BRPI0616250A2

BRPI0616250A2 - compostos antagonistas de rna para a inibiÇço de expressço de apo-b100

Info

Publication number: BRPI0616250A2
Application number: BRPI0616250-9A
Authority: BR
Inventors: Henrik Frydenlund Hansen; Bo Hansen; Majken Westergaard; Ellen Marie Straarup; Christoph Rosenbohm
Original assignee: Santaris Pharma As
Priority date: 2005-09-15
Filing date: 2006-09-01
Publication date: 2011-06-14

Abstract

COMPOSTOS ANTAGONISTAS DE RNA PARA A INIBIÇçO DE EXPRESSçO DE APO-B100. A presente invenção refere-se a oligonucleotídeos direcionados contra o gene Apo-B100 são providos para modulação de expressão de Apo-B100. As composições compreendem oligonucleotídeos, particularmente oligonucleotídeos anti-sentido, alvejados para ácidos nucléicos codificando Apo-B100. Métodos de utilização destes compostos para modulação de expressão de Apo-B100 e para o tratamento de doenças associadas com superexpressão de Apo-B100, expressão de Apo-B100 com mutação ou ambas são providos. Exemplos de doenças são câncer tais como cânceres de pulmão, mama, cólon, próstata, pâncreas, pulmão, fígado, tiróide, rim, cérebro, testículos, estômago, intestinos, cordão espinhal, sinos, bexiga, trato urinário ou ovário. Os oligonucleotideos podem ser compostos por desoxirribonucíeosídeos ou um análogo de ácido nucléico tal como por exemplo, ácido nucléico fechado ou uma combinação dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSTOS ANTAGONISTAS DE RNA PARA A INIBIÇÃO DE EXPRESSÃO DEAPO-BIOO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a composições e processos paramodulação de expressão de Apo-BIOO. Em particular, esta invenção refere-se a compostos oligonucleotídeos que especificamente hibridizam com áci-dos nucléicos codificando Apo-BIOO. Os compostos oligonucleotídeos forammostrados modularem a expressão de Apo-BIOO e suas preparações farma-cêuticas e seu uso como tratamento de doenças de câncer são mostradas.

Antecedentes da Invenção

Apolipoproteína B (também conhecida como ApoB, apolipoprote-ína B-100; ApoB-100, apolipoproteína B-48; ApoB-48 e antígeno Ag(x)), éuma grande glicoproteína que serve um indispensável papel na montagem esecreção de lipídeos e no transporte e tomada mediada por receptor e libe-ração de distintas classes de lipoproteínas. ApoB desempenha um importan-te papel na regulação de níveis de lipoproteína circulante, e é por isso rele-vante em termos de suscetibilidade à aterosclerose que é altamente correla-cionada com a concentração ambiente de apolipoproteína B contendo Iipo-proteínas. Ver Davidson and Shelness (Annul Ver. Nutr., 2000, 20, 169-193)para ainda detalhes das duas formas de ApoB presente em mamíferos, suaestrutura e importância medicinal de ApoB.

Elevados níveis em plasma da ApoB-100 contendo lipoproteínaLp(a) estão associados com aumentado risco para aterosclerose e suas ma-nifestações, que podem incluir hipercolesterolemia (Seed et al., N. Eng. J.Med., 1990, 322, 1494-1499), infartação miocardial (Sandkamp et al., Clin.Chew., 1990, 36, 20-23), e trombose (Nowak-Gottl et al., Pediatrics, 1997,99, Eli).

A concentração em plasma de Lp(a) é fortemente influenciadapor fatores herdáveis e é refratária a maioria de drogas e manipulação dedieta (Katan and Beynen, Am. J. Epidemiol., 1987, 125, 387-399; Vessby etal., Atherosclerosis, 1982, 44, 61-71). Terapia farmacológica de elevadosníveis de Lp(a) tem sido somente modestamente bem-sucedida e aféresepermanece a modalidade terapêutica mais eficaz (Hajjar and Nachman, An-nul Rev. Med., 1996, 47, 423-442).

Duas formas de apolipoproteína B existem em mamíferos. ApoB-100 representa a proteína de inteiro comprimento contendo 4536 resíduosde aminoácidos sintetizada exclusivamente no fígado humano (Davidsonand Shelness1 Annul Ver. Nutr., 2000, 20, 169-193). Uma forma truncadaconhecida como ApoB-48 é colinear com os 2152 resíduos terminais aminoe é sintetizada no intestino delgado de todos os mamíferos (Davidson andShelness, Annul Ver. Nutr., 2000, 20, 169-193).

As bases através das quais o gene estrutural comum para apoli-poproteína B produz duas isoformas de proteína distintas é um processoconhecido como edição de RNA. Uma reação de edição citosina-para-uracilaespecífica de sítio produz um códon de interrupção UAA e término transdu-cional de apolipoproteína B para produzir Apo-48 (Davidson and Shelness,Annul Ver. Nutr., 2000, 20, 169-193).

A significância medicinal de ApoB de mamífero foi verificada u-sando estudos de camundongo transgênico tanto superexpressando ApoBhumana (Kim and Young, J. Lipid Res., 1998, 39, 703-723; Nishina et al., J.Lipid Res., 1990, 31, 859-869) ou camundongos nocaute ApoB (Farese etal., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1995, 92, 1774-1778; Kim and Young, J.Lipid Res., 1998, 39, 703-723).

Atualmente, estratégias objetivando inibição de função de apoli-poproteína B têm sido limitadas à aferese de Lp(a), anticorpos, fragmentosde anticorpos e ribozimas. Além disso, oligonucleotídeos anti-sentido de bai-xa bioestabilidade e/ou baixa afinidade de ligação foram mostrados e reivin-dicados em publicação PCT WO 00/97662, WO 03/11887 e WO2004/44181.

Conseqüentemente, permanece uma necessidade de adicionaisagentes capazes de efetivamente antagonizarem função de apolipoproteínaB e conseqüentemente diminuir o nível de Lp(a) em plasma.

A presente invenção provê compostos eficazes oligoméricos A1cido Nucléico Fechado (ANF) (LNA) e seu uso em métodos para modulaçãode expressão de apolipoproteína B, incluindo inibição da isoforma alternativade apolipoproteína B1 ApoB-48.

Sumário da Invenção

A presente invenção provê composições e métodos para modu-lação de expressão de apolipoproteína B (Apo-B100/Apo-B48). Em particu-lar, esta invenção refere-se a compostos oligonucleotídeos sobre específicosmotivos alvejando apolipoproteína B. Estes motivos são SEQ ID NOS: 2-26,em particular SEQ ID NOS: 2, 3, 10, 11 e 21. Específicos desenhos de com- postos oligonucleotídeos contendo LNA também são mostrados. Compostosespecificamente preferidos são SEQ ID NOS: 29-47, em particular SEQ IDNOS: 29, 30, 31, 36, 37, 38, 40 e 42. Os compostos da invenção são poten-tes inibidores de mRNA de apolipoproteína e expressão de proteína. In vitro,SEQ ID NOS: 29 e 30 regularam descendentemente expressão de ApoBcom IC5O ao redor de 1-5 nM, e SEQ ID NO 37 mostrou uma IC50 de cercade 0,5 nM. In vivo, a expressão de mRNA de ApoB-100 foi suprimida no fí-gado e jejuno seguindo tratamento com SEQ ID NO: 29 em uma maneiradependente de droga. Concomitante com reduzidos níveis de ApoB-100, ocolesterol total em plasma foi reduzido por 70%.

Composições farmacêuticas e outras compreendendo os com-postos oligonucleotídeos da invenção também são providas. São ainda pro-vidos processos de modulação de expressão de apolipoproteína B em célu-las ou tecidos compreendendo contato das ditas células ou tecidos com umou mais compostos ou composições de oligonucleotídeos da invenção.Também são mostrados métodos de tratamento de um animal ou um serhumano, suspeito de ter ou sendo propenso a uma doença ou condição, as-sociada com expressão de apolipoproteína B através de administração deuma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um ou mais doscompostos ou composições de oligonucleotídeos da invenção. Ainda, méto-dos de uso de compostos oligonucleotídeos para a inibição de expressão deapolipoproteína B e para tratamento de doenças associadas com atividadede apolipoproteína B são providos. Exemplos de tais doenças são diferentestipos de desequilíbrio de colesterol HDL/LDL; dislipidemias, por exemplo,hiperlipidemia combinada familiar (FCHL), hiperlipidemia adquirida, hiperco-lesterolemia; hipercolesterolemia resistente à estatina; doença de artéria co-ronária (CAD), doença de coração de coronária (CHD), aterosclerose.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1A: Expressão relativa de mRNA de ApoB em hepatóci-tos de camundongo (células Hepal-6) seguindo tomada auxiliada com lipí-deo de SEQ ID NO: 29, siRNA (não-modificado) ou siRNA modificado comcolesterila.

Figura 1B: Expressão relativa de ApoB em células BNLCL2 se-guindo tratamento com SEQ ID NOS: 29 e 30. Ambos compostos são poten-tes inibidores do mRNA de ApoB-100 já em 1 nM ou 5 nM de concentração.

Figura 2A: Expressão de mRNA de ApoB-100 relativa seguindotratamento (dosagem diária i.v. por três dias) com SEQ ID NO: 29, siRNA(não-modificado) (SEQ ID NOs: 48/49) ou siRNA modificado com colesterila(SEQ ID Nos: 50/49) em fígados.

Figura 2B: expressão relativa de mRNA de ApoB-100 seguindotratamento (dosagem diária i.v por três dias com SEQ ID NO: 29, siRNA(não-modificado) (SEQ ID NOs: 48/49) ou siRNA modificado com colesterila(SEQ ID NOs: 50/49) em jejuno.

Figura 3: Níveis relativos de colesterol em plasma de camun-dongos tratados com SEQ ID NO: 29, siRNA (não-modificado) (SEQ ID NOs:48/49) ou siRNA modificado colesterila (SEQ ID NOs: 50/49).

Figura 4: ApoB-100 in vitro alveja regulação descendente em cé-lulas Hepa 1-6 ou BNCL. Efeito de resposta de dose de SEQ ID NOs: 29 e27 sobre o nível de mRNA de ApoB (normalizado para GapDH) a partir delinhas de células de camundongos.

Figura 5A: Silenciamento de ApoB-100 in vivo no fígado seguin-do tratamento com LNA anti-sentido de camundongos C57BL/6. As molécu-las anti-sentido de LNA foram dosadas uma dose (6,25, 12,5 ou 25 mg/kg) eo siRNA (50 mg/kg) 3 dias consecutivos em camundongos C57BL/6. Ex-pressão de ApoB-100 foi medida por qPCR e normalizada para Gapdh. Da-dos representam média +/- DP (n = 7).

Figura 5B: Silenciamento de ApoB-100 in vivo em jejuno seguin-do tratamento com LNA anti-sentido de camundongos C57BL/6. As molécu-las de LNA anti-sentido foram dosadas uma dose (6,25, 12,5 ou 25 mg/kg) eo siRNA (50 mg/kg) 3 dias consecutivos em camundongos C57BL/6 camun-dongos. Expressão de ApoB-100 foi medida por qPCR e normalizada paraGapdh. Dados representam média +/- DP (n = 7).

Figura 6A: Níveis de colesterol em plasma seguindo tratamentocom LNA anti-sentido. As moléculas de LNA anti-sentido foram dosadas umadose (6,25, 12,5 ou 25 mg/kg) e o siRNA (50 mg/kg) 3 dias consecutivos emcamundongos C57BL/6. Níveis de colesterol - LDL foram determinados u-sando um kit colorimétrico. Dados representam média +/- DP (n = 7).

Figura 6B: níveis de colesterol em plasma seguindo tratamentocom LNA anti-sentido. Moléculas de LNA anti-sentido foram dosadas umadose (6,25, 12,5 ou 25 mg/kg) e o siRNA (50 mg/kg) 3 dias consecutivos emcamundongos C57BL/6. Níveis de colesterol total em plasma foram determi-nados usando um kit colorimétrico. Dados representam média +/- DP (n = 7).

Figura 7: Mostra a comparação de seqüência do comprimentoreverso das seqüências preferidas do ácido nucléico alvo de ApoB, que fo-ram usadas para desenhar compostos oligoméricos de acordo com a inven-ção.

Figura 8: Resposta de dose e seleção in vitro (1,5 ou 25 nM) emcélulas Huh-7 (hepatócitos) tratadas com diferentes oligonucleotídeos deLNA anti-sentido e o efeito dos oligonucleotídeos medido como regulaçãodescendente de mRNA (ApoB-100) alvo (QPCR).

Figura 9: IC50 (a concentração de oligonucleotídeo anti-sentidopara obter 50% de inibição de expressão alvo (ApoB-100)) para 7 oligonu-cleotídeos LNA anti-sentido selecionados, medida em células Huh-7 analisa-das por QPCR.

Figura 10A: Níveis de mRNA ApoB-100 medidos no fígado nosacrifício dia 28. Camundongos C57BL/6 foram dosados tanto duas vezespor semana com 2,5 mg/kg/dose (total de 8 doses) ou uma vez por semana5 mg/kg (total de 4 doses) por 4 semanas.

Figura 10B: Níveis de LDL em plasma medidos uma vez porsemana por 4 semanas em sangue retro orbital. Camundongos C57BL/6foram dosados tanto duas vezes por semana com 2,5 mg/kg/dose (total de 8doses) como uma vez por semana com 5 mg/kg (total de 4 doses) por 4 semanas.

Figura 11 A: Duração de ação medida como níveis de mRNAApoB-100 no fígado no sacrifício dia 3, 5, 8, 13 ou 21. CamundongosC57BL/6 foram dosados uma, duas ou três doses de 25 mg/kg/dose de SEQID NO: 37 uma dose em cada um de 1, 2 ou 3 dias consecutivos, respecti-vamente.

Figura 11B: Colesterol total em plasma medido no dia de sacrifí-cio 3, 5, 8, 13 ou 21. Camundongos fêmeas C57BL/6 foram dosados comuma, duas ou 3 doses de 25 mg/kg/dose de SEQ ID NO: 37, uma dose cadadia em um, dois ou três dias consecutivos, respectivamente.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção emprega compostos oligoméricos, particu-larmente oligonucleotídeos anti-sentido, para uso em modulação de funçãode moléculas de ácido nucléico codificando apolipoproteína B (tal como Apo-B100 e/ou ApoB-48). A modulação é por último uma mudança na quantidadede apolipoproteína B produzida. Em uma modalidade isto é realizado atravésde provimento de compostos oligoméricos, que especificamente hibridizamcom ácidos nucléicos, tal como RNA mensageiro, que codificam apolipopro-teínaB. A modulação preferivelmente resulta na inibição da expressão deapolipoproteína B, isto é, conduz a uma diminuição no número de proteínasfuncionais produzidas.

A Figura 1 demonstra que siRNA e oligonucleotídeos anti-sentido de fita única compreendendo análogos de nucleotídeo LNA são po-tentes na mesma faixa nano molar in vitro. Entretanto, in vivo os oligonucleo-tídeos LNA anti-sentido de 16-mer da invenção são superiores a ambos,siRNA conjugado com colesterol e não-modificado.

As Figuras 2A e 2B mostram oligonucleotídeos LNA da invençãoque são até 8 vezes mais potentes que siRNA conjugado com colesterila invivo (cfr.). Oligonucleotídeos LNA diminuíram colesterol total em plasma decamundongo enquanto tratamento com siRNA não (Figura 3). Além disso,oligonucleotídeos LNA são mais bioestáveis que siRNA.

Compostos oligoméricos, que modulam expressão do alvo, são

identificados através de experimentação ou através de desenho racional ba-seado em informação de seqüência sobre o alvo e conhecimento de comomelhor desenhar um composto oligonucleotídeo contra um desejado alvo. Asseqüências destes compostos são modalidades preferidas da invenção. Damesma maneira, os motivos de seqüências no alvo ao qual estes compostosoligoméricos preferidos são complementares (referidos como "pontos quen-tes") são preferidos sítios para serem alvo.

Compostos oligoméricos e compostos oligonucleotídeosOs termos "composto oligomérico", que são usados intercambia-velmente com o termo "oligonucleotídeo", "oligo", e "composto oligonucleotí-deo", referem-se, no contexto da presente invenção, a um oligômero, isto é,um polímero de ácido nucléico (por exemplo, ácido ribonucléico (RNA) ouácido desoxirribonucléico (DNA)) ou análogo de ácido nucléico daqueles co-nhecidos na técnica, preferivelmente ácido nucléico fechado (Iocked) (LNA),ou uma mistura dos mesmos). Este termo inclui oligonucleotídeos compos-tos por núcleo-bases ocorrendo naturalmente, açúcares e ligações internu-cleosídeo (cadeia principal) assim como oligonucleotídeos tendo porçõesocorrendo não-naturalmente que funcionam similarmente ou com específicasfunções aperfeiçoadas. Oligonucleotídeos modificados ou substituídos inteiraou parcialmente são freqüentemente preferidos sobre formas nativas devidoa várias desejáveis propriedades de tais oligonucleotídeos, tal como, porexemplo, a habilidade de penetrar uma membrana de célula, boa resistênciaa nucleases extra e intracelulares, alta afinidade e especificidade para o alvoácido nucléico. O análogo de LNA é particularmente preferido, por exemplo,com relação às propriedades mencionadas acima. Por isso, em uma modali-dade altamente preferível, os termos "composto oligomérico", "oligonucleotí-deo", "oligo" e "composto oligonucleotídeo" de acordo com a invenção, sãocompostos que são construídos por ambas unidades de análogos de nucleo-tídeos e nucleotídeos, tais como unidades de LNA para formação de umcomposto polimérico de entre 12-50 nucleotídeos/análogos de nucleotídeos(oligômero).

Pelo termo "unidade" é entendido um monômero.

Os compostos oligoméricos da invenção são capazes de hibridi-zarem tanto para a fita de RNA(s) mensageiro de apolipoproteína B e/ou ade DNA de apolipoproteína B (Apo-B) de mamífero sentido ou complemen-tar. Acesso NCBI Ne NM_000384 provê uma seqüência de mRNA para apo-lipoproteína B humana. É altamente preferível que o composto oligoméricoda invenção seja capaz de hibridizar para a apolipoproteína humana codifi-cada pelo ácido nucléico mostrado em acesso NCBI Ne NM_000384, ou seucomplemento reverso, incluindo em uma modalidade preferida, alvos ácidonucléico mRNA derivados da dita apolipoproteína humana.

Em uma modalidade preferida, os oligonucleotídeos são capa-zes de hibrizarem contra o ácido nucléico alvo, tal como um mRNA ApoB,para formar um dúplex com uma Tm de pelo menos 37°C, tal como pelo me-nos 40°C, pelo menos 50°C, pelo menos 55°C, ou pelo menos 60°C. Em umaspecto a Tm está entre 37°C e 80°C, tal como entre 50 e 70°C.

Medição de Tm

Uma solução 3 μΜ do composto em fosfato de sódio 10 mM/NaCI 100 mM/EDTA 0,1 nM, pH 7,0 é misturada com seu oligonucleotídeoRNA ou DNA complemento em uma concentração de 3 μΜ em fosfato desódio 10 mM/NaCI 100 mM/EDTA 0,1 nM, pH 7,0 a 90°C por um minuto edeixado resfriar para temperatura ambiente. A curva de fusão do dúplex éentão determinada através de medição de absorbância em 260 nm com umataxa de aquecimento de 1°C/minuto na faixa de 25 a 95°C. A Tm é medidacomo o máximo do primeiro derivado da curva de fusão.

Os compostos oligoméricos são preferivelmente compostos oli-goméricos anti-sentido, também referidos como 'oligonucleotídeos anti-sentido' e 'inibidores anti-sentido'.

Tais inibidores anti-sentido, são compostos que compreendemseqüências de nucleotídeos/análogos de nucleotídeos complementares parao ácido nucléico alvo, e podem tomar a forma de "siRNA", "miRNA", "ribozi-mas", "oligozimas". Entretanto, preferivelmente, os inibidores anti-sentidosão oligonucleotídeos de fita única. Os oligonucleotídeos de fita única sãopreferivelmente complementares à correspondente região do ácido nucléicoalvo.

Tipicamente, oligonucleotídeos 'anti-sentido' de fita única intera-gem especificamente com o mRNA do gene alvo, causando degradação al-vejada do mRNA, por exemplo, via o mecanismo RnaseH, ou de outro modoprevenindo tradução.

Em uma modalidade, o composto oligomérico de acordo com ainvenção pode alvejar o DNA codificando ApoB de mamífero, tal como a fitade DNA sentido ou anti-sentido. siRNAs são conhecidos serem capazes deinteragirem com DNA alvo.

O composto oligomérico de acordo com a invenção preferivel-mente compreende pelo menos três análogos de nucleotídeos. Os pelo me-nos três análogos de nucleotídeos são preferivelmente análogos de nucleo-tídeos ácido nucléico fechado, e o composto oligomérico que compreendetais análogos de nucleotídeos são aqui referidos como "composto oligoméri-co LNA", "composto oligonucleotídeo LNA" e "oligonucleotídeo LNA".

Apropriadamente, os termos "composto oligonucleotídeo", "com-posto oligomérico", "composto oligomérico LNA", de acordo com a invenção,são oligonucleotídeos, como aqui definidos, que podem induzir um desejadoefeito terapêutico em seres humanos através de, por exemplo, ligação atra-vés de ligação de hidrogênio a um ácido nucléico alvo.

A invenção é direcionada a um composto oligomérico, tal comoum oligonucleotídeo, consistindo em 8-50, tal como 10-50, em particular 12-50 ou 12-25, nucleotídeos e/ou análogos de nucleotídeos, onde o dito com-posto compreende uma subseqüência de pelo menos 8, por exemplo, pelomenos 10, tal como pelo menos 12, tal como pelo menos 14, tal como pelomenos 15, tal como 14, 15, 16 ou 17, nucleotídeos ou análogos de nucleotí-deos, a dita subseqüência estando localizada dentro (isto é, correspondendoa) uma seqüência da seqüência alvo de ácido nucléico, Apo-BIOO e/ou Apo-B48. Os análogos de nucleotídeos são análogos de seus respectivos nucleo-tídeos das seqüências de SEQ ID NOS: 2-26, em particular SEQ ID NOS: 2,3, 10, 11 e 21. Assim, a subseqüência do composto da invenção está Iocali-zada dentro (isto é, corresponde a) uma seqüência selecionada do grupoconsistindo em SEQ ID NOS: 2-26, em particular SEQ ID NOS: 2, 3, 10, 11 e21, ou compreende análogos dos nucleotídeos dentro da seqüência de SEQID NOS: 2-26, em particular SEQ ID NO: 2, 3, 10, 11, e 21.

Grupos preferidos de seqüências nos quais a subseqüência docomposto está localizada dentro (ou a subseqüência compreende análogosdos nucleotídeos dentro) incluem SEQ ID NO: 2 & 3; SEQ ID NO: 2 & 3;SEQ ID NO: 10 & 11; SEQ ID NO: 21.

Em uma modalidade, o grupo de seqüências no qual a subse-qüência do composto está localizada dentro (ou a subseqüência compreen-de análogos dos nucleotídeos dentro) SEQ ID NO: 3.

Em uma modalidade, o grupo de seqüências no qual a subse-qüência do composto está localizado dentro (ou a subseqüência compreen-de análogos dos nucleotídeos dentro) uma seqüência selecionada do grupoconsistindo em: SEQ ID NO: 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17,27, 28, 48 e 50.

Em uma modalidade interessante, o composto da invenção com-preende de 8-50 nucleotídeos, onde o dito composto compreende uma sub-seqüência de pelo menos 8 nucleotídeos, a dita subseqüência sendo locali-zada dentro de uma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ IDNO: 2 e 3, onde pelo menos um nucleotídeo é substituído com um corres-pondente análogo de nucleotídeo e onde a extremidade 3' compreende nu-cleotídeo, antes que um análogo de nucleotídeo.

Em modalidades do composto da invenção compreendendo de8-50 nucleotídeos, onde o dito composto compreende uma subseqüência depelo menos 8 nucleotídeos, a dita subseqüência estando localizada dentrode suma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 2 e3 e os ditos nucleotídeos compreendendo análogos de nucleotídeos LNA, asubseqüência tipicamente pode compreender uma extensão de 2-6 LNAs1como aqui definido, seguida por uma extensão de 4-12 nucleotídeos, que éseguida por uma extensão de 2-6 LNAs, como aqui definida.

Os termos "localizado dentro" e "correspondendo a"/"corres-ponde a" referem-se à comparação entre a seqüência combinada de nucleo-tídeos e análogos de nucleotídeos do composto oligomérico da invenção, ousua subseqüência, e a seqüência de nucleotídeos equivalente de i) o com-plemento reverso da seqüência de ácidos nucléicos de Apolipoproteína B(isto é, o alvo ácido nucléico), e/ou ii) a seqüência de nucleotídeos providano grupo consistindo em SEQ ID NOS: 2-26, 59-67 respectivamente (isto é,um motivo de seqüência), ou em uma modalidade os seus complementosreversos. Análogos de nucleotídeos são comparados diretamente a seusnucleotídeos equivalentes.

A subseqüência pode compreender pelo menos 8, tal como pelomenos 9, tal como pelo menos 10, tal como pelo menos 11, tal como pelomenos 12, tal como pelo menos 13, tal como pelo menos 14, tal como pelomenos 15, tal como pelo menos 16, tal como pelo menos 17, tal como pelomenos 18, tal como pelo menos 19, ou pelo menos 20 nucleotídeos ou aná-logos de nucleotídeos que correspondem a um número equivalente de nu-cleotídeos consecutivos presentes em um ácido nucléico selecionado dogrupo consistindo em: SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66 ,67 e 68. (Ver Figura 7).

Preferivelmente, pelo menos 3 análogos de nucleotídeos estãolocalizados dentro da dita subseqüência, opcionalmente como uma seqüên-cia consecutiva de pelo menos 3 análogos de nucleotídeos, tal como umaseqüência consecutiva de 3, 4, 5 ou 6 análogos de nucleotídeos.

Em uma modalidade preferida o composto oligomérico consistesomente em uma subseqüência, isto é, a inteira seqüência do composto oli-gomérico é encontrada na correspondente seqüência, tal como uma se-qüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 2-26 e 59-62.

Preferivelmente, não existem nucleotídeos ou análogos de nu-cleotídeos que formam um desemparelhamento quando correlacionados àcorrespondente região da seqüência alvo de ApoB, isto é, todos os nucleotí-deos e análogos de nucleotídeos presentes no oligômero da invenção sãocapazes de formarem emparelhamento de bases consecutivos com a se-qüência alvo de ácido nucléico de ApoB.

Entretanto, em uma modalidade pode existir um desemparelha-mento ou dois desemparelhamentos dentro de uma subseqüência e a se-qüência alvo de ácido nucléico. Quando ocorrem desemparelhamentos, po-de ser preferido que eles não estejam presentes entre um análogo de nucle-otídeo e a seqüência alvo.

Entretanto, em um 'gap' de um 'gapmer1, que seja capaz de re-crutar RnaseH1 desemparelhamentos podem conduzir a perda da habilidadepara recrutar RnaseH. Tipicamente, 5 ou 6 nucleotídeos complementaressão requeridos para assegurar suficiente atividade de RnaseH.

Em uma modalidade preferível o composto oligonucleotídeo deacordo com a invenção compreende uma seqüência que corresponde à SEQID NO 59 e/ou SEQ ID NO 60, onde a dita subseqüência pode, opcionalmen-te, compreender um ou dois desemparelhamentos.

Em uma modalidade, o composto oligonucleotídeo de acordocom a invenção compreende uma seqüência que corresponde à SEQ ID NO:61 e/ou 62, onde a dita subseqüência pode, opcionalmente, compreenderum ou dois desemparelhamentos.

Em uma modalidade preferível da invenção, a subseqüênciacompreende pelo menos 8, tal como pelo menos 10, ou pelo menos 12, talcomo pelo menos 14, tal como 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos ouanálogos de nucleotídeos que estão localizados dentro (isto é, correspon-dendo a) do número equivalente de nucleotídeos consecutivos em SEQ IDNO: 63, onde a dita subseqüência pode, opcionalmente, compreender um oudois desemparelhamentos.

Ainda em modalidades da invenção, a subseqüência compreen-de pelo menos 8, tal como pelo menos 10, ou pelo menos 12, tal como pelomenos 14, tal como entre 14 e 20, tal como 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nu-cleotídeos ou análogos de nucleotídeos que estão localizados dentro (isto é,correspondendo a) do número equivalente de nucleotídeos consecutivos emuma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em SEQID NO: 64, 65, 66, 67 e 68, onde a dita subseqüência pode, opcionalmente,compreender um ou dois desemparelhamentos.

Em uma modalidade, o composto oligomérico de acordo com ainvenção é um oligonucleotídeo de fita dupla, onde cada fita compreende (ouconsiste em) um total de 16-30 nucleotídeos e/ou análogos de nucleotídeos.Deve ser entendido que uma fita do complexo de fita dupla (oligonucleotí-deo) corresponde ao composto oligonucleotídeo aqui definido, e que a outrafita é um oligonucleotídeo tendo uma seqüência complementar.

O total de, por exemplo, 8-50 nucleotídeos e/ou análogos de nu-cleotídeos é pretendido significar 8-50 nucleotídeos ou 8-50 análogos denucleotídeos ou uma combinação dos mesmos não excedendo um totalcombinado de 50 unidades nucleosídeos.

Os compostos preferivelmente consistem em 12-25 nucleotídeosou análogos de nucleotídeos, tal como 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, ou 24 nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos, tal como entre 15 e 22nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos, tal como entre 14 e 18 nucleotí-deos ou análogos de nucleotídeos, mais preferido 15 ou 16 nucleotídeos ouanálogos de nucleotídeos.

No presente contexto, os termos "nucleosídeo" e "nucleotídeo"são usados em seu significado normal. Por exemplo, ele contém uma unida-de 2-desoxirribose que é ligada através de seu carbono número um a umadas bases nitrogenadas adenina (A), citosina (C), timina (T) ou guanina (G).

Em uma maneira similar, o termo "nucleotídeo" significa, por e-xemplo, em uma modalidade preferida quando relacionado ao composto dainvenção o termo "nucleotídeo" refere-se a uma unidade 2-desoxirribose queé ligada através de seu átomo de carbono número um a uma das bases ni-trogenada adenina (A), citosina (C), timina (T) ou guanina (G), e que é ligadaatravés de seu átomo de carbono número cinco a um fosfato internucleosí-deo (ou em uma modalidade um equivalente, tal como um grupo fosforotioa-to), ou a um grupo terminal. Um nucleotídeo também pode, por exemplo, emuma modalidade compreender uma unidade ribose, tal como um nucleotídeoRNA.

Quando aqui usado, o termo "análogo de nucleotídeo" refere-sea um nucleotídeo ocorrendo não-natural, por exemplo, em uma modalidadepreferida, tanto a unidade ribose é diferente de 2-desoxirribose e/ou a basenitrogenada é diferente de A, C, T e G e/ou o grupo de ligação fosfato inter-nucleosídeo é diferente. Exemplos específicos de análogos de nucleosídeossão descritos, por exemplo, em Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25,4429-4443, e Uhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213, e em Esquemas 1.

Os termos "correspondente nucleosídeo/análogo de nucleotídeo"e "correspondente nucleosídeo/nucleotídeo" são pretendidos indicar que abase nitrogenada no nucleosídeo/análogo de nucleotídeo e o nucleosí-deo/nucleotídeo é idêntica. Por exemplo, quando a unidade 2-desoxirribosedo nucleotídeo está ligada a uma adenina, o "correspondente análogo nu-cleosídeo" contém uma unidade pentose (diferente de 2-desoxirribose) liga-da a uma adenina.

O termo "ácido nucléico" é definido como uma molécula formadapor uma ligação covalente de dois ou mais nucleotídeos. Os termos "ácidonucléico" e "polinucleotídeo" são aqui usados intercambiavelmente. Por e-xemplo, DNA e RNA são ácidos nucléicos.

O termo "análogo de ácido nucléico" refere-se a um compostoligando ácido nucléico ocorrendo não-naturalmente, isto é, em uma modali-dade preferida um composto, tal como uma seqüência de pelo menos umnucleotídeo e pelo menos um análogo de nucleotídeo, tal como uma unidadeLNA. Tais compostos não são encontrados naturalmente dentro do organis-mo mamífero (ou, em uma modalidade não foram publicamente conhecidosserem encontrados dentro de organismo mamífero no momento da inven-ção).

Uma análogo de nucleotídeo preferido é LNA, tal como beta-D-óxi-LNA, alfa-L-óxi-LNA, beta-D-amino-LNA e beta-D-tio-LNA, mais preferidobeta-D-óxi-LNA. Os compostos da invenção são tipicamente aqueles ondeos ditos nucleotídeos compreendem um grupo de ligação selecionado dogrupo consistindo em um grupo fosfato, um grupo fosforotioato, e um grupoboranofosfato, a ligação internucleosídeo pode ser -O-P(O)2-O-, -O-P(O1S)-O-, em particular um grupo fosfato e/ou um grupo fosforotioato. Em uma mo-dalidade particular, todos os nucleotídeos compreendem um grupo fosforoti-oato. Em uma modalidade, alguns ou todos os nucleotídeos são ligados unsaos outros por meio de um grupo fosforotioato. Apropriadamente, todos osnucleotídeos são ligados uns aos outros por meio de um grupo fosforotioato.

Os nucleotídeos são tipicamente ligados uns aos outros pormeio do grupo de ligação.

Análogos de nucleotídeos e análogos de ácidos nucléicos sãodescritos em, por exemplo, Freier & Altmann (Nucl. Acid Res., 1997, 25,4429-4443) e Uhlmann (Curr. Opinion in Drug & Development (2000, 3(2):293-213). Esquemas 1 e 2 ilustram exemplos selecionados de análogos denucleotídeos apropriados para obtenção de ácidos nucléicos:Esquema 1

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Boranofosfatos

Em uma modalidade interessante, os compostos compreendemde 3-12 análogos de nucleotídeos, por exemplo, 6 ou 7 análogos de nucleo-tídeos. Nas modalidades mais preferidas, pelo menos um dos ditos análogosde nucleotídeos é um ácido nucléico fechado (Iocked) (LNA), tal como pelomenos dois, ou pelo menos 3 ou pelo menos 4, ou pelo menos 5, ou pelomenos 6, ou pelo menos 7, ou pelo menos 8, ou pelo menos 9, ou pelo me-nos 10, ou pelo menos 11, dos análogos de nucleotídeos podem ser LNA,em uma modalidade todos os análogos de LNA podem ser LNA.

O termo "LNA" refere-se a um análogo de nucleotídeo contendoum análogo de nucleotídeo bicíclico, também referido como um monômeroLNA.

O termo "LNA" quando usado no contexto de "oligonucleotídeosLNA" refere-se a um oligonucleotídeo contendo um ou mais análogos nucle-osídeos bicíclicos. O ácido nucléico fechado (LNA) usado nos compostosoligonucleotídeos da invenção tem a estrutura da fórmula geral

<formula>formula see original document page 18</formula>

XeY são selecionados independentemente entre os grupos -O-, -S-, -N(H)-,N(R)-, -CH2 ou -CH- (se parte de uma ligação dupla), -CH2-O-, -CH2S-,-CH2N(H)-, -CH2-CH2 ou -CH2-CH-(se parte de uma ligação dupla),-CH=CH-, onde R é selecionado de hidrogênio e C^4 alquila; Z e Z* são se-lecionados independentemente entre uma ligação internucleosídeo, um gru-po terminal ou um grupo de poteção; B constitui uma nucleobase natural ounão-natural; e os grupos assimétricos podem ser encontrados em qualquerorientação.

Preferivelmente, o ácido nucléico fechado (LNA) usado no com-posto oligonucleotídeo da invenção compreende pelo menos uma unidadeácido nucléico fechado (LNA) de acordo com qualquer uma das fórmulas

<formula>formula see original document page 18</formula>

onde Y é -O-, -S-, -NH-, ou N(Rh); Z e Z* são selecionados independente-mente entre uma ligação internucleosídeo, um grupo terminal ou um grupode proteção; B constitui uma nucleobase natural ou não-natural, e Rh é sele-cionado de hidrogênio e C1-4 alquila.

Preferivelmente, o ácido nucléico fechado (LNA) usado no com-posto oligonucleotídeo da invenção compreende ligações internucleosídeoselecionadas do grupo consistindo em -O-P(O)2-O-, -O-P(O1S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O1S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O1S)-S-,-S-P(O)2-S-, -O-PO(Rh)-O-, O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(NRh)-O-, -O-PO (0-CH2CH2S-R)-0-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRh)-O-, -O-P(O)2-NRh-, -NRh-P(O)2-O-, -NRh-CO-O-, onde Rh é selecionado de hidrogênio e C1.4 alquila.

Como estabelecido, em uma modalidade interessante da inven-ção, os compostos oligonucleotídeos contêm pelo menos uma unidade dequímica chamada LNA (ácido nucléico fechado)

Unidades LNA especificamente preferidas são mostradas emesquema 2.

<formula>formula see original document page 19</formula>

O termo "tio-LNA" compreende um nucleotídeo fechado no qualpelo menos um de X e Y na fórmula geral acima é selecionado de S ou-CH2-S-. Tio-LNA pode estar em ambas configurações beta-D e alfa-L.O termo "amino-LNA" compreende um nucleotídeo fechado noqual pelo menos um de X ou Y na fórmula geral acima -N(H)-, N(R)-, CH2-N(R)- onde R é selecionado de hidrogênio e C1-4 alquila. Amino-LNA podeestar em ambas configurações beta-D e alfa-L.

O termo "óxi-LNA" compreende um nucleotídeo fechado no qualpelo menos um de X ou Y na fórmula geral acima representa -O- ou -CH2-O-Óxi-LNA pode estar em ambas configurações beta-D e alfa-L.

O termo "ena-LNA" compreende um nucleotídeo fechado no qualY na fórmula geral acima é -CH2-O- (onde o átomo de oxigênio de -CH2-O-está ligado à posição 2' em relação à núcleo base B).

Em uma modalidade preferida LNA é selecionado de beta-D-óxi-LNA, alfa-L-óxi-LNA, beta-D-amino-LNA e beta-D-tio-LNA, em particular be-ta-D-óxi-LNA. Os nucleosídeos e/ou LNAs são tipicamente ligados juntos pormeio de grupos fosfato e/ou por meio de grupos fosforotioato.

O termo "pelo menos um" compreende os inteiros maiores queou iguais a 1, tal como 1,2,3,4,5,6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 20, 21 e assim por diante.

Como aqui usado, o termo "ácido nucléico alvo" abrange DNAcodificando a Apo-Bl00, RNA (incluindo pré-mRNA e mRNA e mRNA edit)transcrito de tal DNA, e também cADN derivado de tal RNA.

A "proteína alvo" é apolipoproteína B mamífera, preferivelmenteapolipoproteína B humana. Será reconhecido que como ApoB-100 e ApoB-48 ambas originam da mesma seqüência genética, que os compostos oligo-méricos de acordo com a invenção podem ser usados para regulação des-cendente de qualquer, ou ambas as formas de apolipoproteína B, e ambosmRNA codificando ApoB-100, e a forma editada de RNA, que codifica Apo-B48.

Como aqui usado, o termo "gene" significa o gene incluindo é-xons, íntrons, regiões 5' e 3' não-codificantes e elementos reguladores e to-das suas variantes correntemente conhecidas e ainda quaisquer variantes,que possam ser elucidadas.

Como aqui usado, o termo "mRNA" significa o transcrito(s) demRNA presentemente conhecido de um gene alvejado, e ainda quaisquertranscritos, que possam ser identificados.

Como aqui usado, o termo "modulação" significa tanto um au-mento (estimulação) como uma diminuição (inibição) na expressão de umgene. Na presente invenção, inibição é a forma preferida de modulação deexpressão de gene e mRNA é o alvo preferido.

Como aqui usado, o termo "alvejando" um composto anti-sentidopara um particular ácido nucléico alvo significa provendo o oligonucleotídeoanti-sentido para a célula, animal ou humana de modo que o composto anti-sentido seja capaz de se ligar e modular a função de seu alvo pretendido.

Um análogo de nucleotídeo preferido é LNA.

Ainda um análogo de nucleotídeo preferido é onde a ligação fos-fato internucleosídeo é um fosforotioato.

Ainda um análogo nucleotídeo preferido é onde o nucleotídeo éLNA com uma ligação fosforotioato internucleosídeo.

Em uma modalidade interessante, a extremidade 3' do compostoda invenção compreende um nucleotídeo, antes que um análogo de nucleo-tídeo.

Preferivelmente, o composto oligomérico, tal como um oligonu-cleotídeo anti-sentido, de acordo com a invenção compreende pelo menosuma unidade ácido nucléico fechado (LNA), tal como 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10unidades ácido nucléico fechado (LNA), preferivelmente 4 a 9 unidades LNA,tal como 6-9 unidades LNA, mais preferivelmente 6, 7 ou 8 unidades LNA.

Preferivelmente as unidades LNA compreendem pelo menos uma unidadebeta-D-óxi-LNA tal como 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 unidades beta-D-óxi-LNA. To-das as unidades LNA podem ser unidades beta-D-óxi-LNA, embora sejaconsiderado que os compostos oligoméricos, como o oligonucleotídeo anti-sentido, podem compreender mais de um tipo de unidade LNA. Apropriada-mente, o composto oligomérico pode compreender ambos, beta-D-óxi-LNA euma ou mais de uma das seguintes unidades LNA: tio-LNA, amino—LNA,óxi-LNA, ena-LNA e/ou alfa-LNA em qualquer das configurações D-beta ouL-alfa ou suas combinações.Em uma modalidade do composto da invenção que compreendeanálogos nucleotídeos, tais como análogos de nucleotídeos LNA1 a subse-qüência tipicamente pode compreender um estiramento de 2-6 análogos denucleotídeos, tais como análogos de nucleotídeos LNA, como aqui definidos,seguido por um estiramento de 4-12 nucleotídeos, que é seguido por umestiramento de 2-6 análogos de nucleotídeos, tais como os análogos de nu-cleotídeos de LNA, como aqui definidos.

Subseqüências compreendendo um estiramento de análogos denucleotídeos, tais como análogos de nucleotídeos de LNA, seguido por umestiramento de nucleotídeos, seguido por um estiramento de análogos denucleotídeos LNAs são conhecidos como gapmers.

Apropriadamente, em uma modalidade de tal "gapmer", a ditasubseqüência compreende um estiramento de 4 análogos de nucleotídeos,como análogos de nucleotídeos LNA, como aqui definidos, seguido por umestiramento de 8 nucleotídeos, que é seguido por um estiramento de 4 aná-logos de nucleotídeos, tais como análogos de nucleotídeos LNA como aquidefinidos, opcionalmente com um nucleotídeo simples na extremidade 3'.

Ainda em uma modalidade 'gapmer', a dita subseqüência com-preende um estiramento de 3 análogos de nucleotídeos, tais como análogosde nucleotídeos LNA, como aqui definidos, seguido por um estiramento de 9nucleotídeos, que é seguido por um estiramento de 3 análogos de nucleotí-deos, tais como análogos de nucleotídeos LNA aqui definidos, opcionalmen-te com um nucleotídeo simples na extremidade 3'. Um tal desenho foi sur-preendentemente verificado ser muito eficaz.

Ainda em uma modalidade "gapmer", a dita subseqüência com-preende um estiramento de 4 análogos de nucleotídeos, tais como análogosde nucleotídeos LNA, como aqui definidos, seguido por um estiramento de 8nucleotídeos, que é seguido por um estiramento de 3 análogos de nucleotí-deos, tais como análogos de nucleotídeos LNA como aqui definidos, opcio-nalmente com um nucleotídeo simples na extremidade 3'.

Preferivelmente, o composto oligomérico, tal como um oligonu-cleotídeo anti-sentido, pode compreender ambas unidades LNA e DNA. Pre-ferivelmente o total combinado de unidades LNA e DNA está entre 14-20, talcomo entre 15-18, mais preferivelmente 16 ou 17 unidades LNA/DNA. Prefe-rivelmente a razão de LNA para DNA presente no composto oligomérico dainvenção está entre 0,3 e 1, mais preferivelmente entre 0,4 e 0,9, tal comoentre 0,6 e 0,8.

Preferivelmente o composto oligomérico, tal como oligonucleotí-deo anti-sentido, de acordo com a invenção é um gapmer, compreendendouma seqüência de polinucleotídeo de fórmula (5' para 3'), A-B-C (e opcio-nalmente D), onde; A (região 5') consiste ou compreende pelo menos umaunidade LNA1 tal como entre 1-6 unidades LNA1 preferivelmente entre 2-5unidades LNA, mais preferivelmente 4 unidades LNA e; B (domínio central),preferivelmente imediatamente 3' para A, consiste ou compreende pelo me-nos uma unidade açúcar DNA, tal como 1-12 unidades DNA, preferivelmenteentre 4-12 unidades DNA, mais preferivelmente entre 6-10 unidades DNA,tal como entre 7-9 unidades DNA, mais preferivelmente 8 unidades DNA, e;C (região 3') preferivelmente imediatamente 3' para B, consiste ou compre-ende pelo menos uma unidade LNA, tal como entre 1 -6 unidades LNA, pre-ferivelmente entre 2-5 unidades LNA, mais preferivelmente 4 unidades LNA.Desenhos de gapmer preferidos são mostrados no W02004/046160.

Em um oligonucleotídeo gapmer, é preferível que quaisquer de-semparelhamentos não estejam dentro do domínio central (C) acima, quepreferivelmente compreende ou consiste em unidades DNA. Para digestãoRNAse H é tipicamente verificado pelo menos 5 nucleotídeos consecutivos(ou análogos que são capazes de recrutarem RnaseH para o híbrido oli-go/alvo) são requeridos no domínio central. Por isso, para gapmers, onde odomínio central excede 5 nucleotídeos consecutivos, é imaginado que um,ou possivelmente dois desemparelhamentos podem ser aceitáveis, emboranão preferível.

Em uma modalidade de oligonucleotídeos gapmer, pode ser pre-ferido que quaisquer desemparelhamentos estejam localizados na direçãodos termini 5' ou 3' do gapmer. Em uma tal modalidade, é preferido que emum oligonucleotídeo gapmer que compreende desemparelhamentos com omRNA alvo, que tais desemparelhamentos estejam localizados em regiões5' e/ou 3', e/ou os ditos desemparelhamentos estejam entre a unidade nu-cleotídeo terminal 5' ou 3' do dito oligonucleotídeo gapmer e molécula alvo.

Em uma modalidade, dentro do composto oligomérico de acordocom a invenção, tal como um oligonucleotídeo anti-sentido, que compreendeLNA1 todos os resíduos C LNA são 5'-metil citosina.

Em uma modalidade particularmente interessante, o compostotem a fórmula 5,-[(LNA)3.4-(DNA/RNA)8.9-(LNA)3-(DNA/RNA)1]-3,onde "LNA" designa um nucleotídeo LNA e "DNA" e "RNA" designam umdesoxirribonucleotídeo e um ribonucleotídeo, respectivamente.

Mais particularmente, o composto pode ser selecionado do gru-po consistindo em SEQ ID NOS: 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 e 47. Compostos preferidos podem ser seleciona-dos do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 29, 30, 31, 32, 36, 37, 38, 40, 41e 42, ou do grupo consistindo em SEQ ID NO: 30 e 31, e/ou do grupo con-sistindo em SEQ ID NOS: 36, 37 e 38, e/ou do grupo consistindo em SEQ IDNO: 41 e 42. Correntemente compostos mais preferidos são aqueles sele-cionados do grupo consistindo em SEQ ID NO: 29, 30 e 37.

Apropriadamente, os ditos nucleotídeos e/ou ditos LNAs podemser ligados por meio de grupos fosfato e/ou grupos fosforotioatos ou suascombinações.

Em uma modalidade, os ditos nucleotídeos e/ou ditos LNAs sãopreferivelmente ligados por meio de grupos fosforotioatos.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 29.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 30.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 31.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 32.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 33.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 34.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 35.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 36.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 37.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 38.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 39.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 40.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 41.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 42.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 43.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 44.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 45.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 46.

Em uma modalidade, a invenção provê um composto oligonu-cleotídeo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 47.

Em uma modalidade, quando o oligonucleotídeo de acordo coma invenção é üm oligonucleotídeo RNA, tal como SEQ ID NOS: 48, 49, 50 ou51, o terminal 3' contém duas unidades ribonucleotídeo modificada com 2'-O-metila coligadas, imediatamente adjacentes ao ribonucleotídeo terminal.Preparação de compostos oligonucleotídeos

Os blocos de construção de análogo de nucleotídeo LNA (β-D-óxi-LNA, β-D-tio-LNA, β-D-amino-LNA e α-L-óxi-LNA) podem ser preparadosseguindo procedimentos e referências publicadas citadas, ver, por exemplo,WO 03/095467 A1; D.S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Prepara-tion of LNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808; M.D. Sorensen, L.Kvaerno, T. Bryld. A.E. Hakansson, B. Verbeure, G. Gaubert, P. Herdewijn,J. Wengel (2002) α-L-ribo-configured Locked Nucleic Acid (a-l-LNA): Syn-thesis and Properties, J.Am. Chem. Soc., 124, 2164-2176; S.K. Singh, R.Kumar, J. Wengel (1998) Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1]Ribonucleosides:2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides, J. Org. Chem. 1998, 63,6078-6079; C. Rosenbohm, S.M. Christensen, M.D. Sorensen, D.S. Peder-sen, L.E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2'-amino-LNA: anew strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663; e WO 2004/069991 A2.

Um particular exemplo de um monômero LNA timidina é(1 S,3R,4R,7S)-7-hidróxi-1 -hidróxi metil-3-(timin-1-il)-2,5-dioxa biciclo[2: 2: 1]heptano.

Os oligonucleotídeos LNA podem ser preparados como descritonos Exemplos e nos WO 99/14226, WO 00/56746, WO 00/56748, WO00/66604, WO 00/125248, WO 02/28875, WO 2002/094250 e WO03/006475. Assim, os oligonucleotídeos LNA podem ser produzidos usandoas técnicas de oligomerização de química de ácido nucléico bem conhecidaspor aqueles versados na técnica de química orgânica. Geralmente, ciclos deoligomerização padrão da abordagem fosforamidito (S.L. Beaucage e R.P.lyer, Tetrahedron, 1993, 49, 6123; S. L. Beaucage e R.P. lyer, Tetrahedron,1992, 48, 2223) são usados, mas, por exemplo, química H-fosfonato, quími-ca fosfotriéster também podem ser usadas.

Para alguns monômeros, tempo de acoplamento mais longo,e/ou repetidos acoplamentos e/ou uso de reagentes de acoplamento maisconcentrados pode ser necessário ou benéfico.

Os fosforamiditos empregados acoplam tipicamente com satisfa-tórios rendimentos em etapas de >95%. Oxidação do fosforoso (III) a fosfo-roso (V) é normalmente feita com por exempl o, iodo/piridina/H20. Isto rendeapós desproteção a ligação internucleosídeo fósforo diéster nativa. No casode uma ligação internucleosídeo fosforotioato ser preparada uma etapa detiolação é realizada através de troca de oxidação normal, por exemplo, io-do/piridina/H20 usada para síntese de ligações internucleosídeo fósforo di-éster com uma oxidação usando o reagente ADTT (hidreto de xantano (0,01M em acetonitrila : piridina 9: 1; v/v)). Outros reagentes de tiolação tambémsão possíveis de serem usados, tal como Beaucage e PADS. Os oligonucle-otídeos LNA fosforotioato foram eficientemente sintetizados com rendimen-tos de acoplamento em etapas >=98%.

Oligonucleotídeos LNA compreendendo β-D-amino-LNA, β-D-tio-LNA, e/ou α-L-LNA também podem ser eficientemente sintetizados com ren-dimentos de acoplamento em etapas > 98% usando os procedimentos fosfo-ramidito.

Purificação de oligonucleotídeos LNA pode ser realizada usandocartuchos de purificação de fase reversa descartáveis e/ou HPLC de fasereversa e/ou precipitação a partir de etanol ou butanol. Eletroforese de gelcapilar, HPLC de fase reversa, MALDI-MS, e ESI-MS foram usados paraverificar a pureza dos oligonucleotídeos LNA sintetizados. Sais

Os oligonucleotídeos LNA podem ser empregados em uma vari-edade de sais farmaceuticamente aceitáveis. Como aqui usado, o termo re-fere-se a sais que retêm a desejada atividade biológica do oligonucleotídeoLNA e exibem mínimos efeitos toxicológicos indesejados. Exemplos de não-limitantes de tais sais podem ser formados com aminoácidos orgânicos esais de adição de base formados com cátions metálicos tais como zinco,cálcio, bismuto, bário, magnésio, alumínio, cobre, cobalto, níquel, cádmio,sódio, potássio e semelhantes, ou com um cátion formado a partir de amô-nia, Ν,Ν-dibenzil etileno diamina, D-glucosamina, tetra etil amônio, ou etile-nodiamina; ou combinações, por exemplo, um sal tanato de zinco ou seme-lhantes.

Tais sais são formados, a partir de oligonucleotídeos LNA quepossuem grupo fósforo diéster e/ou grupos fosforotioato, e são, por exemplo,sais com bases apropriadas. Estes sais incluem, por exemplo, sais de me-tais não-tóxicos que são derivados de metais de grupos Ia, lb, lia, e Ilb doSistema Periódico dos Elementos, em particular sais de metais alcalinos a-propriados, por exemplo, sais de lítio, soído ou potássio, ou sais de metaisalcalino-terrosos, por exemplo, sais de magnésio ou cálcio. Eles além dissoincluem sais de zinco e amônio e também sais que são formados com apro-priadas aminas orgânicas, tais como mono-, di- ou trialquil aminas não-substituídas ou substituídas com hidroxila, em particular mono-, di- ou trial-quil aminas, ou com compostos amônio quaternários, por exemplo, com N-metil-N-etil amina, dietilamina, trietilamina, mono-, bis- ou tris-(2-hidróxi alquilinferior) aminas, tais como mono-, bis- ou tris-(2-hidróxi etil) amina, 2-hidróxi-t-butil amina ou tris(hidróxi metil) metil amina, N,N-d-alquil inferior-N-(hidróxialquil inferior) aminas, tais como N,N-dimetil-N-(2-hidróxi etil) amina ou tri(2-hidróxi etil) amina, ou N-metil-D-glucamina, ou compostos de amônio qua-ternário como sais de tetra butil amônio. Sais de lítio, sais de sódio, sais demagnésio, sais de zinco ou sais de potássio são preferidos, com sais de só-dio sendo particularmente preferidos.Pró-drogas

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo LNA pode estar na for-ma de uma pró-droga. Oligonucleotídeos são por virtude íons carregadosnegativamente. Devido à natureza lipofílica de membranas de células, a to-mada celular de oligonucleotídeos é reduzida comparada a equivalentesneutros ou lipofílicos. Este "impedimento" de polaridade pode ser evitadoatravés do uso de abordagem de pró-droga (ver, por exemplo, Crooke, R.M.(1998) em Crooke, S.T. Antisense research and Application. Springer-Verlag,Berlin, Germany, vol. 131, pp. 103-140). Nesta abordagem, os oligonucleotí-deos LNA são preparados em uma maneira protegida de modo que os oligo-nucleotídeos LNA são neutros quando administrados. Estes grupos de pro-teção são desenhados de modo que eles podem ser removidos quando ooligonucleotídeo LNA é tomado pelas células. Exemplos de tais grupos deproteção são S-acetil tioetila (SATE) ou S-pivaloil tio etila (t-butil-SATE). Es-tes grupos de proteção são resistentes à nuclease e são seletivamente re-movidos intracelularmente.

Conjugados

Ainda um aspecto da invenção refere-se a um conjugado com-preendendo o composto como definido aqui pelo menos uma metade não-nucleotídeo ou não-polinucleotídeo ligada covalentemente ao dito composto.

Em um aspecto relacionado da invenção, o composto da inven-ção é ligado a Iigantes de modo a formar um conjugado, os ditos Iigantespretendidos para aumento de tomada celular do conjugado em relação aosoligonucleotídeos anti-sentido.

Os compostos ou conjugados da invenção também podem serconjugados ou ainda conjugados a substâncias drogas ativas, por exemplo,aspirina, ibuprofeno, uma droga sulfa, um agente de diminuição de coleste-rol, um agente antidiabético, um agente antibacteriano, um agente quimiote-rapêutico, ou um antibiótico.

No presente contexto, o termo "conjugado" é pretendido indicaruma molécula heterogênea formada através de ligação covalente de um oli-gonucleotídeo LNA como aqui descrito (isto é, um composto compreendendouma seqüência de nucleosídeos e análogos de nucleosídeos LNA) a uma oumais metades não-nucleotídeos ou não-polinucleotídeo.

Assim, os oligonucleotídeos LNA podem, por exemplo, ser con-jugados ou formarem quimera com metades não-nucleotídeo ou não-polinucleotídeo incluindo ácidos nucléicos peptídeo (PNA), proteínas (porexemplo, anticorpos para uma proteína alvo), macromoléculas, substânciasdrogas de baixo peso molecular, cadeias de ácidos graxos, resíduos de açú-car, glicoproteínas, polímeros (por exemplo, polietileno glicol), grupos deformação de micelas, anticorpos, carboidratos, grupos de ligação de recep-tor, esteróides como colesterol, polipeptídeos, agentes intercalantes comoum derivado de acridina, um álcool de cadeia longa, um dendrímero, um fos-folipídeo, e outros grupos Iipofílicos ou suas combinações, etc., justo comoos oligonucleotídeos podem ser arranjados em estruturas diméricas ou den-dríticas. Os oligonucleotídeos LNA ou conjugados também podem ser conju-gados ou ainda conjugados a substâncias drogas ativas, por exemplo, aspi-rina, ibuprofeno, uma droga sulfa, um antidiabético, um agente antibacteria-no, um composto quimioterapêutico ou um antibiótico.

Conjugação desta maneira confere propriedades vantajosas comrelação às características fármaco-cinéticas dos oligonucleotídeos LNA. Emparticular, conjugação desta maneira obtém aumentada tomada celular.

Em uma modalidade, um oligonucleotídeo LNA é ligado a Iigan-tes de modo a formar um conjugado, os ditos Iigantes pretendidos para au-mento de tomada celular do conjugado em relação aos oligonucleotídeosLNA anti-sentido. Esta conjugação pode ocorrer nas posições terminais 573'-OH, mas os Iigantes também podem tomar lugar nos açúcares e/ou as ba-ses. Em particular, o fator de crescimento ao qual o oligonucleotídeo LNAanti-sentido pode ser conjugado, pode compreender transferrina ou folato.Complexos de transferrina - polilisina - oligonucleotídeo ou complexos defolato - polilisina - oligonucleotídeo podem ser preparados para tomada porcélulas expressando altos níveis de receptor transferrina ou folato. Outrosexemplos de conjugados/ligantes são metades colesterol, intercaladores dú-plex como acridina, poli-L-lisina, "capeamento de extremidade" com um oumais grupos de ligação resistentes à nuclease como fósforo mono tioato, esemelhantes.

A preparação de complexos de transferrina como veículos detomada de oligonucleotídeo em células é descrita por Wagner et al. Proc.Natl. Acad. Sei. USA 87, 3410-3414 (1990). Liberação cellular de conjugadosde float - macromolécula via endocitose de receptor de float, incluindo Iibe-ração de um oligonucleotídeo anti-sentido, é descrita por Low et al., PatenteUS 5 108 921. Ver também, Leamon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 88, 5572(1991).

Composição Farmacêutica

Um aspecto particularmente interessante da invenção é direcio-nado a uma composição farmacêutica compreendendo um composto comoaqui definido ou um conjugado como aqui definido, e um diluente, veículo ouadjuvante farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade particularmenteinteressante, a composição farmacêutica é adaptada para administraçãooral.

Instruções para a preparação de composições farmacêuticaspodem ser encontradas em "Remington: The Science and Practice of Phar-macey" por Alfonso R. Gennaro, e no que se segue.

Deve ser entendido que a presente invenção também é particu-larmente relevante para uma composição farmacêutica, que compreendepelo menos uma construção de oligonucleotídeo anti-sentido da invençãocomo um ingrediente ativo. Deve ser entendido que a composição farmacêu-tica de acordo com a invenção opcionalmente compreende um veículo far-macêutico, e que a composição farmacêutica opcionalmente ainda compre-ende compostos anti-sentido, agentes quimioterapêuticos, agentes de dimi-nuição de colesterol, compostos antiinflamatórios, compostos antivirais, e/oucompostos de imunomodulação.

Como estabelecido, a composição farmacêutica da invençãoainda pode compreender pelo menos um composto terapêutico/profilático. Ocomposto é tipicamente selecionado do grupo consistindo em resinas deseqüestro de sal de bile (por exemplo, colestiramina, colestipol e cloridratode colesevelam), inibidores de HMGCoA-redutase (por exemplo, lovastatina,cerivastatina, prevastatina, atorvastatina, simvastatina, e fluvastatina), ácidonicotínico, derivados de ácido fíbrico (por exemplo, clofibrato, gemfibrozil,fenofibrato, bezafibrato, e ciprofibrato), probucol, neomicina, dextrotiroxina,ésteres de estanol de planta, inibidores de absorção decolesterol (por exem-plo, ezetimibe), implitapide, inibidores de transportadores de ácido de bile(transportadores de ácido de bile dependentes de sódio apical), reguladoresde CYP7a hepático, terapêuticos de substituição de estrogênio (por exem-plo, tamoxifen), e antiinflamatórios (por exemplo, glucocorticóides).

O composto oligonucleotídeo ou conjugado compreendido nestainvenção pode ser empregado em uma variedade de sais farmaceuticamen-te aceitáveis. Como usado aqui, o termo refere-se a sais que retêm a dese-jada atividade biológica dos compostos aqui identificados e exibem mínimosindesejados efeitos toxicológicos, cf. "Conjugados".Em uma modalidade da invenção, o composto ou conjugado oli-gonucleotídeo pode estar na forma de uma pró-droga, cf. "Pró-drogas".

A invenção também inclui a formulação de um ou mais compostoou conjugado oligonucleotídeo como aqui mostrado. Agentes de ligação eadjuvantes farmaceuticamente aceitáveis podem compreender parte da dro-ga formulada. Cápsulas, comprimidos e pílulas, etc., podem conter por e-xemplo os seguintes compostos: celulose microcristalina, goma ou gelatinacomo ligantes; amido ou Iactose como excipientes; estearatos como lubrifi-cantes; vários agentes adoçantes ou aromatizantes. Para cápsulas a unida-de de dosagem pode conter um veículo líquido como óleos graxos. Damesma maneira revestimentos de açúcar ou agentes entéricos podem serparte da dosagem unitária. As formulações de oligonucleotídeos tambémpodem ser emulsões dos ingredientes farmacêuticos ativos e um lipídeoformando uma emulsão micelular. Tais formulações são particularmente ú-teis para administração oral.

Um oligonucleotídeo da invenção pode ser misturado com qual-quer material que não prejudique a ação desejada, ou com material que su-plementa a desejada ação. Estes podem incluir outras drogas incluindo ou-tros compostos nucleotídeos.

Para administração parenteral, subcutânea, intradérmica ou tó-pica, a formulação pode incluir um diluente estéril, tampões, reguladores detonicidade e antibacterianos. O composto ativo pode ser preparado com veí-culos que protejam contra degradação ou imediata eliminação do corpo, in-cluindo implantes ou microcápsulas com propriedades de liberação controla-da. Para administração intravenosa os veículos preferidos são solução salinafisiológica ou solução salina tamponada com fosfato.

Preferivelmente, um composto oligonucleotídeo é incluído emuma formulação unitária tal como em um veículo ou diluente farmaceutica-mente aceitável em uma quantidade suficiente para liberar para um pacienteuma quantidade terapeuticamente eficaz sem causar sérios efeitos colateraisno paciente tratado.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem seradministradas em um número de maneiras dependendo de se é desejadotratamento local ou sistêmico e da área a ser tratada. Administração podeser (a) oral (b) pulmonar, por exemplo, através de inalação ou insuflação depulverizados ou aerossóis, incluindo através de nebulizador; intratraqueal,intranasal, (c) tópica incluindo epidérmica, transdérmica, oftálmica e paramembranas de mucosa incluindo liberação vaginal e retal; ou (d) injeção ouinfusão parenteral incluindo intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intraperi-toneal, ou intramuscular; ou intracranial, por exemplo, administração intrate-cal ou intraventricular. Em uma modalidade o oligonucleotídeo LNA ativo éadministrado IV, IP, oralmente, topicamente ou como uma injeção de quanti-dade relativamente grande ou administrado diretamente para o órgão alvo.

Composições e formulações farmacêuticas para administraçãotópica podem incluir emplastos transdérmicos, pomadas, loções, loções,cremes, géis, gotas, espargimentos, supositórios, líquidos e pulverizados.Veículos farmacêuticos convencionais, aquosos, pulverizados ou bases ole-osas, espessantes e semelhantes podem ser necessários ou desejáveis.Conservantes revestidos, luvas e semelhantes também podem ser úteis.Formulações tópicas preferidas incluem aquelas nas quais os oligonucleotí-deos da invenção estão em mistura com um agente de liberação tópica co-mo lipídeos, lipossoma, ácidos graxos, ésteres de ácido graxo, esteróides,agentes quelantes e tensoativos.

Composições e formulações para administração oral incluem,mas não são restritos a pulverizados ou grânulos, micropartículas, nanopar-tículas, suspensões ou soluções em água ou meios não-aquosos, cápsulas,cápsulas de gel, sachês, comprimidos ou minicomprimidos. Tipicamente,

Composições e formulações para administração parenteral, in-tratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis que tam-bém podem conter tampões, diluentes e outros aditivos apropriados tais co-mo, mas não limitado a, aperfeiçoadores de penetração, compostos veículose outros veículos ou excipientés farmaceuticamente aceitáveis.

Composições farmacêuticas da presente invenção incluem, masnão são limitadas a, soluções, emulsões, e formulações contendo Iiposso-mas. Estas composições podem ser geradas a partir de uma variedade decomponentes que incluem, mas não são limitados a, líquidos pré-formados,sólidos de auto-emulsificação e semi-sólidos de auto-emulsificação. Libera-ção de droga para tecido de fígado pode ser aperfeiçoada por liberação me-diada por veículo incluindo, mas não limitado a, Iipossomas catiônicas, ciclodextrinas, derivados de porfirina, dendrímeros de cadeia ramificada, políme-ros polietileno imina, nanopartículas e microesferas (DassCR. J PharmPharmacol 2002; 54(1): 3-27).

As formulações farmacêuticas da presente invenção, que podemser convenientemente apresentadas em forma de dosagem unitária, podemser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas naindústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de colocação em asso-ciação os ingredientes ativos com o veículo(es) ou excipiente(s) farmacêuti-co. Em geral, as formulações são preparadas colocando em associação uni-forme e íntima os ingredientes ativos com veículos líquidos ou veículos sóli-dos finamente divididos ou ambos, e então, se necessário, conformando oproduto.

As composições da presente invenção podem ser formuladasem qualquer uma de muitas possíveis formas de dosagem como, mas nãolimitado a, comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, géismoles, e supositórios. As composições da presente invenção também po-dem ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não-aquosos oumistos. Suspensões aquosas ainda podem conter substâncias que aumen-tam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, sódio carbóxi metilcelulose, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão também pode conter estabili-zantes.

Compostos oligonucleotídeos contendo LNA são úteis para umnúmero de aplicações terapêuticas como indicado acima. Em geral, métodosterapêuticos da invenção incluem administração de uma quantidade terapeu-ticamente eficaz de um oligonucleotídeo modificado com LNA a um mamífe-ro, particularmente um ser humano.

Em uma certa modalidade, a presente invenção provê composi-ções farmacêuticas contendo (a) um ou mais compostos anti-sentido e (b)um ou mais outros agentes de diminuição de colesterol que funcionam atra-vés de um mecanismo não-anti-sentido. Quando usados com os compostosda invenção, tais agentes de diminuição de colesterol podem ser usadosindividualmente (por exemplo, atorvastatina e oligonucleotídeo), seqüencial-mente (por exemplo, atorvastatina e oligonucleotídeo por um período detempo seguido por um outro agente e oligonucleotídeo), ou em combinaçãocom um ou mais outros tais agentes de diminuição de colesterol. Todos osagentes de diminuição de colesterol conhecidos por aqueles versados natécnica são aqui incorporados como tratamentos combinação com compostode acordo com a invenção.

Drogas antiinflamatórias, incluindo, mas não limitado a drogasantiinflamatórias não-esteroidais e corticosteróides, drogas antivirais, e dro-gas de imunomodulação também podem ser combinadas em composiçõesda invenção. Dois ou mais compostos combinados podem ser usados juntosou seqüencialmente.

Em uma outra modalidade, composições da invenção podemconter um ou mais compostos anti-sentido, particularmente oligonucleotí-deos, alvejados para um primeiro ácido nucléico e um ou mais compostosadicionais anti-sentido alvejados para um segundo ácido nucléico alvo. Doisou mais compostos combinados podem ser usados juntos ou seqüencial-mente.

Dosagem é dependente da severidade e capacidade de respos-ta do estado de doença a ser tratado, e o curso de tratamento demorando devários dias a vários meses, ou até uma cura ser efetuada ou uma diminuiçãodo estado de doença ser obtida. Ótimos esquemas de dosagem podem sercalculados a partir de medições de acumulação de droga no corpo do paci-ente.

Dosagens ótimas podem variar dependendo da relativa potênciade oligonucleotídeos individuais. Geralmente elas podem ser estimadas ba-seado em EC50S verificadas serem eficazes in vitro e in vivo em modelosanimais. Em geral, dosagem é de 0,01 μg a 1 g por kg de peso de corpo, epode ser dada uma vez ou mais ao dia, semanalmente, mensalmente ouanualmente, mesmo uma vez cada 2 a 10 anos ou através de infusão contí-nua por horas até vários meses. As taxas de repetição para dosagem podemser estimadas baseado em tempos de residência medidos e concentraçõesda droga em fluidos ou tecidos corpóreos. Seguindo tratamento bem-sucedido, pode ser desejável se ter o paciente sofrendo terapia de manuten-ção para prevenir a recorrência do estado de doença.Processo de tratamento

Aqueles versados na técnica apreciarão que compostos oligonu- cleotídeos contendo LNA podem ser usados para combate de doenças liga-das à apolipoproteína B (Apo-BIOO) através de muitos princípios diferentes,que assim caem dentro do espírito da presente invenção.

Os compostos oligonucleotídeos LNA podem ser desenhadoscomo siRNAs que são pequenas moléculas de RNA de fita dupla que sãousadas por células para silenciar específicos genes endógenos ou exógenosatravés de um mecanismo "semelhante a anti-sentido" ainda pouco entendido.

Foi mostrado que β-D-óxi-LNA não suporta atividade RnaseH.Entretanto, isto pode ser alterado de acordo com a invenção através de cria-ção de oligonucleotídeos quiméricos compostos por β-D-óxi-LNA e DNA,chamado gapmers. Um gapmer é baseado em um estiramento central de 4-12 nt DNA ou monômeros modificados reconhecíveis e cliváveis pela (Rna-seH (o hiato) tipicamente flanqueada por 1 a 6 resíduos de β-óxi-LNA (osflancos). Os flancos também podem ser construídos com derivados de LNA.Existem outros constructos quiméricos de acordo com a invenção que sãocapazes de atuar via um mecanismo mediado por RhaseH. Um "headmer" édefinido por um estiramento contíguo de β-D-óxi-LNA ou derivados de LNAna extremidade-5' seguido por um estiramento contíguo de DNA ou monô-meros modificados reconhecíveis e cliváveis pela RnaseH na direção da ex-tremidade 3', e um "tailmer" é definido por um estirão contínuo de DNA oumonômeros modificados reconhecíveis e cliváveis pela RnaseH na extremi-dade 5' seguido por um estiramento contíguo de β-D-óxi-LNA ou derivadosde LNA na direção de extremidade 3'. Outras quimeras de acordo com a in-venção, chamadas "mixmers" consistindo em uma composição alternativa deDNA ou monômeros modificados reconhecíveis e cliváveis por RnaseH e β-D-óxi-LNA e/ou derivados de LNA também podem ser capazes de mediarligação e clivagem mediadas por RnaseH. Uma vez que α-L-LNA recrutaatividade RnaseH em uma certa extensão, menores hiatos de DNA ou mo-nômeros modificados reconhecíveis e cliváveis pela RnaseH para a constru-ção de gapmer podem ser requeridos, e mais flexibilidade na construçãomixmer pode ser introduzida.

A eficácia clínica de oligonucleotídeos anti-sentido depende emuma significante extensão de suas fármaco-cinéticas, por exemplo, absor-ção, distribuição, tomada celular, metabolismo e excreção. Por usa vez estesparâmetros são significantemente guiados pela química subjacente e o ta-manho e estrutura tridimensional do oligonucleotídeo.

Modulação das propriedades fármaco-cinéticas de um oligonu-cleotídeo LNA de acordo com a invenção ainda pode ser obtida através deligação de uma variedade de metades diferentes. Por exemplo, a habilidadedos oligonucleotídeos em passar a membrana de célula pode ser aperfeiço-ada através de ligação, por exemplo, de metades lipídeo como uma metadecolesterol, um tioéter, uma cadeia lifática, um fosfolipídeo ou uma poliaminaao oligonucleotídeo. Da mesma maneira, tomada de oligonucleotídeos LNAem células pode ser aperfeiçoada através de conjugação de metades aooligonucleotídeo que interagem com moléculas na membrana, o que mediatransporte no citoplasma.

As propriedades fármaco-cinéticas de acordo com a invençãopodem ser aperfeiçoadas com grupos que aperfeiçoam tomada de oligôme-ro, aperfeiçoam bioestabilidade, tal como aperfeiçoam resistência de oligô-mero à degradação e/ou aumentam a especificidade e afinidade de caracte-rísticas de hibridização de oligonucleotídeos com seqüência alvo, por exem-pio, uma seqüência de mRNA.

A composição farmacêutica de acordo com a invenção pode serusada para o tratamento de condições associadas com níveis anormais deΑροΒ-100.

Exemplos de tais condições ssão hiperlipoproteinimia, hiperlipo-proteinimia tipo 3 familiar (dis-beta Iipoproteinimia familiar), e hiper-alfa-lipoproteinimia familiar; hiperlipidemia, hiperlipidemias mistas, hiperlipidemiado tipo lipoproteína múltipla, e hiperlipidemia combinada familiar; hipertrigli-ceridemia, hipertrigliceridemia familiar, e lipoproteína lípase familiar; hiperco-lesterolemia, hipercolesterolemia resistente à estatina, hipercolesterolemiafamiliar, hipercolesterolemia poligênica, e apolipoproteína B defeituosa fami-liar; distúrbios cardiovasculares incluindo aterosclerose e doença de artériacoronária; trombose; doença vascular periférica; doença de von Gierke (do-ença de estocagem de glicogênio, tipo I); Iipodistrofias (formas congênitas eadquiridas); síndrome de Cushing; nanismo ateloítico sexual (deficiência dehormônio de crescimento isolada); diabetes melitus; hipertiroidismo; hiper-tensão; anorexia nervosa; síndrome de Werner; porfiria intermitente aguda;cirrose biliar primária; obstrução biliar 5 extra-hepática; hepatite aguda; he-patoma; Iupus sistêmico eritematoso; gamopatias monoclonais (incluindomieloma, mieloma múltiplo, macroglobulinemia, e linfoma); endocrinopatias;obesidade; síndrome nefrótica; síndrome metabólica; inflamação; hipotiroi-dismo; uremia (hiperurecemia); impotência; doença obstrutiva de fígado; hi-percalcemia idiopática; disqlobulinemia; níveis elevados de insulina; síndro-me-X; contratura de Dupuytren; AIDS; e mal de Alzheimer e demência.

A invenção também provê métodos de redução de risco de umacondição compreendendo a etapa de administração a um indivíduo de umaquantidade de composto da invenção suficiente para inibir expressão deapolipoproteína B, a dita condição selecionada de gravidez; claudicação in-termitente; gota; e toxidez de mercúrio e doença de amálgama. A invençãoainda provê métodos de inibição de ligação de partícula de colesterol a en-dotélio vascular compreendendo a etapa de administração a um indivíduo deuma quantidade de um composto da invenção suficiente para inibir expres-são de apolipoproteína B, e como um resultado, a invenção também provêmétodos de redução de risco de: (i) oxidação de partícula de colesterol; (ii)ligação de monócito e endotélio vascular; (iii) diferenciação de monócitos emmacrófagos; (iv) ingestão de macrófagos de partículas de lipídeo 30 oxida-das e liberação de citocinas (incluindo, mas não limitado a IL_I, TNF-alfa,

TGF-beta); (v) formação de plaqueta de lesões fibro-graxas fibrosas e infla-mação; (vi) lesões do endotélio conduzindo a coágulos; e (vii) coágulos con-duzindo a infartação miocardial ou acidente vascular cerebral, também com-preendendo a etapa de administração a um indivíduo de uma quantidade deum composto da invenção suficiente para inibir expressão de apolipoproteí-na B.

A invenção também provê processos de redução de hiperlipide-mia associada com alcoolismo, fumo, uso de contraceptivos orais, uso deglucocorticóides, uso de agentes de bloqueio beta-adrenérgicos, ou uso deisotretiniona (ácido 13-cis retinóico) compreendendo a etapa de administra-ção a um indivíduo de uma quantidade de um composto da invenção sufici-ente para inibir expressão de apolipoproteína B.

A invenção ainda prove uso de um composto da invenção nafabricação de um medicamento para o tratamento de qualquer uma e todasas condições aqui mostradas.

Geralmente estabelecido, um aspecto da invenção é direcionadoa um método de tratamento de um mamífero sofrendo de ou suscetível acondições associadas com níveis anormais de ApoB-100, compreendendoadministração ao mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz deum oligonucleotídeo alvejado para Apo-BIOO que compreende uma ou maisunidades LNA.

Um interessante aspecto da invenção é direcionado ao uso deum composto como aqui definido ou um conjugado como aqui definido paraa preparação de um medicamento para o tratamento de uma condição deacordo com acima.

Os métodos da invenção são preferivelmente empregados paratratamento ou profilaxia contra doenças causadas por níveis anormais deApoB-100.

Além disso, a invenção aqui descrita abrange um método deprevenção ou tratamento de uma doença compreendendo uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um composto oligonucleotídeo modulando Apo-B100, incluindo, mas não limitada a altas doses do oligômero, a um ser hu-mano em necessidade de tal terapia. A invenção ainda abrange o uso de umcurto período de administração de um composto oligonucleotídeo modulandoApo-Bl 00.

Em uma modalidade da invenção o composto oligonucleotídeo éligado a ligantes/conjugados. É uma maneira para aumentar tomada celularde oligonucleotídeos anti-sentido.

Compostos oligonucleotídeos da invenção também podem serconjugados a substâncias drogas ativas, por exemplo, aspirina, ibuprofeno,uma droga sulfa, um agente antidiabético, antibacteriano ou antibiótico.

Alternativamente estabelecido, a invenção é além disso direcio-nada a um processo para tratamento de níveis anormais de ApoB-100, o ditoprocesso compreendendo administração de um composto como aqui defini-do, ou conjugado como aqui definido ou uma composição farmacêutica co-mo aqui definida a um paciente em sua necessidade e ainda compreenden-do a administração de ainda um agente quimioterapêutico. Ainda tal adminis-tração pode ser tal que o ainda agente quimioterapêutico seja conjugado aocomposto da invenção, está presente na composição farmacêutica, ou édministrado em uma formulação separada.

Os compostos oligonucleotídeos contendo LNA da presente in-venção também podem ser utilizados como reagentes de pesquisa para di-agnósticos, terapêuticas e profilaxiá. Em pesquisa, os oligonucleotídeos anti-sentido podem ser usados para inibirem especificamente a síntese de genesApo-BIOO em células e animais experimentais pelo que facilitando análisefuncional do alvo ou uma avaliação de sua utilidade como um alvo para in-tervenção terapêutica. Em diagnósticos os oligonucleotídeos anti-sentidopodem ser usados para detecção e quantificação de expressão de Apo-BIOOem células e tecidos através de Northern blotting, hibridização in situ ou téc-nicas similares. Para terapêuticas, um animal ou ser humano, suspeito de teruma doença ou distúrbio, que pode ser tratada através de modulação deexpressão de Apo-BIOO é tratado através de administração de compostosanti-sentido de acordo com esta invenção. Ainda são providos métodos detratamento de um animal, em particular camundongo e rato e tratamento deum ser humano, suspeito de ter ou sendo propenso a uma doença ou condi-ção, associada com expressão de Apo-B100 através de administração deuma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de um ou mais doscompostos anti-sentido ou composições da invenção.

A invenção também refere-se a um composto ou um conjugadocomo aqui definido para uso como um medicamento.

A invenção ainda refere-se ao uso de um composto ou um con-jugado como aqui definido para a fabricação de um medicamento para o tra-tamento de níveis anormais de Apo-Bl00. Tipicamente, tais níveis anormaisde Apo-B100 estão na forma de aterosclerose, hipercolesterolemia ou hiper-lipidemia.

Além disso, a invenção refere-se a um processo de tratamentode um indivíduo sofrendo de uma doença ou condição selecionada de ate-rosclerose, hipercolesterolemia, e hiperlipidemia, o processo compreenden-do a etapa de administração de uma composição farmacêutica como aquidefinida ao sujeito em sua necessidade. Preferivelmente a composição far-macêutica é administrada oralmente.

Algumas Modalidades da Invenção

1. Um composto consistindo em um total de 12-50 nucleotídeose/ou análogos de nucleotídeos, onde o dito composto compreendendo umasubseqüência de pelo menos 10 nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos,a dita subseqüência estando localizada dentro de uma seqüência seleciona-da do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10 ,11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 27, 28, 48 e 50 onde o dito composto compreende pelo menos 3análogos de nucleotídeos.

2. Um composto de acordo com a reivindicação 1, consistindoem um oligonucleotídeo de fita dupla, onde cada fita compreende um total de16-30 nucleotídeos e/ou análogos de nucleotídeos, onde o dito compostocompreende uma subseqüência de pelo menos 10 nucleotídeos ou análogosde nucleotídeos, a dita subseqüência estando localizada dentro de uma se-qüência selecionada de SEQ ID NOS: 27, 28, (e/ou 48 ou 50) e, onde o ditocomposto compreende pelo menos 3 análogos de nucleotídeos.

3. O composto de acordo com a modalidade 1 consistindo em12-25 nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos.

4. O composto de acordo com a modalidade 3 consistindo em15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos.

5. O composto de acordo com a modalidade 4 consistindo em 16nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos.

6. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades 1-10 5, onde os ditos nucleotídeos compreendem um grupo de ligação seleciona-do do grupo consistindo em um grupo fosfato, um grupo fosforotioato, e umgrupo boranofosfato, a ligação internucleosídeo pode ser -O-P(O)2-O-, -O-P(O1S)-O-.

7. O composto de acordo com a modalidade 6, onde a dita Iiga-ção é um grupo fosfato.

8. O composto de acordo com a modalidade 6, onde a dita liga-ção é um grupo fosforotioato.

9. O composto de acordo com a modalidade 6, onde todos osnucleotídeos compreendem um grupo fosforotioato.

10. O composto de acordo com a modalidade 9 compreendendode 3-12 análogos de nucleotídeos.

11.0 composto de acordo com a modalidade 10 compreenden-do 6 análogos de nucleotídeos.

12. O composto de acordo com qualquer uma das modalidades10-11, onde pelo menos um dos ditos análogos de nucleotídeo é um ácidonucléico fechado (LNA).

13. O composto de acordo com a modalidade 12, onde LNA éselecionado de beta-D-óxi-LNA, alfa-L-óxi-LNA, beta-D-amino-LNA ou beta-D-tio-LNA.

14. O composto de acordo com a modalidade 13, onde os ditosnucleotídeos e/ou LNAs são ligados juntos por meio de grupos fosfato.

15. O composto de acordo com a modalidade 14, onde os ditosnucleosídeos e/ou os ditos LNAs são ligados por meio de grupos fosforotioa-to.

16. O composto de acordo com a modalidade 12, onde a subse-qüência é SEQ ID NO: 2.

17. O composto de acordo com a modalidade 12, onde a subse-qüência é SEQ ID NO: 3.

18. O composto de acordo com qualquer uma de modalidades-16-17, onde o LNA de extremidade 3' é substituído com o correspondentenucleosídeo natural.

19. Um composto consistindo em SEQ ID NO: 29.

20. Um composto consistindo em SEQ ID NO: 30.

21. Um conjugado compreendendo o composto de acordo comqualquer uma de modalidades 1-20 e pelo menos uma metade não-nucleotídeo ou não-polinucleotídeo ligada covalentemente ao dito composto.

22. Uma composição farmacêutica compreendendo um compos-to como definido em qualquer uma das modalidades 1-20 ou um conjugadocomo definido na modalidade 21, e um diluente, veículo ou adjuvante farma-ceuticamente aceitável.

23. A composição farmacêutica de acordo com a modalidade 22ainda compreendendo pelo menos um composto para diminuição de coleste-rol.

24. A composição farmacêutica de acordo com a modalidade 23,onde o dito composto é selecionado do grupo consistindo em resinas se-qüestrantes de sal de bile (por exemplo, colestiramina, colestipol, e cloridratode colesevelam), inibidores de HMGCoA-redutase (por exemplo, lovastatina,cerivastatina, prevastatina, atorvastatina, simvastatina, e fluvastatina), ácidonicotínico, derivados de ácido fíbrico (por exemplo, clofibrato, gemfibrozil,fenofibrato, bezafibrato, e ciprofibrato), probucol, neomicina, dextrotiroxina,ésteres de estanol de planta, inibidores de absorção de colesterol (por e-xemplo, ezetimibe), implitapide, inibidores de transportadores de ácido debile (transportadores de ácido de bile dependentes de sódio apical), regula-dores de CYP7a hepática, terapêutica de substituição de estrogênio (porexemplo, tamoxifeno), e antiinflamatórios (por exemplo, glucocorticóides).

25. Um composto como definido em qualquer uma das modali-dades 1-20 ou um conjugado como definido na modalidade 21 para uso co-mo um medicamento.

26. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasmodalidades 1-20 ou como conjugado como definido na modalidade 21 paraa fabricação de um medicamento para o tratamento de níveis anormais deApo-Bl 00.

27. Uso de acordo com a modalidade 26, onde os ditos níveisanormais de Apo-BIOO estão na forma de aterosclerose, hipercolesterolemiaou hiperlipidemia.

A invenção é ainda ilustrada em uma maneira não-limitante pe-los exemplos que se seguem.

Exemplos

Exemplo 1: Síntese de monômero

Os blocos de construção de monômero LNA e seus derivadosforam preparados seguindo procedimentos publicados e referências ali cita-das, ver:

WO 03/095467 A1

D. S. Pedersen, C. Rosenbohm, T. Koch (2002) Preparation ofLNA Phosphoramidites, Synthesis 6, 802-808.

M. D. Sorensen, L. Kvaerno, T. Bryld, A. E. Hákansson, B. Ver-beure, G. Gaubert, P. Herdewijn1 J. Wengel (2002) a-L-/7bo-configuredLocked Nucleic Acid (α-Ι-LNA): Synthesis and Properties, J. Am. Chem. Soc.,124,2164-2176.

S. K. Singh, R. Kumar, J. Wengel (1998) Synthesis of Novel Bi-cyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleo-sides, J. Org. Chem. 1998, 63, 6078-6079.

C. Rosenbohm, S. M. Christensen1 M. D. Sorensen, D. S. Peder-sen, L. E. Larsen, J. Wengel, T. Koch (2003) Synthesis of 2'-amino-LNA: anew strategy, Org. Biomol. Chem. 1, 655-663.D. S. Pedersen, T. Koch (2003) Analogues of LNA (Locked Nu-cleic Acid). Synthesis of the 2'-Thio-LNA Thymine and 5-Methyl CytosinePhosphoramidites, Synthesis 4, 578-582.

Exemplo 2: Síntese de oligonucleotídeo

Oligonucleotídeos foram sintetizados usando a abordagem fosfo-ramidito em um Expedite 89OO/MOSS Synthesizer (Multiple OligonucleotideSynthesis System) em escala de 1 μηιοΙ ou 15 μιτιοίβε. Para sínteses demaior escala foi usado um Akta Oligo Pilot. No fim da síntese (DMT-on), osoligonucleotídeos foram clivados do dito suporte sólido usando amônia a-quosa por 1-2 horas em temperatura ambiente, e ainda desprotegidos por 4horas a 65°C. Os oligonucleotídeos foram purificados por HPLC de fase re-versa (RP-HPLC). Após a remoção do grupo DMT1 os oligonucleotídeos fo-ram caracterizados por AE-HPLC, RP-HPLC, e CGE e a massa molecular foiainda confirmada por ESI-MS. Ver abaixo para mais detalhes.

Preparação do suporte sólido de LNA:

Preparação do succinil hemi-éster de LNA

Monômero 5'-0-Dmt-3'-hidróxi-LNA (500 mg), anidrido succínico(1,2 eq.) e DMAP (1,2 eq.) foram dissolvidos em DCM (35 mL). A reação foiagitada em temperatura ambiente por toda noite. Após extrações comNaH2PO4 0,1 M pH 5,5 (2x) e salmoura (1x), a camada orgânica foi aindasecada com Na2SO4 anidro, filtrada e evaporada. O derivado hemi-éster foiobtido em 95% de rendimento e foi usado sem ainda qualquer purificação.

Preparação do suporte de LNA

O derivado de hemi-éster preparado acima (90 μητιοίβε) foi dis-solvido em uma quantidade mínima de DMF, DIEA e pyBOP (90 μηιοίβε)foram adicionados e misturados por 1 minuto. Esta mistura pré-ativada foicombinada com LCAA-CPG (500 Angstróns, 80-120 de tamanho de tela, 300mg) em um sintetizador manual e agitados. Após 1,5 hora em temperaturaambiente, o suporte foi filtrado e lavado com DMF, DCM e MeOH. Após se-cagem, a carga foi determinada ser de 57 μηιοίβε^ (ver Tom Brown, DorcasJ.S. Brown. Modem machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotidesynthesis. In: F. Eckstein, editor. Oligonucleotides and Analogues A PracticalApproach. Oxford: IRL Press, 1991: 13-14).Alongamento do oligonucleotídeo

O acoplamento de fosforamiditos (A(bz), G(ibu), 5-metil-C(bz))ou Τ-β-ciano etil fosforamidito) é realizado através do uso de uma solução0,1 M do amidito protegido com 5'-0-DMT- em acetonitrila e DCI (4,5-dicianoimidazol) em acetonitrila (0,25 M) como ativador. A tiolação é realizada u-sando cloreto de xantano (0,01 M em acetonitrila : piridina 10%). O resto dosreagentes são os tipicamente usados para síntese de oligonucleotídeos. Oprotocolo provido pelo fornecedor foi convenientemente otimizado.Purificação por RP-HPLC:Coluna: Xterra RPi8

Taxa de fluxo: 3 mL/minuto

Tampões: acetato de amônio 0,1 M pH 8 e acetonitrilaAbreviaturasDMT: dimetóxi tritila

DCI: 4,5-diciano amino piridina

DMAP: 4-dimetil amino piridina

DCM: dicloro metano

DMF: dimetil fòrmamida

TH F: tetraidrof urano

DIEA: Ν,Ν-diisopropil etil amina

PyBOP: hexa flúor fosfato de benzotriazol-1-il óxi-tris-pirrolidino fos-fônio

Bz: benzoíla

Ibu: isobutirila

Exemplo 3: Desenho do composto oligonucleotídeo

O siRNA é uma fita sentido de 21-nucleotídeos (SEQ ID NO: 27)e uma fita anti-sentido de 23 nucleotídeos (SEQ ID NO: 28) - resultando emuma projeção de dois nucleotídeos na extremidade 3' da fita anti-sentido.SiRNA-ApoB sentido 5'-GUCAUCACACUGAAUACCAA*U-3'

(SEQ ID NO: 48), siRNA - ApoB-1 fita anti-sentido 5'-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGAc*a*C-3 (SEQ ID NO: 49) e SiARN-ChoI-ApoB fita sentido: 5'-GUCAUCACACUGAAUACCAAlTChol-3' (SEQ ID NO: 50) foram sintetiza-dos por RNATEC (Leuven).

Em uma modalidade da invenção, SEQ ID NOS: 2-26 contêmpelo menos 3 nucleotídeos LNA1 tal como 6 ou 7 nucleotídeos LNA como emSEQ ID NOS: 29-47.

Tabela 1: Composto oligonucleotídeo da invenção

Em SEQ ID NOS: 27, 28, 48, 49, 50, letras em caixa superiorindicam unidades ribonucleotídeo e subscritos "s" representam ligação fosfo-rotioato.

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SEQ ID NO: 30 é um composto interessante de acordo com ainvenção.

Exemplo 4: Estabilidade de compostos LNA em plasma humano ou de ratoEstabilidade de oligonucleotídeo LNA foi testada em plasma deseres humanos ou ratos (também podendo ser plasma de camundongo, ma-caco ou cão). Em 45 μL de plasma, 5 μL de oligonucleotídeo são adiciona-dos (uma concentração final de 20 μΜ). Os oligos são incubados em plasmapor tempos variando de 0 h - 96 h a 37°C(o plasma é testado para atividadenuclease até 96 h e não mostra diferença em padrão de clivagem de nuclea-se). No tempo indicado a amostra foi congelada instantânea em nitrogêniolíquido. 2 μL (igual a 40 pmoles) de oligonucleotídeo em plasma foram diluí-dos pela adição de 15 μL de água e 3 μL de 6x corante de carga (Invitro-gen). Como marcador uma escada de 10 pb (Invitrogen 10821-015) é usado.A 1 μL de escada, 1 μΙ_ de 6x carga e 4 μΙ_ de água foram adicionados. Asamostras foram misturadas, aquecidas a 65°C por 10 minutos e carregadaspara um gel de pré-corrida (acrilamida 16%, uréia 7 M, 1x TBE1 pré-corridaem 50 Watt por 1 h) e corrida em 50-60 Watt por 2 Vz h. Subseqüentementeo gel foi manchado com 1x SyBR gold (molecular probes) em 1x TBE por 15minutos. As bandas foram visualizadas usando um phosphoimager de Biorad.

Exemplo 5: Modelo in vitro: Cultura de células

O efeito de compostos anti-sentido sobreexpressão de ácido nu-cléico alvo pode ser testado em qualquer um de uma variedade de tipos decélulas contanto que o ácido nucléico alvo esteja presente em níveis mensu-ráveis. Alvo pode ser expresso endogenamente ou através de transfecçãoestável ou transiente de um ácido nucléico codificando o dito ácido nucléico.

O nível de expressão de ácido nucléico alvo pode ser rotineira-mente determinado usando, por exemplo, análises Northern blot, PCR quan-titativa, ensaios de proteção de ribonuclease. Os seguintes tipos de célulassão providos para propósitos ilustrativos, mas outros tipos de células podemser rotineiramente usados, contanto que o alvo seja expresso no tipo de cé-lula escolhido.

Células foram cultivadas no meio apropriado como descrito a-baixo e mantidas a 37°C em 95-98% de umidade e 5% de CO2. Células fo-ram rotineiramente passadas 2-3 vezes por semana.BNCL-2: linha de células de fígado de camundongo BNCL-2 foi adquiridade ATCC e cultivada em DMEM (Sigma) com FBS 10% + Glu-tamax I + aminoácidos não-essenciais + gentamicina.Hepal -6: linha de células de fígado de camundongo Hepal -6 foi adquiridade ATCC e cultivada em DMEM (Sigma) com FBS 10% + Glu-tamax I + aminoácidos não-essenciais + genatamicina.HepG2: linha de células de fígado humano HepG2 foi adquirida de ATCCe cultivada em Eagle MEM (Sigma) com FBS 10% + Glutamax I+ aminoácidos não-essenciais + gentamicina.Exemplo 6: Modelo in vitro: Tratamento com oliaonucleotídeo anti-sentido

Cultura e transfecção de células: células BNCL-2 ou Hepal-6foram semeadas em placas de 12 cavidades a 37°C (5% CO2) em meios decrescimento suplementados com FBS 10%, Glutamax I e gentamicina.

Quando as células foram 60-70% confluentes, elas foram transfectadas emduplicatas com diferentes concentrações de oligonucleotídeos (0,04-25 nM)usando Lipofectamina 2000 (5 μg/mL). Transfecções foram realizadas es-sencialmente como descrito por Dean et al. (1994, JBC 269: 16416-16424).Em resumo, células foram incubadas por 10 minutos com Iipofectamina emOptiMEM seguido por adição de oligonucleotídeo para um volume total de0,5 mL de mistura de transfecção por cavidade. Após 4 horas, a mistura detransfecção foi removida, células foram lavadas e crescidas a 37°C por a-proximadamente 20 horas (análises de mRNA e análises de proteínas noapropriado meio de crescimento. Células foram então colhidas para análisesde RNA e proteínas.

Exemplo 7: Modelo in vitro: Extração de RNA e síntese de cADNIsolamento de RNA total

RNA total foi isolado usando mini kit RNeasy (qiagen). Célulasforam lavadas com PBS, e tampão de Iise de célula (RTL, Qiagen) suple-mentado com mercaptoetanol 1% foi adicionado diretamente às cavidades.Após uns poucos minutos, as amostras foram processadas de acordo comas instruções do fabricante.Síntese de primeira fita

Síntese de primeira fita foi realizada usando OmniScript ReverseTranscriptase kit ou M-MLV Reverse transcriptase (essencialmente comodescrito pelo fabricante (Ambion)) de acordo com as instruções do fabricante(Qiagen). Quando usando OmniScript Reverse Transcriptase, 0,5 μg deRNA total de cada amostra, foi ajustado para 12 μΙ_ e misturados com 0,2 μίde poli(dT)12-i8 (0,5 μg/μL) (Life Technologies), 2 μΙ_ de mistura de dNTP (5mM cada), 2 μΐ_ 10x tampão RT, 0,5 μΙ_ inibidor RNAguard Rnase (33 unida-des/mL, Amersham) e 1 μΙ_ OmniScript Reverse Transcriptase seguido porincubação a 37°C por 60 minutos, e inativação térmica a 93°C por 5 minutos.Quando síntese de primeira fita foi realizada usando decâmerosrandômicos e M-MLV-transcriptase reversa (essencialmente como descritopelo fabricante (Ambion)), 0,25 μς de RNA total de cada amostra foi ajustadopara 10,8 μΙ_ em H2O. 2 μΙ_ de decâmeros e 2 μΙ_ de mistura de dNTP (2,5mM cada) foram adicionados. Amostras foram aquecidas a 70°C por 3 minu-tos e imediatamente resfriadas em água e gelo e adicionados 3,25 μΙ_ deuma mistura contendo (2 μΙ_ 10x tampão RT; 1 μι. M-MLV transcriptase re-versa; 0,25 μΙ_ inibidor de Rnase). cADN é sintetizado a 42°C por 60 minutosseguido por etapa de inativação com aquecimento a 95°C por 10 minutos efinalmente resfriado para 4°C.

Exemplo 8: Modelo in vitro e in vivo: Análises de inibicão de oliaonucleotídeode expressão de Apo-BIOO através de PCR de tempo real

Modulação anti-sentido de expressão de Apo-BIOO pode ser en-saiada em uma variedade de maneiras conhecidas na técnica. Por exemplo,níveis de mRNA de Apo-BIOO podem ser quantificados através de, por e-xemplo, análises de Northern blot, reação de polimerase competitiva (PCR),ou PCR de tempo real. PCR quantitativa de tempo real é presentemente pre-ferida. Análises de RNA podem ser realizadas sobre RNA celular total oumRNA.

Métodos de isolamento de RNA e análises de RNA tais comoanálises de Northern blot é rotina na técnica e é ensinada em, por exemplo,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.

PCR quantitativa de tempo real pode ser convenientemente rea-lizada usando o iQ Multi-Color Real Time PCR Detection System comercial-mente disponível de BioRAD. PCR quantitativa de tempo real é uma técnicabem conhecida e é ensinada, por exemplo, em Heid et al. Real time quantita-tive PCR, Genome Research (1996), 6: 986-994.

Análises PCR quantitativas de tempo real de níveis de mRNA de Apo-BIOOPara determinar o nível relativo de mRNA de ApoB de camun-dongo em amostras tratadas e não-tratadas, o cADN gerado foi usado emanálises PCR quantitativas usando um iCycler de BioRad.

A 8 μΙ_ de cADN diluído 5 vezes (Gapdh and Beta-Actin) foramadicionados 52 μΙ_ de uma mistura contendo 29,5 μΙ_ de Platinum qPCR.

Supermix-UDG (Invitrogen), 1030 nM de cada iniciador, 0,57 XSYBR Verde (Molecular Probes) e 11,4 nM de fluoresceína (Molecular Pro-bes).

Duplicatas de 25 μ!_ foram usadas para qPCR: 50°C por 120 se-gundos, 95°C por 120 segundos e 40 ciclos [95°C por 30 segundos e 60°Cpor 60 segundos].

Expressão de ApoB foi quantificada usando um cADN diluído 50vezes e um protocolo Q-PCR padrão. Os iniciadores (conc. final de respecti-vãmente primers dianteiro e reverso de 0,6 μΜ e 0,9 μΜ) e sonda (conc. finalde 0,1 μΜ) foram misturados com 2 χ Platinum Quantitative PCR SuperMixUDG (cat. # 11730, Invitrogen) e adicionados a 3,3 μΙ_ de cADN para um vo-lume final de 25 μΙ_. cada amostra foi analisada em duplicatas. Programa dePCR: 50°C por 2 minutos, 95°C por 10 minutos seguido por 40 ciclos de95°C, 15 segundos, 60°C, 1 minuto.

Expressão de mRNA de ApoB foi normalizada para mRNA Gap-dh ou beta-actina de camundongo que foi similarmente quantificado usandoQ-PCR.Iniciadores:

mGapdh: 5'-agcctcgtcccgtagacaaaat-3' (SEQ ID NO: 51) and 5'-gttgatggcaacaatctccacttt-3' (SEQ ID NO: 52)mp-actin: 5'-ccttccttcttgggtatggaa-3' (SEQ ID NO: 53) and 5'-gctcaggaggagcaatgatct-3' (SEQ ID NO: 54)mApoB: 5'-gcccattgtggacaagttgatc-3' (SEQ ID NO: 55) and 5'-ccaggacttggaggtcttgga-3' (SEQ ID NO: 56)mApoB Taqman probe: 5'-fam-aagccagggcctatctccgcatcc-3' (SEQ IDNO: 57)sonda Taqman mApoB: 5'-fam-.....(SEQ ID NO: 57).

Diluições de 2 vezes de cADN sintetizado de linha de célulashepatócitos de camundongos não-tratados (células Hepal-6) (diluída 5 ve-zes e expressando ApoB e beta-actina ou Gapdh) foram usadas para prepa-ração de curvas padrão para os ensaios. Quantidades relativas de mRNAApoB foram determinadas a partir do calculado ciclo Limite usando o iCycleriQ Real Time Detection System software.

Exemplo 9: Análises in vitro: Análises Western blot de níveis de proteínasApo-B 100

O efeito in vitro de oligos Apo-BIOO sobre níveis de proteínaApo-BIOO em células transfectadas foi determinado por Western blotting.

Células foram colhidas e Iisadas em Tris-HCI 50 mM pH 6,8, gli-cerol 10%, SDS 2,5%, DTT 5 mM e uréia 6 M suplementada com coquetelinibidor de protease (Roche). Concentrações de proteína total foram medi-das usando um kit de ensaio de proteína BCA (Pierce). 50 μg de proteínatotal foram corridos sobre géis Bis-Tris 10-12% em tampão MOPS ou sobregéis Tris Acetato 3-8% e manchados sobre membranas PVDF de acordocom instruções do fabricante (Invitrogen). Após incubação por toda noite emtampão de bloqueio (PBS-T suplementado com pulverizado de leite de baixagordura 5%), as membranas foram incubadas por toda noite com anticorpoprimário detectando ApoB-100. Como controle de carga, tubulina ou actinaforam detectadas usando anticorpos monoclonais de Neomarker. Membra-nas foram então incubadas com anticorpos secundários e ApoB-100 foi vi-sualizada usando um kit de imuno-detecção cromogênica (Invitrogen) ou umkit de detecção ECL+ de quimioluminescência (Amersham).

Exemplo 10: Análises in vitro: Inibição anti-sentido de expressão de Apo-B100 humana usando oligonucleotídeos anti-sentido

De acordo com a presente invenção, uma série de oligonucleotí-deos foram desenhados para alvejar diferentes regiões do RNA Apo-BIOOhumano. Ver Tabela 1 compostos oligonucleotíceos foram avaliados paraseu potencial para mRNA Apo-BIOO nocaute em hepatócitos de camundon-go (células Hepal-6) seguindo tomada assistida por lipídeo de SEQ ID NO:29, siRNA (não-modificado) ou siRNA modificado com colesterila (Figura 1A)e comparação de nocaute de ApoB-100 em BNLCL2 pelos dois oligonucleo-tídeos LNA SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 30 (Figura 1B) e em células He-pa1-6 por SEQ ID NO: 29 e SEQ ID NO: 37 (Figura 4).

Os dados são apresentados como porcentagem de regulaçãodescendente em relação a células transfectadas falsas. Estado estável detranscrito foi monitorado por PCR de tempo real e normalizado com o estadoestável transcrito GAPDH.

Exemplo 11: Regulação descendente de alvo in vivo de compostos oliqonu-cleotídeos contendo LNA

Camundongos C57BL76 (20 g) receberam 6,25, 12,5, 25 ou 50mg/kg i.v. em três dias consecutivos (tamanho de grupo de 7 camundongos).Nós dosamos com menos oligonucleotídeo anti-sentido uma vez que o pesomolecular de um siRNA-Chol comparado a um oligonucleotídeo anti-sentidoé aproximadamente 3:1. Todos oligonucleotídeos anti-sentido e siRNA foramdissolvidos em solução salina 0,9% (NaCI) e dados em 10 mL/kg de peso decorpo (-0,2 mL por injeção). No sacrifício o peso do fígado foi anotado. Te-cidos para medição de expressão de mRNA de ApoB foram estocados emRNA posterior (Ambion) a -20°C até uso. Análises de mRNA sobre jejuno efígado e colesterol total em plasma foram realizadas 24 horas após injeçãoi.v. (ver Figuras 2A e 2B).

Exemplo 12: Níveis de colesterol em plasma

Nível total de colesterol foi medido em plasma usando um ensaiocolorimétrico Choleterol CP de ABX Pentra. O colesterol é medido seguindohidrólise enzimática e oxidação. 21,5 μL de água foram adicionados a 1,5 μlde plasma. 250 μl. de reagente são adicionados e dentro de 5 minutos o teorde colesterol é medido em um comprimento de onde de 540 nM. Mediçõesem cada animal são feitas em duplicata. A sensitividade e linearidade foramtestadas com composto controle diluído 2 vezes (ABX Pentra N control). Onível relativo de colesterol foi determinado através de subtração do fundo eapresentado em relação aos níveis de colesterol em plasma de camundon-gos tratados com solução salina (ver Figura 3).

Exemplo 13: Regulação descendente de alvo in vivo de compostos oligonu-cleotídeos LNA

Camundongos C57BU6 (20 g) receberam 6,25, 12, ou 25 mg/kgi.v. em tr~es dias consecutivos (tamanho de grupo de 7 camundongos). Osoligonucleotídeos anti-sentido (SEQ ID NO: 29 e 37) foram dissolvidos emsolução salina 0,9% (NaCI) e dados em 10 mLVkg de peso de corpo (-0,2 mLpor injeção). Tecidos para medição de expressão de mRNA ApoB foi esto-cado em RNA postrior (Ambion) a -20°C até uso. Análises de mRNA em je-juno e fígado, colesterol total e LDL em plasma foram realizadas 24 horasapós última injeção i.v. (ver Figuras 5A, 5B, 6A e 6B).

Exemplo 14: Administração roal de compostos oliaonucleotídeo LNA a ca-mundonqos

Camundongos C57BL/6 920 g) receberam 10 ml_/kg, isto é, 0,2mL, de uma formulação preparada recentemente de 1, 0 mL de oligonucleo-tídeo (SEQ ID NOS: 29 ou 37) em H2O estéril (7,5 mg/mL), 0,1 mL de Tween80, 1,9 mL de óleo de oliva. A concentração final de composto oligonucleotí-deo: 2,5 mg/mL. A formulação foi agitada por 1 minuto; sonificada com ultra-som por 5 minutos (repetido 3 vezes). Nenhum efeito negativo foi observado.Exemplo 15: Análises in vitro: Resposta a dose em cultura de células (hepa-tócito humano Huh-7)/lnibição Anti-sentido de expressão de Apo-BIOO Hu-mana

De acordo com a presente invenção, uma série de oligonucleotí-deos foi desenhada para alvejar diferentes regiões do mRNA Apo-BIOO hu-mano. Ver Tabela 1 Compostos oligonucleotídeos foram avaliados por seupotencial para nocaute de mRNA Apo-BIOO em hepatócitos humanos (célu-las Huh-7) seguindo tomada auxiliada por lipídeo de SEQ ID NOS: 31-32,36-38, e 40-42 (Figura 8). O experimento foi realizado como descrito em e-xemplos 5-8. Os resultados mostraram regulação descendente muito potente(>80%) com 25 nM para todos os compostos. Entretanto, em 1 nM somente2 compostos resultaram em uma regulação descendente de mRNA ApoB-100 tão alta quanto 70% (SEQ ID NO: 37 e 40, a qual é uma regulação des-cendente muito potente (Figura 8).

Exemplo 16: ICgn para 7 oligonucleotídeos anti-sentido LNA selecionadosem cultura de células (hepatócitos humanos Huh-7)

Os 7 oligonucleotídeos anti-sentido com a melhor regulaçãodescendente in vitro foram selecionados para um estudo de IC50 para deter-minar a concentração do oligonucleotídeo anti-sentido para render uma inibi-ção 50% de expressão de mRNA ApoB-100. O experimento foi feito comodescrito em exemplos 5-8. Somente SEQ ID NO: 36 e 37 tiveram uma IC50de cerca de 1 nM, enquanto SEQ ID NO: 38 teve IC 50 tão alta quanto 5,7(figura 9). Uma IC50 de 0,5 nM indica um composto muito potente, que paraSEQ ID NO; 37 foi confirmado por dados in vivo (exemplos 17 e 18).

Exemplo 17: Duração de ação de dosagem de SEQ ID NO: 37 uma vez, du-as vezes ou três vezes

Camundongos C57BL/6 (20 g) receberam 6,25 ou 25 mg/kg/ do-se i.p. em um, dois ou três dias consecutivos (tamanho de grupo de 5 ca-mundongos). Todos os oligonucleotídeos anti-sentido foram dissolvidos emsolução salina 0,9% (NaCI) e administrados em 10 mL/kg de peso de corpo(-0,2 mL por injeção). No sacrifício (dias 3, 5, 8, 13 e 21) o peso do fígadofoi anotado. Tecidos para medição de expressão de mRNA ApoB foi estoca-do em RNA posterior (Ambion) a -20°C até uso. Análises de mRNA no fíga-do foram realizadas no sacrifício enquanto colesterol LDL e total em plasmaforam realizadas 24 h, e ou 3 e, 6, 11, e 19 dias após última injeção i.p. (verFigura 11). Este estudo mostrou uma regulação descendente muito potentede mRNA ApoB-100 seguindo dosagem com SEQ ID NO: 37. Uma dose re-sultou em expressão de mRNA ApoB de 45-60% a partir de dia 3 para dia 8após dosagem, enquanto 3 doses resultaram em 85-90% de regulação des-cendente no dia 13 e cerca de 70% no dia 21, mostrando uma duração deação mais longa que 20 dias no fígado quando 2 ou 3 doses foram adminis-tradas. Expressão de mRNA ApoB-100 e colesterol total foram medidas co-mo descrito em exemplos 8 e 12.

Exemplo 18: Regimes de doses de SEQ ID NO 37

Camundongos C57BL/6 (20 g) receberam 2 mg/kg/dose i.p. du-as vezes por semana por 4 semanas ou 5 mg/kg/dose uma vez por semanapor 4 semanas (tamanho de grupo de 5 camundongos) para examinar o efei-to sobre regulação descendente de mRNA ApoB-100 alvo e sobre nível decolesterol em plasma (coletado uma vez por semana). O oligonucleotídeoanti-sentido foi dissolvido em solução salina 0,9% (NaCI) e administrado em10 mL/kg de peso de corpo (-0,2 mL por injeção). No sacrifício (dia 28) opeso do fígado foi anotado. Tecidos para medição de expressão de mRNAApoB foram estocados em RNA posterior (Ambion) a -20°C até uso. Análisesde mRNA no fígado foram realizadas no sacrifício enquanto nível de coleste-rol LDL em plasma foi determinado dias 7, 14, 21 e 28 (ver Figura 10). Osresultados mostraram uma diminuição linear em nível de colesterol LDL so-bre o tempo resultando em uma redução de 30% no dia 28 comparado aodia 7 e o grupo de solução salina após dosagem de 2,5 mg/kg/dose duasvezes por semanas. Resultados similares foram obtidos dosando a mesmaquantidade total de oligonucleotídeo anti-sentido, mas dosando 5 mg/kg/ do-se somente uma vez por semana. Além disso, o nível de mRNA ApoB-100no fígado no sacrifício (dia 28) mostrou uma regulação descendente de 30-40% após dosagem 20 mg/kg sobre 28 dias independente do regime de do-se (uma ou duas doses semanalmente). Estes resultados mostram que umasignificante regulação descendente de mRNA ApoB-100 mesmo em baixasdoses de SEQ ID NO: 37, e que esta regulação descendente tem um impac-to sobre a leitura terapêutica medida como uma redução de 30% em coleste-rol LDL em plasma. Expressão de mRNA ApoB-100 e níveis de colesterolem plasma foram medidos como descrito em exemplos 8 e 12.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA<110> Santaris A/s

<120> COMPOSTOS ANTAGONISTAS DE RNA PARA A INIBIÇÃO DE EX-PRESSÃO DE APO-B100

<130> 16513PCTOO<160> 68

<170> Patentln version 3.3<210> 1<211> 16<212> DNA

<213> artificial<220>

<223> Controle oligonucleotideo LNA scambled<400> 1

cgtcagtatg cgaatc 16

<210> 2<211> 16<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido<400> 2

ggtattcagt gtgatg 16

<210> 3<211> 16<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido<400> 3

attggtattc agtgtg 16

<210> 4<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 4

ttgttctgaa tgtcca 16

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 5

tcttgttctg aatgtc 16

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 6

tggtattcag tgtgat 16

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 7

ttggtattca gtgtga 16

<210> 8<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 8

cattggtatt cagtgt 16

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 9

gcattggtat tcagtg 16

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 10

agcattggta ttcagt 16

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 11

cagcattggt attcag 16

<210> 12<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 12

tcagcattgg tattca 16

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 13

ttcagcattg gtattc 16

<210> 14

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 14

gttcagcatt ggtatt 16

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 15

agttcagcat tggtat 16

<210> 16<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 16

aagttcagca ttggta 16

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 17

aaagttcagc attggt 16

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 18

atttccatta agttct 16

<210> 19

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 19

ggtatttcca ttaagt 16

<210> 20<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 20

gactcaatgg aaaagt 16

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 21

atgactcaat ggaaaa 16

<210> 22

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 22

gctaacacta agaacc 16

<210> 23

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 23

cactaagaac cagaag 16

<210> 24<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<22Β> Motivo anti-sentido

<400> 24

ctaagaacca gaagat 16

<210> 25

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 25

tgaatcgggt cgcatc 16

<210> 26

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo anti-sentido

<400> 26

tgaatcgggt cgcatt 16

<210> 27

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial<220>

<223> siRNA

<400> 27

gucaucacac ugaauaccaa u 21

<210> 28<211> 23

<212> RNA

<213> Artificial<220>

<223> siRNA

<400> 28

auugguauuc agugugauga cac 23

<210> 29

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo N0 2<220>

<221> Oligonucleotideo modificado LNA

<222> Cl)..(3)<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> (1)..(15)

<220>

<221> Oligonucleotideo modificado LNA

<222> '(13)..(15)

<400> 29

ggtattcagt gtgatg 16

<210> 30

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo N0 3<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA<222> (1)..(3)<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> (1)..(15) <220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (13)..(15)

<400> 30

attggtattc agtgtg 16

<210> 31

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo N0 3<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (1)..(4)<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> (1)..(15)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (13)..(15)

<400> 31

attggtattc agtgtg 16

<210> 32

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo N0 4<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (1)..(4)

<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> (1)..(15)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (13)..(15)<220>

<221> citosina LNA modificada com 5-metila

<222> (14)..(15)

<400> 32

ttgttctgaa tgtcca 16

<210> 33

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo N0 5<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> (1)..(15)

<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (1)..(4)<220>

<221> Citosina LNA modificada com 5-metila

<222> (2)..(2)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (13)..(15)<400> 33tcttgttctg aatgtc<210> 34

16

<211><212><213><220><223><220><221><222><220><221><222><220><221><222><220><221><222><400>

16DNA

ArtificialMotivo N0 8

Citosina LNA modificada com 5-metila(1)■■Cl)

Nucleotideo modificado LNA(1)··(4)

Ligação fosforotioato(1)..(15)

Nucleotideo modificado LNA(13)..(15)34

cattggtatt cagtgt<210> 35

16

<211><212><213><220><223><220><221><222><220>

16DNA

ArtificialMotivo N0 9

Nucleotideo modificado LNA(1)··(4)<221> Ligação fosforotioato

<222> (1)..(15)<220>

<221> Citosina LNA modificada com 5-metila

<222> (2)..(2)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (13)..(15)

<400> 35

gcattggtat tcagtg 16

<210> 36

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo N0 10<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> (1)..(15)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (1) (4)<220>

<221> Citosina LNA modificada com 5-metila

<222> (3)..(3)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (13)..(15)

<220>

<221> Citosina LNA modificada com 5-metila

<222> (13)..(13)

<400> 36agcattggta ttcagt 16

<210> 37

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo N0 11<220>

<221> Citosina LNA modificada com 5-metila

<222> (1)..(1)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> Cl)··C3)

<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> CD..C15)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> C13)..C15)<220>

<221> Citosina LNA modificada com 5-metila

<222> C14)..C14)

<400> 37

cagcattggt attcag 16

<210> 38

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo N0 11<220>

<221> Citosina LNA modificada com 5-metila<222> Cl)..Cl)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> CDC4)

<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> CD-.C15)

<220>

<221> Citosina LNA modificada com 5-metila

<222> C4)..C4)

<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (13)..-(15)

<220>

<221> citosina LNA modificada com 5-metila

<222> C14)..C14)

<400> 38

cagcattggt attcag 16

<210> 39

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo N0 19

<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> Cl).·C4)

<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> CD..C15)

<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA<222> (13)..(15)<220> <221> Citosina LNA modificada com 5-metila<222> (15)..(15)<400> 39atttccatta agttct<210> 40<211> 16<212> DNA<213> Artificial<220><223> Motivo No 19<220><221> Nucleotideo modificado LNA<222> (1)··(4)<220><221> Ligação fosforotioato<222> (1)..(15)<220><221> Nucleotideo modificado LNA<222> (13)..(15)<400> 40ggtatttcca ttaagt<210> 41<211> 16<212> DNA<213> Artificial<220> <223> Motivo N0 20<220><221> Nucleotideo modificado LNA<222> (1)··(4)<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> (1)..(15)

<220>

<221> Citosina LNA modificada com 5-metila

<222> (3)..(3)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (13)..(15)

<400> 41

gactcaatgg aaaagt 16

<210> 42

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo N0 21<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (1)..(4)<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> (1)..(15)

<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (13)..(15)

<400> 42

atgactcaat ggaaaa 16

<210> 43

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220><22 Β><220><221><222><220><221><222><220><221><222><220><221><222><220><221><222><400>

Motivo N0 22

Nucleotideo modificado LNACl)(4)

Citosina LNA modificada com 5-metila(2) .. (2)

Nucleotideo modificado LNA(13)..(15)

Ligação fosforotioato(1)..(15)

Citosina LNA modificada com 5-metila(15)..(15)43

gctaacacta agaacc

16

<210> 44 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> <220> Motivo N0 23 <221> Citosina LNA modificada com <222> (1)·(1) <220> <221> Nucleotideo modificado lna <222> (1)··(4) <220><221> Ligação fosforotioato

<222> (1)..(15)

<220>

<221> Citosina LNA modificada com 5-metila

<222> (3)..(3)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (13)..(15)

<400> 44

cactaagaac cagaag 16

<210> 45

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo N0 24<220>

<221> Citosina LNA modificada com 5-metila

<222> (1)..(1)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (1)..(4)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (13)..(15)<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> (1)..(15)

<400> 45

ctaagaacca gaagat 16

<210> 46

<211> 16<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo N0 25<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (1)..(4)

<220>

<221> Citosina LNA modificada com 5-metila

<222> (13)..(13)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (13)..(15)

<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> (1)..(15)

<400> 46

tgaatcgggt cgcatc 16

<210> 47

<211> 16

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo N0 26<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (1)··(4)

<220>

<221> Ligação fosforotioato

<222> (1)..(15)<220>

<221> Citosina LNA modificada com 5-metila<222> (13)..(13)<220>

<221> Nucleotideo modificado LNA

<222> (13)..(15)

<400> 47

tgaatcgggt cgcatt 16

<210> 48

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial<220>

<223> SiRNA não-conjugado

<400> 48

gucaucacac ugaauaccaa u 21

<210> 49

<211> 23

<212> RNA

<213> Artificial<220>

<223> SiRNA não-conjugado

<400> 49

auugguauuc agugugauga cac 23

<210> 50

<211> 21

<212> RNA

<213> Artificial<220>

<223> SiRNA conjugado com colesterol

<400> 50

gucaucacac ugaauaccaa u 21

<210> 51

<211> 23<212> RNA

<213> Artificial

<220>

<223> SiRNA conjugado com colesterol

<400> 51

auugguauuc agugugauga cac 23

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo

<400> 52

agcctcgtcc cgtagacaaa at 22

<210> 53

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo

<400> 53

gttgatggca acaatctcca cttt 24

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Iniciador oligonucleotideo

<400> 54

ccttccttct tgggtatgga a 21

<210> 55

<211> 21<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> lniciador oligonucleotideo

<400> 55

gctcaggagg agcaatgatc t 21

<210> 56

<211> 22

<212> DNA

<21Β> Artificial<220>

<223> lniciador oligonucleotideo

<400> 56

gcccattgtg gacaagttga tc 22

<210> 57

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> lniciador oligonucleotideo

<400> 57

ccaggacttg gaggtcttgg a 21

<210> 58

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Sonda mApoB Taqman

<400> 58

aagccagggc ctatctccgc atcc 24

<210> 59

<211> 8<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Motivo alvo

<400> 59gtattcag

<210> 60

<211> 8

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo alvo

<400> 60ggtattca

<210> 61

<211> 8

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo alvo

<400> 61tcagcatt

<210> 62

<211> 8

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo alvo

<400> 62gcattggt

<210> 63

<211> 29<212> DNA

<21Β> Artificial

<220>

<223> Motivo alvo

<400> 63

aaagttcagc attggtattc agtgtgatg 29

<210> 64

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Motivo alvo

<400> 64

ggtatttcca ttaagttct 19

<210> 65

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo alvo

<400> 65

atgactcaat ggaaaagt 18

<210> 66

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Motivo alvo

<400> 66

cactaagaac cagaaccaga agat 24<210> 67

<211> 16<212> DNA

<21Β> Artificial

<220>

<223> Motivo alvo

<400> 67

tgaatcgggt cgcaty 16

<210> 68

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial<220>

<223> Subseqüência/motivo oligo preferido

<400> 68

tcttgttctg aatgtcca 18

Claims

1. Composto oligomérico consistindo em um total de 12-50 nu-cleotídeos e/ou análogos de nucleotídeos, caracterizado pelo fato de que odito composto compreende uma subseqüência de pelo menos 10 nucleotí-deos ou análogos de nucleotídeos, a dita subseqüência correspem quendo auma seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 59, 60,- 61, 62, 63, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17, em que o ditocomposto compreende pelo menos 3 análogos de nucleotídeos.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pe-lo fato de que consiste em um oligonucleotídeo de fita dupla, em que cadafita compreende um total de 16-30 nucleotídeos e/ou análogos de nucleotí-deos, em que o dito composto compreende uma subseqüência de pelo me-nos 10 nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos, a dita subseqüência es-tando localizada dentro de uma seqüência selecionada de SEQ ID NOS: 59,- 60, 61, 62, 63, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17, em que o ditocomposto compreende pelo menos 3 análogos de nucleotídeos.

3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracteriza-do pelo fato de que a dita subseqüência compreende os ditos pelo menostrês análogos de nucleotídeos.

4. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 3, caracterizado pelo fato de que a dita subseqüência compreende um esti-ramento de 2-6 análogos de nucleotídeos, seguido por um estiramento de 4-- 12 nucleotídeos, que é seguido por um estiramento de 2-6 análogos de nu-cleotídeos.

5. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 4, caracterizado pelo fato de que a dita subseqüência compreende 1 ou 2desemparelhamentos quando comparada com a correspondente seqüênciana dita seqüência selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 59,- 60, 61, 62, 63, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 e 17.

6. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 5, caracterizado pelo fato de que consiste em 12-25 nucleotídeos ou aná-logos de nucleotídeos.

7. Composto de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pe-lo fato de que consiste em 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 nucleotídeos ouanálogos de nucleotídeos.

8. Composto de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pe-lo fato de que consiste em 15 ou 16 nucleotídeos ou análogos de nucleotí-deos.

9. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 8, caracterizado pelo fato de que os ditos nucleotídeos compreendem umgrupo de ligação selecionado do grupo consistindo em um grupo fosfato, umgrupo fosforotioato, e um grupo boranofosfato, a ligação internucleosídeopodendo ser -O-P(O)2-O-, -O-P(O1S)-O-.

10. Composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a dita ligação é um grupo fosfato.

11. Composto de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a dita ligação é um grupo fosforotioato.

12. Composto de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que todas as ligações são grupos fosforotioato.

13. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 12, caracterizado pelo fato de que compreende de 3-12 análogos de nu-cleotídeos.

14. Composto de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que compreende 6 ou 7 análogos de nucleotídeos.

15. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos ditos análogos denucleotídeos é um ácido nucléico fechado (LNA), assim como pelo menostrês, ou todos os análogos de nucleotídeos são LNA.

16. Composto de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de que o LNA é selecionado de beta-D-óxi-LNA, alfa-L-óxi-LNA,beta-D-amino-LNA e beta-D-tio-LNA.

17. Composto de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que os ditos nucleosídeos e/ou LNAs são ligados por meio degrupo fosfato ou fosforotioato.

18. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 17, caracterizado pelo fato de que a subseqüência é selecionada do grupoconsistindo em: SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 e SEQ IDNO: 11.

19. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 18, caracterizado pelo fato de que a subseqüência é selecionada do grupoconsistindo em: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, e SEQ IDNO: 12.

20. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 19, caracterizado pelo fato de que apresenta a fórmula-5'-[(LNA)2-6-(DNA/RNA)4-12-(LNA)2-6-(AND-RNA)0-1 ]-3' ou-5'-[(LNA)3-4-(DNA/RNA)8-9-(LNA)3-(AND/RNA)1]-3'em que "LNA" designa um nucleotídeo LNA e "DNA" e "RNA" designam umdesoxirribonucleotídeo e um ribonucleotídeo, respectivamente.

21. Composto, caracterizado pelo fato de que é selecionado dogrupo consistindo em SEQ ID NOS: 29, 30, 31, 34, 35^ 36, 37, ou 38.

22. Composto de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que é SEQ ID NO: 29.

23. Composto de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que é SEQ ID NO: 30.

24. Composto de acordo com a reivindicação 20, caracterizadopelo fato de que é SEQ ID NO: 37.

25. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 24, caracterizado pelo fato de que consiste em 13 ou 14 nucleotídeos ouanálogos de nucleotídeos.

26. Conjugado, caracterizado pelo fato de que compreende ocomposto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, e pelomenos uma porção não-nucleotídeo ou não-polinucleotídeo ligada covalen-temente ao dito composto.

27. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de quecompreende um composto como definido em qualquer uma das reivindica-ções 1 a 25 ou um conjugado como definido na reivindicação 26, e um dilu-ente, veículo ou adjuvante farmaceuticamente aceitável.

28. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 27,caracterizada pelo fato de que é adaptada para administração oral.

29. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 27ou 28, caracterizada pelo fato de que ainda compreende pelo menos umcomposto de diminuição de colesterol.

30. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 29,caracterizada pelo fato de que o dito composto é selecionado do grupo con-sistindo em resinas seqüestrantes de sal de bile (por exemplo, colestiramina,colestipol, e cloridrato de colesevelam), inibidores de HMGCoA redutase (porexemplo, lovastatina, cerivastatina, prevastatina, atorvastatina, simvastatina,e fluvastatina), ácido nicotínico, derivados de ácido fíbrico (por exemplo, clo-fibrato, gemfibrozil, fenofibrato, bezafibrato e ciprofibrato), probucol, neomi-cina, dextrotiroxina, ésteres de estanol de planta, inibidores de absorção decolesterol (por exemplo, ezetimibe), implitapide, inibidores de transportado-res de ácido de bile (transportadores de ácido de bile dependentes de sódioapical), reguladores de CYP7a hepática, terapêuticas de substituição de es-trogênio (por exemplo, tamoxifeno), e antiinflamatórios (por exemplo, gluco-corticóides).

31. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 25 ou um conjugado como definido na reivindicação 26, caracterizado pelofato de que é para uso como um medicamento.

32. Uso de um composto como definido em qualquer uma dasreivindicações 1 a 25 ou um conjugado como definido na reivindicação 26,caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento parao tratamento de níveis anormais de Apo-Bl00.

33. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de que os ditos níveis anormais de Apo-BIOO estão correlacionados àpresença de uma condição médica selecionada do grupo consistindo em:aterosclerose, hipercolesterolemia ou hiperlipidemia.

34. Método de tratamento de um sujeito sofrendo de uma doen-ça ou condição selecionada de aterosclerose, hipercolesterolemia, e hiperli-pidemia, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administra-ção de um conjugado como definido na reivindicação 26 ou uma composiçãofarmacêutica como definida em qualquer uma das reivindicações 27 a 30, aosujeito em sua necessidade.

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pe-lo fato de que o conjugado ou a composição farmacêutica é administradaoralmente.

36. Método para regulação descendente de apolipoproteína B1caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de administração de umconjugado como definido na reivindicação 26 ou uma composição farmacêu-tica como definida em qualquer uma das reivindicações 27 a 30, a um sujei-to, tal como o sujeito definido na reivindicação 34.