desintoxicação de amônioem hepatócitos crioconservados com WPEs foi similar àquelados frescos durante intervalos de tempo de 48-72 e 72-96 h.Essas descobertas indicam que a função hepato-especxfica dedesintoxicação de amônio foi bem mantida no decorrer doperíodo de cultura de 4 dias com WPE com relação ao padrãoDMSO (fig. 4B).

Exemplo 7: Atividades da enzima de citocromo P450 atravéshepatócitos de rato crioconservados.

A atividade das enzimas de citocromo P4 5 0 quemetabolizam xenobióticos também foi avaliada como umterceiro marcador de funções hepato-específicas. Aatividade metabólica das isoformas CYPlAl e CYP2B decitocromo P450 foi medida através das análises EROD(CYPlAl) e PROD (CYP2B) após uma indução de 24 h com benzo-a-pireno (fig. 5A) . Comparado com hepatócitos frescos, aatividade relativa das enzimas CYPlAl e CYP2B de P450diminuiu ligeiramente em hepatócitos crioconservados comDMSO, enquanto que foi mantida em hepatócitoscrioconservados com WPEs NA e CA. Análises de "WesternBlot" da isoforma CYPlAl demonstrou que o aumento naatividade benzo-a-pireno induzível estava associado àexpressão elevada da proteína (fig. 5B). Isso indica que aatividade metabólica das isoformas CYPlAl e CYP2B decitocromo P45 0 também foi aperfeiçoada em hepatócitoscrioconservadas com WPE, comparado com DMSO (fig. 5A, B) .Esses resultados indicam que os hepatócitos crioconservadoscom WPE retiveram sua atividade metabólica e sua capacidadede responder a indutores de CYP mais eficientemente do queas células de rato crioconservadas com DMSO.

Exemplo 8: Potencial de crioconservação dos PEs de umavariedade de tipos de planta sobre hepatócitos isolados derato.

Análise da viabilidade de suspensões de hepatócitos derato após congelamento foi avaliada com o teste decalceína/PI através de citometria de fluxo, com resultadosmostrados na figura 6. A viabilidade de hepatócitos de rato(1,5 χ IO6 células/ml) foi avaliada após 7 dias decongelamento em WME, FBS a 10% suplementado com DMSO a 15%e FBS a 50% (DMSO) . 0 efeito de PEs de trigo (Triticumaestivum) cv Clair, trigo cv Glenlae, cevada (Hordeumvulgare), centeio (Secale cereale), alfafa (Medicagosativa) ou espinafre (Spinacia oleracea) sobre aviabilidade da suspensão de hepatócitos de rato também foiavaliada após 7 dias de congelamento em WME suplementadocom 20 mg ou 40 mg ( + ) de PEs de planta NA. Hepatócitosrecentemente isolados (frescos) serviram como umareferência.

Exemplo 9: Crioconservação de vários tipos de célulaseucarióticas com DMSO e WPEs.

Análise da viabilidade de suspensões de célulaseucarióticas após congelamento foi avaliada com um testecom calceína/PI através de citometria de fluxo, comresultados apresentados na figura 7. A viabilidade dehepatócitos primários de rato, linhagens de células A54 9 (carcinoma de pulmão humano), Caco-2 (adenocarcinoma cólon-retal humano), CHO-Bl (ovário de hamster chinêstransfectado com cDNA de TGF-bl), HeLa (células de câncercervical tiradas de Henrietta Lacks), HIEC (células deepitélio intestinal humano) e Jurkat (leucemia de células Thumanas) (1,5 χ IO6 células/ml) foi avaliada após 7 dias decongelamento em seus respectivos meios de crescimentosuplementados com DMSO a 15% e FBS a 50% (DMSO) ou WPEs NAClair (NA). Hepatócitos recentemente isolados (frescos)serviram como uma referência. Esses dados demonstram que oWPE é um melhor agente crioprotetor do que o DMSO.

Exemplo 10: Potencial de crioconservação dos WPEs defrações de precipitado de sulfato de amônio sobrehepatócitos isolados de rato.O efeito de precipitação com sulfato de amônio doextrato de CA sobre a viabilidade celular foi testado.Precipitação com sulfato de amônio é obtida através daadição de sais de amônio aos WPEs para compor aconcentração de sal. As proteínas começam a se precipitar àmedida que a concentração de sal é aumentada. A coleta deproduto separado é denominada fracionamento; a fração dasproteínas precipitadas coletadas entre 41 e 60% desaturação de sal é referida como a fração de 41-60%.Resultados significativos foram obtidos com a fração 41-60do WPE CA, proporcionando uma viabilidade de 50,1%comparado com 25,8% para o WPE CA total (figura 8). Asfrações de 61-80 e 81-100% foram mais eficientes,proporcionando viabilidades de 76,56% e 74,75%,respectivamente, com extrato NA. Para o WPE CA, asviabilidades foram 67,09 e 76,04%. Isso demonstra que aprecipitação com sulfato de amônio tem um efeito positivosobre a viabilidade celular. Nós também observamos que asfrações de proteína 41-60, 61-80 e 81-100 eram isentas desua coloração verde viscosa.

Exemplo 11: Influência do soro bovino fetal sobre opotencial de crioconservação de WPE NA sobre hepatócitosisolados de rato.-Em protocolos de crioconservação, soro bovino fetal(FBS) é usualmente adicionado em concentrações oscilando de10 a 50%. Uma vez que o FBS é de origem animal, elerepresenta um risco potencial de contaminação e criagrandes preocupações de segurança na indústria. Assim, háum interesse crescente no desenvolvimento de novas soluçõesde crioconservação isentas de produtos de origem animal.WPE foi testado como um crioconservante sem suplementaçãode FBS. Diferenças não significativas na viabilidade dehepatócitos foram obtidas quando FBS foi adicionado ou nãoàs soluções de crioconservação (figura 9) . Isso demonstraque a adição de soro bovino não é essencial para acrioconservação de células de hepatócitos primárias.

Exemplo 12: Teor de glúten de WPEs.

Glúten é uma mistura de proteínas prolamina eglutelina presentes no trigo. Doença celíaca é umaintolerância permanente ao glúten que resulta em dano aointestino delgado e é reversível quando glúten é evitadopela dieta. No Codex Alimentarius, alimento "sem glúten" édefinido como um alimento tendo menos do que 200 ppm deglúten. 0 novo Codex Standard proposto para alimentos semglúten define um teor máximo de 20 ppm de glúten emprodutos naturalmente sem glúten e 2 00 ppm de glúten emprodutos tornados sem glúten. Análises quantitativas doteor de glúten foram obtidas para os WPEs NA e CA,proporcionando 0,044 e 0,00 ppm, respectivamente (figura10). isso demonstra que os WPEs NA e CA são produtos semglúten.

Abreviações usadas neste documento: tolerância aocongelamento, "FT"; proteínas anti-congelamento, "AFPs";inibição de recristalização do gelo, -IRI-; extratos deproteína de trigo, "WPE"; meio E de Williams, "WME";sulfóxido dimetil, "DMSO"; meio de Leibovitz, L-15; 7-etóxiresorufin-O-deetilase, "EROD"; 7-pentóxiresorufin-O-depentilase, "PROD"; iodeto de propídio, "PI"; citocromoP450, "CYP"; peroxidase de Armoracia rusticana, "HRP"; sorobovino fetal, "FBS"; aclimatado ao frio, "CA"; nãoaclimatado, "NA"; lactato desidrogenase, "LDH"; ensaioenzimático indireto "ELISA"; temperatura ambiente, - "RT" ;solução salina tamponada com fosfato, "PBS"; PBSsuplementado com Tween-20 a 0,05%, "PBS-T"; o-fenilenodiamina, "OPND"; solução salina tris-tamponada suplementadacom Tween-20 a 0,1%, "TBS-T".

Embora a presente invenção tenha sido descritaconforme acima por meio de modalidades específicas damesma, ela pode ser modificada, sem divergir do espírito enatureza da invenção em questão, conforme definido nasreivindicações em anexo.Referências.

1. Meeks RG, Harrison SD, Bull RJ. Hepatotoxicology. CRCPress ed. FL: Boca Raton, 1991.

2. Clément B, Guillouzo A. Cellular and molecular aspectsof cirrhosis. John Libbey Eurotext, INSERM ed. Paris: 1992.

3. Glicklis R, Shapiro L, Agbaria R, Merchuk JC, Cohen S.Hepatocyte behavior within three-dimensional porousalginate scaffolds. Biotechnol Bioeng 2000; 67: 344-353.

4. Billings RE, McMahon RE, Ashmore J, Wag I e SR. ThemetaboIism of drugs in isolated rat hepatocytes. Acomparison with in vivo drug metabolism and drug metabolismin subcellular liver fractions. Drug Metab Dispôs 1977; 5:518-526.

5. Houston JB. Utility of in vitro drug metabolism data inpredicting in vivo metabolic clearance. Biochem Pharmacol1994; 47: 1469-1479.

6. Kedderis GL. Extrapolation of in vitro enzyme inductiondata to humans in vivo. Chem Biol Interact 1997; 107: 109-121.

7. Zaleski J, Riehburg J, Kauffman FC. Preservation of therate and profile of xenobiotic metabolism in rathepatocytes stored in liquid nitrogen. Biochem Pharmaeol1993; 46: 111-116.

8. Powis G, Santone KS, Melder DC, Thomas L, Moore DJ,Wilke TJ. Cryopreservation of rat and dog hepatocytes forstudies of xenobiotic metabolism and activation. Drug MetabDispôs 1987; 15: 826-832.

9. Santone KS, Melder DC, Powis G. Studies of chemicaltoxicity to fresh and cryopreserved rat hepatocytes.Toxicol Appl Pharmacol 1989; 97: 370-376.

10. Fahy GM. The relevance of cryoprotectant "toxicity" tocryobiology. Cryobiology 1986; 23: 1-13.

11. Schneider U, Mazur P. Osmotic consequences ofcryoprotectant permeability and its relation to thesurvival of frozen-thawed embryos. Theriogenology 1984; 21:-68-79.

12. Danyluk J, Perron A, Houde M, Limin A, Fowler B,Benhamou N e colaboradores. Accumulation of an acidicdehydrin in the vicinity of the plasma membrane during coldácclimation of wheat. Plant Cell 1998; 10: 623-638.

13. Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells.Methods Cell Biol 1976; 13: 29-83.

14. Guillemette J, Marion M, Denizeau F, Fournier. M,Brousseau P. Characterization of the in vitro hepatocytemodel for toxicological evaluation: repeated growthstimulation and glutathione response. Biochem Cell Biol-1993; 71: 7-13.

15. Canadian council on animal care. Guide to the care anduse of experimental animais. 2a ed. Canadian council onanimal care, 1993.

16. Reader S, Marion M, Denizeau F. Flow cytometricanalysis of the effects of tri-n-butyltin chloride oncytosolic free calcium and thiol leveis in isolated rainbowtrout hepatocytes. Toxicology 1993; 80: 117-129.

17. Moldeus P, Hogberg J, Orrenius S. Isolation and use ofliver cells. Methods Enzymol 978; 52: 60-71.

18. Moffatt P, Plaa GL, Denizeau F. Rat hepatocytes withelevated metallothionein expression are resistant to N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine cytotoxicity. ToxicolAppl Pharmacol 1996/136: 200-207.

19. Uotila M, Ruoslahti E, Engvall E. Two-site sandwichenzyme immunoassay with monoclonal antibodies to humanalpha-fetoprotein. J Immunol Methods 1981; 42: 11-15.

20. Wan X, Lachapelle M, Marion M, Fournier M, Denizeau F.Recovery potential of hepatocytes from inhibition ofalbumin secretion by cadmium. J Toxicol Environ Health-1993; 38: 381-392.

21. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4. Nature 1970; 227:-680-685.

22. Silva JM, Day SH, Nicoll-Griffith DA. Induction ofcytochrome-P45O in cryopreserved rat and human hepatocytes.Chem Biol Interact 1999; 121: 49-63.

23. Sosef MN, Baust JM, Sugimachi K, Fowler A, Tompkins RG,Toner M. Cryopreservation of isolated primary rathepatocytes: enhanced survival and long-term hepatospecificfunction. Ann Surg 2005; 241: 125-133.

Claims (114)

1. Meio de crioconservação caracterizado pelo fato decompreender um extrato de planta compreendendo proteína.

2. Meio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o referido extrato é derivado de umaplanta não-aclimatada.

3. Meio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o referido extrato é derivado das partesaéreas ou tecido de folha de uma planta.

4. Meio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a referida planta é de uma família deplanta selecionada de Poaceae (Gramineae) , Leguminoseae eAmaranthaceae.

5. Meio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a referida planta é selecionada de trigo,centeio, cevada, alfafa e espinafre.

6. Meio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o referido extrato é substancialmentesolúvel.

7. Meio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o referido extrato é enriquecido deproteínas.

8. Meio, de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o referido extrato enriquecido deproteínas foi preparado através de precipitação dê sal.

9. Meio, de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de que o referido extrato enriquecido de proteínafoi preparado através de precipitação com sulfato deamônio.

10. Meio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o referido meio é substancialmente isentode DMSO.

11. Meio, de acordo com a reivindicação 1 ou 10,caracterizado pelo fato de que o referido meio ésubstancialmente isento de soro de animal exógeno.

12. Meio, de acordo com a reivindicação 11, caracterizadopelo fato de que o referido soro de animal é soro de bovinofetal.

13. Meio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o referido extrato é substancialmenteisento de glúten.

14. Meio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a viabilidade após descongelamento de ummaterial biológico crioconservado a respeito é maior do queou igual a 4 0%.

15. Meio, de acordo com a reivindicação 14, caracterizadopelo fato de que a viabilidade após descongelamento de ummaterial biológico crioconservado a respeito é maior do queou igual a 5 0%.

16. Meio, de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que a viabilidade após descongelamento de ummaterial biológico crioconservado a respeito é maior do queou igual a 60%.

17. Meio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o nível ou atividade de um parâmetrofuncional após descongelamento de um material biológicocrioconservado a respeito é maior do que ou igual a 4 0%.

18. Meio, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o nível ou atividade de um parâmetrofuncional após descongelamento de um material biológicocrioconservado a respeito é maior do que ou igual a 50%.

19. Meio, de acordo com a reivindicação 18, caracterizadopelo fato de que o nível ou atividade de um parâmetrofuncional após descongelamento de um material biológicocrioconservado a respeito é maior do que ou igual a 60%.

20. Meio, de acordo com a reivindicação 17, caracterizadopelo fato de que o referido parâmetro funcional éselecionado da eficiência do plaqueamento, aderência,morfologia celular, secreção celular, síntese de proteína,desintoxicação de amônio e atividade enzimática.

21. Meio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o referido meio é para crioconservação deum material biológico selecionado de uma molécula,organela, célula, embrião, tecido e órgão.

22. Meio, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que a referida célula é uma célula eucariota.

23. Meio, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que a referida célula é uma célula primária,uma linhagem de célula ou uma célula imortalizada.

24. Meio, de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de que a referida célula, embrião, tecido ouórgão é uma célula, embrião, tecido ou órgão mamífero.

25. Meio, de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que a referida célula, embrião, tecido ouórgão é uma célula, embrião, tecido ou órgão humano.

26. Meio, de acordo com a reivindicação 24, caracterizadopelo fato de que a referida célula ou tecido é umhepatócito ou tecido hepático.

27. Composição caracterizada pelo fato de compreender omeio, conforme definido pela reivindicação 1, e um materialbiológico.

28. Composição, de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que o referido extrato éderivado de uma planta não-aclimatada.

29. Composição, de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que o referido extrato éderivado das partes aéreas ou tecido de folha de umaplanta.

30. Composição, de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que a referida planta é de umafamília de planta selecionada de Poaceae (Gramineae),Leguminoseae e Amaranthaceae.

31. Composição, de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que a referida planta éselecionada de trigo, centeio, cevada, alfafa e espinafre.

32. Composição, de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que o referido extrato ésubstancialmente solúvel.

33. Composição, de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que o referido extrato éenriquecido de proteínas.

34. Composição, de acordo com a reivindicação 33,caracterizada pelo fato de que o referido extratoenriquecido de proteínas foi preparado através deprecipitação de sal.

35. Composição, de acordo com a reivindicação 33,caracterizada pelo fato de que o referido extratoenriquecido de proteína foi preparado através deprecipitação de sulfato de amônio.

36. Composição, de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que o referido meio ésubstancialmente isento de DMSO.

37. Composição, de acordo com a reivindicação 27 ou 36,caracterizada pelo fato de que o referido meio ésubstancialmente isento de soro de animal exógeno.

38. Composição, de acordo com a reivindicação 37,caracterizada pelo fato de que o referido soro de animal ésoro de bovino fetal.

39. Composição, de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que o referido extrato ésubstancialmente isento de glúten.

40. Composição, de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que a viabilidade apósdescongelamento de um material biológico crioconservado arespeito é maior do que ou igual a 4 0%.

41. Composição, de acordo com a reivindicação 40,caracterizada pelo fato de que a viabilidade apósdescongelamento de um material biológico crioconservado arespeito é maior do que ou igual a 50%.

42. Composição, de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de que a viabilidade, apósdescongelamento, do material biológico crioconservado arespeito é maior do que ou igual a 60%.

43. Composição, de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que o nível ou atividade de umparâmetro funcional após descongelamento de um materialbiológico crioconservado a respeito é maior do que ou iguala 40%.

44. Composição, de acordo com a reivindicação 43,caracterizada pelo fato de que o nível ou atividade de umparâmetro funcional após descongelamento de um materialbiológico crioconservado a respeito é maior do que ou iguala 50%.

45. Composição, de acordo com a reivindicação 44,caracterizada pelo fato de que o nível ou atividade de umparâmetro funcional após descongelamento do materialbiológico crioconservado a respeito é maior do que ou iguala 60%.

46. Composição, de acordo com a reivindicação 43,caracterizada pelo fato de que o referido parâmetrofuncional é selecionado da eficiência de plaqueamento,aderência, morfologia celular, secreção celular, síntese deproteína, desintoxicação de amônio e atividade enzimática.

47. Composição, de acordo com a reivindicação 26,caracterizada pelo fato de que o referido materialbiológico é selecionado de uma molécula, organela, célula,embrião, tecido e órgão.

48. Composição, de acordo com a reivindicação 47,caracterizada pelo fato de que a referida célula é umacélula eucariota.

49. Composição, de acordo com a reivindicação 47,caracterizada pelo fato de que a referida célula é umacélula primária, uma linhagem de célula ou uma célulaimortalizada.

50. Composição, de acordo com a reivindicação 48,caracterizada pelo fato de que a referida célula, embrião,tecido ou órgão é uma célula, embrião, tecido ou órgãomamífero.

51. Composição, de acordo com a reivindicação 50,caracterizada pelo fato de que a referida célula, embrião,tecido ou órgão é uma célula, embrião, tecido ou órgãohumano.

52. Composição, de acordo com a reivindicação 50,caracterizada pelo fato de que a referida célula ou tecidoé um hepatócito ou tecido hepático.

53. Composição, de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que a referida composição écongelada.

54. Método para crioconservação de um material biológicocaracterizado pelo fato de que o referido método compreendecongelamento de uma suspensão do material biológico nomeio, conforme definido pela reivindicação 1.

55. Método para crioconservação de um material biológicocaracterizado pelo fato de que o referido método compreendeintrodução do material biológico no meio, conforme definidopela reivindicação 1, e congelamento do meio compreendendoo material biológico.

56. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizadopelo fato de que o referido extrato é derivado de umaplanta não-aclimatada.

57. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizadopelo fato de que o referido extrato é derivado das partesaéreas ou tecido de folha de uma planta.

58. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizadopelo fato de que a referida planta é de uma família deplanta selecionada de Poaceae (Gramineae) , Leguminoseae eAmaranthaceae.

59. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizadopelo fato de que a referida planta é selecionada de trigo,centeio, cevada, alfafa e espinafre.

60. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizadopelo fato de que o referido extrato é substancialmentesolúvel.

61. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizadopelo fato de que o referido extrato é enriquecido deproteína.

62. Método, de acordo com a reivindicação 61, caracterizadopelo fato de que o referido extrato enriquecido de proteínafoi preparado através de precipitação de sal.

63. Método, de acordo com a reivindicação 62, caracterizadopelo fato de que o referido extrato enriquecido de proteínafoi preparado através da precipitação de sulfato de amônio.

64. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracterizadopelo fato de que o referido meio é substancialmente isentode DMSO.

65. Método, de acordo com a reivindicação 54 ou 64,caracterizado pelo fato de que o referido meio ésubstancialmente isento de soro de animal exógeno.

66. Método, de acordo com a reivindicação 65, caracterizadopelo fato de que o referido soro de animal é soro de bovinofetal.

67. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizadopelo fato de que o referido meio é substancialmente isentode glúten.

68. Método, de acordo com a reivindicação 54 ou 55,caracterizado pelo fato de que a viabilidade, apósdescongelamento, do material biológico crioconservado noreferido meio é maior do que ou igual a 4 0%.

69. Método, de acordo com a reivindicação 68, caracterizadopelo fato de que a viabilidade, após descongelamento, domaterial biológico crioconservado no referido meio é maiordo que ou igual a 50%.

70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracterizadopelo fato de que a viabilidade, após descongelamento, domaterial biológico crioconservado no referido meio é maiordo que ou igual a 60%.

71. Método, de acordo com a reivindicação 54 ou 55,caracterizado pelo fato de que o nível ou atividade de umparâmetro funcional após descongelamento do material biológico crioconservado a respeito é maior do que ou iguala 40%.

72. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizadopelo fato de que o nível ou atividade de um parâmetrofuncional após descongelamento do material biológicocrioconservado a respeito é maior do que ou igual a 50%.

73. Método, de acordo com a reivindicação 72, caracterizadopelo fato de que o nível ou atividade de um parâmetrofuncional após descongelamento do material biológicocrioconservado a respeito é maior do que ou igual a 60%.

74. Método, de acordo com a reivindicação 71, caracterizadopelo fato de que o referido parâmetro funcional éselecionado da eficiência de plaqueamento, aderência,morfologia celular, secreção celular, síntese de proteína,desintoxicação de amônio e atividade enzimática.

75. Método, de acordo com a reivindicação 54, caracterizadopelo fato de que o referido material biológico éselecionado de uma molécula, organela, célula, embrião,tecido e órgão.

76. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizadopelo fato de que a referida célula é uma célula eucariota.

77. Método, de acordo com a reivindicação 76, caracterizadopelo fato de que a referida célula é uma célula primária,uma linhagem de célula ou uma célula imortalizada.

78. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizadopelo fato de que a referida célula, embrião, tecido ouórgão é uma célula, embrião, tecido ou órgão mamífero.

79. Método, de acordo com a reivindicação 78, caracterizadopelo fato de que a referida célula, embrião, tecido ouórgão é uma célula, embrião, tecido ou órgão humano.

80. Método, de acordo com a reivindicação 75, caracterizadopelo fato de que a referida célula ou tecido é umhepatócito ou tecido hepático.

81. Kit ou embalagem caracterizada pelo fato de compreendero meio conforme definido pela reivindicação 1.

82. Uso do meio, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de ser para a crioconservação de ummaterial biológico.

83. Extrato de planta compreendendo proteína caracterizadopelo fato de ser para uso em crioconservação.

84. Extrato, de acordo com a reivindicação 83,caracterizado pelo fato de que o referido extrato éderivado de uma planta não-aclimatada.

85. Extrato, de acordo com a reivindicação 83,caracterizado pelo fato de que o referido extrato éderivado das partes aéreas ou tecido de folha de umaplanta.

86. Extrato, de acordo com a reivindicação 83,caracterizado pelo fato de que a referida planta é de umafamília de planta selecionada de Poaceae (Gramineae) ,Leguminoseae e Amaranthaceae.

87. Extrato, de acordo com a reivindicação 83,caracterizado pelo fato de que a referida planta éselecionada de trigo, centeio, cevada, alfafa e espinafre.

88. Extrato, de acordo com a reivindicação 83,caracterizado pelo fato de que o referido extrato ésubstancialmente solúvel.

89. Extrato, de acordo com a reivindicação 83,caracterizado pelo fato de que o referido extrato éenriquecido de proteína.

90. Extrato, de acordo com a reivindicação 89,caracterizado pelo fato de que o referido extratoenriquecido de proteína foi preparado através deprecipitação de sal.

91. Extrato, de acordo com a reivindicação 90,caracterizado pelo fato de que o referido extratoenriquecido de proteína foi preparado através daprecipitação de sulfato de amônio.

92. Extrato, de acordo com a reivindicação 83,caracterizado pelo fato de que o referido extrato é usadosob condições de crioconservação que são substancialmenteisento de DMSO.

93. Extrato, de acordo com a reivindicação 83 ou 92,caracterizado pelo fato de que o referido extrato é usadosob condições de crioconservação que são substancialmenteisentas de soro de animal exógeno.

94. Extrato, de acordo com a reivindicação 93,caracterizado pelo fato de que o referido soro de animal ésoro de bovino fetal.

95. Extrato, de acordo com a reivindicação 83,caracterizado pelo fato de que o referido extrato ésubstancialmente isento de glúten.

96. Extrato, de acordo com a reivindicação 83,caracterizado pelo fato de que a viabilidade apósdescongelamento de um material biológico crioconservadousando o referido extrato é maior do que ou igual a 4 0%.

97. Extrato, de acordo com a reivindicação 96,caracterizado pelo fato de que a viabilidade apósdescongelamento de um material biológico crioconservadousando o referido extrato é maior do que ou igual a 50%.

98. Extrato, de acordo com a reivindicação 97,caracterizado pelo fato de que a viabilidade apósdescongelamento de um material biológico crioconservadousando o referido extrato é maior do que ou igual a 60%.

99. Extrato, de acordo com a reivindicação 83,caracterizado pelo fato de que o nível ou atividade de umparâmetro funcional após descongelamento de um materialbiológico crioconservado usando o referido extrato é maiordo que ou igual a 4 0%.

100. Extrato, de acordo com a reivindicação 99,caracterizado pelo fato de que o nível ou atividade de umparâmetro funcional após descongelamento de um materialbiológico crioconservado usando o referido extrato é maiordo que ou igual a 50%.

101. Extrato, de acordo com a reivindicação 100,caracterizado pelo fato de que o nível ou atividade de umparâmetro funcional após descongelamento de um materialbiológico crioconservado usando o referido extrato é maiordo que ou igual a 60%.

102. Extrato, de acordo com a reivindicação 101,caracterizado pelo fato de que o referido parâmetrofuncional é selecionado da eficiência de plaqueamento,aderência, morfologia celular, secreção celular, síntese deproteína, desintoxicação de amônio e atividade enzimática.

103. Extrato, de acordo com a reivindicação 83,caracterizado pelo fato de que o referido extrato é paracrioconservação de um material biológico selecionado de umamolécula, organela, célula, embrião, tecido e órgão.

104. Extrato, de acordo com a reivindicação 103,caracterizado pelo fato de que a referida célula é umacélula eucariota.

105. Extrato, de acordo com a reivindicação 104,caracterizado pelo fato de que a referida célula é umacélula primária, uma linhagem de célula ou uma célulaimortalizada.

106. Extrato, de acordo com a reivindicação 103,caracterizado pelo fato de que a referida célula, embrião,tecido ou órgão é uma célula, embrião, tecido ou órgãomamífero.

107. Extrato, de acordo com a reivindicação 106,caracterizado pelo fato de que a referida célula, embrião,tecido ou órgão é uma célula, embrião, tecido ou órgãohumano.

108. Extrato, de acordo com a reivindicação 106,caracterizado pelo fato de que a referida célula ou tecidoé um hepatócito ou tecido hepático.

109. Kit ou embalagem caracterizado pelo fato decompreender o extrato, conforme definido pelareivindicação 83, juntamente com instruções para acrioconservação de um material biológico.

110. Uso do extrato, de acordo com a reivindicação 83,caracterizado pelo fato de ser para a crioconservação de ummaterial biológico.

111. Método para crioconservação de um material biológico,o referido método caracterizado pelo fato de compreender aintrodução do extrato, conforme definido pela reivindicação-83, em um meio de crioconservação antes do congelamento.

112. Composição caracterizada pelo fato de compreender oextrato, conforme definido pela reivindicação 83, e ummaterial biológico.

113. Composição, de acordo com a reivindicação 112,caracterizada pelo fato de que a referida composição écongelada.

114. Composição caracterizada pelo fato de compreender oextrato, conforme definido pela reivindicação 83, e umcarreador ou veículo biologicamente compatível ouaceitável.