BRPI0616448A2 - método de tratar e de profilaxia de pancreatite, método de induzir gene ho e método de tratamento ex vivo de pancreatite - Google Patents
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Abstract
MéTODO DE TRATAR E DE PROFILAXIA DE PANCREATITE, MéTODO DE INDUZIR GENE HO E METODO DE TRATAMENTO EX VIVO DE PANCREATITE. A presente invenção apresenta um método de tratar pancreatite compreendendo administrar a um humano em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de hemina. A administração de hemina é, de preferência, parenteral. Em outro aspecto, a presente invenção apresenta um método de profilaxia de pancreatite compreendendo administrar a um humano em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de hemina. Em ainda outro aspecto, a presente invenção contempla um método de induzir um gene HO compreendendo administrar a um humano em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz indutora de HO de hemina. De preferência, o gene HO é o gene HO-1. Em ainda outro aspecto, a presente invenção contempla um método de induzir um gene HO em leucócitos para recrutamento ao pâncreas para tratar pancreatite compreendendo administrar a um humano em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz indutora de HO de hemina. Em outra modalidade, a presente invenção contempla um método de induzir um gene HO em leucócitos para recrutamento ao pâncreas para profilaxia de pancreatite compreendendo administrar a um humano em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz indutora de HO de hemina. Em ainda outro aspecto a presente invenção proporciona um método de tratamento ex vivo de pancreatite compreendendo proporcionar leucócitos sangüíneos periféricos seguido de contato com hemina para formar leucócitos sangüíneos periféricos induzidos, depois, infundir os leucócitos sangüíneos periféricos induzidos em um humano em necessidade do mesmo.
Description
MÉTODO DE TRATAR E DE PROFILAXIA DE PANCREATITE, MÉTODO DEINDUZIR GENE HO E MÉTODO DE TRATAMENTO EX VIVO DE PANCREATITE
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A pancreatite aguda é uma doença fortementedebilitadora, por vezes letal em humanos. A maioria dasterapias é auxiliar e visa efeitos hemodinâmicos tais como adesidratação com remoção de fatores precipitantes queincluem, entre outros, álcool ou cálculos de obstruçãobiliares. Banks, P.A., 1997. Practice guidelines in acutepancreatitis. Am.J. Gastoenterol. 92:377-386; Baron, T. H eMorgan, D.E. 1999. Acute necrotizing pancreatitis. N. Eng. J.Med. 340:1412-1417. Existe, portanto, uma necessidade sentidahá muito tempo por uma nova terapia para o tratamento depancreatite que forneça além de cuidados paliativos. Existetambém uma necessidade por agentes efetivos que possam serutilizados como profilaxia de pancreatite em pacientes dealto risco.
A hemina supra-regula HO-1, uma enzima induzida porstress envolvida na proteção de uma variedade de lesões,enquanto sua isoforma HO-2 relacionada é expressa de formaconstitutiva. Poss, K.W. e Tonegawa, S.1997. É necessáriaheme oxigenase-1 para reutilização do ferro pelos mamíferos.Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 94: 10919-10924, Soares, M.P.,Lin, Y., Anrather, J., Csizmadia, E., Takigami, K., Sato, K.,Grey, S.T., Colvin, R.B., Choi, A.M., Poss, K.D., et al.1998.Expression of heme oxygenase-1 can determine cardiacxenograft survival. Nat.Med.4:1073-1077; Lee, T.S., e Chau,L.Y., 2002. Heme oxygenase-1 mediates the anti-inflammatoryeffect of interleukin-10 in mice. Nat. Med. 8: 240-250;Otterbein, L.E., Soares, M.P., Yamashita, K. e Bach, F.H.2003. Heme oxygenase-1: unleashing the protective propertiesof heme. Trends Imunol.24: 449-455. Durante, W.2003. Hemeoxygenase-1 in growth control and its clinicai application tovascular disease. J. Cell. Physiol., 195:373-382. Sikorski,E.M., Hock, T., Hill-Kapturczak, N. e Agarwal, A.2004. Thestory so far: Molecular regulation of the heme oxygenase-1gene in renal injury. Am. J. Physiol. Renal Phisiol.286:F425-441. Tehunen, R.Marven, H.S. e Schmid, R.1968. The enzymaticconversion of heme to bilirubin by microsomal herae oxygenase.Proc. Natl. Acad. Sei.U.S.A. 61:748-755. Biliverdina é entãoreduzida para bilirrubina por biliverdina reduetase. HO-I(32kDa; também referida como proteína-32 de choque térmico) eHO-2 (36kDa) são os únicos produtos de gene que partilhamaproximadamente 40% de identidade ao nivel de aminoácido.Otterbein, L. E. e outros, Trends Imunol. 24:449-455;Sikorski, Ε. M. e outros. Am. J. Physio. Renal Phisiol.286:F425-441. 0 papel de HO-I ou hemina no pâncreas exócrinoe sua modulação potencial de lesão pancreática sãodesconhecidos. As únicas descrições de HO-I no pâncreasexócrino são dois relatórios de 1977 que demonstram a induçãode HO-I em pancreatite de camundongos mediada por caurelin eem células acinar de ratos AR42J expostas a H2O2 ou CdCl2. Fu,K., Sarras, M.P., Jr., De Lisle, R.C., e Andrews, G.K.1977.Expression of oxidative stress-responsive genes and cytokinegenes during caerulein-induced acute pancreatitis. Am. J.Physiol.273:G696-7 05; Sato, H., Siow, R.C., Bartlett, S.,Taketani, S., Ishii, T., Banai, S., Mann, E.1977. A expressãodas proteínas de stress heme oxigenase-1 e 2 em pancreatiteaguda e ilha pancreática betaTC3 e células acinar AR42J.FEBSLett. 405:219-223. Camundongos sem HO-I desenvolvem anemia eelevados teores de ferro nos tecidos com conseqüentes danosoxidativos no fígado, glomerulonefrites e esplenomegalia.Estes camundongos apresentam > 80% de letalidade embrionáriae a maior parte dos camundongos sobreviventes morrem noperíodo de 6 meses devido à falência presumida múltipla dosórgãos. Poss, K.D., Tonegawa, S., Proc. Natl. Acad.Sei.U.S.A. 94:10919-10924; Soares, M.P., e outros, Nat.Med. ,4:10731077; Yet, S.R., Perrela, M.A., Layne, M.D.,Hsieh, C.M., Maemura, K., Kobzik, L., Wiesel, P., Christou,H., Kourenbanas, S., e Lee, M.E.1999. Hipoxia induz à severadilatação ventricular direita e enfarte em camundongosdesprovidos de heme oxigenase-1. J. Clin. Invest.103:R23-29.Existe ainda um caso único reportado de deficiência de HO-Iidentificada em uma criança que morreu aos 6 anos de idadecom doença renal e hemorragia intracraniana. Yachie, A.,Niida, Y., Wada, T., Igarashi, N., Kaneda, H., Toma, T., Ohta, K., Kasahara, Y., e Koizumi, S.1999. Estresse oxidativoprovoca o aumento de danos nas células endoteliais emdeficiência de heme oxigenase-1 em seres humanos. J. Clin.Invest. 103:129-135. Kawashima, A., Oda, Y., Yachie, A.,Koizumi, S., e Nakashini, 1.2002. Heme oxygenase-1 deficiency: the first autopsy case. Hum. Pathol. 33:125-30. 0efeito da ausência de HO-I em humanos ou camundongos édesconhecido na patologia pancreática.
A hemina é a fração prostética para uma faixa ampla deproteínas que exerce papel essencial na distribuição deoxigênio, função mitocondrial, e transdução de sinais queincluem a hemoglobina, citocromas, sintases de óxido nitrosoe endoperóxido de prostaglandina, catalases e peroxidases.Várias formulações de hemina, incluindo hematina e outrasformulações intravenosas (por exemplo, pan-hematina) estãoatualmente disponíveis e têm sido usadas em pacientes desde adécada de 1970 com relatos de tratamentos bem sucedidos deporfíria aguda e efeitos colaterais mínimos, para controlarfalha no aloenxerto de fígado devido à recorrência deprotoporfiria eritropoiética e em pacientes de talassemia intermédia. Tenhunen,R., Mustajoki, P.1998. Acute porphyria:treatment with heme. Semin.Li ver.Dis.18:53-55; Delon, E.S.,Szczepiokorwski,Z.M., Dzik, W.H., Graeme-Cook,F., Ades, A,Bloomer, J.R., Cosimi, A.B., e Chung, R.T. 2002. Treatment ofrecurrent allograft dysfunction with intravenous hematinafter liver transplantation for erythropoieticprotoporphyria. Transplantation. 73:911-915; Rund, D., eRachmilevitz, E.2000. New trends in the treatment of beta-thalassemia. Crit. Rev. Oncol. Hematol.33:105-118; Anderson,K.E., Bloomer, J.R., Bonkovsky, H.L., Kushner, J.P.,Pierach,C.A., Pimstone, N.R., e Desnick, R.J. 2005.Recommendations for the diagnosis and treatment of the acuteporphyrias. Rnn. Inter. Med. 142:439-50. A hemina também é umagente indicado para induzir HO-I em diversas culturas decélulas testadas e in vivo. Sato, H. e outros, FEBS. Lett.,405:219-223; Ishikawa, K., Sugawara, D., Wang, X., Suzuki,K.,Itabe, H., Maruyama, Y., e Lusis, A. J. 2002. A hemeoxigenase-1 inibe formação de lesão de arteriosclerose emcamundongos de nocaute receptores de Idl. Circ. Res. 88:506-512; Kanakiriya, S.K., Croatt, A.J., Haggard, J.J.,Ingelfinger, J.R., Tang, S.S., Alam, J. e Nath, K.A. 2003.Heme: a novel inducer of MCP-I through HO-dependente and HO-independent mechanisms. Am. J. Phisiol. Renal Physiol. 284:F546-554; Alam, J., Killeen, G., Gong, P., Naquin, R., Hu,B., Stewart, D., Ingelfinger, J.R., e Nath, K.A. 2003. Hemeativa a heme oxigenase-1 em células renais epiteliais pelaestabilização de Nrf2. Am. J. Physiol. Renal Physiol.2.84: F743-754. Graça-Souza, Α. V., Arruda, M.A., de Freitas,M.S. Barja-Fidalgo, C. e Oliveira, P.L.2002. Neutrophilactivation by heme: implications for inflammatory processes.Blood. 99:4160-4165.
A conversão do tripsinogênio para ativar tripsina nointerior de células acinar pancreáticas é um eventoimportante no desenvolvimento de pancreatite aguda. Além doque, tem sido bem demonstrado que infiltrar neutrófilossignificativamente contribui para essa ativação da tripsinapancreática. Gukovskaya, A.S., Vaquero, E., Zaninovic, V.,Gorelik, F.S., Lusis, A.J., Brenan, M.L., Holland, S.,ePandol, S.J.2002. Neutrófilos e Oxidase de NADPH mediamativação de tripsina intrapancreática em pancreatite agudaexperimental de murino. Gastroenterology. 122:974-984;Entretanto, os mecanismos e sinais que mediam os neutrófilosou outro recrutamento de célula inflamatória (como osmacrófagos) para o pâncreas são menos bem entendidos. Édemonstrado aqui um novo papel protetor para hemina emtratamento de pancreatite experimental de camundongos e queapresenta uma base mecânica celular para tal proteção. Estepapel é mediado por HO-I e leva ao recrutamento de macrófagosque expressam HO-I para o pâncreas.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Em um aspecto, a presente invenção apresenta um métodopara tratamento de pancreatite compreendendo administrar a umhumano em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz dehemina. A administração de hemina é preferencialmenteparenteral. 0 termo "parenteral", como utilizado aqui, é dadoem seu sentido comum e costumeiro no campo das vias deadministração de drogas farmacêuticas. De acordo com o Manualde Padrões de dados de Avaliação e Pesquisa de Drogas do Foodand Drugs Adminstration's Center (Número de elemento de dadosCDER C-DRG-O 0301; Nome do elemento de dado: Via deadministração) ^parenteral' refere-se à administração porinjeção, infusão ou implantação. Infusão e injeção incluem aadministração por veia (intravenosa), por artéria (intra-arterial), muscular (intramuscular), sob a pele (subcutânea),e no peritônio (intraperitoneal). Qualquer via deadministração apropriada, estabelecida no documento da Foodand Drug Administration acima mencionado, estáespecificamente no escopo da presente invenção e nada oraabordado será interpretado como limitando de algum modoaquelas vias de administração que seriam úteis com relação àadministração da hemina da presente invenção.
Em outro aspecto, a presente invenção apresenta ummétodo de profilaxia de pancreatite compreendendo administrara um humano em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz dehemina. Como ora utilizado, a profilaxia é considerada em seusentido ordinário e costumeiro na técnica médica, geralmentedefinido como prevenção de ou tratamento de proteção para umadoença, neste caso pancreatite.
Uma quantidade eficaz de hemina é a quantidade definidapara tratar ou realizar profilaxia em pancreatite. Umaquantidade eficaz de hemina pode oscilar entre 1 e 6mg/kg/dia ou, preferencialmente 1 e 4 mg/kg/dia, embora umaquantidade eficaz de hemina possa ser prontamente determinadapor um tratamento por um médico que trata ou assiste,considerando, entre outras coisas, a idade do paciente, aextensão da doença, e as condições gerais médicas dopaciente. Conseqüentemente, está bem compreendido no alcancede uma pessoa com conhecimentos comuns na técnica, determinaruma quantidade eficaz de hemina para profilaxia depancreatite, ou uma quantidade eficaz de hemina paratratamento de pancreatite, de acordo com os ensinamentos dapresente invenção.
Em ainda outro aspecto, a presente invenção contempla ummétodo de induzir um gene HO, compreendendo administrar a umhumano em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz indutorade HO, de hemina. Uma quantidade eficaz indutora de HO, dehemina, pode oscilar entre 1 e 6 mg/kg/dia, preferencialmentede 1 e 4 mg/kg/dia, mas como abordado anteriormente, umaquantidade eficaz indutora de HO, de hemina pode serprontamente determinada por um prático com conhecimentoscomuns na técnica baseado nas considerações do humano a sertratado.
Preferencialmente, o gene HO é o gene HO-I. Comoutilizado aqui, a indução ou supra-regulação de um gene HO édado pelo seu sentido ordinário e costumeiro, que incluiligar ou surgir a expressão de um gene HO por mecanismosgenéticos que não estão compreendidos no escopo da presenteinvenção. Aqueles mecanismos genéticos não devem serinterpretados como limitando qualquer teoria particular deindução ou supra-regulação de um gene HO. A indução ou supra-regulação de um gene HO pode ser prontamente determinada pormétodos e ensaios discutidos em outra parte na presenteinvenção.
Em ainda outro aspecto, a presente invenção contempla ummétodo de indução do gene HO em leucócitos para recrutamentopara o pâncreas para o tratamento de pancreatitecompreendendo administrar a um humano em necessidade do mesmouma quantidade eficaz indutora de HO, de hemina. Comoutilizado aqui, o termo leucócito é dado em seu sentidoordinário e costumeiro, geralmente referente a qualquer devários tipos de células sangüíneas, incluindo granulócitos,incluindo neutrófilos (heterófilos), basófilos e eosinófilos,monócitos (incluindo macrófagos); e linfócitos. 0recrutamento ou migração ao pâncreas dos leucócitos nos quaisum gene HO foi induzido ou supra-regulado é realizado pelomecanismo que está fora do escopo da presente invenção e nãodeve ser interpretado como limitante da invenção ou dequalquer mecanismo ou teoria especifica de recrutamento oumigração dos leucócitos ao pâncreas.
Em outra modalidade, a presente invenção contempla ummétodo de induzir um gene HO em leucócitos para recrutamentoao pâncreas para profilaxia de pancreatite compreendendoadministrar a um humano em necessidade do mesmo umaquantidade eficaz indutora de HO, de hemina.
Em ainda outro aspecto, a presente invenção apresenta ummétodo de tratamento ex vivo de pancreatite compreendendo umaprimeira etapa de proporcionar leucócitos sangüíneoperiféricos. A provisão de leucócitos sangüíneo periféricos("PBLs") pode ser realizada por técnicas bem conhecidas porpráticos com conhecimentos comuns na técnica, incluindo, porexemplo, a remoção intravenosa de leucócitos da vasculaturade sangue periférico de um paciente por punção venosa. OsPBLs são separados e isolados de outros constituintes dosangue por, por exemplo, centrifugação de gradiente dedensidade com polisacarose seguido pela remoção da camada deleucócitos.
Os assim obtidos linfócitos sangüíneos periféricos sãocolocados a seguir em contato com hemina para formarlinfócitos sangüíneos periféricos induzidos. Os PBLs sãocontatados com hemina por métodos bem conhecidos daqueles comconhecimentos comuns na técnica, incluindo misturar PBL comhemina in vitro por um tempo e sob condições apropriadas parainduzir os PBLs. Mais especificamente, aqueles elementosgenéticos dos PBLs, como o gene HO (e mais preferencialmenteo gene HO-1) são induzidos ou supra-regulados, como discutidoem outra parte aqui.Após os PBLs serem induzidos pela hemina, os PBLs sãoentão infundidos em um humano em necessidade do mesmo. OsPBLs são infundidos em humanos em necessidade do mesmo,utilizando técnicas conhecidas por aqueles com conhecimentoscomuns na técnica, incluindo a administração parenteral dePBLs em humanos. Hemina ou outros agentes podem ser pré-administrados ou co-administrados com os PBLs induzidos, demodo a promover migração de PBLs induzidos ao pâncreas.Humanos que necessitam de PBLs induzidos por hemina incluemhumanos que sofrem de pancreatite, que estejam sob risco depancreatite, ou exigem profilaxia contra pancreatite.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Fig.l - Efeito da hemina ou dano pancreático na induçãode HO-I e inibição do dano pancreático pela hemina (A,B)homogeneizados totais de tecidos foram obtidos a partir depâncreas de camundongos alimentados com dieta deficiente decolina (CDD) ou injetados com caerulein. Dois camundongoscombinados em sexo e idade foram utilizados para cada pontode tempo. Homogeneizados foram testados por blotting,utilizando anticorpos para H0-1 ou H0-2. (C) Foramministradas injeções intraperitoneais de hemina noscamundongos (3 camundongos/condição) (4x durante uma semanaou 8x durante duas semanas). Dois camundongos de "controle"foram injetados somente com veiculo. Homogeneizadospancreáticos foram então obtidos e blotted com anti-H0-l/2.(D,E) Os camundongos foram injetados com solução salina,hemina ou veiculo (8 camundongos/grupo) 3x (setas) seguido dealimentação com CDD por 3 dias e então colhido o pâncreas.HO-I e HO-2 foram analisados por blotting de homogeneizadospancreáticos (3 camundongos/grupo). 0 número de camundongos,em cada coorte de 8, que morreu é mostrado e a diferença desobrevivência foi significante (p<0,03) quando comparado comos controles (solução salina + veiculo) versus camundongosque foram injetados com hemina. É mostrada uma representativacoloração de hematoxilina e eosina de pâncreas doscamundongos que sobreviveram à alimentação com CDD (escala debarras = 50 pm) . Observar a marca do edema do pâncreas (E) ea necrose (N) nos camundongos injetados (não-mostrado) comsolução salina e veiculo, quando comparado ao grupo xhemina' .Fig.2 — Efeito da hemina sobre a pancreatite induzidapor caerulein e suas complicações pulmonares
(A,B) Os camundongos foram injetados via intraperitonealcom hemina (H) ou veiculo (V; 7 camundongos/grupo) em diasalternados (3x; setas) seguido por injeções com soluçãosalina (Sal) ou Caerulein (Cae) a cada hora (7x; setas) e 12horas após a primeira injeção de Sal ou Cae são colhidos opâncreas e os pulmões. Soros foram colhidos para medição deamilase/lipase. (C-E) Tecidos pancreáticos e pulmonares (dospainéis, AeB) foram utilizados para determinar a tripsina(pmol/mg de proteína) e atividades da enzima demieloperoxidase (MPO; ng/mg tecido molhado) e para avaliar aextensão do dano do tecido. Os dados são apresentados comomédia ±SD. É mostrada uma coloração de hematoxilina e eosinarepresentativa do pulmão (escala de barras = 50 pm). Observara hemorragia marcada e o colapso alveolar no veículo (a)comparada a camundongos pré-tratados com hemina (b) quereceberam caerulein.
Fig.3 - Hemina aumenta macrófagos pancreáticos HO-I+ emassociação à indução de MCP-I e MIP-Ia (A) Pâncreas decamundongos alimentados com CDD tiveram tripla coloraçãoutilizando anticorpos para HO-I (a), o marcador de macrófagoF4/80 (b) e o marcador de granulócito Gr-I (c) Escala debarras em painel d=20pm. (B) Camundongos foram tratados, viaintraperitoneal com hemina (H) ou veículo (V) uma vez (Hxl)ou 3x (Hx3, Vx3), durante o período de uma semana, seguido dealimentação com CDD ou ração regular por 3 dias. Os pâncreasforam coletados seguidos de coloração e contagem demacrófagos F4/80+ em 10 campos de energia elevadaselecionados de forma aleatória. São mostradas a média ±SD (3camundongos/grupo) e o valor-p para as comparações indicadas.
(C) Hemina (H) ou Veículo (V) foi injetado, viaintraperitoneal uma vez seguida de coleta de pâncreas após24h. Um grupo de controle iC' não injetado também foiincluída. Níveis de mRNA do pâncreas foram estimados dogrupo de 3 camundongos como uma relação da quimiocinaindicada para β-actina (média ±SD). Mudanças nos níveis deRANTES/MIP-2 mRNA não foram significantes após aadministração de V ou H.
Fig. 4 - Efeito de hemina em macrófagos in vivodirecionando-se ao pâncreas utilizando imageamento debioluminescência. (A) Esquema experimental de transferênciade célula. Hemina (H) foi injetada 3x via intraperitoneal, emcamundongos superexpressos com luciferase (+/+), entãocélulas peritoneais foram colhidas e macrófagos selecionadosutilizando contas magnéticas anti-Mac-1. Células duplo-positivas Luciferase/Mac-1 foram transferidas, viaintraperitoneal para camundongos tipo-selvagem (luciferase -/-) que foram pré-injetados com uma dose de H ou V (veículo),24h antes da transferência. Esta injeção de hemina énecessária para induzir as quimiocinas pancreáticas (Fig.3C)(B) Imagens vivas de camundongos anestesiados receptoresintactos foram extraídas 5 min (a) ou 24h (b) após atransferência da célula. Os fígado e pâncreas foram removidos24h seguido por imageamento (c). A barra de escala deintensidade do sinal é mostrada abaixo de cada imagem. (C)
Uma cópia dos pâncreas mostrada na imagem c do painel B (dosreceptores recebendo células doadoras de animais injetados-H)foi colorida duas vezes com anticorpos para luciferase eF4/80. Dupla-coloração similar de pâncreas a partir deanimais receptores recebendo células doadoras de camundongosinjetados com V mostrou coloração antecedente (e.g. inserçãodo painel a para a coloração antiluciferase). Barra no painelο=50μπι.
Fig.5 - Efeito protetor das células peritoneaisiniciadas com hemina em pancreatite induzida por CDD. (A)
Células peritoneais são isoladas de camundongos pré-tratadoscom hemina ΛΗ' ou veículo xV' (3 injeções destacadas porsetas) daí transferidas, via intraperitoneal para a mesmaninhada receptora simples seguida por iniciação imediata dealimentação CDD. (B-D) Após 2,5 dias de CDD, o soro foicoletado para medir amilase e BUN (média ±SD, grupo de 6camundongos). 0 pâncreas também foram coletados paraavaliação do tecido grossa e para coloração e marcaçãohistológica. A barra no painel ϋ=50μπι, Vac = vacúolos, E =edema, Hem = hemorragia, ml e m2 = tecidos pancreáticos dedois camundongos separados por grupo H/V.
Fig.6 - Inibição do efeito protetor de célulasperitoneais iniciadas por hemina utilizando HO-I knock downin vivo. (A, B) Células peritoneais foram isoladas decamundongos tratados com hemina que também foram injetadasvia peritoneal em dias alternados com solução salina (-), HO-1 siRNA (constructos #1 e #2), ou controle de mistura(Sc)siRNA. Células peritoneais foram então utilizadas paraexaminar níveis de HO-I e H0-2 por imunoblotting. (C,D)Células peritoneais foram colhidas de camundongos injetadoscom siRNA hemina/misturado ou siRNA HO-I de hemina/constructo#2 e daí transferidas para a mesma ninhada receptora simplesseguida de imediata iniciação de alimentação CDD. Em 2,5 d dealimentação, os pâncreas foram coletados para marcaçãohistológica. Dados para marcação histológica são apresentadoscomo média ±SD (n= 5-6/grupo) e são 6,4 ± 1,7 (misturados) e12,7 ±4,5 (H0-1 siRNA).(E) Os pâncreas dos painéis C,D foramduplamente coloridos utilizando anticorpos para F4/80 e H0-1(barra de escala = 20 μπι) .
Fig.7 - Diagrama Esquemático do efeito da hemina naindução de HO-I em camundongos e direcionamento de macrófagosperitoneais ao pâncreas A hemina provoca a expressão dediversas quimiocinas do pâncreas e aumenta os macrófagosperitoneais e sua expressão H0-1. Os macrófagos peritoneaisque superexpressam HO-I direcionados ao pâncreas, e estãoaptos a apresentar proteção significante contra danospancreáticos.
Fig. 8 - Expressão de HO-I e indução mediada por heminaem células e tecidos de camundongos. Os camundongos foraminjetados 3x durante 7 dias com veiculo ou hemina (grupo de 2camundongos) seguido de coleta de órgãos indicados e célulase dai a preparação de homogeneizados de células/tecidostotais. As concentrações de proteína dos homogeneizados forammedidas, seguido da separação de SDS-PAGE (40μιτι deproteína/raia) e então blotting utilizando anticorpos anti-HO-I. Observar a indução de HO-I em células peritoneais, dofígado, pâncreas e cólon (sendo a mudança mais proeminente nopâncreas) , mas não nas da medula óssea, baço ou cérebro. Osníveis de HO-2 não se alteraram após a administração dehemina em quaisquer dos tecidos (não-mostrado).
Fig.9 - A indução de hemina de HO-I pancreática ocorreem células não epiteliais de camundongos alimentados com CDD.Os pâncreas de camundongos pré-tratados com hemina seguido de3 dias de alimentação com CDD foram isolados, seccionados eentão coloridos duplamente utilizando anticorpos HO-I (a, d eg) e polipeptídeo de queratina 8 (marcador epitelial, b)vimentina (marcador mesenquimal, e) ou MR7/18 (marcadorendotelial, h) . A fusão das imagens indicadas é mostrada nospainéis à direita. Barra de escala no painel ϊ=20μιη.Coloração de HO-I do pâncreas de camundongos tratados somentecom veículo somente (sem CDD) proporcionou coloraçãoantecedente (inserção do painel a).
Fig.10 - Modos de administração de pan-hematina (pH)como uma modalidade de tratamento profilático ou terapêuticopotencial em pancreatite. São mostrados resultados do westernblots do lisado pancreático em t=0, 2h, 4 h após tratamentoúnico de pH dado tanto via intraperitoneal (ip) quanto viaintravenosa (iv). Tanto iv quanto ip supra-regulam HO-Irapidamente, enquanto HO-2 permanece inalterado.
Fig.ll - Efeito da injeção de pH em células peritoneaiscom o passar do tempo. A análise citométrica do fluxo dascélulas peritoneais é mostrada após uma única injeção de pHdada iv ou ip. Macrófagos peritoneais residentes(F4 / 8 OhiCDl Ibhi) são diminuídos após a injeção de pHcompatível com a saída destas células e surgimento nopâncreas. Este efeito é demorado para o grupo tratado ivquando comparado ao tratado com o ip com o passar do tempo.
F±g.l2 - Coloração imunohistoquímica do pâncreas. Ospâncreas foram isolados de camundongos tratados com pH ip ouiv com o passar do tempo. Seções congeladas foram fixadas comacetona e coloridas com anticorpos anti-HO-1. Consistente comas descobertas por western blot, o pH provoca influxo decélulas de HO-I+ (destacadas por setas nos painéis direito edo meio) ao pâncreas (ampliação 20x).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção oferece uma nova abordagem deterapia imuno-mediada através do efeito não-antecipado dahemina no recrutamento de leucócitos para o pâncreas. Baseadoem um modelo de animal de camundongo, de pancreatite, aabordagem terapêutica da presente invenção tem aplicabilidadeem pancreatite de outros mamíferos, especialmente humanos.Nos exemplos apresentados em outra parte na presenteinvenção, dois tipos de transferência de células foramrealizados. Para ambos tipos de experimentos detransferência, os macrófagos iniciados com hemina sãoderivados de camundongos doadores que foram tratados com três(3) doses de hemina (dosagem excessiva reduz a indução de HO-1, Fig.l-C). A diferença do estudo de transferência debioluminescência (Fig.4) e outros experimentos detransferência que envolvem alimentação com CDD (Fig. 5,6) éaquela em que nos experimento relacionados com CDD ainiciação de hemina do camundongo receptor não é necessáriadevido ao efeito do CDD no pâncreas que desencadeiadirecionamento das células transferidas para o pâncreas. Emcontraste, para o experimento de direcionamento dabioluminescência (Fig.4) uma dose única de iniciação dehemina é necessária desde que macrófagos não sejam recrutadospara o pâncreas a menos que os receptores recebam a iniciaçãode hemina que estimula a produção de quimiocina pancreática edesencadeia a migração de macrófagos para o pâncreas. (Fig.3)Notavelmente, a administração de pan-hematina viaintraperitoneal (disponível junto a Ovations Pharmaceuticals,Inc., Deerfield, IL) em camundongos também induz níveiselevados pancreáticos de HO-I. Embora as relevantesquimiocinas in vivo que são envolvidas no recrutamento demacrófagos ao pâncreas permaneçam a serem definidas, umaabordagem terapêutica celular pode também ser prevista, peloque monócitos autólogos ou outras células relevantes podemser ativados por hematina ex vivo seguida de reinfusão.
O benefício demonstrado da hemina ou da terapia decélula ativada por hemina em pancreatite experimental decamundongos é profilático e análogo à utilização em humanosem pacientes de alto risco sendo submetidos acoleangipancreotogramas endoscópicas retrógradas, que podemdesenvolver pancreatite. Maschi, E., Mariani, A., Curioni,S., Testoni, P.A., 2003; Risk factors for pancreatitisfollowing endoscopic retrograde cholangiopancreatography: ameta-analysis. Endoscopy. 35:830-4. Portanto, a hemina ou aterapia celular baseada em hemina pode ser considerada umaprofilaxia para pancreatite iatrogênica potencial, porexemplo, testes médicos necessários ou intervenções comocoleangipancreotografia endoscópica retrógrada.
A presente invenção apresenta um método de tratamento depancreatite pela administração de hemina a um paciente emnecessidade do mesmo. Em uma modalidade, a hemina éadministrada via parenteral. Preferencialmente, a viaparenteral é intraperitoneal. Mais preferencialmente, a viaparenteral é intravenosa.
Em outro aspecto, a presente invenção apresenta ummétodo de prevenção de pancreatite pela administração dehemina a um paciente em necessidade do mesmo. Em umamodalidade, a hemina é administrada via parenteral. Em umamodalidade, a via parenteral é intraperitoneal. Em modalidadepreferencial, a via parenteral é intravenosa.
A dosagem de hemina depende de vários fatores, queincluem a idade do paciente, o peso corpóreo do paciente e ascondições gerais do paciente, com particular foco nas funçõesrenais ou a presença de quaisquer coagulopatias outrombocitopenia. Dosagens de hemina úteis na presenteinvenção podem oscilar de 1 a 5 mg/kg/dia, e maispreferencialmente de 1 a 4 mg/kg/dia.
A hemina pode ser administrada via parenteral,preferencialmente intravenosa ou intraperitoneal. A escolhada via dependerá de fatores considerados pelo médico queassiste, incluindo acessibilidade das vias intravenosas enecessidade de rápida infusão de hemina. Preferencialmente avia de administração é a intravenosa. De maneira alternativaa via de administração é intraperitoneal. Sem desejar selimitar à teoria, considera-se que a administraçãointraperitoneal recruta eficaz e ativamente os macrófagosintraperitoneais que se deslocam ao pâncreas paraproporcionar profilaxia e tratamento contra a pancreatite.
Os estudos apresentados em outra parte da presenteinvenção indicam que CDllb/Mac-1 não desempenham papel namigração das células HO-I+ para o pâncreas e o aumento dascélulas visto no tratamento pode refletir o aumento emmonócitos em circulação. Além disso, o CCR2 pode serimportante no transporte de monócitos/macrófagos protetores'ao pâncreas uma vez que em sua ausência leucócitos pró-inflamatórios em potencial podem tirar proveito sobremonócitos/macrófagos 'protetores' para migrar para o pâncrease provocar danos.
EXEMPLOS
MATERIAIS E MÉTODOS
Hemina, veiculo e anticorpos. A hemina (Sigma, St.Louis, MO) foi dissolvida em hidróxido de amônio a 10% em0, 15 M de NaCl para preparar uma solução de material de 100mg/ml, dai é diluída em 1:40 com 0,15 M de NaCl estéril einjetada em camundongos (10 μΐ/g). Os camundongos injetadoscom veículo receberam uma idêntica solução contendo NH40H semhemina. Os anticorpos utilizados foram direcionados para: HO-Ie HO-2 (StressGen; Victoria, Canadá); vimentina, músculoliso actina e luciferase (NeoMarkers; Fremont,CA); Gr-I eMac-I conjugados com aloficocianina (BD Pharmingen, SanDiego, CA); e FITC-conjugado F4/80 (Serotech; Raleigh, NC).Pan-hematina foi obtido da Ovation Pharmaceuticals,Inc.(Deerfield, IL).
Camundongos e modelos de pancreatite. Os experimentos ecuidados com animais foram realizados de acordo com asdiretrizes institucionais aprovadas. Camundongos Balb/c foramconfinados sob condições livres de patógeno e utilizados emdois modelos estabelecidos de pancreatite. Jensen, R.T.,Lemp, G.F. e Gardner, J.D., 1980 Interaction ofcholecystokinin with specific membrane receptors onpancreatic acinar cells. Prot. Nat. Acad. Sei. U.S.A.77:2079-2083; Lombardi, B., Estes, L.W., e Longnecker, D.Sw1975. Acute hemorrhagic pancreactitis (massive necrosis) withfat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with acholine-deficient diet. Am. J. Pathol. 79:465-480; Algul, HwTando, Tw Schneider, Gw Weidenbach, Hw AdlerfGw e Schmid,R.M. 2002; Acute experimental pancreatitis and NF-kappaN/Relactivation. Pancreatology, 2:503-509; Toivola, D, M,Baribault, Hw Magin, Tw Michie, S.A., e Omary, Μ. B.2000.Simple epithelial keratins are dispensable for cytoprotectionin two pancreatitis models. Am. J. Physio. Gastrointest.LiverPhysiol. 279: G1343-1354; Zhong, Bw Zhou, Qw Toivola,D. Mw Tao, G. Zw Ressurecion, E. Zw e Omary, B. 2004.Organ-specific stress induces mouse pancreatic keratinoverexpression in association with NF-kappaB activation. J.Cel. Sei. 117:1709-1719. Para pancreatite induzida porcaerulin, camundongos combinados em sexo e idade foramdeixados em jejum por 12-16h, mas permitida água à vontade. Aseguir os camundongos receberam sete injeçõesintraperitoneais a cada hora, de solução salina (grupo decontrole) ou 50 μg de caerulin (Research Plus Bayonne, NJ) emsolução salina e foram acompanhados por 12h. Para apancreatite induzida por alimentação com uma dieta deficienteem colina-metionina (CDD), jovens camundongos fêmeas (15-19g) foram deixadas em jejum e a seguir alimentadas com CDD(Harlan Teklad; Madison, WI) suplementadas com 0,5% de DL-etionina (Sigma; St. Louis, MO) ou ração normal (grupo decontrole) por 3 d, e então mudadas para dieta normal por 1, 2ou 5 d.
Procedimentos com animais. Os camundongos sofrerameutanásia por inalação de C02, sendo o pâncreas e os pulmõesrapidamente removidos, divididos em 3-4 pedaços, e o sanguecoletado por punção intracardiaca. Fragmentos individuais depulmão e pâncreas foram imediatamente fixados em formalina a10%, embebidos em OCT (Miles; Eckhart, IN) ou congeladosrapidamente em N2 liquido para análise subseqüente deproteína, enzima e RNA. Toivola, D.M, et al., Am. J. Physiol.Gastrointest. LiverPhysiol. 279:G1343-1354; Zhong, B.,eoutros, J. Cell. Sci., 117:1709-1719. Os tecidos fixos foramselecionados e a seguir coloridos utilizando hematoxilina eeosina (realizado por Hysto-tec Laboratory; Hayward, CA). Acoloração de imunofluorescência foi realizada conformedescrito (29) e imagens foram analisadas utilizandomicroscópio confocal. Lisados totais de tecido forampreparados pela homogeneização em tampão de amostra Lameli eanalisados por SDS-PAGE seguidos de transferência paramembranas para blotting e visualização de proteínas porquimioiluminescência aumentada. A atividade de tripsina foideterminada utilizando um ensaio fluorimétrico e o substratoBoc-Gln-Ala-Arg-MCA (Peptides International, Inc.;Louisville, KY) e comparação com uma curva padrão gerada comtripsina purificada, conforme descrito. Nathan, J. D., Romac,J., Peng, R. Y., Payton, N., McDonald, R. J., e Liddle,R.A.2005. Transgenic expression of pancreatic secretorytrypsin inhibitor-I ameliorates secretagogue-inducedpancreatitis in mice. Gastroenterology, 128:717-27. Paraatividade de MP0, os tecidos do pâncreas e pulmão foramprocessados como descrito (Oruc, N., Ozutemiz, A. 0.,Yukselen, V., Nart, D., Celik, Η. A., Yuce, G., e Bartuk, K.2004; Infliximab: a new therapeutic agent in acutepancreatitis? Pancreas, 28:el-8] seguido pelo uso de um kitde MPO de acordo com as diretrizes do fabricante (Calbiochem;San Diego; CA). A lesão no pulmão após administração decaerulein foi avaliada como anteriormente descrito, com baseem infiltração neutrofilica, edema pulmonar, distensãoalveolar e colapso. Oruc, N. e outros, Pancreas, 28:el-8. Osvalores- P foram calculados para comparações de testes emhistologia, enzimas e soro, utilizando o teste pareado t epara comparações de sobrevivência utilizando o método do qui-quadrado.
Transcrição reversa em tempo real (RT)-PCR. 0 RNA totalfoi isolado do tecido pancreático utilizando um kit comercial(TEL-TEST; Friendswood, TX). CDNA de primeira fita foisintetizado utilizando iniciadores oligo dT e transcriptasereversa SuperScript II (Invitrogen: Carlsbad, CA) . PCRquantitativo em tempo real foi realizado com um Sistema deDetecção Seqüencial ABI Prism 7900 (PEBiosystems; FosterCity, CA), e iniciadores estabelecidos para MCP-1, ΜΙΡ-Ια,MIP-2, RANTES, e β-actina. Zhong, B., e outros, J. Cell Sci.,117:1709-1719; Zhang, Y., McCormick, L. L.,Desai,S. R., Wu,C.,e Gilliam, A.C.2002. Murine sclerodermatous graft-versus-host disease, a model for human scleroderma: cutaneouscytokines, chemokines, and immune cell activation. J.Immunol.168: 3088-3098. Walzog, B., Weinmmann, P., Bommert,K., e Gaehtgens,P. 1999. A role for beta(2) integrins(CD11/CD18) in the regulation of cytokine20 gene expressionof polymorphonuclear neutrophils during the inflammatoryresponse. FASEBf J. 13:1855-1865. Os iniciadores para β-actina foram utilizados como referência do controle interno,e a quantidade de citocina especifica relativa ao transcritode actina foi determinada e relatada como média de ±SD.
Camundongos transgênicos em luciferase e imageamento. Oscamundongos transgênicos com superexpressão de luciferase (emum antecedente FVB/n) e suas contrapartes não transgênicas[Cao, Υ. A., Wagers, A. J., Beilhack, A., Dusich, J.,Bachmann, M. H., Negrin, R. S., Weissmann, I. L., e Contag,C.H.2004. Shifting foci of hematopoiesis duringreconstitution from single stem cells. Proc. Natl. Acad. Sei.U.S.Α.101:221-226] receberam 3 doses de hemina em dias -5, -3e -1. No dia "0", células peritoneais foram colhidas e ascélulas Mac-I+ foram selecionadas utilizando microcontasrevestidas com Mac-I (anti-CD-llb) (Miltenyi Biotec; Auburn,CA). Células duplo-positivas de Luciferase-Mac-I (2xl06)foram transferidos i.p. para camundongos FVB/η do tiposelvagem pré-tratados um dia antes com uma dose de hemina ouveiculo de forma a iniciar direcionamento celular. Imagensbioluminescentes in vivo dos camundongos receptores foramobtidas 5 min e 24h após a transferência de células conformedescrito. Cao, Y.A., e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A.101:221-226. Os camundongos que foram imageados 24h após atransferência foram então mortos seguidos por isolamento dediversos órgãos por imageamento de luciferase e coloração deimunofluorescência.
Transferência de célula peritoneal pré-tratada comhemina em camundongos alimentados com CDD. Célulasperitoneais de camundongos jovens fêmeas Balb/c (15-19g) pré-tratadas com hemina ou veiculo foram colhidas (3 dosesfornecidas diariamente). Células isoladas foram lavadas comPBS, e células equivalentes foram transferidas por i.p. paraanimais da mesma ninhada Balb/c simples, seguido poriniciação de alimentação com CDD. Os camundongos fêmeas foramsacrificados após 2,5 d de alimentação de CDD, seguido deisolamento dos pâncreas (para coloração histológica efluorescência) e do sangue. O soro foi isolado do sanguecoagulado seguido por medição da amilase e BUN utilizandométodos padrões. A severidade de pancreatite foi marcadautilizando critérios histológicos estabelecidos queatribuíram marcas numéricas individuais (l=brando;2=moderado; 3=severo) a edema, inflamação, hemorragia; emarcas alternativas para necrose parenquimal (3=focal,5=sublobular e 7=lobular). Spormmann, H., Sokolovsky, A., eLetko, G.1989. Effect of temporary ischemia upon developmentand histological patterns of acute pancreatitis in the rat.Pathol. Res. Pract.184:507-513.
Transferência de células pré-tratadas com hemina e HO-IsiRNA. Os camundongos foram injetados i.p. em dias alternados(total de 3 injeções) com solução salina ou com duasconstruções siRNA HO-I (2 mg/kg de peso do corpo) ou com umaseqüência de siRNA misturada. A hemina foi injetada em diasintercalados (adicional de 3 injeções). Após 7 dias, célulasperitoneais foram colhidas e analisadas por imunoblottingutilizando anti-corpos para H0-1/2. Uma vez que significanteinibição de H0-1 ocorreu com o constructo #2, o constructo #2foi utilizado para subseqüente transferência de célulasperitoneais (pré-tratadas com hemina + siRNA misturado ou comhemina + HO-I siRNA) para camundongos receptores simples queforam então alimentados com CDD por 2,5 dias seguido deisolamento do pâncreas. Os siRNAs foram sintetizados porDharmacon Research, Inc (Lafayette, CO) e testadospreviamente. Zhang, X., Shan, P., Jian, D., Noble, P.W.,Abraham, N.G., Kappas, A., e Lee, P.J.2004; Small interferingRNA targeting heme oxygenase-1 enhances ischemia-reperfusion-induced Iung apoptosis. J. Biol. Chem. 279:10677-10684. Asseqüências de fita de sentido e anti-sentido dos dois H0-1siRNA e duplex misturados siRNA não especifico foram:
{#l)5'-U0GCUUCCÜUGUACCAUAUdTdT.r(sentido) [SEQ.ID.N0.1] e
5'- AUAUGGUACAAGGAAGCCAdTdT-3' (anti_sentido) [seq. id.N0. 2](#2)5»-GCCACACAGCACÜAUGUAAdTdT-3'(sentido) [SEQ.ID.N0.3] e
5'- UUAC AUAGUGCUGUGUGGCdTdT-3'
e(anti-sentido) [SEQ.ID.NO.4]
(misturado) 5'GCGCGCUUUGUAGGAUUOMTdT-3' (sentido)
[SEO ID NO 5] e
5' -CGAAUCCUAC A AAGCGCGCdTdT-3'
(anti-sentido) [SEQ.ID.NO.6]
Camundongos não tratados foram comparados com os grupostratados com pan-hematina por via intravenosa ouintraperitoneal. Os camundongos também foram tratados comanticorpos Mac-I tanto no momento de ou 1 h antes dotratamento com pan-hematina intravenosa. Além disso,camundongos do tipo selvagem ou CCR2-/-foram tratados compan-hematina ou veiculo. Análises de western blot e imuno-histoquímica (IHC) foram utilizados para determinar aexpressão de HO-I no pâncreas. Análise do fluxo citométrico(FACS) foi utilizada para o fenótipo peritoneal e leucócitossangüíneos.
Ambas, administração intraperitoneal e intravenosa depan-hematina induzem a expressão de HO-I no pâncreas tãorápido quanto 2 horas após sua administração. Utilizando aanálise de FACS, os macrófagos peritoneais residentes(F4/80hiCDllbhi) foram diminuídos em 4 horas no grupoperitoneal e não estavam mais presentes por 12 horas.Similarmente pelo IHC, as células HO-I+ foram identificadasno pâncreas tanto nos grupos tratados intravenoso quantointraperitoneal tão cedo quanto 4 horas e aumentou em númerospor 24 horas. Quando os camundongos foram tratados comanticorpos anti-Mac-1 no momento da administração de pan-hematina (e especialmente administrado 1 hora antes), númerosaumentados de células HO-I+ foram observados no pâncreas 4horas após por IHC. Além do mais, o tratamento com oanticorpo anti-Mac-1 causou acumulação de monócitos nacirculação e não evitou o desaparecimento de macrófagosperitoneais residentes. Surpreendentemente, o tratamentoisolado com pan-hematina provocou pancreatite nos camundongosCCR2-/-. Pan-hematina injetada tanto via intravenosa quantointraperitoneal induz HO-I no prazo de 2 horas e provocamigração das células HO-I+ para dentro do pâncreas.
Claims (12)
1. Método de tratar pancreatite, caracterizado pelofato de que compreende administrar a um humano em necessidadedo mesmo uma quantidade eficaz de hemina.
2. Método de profilaxia de pancreatite, caracterizadopelo fato de que compreende administrar a um humano emnecessidade do mesmo uma quantidade eficaz de hemina.
3. Método, de acordo com as reivindicações 1 ou 2,caracterizado pelo fato de que a hemina é administrada viauma rota parenteral.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a rota parenteral éintravenosa.
5. Método, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato de que a rota parenteral éintraperitoneal.
6. Método de induzir gene HO, caracterizado pelo fatode que compreende administrar a um humano em necessidade domesmo uma quantidade eficaz indutora de HO de hemina.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o gene HO é HO-I.
8. Método de induzir gene HO, em leucócitos pararecrutamento ao pâncreas para tratar pancreatite,caracterizado pelo fato de que compreende administrar a umhumano em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz indutorade HO de hemina.
9. Método de induzir gene HO, em leucócitos pararecrutamento ao pâncreas para profilaxia de pancreatite,caracterizado pelo fato de que compreende administrar a umhumano em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz indutorade HO de hemina.
10. Método de tratamento ex vivo de pancreatite,caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:-1) proporcionar linfócitos sangüíneos periféricos;-2) contactar os linfócitos sangüíneos periféricos comhemina para formar linfócitos sangüíneos periféricosinduzidos; e- 3) infundir os linfócitos sangüíneos periféricosinduzidos em um humano em necessidade do mesmo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de co-administrar hemina durante a etapa de infusão.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de pré-administrar hemina antes da etapa de infusão.
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