BRPI0616207A2 - fabricaÇço biocatalÍtica de Ésteres (met) acrÍlicos - Google Patents

Abstract

FABRICAÇçO BIOCATALÍTICA DE ÉSTERES(MET)ACRÍLICOS.A presente invenção refere-se a um método ou processo biocatalítico para a síntese de ésteres de ácido acrílico e/ou ácido metacrílico livres de grupos positivamente carregáveis/carregados, que compreende a reação de um ou mais álcoois (materiais de partida de álcool) que sejam livres de grupos positivamente carregáveis ou carregados com (met)acrilil-CoA, de preferência na presença de um catalisador (inorgânico, orgânico ou ) organometálico, ou de preferência um biocatalisador) capaz de efetuar a transferência de um radical álcool de um material de partida de álcool como definido acima ou abaixo para (met)acrilil-CoA com remoção da fração CoA por atividade de transferase, como uma enzima da classe transferase ou hidrolase de enzimas. A (met)acrilil-CoA é formada, de preferência, por reação de ácido (met)acrílico ou sais do mesmo com coenzima A, na presença de uma substância fornecedora de energia e um biocatalisador, por exempIo, com atividade de S-acetila coenzima A sintetase ou por reação do acrilato ou metacrilato produzido metabolicamente na presença de um biocatalisador ou metabolicamente.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FABRICA-ÇÃO BIOCATALÍTICA DE ESTERES (MET)ACRÍLICOS".

A presente invenção refere-se a um método ou processo bioca-talítico para a síntese de (um ou mais) ésteres de ácido acrílico e/ou ácidometacrílico, que sejam livres de grupos positivamente carregáveis ou carre-gados, o dito método ou processo compreendendo a reação de um ou maisálcoois (materiais de partida de álcool), que sejam livres de grupos positiva-mente carregados, com um acrilil-CoA e/ou metacrilil-CoA, de preferência napresença de um catalisador, que pode ser um catalisador inorgânico, orgâni-co ou organometálico, ou, de preferência, um biocatalisador, particularmenteum biocatalisador capaz de efetuar a transferência de um radical álcool deum material de partida de álcool, como definido acima ou abaixo, para(met)acrilil CoA com remoção da fração CoA (por exemplo, usando-se ativi-dade de transferase), como uma enzima da classe de enzimas transferaseou hidrolase. O (met)acrilil-CoA é, de preferência, formado por reação deácido (met)acrílico ou sais do mesmo, como acrilato de sódio, com coenzimaA, na presença de uma substância provedora de energia e um biocatalisadorcom atividade de sintetase (em particular Coenzima A sintetase, particular-mente S-acetila Coenzima A sintetase) ou por reação de acrilato ou metacri-lato que tenha sido produzido metabolicamente, por exemplo, a partir de a-çúcares, por exemplo, mediante Iactato por um microorganismo; a organis-mos (particularmente transformados, isto é, geneticamente modificados) ca-pazes de efetuar a transferência de um radical álcool de um material de par-tida de álcool, como definido acima ou abaixo, para (met)acrilil CoA com re-moção da fração CoA e, de preferência, além disso, possuindo atividade desintetase (em particular Coenzima A sintetase, particularmente S-acetila Co-enzima A sintetase), e seu uso no dito processo ou método; ao uso de umbiocatalisador capaz de efetuar a transferência de um radical álcool de ummaterial de partida de álcool, como definido acima ou abaixo, para(met)acrilil CoA com remoção da fração CoA, para realizar a dita transferên-cia, para fabricar um ou mais dos ésteres acima mencionados; e também ausos, organismos, processos e métodos conforme descritos abaixo.A conversão microbiana ou biocataliticamente mediada de bio-massa, por exemplo, celulose ou amido, para fornecer matérias-primas quí-micas, também em quantidades industrialmente utilizáveis, representa umaimportante alternativa para combustíveis fósseis, e a produção de combustí-veis e outros produtos químicos brutos em biorrefinarias está se tornandocada vez mais importante, em vista da futura exaustão de combustíveis fós-seis e das pressões sociais e políticas para reduzir as emissões de carbono,devido às alterações climáticas globais relacionadas que estão ocorrendo.Conseqüentemente, é importante ter em mãos tantas reações biologicamen- te catalisadas quanto possível para permitir o uso de processos biológicosou biocatalíticos para sua produção, particularmente a partir de substratosrenováveis e neutros em termos de carbono, como carboidratos derivadosde colheitas.

Por exemplo, os ésteres alquílicos inferiores (por exemplo, Ci -15 C7) de ácido acrílico e, em particular, acrilato de metila, etila e n-butila sãoconhecidos como ésteres industrialmente utilizáveis. Os ésteres acrílicos sãoatualmente fabricados pela esterificação de ácido acrílico. O ácido acrílico épreparado a partir do propileno petroquímico mediante um processo de oxi-dação em 2 etapas de uso intenso de energia em uma escala muito grande20 (> 2 milhões de toneladas por ano globalmente). Mais de metade desta pro-dução é convertida nos ésteres mencionados ou outros, com a maior partesendo o éster n-butílico. Estes monômeros são usados na fabricação de po-límeros para uma faixa muito ampla de aplicações, incluindo pinturas, verni-zes, tintas, adesivos, espessantes, para nomear apenas alguns. A fabrica-25 ção dos ésteres acrilato requer um investimento considerável em instalaçõese é um processo de uso intenso de energia.

Ao invés de que são basicamente reações químicas, uma rea-ção biocatalítica seria altamente desejável para proporcionar uma aborda-gem biossintética integrada que também possa fazer uso de biomassa reno-30 vável ou de refugo.

A patente U. S. nQ 5.541.093 descreve a preparação deste éstera partir da reação de álcool com ácido orgânico no estado de vapor, a umatemperatura de 25 a 55°C, na presença de lipase. Estes ésteres incluem a-cetato de etila e propionato de etila. A patente U. S. ns 5.973.203 descreveum processo para a preparação de amidas de ácido (met)acrílico por aminó-Iise de ésteres de ácido (met)acrílico usando lipase.

Além disso, a bioprodução de etanol para combustível aumentoudramaticamente, e, em 2001, relatou-se que representa 30 bilhões de litros(Th. Willke e K.-D. Vorlop1 Appl. Microbiol. Biotechnol. (2004) 66:131-142).De acordo com estes autores, n-butanol era produzido até a era do óleo ba-rato (1930) por fermentação de biomassa e atualmente poderia ser nova-mente produzido biotecnologicamente como um aditivo de combustível acustos competitivos.

Conseqüentemente, há uma clara necessidade e uma oportuni-dade para produzir ésteres acrílicos (e metacrílicos) em escala significativa-mente grande em, por exemplo, uma operação de biorrefinaria, em que aprodução do álcool seja seguida por acoplamento a ácido acrílico medianteacrilil CoA produzido metabolicamente, para fornecer os ésteres de umamaneira totalmente verde e sustentável.

A síntese metabólica de ácido acrílico foi descrita por Dalal et al.(Biosources Digest vol. 2 p. 89 a 97) em 1980. Os autores apresentaram ahipótese de que acrilil CoA é um intermediário na desidratação anaeróbicade Iactato em Megasphera elsdenii e Clostridium propionicum e que tambémocorre após a desidratação de β-hidroxipropionil CoA em Clostridium propio-nicum. Também sugeriram que, em uma reação usando células em repousode C. propionicum, o acúmulo de acrilato era observado com propionato co-mo substrato. Um esquema metabólico para a síntese de acrilil CoA é dadono Esquema 1.<formula>formula see original document page 5</formula>

Esquema I: Vias metabólicas envolvendo Acrilil-CoA em Clostri-dium propionicum (vide também Dalal et al., loc. cit.).

Mais recentemente, foram descritas algumas maneiras para apreparação biossintética de acrilato e ésteres acrílicos, por exemplo, em WO02/042418 A2 ou WO 02/42471 A1, vide também WO 00/71738 para a sín-tese de ácido acrílico.

Nenhum destes documentos descreve a possibilidade de fabri-cação de ésteres acrílicos diretamente.

Ácido acrílico e metacrílico são substratos conhecidos da enzi-ma S-acetila CoA sintetase (S-acetila coenzima A sintetase, acetato tioqui-nase ou acetato:CoA ligase) (EC 6.2.1.1); entretanto, anteriormente, os pro-dutos encontrados não pareciam corresponder principalmente aos CoA tio-ésteres acílicos - ao invés, a ligação de dois equivalentes de CoA ocorriamediante adição de Michael à dupla ligação, quanto formação de tioéstermediante a carbonila do ácido e, portanto, verificava-se a formação de umproduto de adição bis (vide, por exemplo, Patel e Walt, Anal. Biochem. 170,355-60 (1988)). O produto de adição bis tem a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 6</formula>

Contra este pano de fundo, seria altamente desejável apresentarum processo biológico para a síntese de ésteres (met)acrílicos que fossesimples e/ou uma alternativa real para os atuais métodos químicos e for-masse também uma base para a integração em um processo biotecnológicomais geral, por exemplo, finalmente fazer uso de recursos renováveis.

Surpreendentemente, descobriu-se agora que é possível obterésteres (met)acrílicos que são livres de grupos positivamente carregados,particularmente ésteres (met)acrílicos de álcoois inferiores, diretamente a partir de S-(met)acrilil-Coenzima A ((met)acrilil CoA) por reação de um oumais álcoois que sejam livres de grupos positivamente carregados com(met)acrilil-CoA, opcionalmente, ou de preferência, na presença de um cata-lisador, que pode ser um catalisador inorgânico, orgânico ou organometálico;ou, mais preferivelmente, um biocatalisador capaz de efetuar a transferênciade um radical álcool de um material de partida de álcool, como definido aci-ma ou abaixo, para (met)acrilil CoA, com remoção da fração CoA.

Mesmo a síntese do precursor (met)acrilii CoA usando ácido(met)acrílico ou sais do mesmo, como acrilato de sódio, acrilato de potássio,acrilato de amônio e outros, e Coenzima A com o auxílio de um biocatalisa-dor com atividade de sintetase é possível, porque se pode demonstrar quehá condições disponíveis para que a reação do grupo carboxila do ácido(met)acrílico ou sal de ácido (met)acrílico com o grupo tiol da Coenzima Aseja favorecido com relação à adição à dupla ligação, de modo que relativa-mente mais tioéster do que produto de adição de dupla ligação ou produtode adição bis possa ser formado, já in vitro, usando um biocatalisador quetenha atividade de sintetase, por exemplo, por otimização da concentraçãodos reagentes, particularmente um com relação ao outro. É particularmentepreferido com relação a isto um processo de alimentação por lotes descritoem maiores detalhes abaixo.

A percepção surpreendente e nova de que condições in vitropermitem a síntese de (met)acrilila Goenzima A forma a base da síntese deéster (met)acrílico também in vivo ou por uma combinação de etapas in vitroe in vivo.

Isto forma a base das vias biossintéticas para a síntese de éste-res acrílicos que eliminam grandemente a dependência de matérias-primaspetroquímicas, por exemplo, também por uma combinação de síntese de(met)acrílil-CoA in vivo ou in vitro e síntese de éster in vitro ou síntese deéster com ambas as etapas in vivo.

A invenção, em um primeiro aspecto, refere-se a um processoou método para a fabricação de um éster ou ésteres de ácido acrílico e/ouácido metacrílico que sejam livres de grupos positivamente carregáveis oucarregados, particularmente de (met)acrilato de n-butila (muito preferido),(met)acrilato de etila (preferido), (met)acrilato de metila (preferido), ou tam-bém (met)acrilato de n-propila, isopropila, isobutila, sec-butila, terc-butila, 2-etilbutila, n-pentila, isopentila, 1-metilpentila, 1,3-dimetilbutila, n-hexila, isoep-tila, 1-metilexila, 2-etilexila, estearila ou 2-hidróxi etila, ou misturas de dois oumais destes, o dito processo compreendendo a reação de um ou (menospreferivelmente) mais álcoois que sejam livres de grupos positivamente car-regáveis ou carregados, particularmente n-butanol (muito preferido) ou etanol(preferido) ou metanol (preferido) ou também n-propanol, isopropanol, isobu-tanol, sec-butanol, terc-butanol, 2-etilbutanol, n-pentanol, isopentanol, 1-metilpentanol, 1,3-dimetilbutanol, n-hexanol, isoeptanol, 1-metilexanol, 2-etilexanol, álcool estearílico ou 2-hidroxietanol com (met)acrilil-CoA, opcional-mente, ou de preferência, na presença de um catalisador, que pode ser umcatalisador inorgânico, orgânico ou organometálico; ou, de preferência, umbiocatalisdor capaz de efetuar a transferência de um radical álcool de um ma-terial de partida de álcool, como definido acima ou abaixo, para (met)acrililCoA com remoção da fração CoA. Dependendo dos materiais de partida, osprodutos ou misturas de produtos correspondentes são obtidos.

Além disso, também se pode fabricar amidas pela reação de(met)acrilil CoA com uma amina para fornecer a amida correspondente. Asamidas podem incluir, mas não se limitam a, dimetilacrilamida, isopropilacri-lamida, n-butilacrilamida, amilacrilamida, dimetilaminopropil(met)acrilamida.

Em um aspecto adicional, a invenção refere-se a um organismogeneticamente modificado (OGM) transformado com um ou mais ácidos nu-cléicos (de preferência recombinantes) compreendendo uma ou mais seçõescodificadoras de e que permitam a expressão de um biocatalisador capaz deefetuar a transferência de um radical álcool de um material de partida de ál-cool como definido acima ou abaixo para (met)acrilil CoA com remoção dafração CoA.

Em outro aspecto, a invenção refere-se ao uso de um OGM,conforme mencionado no último parágrafo, para a fabricação de um ou maisésteres de ácido acrílico e/ou ácido metacrílico que sejam livres de grupospositivamente carregáveis ou carregados, particularmente aqueles definidosacima ou abaixo, compreendendo a administração de um ou mais materiaisde partida apropriados derivados de biomassa e, de preferência, tambémdo(s) álcool(ois) correspondente(s) que seja(m) livre(s) de grupos positiva-mente carregáveis ou carregados, particularmente aqueles definidos acimaou abaixo, a uma cultura do dito microorganismo e isolamento do(s) és-teres) (met)acrílico(s) resultante.

A invenção também refere-se ao uso (in vitro e/ou in vivo) de umbiocatalisador capaz de efetuar a transferência de uma fração álcool de ummaterial de partida de álcool, como definido acima ou abaixo, para(met)acrilil CoA com remoção da fração CoA, para realizar a transferência dafração (met)acrilila do (met)acrilil CoA para n-butanol, para fabricar acrilatode n-butila (muito preferido) ou etanol para fabricar acrilato de etila (preferi-do), ou metanol para fabricar acrilato de metila (preferido) ou 2-hidroxietanolpara fabricar metacrilato de 2-hidroxietila, ou uma reação similar de outroálcool para fabricar o(s) outro(s) éster(es). Também se podem usar misturasde álcoois para se obterem misturas de ésteres.

dalidade, inclui o uso de um biocatalisador com atividade de sintetase para afabricação de (met)acrilil CoA (particularmente com a etapa de reação cor-respondente ocorrendo in vitro, com um baixo nível de formação de produtode adição bis). A sintetase pode ser qualquer enzima sintetase capaz de efe-tuar a formação de (met)acrilil CoA. Pode ser, por exemplo, uma coenzimasintetase, particularmente uma coenzima A sintetase. O termo sintetase in-clui, mas não se limitam a, acil sintetase, butiril sintetase, propionil sintetaseou, de preferência, acetila S-Coenzima A sintetase. Alternativamente, pode-se usar qualquer sintetase capaz de realizar a reação entre ácido acrílico ouácido metacrílico ou sais de ácido (met)acrílico com CoA.

A reação que forma a base da presente invenção pode ser re-presentada pelo seguinte esquema de reação:ESQUEMA II:

O método ou processo de acordo com a invenção, em uma mo·

<formula>formula see original document page 9</formula>No Esquema II, o grupo R é o resíduo de um álcool (sem o H noOH) de um álcool livre de grupos positivamente carregáveis ou carregados,particularmente como definido acima ou abaixo.

De preferência, (met)acrilil-CoA é sintetizado in vitro ou in vivo apartir de ácido acrílico ou ácido metacrílico e/ou sais, por exemplo, sais domesmo de metais alcalinos, como seu sal de sódio, comumente chamadosde (met)acrilatos daqui por diante, por meio de um biocatalisador com ativi-dade de sintetase, como atividade de S-acetila CoA sintetase (que é umasintetase preferida para uso de acordo com a invenção), de acordo com oEsquema Ill a seguir:

ESQUEMA III:

<formula>formula see original document page 10</formula>

Em contraste com a literatura acima mencionada, muito surpre-endentemente, quantidades substanciais de (met)acrilil CoA podem ser obti-das, Ao invés de produto de adição bis, se as condições de reação {in vitro)forem apropriadamente modificadas, proporcionando, assim, uma contribui-ção, de modo que o método ou processo da invenção possa resultar embons rendimentos dos ésteres.

Assim, verificou-se que a reação pode resultar em mais do(met)acrilil CoA desejado, se as razões molares de (met)acrilato e CoA fo-rem tais que o (met)acrilato seja usado em um excesso molar, por exemplo,um excesso molar de mais de duas vezes, mais preferivelmente em um ex-cesso molar de mais de 4 vezes, ainda mais preferivelmente em um excessomolar de mais de 10 vezes, por exemplo, de aproximadamente 15 vezes de(met)acrilato com relação à CoA; por exemplo, a concentração de(met)acrilato pode estar na faixa de 50 a 300, por exemplo, de 120 a 280mM, e a concentração de CoA em uma fração desta, de preferência, con-forme derivado das razões de excesso molar preferidas em favor de(met)acrilato acima mencionadas.

Outros componentes requeridos também estão presentes (porexemplo, um sal de Mg2+, como MgCI2; ATP (de preferência em quantidadesmolares hipoestequiométricas com relação ao (met)acrilato (por exemplo, demetal alcalino, como sódio), por exemplo, em menos de um quinto da quan-tidade molar do (met)acrilato, por exemplo, em 1/10 desta quantidade), e,evidentemente, o biocatalisador, de preferência, a enzima S-acetila CoA sin-tetase, que está presente em uma atividade apropriada, por exemplo, de 0,5a 15 unidades por mL na presença de ATP, acetato e coenzima A a 37°C.De preferência, também há substâncias tampão presentes, por exemplo,tampão Tris (tris(hidroximetil) aminometano) ou outras substâncias tampãoque permitam o estabelecimento de um pH apropriado, por exemplo, na fai-xa de 5 a 9, como de 6 a 8 (por exemplo, cerca de pH 6,4 a 7,3). Estas in-cluem qualquer tampão biologicamente compatível adequado, como tam-pões de fosfato e outros. Entretanto, em uma modalidade alternativa, umtampão não é requerido para que a reação ocorra, e a ausência de um tam-pão pode ser preferida para evitar a contaminação da mistura de reação comcomponentes de tampão.

O rendimento do produto (met)acrilil CoA desejado com relaçãoao produto de adição bis é melhorado ainda mais se a coenzima A não foradicionada toda de uma vez, mas, ao invés, for adicionada em pequenoslotes (a abordagem de alimentação por lotes muito preferida) ou continua-mente durante a reação, permitindo, assim, que a formação de tioéster ocor-ra antes de ser possível a adição de mais Coenzima A à dupla ligação deseu produto (met)acrilil CoA. Por exemplo, a CoA pode ser adicionada emquantidades de 1/20 a 1/3 da quantidade/concentração final total por lotes, aintervalos dentro de um período de tempo de, por exemplo, até 0,5 horas,por exemplo, 1/10 da CoA total a ser usada no tempo O, 5 min, 10, 15 e 20min, respectivamente. Além disso, o ATP também pode ser reabastecido aomesmo tempo de que se adiciona CoA.

Quando requerido, a enzima também pode ser reabastecida a-pós períodos de tempo apropriados.

Assim, a concentração hipoestequiométrica de CoA livre é manti-da de preferência menor que uma razão de 1:100, por exemplo, 1:150 daconcentração original de (met)acrilato em cada momento único, por exemplo,em 2 mM ou menos, por exemplo, aproximadamente 1 mM ou menos e, maispreferivelmente, a concentração de ATP também é mantida abaxo de 1/20 daconcentração inicial de (met)acrilato em cada momento, por exemplo, abaixode 10 mM, por exemplo, em ou abaixo de aproximadamente 5 mM.

Uma variante interessante da invenção refere-se ao uso de áci-do acrílico como apenas fonte de carbono (por exemplo, assimilado em Iac-tato e, então, piruvato que possa ser usado mediante o ciclo de Krebs), que,em paralelo, também é alimentado à reação apresentada no Esquema III.Esta abordagem pode proporcionar condições particularmente boas para asíntese de ésteres (met)acrílicos produzidos de acordo com o método ouprocesso da invenção.

Ao invés de fornecer ácido (met)acrílico ou sais do mesmo comoprecursores para a reação com o álcool escolhido, opcionalmente, ou depreferência, na presença de um catalisador, que pode ser um catalisadorinorgânico, orgânico ou organometálico; ou, de preferência, um biocatalisa-dor capaz de efetuar a transferência de uma fração álcool de um material departida de álcool como definido acima ou abaixo para (met)acrilil CoA comremoção da fração CoA1 também é possível usar materiais de partida apro-priados derivados de biomassa. Estes precursores são o produto de proces-sos biológicos (incluindo, mas não limitados a, materiais de biomassa derefugo, como materiais agrícolas que possam ser tratados, por exemplo, hi-drolisados, para liberar materiais de partida apropriados) e podem ser pri-meiro convertidos mediante vias bioquímicas em (met)acrilil CoA. Os exem-plos são açúcares (por exemplo, materiais de biomassa de refugo, amido,celulose ou outros polissacarídeos), polióis (por exemplo, de gorduras), áci-dos orgânicos (por exemplo, do metabolismo ou da hidrólise de ésteres deácidos graxos), aminoácidos e outros. O (met)acrilil CoA pode ser, então,convertido em ésteres (met)acrílicos conforme aqui descritos. Como a bio-massa é renovável, esta abordagem é basicamente muito vantajosa comrelação ao desenvolvimento sustentável e à proteção ambiental. Em princí-pio e vantajosamente, também é possível derivar outros materiais de partida,particularmente os álcoois que sejam livres de grupos positivamente carre-gáveis ou carregados, particularmente como definidos acima ou abaixo, devias bioquímicas com materiais de partida de biomassa. Por razões práticas,entretanto, estes materiais de partida podem ser adicionais como tais.

Alguns exemplos de possíveis vias de reação metabólica e pos-síveis pontos de junção, assim como atividades enzimáticas em que os pre-cursores podem ser alimentados para a síntese de acordo com a invenção,são mostrados no Esquema I acima, assim como no Esquema IV apresenta-do abaixo:ESQUEMA IV:

<formula>formula see original document page 14</formula>

Aqui, as letras maiúsculas AaN indicam, de preferência, as se-guintes atividades de enzima:

A: fosfoenolpiruvato carboxiquinase;

B: aspartato aminotransferase;

C: aspartato descarboxilase;

D: CoA transferase;

E: beta-alanil Co-A-amônia liase;

F: acetila CoA-carboxilase;

G: malonil CoA-redutase;

H: 3-hidroxipropionil CoA-desidratase (= acrilil CoA-hidratase);

I: (acetil) Co-A sintetase ou (acetil) CoA-transferase (que podeser parte de um complexo de enzimas, como 0S17 no WO 02/042418);

K: propionil CoA-redutase (que pode ser parte de um complexode enzimas, como 0S17 no WO 02/042418);

L: CoA sintetase ou CoA transferase;

M: Iactil CoA-desidratase;

N: biocatalisador capaz de efetuar a transferência de uma fraçãoálcool de um material de partida de álcool, como definido acima ou abaixo,para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA.

Para a síntese de ésteres metacrílicos, é possível, por exemplo,usar ácido isobutírico ou seus precursores metálicos, Ao invés de ácido pro-piônico no Esquema IV como ponto de junção ou como material de partida.

Outros métodos são possível, por exemplo, o uso da via de oxi-dação de propileno, que pode ser possível usando-se Mycobacterium convo-Iutum ou material genético para biocatalisadores e biocatalisadores obtení-veis a partir dele, em acrilato, a oxidação de álcool alílico em acrilato (porexemplo, usando Pseudomonas fluorescens ou Nocardia coralline ou mate-rial genético para biocatalisadores e biocatalisadores obteníveis a partir dele)ou acrilonitrila ou metacrilonitrila, usando nitrilase ou nitrila hidratase bacteri-ana em combinação com atividades de amidase, por exemplo, por Rhodo-coccus ruber ou Rhodococcus rhodochrous, respectivamente.

As vias e atividades enzimáticas correspondentes podem ser oresultado da expressão de genes (incluindo a transcrição e tradução e pos-sível modificação pós-tradução) de ácidos nucléicos que façam parte do áci-do nucléico natural e equipamento genético de organismos, particularmenteplantas (ou tecidos vegetais) ou, mais preferivelmente, microorganismos(particularmente organismos unicelulares), mais particularmente procariotos,por exemplo, bactérias, ou (pelo menos durante uma parte de seu ciclo devida) eucariotos unicelulares, por exemplo, fungos, como leveduras, ou po-dem ser o resultado da transformação destas células (que estão, então, setornando "células hospedeiras" para os ácidos nucléicos exógenos introduzi-dos, isto é, organismos geneticamente modificados (OGM)) compreendendoácidos nucléicos "exógenos" de outros organismos (por exemplo, animais,como roedores ou seres humanos) ou seus análogos, com as seções reque-ridas para codificação e capazes de expressar as atividades biocatalisadorascorrespondentes, de preferência com ácidos nucléicos recombinantes, porexemplo, com vetores (por exemplo, plasmídios, cosmídios, vetores virais ouderivados de vírus ou outros) que, aiém de uma ou mais seções que codifi-quem as atividades biocatalisadoras requeridas para a síntese de ésteres(met)acrílicos de acordo com o processo da invenção, ou seus precursores,podem compreender uma ou mais seqüências repressoras, ativadoras, pro-motoras e/ou transportadoras ou outras seqüências requeridas ou utilizáveispara a integração, manutenção, transporte dentro da célula ou através demembranas celulares, modificação pós-tradução e particularmente expres-são dos polipeptídios codificados e suas atividades, asism como opcional-mente marcadores genéticos que permitam a seleção (como seqüênciascodificadoras de galactosidase ou de resistência a antibióticos), particular-mente construtos de ácidos nucléicos recombinantes portando um ou maisconstituintes de informação genética requeridos para a biossíntese das ativi-dades enzimáticas correspondentes.

Exemplos de possíveis polipeptídios e informação genéti-10 ca/ácidos nucléicos subjacentes que podem ser usados para se obterematividades de enzima diretamente utilizáveis em seus organismos de origemou utilizáveis na transformação de diferentes células hospedeiras são dadosem ou podem ser deduzidos de WO 02/042418, e esta exposição e particu-larmente as seqüências de ácidos nucléicos e aminoácidos corresponden-15 tes, assim como os métodos para sua obtenção ou seus análogos, são aquiincorporadas por referência. Métodos utilizáveis em tecnologia genética, par-ticularmente para isolamento, recombinação, expressão, transformação eoutros, são conhecidos por aqueles versados na técnica e podem, por e-xemplo, se basear em ou fazer uso do conhecido, métodos e reagentes a-20 presentados em Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual,2- edição, Cold Spring Harbor Press, 1989, ou em Gassen et al., "Gentech-nische Methoden - Eine Sammlung von Arbeits-anleitungen für das moleku-Iarbiologische Labor" (tradução: "Métodos de Enegenharia Genética - UmaColetânea de Protocolos de Trabalho para o Laboratório de Biologia Molecu-25 lar"), Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 1999, em F. M. Asubel(Hg.) "Short Protocols in Molecular Biology", 3ã ed., New York, Wiley 1997;ou em Asubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", Vol. 1-3, Gree-ne Publishing Associates e Wiley-lnterscience, New York, 1987.

Como um exemplo, uma enzima isolada até agora desconhecida30 com atividade biocatalítica utilizável na presente invenção (por exemplo,uma lipase, esterase (como acetila colina esterase), transferase (como coli-na acetila transferase) ou sintetase, particularmente Coenzima A sintetase(como S-acetila CoA sintetase), protease ou acilase (como aminoacilase)pode ser parcialmente seqüenciada, por exemplo, usando-se endoproteasesseletivas para digestão seletiva, por exemplo, endoprotease Lys-C, endopro-tease Glu-C, quimiotripsina, termolisina ou, de preferência, tripsina (que clivana terminação C a partir dos aminoácidos básicos arginina ou lisina) e, apósseparação, por exemplo, eletroforética ou em um gel ou por cromatografia(por exemplo, HPLC), determinação das seqüências terminais dos peptídiosresultantes, por exemplo, por exopeptidases, por exemplo, carboxipeptida-ses, como carboxipeptidases A, B ou P). Prefere-se a digestão tríptica, en-tão, análise MS/MS (TOF). As seqüências assim obtidas podem ser, então,usadas para encontrar seqüências de ácidos nucléicos codificadoras corres-pondentes (por exemplo, RNA ou, particularmente, DNA) ou seus contrafila-mentos não codificadores, que podem ser, então, usadas, para projetar pri-mers (por exemplo, por hibridização com DNA genômico ou parcialmentedigerido (por exemplo, por endonuclease de restrição)) para encontrar peda-ços mais longos de DNA que codifiquem a enzima correspondente (ou asseqüências não codificadoras correspondentes a partir do filamento parceiroem DNA de filamento duplo), que podem ser, então, unidos entre si (por e-xemplo, por Gene Walking) em um ácido nucléico codificador completo; ou apartir de bibliotecas de cDNA. Com uma combinação de métodos, como a-queles apresentados nas referências mencionadas no último parágrafo, é,então, possível isolar o DNA que codifica um polipeptídio com uma das ativi-dades desejadas.

Alternativamente, DNA sintético ou isolado (por exemplo, cDNA)de seqüências já publicadas que codifiquem as atividades biocatalíticas cor-respondentes, por exemplo, enzimas, por exemplo, lipase, esterase (comoacetila colina esterase), transferase, como colina acetiltransferase, ou sinte-tase, particularmente Coenzima A sintetase, como atividade de S-acetilaCoA sintetase, protease ou acilase (como aminoacilase), e/ou transportado-res, por exemplo, para ésteres maiores com grupos funcionais, como gruposamida, hidróxi, éter, cetona ou éster, podem ser usados e integrados em ve-tores.O termo "ácido nucléico" refere-se a polinucleotídeos, particu-larmente DNA. Quando se mencionam ácidos nucléicos recombinantes, istosignifica especificamente ácidos nucléicos na forma de vetores apropriados,assim como os produtos resultantes deles nas células hospedeiras transfor-madas (por exemplo, devido à integração no genoma, incluindo tambémplasmídios e outros e alterações concomitantes, recombinação ou eventoscomparáveis). Ácidos nucléicos recombinantes utilizáveis na transformaçãode organismos hospedeiros são, por exemplo, vetores (por exemplo, plasmí-dios, cosmídios, vetores virais ou derivados de vírus ou outros), compreen-dendo as seqüências codificadoras necessárias para a expressão das ativi-dades biocatalíticas correspondentes.

Em geral, "recombinante", sempre que usado no contexto de umácido nucléico ou particularmente DNA, é, de preferência, com seu significa-do comum, por exemplo, incluindo (1) uma seqüência que não seja de ocor-15 rência natural no organismo no qual é introduzida ou particularmente ex-pressda, ou (2) uma seqüência feita por uma combinação artificial de duasseqüências mais curtas de outra forma separadas (por exemplo, por inser-ção de uma seqüência codificadora em um plasmídio ou outro vetor). Acombinação artificial pode ser conseguida por síntese química e/ou, de pre-20 ferência, pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléi-cos, por exemplo, por técnicas de engenharia genética, como digestão par-cial, por exemplo, com endonucleases, ligação, junção ou outras. "Recombi-nante" também é usado para descrever moléculas de ácidos nucléicos quetenham sido artificialmente manipuladas, mas que contenham as mesmas25 seqüências reguladoras e regiões codificadoras encontradas no organismodo qual o ácido nucléico foi isolado.

A invenção também refere-se particularmente a uma via biossin-tética (pelo menos parcialmente) para qualquer um ou mais dos ésteres(met)acrílicos que sejam livres de grupos positivamente carregáveis ou car-30 regados, usando um ou mais organismos geneticamente modificados(OGM), assim como o OGM correspondente, de preferência selecionado demicroorganismos geneticamente modificados, de preferência unicelulares(pelo menos durante partes de seu ciclo de vida) (particularmente um proca-rioto, mais preferivelmente uma bactéria, ou um fungo, o mais preferivelmen-te uma levedura, mas também células de insetos podem ser empregadas,por exemplo, usando sistemas expressados em baculovírus), que (já em suaforma natural ou depois da transformação com um ou mais ácidos nucléicosapropriados) compreendem: a) um ácido nucléico (particularmente um DNA)de um procarioto, de preferência uma bactéria; ou menos preferivelmenteum eucarioto, como levedura, outras células de insetos, fúngicas ou vege-tais, tecidos fúngicos ou vegetais ou plantas; cada um permitindo que oOGM convertaJDiocataIiticamente um material de partida de biomassa (depreferência conforme acima definido, por exemplo, um poliol ou um açúcar,como glicose), de preferência em Iactato e também em (met)acrilil CoA; b)em combinação com um ou mais ácidos nucléicos (de preferência recombi-nantes) (particularmente um DNA) que codifique uma enzima capaz de efe-tuar a transferência de uma fração álcool de um material de partida de álco-ol, como definido acima ou abaixo) para (met)acrilil CoA com remoção dafração CoA, como uma transferase (EC 2) ou hidrolase (EC 3), por exemplo,lipase, esterase, protease ou acilase (como aminoacilase) (incluindo a codifi-cação de uma ou mais destas enzimas). Estas enzimas podem ser deriva-das de um procarioto, como uma bactéria, um eucarioto ou um organismosuperior, como lipase de Candida spp., esterase ou colina acetila transferasede células de mamíferos, e podem ser supridas à reação como estão. Alter-nativamente, também podem ser produzidas biossinteticamente a partir demateriais de partida apropriados derivados de biomassa.

Vantajosamente, o OGM, se já não apresentar esta atividade,também é, além disso, modificado para permitir que o(s) álcool(ois) escolhi-do(s) usado(s) como material de partida, como definido acima ou abaixo,entre(m) na célula e/ou, quando requerido, para permitir que o(s) produto(s)éster obtenível(eis) (particularmente resultante) deixe(m) a célula. As moda-lidades deste conceito de combinação das atividades ou materiais genéticosrecombinantes de microorganismos, particularmente procariotos ou eucario-tos unicelulares ou plantas com aqueles de organismos superiores, por e-xemplo, tomando-se material genético que codifique uma enzima capaz deefetuar a transferência de uma fração álcool de um material de partida deálcool, como definido acima ou abaixo, em (met)acrilil CoA com remoção dafração CoA para a síntese preferida dos ésteres (met)acrílicos, como o OGMresultante e seu uso na fabricação de ésteres (met)acrílicos (como definidosacima ou abaixo) e/ou processos ou métodos que usem estes OGMs na fa-bricação de ésteres (met)acrílicos (como definidos acima ou abaixo) são va-riantes particularmente preferidas da invenção, como particularmente o usodeste OGM compreendendo ácidos nucléicos recombinantes que codifiquemas atividades requeridas, além das outras atividades requeridas já rpesentese também integradas de maneira recombinante no dito OGM em processospara a fabricação de ésteres (met)acrílicos como definidos acima ou abaixo.A invenção também refere-se à fabricação do respectivo OGM, particular-mente organismos unicelulares, particularmente procariotos, como bactérias,por exemplo, E. coli, ou fungos ou eucariotos de célula única, por exemplo,leveduras, compreendendo a combinação de um ou mais ácidos nucléicosque codifiquem as atividades mencionadas neste parágrafo em a) e b). Pre-fere-se um procarioto transformado, particularmente uma bactéria, ou umfungo transformado, de preferência uma levedura, compreendendo um oumais ácidos nucléicos (naturais ou recombinantes) que codifiquem enzimascapazes de efetuar a transferência de uma fração álcool de um material departida de álcool, como definido acima ou abaixo, para (met)acrilil CoA comremoção da fração CoA.

O produto de ésteres (met)acrílicos (como definidos acima ouabaixo), quando produzido em células (por exemplo, OGM conforme men-cionado nos últimos parágrafos) pode ser isolado do sobrenadante direta-mente (também no caso de células permeabilizadas) ou (se não deixar pron-tamente as células) após a permeabilização das células (que também podepermitir a entrada de materiais de partida), por exemplo, com surfatantesapropriados ou proteínas de poros (por exemplo, o sistema do complementode mamíferos) ou após a ruptura (por exemplo, química ou mecânica) damembrana celular, por exemplo, usando um ou mais métodos que empre-guem um homogeneizador, um misturador, ruptura ultra-sônica ou outros.

No caso da ruptura, as células restantes poderiam ser usadas para produçãoadicional, por exemplo, se apenas partes da cultura forem usadas para aruptura, a reação contínua é possível, mas a produção por lotes ou de ali-mentação por lotes é preferível, embora, nos outros casos, o processo possaser operado de modo contínuo ou por lotes, o produto sendo isolado do so-brenadante.

O isolamento do produto ou do produto de ésteres acrílicos, emqualquer caso, também no caso de síntese in vitro, pode ocorrer usando-semétodos padronizados, por exemplo, usando-se cromatografia (particular-mente incluindo uma etapa de cromatografia de troca de íons), eletrodiálise,lavagem com solvente, extração, divisão ou outros, ou combinações destesmétodos. Alternativamente, pode ser possível polimerizar os monômeroséster (met)acrílico correspondentes in situ, para fornecer um homopolímeroou com a adição de outros monômeros polimerizáveis, por exemplo, acrila-mida, estireno ou outros, sem necessidade de purificação prévia. Em ummétodo particularmente preferido de recuperação de produto que é particu-larmente aplicável para a produção de ésteres (met)acrílicos voláteis, o va-por sobre a mistura de reação é condensado e, caso necessário ou deseja-do, material de partida não reagido é reciclado para o reator após a separa-ção parcial ou total da corrente de produto. Este processo pode ser auxiliadopela aplicação de calor ou vácuo ou ambos. Como um exemplo, o vapor deuma mistura aquosa de etanol e acrilato de etila formam um azeotropo que écomposto por 10,1% de água, 48,3% de etanol e 41,6% de acrilato de etilaem peso (Dados Azeotrópicos III, compilados por L. H. Horsley, Advances inChemistry Series 116, American Chemical Society, Washington DC, 1973).Com o ajuste da pressão em 165 mmHg, esta razão muda para 8,6% de á-gua, 36,3% de etanol e 55,1% do éster acrilato de etila desejado. Uma con-centração adicional do éster com relação aos outros componentes é umatécnica conhecida por aqueles versados na técnica e permitiria reciclar oetanol separado para o reator. Com a remoção do éster acrílico desta manei-ra, pode-se esperar que resultem eficiências de conversão mais elevadaspelo deslocamento do equilíbrio em favor da reação direta. Para misturas deágua/n-butanol/acrilato de n-butila, as razões em peso para os vapores aze-otrópicos são de 50%/37,6%/12,4$ à pressão atmosférica, mudando para41%/26%/33% a 100 mmHg.

Também é possível reduzir ou (quando as atividades biocatalíti-cas correspondentes não são requeridas para a sobrevivência de célulasvivas, quando são usadas) remover a atividade de certos biocatalisadores,por exemplo, com o uso de um ou mais métodos, como ruptura de genes,ácidos nucléicos anti-sentido, mutação, métodos de derrubamento ou admi-nistração de inibidores reversíveis ou irreversíveis apropriados, ou outros,para permitir o acúmulo de produtos ou intermediários desejados, por exem-plo, acrilil CoA ou metacrilil CoA, por bloqueio de vias metabólicas que levempara longe destes produtos, diferentes da via usada para sua síntese, e, depreferência, reação adicional nos ésteres de ácido (met)acrílico como defini-dos acima ou abaixo (por exemplo, uma ou mais das reações catalisadaspor ou que levem através das atividades de enzima Ε, Η, K ou M mostradasno Esquema IV). Isto pode ser útil para se conseguir uma maior disponibili-dade (concentração) de precursores requeridos para a síntese dos ésteres(met)acrílicos como definidos acima ou abaixo, por exemplo, (met)acrilil Co-A.

Embora os limites de distinção de reações in vitro e in vivo pos-sam parecer pouco nítidos em casos específicos, estas expressões são de-finidas, de preferência, da seguinte maneira:

"In vitro", quando usado nesta exposição, significa, de preferên-cia, que o processo correspondente é realizado com células ou componen-tes celulares (até enzimas purificadas) que não sejam mais viáveis (isto é,não apresentem todos (significando nenhum ou menos do que todos) os si-nais de vida, isto é, motilidade, propagação, metabolismo, hereditariedadecom ou sem mutabilidade e excitabilidade) ou com sistemas livres de célu-las, por exemplo, soluções de enzima. In vitro também pode significar semcomponentes (por exemplo, enzimas, organelas ou outros) de organismosvivos, por exemplo, puramente na presença dos materiais de partida (comoálcoois e (met)acrilil CoA).

"In vivo" significa que um processo ocorre na presença ou, depreferência, principalmente dentro de organismos ou células vivas, substan-cialmente intactadas (que mostrem as características de vida definidas noúltimo parágrafo). O termo "substancialmente intacto" também pretende in-cluir organismos ou células com membranas permeabilizadas, por exemplo,por meio de surfatantes ou proteínas de poros ou outros, na medida em queas características de vida definidas no último parágrafo ainda estejam pre-sentes.

Quando forem usadas células ou organismos intactos (pelo me-nos substancialmente) (particularmente transformados, resultando emOGM), pode ser útil, em certos casos (por exemplo, quando os álcoois domaterial de partida como definidos acima ou abaixo não forem prontamentepermeáveis pela membrana ou quando isto levar a um melhor transporte),15 que estes tenham uma ou mais moléculas transportadoras apropriadas (par-ticularmente uma integradas em suas respectivas membranas celulares, porexemplo, como uma proteína de membrana) que permitam uma fácil passa-gem dos álcoois através de membranas celulares.

Quando requerido ou útil (por exemplo, para acelerar o transpor-20 te ou para remover o produto de um equilíbrio intracelular), também estãopresentes uma ou mais moléculas transportadoras para os produtos de éster(met)acrílico, já como parte do equipamento natural dos organismos usadosou como resultado de recombinação genética e transformação.

Alternativamente, podem-se usar células que tenham membra-25 nas celulares permeabilizadas (por exemplo, por meio de surfatantes ou pro-teínas de poro conforme já mencionado).

Se forem usados organismos ou células substancialmente intac-tadas como biocatalisadores, por exemplo, no processo de uma fermenta-ção, é requerida uma menor adição (significando normalmente apenas mí-30 nima ou nenhuma) de co-fatores, de modo que esta é uma modalildade par-ticularmente preferida da invenção (embora às vezes possa ser necessáriocontribuir com nutrientes, incluindo precursores ou vitaminas utilizáveis nabiossíntese dos ditos co-fatores). Uma das razões é que as células são ca-pazes de reciclar e às vezes até sintetizar os co-fatores requeridos (por e-xemplo, ATP, NAD(P)+, NAD(P)H, FAD, FADH, Coenzima A) por si mesmas.

Entretanto, os organismos/células normalmente reagem muitosensivelmente a altas concentrações de substratos orgânicos (inibição porsubstrato ou produto, desativação por solvente). Conseqüentemente, quan-do solventes específicos tiverem de ser usados ou quando os substratos ouprodutos puderem levar a uma taxa de reação ou rendimento reduzido, tam-bém pode ser vantajoso o uso de sistemas parcialmente purificados, o queforma uma modalidade diferente da invenção. Para a purificação parcial, ascélulas são rompidas e, quando desejado, os detritos celulares são removi-dos, e se obtém um extrato livre de células.

O tempo de fermentação é selecionado, de preferência, de mo-do que se consiga um ótimo com relação à atividade de biocatalisador dese-jada (por exemplo, capaz de efetuar a transferência de uma fração álcool deum material de partida de álcool, como definido acima ou abaixo, para(met)acrilil CoA com remoção da fração CoA e/ou síntese de (met)acrilil Co-A). Por exemplo, quando a densidade celular tiver atingido um valor adequa-do, descontinua-se o cultivo. O caldo de cultura é separado de maneira co-nhecida, por exemplo, por centrifugação, e as células sedimentadas sãorompidas de maneira costumeira, por exemplo, por agitãção com materialem partículas finas, como glóbulos de vidro, por tratamento com ultra-som,usando -se um homogeneizador, um misturador ou uma prensa French, ououtros. Componentes celulares insolúveis e, caso usado, material em partí-culas, como glóbulos de vidro ou outros, são opcionalmente removidos, porexemplo, por centrifugação ou filtração, e o resíduo livre de partículas e de-tritos celulares é usado como a fonte de atividade biocatalisadora (extratobruto). O resíduo, como um extrato bruto compreendendo atividade biocata-lisadora, pode ser usado diretamente no processo de acordo com a inven-ção. Vantajosamente, entretanto, para remover ácidos nucléicos (soluçõesviscosas) e outras impurezas ou componentes interferentes (por exemplo,inibidores ou atividades de enzima perturbadoras ou outros), o extrato brutoé submetido à purificação adicional para se obter a atividade ou atividadesbiocatalíticas utilizáveis na invenção em forma mais purificada (mais enri-quecida). De preferência, o extrato celular bruto é submetido a uma ou maisetapas de purificação que, como tais, são conhecidas na técnica para remo-ver componentes interferentes do extrato. Alternativamente, o biocatalisadorcapaz de efetuar a transferência de uma fração álcool de um material de par-tida de álcool, como definido acima ou abaixo, para (met)acrilil CoA com re-moção da fração CoA pode ser secretado pelo microorganismo no meio decultura, com o que pode ser prontamente recuperado e usado como umapreparação bruta. A preparação bruta é qualquer solução compreendendo obiocatalisador capaz de efetuar a transferência de uma fração álcool de ummaterial de partida de álcool, como definido acima ou abaixo, para(met)acrilil CoA com remoção da fração CoA que inclua componentes con-taminantes, como componentes do meio de crescimento ou compostos pre-sentes como resultado do metabolismo do microorganismo.

O termo "purificado" significa, de preferência, "em forma pelomenos parcialmente purificada" (= "em forma enriquecida") ou, mais preferi-velmente, purificado no sentido mais restrito, isto é, em forma praticamenteisolada (por exemplo, no caso de proteínas isoladas, como enzimas capazesde efetuar a transferência de uma fração álcool de um material de partida deálcool, como definido acima ou abaixo; para (met)acrilil CoA com remoçãoda fração CoA ou CoA sintetase), particularmente com mais de 50, mais par-ticularmente mais de 95% de pureza em peso, em comparação com outrosoligo- ou polipeptídios presentes).

Além disso, a invenção refere-se ao uso dos organismos men-cionados, que (aqui como em todos os outros lugares em que se mencionamorganismos na presente descrição) podem ser, de preferência, OGM, con-forme acima mencionado, como plantas ou partes de plantas ou tecidos ve-getais ou células de insetos ou particularmente microorganismos (particu-larmente transformados), particularmente células, mais particularmente célu-las hospedeiras para o respectivo material genético recombinante (comobactérias, por exemplo, E. coli, K. Iactis, Lactobacillus spp., Propionibacteri-um shermanii, Clostridium propionicum, Zymomonas mobilis, Bacillus spp.ou Bacillus coagulans, Rhodococcus spp., Pseudomonas spp., Streptomyeesspp., Megasphera spp., para o caso de condições extremas (por exemplo,de temperatura e/ou pH) arquebactérias, leveduras ou outros fungos, como5 Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces spp., Pichia spp., Hansenulospp., Candida spp., Trichosporon spp. ou Yamadazyma spp.) transformadascom ácidos nucléicos apropriados, na produção de um ou mais dos biocata-Iisadores requeridos, particularmente um biocatalisador capaz de efetuar atransferência de uma fração álcool de um material de partida de álcool, como10 definido acima ou abaixo, para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoAou, alternativamente ou além disso, com atividade de sintetase, particular-mente Coenzima A (particularmente S-acetila coenzima A) sintetase, quepode ser, então, usada nos métodos de fabricação (in vitro, in vivo ou com-binados) de acordo com a invenção para a síntese de ésteres (met)acrílicos15 como definidos acima ou abaixo.

A menos que indicado de outra forma acima ou mais abaixo,termos gerais, símbolos e nomes adicionais usados na descrição da presenteinvenção têm, de preferência, os seguintes significados (em que definiçõesmais específicas, em cada caso separadamente ou em combinação, podem20 ser usadas para substituir termos mais gerais para definir modalidades maispreferidas da invenção, também com relação a termos gerais, símbolos enomes e suas explicações ou significados preferidos já dados acima):

um catalisador utilizável no método ou processo de acordo coma invenção pode ser qualquer componente capaz de efetuar a transferência25 de uma fração álcool de um material de partida de álcool, como definido a-cima ou abaixo, para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA.

O termo "biocatalisador", por exemplo, em "biocatalisador capazde efetuar a transferência de uma fração álcool de um material de partida deálcool, como definido acima ou abaixo, para (met)acrilil CoA com remoção30 da fração CoA" ou "biocatalisador com (= possuindo) atividade de transfera-se", quando aqui usado, refere-se a um biocatalisador com a respectivamen-te atividade (por exemplo, uma enzima capaz de efetuar a transferência deuma fração álcool de um material de partida de álcool, como definido acimaou abaixo, para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA, como umatransferase, lipase, esterase, acilase ou protease), particularmente uma en-zima, mais preferivelmente um polipeptídio, com a dita atividade de transfe-rase, de preferência conforme aqui descrita. Se não for declarado de outraforma, todos estes termos incluem não apenas a seqüência de ocorrêncianatural, "autêntica", de um polipeptídio da invenção, que são as modalidadespreferidas da invenção, mas também todos os seus mutantes, variantes efragmentos que exibam a respectiva atividade, de preferência com pelo me-nos 1%, mais preferivelmente pelo menos 10% da atividade relativa da en-zima natural (de origem) (particularmente em forma isolada) da qual são de-rivados. Os termos lipase, protease, acilase, transferase e esterase são, depreferência, definidos aciima no parágrafo com relação a enzimas isoladasaté agora desconhecidas.

O termo "biocatalisador com [= "possuindo", "que tem"] atividadede sintétase" refere-se, de preferência, a um biocatalisador capaz de transfe-rir uma fração ácido carboxílico, particularmente acrilato e/ou metacrilato,para o grupo sulfidrila da Coenzima A sob consumo de energia derivada detrifosfatos de nucleosídeos, como ATP, por exemplo, Coenzima A sintetase,como S-acetila Coenzima A sintetase.

"Um biocatalisador capaz de efetuar a transferência de uma fra-ção álcool de um material de partida de álcool, como definido acima ou abai-xo, para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA" significa particular-mente que o biocatalisador correspondente, de preferência uma enzima, éativo em sistemas de ensaio padrão usados para determinar a atividade daenzima desejada que catalisa a reação nativa para esta enzima particular.Prefere-se como este biocatalisador uma enzima EC grupo 2, isto é, uma"transferase", incluindo, mas não restritas a, transaminases, transamidases,transcetolases, transfosforilases ou colina acetila transferase que sabida-mente catalise o movimento de um grupo químico de um composto para ou-tro, ou uma EC classe 3; "hidrolase", que também seja capaz de catalisadorreações de transesterificação. Enzimas hidrolase adequadas são, por exem-pio, Iipases de Candida antartica (CAL B), Iipase pancreática suína (PPL)1Candida rugosa (CRL), Pseudomonas cepacia (PCL) e outras; esterases,como esterase de fígado de porco (PLE), acetila colina esterase; tambémproteases, como subtilisina, protease, por exemplo, de Aspergillus spp., Ba-cillus spp., Rhizopus spp. e outras hidrolases, como penicilina amidase ou(particularmente L-amino) acilase, podem ser enzimas adequadas para cata-lisar a transferência. Biocatalisadores utilizáveis na presente invenção ou empelo menos um dos ensaios subseqüentes mostram vantajosamente umaatividade de mais de 0,01 nmoles/min por mg de proteína, mais preferivel-mente de 0,1 nmoles/min por mg de proteína, ainda mais preferivelmente de0,4 nmoles/min por mg de proteína. Por exemplo, quando se testa a ativida-de de colina acetila transferase, conhecem-se métodos para a determinaçãoda atividade da enzima (que também é aplicável no caso de enzima ligadaou associada a membrana, por exemplo, medindo homogeneizados), porexemplo, usando acetila CoA marcada com 14C, vide, por exemplo, Fonnum,F., Biochem. J. 115, 465-79 (1969) ou Fonnum, F., J. Neurochem. 24, 407(1975), ou Rylett et al., J. Neurochem. 45, 611-20 (1993), por exemplo, de-terminação das velocidades de reação iniciais a 37C em 40 μί de mistura dereação contendo 5 - 1.200 μΜ de [1-14C]acetila CoA (Amersham), 0,1 - 3,5mM de colina, 0,2-10 ng de biocatalisador com atividade de colina acetil-transferase, 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,4), 250 mM de NaCI, 1 mM deEDTA e 0,5 mg/mL de BSA (vide Ohno et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA98(4), 2017-22 (2001)). Em um método exemplificativo preferido, para testara utilidade de um biocatalisador para finalidades sintéticas, por exemplo,primeiro a atividade de colina acetila transferase do biocatalisador a ser tes-tado é determinada usando-se seu substrato natural acetato. Então, umasolução de cloreto de colina a 7 mM é preparada em tampão a pH 7,46 (1,1mM de Na2HPOVOy mM de NaH2PO4). A solução de colina (3 mL) é incu-bada a 37°C durante 15 min. Acetila CoA (2 mg, 2,5 μπιοίβε) e 0,1 mL decolina acetiltransferase a pH 7,4 ou o biocatalisador a ser examinado (porexemplo, com uma atividade de, por exemplo, aproximadamente 5,5 a 20nmoles/min com relação ao acetato) é adicionado, e a absorbância é medidacom o tempo. Ao término da reação, a mistura de reação é armazenadacongelada até ser analisada por cromatografia iônica (IC). A análise IC érealizada em um instrumento Dionex DX-300 com uma coluan IonPacCS12A, uma fase móvel de 90% de ácido metnaossulfônico a 20 mM/10%5 de uma solução a 90% (v/v) de acetonitrila em água e detecção de conduti-vidade (sistema de regeneração de cátion no modo água externa com auto-supressão CSRS). Após 435 min, 0,10 mM de acetilcolina podem ser encon-trados, com a enzima possuindo uma atividade inicial presumida de 20 nmo-les/min. Um biocatalisador com atividade suficiente deve, nesse sistema de10 teste, proporcionar vantajosamente mais de 0,02 mM de acetilcolina sob es-tas condições. Mais preferivelmente, a atividade com metacrilil-CoA ou, depreferência, acrilil-CoA deve ser maior que 10%, ainda mais preferivelmentemaior que 50% em qualquer sistema de teste usado da atividade com acetil-CoA para um biocatalisador com atividade de colina acetil-transferase que15 seja particularmente útil em um processo ou método da presente invenção.Exemplos de enzimas com atividade de colina acetiltransferase são aquelasde homo sapiens ou outros vertebrados, como camundongos ou particular-mente ratos, ou mais geralmente de outros metazoários. Também estão in-cluídas aqui colina acetila transferases recombinantes, como, vantajosamen-20 te, colina acetila transferase de rato recombinante AG220 da Chemicon In-ternational Inc., Temecula, Califórnia, ou similares.

Para testar a atividade de lipase, também se podem usar proto-colos conhecidos, por exemplo, conforme descrito em Biotechnology Tech-niques 10(4), 283-286, usando-se, por exemplo, 1-undecanol, 9-decen-1-ol,25 10-undecen-1-ol, 13-tetradecen-1-ol, álcool oleílico ou álcool estearílico e,por outro lado, acrilato de metila ou metacrilato de metila como substratos.

Alternativamente, a atividade de esterase ou lipase pode ser de-terminada, por exemplo, medindo-se a quantidade de ácido graxo liberadapela enzima de teste durante um dado período a partir de uma emulsão de30 trioleína (azeite de oliva) a 37°C a pH 7,0 e na presença de 0,025% (concen-tração final) de taurocolato de sódio. Para assegurar que todos os ácidosgraxos liberados são medidos, a titulação final é realizada até pH 9,0, e umatitulação em branco na emulsão de substrato é realizada para se determinarqualquer ácido não resultante da atividade de lipase. Uma unidade é definidacomo a quantidade de enzima que libera um micromol de ácido graxo porminuto sob as condições do ensaio. A atividade específica é expressada emunidades FIP internacionais por mg de enzima. Como equipamento, usam-se um titulador automático, um homogeneizador de alta velocidade, um ba-nho de água e um agitador magnético. Os reagentes são goma arábica dequalidade da Farmacopéia Européia, trioleína (azeite de oliva) USP, tauroco-lato de sódio de qualidade FIP. 110 g de goma arábica e 125 g de cloreto decálcio são dissolvidos em água destilada e completados até 1 L, seguido poragitação durante 30 min à temperatura ambiente para solubilizar o material,e centrifugação ou filtração para produzir uma solução clara. Armazenar a5°C em um refrigerador. Para se obter a solução de substrato, a 130 mL detrioleína, adicionam-se 400 mL da solução de goma arábica, seguido poremulsificação a alta velocidade em um misturador a temperaturas abaixo de30°C. Usando-se controle microscópico, 90% das gotículas devem ser me-nores que 2 a 3 micrômetros de diâmetro, o restante não excedendo 10 mi-crômetros. Para a solução de enzima, a enzima a ser testada é dissolvidaem salina a 1%, de preferência em uma concentração correspondendo a 2,4a 3,6 U de lipase por mL. Para o teste, 24 mL de substrato, 2 mL de soluçãode taurocolato (0,5 g de taurocolato dissolvidos em 100 mL de água destila-da) e 9 mL de água destilada são colocados em um recipiente de reação eequilibrados a 37°C com agitação magnética. O eletrodo de pH e a ponta dabureta são mergulhados na solução, e o pH é ajustado a 6,7 com NaOH(0,02 Μ). A bureta automática é zerada, e 5 mL da solução de enzima sãoadicionados, o cronômetro é ligado, e o pH mantido em 7,0 com o prosseguirda reação. Depois de 10 min, o pH é abruptamente levado a 9,0 pela adiçãomanual de NaOH (0,02 M). Isto é feito rapidamente (aproximadamente 30segundos), e o volume total de NaOH é registrado (N1). Faz-se uma titulaçãode controle usando água em lugar de enzima, e a titulação é determinada(N2). A titulação manual pode ser usada quando o pH 7,0 é mantido durantetoda a adição manual de NaOH. Para o cálculo da atividade, 1 mL de NaOHcorresponde à neutralização de 20 micromoles de ácidos graxos. Por exem-plo, quando 5 mL de solução de enzima liberam Ni mL, e o controle N2 mLde NaOH, e em que N1 é a amostra, N2 é o controle, e C é a concentraçãode enzima em mg/mL, então, a atividade específica é determinada de acordocom a seguinte fórmula:

<formula>formula see original document page 31</formula>

(Alphametrix Ltd., Cambridge, UK).

"Um biocatalisador com atividade de sintetase" significa particu-larmente que o biocatalisador correspondente, de preferência uma enzima, éativo em sistemas de ensaio padrão usados para determinar a atividade deacetila CoA sintetase. Por exemplo, o seguinte teste de enzima acopladaque monitoriza a formação de AMP pode ser usado para determinar a ativi-dade de acetila CoA sintetase: o ensaio consiste em ATO (2,5 mg, 5 χ 10"3mmoles), CoA (0,46 mg, 6 χ 10"4 mmoles), MgCI2 (4 mg, 2 χ 10'2 mmoles),fosfoenolpiruvato (0,19 mg, 9,4 χ 10'4 mmoles), KCI (1,2 χ 10'4 mmoles),NADP (0,25 mg, 3,6 χ 10'4 mmoles), ácido acético (IO"1 a 10"4 mmoles), ace-tila coenzima A sintetase ou o biocatalisador a ser testado (de preferênciaem uma atividade de aproximadamente 0,5 unidades), piruvato quina-se/lactato desidrogenase (1 unidade), mioquinase (1 unidade) e completadoaté um volume total de 1 mL com tampão Tris (0,25 M, pH 7,2). A reação émonitorizada por observação da diminuição da absorbância a 340 nm devidoà oxidação de NADH em NAD+. O Vmax e as constantes de ligação são cal-culados por gráficos de Lineweaver-Burk e Eadie-Hofstee. Outros métodosde determinação são possíveis, por exemplo, usando a formação de acetil-CoA acoplada à reduçpão de NAD+ mediante malato desidrogenase e citra-to sintetase, por exemplo, conforme descrito por Cai et ai., J. Bacteriol. 182,2113-8 (2000) ou Charles et ai., Genetics 146, 9877-82 (1997). É particular-mente preferido o método empregado pela Sigma para testar a atividade decolina acetila transferase, que é uma modificação do método descrito porBerg, P., J. Biol. Chem. 222, 991-1013 (1956). Aqui, o acetila CoA formado éconvertida com hidroxilamina em acetil-NHOH. Este é, então, misturado comuma solução de FeCb para fornecer um produto de cor marrom, cuja absor-vência é, então, medida a 546 nm, 1 cm de trajeto de luz. Em resumo, asconcentrações de ensaio finais da mistura de reação (1,10 ml_ por frasco)são: 136 mM de fosfato de potássio, 4 mM de cloreto de magnésio, 9,1 mMde ATP, 45 mM de fluoreto de potássio, 9,1 mM de acetato de potássio, 9,1mM de glutationa reduzida, 0,35 mM de coenzima A, 182 mM de hidroxila-mina e 0,01 - 0,04 unidades de S-acetila coenzima A sintetase, esta sendoadicionada em um volume de 0,1 mL após equilibrar a solução restante a37°C. O pH é de 7,5. Depois da adição da enzima, a mistura é imediatamen-te misturada e incubada durante 20 min. Depois disso, 2 mL de uma soluçãode 370 mM de FeCl3/3,3% de ácido tricloroacético são adicionados, seguidopor mistura com conversão e transferência para cubetas de medição. Naamostra em branco, falta acetila CoA. De preferência, um biocatalisador comatividade de S-acetila CoA sintetase utilizável na presente invenção nos sis-temas de ensaio precedentes tem uma atividade que esteja na área de maisde 0,0005 unidades por mg de proteína, mais preferivelmente na área de0,001 a, por exemplo, 15 unidades por mg de proteína, uma unidade sendodefinida como a quantidade de biocatalisador que forma 1,0 μιηοΙ de S-acetila Coenzima A a partir de acetato, ATP e coenzima A por min a 37°C epH 7,5. Para testar a atividade de CoA sintetase em uma escala preparató-ria, pode-se iniciar uma reação (por exemplo, em uma escala de 7 mL) econduzi-la em tampão de 10,8 mM de fosfato de sódio/1,4 mM de hidróxidode sódio da seguinte maneira: uma solução de acetato de sódio a 7,4 mM eCoA a 0,75 mM é preparada e incubada a 37°C durante 15 min. S-acetil-coenzima A sintetase, da Sigma, catálogo nQ A 1765, de levedura de pão, ouo biocatalisador a ser testado (por exemplo, 0,2 mg) e 28,4 mg de ATP sãoadicionados. A mistura (pH de cerca de 7,36) é, então, incubada a 37°C emcubetas de quartzo, e a absorbância da mistura a 232 nm é medida com otempo. Por exemplo, uma atividade inicial de aproximadamente 1 a 600nmoles de formação de acetila CoA por minuto ou mais é encontrada nesseensaio. A atividade preferida deste tipo para a preparação de (met)acrilil CoA(efeito como atividade de (met)acrilil CoA sintetase) pode ser vantajosamen-te mostrada conforme descrito nos Exemplos. De preferência, a atividade deS-acetila CoA sintetase para a formação de metacrilil-CoA ou, de preferên-cia, acrilil-CoA na presença de acrilato ou metacrilato deve ser de mais de10%, ainda mais preferivelmente de mais de 50% em pelo menos um siste-ma de teste para a determinação da atividade para formação de acetil-CoApara um biocatalisador com atividade de acetila CoA sintetase, que seja par-ticularmente útil para um processo ou método de acordo com a presente in-venção. Exemplos de enzimas com atividade de acetila CoA sintetase são aacetila CoA sintetase de levedura, por exemplo, levedura de pão (obtenível,por exemplo, na Sigma ou Roche), de bactérias, por exemplo, Salmonellaentérica, Sinorhizobium meliloti, Rhodospirillum rubrum, de animais superio-res, por exemplo, coração de bovinos ou fígado de pombo, ou plantas.

Outras atividades de enzimas podem ser testadas conforme a-qui descrito e/ou descrito em trabalhos padronizados, como a série "Methodsin Enzymology", Academic Press (agora pertencente à Elsevier).

Quando se mencionam ácidos, isto pretende englobar tanto áci-dos livres, quanto sais do mesmo, ou suas misturas, por exemplo, sais demetais ou amônio ou outros. Normalmente, na presente exposição, os áci-dos são citados na forma dos ânions correspondentes, por exemplo, comoacrilato ou acetato.

"(Met)acrilila" significa acrilila e/ou (de preferencia) metacrilila.(Met)acrilato significa acrilato e/ou (de preferência) metacrilato e/ou sais domesmo, (met)acrilila significa acrilila, metacrilila ou metacrilila e acrilila.

Para ésteres de ácido acrílico e/ou (de preferência) ácido metacrí-lico (ou de ácido (met)acrílico) (aqui também chamados de ésteres ésteresacrílicos, metacrílicos ou (met)acrílicos) que sejam livres de grupos positiva-mente carregados (particularmente incluindo carregáveis) e que sejam produ-zidos de acordo com o processo da presente invenção, "livres de grupos posi-tivamente carregados" significa particularmente livres de grupos amino primá-rios, secundários ou terciários positivamente carregados ou carregáveis, ou degrupos amino quaternários positivamente carregados. São preferidos comoestes ésteres um ou (no mesmo método ou processo de fabricação menospreferido) mais ésteres (de ácido) (met)acrílicos selecionados de ésteres deálcool C1-C20 alquílico de (ácido) (met)acrílico não substituídos ou substituí-dos, em que a C1-C20 alquila é não substituída ou substituída por uma oumais, particularmente até três, frações independentemente selecionadas dehidróxi, C1 - C7 alcóxi, C2 - C7 alcanoilóxi, C2 - C7 alcanoilamino, oxo, carba-moíla, N-C1 - C7 aquilaminocarbonila, N,N-di-(C1 - C7 alquila)-aminocarbonilae C1 - C7 alcoxicarbonila, é linear, ramificada uma ou mais vezes e podecompreender uma ou mais duplas ligações; mais preferidos são (met)acrilatode n-butila (muito preferido), (met)acrilato de etila (preferido), (met)acrilato demetila (preferido), ou também (met)acrilato de n-propila, isopropila, isobutila,sec-butila, terc-butila, 2-etilbutila, n-pentila, isopentila, 1-metilpentila, 1,3-dimetilbutila, n-hexila, isoeptila, 1-metilexila, 2-etilexila, estearila ou 2-hidróxietila, ou (embora menos preferivelmente) misturas de dois ou mais destes.São altamente preferidos o éster n-butílico ou etílico de particularmente ácidoacrílico, também de ácido metacrílico ou de ambos.

Em "álcoois que sejam livres de grupos positivamente carrega-dos" e que sejam de preferência usados como materiais de partida no méto-do ou processo da invenção, "livres de grupos positivamente carregados"significa particularmente livres de grupos amino primários, secundários outerciários positivamente carregados ou carregáveis, ou de grupos aminoquaternários positivamente carregados. São preferidos como estes álcooisum ou (no mesmo método ou processo de fabricação menos preferivelmen-te) mais álcoois C1 - C20 alquílicos, em que a C1 - C20 alquila é não substitu-ída ou substituída por uma ou mais, particularmente até três, frações inde-pendentemente selecionadas de hidróxi, C1 - C7 alcóxi, C2 - C7 alcanoilóxi,C2 - C7 alcanoilamino, oxo, carbamoíla, N-C1 - C7 aquilaminocarbonila, N,N-di-(C1 - C7 alquila)-aminocarbonila e C1 - C7 alcoxicarbonila, é linear, ramifi-cada uma ou mais vezes e pode compreender uma ou mais duplas ligações;mais preferidos são n-butanol (muito preferido), etanol (preferido) ou metanol30 (preferido) ou também n-propanol, isopropanol, isobutanol, sec-butanol, terc-butanol, 2-etilbutanol, n-pentanol, isopentanol, 1-metilpentanol, 1,3-dimetilbutanol, n-hexanol, isoeptanol, 1-metilexanol, 2-etilexanol, álcool es-tearílico ou 2-hidroxietanol, ou (embora menos preferivelmente) misturas dedois ou mais destes. São altamente preferidos n-butanol ou etanol.

Em uma modalidade preferida adicional da invenção, a invençãorefere-se a um processo ou método para a fabricação de (met)acrilato de5 etila, particularmente acrilato, ou (met)acrilato de n-butila, particularmenteacrilato (preferido), ou (met)acrilato de metila, particularmente acrilato demetila (preferido), compreendendo a reação de etanol e/ou n-butanol (prefe-rido) e/ou (metanol) (preferido) e acrilil-CoA e/ou metacrilil-CoA, de preferên-cia acrilil-CoA, opcionalmente ou de preferência na presença de um catali-10 sador que pode ser um catlaisador inorgânico, orgânico" ou organometálico;ou, mais preferivelmente, um biocatalisador com atividade de transferase, depreferência conforme acima definido, que ocorra in vitro. Alternativamente,prefere-se o processo ou método correspondente que ocorre in vivo. Damesma forma, prefere-se o processo ou método correspondente ocorrendo15 parcialmente in vitro, parcialmente ocorrendo in vivo (por exemplo, quandoprimeiro (met)acrilil CoA é formada in vivo, então (por exemplo, após a ruptu-ra celular), a (met)acrilil CoA é usada para a síntese de ésteres(met)acrilílicos in vitro, na presença de uma enzima capaz de efetuar a trans-ferência de um radical álcool de um material de partida de álcool, como defi-20 nido acima ou abaixo, para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA),que forma uma modalidade preferida da invenção.

Outra modalidade preferida da invenção refere-se ao dito pro-cesso ou método, em que o biocatalisador capaz de efetuar a transferênciade uma fração álcool de um material de partida de álcool, como definido a-25 cima ou abaixo, para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA está den-tro de um organismo, particularmente um microorganismo (mais preferivel-mente pelo menos durante parte de seu ciclo de vida unicelular), de prefe-rência um OGM conforme acima definido. Em ainda outra modalidade, o ditoorganismo está intacto (particularmente pelo menos viável conforme acima30 definido); em outra modalidade, o organismo é rompido ou permeabilizado.

Em ainda outra modalidade preferida, a invenção refere-se a umprocesso ou método conforme acima descrito, em que a (met)acrilil CoA éobtida por reação de coenzima A com ácido (met)acrílico ou sais do mesmona presença de uma substância fornecedora de energia, particularmente ATP1e um biocatalisador com atividade de sintetase, de preferência atividade deCoenzima A sintetase (como S-acetila CoA sintetase). De preferência, ambas5 as reações (formação de (met)acrilil-CoA e subseqüente transferência paraum álcool) ocorrem em um recipiente, de preferência durante um período detempo pelo menos parcialmente superposto, mais preferivelmente ao mesmotempo. Alternativamente, a reação em um recipiente ocorre de preferência demodo que a reação catalisada pelo biocatalisador com atividade de sintetase10 (particularmente S-acetila CoA sintetase) ocorra primeiro, e os produtos obte-níveis ((met)acrilil CoA) sejam subseqüentemente convertidos em(met)acrilato de etila, particularmente acrilato, (met)acrilato de metila, particu-larmente acrilato de metila ou, de preferência, (met)acrilato de n-butila ou ou-tro acrilato (preferido), usando-se um biocatalisador capaz de efetuar a trans-15 ferência de uma fração álcool de um material de partida de álcool, como defi-nido acima ou abaixo, para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA.

São mais preferidos todos os processos e métodos menciona-dos acima e abaixo, em que os biocatalisadores sejam enzimas, particular-mente polipeptídios, com a respectiva atividade.20 Ainda mais preferido é qualquer processo ou método descrito

acima" ou abaixo, em que a (met)acrilil CoA seja produzida metabolicamente,particularmente a partir de um ou mais materiais de partida derivados de bi-omassa (particularmente conforme acima descrito).

É muito preferido qualquer processo ou método descrito acima25 ou abaixo, em que a produção de metacrilil CoA e/ou (de preferência) acrililCoA ocorra metabolicamente (por exemplo, a partir de metacrilato e/ou acri-lato livre ou mediante outros precursores metabólicos, como Iactil CoA), e aconversão com um biocatalisador capaz de efetuar a transferência de umafração álcool de um material de partida de álcool, como definido acima ou30 abaixo, para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA, na presença domaterial de partida de álcool escolhido, ou, em cada caso, materiais de par-tida para sua biossíntese derivados de biomassa, nos produtos é conduzidapor meio de, de preferência em, um organismo geneticamente modificado(OGM), isto é, na medida em que for necessário ou desejado, modificadopara compreender as atividade biocatalíticas requeridas, e, quando requeri-do, transportadores. De preferência, este processo ocorre in vivo.

Um processo muito preferido adicional é a realização das bio-transformações acima descritas em um modo contínuo, em que o álcool es-colhido é alimentado a um reator contendo biomassa com a capacidade sin-tética conforme descrita para um processo ou método de acordo com a in-venção acima, com remoção contínua de vapores do espaço superior, sub-missão destes vapores a uma destilação fracionada e o retorno dos resíduosde destilação ao reator.

Com relação ao OGM transformado com um ou mais ácidos nu-cléicos compreendendo uma ou mais seções que codifiquem ou permitam aexpressão de um biocatalisador capaz de efetuar a transferência de uma15 fração álcool de um material de partida de álcool, como definido acima ouabaixo, para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA1 a invenção refere-se, de preferência, a um OGM que seja um inseto, um tecido de inseto ou,de preferência, um tecido de inseto; uma planta ou um tecido vegetal; ou, depreferência, um microorganismo (pelo menos durante partes de seu ciclo de20 vida unicelular), particularmente um microorganismo procariótico ou fúngico,mais preferivelmente uma bactéria ou uma levedura, em que o ácido nucléi-co compreendendo uma ou mais seções que codifiquem um biocatalisadorcom a dita atividade seja um ácido nucléico recombinante.

Um método preferido é o uso de um OGM conforme descrito em25 qualquer um dos parágrafos acima, em que, além disso, estejam presentesum ou mais ácidos nucléicos compreendendo uma ou mais seções que codi-fiquem um biocatalisador capaz de efetuar a transferência de um radical ál-cool de um material de partida de álcool, como definido acima ou abaixo,para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA, um ou mais ácidos nu-30 cléicos (em uma modalidade preferida também recombinantes, em outrasendógenos) compreendendo uma ou mais seções que codifiquem e permi-tam a expressão de (S-acetila CoA) sintetase.Modalidades adicionais da invenção são apresentadas nas rei-vindicações, de preferência na reivindicações dependentes, que são, conse-qüentemente, aqui incluídas por referência; em que qualquer uma ou maisexpressões gerais, independentemente entre si, podem ser substituídas poruma definição mais específica, conforme apresentada na presente descri-ção, fornecendo, assim, modalidades ainda mais preferidas da invenção.

A invenção refere-se particularmente ao uso das enzimas men-cionadas nos Exemplos e/ou aos processos e condições de reação aí descri-tos para fins de síntese de acrilila- ou metacrilil CòA e acrilato de etila, acrila-to de metila e acrilato de n-butila.

Exemplos

Os Exemplos a seguir servem para ilustrar a invenção, sem limi-tar seu âmbito. H-CoA significa a forma livre de coenzima A (com o grupoSH), CoA o radical correspondente ligado mediante -S-, sem o hidrogênio.15 Exemplo 1: síntese in vitro de acrilato de etila

a) Preparação de acrilil-CoA por alimentação por lotes:Mistura de reação inicial para a preparação de acrilil-CoA a par-tir de acrilato e H-CoA em 3,5 ml_ de volume: a reação é conduzida em 3,3g/100 ml_ de clodriato de TRIZMA (cloridrato de tris(hidroximetil) aminometa-20 no, Sigma) e 0,49 g/100 mL de base TRIZMA (pH 7,12 a 37°C). Os outros

Componente Concentração (mM)MgCI2.6H20 10Acrilato de sódio 150ATP 5H-CoA 1

Adiciona-se S-acetüa CoA sintetase (acetato tioquinase de leve-dura de pão, Sigma, Saint Louis, Missouri, USA; catálogo n9 1765) (1,9mg/mL). Usando-se a abordagem de alimentação por lotes, que significa a25 adição por etapas (alimentação) de H-CoA, alíquotas de H-CoA são adicio-nadas após 5, 10, 15 e 20 minutos, de modo que as concentrações de H-CoA e ATP no reator sejam aumentadas 1 mM de cada vez. Depois de 25minutos, uma amostra de 0,154 mL (deixando 3,6 mL da mistura de reação)é extraída e analisada quanto a acrilil CoA por HPLC (instrumentação: Agi-Ient Technologies HP 1090L com Detector de UV de Comprimento de OndaVariável HP1100 e Chemstation (rev. A.06.01) Data System; coluna: LunaC18 da Phenomenes, 25 cm χ 4,6 mm de diâmetro interno, diâmetro de gló-bulos 5 μηι; fase móvel: A: 25 mM de formato de amônio (pH 7,0), B: meta-nol; gradiente de 5% de B durante 0 min, então, até 30% de B em 20 min;fluxo de 1 mL/min (aproximadamente 130 bar), temperatura de forno de40°C, Detector: UV a 254 nm; volume de injeção de 5 μί, Tempo de opera-ção de 28 min; os picos são encontrados nos seguintes tempos de retenção:ATP a aproximadamente 3,7 min, Coenzima A a aproximadamente 10,5 min,acetila CoA a aproximadamente 14,4 min, acrilil CoA a aproximadamente17,5 min, produto de adição bis a aproximadamente 15,9 min.

Depois de 25 min, a análise de HPLC determina que 0,128% deacrilil CoA se formaram após 25 minutos.

b) Preparação de acrilato de etila

Preparação de acrilato de etila por lotes:

A mistura de reação inicial para a preparação de acrilato de etila

a partir de etanol e lipase, usando 3,6 mL da mistura de reação preparadano Exemplo 1, que contém 0,128% de acrilil CoA. A reação é conduzida a37°C. Os componentes da mistura de reação são os seguintes:_

Componente QuantidadeSolução de acriliol CoA a 0,128% 3,60 mLLipase (Novozyme 435) 0,36 gEtanol a 99% 0,24 mL

Primeiro, 0,36 g de lipase (Novozyme 435 imobilizada; Sigma)são adicionados aos 3,6 mL de solução de acrilil CoA (0,128%). A lipase émisturada à solução, e se adicionam 0,24 mL de etanol. A mistura é incuba-da a 37°C e amostrada em 1, 2, 3 e 19 horas. As amostras são analisadasquanto à formação de acrilato de etila por análise GC do espaço superior e,depois de 3 horas, a concentração de acrilato de etila é de 12 ppm.Exemplo 2Uma solução de acrilila coenzima A a 0,078% é preparada se-guindo-se o método descrito no exemplo 1a. Novozyme 435 (Lipase B deCandida antarctica produzida por fermentação submersa de um microorga-nismo Aspergillus oryzae geneticamente modificado e adsorvida em umaresina macroporosa; Novozyme Corp., Bagsvaerd, Dinamarca) (100 mg/mL)e n-butanol (51 mg/mL) são adicionados seguindo-se o exemplo 1 e, depoisde 3 horas a 37°C, a concentração de acrilato de n-butila é determinada co-mo sendo de 3,2 ppm.

Exemplo 3

Uma solução de acrilila coenzima A é preparada a uma concen-

tração de 890 ppm seguindo-se um método similar ao delineado no Exemplo1a, mas preparada em água e usando um terço da quantidade de S-acetilacoenzima A sintetase. A isto, 44 mg/mL de etanol e 100 mg/mL de Novozyme435 são adicionados seguindo-se o exemplo 1 b. Depois de 2 horas a 37°C, aconcentração de acrilato de etila é encontrada como sendo de 16,4 ppm.

Exemplo 4

Uma solução de acrilila coenzima A é preparada a uma concen-tração de 1.260 ppm seguindo-se o Exemplo 3, e se adicionam a isto 44mg/mL de etanol e 100 mg/mL de Lipase B. Depois de duas horas a 37°C, aconcentração de acrilato de etila é de 4,8 ppm.

Exemplo 5

Repetindo-se o exemplo 4, mas substituindo-se a enzima por Li-pase C2 de Candida cylindracea (Alphamerix Ltd.), obtém-se uma concen-tração de acrilato de etila de 1,4 ppm.

Exemplo 6

Substituindo-se a Novozyme 435 no exemplo 4 por lipase dePseudomonas fluorescens (Alphamerix Ltd.), resulta uma concentração deacrilato de etila de 7,3 ppm.

Exemplo 7

Acrilila coenzima A é preparada a uma concentração de 1460

ppm seguindo -se o exemplo 3. A esterificação é realizada conforme descritono exemplo 1b, mas substituindo-se a Novozyme 435 por L-aminoacilase deAspergillus spp., o que resulta em uma concentração de acrilato de etila de22,7 ppm.Exemplo 8

Repetindo-se o exemplo 7, mas usando-se protease de Asper-gillus oryzae, resulta em uma concentração de acrilato de etila de 50,1 ppm.Exemplo 9

Substituindo-se o etanol no exemplo 7 por metanol e usando-seNovoztme 435 como biocatalisador, resulta em uma concentração de acrilatode metila de 17,4 ppm.Exemplo 10 (Controle)

Removendo-se a Novozyme 435 no exemplo 3, não resulta emnenhum nível detectável de formação de acrilato de etila.

Claims (22)

1. Processo ou método para a fabricação de um éster ou ésteresmetacrilato de ácido acrílico e/ou ácido metacrílico que sejam livres de gru-pos positivamente carregados, o dito processo compreendendo a reação deum ou mais álcoois que sejam livres de grupos positivamente carregadoscom acrilil-CoA e/ou metacrilil-CoA na presença de um catalisador capaz deefetuar a transferência de um radical álcool de um material de partida de ál-cool como acima definido para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA.

2. Processo ou método, de acordo com a reivindicação 1, emque o catalisador é um biocatalisador capaz de efetuar a transferência de umradical álcool de um material de partida de álcool como definido na reivindi-cação 1.

3. Processo ou método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,que é conduzido in vitro.

4. Processo ou método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,que é conduzido in vivo.

5. Processo ou método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,que é conduzido parcialmente in vivo e parcialmente in vitro.

6. Processo ou método, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 5, em que o biocatalisador está dentro de um organismo,particularmente um microorganismo (mais preferivelmente durante pelo me-nos parte de seu ciclo de vida unicelular).

7. Processo ou método, de acordo com a reivindicação 6, emque o organismo está intacto.

8. Processo ou método, de acordo com a reivindicação 6, emque o organismo é rompido.

9. Processo ou método, particularmente de acordo com qualqueruma das reivindicações 1, 2, 3, 5 ou 8, em que o biocatalisador capaz deefetuar a transferência de um radical álcool de um material de partida de ál-cool como definido na reivindicação 1, para (met)acrilil CoA com remoção dafração CoA está presente em forma pelo menos parcialmente purificada.

10. Processo ou método, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 9, em que o acrilil CoA e/ou (met)acrilil CoA é obtido porreação de coenzima A com ácido (met)acrílico ou sais do mesmo, na pre-sença de uma substância fornecedora de energia, particularmente ATP, eum biocatalisador com atividade de sintetase, particularmente atividade deCoenzima A sintetase.

11. Processo ou método, de acordo com a reivindicação 10, emque a atividade de sintetase é atividade de S-acetila Coenzima A sintetase.

12. Processo ou método, de acordo com a reivindicação 10 ou-11, em que a reação catalisada pelo biocatalisador capaz de efetuar a transfe-rência de um radical álcool de um material de partida de álcool como definidona reivindicação 1, para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA e a rea-ção catalisada pelo biocatalisador com atividade de sintetase ocorrem em umrecipiente, de preferência durante um período de tempo pelo menos parcial-mente superposto, o mais preferivelmente durante o mesmo período de tem-po.

13. Processo ou método em um recipiente, de acordo com a rei-vindicação 12, em que a reação catalisada pelo biocatalisador com atividadede sintetase ocorre primeiro, e os produtos obtidos são subseqüentementeconvertidos nos produtos éster usando-se o biocatalisador capaz de efetuar atransferência de um radical álcool de um material de partida de álcool comodefinido na reivindicação 1, para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA.

14. Processo ou método, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 13, em que os biocatalisadores são enzimas, particular-mente polipeptídios com a respectiva atividade.

15. Processo ou método, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 14, em que o precursor (met)acrilil CoA é produzido me-tabolicamente, particularmente a partir de um ou mais precursores derivadosde biomassa.

16. Processo ou método, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 15, em que a metacrilil CoA e/ou (de preferência) a acrililCoA são produzidas metabolicamente, e a conversão com um biocatalisadorcapaz de efetuar a transferência de um radical álcool de um material de par-tida de álcool como definido na reivindicação 1 para (met)acrilil CoA comremoção da fração CoA na presença de um álcool como definido na reivindi-cação 1, ou, em cada caso, materiais de partida para sua biossíntese deri-vados de biomassa, nos produtos é conduzida por meio de, de preferênciaem, um organismo geneticamente modificado (OGM), isto é, na medida ne-cessária ou desejada, modificado para compreender as atividades biocatalí-ticas requeridas e, caso requerido, moléculas transportadoras.

17. Processo ou método, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 16, em que os vapores acimáda mistura de reação sãocontinuamente removidos e submetidos à destilação fracionada.

18. Processo ou método, de acordo com qualquer uma das rei-vindicações de 1 a 17, para a fabricação de um ou (no mesmo método ouprocesso de fabricação menos preferivelmente) mais ésteres (de ácido)(met)acrílicos selecionados de ésteres de álcool C1 - C20 alquílico de (ácido)(met)acrílico não substituídos ou substituídos, em que a C1 - C20 alquila énão substituída ou substituída por uma ou mais, particularmente até três,frações independentemente selecionadas de hidróxi, C1 - C7 alcóxi, C2 - C7alcanoilóxi, C2 - C7 alcanoilamino, oxo, carbamoíla, N-C1 - C7 aquilamino-carbonila, N,N-di-(C1 - C7 alquila)-aminocarbonila e C1 - C7 alcoxicarbonila,é linear, ramificada uma ou mais vezes e pode compreender uma ou maisduplas ligações; mais preferidos são (met)acrilato de n-butila (muito preferi-do), (met)acrilato de etila (preferido), (met)acrilato de metila (preferido), outambém (met)acrilato de n-propila, isopropila, isobutila, sec-butila, terc-butila,- 2-etilbutila, n-pentila, isopentila, 1-metilpentila, 1,3-dimetilbutila, n-hexila, iso-eptila, 1-metilexila, 2-etilexila, estearila ou 2-hidróxi etila, ou (embora menospreferivelmente) misturas de dois ou mais destes; em que, como material departida de álcool, um ou mais, de preferência um, álcoois selecionados dogrupos que consiste em álcoois C1 - C20 alquílicos, em que a C1 - C20 alquilaé não substituída ou substituída por uma ou mais, particularmente até três,frações independentemente selecionadas de hidróxi, C1 - C7 alcóxi, C2 - C7alcanoilóxi, C2 - C7 alcanoilamino, oxo, carbamoíla, N-C1 - C7 aquilamino-carbonila, N,N-di-(C1 - C7 alquila)-aminocarbonila e C1 - C7 alcoxicarbonila,é linear, ramificada uma ou mais vezes e pode compreender uma ou maisduplas Jigações; mais preferivelmente, n-butanol (muito preferido), etanol(preferido) ou metanol (preferido) ou também n-propanol, isopropanol, isobu-tanol, sec-butanol, terc-butanol, 2-etilbutanol, n-pentanol, isopentanol, 1-metilpentanol, 1,3-dimetilbutanol, n-hexanol, isoeptanol, 1-metilexanol, 2-etilexanol, álcool estearílico ou 2-hidroxietanol, ou (embora menos preferi-velmente) misturas de dois ou mais destes; em que n-butanol ou etanol sãoaltamente preferidos.

19. Organismo geneticamente modificado (OGM) transformadocom um ou mais ácidos nucléicos compreendendo uma ou mais seções quecodifiquem e permitam a expressão de um biocatalisador capaz de efetuar atransferência de um radical álcool de um material de partida de álcool comodefinido na reivindicação 1, para (met)acrilil CoA com remoção da fração CoA.

20. Organismo geneticamente modificado (OGM), de acordocom a reivindicação 19, em que, além dos um ou mais ácidos nucléicoscompreendendo uma ou mais seções que codifiquem um biocatalisador ca-paz de efetuar a transferência de um radical álcool de um material de partidade álcool como definido na reivindicação 1 para (met)acrilil CoA com remo-ção da fração CoA, também estão presentes um ou mais ácidos nucléicoscompreendendo uma ou mais seções que codifiquem e permitam a expres-são de S-acetila CoA sintetase.

21. Uso de um OGM, como definido em qualquer uma das rei-vindicações 19 ou 20, para a fabricação de acrilato de n-butila, acrilato deetila e/ou acrilato de metila, compreendendo a administração de um ou maismateriais de partida apropriados derivados de biomassa a uma cultura dodito microorganismo e isolamento do(s) produto(s) resultante(s).

22. Uso in vitro e/ou in vivo de um biocatalisador capaz de efetuara transferência de um radical áicooi de um material de partida de álcool comodefinido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 18 para (met)acrilil CoAcom remoção da fração CoA, para realizar a transferência de uma fração me-tacrilila e/ou acrilila da metacrilila e/ou acrilil CoA para um álcool como defini-do na reivindicação 1 ou, de preferência, ria reivindicação 18.