BRPI0615862A2 - vacina contra pcv-2, e, método para a manufatura de uma vacina - Google Patents

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Abstract

VACINA CONTRA PCV-2, E, METODO PARA A MANUFATURA DE UMA VACINA A presente invenção refere-se a uma vacina contra circovírus tipo 2 (PCV-2) porcino e a um método para a manufatura de tal vacina, para proteger leitões contra infecção por PCV-2. Descobriu-se que uma vacina compreendendo pelo menos 20 microgramas/dose de proteína ORF-2 de circovírus tipo 2 (PCV-2) porcino é capaz de eliciar uma resposta imune protetora contra PCV-2 (e, assim, contra PMWS), mesmo quando ela tem uma titulação relativamente elevada de MiDA contra PCV-2. Uma vacina de acordo com a invenção pode conter uma proteína ORF-2 recombinante, em que dita proteína recombinante é preferivelmente produzida por meio de expressão de um vetor de expressão de baculovírus em células de inseto, dito vetor de expressão de baculovírus contendo a seqúência do gene PCV-2 ORF- 2 sob o controle de um promotor adequado.

Description

"VACINA CONTRA PCV-2, Ε, MÉTODO PARA A MANUFATURA DEUMA VACINA"
A presente invenção refere-se a uma vacina contra circovírusporcino (PCV-2) e a um método para a manufatura de tal vacina, paraproteger leitões contra infecção por PCV.
Imagina-se que o PCV-2 seja ligado à síndrome de emaciaçãomulti-sistêmica pós desmame (PMWS) observada em leitões.
Esta doença foi encontrada pela primeira vez no Canadá em 1991.
Os sinais clínicos e a patologia foram publicados em 1997(Clark et al. Proc. Am. Assoc. Swine. Pract., 1997: 499 - 501, Harding et al.,Proc. Am. Assoc. Swine. Pract, 1997: 503) e incluem emaciação progressiva,dispnéia, taquipnéia e ocasionalmente icterícia. Nayar et al., Can., Vet. J.Volume 38, Junho de 1997, detectou Circovírus Porcino em porcos comsintomas clínicos de PMWS e concluiu que um PCV, outro que o conhecidoPCV, reconhecido como um habitante natural das células PK-15, poderialigar-se à PMWS. Publicações posteriores (Hamel et al., J. Virol., 72(6), 5262- 5267, 1998; Meehan et al., J. gen. Virol., 79, 2171 - 2179, 198)confirmaram estes achados e foi proposto (Meehan et al., supra) referir-se aonovo PCV patogênico como PCV-2, enquanto que o isolado de cultura decélula PK-15 original (Tischer et al., Nature 295, 64 - 66, 1982), deveria serreferido como PCV-1.
Os PCVl e PCV-2 são pequenos vírus não-envelopadosicosaédricos (17 nm), contendo um genoma de DNA de filamento únicocircular. O comprimento do genoma do PCV-2 é de cerca de 1768 pb. Osisolados de PCV-2, originando-se de diferentes regiões do mundo, parecemestar estreitamente relacionados entre si e exibirem 95 a 99% de identidadesde seqüência de nucleotídeo (Fenaux et al., J. Clin. Microbiol., 38(7), 2494-2503, 2000). ORF-2 do PCV codifica a proteína capsídica putativa do vírus.A ORF 2 de todos os isolados de PCV-2 compartilha 91 - 100% da identidadeda seqüência de nucleotídeo e 90 - 100% de identidade de seqüência deamino ácido deduzida. Entre os genes ORF 2 do PCV 1 e PCV-2 existemsomente 65 a 67% de identidade de nucleotídeo e 63 a 68% de identidade deseqüência amino ácida (Fenaux et ai., supra).
PDNS (síndrome da dermatite e nefropatia porcina) é outrogrande problema para criadores de porcos, que surgiu ao mesmo tempo quePMWS. A característica da PDNS são lesões de pele circularesvermelhas/marrons, com hemorragias, usualmente nas orelhas, flancos, pernase coxas. Uma recapitulação das síndromes e doenças relacionadas com PCV-2é fornecida em Chae. C (2005) Vet. J. 169 326 - 336.
Há necessidade de uma vacina que proteja os leitões contradoenças relacionadas com PCV-2, tais como PMWS e PDNS. Entretanto, atéagora não há vacina comercialmente disponível contra doenças relacionadascom o PVC-2.
Tradicionalmente pensar-se-ia de uma vacina convencionalpara porcos, baseada em vírus PCV-2 inteiro inativado. Entretanto, no caso dePCV-2 o assunto é complicado pelo fato de que o PCV-2 não replica emelevadas titulações na cultura de células.
Como uma alternativa, uma vacina poderia ser baseada emantígenos recombinantes, derivados de PCV-2. As proteínas de PCV-2 jáforam expressas em vários sistemas de expressão. Por exemplo, Liu et al.(Protein Expression and Purification, 21, 115 - 120 (2001) expressou umaproteína de fusão da inteira proteína codificada por ORF-2 de PCV-2 ligado aum MBP His tag, em E. coli. Kim et al. (J. Vet. Sei. 3(1), 19-23, 2002)expressou ORF 1 e 2 de PCV 2 em um sistema de expressão de baculovírus.Blanchard et al. (Vaccine, 21, 4565 - 4575, 2003) expressou ORF 1 e ORF 2em sistema baseado em baculovírus de células de insetos também. As célulasde insetos que tinham produzido as proteínas PCV-2 foram lisadas eformuladas em uma vacina que foi usada para vacinar leitões livres depatógeno específico (SPF). Os leitões receberam uma das proteínas em umregime de reforço principal, em que a vacina subunitária seguiu umavacinação de DNA ou, em outro grupo de leitões, os leitões receberam aproteína ORF 1 e ORF 2 em duas injeções. Entretanto, todos os experimentosforam realizados com porcos SPF, que são livres de patógenos e, assim, nãotêm quaisquer anticorpos maternalmente derivados contra PCV-2.
A PMWS e PDNS causadas por PCV-2 podem ser observadasa partir de 4 semanas de idade até cerca de 15 semanas de idade. Parece queaté o desmame os leitões estão bastante ilesos de doenças relacionadas comPCV-2, somente após o desmame os leitões têm realmente uma chance deadquirir sintomas clínicos. Como conseqüência, para proteger os leitões comvacinação, os leitões idealmente terão que ser protegidos de emaciação paradiante, visto que é imprevisível quando doenças relacionadas com o PCV-2 semanifestarão.
Para conseguir isto com um regime de vacinação de duasinjeções, os leitões precisam obter sua vacinação de imprimação já na(s)primeira(s) semana(s) de idade, de modo que eles possam receber a vacinaçãode reforço próximo do tempo do desmame e tenham obtido proteção totalcontra infecção por PCV-2 logo após o desmame.
Os leitões são prováveis terem anticorpos maternalmentederivados (MDA) contra PCV-2 (uma distribuição de titulações MDA emleitões usada em experimentos com uma vacina de acordo com a presenteinvenção é fornecida nos Exemplos). Entretanto, é bem sabido que a presençade anticorpos maternalmente derivados interferirão com a vacinação. Os
leitões podem ter diferentes títulos de MDA. Títulos de MDA passivos muitoelevados podem proteger os leitões contra infecção por PCV-2 (Merial:'PCV-2 Dieseases: From research back to the field strain", 18o. IPVS,Hamburg Germany, Junho de 2004, página 99-101).Entretanto, os leitões com menos títulos de MDA não serãoprotegidos contra infecção por PCV-2 quando eles tiverem alcançado a idadepertinente (isto é, pós desmame).
Para aqueles leitões que parecem ser a maioria encontrada nocampo, a titulação MDA pode ser demasiado baixa para fornecer proteçãocontra infecção por PCV-2, embora ainda bastante elevada para interferir coma vacinação com, por exemplo, uma vacina PCV-2 inativada convencional.
Especialmente uma vez que uma vacina inativada pode conter menos antígenodevido ao fato de que o virus pode não ser propagado em elevadas titulaçõesda cultura de células (ou procedimentos de concentração complicados edemorados devem ser introduzidos na produção da vacina). Especialmentepara este grupo de leitões, uma vacina de acordo com a presente invenção foiconstatada fornecer adequada proteção contra infecção por PVC-2.
Com a presente invenção, uma vacina foi provida que pode ser1usada em um método para proteger leitões, mesmo leitões que são positivosde MDA contra PCV-2, contra infecção com PCV-2 e, assim, contra doençasrelacionadas com PCV-2, muitíssimo notavelmente PMWS e PDNS.
A presente invenção fornece uma vacina contra PCV-2compreendendo pelo menos 20 micrograma/dose de proteína ORF-2 decircovírus porcino tipo 2 (PCV-2).
Foi constatado que uma vacina contendo pelo menos 20microgramas (ug) de proteína ORF-2 PCV-2 por dose é capaz de eliciar umaresposta imune protetora contra infecção por PCV-2 (e assim contra doençasrelacionadas com PCV-2, como PMWS e PDNS), mesmo em face de MDA.
Preferivelmente a vacina contém pelo menos 50 ug por dose e, muitíssimopreferivelmente, 80 ug por dose. As vacinas de acordo com a presenteinvenção com uma massa antigênica de até 275 ug por dose poderia mesmoser preparada e tais vacinas ainda não eliciriam reações locais no sítio deinjeção. Naturalmente, mesmo mais microgramas de antígeno poderiam sercolocadas em uma dose de uma vacina de acordo com a presente invenção,porém, se a proteção obtida com a vacina não for melhorada com uma maiselevada dose, o aumento da carga antigênica somente resulta na vacina sermais dispendiosa do que o necessário. Além disso, uma dose crescente deantígeno pode eventualmente resultar em inaceitáveis reações locais no sítioda injeção, o que deve ser evitado. Um método para medir a massa antigênicaé dado na parte experimental deste pedido.
Uma vacina de acordo com a presente invenção pode conteruma proteína ORF-2 recombinante, em que dita proteína recombinante épreferivelmente produzida por meio de expressão de um vetor de expressãode baculovírus em células de inseto, dito vetor de expressão de baculovíruscontendo a seqüência genética de ORF-2 PCV-2 sob controle de um promotor adequado.
Embora outros sistemas de expressão adequados conhecidosna arte possam ser usados também em um método para preparar uma vacinade acordo com a presente invenção, descobriu-se que o uso do sistema deexpressão baculo resulta na produção de altas produções de antígeno viral,que além do mais apresenta uma boa antigenicidade. O uso do sistema deexpressão baculo elimina, assim, a necessidade de procedimentoscomplicados e demorados para concentrar o antígeno a um nível adequado,quando não puder ser produzido em uma elevada concentração, por exemplo,em uma cultura celular infectada por vírus.
O vetor de expressão baculo mais comumente usado éAutographa californica, com freqüência usado com uma cultura de células deinsetos de células de insetos SF-9, SF-21 ou High five. SF-9 e SF-21 sãolinhagens de células ovarianas de Spodoptera frugiperda. As células Highfive são derivadas de células de ovo de Trichoplusia ni. O gene PCV-ORF-2deve ser colocado sob o controle de um promotor adequado. Os promotoresmais comumente usados no sistema de expressão de baculovírus são ospromotores para o gene da poliedrina e o promotor para o gene ρ 10,significando que a seqüência genética de ORF-2 PCV-2 é inserida em umsítio de inserção no local poliédrico ou no local plO do genoma dobaculovírus. Outros promotores adequados, homólogos ou heterólogosconhecidos na arte podem ser usados também. Uma descrição detalhada detodos os aspectos do sistema de expressão de baculovírus é dada em"Baculovirus Expression vectors" por D.R. 0'Reilly, L.K. Miller e V.A.Luckow (1992, W. H. Freeman & Co., New York). Além disso, os vetores deexpressão derivados do baculovírus e os sistemas de expressão completa sãocomercialmente disponíveis em muitas diferentes companhias.
Uma vacina de acordo com a presente invenção pode aindacompreender um adjuvante adequado. Muitos sistemas adjuvantes sãoconhecidos na arte, por exemplo, sistemas adjuvantes de óleo em águacomumente usados. Qualquer óleo adequado pode ser usado, por exemplo,um óleo mineral conhecido na arte para uso em adjuvantes. A fase óleo podeconter uma mistura adequada de diferentes óleos, minerais ou não-minerais.
Adjuvantes adequados podem também compreender vitamina E,opcionalmente misturada com um ou mais óleos. A fase água de uma vacinaauxiliada por óleo em água conterá o material antigênico. Formulaçõesadequadas usualmente compreenderão de cerca de 25 - 60 % de fase óleo (40- 75 % de fase óleo). Exemplos de formulações adequadas podemcompreender 30 % de fase água e 70% de fase óleo ou 50 % de cada.
Uma vacina de acordo com a invenção pode ser administradavia qualquer via adequada conhecida na arte, tal como intramuscular,intradérmica ou subcutaneamente, a administração intramuscular sendopreferida.
A presente invenção fornece ainda um método para amanufatura de uma vacina destinada para a proteção de leitões novos, quesejam MDA PCV-2 positivos, contra infecção por PCV-2, em que dita vacinaé provida com pelo menos 20 ug/dose de proteína ORF-2 de circovírusporcino tipo 2 (PCV-2).
Uma vacina (preparada por um método) de acordo com apresente invenção pode ser usada em um método para proteger leitões jovenscontra infecção por PCV-2.
Uma vacina de acordo com a presente invenção pode mesmoser usada em um método para a proteção de leitões jovens, que sejampositivos para anticorpos maternalmente derivados (MDA) contra PCV-2,contra infecção com PCV-2.
Constatou-se que uma vacina de acordo com a presenteinvenção pode proteger leitões, mesmo quando eles tenham uma titulaçãorelativamente elevada de MDA contra PCV-2. Uma distribuição das titulaçõesde MDA em leitões jovens encontrados no campo em várias fazendas atravésda Europa é expressa na tabela Iea proteção provida por uma vacina deacordo com a presente invenção é expressa na tabela 2. Foi mostrado que umavacina de acordo com a presente invenção pode mesmo fornecer adequadaproteção contra infecção por PCV-2 a leitões que têm titulações de MDAsituando-se no "agrupamento 2", como definido nos Exemplos (Tabela 2). Osleitões situando-se no agrupamento têm titulações MDA entre 8 e 12 log2,que é uma titulação de MDA alta.
Uma vacina de acordo com a presente invenção, portanto,pode mesmo ser usada em um método para a proteção de leitões jovens, quetenham uma titulação MDA contra PCV-2 de até 10 log2, ou mesmo 12 log2(conforme medido com um método indicado nos Exemplos).
Pela Tabela 1 pode ser visto que cerca de 55% dos leitõescoletados em várias fazendas através da Europa situam-se dentro desteagrupamento 2 (enquanto, naturalmente, leitões situando-se dentro doagrupamento 1, que têm uma titulação MDA menor e que compreendem 32%da população, são também protegidos por uma vacina de acordo com apresente invenção). Assim, pode-se concluir que uma vacina de acordo com apresente invenção fornece proteção à grande maioria de leitões encontradosno campo, incluindo aqueles com elevadas titulações de MDA.
Para fornecer adequada proteção, a vacina é preferivelmenteadministrada em um regime de vacinação de 2 injeções, por meio do que aprimeira injeção (vacinação iniciadora) é dada nos leitões na primeira à quartasemana de idade, preferivelmente antes do desmame, por exemplo, naprimeira semana de idade. A segunda injeção (vacinação de reforço) pode serdada cerca de 3 semanas mais tarde. Desta maneira, os leitões terão obtidoproteção total contra infecção por PCV-2, logo após o desmame, que équando os leitões são mais susceptíveis a infecção por PCV-2 e, assim,tornam-se susceptíveis a PMWS e PDNS.
EXEMPLOS:
Exemplo 1: Determinação de titulações anticorpo específicasde PCV-2 maternalmente derivatizadas)
As titulações de anticorpo contra PCV-2 podem serdeterminadas da seguinte maneira:
Uma monocamada de células PK15 foi formada em placa decultura de tecido de 96 poços. A 80% de confluência as células foram20 infectadas com um isolado de campo de PCV-2 e ainda incubadas por 2 dias a37 °C em um incubador CO2. Após este período, as células foram fixadas emEtanol e armazenadas a 2 - 8 0C até uso. As placas são usadas para testesquando aproximadamente 20% das células foram infectadas.
Para determinar a titulação de anticorpo específica de PCV-2de um dado soro, diluições seriais são feitas e incubadas nas células fixadascom etanol. Após 1 hora de incubação a 37 °C, as placas são lavadas comágua de bica e os anticorpos ligados detectados por incubação com IgG anti-Suíno de Coelho rotulado-FITC. A titulação de um dado soro é expressacomo o recíproco da mais elevada diluição, em que uma resposta de anticorpoespecífica de PCV-2 pode ainda ser observada.
Uma distribuição típica das titulações de anticorpomaternalmente derivadas contra PCV-2 em leitões de pré-desmame é dada natabela 1.
Os soros foram coletados de 232 leitões de vários paísesatravés da Europa.
Tabela 1 - Distribuição das titulações de anticorpos derivados maternalmenteem um grupo de 232 leitões jovens
<table>table see original document page 10</column></row><table>
Na tabela 1 três agrupamentos podem ser distinguidos:
Agrupamento 1; leitões com titulações menores do que 8, agrupamento 2;leitões com titulações de 8 a 12 e agrupamento 3; leitões com titulações de 13e superiores. No agrupamento 3, as titulações de anticorpos derivadosmaternalmente são aquelas pelas quais se espera que os leitões sejamprotegidos durante o período crítico de idade (Merial: 'PCV-2 Diseases: Fromresearch back to the field strain', 18a. IPVS5 Hamburg, Alemanha, Junho de2004, página 99 - 101). No agrupamento 1, entretanto, as titulações deanticorpos maternalmente derivados são aquelas com quais a maioria destesleitões podem ser facilmente vacinados. Entretanto, no agrupamento 2, astitulações de anticorpos são de uma tal magnitude que uma abordagem devacinação convencional provavelmente deixará de imunizar a maioria destegrupo. Uma vez que mais do que metade dos leitões parecem situar-se dentrodeste agrupamento, será da máxima importância ser-se capaz de proteger osleitões deste agrupamento, se se desejar eliminar a PMWS de uma fazenda.
É bem sabido na arte que a vacinação em face de titulações deanticorpos maternalmente derivados pode ser ajudada por um adjuvante e/ouum teor de antígeno elevado. Não é sabido que adjuvante ou que teor deantígeno será capaz de atravessar as titulações de anticorpos maternalmentederivadas, dirigidos contra um dado patógeno. Portanto, nos experimentosdescritos procuramos definir a quantidade mínima de antígeno que serianecessária para proteger os leitões do agrupamento 2 contra uma infecção porPCV-2.
Exemplo 2, construção de um baculovírus recombinanteexpressando PCV-2 ORF-2
O vírus PCV-2 foi isolado do tecido do pulmão de um porcode engorda apresentando sinais clínicos e histopatológicos de PMWS,empregando-se células de Testículo de Suíno livres de PCV. O vírus foipropagado através de cinco passagens das células PK15 livres de PCV.
O DNA foi isolado de uma preparação de vírus PCV-2purificado de sobrenadante infectado de células PKl 5. A PCR foi realizadapara amplificar o gene ORF-2, com base nas seqüências publicadas,empregando-se iniciadores contendo sítios de restrição BamWl (iniciador paradiante: CGG GAT CCG TTT TCA GCT ATG ACG TAT, iniciador reversos:CGG GAT CCT TTA TCA CTT CGT AAT GGT Τ). O amplicon resultanteabrange o gene ORF-2 completo, mais sítios de restrição BamRlflanqueantes.
Em seguida a eletroforese de gel, o amplicon foi extirpado epurificado. O fragmento ORF-2 PCV-2 purificado foi então digerido comBamHl e ligado dentro de pAcAS3 digerido por BamHl (Viak et al. (1990)Virology 179 312 - 320). Este plasmídeo contém o promotor plO a montantedo sítio de inserção, permitindo a expressão dos genes estrangeiros sobcontrole do promotor ρ 10.
Bactérias TOP IOF' (Invitrogen, Carlsbad, USA) foramtransformadas com a mistura de ligação e clones que continham a construçãocorreta foram selecionados com base em sua seqüência. Um clone positivo foiexpandido e o DNA de plasmídeo de transferência foi novamente retestadoempregando-se seqüenciamento.
Antes da transfecção, o vírus da poliedrose nuclearAutographa califomica (AcNPV, descrito em Martens et al. (1995) J. Virol.Methods 52 15 - 19) foi digerido com Bsuiei. O sítio Zfa«361 deste vírus éum sítio de restrição único no local ρ 10.
Células de Spodoptera frugiperda (Sf9) foram entãotransfectadas com plamídeo de transferência e DNA de baculovírus ^cNPvdigerido com Bsu2>6\, empregando-se CellFectine (Life Technologies,Gaithersburg, USA). O sobrenadante da transfecção foi colhido a 3 dias póstransfecção e purificações de placa foram realizadas em células Sf9.
As placas foram expandidas e o vírus resultante foi avaliadoquanto à inserção de gene ORF-2 PCV-2 seqüenciando-se DNA viral isoladoe imunofluorescência em células Sf9, empregando-se anti-PCV-2empregando-se soros anti-PCV-2 de coelho e porco.
Uma semente de baculovírus recombinante BacPCV-2-ORF-2foi preparada, chamada "Masterseed" (semente mestra). A Masterseed e a 5a.passagem da Masterseed em células Sf9 foram testadas quanto a inserçãoestável do gene ORF-2 PCV-2 por seqüenciamento de DNA isolado eimunofluorescência das células Sf9.
Titulações foram realizadas para medir o grau de vírusinfeccioso nas preparações de vírus. Titulações foram realizadas em célulasSf9 e foram lidas observando-se imunofluorescência CPE específica debaculovírus e/ou específica de ORF-2 PCV-2, empregando-se soro imuneanti-PCV-2 de coelho policlonal.
Foi demonstrado que uma Masterssed purificada-placa deBacPCV-2-ORF-2 de baculovírus ^cNPV recombinante foi produzida. Estaconstrução estavelmente expressou a proteína ORF-2-PCV sob controle dopromotor plO em células Sf9, como julgado por seqüenciamento eimunofluorescência da Masterseed e da 5 a. passagem da Masterseed emcélulas Sf9.
Exemplo 3, produção de antígeno PCV-2
A fim de obterem-se quantidades máxima de produto deexpressão, experimentos piloto foram realizados para otimizar as condiçõespara obter-se proteína ORF-2 PCV-2 recombinante. Todos os experimentosforam realizados utilizando-se células Spodoptera frugiperda 21 (Sf21) emcultura de suspensão a 28 0C. O vírus BacPCV-2-ORF-2 da no nível da 4a.passagem da Masterseed foi usado para infecção. Para produção otimizada, adensidade de célula na ocasião da infecção foi de 1,4 χ IO6 células/ml, amultiplicidade de infecção (MOI) foi de 0,01 e a cultura foi continuada por 6dias em seguida à infecção. A mistura resultante foi chamada colheita deproduto de expressão. A expressão sob condições otimizadas foi realizada 5vezes em experimentos separados durante o curso de um ano.
Uma vez que o antígeno foi localizado nas células, a colheitatotal, contendo tanto células como sobrenadante, foi submetida a sonicação namedida em que pelo menos 90% das células eram rompidas. Em seguida, ovírus recombinante vivo das bateladas de colheita sonicada era inativado com33 mM Binary Ethylenimine (BEI) a 37 0C por 72 horas sob agitaçãocontínua, em um pH de 7,5. Após inativação, a BEI foi neutralizada pelaadição de um excesso molar de 1,6 vezes de Tiossulfato de Sódio.
Após neutralização, os detritos de célula e os poliedros foramremovidos por centrifugação de baixa velocidade a 600g por 10 min. Osobrenadante resultante foi chamado suspensão de vírus inativado. Ascolheitas foram verificadas quanto à esterilidade e quanto à totalidade dainativação. A totalidade da inativação foi testada pela passagem de suspensãode vírus inativado em células Sf9 por 2 semanas e inspeção visual quanto àausência de CPE específico de baculovírus.
Foi demonstrado que foram obtidos títulos de Baculovírus de8,5 Iogi0 TCLD50/ml que eram completamente inativados após tratamento com BEI.
Exemplo 4, determinação da quantidade de antígeno PCV-2
Amostras de suspensão inativada antes e após centrifugação debaixa velocidade e uma amostra de sobrenadante de cultura de célula de vírusde transferência precursor foram submetidas a eletroforese-gel depoliacrilamida-SDS desnaturante, de acordo com o método de Laemmli(Laemmil, U.K (1970). Nature 227, 680-685). Um gel gradiente de 4 - 12%foi usado, que foi tingido com Azul Brilhante de Coomassie.
Quando Western Blotting foi realizada, as proteínas do gelforam eletroforeticamente transferidas para as membranas Nylon, bloqueadascom leite desnatado em PBS e reagidas com soro Swine policlonal diluído,instigado contra um isolado de campo de PCV-2.
Como uma medida do teor de antígeno da suspensão de vírusinativado resultante, 1 microlitro (μΐ) desta suspensão foi colocado em um gelde uma maneira similar, enquanto diluições seriais de Bovine Serum Albumin(Sigma, St. Louis, USA, cat. no. A-2153) foram realizadas em paralelo nomesmo gel como uma referência. A quantificação do produto genético ORF-2na suspensão de vírus inativado foi realizada comparando-se as densidades dareferência BSA com aquela da amostra contendo PCV-2, utilizando-seformação de imagem de captura de câmera e análise computadorizadaempregando-se GeneTools (SynGene, Cambridge, UK. v.3.06.02).
Quando colheitas inativadas antes e após centrifugação debaixa velocidade foram comparadas por separação eletroforética em ge'sSDS-PAG contra marcadores Precision Plus (Bio-Rad, Hercules, USA), omaterial antes da centrifugação forneceu 2 faixas maiores de densidadeaproximadamente igual de Molecular Weights (MW) aparentes de 30 e 26,8kDa, enquanto o material após centrifugação somente continha da faixamenor. Quando o vírus de transferência precursor foi colocado lado a ladocom o vírus recombinante, o vírus de transferência precursor somentecontinha a mais importante das duas faixas, demonstrando que a faixa inferiorera a ORF-2 de PCV e a faixa mais importante a poliedrina, que foi removidaapós centrifugação.
A identidade da faixa de 26,8 kDA inferior foi aindaconfirmada por Western blotting, em que foi mostrado que esta faixa, mas nãoa faixa de 30 kDa, reagia com soro Swine policlonal instigado contra vírus decampo PCV-2.
Os níveis de expressão da ORF-2 PCV-2 foram determinadosem 5 experimentos separados e em cada exemplo a quantidade era bem acimado limite de detecção do teste, especificamente variando de 40 a 500micrograma/mililitro (ug/ml) de suspensão de vírus inativado.
Exemplo 5. Influência da quantidade de ORF-2 PCV-2 napegada de vacina em leitões jovens de MDA positivos
Vacinas de diferentes teor de antígeno ORF-2 PCV-2 foramformuladas e usadas para vacinar leitões jovens com variáveis níveis deanticorpos maternalmente derivados (MDA) contra PCV-2. Duas vacinaçõesforam feitas, 3 semanas separadas. A soro-resposta contra o antígeno foimedida a 5 - 6 semanas após a primeira vacinação. A partir destes dados, ainfluência do teor de antígeno sobre a pegada da vacina em face de MDA foicalculada.
Várias diluições de antígeno foram feitas e misturadas 1:1(v/v) com um adjuvante de óleo em água, tal como são comuns na arte.Em seguida, entre 1 e 4 semanas de idade, as ninhadas foramdivididas em grupos e tratadas intramuscularmente com vacinas contendoquantidades variáveis de proteína PCV-2-ORF-2, ou não foram vacinadas. ASvacinações foram repetidas após 3 semanas. Os seguintes grupos foramcriados:
114 leitões vacinados com 1 - 14 ug de proteína ORF-2 PCV-2/dose (grupo 1),
85 leitões vacinados com 20 e 80 ug/dose (grupo 2)Sangue foi tirado na ocasião da primeira vacinação e a 5 - 6semanas em seguida. Os soros foram preparados e examinados quanto aanticorpos PCV-2 por imunofluorescência. Para isto uma monocamada decélulas PKl5, em uma placa de cultura de tecido de 96 poços, foi infectadacom um isolado de campo de PCV-2. Após 2 dias de cultura, quandoaproximadamente 20 - 30% das células estavam infectadas, as monocamadasforam fixadas em Etanol e armazenadas a 2 - 8 0C até uso. Para determinar atitulação, diluições seriais de soros de teste foram incubadas nas células por 1hora a 37 0C e, após lavagem das placas, anticorpos ligados foram detectadospor incubação por 1 hora a 37 0C com IgG anti-Swine de Coelho rotulado-FITC (Nordic, Tilburg, Países Baixos). As titulações foram determinadascomo o recíproco da mais elevada diluição, em que uma fluorescênciaespecífica de PCV-2 pôde ainda ser observada. Para todos os animais, odeclínio da titulação anticorpo entre o primeiro e o segundo sangramentos foideterminado. Se neste período a titulação de anticorpo não tivesse declinadoou fosse aumentada, era considerado que no animal envolvido a vacina tinhapegado. Entretanto, quando o anticorpo específico de PCV-2 tinha diminuído,era considerado que a vacinação não tinha tido sucesso e que a vacina tinha pegado.
Relacionando-se a pega de várias doses de vacina com atitulação de anticorpo derivado maternalmente na ocasião da vacinação, amassa antigênica mínima necessária para vacinar uma quantidade suficientede leitões pôde ser determinada. Os resultados desta análise são dados naTabela 2.
Tabela 2. Percentagem de vacina pegada em várias titulações de MDA econcentrações de antígeno
<table>table see original document page 17</column></row><table>
* O número total de leitões protegidos é dado pelo número de leitões em quea vacina pegou em leitões com uma menor titulação do que 13, mas os leitõesque já têm uma titulação de 13 ou superior.
Nesta tabela, "pega de vacina" significa que a vacinação de umleitão resultou em uma titulação de anticorpo específica de PCV-2 em 1semana pós vacinação de reforço, que é igual ou superior à titulaçãoespecífica de PCV-2 na vacinação primária. Em todos tais casos édemonstrado que a vacina armou uma resposta de soro ativa contra PCV-2 eem cujo caso os leitões podem ser considerados como estando protegidoscontra uma infecção pro PCV-2. Entretanto, em leitões em que a titulação a 1semana pós reforço era menor do que na vacinação primária, a vacina eraincapaz de induzir uma resposta imune e o declínio natural dos anticorposmaternalmente derivados foi observado que, no tempo, tornará estes animaissusceptíveis a uma infecção por PCV-2.
Pela tabela é demonstrado que, quando usando-se doses devacina iguais ou menores do que 14 microgramas, no agrupamento 1(titulações MDA < 7) 90% dos animais serão soroconvertidos devido àvacinação e podem, portanto, ser considerados como estando protegidos.Entretanto, no agrupamento 2 (titulações de MDA > 7 e < 13), somente 17%dos animais vacinados com uma dose menor ou igual a 14 microgramassoroconverteram-se e foram protegidos. Neste grupo, 17 animais tinhamtitulações de 13 ou maiores e estavam, portanto, já protegidos por seusanticorpos derivados maternalmente, específicos de PCV-2, adquiridosnaturalmente. Portanto, pode-se concluir que, neste grupo de um total de 114leitões, somente 48 (42%) foram protegidos; 17 leitões já com elevadastitulações de anticorpos derivados maternalmente, mais 31 leitõessoroconvertidos dos agrupamentos 1 e 2.
No grupo vacinado com 20 microgramas por dose ou mais,significativamente mais animais foram protegidos; todos os animais doagrupamento 1 e 76% dos animais do agrupamento 2 soroconverteram-se paraPCV-2 e foram, em conseqüência, protegidos, adicionando-se a estes osleitões com titulações MDA de 13 ou mais, tendo-se constatado que 88% dosleitões deste grupo estavam protegidos.
Uma vez que a proteção do rebanho é obtida quando cerca de80% ou mais dos animais estão protegidos, pode-se concluir que a massaantigênica de uma vacina dirigida contra PCV-2 deve pelo menos conter 20 ug de antígeno ou mais, para ser capaz de eficientemente proteger um rebanhocontra as conseqüências de uma infecção por PCV-2.

Claims (9)

1. Vacina contra PCV-2, caracterizada pelo fato decompreender pelo menos 20 microgramas/dose de proteína ORF-2 decircovírus porcino tipo 2 (PCV-2).
2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de compreender pelo menos 50 microgramas/dose de proteína ORF-2 decircovírus porcino tipo 2 (PCV-2).
3. Vacina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadapelo fato de a proteína ORF-2 ser uma proteína recombinante.
4. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizada pelo fato de a proteína ORF-2 ser produzida pormeio de expressão de um vetor de expressão de baculovírus em células deinseto, dito vetor de expressão de baculovírus contendo a seqüência genéticaORF-2 PCV-2 sob controle de um promotor adequado.
5. Vacina de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelofato de o promotor ser o promotor ρ 10.
6. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, dita vacina caracterizada pelo fato de compreender ainda umadjuvante adequado.
7. Vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelofato de o adjuvante ser uma emulsão de óleo em água.
8. Vacina de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizadapelo fato de o adjuvante conter vitamina E.
9. Método para a manufatura de uma vacina destinada para aproteção de leitões, que é MDA positiva PCV-2, contra infecção por PCV-2,caracterizado pelo fato de que dita vacina é provida com pelo menos 20microgramas/dose de proteína ORF-2 de circovírus porcino tipo 2 (PCV-2).
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