BRPI0616323A2 - mÉtodo para determinar se um fluido mamÁrio doado foi obtido a partir de um indivÍduo especÍfico - Google Patents
mÉtodo para determinar se um fluido mamÁrio doado foi obtido a partir de um indivÍduo especÍfico Download PDFInfo
- Publication number
- BRPI0616323A2 BRPI0616323A2 BRPI0616323-8A BRPI0616323A BRPI0616323A2 BR PI0616323 A2 BRPI0616323 A2 BR PI0616323A2 BR PI0616323 A BRPI0616323 A BR PI0616323A BR PI0616323 A2 BRPI0616323 A2 BR PI0616323A2
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- fluid
- sample
- nucleic acid
- breast
- hla
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 113
- 239000012530 fluid Substances 0.000 title claims abstract description 57
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims abstract description 21
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims abstract description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 67
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 61
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 61
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 46
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 40
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 39
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 35
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 claims description 24
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 18
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 15
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 claims description 3
- 238000005553 drilling Methods 0.000 claims description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000007790 scraping Methods 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 54
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 53
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 49
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 39
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 39
- 239000000047 product Substances 0.000 description 36
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 29
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 21
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 19
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 13
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 13
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 12
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 8
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 8
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 7
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 7
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 6
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 6
- -1 nucleoside triphosphate Chemical class 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 5
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 5
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 5
- 238000000123 temperature gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 4
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 4
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 4
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 4
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 3
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 102100028971 HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Human genes 0.000 description 3
- 108010058607 HLA-B Antigens Proteins 0.000 description 3
- 108010052199 HLA-C Antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 3
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102100029058 Coagulation factor XIII B chain Human genes 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 2
- 102100028970 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Human genes 0.000 description 2
- 102100028966 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain F Human genes 0.000 description 2
- 102100028967 HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain G Human genes 0.000 description 2
- 108010010378 HLA-DP Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000015789 HLA-DP Antigens Human genes 0.000 description 2
- 108010062347 HLA-DQ Antigens Proteins 0.000 description 2
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 description 2
- 102100031180 Hereditary hemochromatosis protein Human genes 0.000 description 2
- 102000018713 Histocompatibility Antigens Class II Human genes 0.000 description 2
- 101000918350 Homo sapiens Coagulation factor XIII B chain Proteins 0.000 description 2
- 101000986085 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain E Proteins 0.000 description 2
- 101000986080 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain F Proteins 0.000 description 2
- 101000993059 Homo sapiens Hereditary hemochromatosis protein Proteins 0.000 description 2
- 101000866971 Homo sapiens Putative HLA class I histocompatibility antigen, alpha chain H Proteins 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700005089 MHC Class I Genes Proteins 0.000 description 2
- 108091092878 Microsatellite Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 102100023361 SAP domain-containing ribonucleoprotein Human genes 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 101710139423 THO complex subunit 1 Proteins 0.000 description 2
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 2
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000014654 Adna Species 0.000 description 1
- 102000007325 Amelogenin Human genes 0.000 description 1
- 108010007570 Amelogenin Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 101100284398 Bos taurus BoLA-DQB gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010027412 Histocompatibility Antigens Class II Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108700005092 MHC Class II Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108010020713 Tth polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001818 capillary gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000005829 chemical entities Chemical class 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 108091092330 cytoplasmic RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 125000001295 dansyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(N(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H])=C2C([H])=C([H])C([H])=C(C2=C1[H])S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000000368 destabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011331 genomic analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012985 polymerization agent Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 210000002325 somatostatin-secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 210000004243 sweat Anatomy 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Measurement Of The Respiration, Hearing Ability, Form, And Blood Characteristics Of Living Organisms (AREA)
Abstract
MÉTODO PARA DETERMINAR SE UM FLUIDO MAMÁRIO DOADO FOI OBTIDO A PARTIR DE UM INDIVÍDUO ESPECÍFICO. A divulgação está relacionada de maneira geral a um método para testar fluido mamário (incluindo leite) para estabelecer ou confirmar a identidade do doador do fluido mamário. Tias métodos e sistemas são úteis na indústria de banco de leite para aumentar a segurança.
Description
MÉTODO PARA. DETERMINAR SE UM FLUIDO MAMÁRIO DOADO FOIOBTIDO A PARTIR DE UM INDIVÍDUO ESPECÍFICOREFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica prioridade sob U.S.C. 35 §119,dos Pedidos de Patente Provisória de números de série60/719.317, depositado em 20 de setembro de 2005, e60/731.428, depositado em 28 de outubro de 2005, dos quaisas divulgações estão aqlui incorporadas por referência.
CAMPO TÉCNICO
A invenção está relacionada de forma geral a um método
para testar fluido mamário (incluindo leite) paraestabelecer ou confirmar a identidade do doador do fluidomamário.
FUNDAMENTOS
Diferentemente de doadores de sangue que fazem suadoação sob a supervisão direta da equipe do banco desangue, doadores de leite materno humano tendem a bombearseu leite para doação em casa ou outros locais convenientesaos mesmos e então armazenam o leite materno em seus
congeladores até que possam acumular o bastante para trazer
ao centro de doação. Assim, na ausência de supervisãodireta das doações, podem surgir dúvidas quanto àprocedência do leite materno doado.
A fim de estabelecer que o leite materno fornecido
pelo doador é, de fato, exclusivamente daquela doadorahumana, deve ocorrer alguma forma de teste para estabelecera identidade do doador.
Muitos métodos diferentes de tipagem de DNA sãoconhecidos para identificar ou tipar entre espécimes e
humanos. Tais métodos incluem análise de DNA humano porrepetições curtas em seqüência (STR), repetições demicrossatélites ou repetições de seqüência simples (SSR),análise de múltiplos genes humanos e análise de genes deantígeno de linfócito humano (HLA) e Ioci por análise dereação em cadeia de polimerase (PCR), análise depolimorfismo no comprimento de restrição e outros métodos.
É conhecido que humanos possuem antígenos que sãoespecíficos àquele indivíduo. Por exemplo, os antígenos deleucócitos humanos (HLA) foram utilizados no passado paratipar tecido para transplante.
SUMÁRIO
A invenção fornece métodos e sistemas paradiagnosticar ou selecionar fluido mamário de qualquernúmero de organismos mamíferos. Em um aspecto, a invençãofornece métodos e sistemas para diagnosticar ou selecionaramostras de leite humano para confirmar que o leite é deuma determinada fonte.
Em um aspecto a invenção está relacionada a um métodopara determinar se leite materno foi obtido a partir de umhumano específico compreendendo testar uma amostra d leitematerno para obter um perfil de marcador de identidade etestar uma amostra biológica do humano para obter um perfilde marcador de identidade de referência e comparar osperfis de marcador de identidade.
A invenção fornece um método para determinar se oleite materno foi obtido de uma fonte desejada ou humanoespecífico compreendendo tipagem de ácido nucléico de umaamostra do leite materno para se obter um perfil de tipo deDNA e tipagem de ácido nucléico de uma amostra biológica dohumano para obter um perfil de tipo de DNA de referência ecomparar os perfis de tipo de DNA.
Em uma modalidade, o método de tipagem de ácidonucléico da amostra biológica do humano é selecionado entreanálise STRi análise HLA ou análise de genes múltiplos. Éainda observado que o método de tipagem de ácido nucléicoutilizado para a amostra de leite materno é o mesmo queaquele utilizado para a amostra biológica. É observado queos loci/alelos utilizados para o perfil de tipo de DNAserão os mesmos tanto para o perfil de tipo de DNA dereferência e o perfil de tipo de DNA da amostra de leitematerno.
Em uma modalidade o leite materno será congelado. Éainda observado que o método para obtenção da amostra deleite materno a partir do leite materno congelado será porperfuração de um núcleo através do leite materno congelado.Alternativamente, é observado que a amostra de leitematerno pode ser obtida raspando-se a superfície do leitematerno congelado.
Em outra modalidade o leite materno estará líquido. Éobservado que o método para obtenção da amostra de leitematerno será por isolamento da amostra de leite materno porpipetagem ou outro meio.
Em outra modalidade as amostra de leite materno podemser combinadas ou misturadas antes da tipagem de ácidonucléico.
A invenção também fornece um método para determinar seleite materno foi obtido de uma fonte definida (porexemplo, um humano específico) compreendendo testar umaamostra de leite materno para se obter um perfil de auto-antígeno e testar uma amostra biológica do humano para seobter um perfil de auto-antígeno de referência e compararos perfis de auto-antígeno.
A invenção também fornece um artigo de fabricação ouconjunto compreendendo um recipiente, um marcador norecipiente e um reagente para detectar ou medir osmarcadores de identidade, onde o marcador no recipienteindica que o reagente pode ser utilizado para determinar operfil do marcador de identidade de leite materno. Em umamodalidade, o reagente compreende materiais de PCR (umconjunto de iniciadores, DNA polimerase e 4 nucleosídeotrifosfato) que hibridizam com o gene ou Ioci do mesmo. Oconjunto pode ainda compreender componentes adicionais,como reagentes, para detectar ou medir a entidadedetectável ou fornecer um controle. Outros reagentesutilizados para hibridização, pré-hibridização, extração deDNA, visualização e similares podem estar também iijcluídos,se desejado. Em outra modalidade, o reagente é um ^nticorpo
para detectar auto-antígenos.
Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção sãoexpostos na descrição abaixo. Outras características evantagens da invenção serão aparentes a partir da descrição
e das reivindicações.
DESCRIÇÃO DETALAHADA
A menos que de outra forma definido, os termostécnicos e científicos usados aqui possuem os mesmossignificados conforme comumente compreendido por qualquerum habilitado na técnica à qual esta invenção pertença.Todas as referências citadas aqui estão incorporados por
referência em sua totalidade.
Aquele habilitado na técnica reconhecerá muitosmétodos e materiais similares ou equivalentes àquelesdescritos aqui que poderiam ser utilizados na prática destainvenção. De fato a invenção não está de qualquer formalimitada aos métodos e materiais aqui descritos. Para ospropósitos da invenção os seguintes termos são definidos.
Fluido mamário inclui leite materno e/ou colostroretirado de indivíduos do sexo feminino lactantes. Fluidomamário integral, líquido selecionado ou frações sólidas dofluido mamário, células integrais ou constituintescelulares, proteínas, glicoproteínas, peptídeos,nucleotídeos (incluindo polinucleotídeos de DNA e RNA) eoutros constituintes bioquímicos e moleculares semelhantesdo fluido mamário podem ser utilizados nos métodos dainvenção. O fluido mamário pode ser obtido a parti dequalquer número de espécies de indivíduos femininos, masnão limitado a humanos, bovinos, caprinos e similares.
O marcador de identidade inclui um marcador que podeser utilizado para identificar um único indivíduo de outrosindivíduos em uma população. Tais marcadores estãopresentes nas células encontradas em fluido mamário. Taismarcadores poderiam incluir, mas não estão limitados agenes, alelos, Ioci, polipeptídios ou peptídeos antígenos.
Um perfil de marcador de identidade compreende umperfil de um número de marcadores de identidade cujosperfis identificam o humano ou indivíduo único de outroshumanos com um grau suficiente de certeza. É observado queo perfil de marcador de identidade identifica pelo menos umhumano entre 100.000 humanos, ou um humano entre 1 milhãode humanos ou um humano entre 5 milhões de humanos.
Tipagem de ácido nucléico refere-se a um método paradeterminar o perfil de tipo DNA de uma amostra biológica oude leite. Tais métodos incluem, mas não estão limitados aanálise STR, análise HLA ou análise de genes múltiplos degenes/alelos/loci presentes em uma amostra depolinucleotideos da amostra biológica ou de leite.
Perfil de tipo de DNA refere-se a um perfil de um DNAgenômico de um humano ou de um indivíduo que é suficientepara distinguir o humano ou indivíduo único de outroshumanos com um grau suficiente de certeza. É observado queo perfil de DNA identifica pelo menos um humano entre10 0.000 humanos, ou um humano entre 1 milhão de humanos ouum humano entre 5 milhões de humanos. Geralmente estemétodo envolve identificar alelos de pelo menos 5loci/genes ou pelo menos 10 Ioci/genes ou pelo menos 13loci/genes.
Um alelo compreende uma das diferentes seqüências deácido nucléico de um gene em um locus particular em umcromossomo. Uma ou mais diferenças genéticas podemconstituir um alelo. Exemplos de seqüências de alelo HLAsão expostas em Mason e Parham (1998), "Tissue Antigens",51: 417-66, que relaciona os alelos HLA-A, HLA-B e HLA-C eMarsh e outros, (1992), "Hum. Immunol." 35:1, que relacionaalelos Classe II para DRA, DRB, DQAl, DQBl, DPAl e DPBl.
Um locus compreende uma localização distinta em umcromossomo. Os Ioci podem ser parte de um gene ou parte deuma seqüência de repetição. Loci de antígenos de leucócitohumano exemplares (HLAs) são 'os genes MHC classe Idenominados HLA-A, HLA-B e HLA-C; genes classe I não-clássicos incluindo HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J eHLA-X, MIC; e genes classe II como HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR.Loci STR exemplares são: CSFlPO, D3S1358, D5S818, D7S820,D8S1179, D13S317, D16S539, DI8S51, D21S11, DYSl9, F13A1,FES/FPS, FGA, HPRTB, THOl, TPOX, DYS388, DYS391, DYS392,DYS393, D2S13 91, D18S535, D2S.1338, D19S433, D6S477,D1S518, D14S3 06, D22S684, F13B, CD4, D12S391, D10S220 eD7S523 (ver, por exemplo, Patente U.S. de número 6.090.558).
Um método de análise de HLA ou análise de antígeno deleucócito humano é um método que permite a determinação oudesignação de um ou mais polimorfismos genéticos deantígenos de leucócito humano (HLA) distintos geneticamentepor qualquer número de métodos conhecidos na técnica.Alguns métodos ponderados são aqui descritos.
Um método de análise de STR é um método que permite adeterminação ou designação de um ou mais polimorf ismosgenéticos de STR geneticamente distintos por qualquernúmero de métodos conhecidos na técnica. Alguns métodosponderados estão aqui descritos.
Um método de análise de genes múltiplos é um métodoque permite a determinação ou designação de um ou maispolimorfismos genéticos de genes humanos distintosgeneticamente por qualquer número de métodos conhecidos natécnica. Tais genes podem ou não incluir os genes HLA.Alguns métodos ponderados estão aqui descritos.
Diversas técnicas de amplificação são conhecidas natécnica. Amplificação refere-se a uma reação onde um ácidonucléico modelo, ou porções deste, é duplicado pelo menosuma vez. Tais técnicas de amplificação incluem amplificaçãoaritmética, logaritmica ou exponencial. A amplificação deum ácido nucléico pode ocorrer utilizando-se qualquersistema de amplificação de ácido nucléico, tanto isotérmicoquanto de gradiente térmico incluindo, mas não limitado areação em cadeia de polimerase (PCR), reação em cadeia depolimerase de transcrição reversa (RT-PCR) , reação emcadeia de ligase (LCR), reação em seqüência auto-sustentada(3SR), e amplificações mediadas por transcrição (TMA).Misturas de amplificação de ácido nucléico típicas (porexemplo, mistura de reação de PCR) incluem um modelo deácido nucléico que deve ser amplificado, uma polimerase deácido nucléico, seqüência(s) de iniciador de ácidonucléico, trifosfato de nucleotídeo e um tampão contendotodas as espécies de íons exigidas para a reação deamplificação.
Produtos de amplificação obtidos a partir de umareação de amplificação tipicamente compreendem um DNA ouRNA de filamento simples ou de filamento duplo ou quaisqueroutros produtos de ácido nucléico de reações deamplificação isotérmica ou de gradiente térmico que incluamPCR, LCR e similares.
Um ácido nucléico modelo refere-se a um polímero deácido nucléico que se procura copiar ou amplificar. 0(s)ácido(s) nucléico(s) modelo pode(m) ser isolado(s) oupurificado(s) a partir de uma célula, tecido e similares. 0ácido nucléico modelo pode compreender DNA, cDNA, RNAgenômicos ou similares.
Iniciadores são utilizados em algumas técnicas deamplificação. Um iniciador compreende um oligonucleotídeoutilizado em uma reação de amplificação (por exemplo, PCR)para amplificar um ácido nucléico alvo. O iniciador étipicamente de filamento simples. O iniciador pode ser decerca de 5 a 3 0 ácidos nucléicos de comprimento, maiscomumente de cerca de 10 a 25 ácidos nucléicos decomprimento.
Um iniciador de locus específico de STR é umoligonucleotídeo que hibridiza em uma variante de ácidonucléico alvo que define, total ou parcialmente, aquele
locus de STR particular.
Um iniciador de alelo específico de HLA é umoligonucleotídeo que hibridiza em uma variante de ácidonucléico alvo que define, total ou parcialmente, aquele
alelo de HLA particular.
Um iniciador de locus específico de HLA é umoligonucleotídeo que permite a amplificação de um locus deHLA ou que pode hibridizar especificamente em um locus de
HLA.
Um iniciador de alelo específico é um oligonucleotídeoque hibridiza em uma variante de ácido nucléico alvo quedefine, total ou parcialmente," aquele alelo de geneparticular.
Um iniciador de locus específico é um oligonucleotídeoque permite a amplificação de um locus de um gene ou quepode hibridizar especificamente em um locus de um gene.
Um iniciador e um iniciador reverso constituem um parde iniciadores que podem se ligar a um ácido nucléicomodelo e, sob condições de amplificação apropriadas,produzir um produto de amplificação. Se o iniciador está seligando ao filamento no sentido então o iniciador reversoestá se ligando ao filamento anti-sentido.
Alternativamente, se o iniciador está se ligando aofilamento anti-sentido então o iniciador reverso está seligando ao filamento no sentido. Em essência, o iniciadorou iniciador reverso pode se ligar a ambos os filamentos,desde que o outro iniciador ou iniciador reverso se ligueao filamento oposto.
Qualquer número de marcadores identificáveis pode serutilizado para detectar um ácido - nucléico alvo pelo uso deamplificação ou outra técnica. Um marcador detectávelrefere-se a uma metade que está fixada através de técnicascovalentes ou não covalentes a um oligonucleotideo ou outroagente de detecção. Exemplos de marcadores detectáveisincluem uma metade radioativa, uma metade fluorescente, umametade quimioluminescente, uma metade cromogênica esimilares. Metades fluorescentes compreende entidadesquímicas que aceitam energia radiante de um comprimento deonda e emitem energia radiante em um segundo comprimento deonda.
Várias técnicas de hibridização podem ser utilizadasnos métodos aqui descritos. Hibridizar ou hibridizaçãorefere-se à ligação ou duplexação de uma molécula a umpolinucleotídeo substancialmente complementar ou fragmentodeste através de ligação por meio de emparelhamento debase. A hibridização tipicamente envolve a formação deligações de hidrogênio entre nucleotídeos em um ácidonucléico e um segundo ácido nucléico complementar. Métodosde hibridização podem incluir condições altamenteestringentes, moderadamente estringentes ou de baixaestringência.
O termo "condições de estringência" refere-se acondições sob as quais um oligonucleotideo de captura,oligonucleotideo ou produto de amplificação hibridizará aseu ácido nucléico alvo. Os termos "condições dehibridização estringente" ou "condições altamenteestringentes" são dependentes de seqüência e serãodiferentes com parâmetros ambientais diferentes (porexemplo, concentrações de sal e presença de orgânicos).
Geralmente, as condições estringentes são selecionadas paraestarem cerca de 5°C a 20°C abaixo do ponto de fusãotérmica (Tm) para um ácido nucléico especifico a uma forçaiônica e pH definidos. Condições estringentes estão cercade 5°C a 10°C abaixo do ponto de fusão térmica para umácido nucléico específico ligado a um ácido nucléicocomplementar. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pHdefinidos) na qual 50% de um ácido nucléico hibridiza a ummarcador compatível. Oligonucleotídeos mais longoshibridizam a temperaturas mais altas. Tipicamente,condições estringentes serão aquelas nas quais aconcentração de sal compreende cerca de 0,01 M a 1,0 M deNa (ou outros sais) a um papel higiênico 7,0 a 8,3 e atemperatura está pelo menos cerca de 30°C para marcadorescurtos (por exemplo, 10 a 50 nucleotídeos). As condiçõesestringentes podem também ser alcançadas com a adição deagentes desestabilizantes, tal como formamida. Um guiaextenso da hibridização e lavagem de ácidos nucléicos éencontrado em Tijssen (1993), "Laboratory Techniques inbiochemistry and molelecular biology -hybridization withnucleic acid probes parts I and II", Elsevier, N.Y.; Choo(ed) , (1994) , "Methods Molecular Biology Volume 33 - InSitu Hybridization Protocols", Humana Press Inc., NovaJersey; Sambrook e outros, "Molecular Cloning, A LaboratoryManual", (2a ed. , 1989), "Current Protocols in MolecularBiology", Ausubel e outros, (eds.), (1994).
As condições de hibridização para um marcador,iniciador e alvo em particular são prontamentedetermináveis por aquele de habilidade comum na técnica egeralmente é um cálculo empírico dependente de comprimentode marcador, temperatura de lavagem e concentração de sal.De forma geral, marcadores maiores exigem temperaturas maisaltas para uma recombinação adequada, enquanto marcadoresmenores precisam de temperaturas menores. A hibridizaçãogeralmente depende da capacidade de ácidos nucléicosmonofilamentares se recombinarem a filamentoscomplementares presentes em um ambiente abaixo de suatemperatura de fusão. Quanto maior o grau de homologiadesejado entre um marcador e um alvo hibridizável, maiorserá a temperatura relativa que poderá ser utilizada. Comoum resultado, ocorre que temperaturas relativas mais altastenderão a tornar as condições de reação mais estringentes,enquanto temperaturas mais baixas, o contrário.
As condições de lavagem de hibridização são comumentedeterminadas de forma empírica para a hibridização de cadamarcador ou conjunto de iniciadores com um ácido nucléicoalvo correspondente. 0 ácido nucléico alvo emarcadores/iniciadores são primeiramente hibridizados(tipicamente sob condições de hibridização estringentes) eem seguida lavados com tampões contendo concentraçõessucessivamente menores de sais ou concentrações maiores dedetergentes, ou em temperaturas crescentes até que arelação entre sinal e ruído para hibridização específica enão específica seja alta o bastante para facilitar adetecção de hibridização específica. Condições detemperatura estringentes irão geralmente incluirtemperaturas que excedam cerca de 30°C, mais comumente queexcedam cerca de 370C e, ocasionalmente, que excedam cercade 45°C. Condições de sal estringentes serão, comumente, demenos que cerca de 1.000 mM, geralmente de menos de cercade 500 mM, mais comumente de menos de cerca de 400 mM,tipicamente menos de cerca de 3 00 mM, tipicamente menos decerca de 2 00 mM e mais tipicamente de cerca de menos de 150mM. Entretanto, a combinação de parâmetros é maisimportante que a medida de qualquer parâmetro individual.Ver, por exemplo, Wetmur e outros, "J. Mol Biol", 31:349-70(1966), e Wetmur, "Criticai Reviews Biochemistry andMolecular Biology 26", (34):227-59 (1991).
Em uma modalidade, condições altamente estringentescompreendem hibridização em 50% de formamida, SSC 6X (NaCl0,75 M, citrato de sódio 0,075 Μ), fosfato sódico 50 mM (pH6,8), 0,1% de pirofosfato sódico, solução de Denhardt 5X,DNA de esperma de salmão sonicado (100/pg/tnL) , 0,5% de SDSe 10% de sulfato de dextrano a 42°C, com lavagens a 42°C emSSC 2x (cloreto de sódio/citrato de sódio) e 0,1% de SDS,seguido de uma lavagem de alta estringência compreendendo
SSC 0,2X contendo 0,1% de SDS a 42°C.
Os termos "complemento", "complementaridade" ou"complementar" conforme aqui utilizados, são utilizadospara descrever polinucleotídeos monofilamentares
relacionados pelas regras de emparelhamento de baseantiparalelo. Por exemplo, a seqüência 5'-CTAGT-3' écompletamente complementar à seqüência 5'-ACTAG-3'.Complementaridade pode ser "parcial", onde a baseemparelhando é inferior a 100%, ou complementaridade podeser "completa" ou "total", implicando em complementaçãoantiparalela 100% perfeita entre dois polinucleotídeos. Porconvenção da técnica, moléculas de ácido nucléicomonofilamentares são escritas com suas extremidades 5' paraa esquerda e suas extremidades 3' para a direita.
0 termo "par de bases complementar" refere-se a um parde bases (nucleotideos) cada um em um ácido nucléicoseparado no qual cada base do par está ligada porhidrogênio à outra. Um emparelhamento de base "clássico"(Watson-Crick) contém uma purina e uma pirimidina; aadenina emparelha especificamente com timina (A-T), guaninacom citosina (G-C), uracila com adenina (U-A). As duasbases em um par de bases clássico são referidos como sendocomplementares um ao outro.
Substancialmente complementar entre um marcador ouácido nucléico iniciador e um ácido nucléico alvo admitepequenas discrepâncias que podem ser acomodadas reduzindo-se a estringência do meio de hibridização para se atingir ograu desejado de hibridização e identificação dopolinucleotideo alvo hibridizado.
Um oligonucleotídeo de captura útil para identificaçãode um ácido nucléico alvo refere-se a um ácido nucléico oufragmento que pode hibridizar a um polinucleotideo,oligonucleotídeo, produto de amplificação ou similar epossui a capacidade de ser imobilizado a uma fase sólida.Um oligonucleotídeo de captura tipicamente hibridiza a pelomenos uma porção de um produto de amplificação contendoseqüências complementares sob condições estringentes.
Um oligonucleotídeo de captura de locus específico deHLA é um oligonucleotídeo de captura que é complementar a ehibridiza a uma região conservada de um locus de HLA. Porexemplo, o oligonucleotídeo de captura pode ser específicopara o locus de HLA-A e hibridizará a um ou mais regiõesconservadas ou subseqüências do locus de HLA-3
De forma similar, um oligonucleotídeo de captura delocus específico de ST é um oligonucleotídeo de captura queé complementar a e hibridiza a uma região conservada de umlocus de STR. Um oligonucleotídeo de captura de locusespecífico é um oligonucleotídeo de captura que écomplementar a e hibridiza a uma região conservada de umlocus genérico.
Um oligonucleotídeo de captura é tipicamenteimobilizado em uma fase sólida diretamente ouindiretamente. Tal imobilização pode se dar através deligações covalentes ou não covalentes.
0 termo "amplicon" é aqui utilizado para significaruma população de moléculas de DNA que foram produzidas poramplificação, por exemplo, por PCR.
0 termo "indivíduo" refere-se a um indivíduo mamíferolactante. 0 indivíduo pode ser humano, bovino, caprino esimilares. Por exemplo, a seleção quanto à origem deprodutos de leite de mamíferos não humanos pode serimportante para rastreamento de produtos até um bovino emparticular, por exemplo, para a FDA ou outras finalidades.
0 termo "mutação" conforme aqui utilizado algumasvezes se refere a um polimorfismo funcional que ocorre napopulação e está fortemente correlacionado a um gene. 0termo "mutação" é também utilizado aqui para se referir aum local e tipo específico de polimorfismo funcional, semreferência ao grau de risco que uma mutação particularofereça a um indivíduo quanto a uma doença particular.
Um "auto-antígeno" é um antígeno que identifica oindivíduo em particular de outros indivíduos na população.Auto-antigenos exemplares incluem os antígenos dehistocompatibilidade principais (MHC) ou os antígenos detipo sangüíneo (ABO).
Um "perfil de auto-antígeno" significa um perfil deauto-antígeno de um humano ou de um indivíduo que ésuficiente para distinguir o indivíduo único de outrosindivíduos com um grau suficiente de certeza.
O termo "anticorpo" é utilizado em seu significadomais amplo e cobre anticorpos policlonais, anticorposmonoclonais, anticorpos de cadeia simples e fragmentos deanticorpos.
Em um aspecto, a invenção fornece um método paradeterminar origem de leite. Por exemplo, a fim de garantirque leite materno humano recebido de um humano específicorealmente vem daquele humano, são necessários métodos deteste de identidade em algumas amostras de leite recebidasde cada humano.
Como parte do processo de qualificação para doador deleite, cada doador de leite em potencial será identificadopor métodos biológicos (conforme descrito acima). Ascaracterísticas de identificação do indivíduo estarãotambém presentes no leite do doador. Tais característicasserão utilizadas para comparar o leite do doador aoindivíduo doador.
Conseqüentemente, o método da invenção utilizou umaamostra biológica de referência de um doador em potencialpara identificação biológica. Tais amostras podem serobtidas por métodos conhecidos na técnica tais como, semestar limitados a, uma amostra de células de esfregão debochecha ou uma amostra de sangue extraído ou outro tecidoconveniente.
A amostra biológica de referência, identificada com umúnico número de referência, é testada em marcadores deidentidade.
É observado que a amostra biológica pode ter seu DNAtipado por métodos conhecidos na técnica, como análise STRde loci de STR, análise de HLA de loci de HLA ou análise degene múltiplo de genes/alelos individuais. O perfil de tipode DNA da amostra de referência é registrado.
É adicionalmente observado que a amostra biológicapode ser testada quanto a auto-antígenos utilizando-seanticorpos conhecidos na técnica ou outros métodos paradeterminar um perfil de auto-antígeno.
Um indivíduo desejando doar fluido mamário expressaráo fluido mamário (leite materno) utilizando procedimentospadrão. O fluido mamário é tipicamente coletado emrecipientes úteis para envio e armazenamento. O fluidomamário pode ser então congelado para análise e usoposteriores ou analisados sem congelamento. Um ou maisrecipientes são utilizados para se obter uma amostra deteste. A amostra de teste é retirada para identificação deum ou mais marcadores de identidade.
Métodos para obtenção de uma amostra de fluidocongelado expresso incluem uma ferramenta de perfuração deaço inoxidável utilizada para perfurar um núcleo por todo ocomprimento do recipiente. Alternativamente, uma amostrapode ser raspada da superfície do fluido mamário congelado.O recipiente pode conter uma porção separada que coleta umaamostra do fluido mamário expresso e esta pode ser removidacomo a amostra. Onde o fluido mamário está em forma liquidaé observado que o método para obtenção da amostra de testeserá por pipetagem ou outro método.
É observado que amostras de um número de recipientesde leite do mesmo indivíduo podem ser utilizados paraverificação de marcador de identidade. É observado que pelomenos 2 amostras, pelo menos 5 amostras ou pelo menos 8amostras podem ser utilizadas para verificação.
É observado que a amostra de teste pode ser testadapor tipagem de ácido nucléico utilizando-se métodosconhecidos na técnica, como análise STR de Ioci de STR,análise de HLA de Ioci de HLA ou análise de gene múltiplode genes/alelos individuais para se obter a tipagem de DNAda amostra de leite.
A tipagem de DNA ou perfil biológico (isto é, perfisde identidade das amostras de teste) será comparada àtipagem de DNA de referência ou perfil biológico para osuposto doador. Uma combinação ou identidade da tipagem deDNA ou perfil biológico indicará que o fluido mamário foiobtido de um mesmo, por exemplo, indivíduo específico.
As amostras de núcleo podem ser também testadas porverificação de marcador de identidade quanto à presença deperfis de marcador de identidade diferentes. Se não houverperfis de marcador de identidade que não o perfil demarcador de identidade do indivíduo esperado, indicará quenão há fluido (por exemplo, leite) de outros humanos ouanimais contaminando o fluido mamário doado. Se houversinais que não aquele sinal esperado para aquele indivíduo,os resultados indicam contaminação. Tal contaminaçãoresultará na reprovação do fluido mamário (por exemplo,leite) ao teste.
Amostras de ácidos nucléicos do doador de referência(por exemplo, DNA genômico) são isoladas de qualqueramostra biológica conveniente incluindo, mas não limitadaa, leite, saliva, células bucais, raízes capilares, sanguee qualquer outra amostra de célula ou tecido com núcleosinterfase ou células interfase intactas.
Métodos para isolamento de ácidos nucléicos (porexemplo, DNA genômico) destas várias fontes são descritosem, por exemplo, Kirby, "DNA Fingerprinting, An
Introduction", W. H. Freeman & Co., Nova Iorque (1992).
Ácidos nucléicos (por exemplo, DNA genômico) podem ser15 também isolados de culturas celulares primárias ousecundárias ou de linhas celulares transformadas derivadasde qualquer uma das amostras de tecido mencionadasanteriormente.
Amostras de RNA podem ser também utilizadas. O RNApode ser também isolado conforme descrito em Sambrook eoutros, supracitado. 0 RNA pode ser RNA celular total,mRNA, poli A+ RNA ou qualquer combinação destes. Paramelhores resultados, o RNA é purificado, mas pode tambémser RNA citoplasmático não purificado. 0 RNA pode ser
transcrito de forma reversa para formar DNA que é então
utilizado como o padrão de amplificação, de forma que PGRindiretamente amplifique uma população específica detranscrições de RNA. Ver, por exemplo, Sambrook e outros,supracitado, e Berg e outros, "Hum. Genet." 85:655-658,(1990) .Marcadores de DNA de repetições de microssatélites(STR), também chamadas de microssatélites ou repetições deseqüência simples (SSRs) ou repetição de nucleotídeo desatélite de DNA ("DTNR"), compreendem seqüências de DNA desatélites repetidos com uma repetição de núcleo de 2 a 6pares de base (bp) . Marcadores STR são prontamenteamplificador durante a PCR utilizando-se iniciadores que seligam a regiões conservadas do genoma flanqueando a regiãode repetição.
Repetições de tamanho comum incluem dinucleotídeos,trinucleotídeos, tetranucleotideos e superiores. 0 númerode repetições ocorrendo em um locus genético particularvaria de poucas a centenas dependendo do locus e doindivíduo. A composição de repetições da seqüência e dabase pode variar significativamente, incluindo uma falta deconsistência em um locus de repetição de nucleotídeoparticular. Milhares de Ioci de STR foram identificados nogenoma humano e anteviu-se que ocorrem com a freqüência deuma vez a cada 15 kb. Estudos de população foram executadosem dúzias destes marcadores de STR assim como extensosestudos de validação em laboratórios forenses. Seqüênciasde iniciador específico localizadas nas regiões flanqueandoa região de repetição de satélite de DNA foram utilizadaspara amplificar alelos de Ioci de STR através da reação emcadeia de polimerase ("PCR") . Os produtos de PCR incluem asregiões de repetição polimórficas, que variam emcomprimento dependendo do número de repetições ourepetições parciais, e as regiões de flanqueamento, que sãotipicamente de comprimento e seqüência constantes entreamostras.O número de repetições presentes para um indivíduoparticular em um locus particular está descrito como ovalor do alelo para o locus. Pelo fato de a maioria doscromossomos estarem presentes em pares, as amplificaçõespor PCR de um único locus comumente produz dois produtos dePCR de tamanhos diferentes representando dois diferentesnúmeros de repetição ou valores de alelo. A faixa denúmeros de repetição possíveis para um dado locus,determinado através de amostragem experimental dapopulação, é definida como a faixa de alelo, e pode variarpara cada locus, por exemplo, de 7 a 15 alelos. A faixa detamanho do produto de PCR do alelo (faixa de tamanho doalelo) para um dado locus é definida pela colocação de doisiniciadores de PCR em relação à região de repetição e àfaixa do alelo. As seqüências nas regiões que flanqueiamcada locus devem ser completamente conservadas de forma queos iniciadores se recombinem efetivamente e iniciem aamplificação por PCR. Para os propósitos de análisegenética repetições de di-, tri- e tetranucleotídeos nafaixa de 5 a 50 são tipicamente utilizadas nas seleções.Laboratórios Forenses usam loci de tetranucleotídeo (istoé, 4 pares de base na repetição) devido à menor quantidadede "fantasmas" produzidos durante a PCR (produtos fantasmassão picos adicionais que podem complicar a interpretaçãodas misturas de DNA aparecendo em frente de picos de aleloregulares). O número de repetições pode variar de 3 a 4repetições para mais de 50 repetições com marcadoresextremamente polimórficos. O número de repetições e, porconseguinte o tamanho do produto de PCR pode variar entreas amostras em uma população tornando os marcadores STRúteis na testagem de identidade dos estudos de mapeamentogenético.
Há 13 Ioei STR centrais identificados na base de dadosde CODIS dos Estados Unidos. Estes Ioei STR são THO1, TPOX,CSFlPO, VWA, FGAi D3S1358, D5S818, D7S820, D13S317,D16S539, D8S1179, D18S51 e D21S11. A amelogenina marcadorade tipagem de sexo, está também incluída nos multiplex deSTR que cobrem os 13 Ioci STR centrais. Os 13 Ioci STR deCODIS são cobertos pelos kits de Profiler Plus™ e COfiler™de Applied Biosystems (ABI) (Cidade de Foster, CA) . Éconsiderado que os seguintes Ioci STR possam ser usadosnesta invenção: CSF1P0, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179,D13S317, D16S53 9, D18S51, D21S11, DYS19, F13A1, FESfFPS7FGA, HPRTB, THOl, TPOX, DYS388, DYS391, DYS392, DYS393,D2S1391, D18S535, D2S1338, D19S433, D6S477, D1S518,D14S306, D22S684, F13B, CD4, D12S391, D10S220 and D7S523 (aseqüência de cada Ioci está aqui incorporada parareferência). Com exceção de D3 S1358, as seqüências para oIoei STR desta invenção são acessíveis ao público geral
através do GenBank (veja a Patente U. S. de número6.090.558, aqui incorporada para referência). Outro IoeiSTR foi desenvolvido por fabricantes comerciais e estudadosextensivamente por cientistas forenses. Estes incluem todosos sistemas de STR de tetranucleotídeo GenePrint™ a partirde Promega Corporation (Madison, WI).
Muitos diferentes iniciadores foram projetados paravários Ioci STR e são relatados na literatura. Estesiniciadores recombinam-se a segmeritos de DNA fora da regiãode repetição em tandem do DNA para produzir produtos de PCR
contendo a região de repetição em tandem. Estes iniciadoresforam projetados com separação eletroforética em gel depoliacrilamida em mente como um método de detecção/medição,porque as separações de DNA foram tradicionalmenteexecutadas por eletroforese em gel de placa ou capilar. Aanálise de multiplex de STR é freqüentemente executada comamplificação por PCR e detecção de marcadores múltiplos. Amultiplexação por STR é mais comumente executada usando-seetiquetas fluorescentes espectralmente distinguíveis e/outamanhos de produtos por PCR que não se sobrepõem. Aamplificação de multiplex de STR em uma ou duas reações porPCR com iniciadores marcados de forma fluorescente emedição com separação por eletroforese em gel ou capilar edetecção fluorescente induzida a laser é um método padrão.
Os alelos de STR destes produtos de PCR multiplexadostipicamente variam em tamanho de 100 a 800 pares de basecom lotes comercialmente disponíveis.
Sistemas baseados em gel são capazes de multiplexar aanálise de 2 ou mais Ioei STR usando-se dois métodos. 0primeiro método é particionar por tamanho os diferentesloei de produto de PCR. O particionamento por tamanhoenvolve projetar os iniciadores de PCR usados paraamplificar os diferentes Ioci de forma que a faixa detamanho do produto de PCR alelo para cada locus cubra umaparte diferente e separável do espectro de tamanho do gel.
Como um exemplo, os iniciadores de PCR para o Locus A devemser projetados de forma que a faixa de tamanho dos alelosseja de 250 a 300 nucleotídeos, enquanto que os iniciadorespara o Loeus B são projetados para produzir uma faixa detamanho de alelos de 340 a 410 nucleotídeos.
O segundo método para multiplexar 2 ou mais Ioei STRem sistemas baseados em gel é o uso de particionamentoespectroscópico. O estado atual da técnica para os sistemasbaseados em gel envolve o uso de corantes fluorescentescomo marcadores espectroscópicos específicos paradiferentes Ioei amplificados de PCR. Diferentes cromóforosque emitem luz em diferentes comprimentos de onda fornecemum método para detecção diferencial de dois diferentesprodutos de PCR mesmo se eles são exatamente do mesmotamanho, assim 2 ou mais loci podem produzir produtos dePCR com faixas de tamanho que se sobrepõem. Por exemplo, oLocus A com um marcador fluorescente verde produz uma faixade tamanho de alelo de 250 a 300 nucleotídeos, enquanto queo Locus B com um marcador fluorescente vermelho produz umafaixa de tamanho de alelo de 270 a 330 nucleotídeos. Umdispositivo de detecção fluorescente excitado a laser paraescaneamento monitora o comprimento de onda de emissões edetermina diferentes tamanhos de produto de PCRi e seusvalores de alelo correspondentes, para seus lociespecíficos com base em sua cor fluorescente.
É considerado que um método de espectrometria de massapara tipificar e analisar STR, examinar oligômeros de ácidonucleico menores pode ser usado porque a sensibilidade dedetecção e resolução de massa são superiores com oligômerosmenores. A aplicação de análise de STR ao tempo de vôo-espectrometria de massa (TOF-MS) requer o desenvolvimentode conjuntos de iniciadores que produzem pequenos produtosde PCR de 50 a 160 nucleotídeos de comprimento, tipicamentede 50 a 100 nucleotídeos de tamanho. Os ácidos nucleicosamplificados podem também ser usados para gerar produtosfilamentosos únicos que estão na.faixa de tamanho desejadopara análise de TOF-MS através do prolongamento de uminiciador na presença de um reagente de terminação decadeia. Uma classe tipica de reagente de terminação decadeia comumente usado por aqueles habilitados na técnica éo trifosfato de dideoxinucleotídeo. Novamente, a aplicaçãode análise de STR ao TOF-MS requer que o iniciador sejaprolongado para gerar produtos de 50a 160 nucleotídeos detamanho, e tipicamente cerca de 50 a 100 nucleotídeos detamanho (ver a Patente U. S. de número 6.090.558, aquiincorporada por referência).
Um oligonucleotídeo clivável biotinilado é usado comoum iniciador em cada ensaio e é incorporado através demetodologias de amplificação de ácido nucleico (isto é,PCR) no produto final que é medido no espectrômetros demassa. Este processo está descrito em, por exemplo, PatenteU. S. de número 5.700.642 e Patente U. S. de número6.090.558 (ver também Butler e outros, InternationalJournal of Legal Medicine 112(1) 45-59 (1998)). 0 ensaio deSTR envolve uma etapa de amplificação por PCR onde um dosiniciadores é substituído por um iniciador biotiniladoclivável. O produto de PCR biotinilado é então capturadonas contas magnéticas revestidas com estreptavidina paralimpeza de amostra pós-PCR e remoção de sal, seguida poranálise de espectrometria de massa.
Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) representamuma outra forma de variação de DNA que é útil para testagemde identidade humana. SNPs são as formas mais freqüentes devariação de seqüência de DNA nos genomas de organismos eestão se tornando de forma crescente marcadores genéticospopulares para estudos de mapeamento de genoma ediagnóstico médico. SNPs são tipicamente bi-alélicos comdois possíveis nucleotídeos (nt) ou alelos em um sítioparticular no genoma. Porque os SNPs são menos polimórficos(isto é, possuem menos alelos) que os marcadores STRcorrentemente usados, mais marcadores de SNP são exigidospara se obter o mesmo nível de discriminação entre asamostras. Aproximadamente de 30-50 SNPs não ligados podemser exigidos para se obter as probabilidades de combinaçãode 1 em 100 bilhões conforme visto com os 13 STRs do CODIS.
Um ensaio de SNP envolve tipicamente um processo detrês etapas: (1) amplificação por PCR, (2) remoção defosfatase de nucleotídeos, e (3) extensão de iniciadorusando-se um iniciador clivável biotinilado comdideoxinucleotídeos para adição de base única dosnucleotídeos complementares àqueles no sítio de SNP (Li eoutros, Electrophoresis 20 (6) :1258-1265 (1999)) .
A análise simultânea de múltiplos marcadores de SNP(isto é, multiplexação) é possível colocando-se os sítiosde clivagem em posições diferentes nos vários iniciadoresde forma que eles não se sobreponham em uma escala demassa.
0 meio mais comum para amplificação é a reação emcadeia de polimerase (PCR), conforme descrito nas PatentesU. S. de números 4.683.195, 4.683.202, 4.965.188 cujadivulgação de cada uma está aqui incorporada porreferência. Se PCR é usado para amplificar as regiões alvonas células de sangue, sangue integral heparinizado deveser retirado em um tubo selado a vácuo mantido separado deoutras amostras e manipulado com luvas limpas. Paramelhores resultados, o sangue deve ser processadoimediatamente após coleta; se for possível, ele deve sermantido em um recipiente lacrado a 4 0C até o uso. Ascélulas em outros fluidos fisiológicos podem também seranalisados. Quando se usa qualquer um destes fluidos, ascélulas no fluido devem ser separadas do componente dofluido por centrifugação.
Para amplificar uma seqüência de ácido nucleicoobjetivada em uma amostra por PCR, a seqüência deve seracessível aos componentes do sistema de amplificação. Ummétodo de isolamento do DNA alvo é a extração bruta que éútil para amostras relativamente grandes. De formaresumida, as células mononucleares das amostras de sangue,células da boca, ou semelhantes são isolados. As pelotassão armazenadas congeladas a -200C até que sejam usadas(Publicação de Patente U. S. de número 20040253594 que está
aqui incorporada por referência).
As pelotas podem ser ressuspensas na solução de Iisedo kit de isolamento de DNA PUREGENE® (cat#D-5000, GENTRA,Minneapolis, MN) CONTENDO 100/pG/mL de proteinase K. Apósincubação a 55 0C durante a noite. A extração de DNA éexecutada de acordo com as recomendações dos produtores. Asamostras de DNA são ressuspensas em solução aquosa e
armazenadas a -20°C.
Quando a amostra contém um grande número de células, aextração pode ser executada por métodos conforme descritoem Higuchi, "Simple and Rapid Preparation of Samples forPCR", em PCR Technology, p. 31-43 Ehrlich, H. A. (ed.) ,
Stockton Press, New York.
Um procedimento relativamente fácil para extrair DNApor PCR é um procedimento de coagulação adaptado do métododescrito por Miller e outros, Nucleic Acids Res. 16:1215,(1988) , que está incorporada por referência. Célulasnucleadas são ressuspensas em 3 mL de tampão de lise (10 mMTris-HCl, 400 mM NaCl, 2 mM Na2 EDTA, pH 8,2). Cinqüentamicrolitros de uma solução 20 mg/mL de proteinase K e 200pL de uma solução 20% SDS são adicionados às células eentão incubados a 37°C durante a noite. Seguindo a digestãoadequada, 1 mL de uma solução NaCL 6M é adicionado àamostra e vigorosamente misturado. A solução resultante écentrifugada por 15 minutos a 3000 rpm. A pelota contém asproteínas celulares precipitadas, enquanto o sobrenadantecontém o DNA. O sobrenadante é removido a um tubo de 15 mLque contém 4 mL de isopropanol. Os conteúdos do tubo sãomisturados gentilmente até que a água e as fases de álcoolsejam misturadas e um precipitado de DNA branco fosseformado. O precipitado de DNA é colocado em água destiladae dissolvido. (A publicação de Patente U. S. de número20040253594 que está aqui incorporada para referência).
Kits para a extração de DNA de alto peso molecular porPCR incluem o kit de isolamento de DNA PUREGENE® GENTRA (D-5000), um kit de isolamento genômico A.S.A.P.® (BoehringerMannheim, Indianapolis, Ind.), Sistema de isolamento de DNAgenômico (G1BCO BRL, Gaithdrsburg, Md.), kit de purificaçãode DNA ELU-QUIK® (Schleicher & Schuellf Keene, N.H.), Kitde extração de DNA (Stratagene, LaJolla, Calif.), kit deisolamento TURBOGEN® (Invitrogen, San Diego, Calif.), eetc. O uso destes kits de acordo com as instruções dofabricante é geralmente aceitável para a purificação do DNAantes de se praticar os métodos da invenção (Publicação dePatente U. S. de número 20040253594 que está aquiincorporada para referência).
A concentração e pureza do DNA extraído podem serdeterminadas por análise espectro fotométrica daabsorbância de uma alíquota diluída a 260 nm e 280 nm.
Após a extração do DNA, a amplificação por PCR podeproceder. A primeira etapa de cada ciclo do PCR envolve aseparação do duplo ácido nucleico formado pela extensão doiniciador. Uma vez que os filamentos são separados, apróxima etapa em PCR envolve a hibridização dos filamentosseparados com os iniciadores que flanqueiam a seqüênciaalvo. Os iniciadores são então prolongados para formarcópias complementares dos filamentos alvos. Paraamplificação por PCR bem-sucedida, os iniciadores sãoprojetados de forma que a posição na qual cada iniciadorhibridiza ao longo da seqüência dupla é tal que um produtode extensão sintetizado a partir de um iniciador, quandoseparado do modelo (complemento), serve como um modelo paraa extensão do outro iniciador. Os ciclos de desnaturação,hibridização e extensão são repetidos quantas vezes quantonecessário para se obter a quantidade desejada de ácidonucleico amplificado (Patente U. S. de número 20040253594que está aqui incorporada para referência).
Em uma modalidade de amplificação por PCR, a separaçãodo filamento é alcançada aquecendo-se a reação a umatemperatura suficientemente alta por um tempo suficientepara causar a desnaturação da dupla mas não causar umadesnaturação irreversível da polimerase (veja Patente U. S.de número 4.965.188, aqui incorporada para referência). Adesnaturação por calor típica envolve temperaturas variandode cerca de 800C a cerca de 1050C por períodos de tempovariando de segundos a minutos. A separação dos filamentos,entretanto, pode ser executada por qualquer método dedesnaturação adequado incluindo meios físicos, químicos ouenzimáticos. A separação do filamento pode ser induzida poruma helicase, por exemplo, ou uma enzima capaz de exibiratividade de helicase. Por exemplo, a enzima RecA possuiatividade de helicase na presença de ATP. Condições dereação adequadas para a separação de filamento porhelicases são conhecidas na técnica (ver Kuhn e outros,1979, CSH-Quantitative Biology, 43:63-67; e Radding, 1982,Ann. Rev. Genetics 16:405-437, incorporada por referência).
A extensão dependente de modelo dos iniciadores em PCRé catalisada por um agente de polimerização na presença dequantidades adequadas de quatro trifosfatos dedesoxirribonucleotídeos (tipicamente dATP, dGTP, dCTP edTTP) em um meio de . reação compreendido dos saisapropriados, cátions metálicos, e sistemas de tamponamentode pH. Agentes de polimerização adequados são enzimasconhecidas por catalisarem a síntese de DNA dependente demodelo. Em alguns casos, as regiões alvo podem codificarpelo menos uma parte de uma proteína expressa pela célula.Neste exemplo, o mRNA pode ser usado para amplificação daregião alvo. Alternativamente, o PCR pode ser usado paragerar uma biblioteca de cDNA a partir do RNA paraamplificação posterior, o modelo inicial para extensão doiniciador é o RNA. Os agentes de polimerização adequadospara sintetizar uma seqüência de cópia do DNA (cDNA)complementar a partir do modelo de RNA são transcriptasereversa (RT) , tal como a RT do vírus da mieloblastoseaviária, a RT do vírus da leucemia murina de Moloney ou aDNA polimerase de Thermus thermophilus (Tth) , uma DNApolimerase termoestável com a atividade da transcriptasereversa comercializada por Perkin Elmer Cetus, Inc.Tipicamente, o modelo de RNA genômico é degradado poraquecimento durante a primeira etapa de desnaturação após aetapa de transcrição reversa deixando apenas um modelo deDNA. As polimerases adequadas para uso com um modelo de DNAincluem, por exemplo, a DNA polimerase I da E. coli ou seufragmento Klenow, a T4 DNA polimerase, Tth polimerase, eTaq polimerase, uma DNA polimerase estável ao calor isoladada Thermus aquaticus e comercialmente disponível a partirde Perkin Elmer Cetus, Inc. A última enzima é amplamenteusada na amplificação e seíqüenciamento dos ácidosnucleicos. As condições de reação para uso da Taqpolimerase são conhecidas na técnica (Publicação de PatenteU. S. de número 20040253594 que está aqui incorporada porreferência).
A PCR alelo-específica diferencia entre as regiõesalvo diferenciando-se na presença ou ausência de umavariação ou polimorfismo. Os iniciadores de amplificaçãopor PCR são escolhidos os quais se ligam apenas a certosalelos da seqüência alvo. Este método está descrito porGibbs, Nucleic Acid Res. 17:2437-2448 (1989) (Publicação dePatente U. S. de número 20040253594 que está aquiincorporada para referência).
Métodos de seleção de diagnóstico adicionais empregamos métodos de seleção por oligonucleotídeo alelo-específico(ASO), conforme descritos por Saiki e outros, Nature324:163-166 (1986). Os oligonucleotídeos com um ou maispares de base desemparelhados são gerados para qualqueralelo particular. Os métodos de seleção por ASO detectamdesemparelhamentos entre o DNA amplificado por PCR ou o DNAgenômico de alvo variante e os oligonucleotideos nãomutantes, mostrando ligação diminuída dos oligonucleotideosem relação a um oligonucleotídeo mutante. Os marcadores deoligonucleotídeo podem ser projetados de forma que, sobbaixa estringência, se liguem a ambas as formaspolimórficas do alelo, mas que sob alta estringência, seliguem ao alelo que eles correspondem. Alternativamente, ascondições de estringência podem ser projetadas de forma queuma resposta essencialmente binaria seja obtida, isto é, umASO correspondente a uma forma variante do gene alvo que sehibridizará àquele alelo, e não ao alelo do tipo selvagem(Publicação de Patente U. S. de número 20040253594 que estáaqui incorporada para referência).
As regiões alvo do DNA de um indivíduo podem sercomparadas com a amostra do fluido mamário por detecção dealelo mediado por ligase. A ligase pode também ser usadapara detectar mutações pontuais na reação de amplificaçãoda ligação descrita em Wu e Wallace, Genomics 4:560-569(1989) . A reação de amplificação de ligação (LAR) utiliza aamplificação da seqüência de DNA específica usando rodadasseqüenciais de ligação dependente de modelo conformedescrito em Barany, Proc. Nat. Acad. Sei. 88:189-193 (1990)(Publicação de Patente U. S. de número 20040253594 que estáaqui incorporada para referência.
Os produtos de amplificação gerados usando-se a reaçãoem cadeia da polimerase podem ser analisados pelo uso deeletroforese em gel de gradiente desnaturante. Alelosdiferentes podem ser identificados com base nas diferentespropriedades de fusão dependentes de seqüência e migraçãoeletroforética do DNA em solução. A fusão de moléculas deDNA em segmentos, chamados de domínios de fusão, sobcondições de temperatura aumentada ou desnaturação. Cadadomínio de fusão funde-se de forma cooperativa a umatemperatura de fusão (TM) distinta específica à base. Osdomínios de fusão possuem pelo menos 20 pares de base decomprimento e podem ser de até várias centenas de pares debase de comprimento.
A diferenciação entre os alelos com base nasdiferenças de domínio de fusão específico à seqüência podeser avaliada usando-se eletroforese em gel depoliacrilamida, conforme descrito em Myers e outros,Capítulo 7 de Erlich ed. , PCR Technology, W. H. Freeman eCo., New York (1989) aqui incorporada por referência.
Geralmente, uma região alvo a ser analisada poreletroforese em gel de gradiente desnaturante é amplificadausando-se iniciadores de PCR que flanqueiam a região alvo.O produto de PCR amplificado é aplicado a um gel depoliacrilamida com um gradiente desnaturante linearconforme descrito em Myers e outros, Meth. Enzymol.155:501-527 (1986), e Myers e outros, em Genomic Analysis,A Practical Approach, K. Davies Ed. IRL Press Limited,Oxford páginas 95-13 9 (198 8). 0 sistema de eletroforese émantido a uma temperatura levemente abaixo da TM dosdomínios de fusão das seqüências alvo.
Em um método alternativo de eletroforese em gel degradiente desnaturante, as seqüências alvos podem serinicialmente fixadas a uma extensão de nucleotídeos GC,chamado de nGC-clamp", conforme descrito por Myers noCapítulo 7 de Erlich, PCT Technology Stockton Press. Éconsiderado que pelo menos 80% dos nucleotídeos na "GC-clamp" ou são guanina ou citosina. O nGC-clamp" podepossuir pelo menos 30 bases de comprimento. Este método éparticularmente adaptado às seqüências alvo com altas TM' s.
Geralmente, a região alvo é amplificada pela reação emcadeia da polimerase conforme descrito acima. Um dosoligonucleotídeos iniciadores para PCR carrega em suaextremidade 5', a região de "GC-clamp", pelo menos 30 basesda seqüência rica em GC, que está aqui incorporada naextremidade 5' da região alvo durante a amplif icação. Aregião alvo amplificada resultante é submetida em um gel deeletroforese sob condições de gradiente desnaturanteconforme descrito acima. Os fragmentos de ácido nucleicoque se diferenciam por uma única mudança de base migrarãoatravés do gel a diferentes posições que podem servisualizadas por coloração de brometo de etídio.
A eletroforese em gel com gradiente de temperatura(TGGE) é baseada nos mesmos princípios fundamentais daeletroforese em gel de gradiente desnaturante, exceto que ogradiente desnaturante é produzido por diferenças emtemperatura em vez de diferenças na concentração de umdesnaturante químico. A TGGE padrão utiliza um aparelho deeletroforese com um gradiente de temperatura submetido aolongo da rota de eletroforese. À medida que as amostrasmigram através de um gel com uma concentração uniforme deum desnaturante químico, elas encontram temperaturascrescentes. Um método alternativo de TGGE, eletroforese emgel com gradiente de temperatura temporal (TTGE ou tTGGE)usa uma temperatura que aumenta regularmente do gel deeletroforese inteiro para alcançar o mesmo resultado. Àmedida que as amostras migram através do gel, a temperaturado gel inteiro aumenta, levando as amostra a encontrartemperatura crescente à medida que elas migram através dogel. A preparação das amostras, incluindo amplificação porPCR com incorporação de uma nGC-Clamp", e a visualizaçãodos produtos são as mesmas para a eletroforese em gel degradiente desnaturante (ver, por exemplo, Publicação dePatente U. S. de número 20040253594).
O complexo antígeno de leucócito humano (tambémconhecido como o complexo de maior histocompatibilidade)atravessa aproximadamente 3,5 milhões de pares de base nobraço curto do cromossomo 6. Ele é divisível em 3 regiõesseparadas que contém os genes de classe I, classe II e declasse II. Em humanos, o complexo HLA classe I possui cercade 2 000 kb de comprimento e contém cerca de 20 genes.Dentro da região de classe I existem genes que codificam asbem caracterizadas moléculas MHC classe I designadas HLA-A,HLA-B e HLA-C. Além disso, há genes de classe I nãoclássicos que incluem HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J eI-ILA-X assim como uma nova família conhecida como MIC. Aregião de classe II contém três genes conhecidos como osloci HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR. Estes genes codificam ascadeiras das moléculas MHC classe II clássicas designadasHLA-DR, DP e DQ. Em humanos, os genes não clássicosdesignados DM, DN e Do foram também identificados dentro daclasse II. A região de classe II contém uma coleçãoheterogênea de mais de 3 6 genes. Vários componentescompletos são codificados por três genes incluindo as TNF's(ver, por exemplo, a Patente U. S. de número 6.670.124 aquiincorporada por referência).
Qualquer cópia dada do cromossomo 6 humano pode contervárias diferentes versões alternativas de cada um dos genesprecedentes e assim pode produzir proteínas com seqüênciasdistintamente diferentes. Os Ioci que constituem a MHC sãoaltamente polimórficos, isto é, muitas formas do gene oualelos existem em cada locus. Várias centenas de variantesalélicas diferentes de moléculas MHC de classe I e classeII foram identificadas em humanos. Entretanto, qualquer umaapenas expressa até 6 diferentes moléculas de classe I eaté 12 diferentes moléculas de classe II.
As regiões precedentes desempenham uma importantefunção na determinação se o tecido transplantado seráaceito com sendo próprio (histocompatível) ou rejeitadocomo estranho (histoincompatível). Por exemplo, dentro daregião de classe II, três Ioci, isto é, HLA-DR, DQ e DP sãoconhecidos por expressar produtos funcionais. Pares degenes AeB dentro destes três Ioci codificam produtos deproteína heterodimérico que são multi-alélicos ealorreativos. Além disso, combinações de epítopos emmoléculas DR e/ou DQ são reconhecidos por células Talorreativas. Esta reatividade foi usada para definir ostipos "DW" por ensaios celulares com base na reação mistade Iinfócito (MLR) . É considerado que a união do tipo HLAda amostra biológica de referência com a amostra de fluidomamário pode ser usada para determinar se a amostra defluido mamário foi originada do doador.
Um método de tipagem de ácido nucleico para aidentificação destes alelos foi a análise de polimorfismono comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) discutidaaqui (ver também, Patente U. S. de número 6.670.124).
Além do polimorfismo no comprimento de fragmentos derestrição (RFLP), um outro método é a hibridização dosprodutos amplificados por PCR com marcadores deoligonucleotídeos específicos a seqüência (PCR-SSO) paradistinguir entre os alelos HLA (ver, Tiercy e outros,(1990) Blood Review 4:9-15). Este método requer que umproduto de PCR do locus HLA de interesse seja produzido eentão semeado sobre membranas ou tiras de nitrocelulose.
Então cada membrana é hibridizada com um marcadorespecífico ã seqüência, lavado e então analisado porexposição a filme de raios-X ou por ensaio colorimétricodependendo do método de detecção. Similar à metodologia dePCR-SSP, os marcadores são feitos para a área polimórficaalélica responsável pelos diferentes alelos HLA. Cadaamostra deve ser hibridizada e marcada pelo menos de 100 a200 vezes diferentes para uma tipagem de Classe I e IIcompleta. Os métodos de hibridização e detecção paratipagem por PCR-SSO incluem o uso de marcadores marcadosnão radioativos, formatos de microplaca, e etc. (veja, porexemplo, Saiki e outros (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. ,U.S.A. 86:6230-6234; Erlich e outros (1991) Eur. J.Immunogenet. 18 (1-2) :33-55; Kawasaki e outros (1993)Methods Enzymol. 218:369-381), e tipagem de HLA classe IIem grande escala automatizada (veja, por exemplo, PatenteU. S. de número 6.670.124).
Um outro método de tipagem compreende a amplificaçãode iniciador específico à seqüência (PCR-SSP) que pode serusado nos métodos da invenção (veja, Olemp e Zetterquist(1992) Tissue Antigens 39:225-235). Em PCR-SSP, osiniciadores específicos à seqüência alélicos amplificamapenas o alelo do modelo complementar, permitindo avariabilidade genética para ser detectada com um alto graude resolução. Este método permite a determinação do tipo deHLA simplesmente se os produtos de amplificação(coletivamente chamados de "amplicon") estão ou nãopresentes ou ausente depois da PCR. Em PCR-SSP, a detecçãodos produtos de amplificação é freqüentemente feita poreletroforese em gel de agarose seguida por coloração combrometo de etídio (EtBr) do gel (ver, por exemplo, PatenteU.S. de número 6.670.124).
Um outro método de tipagem de HLA é o SSCP-Single-Stranded Conformational Polymorphism. Resumidamente, osprodutos de PCR de filamento único do Ioci de HLA diferentesão submetidos à Eletroforese em Gel de Poliacrilamida nãodesnaturante (PAGE). O filamento único irá migrar a umaúnica locação com base em sua composição do par da base.Por comparação com filamentos conhecidos, uma tipagem podeser deduzida. Este é o único método que pode determinar ahomozigosidade (ver, por exemplo, Patente U. S. de número6.670.124) (Orita e outros, Proc. Nat. Acad. Sci 86:2766-2770 (1989)).
A identificação de uma seqüência de DNA pode ser feitasem uma etapa de amplificação, com base em polimorfismosincluindo polimorfismos em comprimento de fragmento derestrição ("RFLP") em um indivíduo. Os marcadores dehibridização são geralmente oligonucleotídeos que se ligamatravés de pares de base complementares a todo ou parte deum ácido nucleio alvo. Os marcadores tipicamente ligamseqüências alvo carentes de complementaridade completa coma seqüência de marcador dependente da estringência dascondições de hibridização. Os marcadores são tipicamentemarcados diretamente ou indiretamente, de forma que pelaanálise da presença ou ausência do marcador, pode-sedetectar a presença ou ausência da seqüência alvo. Métodosde marcação direta incluem marcação com radioisótopo, talcomo com 32P ou 35S. Métodos de marcação indireta incluemetiquetas fluorescentes, complexos de biotina que podem serligados a avidina ou estreptavidina, ou etiquetas depeptideo ou de proteína. Os métodos de detecção visuaisincluem fotoluminescentes, vermelho Texas, rodamina e seusderivados, corante leuco vermelho e 3,3',5,5'-tetra-metilbenzidina (TMB), fluoresceína, e seu derivados,dansil, umbeliferona e etc. ou com peroxidase do rábanosilvestre, fosfatase alcalina e etc. (ver, por exemplo,Publicação de Patente U. S. de número 20040253594,Publicação de Patente U. S. de número 20050123947, queestão aqui incorporadas para referência).
Uma ou mais enzimas de restrição adicionais e/oumarcadores e/ou iniciadores podem ser usados. Enzimasadicionais, marcadores construídos e iniciadores podem serdeterminados por experimentação de rotina por aqueleshabilitados na técnica e são objetivados para estareminseridos no escopo da invenção.
Embora os métodos descritos aqui possam ser em termosdo uso de uma única enzima de restrição e um único conjuntode iniciadores, os métodos não são desta forma limitados.Uma ou mais enzimas de restrição adicionais e/ou marcadorese/ou iniciadores podem ser usados, se desejado. Enzimasadicionais, marcadores construídos e iniciadores podem serdeterminados através de experimentação de rotina,combinados com os ensinamentos fornecidos e aquiincorporados.
Os reagentes adequados para aplicar os métodos dainvenção podem ser embalados em kits convenientes. Os kitsfornecem os materiais necessários, embalados em recipientesadequados. Tipicamente, o reagente é um conjunto de PCR (umconjunto de iniciadores, DNA polimerase e 4 nucleosídeostrifosfatos) que se hibridizam com o gene ou Ioci deste.
Tipicamente, o conjunto de PCR é incluído no kit.Tipicamente, o kit também compreende meios adicionais, taiscomo reagentes, para detectar ou medir a entidadedetectável ou fornecer um controle. Outros reagentes usadospara hibridização, pré-hibridização, extração de DNA,visualização, etc. podem também ser incluídos, se desejado.
É também considerado que a amostra de fluido mamáriopode ser testada para auto-antigenos presentes no fluidomamário para estabelecer um perfil de auto-antígeno (perfilmarcador de identidade) 0 perfil de auto-antígeno daamostra de fluido mamário será comparado ao perfil de auto-antígeno de referência para o humano individual. Umacombinação ou identidade do perfil de auto-antígenoindicará que o fluido mamário foi obtido a partir doindivíduo específico.
Os vários antígenos que determinam o próprio sãocodificados por mais de 4 0 Ioci diferentes, tal como oprincipal complexo de histocompatibilidade (MHC), tambémchamado de locus do antígeno de leucócito humano (HLA) e osantígenos do grupo do sangue, tal como ABO.
Métodos são conhecidos na técnica para selecionarhumanos para o tipo de grupo sangüíneo ABO. Os antígenos dogrupo de sangue são expressos em células vermelhas dosangue, células epiteliais e células endoteliais.
O teste para o tipo de HLA podem ser conduzidos pormétodos conhecidos na técnica tal como tipagem sorológica ecelular.
É considerado que os antígenos poderão seridentificados por um teste microcitotoxicidade. Nesteteste, células brancas do sangue são distribuídas em umaplaca de microtitulação e anticorpos monoclonaisespecíficos para antígenos MHC de classe I e classe II sãoadicionados a diferentes cavidades. Desde então,complemento é adicionado às cavidades e a citotoxicidade éavaliada por absorção ou exclusão para vários corantes (porexemplo, azul de tripan ou eosina) pelas células. Se ascélulas brancas do sangue expressão o antígeno MHC para umanticorpo monoclonal particular, então as células serãolisadas na adição do complemento e estas células mostrasirão absorver o corante (ver, Terasaki e McClelland, (1964)Nature, 204:998 e Patente U. S. de número 6.670.124). Atipagem de HLA baseada na microcitotoxicidade mediada poranticorpo pode portanto indicar a presença ou ausência devários alelos MHC (veja, Kuby Inmunology, 4a Edição,Freeman and Company, páginas 520-522).
A detecção de antígenos pode ser selecionada a partirde, mas não é limitada a, ensaios imunossorvente ligados àenzima, imunoensaios radioligantes de fase sólida onde osanticorpos podem ser direcionados contra antígenos solúveisou antígenos de superfície de célula, autoradiografia,radioimunoensaio de ligação competitiva, ensaioimunoradiométrico (IRMA), microscopia de elétrons, marcaçãocom peroxidase antiperoxidase (PAP) , microscopiafluorescente, marcação com fosfatase alcalina e marcaçãocom peroxidase.
No caso onde o(s) método (s) de detecção usa(m)microscópio ótico, as células da amostra biológica ou aamostra do fluido mamário são montadas e fixadas em umalâmina de microscópio. Neste caso, a etapa de detecção doanticorpo marcado consiste em detectar uma coloraçãoresultante do auto-antígeno com um microscópio ótico (ver,por exemplo, Patente U. S. de número 6.376.201).
Várias modalidades da invenção foram descritas.Entretanto, será compreendido que várias modificações podemser feitas sem se afastar do espírito e escopo da invenção.Conseqüentemente, outras modalidades estão inseridas noescopo das seguintes reivindicações.
Claims (20)
1. Método para determinar se um fluido mamário doadofoi obtido a partir de um indivíduo específico, o métodocaracterizado por compreender:(a) testar uma amostra biológica doada a partir doindivíduo específico para se obter pelo menos um perfilmarcador de identidade de referência para pelo menos ummarcador;(b) testar uma amostra do fluido mamário doado para seobter pelo menos um perfil marcador de identidade para opelo menos um marcador na etapa (a); e(c) comparar os perfis marcadores de identidade,onde uma combinação entre os perfis marcadores deidentidade indica que o fluido mamário foi obtido a partirdo indivíduo específico.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o teste da amostra de fluidomamário e o teste da amostra biológica compreendem umatipagem de ácido nucleico.
3. Método, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que a tipagem do ácido nucleicocompreende um método selecionado a partir do grupoconsistindo de: análise STR, análise de HLA, análise degene múltiplo e uma combinação destes.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a tipagem do ácido nucleicocompreende uma análise de STR.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a tipagem do ácido nucleicocompreende uma análise de HLA.
6. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a tipagem do ácido nucleicocompreende uma análise de gene múltiplo.
7. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o fluido mamário doado écongelado.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado por também compreender a obtenção da amostrade fluido mamário através da perfuração até o centro dofluido congelado.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado por também compreender a obtenção da amostrade fluido mamário por raspagem da superfície do fluidomamário congelado.
10. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado por também compreender isolar o fluidomamário antes da etapa (b).
11. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo de que a amostra de fluido mamáriocompreender uma mistura de uma ou mais amostras de fluidomamário.
12. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o teste da amostra de fluidomamário e o teste da amostra biológica compreendem um testede anticorpo para se obter um perfil de auto-antígeno.
13. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a amostra do fluido mamáriodoado compreende uma fração sólida selecionada do fluido.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que os perfis de identidadecompreendem marcadores de peptídeo.
15. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a amostra biológica doada éselecionada a partir do grupo consistindo de: leite,saliva, célula bucal, raiz de cabelo e sangue.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que as amostras biológicasdoadas compreendem uma amostra de sangue.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que as amostras biológicasdoadas compreendem uma célula bucal.
18. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que a falta de uma combinaçãoentre os perfis de marcador de identidade indicacontaminação do fluido mamário por um outro mamífero.
19. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que as etapas (a) até (c) sãoexecutadas em um centro de doação de leite materno humano.
20. Método para determinar se um fluido mamário doadofoi obtido a partir de um indivíduo específico,caracterizado por compreender:(a) testar uma amostra do fluido mamário para se obterpelo menos um perfil marcador de identidade;(b) testar uma amostra biológica a partir do indivíduoespecífico para se obter pelo menos um perfil marcador deidentidade de referência; e(c) comparar os perfis marcadores de identidade, ondeuma combinação entre os perfis marcadores de identidade éindicativa de que o fluido mamário foi obtido a partir doindivíduo específico.
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US71931705P | 2005-09-20 | 2005-09-20 | |
| US60/719.317 | 2005-09-20 | ||
| US73142805P | 2005-10-28 | 2005-10-28 | |
| US60/731.428 | 2005-10-28 | ||
| PCT/US2006/036827 WO2007035870A2 (en) | 2005-09-20 | 2006-09-20 | A method for testing milk |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BRPI0616323A2 true BRPI0616323A2 (pt) | 2011-06-14 |
Family
ID=37889534
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BRPI0616323-8A BRPI0616323A2 (pt) | 2005-09-20 | 2006-09-20 | mÉtodo para determinar se um fluido mamÁrio doado foi obtido a partir de um indivÍduo especÍfico |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US7943315B2 (pt) |
| EP (1) | EP1926834A4 (pt) |
| BR (1) | BRPI0616323A2 (pt) |
| CA (1) | CA2623483A1 (pt) |
| WO (1) | WO2007035870A2 (pt) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070203802A1 (en) * | 2005-09-23 | 2007-08-30 | Prolacta Bioscience, Inc. | Method for collecting, testing and distributing milk |
| US20070098863A1 (en) * | 2005-09-23 | 2007-05-03 | Prolacta Bioscience, Inc. | Method for collecting, testing and distributing milk |
| US20100268658A1 (en) * | 2001-05-14 | 2010-10-21 | Prolacta Bioscience | Method for collecting, testing and distributing milk |
| US20020182243A1 (en) | 2001-05-14 | 2002-12-05 | Medo Elena Maria | Method of producing nutritional products from human milk tissue and compositions thereof |
| WO2007035870A2 (en) | 2005-09-20 | 2007-03-29 | Prolacta Bioscience, Inc. | A method for testing milk |
| CA2706722C (en) | 2006-11-29 | 2016-01-12 | Prolacta Bioscience, Inc. | Human milk compositions and methods of making and using same |
| US8377445B2 (en) | 2006-12-08 | 2013-02-19 | Prolacta Bioscience, Inc. | Compositions of human lipids and methods of making and using same |
| CN102300575A (zh) | 2008-12-02 | 2011-12-28 | 普罗莱克塔生物科学公司 | 人乳渗透物组合物及其制备和使用方法 |
| CN103987265B (zh) | 2011-08-03 | 2017-05-24 | 普罗莱克塔生物科学公司 | 减少细菌污染的人乳微滤 |
| EP2972312A4 (en) * | 2013-03-13 | 2016-10-19 | Prolacta Bioscience Inc | TEST OF ADULTATION OF MATERNAL MILK |
| FI3821713T3 (fi) | 2013-03-13 | 2025-03-27 | Prolacta Bioscience Inc | Runsasrasvaisia äidinmaitotuotteita |
| AU2016381834B2 (en) | 2015-12-30 | 2021-09-23 | Prolacta Bioscience, Inc. | Human milk products useful in pre- and post-operative care |
| WO2018109199A1 (en) * | 2016-12-16 | 2018-06-21 | Koninklijke Philips N.V. | System and method for determining an impact of an active sub-stance on an infant |
| CN109813813B (zh) * | 2019-01-18 | 2022-01-28 | 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 | 基于脂质组鉴别超高温灭菌乳与复原乳的方法 |
| JP2022548785A (ja) | 2019-09-24 | 2022-11-21 | プロラクタ バイオサイエンス，インコーポレイテッド | 炎症性疾患及び免疫疾患の治療のための組成物及び方法 |
| WO2022148549A1 (en) | 2020-01-14 | 2022-07-14 | Babylat Gmbh | Apparatus and method for obtaining protein-enriched fractions from breast milk |
| WO2021146561A1 (en) | 2020-01-17 | 2021-07-22 | Prolacta Bioscience, Inc. | Feeding protocol for optimal growth of preterm infants |
| KR20230088680A (ko) | 2020-08-14 | 2023-06-20 | 프롤랙타 바이오사이언스, 인코포레이티드 | 박테리아 요법에 사용하기 위한 인간 모유 올리고당 조성물 |
| CA3204530A1 (en) | 2021-01-12 | 2022-07-21 | Gregory Mckenzie | Synbiotic treatment regimens |
| AU2022211396A1 (en) | 2021-01-22 | 2023-06-29 | Prolacta Bioscience, Inc. | Topical human milk formulations |
| WO2024130119A2 (en) | 2022-12-16 | 2024-06-20 | Prolacta Bioscience, Inc. | Synbiotic compositions for short chain fatty acid production |
Family Cites Families (119)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US1526780A (en) | 1921-06-20 | 1925-02-17 | Troy Milk Products Company | Process for canning cream |
| US2148100A (en) | 1936-07-01 | 1939-02-21 | M & R Dietetic Lab Inc | Treatment of milk fluids |
| US2567898A (en) | 1945-03-19 | 1951-09-11 | Separator Ab | Method of standardizing cream |
| US3946113A (en) * | 1972-08-21 | 1976-03-23 | Economics Laboratory, Inc. | Continuous separating and standardizing of milk |
| SE380422B (sv) | 1974-03-07 | 1975-11-10 | Alfa Laval Ab | Foerfaringssaett foer separering av flytande mjoelkprodukter |
| US4282265A (en) * | 1980-01-14 | 1981-08-04 | Bristol-Myers Company | Fat compositions for infant formulas |
| DE3040171C2 (de) | 1980-10-24 | 1986-05-22 | Max-Josef Dr.-Ing. Zürich Schönhuber | Datenregistriersystem zur Erfassung der Daten von bestimmten Gutmengen, insbesondere von Milchlieferungen |
| US4362697A (en) | 1981-04-20 | 1982-12-07 | Miles Laboratories, Inc. | Homogeneous specific binding assay test device having copolymer enhancing substance |
| AU577049B2 (en) * | 1983-06-16 | 1988-09-15 | Farley Health Products Limited | Infant milk formula |
| US4462932A (en) | 1983-06-22 | 1984-07-31 | Purdue Research Foundation | Isolation of native casein by cryodestabilization |
| JPS6133895U (ja) | 1984-07-31 | 1986-03-01 | 東レ株式会社 | 加熱ロ−ラ装置 |
| SE451791B (sv) * | 1984-09-11 | 1987-11-02 | Alfa Laval Food & Dairy Eng | Sett och anleggning for framstellning av mjolk med lag bakteriehalt |
| US4772262A (en) | 1985-04-16 | 1988-09-20 | Natural Technologies, Inc. | Portable electric breast pump |
| US4762822A (en) | 1985-08-08 | 1988-08-09 | Ettinger Anna C | Reduction of gastrointestinal disease-producing organisms with sialic acid and gangliosides |
| US5310893A (en) * | 1986-03-31 | 1994-05-10 | Hoffmann-La Roche Inc. | Method for HLA DP typing |
| US4880750A (en) | 1987-07-09 | 1989-11-14 | Miragen, Inc. | Individual-specific antibody identification methods |
| JPS6467141A (en) | 1987-09-08 | 1989-03-13 | Kougakushiya Kk | Method for removing various germs and somatic cell from cow's milk and apparatus therefor |
| NZ228690A (en) | 1988-04-13 | 1991-10-25 | Snow Brand Milk Products Co Ltd | Continuous production of cheese curds from ultrafiltrated milk |
| US6020015A (en) * | 1988-09-22 | 2000-02-01 | Gaull; Gerald E. | Infant formula compositions and nutrition containing genetically engineered human milk proteins |
| US5064674A (en) | 1989-01-13 | 1991-11-12 | Immunopath Profile, Inc. | Hypoallergenic milk products and process of making |
| US5795611A (en) * | 1989-12-20 | 1998-08-18 | Slattery; Charles W. | Human infant formulas containing recombinant human alpha-lactalbumin and beta-casein |
| US5436020A (en) * | 1990-02-19 | 1995-07-25 | Meiji Milk Products Company Limited | Method for producing a formulated milk for infants analogous to human milk |
| US5013569A (en) * | 1990-05-21 | 1991-05-07 | Century Laboratories, Inc. | Infant formula |
| US5334822A (en) | 1990-05-21 | 1994-08-02 | Universal Computer Technologies Inc. | Method and system for inventoring a distributed plurality of items on a supply |
| DE4018468A1 (de) | 1990-06-08 | 1991-12-12 | Ultrakust Electronic Gmbh | Verfahren und vorrichtung zur entnahme einer repraesentativen milchprobe |
| US5972337A (en) * | 1990-11-01 | 1999-10-26 | Cancer Research Fund Of Contra Costa | 46 kilodalton human milk fat globule (HMFG) antigen, fragments and fusion protein |
| JP3061649B2 (ja) | 1991-02-08 | 2000-07-10 | 森永乳業株式会社 | 抗アレルギー性調製乳 |
| CA2108580A1 (en) | 1991-05-31 | 1992-12-01 | Arthur J. Ammann | Treatment of hiv-associated immune thrombocytopenic purpura |
| US5169766A (en) * | 1991-06-14 | 1992-12-08 | Life Technologies, Inc. | Amplification of nucleic acid molecules |
| WO1993004171A1 (en) * | 1991-08-19 | 1993-03-04 | Symbicom Aktiebolag | Human beta-casein, process for producing it and use thereof |
| US6022853A (en) * | 1991-08-30 | 2000-02-08 | Creative Biomolecules, Inc. | Morphogen-enriched dietary composition |
| US5186963A (en) * | 1992-01-07 | 1993-02-16 | Karen Howman | Therapeutic dietary composition containing amaranth |
| DK8892D0 (da) * | 1992-01-23 | 1992-01-23 | Symbicom Ab | Humant proteingen |
| WO1993020717A2 (en) | 1992-04-13 | 1993-10-28 | Research Corporation Technologies, Inc. | Reducing gastrointestinal irritation in infant nutrition |
| US5902617A (en) * | 1992-05-19 | 1999-05-11 | Pabst; Patrea L. | Enzyme supplemented baby formula |
| HRP930935A2 (en) * | 1992-06-11 | 1994-12-31 | Astra Ab | New dna sequences |
| US6056978A (en) * | 1992-06-16 | 2000-05-02 | Stolle Milk Biologics, Inc. | Use of hyperimmune milk to prevent suppression of T-lymphocyte production |
| US5256437A (en) | 1992-06-19 | 1993-10-26 | Pall Corporation | Product and process of making sterile milk through dynamic microfiltration |
| CA2148261A1 (en) | 1992-10-30 | 1994-05-11 | Jerry A. Peterson | Anti-diarrheic product and method of treating rotavirus-associated infection |
| JP3150504B2 (ja) | 1993-02-26 | 2001-03-26 | 雪印乳業株式会社 | 低乳糖乳製品およびその製造方法 |
| DK169510B1 (da) | 1993-05-13 | 1994-11-14 | Apv Pasilac As | Anlæg og fremgangsmåde til behandling af mælk |
| DE4326665C2 (de) * | 1993-08-09 | 1995-07-13 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur Sterilfiltration von Milch |
| US5417860A (en) | 1993-08-30 | 1995-05-23 | Filtertek, Inc. | Bottle filter and pouring device |
| DE4424935C1 (de) | 1994-07-14 | 1996-03-21 | Immuno Ag | Humanes virussicheres monomeres Immunglobulin A und Verfahren zu seiner Herstellung |
| US5686491A (en) * | 1994-09-14 | 1997-11-11 | Sigma-Tau Pharmaceuticals, Inc. | Infant formula |
| US5707678A (en) | 1995-04-12 | 1998-01-13 | Galagen Inc. | Method for microfiltration of milk or colostral whey |
| US5670196A (en) | 1995-04-12 | 1997-09-23 | Galagen Inc. | Method for microfiltration of milk or colostral whey |
| SE506683C2 (sv) | 1995-05-17 | 1998-02-02 | Tetra Laval Holdings & Finance | Sätt vid framställning av konsumtionsmjölk med lång hållbarhet |
| US6099871A (en) * | 1995-06-01 | 2000-08-08 | Bristol-Myers Squibb Company | Anti-regurgitation infant formula |
| JPH09275897A (ja) | 1996-04-16 | 1997-10-28 | Takamichi Tominaga | ミルクの調整法及び粉ミルク計量器及び粉ミルク計量器の組合せ |
| US5983198A (en) | 1996-04-23 | 1999-11-09 | Novus International, Inc. | Integrated system monitoring use of materials, controlling and monitoring delivery of materials and providing automated billing of delivered materials |
| DE69737063T2 (de) * | 1996-07-23 | 2007-07-19 | Nagase Chemtex Corp. | Verfahren zur herstellung von decosahexaensäure und decosapentsäure |
| US5798266A (en) * | 1996-08-27 | 1998-08-25 | K-Quay Enterprises, Llc | Methods and kits for obtaining and assaying mammary fluid samples for breast diseases, including cancer |
| US6194009B1 (en) | 1996-11-22 | 2001-02-27 | Princeton Nutrition, Llc | Refrigeration-shelf-stable ultra-pasteurized or pasteurized infant formula |
| US6652900B2 (en) | 1997-03-14 | 2003-11-25 | Tetra Laval Holdings & Finance S.A. | Method and plant for producing a sterile milk product |
| SE519853E (sv) | 1997-06-19 | 2005-03-29 | Tetra Laval Holdings & Finance | Metod för framställning av steril skummjölk |
| US6017511A (en) * | 1997-05-30 | 2000-01-25 | Resolution Pharmaceuticals Inc. | Glycopeptide-chelator conjugates |
| GB9713597D0 (en) * | 1997-06-28 | 1997-09-03 | Sec Dep Of The Home Department | Improvements in and relating to forensic identification |
| US6846298B1 (en) | 1997-07-25 | 2005-01-25 | Bristol-Myers Squibb Company | Blood product delivery system |
| US6004288A (en) | 1998-11-24 | 1999-12-21 | Hochstedler; Judy R. | Breast pump |
| NL1010829C2 (nl) | 1998-12-16 | 2000-06-19 | Prolion Bv | Inrichting en werkwijze voor het melken van dieren en een vervuilingsmeter. |
| ES2187115T3 (es) * | 1999-01-20 | 2003-05-16 | Nutricia Nv | Preparado para lactantes. |
| AU2971700A (en) * | 1999-01-21 | 2000-08-07 | Wayne State University | Method and apparatus for measuring factors in mammary fluids |
| US20010049096A1 (en) * | 1999-03-23 | 2001-12-06 | Stephen J. Brown | Sample identification with analyte determination |
| US6294206B1 (en) * | 1999-04-09 | 2001-09-25 | Abbott Laboratories | Powdered human milk fortifier |
| DK174656B1 (da) | 1999-06-04 | 2003-08-11 | Apv Pasilac As | Fremgangsmåde og anlæg til behandling af mælk |
| US6183803B1 (en) | 1999-06-11 | 2001-02-06 | Biosante Pharmaceuticals, Inc. | Method for processing milk |
| EP1233976A4 (en) | 1999-11-17 | 2003-06-11 | Jiuping Ji | SIMULTANEOUS DETECTION OF HBV, HCV AND HIV IN PLASMA SAMPLES WITH THE AID OF A MULTIPLEX FIXING TEST |
| US6780987B1 (en) * | 1999-12-10 | 2004-08-24 | Trustees Of The Tufts College | β-cap73 control of normal and abnormal cell migration |
| US20020155445A1 (en) * | 1999-12-16 | 2002-10-24 | Jarvik Jonathan W. | Methods and products for peptide based DNA sequence identification and analysis |
| US6670124B1 (en) * | 1999-12-20 | 2003-12-30 | Stemcyte, Inc. | High throughput methods of HLA typing |
| WO2001065463A2 (en) | 2000-03-01 | 2001-09-07 | Gambro, Inc. | Extracorporeal blood processing information management system |
| US6737096B2 (en) | 2000-03-29 | 2004-05-18 | Tetra Laval Holdings & Finance S.A. | Method and apparatus for producing a sterile milk product |
| US20040047856A1 (en) | 2000-11-15 | 2004-03-11 | Williams Charles Edward | Colorstrum-based composition |
| US6932967B2 (en) | 2001-03-22 | 2005-08-23 | Michael R. Simon | Human medical treatment by aerosol inhalation of immunoglobulin A |
| WO2002090572A2 (en) | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Third Wave Technologies, Inc. | Nucleic acid detection in pooled samples |
| US20070203802A1 (en) | 2005-09-23 | 2007-08-30 | Prolacta Bioscience, Inc. | Method for collecting, testing and distributing milk |
| US20020182243A1 (en) | 2001-05-14 | 2002-12-05 | Medo Elena Maria | Method of producing nutritional products from human milk tissue and compositions thereof |
| US20070098863A1 (en) | 2005-09-23 | 2007-05-03 | Prolacta Bioscience, Inc. | Method for collecting, testing and distributing milk |
| US20100268658A1 (en) | 2001-05-14 | 2010-10-21 | Prolacta Bioscience | Method for collecting, testing and distributing milk |
| US6866994B2 (en) * | 2001-05-30 | 2005-03-15 | Neomatrix, Llc | Noninvasive intraductal fluid diagnostic screen |
| US20030093171A1 (en) | 2001-07-19 | 2003-05-15 | Creative Edge Design Group, Ltd. | Flexible label printing assembly |
| ATE399562T1 (de) * | 2001-08-23 | 2008-07-15 | Westgate Biolog Ltd | Verwendung von milchserum-apoproteinen bei der prophylaxe oder behandlung von mikrobiellen oder virusinfektionen |
| US6875459B2 (en) | 2001-09-10 | 2005-04-05 | Henry B. Kopf | Method and apparatus for separation of milk, colostrum, and whey |
| AU2003208970A1 (en) * | 2002-02-04 | 2003-09-02 | Bristol-Myers Squibb Company | Human milk supplement |
| US20030213007A1 (en) * | 2002-03-27 | 2003-11-13 | Slattery Charles Wilbur | Human milk produced by human mammary tissue implanted in non-human host animals and uses thereof |
| AU2003247354A1 (en) | 2002-04-24 | 2003-11-10 | Intermediate ingredient for dairy product manufacturing and method of making the same | |
| FI115752B (fi) | 2002-05-14 | 2005-07-15 | Valio Oy | Menetelmä käytettäväksi vähälaktoosisen tai laktoosittoman maitotuotteen valmistamiseksi |
| US6910594B2 (en) * | 2002-11-19 | 2005-06-28 | The First Years Inc. | Method and apparatus for storing milk |
| US20050175759A1 (en) * | 2004-02-09 | 2005-08-11 | Atul Singhal | Newborn infant formulas and feeding methods |
| US8815279B2 (en) * | 2003-02-10 | 2014-08-26 | University College London | Baby feeding formula and system |
| US7951410B2 (en) * | 2003-04-14 | 2011-05-31 | Mead Johnson Nutrition Company | Enteral compositions containing caseinoglycomacropeptide having an enhanced concentration of sialic acid |
| US7867541B2 (en) * | 2003-04-14 | 2011-01-11 | Mead Johnson Nutrition Company | Compositions and methods of formulation for enteral formulas containing sialic acid |
| ITPR20030047A1 (it) | 2003-06-19 | 2004-12-20 | Parmengineering S R L | Procedimento di trattamento del latte. |
| CN1863463B (zh) | 2003-06-23 | 2011-05-04 | 雀巢技术公司 | 用于促进肠道屏障成熟的营养组合物 |
| CN1842277A (zh) | 2003-06-24 | 2006-10-04 | 堪萨斯大学医学中心 | 婴儿配方食品 |
| JP3894168B2 (ja) * | 2003-07-15 | 2007-03-14 | トヨタ自動車株式会社 | 動力出力装置およびその制御方法並びに自動車 |
| NZ527434A (en) | 2003-08-07 | 2006-03-31 | Fonterra Co Operative Group | Production of protein composition from a dairy stream and its use as an ingredient in the manufacture of a cheese |
| US20060229256A1 (en) * | 2003-09-26 | 2006-10-12 | Bristol-Myers Squibb Company | Enternal administration of arginine and glutamine for abnormal vascular proliferation |
| WO2005051088A2 (en) | 2003-11-12 | 2005-06-09 | Abbott Laboratories | Iron-containing human milk fortifier with improved antimicrobial properties |
| JP2008500271A (ja) * | 2003-10-14 | 2008-01-10 | ザ・プロウボウスト・フェロウズ・アンド・スカラーズ・オブ・ザ・カレッジ・オブ・ザ・ホリー・アンド・アンデバイデッド・トリニティ・オブ・クイーン・エリザベス・ニア・ダブリン | 免疫介在性疾患の治療および／または予防におけるアデニル酸シクラーゼ |
| US20050181095A1 (en) | 2004-02-18 | 2005-08-18 | Dominion Nutrition, Inc. | Concentrated-protein food product and process |
| CA2557927A1 (en) | 2004-03-04 | 2005-09-15 | Htl High-Tech Lipids Ltd. | Structured triglycerides and emulsions comprising same |
| US20050214358A1 (en) * | 2004-03-23 | 2005-09-29 | Riken | Composition for promoting development of nervous system |
| AU2005282182A1 (en) | 2004-09-10 | 2006-03-16 | Medela Holding Ag | Human milk fortifiers and methods for their production |
| EP1637043A1 (en) | 2004-09-17 | 2006-03-22 | Medela Holding AG | Human milk fortifiers and methods for their production |
| EP1787114A1 (en) | 2004-09-10 | 2007-05-23 | Medela Holding AG | Method for analysing and treating human milk and system therefore |
| US20060115558A1 (en) | 2004-11-30 | 2006-06-01 | Jean-Claude Lamothe | Method of production and control of animal derived food products and derivatives thereof |
| CA2537452C (en) | 2005-03-09 | 2013-12-24 | Abbott Laboratories | Concentrated human milk fortifier liquid |
| US20060233915A1 (en) | 2005-04-15 | 2006-10-19 | Bristol-Myers Squibb Company | Liquid nutritional product to supplement human milk |
| CN101212911B (zh) * | 2005-07-01 | 2012-12-05 | 努特里希亚公司 | 含水解的蛋白质的婴儿营养品 |
| WO2007035870A2 (en) * | 2005-09-20 | 2007-03-29 | Prolacta Bioscience, Inc. | A method for testing milk |
| EP2063722B1 (en) | 2006-08-30 | 2017-05-03 | Prolacta Bioscience, Inc. | Methods of obtaining sterile milk and compositions thereof |
| CA2706722C (en) | 2006-11-29 | 2016-01-12 | Prolacta Bioscience, Inc. | Human milk compositions and methods of making and using same |
| US8377445B2 (en) | 2006-12-08 | 2013-02-19 | Prolacta Bioscience, Inc. | Compositions of human lipids and methods of making and using same |
| US20080254165A1 (en) | 2007-04-12 | 2008-10-16 | Rashid Patel | Novel manufacturing process for milk acid |
| US20090181848A1 (en) | 2007-07-06 | 2009-07-16 | Ep Minerals, Llc | Crystalline silica-free diatomaceous earth blended filter aids and methods of manufacturing the same |
| US20100069716A1 (en) | 2008-09-12 | 2010-03-18 | Yem Chin | Flexible guide conduit |
| JP5948964B2 (ja) | 2012-02-29 | 2016-07-06 | 富士ゼロックス株式会社 | 画像読取制御装置、画像読取装置、画像形成装置、及びプログラム |
-
2006
- 2006-09-20 WO PCT/US2006/036827 patent/WO2007035870A2/en not_active Ceased
- 2006-09-20 CA CA002623483A patent/CA2623483A1/en not_active Abandoned
- 2006-09-20 EP EP06815100A patent/EP1926834A4/en not_active Withdrawn
- 2006-09-20 BR BRPI0616323-8A patent/BRPI0616323A2/pt not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-03-20 US US12/052,253 patent/US7943315B2/en active Active
-
2011
- 2011-04-05 US US13/079,932 patent/US8278046B2/en active Active
-
2012
- 2012-08-23 US US13/592,678 patent/US8628921B2/en not_active Ceased
-
2018
- 2018-09-10 US US16/127,016 patent/USRE48240E1/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US8278046B2 (en) | 2012-10-02 |
| US20110311689A1 (en) | 2011-12-22 |
| WO2007035870A3 (en) | 2007-11-01 |
| US7943315B2 (en) | 2011-05-17 |
| US20130064940A1 (en) | 2013-03-14 |
| EP1926834A4 (en) | 2009-04-22 |
| US8628921B2 (en) | 2014-01-14 |
| USRE48240E1 (en) | 2020-10-06 |
| CA2623483A1 (en) | 2007-03-29 |
| WO2007035870A2 (en) | 2007-03-29 |
| EP1926834A2 (en) | 2008-06-04 |
| US20080227101A1 (en) | 2008-09-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7943315B2 (en) | Methods for testing milk | |
| Wu et al. | Rapid and/or high-throughput genotyping for human red blood cell, platelet and leukocyte antigens, and forensic applications | |
| JP6302048B2 (ja) | 次世代システムを用いるｈｌａ遺伝子アンプリコンのディープシーケンシングにより混合物を定量解析することによる固形臓器移植片拒絶の非侵襲的早期検出 | |
| CZ293278B6 (cs) | Způsob přípravy komplexních DNA methylačních peptidových map | |
| CN106029903A (zh) | 用于鉴定基因的等位基因的方法和探针 | |
| JP2023116700A (ja) | 主要組織適合遺伝子複合体一塩基多型 | |
| JP2016516449A (ja) | Ｈｌａマーカーを使用する母体血液中の胎児ｄｎａ分率の決定方法 | |
| US20260125758A1 (en) | Major histocompatibility complex single nucleotide polymorphisms | |
| RU2837865C1 (ru) | Способ секвенирования экзонов гена HLA-DPA1 и набор синтетических олигонуклеотидов для его реализации | |
| JP2008220311A (ja) | Ｈｌａ−ｂローカスにおける新規アリル | |
| HK40093223A (en) | Major histocompatibility complex single nucleotide polymorphisms | |
| HK1228467B (en) | Major histocompatibility complex single nucleotide polymorphisms | |
| HK1228467A1 (en) | Major histocompatibility complex single nucleotide polymorphisms | |
| HK1228466A1 (en) | Major histocompatibility complex single nucleotide polymorphisms |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B08F | Application dismissed because of non-payment of annual fees [chapter 8.6 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE A 5A ANUIDADE. |
|
| B08K | Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE AO DESPACHO 8.6 PUBLICADO NA RPI 2161 DE 05/06/2012. |