BRPI0616091A2 - produto processado pelo calor e respectivos mÉtodos de produÇço de produto de planta comestÍvel e de planta transgÊnica, de reduÇço do conteédo de acrilamida em produto de planta e de sobreexpressço de gene em tubÉrculo de batata, seqÜÊncia de polinucleotÍdeo isolado e planta - Google Patents

Abstract

Produto Processado pelo Calor e Respectivos Métodos de Produção de Produto de Planta Comestível e de Planta Transgênica, de Redução de Conteúdo de Acrilamida em Produto de Planta e de Sobreexpressão de Gene em Tubérculo de Batata, Seqüência de Polinucleotídeo Isolado e Planta. A presente invenção proporciona seqüências de polinucleotídeos e polipeptídeos a partir de plantas, métodos de redução dos níveis de asparagina livre em plantas, métodos de produção de alimentos processados pelo calor contendo níveis reduzidos de acrilamida e plantas e alimentos obtidos por estes métodos.

Description

"Produto Processado pelo Calor e Respectivos Métodos de Produção de Produto de Planta Comestível e de Planta Transgênica,

de Redução do Conteúdo de Acrilamida em Produto de Planta e de Sobreexpressão de Gene em Tubérculo de Batata, Seqüência de Polinucleotideo Isolado e Planta"

Relatório Descritivo

Referência Remissiva a Pedidos de Prioridade

Este Pedido de Patente norte-americano não provisório reivindica prioridade sobre os pedidos norte-americanos provisórios números 60/718.335, depositado em 20 de setembro de 2005, e 60/833.788, depositado em 28 de julho de 2006, ambos os quais são aqui incorpo- rados por referência.

Campo da Invenção

A presente invenção está relacionada a métodos genéticos para regular negativa e positivamente os genes em uma planta, por exemplo, nos órgãos de armazenamento dessa planta ricos em amido, para diminuir o nível de acrilamida que se acumula com o aquecimento oriundo do processamento desses órgãos.

Histórico

O aquecimento de alimentos que contêm tanto asparagina livre quando açúcares redutores resulta na produção de acrilamida. A acrilamida é um produto químico industrial usado no mundo inteiro para sintetizar poliacrilamida. A exposição a esse composto reativo resulta numa rápida absorção e mesmo distribuição entre os tecidos (Barber e colaboradores, Neurotoxicology 2001, 22, 341-353). Em roedores, os efeitos toxicológicos da alta concentração de acrilamida (>2 mg/kg de peso corporal) incluem sintomas neurológicos, fertilidade diminuída e câncer (Friedman, J. Agríc. Food Chemi 2003, 51, 4504- 4526).

Também se sabe que a exposição ocupacional a altos níveis de acrilamida eleva a incidência de neurotoxicidade em humanos (LoPa- chin, Neurotoxicology, 2004, 25, 617-630), mas não há efeitos docu- mentados da acrilamida na reprodução humana ou na carcinogênese. Tanto a acrilamida quanto o seu metabólito oxidizado glicidamida reagem com a valina amino-terminal da hemoglobina para formar adutos. A extensão da formação de adutos é uma boa marcadora dos níveis de exposição e implica em uma dose diária de formação de adutos de aproximadamente 100 μg (Tareke e colaboradores, J. Agric. Food Chem., 2002, 50, 4998-5006). Embora se acreditasse inicialmente que água potável, cosméticos e o fumo fossem as únicas principais fontes de exposição ambiental à acrilamida (Bergmark, Chem, Res. Toxicolr 1997, 10, 78-84), análises recentes indicaram que o consumo de alimentos fritos ou assados ricos em amido contribuem com 36% da ingestão de acrilamida (Becker e Pearson, Dietary habits and nutrient intake in Sweden 1997-98. Riksmaten 1997-98, 1999).

A acrilamida na dieta é derivada em grande parte das reações induzidas pelo calor entre o grupo amina do aminoácido livre asparagi- na e o grupo carbonila dos açúcares redutores (Mottram e colaborado- res, Naturei 2002, 419, 448-449; Stadler e colaboradores, Naturei 2002, 419, 449-450). Os tubérculos frescos de batata contêm altos níveis de asparagina, mas concentrações relativamente baixas de açúcares redutores, como glicose e frutose. Entretanto, os açúcares redutores acumulam durante o armazenamento a frio através da expressão de invertases induzidas pelo frio, as quais catalisam a conversão de sacarose em glicose e frutose.

Tentativas anteriores de se limitar o acúmulo de acrilamida em alimentos ricos em amido não resultaram em aplicações práticas e custo-efetivas. Um primeiro método de arte prévia é baseado na modifi- cação de parâmetros de processamento, como a razão entre superfície e volume, temperatura e tempo de fritura. Embora aplicações desse método sejam parcialmente eficazes em diminuir o acúmulo de acrila- mida, elas alteram as características sensoriais do produto alimentício final ao reduzir a cor, modificar o formato e alterar o gosto e a textura. Essas alterações não são desejáveis.

Um segundo método é baseado na incubação de produtos alimentícios parcialmente processados com asparaginase (EC 3.5.1.1) ou glurninase (EC 3.4.1.2) antes do aquecimento (ver Pedidos de Patente Mundial 2004/030468 A3 e 2004/026042 Al). Esse método é caro e só pode ser aplicado prontamente a materiais como farinha de trigo, que podem ser facilmente misturados com a enzima.

Um terceiro método adiciona um competidor da asparagina, como a glicina, ao alimento parcialmente processado (Pedido de Patente Mundial 2005/025330 Al para tubérculos de batata, Pedido de Patente US 2004/0081724 Al para grãos de café torrados, pedido de patente mundial 2005/004620 Al para grãos de cacau, pedido de patente mundial 2005/004628 Al para alimentos baseados em milho). Esse método é apenas parcialmente efetivo, requer altas concentrações do aditivo e é caro demais para ser amplamente aplicado.

Um quarto método adiciona uma enzima alteradora de açúcar redutor, que consiste da aldose redutase, ao material alimentício antes do aquecimento (ver Patente US 6989167). Esse método não é muito eficaz e é muito caro para ser amplamente aplicado.

Um quinto método reveste o alimento com um reagente selecio- nado, de um grupo que consiste de um composto contendo aminoácido, um sal de aminoácido, uma amida de aminoácido, um éster de aminoá- cido e misturas destes, antes do aquecimento (ver pedido de patente mundial 2005/077203A3). Esse método é apenas parcialmente eficaz e é muito caro para ser aplicado amplamente.

Um sexto método é baseado na seleção de germoplasma que contém níveis muito baixos tanto de açúcares redutores quanto de asparagina. A disponibilidade desse germoplasma tornaria possível introgredir as características ^aixo açúcar' e TDaixa asparagina' em variedades que são aceitáveis para amplo uso na indústria alimentícia. Entretanto, nenhuma planta de cultivo com baixo nível de asparagina foi identificada até agora. Mesmo se esse germoplasma for descoberto no futuro, levaria pelo menos de 15 a 20 anos para introduzir as características desejadas nas variedades comerciais.

Um sétimo método modifica geneticamente o cultivo para reduzir os níveis de açúcares redutores. Esse método é baseado na regulação negativa da expressão dos genes envolvidos na degradação do amido, como os genes Rl associados a amido e fosforilase-L (ver, por exemplo, o Pedido de Patente US 2003/0221213 Al). Embora parcialmente eficaz, alimentos processados derivados desses cultivos modificados ainda contêm cerca de um terço dos níveis de acrilamida encontrados em produtos controle.

Assim, há uma necessidade importante de métodos para reduzir os níveis de acrilamida em alimentos processados que são obtidos de cultivos ricos em amido. Esses métodos devem ser efetivos do ponto de vista do custo e não devem reduzir as características sensoriais do alimento. A presente invenção proporciona esses métodos.

Sumário da Invenção Numa modalidade, a invenção proporciona uma nova estratégia para reduzir os níveis de acrilamida em um alimento processado que foi obtido aquecendo os tecidos ricos em amido do cultivo. De maneira inédita, essa estratégia emprega métodos de engenharia genética para reduzir os níveis de asparagina nos tecidos ricos em amido de uma planta do cultivo em pelo menos 50%.

Numa modalidade, os níveis de asparagina nos tecidos ricos em amido de uma planta do cultivo são reduzidos diminuindo-se o nível de biossíntese da asparagina e/ou aumentando o nível do metabolismo de asparagina. Qualquer um dos mecanismos pode empregar a regulação negativa ou positiva dos genes que estão direta ou indiretamente envolvidos em cada uma das vias de asparagina. Num aspecto, o gene envolvido no metabolismo da asparagina codifica uma asparaginase. Num aspecto, o gene envolvido na biossíntese da asparagina codifica uma asparagina sintetase.

Noutro aspecto, os genes que estão indiretamente envolvidos em uma via da asparagina são selecionados de um grupo contendo um gene de glutamina sintetase (GS), um gene de nitrato redutase (NR), um gene 14-3-3 e um gene de hexoquinase (HXK).

Num aspecto, o nível de biossíntese da asparagina é reduzido pe- la diminuição da expressão de pelo menos um gene envolvido na biossíntese de asparagina.

Num aspecto, a expressão reduzida de um gene envolvido na bi- ossíntese de asparagina é obtida pela introdução na planta de um cassete de expressão contendo, de 5' para 3', (i) um promotor, (ii) pelo menos uma cópia da seqüência que contém pelo menos um fragmento de pelo menos um gene envolvido no metabolismo da asparagina e, opcionalmente, (iii) um segundo promotor ou um terminador, sendo que o primeiro e o opcional segundo promotores estão posicionados na orientação convergente.

Num aspecto, o cassete de expressão que é usado para reduzir a expressão de um gene envolvido na biossíntese de asparagina contém duas cópias de uma seqüência contendo pelo menos um fragmento de um gene envolvido no metabolismo de asparagina.

Num aspecto, as duas cópias estão posicionadas como (i) repeti- ções invertidas ou (ii) repetições diretas.

Num aspecto, o gene envolvido na biossíntese de asparagina é isolado da batata, de uma batata selvagem, como a Solanum phurej, da batata doce, do inhame, de um cafeeiro, de um cacauzeiro, do trigo, do milho, da aveia, do sorgo ou da cevada, e codifica uma asparagina sintetase.

Num aspecto, o gene da asparagina sintetase contém uma se- qüência que compartilha pelo menos 70% de identidade com pelo menos um fragmento da seqüência mostrada na SEQ ID.: 1.

Em outro aspecto, o gene da asparagina sintetase contém uma seqüência que compartilha pelo menos 70% de identidade com pelo menos um fragmento da seqüência mostrada na SEQ ID.: 2.

Num aspecto, a sobreexpressão de um gene envolvido no meta- bolismo da asparagina é obtida pela introdução na planta de um cassete de expressão contendo, de 5' para 3', um primeiro promotor, um gene envolvido na biossíntese de asparagina e um terminador.

Num aspecto, o gene envolvido no metabolismo de asparagina é isolado da batata, de uma batata selvagem, como a Solanum phurej, da batata doce, do inhame, de um cafeeiro, de um cacauzeiro, do trigo, do milho, da aveia, do sorgo ou da cevada, e codifica uma asparaginase. Num aspecto, o gene da asparaginase contém uma seqüência que compartilha pelo menos 70% de identidade com a seqüência mostrada em SEQ ID.: 9, 10, 14, 15, 31, 32 ou 33.

Em outro aspecto, o gene da asparaginase contém uma seqüên- cia que compartilha pelo menos 70% de identidade com a seqüência mostrada em SEQ ID.: 14. Em outro aspecto, o gene envolvido na biossíntese de asparagina é um gene de glutamina sintetase ou hexoquinase.

Num aspecto, o promotor é um promotor de (i) um gene de ami- do sintetase ligada ao um grânulo de batata, (ii) um gene de ADP glicose pirofosforilase de batata, (iii) um gene de ubiquitina-7 de batata, (iv) um gene de patatina de batata, (v) um gene de flavonóide mono-oxigenase de batata.

Num aspecto, o promotor de um gene de amido sintetase ligada ao um grânulo de batata compartilha pelo menos 70% de identidade com pelo menos parte da SEQ ID NO.: 8, o promotor do gene de ADP glicose pirofosforilase de batata compartilha pelo menos 70% de identi- dade com pelo menos parte da SEQ ID NO.: 7, o promotor do gene de ubiquitina-7 de batata compartilha pelo menos 70% de identidade com pelo menos parte da SEQ ID NO.: 21, o promotor do gene de patatina de batata compartilha pelo menos 70% de identidade com pelo menos parte da SEQ ID NO.: 22 e um promotor do gene de flavonóide mono- oxigenase de batata compartilha pelo menos 70% de identidade com pelo menos parte da SEQ ID NO.: 13.

Em outro aspecto, o promotor é o promotor de um gene que é expresso em um tubérculo, raiz ou semente de um cultivo rico em amido destinado ao processamento alimentício.

Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para reduzir os níveis de acrilamida em um alimento que foi obtido pelo aquecimento dos tecidos de um cultivo por meio da redução simultânea da asparagina e dos açúcares redutores nos tecidos. Numa modalidade, o tecido é um tecido rico em amido do cultivo ou da planta. Num aspecto, a redução simultânea dos níveis de asparagina e açúcares redutores é obtida por meio (i) da regulação negativa da expressão de um gene envolvido na biossíntese da asparagina ou na sobreexpressão

de um gene envolvido no metabolismo da asparagina, e (ii) da regulação negativa de pelo menos um gene envolvido na degradação do amido.

Num aspecto, a expressão de um gene na degradação do amido é regulada negativamente pela introdução na planta de um cassete de expressão contendo, de 5' para 3', (i) um promotor, (ii) pelo menos uma cópia de uma seqüência contendo pelo menos um fragmento de um gene envolvido na degradação do amido e, opcionalmente, (iii) ou um segundo promotor ou um terminador, sendo que o primeiro promotor e o opcional segundo promotor estão posicionados na orientação conver- gente.

Num aspecto, um gene envolvido na degradação do amido é sele- cionado de um grupo que consiste de (i) um gene Rl associado ao amido e (ii) um gene de fosforilase-L associada ao amido.

Em outra modalidade, a invenção fornece um método para si- multaneamente reduzir os níveis de acrilamida em um alimento que foi obtido pelo aquecimento de tecidos de um cultivo e aumentar as carac- terísticas sensoriais desse alimento através da redução simultânea dos níveis de asparagina e de açúcares redutores nos tecidos. Numa moda- lidade, o tecido é um tecido rico em amido do cultivo ou da planta. Num aspecto, a redução simultânea é obtida por meio do empre-

go de uma construção de 'ataque multigênico' ( tttíiItiçjGTie-tcivçjGting) que contém um primeiro cassete de expressão contendo ou (i) um gene de asparaginase operacionalmente ligado a um promotor ou (ii) pelo menos uma cópia de um fragmento de um gene de asparagina sintetase operacionalmente ligado a um promotor e um segundo cassete de expressão contendo pelo menos uma cópia de um segmento de DNA que contenha tanto um fragmento do gene Rl quanto um fragmento do gene da fosforilase operacionalmente ligados a um promotor, sendo que o primeiro e segundo cassetes de expressão podem ser o mesmo cassete de expressão.

Numa modalidade, uma planta contém pelo menos uma célula transformada de maneira estável com a construção de ataque multigê- nico. Numa modalidade seguinte, a planta produz tubérculos. Em outra modalidade, a planta produtora de tubérculos é uma batata. Em outra modalidade, a planta produtora de tubérculos contém o cassete inte- grado de maneira estável em seu genoma.

Em outro aspecto, a invenção fornece um produto processado a partir de um tubérculo transgênico, sendo que (a) pelo menos uma célula do tubérculo transgênico contém a construção de ataque multi- gênico, e (b) o produto tem uma concentração mais baixa de acrilamida que um produto equivalente de um tubérculo não transgênico da mesma variedade vegetal.

Em outro aspecto, a invenção fornece um produto de um tubér- culo transgênico, sendo que (a) pelo menos uma célula do tubérculo transgênico contém a construção de ataque multigênico, (b) o produto tem uma concentração mais baixa de acrilamida que um produto equivalente de um tubérculo não transgênico da mesma espécie, e (c) o produto exibe ainda uma taxa mais baixa de escurecimento (browning) não enzimático, quando comparado com o produto equivalente de um tubérculo não transgênico da mesma espécie.

Em outro aspecto, a invenção fornece um produto de um tubér- culo transgênico, sendo que (a) pelo menos uma célula do tubérculo transgênico contém a construção de ataque multigênico, (b) o produto tem uma concentração mais baixa de acrilamida que um produto equivalente de um tubérculo não transgênico da mesma espécie e (c) o produto exibe ainda uma taxa mais baixa de escurecimento não enzi- mático quando comparado com o produto equivalente de um tubérculo não transgênico da mesma espécie, e (d) o produto exibe ainda um perfil

sensorial melhorado quando comparado com o produto equivalente de um tubérculo não transgênico da mesma espécie. Numa modalidade, o produto vegetal comestível tem características sensoriais melhoradas quando comparado com um produto equivalente de uma planta que não foi modificada de acordo com os presentes métodos inventivos. Numa modalidade, o produto vegetal comestível tem pelo menos uma caracte- rística sensorial melhorada selecionada do grupo que consiste de aparência, sabor, aroma e textura.

Numa modalidade, o tubérculo transgênico é uma batata. Numa modalidade adicional, o produto é batata frita. Em outra modalidade adicional, o produto é batata chip,

Em outra modalidade, o tubérculo transgênico é uma batata e o

produto do tubérculo transgênico é armazenado entre 4°C e 12°C por

cerca de uma a trinta semanas e contém um nível de glicose de menos

de 50% do nível de glicose de um tubérculo não transgênico da mesma

espécie armazenado sob as mesmas condições que o tubérculo transgê- nico.

Numa modalidade, a planta é selecionada de um grupo que con- siste de batata, milho, café, cacau e trigo.

Em outra modalidade, a planta é transformada com uma cepa de bactéria selecionada do grupo que consiste de Agrobacterium tumefa- dens, Rhizobium trifolü, Rhizobium Ieguminosammy Phyllobactenum myrsinacearum, SinoRhizobium melilotie MesoRhizobium Ioti

Num aspecto, a invenção fornece uma seqüência polinucleotídica isolada contendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo que é capaz de reduzir os níveis de asparagina em uma planta e, conseqüentemente, reduzir os níveis de acrilamida no produto processado dessa planta.

Numa modalidade, a seqüência de ácido nucléico compartilha

20

10

pelo menos 70% de identidade com a seqüência que é selecionada do grupo que consiste de SEQ ID NO: 9, 10, 14, 15, 31, 32 e 33, ou uma variante ou fragmento destas e esse ácido nucléico codifica um polipep- tídeo com atividade de asparaginase.

Numa modalidade adicional, a variante tem uma identidade de seqüência que é maior ou igual a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, ou 60% em seqüên- cia a qualquer uma das SEQ ID NOs: 9, 10, 14, 15, 31, 32 e 33.

Em outro aspecto, é fornecida uma seqüência polinucleotídica isolada contendo uma seqüência de ácido nucléico que codifica uma asparaginase capaz de reduzir os níveis de asparagina em uma planta e, conseqüentemente, reduzir os níveis de acrilamida no produto proces- sado dessa planta.

Em outro aspecto, a invenção propicia uma planta transgênica com níveis reduzidos de expressão de asparaginase, a qual pode ser usada para produzir um alimento processado com um conteúdo menor de acrilamida.

Em outro aspecto, a invenção proporciona um alimento com menor conteúdo de acrilamida, o qual foi obtido através do processa- mento de um tubérculo transgênico com um conteúdo menor de aspa- ragina.

Com base nos dados da U.S. Food an Drug Administration (www.cfsan.fda.gov/~dms/aciydata.html), uma batata frita típica produzida em um restaurante de uma grande cadeia de fast food contém mais de 100-partes por bilhão (ppb) de acrilamida. A quantida- de média de acrilamida nessa batata frita típica é de 404 ppb e a ingestão diária média de acrilamida pelo consumo de batata frita é de

20 0,07 microgramas/quilograma de peso corporal/dia. Conseqüentemen- te, a batata frita representa 16% do total de ingestão alimentar de acrilamida. As quantidades médias de acrilamida numa batata frita assada em forno (oven-baked) e batata chips produzida por um processo comercial são de 698 ppb e 597 ppb, respectivamente. Assim, alimentos processados derivados de batata, incluindo batata frita, fritas assadas em forno e batata chips, representam 38% do total de ingestão alimen- tar de acrilamida.

De acordo com a presente invenção, o nível de acrilamida que está presente em uma batata frita, frita assada ou chip que é obtida de um tubérculo produzido por uma planta transgênica de uma variedade específica da presente invenção é menor que o nível de acrilamida em uma batata frita, frita assada ou chip obtida de uma planta não trans- gênica da mesma variedade por um fator maior do que 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 11 vezes, 12 vezes, 13 vezes, 14 vezes, 15 vezes, 16 vezes, 17 vezes, 18 vezes, 19 vezes, 20 vezes ou mais do que 20 vezes.

Em termos de partes por bilhão, uma batata frita produzida de um tubérculo da presente invenção pode ter entre 1-20 ppb, 20-40 ppb, 40-60 ppb, 60-80 ppb ou 80-100 ppb de acrilamida.

Em termos de partes por bilhão, uma frita assada em forno, uma batata chip ou batata dourada (hash hrown) produzida de um tubérculo da presente invenção pode ter entre 1-20 ppb, 20-40 ppb, 40-60 ppb, 60-80 ppb, 80-100 ppb, 100-120 ppb, 120-140 ppb, 140-160 ppb, 160- 180 ppb ou 180-200 ppb de acrilamida.

A presente invenção não está limitada a reduzir o nível de acri- lamida em fritas e chips produzidas de tubérculos. Outros alimentos podem ser manipulados de acordo com a presente invenção para reduzir os níveis de acrilamida. Os níveis de acrilamida em cereais matutinos podem ser reduzi- dos de cerca de 50-250 ppb para níveis abaixo de 40 ppb, e preferenci- almente para níveis abaixo de 20 ppb.

Os níveis de acrilamida em bolachas, como Dare Breton Thin Wheat Crackers e Wasa Original Crispbread Fiber Rye, podem ser reduzidos de cerca de 300-500 ppb para níveis abaixo 100 ppb, e preferencialmente para níveis abaixo de 50 ppb.

Os níveis de acrilamida em chocolate, como Ghirardelli Unswee-

tened Cocoa ou Hershey's Cocoaj podem ser reduzidos de cerca de 300-

900 ppb para níveis abaixo de 200 ppb e preferencialmente para níveis abaixo de 50 ppb.

Os níveis de acrilamida em biscoitos podem ser reduzidos de cerca de 50-200 ppb para níveis abaixo de 40 ppb e preferentemente para níveis abaixo de 20 ppb.

Os níveis de acrilamida em café moído podem ser reduzidos de cerca de 175-350 ppb para níveis abaixo de 60 ppb, e preferencialmente para níveis abaixo de 30 ppb.

Os níveis de acrilamida no pão integral podem ser reduzidos de cerca de 50-150 ppb para níveis abaixo de 30 ppb e, de preferência, para níveis abaixo de 15 ppb.

Deve-se entender que muitos fatores influenciam os níveis de a- crilamida no produto alimentício final. Esses fatores incluem o cultivo, a variedade, as condições de crescimento, as condições de armazena- mento da semente ou do tubérculo colhido e as variáveis de processa- mento, tais como a temperatura de aquecimento, o período de aqueci- mento, o tipo de óleo usado na fritura e a superfície exposta.

A aplicação dos métodos descritos na presente invenção reduzi- rão os níveis de acrilamida por pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, pelo

menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, 50%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou pelo menos cerca de 90%.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1: Diagrama de (A) pSIM1148, (B) pSIM1151 e (C) pSIM658. LB = terminação esquerda do T-DNA, P:Agp = promotor Agp da batata, 2a - cópia anti-senso de um fragmento do gene ast2, Ia= cópia anti-senso de um fragmento do gene astl, Ib= cópia senso de um .10 fragmento do gene astl, 2b= cópia senso de um fragmento do gene ast2, P:Gbss = promotor Gbss da batata, T:nos = terminador do gene nopali- na sintetase da Agrobactenum, P:nos = promotor do gene nopalina sintetase da Agrobacterium, RB = terminação direita do T-DNA, P:Ubi7 = promotor do gene de Ubiquitina-7 da batata.

Figure 2: Construção Russet Boise. PF= fragmento do promotor,

GF = fragmento do gene.

Descrição Detalhada das Implementações Desejáveis

A presente invenção proporciona seqüências polinucleotídicas e métodos para reduzir os níveis de acrilamida.

A presente invenção usa termos e frases que são bem conheci- dos daqueles que praticam a técnica. A menos que sejam definidos de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que normalmente entendido por um indivíduo com habilidade média na arte a qual esta invenção pertence. Em geral, a nomenclatura usada aqui e os procedimentos laboratoriais em cultivo de células, genética molecular e química e hibridização de ácidos nucléicos são aqueles bem conhecidos e comumente empregados na arte. As técnicas padrões são usadas para métodos de ácido nucléico recombinante, síntese de polinucleotídeo, cultivo microbiano, cultivo celular, cultivo de tecidos, transformação, transfecção, transdução, química analítica, química orgânica sintética, síntese química, análise química e formulação e distribuição farmacêutica. Em geral, as etapas de reações enzimáticas, purificação e/ou isolamento foram realizadas de acordo com as especificações do fabricante. As técnicas e procedi- mentos são geralmente realizados de acordo com a metodologia conven- cional (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd. edition, editado por Sambrook & Russel Cold Spring Harbor Laboratoiy Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).

Acrilamida: A acrilamida como monômero é considerada tóxica,

afetando diretamente o sistema nervoso. Pode ser considerada um

carcinógeno. A acrilamida é prontamente absorvida de soluções aquo-

sas pela pele sem proteção. A fórmula molecular é C3H5NO; estrutural: CH2=CH-CO-NH2.

Agrobacterium ou transformação bacteriana: como é bem co- nhecido na área, as Agrobacteria que são usadas para transformar células vegetais são derivados desarmados e virulentos de, normalmen- te, Agrobacterium tumefaciens ou Agrobactenum rhizogenes. Ao infecta- rem plantas, explantes, células ou protoplastos, a Agrobacterium transfere um segmeno de DNA de um vetor plasmidial para o núcleo da célula vegetal. O vetor tipicamente contém o polinucleotídeo desejado, que está localizado entre as terminações de um T-DNA ou P-DNA. Entretanto, qualquer bactéria capaz de transformar uma célula vegetal pode ser usada, como Rhizobium trifolü, Rhizobium leguminosarum,

Phyllobactenum myrsinacearum,} SinoRhizobium meliloti e MesoRhizobi- um Ioti

Angiosperma: plantas vasculares que possuem sementes acon- dicionadas em um ovário. As angiospermas são plantas com sementes que produzem flores, as quais produzem frutos. As angiospermas são divididas em plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

Biossíntese de asparagína: reações enzimaticamente catalisa- das que ocorrem em uma planta para produzir asparagína.

Metabolismo de asparagína: reações enzimaticamente catalisa- das que ocorrem em uma planta para converter asparagína em outros compostos.

Asparaginase: Asparaginase, a qual é encontrada em várias plantas, animais e células bacterianas, é uma enzima envolvida no metabolismo de asparagína. Ela catalisa a desaminação da asparagína para produzir ácido aspártico e um íon de amônio, resultando numa diminuição de asparagína em circulação livre.

Asparagína sintetase: Essa enzima está envolvida na biossínte- se da asparagína e catalisa a síntese de asparagína a partir do asparta- to.

Resistência a antibióticos: a habilidade de uma célula de so- breviver na presença de um antibiótico. A resistência a antibióticos, como empregada aqui, resulta da expressão de gene de resistência a antibióticos na célula hospedeira. Uma célula pode ter resistência a qualquer antibiótico. Exemplos de antibióticos comumente usados incluem a canamicina e a hidromicina.

Planta dicotiledônea (dicot): uma planta que floresce cujos embriões têm duas metades de uma semente ou cotilédones, vasos foliares que se ramificam e partes florais em múltiplos de quatro ou cinco. Exemplos de dicots incluem, mas sem limitação, batata, beterra- ba, brócolis, mandioca, batata doce, pimenta, poinsétia, feijão, soja e abacate.

Endógeno: ácido nucléico, gene, polinucleotídeo, molécula de DNA, RNA, mRNA ou cDNA que é isolado do genoma de uma planta ou espécie de planta que será transformada ou que é isolado de uma planta ou espécie que é compatível sexualmente ou interfértil com a espécie vegetal a ser transformada, é "nativa" da, Le., indígena a, da espécie vegetal.

Cassete de expressão: um polinucleotídeo consistindo em 5' pa- ra 3', (a) um primeiro promotor, (b) uma seqüência contendo (i) pelo menos uma cópia de um gene ou fragmento de gene, ou (ii) pelo menos uma cópia de um promotor de um gene, e (c) um terminador ou um segundo promotor que está posicionado na orientação oposta do primei- ro promotor.

Exógeno: "exógeno," quando se está referindo a um ácido nu- cléico, significa que aquele ácido nucléico é derivado de organismos não vegetais ou derivado de uma planta que não é da mesma espécie da planta a ser transformada ou não é derivado de uma planta que não é interfértil com a planta a ser transformada, não pertence a espécie da planta alvo. De acordo com a presente invenção, DNA ou RNA exógeno representa ácidos nucléicos que ocorrem naturalmente na constituição genética de fungos, bactérias, vírus, mamíferos, peixes ou aves, mas não ocorrem naturalmente na planta a ser transformada. Assim, um ácido nucléico exógeno é um que codifica, por exemplo, um polipeptídeo que não é naturalmente produzido pela planta transformada. Um ácido nucléico exógeno não tem que codificar um produto protéico.

Gene: Um gene é um segmento de uma molécula de DNA que contém toda a informação necessária para a síntese de um produto, cadeia polipeptídica ou molécula de RNA que inclui tanto seqüências codificantes quanto não codificantes. Um gene pode representar tam- bém múltiplas seqüências, sendo que cada uma pode ser expressa independentemente, e pode codificar proteínas levemente diferentes que apresentam a mesma atividade funcional. Por exemplo, os genes da asparagina sintetase 1 e 2 podem, em conjunto ser referidos como um gene.

Elemento genético: um «elemento genético" é qualquer seqüên- cia nucleotídica discreta, como, mas não limitada a, um promotor, gene, terminador, intron, acentuador, região não traduzida 5', região não traduzida 3' ou sítio de reconhecimento de recombinase.

Modificação genética: introdução estável de DNA no genoma de certos organismos pela aplicação de métodos de biologia molecular e celular.

Gimnosperma: como empregado aqui, esse termo se refere a plantas com sementes que produzem sementes sem ovários. Exemplos de gimnospermas incluem coníferas, cicas, nogueiras do Japão e Ephedras.

Introdução: como empregado aqui, esse termo se refere à inser- ção de uma seqüência de ácido nucléico em uma célula por métodos que incluem infecção, transfecção, transformação e transdução.

Plantas monocotiledôneas (monocot): uma planta que floresce e que tem embriões com um cotilédone ou folha na semente, vasos foliares paralelos e partes florais em múltiplos de três. Exemplos de monocots incluem milho, arroz, aveia, trigo, cevada e sorgo.

Nativo: ácido nucléico, gene, polinucleotídeo, molécula de DNA, RNA, mRNA ou cDNA que é isolado do genoma de uma planta ou espécie de planta que será transformada ou que é isolado de uma planta ou espécie que é compatível sexualmente ou interfértil com a espécie vegetal a ser transformada, é "nativa" da, i.e., indígena a, da espécie vegetal.

DNA nativo: ácido nucléico, gene, polinucleotídeo, molécula de DNA, RNA, mRNA ou cDNA que é isolado do genoma de uma planta ou espécie de planta que será transformada ou que é isolado de uma planta ou espécie que é compatível sexualmente ou interfértil com a espécie vegetal a ser transformada, é "nativa" da, Le., indígena a, da espécie vegetal. Em outras palavras, um elemento genético nativo representa todo material genético que está acessível àqueles que culti- vam as plantas para a melhoria destas por meio de cruzamento vegetal clássico. Qualquer variante de ácido nucléico nativo também é conside- rada "nativa" de acordo com a presente invenção. Por exemplo, um DNA nativo pode conter uma mutação pontual, já que mutações pontuais ocorrem naturalmente. É também possível ligar dois DNAs nativos diferentes por meio de sítios de restrição, porque esses sítios existem por quase todo os genomas vegetais.

Construção de ácido nucléico nativo: um polinucleotídeo con- tendo pelo menos um DNA nativo.

Ligado operacionalmente: combinar duas ou mais moléculas de maneira que, em conjunto, elas funcionem de maneira apropriada em uma célula vegetal. Por exemplo, um promotor é ligado operacio- nalmente a um gene estrutural quando o promotor controla a transcri- ção do gene estrutural.

Sobreexpressão: expressão de um gene a níveis que são maiores do que aqueles que existem em plantas não transgênicas.

P-DNA: a seqüência de terminação do DNA de transferência de origem vegetal ("P-DNA") da presente invenção não é idêntica em se- qüência de nucleotídeo à seqüência de terminação de DNA de transfe- rência de origem bacteriana, mas ela funciona para essencialmente a mesma função. Ou seja, o P-DNA pode ser usado para transferir e integrar um polinucleotídeo no outro. UM P-DNA pode ser inserido em um plasmídeo indutor de tumores, como o plasmídeo Ti de Agrobacteri- um, no lugar de um T-DNA convencional, e mantido em uma cepa bacteriana, assim como plasmídeos convencionais de transformação. O

P-DNA pode ser manipulado de maneira a conter o polinucleotídeo desejado, o qual destina-se à integração no genoma vegetal via trans- formação vegetal mediada por bactéria. Ver Rommens e colaboradores em W02003/069980, US-2003-0221213, US-2004-0107455 e W02005/004585, as quais estão aqui incorporadas por referência.

Fenótipo: fenótipo é um traço ou característica distintiva de uma planta, a qual pode ser alterada de acordo com a presente inven- ção pela integração de um ou mais "polinucleotídeos desejados" e/ou marcadores selecionáveis/triáveis no genoma de pelo menos uma célula vegetal de uma planta transformada. O(s) "polinucleotídeo(s) deseja- do(s)" e/ou marcadores podem efetuar uma mudança no fenótipo de uma planta transformada ao modificar qualquer uma de uma série de características ou propriedades genéticas, moleculares, bioquímicas, fisiológicas, morfológicas e agronômicas da célula vegetal ou planta transformada. Assim, a expressão de um ou mais polinucleotídeos desejados integrados de maneira estável em um genoma vegetal que

produz o fenótipo de concentrações reduzidas de acrilamida nos tecidos vegetais.

Tecido vegetal: uma "planta" é qualquer uma de uma série de organismos multicelulares, eucarióticos, fotossintéticos do reino Plantae que produzem embriões, contêm cloroplastos e possuem paredes celulares de celulose. Um aparte da planta, isto é, um "tecido vegetal" pode ser tratado de acordo com os métodos da presente invenção para produzir uma planta transgênica. Vários tecidos vegetais apropriados podem ser transformados de acordo com a presente invenção e incluem, mas sem limitação, embriões somáticos, pólen, folhas, caules, calo, estolões, microtubérculos e brotos. Assim, a presente invenção abrange a transformação de plantas angiospermas e gimnospermas como trigo, milho, arroz, cevada, aveia, beterraba, batata, tomate, alfafa, mandioca, batata doce e soja. De acordo com a presente invenção, "tecido vegetal" também abrange células vegetais. Células vegetais incluem culturas de suspensão, calo, embriões, regiões meristemáticas, tecido do calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, sementes e microsporos. Os tecidos vegetais podem estar em vários estágios de maturação e podem ser cultivados em cultura líquida ou sólida, ou em solo ou meios apropriados em vasos, estufas ou no campo. Tecido vegetal também se refere a qualquer clone dessa planta, semente, prole, propágulo, quer seja gerado sexuadamente ou assexuadamente, e descendentes destes, como enxertos ou sementes. De particular inte- resse são a batata, o milho e o trigo.

Transformação vegetal e cultura de células: refere-se ampla- mente ao processo pelo qual células vegetais são modificadas genetica- mente e transferidas para um meio de cultura vegetal apropriado para manutenção, crescimento adicional e/ou desenvolvimento adicional. Esses métodos são bem conhecidos para aqueles com habilidade na arte.

Processamento: o processo de produzir um alimento a partir de (1) uma semente de, por exemplo, trigo, milho, café ou cacau, (2) um tubérculo de, por exemplo, batata, ou (3) da raiz de, por exemplo, batata doce e inhame, que consiste de aquecimento a pelo menos 120°C. Exemplos de alimentos processados incluem pão, cereal matutino, tortas, bolos, torrada, biscoitos, cookies, pizza, pretzels, tortilha, batata frita, fritas assadas, batata chips, batata dourada e café e cacau torra- dos.

Prole: uma "prole" da presente invenção, como a prole de uma planta transgênica, é uma que nasceu, ou foi gerada, ou derivada de uma planta ou planta transgênica. Assim, uma planta da "prole", isto é, uma planta da geração "Fl" é um filho ou descendente da planta transgênica produzida pelos métodos inventivos. Uma prole de uma planta transgênica pode conter em pelo menos um, alguns ou todos os genomas de suas células, o polinucleotídeo desejado que foi integrado na célula da planta transgênica mãe pelos métodos descritos aqui. Assim, o polinucleotídeo desejado é "transmitido" ou "herdado" pela planta da prole. O polinucleotídeo desejado que é herdado pela planta da prole pode estar localizado dentro de uma construção de T-DNA ou P-DNA, a qual também é herdada pela planta da prole da sua mãe. O termo "prole", como usado aqui, também pode se referir aos filhos ou descendentes de um grupo de plantas.

Promotor: por promotor pretende-se designar um ácido nucléi- co, de preferência DNA que se liga à RNA polimerase e/ou a outros elementos reguladores de transcrição. Como com qualquer promotor, os promotores da invenção atual facilitarão ou controlarão a transcrição de DNA ou RNA para gerar uma molécula de mRNA a partir de uma molécula de ácido nucléico que está ligada operacionalmente ao promo- tor. Como explicado anteriormente, o RNA gerado pode codificar uma proteína ou polipeptídeo ou pode codificar uma molécula de RNA de interferência ou anti-senso.

Um promotor é uma seqüência de ácido nucléico que permite que um gene com o qual esteja associado seja transcrito. Em procario- tos, um promotor consiste normalmente de duas pequenas seqüências nas posições -10 e -35 acima do gene, ou seja, antes do gene na direção da transcrição. A seqüência em -10 é chamada de Pribnow box e geralmente consiste de seis nucleotídeos TATAAT. O Pribnow box é essencial para começar a transcrição em procariotos. A outra seqüência em -35 consiste em seis nucleotídeos TTGACA, cuja presença facilita a taxa de transcrição.

Os promotores eucarióticos são mais diversos e, por isso, mais difíceis de caracterizar, mesmo assim há certas características funda- mentais. Por exemplo, os promotores eucarióticos normalmente se encontram acima do gene ao qual estão mais imediatamente associa- dos. Os promotores podem ter elementos reguladores localizados a várias quilobases de distância do sítio de início da transcrição, embora certas conformações estruturais terciárias do complexo transcricional possam fazer com que o DNA dobre, o que faz com que os elementos reguladores se aproximem do sítio real de transcrição. Muitos promoto- res eucarióticos contêm uma seqüência "TATA box», que normalmente é identificada pela seqüência nucleotídica TATAAA. Esse elemento se liga à proteína de ligação TATA, a qual auxilia na formação do complexo transcricional da RNA polimerase. A TATA box normalmente reside nem um raio de 50 bases do sítio de início da transcrição.

Os promotores eucarióticos também são caracterizados pela pre- sença de certas seqüências reguladoras que se ligam a fatores de transcrição envolvidos na formação do complexo transcricional. Um exemplo é a E-box identificada pela seqüência CACGTG, a qual se liga a fatores de transcrição na família hélice-básica-hélice-laço. Também há regiões nas quais o conteúdo de nucleotídeo GC é alto.

Logo, de acordo com a presente invenção, uma seqüência parci- al, ou um "fragmento" específico de promotor de um promotor, por exemplo, do gene da asparagina sintetase, que pode ser usado na produção de um polinucleotídeo pretendido da presente invenção, pode ou não conter um ou mais desses elementos ou nenhum desses elemen- tos. Numa modalidade, um fragmento de seqüência de um promotor da presente invenção não é funcional e não contém uma TATA box.

Outra característica da construção da presente invenção é que ela promove a transcrição convergente de uma ou mais cópias do polinucleotídeo que não está, ou não estão, ligada operacionalmente a um terminador, por meio de dois promotores opostos. Devido à ausên- cia de um sinal de terminação, o comprimento do pool de moléculas de RNA que é transcrito do primeiro e segundo promotores pode ser de vários tamanhos.

Às vezes, por exemplo, a maquinaria transcricional pode conti- nuar a transcrever além do último nucleotídeo que significa o "fim" da seqüência do polinucleotídeo desejado. Por isso, neste arranjo em particular, a terminação da transcrição pode ocorrer pela ação fraca e não intencional de seqüências mais baixas que, por exemplo, promovem a formação de hairpin, ou pela ação de terminadores transcricionais não intencionais localizados no DNA vegetal que flanqueia o sítio de integra- ção do DNA de transferência.

O polinucleotídeo desejado pode estar ligado ao promotor em duas diferentes orientações. Numa orientação, por exemplo, "senso", pelo menos a parte 5' do transcrito de RNA resultante compartilhará identidade de seqüência com pelo menos uma parte de pelo menos um transcrito-alvo. Na outra orientação, designada "anti-senso", pelo menos a parte 5' do transcrito esperado será idêntica ou homóloga a pelo menos parte do complemento inverso de pelo menos um transcrito- alvo.

Um promotor vegetal é um promotor capaz de iniciar a transcri- ção em células vegetais, mesmo que a sua origem não seja em células vegetais. Exemplos de promotores vegetais incluem, mas não estão limitados àqueles obtidos de plantas, vírus de plantas e bactérias, como Agrobacterium ou Rhizobium, as quais contêm genes expressos em células vegetais. Exemplos de promotores sob controle de desenvolvi- mento incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos, como no xilema, nas folhas, nas raízes e nas semen- tes. Esses promotores são chamados de promotores preferenciais de tecido. Os promotores que iniciam a transcrição apenas em certos tecidos são chamados de promotores tecido-específicos. Um promotor específico de um tipo de células direciona primariamente a expressão em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes e folhas. Um promotor induzível ou reprimível é um promotor que está sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas ou a presença de luz. Os promotores tecido-específicos, preferenciais de tecido, específicos de tipo celular e induzíveis constituem a classe dos promotores não-constitutivos. Um promotor constitutivo é um promotor que está ativo sob a maioria das condições ambientais e na maioria das plantas.

Polinucleotídeo é uma seqüência nucleotídica que consiste de uma seqüência codificante de um gene ou um fragmento desta (conten- do pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos, sendo desejável pelo menos 30 nucleotídeos consecutivos, e sendo mais desejável ainda pelo menos 50 nucleotídeos consecutivos), um promotor, um intron, uma região acentuadora, um sítio de poliadenilação, um sítio de iniciação de transcrição, regiões 5' ou 3' não traduzíveis, um gene repórter, um marcador selecionável ou similar. O polinucleotídeo pode conter DNA ou RNA de fita simples ou fita dupla. O polinucleotídeo pode conter bases modificadas ou um arcabouço modificado. O polinucleotídeo pode ser genômico, um transcrito de RNA (como mRNA) ou uma seqüência nucleotídica processada (como um cDNA). O polinucleotídeo pode conter uma seqüência nas orientações senso ou anti-senso.

Um polinucleotídeo isolado é uma seqüência polinucleotídica que não está no seu estado nativo, por exemplo, o polinucleotídeo é composto de uma seqüência nucleotídica não encontrada na natureza, ou o polinucleotídeo está separada de seqüências nucleotídicas com as quais está normalmente próximo, ou está próximo a seqüências nucleo- tídicas com as quais normalmente não está perto.

Semente: uma "semente" pode ser considerada um óvulo vegetal maduro que contém um embrião e uma parte propagativa de uma planta, como um tubérculo ou um esporo. Uma semente pode ser incubada antes da transformação mediada por Agrobacterium, no escuro, por exemplo, para facilitar a germinação. Uma semente pode também ser esterilizada antes da incubação, como com um rápido tratamento com água sanitária. A plântula resultante pode então ser exposta à cepa desejada de Agrobacterium.

Marcador selecionável/triável: um gene que, se expresso em plantas ou tecidos vegetais, torna possível distingui-los de outras plantas ou tecidos vegetais que não expressam esse gene. Os procedi- mentos de triagem podem requerer ensaios para a expressão das proteínas codificadas pelo gene marcador triável. Exemplos de marca- dores selecionáveis incluem o gene da neomicina fosfotransferase (NptII) codificando resistência para a canamicina e a geneticina, o gene da higromicina fosfotransferase (Hptll) codificando resistência para a higromicina e outros genes similares conhecidos na técnica.

Características sensoriais: painéis de indivíduos treinados pro- fissionalmente podem avaliar produtos alimentícios em relação a suas características sensoriais, como aparência, sabor, aroma e textura. Uma avaliação de batatas fritas que foram obtidas de tubérculos cujos níveis de expressão gênica de Rl e fosforilase-L foram regulados negativamen- te é descrita no Exemplo 4. Batatas fritas de tubérculos descritos no Exemplo 5 também apresentarão características sensoriais melhoradas. Assim, a presente invenção contempla o melhoramento das característi- cas sensoriais de um produto vegetal obtida de uma planta que foi modificada de acordo com a presente invenção para a manipular as suas vias de biossíntese e metabolismo de asparagina.

Identidade de seqüência: como usada aqui, "identidade de se- qüência" ou "identidade" no contexto de duas seqüências de ácido nucléico ou polipeptídeos se refere aos resíduos nas suas seqüências que são os mesmos quando alinhados para correspondência máxima em uma região específica. Quando a percentagem de identidade de seqüência é usada em referência a proteínas, se reconhece que a posição dos resíduos que não são idênticas costumam diferir devido a substituições conservadas de aminoácido, nas quais os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicida- de) e, por isso, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Nos locais onde as seqüências diferem em substituições conservadas, a percentagem da identidade de seqüência pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservada da substituição. Diz-se que as seqüências que divergem devido a essas substituições conservadas tem "similaridade de seqüência" ou "similaridade". Os meios para fazer esse ajuste são bem conhecidos daqueles com habilidade na arte. Normal- mente, isso envolve contar uma substituição conservada com um erro parcial em vez de total, aumentando assim a percentagem de identidade de seqüência. Assim, por exemplo, se um aminoácido idêntico receber um valor e uma substituição não conservada receber um valor zero, uma substituição conservada receberia um valor entre zero e 1. A contagem de substituições conservadas é calculada, por exemplo, de acordo com o algoritmo de Meyers e Miller, Computer Applic. Biol. ScL, 4: 11 17 (1988), por exemplo, como implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, EUA).

Como empregada aqui, percentagem da identidade de seqüência significa o valor determinado pela comparação de duas seqüências alinhadas de maneira ótima sobre uma janela de comparação, sendo que a porção da seqüência polinucleotídica na janela de comparação pode conter adições ou deleções (isto é, falhas) quando comparada com a seqüência referência (a qual não contém adições ou deleções), para o alinhamento ótimo das duas seqüências. A percentagem é calculada determinando-se o número de posições nas quais a base de ácido nucléico ou. resíduo de aminoácido idênticos ocorre em ambas as seqüências para produzir um número de posições corretas, dividindo-se o número de posições corretas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para chegar-se à percentagem de identidade de seqüência.

A "identidade de seqüência" possui um significado reconhecido na arte e pode ser calculada usando técnicas publicadas. Ver Computa- tional Molecular Biologyi Lesk, ed. (Oxford University Press, 1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projectsy Smith, ed. (Academic Press, 1993), Computer Analysis of Sequence Data, Part Iy Griffm & Griffm, eds., (Humana Press, 1994), Sequenee Analysis in Molecular Biology, Von Heinje ed., Academic Press (1987), Sequenee Analysis Primer, Gribskov & Devereux, eds. (Macmillan Stockton Press, 1991) e Carillo & Lipton, SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988). Os métodos comumente empregados para determinar identidade ou similaridade entre duas seqüências incluem, mas não estão limitados àquelas mostradas em Guide To Huge Computers1 Bishop, ed., (Academic Press, 1994) e Carillo & Lipton, supra. Os métodos para determinar identidade de similaridade estão codificados em programas de computador. Os métodos computacionais preferidos para determinar identidade e similaridade entre duas seqüências incluem, mas sem limitação, o pacote de programas GCG (Devereux e colaboradores, Nueleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul e colabo- radores, J, Mol Biol 215: 403 (1990)), e FASTDB (Brutlag e colaborado- res, Comp. App. Biosci. 6: 237 (1990)).

Silenciamento: a transcrição unidirecional e não interrompida de genes ou fragmentos de genes do promotor ao terminador pode ativar o silenciamento pós-transcricional dos genes alvo. Os cassetes de expressão iniciais para o silenciamento pós-transcricional de genes em plantas consistiam de um único fragmento de gene posicionado em uma orientação anti-senso (McCormick e colaboradores, patente norte- americana 6617496; Shewmaker e colaboradores, Patente US 5.107.065) ou senso (van der Krol e colaboradores, Plant Cell 2:291- 299, 1990) entre seqüências reguladoras de iniciação e terminação de transcrito. Em Arabidopsis, o reconhecimento dos transcritos resultan- tes por polimerase de RNA dependente de RNA leva a produção de RNA de fita dupla (ds). A clivagem desse dsRNA por proteínas tipo Dicer (Del), como Dc 14, gera pequenos RNAs de interferência (siRNAs) de 21 nucleotídeos (nt). Esses siRNAs complexam com proteínas, incluindo membros da família Argonaute (Ago) para produzir complexos silencia- dores induzidos por RNA (RISCs). Os RISCs atacam então RNAs homó- logos para clivagem endonucleolítica.

Construções mais eficazes de silenciamento contêm tanto o componente senso quanto o anti-senso, produzindo moléculas de RNA que se dobram em estruturas de hairpin (Waterhouse e colaboradores, ProcNatlAcad Sci USA 95: 13959-13964, 1998). Supôs-se que os altos níveis de dsRNA produzidos pela expressão de repetições invertidas de genes trans promovessem a atividade de múltiplos Deis. A análise de knockouts combinatórios de Del em Arabidopsis deram suporte a essa idéia e também identificaram Dc 14 como sendo uma das proteínas envolvidas na clivagem do RNA.

Um componente das construções convencionais de silenciamen- to gênico baseadas em RNA senso, anti-senso e fita dupla (ds) é o terminador transcricional. WO 2006/036739 mostra que esse elemento regulador se torna obsoleto quando fragmentos de gene são dispostos entre dois promotores funcionalmente ativos e orientados em direções opostas. A transcrição convergente resultante ativa um silenciamento gênico que é pelo menos tão eficaz quanto a transcrição unidirecional "promotor ao terminador". Além de RNAs curtos de vários tamanhos e não poliadenilados, o cassete sem terminador produziu transcritos mais longos e raros que alcançam o promotor no flanco. A substituição de fragmentos gênicos por seqüências derivadas de promotores aumentou ainda amais a extensão do silenciamento gênico.

Numa modalidade desejável da presente invenção, o polinucleo- tídeo desejado contém uma seqüência parcial de um promotor do gene alvo ou uma seqüência parcial que compartilhe identidade com uma porção do promotor do gene alvo. Logo, o polinucleotídeo pretendido da presente invenção contém um fragmento específico de um promotor de interesse do gene alvo.

O polinucleotídeo desejado pode estar ligado operacionalmente a um ou mais promotores funcionais. Várias construções contempladas pela presente invenção incluem, mas não estão limitadas à (1) uma construção na qual o polinucleotídeo desejado contém um ou mais fragmentos de seqüência do promotor que está ligado operacionalmente nas duas bordas a promotores 1drivers' funcionais. Esses dois promoto- res funcionais estão dispostos em uma orientação convergente, de maneira que cada fita do polinucleotídeo desejado seja transcrita; (2) uma construção na qual o polinucleotídeo desejado está ligado opera- cionalmente a um promotor funcional na sua terminação 5' ou 3', e o polinucleotídeo desejado também está ligado operacionalmente, na sua terminação que não está ligada ao promotor, a uma seqüência termina- dora funcional; (3) uma construção na qual o polinucleotídeo desejado está ligado operacionalmente a um promotor funcional na sua termina- ção 5' ou 3', mas na qual o polinucleotídeo desejado não está ligado operacionalmente a um terminador; ou (4) um cassete no qual o polinu- cleotídeo desejado contém um ou mais fragmentos de seqüência do promotor, mas não está ligado operacionalmente a qualquer promotor ou terminador.

Logo, uma construção da presente invenção pode conter dois ou mais promotores 'driver1 que flanqueiam um ou mais polinucleotídeos desejados ou que flanqueiam cópias do polinucleotídeo desejado, de maneira que ambas as fitas do polinucleotídeo desejado sejam transcri- tas. Ou seja, um promotor pode estar orientado para iniciar a transcri- ção a partir da terminação 5' de um polinucleotídeo desejado, enquanto um segundo promotor pode estar orientado operacionalmente para iniciar a transcrição a partir da terminação 3' do mesmo polinucleotídeo desejado. Os promotores orientados em direções opostas podem ílan- quear múltiplas cópias do polinucleotídeo desejado. Logo, o número de cópias pode variar de modo que uma construção contenha 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 ou mais de 100 cópias, ou qualquer número inteiro entre estes, do polinucleotídeo desejado, o qual pode ser ílanqueado pelos promotores 'driver1 que estão orientados para induzir transcrição convergente.

Se nenhum dos cassetes contiver uma seqüência terminadora, então essa construção, por virtude do arranjo de transcrição convergen- te, pode produzir transcritos de RNA que têm comprimentos diferentes.

Nesse caso, portanto, podem existir subpopulações de transcri- tos de RNA parcialmente ou totalmente transcritos que contêm seqüên- cias parciais ou completas do polinucleotídeo desejado transcrito do cassete respectivo. Alternativamente, na ausência de um terminador funcional, a maquinaria de transcrição pode ultrapassar o fim do polinucleotídeo desejado para produzir um transcrito que é mais longo que o polinucleotídeo desejado.

Numa construção que contém duas cópias do polinucleotídeo desejado, portanto, em que um dos polinucleotídeos pode ou não estar orientado na direção complementar inversa ao outro, e onde os polinu- cleotídeos estão ligados operacionalmente a promotores para induzir uma transcrição convergente, e não há um terminador funcional na construção, a maquinaria de transcrição que inicia a partir de um polinucleotídeo desejado pode seguir transcrevendo a outra cópia do polinucleotídeo desejado e vice-versa. As múltiplas cópias do polinucleo- tídeo desejado podem estar orientadas em várias permutações: no caso em que as duas cópias do polinucleotídeo desejado estão presentes na construção, as cópias podem, por exemplo, estar orientadas na mesma direção, em uma orientação reversa em relação a outra, ou na orienta- ção complementar inversa a outra, por exemplo.

No arranjo em que um dos polinucleotídeos desejados está orien- tado na orientação complementar inversa ao outro polinucleotídeo, um transcrito de RNA pode ser produzido que contenha não apenas a seqüência "senso" do primeiro polinucleotídeo, mas também a seqüên- cia "anti-senso" do segundo polinucleotídeo. Se o primeiro e segundo polinucleotídeos contêm a mesma ou a substancialmente mesmo seqüência de DNAj então, um único transcrito de RNA pode conter duas regiões que são complementares entre si e que podem, portanto, se ligar. Logo, esse único transcrito de RNA que é assim transcrito pode formar uma estrutura dupla hairpin parcial ou completa.

Por outro lado, se duas cópias desse transcrito longo forem pro- duzidas, uma de cada promotor, então existirão duas moléculas de RNA, cada uma das quais compartilharia regiões de complementaridade de seqüência com a outra. Logo, a região "senso" do primeiro transcrito de RNA pode se ligar com a região "anti-senso" do segundo transcrito de RNA e vice versa. Nesse arranjo, portanto, outra dupla de RNA pode ser formada, a qual consistirá de dois transcritos de RNA separados, ao contrário da dupla hairpin que forma de um único transcrito de RNA autocomplementar.

Alternativamente, duas cópias do polinucleotídeo desejado po- dem estar orientadas na mesma direção, de maneira que, no caso de transcrição read-through, o transcrito de RNA longo que é produzido a partir de um promotor possa conter, por exemplo, a seqüência senso da primeira cópia do polinucleotídeo desejado e também a seqüência senso da segundo cópia do polinucleotídeo desejado. O transcrito de RNA que é produzido a partir do outro promotor orientado convergentemente, portanto, pode conter a seqüência anti-senso da segunda cópia do polinucleotídeo desejado e também a seqüência anti-senso da primeira cópia do polinucleotídeo desejado. Dessa maneira, é provável que nenhum dos transcritos de RNA contivesse regiões de complementari- dade exata e, portanto, nenhuma dos transcritos de RNA se dobraria sobre si mesmo para produzir uma estrutura hairpin. Por outro lado, os dois transcritos individuais de RNA poderiam hibridizar e se ligar um ao outro para formar uma dupla de RNA.

Logo, Num aspecto, a presente invenção fornece uma construção que não tem um terminador ou que não tem um terminador que é precedido por uma região de DNA codificando uma ribozima autospli- cing, mas que contém um primeiro promotor que está ligado operacio- nalmente ao polinucleotídeo desejado.

Tecido: qualquer parte de uma planta que é usada para produ- zir um alimento. Um tecido pode ser um tubérculo de batata, uma raiz de batata doce ou uma semente de um milho. Terminadores transcricíonais: As construções de expressão de DNA da presente invenção normalmente têm uma região de terminação transcricional na borda oposta à região reguladora de iniciação de transcrição. A região de terminação transcricional pode ser selecionada para a estabilidade do mRNA de maneira a melhorar a expressão e/ou para a adição de caudas de poliadenilação ao produto da transcrição do gene. A tradução de um polipeptídeo nascente sofre terminação quando um dos três códons de terminação de cadeia entra no sítio A do ribossomo. Os códons de terminação de tradução são UAA, UAG, and UGA.

Na presente invenção, os terminadores de transcrição são deri- vados a partir de um gene ou, preferivelmente, de uma seqüência que não represente um gene, mas sim DNA intergênico. Por exemplo, a seqüência terminadora do gene da ubiquitina de batata pode ser usada e é mostrada na SEQ ID NO: 5.

DNA de transferência (T-DNA): um DNA de transferência é um segmento de DNA demarcado por terminações de T-DNA ou de P-DNA para criar um T-DNA ou P-DNA, respectivamente. UM T-DNA é um elemento genético que é bem conhecido como um elemento capaz de integrar uma seqüência nucleotídica contida entre as suas terminações em outro genoma. Nesse caso, um T-DNA é flanqueado, tipicamente, por duas seqüências "terminais". Um polinucleotídeo desejado da presente invenção e uma marcador selecionável podem ser dispostos entre a seqüência terminal esquerda e a seqüência terminal direita do T-DNA. O polinucleotídeo desejado e o marcador selecionável contidos no T-DNA podem estar ligados operacionalmente a uma variedade de ácidos nucléicos específicos de plantas (isto é, nativos) ou exógenos), como elementos reguladores promotores ou terminadores que facilitam sua expressão, isto é, a transcrição e/ou tradução da seqüência de DNA codificada pelo polinucleotídeo desejado ou marcador selecionável.

Transformação de células vegetais: um processo pelo qual um ácido nucléico é inserido de maneira estável no genoma de uma célula vegetal. A transformação pode ocorrer sob condições naturais ou artificiais usando vários métodos bem conhecidos na arte. A transfor- mação pode se valer de qualquer método conhecido para a inserção de seqüências de ácido nucléicos em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, incluindo protocolos de transformação mediados por Agrobacterium, como 'transformação refinada' ou 'procriação precisa', infecção viral, sondas (whiskers), eletroporação. microinjeção, trata- mento com polietileno glicol, choque térmico, lipofecção e bombardea- mento de partículas.

Planta transgênica: uma planta transgênica da presente inven- ção é uma que contém pelo menos um genoma celular em que um ácido nucléico exógeno foi integrado de maneira estável. De acordo com a presente invenção, uma planta transgênica é uma planta que contém apenas uma célula ou genoma celular modificados geneticamente, ou é uma planta que contém algumas células modificadas geneticamente, ou é uma planta na qual todas as células são geneticamente modificadas. Uma planta transgênica da presente invenção pode ser uma que contém a expressão do polinucleotídeo desejado, isto é, o ácido nucléico exóge- no, em certas partes da planta. Assim, uma planta transgênica pode conter apenas células modificadas geneticamente em certas partes de sua estrutura.

Variante: uma "variante", como usada aqui, significa uma se- qüência de nucleotídeos ou aminoácidos que diverge da seqüência de nucleotídeos ou aminoácidos padrão ou dada de um gene ou proteína. Os termos "isoforma", "isotipo" e "análogo" também se referem a formas "variantes" de uma seqüência de nucleotídeos ou de aminoácidos. Uma seqüência de aminoácido que é alterada pela adição, remoção ou substituição de um ou mais aminoácidos, ou pela mudança da seqüên- cia de nucleotídeos, pode ser considerada uma seqüência "variante". A variante pode ter mudanças "conservadas", nas quais o aminoácido substituinte tem propriedades estruturais e químicas similares, for exemplo, substituição de leucina por isoleucina. Uma variante pode ter mudanças "não conservadas", por exemplo, substituição de glicina por triptofano. Pequenas variações análogas também podem incluir dele- ções, inserções, ou ambas, de aminoácidos. Diretrizes a respeito de quais resíduos de aminoácidos podem ser substituídos, inseridos ou deletados podem ser obtidas usando programas de computador bem conhecidos na arte, como o software Vector NTI Suite (InforMax, MD). "Variante" também pode se referir a um gene "shuffleãcomo aqueles descritos em pacientes alocados a Maxygen.

Deve ficar entendido que a presente invenção não está limitada à metodologia, protocolos, vetores e reagentes etc. descritos aqui, já que esses podem variar. Deve ser entendido também que a terminologia usada aqui é usada com o propósito apenas de descrever implementa- ções específicas e não deve ser entendido como uma limitação à abran- gência da presente invenção. Deve-se perceber que, como empregado aqui e nas reivindicações, as formas singulares de "um", "uma", "o" e "a" incluem referências plurais, a menos que o contexto afirme clara- mente outro sentido. Assim, por exemplo, a referência a "um gene" é uma referência a um ou mais genes e inclui equivalentes destes conhe- cidos daqueles com habilidade na arte e assim por diante. De fato, alguém com conhecimento na técnica pode usar os métodos descritos aqui para expressar qualquer gene nativo (conhecido atualmente ou posteriormente) em sistemas da planta hospedeira.

Seqüências de Polinucleotídeos Zlf

A presente invenção está relacionada a uma molécula nucléica isolada que consiste de um polinucleotídeo contendo uma seqüência selecionada de um grupo consistindo de qualquer uma das seqüências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25. A invenção também fornece fragmentos funcionais de seqüências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25. A invenção fornece ainda ácidos nucléicos complementares, ou fragmentos destes, a qualquer uma das seqüências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25, bem como um ácido nucléico contendo pelo menos 15 bases contíguas, o qual hibridi- za com qualquer uma das seqüências polinucleotídicas de SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25.

Por molécula(s) de ácido nucléico "isolada(s)", nos referimos a uma molécula de ácido nucléico, DNA ou RNA, que foi removida do seu ambiente natural. Por exemplo, moléculas de DNA recombinante contidas em uma construção de DNA são consideradas isoladas para os propósitos da presente invenção. Exemplos adicionais de moléculas de DNA isoladas incluem moléculas de DNA recombinante mantidas em células hospedeiras heterólogas ou moléculas de DNA purificadas (parcialmente ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isoladas incluem transcritos de RNA in vitro das moléculas de DNA da presente invenção. Moléculas de ácido nucléico isoladas, de acordo com a presente invenção, incluem ainda essas moléculas produzidas sinteti- camente.

As moléculas de ácido nucléico da presente invenção podem es-

tar na forma de RNA, como mRNA, ou na forma de DNA, incluindo, por exemplo, cDNA e DNA genômico obtido por clonagem ou produzido sinteticamente. O DNA ou RNA pode ser fita dupla ou fita simples. O DNA de fita simples pode ser a fita codificante, também chamada de fita senso, ou pode ser a fita não codificante, também conhecida como fita anti-senso.

A menos que seja indicado diferentemente, todas as seqüências nucleotídicas determinadas aqui através do seqüenciamento de uma molécula de DNA, foram determinadas usando um seqüenciador automático de DNA (como o Modelo 373 da Applied Biosystems, Inc.). Portanto, como é sabido na técnica para qualquer seqüência de DNA determinada por essa abordagem automática, qualquer seqüência nucleotídica determinada assim pode conter alguns erros. As seqüên- cias nucleotídicas determinadas por automação são normalmente pelo menos cerca de 95% idênticas, sendo mais comum que sejam pelo menos cerca de 96% idênticas até pelo menos cerca de 99,9% idênticas à seqüência nucleotídica real da molécula de DNA seqüenciada. A seqüência real pode ser determinada com mais precisão por outras abordagens, incluindo métodos manuais de seqüenciamento de DNA bem conhecidos na arte. Como também é sabido na técnica, uma única inserção ou deleção em uma seqüência nucleotídica determinada comparada à seqüência real causará uma mudança do referencial de leitura na tradução da seqüência nucleotídica, de maneira que a se- qüência de aminoácidos esperada codificada por uma seqüência nucleo- tídica determinada pode ser completamente diferente da seqüência de aminoácidos verdadeiramente codificada pela molécula de DNA seqüen- ciada, começando a partir do ponto dessa inserção ou deleção.

Cada "seqüência nucleotídica" apresentada aqui é apresentada como uma seqüência de desoxiribonucleotídeos (abreviados A, G, C e T). Entretanto, "seqüência nucleotídica" de uma molécula de ácido nucléico ou polinucleotídeo significa, para uma molécula ou polinucleotídeo de DNA, uma seqüência de desoxiribonucleotídeos, e para uma molécula de ou polinucleotídeo de RNA, a seqüência correspondentes de ribonu- cleotídeos (A, GlCe U), na qual cada desoxinucleotídeo de timidina (T) na seqüência especificada de desoxinucleotídeos é substituído pelo ribonucleotídeo urídina (U).

A presente invenção também está direcionada a fragmentos das moléculas de ácido nucléico isoladas descritas aqui. Preferencialmente, os fragmentos de DNA consistem de pelo menos 15 nucleotídeos, sendo mais desejável pelo menos 20 nucleotídeos, e mais desejáveis ainda pelo menos 30 nucleotídeos, os quais são úteis como sondas de diagnóstico e iniciadores. É claro que fragmentos maiores com até o comprimento total das moléculas de ácido nucléico da presente invenção também são úteis como sondas de diagnóstico, de acordo com técnicas convencio- nais de hibridização, ou como iniciadores para amplificação da seqüên- cia alvo pela reação em cadeia da polimerase (PCR), como descrita, por exemplo, em Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd. edition, editado por Sambrook & Russel, (2001), Cold Spring Harbor Laboratoiy Press, cujo conteúdo na íntegra está aqui incorporado por referência. Fragmentos de pelo menos 20 nucleotídeos de comprimento, por exemplo, significa fragmentos que incluem 20 ou mais bases contíguas da seqüência nucleotídica de SEQ ID NOs: 1, 2, 17, 20, 21. Os ácidos nucléicos contendo as seqüências nucleotídicas em SEQ ID NOs: 1, 2, 17, 20, 21 podem ser gerados usando métodos convencionais de síntese de DNA, os quais serão rotineiros para aqueles com habilidade na arte. Por exemplo, clivagem com endonucleases de restrição ou quebra por sonicação podem ser facilmente usados para gerar fragmentos de vários tamanhos. Alternativamente, os fragmentos de DNA da presente inven- ção podem ser gerados sinteticamente de acordo com técnicas conheci- das.

Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ácido nucléico isolada que consiste de um polinucleotídeo que hibridiza sob condições severas de hibridização a uma porção do polinucleotídeo em uma molécula de ácido nucléico da invenção descrita acima. Polinucleo- tídeo que hibridiza com uma "porção" de um polinucleotídeo significa um polinucleotídeo (tanto DNA quanto RNA) hibridizando com pelo menos cerca de 15 nucleotídeos, sendo desejável pelo menos cerca de nucleotídeos, sendo mais desejável pelo menos cerca de 30 nucleotí- deos, e sendo mais desejável ainda mais de 30 nucleotídeos. Esses fragmentos que hibridizam com os fragmentos de referência são úteis como sonda de diagnóstico e iniciadores. Uma sonda, como usada aqui, é definida como sendo pelo menos cerca de 100 bases contíguas de uma das seqüências de ácido nucléico apresentadas em SEQ ID NOs: 1-230. Para o propósito desta invenção, duas seqüências hibridizam quando elas formam um complexo de fita dupla em uma solução de hibridização de SSC 6X, SDS 0,5%, solução de Denhardt 5X e IOOMg de DNA carrea- dor não específico. VerAusubel e colaboradores, seção 2.9, suplemento 27 (1994). As seqüências podem hibridizar em "severidade moderada", a qual é definida como uma temperatura de 60°C em uma solução de hibridização de SSC 6X, SDS 0,5%, solução de Denhardt 5X e IOOMg de DNA carreador não específico. Para hibridização de "alta severidade", a temperatura é aumentada para 68°C. Após a reação de hibridização de severidade moderada, os nucleotídeos são lavados cinco vezes em uma solução de SSC 2X mais SDS 0,05% em temperatura ambiente, com lavagens subseqüentes com de SSC 0,1X mais SDS 0,1%, a 60°C por 1 h. Para alta severidade, a temperatura do banho é aumentada para 68°C. Para os propósito desta invenção, nucleotídeos hibridizados são aqueles que são detectados usando 1 ng de uma sonda radioativa com uma radioatividade específica de 10.000 cpm/ng, sendo que os nucleo- tídeos hibridizados são claramente visualizados após exposição a um filme de raios-X a 70°C por não mais que 72 horas. A presente aplicação é dirigida a moléculas de ácido nucléico que são pelo menos 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à seqüência de ácido nucléico descrita em SEQ ID NOs: 1, 2, 17, 20, 21. São preferidos, no entanto, moléculas de ácido nucléico que são pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à seqüência de ácido nucléico mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 2, 17, 20, 21. Diferenças entre duas seqüências de ácido nucléico pode ocorrer nas posições terminais 51 e 3' da seqüência de nucleotídeos referência ou em qualquer lugar entre essas posições terminais, espalhados tanto individualmente entre os nucleotídeos na seqüência de referência quanto em um ou mais grupos contíguos dentro da seqüência de referência.

Como uma questão prática, uma molécula de ácido nucléico em particular ser pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à seqüência nucleotídica de referência se refere a uma comparação feita entre duas moléculas usando algoritmos padrões bem conhecidos na arte e pode ser determinada convencionalmente usando programas de computador disponíveis publicamente, como o algoritmo BLASTN. Ver Altschul e colaboradores, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997).

Análise de Seqüências

Os métodos de alinhamento de seqüência para comparação são bem conhecidos na arte. O alinhamento ótimo das seqüências para comparação pode ser realizado pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Adv. Appl Math. 2: 482 (1981); pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, J. MoI. Biol 48: 443 (1970); pelo método de busca por similaridade de Pearson e Lesam, Proe. Natl Aead. Sei 85: 2444 (1988); por implementações computado- rizadas desses algoritmos, incluindo, mas sem limitação: CLUSTAL no programa PC/Gene da Intelligenetics, Mountain View, Califórnia; GAP, BESTFIT5 BLAST, FASTA, e TFASTA no pacote Wisconsin Geneties Software, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, EUA; o programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins e Sharp, Gene 73: 237 244 (1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151 153 (1989); Corpet e colaboradores, Nucleic Acids Research 16: 10881- 90 (1988); Huang e colaboradores, Computer Applieations in the Biosci- enees 8: 155-65 (1992), e Pearson e colaboradores, Methods in Molecu- lar Biology 24: 307-331 (1994).

A família BLAST de programas que pode ser usada para buscas de similaridade em bancos de dados inclui: BLASTN para consultas de seqüências de nucleotídeos em bancos de dados de seqüências nucleo- tídicas; BLASTX para consultas de seqüências de nucleotídeos em bancos de dados de proteínas; BLASTP para consultas de seqüências de proteínas em bancos de dados de proteína; TBLASTN para consultas de seqüências de proteínas em bancos de dados de seqüências de nucleo- tídeos; e TBLASTX para consultas de seqüências de nucleotídeos em bancos de dados de nucleotídeos. Ver, Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, e colaboradores, Eds., Greene Publishing and Wiley- Interscience, New York (1995); Altschul e colaboradores, J. MoL Biol7 215:403-410 (1990); e Altschul e colaboradores, Nueleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997).

O software para realizar análises BLAST está disponível publi- camente, por exemplo, através do National Center for Biotechnology Information (http://www.nebi.nlm.nih.gov/). Esse algoritmo envolve primeiro a identificação de pares de seqüência com valores altos (HSPs) pela identificação de palavras curtas com comprimento W na seqüência de consulta, que combinam ou satisfazem algum valor limite positivo T quando alinhadas com uma palavra de mesmo comprimento na se- qüência do banco de dados. T é chamado de valor limite de palavra vizinha (neighborhood worá score threshold). Essa identificação inicial de palavra vizinha age como uma semente para iniciar buscas que encontrem HSPs mais longas que as contenham. As identificações de palavras são então estendidas em ambas as direções ao longo de cada seqüência até que o valor acumulado de alinhamento possa ser aumen- tado. Os valores cumulativos são calculados usando, para seqüências nucleotídicas, os parâmetros M (valor de recompensa para um par de resíduos que combinam; sempre > 0) e N (valor de penalidade para resíduos que não combinam; sempre < 0). Para seqüências de aminoá- cidos, uma matriz de valoração é usada para calcular o valor cumulati- vo. As extensões da identificação de palavras em cada direção são paradas quando: o valor cumulativo de alinhamento diminui pela quantidade X do valor máximo atingido; o valor cumulativo vai a zero ou menos devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduos com valores negativos; ou fim das seqüências é alcançado. Os parâme- tros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências nucleotídicas) usa como base os valores de tamanho de palavra (W) de 11, um esperado (E) de 10, um corte de 100, M=5, N=-4 e uma compa- ração de ambas as fitas. Para seqüências de aminoácidos, o programa BLASTP as bases de tamanho de palavra (W) de 3, um esperado (E) de 10, e a matriz de valoração BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl Acad. Sci USA 89:10915).

Além de calcular a percentagem de identidade de seqüência, o algoritmo BLAST também realiza análises estatísticas da similaridade entre duas seqüências (ver, e.g., Karlin & Altschul, Proc. Natl Acad. Sei. USA 90:5873-5877 (1993)). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é menor probabilidade de soma (P(N)), a qual fornece uma indicação da probabilidade de uma combinação entre duas se qüências de nucleotídeos ou aminoácidos ocorrer aleatoriamente.

O alinhamento múltiplo das seqüências pode ser realizado vi- sando o método de alinhamento CLUSTAL (Higgins e Sharp (1989) CABIOS. 5:151 153) com os parâmetros base (GAP PENALTY=I05 GAP LENGTH PENALTY=IO). Os parâmetros base para alinhamento de pares usando o método CLUSTAL são KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WIN- DOW=5 e DIAGONALS SAVED=5.

Os seguintes parâmetros de operação são preferíveis para a de- terminação de alinhamentos e similaridades usando BLASTN que contribuem para os valores de E e para as percentagens de identidade para seqüências de polinucleotídeos: comando de operação Unix: blastall -p blastn -d embldb -e 10 -GO -EO -r 1 -v 30 -b 30 -i queryseq - o results; os parâmetros são: -p Nome do programa [String]; -d Banco de dados [String]; -e Valor de expectativa (E) [Real]; -G Custo para abrir a falha (zero ativa o comportamento base) [Integer]; -E Custo para estender a falha (zero ativa o comportamento base) [Integer]; -r Recom- pensa para uma combinação de nucleotídeo (apenas para blastn) [Integer]; -v Número de descrições de uma linha (V) [Integer]; -b Número de alinhamentos a mostrar (B) [Integer]; -i Consultar arquivo [File In]; e -o BLAST reportar arquivo de resultado [File Out] Optional.

As identificações ou «acertos» em uma ou mais seqüências do banco de dados por uma seqüência de consulta produzidas por BLASTN, FASTA, BLASTP ou um algoritmo similar alinham e identifi- cam porções similares das seqüências. Os acertos são arrumados na ordem do grau de similaridade e do comprimento da sobreposição de seqüências. Os acertos em uma seqüência do banco de dados geralmen- te representam uma sobreposição com apenas uma fração do compri- mento da seqüência consultada.

Os algoritmos BLASTN, FASTA e BLASTP também produzem va- 10

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lores «esperados» para alinhamentos. O valor Esperado (E) indica o números de acertos aleatórios que podem «esperados» em um certo número de seqüências contíguas, quando se está buscando em um banco de dados de um determinado tamanho. O valor Esperado é usado como um limite de significância para determinar se um acerto em um banco de dados, como o banco de dados EMBL, indicam uma similari- dade verdadeira. Por exemplo, um valor E de 0,1 alocado a um acerto de polinucleotídeo é interpretado como significando que em um banco de dados do tamanho do banco de dados EMBL, pode-se esperar 0,1 acerto na porção alinhada da seqüência com um valor similar devido ao acaso. Por esse critério, as porções alinhadas e combinadas das seqüências de nucleotídeos têm então uma probabilidade de 90% de serem a mesma. Para seqüências com um valor E de 0,01 ou menos para porções alinhadas e combinadas, a probabilidade de se encontrar uma combi- nação ao acaso no banco de dados EMBL é 1% ou menos usando o algoritmo BLAST ou FASTA.

De acordo com uma modalidade, os polinucleotídeos «variantes», referindo-se a cada um dos polinucleotídeos da presente invenção,' contêm preferencialmente seqüências o mesmo número ou menos de ácidos nucléicos do que cada um dos polinucleotídeos da presente invenção e que produzem um valor E de 0,01 ou menos, quando com- parados com o polinucleotídeo da presente invenção. Ou seja, um polinucleotídeo variante é qualquer seqüência que tem pelo menos 99% de probabilidade de ser a mesma que a do polinucleotídeo da presente invenção, medido como tendo um valor E de 0,01 ou menos usando os

algoritmos BLASTN, FASTA, ou BLASTP ajustados nos parâmetros descritos acima.

Alternativamente, os polinucleotídeos variantes da presente in- venção hibridizam com as seqüências polinucleotídicas descritas nas SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25 ou complementos,

seqüências reversas, ou complementos reversos dessas seqüências, sob condições severas.

A presente invenção abrange polinucleotídeos que diferem das seqüências apresentadas, mas que, como conseqüência da degeneração do código genético, codificam um polipeptídeo que é o mesmo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Assim, os polinucleotí- deos que contêm seqüências que diferem das seqüências polinucleotídi- cas apresentadas em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24 ou 25; ou complementos, seqüências reversas ou complementos reversos destas, como resultado de substituições conservadas são contemplados e abrangidos pela presente invenção. Além disso, os polinucleotídeos que contêm seqüências que diferem das seqüências polinucleotídicas apresentadas em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25 ou complementos, seqüências reversas ou complementos reversos destas, como resultado de deleções e/ou inserções que totalizem menos de 10%

do comprimento total da seqüência são também contemplados e abran- gidos pela presente invenção.

Além de ter uma identidade de seqüência especificada com uma seqüência de polinucleotídeo inventiva, polinucleotídeos variantes preferivelmente têm uma estrutura e/ou características funcionais adicionais em comum com o polinucleotídeo inventivo. Além de compar- tilharem um alto grau de similaridade em sua estrutura primária com os polinucleotídeos da presente invenção, os polinucleotídeos com um grau de identidade especificado com, ou capazes de hibridizar com um polinucleotídeo inventivo preferivelmente têm pelo menos uma das seguintes características: (i) eles contêm uma região de leitura aberta ou uma região de leitura aberta parcial que codifica um polipeptídeo com substancialmente as mesmas propriedades funcionais do polipep- SV 47/81 1

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tídeo codificado pelo polinucleotídeo inventivo; ou(ii) eles possuem domínios em comum.

Fontes de Elementos

e Seqüências de DNA

> Todos e quaisquer elementos e seqüências de DNA descritos aqui

podem ser endógenos a um ou mais genomas vegetais. Por isso, em uma modalidade em particular da presente invenção, todos os elemen- tos e seqüências de DNA, os quais são selecionados para 0 cassete final de transferência são endógenos, ou nativos do genoma da planta que será transformada. Por exemplo, todas as seqüências podem vir do genoma da batata. Alternativamente, um ou mais dos elementos ou seqüências de DNA podem ser endógenos de um genoma vegetal que nao é o mesmo da espécie da planta a ser transformada, mas que funciona de qualquer maneira na célula vegetal hospedeira. Essas plantas incluem batata, tomate e alfafa. A presente invenção também abrange o uso de um ou mais elementos genéticos de uma planta que seja interfértil com a planta que será transformada.

Nesse caso, a «planta» da presente invenção inclui, mas não está limitada à batata, tomate, abacate, alfafa, beterraba, mandioca, batata doce, soja, ervilha, feijão, milho, trigo, arroz, cevada e sorgo. Assim, a planta pode ser uma monocot ou uma dicot. «Planta» e «material vege- tal» também abrangem células vegetais, sementes, prole das plantas, propágulos gerados sexuadamente ou assexuadamente, e descendentes de qualquer um destes, como enxertos e sementes. «Material vegetal» pode se referir a células vegetais, culturas de células em suspensão, calo, embriões, regiões meristemáticas, tecido do calo, folhas raízes brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, sementes, plântulas em germi- nação e microsporos. As plantas podem estar em vários estágios de maturação e podem ser cultivadas em cultura líquida ou sólida ou em O

solo ou em meio apropriado em vasos, estufas e no campo. A expressão

de uma seqüência líder, traüer ou gêmea pode ser transiente ou perma- nente.

Nesse caso, uma seqüência terminal de DNA de transferência derivado de planta («P-DNA») da presente invenção não é idêntica em seqüência de nucleotídeo a qualquer seqüência terminal conhecida de T-DNA de origem bacteriana, mas ela funciona para essencialmente a mesma função. Ou seja, o P-DNA pode ser usado para transferir e integrar um polinucleotídeo no outro. UM P-DNA pode ser inserido em um plasmídeo indutor de tumores, como o plasmídeo Ti de Agrobacteri- um, no lugar de um T-DNA convencional, e mantido em uma cepa bacteriana, assim como plasmídeos convencionais de transformação. O P-DNA pode ser manipulado de maneira a conter o polinucleotídeo desejado, o qual destina-se à integração no genoma vegetal via trans- formação vegetal mediada por bactéria. Ver Rommens e colaboradores em W02003/069980, US-2003-0221213, US-2004-0107455 e W02005/004585, que são aqui incorporadas por referência.

Assim, a seqüência terminal de difere por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ou mais nucleotideos de uma seqüência terminal conhecida de T-DNA de uma espécie de Agrobacte- rium, como Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes.

Uma seqüência terminal de P-DNA não é mais similar do que

99%, 98%, 97o/„, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%,

87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%,

75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%,' 64%,'

63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%,'

51% ou 50% em seqüência de nucleotideos a uma seqüência terminal de T-DNA de Agrobacterium.

Foram desenvolvidos métodos para identificar e isolar DNAs de 10

transferência de plantas, particularmente de batata e trigo, e fizeram uso do consenso do motivo terminal descrito em US-2004-0107455, o qual é aqui incorporado por referência.

Nesse caso, um DNA derivado de planta da presente invenção, como qualquer uma das seqüências, sítios de clivagem, regiões ou elementos apresentados aqui, é funcional se promove a transferência e integração de um polinucleotídeo ao qual está ligado em outra molécula de ácido nucléico, como em um cromossomo vegetal, com uma freqüên- cia de transformação de cerca de 99%, cerca de 98%, cerca de 97%, cerca de 96%, cerca de 95%, cerca de 94%, cerca de 93%, cerca de 92%,' cerca de 91%, cerca de 90%, cerca de 89%, cerca de 88%, cerca de 87%! cerca de 86%, cerca de 85%, cerca de 84%, cerca de 83%, cerca de 82%,' cerca de 81%, cerca de 80%, cerca de 79%, cerca de 78%, cerca de 77%, cerca de 76%, cerca de 75%, cerca de 74%, cerca de 73%, cerca de 72%! cerca de 71%, cerca de 70%, cerca de 69%, cerca de 68%, cerca de 67%! cerca de 66%, cerca de 65%, cerca de 64%, cerca de 63%, cerca de 62%! cerca de 61%, cerca de 60%, cerca de 59%, cerca de 58%, cerca de 57%! cerca de 56%, cerca de 55%, cerca de 54%, cerca de 53%, cerca de 52%! cerca de 51%, cerca de 50%, cerca de 49%, cerca de 48%, cerca de 47%! cerca de 46%, cerca de 45%, cerca de 44%, cerca de 43%, cerca de 42%! cerca de 41%, cerca de 40%, cerca de 39%, cerca de 38%, cerca de 37%! cerca de 36%, cerca de 35%, cerca de 34%, cerca de 33%, cerca de 32%! cerca de 31%, cerca de 30%, cerca de 29%, cerca de 28%, cerca de 27%! cerca de 26%, cerca de 25%, cerca de 24%, cerca de 23%, cerca de 22%!

cerca de 21%, cerca de 20%, cerca de 15%, ou cerca de 5% ou pelo menos cerca de 1%.

Qualquer uma dessas seqüências e elementos relacionados à transformação pode ser modificado e mutacionado para alterar a eficiência de transformação. Outras seqüências de polinucleotídeos podem ser adicionadas à seqüência de transformação da presente invenção. Por exemplo, ela pode ser modificada para possuir múltiplos sítios de clonagem 5' e 3' ou sítios adicionais de restrição. A seqüência de um sítio de clivagem apresentada aqui, por exemplo, pode ser modificada para aumentar a chance que o arcabouço de DNA do vetor que a acompanha não seja integrado no genoma vegetal.

Qualquer polinucleotídeo desejado pode ser inserido entre as se- qüências de clivagem ou terminais descritas aqui. Por exemplo, um polinucleotídeo desejado pode ser um gene selvagem ou modificado que é nativo de uma espécie vegetal, ou pode ser um gene de um genoma não vegetal. Por exemplo, quando se transforma uma batata, pode-se fazer um cassete de expressão que contenha um promotor específico de batata ligado operacionalmente a um gene desejado de batata ou fragmento deste e a um terminador específico de batata. O cassete de expressão pode conter elementos genéticos adicionais de batata, como uma seqüência peptídeo-sinal fundida em referencial no terminal 5' do gene, e um acentuador pós-transcricional de batata. A presente inven- ção não está limitada a esse arranjo e um cassete de expressão pode ser construído de maneira que o polinucleotídeo desejado, embora ligado operacionalmente a um promotor, não está ligado operacionalmente a uma seqüência terminadora.

Quando uma seqüência ou elemento relacionado à transforma- ção, como aqueles descritos aqui, são identificados e isolados de uma planta, e se essa seqüência ou elemento são subseqüentemente usados para transformar uma planta da mesma espécie, essa seqüência ou elemento pode ser descrito como "nativo" daquele genoma vegetal.

Assim, um elemento genético "nativo" se refere a um ácido nu- cléico que existe naturalmente em, se origina de, ou pertence ao geno- ma de uma planta que será transformada. Na mesma linha, o termo "endógeno" também pode ser usado para identificar um ácido nucléico

específico, por exemplo, um DNA ou RNA, ou uma proteína «nativa» da

planta. Endógeno significa um elemento que se origina de dentro do

organismo. Assim, qualquer molécula de ácido nucléico, gene, polinu-

* cleotídeo, DNA, RNA, mRNA, ou cDNA que é isolado do genoma de uma

Planta ou espécie vegetal que será transformada, ou é isolado de uma

Planta ou espécie que é sexualmente compatível ou interfértil com a

espécie de planta a ser transformada, é «nativa», isto é, indígena à

espécie vegetal. Em outras palavras, um elemento genético nativo

representa todo material genético que está acessível aos criadores de

Planta para a melhoria de plantas pelo cruzamento vegetal clássico

Qualquer variante de um ácido nucléico nativo também é considerada

«nativa» de acordo com a presente invenção. Nesse caso, um ácido

nucléico «nativo» também pode ser isolado de uma planta ou espécie

sexualmente compatível com esta e modificada ou mutacionada de

maneira que a variante resultante tenha uma similaridade maior ou igual a 990/0, 980/c, 97o/o> 96%> gg%j g4%) ^ ^ ^ ^ ^

880/0, 870/0, 860/e, 850/0, 84%, 83%, 82ο/θ) 81%> ^ ^ 7g% ^

76o/o, 750/0, 74o/0, 730/0, 720/0, 71%> 70o/o> 69o/o> 68ο/θ; ^ ^ ^

640/0, 630/0, 620/0, 61%, ou 60o/„ em seqüência de nucleotídeos em relação ao ácido nucléico nativo não modificado isolado da planta. Uma varian- te de ácido nucléico nativo também pode ter uma similaridade menor do

que cerca de 60o/o, menor do que cerca de 55<>/o, ou menor do que cerca de 50% em seqüência nucleotídica.

Um ácido nucléico «nativo» isolado de uma planta também pode codificar uma variante do produto protéico natural transcrito e tradu- zido daquele ácido nucléico. Assim, uma ácido nucléico nativo pode codificar uma proteína que tem uma similaridade maior ou igual a 99% 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89o/o> 88o/o> ^ 10

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20

25

860/c, 85%, 84ο/ο, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%,

74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%!

62%, 61%, ou 60% em seqüência de aminoácidos em relação à proteínJ

nativa e não modificada expressa na planta da qual o ácido nucléico foi isolado.

Promotores

Os polinucleotídeos da presente invenção podem ser usados pa- ra direcionar de maneira específica a expressão de polipeptídeos e proteínas nos tecidos das plantas. Os ácidos nucléicos da presente invenção também podem ser usados para direcionar de maneira especí- fica a expressão de RNA anti-senso ou RNA envolvido em RNA de interferência (RNAi), como RNA de interferência pequeno (siRNA), nos tecidos das plantas, o que pode ser útil para inibir ou bloquear comple- tamente a expressão dos genes alvos. Como usado aqui, «produto codificado» significa o produto final do ácido nucléico que está ligado operacionalmente aos promotores. Por exemplo, uma proteína ou polipeptídeo é um produto codificado, bem como RNA anti-senso ou siRNA, que são os produtos finais do ácido nucléico que codifica o RNA anti-senso. O produto codificado pode ser também um mRNA não traduzido. Os termos polipeptídeo e proteína são usados como sinôni- mos aqui. Como usado aqui, promotor significa um ácido nucléico, de preferência um DNA, que se liga à RNA polimerase e/ou a outros elementos reguladores de transcrição. Como com qualquer promotor, os promotores da presente invenção facilitarão ou controlarão a transcri- ção de DNA ou RNA para gerar uma molécula de mRNA a partir de uma molécula de ácido nucléico que está ligada operacionalmente ao promo- tor. O RNA pode codificar uma proteína ou polipeptídeo, ou pode codificar um RNA de interferência ou uma molécula anti-senso. Como usado aqui, «ligado operacionalmente» significa a fusão, ligação ou síntese química de DNA, de maneira que seja formada uma seqüência de combinação promotor-ácido nucléico em uma orientação específica para que a seqüência de ácido nucléico seja transcrita em um segmento de RNA. Os promotores da presente invenção também podem conter parte ou toda a região não traduzível 5' (5' UTR) do transcrito de mRNA resultante. Por outro lado, os promotores da presente invenção não necessariamente precisam conter qualquer 5' UTR.

Um promotor, como empregado aqui, também pode inclu- ir elementos reguladores. Por outro lado, um elemento regulador pode também estar separado do promotor. Os elementos reguladores confe- rem uma série de características importantes à região do promotor. Alguns elementos se ligam a fatores de transcrição para aumentar a taxa de transcrição do ácido nucléico ligado operacionalmente. Outros elementos se ligam a repressores que inibem a atividade de transcrição. O efeito de fatores de transcrição na atividade do promotor pode deter- minar se a atividade do promotor é alta ou baixa, isto é, se o promotor é "forte" ou "fraco".

Em outra modalidade, um promotor constitutivo pode ser usado para expressar seqüências polinucleotídicas inventivas.

Em outra modalidade, vários promotores induzíveis de genes ve- getais podem ser usados para expressar as seqüências polinucleotídicas inventivas. Os promotores induzíveis regulam a expressão gênica em resposta a sinais ambientais, hormonais ou químicos. Exemplos de promotores induzíveis por hormônio incluem os promotores induzíveis por auxina (Baumann e colaboradores Plant Cell 11:323-334(1999)), o promotor induzível por citocinina (Guevara-Garcia Plant Mol Biol 38:743-753(1998)) e os promotores que respondem à giberelina (Shi e colaboradores PlantMol Biol 38:1053-1060(1998)). Além disso, promo- tores que respondem a calor, luz, ferimento, resistência a patógeno e produtos químicos, como jasmonato de metila ou ácido salicílico, podem ser usados para expressar as seqüências polinucleotídicas inventivas.

Numa modalidade, o promotor é um promotor de amido sintase ligada ao grânulo, um promotor do gene de ADP-glicose pirofosforilase de batata ou um promotor de flavonóide 3-monooxigenase. Em outra modalidade,o promotor é um promotor especifico de semente.

A presente invenção também abrange polinucleotídeos que dife- rem das seqüências apresentadas, mas que como conseqüência da degeneração do código genético, codificam um polipeptídeo que é o mesmo codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. Assim, os polinucleotídeos que contêm seqüências que diferem das seqüências polinucleotídicas apresentadas em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14 15, 23, 24, ou 25; ou complementos, seqüências reversas, ou comple- mentos reversos destas, como resultado de substituições conservadas são contemplados e abrangidos pela presente invenção. Além disso, os polinucleotídeos que contêm seqüências que diferem das seqüências polinucleotídicas apresentadas em SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 9, 10, 14, 15, 23, 24, ou 25 ou complementos, seqüências reversas, ou comple- mentos reversos destas, como resultado de deleções e/ou inserções que totalizem menos de 10% do comprimento total da seqüência são tam- bém contemplados e abrangidos pela presente invenção.

Além de terem uma identidade de seqüência específica em rela- ção a uma seqüência polinucleotídica inventiva, polinucleotídeos variantes têm preferivelmente características estruturais e/ou funcio- nais adicionais em comum com o polinucleotídeo inventivo. Além de compartilharem um alto grau de similaridade na sua estrutura primária com os polinucleotídeos da presente invenção, os polinucleotídeos com um grau de identidade especificado com, ou capazes de hibridizar com um polinucleotídeo inventivo preferivelmente têm pelo menos uma das 55/81 -J1O^ seguintes características: (i) eles contêm uma região de leitura aberta ou uma região de leitura aberta parcial que codifica um polipeptídeo com substancialmente as mesmas propriedades funcionais do polipep- tídeo codificado pelo polinucleotídeo inventivo; ou (ii) eles possuem domínios em comum.

Fontes de Elementos e Seqüências de DNA

Todos e quaisquer elementos e seqüências de DNA descritos aqui podem ser endógenos a um ou mais genomas vegetais. Por isso, em uma modalidade em particular da presente invenção, todos os elemen- tos e seqüências de DNA, os quais são selecionados para o cassete final de transferência são endógenos, ou nativos do genoma da planta que será transformada. Por exemplo, todas as seqüências podem vir do genoma da batata. Alternativamente, um ou mais dos elementos ou seqüências de DNA podem ser endógenos de um genoma vegetal que não é o mesmo da espécie da planta a ser transformada, mas que funciona de qualquer maneira na célula vegetal hospedeira. Essas plantas incluem batata, tomate e alfafa. A presente invenção também abrange o uso de um ou mais elementos genéticos de uma planta que seja interfértil com a planta que será transformada.

Nesse caso, a "planta" da presente invenção inclui, mas não está limitada à batata, tomate, alfafa, beterraba, mandioca, batata doce, soja, ervilha, feijão, milho, trigo, arroz, cevada e sorgo. "Planta" e "material vegetal" também abrangem células vegetais, sementes, prole das plantas, propágulos gerados sexuadamente ou assexuadamente, e descendentes de qualquer um destes, como enxertos e sementes. "Material vegetal" pode se referir a células vegetais, culturas de células em suspensão, calo, embriões, regiões meristemáticas, tecido do calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, sementes, plântu- 56/81 jc^ Ias em germinação e microsporos. As plantas podem estar em vários estágios de maturação e podem ser cultivadas em cultura líquida ou sólida, ou em solo ou em meio apropriado em vasos, estufas e no campo. A expressão de uma seqüência líder, trailer ou gênica pode ser transiente ou permanente.

Construções de Ácido Nucléico

A presente invenção fornece construções de moléculas de ácido nucléico e seqüências polipeptídicas isoladas da presente invenção. Numa modalidade, as construções de DNA da presente invenção são plasmídeos Ti derivados de A. tumefadens.

Durante o desenvolvimento das construções de ácido nucléico desta invenção, os vários componentes da construção, ou fragmentos destes, serão inseridos normalmente em um vetor de clonagem conveni- ente, por exemplo, um plasmídeo que seja capaz de se replicar em uma hospedeiro bacteriano, por exemplo, E. coli Existem vários vetores que foram descritos na literatura, muitos dos quais estão disponíveis comercialmente. Após cada clonagem, o vetor de clonagem com a inserção desejada pode ser isolado e submetido à manipulação adicio- nal, como digestão de restrição, inserção de novos fragmentos ou nucleotídeos, ligação, deleção, mutação, resecção etc., para ajustar os componentes da seqüência desejada. Uma vez que a construção tenha sido completada, pode então ser transferida para o vetor apropriado

para manipulações adicionais, de acordo com o modo de transformação da célula hospedeira.

Uma molécula de DNA recombinante da invenção pode incluir normalmente um marcador selecionável, de maneira que as células transformadas possam ser facilmente identificadas e selecionadas entre as células não transformadas. Exemplos desses marcadores incluem, mas sem limitaçãoo gene da neomicina fosfotransferase (nptll) (Potiykus

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20

e colaboradores, Mol Geri. Genet 199:183-188 (1985)), o qual confere resistência à canamicina. As células que expressam o gene nptll podem ser selecionadas um antibiótico apropriado, como a canamicina ou o G418. Outros marcadores selecionáveis comumente usados incluem o gene bar, que confere resistência a bialaphos; um gene mutante de EPSP sintase (Hinchee e colaboradores, Bio/Technology 6:915-922 (1988)), o qual confere resistência ao glifosato; e um gene mutante de acetolactato sintase (ALS), o qual confere resistência à imidazolinona ou à sulfoniluréia (Pedido de Patente Europeu 154.204, 1985). Além disso, os vetores podem incluir uma origem de replicação

(replicons) para uma célula hospedeira específica. Vários replicons procarióticos são conhecidos daqueles com habilidade na arte e tem a função de dirigir a replicação e manutenção autônoma de uma molécula recombinante em uma célula hospedeira procariótica. A invenção também fornece células hospedeiras que contêm as

construções de DNA da presente invenção. Como usada aqui, células hospedeiras se referem à célula na qual o produto codificado é final- mente expresso. Dessa maneira, uma célula hospedeira pode ser uma célula individual, uma cultura de células ou células que são parte de um organismo. A célula hospedeira também pode ser parte de um embrião, endosperma, espermatozóide ou óvulo, ou zigoto.

Conseqüentemente, a presente invenção também fornece plantas ou células vegetais que contêm as construções de DNA da presente invenção. De preferência, as plantas são angiospermas ou gimnosper- mas. A construção de expressão da presente invenção também pode ser usada para transformar várias plantas, tanto mococotiledôneas (por exemplo, trigo, grama, milho, cevada, sorgo, orquídea, íris, lírio, cebola, banana, cana de açúcar e palmeira), quanto dicotiledôneas (por exem- plo, Arabidopsis, batata, tabaco, tomate, abacate, pimenta, beterraba, brócolis, mandioca, batata doce, algodão, poinsétia, legumes, alfafa, soja, ervilha, feijão, pepino, uva, brassica, cenoura, morango, alface, carvalho, bordo, nogueira, rosa, hortelã, abóbora, margarida, cacto, eucalipto), e gimnospermas (por exemplo, pinheiro-comum; ver Aronen, Finnish Forest Res. Papersi Vol. 595, 1996), white spruce (Ellis e colabo- radores, Biotechnology 11:84-89, 1993), e lariço (Huang e colaborado- res, In Vitro Cell 27:201-207, 1991).

Transformação e Regeneração Vegetal

Os presentes polinucleotídeos podem ser introduzidos em uma célula vegetal hospedeira pelos procedimentos padrões conhecidos na arte para introduzir seqüências recombinantes em uma célula hospe- deira alvo. Esses procedimentos incluem mas não estão limitados à transfecção, infecção, transformação, captação natural, eletroporação, biolística e Agrobacterium. Os métodos para introduzir genes exógenos em plantas são conhecidos na arte e podem ser usados para inserir uma construção da invenção na planta hospedeira, incluindo protocolos de transformação vegetais biológicos e físicos. Ver, por exemplo, Miki e colaboradores, 1993, " Procedure for Introducing Foreign DNA into PlantsIn: Methods in Plant MolecularBiology and Bioteehnologyi Glick e Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, páginas 67-88. Os métodos escolhidos variam com a planta hospedeira e incluem métodos de transfecção química, como fosfato de cálcio, transferência gênica mediada por microrganismo, como Agrobacterium (Horsch e colabora- dores, Science 227:1229-31, 1985), eletroporação, microinjeção e bombardeamento biolístico. Os métodos preferíveis de transformação incluem cruzamento preciso (ver: Pedidos de Patente US 2003/0221213 Al, 2004/0107455 Al e 2005/0229267 Al) e transformação refinada (ver Pedido de Patente US 2005/0034188 Al).

Conseqüentemente, a presente invenção também fornece plantas ou células vegetais que contém os polinucleotídeos ou polipeptídeos da presente invenção. Numa modalidade, as plantas são angiospermas ou gimnospermas. Além do significado comum de planta, o termo "plantas" também significa aqui fruto, sementes, estróbilo etc. da planta. A planta da presente invenção pode ser um transfectante direto, o que quer dizer que o vetor foi introduzido diretamente na planta, como por meio de Agrobacterium, ou a planta pode ser da prole de uma planta transfecta- da. A prole também pode ser obtida por reprodução assexuada de uma planta transfectada. A planta de segunda ou subseqüente geração pode ou não ser produzida por reprodução sexuada, isto é, fertilização. Além disso, a planta pode ser um gametóflto (estágio haplóide) ou um esporó- fito (estágio diplóide).

Nesse caso, a presente invenção contempla a transformação de uma planta com um ou mais elementos de transformação que são geneticamente originários da planta. A presente invenção abrange uma abordagem "toda nativa" da transformação, na qual apenas elementos de transformação nativos da planta são finalmente integrados na planta desejada por meio de transformação. Nesse sentido, a presente invenção abrange a transformação de uma espécie vegetal específica apenas com elementos genéticos de transformação que são nativos daquela espécie vegetal. A abordagem nativa também pode significar que um elemento de transformação específico é isolado da mesma planta que será trans- formada, da mesma espécie vegetal ou de uma planta que é sexualmen- te interfértil com a planta a ser transformada.

Por outro lado, a planta a ser transformada pode ser transfor- mada com um cassete de transformação que contém um ou mais elementos e seqüências genéticos oriundos de uma planta de espécie diferente. Pode ser desejável usar, por exemplo, um sítio de clivagem que é nativo do genoma da batata em um cassete ou plasmídeo de transformação para transformar tomate ou pimenta.

A presente invenção não está limitada, no entanto, às aborda- gens nativa e toda nativa. Um cassete ou plasmídeo de transformação da presente invenção também pode abranger seqüências e elementos de outros organismos, como de espécies bacterianas.

Os exemplos a seguir são apresentados como representação de implementações específicas da presente invenção. Esses exemplos não devem ser entendidos de maneira alguma como uma limitação da abrangência da invenção. Deve ser entendido que podem ser implemen- tadas muitas variações e modificações mantendo-se dentro do espírito e abrangência da invenção.

Exemplos Exemplo X Expressão de Genes de Asparagina Sintetase Regulada Negativamente

Este Exemplo demonstra que a expressão regulada negativamen- te de um gene envolvido na biossíntese de asparagina nos tecidos ricos em amido do cultivo diminui a asparagina nesses tecidos e, conseqüen- temente, reduz a quantidade de acrilamida no alimento obtido pelo aquecimento desses tecidos ricos em amido.

A seqüência do gene de asparagina sintetase (AsiZ) da batata é mostrada em SEQ ID NO.: l.A seqüência parcial do gene de asparagina sintetase-2 {Ast2) da batata é mostrada em SEQ ID NO.: 2.

Fragmentos desses genes, mostrados em SEQ ID NO.: 3 e 4, fo- ram ligados para criar SEQ ID NO.: 5. Duas cópias do segmento de DNA -resultante foram inseridas, como repetições invertidas e separadas pelo espaçador mostrado em SEQ ID NO.: 6, entre os promotores com orientação convergente dos genes da ADP-glicose pirofosforilase (Agp) e da amido sintase ligada ao grânulo (Gbss) (SEQ ID NO.: 7 e 8, respecti- vãmente).

A construção silenciadora resultante foi inserida entre as regi- ões terminais de T-DNA que já continha um cassete de expressão para o gene marcador selecionável da neomicina fosfotransferase (nptll).

Um vetor binãrio contendo esse T-DNA, designado pSIM1148 (Figura IA), foi introduzido na Agrobacterium LBA4404 como descrito a seguir. Células competentes de LB4404 (50 vL) foram incubadas por 5 min em gelo na presença de 1 Mg de vetor de DNA, congeladas por cerca de 15 s em nitrogênio líquido e incubadas a 37°C por 5 min. Após a adição de ImL de meio líquido, as células tratadas foram cultivadas por 3 h a 28°C e plaqueadas em meio líquido/agar contendo estreptomicina (100 mg/L) e canamicina (100 mg/L). Os DNAs do vetor são então isolados em culturas de pernoite das colônias individuais de LBA4404 e examinados por análise de restrição para confirmar a presença do DNA plasmidial intacto.

Diluições de dez vezes das culturas de pernoite de Agrobacteri- um foram cultivadas por 5-6 horas, precipitadas a 2.800 RPM, lavadas com meio MS líquido (Phytotechnology) suplementado com sacarose (3%, pH 5,7) e ressuspendidas no mesmo meio até 0,2 OD/õOOnm. As células ressuspensas foram misturadas e usadas para infectar segmen- tos internos de 0,4-0,6 mm da variedade "Ranger Russet" de batata.

Os caules infectados foram incubados por dois dias em meio de co-cultivo (sais MS 1/10, sacarose 3%, pH 5,7) contendo 6 g/L agar a 22°C em uma câmara de cultivo Percival (16 h de luz) e subseqüente- mente transferidos para meio de indução de calo (CIM, meio MS suple- mentado com sacarose 3%, 2,5 mg/L de zeatina ribosídeo, 0,1 mg/L de ácido acético naftaleno e 6g/L de agar) contendo timentina (150 mg/L) e canamicina (100 mg/L). Após um mês de cultivo em CIM, os explantes foram transferidos para meio de indução de broto (SIM, meio MS suplementado com sacarose 3%, 2,5 mg/L de zeatina ribosídeo, 0,3 mg/L de ácido giberélico GA3 e 6g/L de agar) contendo timentina e canamicina (150 e 100 mg/L respectivamente) até que os brotos apare- cessem. Os brotos que nasceram no fim do período de regeneração foram transferidos para o meio MS com 3% de sacarose, 6 g/L de agar e timentina (150mg/L). As plantas transgênicas foram transferidas para solo e colocadas em uma estufa.

Após três meses, os tubérculos foram colhidos e analisados quanto aos seus níveis de asparagina de acordo com o Official Methods of Analysis of AOAC INTERNATIONAL (2002), 17th Edition, AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, EUA Método Oficial 982.30. Essa análise demonstrou que 17 das 26 plantas pSIM1148 continham apenas cerca de 25% a 50% da asparagina presente nas plantas contro- le (Tabela 1).

Os tubérculos de algumas das plantas com níveis baixos de as-

paragina foram cortados, cozidos, pré-fritos e completamente fritos para produzir batatas fritas. Essas batatas fritas foram moídas até um pó bem fino em nitrogênio líquido e enviadas em gelo seco até os laborató- rios Covance laboratories. Em Covance, os níveis de acrilamida foram determinados realizando-se cromatografia líquida/espectrometria de massa/espectrometria de massa (LC/MS/MS) (United States Food and Drug Administration, Centerfor Food Safety and Applied Nutrition Office of Plant Ss Dairy Foods and Beveragesj uDetection and Quantitation of Acrylamide in Foods", 2002). A Tabela 2 mostra que as fritas das plantas pSIM48 com baixa asparagina acumularam menos que um terço da acrilamida que é produzida em fritas controle.

Como alternativa ao uso dos promotores de Agp e Gbss como e- lementos reguladores, também é possível empregar dois promotores Gbss. Uma construção contendo a repetição invertida que consiste nos

ίο

fragmentos dos genes Astl e Ast2 entre dois promotores Gbss foi intro- duzidas entre as regiões terminais de um T-DNA para produzir um vetor binário pSIMl 151 (Figura 1B). Esse vetor foi usado para produzir linhagens de batata transgênica de uma maneira similar à descrita para pSIMl 148. Além disso, seqüências derivadas do gene Ast podem ser inseridas entre um promotor e um terminador.

Para qualquer gene Astj pode haver outras seqüências com um alto grau de similaridade de seqüência. É possível usar essas seqüên- cias homólogas para produzir construções silenciadoras. Por exemplo, fragmentos de um gene Ast de tomate podem ser usados para silenciar o gene Ast homólogo em batata.

Após a identificação de um gene Ast vegetal, iniciadores específi- cos do gene são produzidos para a amplificação por PCR do gene. A amplificação por PCR é realizada de acordo com os métodos conhecidos na arte e então o gene amplificado por PCR é clonado em um vetor de clonagem.

Os genes Ast podem ser identificados por buscas em banco de dados ou podem ser isolados de DNA vegetal. Um exemplo de genes Ast de um cultivo que não a batata são os genes Ast de trigo mostrados em SEQ ID NO.: 34 e 35. O silenciamento simultâneo desses genes no grão de trigo tornará possível reduzir os níveis de asparagina na farinha e, conseqüentemente, os níveis de acrilamida em, por exemplo, pães, biscoitos, cookies ou bolachas.

Em vez de usar fragmentos dos genes Ast para a produção de uma construção silenciadora, é possível empregar os fragmentos obtidos dos promotores dos genes Ast. Esses promotores podem ser isolados por meio da aplicação de métodos como PCR inverso, e duas cópias de fragmentos específicos do promotor de 150-600 pares de base podem então ser inseridos como repetições invertidas entre um promotor e um

20 terminador ou entre dois promotores com orientação convergente (ver: Rommens e colaboradores, pedido de patente mundial 2006/036739 A2, o qual está aqui incorporado por referência).

Exemplo 2

Sobreexpressão dos Genes de Asparaginase

Este Exemplo demonstra que a sobreexpressão de um gene en- volvido no metabolismo de asparagina nos tecidos ricos em amido do cultivo diminui a quantidade de asparagina nesses tecidos e, conse- qüentemente, reduz a quantidade de acrilamida no alimento obtido pelo aquecimento desses tecidos ricos em amido.

A seqüência do gene de asparaginase (Asgl) da variedade Ranger Russet de batata é mostrada em SEQ ID NO.: 9. O referencial aberto de leitura correspondente e a seqüência de aminoácidos esperada são mostrados em SEQ ID NO.: 10 e 11, respectivamente. Um vetor binário contendo o gene Asgl inserido entre o promotor Agp e o terminador Ubi3 (SEQ ID NO.: 12) é designado pSIM658 (Figura 1C).

Os níveis de expressão do gene Asgl em tubérculos foram de- terminados por meio da aplicação de PCR de transcriptase reversa em tempo real quantitativo. A Tabela 3 mostra que 18 dos 25 tubérculos de plantas pSIM658 superexprimiram o gene Asgl cerca de 2 a 20 vezes. Esses tubérculos foram usados para produzir batatas fritas. As análises químicas demonstraram que as fritas de duas das linhagens transgêni- cas continham níveis reduzidos de acrilamida (Tabela 4).

É possível empregar também outros promotores específicos de tubérculo para controlar a expressão do gene Asg 1. O plasmídeo pSIM757 contém o promotor Gbss ligado operacionalmente ao gene Asgl. A transformação da batata com o DNA de transferência desse plasmídeo produz plantas resistentes à canamicina que superexpres- sam o gene Asgl. Outros promotores que podem ser usados para controlar a expressão de asparaginase em tubérculos de batata podem ser selecionados do grupo que consiste dos promotores de patatina, promotores induzidos pelo frio e promotores flavonóide-3'- monooxigenase (Fmo). Um promotor Fmo é mostrado em SEQ ID NO.: 13. Esse promotor está ativo em tubérculos semimaduros e maduros, mas não em minitubérculos.

Em vez de usar Asg 1, é também possível explorar outros genes de asparaginase. A SEQ ID NO.: 14 mostra a seqüência de cDNA do gene Asgl alternativo de batata. Outros exemplos de genes de asparagi- nase incluem o gene de asparaginase de B. coli (número de acesso Z105Im; SEQ ID NO.: 31), Agrobacterium (número de acesso Atu3044; SEQ ID NO.: 32), cevada (número de acesso AF308474; SEQ ID NO.: 33), e qualquer gene que codifique uma proteína com o motivo pfam01112.12 (Marchler-Bauer e colaboradores, NucleicAcids Res 33, D 192-6, 2005).

A seqüência do gene de asparaginase do trigo é mostrada em SEQ ID NO: 15. A seqüência de aminoácidos esperada é apresentada em SEQ ID NO: 16.

Para qualquer gene de asparaginase, pode haver outras seqüên- cias de asparaginase com um alto grau de similaridade de seqüência. Por exemplo, um gene de asparaginase de origem vegetal pode ser identificado por uma busca em um banco de dados como o mantido pelo NCBI.

Após a identificação de um gene de asparaginase vegetal, inicia- dores específicos do gene são produzidos para a amplificação por PCR do gene de asparaginase. A amplificação por PCR é realizada de acordo com os métodos conhecidos na arte e então o gene da asparaginase amplificado por PCR é clonado em um vetor de clonagem.

A asparaginase está ligada operacionalmente a um promotor es Λ λ.

pecífico de semente, como o promotor do gene de puroindolina de trigo mostrado em SEQ ID NO: 17. Um DNA de transferencia contendo o cassete de expressão resultante é introduzido usando métodos conven- cionais de transformação para a produção de trigo com baixa asparagi- na. A farinha originária da semente desse trigo acumulará menos acrilamida durante o aquecimento.

Exemplo 3 Sobreexpressão de Glutamina Sintetase A sobreexpressão do gene de glutamina sintetase resultará em níveis reduzidos de asparagina. Qualquer seqüência que codifique uma proteína com atividade de glutamina sintetase pode ser ligada operacio- nalmente a um promotor que é expresso no órgão desejado da planta, como um tubérculo de batata. A batata contém três genes de glutamina sintetase relacionados, mostrados em SEQ ID NOs.: 28-30. Um segmen- to de DNA contendo um fragmento de cada um desses genes pode ser usado regular negativamente de maneira eficaz a atividade a atividade da glutamina sintetase. Com esse propósito, pelo menos uma cópia do segmento pode ser inserido entre dois promotores convergentes ou entre um promotor e um terminador. O cassete de expressão resultante pode ser introduzido na planta de interesse por meio de qualquer método de transformação. Pode-se então selecionar as plantas transgênicas que produzem órgãos com baixa asparagina. O processamento por calor desses órgãos fornecerá produtos que contêm menos acrilamida do que produtos obtidos do correspondente. Por exemplo, um tubérculo trans- gênico processado produzirá batatas fritas que contêm níveis mais baixos de acrilamida do que as batatas fritas obtidas de tubérculos não transformados. O resultado da sobreexpressão de glutamina sintetase nos níveis de asparagina foram descritos por Harrison e colaboradores (Plant Physiology 133: 252-262, 20.03). Entretanto, esses autores não 4 ΐ-Μ 67/81 ^

poderiam ter antecipado as conseqüências inesperadas de níveis reduzidos de asparagina em um acúmulo fortemente reduzido de acrilamida por indução de calor.

De maneira similar, é possível regular negativamente a expres- são de um gene endógeno que apresenta atividade de nitrato redutase. Com esse propósito, pelo menos uma cópia de uma parte do gene ou promotor de um gene de nitrato redutase pode ser expressa. As plantas transgênicas podem ser tríadas pelo nível de expressão do gene de nitrato redutase e as linhagens que apresentam níveis reduzidos podem subseqüentemente serem tríadas para níveis reduzidos de asparagina. Também é possível silenciar um gene de hexose quinase e aumentar os níveis de ácido aspártico ao mesmo tempo em que se reduz os níveis de asparagina. A correlação entre sobreexpressão dos genes de nitrato redutase e de hexoquinase com os níveis aumentados de asparagina foram descritos previamente (Roland e colaboradores, Armu Rev Plant Biol 57: 675-709, 2006; Szopa, Biochem Soc Trans 30: 405-410, 2002). Entretanto, os autores não anteciparam a abordagem oposta para reduzir os níveis de acrilamida em alimentos.

Obviamente, há outras estratégias para modificar os níveis de asparagina em plantas por meio da expressão de genes que estão direta ou indiretamente envolvidos na síntese ou no metabolismo de asparagi- na. Nossos resultados sugerem que qualquer um desses métodos pode ser usado para produzir alimentos com baixa acrilamida.

Exemplo 4

Expressão Simultânea Regulada Negativamente

de Genes de Degradação de Amido e Biossíntese de Asparagina

Este Exemplo demonstra que a expressão simultânea regulada negativamente de genes envolvidos na degradação do amido e na biossíntese de asparagina, respectivamente, em tecidos ricos em amido de um cultivo pode diminuir o acúmulo de acrilamida em um alimento obtido a partir do aquecimento desses tecidos ricos em amido.

As plantas transgênicas que produzem tubérculos com níveis baixos de açúcares redutores e asparagina foram geradas em duas etapas. Primeiro, as plantas foram transformadas com o P-DNA do vetor binário pSIM371. Esse P-DNA contém duas cópias de um polinucleotí- deo contendo fragmentos dos genes PPO (SEQ ID NO.: 18), Rl (SEQ ID NO.: 19), e phL (SEQ ID NO.: 20), inseridas como repetições invertidas entre o promotor Gbss e o terminador Ubi3.

Uma cepa de Agrobacterium contendo tanto pSIM371 quando o vetor LifeSupport pSIM368, que contém cassetes de expressão para ambos os genes nptU e codA inseridos entre as regiões terminais de um T-DNA, foi usada para infectar 21.900 explantes de caule de batata. Após um período de co-cultivo de dois dias, os explantes infectados foram submetidos a um tratamento com canamicina por cinco dias para selecionar a expressão transiente do gene nptll Para impedir a prolife- ração de células contendo T-DNAs integrados de maneira estável, os explantes foram subseqüentemente transferidos para um meio conten- do 5-fluorocitosina (5FC). Esse produto químico é convertido em 5- íluorouracil (5FU) tóxico pelo produto do gene codA (Perera e colabora- dores, 1993). Um total de 3.822 brotos que sobreviveram a dupla seleção foram genotipados para a presença do P-DNA e ausência de qualquer DNA exógeno tanto do T-DNA quanto do arcabouço do plasmí- deo. Essa análise identificou 256 brotos de DNA todo nativo (intragêni- co), as quais permitiu-se desenvolverem raízes, para então serem plantadas em solo e cultivadas por seis semanas em câmaras de cres- cimento. Para triar atividade PPO, uma solução de catecol foi pipetada nas superfícies cortadas dos minitubérculos de aproximadamente 2 cm.

20 Quarenta e oito linhagens que tiveram o escurecimento induzido por catecol do tubérculo inibido foram cultivados na estufa por três meses até produzirem tubérculos semimaduros que foram testados bioquimi- camente para níveis residuais de atividade PPO. Essa análise demons- trou que o emprego da construção de silenciamento do gene PPO diminui a atividade PPO em cerca de 90%. Tanto as 48 linhagens intragênicas quanto as plantas controle não transformadas Ranger Russet e Russet Burbank foram subseqüentemente propagadas e cultivadas no campo em Idaho, Aberdeen.

Os tubérculos maduros de todas as linhagens intragênicas e controle foram analisadas quanto aos níveis de glicose após três e seis meses de armazenamento a frio. A maioria das linhagens (43) apresen- tou uma maior redução de adoçamento induzido por frio (-60%) do que a obtida com as linhagens controle que tiveram apenas um dos genes associados ao amido silenciados. As batatas fritas derivadas dos tubér- culos silenciados das plantas 371-28 e 371-38 continham menos de um terço da neurotoxina acrilamida acumulada nas fritas controle (Tabela 4). Essa redução foi antecipada porque a acrilamida é em grande parte oriunda das reações induzidas por calor entre o grupo carbonila dos açúcares redutores e a asparagina (Mottram e colaboradores, 2002; Stadler e colaboradores, 2002).

As características sensoriais das batatas fritas modificadas fo- ram avaliadas por um painel de oito indivíduos treinados profissional- mente. As batatas fritas oriundas dos tubérculos da Ranger Russet modificada apresentaram uma melhor aparência visual do que as fritas da Ranger Russet ou Ranger Burbank. Além disso, as fritas intragêni- cas apresentaram um aroma significativamente melhor quando sentido pelo epitélio olfativo, que é localizado no teto da cavidade nasal. Uma tendência similar foi observada para os tubérculos que haviam sido armazenados por 10 semanas a 4°C. De fato, as linhagens intragênicas 371-28, 30, 38 e 68 armazenadas no frio atingiram ou ultrapassaram os atributos sensoriais das variedades não transformadas frescas.

Uma linhagem de batata com baixo açúcar foi retransformada com pSIMl 148. Comparadas com as batatas fritas das plantas pSIMl 148 originais, as fritas dos duplo transformantes resistentes à canamicina apresentarão geralmente níveis mais reduzidos de acrilami- da. Assim, os duplo transformantes produzem tubérculos que podem ser usados para obter fritas que (i) contêm níveis reduzidos de acrilami- da e (ii) apresentam características sensoriais melhoradas.

Exemplo 5

Métodos de Transformação de DNA Todo Nativos para Reduzir Tanto os Níveis de Asparagina Quanto de Adoçamento Induzido Pelo Frio em Tubérculos de Batata

Este Exemplo descreve o emprego de métodos de transformação de DNA todo nativos para reduzir tanto os níveis de asparagina quanto de adoçamento induzida por frio em tubérculos de batata. Os alimentos processados obtidos desses tubérculos conterão níveis reduzidos de acrilamida.

O DNA de transferência usado para transformação contém dois cassetes de expressão inseridos entre as regiões terminais oriundas de batata é mostrado em SEQ ID NO.: 23 (Figura 2). O primeiro cassete consiste de duas cópias de um segmento de DNA contendo fragmentos de promotores dos genes Ppo (SEQ ID NO.: 24), PhL (SEQ ID NO.: 25) e Rl (SEQ ID NO.: 26), inseridos como repetições invertidas entre um promotor do gene Agp funcionalmente ativo e o terminador do gene de ubiquitina-3. 0 segundo cassete consiste de duas cópias de um seg- mento de DNA contendo fragmentos dos genes Astl, Ast2 e Ppo (SEQ ID

NO.: 27) inseridos como repetigoes invertidas entre dois promotores do gene Gbss funcionalmente ativos e orientagoes convergentes

Um plasmideo contendo tanto ο DNA de transferencia quanto ο cassete de expressao para ο gene de isopentenila transferase (ipt) e introduzido na Agrobacterium LBA4404, e a cepa resultante e usada para transformar variedades de batatas, como Ranger Russet e Atlantic, por meio de metodos de transformagao sem marcadores (ver: Craig Richael, "Generation of marker-free and backbone-free transgenic plants using a single binary approach"，Pedido de Patente Provisorio 60/765,177, que e aqui incorporado por referenda). Permite-se que as plantas transformadas que nao apresentam um fenotipo de citocina, descrito como tendo ο crescimento interrompido e sendo incapaz de desenvolver raiz, produzam tuberculos. Os tuberculos de algumas das linhagens apresentarao niveis baixos de atividade da enzima Ppoj como pode ser testado pela pipetagem de 0,5 mL de catecol 50 mM nas superficies recem-cortadas de tuberculos. Os niveis de atividade da enzima Ppo podem ser determinados de maneira mais precisa mistu- rando-se tuberculos pulverizados (1 grama) por 1 hora em tampao de acido propano-sulfonico 3-(N-morfolino) 50 em pH 6,5 (5 mL). Apos a precipita^ao da fragao solida, a mudanga de OD410 pode ser determi- nada com ο tempo. As linhagens de tuberculo que contem menos do que 25% de atividade da enzima Ppo serao testados ainda mais por meio da incubagao dos tuberculos a cerca de 4°C. Apos pelo menos um mes, os niveis de glicose podem ser determinados, por exemplo，usando ο reagente glicose oxidase/ peroxidase (Megazyme, Irlanda). As linha- gens de tuberculos que apresentam niveis de atividade de Ppo reduzidos em mais de 75% e uma adogamento induzida por frio reduzida em mais de 50% podem ser analisados quanto aos niveis de asparagina livre. Se

os niveis de asparagina livre foram reduzidos por cerca de mais de 50%, os tubérculos podem ser processados e analisados quanto aos níveis de acrilamida. As linhagens transformadas que não contêm níveis baixos de asparagina, além de baixa Ppo e baixo adoçamento induzido pelo frio, podem ser usados o aumento de volume (bulk up) e produção comercial. As batatas fritas oriundas de tubérculos das linhagens desejáveis contêm menos açúcares redutores, tornando possível reduzir o período de cozimento e preservar o sabor original da batata. Além disso, sua aparência visual é melhorada pela ausência de depósito de açúcar (sugar ends) e manchas negras (black spot bruise). As batatas fritas também têm um aroma melhor e acumulam menos níveis de acrilamida, como pode ser determinado por painéis sensoriais treinados para avaliar fritas por características sensoriais.

Examplo 6 Tilling

Os genes envolvidos na biossíntese de asparagina, como a aspa- ragina sintetase, também podem ser regulados negativamente por meio de mutação. Um método para obter esse objetivo é chamado de 'mirar lesões locais induzidas em genoma' (Tilling). Esse método combina a eficiência da mutagênese induzida por etil metanosulfonato (EMS) com a habilidade da cromatografia líquida denaturante de alta desempenho (DHPLC) de detectar mudanças de pares de base para análise de heteroduplex. O método gera uma vasta gama de alelos mutantes, é rápido e automático e é aplicável a qualquer organismo que pode ser mutagenizado quimicamente. No método básico de TILLING, as semen- tes são mutagenizadas por tratamento com EMS. As plantas Ml resul- tantes são autofertilizadas e a geração M2 de indivíduos é usada para preparar amostras de DNA para triagem mutacional, enquanto suas sementes são inventoriadas. As amostras de DNA são agrupadas, dispostas em microplacas e submetidas a PCR gene-específico (McCal Ium e colaboradores, NatBiotechnol 18: 455-457).

Há várias alternativas ao tilling. Por exemplo, é possível empre- gar diferentes tipos de mutágeno, como nêutrons rápidos ou diepoxibu- tano (DEB). Todos esses métodos podem ser associados a plataformas de genética reversa que permitem a triagem e o isolamento de mutantes para genes pré-selecionados. Os métodos foram descritos em detalhe em, por exemplo, Wang e colaboradores, Floriculture, Ornamental and Plant Biotechnology, Volume I, 2006, Global Science Books.

Além disso, é possível simplesmente triar o germoplasma dispo- nível para um fenótipo de baixa asparagina. Assim, cruzamento vegetal molecular, cruzamento mutacional e seleção de linhagem proporcionam métodos que tornam possível obter variedades de 'baixa asparagina'.

Exemplo 7 Reduzindo os Níveis de Asparagina Os níveis de asparagina podem também ser reduzidos modifi- cando-se as práticas de cultivo. Por exemplo, o gene da asparagina sintetase é suprimido por carbono (Koch KE. Carbohydrate-modulated gene expression in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol 47:509- 540, 1996). Também é possível reduzir o acúmulo de asparagina reduzindo-se a razão de nitrogênio/enxofre no solo. Os níveis relativa- mente baixos de nitrogênio resultarão em concentrações reduzidas de compostos ricos em N e em um aumento dos metabólitos contendo S, como cisteína, glutationa e S-adenosilmetionina. Dessa maneira, os solos que contêm C relativamente alto, S relativamente alto e N relati- vamente baixo podem ser usados para produzir alimentos com aspara- gina relativamente baixa.

Tabelas Tabela 1

Niveis de Asparagina em Tuberculos de Linhagens de Batata Crescidas em Estufa com Tres Meses de Idade

Linhagem Nivel de Asparagina (mq/100 a) Ranger Russet nao transformada 1 150 Ranger Russet nao transformada 2 130 Ranger Russet nao transformada 3 100 Russet Burbank nao transformada 1 230 Russet Burbank nao transformada 2 210 Controle transgenico resistente a canamicina 1 200 Controle transgenico resistente a canamicina 2 220 Controle transgenico resistente a canamicina 3 110 Controle transgenico resistente a canamicina 4 200 Controle transgenico resistente a canamicina 5 130 Linhagem transgenica 1148 1 160 Λ ^Ιχ

Linhagem transgenica 1148 3 90 Linhagem transgenica 1148 4 70 Linhagem transgenica 1148 5 150 Linhagem transgenica 1148 6 80 Linhagem transgenica 1148 7 70 Linhagem transgenica 1148 8 80 Linhagem transgenica 1148 10 110 Linhagem transgenica 1148 11 160 Linhagem transgenica 1148 13 80 Linhagem transgenica 1148 14 210 Linhagem transgenica 1148 15 110 Linhagem transgenica 1148 17 50 Linhagem transgenica 1148 18 90 Linhagem transgenica 1148 19 80 ----__

Linhagem transgenica 1148 21 60 Linhagem transgenica 1148 22 170 Linhagem transgenica 1148 23 80 Linhagem transgenica 1148 24 80 Linhagem transgenica 1148 25 90 Linhagem transgenica 1148 26 80 Linhagem transgenica 1148 28 310 Tabela 2

Níveis de Acrilamida em Batatas Fritas Obtida a Partir de Tubérculos de Linhagens de Batata Crescidas em Estufa com Três Meses de Idade. Os níveis foram determinados de acordo com United States Food and Drug administration, Center for Food Safety and Applied Nutntion Office ofthe Plant Ss Dairy Foods and Beveragesi "Detection and Quantitation of

Acrylamide in Foods" (2002).

Nível de Acrilamida (partes por bilhão)

Linhagem

Ranger Russet não transformada

2

126

Controle transgênico resistente à canamicina 1

127

Linhagem transgênica 1148 7

46,6

Linhagem transgênica 1148 17

<20,0

Linhagem transgênica 1148 19

<20,0

Linhagem transgênica 1148 21

38,6

Linhagem transgênica 1148 24

23,1

Tabela 3

Níveis de Expressão do Gene de Asparaginase-I em Tubérculos de

Batata de Linhagens de Batata Crescidas em Câmara com Seis Semanas de Idade Determinados por RT-PCR Quantitativo

em Tempo Real

Linhagem Expressão Relativa Brro Padrão Controle transgênico resisten- te à canamicina 1 22,4 8,8 Controle transgênico resisten- te à canamicina 2 8,9 4,2 Controle transgênico resisten- te à canamicina 3 23,7 4,2 Controle transgênico resisten- te à canamicina 4 27,5 3,4 Ranger Russet não transfor- mada 1 22,4 8,8 Linhagem transgênica 658 1 101,6 13,4 Linhagem transgênica 658 2 58,8 8,1 Linhagem transgênica 658 3 912,9 57 Linhagem transgênica 658 4 165,9 52,1 Linhagem transgênica 658 5 75,8 6,3 Linhagem transgênica 658 7 101,2 10,7 79/81 ^^^ Linhagem transgenica 658 8 289,3 59,6 Linhagem transgenica 658 9 99,0 9,8 Linhagem transgenica 658 11 92，1 8,2 Linhagem transgenica 658 12 85,9 29,2 Linhagem transgenica 658 14 390,2 5,0 Linhagem transgenica 658 15 57,9 8,0 Linhagem transgenica 658 16 8,4 1，7 Linhagem transgenica 658 17 64,7 4,2 Linhagem transgenica 658 18 112,1 21,8 Linhagem transgenica 658 19 196,7 46,6 Linhagem transgenica 658 20 101,9 31,2 Linhagem transgenica 658 21 58,3 3,7 Linhagem transgenica 658 22 81,4 20,5 Linhagem transgenica 658 23 85,7 17,8 Linhagem transgênica 658 24

281,0

Linhagem transgênica 658 25

Linhagem transgênica 658 26

229,0

110,7

63,7

67,1

16,2

Linhagem transgênica 658 27

220,3

66,9

Linhagem transgênica 658 28

151,1

17,5 81/81 ,§> % Tabela 4

Níveis de Acrilamida em Batatas Fritas Obtidas a Partir de Tubérculos de Linhagens de Batata Crescidas em Estufa com Três Meses de Idade

Linhagem Nível de Acrilamida (partes por bilhão) Ranger Russet não transforma- da 1 1150 Ranger Russet não transforma- da 2 1200 Russet Burbank não transfor- mada 1 958 Russet Burbank não transfor- mada 2 1230 Linhagem intragênica 371-28 1 211 Linhagem intragênica 371-28 2 281 Linhagem intragênica 371-38 1 152 Linhagem intragênica 371-38 2 184 SEQ ID NO: 2 (Sintetase 2 da Aspargina)

CACTT TTC TCGATIT CAG&AGAAG CÍ3AGAARA^JÍÍ3TTGCGA(3CÃATGTGTG gaatacttgcaattttçg

GTTCCACTGATAATTCTCATâCC^

GACCTQATTGGAGTGGATíGCATAGCXlATGAGGACTCr^

ACCCAACTTCAÍ^GATCAGCCGCT

TCTACAACCATAAGGAAT"Í*ACGG GIAGA^

ÍTAITGCCC&TCTTTATGAAG^

TTCrTCTTQATACCCGSGATAAAAGTOCATa^^

TXSGGGTGGGGTOTTGATGGOTCCATATGGTTTTCCTCAGAGA 2/20. SEQ ID NO: 3 (Fragmento Astlj

SEQ ID NOs4(Fragmento Ast2)

SEQ ID NO: 5

TCftTAWaTQTftSAftfi^TSGm-OCÔW^CC^TOGTC^^ «eCMX^TAAATAT^^ TCrcAGGAAAACCATATC^^ ^^£AGCGATGIA^CT7TTATCCCX3GGTATCAA(^^

TGAÍ^TTCOAACTCTTTATCC^AAATGGTACrrcTAGCTTCT TGCTCTTAAAC^GTC^TACTGGTGARGCGCTlTrATCTTGCGACA

CTTCACTCCTAGTG&TTTAATOTACÍ^ ATCATACG!TCK^ATATC^TATATAACATCTT<^TAGCAT^ CTCGT<KTOAACGGrTCCTAAAAAGTCAGCAACTTCTTTTGC^ A 3/20

SEQ ID NO: 6

SEQ ID NO: 7 (PsAgp)

ATATTGATAAACCAATAACTTTTTTTATTCGG

TccnmrrATCGrrrTGAGAACC/u^

TATCTC^TGRTAA1TGATTTCCAAC&TGTAT&AT^^

TTACG CTTCCCTTTTTTCTTTTGC&GTCGT ATGõiW QAGGCATTCCCG I-GCCTT

CAG AGACQGAGCTGCTTCACAAGGAGGGdGT TGTTGTAC ITGWiAATG C^CZiTTTATTGTTC

.titSÁftfcCÇTArç^

'fTGTTCCTT2TAATGAMGGA?AATATCTGTGC7^^

TTTGCATiI TTCTGt1 TX^TGGAGTTGTC^AATG™GAATTTATTrCATAGCAT3T3AGTT TCCTCTCC T? T TTCATSTGCCCrreGGGCCTT<K!ATGTTTCTTG^^

A&TGGCÀCACCG C TCGGCTCGTGG AAAGAGTA7GGTCAGTOTCAT TGATAAG TATTTACTCG TATTCGG TG1I1TTACATCfiiAGT TRAThTGTT CAAACACATG TGATATCA-TACATGC ATTAC3TTA?M3 TATAAATGCCA

TGCftC^ATTTGAT TAAG AATAAATAAAC GATG TGTAAT TTGAAAACCAATTAGAAAAGAAGTATG ACGG

GATyGATGTTCTGSGAAATCACTGGTAAATTGGA^

CAACA?G<Xm:TT?AGTCATCATCATTATGra^

TTt^GAARGTC^CAGCATAGTATA&ACT^^

TTTGTCATTTÍ^TTTCCTer^

CA&TTTATTrrCTCACTAATAAT!^^

ATTCTCT CAAGCG CATGTGATC ATAC C^ATTATTTAAATACAAAAAATCTT GATTAJy^CAATTCAGTTT

CTCACTAATAATCAC&TTCAATCATCAAOMTO

CGCATGTGATCATACCMTTATTTAAATAC/m^

TCAC&TTTAATC&TCAACfíGCT

ATATCFAACTCTCGTGCAAACAAGTGAAft TGACGTTCACTAATAAATAATCTiTrIGAATA CTTTGTTC A GTTTAATTTATTTAATOTAT^^ TTA&ATATATC&MATATCTTTTA&TTTTATITTTGAAÍ^^ GTAACTGTTm^AA&MTtóTG^^

CTAAST ACAA^GTCATMTTC^TCCCCAAAATAGCCTC^^

TACCCTCAATCACAAG ACGtKSTGTACCAATCATAC CTATGGTC CTCTC GTAA&TTCCGACAAAATCAGG

TCTATAAAGTTACCCTTGAmTCAGTATTATAAAAC^AAAAATCrrCAGCTGTAA

ACTCTACCACACACTCTCTACTAGAâAGATGAGTTGATAACAAGCTTGTTAACG —---C-JS ■ 4/20

SEQ ID NO: 3 (p:Gbss)

SEQ ID NO: 9 (Asparàgínasé-1)

ÃT^^5\^CTArAGCG'I^GCACG<^eAGCTGGTOACATACCCAAGSATCTGCCOCCOGaGCrTCGT GAGCCCAGAGAAGCCTCTOTCGCTArrGCrrACAí^T^

C ClTTGSACGI^fGTTGAACrC<3TGG TATAOACTTACCAAC TTTACCTATCATAT CTT AAAGTATAOAA TGTAGGATTTTG CCT TGCATCTGTTCMTT TCTCAT CAAGACTCGCGATGGATAT CAC TTGTTA CCATG ATTAGAGGAAAAAATATOGGTtTGACTCMTTrCTCT TTGTTTACTTGTTTTTCTATTAGTACTATGm

TTTATCTATGGCTTATQAAATftAT T GMlTT ACTGG ATGT CTASYAATTT CATQGATCrACATGACATCA

ACTATAAAAflCTTCTGCAAGTTGQJtôTO

TCTATTXoatcctctgaoattkagtiogagit^

TCCCTRM»TCrrCftCC^^

CTCCCTGCTTrAGTTTTTCTTACAAACACA^Cre

TCCATATATCTCGCGTAGAAArcCTCCTGA^^

TTFITTATTTrACCTTTTACT^TATTGlV^

TAGAAAATAACCCATACTTCAATGCTGGTAGAGGGTCTGTCrr^

AAGCATGCATCATGGATGGKi·^

CTATATCTCTGGC TAGGCTGGT CATGGAAA&AAC TCCACAT&TATATCTTG CATTXGAGGGAGCG GAAG

C&TTTGCGAGGGAGCAGGTCrGTAAAAATC

ACGTTAAGAAAGTTATTGAAGTACTCAATGCTia^

AAAGÂCTTGACGG&T TATTCTCTCTGTTAATACfGT TTAATTACAGTTCTAAT TT CTG ATGGTCTGTTT

ATG GACT TCAAGCAG-CTACCASTTTCTCTAAGTTT TTCTGGTTA&TTAATGTG AC CTTTCTG GCATACK3

TGACTAATTCATTTTAAACfTACT

GTATrATaTTCATTOriCTM^

CAfcGGCXWTJFGftAAOTACGGÃCTCAAGCC&TTTTATC

aWUKSMOCfcAfiCAfcAGTCC^^

ATATTCATGCTTTTGGCXrrTGATATTGAT^ ,5720 SEQ ID NO: 10 (cDNA Asparaginase-I)

MXMMTOGeCTATAGC^

C&GCCCAÍ^A^CCOTOTCOT CCTOTGGACGTTGTTGAACTCGT^TGCGGG^ OTGTCTOMCAGC^rSGCAM GGttKTCTTTCTGGCXraAC^^

CCACflTATATATCTTGCATTTGAGGGASCGGAAGCATI''rG CGASGGAGCAG GGKGtITGAAft CCACG'3AC TCAftflCClVrTTrATCACíK:^^

TGTGCAGTCTCTGCTACAGGCCAA<^TGAAGCTAY^ CTAATGGAGmTAAAGGGCWTCTCTCAAGG^

GGAACCACTGGCCI^T'IQC'^TATCGGCCACTGGGGAAGTTAGCATGCCA^TTAATACAACCÜGAAra TTTAGAG ÇTTGTGCA&C TGAAGAÍTGG TCACACAGMlTAGCAATTTG GTAACTTTTC&TTAGA&TAGAT TAG

SEQ ID NO: H (Proteína Asparaginase-I)

SEQ ID NO: 12 (ubiT) TTGCTATATGH3ATTTT(X3 TTTTTGATGYATGTGACftACO GAGTrTWGOTATrOTrCTCGTCTAOOTGGATATCAAí CG TGTTÃAATG T TCAACACACTAGCAAt TTSGCTGCA<3 O

SEQ ID. NOi 13 (PsFmo)

TTTTOGTAAAC 'CAATAATCGG-AAACATAGTCCAATTAOGTC

'AA

CrrACAATTATCTCr^ATTTCAAATTG^CAAQTAAAAACA^^

fiTATAGTOGATCAaTT<3TTCTl-ATACAAAT

TCACTCTAATATTACAAACTTACAAATIl-GAAGTTT.

•AAAQATTTATCAGTTCAAATTTCATQATTTTTC SEQ ID NO: 15 (Asparaginase do trigo)

GC<3CHXKlACGTCGTGGAGGCCC?iX^TGCGGGAGCTG0AGACGGACCCCTGC^

GGCGCOTTCTCCG^^^ ^^CTTCATCA^

GCCGTGTCCGGC^CCGGC^GGTC3QCGTAC<K3GTTC^CTGCACCGC<^ SEQ ID NO: 16 (Asparaginase do Trigo)

ID NO: 17 ( Promotor da Puromdolina do Trigo)

ATTGGAGATGTTCATATTTTT1;

aas^^cttgaatito^

IThGhTTMS TC3TF7C3 AG C?OTAAAQ TGAAT

): 16 I SEQ ID NO: 19 (Rl)

SEQ ID NO: 20 (PhL)

SEQ ID NO: 21 (P:ubi7)

____HiCQACTGACTTTTTTTTTTTTATCATAAGAAAATA

aattattaactoaacctaataaaacacxaatataatttc^

vtatattap^taaaaaaatacctaaaa^AAA

rACATYTTTCTCGGTTTTTCTAAAGOAGCGTG

CT^TrrcTATmTxxTTTcrcT^r^nw

TtraTcacGTaGsosio

.TCiacasasscTTaTCTTCGCCGGM, 'CTacccrccAMítítíTgc SEQ ID Np: 22 (PiPatatina)

霞膽顺■職酸胁聊麵孤聊^^而爾卿 cm·膽壓cotgg·證霞麗mTOTC_瞧

卿職T^嫩從默卿舰侧取卿^^；^^^^叨丽鹏爾耽

咖隐τ鹏議臉酸匪TMOTrrcaM:_脑爾職 請撤赚c職rr霞麵職珊CffiCGATATA瞻卿雅蘭删而τ

細浦磁龍·霞而C^ttto爾纖而雷職猫^^瞻

CAAto而m職c_c腿霞職抓織腿TT贿GTCCC·膽 _爾撤而測™™TC騰聰Ϊ讀驅^aammctctctot

TO關TOGCCAmMAT綱卿職讀職爾膽辑腦·姑腿

鄉 C^ATCAWGTGASiTTTAT

ΑΟΤΤ^Τβ。舰龜 S^TG^ftM^c^謎^^^^ 耀 ^^聰雕 AWTOTC聽TOW聰OC酸舰m請贿隨龜·以磁打

TAAA2iACAATITGAACATTTGCaAAGQTACCGA

SEQ ID NOi 23 aaftagcgtgacat

AATTGACTTCTÇCAATCTTCAT·

TCCTGTaTGTGAATCAAT TAACC

acggttotgatttgttatgggatgtcãcgtggg2\aagtttgagatgc3\gccggcgtgggccccgtgaag

tagagcaatttgattggatgt': taaccii1cotctttttctttga']

PATrTGGTTAACATAAGAATTT

:aattattgattcacacacagg

aattaagtgtgttgtgttcggtcctcttgtggaaattaaatgtcaccctttttttatttatcaataa^

^taagaacaaatacaaaatatggtgca

.ctaagagtttttgcttattg ttctagttctctacgtgttaaatgttcaa

yctcaggaatttgagattttacagtctttatgctcattgggttgagtataatatagtaaaaaaatagga

attcgaac catgcatc tc aatcttaata ctaaaaaatqcaacaaaatt ctagtggagggaccagtac ca gtacattagatatta^^

ggtagcggtaggagggagttggttcagttttttagatactaggagacagaaccggaggggcccattgca

aggcccaagttgaaqtc c agccgtgaat c&acaaagag aqggc cc ataatactgtc gatgagcattt cc ctgaaacctgctacaaat^^

igattccccjttttgtagaccacacatcac ccgcggtf^tatggtgtagaaggaatgotttccgaaaaccatggtgggttgtaccatcttct ccatttt^cttgaataaata^accgggaagg^ 'GAAGTACAAGTAACC ITAATCTTACGCGA

íATÕCTATTGAAGATG

TTATATATCATATCGAGACGTATGATC5TAACAACAATAAGAGC CAGCACTCCTATGTTC CTTATGTCGC

ACW^TOATTCTC^^ SEQ ID NO, : 24 |P:PPO)

CTAGrA&TAC^GÃOÃTT&CTTACC AATtATCrETTCAAaSGCXMTGCT^

ATÍiGGTTG CTTATATGTTC TGTAATACTGAATATG ATGTATAACT AATAC ATAC AT TiiAATTCT C T AAT AAATCTATCAACAGAAGdCTAAGAGATTAACAAATACTACTATTATCCAGACTAAGTTATTTTTCTGTT TACTACAGATCCTTCCAAGAACAAAAACTTAATAATTGTATGGCTGCTATAC

SEQ ID NO. Í 25 (P:PHL)

CATCAAACCAMCAAIOTATAAGAAATAATACTTGCATAACTAATGCÃCGCACTACTAATGCAAGCATT ACTAATGCACCATATTTTGTATTTGTTCTTATACÃCTCTACC^^

AA7-rAAGTl'ACraGATTTyTGGGAAATGGACAAATATAAGAGAGTGCAGGGGAGTAGTCCAGGAGATTT'T

CGTGCTI^ATTGATAAATAAWJ^GGGTGACATTTAAOTCCACAAOAGGACCGAACACAACACACT TAATT C C TGTGTGTGAATCAtVTAATTGACTT CTCCAAT CTT C ATC AAT AAAAT AAT T CACAAT CCTCAC TCTC

SBQ ID HO. : 2,6 (P:R1)

AAA ATT CTT A.TGTTAAC CAAATAAAT TG AGACAAATTAATT CAG TTAACC AG AGTTAAG AG TAAAG TAC TATTGCAAGAAAATATCAAftGGCAAAAG AAAAG AT CATG AAAGAAAATAT CAAAGAAAAAGAACACGTT ACAATCAAACTCCCATAAAACTCCAAAAATMtó

ACTTCACGGGGCCCACGCCG<^TGCATCT'CAAACTTTCCCACGTGACATCCCATAACAAATCACCACCG TAACCCTTCTCAAAACTCGACACCTCACrCTTm-CTCTAraTTACAATAAAAl^

SEQ ID NO: 27 (G:PPO)

GAAAA r^ATTGGGCTÍATACCTTGCTTTAÍAT^ GGCTTCCATATCAATTATTCCAGGAAGCGGTAGGTGGCXS 15/20

SEQ ID NOr 28 (GSl)

TAGTCCCTTGACTTCAAAGATGTGGAGCTCTGTGGTGCTGAAGCAGAA

TG ATGTGCGCAGTAAATCAAGGACTATTTCAft AACC A GTCAftGGA^ RA

CTACGATGGATCAAGTACTGGACAAGCACCTGGAGAAGACAGTGAAGTCATTCTATATCCTCAGGCAAT

XüTlT^ACSGCX^ACCCTtííSACCTCACKsGTCCTCACTAClOTÍ^TGCIOGAGTGGAAAAGTCATTTGGCCG AGATATATCAGATCCTCACTACAAGGCTTGCCrGTATGCTGGAATTAACATTAGTGGTACTAACGGAGA

Gl

AGACCGCCGCCCAGCTTCAAACATGGACCCCTATGTTGTGACCGCATTACTTGCCGAAACTACTATACT

GTG G GAGC CAACCC TTGAGGC TGAÍVG CTCTTGCTG C C CAA AAG ATC TCATTGAAGGTTTAGAGTAATTG AGGGGAAATTGOTTCATCATAATCCTCTTAGAATTTATGAGATAAGTGCTGAAGCTTGTACCTTGT-rG

?TCC

TTCTCCAGATGAATCCATlTCTCTGAAATl'CCAATTGGTGTGATrTTTCCGAATTAAATCTTTGAACAC

GGAC T TCC AAGTGAGTAAAAGATGCATAAT CTCATGTACAAGC SEQ XD NO: 29 (GS2)

GGAI actggcercttgoatggcctattggt^

ctggaaaggcttttggacgcgatattgttgatgctc^ttacaaggcatgtatctatcccgggattaaca ttagtggtatcaacggagaagtgatgcctggacagtgggaat1tcaagttggtcc1tcagttgg cattg catcaggtgacgagttgtgggcagctcgrracattctcgagaggattacagagattgc-rggagttgtcg tgtcattcgaccccaaacctattccgggcgactggaatggtgcaggagcgcatacaaattacagtacca agtccaix^ggaatgagggagggtatgaagttatc^gaaggctattgagaagcttggacttaggcaca aggag cacattg cag catatggtgaaggc aatgaacgtcgtctgactg gaagacacgaaac ag c tgac a tcaacacgttcaaat^ggtgrtgcaaatcgtggtgcatccattcgtgtgggaagagacacggagaagg aaggc aagggatactttgaggacaggaggcctccatcgaacatggatccatacatcgtgacctctatga tcgcggagactaccctcctgtggaacccttgaacgcgtatgggatgaatattctcgggtgcaacatatg gagaaagaattgaatttcttaacagccctttcctcacatgtccttaagagagttatgtagctagtaatt ttgatatattatgttgttttctaagtttcaatttgtattgtactcagcaagcctgagttcattgccaaa atgatrtgscmtôttgttaawva^^

SBQ TD NO: 30 (GS3)

gatctaatafíagaatttcaacttcrag^gttatcatcatgtctcrgctttcagarcttatcaacgtca atctctcagatgatactcagaagatcattgctgaatacatatggati-ggtggatcaggcatcsgacatga ggagcaaagccaggactctccctggtccagtfactagtcctgcagaactacccaaatggaactatgatg gatí^gcacaggtcaagc1'cc1oüaüaagacag"i'gaagtgatcatatacccacaagcaatcttcaagg atccattcaggagaggcaacaatatcttggtcatgtgtgatgcctatactcctgctggtgagcccatcc c?.aca?iacaagaggcacgccgctgccaaggtcitctgccaccctgatgtggctgctgaggaaacttggt atggtattgaacaagaatataccttg ctgcaaaag gaggtcaactggcctcttggatggcccattggcg gttttcctggaccccagggaccatactactgtcgaactggagctgacaaggcctttggacgtgacarrg

tggacgcccattacaaggcatgtctctatgctgggattaatatcagcggaatcaatggtgaagtcatgc

cgggacagtgggaattcí^gtgggaccrrctgttggcatctcxgcasgtgatgaagtgtgggtagctc gttacattctagagaggatt-gcagagattgctggggtggtcgtgtcattcgaccccaagcctattccgg gcgactggaacggcgcaggtgctcacacaaattacagcaccaagtcgatgagggaagacggaggctata aaataatcttgaaggctattgagaagcttggcctgaagcacaaagaacacattgctgcatatggtgaag

aat gagc gtcotctcac^gg aaagc acgaaacafx^c aac atc aaca^ accgrggtgcatctgtcastgttggaagagacacagagaaggcaggcaagggatactttgaggacagaa ggccagcctcaaatatggacccatacgtcgttacctccatgatcgcagaaaccaccatcatcggttaac cttgaagacattttactatggatggctcgqgggatcgcttgtttctggtttgcacaatttgggatagga gaaaagattgaattgtgaaac^accctttcgacttcacctgtgttaatttttagttataggggtagatt gtctcttgttatrrriotgtttatttgccagstgaattgtattttcatacagcaaggccrratacarrg tctatg/^tttggc^atgctgtgttacaaaacaatgttattcttattaataacaaagataatgaaagggt ttgattctattgctcattgcact Siig ID NO: 31 (Gene da Asparaginase a Partir da E. Coli)

atgggcaaagcagtcattgcaattcatggtggcgcaggtgcaattagccgcgcgcagatgagtctgc^a C

AGGAATTACGCTACATCGA.GGCGTTGTCTGCCATTGTTGÍ^GCGGGCAGA?^1^CTGGMGCGGGCG A

aagtgcgctggatgtggtgacggaagcggtgcgtctgctggaagagtgtccactgtttaacgccggaat T

ggcgc c^tctttacgcgi^atgaaacgcaix^ctggacgcgtgtgtoatggatggtaacaccctgaaa

G

ccggtgcggtggcgggcgttagtcatctgcgtaatccggttcttgccgcccggctggtgatggagtaaa

G

cccgcatgtgatwrgattggcgaaggggcagaaaattttgcgtttgctcatggcatggagcgcgtctc A

ccggagattttc-rccacgcctttgcgt-ratgaacaactaatggcagcgcgcgaggaaggggcaacagtc c

tcgaccatagcggtgcgccactggatgaaaaacagaaaatgggcaccgtgggggccgtggcgttggatt

T

agacggcaatctggcg<k^gccacgtccacgggcggaatgaccaataaattacccggacga6ttggcga

T

agccccttagtgggtgccggatgctacgccaataacgccagtgtggcggrrfcttgtaccggcacgggc

G

aagtcttcatccgcgcgctggçggcatatgacatcgccgggttaatggattacggcggattaagtctcg

C

ggaagcctgcgagcgggtagtaatggaaaaactccctgcgcttggcggtagcggtggcttaatcgctat

C

gaccatgaagggaatotcgcgctaccgtttaacaccgaaggaatgtatcgcgcctggggctacgcaggc

G

atacgccaaccaccggtatctaccgtgaaaaaggggacac<mrtgccaqacagtga

SSQ ID MO: 32 (Gene da Asparaginase a Partir de Agrobacterium)

atgacgaagatcgcactggccattcacggtggttgcggcgtgatgccggaagacagcatgacggcggcg g

aa^ggccgcggcccgtgaagatctggc^gcagcgctgcgggccgottatggcgtgctgaaggcgggcg

G

aacagcgctc^aggccgttgaggcagcggtcgtcgtcamgagqacagcccggacttcaatgogggaca

C

ggggcggcgctgaacgaaaac^cattcacgaactcgatgcctcgatcatggacggg(x:cacgctttcg

G % 18/ 20

CAGGCGCGATCAGCeCATCGCGCGCCATTCGCAATCCTaTQAACGCaaCCCGCGCACTGA'.raGTGOATG A

ACGGGCÍ3GTCTAroC^CMAGAGGCT0CGGATCaCTTtGCCACGGftG^GGTCTCGCCACCGÍUiCC

T

C^TCCTATTTCACCACGCAAAAACGCCTCGAGGCA^

A

CGGAAGCGACGGAAAATOAAAAGCACGGAACCaTCGGCGCGQTGGCGCTCGATGCGGCGGGGCACCTTG C

TGCGGCCACCTCAACCGGCGGCTATACCAACAAGCCGGATGGCCGGGTGGGCGACAGCCCCGTGATCGG C

GCCGGCACCTATGCGCGCGACGGCGCCTGCGCGGTCTCCQGCACCGGCAAGGGTGAGTTTTTCATCCGT

T

ATGn'CGTCÜGCCACt^GAl"ÜGCGTCACGCG'i'CGLXn^CTCGGACAGGATC'i'GGyw.\ACCGCCGCCGGCA

A

TCTCGTGCACAGGGACCTGGCTCCCTATGATATCGGTGCCGGTCTGGTCGCCATIOATGCGAAGGGCGG C

ATTACCGCI-CCGTACAATACACCAGGCATGTTGCGCGGCTGGGTTACGGCGTCTGGAGAGGCGTTTGTG G

CCACTCACGCTGAAGCTTACGCCGTCAAATTATAA

SEQ ID K0: 33 ( Gene da Asparaginase a Partir da Cevada)

ATGGCGCGCTGGGCCATTGGCATCCACGGCGGCGCGGGCGTGGACCCGAACCTGCCGGAGCACAGGCAG

G

C TGTAACC3GCTTCACGGCGGCGGCCACCTCCAC<3GGCGGGCTCM'GAACRAGATGACGGGCCGCA,TCGGC

G

ACTCGCCGCTCA.TCGGCGCTGGCACCTACGCGTGCGGGGACTGCGCCGTGTCGTGCACGGGCGAGGGCG A

GGCCATCATCCGCTCCACGCTGGCGCGGGACGTGGCCGCCGTGATGGAATCAAGGGGCTGCCTTCTGCA G

GAGGCCGTGGACTTCTGCGTCAAGGAACGGCTCGACGAAGGGTTCGCCGGGCTCATCGCCGTGTCCGGC A

CCGGCGAGGTGGCATACGGGTTCAACTGCACCGGCATGTTCAGAGGCTGCGCCACCGAGGACGGATTCA

T

GGAGGTCGGCATCTGGGAGTGA

SBQ ID NO: 34 (Gene Ast do Trigo)

CGCCGCTCCGTTCCGCCCGTÁCCTTACCCCTCCCCACCACCCGCGCCTGCGTCGCCGCCGGCGCCGTCG CCGGCGACCGTCCCrCCTCGTCGGGCCGCCGCCGCOCCCGCCGCGTTCGTCCGCGGCGTCTGGCCAACG AGGCGTGAGGTCCCGCCGGCCGCCACCATGIOCGGCATCCTCGCCGTCCTCGGCGTCGGCGACGTCTCC CTCGCCAAGCGCTCCCGCATCATCGAGCTCTCCCGCCGATTACGGCACAGAGGCCCTGATl-GGAGTGGT ATACACAGCTTTGAGGATTGCTATCTTGCACACCAGCGGTTGGCTATTGTTGATCCCACATCTGGAGAC CAGCCATTGTACAACGAGGACAAAACAGTTGTTGTGACGGTGAATGGAGAGATCTATAACCATGAAGAA CTGAAAGCTAAGCTAAAATCTCATCAATTCCAAACTGGTAGTGATTGTGAAGTTATTGCTCACCTATAT GAGGAATACGGGGAGGAA-TTTGTGGPvTATGCTGGATGGCATGrEtCT CGTTTGTGCi-I1CTTGACACACGT GATAAAAGCITCATTGCTGCCCGTGATGCTATTGGCATCTGTCCTTTGTACATGGGCTGGGGTCTTGAT GGGTCAGTTTGGTTTTCTT'CAGAGATGAAGGCATTGAGTGATGATTGCGAGCGCTTCATATCGTTCCCC CCTGGACACTTGTACTCAAGCAAAACAGGTGGCCrAAGGAGGTGGTACAACCCCCCATGGTl-TTCAGAA AGCATTCCCTCAGCCCCCTATGATCCTCTCCTCATCCGAGAGAGrTTTGAGAAGGCTGaTATTAAGAGC CTAATGACTGATGTGCCAa-TTGGTGTTCTCTTGTCTGGTGGGCTTGACTCTTCTTTGGTGGCTTCTGTT GTTTCACGCTACTTGGCAGAAACAAAAGTTGCTAGGCAGTGGGGAAACAAACTGCACACCTTTTGC/ÍTC GGTTTGAAGGGrrCTCCTGATCTTAAAGCTGCTAAGGAAGTTGCTGACTACCTTGGCACAGTCCATCAT

gaattacactttacagtgcaggagggcattgatgctti-tggaagaagttatatatcacatcgagacgta tgacgtaacgaccattagagcaagtaccccgatgtttctaatgtctcggaaaatcaaatcgttgggtgt gaagatggttctttcgggtgaaggttccgatgaaatatttggtggttatctttattttcataaggcacc aaacaaaaaggaactccatgaggaaacatgtcggaagataaaagctctccatttataxoattgtttgag

agcgaacaaagcaacttctgcctggggtctcgaggctcgtgttccattccrcgacaaaaacitcatcaa

tgtagcaatggacctggatccggaatgtaagatgataaggcgtgatcttggccggatcgagaaatgggt cctgcgtaatgcatttgatgatgagaagaagccctatttacccaagcacattctttacaggcaaaaaga acagttcagcgatggtgttgggtacagttggattgátggattgaaggaccatgctaatgcacatgtgtc

AGATTCCATOATGACGAACGCCAGCTTTGTTTACCCTC^

ttataggaca.gtatttgagaagttttatcccaagaatgctgctaggctaacggtgccaggaggtcccag

cgttgcatgcagcaccgcgaaagctgttgaatgggacgccgcctggtccaagctcctcgacccatctgg ccgtgctgctctcgqtgtgcatgacggggcatatgaaqaagaaaaggctcctgcgttggccgatcatgt cta^cgtccaccagcccacggggagagcatcctagtcgaaactgqtgttccaqcagcagctgtttaact TTCCATTCCaTGGTTTCATAM^

tgtccgtaggttcaatcattcagtgtagaaattcctstgcaccattttccttgatgcttgctggtatgt

catgcttitcgcatgtatgtactaagt^

tacatccgaattgctcaaagtctgggttgc^cctggaaaagottcattaataaaccccaaggtgt

ssq ib no: 3S (Gene Ast do Trigo)

tacgacaacccacacgtccgggactggagcacgaggacacggacatggactgaccccgtagaaattccc atcctctttcagaagcacagagagagatcttctagctacatactgttgccgtcgatccagcgpaaatgt gcggcatactggcggtgctgggctgcgctgatgacacccaggggaagagagtgcgcgtgctcgagctct cgcgcaggct caagcaccg cggcccc gactggagcggcatgcac caggttggcgacigctacctctc cc accagcgcctcgccatcatcgaccctgcctctcgcgaccagccgctctacaacgaggacaagtccatcg tcgtcacagtgaatggagagatctacaaccatc-aacagctccgggcgcagctctcctcccacacgttca ggacaggcagcgactgcgaggtcatcgcacacctgtacgaggagcatggggagaacttcatcgacatgc tggatggtgtcttctccttcgtcttgctcgatacacgcgacaacagcttcattgctgcacgtgatgcca ttggcgtc^cacccctctatattcgctggggaattgatgggtcggtgtggatatcatcagagatgaagg gcctgaatgatgattgtgagcactttgagatctttcctcctggccatctctactccagcaagcagggag çcrrca^çsaqatcgtacaacccac^rtogttctccga^gtçattccttcagtoccatat^cccactto ctctcaggaaggctttcgaaaaggctgtcatcaagaggct-ratgacggacgttccattcggtgttctac tctctggtggccttgadtcatcattggttgcagccgttac^gttcgtcacctggcaggaâcaaaggctg caaagcgctgggggactaagcttcactctttttgtgtcggacttgaggggtcacctgatctgaaggctg c aaaggaggtagc.caattacctgggcaccatgcac catgagttcaccttcactgtt caggacggcattg atgcaattgaggatgtgatttatcacaccgaaacatatgatgtgacgacaatcagggcaagcacgccaa tgttcctgatgtcacgcaagatcaagtcacttggggtcaagatggtcatctctggtgagggttccgatg agattttcgqagggtacctctactl^ccacaaggcacccaacaaagaggagctccaccgtgagacatgtc aaaagatcaaagctctgcatcagtacgattgcttgagggccaacaaggcaacatctgcatggggcctcg mgcacratgtgccarrcttggacaaggagtttatcaatgaggcaatgagcattgatcctgagtggaaga tgatccggcctgatcttggaagaattgagaaatgggtgctgaggaaagcatttgatgacgaggagcaac cattcctgccgaagcacattctgtacaggcagaaagagcagttcagtgatggtgttggctacagctgga ttgatggcctaaaggctcacgcagaatcaaatgtgacagataagatgatgtcaaatgcaaagttcatct acccãcacaacaccxjcg^^

AGAACTCGGCGATCCTGACGGTGCCAGGTGGGCCAAGCGTTGCATGCAGCACGGCGAAGGCGGTAGAGT gggatgcccagtggtcagggaacctggatccctcagggagafscagcacttggagtccatctctcggcct ai-GAACAGGAGCATCTCCCAGCAACCATCATGGCAGGAACCAGCAAGAAGCCGAGGATGATCGAGGTTG CGGCGCCTGGTGTCGCAArrGAGSAGTTGATGGTGTCCTGTCCTGC-rTGCCGTTTCTGATAAGAAATAAG ATQTACCTGGTCTTGCCATTAGAGTGGTGCAGACCTMGGTTimGTGAAGATTGTGCATTAATGITTC TATTG^CTTATGACGATTTGTAATCCTTTTCrGGCAACTTCCATCAAAACATTATTACATGATGG'XTA

ttatttgacataaacgg ctacatctaccc

Claims (46)

"Produto Processado pelo Calor e Respectivos Metodos de Produgao de Produto de Planta Comestivel e de Planta Transgenica9 de Hedu9ao do Conteudo de Acrilamida em Produto de Planta e de Sobreexpressao de Gene em Tuberculo de Batata, Seqilencia de Polinucleotideo Isolado e Planta" Re ivindica^des

1. - Metodo de Redugao do Conteudo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor，caracterizado por que compreende reduzir os niveis de asparagina na planta que e usada para produzir ο produto.

2. - Metodo de Redu9ao do Conteudo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicagao 1， caracterizado por que a etapa de reduzir os niveis de asparagina compreende expressar um primeiro polinucleotideo na planta, em que ο polinucleotideo compreende a seqiiencia completa ou parcial de pelo menos um de (i) um gene ou ο promoter de um gene que e envolvido na biossintese da asparagina e (b) um gene envolvido no metabolism。da asparagina.

3. - Metodo de Redu9ao do Conteiido de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicagao 2， caracterizado por que ο primeiro polinucleotideo compreende pelo menos um dentre (a) uma seqiiencia completa ou parcial de sentido e/ou de anti-sentido de um gene ou promotor desse gene selecionado do grupo que consiste em (i) genes da sintetase da asparagina，(ii) genes da redutase do nitrato e (iii) genes da hexocinase, em que a expressao da seqiiencia. completa ou parcial subregula os niveis de mRNA da copia endogena desse gene e (b) a sequencia completa ou parcial de um gene selecionado do grupo de genes que consiste em (i) genes da asparagina- se e (ii) genes da sintetase da glutamina, em que a sequencia e sobre- expressa de modo a sobrerregular os niveis totais de mRNA desse gene.

4. - Metodo de Redu^ao do Conteudo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicagao 3， caracterizado por que ο primeiro polinucleotideo compreende pelo menos parte de um gene da sintetase da asparaginase e compreende uma seqiiencia que exibe pelo menos 70% de identidade com pelo menos parte da seqiiencia representada em SEQ ID NOs: 1 ou 2.

5. - Metodo de Redu^ao do Conteudo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicagao 3， caracterizado por que ο primeiro polinucleotideo compreende um gene funcionalmente ativo da asparaginase e compreende uma sequencia que exibe pelo menos 70% de identidade com a sequencia representada em SEQ ID NOs: 9，14 ou 31-33.

6. - Metodo de Redu^ao do Conteudo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicagao 2, caracterizado por que ο primeiro polinucleotideo e lincado operativa- mente a pelo menos um promotor de planta especifico de tecido.

7. · Metodo de Redu^ao do Οοηΐβύάο de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicagao 6, caracterizado por que ο promotor e um especifico de tuberculo ou promotor especifico de semente.

8. - Metodo de Reduqao do Conteudo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicagao 7, caracterizado por que ο promotor e pelo menos 70% identico a pelo menos parte de um promotor de sintase de amido ligado a granulo de batata, um promotor de gene da pirofosforilase da glicose da ADP da batata, um promotor da patatina da batata, um promotor de gene da 3- monooxigenase do flavonoide da batata ou um promotor de gene do puroindol do trigo.

9. _ Metodo de Redugao do Conteudo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicagao 8， caracterizado por que ο promotor da sintase do amido ligado ao granulo da batata compreende pelo menos parte da sequencia represen- tada em SEQ ID NO: 8.

10. - Metodo de Redugao do Conteudo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicagao 8, caracterizado por que a promotor do gene da pirofosforilaseda da ADP da glicose da batata compreende pelo menos parte da seqiiencia repre- sentada em SEQ ID NO: 7.

11. - Metodo de Redugao do Conteudo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicagao 8， caracterizado por que por que ο promotor do gene da patatina compre- ende pelo menos parte da sequencia representada em SEQ ID NO: 22.

12. - Metodo de Reduqao do Conteiido de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicagao 8， caracterizado por que ο promotor do gene da monooxigenase do ilavonoide compreende pelo menos parte da sequencia a montante a partir da seqiiencia representada em SEQ ID NO: 13.

13. - Metodo de Reduqao do Conteudo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicagao 3， caracterizado por que ο primeiro polinucleotideo compreende pelo menos uma copia de um fragmento de sentido e/ou de anti-sentido de um gene biossintetico da asparagina e e expresso de modo a subregular os niveis totais de mRNA da sintetase da asparagina nos tecidos de uma planta que sao usados para produzir um produto alimenticio processa- do pelo Calor.

14. - Metodo de Redugao do Conteudo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicagao 13, caracterizado por que o primeiro polinucleotídeo é lincado operativa- mente a um promotor na sua extremidade 5'e é lincado operativamente a um promotor na sua extremidade 3'.

15. - Método de Redução do Conteúdo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicação 2, caracterizado por que compreende ainda expressar um segundo polinucleotídeo que compreende pelo menos um dentre (i) pelo menos uma cópia, na orientação de sentido e/ou de anti-sentido, de um gene selecionado do grupo que consiste num gene de Rl e um gene da fosfori- Iase L.

16. - Método de Redução do Conteúdo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicação 15, caracterizado por que o primeiro e o segundo polinucleóide ficam posicionados dentro de um DNA de transferência e compreendem uma seqüência que compartilha pelo menos 70% de identidade com a seqüência mostrada em SEQ ID NO: 23.

17. - Método de Redução do Conteúdo de Acrilamida em Produto de Planta Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicação 1, caracterizado por que a planta é um planta que porta tubérculo.

18. - Produto Processado pelo Calor, caracterizado por que é obtido a partir dos tecidos de uma planta transgênica que compreende um primeiro polinucleotídeo compreendendo a seqüência completa ou parcial de um gene que é envolvido na biossíntese da asparagina ou no metabolismo de asparagina, em que o produto tem uma concentração mais baixa de acrilamida do que um produto processado pelo calor que é feito a partir dos tecidos correspondentes de uma planta não transgê- nica de outra forma idêntica.

19. - Produto Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicação 18, caracterizado por que o produto feito a partir da planta transgênica tem características sensoriais aperfeiçoadas em comparação com um produto equivalente feito a partir de um tubérculo do tipo selvagem.

20. - Produto Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicação 18, caracterizado por que a planta transgênica é um planta que porta tubérculo.

21. - Produto Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicação 20, caracterizado por que o produto da planta que porta tubérculo é batata frita, batata em pedaços, batata ondulada ou batata assada.

22. - Produto Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicação 18, caracterizado por que as células da planta transgênica compreen- dem um segundo polinucleotídeo que compreende pelo menos um dentre (i) seqüências de sentido e/ou de anti-sentido correspondendo a um gene de Rl ou fragmento de gene e (ii) uma seqüência de sentido e/ou de anti-sentido que corresponde a um gene da fosforilase L ou fragmento de gene.

23. - Produto Processado pelo Calor, de acordo com a Reivindicação 18, caracterizado por que o produto tem uma concentração de acrila- mida que é pelo menos cerca de 20%, pelo menos aproximadamente 25%, pelo menos mais ou menos 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menos mais ou menos 45%, pelo menos cerca de 50%, por pelo menos aproximadamente 60%, por pelo menos mais ou menos 70%, por pelo menos cerca de 80%, por pelo menos aproximadamente 90% inferior à concentração da acrilamida produto processado pelo calor da planta não transgênica

24. - Planta, caracterizada por que compreende em seu genoma um primeiro polinucleotídeo que compreende a seqüência completa ou parcial de um gene é envolvido na biossíntese da asparagina ou no metabolismo de asparagina.

25. - Planta, de acordo com a Reivindicação 24, caracterizada por que JS a referida planta é portadora de tubérculo.

26. - Planta, de acordo com a Reivindicação 25, caracterizada por que a planta que porta tubérculo é uma planta da batata.

27. - Planta, de acordo com a Reivindicação 24, caracterizada por que compreende ainda em seu genoma um segundo polinucleotídeo que compreende pelo menos um dentre (i) seqüências de sentido e/ou de anti-sentido que correspondem a um gene de Rl ou fragmento de gene e (ii) seqüências de sentido e/ou de anti-sentido que correspondem a um gene da fosforilase L ou fragmento de gene.

28. - Seqüência de Polinucleotídeo Isolado, caracterizada por que compreende uma seqüência de ácidos nucléicos que codifica um poli- peptídio que é capaz de reduzir os níveis de acrilamida numa planta.

29. - Seqüência de Polinucleotídeo Isolado, de acordo com a Reivindi- cação 28, caracterizado por que a referida seqüência de ácidos nucléi- cos é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, 2, 9, 10, 14, 15 e 28-35 ou uma variante, fragmento, complemento ou complemento inverso do mesmo e o referido ácido nucléico codifica um polipeptídio com atividade de asparaginase.

30. - Seqüência de Polinucleotídeo Isolado, de acordo com a Reivindi- cação 29, caracterizado por que a referida variante tem uma identidade de seqüência que é maior ou igual a 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, -93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, -81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, -69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61% ou 60% em seqüência a qualquer uma dentre as SEQ ID NOs: 1, 2, 17, 20, 21.

31. - Método de Produção de Produto de Planta Comestível, a partir de tecido de planta com asparagina reduzida, caracterizado por que compreende (1) aumentar o nível de asparaginase no tecido da planta ou (2) diminuir o nível de sintetase da asparagina no tecido da planta.

32. - Método de Produção de Produto de Planta Comestível, a partir de tecido de planta com asparagina reduzida, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que a etapa de aumentar o nível de asparaginase na célula da planta compreende expressar um gene de asparaginase na célula.

33. - Método de Produção de Produto de Planta Comestível, a partir de tecido de planta com asparagina reduzida, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que a etapa de diminuir o nível de sintetase da asparagina na célula de planta compreende expressar na célula de planta um polinucleotídeo que compreende pelo menos um fragmento, na orientação de sentido e/ou de anti-sentido, de (i) um gene de RI, (ii) um gene da fosforilase L e (iii) um gene da sintetase da aspa- raginase.

34. - Método de Produção de Produto de Planta Comestível, a partir de tecido de planta com asparagina reduzida, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que o produto de planta comestível é um tubérculo, batata frita, batata em pedaços, batata ondulada, assada ou desidratada.

35. - Método de Produção de Produto de Planta Comestível, a partir de tecido de planta com asparagina reduzida, de acordo com a Reivindicação 31, caracterizado por que o produto de planta comestível tem um nível mais baixo de acrilamida depois do produto ser aquecido em comparação com o nível de acrilamida num produto de planta em que o nível de asparaginase não foi aumentado ou o nível de sintetase da asparagina não foi diminuído.

36. - Método de Produção de Produto de Planta Comestível com Baixos Níveis de Acrilamida, caracterizado por que compreende (i) subregular a expressão de um gene biossintético da asparagina e/ou sobrerregular a expressão de um gene envolvido no metabolismo de asparagina gene e (ii) subregular a expressão ou atividade de pelo menos um dentre (a) o gene de Rl e (b) o gene da fosforilase L no tecido de uma planta que produz um legume, uma semente ou uma fruta a partir da qual é feito o produto.

37. - Método de Produção de Produto de Planta Comestível com Baixos Níveis de Acrilamida, de acordo com a Reivindicação 36, caracterizado por que a etapa de subregular o gene de RI, o gene da fosforilase Leo gene biossintético da asparagina compreende expressar na célula de planta, na orientação de sentido e/ou de anti-sentido, pelo menos um fragmento de (i) um gene de RI, (ii) um gene da fosforilase L e (iii) um gene da sintetase da asparaginase.

38. - Método de Produção de Produto de Planta Comestível com Baixos Níveis de Acrilamida, de acordo com a Reivindicação 36, caracterizado por que o produto de planta comestível é um tubérculo, batata frita, batata em pedaços ou batata assada.

39. - Método de Produção de Produto de Planta Comestível com Baixos Níveis de Acrilamida, de acordo com a Reivindicação 36, caracterizado por que o produto de planta comestível tem um nível mais baixo de acrilamida depois do produto ser aquecido em compara- ção com o nível de acrilamida num produto de planta de uma planta não transgênica.

40. - Método de Produção de Produto de Planta Transgênica Comes- tível, que tem um nível mais baixo de acrilamida depois de ser aquecido do que o nível de acrilamida de um produto equivalentemente aquecido a partir de uma planta não transgênica, caracterizado por que compre- ende reduzir os níveis de asparagina na planta transgênica alterando o nível de expressão de um gene envolvido na biossíntese da asparagina ou no metabolismo de asparagina na planta.

41. - Método de Produção de Produto de Planta Transgênica Comes- tível, de acordo com a Reivindicação 40, caracterizado por que os niveis de asparagina sao reduzidos expressando pelo menos uma copia, na orientagao de sentido e/ou de anti-sentido, da sequencia parcial ou completa a partir de um gene da sintetase da asparaginase, gene de reductase do nitrato ou gene da hexocinase.

42. - Metodo de Produ^ao de Produto de Planta Transgenica Comes- tivel, de acordo com a Reivindicagao 41，caracterizado por que os niveis de asparagina sao reduzidos expressando a sequencia completa ou parcial funcionalmente ativa a partir de um gene de asparaginase ou um gene da sintetase da glutamina na planta.

43. - Metodo de Sobreexpressao de Gene em Tuberculo de Batata, caracterizado por que linca operativamente esse gene a uma sequencia que exibe pelo menos 70% de identidade com pelo menos parte da sequencia mostrada em SEQ ID NO: 13.

44. - Metodo de Sobreexpressao de Gene em Tuberculo de Batata, de acordo com a Reivindicagao 1, caracterizado por que os niveis de asparagina sao reduzidos nos tecidos de amido da planta.

45. - Metodo de Sobreexpressao de Gene em Tuberculo de Batata, de acordo com a Reivindicagao 36，caracterizado por que ο produto de planta comestivel tem caracteristicas sensorials aperfeigoadas em comparagao com um produto equivalente que nao e assim modificado.

46. - Metodo de Sobreexpressao de Gene em Tuberculo de Batata, de acordo com a Reivindicagao 45, caracterizado por que ο produto de planta comestivel tem pelo menos uma caracteristica sensorial aperfei- ^oada selecionada do grupo que consiste em aparencia, sabor, aroma e textura.