BRPI0615785A2 - inibidor da absorção de colesterol - Google Patents

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BRPI0615785A2
BRPI0615785A2 BRPI0615785-8A BRPI0615785A BRPI0615785A2 BR PI0615785 A2 BRPI0615785 A2 BR PI0615785A2 BR PI0615785 A BRPI0615785 A BR PI0615785A BR PI0615785 A2 BRPI0615785 A2 BR PI0615785A2
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Hiroko Hayakawa
Tohru Iino
Fumiyasu Ishikawa
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Yakult Honsha Kk
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Abstract

INIBIDOR DA ABSORçãO DE COLESTEROL. é relatado uma bactéria pertencente ao genero Bifidobacterium que apresenta uma excelente habilidade de sobreviver em trato digestivo, tem um efeito de inibir a absorção de colesterol no trato intestinal, é excelente na melhora do metabolismo de lipídio (por exemplo, um efeito de reduzir o nível de colesterol no sangue) e apresenta uma alta taxa de sobrevivência após armazenamento. Também é relatado um inibidor de absorção de colesterol usando a bactéria. O inibidor de absorção de colesterol compreende, como um ingrediente ativo, pelo menos um microorganismo selecionado de Bifidobacterlum animalis subsp. animalis YIT 10394, Bifidobacterium animalis subsp. lactis JCM 1253, Bifidobacterium animalis subsp. lactis JCM 7l17 e Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum.

Description

"INIBIDOR DA ABSORÇÃO DE COLESTEROL"
Campo técnica
A presente invenção se relaciona a bactérias per-tencentes ao gênero Bifidobacterium que tem um excelente e-feito de inibir a absorção de colesterol, e um inibidor daabsorção de colesterol contendo estas bactérias pertencentesao gênero Bifidobacterium como um ingrediente ativo.
Antecedentes da Área
Colesterol existe em muitas células e primariamen-te desempenha papeis fisiológicos de manutenção das funçõescelulares como componentes das lipoproteinas ou membranasbiológicas, servindo como matéria bruta para o ácido biliare vários hormônios, e equivalente. Entretanto, sabe-se queos níveis de colesterol séricos aumentados resultantes daingestão excessiva de alimentos com alto teor de colesteróisleva a arteriosclerose. Nos hábitos alimentares modernos commuitas oportunidades de ingerir colesterol, é necessário su-primir a concentração de colesterol no"corpo.
Além disso, foi relatada que as células bacteria-nas de Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescen-tis, Bifidobaeterium breve, Bifidobaeterium infantis e Bifi-dobaeterium longum tem efeitos de melhora no lipidio sangüí-neo (Documento de patente 1). Em particular, Bifidobacteriumlongum foi bem estudado, e relatos mostraram que Bifidobae-terium longum SBT 2933R (FERM P-8743) tem efeitos excelentes(Documento· não patente 1), e o uso das células desta bacté-ria ou sua cultura como um inibidor da elevação do coleste-rol sérico foi proposto (Documento patente 2). De maneirageral, entretanto, bactérias pertencentes ao gênero Bifido-bacterium não são resistentes ao oxigênio assim como ao á-cido gástrico e ácido biliar no organismo. Portanto, existeum problema que, quando as células desta bactéria ou suacultura é administrada oralmente, as células tem pouca habi-lidade de sobrevivência no trato gastrointestinal e mostramefeitos inadequados em muitos casos. De fato, bactérias per-tencentes ao gênero Bifidobacterium que tem excelente habi-lidade de sobrevivência e um efeito de inibição da elevaçãodo colesterol sérico têm sido desejadas.
Entretanto, só se sabe das bactérias pertencentesao gênero Bifidobacterium com excelente habilidade de sobre-vivência que Bifidobacterium longum SBT 10254 (FERM P-14820)(documento de patente 3) e Bifidobacterium longum (FERM BP-7787) (documento patente 4) tem uma excelente capacidade desobrevivência e apresentam um efeito de inibição da elevaçãodo colesterol sérico, que Bifidobacterium longum BB536, Bi-fidobaeterium breve ATCC 15700 e Bifidobaeterium animalisATCC 25527 (documento não patente 2) mostram um efeito desedimentação de colesterol, e equivalente. Na situação atu-al, existem poucas opções de microorganismos que possuem umaexcelente capacidade de sobrevivência e um efeito de inibi-ção de colesterol.
Além disso, como freqüentemente é inevitável arma-zenar drogas ou alimentos usando estes microorganismos porum período longo, se faz necessário alta estabilidade de ar-mazenamento. Entretanto, microorganismos conhecidos tem pou-ca habilidade de sobrevivência após longos períodos de arma-zenamento, e muitos deles tem pouca habilidade de sobrevi-vência, particularmente, sob uma condição não anaeróbica.[Documento de patente 1] JP-A-61-271223[Documento de patente 2] JP-B-6-96537[Documento de patente 3] JP-B-3384907[Documento de patente 4] JP-A-2003-238423[Documento não patente 1] The 6th Japan BifidusFoundation, Annual Meeting Proceedings, p.18, 1987
[Documento não patente 2] Letters in Applied Mi-crobiology, Vol.21, 149-151, 1995Relato da Invenção
Problemas a serem resolvidos na InvençãoDe fato, um objeto da presente invenção é forneceruma bactéria pertencente ao gênero Bifidobacterium que mos-tra uma excelente habilidade de sobrevivência no trato gas-trointestinal, tem efeitos da inibição da absorção de coles-terol no trato intestinal, é excelente nos efeitos de melho-ra do metabolismo de lipidio incluindo a redução do nivel decolesterol do sangue, e mostra uma alta taxa de sobrevivên-cia após armazenamento, e um inibidor da absorção de coles-terol usando o mesmo.
Meios para resolver os problemas
Os inventores da presente invenção conduzido porvários pesquisadores para obter o objeto citado. Como um re-sultado, eles surpreendemente descobriram que Bifidobaeteri-um animalis subsp. animalis YIT 10394, Bifidobacterium ani-malis subsp. Iactis JCM 1253, Bifidobacterium animalissubsp. Iaetis JCM 7117 e Bifidobaeterium pseudolongum subsp.Globosum são excelentes nos efeitos de eliminação de coles-terol, -tem tolerância ao ácido potente e tolerância ao ácidobiliar, além disso, tem um excelente efeito de inibição daabsorção de colesterol nos intestinos, e mostram uma altahabilidade de sobrevivência após armazenamento, em particu-lar, uma alta taxa de sobrevivência após armazenamento mesmosob uma condição não anaeróbica. Portanto, a presente inven-ção conseguiu. Dos microorganismos usados na presente inven-ção, Bifidobacterium animalis subsp. animalis YIT 10394, eBifidobacterium pseudolongum subsp. globosum YIT 10392 eBifidobacterium pseudolongum subsp. Globosum YIT 10393 sãomicroorganismos recém descobertos pelos inventores da pre-sente invenção.
Especificamente, a presente invenção fornece uminibidor da absorção de colesterol compreendendo, como umingrediente ativo, pelo menos um microorganismo selecionadode Bifidobacterium animalis subsp. animalis YIT 10394, Bifi-dobaeterium animalis subsp. Iaetis JCM 1253, Bifidobaeteriumanimalis subsp. Iaetis JCM 7117 e Bifidobaeterium pseudolon-gum subsp. Globosum.
Além disso, a presente invenção fornece um inibi-dor da absorção de colesterol compreendendo, como um ingre-diente ativo, pelo menos um microorganismo selecionado deBifidobaeterium animalis subsp. Iaetis JCM 1253 e Bifidobae-terium animalis subsp. Iaetis JCM 7117.
Além disso, a presente invenção fornece um inibi-dor da absorção de colesterol compreendendo, como um ingre-diente ativo, pelo menos um microorganismo selecionado deBifidobacterium animalis subsp. animalis YIT 10394, e Bifi-dobacterium pseudolongum subsp. globosum YIT 10392 e Bifi-dobacterium pseudolongum subsp. Globosum YIT 10393.
Além disso, a presente invenção fornece novos mi-croorganismos, Bifidobacterium animalis subsp. animalis YIT10394 (FERM ABP-10662), Bifidobacterium pseudolongum subsp.globosum YIT 10392 (FERM ABP-10660) e Bifidobacterium pseu-dolongum subsp. globosum YIT 10393 (FERM ABP-10661).
Uma vez que Bifidobacterium animalis subsp. anima-lis YIT 10394, Bifidobaeterium animalis subsp. Iaetis JCM1253 e Bifidobaeterium animalis subsp. Iaetis JCM 7117 e Bi-fidobaeterium pseudolongum subsp. globosum da presente in-venção não apenas têm um efeito de eliminação de colesterolexcelente mas também são excelentes na tolerância ao ácido etolerância ao ácido biliar, eles também demonstram um exce-lente efeito de inibição da absorção de colesterol nos in-testinos e podem ser utilizados para o fim de melhorar o me-tabolismo de lipidio, por exemplo, diminuir o nivel de co-lesterol do sangue. Além disso, uma vez que estes microorga-nismos tenham uma alta taxa de sobrevivência após o armaze-namento, em particular, uma alta taxa de sobrevivência mesmoapós armazenamento sob condições não anaeróbicas, o inibidorda absorção de colesterol da presente invenção pode ser ar-mazenado por um longo período assim como sob uma condiçãonão anaeróbica.
Melhor Maneira de Usar a Invenção
Exemplos de Bifidobaeterium pseudolongum subsp.Globosum usados na presente invenção incluem Bifidobacteriumpseudolongum subsp. Globosum YIT 10392 e Bifidobacteriumpseudolongum subsp. globosum YIT 10393.
Estes Bifidobacterium pseudolongum subsp. GlobosumYIT 10392 e Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum YIT10393 e Bifidobacterium animalis subsp. animalis YIT 10394,microorganismos usados na presente invenção, são novas li-nhagens bacterianas isoladas pelos inventores como linhagensbacterianas possuindo propriedades como a atividade de eli-minação de colesterol de 70% ou mais, uma taxa de sobrevi-vencia de 20% ou mais em um suco gástrico artificial e umataxa de proliferação de 100 ou mais como um valor Klett(turbidez da célula bacteriana), em um meio contendo ácidobiliar. Estas linhagens bacterianas tem as seguintes propri-edades microbianas. Especificamente, todas estas linhagensbacterianas são bacilos polimórficos Gram positivos que nãosão formadores de esporos, não tem mobilidade e são anaeró-bicos estritos, podem crescer em 37°C, e mostram proprieda-des de Bifidobacterium pseudolongum subsp. Globosum e Bifi-dobaeterium pseudolongum subsp. globosum e Bifidobaeteriumanimalis subsp. animalis, respectivamente, nesta ordem, a-parte da atividade de eliminação de colesterol, a taxa desobrevivência em um suco gástrico artificial, e a taxa deproliferação em um meio contendo ácido biliar mostrado acima.
As espécies destas novas linhagens bacterianas fo-ram identificadas com base nas descobertas na identificaçãode espécies bacterianas usando a seqüência de nucleotideorDNA 16S, já que a seqüência de nucleotideo rDNA 16S de YIT10392 mostra homologia de 99,6% com a seqüência de Bifido-bacterium pseudolongum subsp. globosum (No de acessoD86194), e a seqüência de nucleotídeo rDNA 16S de YIT 10393mostra mostra homologia de 99,6% com a seqüência de Bifido-bacterium pseudolongum subsp. globosum (No de acesso D86194)e a seqüência de nucleotídeo rDNA 16S de YIT 10392 mostrahomologia de 99,7% com a seqüência de Bifidobacterium anima-Iis subsp. animalis (No de acesso D86185). Aqui, a identifi-cação de espécies bacterianas usando a seqüência de nucleo-tídeo rDNA 16S foi feita amplificando o comprimento total deuma seqüência de rDNA 16S por PCR usando, como um molde, DNAextraído de células bacterianas obtidas por lavagem centrí-fuga da solução bacteriana cultivada anaerobicamente (subs-tituição do dióxido de carbono) usando um meio GAM com adi-ção de glicose 0,5% à 37°C por 24 horas, determinando a se-qüência de nucleotídeo do produto de amplificação pelo méto-do de "dye termina,tor", e procurando a seqüência de nucleo-tídeo em um banco de dados. Além disso, estas linhagens bac-terianas foram determinadas como novas baseado nas descober-tas que suas seqüências e nucleotídeos rDNA 16S eram dife-rentes daquelas das linhagens tipo, e os resultados da aná-lise de polimorfismo de DNA de cromossomo pelo método RandomAmplified Polymorphic DNA (RAPD) foram diferentes.
Bifidobacterium animalis subsp. animalis YIT 10394,
Bifidobacterium pseudolongum subsp. Globosum YIT
10392 e Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum YIT
10393 foram transferidos com os Nos de acesso FERM ABP-
10662, FERM ABP ABP-10660 e FERM ABP-10661, respectivamente,para International Patent Organism Depositary, National Ins-titute of Advanced Industrial Science e Technology em 14 deagosto de 2006. Estes microorganismos foram arquivados namesma organização em 18 de agosto de 2005 antes da transfe-rência. 0 endereço postal deste depósito é o código postal305-8566, Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi Tsukuba Tharaki,Japão.
Além disso, Bifidobacterium animalis subsp. IactisJCM 1253 e Bifidobacterium animalis subsp. Iactis JCM 7117usados na presente invenção podem ser adquiridos de JapanCollection of Microorganisms (JCM) e American Type CultureCollection (ATCC) e os números de acesso ATCC são ATCC 27536e ATCC 27674, respectivamente.
Destes, um microorganismo cuja taxa de sobrevivên-cia seja 50% ou maior quando um alimento ou bebida de leitefermentado produzido usando o microorganismo é armazenado à10°C por 21 dias sob uma condição não anaeróbica (aeróbica) épreferida como o microorganismo usado na presente invenção.
Além disso, como os microorganismos da presenteinvenção, bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacteriumcom uma atividade de eliminação de colesterol de 70% ou su-perior são preferidas e, bactérias pertencentes ao gêneroBifidobaeterium com uma atividade de eliminação de coleste-rol de 70% ou superior, uma taxa de sobrevivência de 20% ousuperior em um suco gástrico artificial, como o valor Klett(turbidez da célula bacteriana), em um meio contendo ácidobiliar é ainda mais preferida. Bactérias comuns pertencentesao gênero Bifidobaeterium, tem uma taxa de sobrevivência decerca de O a vários por cento em um suco gástrico artifici-al. Muitas células de bactéria tendo alta tolerância ao áci-do e tolerância ao ácido biliar que são selecionadas com ba-se no valor mencionado acima podem alcançar os intestinos emum estado viável.
Aqui, a atividade de eliminação de colesterol podeser calculada, por exemplo, medindo o nivel de colesterol nosobrenadante de acordo com um método comum após as célulasdo microorganismos serem deixadas juntas com micelas lipidi-cas artificiais, comparando com o nivel de colesterol em umsobrenadante não contendo células bacterianas e inserindo osvalores na equação seguinte.
Atividade de eliminação de colesterol (%) = 100 -(nivel de colesterol no sobrenadante contendo células bacte-rianas) / (nivel de colesterol no sobrenadante não contendocélulas bacterianas) χ 100
Além disso, a taxa de sobrevivência em um sucogástrico artificial pode ser definido como, por exemplo, ataxa de sobrevivência após armazenamento em um suco gástricoartificial de pH 3,0 à 37°C por 1 hora. Quando este valor éalto, significa que a taxa de sobrevivência no trato gástri-co é alta.
Além disso, a taxa de proliferação em um meio con-tendo ácido biliar pode ser definida como, por exemplo, tur-bidez na cultura em um meio contendo 0,2% de ácido biliar à37°C por 24 horas expressas com um valor Klett (Klett-Summerson Colorimeter, filtro No. 66) . Quando este valor éalto, a taxa de sobrevivência e a taxa de proliferação notrato gastrointestinal são altas.
Uma vez que o nome de gênero, espécie e linhagemde um microorganismo variam dependendo da pessoa que nomeouo microorganismo e também são incertos devido a reclassifi-cação das bactérias ou equivalente, microorganismos que sãosubstancialmente idênticos estão incluídos nos microorganis-mos da presente invenção mesmo eles tendo nomes diferentesde gênero espécie ou linhagem bacteriana. Especificamente,por exemplo, embora Bifidobacterium animalis e Bifidobacte-rium lactis foram considerados como espécies separadas, Mas-co et al. Classificaram coletivamente estes microorganismoscomo Bifidobacterium animalis, que é dividido em duas sub-espécies, Bifidobacterium animalis subsp. animalis e Bifido-bacterium animalis subsp. lactis, como subclasses (Int. J.Syst. Evol. Microbiol. 54, 1137-1143, 2004). Esta classifi-cação se mantém atualizada. Portanto, as bactérias usadassendo referidas como Bifidobaeterium animalis e Bifidobacte-rium lactis também entram no escopo de Bifidobaeterium ani-malis subsp. animalis e Bifidobacterium animalis subsp. Iac-tis, respectivamente, na presente invenção.
Além disso, Bifidobacterium animalis subsp. lactisATCC 27536 é idêntico ao e Bifidobacterium animalis subsp.lactis, JCM 1253 e Bifidobacterium animalis subsp. lactisATCC 27674 é idêntica ao Bifidobacterium animalis subsp.lactis JCM 7117. Todos estes estão incluídos nos microorga-nismos da presente invenção. Todas estas linhagens bacteria-nas são classificadas como Bifidobacterium animalis subsp.animalis em JCM e ATCC. Entretanto, uma vez que as seqüên-cias de nucleotideos rDNA 16S destas duas linhagens bacteri-anas combina 100% com a de Bifidobacterium animalis subsp.Iactis (No. de acesso X89513), estas linhagens são classifi-cadas como Bifidobacterium animalis subsp. Iactis na presen-te invenção.
Uma vez que os microorganismos da presente inven-ção tem atividade de eliminação de colesterol e diminui onivel de colesterol, em particular, o nivel de colesterol nosangue conforme mostrado nos exemplos descritos abaixo, a-gentes contendo estes microorganismos em uma quantidade efe-tiva são úteis como inibidores da absorção de colesterol, emparticular, como inibidores da absorção de colesterol dotrato intestinal. Espera-se que o inibidor da absorção decolesterol da presente invenção pode ser usada para reduziros níveis de colesterol, triglicerideo e colesteróis VLDL eLDL no sangue e o índice de arterioesclerose, melhorando ometabolismo de lipídio incluindo colesterol HDL elevado, me-lhora hiperlipemia, que freqüentemente se desenvolve devidoa falta de hormônios sexuais femininos pós menopausa, e di-minui um risco de desenvolver arteriosclerose.
Além disso, uma vez quer os microorganismos dapresente invenção apresentam tolerância ao ácido e tolerân-cia ao ácido biliar conforme mostrado nos exemplos descritosabaixo, agentes contendo estes microorganismos em uma quan-tidade efetiva podem ser usados como inibidores da absorçãode colesterol para·a administração oral.
Além disso, uma vez quer os microorganismos dapresente invenção apresentam alta habilidade de sobrevivên-cia mesmo após armazenamento em um alimento ou bebida deleite fermentado sob condições aeróbicas (não anaeróbicas)conforme mostrado nos exemplos descritos abaixo, agentescontendo estes microorganismos em uma quantidade efetiva po-dem ser usados como inibidores da absorção de colesterol ar-mazenados sob condições aeróbicas (não anaeróbicas). A tem-peratura de armazenamento pode ser determinada como sendo,por exemplo, de -80 a 10°C.
É suficiente que o inibidor da absorção de coles-terol da presente invenção compreenda, como um ingredienteativo, pelo menos um microorganismo selecionado de Bifido-bacterium animalis subsp. animalis YIT 10394, Bifidobaete-rium animalis subsp. Iactis JCM 1253 e Bifidobacterium ani-malis subsp. Iactis JCM 7117 e Bifidobacterium pseudolongumsubsp.■globosum. Exemplos de uma. combinação de microorganis-mos usados aqui incluem pelo menos uma combinação seleciona-da de Bifidobaeterium animalis subsp. Iaetis JCM 1253 e Bi-fidobaeterium animalis subsp. Iaetis JCM 7117 e pelo menosuma combinação selecionada de Bifidobaeterium animalissubsp. animalis YIT 10394, Bifidobacterium pseudolongumsubsp. globosum YIT 10392 e Bifidobacterium pseudolongumsubsp. globosum YIT 10393.
Além disso, o inibidor da absorção de colesterolda presente invenção usa Bifidobaeterium animalis subsp. a-nimalis YIT 10394, Bifidobaeterium animalis subsp. IaetisJCM 1253, Bifidobaeterium animalis subsp. Iaetis JCM 7117 eBifidobaeterium pseudolongum subsp. globosum. Isolado oucombinados ou pode usar estes microorganismos em combinaçãocom outros microorganismos.· Exemplos de tais microorganismosincluem bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacterium co-mo Bifidobacterium animalis subsp. animalis, Bifidobacteriumanimalis subsp. Iactis, Bifidobaeterium pseudolongum subsp.globosum, Bifidobaeterium adoleseentis, Bifidobaeterium an-gulatum, Bifidobacterium asteróides, Bifidobaeterium bifi-dum, Bifidobaeterium breve, Bifidobaeterium eatenulatum, Bi-fidobaeterium dentium, Bifidobaeterium gallieum, Bifidobae-terium infantis, Bifidobaeterium longum, Bifidobaeteriumpseudoeatenulatum,, Bifidobaeterium pseudolongum subsp.pseudolongum, Bifidobaeterium suis e Bifidobaeterium thermo-philum; bactérias pertencentes ao Laetobaeillus como Laeto-baeillus aeidophilus, Laetobaeillus gasseri, Laetobaeillusplantarum, Laetobaeillus casei, Laetobaeillus johnsonii,Laetobaeillus erispatus, Laetobaeillus rhamnosus, Laetoba-eillus kefiri, Laetobaeillus delbrueekii subsp. delbrueekii,Laetobaeillus delbrueekii subsp. bulgarieus, Laetobaeillushelvetieus, Laetobaeillus salivarius, Laetobaeillus reuteri,Laetobaeillus mali, Laetobaeillus amylovorus, Laetobaeillusalimentarius, Laetobaeillus buehneri, Laetobaeillus brevis,Laetobaeillus gallinarum, Laetobaeillus fermentum, Laetoba-eillus maltaromieus, Laetobaeillus paraeasei e Laetobaeil-lus pentosus; bactérias pertencentes ao gênero Streptococcuscomo Streptoeoeeus thermophilus; bactérias pertencentes aogênero Lactoeoceus como Laetococeus laetis subsp. eremoris eLactoeoceus laetis subsp. laetis; bactérias pertencentes aogênero Leueonostoe como Leueonostoe mesenteroides subsp.eremoris; bactérias pertencentes ao gênero Pedieoeeus comoPedicoccus cerevisiae; bactéria pertencente ao gênero Ente-rococcus como Enterococcus faecalis; bactéria pertencenteao gênero Aeetobaeter como Acetobaeter aeeti; bactéria per-tencente ao gênero Glueonobaeter como Gluconobacte'r oxydans;bactéria pertencente ao gênero Baeillus como Baeillus subti-lis; levedura pertencente ao gênero Saccharomyees como Sae-eharomyees cerevisiae; levedura pertencente ao gênero Toru-laspora como Torulaspora debrueekii; levedura pertencente aogênero Candida como Cândida kefiri; levedura pertencente aogênero Kluyveromyces como Kluyveromyces marxianus; levedurapertencente ao gênero Debaryomyees como Debaryomyces hanse-nii; levedura pertencente ao gênero Piehia como Piehia anô-mala; levedura pertencente ao gênero Zygosaeeharomyees comoZygosaeeharomyees rouxii; fungo pertencente aos gêneros As-pergillus, Mueor, Monaseus, Penieilliumr Rhizomueor e Rhizo-pus como Aspergillus oryzae, Mueor japonieus, Monaseus pur-pureus, Penieillium camemberti, Rhizomueor pusillus e Rhizo-pus asshizus.
Além disso, os microorganismos contidos no inibi-dor da absorção de colesterol da presente invenção pode serliofilizado ou utilizado como uma cultura contendo estes mi-croorganismos. De qualquer forma, é preferível que os micro-organismos estejam no estado de células viáveis.
O inibidor da absorção de colesterol da presenteinvenção pode ser administrado na forma de uma formulação dedroga normalmente usada misturando os microorganismos men-cionados acima com veículos farmacêuticos não tóxicos sóli-dos ou líquidos. Exemplos de tais formulações incluem formu-lações sólidas como tabletes, grânulos, pó e cápsula, formu-lações líquidas como soluções, suspensões e emulsões, formu-lações Iiofilizadas. Estas formulações podem ser preparadaspor medidas comuns para a produção de formulações. Exemplosde veículos farmacêuticos não tóxicos incluindo glicose,lactose, sacarose, amido, manitol, dextrina, ácido graxo,glicerideo, polietilenoglicol, ésteres de ácido graxo polio-xietileno sorbitam, aminoácidos, gelatina, albumina, água,salina fisiológica. Além disso, aditivos usados normalmentecomo estabilizantes, agentes umectantes, emulsificantes, Ii-gantes e agentes isotonizantes podem ser adicionados adequa-damente conforme necessário.
Além disso, o inibidor da absorção de colesterolda presente invenção pode ser usados como os microorganismosmencionados acima são, adicionando-os diretamente a uma co-mida, ou na forma de um alimento ou bebida. Exemplos prefe-ridos de comida e bebida incluem leite fermentado, leite desoja fermentado, suco de fruta fermentado, suco de plantafermentado, suco de arroz fermentado, liquido da cevada fer-mentado e alimentos e bebidas fermentadas usando materiaisderivados de animais e plantas (picles, pasta de soja fer-mentada, molho de soja, chá fermentado, salsicha fermentada,maionese fermentada, queijo, entranhas de peixe salgada,etc.) que compreende os microorganismos da presente invençãono estado de células viáveis. A comida ou bebida pode serfabricada por um método comum. Por exemplo, quando o leitefermentado é fabricado, primeiro, um leite base fermentado éobtido inoculando e cultivando pelo menos um dos usa Bifido-bacterium animalis subsp. animalis YIT 10394, Bifidobaeteri-um animalis subsp. Iactis JCM 1253, Bifidobacterium animalissubsp. lactis JCM 7117 e Bifidobaeterium pseudolongum subsp.globosum. Isolado ou combinados com outros microorganismosem um meio de leite esterelizado, e homogeinizando o meio.Então, uma solução xarope preparada separadamente é adicio-nada e misturada, e a mistura é homogeneizada com um homoge-nizador ou equivalente, e um sabor é adicionado para comple-tar um produto final. O leite fermentado da presente inven-ção obtido pode ser preparado como um produto em qualquerforma como um tipo integral, tipo leve, ou um tipo com saborde fruta, em um estado sólido, liquido ou congelado ou equi-valente. Alimentos de animais também estão incluídos em co-mida e bebida. O microorganismo da presente invenção no lei-te fermentado pode ser contido, por exemplo, em uma concen-tração de 10^3 a 10^13 cfu/mL.
Neste caso, o inibidor de colesterol da presenteinvenção pode ser misturado com ingredientes alimentaresnormalmente usados em comidas e bebidas como, por exemplo,sacarídeos, proteínas, peptídeos, lipídios, vitaminas, mine-rais, componentes de planta como vegetais, grãos e frutas,componentes animais como sangue, leite, fígado, ossos e mús-culos, componentes de microorganismos como bactérias, fun-gos, leveduras e cogumelos, seus componentes de cultura, a-gentes gelatinizantes, agentes de fixação, agentes espessan-tes, sabor, agentes corantes, agentes promotores do creci-mento da bactéria Bifidobaeterium, agentes promotores docrescimento de ácido láctico. Seus exemplos específicos in-cluem vários adoçantes como glicose, sacarose, frutose, mal-tose, isoglicose, xilose, palatinose, mel, xarope de maple eamazake, álcoois de açúcar como sorbitol, xilitol, eritri-tol, lactitol, palatinito, xarope de amido reduzido e xaropede maltose reduzido, vários adoçantes muito doces como su-cralose e aspartame, vários adoçantes naturais como licori-ce, stevia e glicosideo ácido glicirrizinico, vários emulsi-ficantes como estes de ácido graxo sacarose, ésteres de áci-do graxo carboidrato glicerina e lecitina, e vários agentesespessantes (estabilizante) como ágar, gelatina, carragena,goma de guar, goma arábica, goma xantana, pectina e goma Io-custa.
Além disso, exemplos de ingredientes de alimentostambém incluem vários carboidratos como tagatose, lactose,trealòse, agaroligossacarideo, nigeroligossacarideo, galac-tooligossacarideo, fructooligossacarideo, xilooligossacarí-deo, rafinose, amidose, lactulose, maltotriose, isomaltooli-gossacarideo, ciclodextrina, glicosamina e N-
acetilglicosamina, varias fibras dietéticas como ácido algi-co, alginato de sódio, fucoido, sargasso, furcerano, funora-no, porfirano, aminarano, Pullulan, taragoma, manan de kon-jak, inulina, chitina, chitosan, polidextrose, ácido hialu-ronico, condroitim sulfato, β-glucano, manan, galactano,fructano, xilano, arabiana, arabinogalactano, glucomana, ga-lactoman, fibra de beterraba, fibra de aveia, fibra de tri-go, fibra de soja, fibra de arroz, fibra de cevada, goma dexantan, fibra de milho, fibra de maçã, fibra citrica, fibraPsyllium, fibra de pinha, fibra de ameixa, fibra de ervilha,fibra de banana, ácido acético de celulose de bactéria, áci-do láctico da parede celular de bactéria, parede celular debactéria Bifidobacterium, parede celular de levedura, fruta-no natto, colágeno e ácido poliglutámico natto ou vários hi-drolisados destas fibras dietéticas, e vários materiais con-tendo fibras dietética indigeriveis como farelo de trigo,farelo de cevada, farelo de arroz, farelo de Avena fátua,farelode aveia, farelo de centeio, Psyllium, pó de farelo dearroz, arroz marrom, chicória, resíduo de soja, polpa de ma-çã, amido resistente, malte de cevada, grão de milho, ácidoláctico de células de bactéria, células de bactéria de Bifi-dobacterium, células de levedura de cerveja, célula de leve-dura de vinho, sedimento de vinho, sedimento de sake, sedi-mento de molho de soja, sedimento de cerveja, arroz maltado,trigo maltado, grãos maltados, Monascus pilosus, Aspergillusoryzae, substancia viscosa de soja fermentada, extrato desemente de uva, geléia real, própolis, clorela, espirulina,euglena, undaria, alga laminária, parreira, eisenia, Eiseniabicyclis, Porphyra tenera, larva verde, hizika, ulvaceae eNemacystus decipiens.
Além disso, exemplos de ingrediente de comida in-cluem vários minerais como cálcio, magnésio, zinco, ferro,manganês, iodo, selênio, cobre, cobalto e dolomita e váriossais destes minerais, vários ácidos como ácido cítrico, áci-do málico, ácido tartárico, ácido pirúvico, ácido gluconico,ácido succínico, ácido fumárico, ácido ascórbico, ácido lác-tico, ácido acético, ácido propionico, ácido butírico, ácidofosfórico e aminoácidos como creatinina, metionina, cisteínae ácido glutâmico e vários sais destes ácidos, vários compo-nentes como glutationa, fitina, ácido fitico, lignina, ácidoροΐί-γ-glutamico e seus produtos de degradação, saponina,ácido ferulico, ácido γ-aminobutírico, γ-orizanol, chalcona,flavonona, flavona, flavonol, isoflavona, antociana, cate-quina, proantocianidina, polifenol de folha de chá, curcumi-da, capsicinóide, sesaminol, lignana de gergelim, teaflavi-na, β-dicetonas, carotenóides, compostos alil sulfato, iso-tiocianato, terpeno, clorofilas, esfingolipidios, gangliosi-deo, ácidos graxos n-3 polinsaturados, ácidos graxos n-6 po-linsaturados ácido linoleico conjugado, fosfolipideos, es-teróis de planta, varias proteínas como porteinas da sojacomo glicinina e conglicinina, proteínas do ovo como ovalbu-mina e ovomucóide, lactoproteinas e proteínas como caseína,lactoalbumina e lactoferrina, proteínas do arroz como fosfo-peptideo caseína e orizeína, proteínas do trigo como glute-nina e gliadina, e proteínas do peixe e peptídeos degradadospor enzima e seus peptídeos degradaos por ácido, varias vi-taminas como vitamina A, família da vitamina B, vitamina C,família da vitamina D, vitamina E, família da vitamina Κ, β-caroteno, ácido retinóico e ácido fólico, vários extratos decohosh preto, semente de abóbora, semente de pomegranato,erva de S. João, maracujá, valeriana, Pueraria mirifica, a-lecrim, hortelã, salsa, calendula, melissa, artemísia, aça-frão, semente de rabanete japonês, pé de café, araliácea,porongo, casca de laranja, folha de ginko, jujuba, Fructuslycii, alcaçus, Ganoderma lucidum , ginseng, guaraná e equi-valente, vários extratos de planta de chá verde, chá preto,chá de oolong, chá de Gymnema, chá de goiaba, e equivalente,e várias especiarias como pimenta, Zanthoxylum, canela, cúr-cuma, sálvia, tomilho, manjericão, pimenta vermelha e nozmoscada.
Além disso, exemplos de ingredientes de alimentosincluem vários componentes em grãos como arroz, arroz mar-rom, centeio, trigo, cevada, trigo de verão, amaranto, Seta-ria itálica, Panicum miliaceum, trigo mourisco, Sorghum bi-color e milho e vários componentes mudas de semente destesgrãos, vários componentes vegetais como feijão fradinho,feijão branco, feijão comum, feijão rajado, Pisum sativum,feijão flor, grão de bico, soja preta, soja azul, feijãomungo, fava, feijão daifuku, Angélica keiskei, couve, cúrcu-ma, batata, batata doce, batata roxa, inhame japonês, abóbo-ra, berinjela, tomate, melão-de-são-caetano, Capsicum, ger-gelim, repolho, brócolis, couve-flor, alface, soja verde,gengibre, bardana, aipo, rabanete japonês, raiz forte, aba-cate, cenoura, espinafre, cebola, alho, lirio, cebolinha,Perilla frutescens crispa, cebolinha, Allium odurum, pasti-naca, Pteridium aquilinum, broto de bambu, cogumelo Shiitakee cogumelo, componentes frutas como limão, maça, uva, moran-go, laranja, caqui, goiaba, banana, vacinio, amora-preta,oxicoco, framboesa, amora, pimenta da jamaica, goiaba-serrana, tomateiro, acerola, lima, Citrus depressa, melão,pêssego, manga, limão chinês, papaia, abacaxi, pêra, ameixa,toranja, marmelo, abricó, mandarina, romã, melancia, ameixaseca e kiwi, vários componentes nozes como amendoim, amên-doa, coco, castanha de caju, macadamia, cacau, castanha,fruto de ginkgo e noz, vários produtos de uso diário comoleite de vaca, leite desnatado, soro de leite, creme, leitefermentedo, iogurte, lactoproteina, caseina e proteínas dosoro do leite e seus componentes, licores fermentados comosake refinado, vinho, Shaoxing e cerveja, licores destiladoscomo wiskey, brandy e vodca.
Para melhhorar a habilidade de sobrevivência emalimentos ou bebidas de leite fermentado usando bactériaspertencentes ao gênero Bifidobacterium durante armazenamen-to, recipientes feitos de material impermeável ao oxigêniocomo vidro e papel alumínio foram usados principalmente.Conforme mostrado nos exemplos abaixo, entretanto, os micro-organismos da presente invenção tem alta tolerância ao oxi-gênio e não precisam de condições estritamente anaeróbicas.Portanto, materiais do recipiente para o inibidor de absor-ção de colesterol da presente invenção, resinas altamentepermeáveis ao oxigênio (poliestireno, polietileno, polieti-Ieno tereftalato, etc.) também pode ser usado. Recipientesusando estas resinas são mais baratos e tem vantagens como oalto grau de liberdade na modelagem quando comparado com re-cipientes feito de materiais impermeáveis ao oxigênio.
Os microorganismos usados como ingrediente ativodo inibidor da absorção de colesterol da presente invençãomostra excelente tolerância ao ácido conforme mostrado nosexemplos abaixo. Portanto, o inibidor da absorção de coles-terol da presente invenção pode ser feito ácido. Por exem-plo, seu pH à 25°C pode ser de 2 a 7, em particular de 3 a 6.
As bactérias pertencentes ao gênero Bifidobacteri-um usadas como um ingrediente ativo do inibidor da absorçãode colesterol da presente invenção foram utilizados como a-limento, e a segurança destas bactérias foi confirmada. Por-tanto, doses destas bactérias quando usadas como um inibidorda absorção de colesterol não são estritamente limitadas,mas são preferivelmente entre IO5 a IO13 ufc, particularmen-te, preferivelmente entre IO8 a IO12 ufc por dia na contagemde células viáveis.
Exemplos
A presente invenção será explicada mais especifi-camente com relação aos seguintes exemplos. Entretanto, oescopo da presente invenção não está limitada a estes exemplos.
Exemplo Teste 1
(1) Atividade de eliminação de colesterol
Células bacterianas foram cultivadas anaerobica-mente em meio m-ILS (Int. J. Food Microbiol. 81. 131-136,2003) à 37°C por 24 horas, o caldo da cultura foi centrifu-gado à 12000 rpm e 4°C por 15 minutos e as células bacteria-nas foram lavadas com tampão fosfato 150 mM (pH 5,5) . A la-vagem centrifuga foi repetida três vezes, e as células bac-terianas foram ressuspendidas em tampão fosfato 150 mM paradar turbidez (absorbância '660 nm) de 3 (contagem de célulasbacterianas de IO8 a IO8 ufc/mL) para preparar uma suspensãode célula bacteriana. A suspensão de célula bacteriana foiauto-clavada à 121°C por 15 minutos para preparar a suspen-são de bactérias mortas.
2g de pó de bile bovina, 921 mg de colesterol, 135mg de lisofosfatidilcolina, 90,2 mg de ácido monooleico e702,2 mg de ácido oléico foram ressuspendidos em tampão fos-fato 150 mM (pH 7,0), a suspensão foi ultrasonicada por 12minutos e então ultracentrifugada à 100.000 G e 25°C por 18horas, e uma camada de micela foi coletada para preparar mi-celas de lipideos artificiais. 150 pL de micelas de lipidiosartificiais por mL de suspensão de célula bacteriana (conta-gem de célula bacteriana de IO58 a IO9 ufc) foi adicionada, ea suspensão foi deixada descansar à 37°C. Após 18 horas, asuspensão foi centrifugada à 12000 rpm e 4°C por 15 minutos,e o colesterol no sobrenadante foi quantificado usando De-terminer TC555 (Kyowa Medics Co., Ltd.). Um tampão fosfatonão contendo células bacterianas foi tratado similarmentecomo um controle, e a atividade de eliminação de colesterolfoi calculada pela equação abaixo. Além disso, a atividadede eliminação de colesterol foi calculada similarmente paraa suspensão de bactérias mortas.
Atividade de eliminação de colesterol (%) = 100 -(nivel de colesterol no sobrenadante contendo células bacte-rianas)/ nivel de colesterol no sobrenadante não contendocélulas bacterianas) χ 100
(2) Tolerância ácida
0,1 mL de solução bacteriana cultivada em meio GAM(Nissui Pharmaceutical Co., Ltd) até a fase estacionária foiadicionada a 10 mL de solução Na2HP04 50 mM ajustada para pH3 com ácido clorídrico, e a mistura foi tratada à 37oC por 1hora, e a taxa de sobrevivência foi calculada pela seguinteequação.Taxa de sobrevivência (%) = (contagem de célulasviáveis após o tratamento com ácido) / (contagem de célulasviáveis antes do tratamento com ácido) χ 100
(3) Tolerância ao ácido biliar
30 uL de solução bacteriana cultivada em meio GAMaté a fase estacionária foi inoculada em 3 mL de meio GAMcontendo 0,2% de ácido biliar e cultivado anaerobicamente à37°C. Após 24 horas, a turbidez da célula bacteriana foi me-dida usando Klett-Summerson Colorimeter (Filtro No. 66).
Os resultados dos testes 1 a 3 acima são mostradosna tabela 1.<table>table see original document page 26</column></row><table>Conforme mostrado na tabela 1, Bifidobacterium a-nimalis subsp. animalis, Bifidobacterium animalis subsp.Iactis e Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum dapresente invenção mostrou alta atividade de eliminação decolesterol e foi excelente na tolerância ao ácido e tolerân-cia ao ácido biliar. Alem disso, uma vez que as células bac-terianas mortas não tem atividade de eliminação de coleste-rol, foi descoberto que estas bactérias mostram atividade emum estado celular viável.
Subseqüentemente, para saber se a eliminação decolesterol do sobrenadante resultou de precipitação, ou con-versão ou degradação, o nivel de colesterol na fração preci-pitada foi medida. Como resultado, foi descoberto que o co-lesterol eliminado do sobrenadante não foi convertido ou de-gradado e existia no precipitado. Este resultado sugere apossibilidade do colesterol no sobrenadante ter sido captadonas células bacterianas e precipitado ou micelas lipidicaspodem ter sido desintegradas pelo efeito desconjugante doácido biliar das células bacterianas ou equivalente e preci-pitado.
Exemplo Teste 2: Efeitos nos lipidios sangüíneos elipidios hepáticos em animais
Um meio de leite desnatado em pó 10% contendo0,03% de extrato de levedura foi esterelizado à 121oC por 15minutos e Bifidobacterium peusodologum subsp. globosum YIT10393 foi inoculado à 1% e cultivado anaerobicamente por 24horas. Este caldo de cultura foi inoculado à 2% no mesmomeio e cultivado anaerobicamente à 37°C por 46 a 54 horas. Acontagem de células viáveis contidas no leite fermentadopreparado foi de 3,7 χ IO8 ufc/mL. Este leite fermentado foiliofilizado, e um alimento foi preparado com uma composiçãomostrada na tabela 2. Aqui, a contagem de células viáveis noalimento foi de 1,0 χ IO6 ufc/g. Neste meio tempo, como umcontrole, um meio de leite desnatado em pó a 10% contendo0,03% de extrato de levedura foi esterelizado à 121oC por 15minutos e então liofilizado sem inocular bactérias como Iei-
te não fermentado, e um alimento foi preparado com a compo-sição mostrada na Tabela 2.
Tabela 2
<table>table see original document page 28</column></row><table>
Subsequentemente, após 1 semana de criação preli-minar, ratos ovariectomizados Wistar de 8 semanas de idade(adquiridos de Japan SLC) ou ratos controle foram habituadosà dieta AIN-93G purificado por 1 semana e divididos nos gru-pos experimentais mostrados na Tabela 3 dependendo do pesocomrporal.
Tabela 3
<table>table see original document page 29</column></row><table>
Controle: animais submetidos a operação simulada;
OVX: animais submetidos a overiectomia; SM: leite não fer-mentado; FSM: leite fermentado
Os ratos grupados foram mantidos em gaiolas indi-viduais usando o teste dos alimentos em temperatura ambientede 24oC ± 1°C e umidade de 55 ± 5% com a alimentação corres-pondente a cada grupo e água disponível à vontade por 34 di-as. A ingestão diária de células viáveis foi de IO7ufc/animal.
Os animais foram anaéstesiados com Nembutal. A a-limentação foi suspendida por 4 horas antes da morte. 0 san-gue foi coletado da aorta ventral e o fígado foi coletadopor refluxo. 0 fígado foi armazenado à 20oC antes da análisee o sangue foi centrifugado à 3000 rpm por 15 minutos paraseparar o plasma. Após a Iiofilização, o fígado foi extraídopelo método de Folch (J. Biol. Chem. 226, 497-509, 1957).
Os níveis de colesterol total e triglicerideoscontidos no plasma e extrato de fígado obtidos então foramobtidos usando Determiner TC555 (Kyowa, Medics Co., Ltd.) eTriglyceride E-test Wako (Wako Pure Chemical Industries,Ltd.), respectivamente. Além disso, o nível de colesterolHDL contido no plasma foi obtido usando colesterol HDL E-test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). A lém dis-so, o nível de colesterol VLDL + LDL contido no plasma foiobtido deduzindo o nível de colesterol HDL do nível de co-lesterol total.
Baseado nos resultados obtidos, o valor ρ foi ob-tido para o grupo ovariectomia pela análises de variância deduas maneiras. Então, o teste t foi feito entre os ratos o-variectomizados e os ratos controle, ambos receberam o mesmoalimento. Os resultados obtidos são mostrados nas Tabelas 4a 6. Os valores foram expressos com média ± DP. Nas tabelas4 a 6, o termo "interação" significa uma interação entreleite fermentado e galactooligossacarideos.
<image>image see original document page 30</image><table>table see original document page 31</column></row><table>Conforme mostrado na Tabela 4, os ratos ovariectomi-zados tinha mais peso corporal e ingeriram mais alimento quan-do comparado com o grupo controle, conforme relatado anterior-mente (J. Comp. Physiol. Physicol 88: 183-193, 1975). Entre-tanto, efeitos da presença ou ausência de oligossacarideos ouadministração de leite fermentado no foram observada no grupoovariectomizado, e os animais cresceram favoravelmente.<table>table see original document page 33</column></row><table>Além disso, conforme mostrado na tabela 5, os efeitosdo leite fermentado preparados usando Bifidobacterium pseudo-longum subsp. globosum YIT 10393 foram o observados no coleste-rol, trigliceridio, VLDL +LDL no sangue e o índice de arterios-clerose, e todos estes parâmetros diminuíram. Em particular, onível de colesterol VLDL + LDL diminuíram visivelmente. Alémdisso, embora os efeitos dos oligossacarídeos nestes parâmetrose uma interação entre leite fermentado e oligosacarideo não fo-ram estatisticamente significativos, os níveis de colesteroltotal, trigliceridio e colesterol VLDL + LDL no sangue, e o ín-dice de arteriosclerose foram os mais baixos nos animais trata-dos com oligossacarídeos e leite fermentado. Sabe-se que galac-tooligossacarideo é utilizado especificamente pela bactériapertencente ao gênero Bifidobacterium. Portanto, foi demonstra-do que Bifidobacterium pseudolongum subsp. globosum YIT 10393cresce no trato intestinal e reduz os níveis de lipídio no san-gue efetivamente pela administração de leite fermentado conten-do galactooligossacarideo. Além disso, sabe-se que o colesteroltotal no sangue estava elevado após a ovarioectomia, e um ani-mal que foi submetido a ovariectomia é útil como modelo de hi-perlipemia pós menopausa. A comparação de dados do grupo ovari-oectomia/leite não fermentado/sem oligossacarídeo com o grupocontrole mostrou que a ovarioectomia neste teste foi bem suce-dida .<table>table see original document page 35</column></row><table>Conforme mostrado na Tabela 6, o conteúdo de coleste-rol no fígado não foi afetado pela presença de oligossacarídeoou pela administração de leite fermentado e os lipídeos não fi-caram acumulados no fígado. Uma significância estatística nãofoi observada no nível de triglicerideo por fígado após a admi-nistração de leite fermentado, mas o conteúdo de triglicerideopor g de fígado diminuiu.
Uma vez que o leite fermentado preparado usando Bifi-dobacterium pseudolongum subsp. globosum YIT 10393 reduziu onível de colesterol total, triglicerídio e colesterol LDL +VLDL no sangue e o índice de arteriosclerose mostrado acima,foi descoberto que esta bactéria tem uma habilidade de metabo-lismo de lipídio melhorada não apenas para colesterol mas paravários lipídios sangüíneos e um efeito de reduzir o risco dedesenvolver arteriosclerose.
Exemplo teste 3: Exame da habilidade de sobrevivênciano leite fermentado
Extrato de levedura 0,03% foi adicionado a uma solu-ção de leite desnatado em pó, e a mistura foi esterelizada, ca-da uma das bactérias da presente invenção (Bifidobacterium ani-malis subsp. animalis YIT 10394, Bifidobacterium animalissubsp. Iactis JCM 1253, Bifidobacterium animalis subsp. IactisJCM 7117 e Bifidobaeterium pseudolongum subsp. globosum YIT10392, Bifidobaeterium pseudolongum subsp. globosum YIT 10393)foi inoculada a 2% e cultivada à 37°C em pH 5,1 ± 1,0, produziucinco tipos de leite fermentado. Além disso, como um controle,um leite fermentado foi produzido da mesma maneira usando Bifi-dobaeterium longum ATCC 15707.
10 mL de cada leite fermentado preparado foi colocadoem um tubo de ensaio de vidro para armazenamento anaeróbico eum tubo de polipropileno para armazenamento não anaeróbico (ae-róbico) e armazenado à IO0C por 12 semanas. Para armazenamentoanaeróbico, o tubo de ensaio foi fechado firmemente com uma ro-lha butil sob fluxo de gás nitrogênio. Para o armazenamento nãoanaeróbico, o tubo de polipropileno foi fechado frouxamente. Atabela 7 mostra pH e contagem de células viáveis após o fim dacultura. A tabela 8 mostra modificações na contagem de célulasbacterianas no armazenamento não anaeróbico. A tabela 9 mostramodificações na contagem de células bacterianas no armazenamen-to anaeróbico.<table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table>Conforme mostrado na tabela 8, após 3 semanas de ar-mazenamento sob condição não anaeróbica (aeróbica), Bifidobae-terium longum ATCC 15707 usado como um controle foi reduzido a9,2 χ 10^3 ufc/mL e não foi detectado após 8 semanas. Por outrolado, nenhuma linhagem bacteriana da presente invenção foi re-duzida para menos de 1 χ 10^8 ufc/mL mesmo após 3 semanas de ar-mazenamento, e a taxa de sobrevivência foi de 50% ou superiorquando comparado com a contagem de células no fim da cultura.Além disso, após 12 semanas de armazenamento, Bifidobacteriumanimalis subsp. Iactis JCM 1253 e Bifidobacterium animalissubsp. lactis JCM 7117 não estavam com menos de 1 χ 10^8ufc/mL, e as três linhagens bacterianas restantes (Bifidobacte-rium pseudolongum subsp. glosum YIT 10392, Bifidobaeteriumpseudolongum subsp. glosum YIT 10393, Bifidobaeterium animalissubsp. animalis YIT 10394) diminuíram apenas cerca de 1 ou 2ordens.
Conforme mostrado na tabela 9, após 3 semanas de ar-mazenamento sob condições anaeróbicas, a contagem de célulasbacterianas de Bifidobaeterium longum ATCC 15707 reduziu decerca de 1/10. Entretanto, a contagem de. células bacteriana dabactéria Bifidobaeterium da presente invenção no fim da culturafoi virtualmente a mesma. As contagens de célula bacteriana deBifidobaeterium pseudolongum subsp. glosum YIT 10392, Bifido-baeterium pseudolongum subsp. glosum YIT 10393, Bifidobaeteriumanimalis subsp. animalis YIT 10394 reduziram apenas cerca de1/2 a 1/6 após armazenamento por 12 semanas, e a contagem decélulas bacterianas de Bifidobaeterium animalis subsp. IaetisJCM 1253 e Bifidobacterium animalis subsp. Iactis JCM 7117permaneceram virtualmente inalterada mesmo após 12 semanas.Exemplo de prescrição 1: Produção de tableteVários componentes foram misturados, granulados, se-cos e medidos de acordo com a seguinte prescrição para produzirum tablete.
(Prescrição) (mg)Células bacterianas secas da bactéria da presente 20invenção(1)
Celulose microcristalina 100
Lactose 80
Estearato de magnésio 0,5
metilcelulose 12
<:L) : Obtido pela liofilização de células viáveis deBifidobacterium pseudolongum subsp. globosum YIT 10392
Exemplo de prescrição 2: Produção de bebida de leitefermentado
Glicose 3% foi adicionada a uma solução de leite empó desnatado 15%, a mistura foi esterelizada, e pseudolongumsubsp. globosum YIT 10393 foi inoculada à 1% e cultivada anae-robicamente à 35oC por 24 horas para obter 210g de base de Iei-te fermentado. Neste meio tempo, 97g de açúcar e 0,2 g de ferroemulsificado foram dissolvidos em água para fazer 790 g comoquantidade total e esterelizado para obter um xarope. A base deleite fermentada e o xarope obtido conforme descrito acima fo-ram misturados, seguido da adição de Ig de sabor, homogeinizadoem 15 Mpa, e colocado em um recipiente para obter um leite fer-mentado. O leite fermentado obtido foi favorável tanto em apa-rência quanto em sabor, e a contagem de células viáveis imedia-tamente após a produção foi de 2,5 χ IO8 ufc/mL. Além disso, aestabilidade de armazenamento também foi favorável, com a con-tagem de células viáveis após armazenamento à 10°C por 21 diassendo 1,4 χ IO8 ufc/mL.
Exemplo de prescrição 3: . Produção de refrigerante
Os componentes da prescrição abaixo foram misturadose homogeinizados por um método comum de obter refrigerante. 0refrigerante obtido foi colocado em um frasco marrom, seladocom capa de alumínio e submetido ao tratamento de calor. O re-frigerante obtido era favorável em aparência e sabor e a esta-bilidade também foi favorável.
(Prescrição) (g)Células bacterianas secas da bactéria da presente in- 5venção(1)
Sabor 0,8
Água 10 0
Amido reduzido glicosilado 24
frutose 18
(1): Obtido pela liofilização de células viáveis deBifidobacterium pseudolongum subsp. globosum YIT 10394.

Claims (4)

1. Inibidor da absorção de colesterolCARACTERIZADO por compreender, como um ingrediente ativo,pelo menos um microorganismo selecionado de Bifidobacteriumanimalis subsp. animalis YIT 10394, Bifidobacterium animalissubsp. Iactis JCM 1253, Bifidobacterium animalis subsp. Iac-tis JCM 7117 e Bifidobaeterium pseudolongum subsp. globosum.
2. Inibidor da absorção de colesterolCARACTERIZADO por compreender, como um ingrediente ativo,pelo menos um microorganismo selecionado de Bifidobaeteriumanimalis subsp. Iaetis JCM 1253 e Bifidobaeterium animalissubsp. Iaetis JCM 7117.
3. Inibidor da absorção de colesterolCARACTERIZADO por compreender, como um ingrediente ativo,pelo menos um microorganismo selecionado de Bifidobaeteriumanimalis subsp. animalis YIT 10394, Bifidobaeterium pseudo-longum subsp. globosum YIT 10392 e Bifidobaeterium pseudo-longum subsp. globosum YIT 10393.
4. Microorganismo, CARACTERIZADO pelo fato de serBifidobaeterium animalis subsp. animalis YIT 10394 (FERMABP-10662), Bifidobaeterium pseudolongum subsp. globosum YIT-10392 (FERM ABP-10660) ou Bifidobaeterium pseudolongumsubsp. globosum YIT 10393 (FERM ABP-10661).
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